EP4401710A2 - Nanoparticules comprenant au moins un sel metallique et au moins une peptide - Google Patents

Nanoparticules comprenant au moins un sel metallique et au moins une peptide

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EP4401710A2
EP4401710A2 EP22802899.9A EP22802899A EP4401710A2 EP 4401710 A2 EP4401710 A2 EP 4401710A2 EP 22802899 A EP22802899 A EP 22802899A EP 4401710 A2 EP4401710 A2 EP 4401710A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
amino acid
acid sequence
following amino
nanoparticle
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP22802899.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
Célia ARIB
Jolanda Spadavecchia
Audrey GRIVEAU
Joël EYER
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dAngers
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Sorbonne Paris Nord
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dAngers
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Sorbonne Paris Nord
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a nanoparticle and its use as a drug or diagnostic agent.
  • the present invention also relates to a method for preparing a nanoparticle.
  • Hybrid nanoparticles combining a metallic part associated with a biocompatible polymer and a therapeutic molecule are promising nanomedicines and theranostic agents, particularly in the context of cancer treatment. These nanoparticles make it possible both to transport therapeutic molecules to the target cells and can be used, thanks to their metallic part, as photothermotherapeutic agents and/or in vivo imaging markers.
  • Emami stall. (2019) Mol. Pharmaceutics 16: 1184-1199 describe the use of hybrid nanoparticles combining a gold nanoparticle, a biocompatible polymer, polyethylene glycol (PEG), a therapeutic molecule, doxorubicin, and an anti-PD-Li antibody, making it possible to target colorectal cancer cells which over-express PD-Li, to destroy cells of the colorectal cancer cell line CT-26.
  • PEG polyethylene glycol
  • doxorubicin doxorubicin
  • an anti-PD-Li antibody an anti-PD-Li antibody
  • these nanoparticles facilitate the entry of doxorubicin into CT-26 cells, since 66% of cells undergo apoptosis, and that the combination of doxorubicin treatment and near-infrared irradiation significantly abolishes significant and synergistic in vitro proliferation of CT-26 cells by increasing apoptosis and cell cycle arrest.
  • the photothermo-therapeutic efficacy of these nanoparticles is not optimal. Indeed, these same nanoparticles without doxorubicin cause the death of only about 20% of the cells after irradiation in the near infrared.
  • the combination of doxorubicin and near-infrared irradiation only reduced the survival rate of CT-26 cells from about 20% to about 10% compared to the same treatment in the absence of irradiation.
  • hybrid nanoparticles capable of delivering therapeutic molecules, with improved photothermo-therapeutic properties.
  • the present invention stems from the unexpected demonstration by the inventors that hybrid nanoparticles obtained by chelation of chloroauric acid with a peptide of cell penetration, in particular one of the peptides NFL, TAT or VIM functionalized with a biotin and with dicarboxylic acid-terminated polyethylene glycol (NFL-BIOTINE-PEG-AuNPs, TAT-BIOTINE-PEG-AuNPs, VIM-BIOTINE-PEG -AuNPs) exhibit high stability and biocompatibility and are particularly suitable for the treatment of cancer.
  • the method for obtaining the nanoparticles according to the invention is a simple method comprising few 'steps.
  • NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs hybrid nanoparticles at concentrations of 500 pmol/L and 1000 pmol/L lead to a significant reduction in the cell viability of MiaPaCa-2 cells (cancer cell line of human pancreas) and F98 cells (rat glioblastoma line).
  • NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs hybrid nanoparticles at 100 pmol/L also cause a significant decrease in the cell viability of MiaPaCa-2 cells and irradiated F98 cells after administration of the nanoparticles.
  • the inventors have also demonstrated that the hybrid nanoparticles TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs and VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs lead to a significant reduction in the cell viability of F98 cells (rat glioblastoma line).
  • the present invention relates to a nanoparticle comprising: a combination of at least one metal salt and at least one peptide; and at least one biocompatible polymer.
  • the present invention also relates to a nanoparticle as defined above for use as a medicament and/or diagnostic agent.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one nanoparticle as defined above as active ingredient, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention also relates to a diagnostic composition comprising at least one nanoparticle as defined above.
  • the present invention also relates to a medical device comprising at least one nanoparticle as defined above.
  • the present invention also relates to a method for preparing a nanoparticle comprising: a combination of at least one metal salt and at least one peptide; and at least one biocompatible polymer, comprising: a step in which the metal salt is chelated with the peptide; a step of mixing with the biocompatible polymer; And a step of reducing the mixture with a reducing agent.
  • the term “comprising” is synonymous with “including”, “containing” or “encompassing”, i.e. when an object “comprises” one or more elements, other elements than those mentioned can also be included in the object.
  • the expression “consisting of” means “consisting of”, i.e. when an object "consists of” one or more elements, the object cannot include other elements. than those mentioned.
  • biocompatible is meant within the meaning of the invention the ability of a material to be compatible with a biological medium, in particular a tissue or a fluid of a living organism.
  • a biocompatible material within the meaning of the invention can be used in a pharmaceutical composition, in a diagnostic composition, in a medical device, for example for diagnostic or therapeutic purposes.
  • biopolymer or “natural polymer” within the meaning of the invention means a polymer which can be produced by a living organism, such as for example an animal, a plant or a fungus.
  • metallic salt is meant within the meaning of the invention, metal oxides and salts resulting from the action of an acid on a metal.
  • metal salt according to the invention results from the action of an acid on a metal.
  • the metal salt according to the invention is selected from the group consisting of a transition metal salt, a lanthanide salt, an alkaline earth metal salt and mixtures thereof.
  • the metal salt according to the invention is selected from the group consisting of a salt of gold (Au), Selenium (Se), gadolinium (Gd), cobalt (Co), europium (Eu) , terbium (Tb), cerium (Ce), manganese (Mn), iron (Fe), zinc (Zn) and copper (Cu).
  • the metal salt according to the invention is a metal salt of an inorganic acid.
  • metal salt of inorganic acid according to the invention it is possible to cite sulphates, chlorides, nitrates, phosphates and carbonates.
  • the metal salt according to the invention is HAUC1 4 chlorauric acid.
  • the metal salt according to the invention is not an iron salt or an iron oxide.
  • the peptide according to the invention is an isolated amino acid sequence comprising no more than too many amino acids.
  • the peptide according to the invention comprises between 2 and too amino acids, for example between 2 and 90, between 2 and 80, between 2 and 70, between 2 and 60, between 2 and 50 and between 2 and 40 acids.
  • amines Preferably, the peptide according to the invention comprises at least 2 amino acids, for example at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9 and at least 10 amines. More preferably, the peptide according to the invention comprises between 2 and 40 amino acids for example, between 10 and 40 amino acids or between 10 and 30 amino acids.
  • the peptide according to the invention can be chosen from any biocompatible peptide well known to those skilled in the art.
  • the peptide according to the invention is selected from the group consisting of a chimeric peptide, a synthetic peptide and a peptide derived from a protein.
  • the peptide according to the invention is a peptide capable of penetrating into cells, in particular of penetrating the plasma membrane of cells. More preferably, the peptide according to the invention is a cell penetrating peptide (CPP).
  • CPP cell penetrating peptide
  • the peptide according to the invention is a peptide capable of crossing the blood-brain barrier.
  • the peptide according to the invention is a cell-penetrating peptide selected from the group consisting of a polycationic peptide with a sequence rich in positively charged amino acid residues such as for example lysine or arginine, of a amphiphilic peptide with a sequence alternating between electrically charged polar residues and hydrophobic apolar residues and of a hydrophobic peptide containing only electrically slightly charged or hydrophobic apolar residues.
  • a polycationic peptide with a sequence rich in positively charged amino acid residues such as for example lysine or arginine
  • amphiphilic peptide with a sequence alternating between electrically charged polar residues and hydrophobic apolar residues and of a hydrophobic peptide containing only electrically slightly charged or hydrophobic apolar residues.
  • the peptide according to the invention is selected from the group consisting of the NFL peptide having the following amino acid sequence: YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO: 1), the TAT peptide having the following amino acid sequence: GRKKRRQRRRPPQ ( SEQ ID NO: 2), the VIM peptide having the following amino acid sequence: GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO: 3), the transportan peptide having the following amino acid sequence: GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 4), the penetratin peptide having the following amino acid sequence: RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 5), MAP peptide having the following amino acid sequence: KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 6), Pep-1 peptide having the sequence d following amino acids: KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 1), the
  • the peptide according to the invention can also be a cyclic peptide such as for example the cyclic RGD peptide.
  • the peptide according to the invention is selected from the group consisting of the NFL peptide having the following amino acid sequence: YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO: 1), the TAT peptide having the following amino acid sequence: GRKKRRQRRRPPQ ( SEQ ID NO: 2), the VIM peptide having the following amino acid sequence: GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO: 3) or a derivative thereof.
  • the peptide according to the invention is not a peptide targeting the EGFR receptor, in particular a -lysine-azidoacetic acid peptide, or a peptide targeting the bones.
  • peptide derivative is meant within the meaning of the invention the variants and fragments of the peptide to which they refer.
  • the derivatives, in particular the variants or fragments, of the peptide according to the invention are biologically active.
  • the variant of the peptide according to the invention can be chosen from any variant well known to those skilled in the art.
  • a variant according to the invention it is possible to cite an allelic variant of the peptide, and a peptidomimetic variant of the peptide.
  • the variant according to the invention has the same number of amino acids as the peptide from which it is derived.
  • the percentage identity between two peptide sequences is well known to those skilled in the art.
  • the percentage identity between two peptide sequences can be determined by performing a sequence alignment over the entire length of the similar sequences and determining the number of positions for which the amino acids are identical in each sequence and by dividing this number by the total number of amino acids in the longest sequence.
  • the peptidomimetic variant according to the invention is preferably an organic molecule which mimics certain properties of the parent peptide.
  • the preferred peptidomimetic variants according to the invention are obtained by structural modification of the peptides according to the invention, for example by using unnatural amino acids such as a D amino acid instead of an L amino acid, conformational constraints, a isosteric replacement, cyclization or other modifications.
  • modifications By way of example of other modifications, it is possible to cite the following modifications: replacement of one or more amide bonds by a non-amide bond; replacement of one or more amino acid side chains with a different chemical moiety; protection of one or more N-terminal, C-terminal or side chain ends by a protective group; introduction of a double bond or a ring in the main chain.
  • the modifications have the effect of increasing the rigidity, the binding affinity, the resistance to enzymatic degradation, the bioavailability and more generally of improving the pharmacokinetic properties of the peptide according to the invention.
  • the person skilled in the art is able to design and produce peptidomimetic variants having similar or superior biological characteristics to the peptides according to the invention, in particular to the penetration peptides cell, more particularly to the NFL, TAT and VIM peptides according to the invention.
  • the NFL peptide also named NFL-TBS40-63 below, is a polypeptide of 24 amino acids having the following sequence: YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO: 1). This peptide is well known to those skilled in the art and corresponds to the second tubulin-binding site of the light neurofilament subunit (amino acids 40 to 63 of the TBS site of the NFL protein).
  • the peptide according to the invention is a derivative of the NFL peptide, in particular a variant or a fragment thereof.
  • the NFL peptide fragments and variants are biologically active.
  • the fragment of the NFL peptide according to the invention comprises at least 12 successive amino acids of the parent NFL peptide, preferably at least 16, more preferably at least 18 amino acids.
  • the variant according to the invention comprises at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% of identity with respect to NLF-peptide.
  • an allelic variant of the NFL peptide it is possible to cite the TBS motif of the light subunit of the quail neurofilament, which retains 20 out of 24 amino acids of the NFL-TBS40-63 peptide.
  • the TAT peptide also called TAT48-60 below, is a peptide of 13 amino acids having the following sequence GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 2). This peptide, well known to those skilled in the art, corresponds to residues 48 to 60 of the TAT protein involved in the replication of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).
  • the peptide according to the invention is a derivative of the TAT peptide, in particular a variant or a fragment thereof.
  • the TAT peptide derivative according to the invention is biologically active.
  • the fragment of the TAT peptide according to the invention comprises at least 5 successive amino acids of the TAT parent peptide, preferably at least 6, at least 7, at least 8 amino acids.
  • the variant according to the invention comprises at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% of identity with respect to TAT-peptide.
  • the VIM peptide is a 24 amino acid peptide having the following sequence: GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO: 3).
  • the peptide according to the invention is a derivative of the VIM peptide, in particular a variant or a fragment thereof.
  • the VIM peptide derivative according to the invention is biologically active.
  • the fragment of the VIM peptide according to the invention comprises at least 12 successive amino acids of the parent VIM peptide, preferably at least 14, at least 16 and more preferentially at least 18 amino acids.
  • the variant of the VIM peptide according to the invention comprises at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% of identity compared to the VIM peptide.
  • the penetratin peptide is a 16-residue long fragment with the following amino acid sequence: RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 5). This peptide, well known to those skilled in the art, is derived from the homeodomain of the Drosophila transcription factor Antennapedia.
  • the peptide according to the invention is a derivative of the peptide penetratine, in particular a variant or a fragment thereof.
  • the derivative of the penetratin peptide according to the invention is biologically active.
  • the fragment of the penetratine peptide according to the invention comprises at least 5 successive amino acids of the parent peptide penetratine, preferably at least 6, at least 7, at least 8 amino acids.
  • the variant according to the invention comprises at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% of identity with respect to Penetratin peptide.
  • the peptide according to the invention can be prepared using any technique well known to those skilled in the art, in particular via chemical synthesis.
  • the peptide as defined above is coupled with at least one coupling agent.
  • the terms “coupling agent” and “conjugating agent” are interchangeable.
  • the terms “coupled”, “conjugated”, “functionalized”, and “modified” may be used interchangeably.
  • the coupling agent according to the invention can be chosen from any coupling agent well known to those skilled in the art.
  • the coupling agent according to the invention is non-peptide.
  • the coupling agent can be bifunctional, preferably heterobifunctional, such as Ny-maleimidobutyryl-oxysuccinimide (GMBS) ester and the sulfo-GMBS derivative, m-maleimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimide (MBS) ester and sulfo-MBS derivative, succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-i-carboxylate (SMCC), sulfo-succinimidyl 4- (N- maleimidomethyl) cyclohexane-i-carboxylate (sulfo-SMCC), a carbodiimide, bisdiazonium -benzidine (BDB) or glutaraldehyde, biotin, sulfo-NHS-bitoin or a fluorophore, also known as fluorochrome, such as hydroxycoumarin, aminocoumarin, methoxycoumarin, Cascade Blue,
  • GMBS, MBS, SMCC or sulfo-SMCC are used, they are preferably attached to a cysteine (C), which if it is not present in the sequence of the peptide, can be added, in particular to its N-terminal or C-terminal end.
  • C cysteine
  • the coupling agent according to the invention can also be chosen from any functional group well known to those skilled in the art which can bind to a peptide.
  • a functional group according to the invention it is possible to cite fluorine, a phosphate group, an acetyl group, an alkyl group, a glutamic acid residue, a carboxyl group, a glycine residue, a glycosyl group , a hydroxyl group, an amide group and a sulfate group.
  • the coupling agent according to the invention is selected from the group consisting of biotin and fluorescein.
  • the peptide according to the invention is functionalized by at least one biotin, for example by one biotin, by two biotins or by three biotins.
