EP4359434A1 - Nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de elk-1 par erk1/2 - Google Patents

Nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de elk-1 par erk1/2

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Publication number
EP4359434A1
EP4359434A1 EP22738610.9A EP22738610A EP4359434A1 EP 4359434 A1 EP4359434 A1 EP 4359434A1 EP 22738610 A EP22738610 A EP 22738610A EP 4359434 A1 EP4359434 A1 EP 4359434A1
Authority
EP
European Patent Office
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seq
elk
sequence
peptides
peptide according
Prior art date
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Pending
Application number
EP22738610.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jocelyne Caboche
Peter Vanhoutte
Fabrice Trovero
Mathieu BARRIER
Nicolas PIETRANCOSTA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Melkin Pharmaceuticals
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Ecole Normale Superieure de Paris
Original Assignee
Melkin Pharmaceuticals
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Ecole Normale Superieure de Paris
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Melkin Pharmaceuticals, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Sorbonne Universite, Ecole Normale Superieure de Paris filed Critical Melkin Pharmaceuticals
Publication of EP4359434A1 publication Critical patent/EP4359434A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11024—Mitogen-activated protein kinase (2.7.11.24), i.e. MAPK or MAPK2 or c-Jun N-terminal kinase
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional [2D] or three-dimensional [3D] molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G16B15/30—Drug targeting using structural data; Docking or binding prediction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention describes novel synthetic peptides which are inhibitors of Elk-1 phosphorylation by ERK1/2 kinases.
  • a pharmaceutical composition containing said peptides as well as their use as medicaments are also described.
  • a method for identifying and optimizing novel inhibitors of Elk-1 phosphorylation by ERK1/2 is also described.
  • MAP kinases for "Mitogen-Activated Protein kinase"
  • ERK1 and ERK2 ERK for "Extracellular signal-Regulated Kinase” are enzymes whose function is to add phosphate groups to target proteins in order to activate them. They are ubiquitous proteins involved in many cellular functions. They play an essential role in the transduction of intracellular signals. Their activation is done by extracellular signals which act on membrane receptors to induce the cascade activation of different intracytoplasmic actors, upstream of ERK1/2, in particular the Ras, Raf and MEK proteins; this is also referred to as the Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway.
  • ERK-like MAP kinases have many intracellular, membrane, cytoplasmic or nuclear substrates (Yang et al., Trends Pharmacol. Sci. 2019 Nov;40(ll):897-910) and it is amplitude and duration activations of the intracellular signal cascade which will direct ERK1/2 towards one of its substrates.
  • the Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway is activated in neurons by neurotransmitters, neuromodulators or neurotrophic factors.
  • G proteins monoamine receptors, or metabotropic glutamate for example
  • NMDA glutamate receptors to calcium inputs
  • tyrosine kinase activity to receptors with tyrosine kinase activity
  • BDNF neurotrophic factors
  • the ERK pathway controls neuronal differentiation and maturation during development. In the adult brain, it plays a key role in neuronal plasticity and learning and memory processes, particularly involved in cognition, learning by reward and mood.
  • Hyperactivity of the ERK pathway is observed in many neurodevelopmental diseases, including autistic disorders and Rasopathies: neurofibromatosis type 1, Noonan syndrome, capillary-arteriovenous malformation syndrome, Costello syndrome, cardio-facio-cutaneous syndrome and Legius syndrome.
  • Deregulations of the ERK pathway are also responsible for psychiatric illnesses such as addiction, depression, post-traumatic stress or anxiety and mood disorders.
  • ERK-like MAP kinase inhibitors have been developed. They generally target the Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 pathway upstream of ERK, which completely blocks its activity and its binding to its various substrates downstream. Examples include PD98059 (2'-amino-3'-methoxyflavone) and U0126 (1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene), Trametinib ( GSK1120212), Cobimetinib (GDC0973), Mirdametinib (PD0325901) or Selumetinib (AZD6244) which are specific inhibitors of MEKs.
  • PD98059 (2'-amino-3'-methoxyflavone)
  • U0126 (1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene
  • Trametinib G
  • EP1988167 the inventors have demonstrated synthetic peptides allowing the selective inhibition of the ERK-type MAP kinase pathway towards a given substrate.
  • the different substrates of ERK1/2 have consensus sequences called binding or docking sites, known to those skilled in the art, which allow the binding of ERK1/2 to its substrates. These sequences are known under the terms, DEF (or FXFP) and D (or DEJL) (see EP1988167).
  • the DEF binding domain (docking site for ERK FXFP) of specific substrates of ERK1/2 is responsible for the recruitment of ERK1/2 towards genes with immediate early expression (or immediate early gene) and transcription factors (see EP1988169).
  • This DEF binding domain can bind peptides having a consensus sequence FXFP or (F/Y)X(F/Y)P in which F denotes Phenylalanine (Phe) Y denotes Tyrosine (Tyr), P denotes Proline (Pro) and X any naturally occurring amino acid (Sharrocks et al., Trends Biochem Sci. 2000 Sep;25(9):448-53).
  • the DEF domain is specific for ERK1/2 substrates.
  • the DEJL domain (docking site for ERK and JNK LXL) is essential for the activation of different series of substrates, including RSK (for 90 kDA ribosomal S6 kinase) and phosphatases (MAP kinases Phosphatases or MPK). It is also the binding site for MEK1/2 which are located upstream of ERK1/2 in the intracellular signaling cascade. It should be noted that this site is not specific for ERK-type kinases, but also allows the binding and phosphorylation of substrates on MAPkinases of the JNK family and p38/MAPK.
  • MEK1/2 which are or have been studied during clinical trials Selumetinib, Refametinib, Cobimetinib, Trametinib (Samatar et al., Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):928-42).
  • MEK1/2 inhibitors have an overall effect on the inhibition of ERK1/2 and its substrates and thus have a pleiotropic, non-specific and deleterious effect.
  • Ongoing clinical trials show in particular that the side effects are numerous depending on the doses administered and that drug resistance sets in (Balagula et al., Invest. New Drugs, 2010; 29:1114-21).
  • Peptides containing the DEF (or FXFP) domain, and surrounding amino acids in the N- and C-terminal regions, of a specific substrate downstream of ERK inhibit the binding and subsequent phosphorylation of said substrate without impacting the other activities of ERK1/2 or the phosphorylation of other substrates. There are therefore much fewer side effects of this inhibition in the intracellular signal transduction ERK1/2.
  • Patents EP1988167 and EP2337576 describe the use of synthetic peptides of the TAT-DEF type as specific inhibitors of substrates downstream of ERK and in particular the use of a peptide of the TAT-DEF-Elk-1 type for the treatment of an anxiety and mood disorder; the Elk-1 protein being a transcription factor acting downstream of the ERK signaling pathway.
  • the present invention describes new peptides which are inhibitors of the phosphorylation of Elk-1 by ERK1/2 and which are derived from those described in EP1988167.
  • the inventors used 3D in silico modeling of the attachment pocket of the anchoring domain of ERK2 to substrates containing the DEF domain so as to be able to position known ligands, in particular the peptide TAT-DEF-Elk-1 according to the patent EP1988167 (in particular of SEQ ID No. 1) and to characterize their interaction with this fixation pocket.
  • This makes it possible to define the essential and non-essential positions in the binding of the TAT-DEF-Elk-1 peptide to the anchoring domain of ERK2 and to optimize potential inhibitors of the phosphorylation of Elk-1 by ERK1/2.
  • the term "docking method” or “docking method” refers to the method of calculating the preferred orientation of a molecule towards a second when they are linked to form a stable complex. Determining this preferred orientation serves to predict the strength of the bond between two molecules and possibly its effectiveness. Docking, binding, anchoring or mooring studies are therefore used to determine the affinity between the molecules studied and to quantify the consequences of the binding of a ligand to a receiver.
  • fixing method, anchoring method or mooring method can be used to refer to the docking method.
  • Fig. 1 describes the in silico modeling of the interaction between the DEF-Elk1 domain of MLK2001 and the binding pocket of the ERK2-DEF domain of the active kinase. This modeling allows the visualization of the amino acids essential to said interaction. The amino acids shown start at the first amino acid.
  • Fig. 2 describes the binding affinity of the MLK2001 peptide (50nM) towards active ERK2 by the surface plasmon resonance technique (biaccore).
  • biascore surface plasmon resonance technique
  • the recombinant ERK2 protein has been immobilized by an amine coupling and the MLK2001 peptide (analyte) is mobile.
  • a TAT-NR2B9c peptide was used as a negative control.
  • Fig. 3 describes the binding affinity of the MLK2001 peptide, of 3 peptides according to the invention (MLK2002, 2003 and 2004), and two control peptides: the TAT sequence alone, and a "Scramble" peptide (random) of the MLK2001 sequence , using the biacore technique.
  • the resonance signal represents the affinity of the analytes (peptides) towards the immobilized active ERK2 proteins.
  • the graph represents the profiles obtained at 50nM for each analyte. The higher the RU signal, the greater the affinity of the analyte for ERK2. Note that the RU signal for MLK2002 is 1.5 times larger than for MLK2001. [Fig 4] Fig. 4 offers a graph representing the dose-dependent binding of the MLK 2001 to 2004 peptides as well as the TAT and Scr control peptides.
  • Fig. 5 depicts the phosphorylation of Elk-1 and ERK by the MLK2001 peptide and the low dose modified MLK2002 peptide.
  • Fig. 6 describes the toxicity after 24 hours of treatment with the MLK2001 peptide and the MLK2002 peptide modified according to the present invention.
  • Fig. 7 illustrates the result of the implementation of the in silico screening method for the binding of small molecules to the binding site of the DEF-Elk-1 peptide within the anchoring domain of ERK2. Three important binding sites have been identified and separated.
  • Fig. 8 describes the binding kinetics, and the association/dissociation constants of the MLK2001, MLK2002, MLK2007 and MLK2008 peptides according to the invention.
  • Fig. 9 describes the binding kinetics, and the association/dissociation constants of the MLK2001, MLK2013 and MLK20019 peptides according to the invention.
  • Fig. 10 describes the Elk-1 phosphorylation by ERK of the peptides MLK2001, MLK2002, MLK2007, MLK2008 and MLK2019 according to the invention. The dosages tested are 5 and 10 ⁇ M in each case.
  • the docking experiments were carried out with the MLK2001 peptide of SEQ ID No. 1 as a ligand for the anchoring domain of ERK2.
  • the in silico modeling method made it possible to precisely study the interactions between MLK2001 of SEQ ID No. 1 and the DEF-Elk-1 ligand binding pocket. From this experience, new compounds were designed and synthesized. These are described in Table 1 below. Compared to MLK2001 of SEQ ID No. 1 they are either shortened, or stabilized, or both.
  • inhibitory peptides were designed as follows: they contain a sequence rich in basic amino acids of the HIV-TAT protein followed by two prolines (PP) and then by the DEF binding domain of Elk-1 comprising in particular the sequence FQFP consensus framed by amino acids.
  • amino acid amino acid or amino acid are equivalent and refer to the structural units of proteins and peptides. These are molecules organized around the same basic structure, a carbon atom, which bears the acid function -COOH, the basic amine function -NH 2 , a hydrogen atom -H and a radical -R of variable structure which distinguishes and characterizes the twenty amino acids found naturally in proteins.
  • the term "deletion" of an amino acid is understood in its primary sense, namely the fact of deleting an amino acid from the peptide sequence of interest. In general, an amino acid considered to be non-essential to the functionality of the peptide is deleted, which makes it possible to reduce the size of the peptide sequence and possibly to optimize the functionality of the peptide.
  • substitution means the replacement of one amino acid residue with another selected from the 20 natural standard amino acid residues, rare natural amino acid residues and amino acid residues unnatural.
  • substitution refers to the replacement of an amino acid residue by another chosen from the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C , F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S and T).
  • the substitution(s) may be conservative or non-conservative substitutions.
  • substitution refers to a substitution of one amino acid residue for another that has similar chemical or physical properties (size, charge or polarity).
  • racemization refers to a physical property which is the transformation of an optically active compound into a racemic form which is optically inactive; for amino acids it is the transition from one enantiomer or stereoisomer (optical isomers with opposite specific optical rotation) to another. This transformation has an impact on the structure and functionality of the peptides.
