EP4341690A1 - Ex vivo human model intended for evaluating allergic or pseudo-allergic inflammatory potential - Google Patents

Ex vivo human model intended for evaluating allergic or pseudo-allergic inflammatory potential

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Publication number
EP4341690A1
EP4341690A1 EP22729664.7A EP22729664A EP4341690A1 EP 4341690 A1 EP4341690 A1 EP 4341690A1 EP 22729664 A EP22729664 A EP 22729664A EP 4341690 A1 EP4341690 A1 EP 4341690A1
Authority
EP
European Patent Office
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substance
allergic
degranulation
potential
pseudo
Prior art date
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Pending
Application number
EP22729664.7A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Emeline Pages
Pascal Descargues
Nicolas GAUDENZIO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genoskin SAS
Original Assignee
Genoskin SAS
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
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    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates

Definitions

  • the present invention relates to the field of inflammation, whether of an allergic, pseudo-allergic or other nature, and more specifically provides the first ex vivo human model for determining the inflammatory potential of a compound .
  • the inflammatory response is an integral part of the reaction of the immune system in response to an attack. Now, such an inflammatory response can be induced in a subject following an injection. Beyond the discomfort caused, this response can be problematic, especially if it is an allergic response. Also, it is important to be able to predict, prior to any injection, the inflammatory response likely to be induced by a substance.
  • the first so-called sensitization phase begins when the individual comes into contact for the first time with a compound that is called the allergen because it generates an allergic response. This is then recognized and considered as a foreign substance by certain cells of the immune system which are present in large quantities in the skin and mucous membranes (antigen-presenting cells, ex. dendritic cells). These cells will present the allergen on their surface and allow the production of immunoglobulin E (IgE) by other cells.
  • IgE immunoglobulin E
  • mast cells which are found in particular at the level of the skin and the mucous membranes (locations where the allergens are likely to penetrate). This process of IgE binding is called “sensitization” because it makes mast cells susceptible to activation upon subsequent encounter with the same antigen. This first phase is silent, ie the subject in the sensitization phase is asymptomatic.
  • the mast cell is a cell present in the connective tissues, which is part of the white blood cells and is characterized by the presence in its cytoplasm of very many granules containing chemical mediators such as serotonin, histamine, tryptase or heparin.
  • chemical mediators such as serotonin, histamine, tryptase or heparin.
  • IgEs chemical mediators
  • the same activation induces, in a more delayed manner (a few hours), the synthesis of many cytokines (such as TNF-alpha), chemokines and lipid mediators.
  • this histamine will exert its effects by binding mainly to the H1 receptors present in the nose, where histamine increases edema and obstruction, and causes itching, sneezing and mucus secretions, in the skin, where histamine causes erythema, edema and itching, and in the lungs where histamine causes bronchoconstriction.
  • the pseudo-allergic potential In connection with the mast cells, the pseudo-allergic potential must also be taken into account. This is a mechanism that is not mediated by IgE (unlike allergy), but by the MRGPRX2 receptor (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). This mechanism is therefore dose-dependent. Consequently, these pseudo-allergic reactions could be prevented, or limited, in the event of new administration of the substance by reducing the dose or reducing the rate of administration. [00011] Now, it is particularly difficult to predict the inflammatory potential in humans and in particular the allergic or pseudo-allergic risk associated with a compound or a composition.
  • the inventors have previously developed an ex vivo model of human skin making it possible to test the subcutaneous injection of a solution that does not require the use of animals. They have now demonstrated that not only were granulocytes present in this model of human skin, but also that they remained functional with degranulation capacity. This result was all the more unexpected since it was rather a loss of functionality of the mast cells which was documented, with in particular a significant apoptosis of the latter during the first days (see in particular Kl VINEN et al., Experimental Dermatology, vol.12 , p: 53-60, 2003).
  • a first object of the invention relates to an in vitro method intended to determine the inflammatory potential of a substance comprising the steps of:
  • step ia) consists of the subcutaneous injection within the explant of a composition comprising the substance.
  • the method further comprises a step id) of determining the level of degranulation of a culture of mast cells, preferably of a culture of primary human mast cells, after incubation of the latter in presence of different concentrations of the substance.
  • This additional step makes it possible, in addition to confirming mast cell degranulation in the presence of the substance which makes it possible to establish an allergic or pseudo-allergic potential, to determine the median effective concentration (EC50) corresponding to the necessary concentration of substance to induce midline degranulation (between no mast cell degranulation and maximum mast cell degranulation).
  • EC50 median effective concentration
  • the method further comprises a step ie) of determining the agonist potential of the substance with respect to the MRGPRX2 receptor (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2).
  • the method according to the invention then makes it possible to decide between an allergic or pseudo-allergic potential of the substance and, in the case of a pseudo-allergic potential, to determine the maximum concentration of substance that can be injected so as not to not induce a pseudo-allergic reaction.
  • substance is meant a substance of any kind (that is to say protein, carbohydrate, lipid, etc.), which may be of synthetic or natural origin, and of which it is desired to determine inflammatory and potentially allergenic potential.
  • explant of skin denotes a fragment of skin which comprises, in addition to the epidermis, the dermis and the epidermal appendages, a thickness of at least 5 mm of hypodermis (preferably between 5 and 15 mm of hypodermis and, more preferably, between 5 and 10 mm of hypodermis).
  • the epidermal appendages correspond to hair follicles, sebaceous glands and sweat glands.
  • the hypodermis is the layer of tissue that is located immediately below the dermis of the skin.
  • the hypodermis is a loose connective tissue that is richly vascularized and also contains fatty tissue.
  • the skin explant is prepared as described in international application WO 2019/170281. [00035] In detail, this skin explant was included, with the exception of the epidermis, in a liquid matrix capable of solidifying like blood plasma, a solution derived from blood plasma (eg a dilution of plasma blood in physiological buffer, in particular a dilution of blood plasma to at least 10%, 20%, 30%, or even to at least 40% (weight/total weight of the matrix)), a solution of fibrinogen, a solution of collagen , gelatin solution, synthetic polymer solutions, natural polymer solutions (e.g. agarose (low/low melting point agarose or agar-agar), starch, polysaccharides), and mixtures thereof.
  • a solution derived from blood plasma eg a dilution of plasma blood in physiological buffer, in particular a dilution of blood plasma to at least 10%, 20%, 30%, or even to at least 40% (weight/total weight of the matrix)
  • liquid solution comprising at least one specific compound or composition whose concentration in said liquid solution is such that, when appropriate conditions are implemented, in particular particular temperature conditions, the liquid solution takes on a consistency of the solid or gel type .
  • Said compound or a specific composition can be of animal, vegetable or synthetic origin, its nature and its concentration are determined according to the desired physico-chemical characteristics of the matrix when it is solidified, in particular the flexibility and the resistance of the matrix. .