  • the peptide according to the invention is functionalized by at least one fluorescein, for example by one fluorescein, by two fluoresceins, by three fluoresceins.
  • the peptide according to the invention can be modified by any conventional peptide coupling process well known to those skilled in the art, for example by chemical means or by enzymatic means.
  • any conventional peptide coupling process well known to those skilled in the art, for example by chemical means or by enzymatic means.
  • a process for modifying the peptide according to the invention mention may be made of acetylation, alkylation, biotinylation, glutamylation, glycylation, glycosylation, hydroxylation, phosphorylation, sulfation , amidation, PEGylation.
  • the coupling agent according to the invention in particular fluorescein or biotin, is bound to the peptide according to the invention in a covalent manner.
  • the functionalization of the peptide according to the invention by at least one coupling agent, in particular a fluorescein or a biotin, can be carried out directly on a primary amine, a secondary amine or both.
  • At least a coupling agent in particular a fluorescein or a biotin, is linked to the N-terminal end or to the C-terminal end of the peptide according to the invention.
  • the functionalization of the peptide by at least one coupling agent is carried out with an intermediate well known to those skilled in the art on the primary carboxylic functions or secondary or both.
  • an intermediate well known to those skilled in the art on the primary carboxylic functions or secondary or both.
  • a binding intermediate it is possible to cite a carbodiimide such as i-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide.
  • the biocompatible polymer according to the invention can be a natural or synthetic polymer and can be selected from any biocompatible polymer well known to those skilled in the art.
  • the biocompatible polymer according to the invention is selected from the group consisting of synthetic biocompatible polymers, biopolymers and heat-sensitive biocompatible polymers.
  • the biocompatible polymer according to the invention is selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyethylene glycol diacid (PEG-diacid), polyethylene glycol diamine (PEG-diamine), collagen, alginate , elastin, hyaluronic acid, cellulose, gelatin, polylactic acid, maltodextrin, glucose polymer, lactose polymer, chitosan, dextran, d a heat-sensitive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), poly[2-(dimethylamino)ethyl methyl methacrylate] (pDMAEMA), hydroxypropyl cellulose, poly(vinylcaprolactam) and polyvinyl methyl ether) or a combination of these.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG-diacid polyethylene glycol diacid
  • PEG-diamine polyethylene glycol diamine
  • collagen alginate , elastin, hyalur
  • the biocompatible polymer is polyethylene glycol dicarboxylic.
  • the nanoparticle according to the invention has a diameter of between 5 nm and 500 nm, more preferably between 5 nm and 200 nm, for example between 5 nm and 150 nm, between 5 nm and 100 nm, between 5 nm and 90 nm . More preferably, the nanoparticle according to the invention has a diameter of between 20 nm and 200 nm, for example between 20 nm and 150 nm, or between 20 nm and 100 nm.
  • the peptide according to the invention is inside the nanoparticle according to the invention.
  • the peptide adopts a steric configuration making it possible to preserve and/or improve the therapeutic activity of the peptide without impacting the stability of the nanoparticle.
  • the metal salt is chelated by the peptide according to the invention.
  • the metal salt and the peptide are encapsulated by the polymer.
  • the nanoparticle according to the invention is prepared according to the method comprising the following steps: a step in which the metal salt is chelated with the peptide; a step of mixing with the biocompatible polymer; And a step of reducing the mixture with a reducing agent.
  • the step in which the metal salt is chelated with the peptide comprises dissolving the metal salt, preferably in an aqueous solution, and adding the peptide to the metal salt solution.
  • the biocompatible polymer is used as a stabilizing agent.
  • the process for preparing the nanoparticle according to the invention is carried out in the absence of surfactant other than the biocompatible polymer and in the absence of chemical binder.
  • the reducing agent according to the invention can be any reducing agent well known to those skilled in the art.
  • a reducing agent according to the invention it is possible to cite LiAlHq, NaBHq, NaHg, B2H6, SO2.
  • the reducing agent according to the invention is NaBHq.
  • the process for preparing the nanoparticle according to the invention can also comprise a step of centrifuging the nanoparticle solution, preferably after the reduction step, in order to eliminate the excess of biocompatible polymer.
  • the nanoparticle according to the invention is stable.
  • the nanoparticle according to the invention is stable and its biological activity, in particular the targeting and cell internalization properties of the peptide, is maintained for at least 2 months, 4 months, 6 months, 8 months, 10 months, 12 months, 14 months, 16 months, 18 months, 20 months, 22 months, or 24 months.
  • nanoparticles according to the invention are particularly suitable for use as a drug and/or diagnostic agent in an individual.
  • nanoparticles according to the invention are particularly suitable for use as a theranostic agent.
  • nanoparticles according to the invention are also particularly suitable for use in a medical device intended for use in an individual.
  • one embodiment of the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one nanoparticle according to the invention as active principle, optionally in combination with a vehicle or a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the present invention also relates to the use of at least one nanoparticle according to the invention for the manufacture of a medicament, in particular a medicament for the prevention or treatment of cancer, in particular for the prevention or treatment of glioblastoma or pancreatic cancer.
  • the present invention also relates to the use of at least one nanoparticle according to the invention for the targeting, detection and destruction of cancer cells.
  • the present invention also relates to a method of treating cancer, in particular glioblastoma or pancreatic cancer, in an individual comprising the administration to the individual of an effective amount of at least one nanoparticle or of a pharmaceutical composition or a medicament according to the invention.
  • the present invention also relates to a diagnostic composition
  • a diagnostic composition comprising at least one nanoparticle according to the invention as active ingredient, optionally in combination with a vehicle or a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the medical device according to the invention preferably comprises at least one nanoparticle according to the invention.
  • the medical device according to the invention is used for the diagnosis, prevention or treatment of cancer, in particular glioblastoma or pancreatic cancer.
  • the medical device according to the invention can be chosen from any medical device well known to those skilled in the art.
  • the medical device according to the invention is selected from the group consisting of a medical imaging device or an implantable device such as an implant, a stent, a catheter.
  • implantable device is meant any device intended to be introduced totally or partially, by medical intervention, into the human or animal body.
  • the nanoparticle, the pharmaceutical composition, the drug or the medical device according to the invention is used for the prevention or treatment of cancer, in particular glioblastoma or pancreatic cancer.
  • the nanoparticle, the diagnostic composition or the medical device according to the invention is used for the detection of cancerous cells or tumors, for the diagnosis of cancer, for the monitoring of evolution of a cancer and/or for the follow-up of a therapeutic treatment of cancer.
  • the nanoparticle, the pharmaceutical composition, the diagnostic composition, the drug, or the medical device is used as a contrast agent for diagnostic imaging such as radiography, radiography imaging, magnetic resonance (MRI), Raman spectroscopy, optical imaging, optical coherence tomography, X-rays, computed tomography, positron emission tomography or combinations thereof.
  • diagnostic imaging such as radiography, radiography imaging, magnetic resonance (MRI), Raman spectroscopy, optical imaging, optical coherence tomography, X-rays, computed tomography, positron emission tomography or combinations thereof.
  • One embodiment of the present invention relates to the monitoring of the administration of the nanoparticle, of its biodistribution and its bioavailability, of the pharmaceutical composition, of the medicine, or of the diagnostic composition according to the invention to an individual by a diagnostic device and individual diagnosis.
  • the nanoparticles, the drug, the pharmaceutical or diagnostic composition, the medical device according to the invention are used in at least one of the following situations: diagnose cancer, in particular glioblastoma or pancreatic cancer; determine the state or evolution of a cancer, in particular glioblastoma or pancreatic cancer,
  • cancer in particular glioblastoma or pancreatic cancer
  • therapeutic treatment for cancer in particular glioblastoma or pancreatic cancer
  • the cancer prevented or treated according to the invention can be any cancer known to those skilled in the art.
  • the cancer prevented or treated according to the invention can be at stage 1, stage 2, stage 3 or stage 4.
  • the cancer prevented or treated according to the invention is selected from the group consisting of cancers of the central nervous system, of the endocrine system and of the digestive system.
  • the cancer prevented or treated according to the invention is selected from the group consisting of thyroid cancer, parathyroid cancer, thymus cancer, ovarian cancer, testicular cancer, cancer of the pancreatic islets, gallbladder cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, glioblastoma, liver cancer, pancreatic cancer, rectal cancer, breast cancer intestine, cancer of the small intestine. More preferably, the cancer prevented or treated according to the invention is selected from the group consisting of glioblastoma and pancreatic cancer.
  • the nanoparticle, the pharmaceutical composition, the drug, the diagnostic composition or the medical device according to the invention is particularly suitable for use in photothermal therapy, in particular for the treatment of cancer by photothermia.
  • Photothermia is a cancer treatment method well known to those skilled in the art.
  • the nanoparticle according to the invention, the pharmaceutical composition or the drug according to the invention is injected into the bloodstream of the individual, preferably by intravenous injection.
  • the nanoparticle then penetrates the tumor or cancer cells to be treated, which are exposed to infrared radiation causing their destruction.
  • pharmaceutically acceptable carrier or excipient refers to any material suitable for use in a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle or excipient according to the invention is suitable for use with nanoparticles according to the invention, preferably in liquid form.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle or excipient according to the invention is suitable for oral, parenteral, intradermal, intravenous, arterial, intramuscular, nasal, rectal or subcutaneous administration.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle or excipient according to the invention comprises but is not limited to any standard vehicle or excipient well known to those skilled in the art such as water, glycerin, alcohol, an emulsion oil, water emulsion, saline solution, buffer solution, preservative, stabilizer etc.
  • the individual according to the invention is an animal, preferably a mammal, such as a human, a canine, in particular a dog, a feline, in particular a cat, a horse, a bovine, a pig, a caprine, in particular a goat or a sheep, a camelid, a rodent in particular a mouse or a rat. More preferably the individual according to the invention is a human.
  • the individual according to the invention has cancer, in particular cancer of the central nervous system, cancer of the endocrine system and cancer of the digestive system.
  • the individual according to the invention suffers from glioblastoma or pancreatic cancer.
  • the individual according to the invention is suspected of having cancer, in particular glioblastoma or pancreatic cancer.
  • the nanoparticle according to the invention, the pharmaceutical composition, the diagnostic composition, the medicine, or the medical device according to the invention is administered in a prophylactic or therapeutic amount effective for detecting, preventing or treating cancer as defined above.
  • the nanoparticle according to the invention, the pharmaceutical composition, the drug, the diagnostic composition or the medical device according to the invention can be administered orally, parenterally, intradermally, intravenously, arterial, intramuscular, nasal, rectal or subcutaneous.
  • the nanoparticle according to the invention, the pharmaceutical composition, the drug, the diagnostic composition or the medical device can be formulated in the form of an injectable suspension, gels, oil, suppository, capsule, etc...
  • the nanoparticle according to the invention, the pharmaceutical composition, the medicine, the diagnostic composition or the medical device can be administered to the individual in a dose of between 10 pmol/L and 2000 pmol/L, preferably between 50 pmol/L.
  • L and 1500 pmol/L more preferably between 100 pmol/L and 1000 pmol/L, for example between 200 pmol/L and 1000 pmol/L, between 300 pmol/L and 1000 pmol/L between 400 pmol/L and 1000 pmol/L, between 500 pmol/L and 1000 pmol/L.
  • a person skilled in the art is capable of adjusting the dose of nanoparticle or of pharmaceutical composition, of diagnostic composition or of drug according to the weight of the individual to be treated.
  • nanoparticle according to the invention, the pharmaceutical composition, the drug, the diagnostic composition or the medical device can be administered with an additional compound for the prevention or treatment of cancer.
  • the nanoparticle according to the invention can be used as a carrier of an additional compound for the prevention or treatment of cancer.
  • the nanoparticle according to the invention can be used to deliver an additional compound for the prevention or treatment of cancer intracellularly.
  • the nanoparticle according to the invention can be used to transport a therapeutic molecule to the target cells, in particular to the cancerous cells of the tumor to be treated.
  • the invention relates to a product comprising: at least one nanoparticle as defined above; at least one additional compound for the prevention or treatment of cancer, in particular glioblastoma and pancreatic cancer as a combination product for use, in particular simultaneous, separate or spread over time, for the prevention or treatment of cancer , in particular glioblastoma or pancreatic cancer.
  • “combined” or “in combination” means that the nanoparticle according to the invention is administered at the same time as another compound, either together, that is to say at the same site of administration. , either separately or at different times, provided that the period of time during which the nanoparticle according to the invention exerts its effects in the individual and the period of time during which the additional compound produces its pharmacological effects in the individual overlap at least partially.
  • the additional compound for the prevention or treatment of cancer can be any compound well known to those skilled in the art.
  • the additional compound is selected from the group consisting of cyclophosphamide, docetaxel, doxorubicin, epirubicin, fluorouracil, methotrexate, paclitaxel, everolimus, alectinib, melphalan, brigatinib , nilutamide, cyproterone acetate, anastrozole, exemestane, lomustine, bosutinib, encorafenib, cabozatinib, vandenatib, bicalutamide, etopositde, chlorambucil, cobimetinib, enzalutamide , idarubicia, capecitabine, tamoxifen, dexamethasone, bisulfan, lenvatinib, gemcitabine, 5-FU, irinotecan, 5-FU
  • Figure 1 represents the UV-visible spectrum of the NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs nanoparticle synthesis with the wavelength (nm) as a function of the absorbance (a.u).
  • FIG. 2 represents the UV-visible spectrum of NFL-BIOTINE-PEG-AuNPs nanoparticle at To, and at To+11 months (Test 1 and Test 2).
  • Figure 3 represents the increase in temperature (in °C) of water (H2O), of a solution of peptide NFL functionalized with a biotin (NFL-BIOT), of a solution of complex of the gold salt with the peptide functionalized with a biotin (AuNPs) and a solution of NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs nanoparticles as a function of time (in min).
  • FIG. 4 shows the mitochondrial activity of MiaPaCa-2 cells, MiaPaCa-2 cells treated with colchicine, MiaPaCa-2 cells treated for 24b with 50, 100, 250, 500 and 1000 pmol/L of PEG- AuNPs complexed or not with the NFL-BIOTIN peptide. Mitochondrial activity is expressed as an average % relative to the activity of control MiaPaCa-2 cells.
  • Figure 5 represents the mitochondrial activity of MiaPaCa-2 cells, MiaPaCa-2 cells treated with colchicine, MiaPaCa-2 cells treated for 72I1 with 50, 100, 250, 500 and 1000 pmol/L of PEG- AuNPs complexed or not with the NFL-BIOTIN peptide. Mitochondrial activity is expressed as an average % relative to the activity of control MiaPaCa-2 cells.
  • FIG. 6 represents the mitochondrial activity of F98 cells, of F98 cells treated with colchicine, of F98 cells treated for 24I1 with 50, 100, 250, 500 and 1000 pmol/L of PEG-AuNPs nanoparticles complexed or not with the NFL-BIOTIN peptide.
  • the mitochondrial activity is expressed as an average % relative to the activity of the control F98 cells.
  • Fig. 7
  • FIG. 7 represents the mitochondrial activity of F98 cells, of F98 cells treated with colchicine, of F98 cells treated for 72I1 with 50, 100, 250, 500 and 1000 pmol/L of PEG-AuNPs nanoparticles complexed or not with the NFL-BIOTIN peptide. Mitochondrial activity is expressed as an average % relative to the activity of control F98 cells.
