EP4359433A1 - Nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de fos par erk1/2 - Google Patents

Nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de fos par erk1/2

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Publication number
EP4359433A1
EP4359433A1 EP22738609.1A EP22738609A EP4359433A1 EP 4359433 A1 EP4359433 A1 EP 4359433A1 EP 22738609 A EP22738609 A EP 22738609A EP 4359433 A1 EP4359433 A1 EP 4359433A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
sequence
peptides
fos
peptide according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22738609.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jocelyne Caboche
Peter Vanhoutte
Nicolas PIETRANCOSTA
Fabrice Trovero
Mathieu BARRIER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Melkin Pharmaceuticals
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Ecole Normale Superieure de Paris
Original Assignee
Melkin Pharmaceuticals
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Ecole Normale Superieure de Paris
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Melkin Pharmaceuticals, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Sorbonne Universite, Ecole Normale Superieure de Paris filed Critical Melkin Pharmaceuticals
Publication of EP4359433A1 publication Critical patent/EP4359433A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11024—Mitogen-activated protein kinase (2.7.11.24), i.e. MAPK or MAPK2 or c-Jun N-terminal kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention describes novel synthetic peptides which are inhibitors of c-Fos phosphorylation by ERK1/2 kinases.
  • a pharmaceutical composition containing said peptides as well as their use as active substances are also described.
  • a method for identifying novel inhibitors of c-Fos phosphorylation by ERK1/2 is also described.
  • MAP kinases for “Mitogen-Activated Protein kinase”
  • ERK1 and ERK2 ERK for “Extracellular signal-Regulated Kinase” are enzymes whose function is to add phosphate groups to target proteins in order to activate them. They are ubiquitous proteins involved in many cellular functions. They play an essential role in the transduction of intracellular signals. Their activation is done by extracellular signals which act on membrane receptors to induce the cascade activation of different intracytoplasmic actors, upstream of ERK1/2, in particular the Ras, Raf and MEK proteins; this is also referred to as the Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway.
  • ERK-like MAP kinases have many intracellular, membrane, cytoplasmic or nuclear substrates (Yang et al., Trends Pharmacol. Sci. 2019 Nov;40(ll):897-910) and it is the amplitude and duration activations of the intracellular signal cascade which will direct ERK1/2 towards one of its substrates.
  • the Ras-Raf-MEKl/2-ERKl/2 signaling pathway appears to be one of the most disrupted transduction pathways.
  • an aberrant activity of ERK1/2 leads to cell proliferation and anarchic cell mobility. It is therefore logical to develop inhibitors of this signaling pathway in order to slow down or even stop this disturbance.
  • ERK-like MAP kinase inhibitors have been developed. They generally target the Ras-Raf-MEKl/2-ERKl/2 pathway upstream of ERK, which completely blocks its activity and its binding to its various substrates downstream. Examples include PD98059 (2'-amino-3'-methoxyflavone) and U0126 (1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene), Trametinib ( GSK1120212), Cobimetinib (GDC0973), Mirdametinib (PD0325901) or Selumetinib (AZD6244) which are specific inhibitors of MEKs.
  • PD98059 (2'-amino-3'-methoxyflavone)
  • U0126 (1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene
  • EP1693458 the inventors have demonstrated synthetic peptides allowing the selective inhibition of the ERK-type MAP kinase pathway towards a given substrate.
  • the different substrates of ERK1/2 have consensus sequences called binding or docking sites, known to those skilled in the art, which allow the binding of ERK1/2 to its substrates. These sequences are known under the terms DEF and/or FXFP and D or LXL (see EP1693458).
  • the DEF-binding domain of specific substrates of ERK1/2 is responsible for the recruitment of ERK1/2 to immediate early expression genes (or immediate early gene) and transcription factors (see EP1988169).
  • This DEF binding domain can bind peptides having a consensus sequence of the FXFP or (F/Y)X(F/Y)P type in which F denotes Phenylalanine (Phe) Y denotes Tyrosine (Tyr), P denotes Proline ( Pro) and X any natural amino acid (Sharrocks et al., Trends Biochem Sci. 2000 Sep;25(9):448-53).
  • the D domain is essential for the activation of different series of substrates, including RSK (for 90 kDA ribosomal S6 kinase) and phosphatases (MAP kinases Phosphatases or MPK). It is also the binding site for MEK1/2 which are located upstream of ERK1/2 in the intracellular signaling cascade.
  • RSK for 90 kDA ribosomal S6 kinase
  • MAP kinases Phosphatases or MPK phosphatases
  • MEK1/2 inhibitors are or have been studied during clinical trials.
  • Selumetinib Semumetinib, Refametinib, Cobimetinib, Trametinib (Samatar et al., Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec; 13(12): 928-42).
  • MEK1/2 inhibitors have an overall effect on the inhibition of ERK1/2 and its substrates and they thus have a pleiotropic, nonspecific and deleterious effect.
  • Ongoing clinical trials show in particular that there are many side effects depending on the doses administered and that drug resistance sets in.
  • Peptides containing the DEF domain of a specific substrate downstream of ERK inhibit the binding and phosphorylation of said substrate without impacting the other activities of ERK1/2 or the phosphorylation of other substrates. There are therefore much fewer side effects of this inhibition in the intracellular signal transduction ERK1/2.
  • Patent EP1988167 describes the use of TAT-DEF type peptides, capable of penetrating into cells, as specific inhibitors of substrates downstream of ERK.
  • the present invention describes new peptides which are inhibitors of Fos phosphorylation by ERK1/2 and which are derived from those described in EP1988167. These new synthetic peptides are modified in order to make them more stable and more effective than those described in EP1988167.
  • the inventors used 3D in silico modeling of the attachment pocket of the anchoring domain of ERK2 to substrates containing the DEF domain so as to be able to position known ligands, in particular DEF-Fos peptides according to patent EP1988169 and to characterize their interaction with this fixation pocket.
  • This makes it possible to define the essential and non-essential positions in the binding of known peptides, in particular DEF-Fos type peptides, to the DEF anchoring domain of ERK2 and to optimize potential inhibitors of Fos phosphorylation by ERK1/2 .
  • Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2 or Ras-Raf-MEK-ERK or ERK or ERK1/2 intracellular signaling pathway are equivalent and refer to the same signaling pathway or cascade.
  • the term "docking method” or “docking method” refers to the method of calculating the preferred orientation of a molecule towards a second when they are linked to form a stable complex. Determining this preferred orientation serves to predict the strength of the bond between two molecules and possibly its effectiveness. Docking, binding, anchoring or mooring studies are therefore used to determine the affinity between the molecules studied and to quantify the consequences of the binding of a ligand to a receptor.
  • fixing method, anchoring method or mooring method can be used to refer to the docking method.
  • FIG. 1 describes the in silico modeling of the interaction between the DEF-Fos domain of MLK1001 and the binding pocket of the ERK2-DEF domain of the active kinase. This modeling allows the visualization of the amino acids essential to said interaction. The amino acids shown start at the first amino acid.
  • FIG 2 describes the antiproliferative properties of DEF-Fos inhibition by MLK1001 on different tumor cell lines of human origin. Cellular proliferation is measured by incorporation of BrdU in the presence of bovine serum.
  • FIG 3 represents the antiproliferative properties of the new peptides according to the invention on HPAF-II pancreatic carcinoma cells.
  • FIG 4 depicts cell cycle progression by Ki-67 immunostaining on HPAF-II cells after addition of serum (10%) in the presence of Selumetinib (MEK inhibitor, reference product), MLK-1001 peptide and some new peptides according to the invention.
  • FIG 5 describes the surface plasma resonance (SPR) method by Biacore, to determine the levels of interaction and the affinities of certain peptides (MLK1001 and MLK1008) according to the invention.
  • FIG 6A describes the kinetics of association and dissociation of the MLK1001 peptide according to the invention at 1.25; 2; 5; 10 and 20 nM on the ERK2 protein by the Biacore method.
  • FIG 6B describes the kinetics of association and dissociation of the MLK1008 peptide according to the invention at 1.25; 2; 5; 10 and 20 nM on the ERK2 protein by the Biacore method.
  • the docking experiments were carried out with the MLK1001 peptide of SEQ ID No. 1 as ligand of the ERK2-DEF domain.
  • the in silico modeling method made it possible to precisely study the interactions between MLK1001 of SEQ ID No. 1 and the binding pocket of DEF-Fos type ligands. From this experience, new compounds were designed and synthesized. These are described in Table No. 1 below. Compared to MLK1001 of SEQ ID No. 1 they are either shortened, or stabilized, or both.
  • inhibitory peptides were designed as follows: they contain a sequence rich in basic amino acids of the HIV-TAT protein followed by two prolines (PP) and then by the DEF binding domain of Fos (hereafter DEF- Fos) surrounded by amino acids.
  • amino acid amino acid or amino acid are equivalent and refer to the structural units of proteins and peptides. These are molecules organized around the same basic structure, a carbon atom, which bears the acid function -COOH, the basic amine function -NH 2 , a hydrogen atom -H and a radical -R of variable structure which distinguishes and characterizes the twenty amino acids found naturally in proteins.
  • the twenty natural standard amino acid residues are named A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y and V in the one-letter classification or Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, and Val in the classification three letters.
  • deletion of an amino acid is understood in its primary sense, namely the fact of deleting an amino acid from the peptide sequence of interest.