  • it is a racemization of type D (for dextrogyre) as opposed to L (for levogyre) because the amino acids in the natural state are of type L with the exception of glycine.
  • D-racemization of one or more amino acids makes the peptide more stable.
  • Table 1 Synthetic peptides derived from TAT-DEF-Elk-1
  • Table 1 we see the different modifications applied according to different criteria to the TAT-DEF-Elk-1 sequence of SEQ ID No. 1 according to the present invention.
  • the amino acids corresponding to the DEF-Elk-1 sequence are underlined and it is this sequence of SEQ ID No. 25 which is essentially modified as follows:
  • N-ter region is shortened in the sequence by 2 amino acids SP (see for example SEQ ID Nos. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 22, 23 and 24); and or
  • a type D racemization (or D racemization) is applied to one or more non-essential amino acids to stabilize each of these new peptides (see for example SEQ ID No. 2, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12 , 14, 16, 17, 18, 20, 22, 23 and 24) which is indicated by a bold lower case letter; and or
  • an acetyl group (Ac) is added at N-ter to protect the molecule (see for example SEQ ID Nos. 13 to 24).
  • the present invention provides new synthetic peptides which are inhibitory ligands of phosphorylation of the Elk-1 protein by ERK1/2.
  • the peptides detailed above include a cell penetration sequence of the HIV TAT type, but this sequence is purely functional and can be substituted by any sequence of equivalent function known to those skilled in the art, such as penetratin, a sequence of 7 to 11 arginine residues, an X7/11R type sequence of 7 to 25 amino acids comprising 7 to 11 arginine residues positioned randomly in said sequence, a sequence derived from DPVs (Diatos peptide vectors) or any other cell-penetrating sequence.
  • DEF-Elk-1 type peptides characterized in that the sequence of 19 amino acids DEF-Elk-1 (SEQ ID No. 25) located between positions 13 to 31 of SEQ ID No. 1 is modified on at least one position by deletion of at least one N-ter amino acid and/or racemization of at least one amino acid and/or substitution of one or two amino acids.
  • the new DEF-Elk-1 peptides are characterized in that the DEF-Elk-1 sequence is modified in at least two positions by deletion of at least one N-ter amino acid and/or racemization of at least one amino acid and/or substitution of one or two amino acids.
  • Said peptides are selected in particular from the peptides of SEQ ID No.
  • modification means the deletion of at least one N-ter amino acid and/or the D racemization of one or more amino acids, and/or the substitution of one or two amino acids; in addition the N-terminal region of SEQ ID No. 25 can be acetylated.
  • the present invention describes a DEF-Elk-1 peptide whose sequence of SEQ ID No. 25 is modified by deletion of at least one N-ter amino acid and/or racemization of at least one amino acid and/or substitution of one or two amino acids on a position of said SEQ ID No. 25.
  • the peptide of SEQ ID No. 25 is fused at N-ter to a sequence allowing cell penetration.
  • Said cell penetration sequence is selected from a cell penetration sequence of the HIV T AT type, penetratine, a sequence of 7 to 11 arginine residues, a sequence of the X7/11R type of 7 to 25 amino acids comprising 7 to 11 residues arginine positioned randomly in said sequence, a sequence derived from DPVs (Diatos peptide vectors) or any other cell-penetrating sequence.
  • said intracellular penetration sequence is HIV TAT and the new peptides according to the invention have a sequence selected from SEQ ID Nos. 2 to 24.
  • the new peptides according to the present invention are selected from the peptides of SEQ ID No. 2 to 24, preferentially from the peptides of SEQ ID No. 2, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 17, 19, 20 and 23.
  • the new peptides are preferentially selected from the peptides of SEQ ID No. 2 and No. 19.
  • the peptides according to the invention are characterized in that the DEF-Elk-1 sequence of SEQ ID No. 25 is shortened in the N-ter region.
  • the DEF-Elk-1 sequence of SEQ ID No. 25 is shortened by deletion of 1 to 2 amino acids, preferably 2 amino acids.
  • the peptides are selected in particular from the peptides of SEQ ID No. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 22, 23 and 24, more particularly from the peptides of SEQ ID Nos. 8, 11, 19, 20 and 23.
  • the substitution of one or two amino acids in the peptides according to the invention is carried out in the consensus sequence SSGS located in positions 11 to 14 of SEQ ID No. 25.
  • at least one serine amino acid (S/Ser) of the SSGS consensus sequence located in positions 11 to 14 of SEQ ID No. 25 is replaced by an amino acid asparagine (D/Asp).
  • the peptides according to the invention are in particular selected from the peptides of SEQ ID No. 3, 4, 6, 9, 10, 12, 15, 16, 18, 21, 22 and 24.
  • two amino acids S (Ser) of the SSGS consensus sequence located in positions 11 to 14 of SEQ ID No. 25 are replaced by two amino acids D (Asp), said residues being preferentially located in positions 12 and 14 of SEQ ID No. 25.
  • a type D racemization is applied to at least one amino acid located at any one of positions 6, 8, 11 and 16 of SEQ ID No. 25.
  • a type D racemization is applied to the amino acids located in positions 6, 11, and 16 of SEQ ID No. 25; in this embodiment, the peptides according to the invention are in particular selected from the peptides of SEQ ID Nos. 2, 4, 14 and 16.
  • a type D racemization is applied to the amino acids located in positions 6 , 8, 11 and 16 of SEQ ID No. 25; in this embodiment, the peptides according to the invention are in particular selected from the peptides of SEQ ID No. 5, 6, 17, 18, 23 and 24.
  • the peptides according to the invention can be selected from the peptides of SEQ ID No. 2, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 23 and 24, more particularly among the peptides of SEQ ID No. 2,
  • the N-ter region is additionally acetylated.
  • the peptides according to the invention are in particular selected from the peptides of SEQ ID Nos. 13 to 24, more particularly from the peptides of SEQ ID Nos. 13, 14, 17, 19, 20 and 23.
  • the peptides according to the invention correspond to SEQ ID Nos. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 22, 23 and 24, preferentially among the peptides of SEQ ID N°7, 8, 11, 19, 20 and 23.
  • the peptides according to the invention correspond to SEQ ID N°2, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 17 , 19, 20 and 23.
  • the present invention describes new DEF-Elk-1 peptides characterized in that the DEF-Elk-1 sequence of SEQ ID No. 25 is modified by deletion of at least one amino acid at Nter and/or racemization of at least one amino acid and/or substitution of one or two amino acids, preferably 2, in which: the sequence is shortened to N-ter by deletion of 1 to 2 amino acids; and/or a type D racemization is applied to one or more amino acids located in position 6, 8, 11 and 16 of SEQ ID No. 25, preferential over F any of positions 6, 11 and 16 of SEQ ID N °25; and/or the DEF-Elk-1 sequence of SEQ ID No. 25 is fused at N-ter to a sequence allowing intracellular penetration; and/or the N-ter region of SEQ ID No. 25 fused to an intracellular penetration sequence is acetylated.
  • the new peptide according to the invention has a sequence selected from SEQ ID No. 2 to 24, preferably from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 19.
  • the invention describes a method for identifying novel inhibitors of Elk-1 phosphorylation by ERK1/2.
  • This method of identification includes the following steps: a. develop a 3D model of the anchoring domain of ERK2 to substrates containing a DEF site, based on the crystal structure of the ERK2 AMP-PNP complex (pdb code 4S32) as a receptor; b. model in 3D the binding of a peptide known as a ligand of this domain to bind to the binding site of the active ERK2 kinase; vs. perform a protein-ligand docking study using the LibDock algorithm; d.
  • this method for identifying molecules capable of binding to the DEF domain of ERK2 towards Elk-1 in a manner similar to the peptides detailed above, comprises the following steps: a. use the 3D model of the DEF domain of ERK2 towards Elk-1 based on the crystal structure of the ERK2 AMP-PNP complex as a receptor; b.
  • the present invention also describes a method for identifying small peptidomimetic molecules of the new peptides according to the invention, therefore capable of binding very precisely in the binding pocket of the DEF-Elk-1 type ligands towards ERK2 and thus of inhibit the phosphorylation of Elk-1 by ERK1/2.
  • peptidomimetic molecules or peptidomimetic ligands we mean small molecules, which mimic the activity of active peptides. In research on peptidomimetic molecules the goal is to identify small molecules that have a very specific effect on the identified target with minimal or no side effects.
  • the peptidomimetic molecules are ligands of the binding pocket of the DEF domain of ERK2 towards the peptide DEF-Elk-1 and capable of inhibiting the phosphorylation of Elk-1 by ERK1/2.
  • This method for identifying small peptidomimetic molecules includes the following steps: a. using the 3D model of the DEF domain of ERK2 towards Elk-1 based on the crystal structure of the ERK2 AMP-PNP complex (pdb code 4S32) described above, as a receptor; b. carry out in silico a high-throughput screen of different small molecules capable of binding to the binding pocket of the DEF domain of ERK2 towards Elk-1; vs. synthesizing said molecules having good binding affinity in silico; d. test the affinity of the molecules selected in the screen for their binding affinity towards ERK2. e. testing the biological activity and/or the properties of the molecule or molecules selected in d. and synthesized in c.
  • the present invention describes a method for identifying peptides that inhibit the binding of Elk-1 to the anchoring domain of ERK2 and its phosphorylation, but also a method for identifying small molecules of a non-peptide nature that also exhibit an activity that inhibits the binding of Elk-1 to the anchoring domain of ERK1/2.
  • These molecules or peptidomimetics are inhibitors of the phosphorylation of Elk-1 by ERK1/2.
  • the present invention describes a method for identifying small molecules strongly interacting with the binding site of the DEF-Elk-1 peptide towards ERK2, as well as small molecules strongly interacting with the binding site of the DEF-Elk-1 peptide.
  • Elk-1 towards ERK2 which are selected from molecules of the beta-lactam, 2-piperacetazine, levocabastine, prostaglandin E1 type and their analogues.
  • the invention describes a novel peptide inhibitor of Elk-1 phosphorylation by ERK1/2 for medical use.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing a therapeutically active dose of at least one peptide according to the present invention.
  • This pharmaceutical composition comprises a peptide according to the invention, a nucleic acid sequence coding for a peptide according to the invention, a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell comprising the nucleic acid sequence or the vector and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a "pharmaceutical composition” means a preparation of one or more of the active agents together with other optional chemical components such as physiologically appropriate carriers and/or excipients.
  • the purpose of a pharmaceutical composition is to facilitate the administration of the active agent to an organism.
  • the compositions of the present invention may be presented in a form suitable for any conventional route of administration or use.
  • the pharmaceutical composition according to the invention encompasses the pharmaceutical compositions used in human medicine and the pharmaceutical compositions used in animal medicine, that is to say the compositions veterinarians.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the new peptides according to the invention interacting with the binding site of the DEF-Elk-1 peptide towards ERK2 are used for the treatment of cancer, anxiety and mood disorders and in particular resistant depressions, addictions, Down syndrome, Alzheimer's disease, lupus erythematosus and proximal spinal muscular atrophy.
  • the small molecules strongly interacting with the binding site of the DEF-Elk-1 peptide towards ERK2 are used for the treatment of cancer, anxiety and mood disorders and in particular resistant depressions , addictions, Down syndrome, Alzheimer's disease, lupus erythematosus and proximal spinal muscular atrophy.
  • the pathologies and/or conditions likely to be treated by the new peptides of the present invention are cancers (breast, bladder, prostate, ovary, glioblastoma, leukemia, etc.), anxiety and mood disorders , addictions, Down syndrome, Alzheimer's disease, lupus erythematosus and proximal spinal muscular atrophy. Numerous studies highlight the link between these pathologies and/or conditions and the phosphorylation of Elk-1 by ERK1/2.
  • Mood disorder we mean a disturbance in the emotional state and well-being of an individual over an extended period of their life.
  • Mood disorders include, but are not limited to, major depression (unipolar disorder), typical or melancholic and atypical depression, pre and postpartum depression, mania, dysphoria, bipolar disorder, dysthymias, cyclothymias, psychotic depression, depressed personality disorder, seasonal affective disorder and many others as defined by the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSMV).
  • anxiety disorder we mean an unpleasant emotional state, which includes the psychophysiological responses in anticipation of an unreal or imagined danger and the ostensibility resulting from an unrecognized intrapsychic conflict.