  • Figure 8 represents the cell viability of MiaPaCa-2 cells, treated with the peptide alone (NFL-BIOT) at 0.1 pM, with the PEG-AuNP nanoparticle (AuNPs) at 100 pM and with the NFL-BIOTIN-Au nanoparticle -NPs at 100 pM, after irradiation and internalization of the nanoparticles for 24b.
  • the cell viability is expressed in % relative to the cell viability of the untreated cells.
  • Figure 9 represents the cell viability of MiaPaCa-2 cells, treated with the peptide alone (NFL-BIOT) at 0.1 pM, with the PEG-AuNP nanoparticle (AuNPs) at 100 pM and with the NFL-BIOTIN-Au nanoparticle -NPs at 100 pM, after irradiation and internalization of the nanoparticles for 48I1.
  • the cell viability is expressed in % relative to the cell viability of the untreated cells.
  • FIG. 10 represents the cell viability of F98 cells, treated with the peptide alone (NFL-BIOT) at 0.1 pM, with the PEG-AuNP nanoparticle (AuNPs) at 100 pM and with the NFL-BIOTIN-Au-NPs nanoparticle at too pM, after irradiation and internalization of the nanoparticles for 24b.
  • the cell viability is expressed in % relative to the cell viability of the untreated cells.
  • FIG. 11 represents the cell viability of F98 cells, treated with the peptide alone (NFL-BIOT) at 0.1 pM, with the PEG-AuNP nanoparticle (AuNPs) at 100 pM and with the NFL-BIOTIN-Au-NPs nanoparticle at too pM, after irradiation and internalization of the nanoparticles for 48b.
  • the cell viability is expressed in % relative to the cell viability of the untreated cells.
  • Figure 12 shows the in vitro mitochondrial activity of rat glioblastoma cells (F98) (cells) as a control, of F98 cells treated with colchicine (Col, 1 ⁇ g/mL). as a positive control and F98 cells treated for 24 hours with PEG-AuNPs, BIOT-TAT-PEGAuNPs and BIOT-VIM-PEG-AuNPs nanoparticles at different concentrations (o, 50, 100, 250, 500 or 1000 pmol/L) .
  • Mitochondrial activity was evaluated by the MTS test. The experiments were performed at least in triplicates. The symbol # signifies no cells present at the end of the incubation treatment. Data represent mean ⁇ standard error relative to activity of control F98 cells. Statistical analysis was performed with Student's t test (*p ⁇ 0.05 and ***p ⁇ 0.001).
  • Figure 13 shows the in vitro mitochondrial activity of rat glioblastoma cells (F98) as control, of F98 cells treated with colchicine (Col, 1 ⁇ g/mL) as positive control and of F98 cells treated for 72 hours with PEG-AuNPs, BIOT-TAT-PEGAuNPs and BIOT-VIM-PEG-AuNPs nanoparticles at different concentrations (0, 50, 100, 250, 500 or 1000 pmol/L). Mitochondrial activity was assessed by the MTS test. The experiments were performed at least in triplicates. The symbol # signifies no cells present at the end of the incubation treatment. Data represent mean ⁇ standard error relative to activity of control F98 cells. Statistical analysis was performed with Student's t test (*p ⁇ 0.05 and ***p ⁇ 0.001).
  • Figure 14 shows a transmission electron microscopy image illustrating the internalization of gold nanoparticles (PEG-AuNPs) in rat glioblastoma (F98) cells.
  • the F98 cells were treated with the nanoparticles at 250 pmol/L for 24 hours.
  • N for nucleus and V for vacuoles.
  • Figure 15 shows a transmission electron microscopy image illustrating the internalization of gold nanoparticles (PEG-AuNPs) coupled with the peptide TAT-BIOTIN (BIOT-TAT-PEGAuNPs) in rat glioblastoma cells (F98).
  • the F98 cells were treated with the nanoparticles at 250 pmol/L for 24 hours.
  • N for nucleus and V for vacuoles.
  • FIG. 16 represents a transmission electron microscopy image illustrating the internalization of gold nanoparticles (PEG-AuNPs) coupled with the VIM-BIOTIN peptide (BIOT-VIM-PEGAuNPs) in rat glioblastoma cells (F98).
  • F98 cells have were treated with the nanoparticles at 250 umol/L for 24 hours.
  • N for nucleus and V for vacuoles.
  • Figure 17 represents the average number of vacuoles containing more than 20 gold nanoparticles in F98 cells incubated for 24 hours with 250 pmol/L of PEG-AUNPs nanoparticles (black bar), BIOT-TAT-PEG-AUNPs nanoparticles (dark gray bar), and BIOT-VIM-PEG-AuNPs nanoparticles (light gray bar). Counting of nanoparticles is done manually on electron microscopy images.
  • the inventors synthesized and characterized NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs gold nanoparticles according to the invention according to the preceded below.
  • the gold nanoparticles are mainly prepared by reduction of chloroauric acid (HAUC1 4 , Sigma-Aldrich) at a concentration of 1 mmol/L.
  • PEG-COOH 600 Poly-Ethylene-Glycol dicarboxylic, Sigma-Aldrich
  • the products of each synthesis step are stored at 27-29°C and characterized by UV-visible spectroscopy, Raman spectroscopy and transmission electron microscopy (TEM).
  • the NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs solution was centrifuged at 10,000 rpm 3 times for 10 min, then the supernatant was discarded. The pellet was redispersed in an equivalent amount of water. This was repeated twice to remove excess dicarboxylic PEG not conjugated to the NFL-BIOTIN peptide.
  • Raman spectra were recorded using an Xplora Raman microspectrometer (Horiba Scientifics) and processed using Labspec software.
  • the spectrometer was tuned with a HeNe (Helium-Neon) laser at 66o nm, a CCD camera for data acquisition and an optical filter set to too % for a laser power of 8 mW and a grating of 6oo lines.
  • HeNe Helium-Neon
  • the zeta potential of NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs dispersed in water was measured using the electrophoretic mode of a Zetasizer NanoZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK).
  • the average hydrodynamic diameters of NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs nanoparticles dispersed in water were characterized using nanoparticle tracking analysis.
  • NanoSight Malvern Instruments Ltd
  • this equipment uses the properties of light scattering and Brownian motion to obtain particle size distributions of samples in liquid suspension.
  • the measurement was performed using an NS500 system equipped with a 405 nm laser, with version 3.0.
  • Six sixty-second videos were recorded at a sufficient nanoparticle concentration to achieve a minimum of 200 completed tracks per video for statistical significance. Data was recorded in ⁇ standard deviation mode.
  • the gold nanoparticles complexed or not with the NFL-BIOTIN peptide were observed by transmission electron microscopy. For this, 2 pL of samples were deposited on 150-mesh copper grids, themselves covered with a film of Formvar for 1 min. The grids were then contrasted with 2% uranyl acetate for 1 min. The samples were observed with a Jeol microscope (model JEM-1400 with an accelerating voltage of 120 kV; Japan) equipped with a model 832 Orius SC-1000 camera from Gatan.
  • the complexation of HAuCl 4 with the NFL-BIOTIN peptide could be observed with a band at 300 nm which represents HAuCl 4 and a band at 280 nm representing the NFL-BIOTIN peptide (see FIG. 1).
  • a UV-visible band at 525 nm representing the plasmon band of NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs nanoparticles was observed.
  • PEG-AuNPs pegylated gold nanoparticles complexed or not with the NFL-BIOTIN peptide were observed under a transmission electron microscope. These observations make it possible to note a difference in the shape of the nanoparticles in the absence or in the presence of the NFL-BIOTIN peptide. PEG-AuNPs nanoparticles have a round shape with relatively homogeneous sizes.
  • the inventors evaluated the effect of NFL-Biotin-PEG-AuNP gold nanoparticles on two cancer cell lines.
  • the two cell lines were cultured in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle's medium Gibco, Bio-Sciences Ltd, Ireland) supplemented with 10% FBS Fetal Bovine Serum; Sigma-Aldrich), 1% antibiotics (50 IU/mL penicillin and 50 pg/mL streptomycin) and L-glutamine (2 mmol/L).
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle's medium Gibco, Bio-Sciences Ltd, Ireland
  • FBS Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich
  • antibiotics 50 IU/mL penicillin and 50 pg/mL streptomycin
  • L-glutamine 2 mmol/L
  • MTS cell viability tests (abi97010; Abeam, Paris, France) measuring the mitochondrial activity of cells were carried out.
  • the cells were seeded in 96-well plates at a rate of 1000 or 3000 cells per well (number of cells variable depending on the duration of the treatment) and were incubated for 24 hours at 37°C and at 5% of C0 2 . Then, the different treatments were brought into contact with the cells: colchicine (1 pg/mL, C9754; Sigma-Aldrich) or concentrations of gold nanoparticles complexed or not with the NFL-BIOTIN peptide (between 50 and 1000 pmol /L) for 24 or 72 hours at 37° C. and 5% C0 2 .
  • the cells (MiaPaCa-2 and F98) were seeded in 6-well plates at the rate of 400,000 cells per well and were incubated for 24 hours at 37° C. and at 5% C0 2 . Then, the nanoparticles at 100 or 500 pmol/L without or with the peptide at 0.08 mmol/L were incubated with the cells for 24 or 72 hours. After incubation, the cells were washed with 0.1 mol/L phosphate buffer (pH 7.4) and were fixed overnight at 4°C, with a solution of 2.5% glutaraldehyde in 0.1 mol/L phosphate buffer (pH 7.4). Then, the cells were rinsed with 0.1 mol/L phosphate buffer.
  • Cells were then rinsed with distilled water and post-fixed in 1% osmium tetroxide solution for 1 hour. They were then rinsed 3 times for 5 min with water, and incubated for 15 min in 50° ethanol, 15 min in 70° ethanol, 15 min in 95 ° ethanol. and 3 times 30 min in 100° ethanol. Then, they were put in a mixture of 50% ethanol 100°/50% Epon resin (volume/volume) and incubated overnight. The following day, the remaining diluted Epon resin was removed and replaced by a pure Epon bath for 4 hours, then this Epon bath was replaced in turn by another pure Epon bath.
  • the plate with the cells in Epon was placed for 24 hours at 37°C, then 24 hours at 45°C and finally 72 hours at 60°C.
  • ultrathin sections 60 nm thick were made with a UC7 ultramicrotome (Leica, Wetzlar, Germany) and deposited on 150 Mesh copper grids. The sections were then contrasted with a solution of 3% uranyl acetate in 50° ethanol for 15 min and then rinsed with ultrapure water. The samples were then observed under a Jeol microscope (model JEM-1400 with an acceleration voltage of 120 kV; Japan) equipped with a model 832 Orius SC-1000 camera from Gatan.
  • the MiaPaCa-2 and F98 cells were seeded at a density of 200,000 cells/mL in 25 cm 2 culture flasks and were cultured at 37° C. and at 5% C0 2 .
  • the cells were then seeded in 96-well plates at a rate of 200 ⁇ l of cells per well, and left for 24 or 48 hours. Then, 50 ⁇ l of medium per well were withdrawn to replace them with the solutions of the nanoparticles which were incubated for 24 hours. The medium was then removed, the cells were washed three times with PBS (Phosphate Buffered Saline), to remove the excess of non-internalized nanoparticles. Then, the same volume of medium per well was added.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • Each well of the plate was subjected to an 808 nm laser source with a power of 0.5 W/cm 2 .
  • Experiments were made upstream to define the optimal parameters, so as not to risk having any artifact due to the laser parameter.
  • the studies were conducted at two times: 5 and 10 min, to determine whether the "time" parameter could have an impact on the results.
  • the medium was changed and left for 24 hours, then a cell viability test was performed to verify that the nanoparticles had the same effect on the cells before and after. radiation treatment.
  • 1 mL of the solution of nanoparticles was deposited in a tank and using an infrared laser the nanoparticles were heated. A thermal probe then makes it possible to collect the rise in temperature for 15 min.
  • colchicine To assess mitochondrial activity, the two cell lines were treated with 1 pg/mL of colchicine or with 0, 50, 100, 250, 500 or 1000 pmol/L of PEG-AuNPs nanoparticles complexed or not with the peptide NFL- BIOTIN for 24 or 72 hours.
  • the action of colchicine is to interact with tubulin and disrupt microtubule assembly (Bhattacharyya et al., 2008), which causes cell death. Colchicine therefore serves as a positive control.
  • the MTS test showed no effect of PEG-AuNPs, however a decrease in mitochondrial activity was observed from treatment with 500 pmol/L of NFL-BIOTIN -PEG-AuNPs, and a very strong decrease was observed at the dose of 1000 pmol/L ( Figure 4).
  • the MTS test shows similar results, namely no effect of PEG-AuNPs, and a decrease in mitochondrial activity from a treatment at 500 pmol/L of NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs ( Figure 5).
  • MiaPaCa-2 and F98 cells were treated for 72 hours with PEG-AuNPs or with NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs at 500 pmol/L.
  • Concerning the MiaPaCa-2 cells the nanoparticles without or with peptide enter the cells and mainly in the vacuoles. Some nanoparticles get trapped in spaces between cells.
  • cell viability is around 60% for 5 min of irradiation and around 45% for 10 min of irradiation after 24I1 of internalization. In addition, cell viability is about 40% for 5 min irradiation and about 30% for 10 min after 48I1 of internalization.
  • the inventors synthesized gold nanoparticles TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs and VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs according to the invention according to a procedure summarized above similar to the method described in Example 1 above.
  • the gold nanoparticles are prepared by reduction of chloroauric acid (HAUC1 4 , Sigma-Aldrich) at a concentration of 1 mmol/L.
  • the biotinylated TAT peptide (TAT.48-60 peptide; TAT-BIOTIN- peptide; BIOT-GRKKRRQRRRPPQ-CONH2; Millegen,ière, France) or the biotinylated VIM peptide (VIM-BIOTIN-peptide; BIOT -GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ-CONH2; Millegen,ière, France) is added. The solution is stirred vigorously for 10 min. The complexation of the peptide with the gold salts HAUC1 4 takes place by chelation.
  • PEG-COOH 600 Poly-Ethylene-Glycol dicarboxylic, Sigma-Aldrich
  • a reducing agent NaBH 4 (Sodium tetrahydruroborate, Sigma-Aldrich) is added, thus reducing the Au 3+ ions to neutral gold atoms (Au 0 ).
  • TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs and VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs nanoparticles is observed thanks to a color change of the solution from pale yellow to bright pink purple after the addition of the reducing agent.
  • the inventors evaluated the effect of gold nanoparticles TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs and VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs on a cancer cell line.
  • the F98 cell line a rat glioblastoma line, obtained from the American Tissue Culture Collection (ATCC) was used.
  • the cell line was cultured in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle's medium; Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS (F ⁇ tal Bovine Serum; Sigma-Aldrich), 1% antibiotics (penicillin at 50 IU/mL and streptomycin at 50 pg/mL) and L-glutamine (2 mmol/L).
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle's medium; Sigma-Aldrich
  • FBS Fe ⁇ tal Bovine Serum
  • antibiotics penicillin at 50 IU/mL and streptomycin at 50 pg/mL
  • L-glutamine 2 mmol/L
  • MTS cell viability assays (abi97010; Abeam, Paris, France) measuring the mitochondrial activity of cells were been made.