  • said liquid matrix capable of being able to solidify is chosen from any liquid solution, preferably nutrient, capable of solidifying or gelling under specific conditions compatible with the survival and culture of skin cells which make up said atoning.
  • Such a matrix is used in an inclusion process comprising the following steps i) the flotation of a cylindrical skin explant in a liquid matrix chosen from a solution derived from blood plasma, fibrinogen or collagen solution, or a solution of agar-agar or low melting point agarose, or a mixture of these solutions, this liquid matrix being contained in said insert, this flotation leaving the epidermal surface of the explant with emerged skin, while the dermis is immersed; ii) rapid induction of solidification of said surrounding skin explant; and, iii) The in vitro or ex vivo culture, or the survival maintenance of 1 of the skin explant in the said matrix thus solidified.
  • step i) the flotation of a cylindrical skin explant is carried out in a liquid matrix comprising a first solution chosen from a solution derived from blood plasma, a fibrinogen solution or a collagen solution, and a second low melting point agar-agar or agarose solution.
  • a first solution chosen from a solution derived from blood plasma, a fibrinogen solution or a collagen solution, and a second low melting point agar-agar or agarose solution.
  • this second solution is previously heated for a time and at a temperature sufficient to be liquid and to remain liquid at around 37°C during the sufficient time to be mixed with the first solution in said insert and until said skin explant is deposited.
  • said second solution is preheated to its melting point, or slightly higher, preferably between 65°C and 70°C.
  • Agar-agar or agarose with a low melting point is preferably an agar-agar or agarose whose maximum gelation temperature is between 24° C. and 28° C., and the melting temperature is greater than 65.5°C in 1.5% solution.
  • this agarose is the agarose named LMP Agarose (“Low melting point” (GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGIES).
  • said second solution is an agar-agar or low-melting-point agarose solution, the concentration of agar-agar or low-melting-point agarose of which is between 1% and 5% (preferably in a physiological solution), more preferably between 2% and 5%, between 3% and 4.5%, between 3.5% and 4.5% or alternatively between 3.8% and 4.2% or between 3.9% and 4.1%, 4% being the most preferred concentration.
  • This second agar-agar or low-melting-point agarose solution at said concentration and once heated to its melting temperature, or slightly higher, can be stored in liquid form for at least 1 hour and, preferably for at least 4 hours, 10 hours or 16 hours at 37°C.
  • the final concentration of agar-agar or low-melting-point agarose is between 0.1% and 2%, preferably between 0.2% and 1.8%.
  • Such a concentration makes it possible not only to obtain a matrix which, once solidified, makes it possible to preserve the 3D structure and to maintain said skin explant in survival, but also to obtain a solid matrix but sufficiently flexible to be non-brittle and resistant to occasional shocks.
  • the solidification of this liquid matrix taking place after deposition of the skin explant, leaving the device thus obtained at a temperature between 37°C and room temperature, preferably at 20°C.
  • the final concentration of agar-agar or low-melting-point agarose melting is between 1% and 2%, preferably between 1.25% and 1.75%, preferably between 1.4% and 1.6%, 1.5% being the most preferred concentration.
  • the final concentration of agar-agar or low-melting-point agarose melting temperature is between 0.1% and 2%, preferably between 0.2% and 1.75%, 0.25% being the most preferred concentration.
  • concentration makes it possible to obtain a matrix which, once solidified, makes it possible to preserve the 3D structure and to maintain said skin explant in survival, but also to obtain a matrix which is sufficiently flexible to be non-brittle and resistant to mechanical effects applied to the explant, for example during a effect mimicking the massage of the skin for the application of a preparation such as, for example, a cream.
  • the volume of said liquid matrix is from 1/3 to 2/3 of the total volume of the insert, preferably from 2/5 to 3/5 of the total volume, Half of the total volume of the 'insert being the preferred volume.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify contains between 1 mM and 5 mM of Ca2+, preferably between 1.5 mM and 4.5 mM of Ca2+ According to a preferred embodiment, in step a) said liquid matrix capable of being able to solidify contains between 1 mM and 2 mM of Ca2+, preferably between 1.2 mM and 1.4 mM of Ca2+. According to another preferred embodiment, in step a) said liquid matrix capable of being able to solidify contains between 2 mM and 3 mM of Ca2+, preferably between 2.5 mM and 2.8 mM of Ca2+ and more preferentially 2 .8 mM Ca2+.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify contains between 5 and 500 mg/mL of ascorbic acid, preferably between 25 and 75 mg/mL, 50 mg/mL of ascorbic acid being the highest concentration. most preferred.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify is a medium containing between 1 mM and 5 mM of Ca2+ and containing between 5 and 500 mg/mL of ascorbic acid.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify contained in the insert in step a) is a liquid matrix, the first solution of the mixture of which (the second solution being the solution of agar-agar or agarose) is preferably nutritious, and also capable of being able to solidify under the action of an increase or decrease in temperature and/or by the addition of a compound or a specific composition.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify does not contain any growth factor or animal or human serum.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify does not cover the upper face of the epidermis before this matrix is solidified in step b).
  • step a) of said inclusion process the skin explant is then placed on a liquid matrix capable of being able to solidify, in particular as indicated above, and which liquid matrix is chosen from any liquid solution providing all the nutritious and/or necessary ingredients for its culture, in particular for maintaining the initial physiological state of the cells which constitute it.
  • This solution is capable of solidifying or gelling under specific conditions compatible with the survival and culture of the skin explant.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify is a liquid solution derived from blood plasma treated with an anticoagulant agent with reversible properties mixed with an agar-agar or agarose solution.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify contains blood plasma, fibrinogen, or collagen, mixed with an agar-agar or low-melting-point agarose solution.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify is a solution derived from blood plasma containing from 25% to 60%, preferably between 35 % and 45% (v/v) of blood plasma, from 70% to 35% of a physiological solution, such as a 0.9% NaCl solution, from 5% to 12%, preferably 8%, a 1% CaC12 saline solution, an anti-fibrinolytic agent in a concentration sufficient to obtain the desired anti-fibrinolytic activity, preferably between 5% and 2%, preferably the anti-fibrinolytic agent being chosen from tranaxemic acid or aprotinin, and an agarose solution with a low melting point between 0.5% and 4%, preferably between 1% and 2%.
  • a physiological solution such as a 0.9% NaCl solution, from 5% to 12%, preferably 8%, a 1% CaC12 saline solution
  • said liquid matrix capable of being able to solidify is a liquid solution of fibrinogen and thrombin, or collagen or blood plasma, mixed to a gelatin solution, including synthetic, natural polymeric gels such as agarose gels, in particular low/low melting point agarose or agar-agar gels, starch or polysaccharide gels and for which incubation at 37°C allows its solidification.