  • Concomitant physiological effects include increased heart rate, impaired breathing, sweating, tremors, weakness and fatigue.
  • Psychological concomitants include the feeling of imminent danger, a feeling of helplessness, apprehension and tension.
  • Anxiety disorders include, but are not limited to, panic disorder, Obsessive Compulsive Disorder, Post Traumatic Stress Disorder (PTSD), Social Phobias, Social Anxiety Disorder, Specific Phobias, Generalized Anxiety Disorder.
  • addictions we mean cerebral pathologies defined by a dependency on a substance or an activity, with deleterious consequences.
  • the most frequent addictions are linked to the repeated consumption of psychoactive substances such as tobacco, alcohol, drugs, psychotropic drugs, etc. or the excessive practice of a behavior (games, social networks, sport, etc.) which leads to a loss of control of the level of consumption and/or practice, a modification of the emotional balance, disturbances of order medical condition and disruption of personal, professional and social life.
  • the invention describes a new peptide inhibitor of phosphorylation of Elk-1 by ERK1/2 for the treatment of anxiety and mood disorders and in particular resistant depression.
  • the invention describes a method for administering a therapeutically active dose of at least one peptide according to the invention.
  • therapeutically active dose defines the minimum amount of the peptide according to the invention to produce a therapeutic benefit to a patient in need thereof. It is an amount of the active ingredient that induces, ameliorates, or causes an amelioration of disease symptoms, disease progression, or disease-associated physical conditions affecting the patient.
  • the present invention more particularly describes the use of a new peptide according to the invention for the treatment and/or prevention of cancers, mood and anxiety disorders, addictions, Down syndrome, Alzheimer's disease, lupus erythematosus and proximal spinal muscular atrophy.
  • treatment refers to the reversal, alleviation or inhibition of one or more symptoms associated with these disorders.
  • prevention refers to the prevention of one or more symptoms associated with these disorders.
  • the present invention also describes a method for treating depressions resistant to conventional antidepressant treatments comprising the administration of a pharmaceutical composition containing a sufficient dose of a peptide according to the invention, to allow inhibition of Elk-1 phosphorylation by ERK1/2, alone or in combination with conventional antidepressants.
  • Major Depressive Disorder or “Unipolar Disorder” refers to a mood disorder involving, on a daily basis and for at least two weeks, at least 5 of the following symptoms: persistent sadness, anhedonia (loss of ability to feel pleasure), anxiety, feelings of worthlessness or guilt, thoughts of planning or attempting suicide, fatigue or loss of energy, sleep disturbances, appetite disturbances, difficulty thinking, concentrating or indecisiveness, psychomotor retardation or hustle.
  • These symptoms of major depression, as described in the DSMV therefore include emotional, autonomic, and neurocognitive disorders.
  • SSRIs selective serotonin reuptake inhibitors
  • fluoxetine PROZAC ®
  • citalopram Cipramil ®
  • daxopetine Primaryligy ®
  • escitalopram Cipralex ®
  • fluvoxamine Faverin ®
  • paroxetine Seroxat ®
  • sertraline Lustral ®
  • vortioxetine Brintellix ®
  • MAOs monoamine oxidase inhibitors
  • NERIs norepinephrine reuptake inhibitors
  • SNRIs serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors
  • PDE4 phosphodiesterase-4
  • antidepressants have a delay of action of several weeks, and many patients do not respond, or only partially, to these treatments. In addition, most of these agents produce significant side effects, such as sexual dysfunction, gastrointestinal disorders, with manifestations of nausea and vomiting, insomnia, weight gain, onset of diabetes and heart problems. These side effects often discourage patients from continuing with their antidepressant treatment.
  • a new class of antidepressants includes ketamine and its derivatives which, although possessing faster onsets of action, produce dissociative and addictive effects.
  • resistant depression refers to the persistence of the depressive episode despite at least two successive well-conducted antidepressant treatments or to an absence of favorable evolution despite these treatments. Resistant depression would concern 15 to 30% of major depressive episodes.
  • Example 1 3D modeling to position MLK2001 in the pocket for binding to the DEF domain of the active kinase ERK2.
  • the crystal structure of the ERK2 AMP-PNP complex (pdb code 4S32) was used as a receptor to perform the docking experiments.
  • the protein has been cleaned up and prepared for fixation (e.g. separation of structures into separate molecules, addition of missing atoms, correction of connectivity, correction of names, insertion of missing loops, etc.).
  • the peptide thus obtained is considered as a small compound or as a small protein.
  • the putative binding sites were selected according to the cavities in the structure of the receptor when the peptides are considered as small compounds or by using the ZDOCK software (exhaustive search scheme of all the rotational and translational spaces between the ligand protein and the receptor protein, which is fixed in its original orientation when the peptide is considered a small protein).
  • Binding of the ligand protein is performed using Libdock methodology and software.
  • Libdock uses the characteristics of protein sites as “HotSpots” which are classified into two categories: polar and apolar HotSpots.
  • the receiver's HotSpots map was established prior to the attachment procedure.
  • Ligand conformations are randomly generated from the initial ligand structure using high temperature molecular dynamics in a “Catalyst” algorithm prior to binding.
  • the poses of the rigid ligand were positioned in the active site of the receptor and the HotSpots were matched by triplets. The poses have been trimmed and an optimization step is performed before the pose is classified.
  • the hydrogen ligands that were removed during the fixation phase are added to the ligand poses and optimized by minimization.
  • the poses with the highest LibDock scores are identified and then grouped according to their mode of attachment.
  • the protein/protein docking experiment is performed using ZDOCK software.
  • This software is a protein/protein rigid structure docking algorithm based on the FFT (Fast Fourier Transform) correlation technique which is used to explore the rotational and translational spaces of the protein/protein system (Chen et al. 2003). Docking is also carried out without constraints or selection of specific residues on ERK or on peptides.
  • the poses obtained (2000 per cycle) are refined using the rDOCK module (DS Modeling 2.5).
  • rDOCK is an energy minimization procedure for refining and classifying fixation poses using energy ranking functions (Li et al., 2003). All poses are classified into different groups (based on energy/number/position criteria) and the most significant groups are selected for interaction studies.
  • Example 2 the level of interaction and affinity of the MLK2001 peptide towards the active ERK2 protein was tested by the surface plasmon resonance technique (Biacore).
  • the recombinant ERK2 protein was immobilized by an amine coupling on a chip, and the peptides were used as mobile analytes.
  • the results are presented in Fig. 2 on which it is observed that the resonance signal (RU) is proportional to the binding of the electrolyte to its ligand (ERK2).
  • Example 3 the affinity of the peptides optimized according to the invention (MLK2002 to MLK2004) at 50 nM on the binding to active ERK2 is determined by the Biacore technique, by comparison with the peptide MLK2001 at 50 nM.
  • the MLK2002 peptide is found to have a 1.5 times greater affinity towards active ERK2, as indicated by the resonance signal (RU).
  • the MLK2003 and MLK2004 peptides show a lower affinity towards active ERK2.
  • Example 4 Graph presenting the affinities of the peptides MLK2001, Scr, TAT and MLK2002 to MLK2004 according to the concept, towards active ERK2, at three different concentrations: 10, 20 and 50 nM. The results are presented in Fig. 4. There is an increasing, dose-dependent affinity for the MLK2001 to MLK2004 peptides, with, for each dose, a greater affinity for the MLK2002 peptide compared to the MLK2001 peptide.
  • the efficacy of the MLK2001 peptide and of the modified MLK2002 peptide at a low dose (5 ⁇ M) was tested on primary cultures of striatal neurons.
  • the striatal extracts are carried out at from mouse embryos (E14). After tissue dissociation, the cells are placed in culture wells in complete Neurobasal medium supplemented with B27 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 500 nM L-glutamine, 60 ⁇ g/ml penicillin G and 25 ⁇ M ⁇ - mercaptoethanol (Sigma, L'Isle d'Abeau, Chasnes, France) at 37° C. in a humid atmosphere (95% air and 5% CO 2 ).
  • the treatments are carried out after 7 days of culturing, when the majority of the cells are of a neuronal phenotype.
  • the MLK2001 and MLK2002 peptides are added to the culture medium at a dose of 5 mM one hour before the BDNF treatment (Brain Derived Neurotrophic Factor, Peprotech France; 50 nM).
  • the MEK U0126 inhibitor is used at a dose of 10 mM and added 30 minutes before the treatment.
  • the cells are fixed using paraformaldehyde and immunolabeled as indicated in Favaur et al. (J. Neuroscience, 2007) and Besnard et al. (J.
  • the toxicity of the MLK2001 peptide and of the modified MLK2002 peptide was tested at 5 ⁇ M and 10 ⁇ M on primary cultures of striatal neurons.
  • the striatal neurons were prepared as shown in Figure 5. After 7 days of culturing the peptides (5 ⁇ M and 10 ⁇ M) are added directly into the medium; The MLK2001 and MLK2002 peptides are added to the culture medium. Twenty four (24) hours later the neurons are fixed with paraformaldehyde. MAP2 immunostaining (bottom panel) is performed to visualize neurite integrity. Labeling of the nucleus with Hoechst makes it possible to visualize the nuclear integrity. The wells thus treated are mounted under a coverslip in vectashield (ThermoFischer). Images are acquired with a 40x objective on a Leica DM400 microscope assisted by a CCD camera.
  • MLK2002 peptide is less toxic at two doses (5 and 10 ⁇ M) on striatal neurons in culture.
  • Example 7 Identification of the Binding Sites of ERK2
  • the in silico method of screening the binding of small molecules to the binding site of the DEF-Elk-1 peptide within the anchoring domain of ERK2 made it possible to highlight 3 binding sites that have been separated. These sites are illustrated in Fig. 7.
  • Example 8 Profile produced by the Biacore technique in Single Cycle Kinetic (SCK) of the saturation curves and the association/dissociation kinetics of the peptides MLK2001, MLK2002, MLK 2007 and MLK2008 according to the invention on the binding to active ERK2.
  • the graphs of Fig. 8 represent the saturation curves at increasing concentrations (5,
  • association constants (ka 1/Ms: number of molecules associated per Millisecond) and dissociation constants (kd 1/s, number of molecules dissociated per second), as well as the RMax (RU) are represented in the tables below saturation curves.
  • MLK2007 and MLK2008 peptides have a higher ka (7.22 e5 and 1.22 e6 molecules per Millisecond respectively) compared to MLK1001 (5.44 e5), and that these peptides dissociate equivalently.
  • the MLK2002 peptide has a slightly lower ka than that of MLK2001 (3.93 vs. 5.44 e e5 /Ms).
  • Example 9 Profile by the Biacore technique in Single Cycle Kinetic (SCK) of the saturation curves and the association/dissociation kinetics of the peptides MLK2001, MLK2013 and MLK 2019 according to the invention on the binding to active ERK2.
  • the graphs of Fig. 9 represent the saturation curves at increasing concentrations kinetics of affinity at increasing concentrations (5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 90 and 100 nM) of the peptides MLK2001, MLK2013 and MLK2019.
  • the association (ka 1/Ms) and dissociation (kd 1/s) constants, as well as the RMax (RU) are shown in the tables.
  • N-ter acetylated peptides MLK2013 and MLK2019 have a higher association constant (1.26 and 1.48 e6 molecules per Milisecond respectively) compared to MLK1001 (5.44 e5) , that is to say about 6 times higher.
  • the kd are of equivalent order for the 3 peptides.
  • Example 10 Measurement of the phosphorylation of Elk-1 by the Elisa method.
  • FIG. 10 Primary neurons are cultured as detailed in Figures 5 and 6. On day 7, the neurons are treated with BDNF (100ng/ml) for 15 minutes. When indicated, the pharmacological inhibitors U0126 (MEK inhibitor) or the peptides MLK2001, MLK2002, MLK2007, MLK2008 and MLK2019 are applied at two doses: 5 ⁇ M (solid forms) and 10 ⁇ M (hatched forms) one hour before the BDNF treatment . The phosphorylation of Elk-1 is evaluated by the Elisa method using an antibody (Ab) anti phospho-Elk1 (Ser383), it is normalized by the value corresponding to total Elk-1 (normalized value P-Elk- 1/Elk-1).