  • an amino acid considered to be non-essential to the functionality of the peptide is deleted, which makes it possible to reduce the size of the peptide sequence and possibly to optimize the functionality of the peptide.
  • substitution means the replacement of one amino acid residue with another selected from the 20 natural standard amino acid residues, rare natural amino acid residues and amino acid residues unnatural.
  • substitution refers to the replacement of an amino acid residue by another chosen from the 20 natural standard amino acid residues (A, R, N, D, C, Q, E, G , H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y and V).
  • substitution(s) may be conservative or non-conservative substitutions.
  • conservative substitution refers to a substitution of one amino acid residue for another that exhibits similar chemical or physical properties (size, charge, or polarity).
  • racemization refers to a physical property which is the transformation of an optically active compound into a racemic form which is optically inactive; for amino acids it is the transition from one enantiomer or stereoisomer (optical isomers with opposite specific optical rotation) to another. This transformation has an impact on the structure and functionality of the peptides.
  • it is a type D racemization (for dextrogyre) by opposed to L (for levorotatory) because the amino acids in their natural state are of type L with the exception of glycine. D-racemization of one or more amino acids makes the peptide more stable.
  • Table 1 Synthetic peptides derived from TAT-DEF-Fos
  • the amino acids corresponding to the DEF-Fos sequence are underlined and it is this sequence of 20 amino acids (SEQ ID No. 14) is essentially modified as follows: the C-ter region is shortened so as to allow perfect positioning of the beta sheet (see for example SEQ ID Nos. 8, 9, 10, 11, 12 and 13).
  • the peptides detailed above include an intracellular penetration sequence of the HIV TAT type of SEQ ID No. 15, but this sequence is purely functional and can be substituted by any sequence of equivalent function known to those skilled in the art, such as penetratin , a sequence of 7 to 11 arginine residues, an X7/11R type sequence of 7 to 25 amino acids comprising 7 to 11 arginine residues positioned randomly in said sequence, a sequence derived from DPVs (Diatos peptide vectors) or any other cell penetration sequence.
  • DPVs Diatos peptide vectors
  • the peptide of SEQ ID No. 14 is fused at N-ter to a sequence allowing cell penetration.
  • Said cell penetration sequence is selected from a cell penetration sequence of the HIV TAT type, penetratin, a sequence of 7 to 11 arginine residues, a sequence of the X7/11R type of 7 to 25 amino acids comprising 7 to 11 arginine residues randomly positioned in said sequence, a sequence derived from DPVs (Diatos peptide vectors) or any other cell-penetrating sequence.
  • said intracellular penetration sequence is HIV TAT of SEQ ID No. 15 and the new peptides according to the invention have a sequence selected from SEQ ID Nos. 2 to 13.
  • the new peptides according to the present invention are selected from the peptides of SEQ ID Nos. 2 to 24, preferentially from the peptides of SEQ ID Nos. 8 to 13, even more preferentially from the peptides of SEQ ID Nos. 8 and 12.
  • amino acids of SEQ ID No. 14 corresponding to the DEF-Fos sequence are modified as follows: the C-ter region is shortened so as to allow perfect positioning of the beta sheet in the pocket of (see for example SEQ ID Nos. 8, 9, 10, 11, 12 and 13).
  • a type D racemization (or D racemization) is applied to the non-essential amino acids to stabilize each of these new peptides (see for example SEQ ID N°10, 11, 12 and 13) which is indicated by a lowercase letter in bold ; and or
  • the threonine residue (T/Thr) is replaced by an acid residue aspartic (D/Asp), represented by a double underlining, to provide phosphomimetic properties (see SEQ ID Nos. 12 and 13); and or
  • N-ter region can be shortened in sequence by 4 amino acids CTTY.
  • the present invention provides new synthetic peptides which are inhibitory ligands of Fos protein phosphorylation by ERK1/2.
  • the peptide of SEQ ID No. 14 is fused at N-ter to a sequence allowing cell penetration.
  • Said cell penetration sequence is selected from a cell penetration sequence of the HIV TAT type, penetratin, a sequence of 7 to 11 arginine residues, a sequence of the X7/11R type of 7 to 25 amino acids comprising 7 to 11 arginine residues randomly positioned in said sequence, a sequence derived from DPVs (Diatos peptide vectors) or any other cell-penetrating sequence.
  • said intracellular penetration sequence is HIV TAT and the new peptides according to the invention have a sequence selected from SEQ ID Nos. 8 to 13.
  • the new peptides according to the present invention are selected from the peptides of SEQ ID Nos. 8 to 13, preferably from the peptides of SEQ ID Nos. 8 and 12.
  • DEF-Fos peptides characterized in that the sequence of 20 amino acids DEF-Fos of SEQ ID No. 14 is modified in at least one position.
  • the DEF-Fos peptides are characterized in that the DEF-Fos sequence is modified in at least two positions.
  • modification is meant the deletion of one or more amino acid (s) in C-ter, and / or the substitution of one or more amino acid (s) and / or the D racemization of one or more amino acid and / or the mutation of a Ser phosphorylation site into a constitutively active Asp residue, and/or the acetylation of the N-terminal region.
  • the invention describes a DEF-Fos peptide characterized in that the DEF-Fos sequence of SEQ ID No. 14 is modified by deletion of one or more amino acids at C-ter, preferentially from 1 to 8 amino acids and even more preferentially from 8 amino acids; and/or substitution and/or racemization of at least one amino acid on a position of SEQ ID No. 14.
  • Said peptides are in particular selected from the peptides of SEQ ID Nos. 8 to 13.
  • the peptides are characterized in that the DEF-Fos sequence of SEQ ID No. 14 is shortened in the C-ter region by 1 to 8 amino acids, preferably by 8 amino acids.
  • Said peptides are in particular selected from the peptides of SEQ ID No. 8, 9, 10, 11, 12 and 13.
  • the amino acid threonine (T/Thr) of the consensus sequence FVFT is replaced by an amino acid asparagine (D/Asp).
  • the peptides according to the invention are in particular selected from the peptides of SEQ ID Nos. 12 and 13
  • a type D racemization is applied to the non-essential amino acid located in position 6 of SEQ ID No. 14.
  • the peptides according to the invention are in particular selected from the peptides of SEQ ID Nos. 10, 11, 12 and 13.
  • the peptides according to the invention are characterized in that the DEF-Fos sequence of SEQ ID No. 14 is shortened in the N-ter region by 1 to 4 amino acids, preferably by 4 amino acids.
  • the N-ter region is acetylated.
  • the peptides according to the invention are in particular selected from the peptides of SEQ ID Nos. 9, 11 and 13.
  • the peptides according to the invention are selected from the peptides of SEQ ID No. 8 to 13, preferentially from the peptides of SEQ ID No. 8 and SEQ ID No. 12.
  • the peptides according to the invention correspond to SEQ ID No. 8.
  • the peptides according to the invention correspond to SEQ ID No. 12.
  • the present invention describes new DEF-Fos peptides characterized in that the DEF-Fos sequence of SEQ ID No. 14 is modified by deletion in the C-ter region of 1 to 8 amino acids, preferably 8, in which: at least one amino acid T (Thr) of the FVFT consensus sequence is replaced by amino acid D (Asp); and/or a type D racemization is applied to a non-essential amino acid located at position 6 of SEQ ID No. 14; and/or the N-ter region of SEQ ID No. 14 is acetylated.
  • the new peptide according to the invention has a sequence selected from SEQ ID Nos. 8 to 13, preferably from SEQ ID Nos. 8 and 12.
  • the invention describes a method for identifying novel inhibitors of Fos phosphorylation by ERK1/2.
  • This identification method includes the following steps: has. develop a 3D model of the anchoring domain of ERK2 to substrates containing a DEF site, based on the crystal structure of the ERK2 AMP-PNP complex (pdb code 4S32) as a receptor; b. model in 3D the binding of a peptide known as a ligand of this domain to bind to the binding site of the active ERK2 kinase; vs. perform a protein-ligand docking study using the LibDock algorithm; d.
  • this method for identifying molecules capable of binding to the DEF domain of ERK2 towards c-Fos in a manner similar to the peptides detailed above comprises the following steps: a. use the 3D model of the DEF domain of ERK2 towards c-Fos based on the crystal structure of the ERK2 AMP-PNP complex as a receptor; b. test in silico the attachment or “docking” of different molecules on the binding pocket of the DEF domain of ERK2 towards c-Fos; vs. synthesizing said molecules having good binding affinity; d. study the affinity of each molecule for the binding pocket of the DEF domain of ERK2 and select the best binding affinities; e. testing the biological activity and/or the properties of the molecule or molecules selected in d. and synthesized in c.
  • the present invention also describes a method for identifying peptidomimetic molecules of the new peptides according to the invention, therefore capable of binding very precisely in the binding pocket of the DEF-Fos type ligands towards ERK2 and thus of inhibiting the phosphorylation of c-Fos by ERK1/2.
  • peptidomimetic molecules or peptidomimetic ligands is meant small molecules, which are designed to mimic the activity of active peptides. In research on peptidomimetic molecules the sole objective is to design and synthesize, or identify, small molecules that have a very specific effect on the identified target with minimal or no side effects.
  • the peptidomimetic molecules are ligands of the binding pocket of the DEF domain of ERK2 towards c-Fos and capable of inhibiting the phosphorylation of c-Fos by ERK1/2.