  • synthetic, natural polymeric gels such as agarose gels, in particular low/low melting point agarose or agar-agar gels, starch or polysaccharide gels and for which incubation at 37°C allows its solidification.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify contains a liquid solution derived from blood plasma treated with an anticoagulant agent with reversible properties, preferably by sodium citrate; and the solidification of said matrix in step b) for this solution obtainable in the presence of calcium ions, preferably also in the presence of thrombin.
  • the solidification of said matrix in step b) can be carried out for this solution by adding thrombin or by increasing the temperature, or else using factors secreted by cells supplied to the matrix, such as primary fibroblasts.
  • said liquid matrix capable of being able to solidify is solidified after a maximum of 8 hours, preferably less than 2 hours or less than one hour, a duration of less than 30 min, preferably of less than 10 min being the most preferred duration to initiate the solidification phase of the liquid matrix after depositing the skin biopsy on this liquid matrix in step a ).
  • the explanted skin is positioned within an insert which can take multiple forms and in particular correspond to a suspended insert or to an insert on piles.
  • a suspended insert The bottom of this insert consists of a porous membrane whose diameter is between 5 and 40 mm and more preferably between 9.5 and 30 mm.
  • this porous membrane will have a porosity of between 0.4 and 8 ⁇ m, preferably between 0.4 ⁇ m and 1.5 ⁇ m, with the range of 0.8 ⁇ m and 1.2 ⁇ m as the porosity range. prefer.
  • porous membrane chosen from polyethylene terephthalate (PET), nitrocellulose and polycarbonate membranes.
  • PET polyethylene terephthalate
  • nitrocellulose polycarbonate membranes
  • MILLIPORE MILLICELL
  • topical application is meant an application of the composition to be tested on the epidermis of the skin explant.
  • Subcutaneous injection means an injection which is performed in the hypodermis of the skin explant, which also gives it the name of “hypodermic” injection.
  • This type of injection which is well known to those skilled in the art, generally requires making a skin fold using the fingers and the subcutaneous injection is then performed in the skin fold.
  • step ia) consists of the subcutaneous injection of a composition comprising the substance in a skin explant.
  • the composition in question is a composition to be tested which is in liquid form.
  • the volume of this composition is between 10 m ⁇ and 1 ml, preferably between 10 m ⁇ and 500 m ⁇ and, particularly preferably, between 10 m ⁇ and 200 m ⁇ .
  • the needle for injecting the composition typically has a sufficient length to reach the hypodermis.
  • needles having a length greater than or equal to 10 mm will preferably be used.
  • the needle has a length of between 16 and 45 mm, preferably a length ranging from 20 to 40 mm.
  • the diameter of the needle to be used it can be identified simply by those skilled in the art with regard to his general knowledge.
  • such hypodermic needles are of the 18G, 19G, 20G, 21G, 22G, 23G, 25G, 26G, 27G, 28G, 29G, 30G or even 31G type.
  • This injection step can be performed by an experimenter, who performs pinching so as to allow the formation of a skin fold and thus facilitate subcutaneous injection.
  • this injection step can also be performed by an automatic injection device.
  • the device allows injection at a determined depth, relative to the surface of the epidermis, so as to obtain a subcutaneous injection.
  • Step ib) for determining the inflammatory response within the skin explant is carried out by monitoring inflammation markers which are well known to those skilled in the art.
  • markers of inflammation may be present within the explant of skin, of the matrix in which the explant of skin is included and/or in the culture medium.
  • markers of inflammation mention may be made, being limited thereto, of cytokines, or antibacterial proteins.
  • proteins involved in the biosynthesis of lipids or any other molecule whose level of expression varies between an inflamed state and a non-inflamed state cf. in particular SERHAN & WARD, Molecular and Cellular Basis of Inflammation, Humana Press).
  • interleukins As cytokines which can be used as markers of inflammation, mention may be made of interleukins and their receptors. By way of example of interleukins, mention may be made of IL-1A, IL-1B, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL- 17A, IL-17C, IL-17F, IL-19, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31 and IL-33, and by way of example of interleukin receptors, mention may be made of IL-10RA, IL-10RB, IL-1R1, IL-5RA (CD125) and IL-9R.
  • cytokines which can be used as markers of inflammation mention may also be made of chemokines which are chemotactic cytokines which control the migration patterns and the positioning of the immune cells, but also their receptors.
  • chemokines include C5, Eotaxin, MCP-4, TARC, MCP-1, MIP-3A, CCL22, CCL23, MPMB, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, IL8RA, INP10 , L8RB and CXCL3
  • CCL13 MCP-4
  • cytokines other than interleukins and chemokines
  • cytokines include MCP-1, GM-CSF, TNFSF5, MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL and IFNA1.
  • antimicrobial peptides also called host defense peptides, which are part of the innate immune response and have a length of less than 50 amino acids. Unlike the majority of conventional antibiotics, it appears that antimicrobial peptides frequently destabilize biological membranes, can form transmembrane channels and can also enhance immunity by acting as immunomodulators.
  • antimicrobial peptides mention may in particular be made of defensins (eg beta-defensins, cathelicidins such as LL-37).
  • defensins eg beta-defensins, cathelicidins such as LL-37.
  • S100A7 psoriasin
  • S100A15 koebnerisin
  • the markers of inflammation are chosen from molecules secreted by structural cells (eg keratinocytes, stromal cells), adipocytes and cells of the immune system (eg macrophages, dendritic cells, T lymphocytes, mast cells ).
  • structural cells eg keratinocytes, stromal cells
  • adipocytes e.g macrophages, dendritic cells, T lymphocytes, mast cells.
  • MCSF MCSF
  • GCSF GCSF
  • markers of inflammation present in the culture medium will be chosen.
  • markers of inflammation present in the culture medium include TNFA, MCP-1, EOTAXIN-3, VEGF, PM0, IL-2, MIP-3A, MPMB, IL-17A, MIP-1A, IL-22, IL- 1B, IL-12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23EOTAXIN, IL-6, IL-8, BETA-HEXOSAMINISASE, HISTAMINE and TRYPTASE.
  • Step ic) for determining the level of mast cell degranulation can be carried out using techniques well known to those skilled in the art.
  • Techniques that can be used for this step include ELISA or colorimetric techniques making it possible to measure the presence of inflammatory mediators contained in the granules of mast cells, such as histamine or tryptase, or secreted de novo such as lipid mediators or cytokines/chemokines , or even on fluorescence, immunofluorescence or fluorochromes techniques specific to mast cell granules.
  • this step ic) is carried out within a maximum period of 6 hours following the administration step ia), preferably within a maximum period of 4 hours.
  • a single step ia) of administration of a composition comprising the substance is carried out per explant of the skin.