  • Ab antibody
  • P-Elk- 1/Elk-1 normalized value
  • the level of activation of P-Elk-1/Elk-1 by BDNF is indicated by a solid horizontal bar; the level of inhibition of P-Elk-1/Elk-1 by the MEK inhibitor U0126 is indicated by a horizontal dotted line.
  • the MLK2019 peptide allows complete inhibition, comparable to the control, and lower than the level of the other inhibitors, from a concentration of 5 ⁇ M.
  • the peptides tested here and particularly MLK2019 are of definite therapeutic interest.
  • Example 11 small molecule screening method or virtual repositioning screening We have seen in detail the identification method applied to the identification and optimization of peptides above. The method according to the invention can also be applied to the screening of small molecules. Collections of known small molecules are found in academic chemical libraries and/or commercial chemical libraries.
  • Prestwick Chemical offers reference drug libraries, available in physical as well as electronic form, which are particularly well suited to virtual repositioning screening.
  • the implementation of the identification method described in the present invention with the Prestwick Chemical library has made it possible to identify small molecules that strongly interact with the central binding site of the DEL-Elk-1 peptide towards ERK2.
  • These molecules are detailed below and grouped into four series. These are molecules with antibacterial properties of the beta-lactam type ( 1st series), molecules with antipsychotic properties of the 2-piperacetazine type ( 2nd series), molecules with anti-H1R properties of the levocabastine type (3rd series) and molecules of the prostaglandin E1 type ( 4th series).
  • Beta-lactam type molecule with anti-bacterial effect [Chem 1]
  • [Chem 2] 2nd series molecule of the 2-Piperacetazine type (Quide) with antipsychotic effect
  • the first series describes a broad class of antibiotics which include penicillin derivatives, cephalosporins, monobactams, carbapenems, etc. which are known to those skilled in the art for their antibacterial properties.
  • the second series describes a prodrug with an antipsychotic effect, often used in the treatment of schizophrenia, as well as its structural analogues.
  • the third series describes a selective H1 antihistamine called levocabastine and its structural analogues.
  • the fourth series describes prostaglandin E1 (PGE 1 ) which is used as a drug for its vasodilating properties, as well as its structural analogues.
  • these molecules have a strong affinity with the binding site of the DEF-Elk-1 peptide towards ERK2.
  • these molecules of the beta-lactam, 2-piperacetazine, levocabastine, prostaglandin E1 type and their analogues can be used for the treatment of cancer, anxiety and mood disorders and in particular resistant depressions, addictions, Down syndrome, Alzheimer's disease, lupus erythematosus and proximal spinal muscular atrophy.

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Abstract

La présente invention décrit de nouveaux peptides synthétiques qui sont des inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par les kinases ERK1/2. Une composition pharmaceutique contenant lesdits peptides ainsi que leur utilisation en tant que médicaments sont également décrites. Une méthode d'identification et d'optimisation de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 est également décrite.

Description

DESCRIPTION
Titre : Nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention décrit de nouveaux peptides synthétiques qui sont des inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par les kinases ERK1/2. Une composition pharmaceutique contenant lesdits peptides ainsi que leur utilisation en tant que médicaments sont également décrites. Une méthode d’identification et d’optimisation de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 est également décrite.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
Les MAP kinases (pour « Mitogen-Activated Protein kinase ») ERK1 et ERK2 (ERK pour « Extracellular signal-Regulated Kinase ») sont des enzymes dont la fonction est d’ajouter des groupements phosphate à des protéines cibles afin de les activer. Ce sont des protéines ubiquitaires impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires. Elles ont un rôle primordial dans la transduction de signaux intracellulaires. Leur activation se fait par des signaux extracellulaires qui agissent sur des récepteurs membranaires pour induire l’activation en cascade de différents acteurs intracytoplasmiques, en amont de ERK1/2, en particulier les protéines Ras, Raf et MEK ; on parle également de voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2- ERK1/2. Les MAP kinases de type ERK ont de nombreux substrats intracellulaires, membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires (Yang et al., Trends Pharmacol. Sci. 2019 Nov;40(ll ):897-910 ) et c’est l’amplitude et la durée des activations de la cascade de signaux intracellulaire qui va diriger ERK1/2 vers l’un de ses substrats.
Dans le système nerveux central, la voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 est activée dans les neurones par des neurotransmetteurs, des neuromodulateurs ou des facteurs neurotrophiques. En agissant via des récepteurs couplés à des protéines G (récepteurs des monoamines, ou métabotropiques du glutamate par exemple), à des entrées calciques (récepteurs NMDA du glutamate) ou à des récepteurs à activité tyrosine kinase (facteurs neurotrophiques tel que BDNF) l’activation de cette cascade de signalisation est impliquée dans de multiples fonctions cellulaires, au cours du développement ou dans le cerveau adulte. Ainsi la voie ERK contrôle la différenciation et la maturation neuronale au cours du développement. Dans le cerveau adulte, elle joue un rôle clé dans la plasticité neuronale et les processus d’apprentissage et de mémoire, notamment impliqués dans la cognition, les apprentissages par récompense et l’humeur. Une hyperactivité de la voie ERK est observée dans de nombreuses maladies neurodéveloppementales, y compris les troubles autistiques et les Rasopathies : neurofibromatose type 1, syndrome de Noonan, syndrome de malformation capillaire-arterioveneux, syndrome de Costello, syndrome cardio-facio-cutané et syndrome de Legius. Des dérégulations de la voie ERK sont également responsables de maladies psychiatriques telles que l’addiction, la dépression, le stress post-traumatique ou les troubles de l’anxiété et de l’humeur.
De nombreux inhibiteurs des MAP kinase de type ERK ont été développés. Ils ciblent en général la voie Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 en amont de ERK ce qui bloque totalement son activité et sa liaison à ses divers substrats en aval. À titre d’exemple on citera PD98059 (2'- amino-3'-méthoxyflavone) et U0126 (1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio) butadiène), le Trametinib (GSK1120212), le Cobimetinib (GDC0973), le Mirdametinib (PD0325901) ou le Selumetinib (AZD6244) qui sont des inhibiteurs spécifiques des MEKs.
Les inhibiteurs spécifiques des kinases en amont des MAP kinases de type ERK bloquent la voie de signalisation Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 mais comme leur action se situe en amont des MAP kinases de type ERK, ceci résulte en une inhibition complète des MAP kinases de type ERK, et par conséquent de tous les substrats en aval, sans discrimination entre ceux-ci et sans distinction de leur localisation cellulaire.
Être capable d’agir au niveau de l’interaction entre la MAP kinase de type ERK et un substrat unique en aval de la voie de signalisation intracellulaire ERK permet de bloquer la voie de signalisation ERK de façon spécifique tout en autorisant ses autres fonctions, notamment sur l’homéostasie cellulaire normale.
Dans EP1988167 les inventeurs ont mis en évidence des peptides synthétiques permettant l’inhibition sélective de la voie des MAP kinases de type ERK envers un substrat donné. Les différents substrats de ERK1/2 présentent des séquences consensus dites sites de fixation ou de docking, connues de l’homme de l’art, qui permettent la fixation de ERK1/2 sur ses substrats. Ces séquences sont connues sous les termes, DEF (ou FXFP) et D (ou DEJL) (voir EP1988167).
Le domaine de liaison DEF (docking site for ERK FXFP) des substrats spécifiques de ERK1/2 est responsable du recrutement de ERK1/2 vers les gènes à expression précoce immédiate (ou gène immédiat précoce) et des facteurs de transcription (voir EP1988169). Ce domaine de liaison DEF peut fixer des peptides ayant une séquence consensus FXFP ou (F/Y)X(F/Y)P dans lequel F désigne la Phénylalanine (Phe) Y désigné la Tyrosine (Tyr), P la Proline (Pro) et X n’importe quel aminoacide naturel (Sharrocks et al., Trends Biochem Sci. 2000 Sep;25(9):448-53). Le domaine DEF est spécifique des substrats de ERK1/2.
Le domaine DEJL (docking site for ERK and JNK LXL) est indispensable à l’activation de différentes séries de substrats, incluant RSK (pour 90 kDA ribosomal S6 kinase) et les phosphatases (MAP kinases Phosphatases ou MPK). C’est également le site de liaison des MEK1/2 qui sont situées en amont de ERK1/2 dans la cascade de signalisation intracellulaire. Il est à noter que ce site n’ est pas spécifique des kinases de type ERK, mais permet aussi la fixation et la phosphorylation de substrats sur les MAPkinases de la famille JNK et p38/MAPK.
De nombreuses équipes développent des inhibiteurs de MEK1/2 dans le but de proposer des solutions thérapeutiques dans diverses pathologies et notamment en oncologie, dans les troubles du système nerveux central et dans l'inflammation.On citera à titre d'exemple d’inhibiteurs de MEK1/2 qui sont ou ont été étudiés durant des essais cliniques Selumetinib, Refametinib, Cobimetinib, Trametinib (Samatar et al., Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):928-42).
Ces inhibiteurs de MEK1/2 ont un effet global sur l’inhibition de ERK1/2 et de ses substrats et ils ont ainsi un effet pleïotrope, non spécifique et délétère. Les essais cliniques en cours montrent notamment que les effets secondaires sont nombreux en fonction des doses administrées et qu’une résistance au médicament s’installe (Balagula et al., Invest. New Drugs, 2010; 29:1114-21).
Des études sont également menées pour découvrir des molécules susceptibles d’ agir sur l’activation de ERK1/2 afin de réguler la prolifération et la survie de cellules, et notamment de cellules cancéreuses. Durant les dix dernières années, des études in silico ont permis de mettre en évidence des ligands susceptibles d’ interagir avec des sites de liaison spécifiques de ERK1/2 et d’inhiber sélectivement les interactions avec des substrats impliqués dans la prolifération cellulaire (Boston et al., BMC Cancer. 2011; 11: 7 ; Samadani et al., Biochem J. 2015 May 1; 467(3): 425-438). Elles ont également permis de mettre en évidence certaines des caractéristiques structurelles des domaines de liaison de ERK1/2.
Les peptides contenant le domaine DEF (ou FXFP), et les acides aminés environnants dans les régions N- et C-terminales, d’un substrat spécifique en aval de ERK inhibent la liaison et la phosphorylation subséquente dudit substrat sans impacter les autres activités de ERK1/2 ou la phosphorylation d’autres substrats. Il y a donc beaucoup moins d’effets secondaires de cette inhibition dans la transduction du signal intracellulaire ERK1/2.
Les brevets EP1988167 et EP2337576 décrivent l’utilisation de peptides synthétiques de type TAT-DEF en tant qu’inhibiteurs spécifiques de substrats en aval de ERK et en particulier l’utilisation d’un peptide de type TAT-DEF-Elk-1 pour le traitement d’un désordre de l’anxiété et de l’humeur ; la protéine Elk-1 étant un facteur de transcription agissant en aval la voie de signalisation de ERK.
RÉSUMÉ DE L’INVENTION
La présente invention décrit de nouveaux peptides qui sont des inhibiteurs de la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 et qui sont dérivés de ceux décrits dans EP1988167.
Ces nouveaux peptides synthétiques sont modifiés afin de les rendre plus stables et plus efficaces que ceux décrits dans EP1988167.
Les inventeurs ont utilisé la modélisation 3D in silico de la poche de fixation du domaine d’ancrage de ERK2 envers des substrats contenant le domaine DEF de façon à pouvoir positionner des ligands connus, en particulier le peptide TAT-DEF-Elk-1 selon le brevet EP1988167 (en particulier de SEQ ID N°1) et caractériser leur interaction avec cette poche de fixation. Ceci permet de définir les positions essentielles et non essentielles dans la liaison du peptide TAT-DEF-Elk-1 au domaine d’ancrage de ERK2 et d’optimiser de potentiels inhibiteurs de la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2. Cette étude permet d’optimiser les peptides contenant des domaines DEF-Elk-1 (SEQ ID N°25) soit par stabilisation et notamment par D-racémisation des aminoacides non essentiels à la liaison, soit par suppression des aminoacides non essentiels à la liaison, soit encore de combiner ces différentes modifications, et enfin d’envisager de nouveaux inhibiteurs.
Dans la présente description il est fait référence à la voie de signalisation intracellulaire Ras- Raf-MEK 1 / 2-ERK 1 / 2 ou Ras-Raf -MEK- ERK ou ERK ou ERK1/2. Ces termes sont équivalents et font référence à la même voie ou cascade de signalisation.