  • This method for identifying peptidomimetic molecules comprises the following steps: a. using the 3D model of the DEF domain of ERK2 based on the crystal structure of the ERK2 AMP-PNP complex (pdb code 4S32) described above, as a receptor; b. perform in silico a high-throughput screen of different small molecules capable of binding to the binding pocket of the DEF domain of ERK2 towards c-Fos; vs. synthesizing said molecules having good binding affinity; d. study the affinity of the molecules selected in the screening for their binding affinity towards ERK2; e. testing the biological activity and/or the properties of the molecule(s) synthesized in c and selected in d.
  • the present invention describes a method for identifying peptides that inhibit the binding of c-Fos to the DEF domain of ERK1/2, but also a method for identifying small molecules of a non-peptide nature which also exhibit an inhibitory activity of the binding of c-Fos to the DEF domain of ERK1/2.
  • These peptides or peptidomimetics are inhibitors of c-Fos phosphorylation by ERK1/2.
  • the invention describes a novel c-Fos phosphorylation inhibitor peptide by ERK1/2 for medical use.
  • the invention describes a pharmaceutical composition containing a therapeutically active dose of at least one peptide according to the present invention.
  • This pharmaceutical composition comprises a peptide according to the invention, a nucleic acid sequence coding for a peptide according to the invention, a vector comprising this nucleic acid sequence, or a cell comprising the nucleic acid sequence or the vector and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a "pharmaceutical composition” means a preparation of one or more of the active agents together with other optional chemical components such as carriers physiologically appropriate and/or excipients.
  • the purpose of a pharmaceutical composition is to facilitate the administration of the active agent to an organism.
  • the compositions of the present invention may be presented in a form suitable for any conventional route of administration or use.
  • the pharmaceutical composition according to the invention encompasses the pharmaceutical compositions used in human medicine and the pharmaceutical compositions used in animal medicine, ie veterinary compositions.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also describes the use of a new peptide according to the invention for the treatment of inflammatory diseases, restenosis or cancer.
  • cancer is meant in particular colon cancer, pancreatic cancer, melanoma, breast cancer, ovarian cancer, kidney cancer, thyroid cancer, bladder cancer, leukemia, gliomas , neurofibromatosis, and osteosarcoma.
  • inflammatory diseases is meant in particular chronic inflammatory bowel diseases with ulcerative colitis and Crohn's disease, as well as rheumatoid arthritis.
  • restenosis is meant the inflammatory reactions of the vascular smooth cells after the placement of a stent (endoprosthesis) in cardiovascular diseases.
  • the present invention also describes the use of a new peptide according to the invention for the treatment of colon cancer, pancreatic cancer, melanoma, breast cancer, ovarian cancer, kidney cancer, cancer thyroid, bladder cancer, leukemia, gliomas, neurofibromatosis, and osteosarcomas, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis and Crohn's disease, rheumatoid arthritis, and inflammatory reactions of vascular smooth cells after placement of a stent (endoprosthesis) in cardiovascular diseases.
  • a new peptide according to the invention for the treatment of colon cancer, pancreatic cancer, melanoma, breast cancer, ovarian cancer, kidney cancer, cancer thyroid, bladder cancer, leukemia, gliomas, neurofibromatosis, and osteosarcomas, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis and Crohn's disease, rheumatoid arthritis, and inflammatory reactions of vascular smooth cells after placement of a stent (endoprosthesis)
  • the present invention describes a method for treating cancer comprising the administration of a pharmaceutical composition containing a therapeutically active dose of a peptide according to the invention, to allow the inhibition of the phosphorylation of Fos by ERK1/2.
  • treatment refers to achieving a desired pharmacological and/or physiological effect.
  • the effect may be prophylactic in terms of total or partial prevention of a disease or symptom and/or may be therapeutic in terms of partial or complete cure of a disease and/or adverse effect attributable to the disease.
  • treatment covers any treatment of a disease in a mammal, particularly in a human, to: reduce the incidence and/or risk of relapse of the disease during a symptom-free period; relieve or reduce a symptom of the disease; prevent the disease from occurring in a subject who may be predisposed to the disease but has not yet been diagnosed as having it; inhibit the disease, i.e. stop its development (for example, reduce the rate of disease progression); reduce the frequency of episodes of the disease; slowing down the development of the disease and alleviating the disease, that is, causing a total or partial regression of the disease.
  • terapéuticaally active dose refers to an amount which results in an improvement in the condition of an organ or a subject, or in a reduction in the disease, disorder or symptoms of the disease or disorder in question.
  • the invention describes a method for inhibiting and/or preventing the proliferation of cell lines selected from the group comprising vascular smooth muscle cells, fibroblasts and nerve cells, said method involving the administration of a therapeutically active dose of at least one peptide according to the invention.
  • Example 1 3D modeling to position MLK1001 in the binding pocket to the DEF domain of the active ERK2 kinase.
  • the crystal structure of the ERK2 AMP-PNP complex (pdb code 4S32) was used as a receptor to perform the docking experiments.
  • the protein has been cleaned up and prepared for fixing (eg separation of structures into separate molecules, addition of missing atoms, correction of connectivity, correction of names, insertion of missing loops, etc.).
  • the peptide thus obtained is considered as a small compound or as a small protein.
  • the putative binding sites were selected according to the cavities in the structure of the receptor when the peptides are considered as small compounds or by using the ZDOCK software (exhaustive search scheme of all the rotational and translational spaces between the ligand protein and the receptor protein, which is fixed in its original orientation when the peptide is considered a small protein).
  • Binding of the ligand protein is performed using Libdock methodology and software.
  • Libdock uses the characteristics of protein sites as “HotSpots” which are classified into two categories: polar and apolar HotSpots.
  • the receiver's HotSpots map was established prior to the attachment procedure.
  • Ligand conformations are randomly generated from the initial ligand structure using high temperature molecular dynamics in a “Catalyst” algorithm prior to binding.
  • the poses of the rigid ligand were positioned in the active site of the receptor and the HotSpots were matched by triplets. The poses have been trimmed and an optimization step is performed before the pose is classified.
  • the hydrogen ligands that have been removed during the fixation phase are added to the ligand poses and optimized by minimization.
  • the poses with the highest LibDock scores are identified and then grouped according to their mode of fixation.
  • the protein/protein docking experiment is performed using ZDOCK software.
  • This software is a protein/protein rigid structure docking algorithm based on the FFT (Fast Fourier Transform) correlation technique which is used to explore the rotational and translational spaces of the protein/protein system (Chen et al. 2003). Docking is also carried out without constraints or selection of specific residues on ERK or on peptides.
  • the poses obtained (2000 per cycle) are refined using the rDOCK module (DS Modeling 2.5).
  • rDOCK is an energy minimization procedure for refining and classifying fixation poses using energy ranking functions (Li et al., 2003). All poses are classified into different groups (based on energy/number/position criteria) and the most significant groups are selected for interaction studies.
  • the inventors have already shown an antiproliferative effect of compound MKL1001 of SEQ ID No. 1 on cell proliferation and this effect is described in EP3164413.
  • the antiproliferative properties were studied by a BrdU assay on different human tumor cell lines: colon, bladder, prostate and pancreatic carcinoma.
  • the compound of SEQ ID No. 1 was tested in increasing doses (from 2 to 100 mM) and, in parallel, two controls were carried out with MEK inhibitors of the prior art: AZD6244 and PD184352 at 1 mM.
  • the tumor cells were cultured in a humidified chamber at 5% C02 at 37°C in the presence of a complete medium (RPMI 1640 or DMEM/F12 depending on the cell type) supplemented with fetal bovine serum at 10%, 50 units/ml penicillin and 50 pg/ml streptomycin (GIBCO). Then: the MKL1001 compound of SEQ ID No. 1 at different concentrations and the reference products (MEK inhibitors) are incubated with the cells for 24 hours at 37°C. BrDu (10mM final concentration) is then added and the cells incubated for an additional 20 h at 37°C. the incorporation of BrDu into the DNA is revealed by an ELISA test using a BrdU kit according to the supplier's recommendation (Roche ® , 11647229001).
  • Fig. 2 shows the cell proliferation measured by incorporation of BrdU after addition of serum on tumor cell lines of human origin.
  • Panels left response doses of the MLK1001 peptide compared to the reference products (MEK inhibitors: selumetinib and PD184352).
  • the MLK1001 peptide produces proliferation inhibition from 20mM on pancreatic carcinoma, 60mM on bladder adenocarcinoma and prostate carcinoma lines, and 6mM on colon adenocarcinoma, with a rebound effect on this last line.
  • the inhibitory effects are comparable to the reference product Selumetinib (dotted line).
  • Left panels inhibitory effects of peptide MLK1001 on melanoma and neurofibromatosis type I lines.
  • the cells are first synchronized for 48h with 0.1% FBS (no serum) followed by 48h with 10% FBS (10% serum).
  • FBS fetal bovine serum
  • the MEK inhibitors Selumetinib or PD184352 (1 mM each) or the peptides according to the invention are applied during the FBS treatment.
  • the BrdU is added to the medium 8 hours after the addition of the serum, in the presence of peptides or not, and left for 36 hours.
  • the cell proliferation is determined by immunological labeling of BrdU, and quantified by comparison with the total nuclei (as labeled with DAPI). The results are twice as high for BrdU/DAPI positive cells in the presence of 10% serum (without effect of the addition of DMSO).
  • MLK1001 does not exhibit antiproliferative properties at the tested doses of 0.1 to 30 mM (Fig. 3).