  • step ic) for determining the level of mast cell degranulation within the skin explant is carried out by fluorescence analysis.
  • this step ic) for determining the level of mast cell degranulation uses avidin.
  • Avidin is in fact a glycoprotein which binds very specifically to the heparin contained in the granules of mast cells (THARP et al., J. Histochem. Cytochem., vol.33, p: 27-32, 1985 ).
  • THARP et al. J. Histochem. Cytochem., vol.33, p: 27-32, 1985 .
  • the granules when they are externalized, become directly accessible to avidin.
  • the intracellular granules are accessible to avidin as soon as tissue permeabilization is performed.
  • This avidin can be complexed with a fluorochrome (avidin-FITC, avidin-Alexa488, avidin-sulfurhodamine 101 or any other fluorescent molecule) or with a bioluminescent molecule.
  • avidin alone (not complexed) and in combination with a molecule which is complementary to it. Mention may be made, by way of example of such a molecule, of biotin complexed with a fluorochrome, with a bioluminescent molecule or with any other identifiable molecule.
  • the determination of the level of degranulation of the mast cells can use other markers, in particular of the nucleus or the plasma membrane, so as to facilitate the identification of the granulocytes externalized from the mast cells. It will also be possible to assay tryptase, histamine, beta-hexosaminidase, chymase or any other molecules preformed within the mast cell granules and released during degranulation in the culture medium. [00088] Typically, the determination of the level of mast cell degranulation within the skin explant can be carried out by following the protocol described in GAUDENZIO et al. (J. Clin. Invest., vol.126, p:3981-3998, 2016)
  • step ic) of determining the level of mast cell degranulation will be carried out on at least one histological section made from the skin explant.
  • immunohistochemistry methods can be used, which use the fixation of the skin explant, the inclusion of the explant (e.g. paraffin, O.C.T., EPON) before its conservation, and finally, performing histological sections on the inclusion block.
  • the detail of such methods is described for example in “Immunohistochemistry: Basics and Methods” by Igor BUCHWALOW (SPRINGER Editions).
  • the histological sections that can be used may have a very large thickness of up to 500 ⁇ m.
  • the histological section will thus have a thickness of between 1 and 500 ⁇ m. Now, it is possible to use cuts with more classic dimensions with a thickness between 2 and 25pm.
  • the level of mast cell granulation within the explant itself it is determined, for each identified mast cell, whether it is associated with weak, moderate or strong degranulation, then the proportion (percentage) of mast cells associated with each of these types of degranulation (weak, moderate and strong).
  • the level of degranulation can also be analyzed automatically using a image analysis software or a computer algorithm or artificial intelligence techniques called machine-learning or deep-learning.
  • a mast cell exhibiting a low level of degranulation corresponds to a mast cell exhibiting 0 to 2 granules around it (or to a cell exhibiting a smooth outline);
  • a mast cell presenting a moderate level of degranulation corresponds to a mast cell presenting from 3 to 6 granules around it (or to a cell presenting an outline with a granular appearance);
  • a mast cell with a high level of degranulation is a mast cell with more than 6 granules around it (or a cell with an exposed shape).
  • the same steps ia), ib) and ic) may be carried out with a negative control (eg PB S) and/or with a composition comprising a positive control corresponding to a substance known to induce a inflammation or, more specifically, degranulation of mast cells such as, for example, IgE/antigen, IgE/anti-IgE complexes, compound 48/80, substance P, various secretagogues, products from pathogens or known therapeutic molecules to induce reactions at the injection site (eg anakinra, cetrorelix or icantibant).
  • a negative control eg PB S
  • a composition comprising a positive control corresponding to a substance known to induce a inflammation or, more specifically, degranulation of mast cells such as, for example, IgE/antigen, IgE/anti-IgE complexes, compound 48/80, substance P, various secretagogues, products from pathogens or known therapeutic molecules to induce reactions at the injection site (eg anakinra
  • Step ii) of determining the inflammatory potential, and more specifically the allergic or pseudo-allergic potential of the substance can then be simply carried out with regard to the result of steps ib) and ic).
  • Step ii) of determining the inflammatory potential, and more specifically the allergic or pseudo-allergic potential of the substance can then be simply carried out with regard to the result of steps ib) and ic).
  • a substance associated with a proportion of granulocytes presenting for more than 50% a low level of degranulation and/or for less than 10% a high level of degranulation will present a low allergic or pseudo-allergic potential, or even zero.
  • the inventors have thus shown that, in the explant in culture, there is a basic level of mast cell degranulation which is comparable to that observed in vivo in animals, which was not obvious and which reinforces the interest of this model.
  • the method further comprises a step id) of determining the level of degranulation of a culture of mast cells after incubation of the latter in the presence of different concentrations of the substance.
  • Step ii) of determining the inflammatory potential of the substance will then make it possible, in connection with this step id), in addition to the confirmation of degranulation by the mast cells in the presence of the substance, to determine the median effective concentration (EC50 ) substance for induction of mast cell degranulation.
  • EC50 median effective concentration
  • a culture of primary mast cells preferably human, will be used.
  • mast cells can be obtained by methods well known to those skilled in the art.
  • the protocol described in GAUDENZIO et al. J. Allergy Clin. Immunol., vol.131(5), p: 1400-7, 2013
  • GAUDENZIO et al. previously cited, 2016
  • the mast cells are derived in the appropriate culture medium from hematopoietic progenitors (eg CD34 + , CD133 + cells) present in the circulating blood of healthy donors (eg adult peripheral blood, blood from the umbilical cord).
  • hematopoietic progenitors eg CD34 + , CD133 + cells
  • mast cell marker assay is performed before and after stimulation (eg, about 1 hour).
  • markers of preformed mast cells in the secretory granules mention may be made of labeta-hexosaminidase, tryptase or chymase, or even histamine.
  • cytokines and chemokines including MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL and IFNA1, TNFA, MCP1, VEGF, PM0, MDC, MIP-1B, IL-17A, IL-17C, IL-17F, TNFB, IL-27, MCP-4, MIP-1A, IL-22, IL-1B, IL- 12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23, IL-31, EOTAXIN, IL-6, IL-4, IL-13, IL-5, IL-8 and IL-15.
  • cytokines and chemokines including MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB
  • the assay of these granulocyte markers can be carried out by colorimetric tests or ELIS A type tests in 96 or 384 well plates.
  • a percentage of degranulation is defined in relation to a positive control which is the lysis of all the mast cells in a well using a detergent (e.g. TRITON X100 used at 1%).
  • a detergent e.g. TRITON X100 used at 1%.
  • the method further comprises a step ie) of determining the agonist potential of the substance with respect to the MRGPRX2 receptor (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2).