Le terme « docking method » ou « méthode de docking » fait référence à la méthode qui permet de calculer l'orientation préférée d'une molécule envers une seconde lorsqu'elles sont liées pour former un complexe stable. Le fait de déterminer cette orientation préférée sert à prévoir la solidité de l'union entre deux molécules et éventuellement son efficacité. Les études de docking, de fixation, d’ancrage ou d’amarrage, servent donc à déterminer l’affinité entre les molécules étudiées et de quantifier les conséquences de la fixation d’un ligand sur un récepteur. Les termes de méthode de fixation, méthode d’ancrage ou méthode d’amarrage peuvent être utilisés pour désigner la méthode de docking.
DESCRIPTION DES DESSINS
[Fig 1] La Fig. 1 décrit la modélisation in silico de l’interaction entre le domaine DEF-Elk1 de MLK2001 et la poche de fixation du domaine ERK2-DEF de la kinase active. Cette modélisation permet la visualisation des aminoacides essentiels à ladite interaction. Les aminoacides représentés débutent au premier aminoacide.
[Fig 2] La Fig. 2 décrit l’affinité de liaison du peptide MLK2001 (50nM) envers ERK2 actif par la technique de résonance de plasmons de surface (biaccore). La protéine recombinante ERK2 a été immobilisée par un couplage amine et le peptide MLK2001 (analyte) est mobile. Un peptide TAT-NR2B9c a été utilisé comme contrôle négatif.
[Fig 3] La Fig. 3 décrit l’affinité de liaison du peptide MLK2001, de 3 peptides selon l’invention (MLK2002, 2003 et 2004), et deux peptides contrôles : la séquence TAT seule, et un peptide « Scramble » (au hasard) de la séquence MLK2001, par la technique de biacore.
Le signal de résonance (RU) représente l’affinité des analytes (peptides) envers les protéines ERK2 active immobilisées. Le graphique représente les profils obtenus à 50nM pour chaque analyte. Plus le signal RU est élevé plus l’affinité de l'analyte pour ERK2 est importante. Il est à noter que le signal RU pour MLK2002 est 1,5 fois plus important que pour MLK2001. [Fig 4] La Fig. 4 propose un graphique représentant la liaison dose-dépendante des peptides MLK 2001 à 2004 ainsi que les peptides contrôle TAT et Scr.
[Fig 5] La Fig. 5 décrit la phosphorylation de Elk-1 et ERK par le peptide MLK2001 et le peptide modifié MLK2002 à faible dose.
[Fig 6] La Fig. 6 décrit la toxicité après 24h de traitement avec le peptide MLK2001 et le peptide MLK2002 modifié selon la présente invention.
[Fig 7] La Fig. 7 illustre le résultat de la mise en œuvre de la méthode de criblage in silico de la fixation de petites molécules envers le site de liaison du peptide DEF-Elk-1 au sein du domaine d’ancrage de ERK2. Trois importants sites de liaison ont été identifiés et séparés.
[Fig 8] La Fig. 8 décrit les cinétiques de fixation, et les constantes d’association/dissociation des peptides MLK2001, MLK2002, MLK2007 et MLK2008 selon l’invention.
[Fig 9] La Fig. 9 décrit les cinétiques de fixation, et les constantes d’association/dissociation des peptides MLK2001, MLK2013 et MLK20019 selon l’invention. [Fig 10] La Fig. 10 décrit la phosphorylation de Elk-1 par ERK des peptides MLK2001, MLK2002, MLK2007, MLK2008 et MLK2019 selon l’invention. Les dosages testés sont de 5 et 10 μM dans chaque cas.
Ces figures viennent illustrer la présente invention et ne sont pas limitatives de la portée revendiquée.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L’INVENTION
Les expériences de docking ont été réalisées avec le peptide MLK2001 de SEQ ID N°1 comme ligand du domaine d’ancrage de ERK2. La méthode de modélisation in silico a permis d’étudier précisément les interactions entre MLK2001 de SEQ ID N°1 et la poche de fixation de ligands DEF-Elk-1. À partir de cette expérience, de nouveaux composés ont été conçus et synthétisés. Ceux-ci sont décrits dans le Tableau n°1 ci-dessous. Par rapport à MLK2001 de SEQ ID N°1 ils sont soit raccourcis, soit stabilisés, soit les deux.
Dans le brevet EP1988167 les peptides inhibiteurs ont été conçus comme suit : ils contiennent une séquence riche en aminoacides basiques de la protéine HIV-TAT suivie par deux prolines (PP) et ensuite par le domaine de liaison DEF de Elk-1 comprenant notamment la séquence consensus FQFP encadrée par des aminoacides.
Les résultats de l’expérience de modélisation 3D in silico à partir du positionnement de TAT- DEF-Elk-1 de SEQ ID N°1 dans la poche de liaison de la kinase ERK2 active ont permis d’identifier les aminoacides essentiels à la liaison des domaines DEF-Elk-1 et ERK2 et en particulier la séquence consensus FQFP. Des aminoacides non essentiels ont été identifiés en N-ter de la séquence DEF-Elk-1 (SEQ ID n°25) et à l’intérieur de cette même séquence.
Grâce à ces informations, plusieurs peptides ont été conçus et synthétisés. Ces peptides, qui illustrent chacune des modifications seules ou en combinaison, sont au nombre de 23 et leurs séquences sont détaillées dans le Tableau 1. Leurs effets pharmacologiques ont été testés et plusieurs présentent des résultats intéressants.
Les termes aminoacide, amino-acide ou acide aminé sont équivalents et font référence aux unités structurales des protéines et des peptides. Ce sont des molécules organisées autour d’une même structure de base, un atome de carbone, qui porte la fonction acide -COOH, la fonction basique amine -NH2, un atome d’hydrogène -H et un radical -R de structure variable qui distingue et caractérise les vingt acides aminés que l’on trouve naturellement dans les protéines. Le terme « suppression » d’un acide aminé s’entend dans son sens premier à savoir le fait de supprimer un acide aminé de la séquence peptidique d’intérêt. En général on supprime un acide aminé considéré comme non essentiel à la fonctionnalité du peptide ce qui permet de réduire la taille de la séquence peptidique et éventuellement d’optimiser la fonctionnalité du peptide.
Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu’utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d’un résidu d’acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité).
Le terme « racémisation » fait référence à une propriété physique qui est la transformation d’un composé optiquement actif en une forme racémique qui est optiquement inactive ; pour les acides aminés c’est le passage d’un énantiomère ou stéréoisomère (isomères optiques à pouvoir rotatoire spécifique opposé) à un autre. Cette transformation a un impact sur la structure et la fonctionnalité des peptides. Dans la présente invention il s’agit d’une racémisation de type D (pour dextrogyre) par opposition à L (pour levogyre) car les amino- acides à l’état naturel sont de type L à l’exception de la glycine. La D-racémisation d’un ou plusieurs amino-acides rend le peptide plus stable.
Tel qu'utilisé ici, le terme "comprenant" ou "comprend" est utilisé en référence à des substances, composés, méthodes ou procédés qui sont essentiels à l'invention, mais qui sont ouverts à l'inclusion d'éléments non spécifiques, essentiels ou non.
Le terme "et/ou" tel qu'il est utilisé ici doit être considéré comme une description spécifique de chacune des deux caractéristiques ou composants spécifiés, avec ou sans l'autre. Par exemple, «A et/ou B» doit être considéré comme une divulgation spécifique de chacun des éléments suivants: (i) A, (ii) B et (iii) A et B, comme si chacun d'eux était présenté individuellement.
[Table 1]
Tableau 1 : peptides synthétiques dérivés de TAT-DEF-Elk-1 Dans ce tableau 1 on voit les différentes modifications appliquées selon différents critères à la séquence TAT-DEF-Elk-1 de SEQ ID N°1 selon la présente invention. Les aminoacides correspondant à la séquence DEF-Elk-1 sont soulignés et c’est cette séquence de SEQ ID N°25 qui est essentiellement modifiée comme suit :
- la région N-ter est raccourcie dans la séquence de 2 aminoacides SP (voir par exemple SEQ ID N°7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 22, 23 et 24) ; et/ou
- on applique une racémisation de type D (ou D racémisation) à un ou plusieurs aminoacides non essentiels pour stabiliser chacun de ces nouveaux peptides (voir par exemple SEQ ID N°2, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 23 et 24) qui est indiquée par une lettre minuscule en caractère gras ; et/ou
- on change les aminoacides sérine (S/Ser) en Acide aspartique (D/Asp), représenté par un double surlignage, pour apporter des propriétés phospho-mimétiques (voir SEQ ID N°3, 4, 6, 9, 10, 12, 15, 16, 18, 21, 22 et 24) ; et/ou
- on ajoute un groupe acétyle (Ac) en N-ter pour protéger la molécule (voir par exemple SEQ ID N°13 à 24).
La présente invention propose de nouveaux peptides synthétiques qui sont des ligands inhibiteurs de phosphorylation de la protéine Elk-1 par ERK1/2.
Les peptides détaillés ci-dessus comprennent une séquence de pénétration cellulaire de type HIV TAT mais cette séquence est purement fonctionnelle et peut être substituée par toute séquence de fonction équivalente connue de l’homme de l’art comme la pénétratine, une séquence de 7 à 11 résidus arginine, une séquence de type X7/11R de 7 à 25 amino-acides comprenant 7 à 11 résidus arginine positionnés de façon aléatoire dans ladite séquence, une séquence dérivée des DPVs (Diatos peptide vectors) ou toute autre séquence de pénétration cellulaire.
Sont décrits des peptides de type DEF-Elk-1 caractérisés en ce que la séquence de 19 aminoacides DEF-Elk-1 (SEQ ID N°25) située entre les positions 13 à 31 de la SEQ ID N°1 est modifiée sur au moins une position par suppression d’au moins un aminoacide en N-ter et/ou racémisation d’au moins un aminoacide et/ou substitution d’un ou deux aminoacides. Selon l’invention les nouveaux peptides DEF-Elk-1 sont caractérisés en ce que la séquence DEF-Elk-1 est modifiée sur au moins deux positions par suppression d’au moins un aminoacide en N-ter et/ou racémisation d’au moins un aminoacide et/ou substitution d’un ou deux aminoacides. Lesdits peptides sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°2 à 24, plus particulièrement parmi les peptides de SEQ ID N°2, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 17, 19, 20 et 23. Par modification on entend la suppression d’au moins un aminoacide en N-ter et/ou la D racémisation d’un ou plusieurs aminoacides, et/ou la substitution d’un ou deux aminoacides ; en outre la région N-terminale de la SEQ ID N°25 peut être acétylée. La présente invention décrit un peptide DEF-Elk-1 dont la séquence de SEQ ID N°25 est modifiée par suppression d’au moins un aminoacide en N-ter et/ou racémisation d’au moins un aminoacide et/ou substitution d’un ou deux aminoacides sur une position de ladite SEQ ID N°25.
Dans un mode de réalisation particulier le peptide de SEQ ID N°25 est fusionné en N-ter à une séquence permettant la pénétration cellulaire. Ladite séquence de pénétration cellulaire est sélectionnée parmi une séquence de pénétration cellulaire de type HIV T AT, la pénétratine, une séquence de 7 à 11 résidus arginine, une séquence de type X7/11R de 7 à 25 amino-acides comprenant 7 à 11 résidus arginine positionnés de façon aléatoire dans ladite séquence, une séquence dérivée des DPVs (Diatos peptide vectors) ou toute autre séquence de pénétration cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier ladite séquence de pénétration intracellulaire est HIV TAT et les nouveaux peptides selon l’invention ont une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N°2 à 24. Dans un mode de réalisation particulier les nouveaux peptides selon la présente invention sont sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°2 à 24, préférentiellement parmi les peptides de SEQ ID N°2, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 17, 19, 20 et 23. Les nouveaux peptides sont préférentiellement sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°2 et n°19.
Les peptides selon l’invention sont caractérisés en ce que la séquence DEF-Elk-1 de SEQ ID N°25 est raccourcie dans la région N-ter. Dans une mode de réalisation particulier la séquence DEF-Elk-1 de SEQ ID N°25 est raccourcie par suppression de 1 à 2 aminoacides, préférentiellement de 2 aminoacides. Dans ce mode de réalisation les peptides sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 22, 23 et 24, plus particulièrement parmi les peptides de SEQ ID N°8, 11, 19, 20 et 23.