  • the F98 cells were seeded in 12-well plates at the rate of 100,000 cells per well and were incubated for 24 hours at 37° C. and at 5% CO2. Then, the PEG- nanoparticles AuNPs (at 500 pmol/L), VIM-BIOTIN-PEG-AuNP (at 250 pmol/L) or TAT-BIOTIN-AuNPs (at 250 ⁇ mol/L) were incubated with the cells for 24 or 72 hours. After incubation, the cells were washed with 0.1 mol/L phosphate buffer (pH 7.4) and were fixed overnight at 4°C, with a solution of 2.5% glutaraldehyde in 0.1 mol/L phosphate buffer (pH 7.4).
  • the cells were rinsed with 0.1 mol/L phosphate buffer.
  • Cells were then rinsed with distilled water and post-fixed in 1% osmium tetroxide solution for 1 hour. They were then rinsed 3 times for 5 min with water, and incubated for 15 min in 50° ethanol, 15 min in 70° ethanol, 15 min in 95° ethanol. and 3 times 30 min in 100° ethanol. Then, they were put in a mixture of 50% 100° ethanol/50% Epon resin (v/v) and incubated overnight. The following day, the remaining diluted Epon resin was removed and replaced by a pure Epon bath for 4 hours, then this Epon bath was replaced in turn by another pure Epon bath.
  • the plate with the cells in Epon was placed for 24 hours at 37°C, then 24 hours at 45°C and finally 72 hours at 60°C.
  • ultrathin sections 60 nm thick were made with a UC7 ultramicrotome (Leica, Wetzlar, Germany) and deposited on 150 Mesh copper grids. The sections were then contrasted with a solution of 3% uranyl acetate in 50° ethanol for 15 min and then rinsed with ultrapure water. The samples were then observed under a Jeol microscope (model JEM-1400 with an acceleration voltage of 120 kV; Japan) equipped with a model 832 Orius SC-1000 camera from Gatan.
  • F98 cells were treated with 1 pg/mL of colchicine or with 0, 50, 100, 250, 500 or 1000 pmol/L of PEG-AuNPs nanoparticles complexed or not with the VIM-BIOTIN peptide or the TAT-BIOTIN peptide for 24 or 72 hours. Similar to the experiments described in Example 2 above, colchicine was used as a positive control.
  • the MTS assay shows similar results for lower concentrations. Indeed, a significant decrease in mitochondrial activity is observed from a treatment with 1000 pmol/L of PEG-AuNPs, 250 pmol/L of TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs or 500 pmol/L of VIM -BIOTIN-PEG-AuNPs.
  • the strong induced toxicity is found for from 500 pmol/L of TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs and also manifests itself from 1000 pmol/L of VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs ( Figure 13).
  • the F98 cells were treated for 24 hours with the VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs or TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs nanoparticles at 250 pmol/L.
  • Transmission electron microscopy images depict F98 cells treated with PEG-AuNPs ( Figure 14), VIM-BIOTIN-PEG-AuNP ( Figure 15), or TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs ( Figure 16) nanoparticles.

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Abstract

La présente invention concerne une nanoparticule comprenant : - une association d'au moins un sel métallique et d'au moins un peptide; et - au moins un polymère biocompatible.

Description

NANOPARTICULES HYBRIDES
Domaine de l’invention
La présente invention concerne une nanoparticule et son utilisation à titre de médicament ou d’agent de diagnostic. La présente invention concerne également un procédé de préparation d’une nanoparticule.
Arrière-plan technique
Les nanoparticules hybrides combinant une partie métallique associée à un polymère biocompatible et à une molécule thérapeutique sont des nanomédicaments et des agents théranostiques prometteurs, notamment dans le cadre du traitement des cancers. Ces nanoparticules permettent à la fois de transporter les molécules thérapeutiques jusqu’aux cellules cibles et peuvent servir, grâce à leur partie métallique, d’agents photothermothérapeutiques et/ou de marqueurs d’imagerie in vivo.
Ainsi, Emami étal. (2019) Mol. Pharmaceutics 16: 1184-1199 décrivent l’utilisation de nanoparticules hybrides associant une nanoparticule d’or, un polymère biocompatible, le polyéthylène glycol (PEG), une molécule thérapeutique, la doxorubicine, et un anticorps anti- PD-Li, permettant de cibler les cellules de cancer colorectal qui sur-expriment PD-Li, pour détruire des cellules de la lignée cellulaire de cancer colorectal CT-26. Les auteurs montrent que ces nanoparticules facilitent l’entrée de la doxorubicine dans les cellules CT-26, puisque 66% des cellules subissent une apoptose, et que la combinaison du traitement à la doxorubicine et d’une irradiation dans le proche infrarouge abolit de manière significative et synergique la prolifération in vitro des cellules CT-26 en augmentant l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire. Toutefois, l’efficacité photothermo-thérapeutique de ces nanoparticules n’est pas optimale. En effet, ces mêmes nanoparticules sans doxorubicine ne provoquent la mort que d’environ 20% des cellules après irradiation dans le proche infrarouge. En outre, la combinaison de la doxorubicine et de l’irradiation dans le proche infrarouge ne permet de faire passer le taux de survie des cellules CT-26 que d’environ 20% à environ 10% par rapport au même traitement en l’absence d’irradiation.
De ce fait, tout le potentiel thérapeutique de ce type de nanoparticules hybrides n’est pas encore atteint et il serait donc utile de disposer de nanoparticules hybrides, susceptibles de délivrer des molécules thérapeutiques, ayant des propriétés photothermo-thérapeutiques améliorées.
Résumé de l’invention
La présente invention découle de la mise en évidence inattendue par les inventeurs que des nanoparticules hybrides obtenues par chélation d’acide chloraurique avec un peptide de pénétration cellulaire, en particulier l’un des peptides NFL, TAT ou VIM fonctionnalisé avec une biotine et avec du polyéthylène glycol à terminaison acide dicarboxylique (NFL-BIOTINE- PEG-AuNPs, TAT-BIOTINE-PEG-AuNPs, VIM-BIOTINE-PEG-AuNPs) présentent une grande stabilité et biocompatibilité et sont particulièrement adaptées pour le traitement du cancer.
Avantageusement, le procédé d’obtention des nanoparticules selon l’invention, en particulier des nanoparticules NFL-BIOTINE-PEG-AuNPs, TAT-BIOTINE-PEG-AuNPs, et VIM-BIOTINE-PEG-AuNPs, est un procédé simple comprenant peu d’étapes.
En effet, les inventeurs ont mis en évidence que les nanoparticules hybrides NFL- BIOTINE-PEG-AuNPs aux concentrations de 500 pmol/L et 1000 pmol/L entraînent une diminution significative de la viabilité cellulaire de cellules MiaPaCa-2 (lignée cellulaire cancéreuse du pancréas humain) et de cellules F98 (lignée de glioblastome de rat). Les nanoparticules hybrides NFL-BIOTINE-PEG-AuNPs à 100 pmol/L ont également pour effet une diminution significative de la viabilité cellulaire de cellules MiaPaCa-2 et de cellules F98 irradiées après l’administration des nanoparticules.
Les inventeurs ont également mis en évidence que les nanoparticules hybrides TAT- BIOTINE-PEG-AuNPs et VIM-BIOTINE-PEG-AuNPs entraînent une diminution significative de la viabilité cellulaire de cellules F98 (lignée de glioblastome de rat).
Ainsi, la présente invention concerne une nanoparticule comprenant : une association d’au moins un sel métallique et d’au moins un peptide ; et au moins un polymère biocompatible.
La présente invention concerne également une nanoparticule telle que définie ci-dessus pour une utilisation à titre de médicament et/ou d’agent de diagnostic.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus en tant que principe actif, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également une composition de diagnostic comprenant au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également un dispositif médical comprenant au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d’une nanoparticule comprenant : une association d’au moins un sel métallique et d’au moins un peptide ; et au moins un polymère biocompatible, comprenant : une étape dans laquelle le sel métallique est chélaté avec le peptide ; une étape de mélange avec le polymère biocompatible ; et une étape de réduction du mélange par un agent réducteur.
Description détaillée de l’invention
Comme on l’entend ici, le terme « comprenant » est synonyme « d’incluant », « contenant » ou « englobant » c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » un ou plusieurs éléments, d’autres éléments que ceux mentionnés peuvent également être compris dans l’objet. A l’inverse, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » un ou plusieurs éléments, l’objet ne peut pas comprendre d’autres éléments que ceux mentionnés.
On entend par « biocompatible » au sens de l’invention la capacité d’un matériau à être compatible avec un milieu biologique, notamment un tissu ou un fluide d’un organisme vivant. Ainsi, un matériau biocompatible au sens de l’invention peut être utilisé dans une composition pharmaceutique, dans une composition de diagnostic, dans un dispositif médical, par exemple à des fins de diagnostic ou thérapeutique.
On entend par « biopolymère » ou « polymère naturel » au sens de l’invention un polymère qui peut être produit par un organisme vivant, tel que par exemple un animal, un végétal ou un champignon.
Sel métallique
On entend par sel métallique au sens de l’invention, les oxydes de métaux et les sels issus de l’action d’un acide sur un métal. De préférence, le sel métallique selon l’invention est issu de l’action d’un acide sur un métal.
De préférence également, le sel métallique selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué d’un sel de métal de transition, d’un sel de lanthanide, d’un sel de métal alcalino-terreux et des mélanges de ceux-ci.
Plus préférablement, le sel métallique selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué d’un sel d’or (Au), de Selenium (Se) de gadolinium (Gd), de cobalt (Co), d’europium (Eu), de terbium (Tb), de cérium (Ce), de manganèse (Mn), de fer (Fe), de zinc (Zn) et de cuivre (Cu).
De préférence, également le sel métallique selon l’invention est un sel métallique d’acide inorganique. A titre d’exemple de sel métallique d’acide inorganique selon l’invention, il est possible de citer les sulfates, les chlorures, les nitrates, les phosphates et les carbonates.
Plus préférablement, le sel métallique selon l’invention est l’acide chloraurique HAUC14.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le sel métallique selon l’invention n’est pas un sel de fer ou un oxyde de fer. Peptide
De préférence, le peptide selon l’invention est une séquence d’acides aminés isolée ne comprenant pas plus de too acides aminés. De préférence également, le peptide selon l’invention comprend entre 2 et too acides aminés, par exemple entre 2 et 90, entre 2 et 80, entre 2 et 70, entre 2 et 60, entre 2 et 50 et entre 2 et 40 acides aminés. De préférence, le peptide selon l’invention comprend au moins 2 acides aminés, par exemple au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9 et au moins 10 acides aminés. Plus préférablement, le peptide selon l’invention comprend entre 2 et 40 acides aminés par exemple, entre 10 et 40 acides aminés ou entre 10 et 30 acides aminés.
Le peptide selon l’invention peut être choisi parmi n’importe quel peptide biocompatible bien connu de l’homme du métier. De préférence, le peptide selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué d’un peptide chimérique, d’un peptide synthétique et d’un peptide dérivé d’une protéine.
De préférence, le peptide selon l’invention est un peptide capable de pénétrer dans les cellules, en particulier de pénétrer la membrane plasmique des cellules. Plus préférablement, le peptide selon l’invention est un peptide de pénétration cellulaire ou « cell penetrating peptide » (CPP).
De préférence également, le peptide selon l’invention est un peptide capable de traverser la barrière hématoencéphalique.
De préférence, le peptide selon l’invention est un peptide de pénétration cellulaire sélectionné dans le groupe constitué d’un peptide polycationique avec une séquence riche en résidus d'acides aminés chargés positivement comme par exemple la lysine ou l'arginine, d'un peptide amphiphile avec une séquence faisant alterner des résidus polaires électriquement chargés et des résidus apolaires hydrophobes et d’un peptide hydrophobe ne contenant que des résidus apolaires électriquement peu chargés ou hydrophobes.
De préférence, le peptide selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du peptide NFL ayant la séquence d’acides aminés suivante : YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO : 1), du peptide TAT ayant la séquence d’acides aminés suivante : GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO : 2), du peptide VIM ayant la séquence d’acides aminés suivante : GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO : 3), du peptide transportane ayant la séquence d’acides aminés suivante : GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO : 4), du peptide pénétratine ayant la séquence d’acides aminés suivante : RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO : 5), du peptide MAP ayant la séquence d’acides aminés suivante : KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO : 6), du peptide Pep-1 ayant la séquence d’acides aminés suivante : KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO : 7), du peptide Pept 1 ayant la séquence d’acides aminés suivante : PLILLRLLRGQF (SEQ ID NO : 8), du peptide Pept 2 ayant la séquence d’acides aminés suivante: PLIYLRLLRGQF (SEQ ID NO : 9), du peptide IW-14 ayant la séquence d’acides aminés suivante : KLWMRWYSPTTRRYG (SEQ ID NO : 10), du peptide Ig(v) ayant la séquence d’acides aminés suivante : MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV (SEQ ID NO : 11), du peptide pVEC ayant la séquence d’acides aminés suivante : LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO : 12), du peptide ppTG20 ayant la séquence d’acides aminés suivante : GLFRALLRLLRSLWRLLLRA (SEQ ID NO : 13), du peptide APP ayant la séquence d’acides aminés suivante : APP GLARALTRLLRQLTRQLTRA (SEQ ID NO : 14), du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante RLWMRWYSPRTRAYGC (SEQ ID NO : 15) ; du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante : WRWYCR (SEQ ID NO : 16), du peptide PepFect 14 ayant la séquence d’acides aminés suivante : stéaryl-AGYLLGKLL00LAAAAL00LL-NH2 (SEQ ID NO : 17), du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante : GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO : 18), du peptide HRSV ayant la séquence d’acides aminés suivante : RRIPNRRPRR (SEQ ID NO : 19) ou d’un dérivé de ceux-ci.
Le peptide selon l’invention peut également être un peptide cyclique tel que par exemple le peptide RGD cyclique.
Plus préférablement, le peptide selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du peptide NFL ayant la séquence d’acides aminés suivante : YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO : 1), du peptide TAT ayant la séquence d’acides aminés suivante : GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO : 2), du peptide VIM ayant la séquence d’acides aminés suivante : GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO : 3) ou d’un dérivé de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation de l’invention, le peptide selon l’invention n’est pas un peptide ciblant le récepteur EGFR, en particulier un peptide d'acide -lysine-azidoacétique, ou un peptide ciblant les os.
On entend par dérivé peptidique au sens de l’invention les variants et fragments du peptide auquel ils se réfèrent. De préférence, les dérivés, en particulier les variants ou fragments, du peptide selon l’invention sont biologiquement actifs.
On attend par dérivé biologiquement actif du peptide selon l’invention les variants et fragments conservant l’activité biologique et la spécificité du peptide parent.
Le variant du peptide selon l’invention peut être choisi parmi n’importe quel variant bien connu de l’homme du métier. A titre d’exemple de variant selon l’invention, il est possible de citer un variant allélique du peptide, et un variant peptidomimétique du peptide.
Un variant allélique du peptide selon l’invention a la même séquence d'acides aminés que le peptide selon l’invention, en particulier que SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO =7, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :1O, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, ou SEQ ID NO : 19 sauf qu’un ou plusieurs acides aminés ont été remplacés par d'autres acides aminés ou supprimés, le peptide final conservant la spécificité du peptide parent.