  • the new peptides MLK1002 to MLK1007 do not exhibit antiproliferative properties at these same doses on the HPAF-II line (data not shown).
  • a significant effect is observed from 30 mM for MLK1008, 1009, 1010, 1011 and 1012 and at 10 mM for MLK1011 and 1012 (see Fig. 3).
  • the MLK1008 to MLK1010 peptides produce an inhibition of cell proliferation from 30 mM similar to the reference product PD183452 (shaded dotted line in FIG. 3) and the MLK1011 and MLK1012 peptides from 10 mM.
  • the MLK1013 peptide does not inhibit cell proliferation on the HPAF-II line.
  • the cell cycle is determined by Ki67 immunostaining after treatment of HPAF-cells. It with 10% SBF serum for 48 hours, in the presence or not of the peptides according to the invention. MEK inhibitors are used as a positive control.
  • Top left shows the effect of the reference product (Selumetinib) on the lengthening of the G0/G1 phase. A stabilization of the tumor cells in a state of quiescence is observed.
  • the MLK1001 peptide produces a decrease in the G2/S phase and an increase in the G0/G1 phase from 10mM because an increase in quiescent cells is observed.
  • the bottom six panels show the comparative effects of the MLK1008 to MLK1013 peptides on the cell cycle as measured by Ki67 immunostaining. It should be noted the effectiveness of the MLK1008 and MLK1012 peptides from 3 mM.
  • the MLK1008 to MLK1012 peptides show an increase in GO/Gi phases compared to G2/S, which shows cell cycle blockage. This GO/Gi phase blocking is observed at lower doses for the MLK1008 and MLK1012 peptides, up to 3 mM (Fig. 4 bottom panels) compared to MLK1001 (Fig. 4, top right panel).
  • the affinities of the MLK1001 and MLK1008 peptides towards the ERK2 proteins were tested by the surface plasma resonance (SPR) technique using a Biacore 3000 apparatus (FIG. 5).
  • the ERK2 recombinant protein was immobilized by an amine coupling on the chip composed of a layer of dextran placed on a gold leaf, itself placed on a glass plate.
  • the MLK1001 and MLK1008 peptides have been used as analytes in the microfluidics cell; these peptides are mobile.
  • the analyzes carried out are a quantification of the resonance signal (RU) therefore an analysis on a single bond and an analysis on kinetic cycles with calculations of affinity constants.
  • RU resonance signal
  • the analysis of the ERK2 interaction with the peptides was studied via the SPR signal.
  • the negative controls included a Scramble peptide (TAT+random AA sequence: GRKKRRQRRRPPQSKPSGSQHPIFSLAFVAS, cf Lavaur and Caboche, J. Neurosci, 2007 for validation) and a TAT sequence comprising an interfering sequence between the NMDA2B receptor and PSD 95 (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV).
  • Table 2 affinity constants of the MLK1001 and MLK1008 peptides defined by the Biocore technique The analyzes revealed twice the affinity (dissociation constant at equilibrium K D ) of the MLK1008 peptide towards ERK2 (KD: 4.54 nM) compared to the MLK1001 peptide (10.5 nM) (see Table 2 above and Fig. 6A and 6B).

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Abstract

La présente invention décrit de nouveaux peptides synthétiques qui sont des inhibiteurs de phosphorylation de c-Fos par les kinases ERK1/2. Une composition pharmaceutique contenant lesdits peptides ainsi que leur utilisation en tant que substances actives sont également décrites. Une méthode d'identification de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de c-Fos par ERK1/2 est également décrite.

Description

DESCRIPTION
Titre : Nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Fos par ERK1/2 DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention décrit de nouveaux peptides synthétiques qui sont des inhibiteurs de phosphorylation de c-Fos par les kinases ERK1/2. Une composition pharmaceutique contenant lesdits peptides ainsi que leur utilisation en tant que substances actives sont également décrites. Une méthode d'identification de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de c-Fos par ERK1/2 est également décrite.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
Les MAP kinases (pour « Mitogen-Activated Protein kinase ») ERK1 et ERK2 (ERK pour « Extracellular signal-Regulated Kinase ») sont des enzymes dont la fonction est d'ajouter des groupements phosphate à des protéines cibles afin de les activer. Ce sont des protéines ubiquitaires impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires. Elles ont un rôle primordial dans la transduction de signaux intracellulaires. Leur activation se fait par des signaux extracellulaires qui agissent sur des récepteurs membranaires pour induire l'activation en cascade de différents acteurs intracytoplasmiques, en amont de ERK1/2, en particulier les protéines Ras, Raf et MEK ; on parle également de voie de signalisation Ras-Raf-MEKl/2-ERKl/2. Les MAP kinases de type ERK ont de nombreux substrats intracellulaires, membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires (Yang et al., Trends Pharmacol. Sci. 2019 Nov;40(ll):897-910) et c'est l'amplitude et la durée des activations de la cascade de signaux intracellulaire qui va diriger ERK1/2 vers l'un de ses substrats.
Dans les cancers chez l'humain, la voie de signalisation Ras-Raf-MEKl/2-ERKl/2 semble être l'une des voies de transduction les plus perturbées. Ainsi, consécutivement à des mutations des protéines Ras, Raf ou MEK rencontrées dans une grande variété de cancers, une activité aberrante de ERK1/2 conduit à des proliférations cellulaires et une mobilité anarchiques des cellules. Il est donc logique de développer des inhibiteurs de cette voie de signalisation en vue de ralentir voire de stopper cette perturbation.
De nombreux inhibiteurs des MAP kinase de type ERK ont été développés. Ils ciblent en général la voie Ras-Raf-MEKl/2-ERKl/2 en amont de ERK ce qui bloque totalement son activité et sa liaison à ses divers substrats en aval. À titre d'exemple on citera PD98059 (2'-amino-3'-méthoxyflavone) et U0126 (l,4-Diamino-2,3-dicyano-l,4-bis(2-aminophenylthio) butadiène), le Trametinib (GSK1120212), le Cobimetinib (GDC0973), le Mirdametinib (PD0325901) ou le Selumetinib (AZD6244) qui sont des inhibiteurs spécifiques des MEKs. Les inhibiteurs spécifiques des kinases en amont des MAP kinases de type ERK bloquent la voie de signalisation Ras-Raf-MEKl/2-ERKl/2 mais comme leur action se situe en amont des MAP kinases de type ERK, ceci résulte en une inhibition complète des MAP kinases de type ERK, et par conséquent de tous les substrats en aval, sans discrimination entre ceux-ci et sans distinction de leur localisation cellulaire.
Être capable d'agir au niveau de l'interaction entre la MAP kinase de type ERK et son substrat, donc en aval de la voie de signalisation intracellulaire ERK permet de bloquer la voie de signalisation ERK de façon spécifique tout en autorisant ses autres fonctions, notamment sur l'homéostasie cellulaire normale.
Dans EP1693458 les inventeurs ont mis en évidence des peptides synthétiques permettant l'inhibition sélective de la voie des MAP kinases de type ERK envers un substrat donné. Les différents substrats de ERK1/2 présentent des séquences consensus dites sites de fixation ou de docking, connues de l'homme de l'art, qui permettent la fixation de ERK1/2 sur ses substrats. Ces séquences sont connues sous les termes, DEF et/ou FXFP et D ou LXL (voir EP1693458).
Le domaine de liaison DEF des substrats spécifiques de ERK1/2 est responsable du recrutement de ERK1/2 vers les gènes à expression précoce immédiate (ou gène immédiat précoce) et les facteurs de transcription (voir EP1988169). Ce domaine de liaison DEF peut fixer des peptides ayant une séquence consensus de type FXFP ou (F/Y)X(F/Y)P dans lequel F désigne la Phénylalanine (Phe) Y désigné la Tyrosine (Tyr), P la Proline (Pro) et X n'importe quel aminoacide naturel (Sharrocks et al., Trends Biochem Sci. 2000 Sep;25(9):448-53).
Le domaine D est indispensable à l'activation de différentes séries de substrats, incluant RSK (pour 90 kDA ribosomal S6 kinase) et les phosphatases (MAP kinases Phosphatases ou MPK). C'est également le site de liaison des MEK1/2 qui sont situées en amont de ERK1/2 dans la cascade de signalisation intracellulaire.
De nombreuses équipes développent des inhibiteurs de MEK1/2 dans le but de proposer des solutions thérapeutiques dans diverses pathologies et notamment en oncologie, dans les troubles du système nerveux central et dans l'inflammation. On citera à titre d'exemple d'inhibiteurs de MEK1/2 qui sont ou ont été étudiés durant des essais cliniques Selumetinib, Refametinib, Cobimetinib, Trametinib (Samatar et al., Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):928-42).
Ces inhibiteurs de MEK1/2 ont un effet global sur l'inhibition de ERK1/2 et de ses substrats et ils ont ainsi un effet pleïotrope, non spécifique et délétère. Les essais cliniques en cours montrent notamment que les effets secondaires sont nombreux en fonction des doses administrées et qu'une résistance au médicament s'installe. Les peptides contenant le domaine DEF d'un substrat spécifique en aval de ERK inhibent la liaison et la phosphorylation dudit substrat sans impacter les autres activités de ERK1/2 ou la phosphorylation d'autres substrats. Il y a donc beaucoup moins d'effets secondaires de cette inhibition dans la transduction du signal intracellulaire ERK1/2.