Dans un mode de réalisation particulier, la substitution d’un ou deux aminoacides dans les peptides selon l’invention est réalisée dans la séquence consensus SSGS située en positions 11 à 14 de la SEQ ID N°25. Dans un mode de réalisation préféré au moins un aminoacide sérine (S/Ser) de la séquence consensus SSGS située en positions 11 à 14 de la SEQ ID N°25 est remplacé par un aminoacide asparagine (D/Asp). Dans ce mode de réalisation les peptides selon l’invention sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°3, 4, 6, 9, 10, 12, 15, 16, 18, 21, 22 et 24.
Dans un autre mode de réalisation préféré, deux aminoacides S (Ser) de la séquence consensus SSGS située en positions 11 à 14 de la SEQ ID N°25 sont remplacés par deux aminoacides D (Asp), lesdits résidus étant préférentiellement situés en positions 12 et 14 de la SEQ ID N°25.
Dans un mode de réalisation particulier une racémisation de type D est appliquée à au moins un aminoacide situé à l’une quelconque des positions 6, 8, 11 et 16 de la SEQ ID N°25. Dans un mode de réalisation préféré une racémisation de type D est appliquée aux aminoacides situés en positions 6, 11, et 16 de la SEQ ID N°25 ; dans ce mode de réalisation les peptides selon l’invention sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°2, 4, 14 et 16. Dans un autre mode de réalisation préféré une racémisation de type D est appliquée aux aminoacides situés en positions 6, 8, 11 et 16 de la SEQ ID N°25 ; dans ce mode de réalisation les peptides selon l’invention sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°5, 6, 17, 18, 23 et 24. Lorsque les peptides selon l’invention présentent une séquence raccourcie en N-ter de la séquence DEF-Elk-1, alors la numérotation des aminoacides change ; la racémisation de type D est appliquée au même aminoacides que ceux cités ci-dessus par référence à la SEQ ID N°25. Dans ce contexte les peptides selon l’invention peuvent être sélectionnées parmi les peptides de SEQ ID N° 2, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 20, 22, 23 et 24, plus particulièrement parmi les peptides de SEQ ID N°2,
5, 8, 11, 14, 17, 20 et 23.
Dans un mode de réalisation particulier la région N-ter est en sus acétylée. Dans ce mode de réalisation les peptides selon l’invention sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°13 à 24, plus particulièrement parmi les peptides de SEQ ID N°13, 14, 17, 19, 20 et 23.
Dans un autre mode de réalisation, les peptides selon l’invention correspondent à la SEQ ID n°7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 22, 23 et 24, préférentiellement parmi les peptides de SEQ ID N°7, 8, 11, 19, 20 et 23. Dans un autre mode de réalisation, les peptides selon l’invention correspondent à la SEQ ID N°2, 5, 7, 8, 11, 13, 14, 17, 19, 20 et 23.
La présente invention décrit de nouveaux peptides DEF-Elk-1 caractérisés en ce que la séquence DEF-Elk-1 de SEQ ID N°25 est modifiée par suppression d’au moins un aminoacide en Nter et/ou racémisation d’ au moins un aminoacide et/ou substitution d’ un ou deux aminoacides, préférentiellement 2, dans lesquels : la séquence est raccourcie en N-ter par suppression de 1 à 2 aminoacides ; et/ou une racémisation de type D est appliquée à un ou plusieurs aminoacides situés en position 6, 8, 11 et 16 de la SEQ ID N°25, préférentielle sur F une quelconque des positions 6, 11 et 16 de la SEQ ID N°25 ; et/ou la séquence DEF-Elk-1 de SEQ ID N°25 est fusionnée en N-ter à une séquence permettant la pénétration intracellulaire ; et/ou la région N-ter de la SEQ ID N°25 fusionnée à une séquence de pénétration intracellulaire est acétylée.
Dans un mode de réalisation préféré le nouveau peptide selon l’invention présente une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N° 2 à 24, préférentiellement parmi les SEQ ID N°2 ou SEQ ID N° 19.
Avantageusement, l’invention décrit une méthode d’identification de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2. Cette méthode d’identification comprend les étapes suivantes : a. élaborer un modèle 3D du domaine d’ancrage de ERK2 envers des substrats contenant un site DEF, basé sur la structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP (pdb code 4S32) en qualité de récepteur ; b. modéliser en 3D la fixation d’un peptide connu en tant que ligand de ce domaine pour se fixer dans le site de fixation de la kinase ERK2 active ; c. faire une étude de docking de type protéine-ligand en utilisant l’algorithme LibDock ; d. faire une étude de docking de type protéine-protéine en utilisant l’algorithme ZDOCK et affiner les résultats en utilisant RDOCK ; e. identifier les aminoacides essentiels et non essentiels à la fixation du peptide modélisé en b. dans la poche d’ancrage de ERK2 envers des substrats contenant un site DEF ; f. optimiser le peptide modélisé en b. puis concevoir et synthétiser de nouveau peptides en tenant compte de toutes les informations obtenues en c., d. et e. ; g. tester l’affinité biochimique par des études d’interaction protéine/protéine h. tester l’activité biologique et/ou les propriétés du ou des peptides synthétisés en f.
Avec cette méthode il est possible d’identifier d’autres peptides inhibiteurs de phosphorylation, présentant de bonnes affinités de liaison sur ERK2 et susceptibles d’avoir des effets intéressants dans les troubles de l’humeur et de l’anxiété, ainsi que leur comorbidité (addiction, anxiété) ou le PTSD. Une fois le modèle de récepteur mis au point, cette méthode d’identification de molécules capables de se lier au domaine DEF de ERK2 envers Elk-1 de façon similaire aux peptides détaillés ci-dessus, comprend les étapes suivantes : a. utiliser le modèle 3D du domaine DEF de ERK2 envers Elk-1 basé sur la structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP en qualité de récepteur ; b. tester in silico la fixation ou « docking » de différentes molécules sur la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 envers Elk-1 ; c. synthétiser lesdites molécules présentant une bonne affinité de liaison ; d. étudier l’affinité de chaque molécule pour la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 et sélectionner les meilleures affinités de liaison ; e. tester l’activité biologique et/ou les propriétés de la ou des molécules sélectionnées en d. et synthétisée(s) en c.
Avantageusement, la présente invention décrit également une méthode d’identification de petites molécules peptidomimétiques des nouveaux peptides selon l’invention, donc capables de se lier très précisément dans la poche de fixation des ligands de type DEF-Elk-1 envers ERK2 et ainsi d’inhiber la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2.
Par molécules peptidomimétiques ou ligands peptidomimétiques on entend de petites molécules, qui miment l’activité des peptides actifs. Dans la recherche sur des molécules peptidomimétiques l’objectif est d’identifier de petites molécules qui ont un effet très spécifique sur la cible identifiée avec un minimum voire aucun effet secondaire. Dans la présente invention les molécules peptidomimétiques sont des ligands de la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 envers le peptide DEF-Elk-1 et capables d’inhiber la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2.
Cette méthode d’identification de petites molécules peptidomimétiques comprend les étapes suivantes : a. utiliser le modèle 3D du domaine DEF de ERK2 envers Elk-1 basé sur la structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP (pdb code 4S32) décrit ci-dessus, en qualité de récepteur ; b. réaliser in silico un crible à haut débit de différentes molécules de petite taille capables de se fixer sur la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 envers Elk-1; c. synthétiser lesdites molécules présentant une bonne affinité de liaison in silico; d. tester l’affinité des molécules sélectionnées dans le criblage pour leur affinité de liaison envers ERK2. e. tester l’activité biologique et/ou les propriétés de la ou des molécules sélectionnées en d. et synthétisée(s) en c.
Cette méthode permet de mettre en évidence des molécules de petite taille de nature non peptidique et susceptibles de réguler un processus biologique. Ainsi la présente invention décrit une méthode d’identification de peptides inhibiteurs de la liaison de Elk-1 sur le domaine d’ancrage de ERK2 et de sa phosphorylation, mais également une méthode d’identification de petites molécules de nature non peptidique présentant elles aussi une activité inhibitrice de la liaison de Elk-1 sur le domaine d’ancrage de ERK1/2. Ces molécules ou peptidomimétiques sont des inhibiteurs de la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2.
Dans un mode de réalisation la présente invention décrit une méthode d’identification de petites molécules interagissant fortement avec le site de liaison du peptide DEF-Elk-1 envers ERK2, ainsi que des petites molécules interagissant fortement avec le site de liaison du peptide DEF-Elk-1 envers ERK2 qui sont sélectionnées parmi les molécules de type beta- lactames, 2-piperacetazine, levocabastine, prostaglandine E1 ainsi que leurs analogues.
L’invention décrit un nouveau peptide inhibiteur de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 pour une utilisation médicale. L’invention porte également sur une composition pharmaceutique contenant une dose thérapeutiquement active d’au moins un peptide selon la présente invention. Cette composition pharmaceutique comprend un peptide selon l’invention, une séquence d’acides nucléiques codant pour un peptide selon l’invention, un vecteur comprenant cette séquence d’acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d’acides nucléiques ou le vecteur et un support pharmaceutiquement acceptable.
Telle qu'utilisée ici, une "composition pharmaceutique" désigne une préparation d'un ou plusieurs des agents actifs avec d'autres composants chimiques optionnels tels que des supports physiologiquement appropriés et/ou des excipients. Le but d'une composition pharmaceutique est de faciliter l'administration de l'agent actif à un organisme. Les compositions de la présente invention peuvent se présenter sous une forme appropriée pour toute voie d'administration ou d'utilisation conventionnelle. La composition pharmaceutique selon l’invention englobe les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine humaine et les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine animale, c’est à dire les compositions vétérinaires. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation les nouveaux peptides selon l’invention interagissant avec le site de liaison du peptide DEF-Elk-1 envers ERK2 sont utilisés pour le traitement du cancer, des troubles de l’anxiété et de l’humeur et en particulier des dépressions résistantes, des addictions, du syndrome de Down, de la maladie d’Alzheimer, du lupus érythémateux et de l’amyotrophie spinale proximale.
Dans un autre mode de réalisation les petites molécules interagissant fortement avec le site de liaison du peptide DEF-Elk-1 envers ERK2 sont utilisées pour le traitement du cancer, des troubles de l’anxiété et de l’humeur et en particulier des dépressions résistantes, des addictions, du syndrome de Down, de la maladie d’Alzheimer, du lupus érythémateux et de l’amyotrophie spinale proximale.
Les pathologies et/ou conditions susceptibles d’être traitées par les nouveaux peptides de la présente invention sont les cancers (sein, vessie, prostate, ovaire, glioblastome, leucémie, etc.), les troubles de l’anxiété et de l’humeur, les addictions, le syndrome de Down, la maladie d’Alzheimer, le lupus érythémateux et l’amyotrophie spinale proximale. De nombreuses études mettent en évidence le lien entre ces pathologies et/ou conditions et la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2.
Par « trouble de l’humeur » on entend une perturbation de l’état émotionnel et de bien-être d’un individu durant une période étendue de sa vie. Les troubles de l’humeur incluent, mais ne sont pas limités à, la dépression majeure (trouble unipolaire), la dépression typique ou mélancolique et atypique, la dépression pré et post-partum, les manies, les dysphories, les troubles bipolaires, les dysthymies, les cyclothymies, la dépression psychotique, le trouble de la personnalité dépressive, le trouble affectif saisonnier et bien d’autres tels que définis par le « Diagnostic and Statistic Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSMV).
Par « trouble de l’anxiété » on entend un état émotionnel déplaisant, qui comprend les réponses psychophysiologiques par anticipation d’un danger irréel ou imaginé et l’ostensibilité résultant d’un conflit intrapsychique méconnu. Les effets physiologiques concomitants incluent une augmentation du rythme cardiaque, une respiration altérée, des sueurs, des tremblements, un état de faiblesse et de fatigue. Les concomitants psychologiques incluent le sentiment de danger imminent, un sentiment d’impuissance, de l’appréhension et de la tension. Les troubles de l’anxiété incluent, mais ne sont pas limités, au trouble panique, au trouble obsessionnel compulsif, au stress post-traumatique (PTSD), aux phobies sociales, au trouble d’anxiété sociale, au phobies spécifiques, au trouble d’anxiété généralisé.