De préférence, le peptide selon l’invention possède au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide parent, en particulier par rapport à SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO =7, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :1O, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18 ou SEQ ID NO : 19.
De préférence également, le variant selon l’invention a le même nombre d’acides aminés que le peptide dont il dérive.
Le pourcentage d’identité entre deux séquences peptidiques est bien connu de l’homme du métier. A titre d’exemple, le pourcentage d’identité entre deux séquences peptidiques peut être déterminé en effectuant un alignement de séquence sur toute la longueur des séquences similaires et en déterminant le nombre de positions pour lesquelles les acides aminés sont identiques dans chaque séquence et en divisant ce nombre par le nombre total d'acides aminés de la séquence la plus longue.
Le variant peptidomimétique selon l’invention, est de préférence une molécule organique qui imite certaines propriétés du peptide parent. Les variants peptidomimétiques préférés selon l’invention sont obtenus par modification structurelle des peptides selon l'invention, par exemple en utilisant des acides aminés non naturels tel qu’un acide aminé D au lieu d'un acide aminé L, des contraintes conformationnelles, un remplacement isostérique, une cyclisation ou d'autres modifications.
A titre d’exemple d'autres modifications il est possible de citer, les modifications suivantes : remplacement d’une ou plusieurs liaisons amides par une liaison non-amide ; remplacement d’une ou plusieurs chaînes latérales d'acides aminés par une fraction chimique différente ; protection d’une ou plusieurs extrémités N-terminale, C-terminale ou chaîne latérale par un groupe protecteur ; introduction d’une double liaison ou d’un cycle dans la chaîne principale. Avantageusement, les modifications ont pour effet d’augmenter la rigidité, l’affinité de liaison, la résistance à la dégradation enzymatique, la biodisponibilité et plus généralement d’améliorer les propriétés pharmacocinétiques du peptide selon l’invention.
Ainsi, compte tenu des séquences peptidiques du peptide selon l’invention, l'homme du métier est en mesure de concevoir et de produire des variants peptidomimétiques ayant des caractéristiques biologiques similaires ou supérieures aux peptides selon l’invention, en particulier aux peptides de pénétration cellulaire, plus particulièrement aux peptides NFL, TAT et VIM selon l’invention.
Le peptide NFL, aussi nommé NFL-TBS40-63 ci-après, est un polypeptide de 24 acides aminés ayant la séquence suivante : YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO : 1). Ce peptide est bien connu de l’homme du métier et correspond au deuxième site de liaison à la tubuline de la sous-unité des neurofilaments légers (acides aminés 40 à 63 du site TBS de la protéine NFL).
Dans un mode de réalisation de l’invention, le peptide selon l’invention est un dérivé du peptide NFL, en particulier un variant ou un fragment de celui-ci. De préférence, les fragments et variants du peptide NFL sont biologiquement actifs.
De préférence, le fragment du peptide NFL selon l’invention comprend au moins 12 acides aminés successifs du peptide NFL parent, de préférence au moins 16, plus préférentiellement au moins 18 acides aminés.
De préférence, le variant selon l’invention comprend au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide NLF. A titre d’exemple de variant allélique du peptide NFL, il est possible de citer le motif TBS de la sous-unité légère du neurofilament de la caille, qui retient 20 sur 24 acides aminés du peptide NFL-TBS40-63.
Le peptide TAT, aussi nommé TAT48-60 ci-après, est un peptide de 13 acides aminés ayant la séquence suivante GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO : 2). Ce peptide bien connu de l’homme du métier correspond aux résidus 48 à 60 de la protéine TAT impliquée dans la réplication du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1).
Dans un mode de réalisation de l’invention le peptide selon l’invention est un dérivé du peptide TAT, en particulier un variant ou un fragment de celui-ci. De préférence, le dérivé du peptide TAT selon l’invention est biologiquement actif.
De préférence, le fragment du peptide TAT selon l’invention comprend au moins 5 acides aminés successifs du peptide parent TAT, de préférence au moins 6, au moins 7, au moins 8 acides aminés.
De préférence, le variant selon l’invention comprend au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide TAT.
Le peptide VIM est un peptide de 24 acides aminés ayant la séquence suivante : GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO : 3).
Dans un mode de réalisation de l’invention le peptide selon l’invention est un dérivé du peptide VIM, en particulier un variant ou un fragment de celui-ci. De préférence, le dérivé du peptide VIM selon l’invention est biologiquement actif.
De préférence, le fragment du peptide VIM selon l’invention comprend au moins 12 acides aminés successifs du peptide VIM parent, de préférence au moins 14, au moins 16 et plus préférentiellement au moins 18 acides aminés. De préférence, le variant du peptide VIM selon l’invention comprend au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide VIM.
Le peptide pénétratine est un fragment long de 16 résidus ayant la séquence d’acides aminés suivante : RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO : 5). Ce peptide bien connu de l’homme du métier est dérivé de l'homéodomaine du facteur de transcription de la drosophile Antennapedia.
Dans un mode de réalisation de l’invention le peptide selon l’invention est un dérivé du peptide pénétratine, en particulier un variant ou un fragment de celui-ci. De préférence, le dérivé du peptide pénétratine selon l’invention est biologiquement actif.
De préférence, le fragment du peptide pénétratine selon l’invention comprend au moins 5 acides aminés successifs du peptide parent pénétratine, de préférence au moins 6, au moins 7, au moins 8 acides aminés.
De préférence, le variant selon l’invention comprend au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide pénétratine.
Le peptide selon l’invention peut être préparé selon n’importe quelle technique bien connue de l’homme du métier, en particulier via une synthèse chimique.
Selon un mode de réalisation, le peptide tel que défini ci-dessus est couplé avec au moins un agent de couplage. Comme on l’entend ici, les expressions « agent de couplage » et « agent de conjugaison » sont interchangeables. Comme on l’entend ici, les termes « couplé », « conjugué », « fonctionnalisé » et « modifié » peuvent être utilisés de manière interchangeable.
L’agent de couplage selon l’invention, peut être choisi parmi n’importe quel agent de couplage bien connu de l’homme du métier.
De préférence, l’agent de couplage selon l’invention est non peptidique.
L’agent de couplage peut être bifonctionnel, de préférence hétérobifonctionnel, tel que l’ester de N-y-maléimidobutyryl-oxysuccinimide (GMBS) et le dérivé sulfo-GMBS, l’ester du m-maléimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimide (MBS) et le dérivé sulfo-MBS, le succinimidyl 4- (N-maléimidométhyl)cyclohexane-i-carboxylate (SMCC), le sulfo-succinimidyl 4-(N- maléimidométhyl)cyclohexane-i-carboxylate (sulfo-SMCC), un carbodiimide, le bisdiazonium-benzidine (BDB) ou le glutaraldéhyde, la biotine, la sulfo-NHS-bitoine ou un fluorophore, aussi connu sous le nom fluorochrome, tel que l’hydroxycoumarine, l’aminocoumarine, la méthoxycoumarine, Cascade Blue, Pacific Blue, Pacific Orange, Lucifer Yellow, NBD, RPhycoerythrin, PE-Cy5 conjugués, PE-Cy7 conjugués, Red 613, PerCP, TruRed, FluorX, fluorescéine, BODIPY-FL, TRITC, X-Rhodamine, Lissamine Rhodamine B, Texas Red, Allophycocyanine, APC-Cy7 conjugués, le 5-carboxytétraméthylrhodamine, le 5.6- carboxytétraméthylrhodamine, le 6-carboxytétraméthylrhodamine, le 5-carboxyfluorescéine, le 5,6-carboxyfluorescéine, le 6-carboxyfluorescéine, et le diméthylaminonaphthylpyridinium.
L’utilisation des agents de couplage est notamment décrite dans le chapitre “Production of Antisera Using Peptide Conjugates” de l’ouvrage de référence “The Protein Protocols Handbook” (2002) qui est incorporé ici par référence.
Lorsque le GMBS, le MBS, le SMCC ou le sulfo-SMCC sont utilisés, ils sont de préférence fixés sur une cystéine (C), qui si elle n’est pas présente dans la séquence du peptide, peut être ajoutée, notamment à son extrémité N-terminale ou C-terminale.
L’agent de couplage selon l’invention peut également être choisi parmi n’importe quel groupement fonctionnel bien connu de l’homme du métier pouvant se lier à un peptide. A titre d’exemple de groupement fonctionnel selon l’invention il est possible de citer le fluor, un groupe phosphate, un groupe acétyle, un groupe alkyl, un résidu d'acide glutamique, un groupe carboxyl, un résidu glycine, un groupe glycosyl, un groupe hydroxyle, un groupe amide et un groupe sulfate.
De préférence, l’agent de couplage selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué de la biotine et de la fluorescéine.
Dans un mode de réalisation, le peptide selon l’invention est fonctionnalisé par au moins une biotine, par exemple par une biotine, par deux biotines ou par trois biotines.
Dans un autre mode de réalisation, le peptide selon l’invention est fonctionnalisé par au moins une fluorescéine, par exemple par une fluorescéine, par deux fluorescéines, par trois fluorescéines.
Le peptide selon l’invention peut être modifié par tout procédé de couplage peptidique classique bien connu de l’homme du métier par exemple par voie chimique ou par voie enzymatique. A titre d’exemple de procédé de modification du peptide selon l’invention, il est possible de citer l’acétylation, l’alkylation, la biotinylation, la glutamylation, la glycylation, la glycosylation, l’hydroxylation, la phosphorylation, la sulfatation, l’amidation, la PEGylation.
De préférence, l’agent de couplage selon l’invention, en particulier la fluorescéine ou la biotine, est lié au peptide selon l’invention de manière covalente.
La fonctionnalisation du peptide selon l’invention par au moins un agent de couplage, en particulier une fluorescéine ou une biotine, peut être effectuée directement sur une amine primaire, une amine secondaire ou les deux.
Dans un mode de réalisation de l’invention, au moins agent de couplage, en particulier une fluorescéine ou une biotine, est lié à l’extrémité N-terminale ou à l’extrémité C-terminale du peptide selon l’invention.
Dans un mode de réalisation de l’invention, la fonctionnalisation du peptide par au moins un agent de couplage, en particulier une fluorescéine ou une biotine, est réalisée avec un intermédiaire bien connu de l’homme du métier sur les fonctions carboxyliques primaires ou secondaires ou les deux. A titre d’exemple d’intermédiaire de liaison, il est possible de citer un carbodiimide tel que le i-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide.
Polymère biocompatible
Le polymère biocompatible selon l’invention peut être un polymère naturel ou synthétique et peut être sélectionné parmi n’importe quel polymère biocompatible bien connu de l’homme du métier.
De préférence, le polymère biocompatible selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué des polymères biocompatibles synthétiques, des biopolymères et des polymères biocompatibles thermosensibles.
Plus préférablement, le polymère biocompatible selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du polyéthylène glycol (PEG), du polyéthylène glycol diacide (PEG- diacide), du polyéthylène glycol diamine (PEG-diamine), du collagène, de l’alginate, de l’élastine, de l’acide hyaluronique, de la cellulose, de la gélatine, de l’acide polylactique, de maltodextrine, d’un polymère de glucose, d’un polymère de lactose, du chitosan, du dextran, d’un polymère thermosensible, du poly(N-isopropylacrylamide), du poly[2- (diméthylamino)éthyl méthacrylate de méthyle] (pDMAEMA), de l'hydroxypropylcellulose , du poly(vinylcaprolactame) et du polyvinyle méthyl éther) ou d’une combinaison de ceux-ci.
Plus préférablement, le polymère biocompatible est le polyéthylène glycol dicarboxylique.
Nanoparticule
De préférence, la nanoparticule selon l’invention a un diamètre compris entre 5 nm et 500 nm, plus préférablement entre 5 nm et 200 nm par exemple entre 5 nm et 150 nm, entre 5 nm et 100 nm, entre 5 nm et 90 nm. Plus préférablement, la nanoparticule selon l’invention à un diamètre compris entre 20 nm et 200 nm, par exemple entre 20 nm et 150 nm, ou entre 20 nm et 100 nm.
De préférence, le peptide selon l’invention est à l’intérieur de la nanoparticule selon l’invention. Ainsi, avantageusement le peptide adopte une configuration stérique permettant de conserver et/ ou d’améliorer l’activité thérapeutique du peptide sans impacter la stabilité de la nanoparticule.
De préférence, le sel métallique est chélaté par le peptide selon l’invention.
De préférence, le sel métallique et le peptide sont encapsulés par le polymère.
De préférence, la nanoparticule selon l’invention est préparée selon le procédé comprenant les étapes suivantes : une étape dans laquelle le sel métallique est chélaté avec le peptide ; une étape de mélange avec le polymère biocompatible ; et une étape de réduction du mélange par un agent réducteur.
De préférence, l’étape dans laquelle le sel métallique est chélaté avec le peptide comprend la dissolution du sel métallique, de préférence dans une solution aqueuse, et l’ajout du peptide dans la solution de sel métallique.
Avantageusement, le polymère biocompatible est utilisé comme agent stabilisant.
De préférence, le procédé de préparation de la nanoparticule selon l’invention est réalisé en l’absence de tensioactif autre que le polymère biocompatible et en l’absence de liant chimique.
De préférence, l’agent réducteur selon l’invention peut être n’importe quel agent réducteur bien connu de l’homme du métier. A titre d’exemple d’agent réducteur selon l’invention il est possible de citer LiAlHq, NaBHq, NaHg, B2H6, SO2. De préférence, l’agent réducteur selon l’invention est NaBHq.
Le procédé de préparation de la nanoparticule selon l’invention peut également comprendre une étape de centrifugation de la solution de nanoparticule, de préférence après l’étape de réduction, afin d’éliminer l’excès de polymère biocompatible.
Avantageusement, la nanoparticule selon l’invention est stable. De préférence, la nanoparticule selon l’invention est stable et son activité biologique, en particulier les propriétés de ciblage et d'internalisation cellulaire du peptide, est maintenue pendant au moins 2 mois, 4 mois, 6 mois, 8 mois, 10 mois, 12 mois, 14 mois, 16 mois, 18 mois, 20 mois, 22 mois, ou 24 mois.
Utilisation
Les nanoparticules selon l’invention sont particulièrement adaptées à une utilisation à titre de médicament et/ou d’agent de diagnostic chez un individu.
Les nanoparticules selon l’invention sont particulièrement adaptées à une utilisation à titre d’agent théranostique.
Les nanoparticules selon l’invention sont également particulièrement adaptées à une utilisation dans un dispositif médical destiné à être utilisé chez un individu.
Ainsi, un mode de réalisation de la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoparticule selon l’invention en tant que principe actif, éventuellement en association avec un véhicule ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une nanoparticule selon l’invention pour la fabrication d’un médicament, en particulier un médicament pour la prévention ou le traitement du cancer, notamment pour la prévention ou le traitement du glioblastome ou du cancer du pancréas.
La présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une nanoparticule selon l’invention pour le ciblage, la détection et la destruction des cellules cancéreuses. La présente invention concerne également une méthode de traitement du cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas, chez un individu comprenant l’administration à l’individu d’une quantité efficace d’au moins une nanoparticule ou d’une composition pharmaceutique ou d’un médicament selon l’invention.