  • MRGPRX2 receptor Mos-Related G-Protein coupled Receptor member X2
  • Such a step can be carried out simply by a person skilled in the art and is described in the examples. To do this, cells are transformed to express the human MRGPRX2 receptor (see for example Accession numbers Q96LB1, NP_001290544.1, NP_473371.1, ACG60653.1, EAW68359.1 or even AAH63450.1).
  • the activation of the MRGPRX2 receptor resulting in a decrease in the intracellular concentration of calcium ions makes it possible to extrapolate the activity of the MRGPRX2 receptor and, in the presence of the substance, the agonist potential of this last with respect to the MRGPRX2 receptor.
  • This measurement of receptor activation can also be made by bioluminescence (eg Fluo-4).
  • bioluminescence eg Fluo-4
  • this step ie) makes it possible to know whether the degranulation of the mast cells reveals an allergic potential or a pseudo-allergic potential.
  • the MRGPRX2 receptor is the receptor responsible for pseudo-allergy. Therefore, these pseudo-allergic reactions could be prevented, in the event of new administration of the substance, by reducing the dose or the rate of administration or co-injection of an antagonist of the MRGPRX2 receptor.
  • step ii) of determining the inflammatory potential of the substance then makes it possible to determine whether or not the degranulation of the mast cells induced by the substance results from a pseudo-allergic reaction. As soon as a substance is identified as presenting a pseudo-allergic potential, step ii) therefore makes it possible to identify the substances which it is appropriate, for example, to combine with at least one mast cell stabilizer in order to facilitate their injection.
  • mast cell stabilizers are drugs used to prevent or control certain allergic disorders which are well known to those skilled in the art. These compounds block mast cell degranulation, stabilizing the cell and thus preventing the release of histamine and related mediators.
  • mast cell stabilizers include loratidine, desloratidine, sodium cromoglycate, ketotifen, olopatadine, rupatadine, mepoluzimab, omolizumab, pzmirolast, nedocromil, azelastine , p2-agonists, quercetin, luteolin, rutin or even vitamin D.
  • Explants of skin are prepared from complete samples of skin from different donors, which samples included the epidermis, the dermis and the hypodermis (1.5 to 2 cm). The explants (epidermis, dermis and hypodermis) were then cut using a metal punch to obtain cylinders 11 to 20 mm in diameter in which the thickness of the hypodermis is adjusted to the desired value ( 0.5 to 1cm). Finally, these explants were kept floating in a buffered saline solution until the stage of “inclusion” in the solidified matrix. This inclusion step was done with a process similar to that used for the NATIVESKINTM model.
  • the explanted skin is delicately deposited on an insert (8-well MILLICELLTM cup) with a porous membrane at the bottom (in PET, porosity 1 ⁇ m) and containing a solution derived from blood plasma treated with an anticoagulant agent with reversible properties in the presence of calcium ions (sodium citrate).
  • This solution contains 42% blood plasma, 50% 0.9% NaCl solution, 8% 1% CaC12 saline solution, an anti-fibrinolytic agent (tranexamic acid or aprotinin), and melted agarose with a low melting point at 0.7% (Agarose LMP GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGIES) (melted in an oven at 65.5° C.).
  • the function of the anti-fibrinolytic agent is to inhibit the enzymes capable of degrading the plasma matrix, these enzymes being secreted by the skin explant, and thus to maintain the integrity of the explant.
  • explants were then cultured (incubator at 37° C., 5% C02 and atmosphere saturated with water) for 1 to 4 hours before they were fixed (4% paraformaldehyde solution) and included in a block of paraffin for histological analysis.
  • the skin explants are dehydrated by a first alcohol bath then by a second xylene bath. Finally, a first paraffin bath replaces the water previously contained in the skin explant with paraffin.
  • the paraffin-impregnated samples are taken out of their bath and transferred to a container whose bottom is lined with absorbent paper, in order to be brought close to the inclusion station.
  • the samples, enclosed in histology cassettes, are immersed in liquid paraffin at 56°C to melt the paraffin which impregnates them. For each sample, the histology cassette is opened, the sample is possibly cut in two.
  • An embedding mold is filled with liquid paraffin and the sample (or the 2 pieces of sample) is placed in the mold and oriented in the desired direction for sectioning.
  • the mold is at the same time transferred to a refrigerated support in order to solidify the paraffin at the bottom of the mold and to hold the sample there.
  • the lid of the histology cassette on which the reference of the sample appears is placed on top, so that the paraffin passes through it (possibility of adding paraffin if necessary), then the whole thing is placed in the cold (refrigerator, freezer, cold room%) several minutes (5 to 6), in order to solidify the paraffin into a block, effectively trapping the sample in the correct orientation with the lid of the histology cassette which will become the support for the block.
  • the paraffin block Once the paraffin block has solidified, it is unmolded.
  • the excess paraffin is possibly scraped using a spatula from the sides of the lid of the embedding cassette.
  • Serial sections with a thickness varying from 4 to 5 ⁇ m are then made over the entire length of the paraffin block containing the sample.
  • labeling is carried out using avidin coupled with a fluorochrome which makes it possible to detect the mast cell granules.
  • the first step deparaffinizes and rehydrates the sections fixed and impregnated with paraffin. The sections are incubated for 30 minutes at room temperature in Citrate pH6 buffer, then saturated and permeabilized for 40 minutes at 37° C. with a 0.1% solution of goat serum and Triton. The sections are then incubated for one hour at room temperature in a humid chamber with 5 mg/ml Avidin-Sulforhodamin 101 (Avidin TEXAS RED; MERCK).
  • Staining of the cell nuclei is then carried out by incubating the sections with DAPI (D9542, SIGMA) at 1/1000 for 3 minutes at ambient temperature. Mounting medium is added and a coverslip is placed on the sections. The slides are then analyzed under a fluorescence microscope in order to determine the level of mast cell degranulation in the different explants.
  • DAPI D9542, SIGMA
  • the results made it possible to determine the level of degranulation of the mast cells identified in the samples and, after integration, to deduce the inflammatory potential of each substance injected.
  • the results confirm that the inflammatory potential of cetrotide is associated with mast cell degranulation. Accordingly, cetrotide has a high allergic or pseudo-allergic potential.
  • a culture of primary human mast cells was obtained according to the protocol described in GAUDENZIO et al. (J. Allergy Clin. Immunol., vol.131(5), p: 1400-7, 2013) and in GAUDENZIO et al. (Previously cited, 2016). Briefly, PBMCs from blood samples from different donors were isolated on a Ficoll gradient. The hematopoietic progenitors expressing the CD34+ marker were then isolated among them by tri-magnetic (potentially also feasible by FACS). These cells were then cultured, then matured into mast cells by cultivating them in a serum-free culture medium supplemented in particular with recombinant IL-6, IL-3 and SCF for a period of approximately 3 month.