Par « addictions » on entend des pathologies cérébrales définies par une dépendance à une substance ou une activité, avec des conséquences délétères. Les addictions les plus fréquentes sont liées à la consommation répétée de substances psychoactives comme le tabac, l’alcool, les médicaments, les psychotropes, etc. ou à la pratique excessive d’un comportement (jeux, réseaux sociaux, sport, etc.) qui conduit à une perte de contrôle du niveau de consommation et/ou de pratique, une modification de l’équilibre émotionnel, des troubles d’ordre médical et des perturbations de la vie personnelle, professionnelle et sociale.
Dans un mode de réalisation particulier l’invention décrit un nouveau peptide inhibiteur de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 pour le traitement des troubles de l’anxiété et de l’humeur et en particulier de la dépression résistante.
Dans un autre mode de réalisation l’invention décrit une méthode d’administration d’une dose thérapeutiquement active d’au moins un peptide selon l’invention.
Tel qu’utilisé ici, « dose thérapeutiquement active » définit la quantité minimale du peptide selon l’invention pour produire un bénéfice thérapeutique à un patient qui en aurait besoin. C’est une quantité du principe actif qui induit, améliore, ou cause une amélioration des symptômes pathologiques, de la progression de la maladie, ou des conditions physiques associées à la maladie affectant le patient.
La présente invention décrit plus particulièrement l’utilisation d’un nouveau peptide selon l’invention pour le traitement et/ou la prévention de cancers, des troubles de l’humeur et de l’anxiété, des addictions, du syndrome de Down, de la maladie d’Alzheimer, du lupus érythémateux et de l’amyotrophie spinale proximale.
Tel qu’utilisé ici, le terme « traitement » des troubles de l’humeur et de l’anxiété fait référence à l'inversion, l'allègement ou l'inhibition d’un ou plusieurs symptômes associés à ces troubles. Dans la présente demande le terme « prévention » des troubles de l’humeur et de l’anxiété, fait référence à la prévention d’un ou plusieurs symptômes associés à ces troubles.
La présente invention décrit également une méthode de traitement des dépressions résistantes aux traitements antidépresseurs classiques comprenant l’administration d’une composition pharmaceutique contenant une dose suffisante d’un peptide selon l’invention, pour permettre l’inhibition de la phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2, seul ou en combinaison avec des antidépresseurs classiques.
Le « trouble de dépression majeure » ou « trouble unipolaire » fait référence à un trouble de l’humeur impliquant, quotidiennement et durant au moins deux semaines, 5 au moins des symptômes suivants : tristesse persistante, anhédonie (perte de la capacité à éprouver du plaisir), anxiété, sentiments d’inutilité ou de culpabilité, idées planification ou tentative de suicide, fatigue ou perte d’énergie, troubles du sommeil, troubles de l’appétit, difficultés à penser, à se concentrer ou indécision, retard psychomoteur ou agitation. Ces symptômes de la dépression majeure, tels que décrits dans le DSMV incluent donc des troubles émotionnels, neurovégétatifs, et neurocognitifs.
Par « antidépresseurs classiques » on entend les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (SSRI), tels que, mais non limité à, la fluoxétine (PROZAC ®), le citalopram (Cipramil ®), la daxopetine (Priligy ®), l’escitalopram (Cipralex ®), la fluvoxamine (Faverin ®), la paroxetine (Seroxat ®), la sertraline (Lustral ®), la vortioxetine (Brintellix ®) ; les inhibiteurs de monoamine oxydases (MAOs) les inhibiteurs de recaptures de noradrénaline (NERIs), les inhibiteurs combinés de recaptures de la sérotonine et de la noradrénaline (SNRIs), les inhibiteurs de phosphodiesterase-4 (PDE4) et d’autres composés. Ces antidépresseurs présentent un délai d’action de plusieurs semaines, et de nombreux patients ne répondent pas, ou de façon partielle à ces traitements. En outre la plupart de ces agents produisent d’importants effets secondaires, tels que des dysfonctions sexuelles, des troubles gastro-intestinaux, avec comme manifestations des nausées et des vomissements, des insomnies, prises de poids, apparition de diabète et des troubles cardiaques. Ces effets secondaires découragent souvent les patients dans la poursuite de leur traitement antidépresseur. Une nouvelle classe d’antidépresseurs comprend la kétamine et ses dérivés qui, bien que possédant des délais d’action plus rapides, produisent des effets dissociatifs et addictifs.
Dans la présente demande le terme « dépression résistante » fait référence à la persistance de l’épisode dépressif malgré au moins deux traitements antidépresseurs successifs bien conduits ou à une absence d’évolution favorable en dépit de ces traitements. La dépression résistante concernerait 15 à 30% des épisodes dépressifs majeurs.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples et figures détaillés ci- après. EXEMPLES
Les avantages des peptides selon l’invention sont détaillés dans les exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1 : modélisation 3D pour positionner MLK2001 dans la poche de fixation au domaine DEF de la kinase ERK2 active.
La structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP (pdb code 4S32) a été utilisée comme récepteur pour réaliser les expériences de docking. La protéine a été nettoyée et préparée pour la fixation (par exemple séparation des structures en molécules distinctes, ajout d’atomes manquants, correction de la connectivité, correction des noms, insertion de boucles manquantes, etc.). Le peptide ainsi obtenu est considéré comme un petit composé ou comme une petite protéine. Les sites de fixation putatifs ont été sélectionnés en fonction des cavités dans la structure du récepteur quand les peptides sont considérés comme de petits composés ou en utilisant le logiciel ZDOCK (schéma de recherche exhaustive de tous les espaces rotationnels et translationnels entre la protéine ligand et la protéine récepteur, qui est fixée dans son orientation de départ quand le peptide est considéré comme une petite protéine).
La fixation de la protéine ligand est réalisée en utilisant la méthodologie et le logiciel Libdock. Libdock utilise les caractéristiques des sites protéiques comme « HotSpots » qui sont classés dans deux catégories : les HotSpots polaires et apolaires. La carte des HotSpots du récepteur a été établie avant la procédure de fixation. Des conformations de ligands sont générées de façon aléatoire à partir de la structure initiale du ligand grâce à la dynamique moléculaire sous haute température en un algorithme « Catalyst » avant la fixation. Les poses du ligand rigide ont été positionnées dans le site actif du récepteur et les HotSpots ont été appariés par triplets. Les poses ont été taillées et une étape d’optimisation est réalisée avant que la pose ne soit classée. Les ligands hydrogène qui ont été retirés durant la phase de fixation, sont rajoutés aux poses de ligand et optimisés par minimisation. Les poses présentant les scores LibDock les plus élevés sont identifiées puis regroupées en fonction de leur mode de fixation.
L’expérience de docking protéine/protéine est réalisée en utilisant le logiciel ZDOCK. Ce logiciel est un algorithme de docking basé sur une structure rigide protéine/protéine basé sur la technique de corrélation FFT (Fast Fourier Transform) qui est utilisée pour explorer les espaces rotationnels et translationnels du système protéine/protéine (Chen et al. 2003). Le docking est également réalisé sans contraintes ou sélection de résidus spécifiques sur ERK ou sur les peptides. Les poses obtenues (2000 par cycle) sont affinées en utilisant le module rDOCK (DS Modeling 2.5). rDOCK est une procédure de minimisation d’énergie pour affiner et classer les poses de fixation en utilisant les fonctions de classement d’énergie (Li et al. , 2003). Toutes les poses sont classées dans différents groupes (basés sur les critères énergie/nombre/position) et les groupes les plus significatifs sont sélectionnés pour des études d’interaction.
Le résultat de cette modélisation est présenté en Fig. 1.
Exemple 2 : le niveau d’interaction et d’affinité du peptide MLK2001 envers la protéine ERK2 active a été testé par la technique de résonance des plasmons de surface (Biacore). La protéine ERK2 recombinante a été immobilisée par un couplage amine sur une puce, et les peptides ont été utilisés comme analytes mobiles. Un peptide TAT-NR2B9c, ne possédant pas de domaine d’encrage sur le DEF domaine de ERK2, ni de site de phosphorylation par ERK, a été utilisé comme contrôle de référence inactif. Les résultats sont présentés en Fig. 2 sur laquelle on observe que le signal de résonance (RU) est proportionnel à la liaison de l’électrolyte envers son ligand (ERK2).
Exemple 3 : on détermine l’affinité des peptides optimisés selon l’invention (MLK2002 à MLK2004) à 50nM sur la liaison envers ERK2 actif par la technique de Biacore, par comparaison au peptide MLK2001 à 50nM. Des peptides : séquence TAT seule, ou une séquence au hasard (Scramble : Scr) de la séquence MLK2001 ont été utilisés. Les résultats sont détaillés en Fig. 3. On constate que le peptide MLK2002 présente une affinité 1,5 fois plus importante envers ERK2 actif, comme indiqué par le signal de résonance (RU). En revanche les peptides MLK2003 et MLK2004 présentent une affinité moindre envers ERK2 actif.
Exemple 4 : Graphique présentant les affinités des peptides MLK2001, Scr, TAT et MLK2002 à MLK2004 selon le concept, envers ERK2 actif, à trois concentrations différentes : 10, 20 et 50 nM. Les résultats sont présentés en Fig. 4. Il existe une affinité croissante, dose dépendante pour les peptides MLK2001 à MLK2004, avec, pour chaque dose, une affinité plus importante pour le peptide MLK2002 par rapport au peptide MLK2001.
Exemple 5 : Phosphorylation de Elk-1 par ERK par les peptides selon l’invention
On a testé l’efficacité du peptide MLK2001 et du peptide modifié MLK2002 à faible dose (5μM) sur des cultures primaires de neurones striataux. Les extraits striataux sont réalisés à partir d’embryons de souris (E14). Après dissociation des tissus les cellules sont mises dans des puits de culture dans un milieu complet Neurobasal supplémenté à l’aide de B27 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 500 nM L-glutamine, 60 μg/ml penicillin G et 25 μM β- mercaptoethanol (Sigma, L'Isle d'Abeau, Chasnes, France) à 37°C dans une atmosphère humide (95% air and 5% CO2). Les traitements sont réalisés après 7 jours de mise en culture, quand la majorité des cellules sont d’un phénotype neuronal. Les peptides MLK2001 et MLK2002 sont ajoutés au milieu de culture à la dose de 5mM une heure avant le traitement a BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor, Peprotech France ; 50nM). L’inhibiteur de MEK U0126 est utilisé à la dose de 10mM et ajouté 30 minutes avant le traitement. 20 minutes après le traitement BDNF les cellules sont fixées à l’aide de paraformaldéhyde et immunomarquées comme indiqué dans Favaur et al. (J. Neuroscience, 2007) et Besnard et al. (J. Neuroscience 2011) à l’aide d’anticorps spécifiques des formes actives, phosphorylées, de ERK et Elk-1-1 (rabbit phospho-ERK 1/500 fournisseur à préciser ; et mouse phospho-Elk-1- 1 1/200, Santa cruz). Des puits séparés sont utilisés pour chaque immunomarquage. Après révélation à l’aide d’anticorps secondaire (anti-rabbit Alexa Fluor 488 (1:400), anti-mouse Alexa Fluor 488 (1:400)) un contre-marquage du noyau est réalisé par le Hoechst. Les puits ainsi traités sont montés sous lamelle dans du vectashield (ThermoFischer). L’acquisition des images est faite avec un objectif 40x sur un microsocope Feica DM400 assisté d’une caméra CCD. Les résultats sont représentés sur la Fig. 5 où on peut observer sur le panneau du haut une plus forte fluorescence correspondant au marquage phospho-Elk-1 qui est observée dans des neurones traités au BDNF ; alors que les peptides MLK2001, MLK2002 et le U0126 produisent une inhibition de cette fluorescence. Sur le panneau du bas on voit que le BDNF augmente la fluorescence phosho-ERK alors que le U0126 inhibe totalement cette fluorescence phospho-ERK, les peptides MLK2001 et 2002, comme attendu, n’affectent pas cette fluorescence. L’ensemble de ces résultats indiquent que le peptide MLK2002 à faible dose (5 M) produit une inhibition de phosphorylation de Elk-1, de la même façon, voire de façon plus efficace que le peptide MLK2001 à la même dose.