La présente invention concerne également une composition de diagnostic comprenant au moins une nanoparticule selon l’invention en tant que principe actif, éventuellement en association avec un véhicule ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Le dispositif médical selon l’invention comprend de préférence au moins une nanoparticule selon l’invention. De préférence, le dispositif médical selon l’invention est utilisé pour le diagnostic, la prévention ou le traitement du cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas. Le dispositif médical selon l’invention peut être choisi parmi n’importe quel dispositif médical bien connu de l’homme du métier. De préférence, le dispositif médical selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué d’un dispositif d’imagerie médicale ou d’un dispositif implantable tel qu’un implant, un stent, un cathéter. Par dispositif implantable, on entend tout appareil destiné à être introduit totalement ou partiellement, par une intervention médicale, dans le corps humain ou animal.
Selon un mode de réalisation de l’invention la nanoparticule, la composition pharmaceutique, le médicament ou le dispositif médical selon l’invention est utilisé pour la prévention ou le traitement du cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas.
Selon un mode de réalisation de l’invention la nanoparticule, la composition de diagnostic ou le dispositif médical selon l’invention est utilisé pour la détection de cellules cancéreuses ou de tumeurs, pour le diagnostic d’un cancer, pour le suivi de l’évolution d’un cancer et/ou pour le suivi d’un traitement thérapeutique du cancer.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la nanoparticule, la composition pharmaceutique, la composition de diagnostic, le médicament, ou le dispositif médical est utilisé comme agent de contraste pour l’imagerie de diagnostic telle que la radiographie, l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la spectroscopie Raman, l'imagerie optique, la tomographie par cohérence optique, les rayons X, la tomodensitométrie, la tomographie par émission de positons ou des combinaisons de celles-ci.
Un mode de réalisation de la présente invention concerne, la surveillance de l’administration de la nanoparticule, de sa biodistribution et sa biodisponibilité, de la composition pharmaceutique, du médicament, ou de la composition de diagnostic selon l’invention à un individu par un dispositif de diagnostic et le diagnostic de l’individu.
De préférence, les nanoparticules, le médicament la composition pharmaceutique ou de diagnostic, le dispositif médical selon l’invention sont utilisées dans au moins l’une des situations suivantes : diagnostiquer un cancer, en particulier le glioblastome ou le cancer du pancréas ; déterminer l’état ou l’évolution d’un cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas,
- traiter un cancer, en particulier le glioblastome ou le cancer du pancréas, effectuer le suivi d’un traitement thérapeutique d’un cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas.
Cancer
Le cancer prévenu ou traité selon l’invention peut être n’importe quel cancer connu de l’homme du métier.
Le cancer prévenu ou traité selon l’invention peut être au stade 1, stade 2, stade 3 ou stade 4.
De préférence, le cancer prévenu ou traité selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué des cancers du système nerveux central, du système endocrinien et du système digestif.
De préférence, le cancer prévenu ou traité selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du cancer de la thyroide, du cancer de la parathyroide, du cancer du thymus, du cancer de l’ovaire, du cancer des testicules, du cancer des îlots pancréatiques, du cancer de la vésicule biliaire, du cancer de l’estomac, du cancer de l’œsophage, du cancer du côlon, du glioblastome, du cancer du foie, du cancer du pancréas, du cancer du rectum, du cancer de l’intestin, du cancer de l’intestin grêle. Plus préférablement, le cancer prévenu ou traité selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du glioblastome et du cancer du pancréas.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la nanoparticule, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical selon l’invention est particulièrement adapté pour une utilisation en thérapie photothermique, en particulier, pour le traitement du cancer par photothermie.
La photothermie est une méthode de traitement de cancer bien connue de l’homme du métier. De préférence, la nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique ou le médicament selon l’invention est injecté dans la circulation sanguine de l’individu, de préférence par injection intraveineuse. La nanoparticule pénètre ensuite dans la tumeur ou les cellules cancéreuses à traiter qui sont exposées à des rayonnements infra-rouges entraînant leur destruction.
Composition pharmaceutique
Comme on l’entend ici, le « véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable » se réfère à tout matériau approprié pour une utilisation dans une composition pharmaceutique. De préférence, le véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable selon l'invention convient à une utilisation avec des nanoparticules selon l’invention, de préférence sous forme de liquide.
De préférence, le véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable selon l’invention est adapté à une administration par voie orale, parentérale, intradermique, intraveineuse, artérielle, intramusculaire, nasale, rectale ou sous-cutanée.
De préférence, le véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable selon l’invention, comprend mais n'est pas limité à tout véhicule ou excipient standard bien connu de l'homme du métier tel que l'eau, la glycérine, l'alcool, une émulsion d'huile, une émulsion d'eau, du sérum physiologique, une solution tampon, un conservateur, un stabilisant etc.
Individu
De préférence, l’individu selon l’invention est un animal, de préférence un mammifère, tel qu'un humain, un canin, en particulier un chien, un félin, en particulier un chat, un équin, un bovin, un porcin, un caprin, en particulier une chèvre ou un mouton, un camélidé, un rongeur en particulier une souris ou un rat. Plus préférablement l’individu selon l’invention est un humain.
De préférence, l’individu selon l’invention a un cancer, en particulier un cancer du système nerveux central, un cancer du système endocrinien et un cancer du système digestif.
Plus préférablement, l’individu selon l’invention souffre d’un glioblastome ou d’un cancer du pancréas.
De préférence également, l’individu selon l’invention est suspecté d’avoir un cancer, en particulier un glioblastome ou un cancer du pancréas.
Administration
De préférence, la nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, la composition de diagnostic, le médicament, ou le dispositif médical selon l’invention est administré en une quantité prophylactique ou thérapeutique efficace pour détecter, prévenir ou traiter un cancer tel que défini ci-dessus.
De préférence, la nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical selon l’invention peut être administré par voie orale, parentérale, intradermique, intraveineuse, artérielle, intramusculaire, nasale, rectale ou sous-cutanée.
La nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical peut être formulé sous la forme de suspension injectable, de gels, d’huile, de suppositoire, de capsule, etc... La nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical peut être administré à l’individu en une dose comprise entre 10 pmol/L et 2000 pmol/L, de préférence entre 50 pmol/L et 1500 pmol/L, plu préférablement entre 100 pmol/L et 1000 pmol/L, par exemple entre 200 pmol/L et 1000 pmol/L, entre 300 pmol/L et 1000 pmol/L entre 400 pmol/L et 1000 pmol/L, entre 500 pmol/L et 1000 pmol/L.
L’homme du métier est capable d’ajuster la dose de nanoparticule ou de composition pharmaceutique, de composition de diagnostic ou de médicament en fonction du poids de l’individu à traiter.
Composé additionnel
La nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical peut être administré avec un composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer.
La nanoparticule selon l’invention peut être utilisée comme transporteur d’un composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer. En particulier, la nanoparticule selon l’invention peut être utilisée pour délivrer un composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer de manière intracellulaire. Avantageusement, la nanoparticule selon l’invention peut être utilisée pour transporter une molécule thérapeutique jusqu’aux cellules cibles, en particulier jusqu’aux cellules cancéreuse de la tumeur à traiter.
Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un produit comprenant : au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus ; au moins un composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer, en particulier, le glioblastome et le cancer du pancréas comme produit de combinaison pour une utilisation, notamment simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour la prévention ou le traitement du cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas.
Comme on l’entend ici, « combiné » ou « en combinaison » signifie que la nanoparticule selon l’invention est administrée en même temps qu’un autre composé, soit ensemble, c’est-à-dire au même site d’administration, soit séparément ou à des moments différents, sous réserve que la période de temps pendant laquelle la nanoparticule selon l’invention exerce ses effets chez l’individu et la période de temps pendant laquelle le composé additionnel produit ses effets pharmacologiques chez l’individu se recoupent au moins partiellement.
Le composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer peut être n’importe quel composé bien connu de l’homme du métier. De préférence, le composé additionnel est sélectionné dans le groupe constitué par le cyclophosphamide, le docétaxel, la doxorubicine, l'épirubicine, le fluoro-uracile, le méthotrexate, le paclitaxel, l’everolimus, l’alectinib, le melphalan, le brigatinib, le nilutamide, l’acétate de cyprotérone, l’anastrozole, l’exemestane, le lomustine, le bosutinib, l’encorafenib, le cabozatinib, le vandénatib, le bicalutamide, l’etopositde, le chlorambucil, le cobimetinib, l’enzalutamide, l’idarubicie, le capécitabine, le tamoxifène, la déxaméthasone, le bisulfan, le lenvatinib, le gemcitabine, le 5-FU, l’irinotécan, le témozolomide, l’oxaliplatine, le nab- paclitaxel et des combinaison de ceux-ci. L’invention sera davantage explicitée de manière non limitative à l’aide des Figures et Exemples qui suivent.
Description des figures
Fig. 1
La figure 1 représente le spectre UV-visible de la synthèse de nanoparticule NFL-BIOTINE- PEG-AuNPs avec la longueur d’onde (nm) en fonction de l’absorbance (a.u).
Fig. 2
La figure 2 représente le spectre UV-visible de nanoparticule NFL-BIOTINE-PEG-AuNPs à To, et à To + 11 mois (Test 1 et Test 2).
Fig. 3
La figure 3 représente l’augmentation de température (en °C) de l’eau (H2O), d’une solution de peptide NFL fonctionnalisé avec une biotine (NFL-BIOT), d’une solution de complexe du sel d’or avec le peptide fonctionnalisé avec une biotine (AuNPs) et d’une solution de nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG- AuNPs en fonction du temps (en min).
Fig. 4
La figure 4 représente l’activité mitochondriale de cellules MiaPaCa-2, de cellules MiaPaCa-2 traitées avec de la colchicine, de cellules MiaPaCa-2 traitées pendant 24b avec 50, 100, 250, 500 et 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL- BIOTIN. L’activité mitochondriale est exprimée en % moyen par rapport à l’activité des cellules MiaPaCa-2 témoin.
Fig. 5
La figure 5 représente l’activité mitochondriale de cellules MiaPaCa-2, de cellules MiaPaCa-2 traitées avec de la colchicine, de cellules MiaPaCa-2 traitées pendant 72I1 avec 50, 100, 250, 500 et 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL- BIOTIN. L’activité mitochondriale est exprimée en % moyen par rapport à l’activité des cellules MiaPaCa-2 témoin.
Fig. 6
La figure 6 représente l’activité mitochondriale de cellules F98, de cellules F98 traitées avec de la colchicine, de cellules F98 traitées pendant 24I1 avec 50, 100, 250, 500 et 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL-BIOTIN. L’activité mitochondriale est exprimée en % moyen par rapport à l’activité des cellules F98 témoin. Fig. 7
La figure 7 représente l’activité mitochondriale de cellules F98, de cellules F98 traitées avec de la colchicine, de cellules F98 traitées pendant 72I1 avec 50, 100, 250, 500 et 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL-BIOTIN. L’activité mitochondriale est exprimée en % moyen par rapport à l’activité des cellules F98 témoin.
Fig. 8
La figure 8 représente la viabilité cellulaire des cellules MiaPaCa-2, traitées par le peptide seul (NFL-BIOT) à 0,1 pM, par la nanoparticule PEG-AuNP (AuNPs) à 100 pM et par la nanoparticule NFL-BIOTINE-Au-NPs à 100 pM, après irradiation et internalisation des nanoparticules pendant 24b. La viabilité cellulaire est exprimée en % par rapport à la viabilité cellulaire des cellules non traitées.
Fig. 9
La figure 9 représente la viabilité cellulaire des cellules MiaPaCa-2, traitées par le peptide seul (NFL-BIOT) à 0,1 pM, par la nanoparticule PEG-AuNP (AuNPs) à 100 pM et par la nanoparticule NFL-BIOTINE-Au-NPs à 100 pM, après irradiation et internalisation des nanoparticules pendant 48I1. La viabilité cellulaire est exprimée en % par rapport à la viabilité cellulaire des cellules non traitées.
Fig. 10
La figure 10 représente la viabilité cellulaire des cellules F98, traitées par le peptide seul (NFL- BIOT) à 0,1 pM, par la nanoparticule PEG-AuNP (AuNPs) à 100 pM et par la nanoparticule NFL-BIOTINE-Au-NPs à too pM, après irradiation et internalisation des nanoparticules pendant 24b. La viabilité cellulaire est exprimée en % par rapport à la viabilité cellulaire des cellules non traitées.
Fig. 11
La figure 11 représente la viabilité cellulaire des cellules F98, traitées par le peptide seul (NFL- BIOT) à 0,1 pM, par la nanoparticule PEG-AuNP (AuNPs) à 100 pM et par la nanoparticule NFL-BIOTINE-Au-NPs à too pM, après irradiation et internalisation des nanoparticules pendant 48b. La viabilité cellulaire est exprimée en % par rapport à la viabilité cellulaire des cellules non traitées.
Fig. 12
La figure 12 représente l’activité mitochondriale in vitro de cellules de glioblastome de rat (F98) (cells) comme témoin, de cellules F98 traitées avec de la colchicine (Col, 1 pg/mL) comme contrôle positif et de cellules F98 traitées pendant 24 heures avec des nanoparticules PEG-AuNPs, BIOT-TAT-PEGAuNPs et BIOT-VIM-PEG-AuNPs à différentes concentrations (o, 50, 100, 250, 500 or 1000 pmol/L). L’activité mitochondriale a été évaluée par le test MTS. Les expériences ont été réalisées au moins en triplicats. Le symbole # signifie aucune cellule présente à l'issue du traitement d’incubation. Les données représentent la moyenne ± erreur type par rapport à l’activité des cellules F98 témoins. L’analyse statistique a été réalisée avec le test t de Student (*p < 0.05 and ***p < 0.001).
Fig. 13
La figure 13 représente l’activité mitochondriale in vitro de cellules de glioblastome de rat (F98) comme témoin, de cellules F98 traitées avec de la colchicine (Col, 1 pg/mL) comme contrôle positif et de cellules F98 traitées pendant 72 heures avec des nanoparticules PEG- AuNPs, BIOT-TAT-PEGAuNPs et BIOT-VIM-PEG-AuNPs à différentes concentrations (o, 50, 100, 250, 500 or 1000 pmol/L). L’activité mitochondriale a été évaluée par le test MTS. Les expériences ont été réalisées au moins en triplicats. Le symbole # signifie aucune cellule présente à l'issue du traitement d’incubation. Les données représentent la moyenne ± erreur type par rapport à l’activité des cellules F98 témoins. L’analyse statistique a été réalisée avec le test t de Student (*p < 0.05 and ***p < 0.001).
Fig. 14
La figure 14 représente une image de microscopie électronique à transmission illustrant l’internalisation de nanoparticules d’or (PEG-AuNPs) dans des cellules de glioblastome de rat (F98). Les cellules F98 ont été traitées avec les nanoparticules à 250 pmol/L durant 24 heures. N pour noyau et V pour vacuoles. Barre d’échelle (à gauche) : 2 pm. Barre d’échelle (à droite) ; 50 nm.