  • Mast cells are considered mature and ready for use when they present cytoplasmic granules which are labeled with avidin coupled to a fluorochrome and when they are capable of degranulating in response to stimulation by IgE complexes /antigen (or IgE/anti-IgE) or by agonists of the MRGPRX2 receptor (eg compound 48/80 or substance P).
  • IgE complexes /antigen or IgE/anti-IgE
  • agonists of the MRGPRX2 receptor eg compound 48/80 or substance P.
  • HEK 293 cells were transformed to express the human MRGPRX2 receptor (Accession number Q96LB1).
  • the transformed cells were placed on a microscope slide fitted with one or more culture wells.
  • the analysis of the fluorescence by post acquisition cell is done on a classic image processing software (ex IMAGEJ).
  • the cells labeled with Fluo-4 are then incubated in the presence of cetrotide.
  • a fluorescence analysis is then made by a video recording made on a fluorescence microscope over a period of about 300 seconds after starting the incubation.
  • a 20-second sequence is performed to establish the base line before adding the molecule to be tested. Then the molecule to be tested is added for a period of 100 seconds, then 100 m M of substance P are added in order to locate the cells expressing MRGPRX2. 100 seconds later, 100 m M of ionomycin is added as a positive control for visualization of calcium flux.
  • cetrotide can be considered an agonist of the MRGPRX2 receptor.
  • cetrotide has a strong pseudo-allergic potential.

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Abstract

The present invention relates to an in vitro method for determining the inflammatory potential of a substance, comprising the steps of: ia) administering a composition comprising the substance to a skin explant, topically or by subcutaneous injection; which skin explant comprises the epidermis, the dermis and the epidermal appendages and also a thickness of at least 5 millimetres of hypodermis; ib) determining the inflammatory response within the skin explant; ic) determining the level of mast cell degranulation within the skin explant; and ii) determining the inflammatory potential of the substance and the association or non-association thereof with an allergic or pseudo-allergic potential.

Description

Modèle humain ex vivo destiné à l’évaluation du potentiel inflammatoire de type allergique ou pseudo-allergique Ex vivo human model intended for the evaluation of the inflammatory potential of the allergic or pseudo-allergic type
[0001] [La présente demande internationale revendique la priorité de la demande de brevet Français FR 21/05293 déposée en date du 20 mai 2021, laquelle est incorporé à la présente demande par référence. [0001] [This international application claims the priority of French patent application FR 21/05293 filed on May 20, 2021, which is incorporated herein by reference.
Domaine technique Technical area
[0002] La présente invention est relative au domaine de l’inflammation, qu’elle soit de nature allergique, pseudo-allergique ou autre, et propose, plus spécifiquement, le premier modèle humain ex vivo pour déterminer le potentiel inflammatoire d’un composé. The present invention relates to the field of inflammation, whether of an allergic, pseudo-allergic or other nature, and more specifically provides the first ex vivo human model for determining the inflammatory potential of a compound .
Art antérieur Prior art
[0003] La réponse inflammatoire fait partie intégrante de la réaction du système immunitaire en réponse à une agression. Maintenant, une telle réponse inflammatoire peut être induite chez un sujet suite à une injection. Au-delà de la gêne occasionnée, cette réponse peut être problématique, notamment s’il s’agit d’une réponse allergique. Aussi, il importe de pouvoir prédire, préalablement à toute injection, la réponse inflammatoire susceptible d’être induite par une substance. [0003] The inflammatory response is an integral part of the reaction of the immune system in response to an attack. Now, such an inflammatory response can be induced in a subject following an injection. Beyond the discomfort caused, this response can be problematic, especially if it is an allergic response. Also, it is important to be able to predict, prior to any injection, the inflammatory response likely to be induced by a substance.
[0004] En lien avec l’allergie, le phénomène biologique conduisant au développement d'une telle allergie se réalise à partir de 2 phases successives, avec une phase initiale dite de « sensibilisation » asymptomatique et une deuxième phase de « réaction allergique » symptomatique. [0004] In connection with allergy, the biological phenomenon leading to the development of such an allergy takes place from 2 successive phases, with an initial phase called asymptomatic "sensitization" and a second phase of symptomatic "allergic reaction". .
[0005] La première phase dite de sensibilisation débute lorsque l'individu entre pour la première fois en contact avec un composé que l’on appelle l'allergène car générateur d’une réponse allergique. Celui-ci est alors reconnu et considéré comme une substance étrangère par certaines cellules du système immunitaire qui sont présentes en grande quantité au niveau de la peau et des muqueuses (les cellules présentatrices d’antigènes, ex. les cellules dendritiques). Ces cellules vont présenter l'allergène à leur surface et permettre la production d'immunoglobulines E (IgE) par d'autres cellules. [0005] The first so-called sensitization phase begins when the individual comes into contact for the first time with a compound that is called the allergen because it generates an allergic response. This is then recognized and considered as a foreign substance by certain cells of the immune system which are present in large quantities in the skin and mucous membranes (antigen-presenting cells, ex. dendritic cells). These cells will present the allergen on their surface and allow the production of immunoglobulin E (IgE) by other cells.
[0006] Ces IgE vont rapidement passer dans le sang et aller se fixer sur des cellules appelées mastocytes qui siègent notamment au niveau de la peau et des muqueuses (localisations où les allergènes sont susceptibles de pénétrer). Ce processus de liaison des IgE est appelé «sensibilisation», car il rend les mastocytes sensibles à une activation en cas de rencontre ultérieure avec le même antigène. Cette première phase est muette, c'est- à-dire que le sujet en phase de sensibilisation est asymptomatique. [0006] These IgEs will quickly pass into the blood and will attach themselves to cells called mast cells which are found in particular at the level of the skin and the mucous membranes (locations where the allergens are likely to penetrate). This process of IgE binding is called “sensitization” because it makes mast cells susceptible to activation upon subsequent encounter with the same antigen. This first phase is silent, ie the subject in the sensitization phase is asymptomatic.
[0007] Lors d'un contact ultérieur entre l'allergène et l'organisme « sensibilisé », l'allergène va se fixer sur les IgE présents à la surface des mastocytes, provoquant G activation de ces derniers. Cette activation résulte en la dégranulation des mastocytes qui entraîne la libération massive dans l’organisme d’histamine et de médiateurs de l'inflammation. [0007] During subsequent contact between the allergen and the “sensitized” organism, the allergen will bind to the IgE present on the surface of the mast cells, causing G activation of the latter. This activation results in the degranulation of mast cells which leads to the massive release in the body of histamine and inflammatory mediators.