Le brevet EP1988167 décrit l'utilisation de peptides de type TAT-DEF, capables de pénétrer dans les cellules, en tant qu'inhibiteurs spécifiques de substrats en aval de ERK.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention décrit de nouveaux peptides qui sont des inhibiteurs de la phosphorylation de Fos par ERK1/2 et qui sont dérivés de ceux décrits dans EP1988167. Ces nouveaux peptides synthétiques sont modifiés afin de les rendre plus stables et plus efficaces que ceux décrits dans EP1988167.
Les inventeurs ont utilisé la modélisation 3D in silico de la poche de fixation du domaine d'ancrage de ERK2 envers des substrats contenant le domaine DEF de façon à pouvoir positionner des ligands connus, en particulier des peptides DEF-Fos selon le brevet EP1988169 et caractériser leur interaction avec cette poche de fixation. Ceci permet de définir les positions essentielles et non essentielles dans la liaison de peptides connus, en particulier des peptides de type DEF-Fos, au domaine d'ancrage DEF de ERK2 et d'optimiser de potentiels inhibiteurs de phosphorylation de Fos par ERK1/2. Cette étude permet d'optimiser les peptides contenant des domaines DEF-Fos (SEQ ID N°14) soit par stabilisation et notamment par D-racémisation des aminoacides non essentiels à la liaison, soit par suppression des aminoacides non essentiels à la liaison, soit encore de combiner ces différentes modifications, et enfin d'envisager de nouveaux inhibiteurs.
Dans la présente description il est fait référence à la voie de signalisation intracellulaire Ras-Raf- MEK1/2-ERK1/2 ou Ras-Raf-MEK-ERK ou ERK ou ERK1/2. Ces termes sont équivalents et font référence à la même voie ou cascade de signalisation.
Le terme « docking method » ou « méthode de docking » fait référence à la méthode qui permet de calculer l'orientation préférée d'une molécule envers une seconde lorsqu'elles sont liées pour former un complexe stable. Le fait de déterminer cette orientation préférée sert à prévoir la solidité de l'union entre deux molécules et éventuellement son efficacité. Les études de docking, de fixation, d'ancrage ou d'amarrage, servent donc à déterminer l'affinité entre les molécules étudiées et de quantifier les conséquences de la fixation d'un ligand sur un récepteur. Les termes de méthode de fixation, méthode d'ancrage ou méthode d'amarrage peuvent être utilisés pour désigner la méthode de docking.
DESCRIPTION DES DESSINS [Fig 1] décrit la modélisation in silico de l'interaction entre le domaine DEF-Fos de MLK1001 et la poche de fixation du domaine ERK2-DEF de la kinase active. Cette modélisation permet la visualisation des aminoacides essentiels à ladite interaction. Les aminoacides représentés débutent au premier aminoacide.
[Fig 2] décrit les propriétés antiprolifératives de l'inhibition de DEF-Fos par MLK1001 sur différentes lignées cellulaires tumorales d'origine humaine. La prolifération cellulaire est mesurée par incorporation de BrdU en présence de sérum bovin.
[Fig 3] représente les propriétés antiprolifératives des nouveaux peptides selon l'invention sur des cellules de carcinome de pancréas HPAF-II.
[Fig 4] décrit la progression du cycle cellulaire par immunocoloration Ki-67 sur des cellules HPAF-II après addition de sérum (10%) en présence de Selumetinib (MEK inhibiteur, produit de référence), du peptide MLK-1001 et de certains des nouveaux peptides selon l'invention.
[Fig 5] décrit la méthode de surface plasma résonance (SPR) par Biacore, pour déterminer les niveaux d'interaction et les affinités de certains peptides (MLK1001 et MLK1008) selon l'invention.
[Fig 6A] décrit la cinétique d'association et de dissociation du peptide MLK1001 selon l'invention à 1,25 ; 2 ; 5 ; 10 et 20 nM sur la protéine ERK2 par la méthode de Biacore.
[Fig 6B] décrit la cinétique d'association et de dissociation du peptide MLK1008 selon l'invention à 1,25 ; 2 ; 5 ; 10 et 20 nM sur la protéine ERK2 par la méthode de Biacore.
Ces figures viennent illustrer la présente invention et ne sont pas limitatives de la portée revendiquée.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Les expériences de docking ont été réalisées avec le peptide MLK1001 de SEQ ID N°1 comme ligand du domaine ERK2-DEF. La méthode de modélisation in silico a permis d'étudier précisément les interactions entre MLK1001 de SEQ ID N°1 et la poche de fixation de ligands de type DEF-Fos. À partir de cette expérience, de nouveaux composés ont été conçus et synthétisés. Ceux-ci sont décrits dans le Tableau n°l ci-dessous. Par rapport à MLK1001 de SEQ ID N°1 ils sont soit raccourcis, soit stabilisés, soit les deux.
Dans le brevet EP1988167 les peptides inhibiteurs ont été conçus comme suit : ils contiennent une séquence riche en aminoacides basiques de la protéine HIV-TAT suivie par deux prolines (PP) et ensuite par le domaine de liaison DEF de Fos (ci-après DEF-Fos) encadré par des aminoacides.
Les résultats de l'expérience de modélisation 3D in silico à partir du positionnement de TAT-DEF-Fos de SEQ ID N°1 dans la poche de liaison DEF de la kinase ERK2 active ont permis d'identifier les aminoacides essentiels à la liaison des domaines DEF-Fos et ERK2. Ces aminoacides essentiels forment un feuillet beta sur ERK2 et excluent un aminoacide (T) de la séquence FVFT (séquence consensus FXFP du site de liaison) de c-Fos (voir Fig. 1). Des aminoacides non essentiels ont été identifiés en N-ter de la séquence DEF-Fos et à l'intérieur de cette même séquence.
Grâce à ces informations, plusieurs peptides ont été conçus et synthétisés. Ces peptides, qui illustrent chacune des modifications seules ou en combinaison, sont au nombre de 12 et leurs séquences sont détaillées dans le Tableau 1. Leurs effets pharmacologiques ont été testés et plusieurs présentent des résultats intéressants.
Les termes aminoacide, amino-acide ou acide aminé sont équivalents et font référence aux unités structurales des protéines et des peptides. Ce sont des molécules organisées autour d'une même structure de base, un atome de carbone, qui porte la fonction acide -COOH, la fonction basique amine -NH2, un atome d'hydrogène -H et un radical -R de structure variable qui distingue et caractérise les vingt acides aminés que l'on trouve naturellement dans les protéines. Les vingt résidus d'acides aminés standards naturels se nomment A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V dans la classification à une lettre ou Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, et Val dans la classification à trois lettres.
Le terme « suppression » d'un aminoacide s'entend dans son sens premier à savoir le fait de supprimer un acide aminé de la séquence peptidique d'intérêt. En général on supprime un aminoacide considéré comme non essentiel à la fonctionnalité du peptide ce qui permet de réduire la taille de la séquence peptidique et éventuellement d'optimiser la fonctionnalité du peptide.
Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité).
Le terme « racémisation » fait référence à une propriété physique qui est la transformation d'un composé optiquement actif en une forme racémique qui est optiquement inactive ; pour les acides aminés c'est le passage d'un énantiomère ou stéréoisomère (isomères optiques à pouvoir rotatoire spécifique opposé) à un autre. Cette transformation a un impact sur la structure et la fonctionnalité des peptides. Dans la présente invention il s'agit d'une racémisation de type D (pour dextrogyre) par opposition à L (pour lévogyre) car les amino-acides à l'état naturel sont de type L à l'exception de la glycine. La D-racémisation d'un ou plusieurs amino-acides rend le peptide plus stable.
Tel qu'utilisé ici, le terme "comprenant" ou "comprend" est utilisé en référence à des substances, composés, méthodes ou procédés qui sont essentiels à l'invention, mais qui sont ouverts à l'inclusion d'éléments non spécifiques, essentiels ou non.
Le terme "et/ou" tel qu'il est utilisé ici doit être considéré comme une description spécifique de chacune des deux caractéristiques ou composants spécifiés, avec ou sans l'autre. Par exemple, «A et/ou B» doit être considéré comme une divulgation spécifique de chacun des éléments suivants: (i) A, (ii) B et (iii) A et B, comme si chacun d'eux était présenté individuellement. [Table 1]
Tableau 1 : peptides synthétiques dérivés de TAT-DEF-Fos Dans ce tableau 1 on voit les différentes modifications appliquées selon différents critères à la séquence TAT-DEF-Fos de SEQ ID N°l. Les aminoacides correspondant à la séquence DEF-Fos sont soulignés et c'est cette séquence de 20 aminoacides (SEQ ID N° 14) est essentiellement modifiée comme suit : la région C-ter est raccourcie de façon à permettre un positionnement parfait du feuillet béta (voir par exemple SEQ ID N°8, 9, 10, 11, 12 and 13).
Les peptides détaillés ci-dessus comprennent une séquence de pénétration intracellulaire de type HIV TAT de SEQ ID N°15 mais cette séquence est purement fonctionnelle et peut être substituée par toute séquence de fonction équivalente connue de l'homme de l'art comme la pénétratine, une séquence de 7 à 11 résidus arginine, une séquence de type X7/11R de 7 à 25 amino-acides comprenant 7 à 11 résidus arginine positionnés de façon aléatoire dans ladite séquence, une séquence dérivée des DPVs (Diatos peptide vectors) ou toute autre séquence de pénétration cellulaire.