Exemple 6 : Toxicité des peptides selon l’invention
La toxicité du peptide MLK2001 et du peptide modifié MLK2002, a été testée à 5μM et 10 μM sur des cultures primaires de neurones striataux. Les neurones striataux ont été préparés comme indiqué Figure 5. Après 7 jours de mise en culture les peptides (5 μM et 10 μM) sont ajoutés directement dans le milieu ; Les peptides MLK2001 et MLK2002 sont ajoutés au milieu de culture. Vingt Quatre (24) heures après les neurones sont fixés au paraformaldéhyde. Un immunomarquage MAP2 (panneau du bas) est réalisé pour visualiser l’intégrité des neurites. Un marquage du noyau par le Hoechst permet de visualise l’intégrité nucléaire. Les puits ainsi traités sont montés sous lamelle dans du vectashield (ThermoFischer). L’acquisition des images est faite avec un objectif 40x sur un microscope Leica DM400 assisté d’une caméra CCD.
Les résultats sont présentés en Fig. 6. Sur le panneau du haut, une rétraction nucléaire est observée avec le peptide MLK2001 à 5 μM et 10 μM. Une meilleure intégrité nucléaire est observée avec le peptide MLK2002 aux deux doses. Sur le panneau du bas : le marquage MAP2 est fortement altéré par le peptide MLK2001 à 5 μM et 10μM. Ce marquage est intègre, par rapport au contrôle avec le peptide MLK2002 à 5 μM et 10 μM.
L’ensemble de ces résultats indique que le peptide MLK2002 est moins toxique à deux doses (5 et 10 μM) sur les neurones striataux en culture.
Exemple 7 : identification des sites de liaison de ERK2 La méthode de criblage in silico de la fixation de petites molécules envers le site de liaison du peptide DEF-Elk-1 au sein du domaine d’ancrage de ERK2 a permis de mettre en évidence 3 sites de liaison qui ont été séparés. Ces sites sont illustrés en Fig. 7.
Exemple 8 : Profil réalisé par la technique de Biacore en Single Cycle Kinetic (SCK) des courbes de saturation et des cinétiques d’association/dissociation des peptides MLK2001, MLK2002, MLK 2007 et MLK2008 selon l’invention sur la liaison envers ERK2 actif. Les graphiques de la Fig. 8 représentent les courbes de saturation à concentrations croissantes (5,
10 ; 15, 20, 30, 50, 70, 90 et 100 nM) des peptides MLK2001, MLK2022, MLK2007 et MLK2008. Les constantes d’association (ka 1/Ms : nombre de molécules associées par Milliseconde) et de dissociation (kd 1/s, nombre de molécules dissociées par seconde), ainsi que les RMax (RU) sont représentés dans les tableaux en -dessous des courbes de saturation.
Il est à noter (encadré noir) que les peptides MLK2007 et MLK2008 présentent un ka supérieur (7,22 e5 et 1,22 e6 molécules par Milliseconde respectivement) par comparaison à MLK1001 (5,44 e5), et que ces peptides se dissocient de façon équivalente. Le peptide MLK2002 possède un ka légèrement inférieur à celui de MLK2001 (3,93 vs, 5,44ee5 /Ms).
Les kd sont d’ordre équivalent pour les 4 peptides. Ces résultats indiquent que la conformation des peptides raccourcis et/ou Dénantiomères selon l’invention MLK2002, MLK2007 et MLK2008, se positionnent parfaitement dans le pocket domaine de ERK2, avec une cinétique d’association environ 6 fois supérieure pour MLK2008, suggérant ainsi des performances accrues sur les propriétés d’inhibition de la phosphorylation de Elk-1.
Exemple 9 : Profil par la technique de Biacore en Single Cycle Kinetic (SCK) des courbes de saturation et des cinétiques d’association/dissociation des peptides MLK2001, MLK2013 et MLK 2019 selon l’invention sur la liaison envers ERK2 actif. Les graphiques de la Fig. 9 représentent les courbes de saturation à concentrations croissantes cinétiques d’affinité à concentrations croissantes (5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 90 et 100 nM) des peptides MLK2001, MLK2013 et MLK2019. Les constantes d’association (ka 1/Ms) et de dissociation (kd 1/s), ainsi que les RMax (RU) sont représentés dans les tableaux.
Il est à noter (encadré noir) que les peptides acétylés en N-ter MLK2013 et MLK2019 présentent une constante d’association supérieure (1,26 et 1,48 e6 molécules par Miliseconde respectivement) par comparaison à MLK1001 (5,44 e5), c’est-à-dire supérieure de 6 fois environ.
Les kd sont d’ordre équivalent pour les 3 peptides.
Ces résultats indiquent que la conformation des peptides acétylés raccourcis ou non selon l’invention, MLK2013 et MLK2019, se positionnent parfaitement dans le pocket domaine de ERK2, avec une cinétique d’association environ 6 fois supérieure, suggérant ainsi des performances accrues sur les propriétés d’inhibition de la phosphorylation de Elk-1. En conséquence ces résultats montrent que les peptides MLK2013 et MLK2019 présentent un intérêt thérapeutique certain.
Exemple 10 : Mesure de la phosphorylation de Elk-1 par la méthode Elisa.
Cette expérience est illustrée par la Fig. 10. Des neurones primaires sont cultivés comme détaillé en Figures 5 et 6. Au jour 7, les neurones sont traités au BDNF (100ng/ml) pendant 15 minutes. Lorsqu’ indiqué, les inhibiteurs pharmacologiques U0126 (inhibiteur de MEK) ou les peptides MLK2001, MLK2002, MLK2007, MLK2008 et MLK2019 sont appliqués à deux doses : 5 μM (formes pleines) et 10 μM (formes hachurés) une heure avant le traitement BDNF. La phosphorylation de Elk-1 est évaluée par la méthode Elisa à l’aide d’un anticorps (Ac) anti phospho-Elk1 (Ser383), elle est normalisée par la valeur correspondante à Elk-1 total (valeur normalisée P-Elk-1 /Elk-1). Le niveau d’activation de P-Elk-1 /Elk-1 par le BDNF est mentionné par une barre horizontale en trait plein ; le niveau d’inhibition de P-Elk-1/Elk-1 par le U0126, inhibiteur de MEK, est mentionné un pointillé horizontal. Par comparaison nous avons un effet dose-dépendant des peptides MLK2001, MLK2002 et 2007, comparable au U0126, observé à 10 μM. Cette efficacité est observée dès 5 μM pour MLK2008. Il est à noter que de façon remarquable le peptide MLK2019 permet une inhibition complète, comparable au contrôle, et inférieure au niveau des autres inhibiteurs, dès la concentration de 5μM. Les peptides testés ici et particulièrement MLK2019 présentent un intérêt thérapeutique certain.
Exemple 11 : méthode de criblage de petites molécules ou criblage virtuel de repositionnement On a vu en détails la méthode d’identification appliquée à l’identification et l’optimisation de peptides ci-dessus. La méthode selon l’invention peut également être appliquée au criblage de petites molécules. On trouve des collections de petites molécules connues dans des chimiothèques académiques et/ou des chimiothèques commerciales.
La société Prestwick Chemical propose des chimiothèques de médicaments de référence, disponibles sous formes physique aussi bien qu’électronique, particulièrement bien adaptées au criblage virtuel de repositionnement.
La mise en œuvre de la méthode d’identification décrite dans la présente invention avec la chimiothèque Prestwick Chemical a permis l’identification de petites molécules interagissant fortement avec le site de liaison central du peptide DEL-Elk-1 envers ERK2. Ces molécules sont détaillées ci-dessous et regroupées en quatre séries. Il s’agit des molécules à propriétés antibactériennes de type beta-lactames (1ère série), des molécules à propriétés antipsychotiques de type 2-piperacetazine (2ème série), des molécules à propriétés anti H1R de type levocabastine (3ème série) et des molécules de type prostaglandine E1 (4ème série).
1ère série : Molécule de type beta-lactame à effet anti -bactérien [Chem 1]
1ère série : Molécule de type beta-lactame à effet anti -bactérien [Chem 2] 2ème série : molécule de type 2-Piperacetazine (Quide) à effet antipsychotique
[Chem 3]
3ème série : Levocabastine à effet anti H1R [Chem 4]
4ème série : Prostaglandine E1, EDEX
La première série décrit une large classe d’antibiotiques qui comprennent les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes, etc. qui sont connues de l’homme de l’art pour leurs propriétés antibactériennes.
La seconde série décrit une prodrogue à effet antipsychotique, souvent utilisée dans le traitement de la schizophrénie, ainsi que ses analogues structurels.
La troisième série décrit un antihistaminique H1 sélectif appelé lévocabastine ainsi que ses analogues structurels.
La quatrième série décrit la prostaglandine E1 (PGE1) qui est utilisée comme médicament pour ses propriétés vasodilatatrices, ainsi que ses analogues structurels.
Toutes ces molécules présentent une forte affinité avec le site de liaison du peptide DEF-Elk- 1 envers ERK2. Comme cela est détaillé ci-dessus ces molécules de type beta-lactames, 2- piperacetazine, levocabastine, prostaglandine E1 ainsi que leurs analogues peuvent être utilisée pour le traitement du cancer, des troubles de l’anxiété et de l’humeur et en particulier des dépressions résistantes, des addictions, du syndrome de Down, de la maladie d’Alzheimer, du lupus érythémateux et de l’amyotrophie spinale proximale.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Peptide inhibiteur de phosphorylation de Elk-1 par ERK1/2 caractérisé en ce que la séquence DEF-Elk-1 de SEQ ID N°25 est modifiée par suppression d’au moins un aminoacide en N-ter et/ou racémisation d’au moins un aminoacide et/ou substitution d’un ou deux aminoacides.
[Revendication 2] Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence DEF- Elk-1 est raccourcie dans la région N-ter par suppression de 1 à 2 aminoacides.
[Revendication 3] Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce qu’une racémisation de type D est appliquée à un ou plusieurs aminoacides situés en position 6, 8, 11 et 16 de la SEQ ID N°25.
[Revendication 4] Peptide selon la revendication 3 caractérisé en ce qu’une racémisation de type D est appliquée à au moins un aminoacide situé à l’une quelconque des positions 6, 11 et 16 de la SEQ ID N°25.
[Revendication 5] Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la substitution d’un ou deux aminoacides est réalisée dans la séquence consensus SSGS située en positions 11 à 14 de la SEQ ID N°25.
[Revendication 6] Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la séquence DEF -Elk-1 de SEQ ID N°25 est fusionnée en N-ter à une séquence permettant la pénétration intracellulaire.
[Revendication 7] Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce que la région N-ter de la SEQ ID N°25 fusionnée à une séquence de pénétration intracellulaire est acétylée.
[Revendication 8] Peptide selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu’il présente une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N° 2 à 24.
[Revendication 9] Peptide selon la revendication 8 caractérisé en ce qu’il est sélectionné parmi les peptides de SEQ ID N°2 ou de SEQ ID N°19.
[Revendication 10] Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 pour une utilisation médicale.
[Revendication 11] Peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 pour une utilisation dans le traitement du cancer, des troubles de l’anxiété et de l’humeur et en particulier des dépressions résistantes, des addictions, du syndrome de Down, de la maladie d’Alzheimer, du lupus érythémateux et de l’amyotrophie spinale proximale.
[Revendication 12] Composition pharmaceutique contenant une dose thérapeutiquement active d’au moins un peptide selon les revendications 1 à 9 pour une utilisation médicale.
[Revendication 13] Composition pharmaceutique selon la revendication 12 qui comprend un peptide selon l’une des revendications 1 à 9, une séquence d’acides nucléiques codant pour un peptide selon l’une des revendications 1 à 9, un vecteur comprenant cette séquence d’acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d’acides nucléiques ou le vecteur et un support pharmaceutiquement acceptable. [Revendication 14] Utilisation d’un peptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 ou d’une composition pharmaceutique selon l’une des revendications 12 ou 13 pour le traitement du cancer, des troubles de l’humeur et de l’anxiété, des addictions, du syndrome de Down, de la maladie d’Alzheimer, du lupus érythémateux et de l’amyotrophie spinale proximale.
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