Fig. 15
La figure 15 représente une image de microscopie électronique à transmission illustrant l’internalisation de nanoparticules d’or (PEG-AuNPs) couplées avec le peptide TAT-BIOTIN (BIOT-TAT-PEGAuNPs) dans des cellules de glioblastome de rat (F98). Les cellules F98 ont été traitées avec les nanoparticules à 250 pmol/L durant 24 heures. N pour noyau et V pour vacuoles. Barre d’échelle (à gauche) : 2 pm. Barre d’échelle (à droite) ; 50 nm.
Fig. 16
La figure 16 représente une image de microscopie électronique à transmission illustrant l’internalisation de nanoparticules d’or (PEG-AuNPs) couplées avec le peptide VIM-BIOTIN (BIOT-VIM-PEGAuNPs) dans des cellules de glioblastome de rat (F98). Les cellules F98 ont été traitées avec les nanoparticules à 250 umol/L durant 24 heures. N pour noyau et V pour vacuoles. Barre d’échelle (à gauche) : 2 pm. Barre d’échelle (à droite) ; 50 nm.
Fig. 17 La figure 17 représente le nombre moyen de vacuoles contenant plus de 20 nanoparticules d’or dans des cellules F98 incubées pendant 24 heures avec 250 pmol/L de nanoparticules PEG- AUNPs (barre noire), de nanoparticules BIOT-TAT-PEG-AUNPs (barre gris foncé), et de nanoparticules BIOT-VIM-PEG-AuNPs (barre gris clair). Le comptage des nanoparticules se fait manuellement sur les images de microscopie électronique.
Exemple 1
Les inventeurs ont synthétisé et caractérisé des nanoparticules d’or NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs selon l’invention selon le précédé ci-dessous.
A. Matériel et méthode
1.Préparation d’une nanoparticule NFL-Biotine-PEG-AuNP
Les nanoparticules d'or sont principalement préparées par réduction d'acide chloraurique (HAUC14, Sigma-Aldrich) à une concentration de 1 mmol/L.
Après dissolution du sel d'or, la solution est agitée vigoureusement, puis 0,08 mL de peptide NFL biotinylé (NFL-BIOTIN) à une concentration de 1 mg/ mL est ajouté. Le peptide NFL a été dilué préalablement dans de l’éthanol à 10 %. La complexation du peptide aux sels d’or HAUC14 se fait par chélation.
Puis, 250 pL d’un agent stabilisant, PEG-COOH 600 (Poly-Ethylène-Glycol dicarboxylique, Sigma-Aldrich) a été ajouté à température ambiante.
Pour finir, 1,2 mL à 3 mg/mL d'agent réducteur NaBH4(Sodium tétrahydruroborate, Sigma- Aldrich) est ajouté, réduisant ainsi les ions Au3+ en atomes d'or neutres (Au0).
La formation des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs est observée grâce à un changement de couleur de la solution passant du jaune pâle au violet rose vif après l'addition de l'agent réducteur.
Les produits de chaque étape de synthèse sont stockés à 27-29°C et caractérisés par spectroscopie UV-visible, spectroscopie Raman et microscopie électronique à transmission (MET).
La solution de NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs a été centrifugée à 10 000 tours/min 3 fois pendant 10 min, puis le surnageant a été éliminé. Le culot a été redispersé dans une quantité équivalente d'eau. Ceci a été répété deux fois pour éliminer l'excès de PEG dicarboxylique non conjugué au peptide NFL-BIOTIN.
2. Caractérisation des nanoparticules
2.1. Spectroscopie d'absorption UV-visible
Les mesures de spectroscopie d'absorption ont été réalisées avec un spectrophotomètre UV- visible (Uvikon 941 de Kontron instruments) piloté par le logiciel Thermalys Uvikon 900. Les spectres d'absorption ont été enregistrés dans le domaine spectral compris entre 200 et 900 nm. Les solutions ont été placées dans des cuves en quartz de 1 cm de trajet optique. 2.2. Spectroscopic Raman
Les spectres Raman ont été enregistrés en utilisant un microspectromètre Raman Xplora (Horiba Scientifics) et traités à l’aide du logiciel Labspec. Le spectromètre a été réglé avec un laser HeNe (Hélium-Néon) à 66o nm, une caméra CCD pour l’acquisition des données et un filtre optique réglé à too % pour une puissance du laser de 8 mW et un réseau de 6oo traits.
2.3. Mesures du potentiel zêta
Le potentiel zêta des NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs dispersés dans l'eau a été mesuré en utilisant le mode électrophorétique d'un Zetasizer NanoZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK).
2.4. La diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Light Scattering ou DLS)
Les diamètres hydrodynamiques moyens des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs dispersées dans de l’eau ont été caractérisés à l'aide d'une analyse de suivi des nanoparticules. Développé par NanoSight (Malvern Instruments Ltd), cet équipement utilise les propriétés de diffusion de la lumière et du mouvement brownien pour obtenir des distributions granulométriques d'échantillons en suspension liquide. La mesure a été réalisée au moyen d'un système NS500 équipé d'un laser 405 nm, avec la version 3.0. Six vidéos de soixante secondes ont été enregistrées à une concentration de nanoparticules suffisante pour obtenir un minimum de 200 pistes terminées par vidéo pour une signification statistique. Les données ont été enregistrées en mode ± écart type.
2.5. Microscopie électronique à transmission
Les nanoparticules d’or complexés ou non avec le peptide NFL-BIOTIN ont été observées par microscopie électronique à transmission. Pour cela, 2 pL d’échantillons ont été déposés sur des grilles de cuivre de 150 mailles, elles-mêmes recouvertes d’un film de Formvar pendant 1 min. Puis les grilles ont été contrastées avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 1 min. Les échantillons ont été observés avec un microscope Jeol (modèle JEM-1400 avec une tension d'accélération de 120 kV ; Japon) équipé d’une caméra modèle 832 Orius SC-1000 de la marque Gatan.
B. Résultats
1. Caractérisation UV-visible
La complexation d’HAuCl4 avec le peptide NFL-BIOTINa pu être observée avec une bande à 300 nm qui représente l’HAuCl4 et une bande à 280 nm représentant le peptide NFL-BIOTIN (voir la figure 1). Une bande UV-visible à 525 nm représentant la bande plasmon des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs a été observée. Ces résultats confirment la formation des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs. La bande 280 nm, représentant le contrôle du peptide est présente dans toutes les étapes de la synthèse ce qui confirme que le peptide est correctement greffé.
Les résultats de DLS et du potentiel zêta montrent que les nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG- AuNPs ont un diamètre d’environ 91 ± 2 nm et un potentiel zêta de -24 ± 1 mV.
2. Caractérisation par spectroscopie RAMAN
Le greffage réussi du peptide a également été démontré par spectroscopie Raman. Les spectres Raman du peptide NFL-BIOTIN libre (contrôle) présentent des bandes attribuées aux acides aminés qui composent le peptide (tyrosine). Une bande 1449 cm 1 représente le groupement CH2 de la biotine et une bande 1656 cm 1 est attribuée à l’amide I. Une large bande observée autour de 1600 cm 1 est attribuée à l'eau. Il a été observé qu’avec la formation des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs, on a une empreinte plus claire de la signature du peptide, en comparaison au complexe. Comme le prouve ces résultats, la formation de nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs est confirmée, puisque la formation de nanoparticules permet d’exalter le signal.
3. Observation des nanoparticules au microscope électronique à transmission
Les nanoparticules d’or pegylées (PEG-AuNPs) complexées ou non au peptide NFL-BIOTIN ont été observées au microscope électronique à transmission. Ces observations permettent de noter une différence au niveau de la forme des nanoparticules en absence ou en présence du peptide NFL-BIOTIN. Les nanoparticules PEG-AuNPs ont une forme ronde avec des tailles relativement homogènes.
Dès lors que ces mêmes particules sont complexées au peptide NFL-BIOTIN, différentes formes de particules (ronds, bâtonnets, hexagone) sont observées avec des tailles assez hétérogènes.
4. Stabilité
On constate que la couleur rouge-violet vive des nanoparticules et les spectres UV-visibles restent inchangés après stockage à température ambiante pendant 11 mois confirmant ainsi que la formation de la suspension de nanoparticules reste stable (voir la figure 2). Exemple 2
Les inventeurs ont évalué l’effet des nanoparticules d’or NFL-Biotin-PEG-AuNP sur deux lignée cellulaires cancéreuses.
A. Matériel et méthode
1. Lignées cellulaires utilisées
Deux lignées cellulaires obtenues auprès d’ American Tissue Culture Collection (ATCC) ont été utilisées pour cette étude :
- les cellules MiaPaCa-2, une lignée de cellules cancéreuses du pancréas humain, et
- les cellules F98, une lignée de glioblastome de rat.
Les deux lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium Gibco, Bio-Sciences Ltd, Ireland) supplémenté de 10% de FBS Fœtal Bovine Serum ; Sigma-Aldrich), d’1% d’antibiotiques (pénicilline à 50 UI/mL et streptomycine à 50 pg/mL) et de la L-glutamine (2 mmol/L).
2. Mesures de l’activité mitochondriale cellulaire
Pour étudier les effets des nanoparticules d’or complexées ou non avec le peptide NFL-BIOTIN sur la viabilité cellulaire, des tests de viabilité cellulaire MTS (abi97010; Abeam, Paris, France) mesurant l’activité mitochondriale des cellules ont été réalisés.
Ces tests ont été réalisés sur les deux types cellulaires. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 1000 ou 3000 cellules par puits (nombre de cellules variables en fonction de la durée du traitement) et ont été incubées pendant 24 heures à 37°C et à 5% de C02. Puis, les différents traitements ont été mis en contact avec les cellules : la colchicine (1 pg/mL, C9754; Sigma-Aldrich) ou des concentrations de nanoparticules d’or complexées ou non au peptide NFL-BIOTIN(entre 50 et 1000 pmol/L) pendant 24 ou 72 heures à 37°C et à 5% de C02. A la fin du traitement (24 ou 72 heures), 20 pL de réactif MTS ont été ajoutés dans chaque puits pendant 4 heures. L'absorbance à 490 nm a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre Spectra Max M2 (Molecular Devices, San José, Californie, USA). 3. Internalisation des nanoparticules observée par microscopie électronique à transmission
Les cellules (MiaPaCa-2 et F98) ont été ensemencées en plaques 6 puits à raison de 400000 cellules par puits et ont été incubées pendant 24 heures à 37°C et à 5% de C02. Ensuite, les nanoparticules à 100 ou à 500 pmol/L sans ou avec le peptide à 0,08 mmol/L ont été incubées avec les cellules pendant 24 ou 72 heures. Après l’incubation, les cellules ont été lavées avec du tampon phosphate à 0,1 mol/L (pH 7,4) et ont été fixées toute la nuit à 4°C, avec une solution de glutaraldéhyde 2,5 % dans du tampon phosphate à 0,1 mol/L (pH 7,4). Puis, les cellules ont été rincées avec du tampon phosphate 0,1 mol/L. Les cellules ont ensuite été rincées avec de l'eau distillée et post-fixées dans une solution de tétroxyde d'osmium 1% pendant 1 heure. Elles ont, par la suite, été rincées 3 fois 5 min avec de l'eau, et incubées 15 min dans de l'éthanol 50°, 15 min dans de l'éthanol 70°, 15 min dans de l'éthanol 950 et 3 fois 30 min dans de l'éthanol 100°. Ensuite, elles ont été mises dans un mélange 50% éthanol 1OO°/5O% résine Epon (volume/volume) et incubées toute la nuit. Le lendemain, la résine d'Epon diluée restant a été retirée et remplacée par un bain d'Epon pur pendant 4 heures, puis ce bain d'Epon a été remplacé à son tour par un autre bain d'Epon pur. La plaque avec les cellules dans l'Epon a été placée 24 heures à 37°C, puis 24 heures à 45°C et enfin 72 heures à 6o°C. Une fois la résine polymérisée à 6o°C, des coupes ultrafines de 60 nm d'épaisseur ont été réalisées avec un ultramicrotome UC7 (Leica, Wetzlar, Allemagne) et déposées sur des grilles de cuivre 150 Mesh. Les coupes ont ensuite été contrastées avec une solution d'acétate d'uranyle 3% dans de l’éthanol 50° pendant 15 min puis rincées avec de l'eau ultrapure. Les échantillons ont ensuite été observés au microscope Jeol (modèle JEM-1400 avec une tension d'accélération de 120 kV ; Japon) équipé d’une caméra modèle 832 Orius SC-1000 de la marque Gatan.
4. Photothermie sur les lignées cellulaires
Les cellules MiaPaCa-2 et F98 ont été ensemencées à une densité de 200000 cellules/mL dans des flacons de culture de 25 cm2 et ont été cultivées à 37°C et à 5% de C02. Les cellules ont, par la suite, été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 200 pL de cellules par puits, et laissées pendant 24 ou 48 heures. Ensuite, 50 pL de milieu par puits ont été retirés pour les remplacer par les solutions des nanoparticules qui ont été incubées pendant 24 heures. Le milieu a par la suite été retiré, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS (Phosphate Buffered Saline), pour enlever l’excès de nanoparticules non internalisées. Puis, le même volume de milieu par puits a été ajouté. Chaque puits de la plaque a été soumis à une source laser de 808 nm avec une puissance 0,5 W/cm2. Des expériences ont été faites en amont pour définir les paramètres optimaux, pour ne pas risquer d’avoir d’artefact dû au paramètre du laser. Les études ont été menées à deux temps : 5 et 10 min, pourvoir si le paramètre « temps » pouvait avoir un impact sur les résultats. Après avoir soumis les cellules aux radiations du laser proche infrarouge de 808 nm, le milieu a été changé et laissé pendant 24 heures, puis un test de viabilité cellulaire a été effectué pour vérifier que les nanoparticules avaient le même effet sur les cellules avant et après le traitement par irradiation. Pour réaliser la photothermie, 1 mL de la solution de nanoparticules a été déposée dans une cuve et à l’aide d’un laser infrarouge les nanoparticules ont été chauffées. Une sonde thermique permet alors de collecter l’élévation de température pendant 15 min.
B. Résultats
1. Photothermie des nanoparticules seules
Sur la figure 3, il est observé que la température augmente au-delà du seuil de 4°C. Les nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs sont donc de très bons candidats pour des tests de photothermie.
2. Impact des NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs sur des lignées cellulaires
2.1. Impact des nanoparticules sur l’activité mitochondriale
Pour évaluer l'activité mitochondriale, les deux lignées cellulaires ont été traitées avec 1 pg/mL de colchicine ou avec 0, 50, 100, 250, 500 ou 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL-BIOTIN pendant 24 ou 72 heures. L'action de la colchicine est d’interagir avec la tubuline et de perturber l'assemblage des microtubules (Bhattacharyya et al., 2008), ce qui provoque la mort cellulaire. La colchicine sert donc de contrôle positif.
Pour les cellules MiaPaCa-2 traitées pendant 24 heures le test MTS n’a montré aucun effet des PEG-AuNPs, cependant une diminution de l’activité mitochondriale a été observée à partir d’un traitement à 500 pmol/L de NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs, et une très forte diminution a été observé à la dose de 1000 pmol/L (figure 4).
Pour les cellules MiaPaCa-2 traitées pendant 72 heures, le test MTS montre des résultats similaires, à savoir pas d’effet des PEG-AuNPs, et une diminution de l’activité mitochondriale à partir d’un traitement à 500 pmol/L de NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs (figure 5).