Dans un mode de réalisation particulier le peptide de SEQ ID N°14 est fusionné en N-ter à une séquence permettant la pénétration cellulaire. Ladite séquence de pénétration cellulaire est sélectionnée parmi une séquence de pénétration cellulaire de type HIV TAT, la pénétratine, une séquence de 7 à 11 résidus arginine, une séquence de type X7/11R de 7 à 25 amino-acides comprenant 7 à 11 résidus arginine positionnés de façon aléatoire dans ladite séquence, une séquence dérivée des DPVs (Diatos peptide vectors) ou toute autre séquence de pénétration cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier ladite séquence de pénétration intracellulaire est HIV TAT de SEQ ID N°15 et les nouveaux peptides selon l'invention ont une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N°2 à 13. Dans un mode de réalisation particulier les nouveaux peptides selon la présente invention sont sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°2 à 24, préférentiellement parmi les peptides de SEQ ID N°8 à 13, encore plus préférentiellement parmi les peptides de SEQ ID N°8 et 12.
Dans un mode de réalisation préféré les aminoacides de la SEQ ID n°14 correspondant à la séquence DEF-Fos sont modifiés comme suit : la région C-ter est raccourcie de façon à permettre un positionnement parfait du feuillet béta dans la poche de (voir par exemple SEQ ID N°8, 9, 10, 11, 12 et 13).
Dans un mode de réalisation particulier les modifications suivantes sont appliquées en sus :
- on applique une racémisation de type D (ou D racémisation) aux aminoacides non essentiels pour stabiliser chacun de ces nouveaux peptides (voir par exemple SEQ ID N°10, 11, 12 and 13) qui est indiquée par une lettre minuscule en caractère gras ; et/ou
- dans la séquence consensus FVFT on substitue le résidu thréonine (T/Thr) par un résidu acide aspartique (D/Asp), représenté par un double surlignage, pour apporter des propriétés phospho- mimétiques (voir SEQ ID N°12 et 13) ; et/ou
- on ajoute un résidu acétyle (Ac) en N-ter pour protéger la molécule (voir par exemple SEQ ID N°9,
11 and 13).
Par ailleurs la région N-ter peut être raccourcie dans la séquence de 4 aminoacides CTTY.
La présente invention propose de nouveaux peptides synthétiques qui sont des ligands inhibiteurs de phosphorylation de la protéine Fos par ERK1/2. Dans un mode de réalisation particulier le peptide de SEQ ID N°14 est fusionné en N-ter à une séquence permettant la pénétration cellulaire. Ladite séquence de pénétration cellulaire est sélectionnée parmi une séquence de pénétration cellulaire de type HIV TAT, la pénétratine, une séquence de 7 à 11 résidus arginine, une séquence de type X7/11R de 7 à 25 amino-acides comprenant 7 à 11 résidus arginine positionnés de façon aléatoire dans ladite séquence, une séquence dérivée des DPVs (Diatos peptide vectors) ou toute autre séquence de pénétration cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier ladite séquence de pénétration intracellulaire est HIV TAT et les nouveaux peptides selon l'invention ont une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N°8 à 13. Dans un mode de réalisation particulier les nouveaux peptides selon la présente invention sont sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°8 à 13, préférentiellement parmi les peptides de SEQ ID N°8 et 12.
Sont décrits des peptides DEF-Fos caractérisés en ce que la séquence de 20 aminoacides DEF-Fos de SEQ ID n°14 est modifiée sur au moins une position. Dans un mode de réalisation particulier les peptides DEF-Fos sont caractérisés en ce que la séquence DEF-Fos est modifiée sur au moins deux positions. Par modification on entend la suppression d'un ou de plusieurs aminoacide(s) en C-ter, et/ou la substitution d'un ou de plusieurs aminoacide(s) et/ou la D racémisation d'un ou plusieurs aminoacide et/ou la mutation d'un site Ser de phosphorylation en résidu constitutivement actif Asp, et/ou l'acétylation de la région N-terminale. L'invention décrit un peptide DEF-Fos caractérisé en ce que la séquence DEF-Fos de SEQ ID n°14 est modifiée par suppression d'un ou plusieurs aminoacides en C-ter, préférentiellement de 1 à 8 aminoacides et encore plus préférentiellement de 8 aminoacides ; et/ou substitution et/ou racémisation d'au moins un aminoacide sur une position de la SEQ ID N°14. Lesdits peptides sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°8 à 13.
Selon l'invention les peptides sont caractérisés en ce que la séquence DEF-Fos de SEQ ID n°14 est raccourcie dans la région C-ter de 1 à 8 aminoacides, préférentiellement de 8 aminoacides. Lesdits peptides sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°8, 9, 10, 11, 12 et 13. Dans un mode de réalisation particulier, dans les peptides selon l'invention l'aminoacide thréonine (T/Thr) de la séquence consensus FVFT est remplacé par un aminoacide asparagine (D/Asp). Dans ce mode de réalisation particulier les peptides selon l'invention sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°12 et 13
Dans un autre mode de réalisation particulier une racémisation de type D est appliquée à aminoacide non essentiel situé en position 6 de la SEQ ID N°14. Dans ce mode de réalisation les peptides selon l'invention sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°10, 11, 12 and 13.
Dans un mode de réalisation particulier les peptides selon l'invention sont caractérisés en ce que la séquence DEF-Fos de SEQ ID n°14 est raccourcie dans la région N-ter de 1 à 4 aminoacides, préférentiellement de 4 aminoacides.
Dans un autre mode de réalisation particulier la région N-ter est acétylée. Dans ce mode de réalisation les peptides selon l'invention sont notamment sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°9, 11 and 13.
Dans un mode de réalisation particulier, les peptides selon l'invention sont sélectionnés parmi les peptides de SEQ ID N°8 à 13, préférentiellement parmi les peptides de SEQ ID N°8 et SEQ ID N°12. Dans un mode de réalisation préféré, les peptides selon l'invention correspondent à la SEQ ID n°8. Dans un autre mode de réalisation préféré, les peptides selon l'invention correspondent à la SEQ ID n°12.
La présente invention décrit de nouveaux peptides DEF-Fos caractérisés en ce que la séquence DEF- Fos de SEQ ID N°14 est modifiée par suppression dans la région C-ter de 1 à 8 aminoacides, préférentiellement 8, dans lesquels : au moins un aminoacide T (Thr) de la séquence consensus FVFT est remplacé par l'aminoacide D (Asp) ; et/ou une racémisation de type D est appliquée à un aminoacides non essentiel situé en position 6 de la SEQ ID N°14 ; et/ou la région N-ter de la SEQ ID N°14 est acétylée.
Dans un mode de réalisation préféré le nouveau peptide selon l'invention présente une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N°8 à 13, préférentiellement parmi les SEQ ID N°8 et 12.
Avantageusement, l'invention décrit une méthode d'identification de nouveaux inhibiteurs de phosphorylation de Fos par ERK1/2. Cette méthode d'identification comprend les étapes suivantes : a. élaborer un modèle 3D du domaine d'ancrage de ERK2 envers des substrats contenant un site DEF, basé sur la structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP (pdb code 4S32) en qualité de récepteur ; b. modéliser en 3D la fixation d'un peptide connu en tant que ligand de ce domaine pour se fixer dans le site de fixation de la kinase ERK2 active ; c. faire une étude de docking de type protéine-ligand en utilisant l'algorithme LibDock ; d. faire une étude de docking de type protéine-protéine en utilisant l'algorithme ZDOCK et affiner les résultats en utilisant RDOCK ; e. identifier les aminoacides essentiels et non essentiels à la fixation du peptide modélisé en b. dans la poche de fixation de type DEF de ERK2 ; f. optimiser le peptide préparé en b. puis concevoir et synthétiser de nouveau peptides en tenant compte de toutes les informations obtenues en c., d. et e. ; g. tester l'activité biologique et/ou les propriétés du ou des peptides synthétisés en f.
Avec cette méthode il est possible d'identifier d'autres peptides inhibiteurs de phosphorylation de Fos, présentant de bonnes affinités de liaison sur ERK2 et susceptibles d'avoir des effets intéressants sur différentes lignées cellulaires, notamment des lignées cellulaires tumorales.
Une fois le modèle de récepteur mis au point, cette méthode d'identification de molécules capables de se lier au domaine DEF de ERK2 envers c-Fos de façon similaire aux peptides détaillés ci-dessus, comprend les étapes suivantes : a. utiliser le modèle 3D du domaine DEF de ERK2 envers c-Fos basé sur la structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP en qualité de récepteur ; b. tester in silico la fixation ou « docking » de différentes molécules sur la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 envers c-Fos ; c. synthétiser lesdites molécules présentant une bonne affinité de liaison ; d. étudier l'affinité de chaque molécule pour la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 et sélectionner les meilleures affinités de liaison ; e. tester l'activité biologique et/ou les propriétés de la ou des molécules sélectionnées en d. et synthétisée(s) en c.
Avantageusement, la présente invention décrit également une méthode d'identification de molécules péptidomimétiques des nouveaux peptides selon l'invention, donc capables de se lier très précisément dans la poche de fixation des ligands de type DEF-Fos envers ERK2 et ainsi d'inhiber la phosphorylation de c-Fos par ERK1/2. Par molécules péptidomimétiques ou ligands péptidomimétiques on entend de petites molécules, qui sont conçues pour mimer l'activité de peptides actifs. Dans la recherche sur des molécules péptidomimétiques le seul objectif est de concevoir et de synthétiser, ou d'identifier, de petites molécules qui ont un effet très spécifique sur la cible identifiée avec un minimum voire aucun effet secondaire. Dans la présente invention les molécules péptidomimétiques sont des ligands de la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 envers c-Fos et capables d'inhiber la phosphorylation de c-Fos par ERK1/2.