[0008] Le mastocyte est une cellule présente dans les tissus conjonctifs, qui fait partie des globules blancs et se caractérise par la présence dans son cytoplasme de très nombreuses granulations contenant des médiateurs chimiques comme la sérotonine, l’histamine, la tryptase ou l’héparine. Lorsqu'il est en contact avec un allergène et qu'il présente à sa surface les IgE spécifiques de celui-ci ou en contact d'agents infectieux, il dégranule et libère ses médiateurs de façon très rapide, par un mécanisme d'exocytose. Il déclenche ainsi des réactions inflammatoires immédiates, parfois graves, comme un choc anaphylactique qui engendre une hypotension. La même activation induit, de façon plus retardée (quelques heures), la synthèse de nombreuses cytokines (comme le TNF-alpha), chimiokines et médiateurs lipidiques. The mast cell is a cell present in the connective tissues, which is part of the white blood cells and is characterized by the presence in its cytoplasm of very many granules containing chemical mediators such as serotonin, histamine, tryptase or heparin. When it is in contact with an allergen and it presents specific IgEs on its surface or in contact with infectious agents, it degranulates and releases its mediators very rapidly, by an exocytosis mechanism. It thus triggers immediate, sometimes serious, inflammatory reactions, such as anaphylactic shock which causes hypotension. The same activation induces, in a more delayed manner (a few hours), the synthesis of many cytokines (such as TNF-alpha), chemokines and lipid mediators.
[0009] Lors de manifestations allergiques, cette histamine va exercer ses effets en se fixant principalement sur les récepteurs H1 présents dans le nez, où l'histamine augmente l'œdème et l'obstruction, et provoque démangeaisons, éternuements et sécrétions de mucus, dans la peau, où l’histamine provoque érythème, œdème et démangeaisons, et dans les poumons où l’histamine provoque une bronchoconstriction. [0009] During allergic manifestations, this histamine will exert its effects by binding mainly to the H1 receptors present in the nose, where histamine increases edema and obstruction, and causes itching, sneezing and mucus secretions, in the skin, where histamine causes erythema, edema and itching, and in the lungs where histamine causes bronchoconstriction.
[00010] En lien avec les mastocytes, on doit également prendre en compte le potentiel pseudo-allergique. Il s’agit là d’un mécanisme qui n’est pas médié par les IgE (à la différence de l’allergie), mais par le récepteur MRGPRX2 (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). Ce mécanisme est alors dose-dépendant. Dès lors, ces réactions pseudo-allergiques pourraient être prévenues, ou limitées, en cas de nouvelle administration de la substance par réduction de la dose ou diminution de la vitesse d’administration. [00011] Maintenant, il est particulièrement difficile de prédire le potentiel inflammatoire chez l’homme et notamment le risque allergique ou pseudo-allergique associé à un composé ou à une composition. [00010] In connection with the mast cells, the pseudo-allergic potential must also be taken into account. This is a mechanism that is not mediated by IgE (unlike allergy), but by the MRGPRX2 receptor (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). This mechanism is therefore dose-dependent. Consequently, these pseudo-allergic reactions could be prevented, or limited, in the event of new administration of the substance by reducing the dose or reducing the rate of administration. [00011] Now, it is particularly difficult to predict the inflammatory potential in humans and in particular the allergic or pseudo-allergic risk associated with a compound or a composition.
[00012] Des modèles ex vivo ont bien été développé comme celui décrit dans le brevet KR 2021 0034733A enseignant un procédé in vitro de détermination du potentiel inflammatoire et allergique d’une substance. Maintenant, outre la complexité de mise en œuvre, la possibilité à extrapoler à l’homme les résultats obtenus dans ces modèles pose question. Dans le cas du brevet KR 2021 0034733A, le procédé revendiqué nécessite la fabrication d’un modèle de peau dédié en trois dimensions qui intègre une co-culture cellulaire de fibroblastes de peau humaine ou issus de cornée de lapin avec des lignées de cellules rapporteuses (“monitoring cells”) de macrophages de souris (RAW264.7) ou de mastocyte de rat (RBL-2H3). [00012] Ex vivo models have indeed been developed such as that described in patent KR 2021 0034733A teaching an in vitro method for determining the inflammatory and allergic potential of a substance. Now, in addition to the complexity of implementation, the possibility of extrapolating the results obtained in these models to humans raises questions. In the case of patent KR 2021 0034733A, the claimed process requires the manufacture of a dedicated three-dimensional skin model which integrates a cell co-culture of fibroblasts from human skin or from rabbit cornea with reporter cell lines ( “monitoring cells”) of mouse macrophages (RAW264.7) or rat mast cells (RBL-2H3).
[00013] Aussi, le seul procédé accessible aujourd’hui repose sur l’utilisation de modèles animaux chez lesquels on va réaliser une injection et constater, si oui ou non, il s’ensuit une réaction inflammatoire et, en outre, une dégranulation des mastocytes. [00014] On comprendra aisément qu’il est souhaitable de se passer de tels modèles animaux pour arriver à déterminer ce potentiel inflammatoire et, notamment, le risque allergique ou pseudo-allergique. [00013] Also, the only method available today is based on the use of animal models in which an injection will be made and whether or not an inflammatory reaction ensues and, in addition, a degranulation of the mast cells. [00014] It will be easily understood that it is desirable to do without such animal models in order to be able to determine this inflammatory potential and, in particular, the allergic or pseudo-allergic risk.
[00015] Aussi, il existe un besoin permettant de déterminer facilement et rapidement, et sans recourir à l’animal, le potentiel inflammatoire, et notamment allergique ou pseudo- allergique chez l’homme d’une composition injectable. [00015] Also, there is a need to determine easily and quickly, and without resorting to animals, the inflammatory potential, and in particular allergic or pseudo-allergic in humans, of an injectable composition.
Exposé de l’invention Disclosure of Invention
[00016] Les inventeurs ont préalablement développé un modèle ex vivo de peau humaine permettant de tester l’injection sous-cutanée d’une solution ne nécessitant pas de recourir à l’animal. Ils ont maintenant mis en évidence que, non seulement les granulocytes étaient présents dans ce modèle de peau humaine, mais encore qu’ils restaient fonctionnels avec une capacité de dégranulation. Ce résultat était d’autant plus inattendu que c’est plutôt une perte de fonctionnalité des mastocytes qui était documentée, avec notamment une apoptose importante de ces derniers durant les premiers jours (voir notamment Kl VINEN et al., Experimental Dermatology, vol.12, p : 53-60, 2003). [00017] Dès lors, la découverte des inventeurs permet, suite à l’injection « sous- cutanée » ou à l’application sur l’épiderme d’une composition dans ce même modèle de peau humaine ex vivo , de déterminer le comportement des granulocytes présents et finalement d’en déduire le potentiel inflammatoire d’une composition, injectée ou appliquée, et notamment l’existence ou d’une réaction allergique ou pseudo-allergique, mais également de trancher sur la nature de celle-ci. [00016] The inventors have previously developed an ex vivo model of human skin making it possible to test the subcutaneous injection of a solution that does not require the use of animals. They have now demonstrated that not only were granulocytes present in this model of human skin, but also that they remained functional with degranulation capacity. This result was all the more unexpected since it was rather a loss of functionality of the mast cells which was documented, with in particular a significant apoptosis of the latter during the first days (see in particular Kl VINEN et al., Experimental Dermatology, vol.12 , p: 53-60, 2003). [00017] Consequently, the discovery of the inventors makes it possible, following the "subcutaneous" injection or the application to the epidermis of a composition in this same model of human skin ex vivo, to determine the behavior of the granulocytes present and finally to deduce therefrom the inflammatory potential of a composition, injected or applied, and in particular the existence or of an allergic or pseudo-allergic reaction, but also to decide on the nature of the latter.