Les mêmes tests ont été réalisés sur des cellules de glioblastome de rat, les F98. Des résultats similaires ont été observés, à savoir lors d’un traitement de 24 heures, pas d’effets des PEG- AuNPs sur l’activité mitochondriale et une réduction drastique de l’activité mitochondriale lorsque les cellules ont été traitées avec 1000 pmol/L de NFL-BIOTIN-PEG-Au-NPs (figure 6).
Lorsque les cellules F98 ont été traitées pendant 72 heures avec les nanoparticules, une réduction de l’activité mitochondriale avec les deux types de particules est observée à 1000 pmol/L (figure 7).
2.2. Internalisation cellulaire des nanoparticules
Les cellules MiaPaCa-2 et F98 ont été traitées pendant 72 heures avec les PEG-AuNPs ou avec les NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs à 500 pmol/L. Concernant les cellules MiaPaCa-2, les nanoparticules sans ou avec peptide entrent dans les cellules et majoritairement dans des vacuoles. Certaines nanoparticules se retrouvent piégées dans des espaces entre les cellules. Ces observations permettent également de retrouver les différentes formes de particules tout comme l’hétérogénéité des tailles de particules.
Les mêmes observations ont été faites avec les cellules F98.
2.3. Photothermie sur les lignées cellulaires de pancréas MiaPaCa-2 et de glioblastome F98 Sur les figures 8 à 11, on observe que le traitement par irradiation n’a aucun effet sur les cellules seules sans nanoparticules (contrôle, viabilité cellulaire à 100%). Avec le peptide un effet similaire avec ou sans irradiation a été observé quel que soit le temps d’internalisation. Pour les nanoparticules PEG-AuNPs sans peptide, une diminution de la viabilité cellulaire est observée, la viabilité cellulaire d’environ 60% par rapport à la viabilité cellulaire obtenu avec le contrôle après 24b et 48I1 d’internalisation. Pour les nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG- AuNPs, une diminution significative de la viabilité cellulaire est observée, la viabilité cellulaire est d’environ 60% pour 5 min d’irradiation et d’environ 45% pour 10 min d’irradiation après 24I1 d’internalisation. De plus, la viabilité cellulaire est d’environ 40 % pour une irradiation de 5 min et d’environ 30 % pour 10 min après 48I1 d’internalisation.
Exemple 3
Les inventeurs ont synthétisé des nanoparticules d’or TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs et VIM- BIOTIN-PEG-AuNPs selon l’invention selon un précédé résumé ci-dessus similaire au procédé décrit dans l’Exemple 1 précédent.
Les nanoparticules d'or sont préparées par réduction d'acide chloraurique (HAUC14, Sigma- Aldrich) à une concentration de 1 mmol/L.
Après dissolution du sel d'or le peptide TAT biotinylés (TAT.48-60 peptide ; TAT-BIOTIN- peptide ; BIOT-GRKKRRQRRRPPQ-CONH2 ; Millegen, Toulouse, France) ou le peptide VIM biotinylés (VIM-BIOTIN-peptide ; BIOT-GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ-CONH2 ; Millegen, Toulouse, France) est ajouté. La solution est agitée vigoureusement pendant 10 min. La complexation du peptide aux sels d’or HAUC14 se fait par chélation.
Un agent stabilisant, PEG-COOH 600 (Poly-Ethylène-Glycol dicarboxylique, Sigma-Aldrich) est ensuite ajouté à température ambiante.
Puis, un agent réducteur NaBH4 (Sodium tétrahydruroborate, Sigma-Aldrich) est ajouté, réduisant ainsi les ions Au3+ en atomes d'or neutres (Au0).
La formation des nanoparticules TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs et VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs est observée grâce à un changement de couleur de la solution passant du jaune pâle au violet rose vif après l'addition de l'agent réducteur.
Exemple 4
Les inventeurs ont évalué l’effet des nanoparticules d’or TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs et VIM- BIOTIN-PEG-AuNPs sur une lignée cellulaire cancéreuse.
A. Matériel et méthode
1. Lignée cellulaire utilisée
Pour cette étude, la lignée cellulaire F98, une lignée de glioblastome de rat, obtenue auprès d’ American Tissue Culture Collection (ATCC) a été utilisée.
La lignée cellulaire a été cultivée dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium ; Sigma-Aldrich) supplémenté de 10% de FBS (Fœtal Bovine Serum ; Sigma-Aldrich), d’1% d’antibiotiques (pénicilline à 50 UI/ mL et streptomycine à 50 pg/mL) et de la L-glutamine (2 mmol/L).
2. Mesures de l’activité mitochondriale cellulaire
Pour étudier les effets des nanoparticules d’or complexées ou non avec le peptide TAT-BIOTIN ou VIM-BIOTIN sur la viabilité cellulaire, des tests de viabilité cellulaire MTS (abi97010; Abeam, Paris, France) mesurant l’activité mitochondriale des cellules ont été réalisés.
Ces tests ont été réalisés sur les cellules de la lignée F98. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 1000 ou 3000 cellules par puits (nombre de cellules variables en fonction de la durée du traitement) et ont été incubées pendant 24 heures à 37°C et à 5% de CO2. Puis, les différents traitements ont été mis en contact avec les cellules : la colchicine (1 pg/mL, C9754 ; Sigma-Aldrich) ou des concentrations de nanoparticules d’or complexées ou non au peptide VIM-BIOTIN ou TAT-BIOTIN (entre 50 et 1000 pmol/L) pendant 24 ou 72 heures à 37°C et à 5% de CO2. A la fin du traitement (24 ou 72 heures), 20 pL de réactif MTS ont été ajoutés dans chaque puits pendant 4 heures. L’absorbance à 490 nm a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre Spectra Max M2 (Molecular Devices, San José, Californie, USA).
3. Internalisation des nanoparticules observée par microscopie électronique à transmission
Les cellules F98 ont été ensemencées en plaques 12 puits à raison de 100000 cellules par puits et ont été incubées pendant 24 heures à 37°C et à 5% de CO2. Ensuite, les nanoparticules PEG- AuNPs (à 500 pmol/L), VIM-BIOTIN-PEG-AuNP (à 250 pmol/L) ou TAT-BIOTIN-AuNPs (à 250 |umol/L) ont été incubées avec les cellules pendant 24 ou 72 heures. Après l’incubation, les cellules ont été lavées avec du tampon phosphate à 0,1 mol/L (pH 7,4) et ont été fixées toute la nuit à 4°C, avec une solution de glutaraldéhyde 2,5 % dans du tampon phosphate à 0,1 mol/L (pH 7,4). Puis, les cellules ont été rincées avec du tampon phosphate 0,1 mol/L. Les cellules ont ensuite été rincées avec de l'eau distillée et post-fixées dans une solution de tétroxyde d'osmium 1% pendant 1 heure. Elles ont, par la suite, été rincées 3 fois 5 min avec de l'eau, et incubées 15 min dans de l'éthanol 50°, 15 min dans de l'éthanol 70°, 15 min dans de l'éthanol 95° et 3 fois 30 min dans de l'éthanol ioo°. Ensuite, elles ont été mises dans un mélange 50% éthanol ioo°/5O% résine Epon (volume/volume) et incubées toute la nuit. Le lendemain, la résine d'Epon diluée restant a été retirée et remplacée par un bain d'Epon pur pendant 4 heures, puis ce bain d'Epon a été remplacé à son tour par un autre bain d'Epon pur. La plaque avec les cellules dans l'Epon a été placée 24 heures à 37°C, puis 24 heures à 45°C et enfin 72 heures à 6o°C. Une fois la résine polymérisée à 6o°C, des coupes ultrafines de 60 nm d'épaisseur ont été réalisées avec un ultramicrotome UC7 (Leica, Wetzlar, Allemagne) et déposées sur des grilles de cuivre 150 Mesh. Les coupes ont ensuite été contrastées avec une solution d'acétate d'uranyle 3% dans de l’éthanol 50° pendant 15 min puis rincées avec de l'eau ultrapure. Les échantillons ont ensuite été observés au microscope Jeol (modèle JEM-1400 avec une tension d'accélération de 120 kV ; Japon) équipé d’une caméra modèle 832 Orius SC- 1000 de la marque Gatan.
B. Résultats
1. Impact des nanoparticules sur l’activité mitochondriale
Pour évaluer l'activité mitochondriale, les cellules F98 ont été traitées avec 1 pg/mL de colchicine ou avec o, 50, 100, 250, 500 ou 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide VIM-BIOTIN ou le peptide TAT-BIOTIN pendant 24 ou 72 heures. De façon similaire aux expériences décrites dans l’exemple 2 ci-dessus, la colchicine a été employée comme contrôle positif.
Pour les cellules F98 traitées pendant 24 heures, le test MTS n’a montré aucun effet des PEG- AuNPs sur l’activité mitochondriale. En revanche, une diminution significative de l’activité mitochondriale a été observée à partir d’un traitement à 1000 pmol/L de VIM-BIOTIN-PEG- AuNPs, et une très forte toxicité a été observée pour les traitements à 500 pmol/L et 1000 pmol/L de TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs. En effet, pour ces deux concentrations de traitement avec les nanoparticules TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs, plus aucune cellule n’était encore viable après 24 heures (Figure 12).
Pour les cellules F98 traitées pendant 72 heures, le test MTS montre des résultats similaires pour des concentrations moindres. En effet, une diminution significative de l’activité mitochondriale est observée à partir d’un traitement à 1000 pmol/L de PEG-AuNPs, de 250 pmol/L de TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs ou de 500 pmol/L de VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs. En outre, la forte toxicité induite est retrouvée pour à partir de 500 pmol/L de TAT-BIOTIN-PEG- AuNPs et se manifeste également à partir de 1000 pmol/L de VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs (Figure 13).
Ni la fonction ni l’activité biologique des peptides VIM-BIOTIN et TAT-BIOTIN n’a pas été affectée par la combinaison avec les nanoparticules PEG-AuNPs.
2. Internalisation cellulaire des nanoparticules
Les cellules F98 ont été traitées pendant 24 heures avec les nanoparticules VIM-BIOTIN-PEG- AuNPs ou TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs à 250 pmol/L. Les images de microscopie électronique à transmission représentent les cellules F98 traitées avec des nanoparticules PEG-AuNPs (Figure 14), VIM-BIOTIN-PEG-AuNP (Figure 15) ou TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs (Figure 16).
Pour les cellules traitées avec les nanoparticules VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs ou TAT-BIOTIN- PEG-AuNPs, davantage de vacuoles ont été détectées. Les nanoparticules ont été quantifiées par comptage manuel (Figure 17). Il peut être observé que le nombre moyen de vacuoles contenant plus de 20 nanoparticules est plus élevée pour les nanoparticules VIM-BIOTIN - PEG-AuNPs et TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs en comparaison des nanoparticules PEG-AuNPs.

Claims

Revendications
1. Nanoparticule comprenant : une association d’au moins un sel métallique et d’au moins un peptide ; et au moins un polymère biocompatible.
2. Nanoparticule selon la revendication 1, dans laquelle le sel métallique est chélaté par le peptide.
3. Nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le sel métallique et le peptide sont encapsulés par le polymère.
4. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la nanoparticule a été réduite par un agent réducteur.
5. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le sel métallique est sélectionné dans le groupe constitué d’un sel d’or (Au), de Selenium (Se) de gadolinium (Gd), de cobalt (Co), d’europium (Eu), de terbium (Tb), de cérium (Ce), de manganèse (Mn), de fer (Fe), de zinc (Zn) et de cuivre (Cu).
6. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le sel métallique est l’acide chloraurique HAUC14.
7. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le peptide comprend de 2 à 40 acides aminés.
8. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle le peptide est sélectionné dans le groupe constitué peptide NFL ayant la séquence d’acides aminés suivante : YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS, du peptide TAT ayant la séquence d’acides aminés suivante : GRKKRRQRRRPPQ, du peptide VIM ayant la séquence d’acides aminés suivante : GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ, du peptide transportane ayant la séquence d’acides aminés suivante : GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL, du peptide pénétratine ayant la séquence d’acides aminés suivante : RQIKIWFQNRRMKWKK, du peptide MAP ayant la séquence d’acides aminés suivante : KLALKLALKALKAALKLA, du peptide Pep-1 ayant la séquence d’acides aminés suivante : KETWWETWWTEWSQPKKKRKV, du peptide Pept 1 ayant la séquence d’acides aminés suivante : PLILLRLLRGQF, du peptide Pept 2 ayant la séquence d’acides aminés suivante: PLIYLRLLRGQF, du peptide IW-14 ayant la séquence d’acides aminés suivante : KLWMRWYSPTTRRYG, du peptide Ig(v) ayant la séquence d’acides aminés suivante : MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV, du peptide pVEC ayant la séquence d’acides aminés suivante : LLIILRRRIRKQAHAHSK, du peptide ppTG20 ayant la séquence d’acides aminés suivante : GLFRALLRLLRSLWRLLLRA, du peptide APP ayant la séquence d’acides aminés suivante : APP GLARALTRLLRQLTRQLTRA, du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante RLWMRWYSPRTRAYGC ; du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante : WRWYCR, du peptide PepFect 14 ayant la séquence d’acides aminés suivante : stéaryl-AGYLLGKLL00LAAAAL00LL-NH2, du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante : GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL, du peptide HRSV ayant la séquence d’acides aminés suivante : RRIPNRRPRR et d’un dérivé de ceux-ci.
9. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle le peptide est sélectionné dans le groupe constitué du peptide NFL ayant la séquence d’acides aminés suivante : YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS, du peptide TAT ayant la séquence d’acides aminés suivante : GRKKRRQRRRPPQ ou du peptide VIM ayant la séquence d’acides aminés suivante : GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ.
10. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle le polymère biocompatible est un polymère thermosensible.
11. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle le polymère biocompatible est sélectionné dans le groupe constitué du polyéthylène glycol, du polyéthylène glycol diacide, du polyéthylène glycol diamine, du collagène, de l’alginate, du chitosan, du dextran , du poly(N-isopropylacrylamide), du poly[2-(diméthylamino)éthyl méthacrylate de méthyle] (pDMAEMA), de l'hydroxypropylcellulose, du poly(vinylcaprolactame), du polyvinyle méthyl éther) et des combinaisons de ceux-ci.
12. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle le polymère biocompatible est le polyéthylène glycol dicarboxylique.
13. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, ayant un diamètre compris entre 20 et 200 nm.
14. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, pour une utilisation à titre de médicament et/ou d’agent de diagnostic.
15. Nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d’un glioblastome ou d’un cancer du pancréas.
16. Composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 13 en tant que principe actif, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Composition de diagnostic comprenant au moins une nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 13.
18. Dispositif médical comprenant au moins une nanoparticule selon l’une quelconque des revendications 1 à 13.
19. Procédé de préparation d’une nanoparticule telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant : une association d’au moins un sel métallique et d’au moins un peptide; et au moins un polymère biocompatible, comprenant : une étape dans laquelle le sel métallique est chélaté avec le peptide ; une étape de mélange avec le polymère biocompatible ; et une étape de réduction du mélange par un agent réducteur.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu’il est réalisé en absence de tensioactif chimique autre que le polymère biocompatible et en absence de liant chimique.
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