Cette méthode d'identification de molécules péptidomimétiques comprend les étapes suivantes : a. utiliser le modèle 3D du domaine DEF de ERK2 basé sur la structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP (pdb code 4S32) décrit ci-dessus, en qualité de récepteur ; b. réaliser in silico un crible à haut débit de différentes molécules de petite taille capables de se fixer sur la poche de liaison du domaine DEF de ERK2 envers c-Fos; c. synthétiser lesdites molécules présentant une bonne affinité de liaison ; d. étudier l'affinité des molécules sélectionnées dans le criblage pour leur affinité de liaison envers ERK2 ; e. tester l'activité biologique et/ou les propriétés de la ou des molécules synthétisée(s) en c et sélectionnées en d.
Cette méthode permet de mettre en évidence des peptides mais également des molécules de petite taille de nature non peptidique et susceptibles de réguler un processus biologique. Ainsi la présente invention décrit une méthode d'identification de peptides inhibiteurs de la liaison de c-Fos sur le domaine DEF de ERK1/2, mais également une méthode d'identification de petites molécules de nature non peptidique présentant elles aussi une activité inhibitrice de la liaison de c-Fos sur le domaine DEF de ERK1/2. Ces peptides ou péptidomimétiques sont des inhibiteurs de la phosphorylation de c-Fos par ERK1/2.
L'invention décrit un nouveau peptide inhibiteur de phosphorylation de c-Fos par ERK1/2 pour une utilisation médicale. L'invention décrit une composition pharmaceutique contenant une dose thérapeutiquement active d'au moins un peptide selon la présente invention. Cette composition pharmaceutique comprend un peptide selon l'invention, une séquence d'acides nucléiques codant pour un peptide selon l'invention, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur et un support pharmaceutiquement acceptable.
Telle qu'utilisée ici, une "composition pharmaceutique" désigne une préparation d'un ou plusieurs des agents actifs avec d'autres composants chimiques optionnels tels que des supports physiologiquement appropriés et/ou des excipients. Le but d'une composition pharmaceutique est de faciliter l'administration de l'agent actif à un organisme. Les compositions de la présente invention peuvent se présenter sous une forme appropriée pour toute voie d'administration ou d'utilisation conventionnelle. La composition pharmaceutique selon l'invention englobe les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine humaine et les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine animale, c'est à dire les compositions vétérinaires. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention décrit également l'utilisation d'un nouveau peptide selon l'invention pour le traitement de maladies inflammatoires, de la resténose ou du cancer. Par cancer on entend notamment le cancer de colon, le cancer du pancréas, le mélanome, le cancer du sein, le cancer des ovaires, le cancer des reins, le cancer de la thyroïde, le cancer de la vessie, la leucémie, les gliomes, la neurofibromatose, et les ostéosarcomes. Par maladies inflammatoires on entend notamment les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin avec la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn, ainsi que la polyarthrite rhumatoïde. Par resténose on entend les réactions inflammatoires des cellules vasculaires lisses après la pose d'un stent (endoprothèse) dans les maladies cardio vasculaires. La présente invention décrit également l'utilisation d'un nouveau peptide selon l'invention pour le traitement du cancer de colon, du cancer du pancréas, du mélanome, du cancer du sein, du cancer des ovaires, du cancer des reins, du cancer de la thyroïde, du cancer de la vessie, de la leucémie, des gliomes, de la neurofibromatose, et des ostéosarcomes, des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, de la rectocolite hémorragique etde la maladie de Crohn, de la polyarthrite rhumatoïde, et des réactions inflammatoires des cellules vasculaires lisses après la pose d'un stent (endoprothèse) dans les maladies cardio-vasculaires.
Enfin la présente invention décrit une méthode de traitement du cancer comprenant l'administration d'une composition pharmaceutique contenant une dose thérapeutiquement active d'un peptide selon l'invention, pour permettre l'inhibition de la phosphorylation de Fos par ERK1/2.
Le terme "traitement" se rapporte ici à l'obtention d'un effet pharmacologique et/ou physiologique souhaité. L'effet peut être prophylactique en termes de prévention totale ou partielle d'une maladie ou d'un symptôme et/ou peut être thérapeutique en termes de guérison partielle ou complète d'une maladie et/ou d'un effet indésirable attribuable à la maladie. Le terme « traitement » tel qu'utilisé ici couvre tout traitement d'une maladie chez un mammifère, en particulier chez un humain, pour : réduire l'incidence et/ou le risque de rechute de la maladie pendant une période sans symptômes; soulager ou réduire un symptôme de la maladie; empêcher la maladie de se produire chez un sujet qui peut être prédisposé à la maladie mais qui n'a pas encore été diagnostiqué comme l'ayant; inhiber la maladie, c'est-à-dire stopper son développement (par exemple, réduire le taux de progression de la maladie); réduire la fréquence des épisodes de la maladie; ralentir le développement de la maladie et soulager la maladie, c'est-à-dire provoquer une régression totale ou partielle de la maladie.
L'expression « dose thérapeutiquement active » telle qu'utilisée ici, se réfère à une quantité qui résulte en une amélioration de l'état d'un organe ou d'un sujet, ou en une diminution de la maladie, du trouble ou des symptômes de la maladie ou du trouble en question.
Dans un mode de réalisation particulier l'invention décrit une méthode pour inhiber et/ou prévenir la prolifération de lignées cellulaires sélectionnées parmi le groupe comprenant les cellules des muscles lisses vasculaires, les fibroblastes et les cellules nerveuses, ladite méthode impliquant l'administration d'une dose thérapeutiquement active d'au moins un peptide selon l'invention.
Les avantages des peptides selon l'invention seront mieux compris à la lecture des exemples non limitatifs suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : modélisation 3D pour positionner MLK1001 dans la poche de fixation au domaine DEF de la kinase ERK2 active.
La structure cristalline du complexe ERK2 AMP-PNP (pdb code 4S32) a été utilisée comme récepteur pour réaliser les expériences de docking. La protéine a été nettoyée et préparée pour la fixation (par exemple séparation des structures en molécules distinctes, ajout d'atomes manquants, correction de la connectivité, correction des noms, insertion de boucles manquantes, etc.). Le peptide ainsi obtenu est considéré comme un petit composé ou comme une petite protéine. Les sites de fixation putatifs ont été sélectionnés en fonction des cavités dans la structure du récepteur quand les peptides sont considérés comme de petits composés ou en utilisant le logiciel ZDOCK (schéma de recherche exhaustive de tous les espaces rotationnels et translationnels entre la protéine ligand et la protéine récepteur, qui est fixée dans son orientation de départ quand le peptide est considéré comme une petite protéine).
La fixation de la protéine ligand est réalisée en utilisant la méthodologie et le logiciel Libdock. Libdock utilise les caractéristiques des sites protéiques comme « HotSpots » qui sont classés dans deux catégories : les HotSpots polaires et apolaires. La carte des HotSpots du récepteur a été établie avant la procédure de fixation. Des conformations de ligands sont générées de façon aléatoire à partir de la structure initiale du ligand grâce à la dynamique moléculaire sous haute température en un algorithme « Catalyst » avant la fixation. Les poses du ligand rigide ont été positionnées dans le site actif du récepteur et les HotSpots ont été appariés par triplets. Les poses ont été taillées et une étape d'optimisation est réalisée avant que la pose ne soit classée. Les ligands hydrogène qui ont été retirés durant la phase de fixation, sont rajoutés aux poses de ligand et optimisés par minimisation. Les poses présentant les score LibDock les plus élevés sont identifiées puis regroupées en fonction de leur mode de fixation.
L'expérience de docking protéine/protéine est réalisée en utilisant le logiciel ZDOCK. Ce logiciel est un algorithme de docking basé sur une structure rigide protéine/protéine basé sur la technique de corrélation FFT (Fast Fourier Transform) qui est utilisée pour explorer les espaces rotationnels et translationnels du système protéine/protéine (Chen et al. 2003). Le docking est également réalisé sans contraintes ou sélection de résidus spécifiques sur ERK ou sur les peptides. Les poses obtenues (2000 par cycle) sont affinées en utilisant le module rDOCK (DS Modeling 2.5). rDOCK est une procédure de minimisation d'énergie pour affiner et classer les poses de fixation en utilisant les fonctions de classement d'énergie (Li et al. , 2003). Toutes les poses sont classées dans différents groupes (basés sur les critères énergie/nombre/position) et les groupes les plus significatifs sont sélectionnés pour des études d'interaction.
Exemple 2 : essais pharmacologiques
Effet antiprolifératif sur des lignées de cellules tumorales
Les inventeurs ont déjà montré un effet antiprolifératif du composé MKL1001 de SEQ ID N°1 sur la prolifération cellulaire et cet effet est décrit dans EP3164413. Les propriétés antiprolifératives ont été étudiées par un essai BrdU sur différentes lignées cellulaires tumorales humaines : colon, vessie, prostate et carcinome du pancréas.
Le composé de SEQ ID N°1 a été testé en doses croissantes (de 2 à 100 mM) et, en parallèle, deux contrôles ont été réalisés avec des inhibiteurs de MEK de l'art antérieur : AZD6244 et PD184352 à 1 mM.
Les cellules tumorales ont été mises en culture dams une chambre humidifiée à 5% C02 à 37°C en présence d'un milieu complet (RPMI 1640 ou DMEM/F12 selon le type cellulaire) supplémenté à l'aide de sérum de bœuf foetal à 10%, 50 unités/ml de pénicilline and 50 pg/ml de streptomycin (GIBCO). Ensuite : le composé MKL1001 de SEQ ID N°1 à différentes concentrations et les produits de référence (MEK inhibiteurs) sont incubés avec les cellules pendant 24h à 37°C. le BrDu (concentration finale lOmM) est ensuite rajouté et les cellules incubées 20 h supplémentaires à 37°C. l'incorporation de BrDu dans l'ADN est révélé par un test ELISA à l'aide d'un kit BrdU selon recommandation du fournisseur (Roche®, 11647229001).
Les résultats sont détaillés en Fig. 2 qui montre la prolifération cellulaire mesurée par incorporation de BrdU après addition de sérum sur des lignées cellulaires tumorales d'origine humaine. Panneaux de gauche : doses réponse du peptide MLK1001 par comparaison aux produits de référence (MEK inhibiteurs : selumetinib et PD184352). Le peptide MLK1001 produit une inhibition de prolifération à partir de 20mM sur le carcinome de pancréas, de 60mM sur les lignées d'adénocarcinome de la vessie et de carcinome de la prostate, et de 6mM sur l'adénocarcinome de colon, avec un effet rebond sur cette dernière lignée. Les effets inhibiteurs sont comparables au produit de référence Selumetinib (ligne pointil lée). Panneaux de gauche : effets inhibiteurs du peptide MLK1001 sur les lignées de mélanome et de neurofibromatose de type I.
Étude des nouveaux peptides selon l'invention
À partir des résultats obtenus ci-dessus les inventeurs ont testé tous les peptides décrits dans le Tableau 1 quant à leurs propriétés antiprolifératives sur une lignée cellulaire d'adénocarcinome pancréatique humain (HPAF-II) après addition de sérum. La prolifération cellulaire suite à la stimulation par le sérum a été déterminée par colorimétrie à l'aide du kit BrDU (Roche, Cat. No.
11 647 229001). Des inhibiteurs de MEK de l'art antérieur sont utilisés comme témoins positifs : selumetinib et PD184352.
Les cellules sont d'abord synchronisées pendant 48h avec 0,1% de FBS (pas de sérum) suivies de 48h avec 10% de FBS (10% de sérum). Quand cela est indiqué, les inhibiteurs de MEK Selumetinib ou PD184352 (1 mM chacun) ou les peptides selon l'invention sont appliqués durant le traitement au FBS. Le BrdU est ajouté au medium 8 heures après l'ajout du sérum, en présence de peptides ou non, et laissé 36 heures. Après le traitement la prolifération cellulaire est déterminée par marquage immunologique du BrdU, et quantifiée par comparaison avec les noyaux totaux (tels que marqués au DAPI). Les résultats sont deux fois plus hauts pour les cellules positives au BrdU/DAPI en présence de sérum à 10% (sans effet de l'ajout de DMSO).
La coloration BrdU montre que les inhibiteurs de MEK entraînent une diminution significative de la prolifération avec le traitement au FBS (10%) (Fig. 3). MLK1001 ne présente pas de propriétés antiprolifératives aux doses testées de 0,1 à 30 mM (Fig. 3). De même les nouveaux peptides MLK1002 à MLK1007 ne présentent pas de propriétés antiprolifératives à ces mêmes doses sur la lignée HPAF-II (données non montrées). Cependant un effet significatif est observé à partir de 30 mM pour MLK1008, 1009, 1010, 1011 et 1012 et à 10 mM pour MLK1011 et 1012 (voir Fig. 3).
Les peptides MLK1008 à MLK1010 produisent une inhibition de prolifération cellulaire à partir de 30 mM similaire au produit de référence PD183452 (pointillé grisé sur la Fig. 3) et les peptides MLK1011 et MLK1012 à partir de 10 mM. Le peptide MLK1013 ne produit pas d'inhibition de prolifération cellulaire sur la lignée HPAF-II.
Cycle cellulaire
Le cycle cellulaire est déterminé par un immunocoloration Ki67 après le traitement de cellules HPAF- Il au sérum SBF à 10% pendant 48h, en présence ou non des peptides selon l'invention. Les inhibiteurs de MEK sont utilisés comme contrôle positif.
En haut à gauche on observe l'effet du produit de référence (Selumetinib) sur le rallongement de la phase G0/G1. On observe une stabilisation des cellules tumorales en état de quiescence.
En haut à droite : le peptide MLK1001 produit une diminution de la phase G2/S et une augmentation de la phase G0/G1 à partir de lOmM car on observe une augmentation des cellules en quiescence.
Les six panneaux du bas montrent les effets comparatifs des peptides MLK1008 à MLK1013 sur le cycle cellulaire mesuré par immunocoloration Ki67. IL convient de remarquer l'efficacité des peptides MLK1008 et MLK1012 dès 3mM.
Les peptides MLK1008 à MLK1012 présentent une augmentation des phases GO/Gi par rapport à G2/S ce qui montre un blocage du cycle cellulaire. Ce blocage en phase GO/Gi est observé à des doses plus faibles pour les peptides MLK1008 et MLK1012, jusqu'à 3 mM (Fig. 4 panneaux bas) par comparaison avec MLK1001 (Fig. 4, panneau haut droit).
Conclusion
Parmi tous les peptides selon l'invention qui ont été testés sur la lignée cellulaire humaine HPAF-II, deux d'entre eux présentent des propriétés antiprolifératives améliorées par rapport à MLK1001 sur des lignées cellulaires d'adénocarcinome pancréatique humain (HPAF-II) par diminution de l'activité du cycle cellulaire.
Exemple 3 : essai biochimique par test Biacore™
Les affinités des peptides MLK1001 et MLK1008 envers les protéines ERK2 ont été testées par la technique de surface plasma résonance (SPR) à l'aide d'un appareil Biacore 3000 (Fig. 5). La protéine recombinante ERK2 a été immobilisée par un couplage amine sur la puce composée d'une couche de dextran posée sur une feuille d'or, elle-même posée sur une plaque de verre. Les peptides MLK1001 et MLK1008 ont été utilisés comme analytes dans la cellule de microfluidique ; ces peptides sont mobiles. Les analyses réalisées sont une quantification du signal de résonance (RU) donc une analyse sur une liaison simple et une analyse sur des cycles de cinétique avec des calculs de constantes d'affinité. L'analyse de l'interaction ERK2 avec les peptides a été étudiée via le signal SPR. Les contrôles négatifs incluaient un peptide Scramble (TAT+séquence AA au hasard : GRKKRRQRRRPPQSKPSGSQHPIFSLAFVAS, cf Lavaur and Caboche, J. Neurosci, 2007 pour validation) et une séquence TAT comprenant une séquence interférante entre le récepteur NMDA2B et la PSD 95 (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV).
Les analyses sur une liaison simple montrent le niveau d'interaction avec la cible et les analyses sur le cycle cinétique permettent de déterminer l'affinité avec la cible. [Table 2]
Tableau 2 : constantes d'affinité des peptides MLK1001 et MLK1008 définis par la technique Biocore Les analyses ont permis de mettre en évidence une affinité (constante de dissociation à l'équilibre KD) deux fois plus importante du peptide MLK1008 envers ERK2 (KD : 4,54nM) par comparaison au peptide MLK1001 (10,5nM) (voir Tableau 2 ci-dessus et Fig. 6A et 6B).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)

Claims

Revendications
[Revendication 1] Peptide inhibiteur de phosphorylation de la protéine Fos par ERK1/2 caractérisé en ce que la séquence DEF-Fos de SEQ ID n°14 est modifiée par suppression dans la région C-ter de 1 à 8 aminoacides.
[Revendication 2] Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que 8 aminoacides sont supprimés en région C-ter de la SEQ ID N°14.
[Revendication 3] Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que au moins un aminoacide T (Thr) de la séquence consensus FVFT est remplacé par l'aminoacide D (Asp).
[Revendication 4] Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'une racémisation de type D est appliquée à un aminoacides non essentiel situé en position 6 de la SEQ ID N°14.
[Revendication 5] Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la région N-ter de la SEQ ID N°14 est acétylée.
[Revendication 6] Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la séquence DEF-Fos de SEQ ID N°14 est fusionnée en N-ter à une séquence permettant la pénétration intracellulaire.
[Revendication 7] Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il présente une séquence sélectionnée parmi les SEQ ID N° 8 à 13.
[Revendication 8] Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les peptides de SEQ ID N°8 et de SEQ ID N°12.
[Revendication 9] Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour une utilisation médicale.
[Revendication 10] Composition pharmaceutique contenant une dose thérapeutiquement active d'au moins un peptide selon les revendications 1 à 8 pour une utilisation médicale.
[Revendication 11] Composition pharmaceutique selon la revendication 10 qui comprend un peptide selon l'une des revendications 1 à 8, une séquence d'acides nucléiques codant pour un peptide selon l'une des revendications 1 à 8, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur et un support pharmaceutiquement acceptable. [Revendication 12] Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 10 ou 11 pour le traitement de maladies inflammatoires, de cancers ou de resténose.
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