[00018] En conséquence, il devient possible de tester le potentiel inflammatoire chez l’homme, notamment le potentiel allergique ou pseudo-allergique d’une solution injectable sans recourir à un modèle animal. [00018] Consequently, it becomes possible to test the inflammatory potential in humans, in particular the allergic or pseudo-allergic potential of an injectable solution without resorting to an animal model.
[00019] Aussi, un premier objet de l’invention concerne un procédé in vitro destiné à déterminer le potentiel inflammatoire d’une substance comprenant les étapes de : [00019] Also, a first object of the invention relates to an in vitro method intended to determine the inflammatory potential of a substance comprising the steps of:
[00020] ia) administration à un expiant de peau, par voie topique ou par injection sous-cutanée, d’une composition comprenant la substance ; lequel expiant de peau comprend l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques ainsi qu’une épaisseur d’au moins 5 millimètres d’hypoderme ; [00021] ib) détermination de la réponse inflammatoire au sein de l’expiant de peau; [00020] ia) administration to a skin explant, topically or by subcutaneous injection, of a composition comprising the substance; which explant of skin comprises the epidermis, the dermis and the epidermal appendages as well as a thickness of at least 5 millimeters of hypodermis; [00021] ib) determination of the inflammatory response within the skin explant;
[00022] ic) détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’expiant de peau ; et [00022] ic) determination of the level of mast cell degranulation within the explanted skin; and
[00023] ii) détermination du potentiel inflammatoire de la substance et son association ou non à un potentiel allergique ou pseudo-allergique. [00024] Avantageusement, l’étape ia) consiste en l’injection sous-cutanée au sein de l’expiant d’une composition comprenant la substance. [00023] ii) determination of the inflammatory potential of the substance and its association or not with an allergic or pseudo-allergic potential. [00024] Advantageously, step ia) consists of the subcutaneous injection within the explant of a composition comprising the substance.
[00025] Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape id) de détermination du niveau de dégranulation d’une culture de mastocytes, de préférence d’une culture de mastocytes primaires humains, après incubation de celle-ci en présence de différentes concentrations de la substance. [00026] Cette étape complémentaire permet, outre la confirmation d’une dégranulation des mastocytes en présence de la substance qui permet d’établir un potentiel allergique ou pseudo-allergique, de déterminer la concentration efficace médiane (CE50) correspondant à la concentration nécessaire de substance pour induire une dégranulation médiane (entre l’absence de dégranulation des mastocytes et la dégranulation maximale de ceux-ci). According to a preferred embodiment, the method further comprises a step id) of determining the level of degranulation of a culture of mast cells, preferably of a culture of primary human mast cells, after incubation of the latter in presence of different concentrations of the substance. [00026] This additional step makes it possible, in addition to confirming mast cell degranulation in the presence of the substance which makes it possible to establish an allergic or pseudo-allergic potential, to determine the median effective concentration (EC50) corresponding to the necessary concentration of substance to induce midline degranulation (between no mast cell degranulation and maximum mast cell degranulation).
[00027] Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape ie) de détermination du potentiel agoniste de la substance vis-à-vis du récepteur MRGPRX2 (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). According to another preferred embodiment, the method further comprises a step ie) of determining the agonist potential of the substance with respect to the MRGPRX2 receptor (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2).
[00028] La méthode selon l’invention permet alors de trancher entre un potentiel allergique ou pseudo-allergique de la substance et, dans le cas d’un potentiel pseudo allergique, de déterminer la concentration maximale de substance pouvant être injectée de sorte à ne pas induire de réaction pseudo-allergique. The method according to the invention then makes it possible to decide between an allergic or pseudo-allergic potential of the substance and, in the case of a pseudo-allergic potential, to determine the maximum concentration of substance that can be injected so as not to not induce a pseudo-allergic reaction.
Description détaillée de l’invention ) Detailed description of the invention)
[00029] Par « substance », on entend une substance de toute nature (c’est-à-dire protéique, glucidique, lipidique, etc...), qui peut être d’origine synthétique ou naturelle, et dont on souhaite déterminer le potentiel inflammatoire et, potentiellement allergène. [00029] By "substance" is meant a substance of any kind (that is to say protein, carbohydrate, lipid, etc.), which may be of synthetic or natural origin, and of which it is desired to determine inflammatory and potentially allergenic potential.
[00030] Par « expiant de peau », on désigne un fragment de peau qui comprend, outre l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques, une épaisseur d’au moins 5 mm d’hypoderme (de préférence entre 5 et 15 mm d’hypoderme et, préférentiellement encore, entre 5 et 10 mm d’hypoderme). [00030] The term “explant of skin” denotes a fragment of skin which comprises, in addition to the epidermis, the dermis and the epidermal appendages, a thickness of at least 5 mm of hypodermis (preferably between 5 and 15 mm of hypodermis and, more preferably, between 5 and 10 mm of hypodermis).
[00031] Les annexes épidermiques correspondent aux follicules pileux, aux glandes sébacées et aux glandes sudoripares. L'hypoderme est la couche de tissu qui est située immédiatement sous le derme de la peau. L’hypoderme un tissu conjonctif lâche qui est richement vascularisé et qui contient en outre du tissu adipeux. [00031] The epidermal appendages correspond to hair follicles, sebaceous glands and sweat glands. The hypodermis is the layer of tissue that is located immediately below the dermis of the skin. The hypodermis is a loose connective tissue that is richly vascularized and also contains fatty tissue.
[00032] Si cet expiant de peau est prélevé chez un mammifère, on pourra opter pour l’humain ou le porc. Maintenant, eu égard à la destination privilégiée du procédé selon l’invention, on optera plutôt pour un expiant de peau humaine. [00032] If this skin explant is taken from a mammal, we can opt for humans or pigs. Now, having regard to the preferred destination of the process according to the invention, we will rather opt for an explant of human skin.
[00033] En lien avec l’origine de l’explant de peau, celui-ci peut provenir d’une plastie provenant de n’importe quelle partie du corps, avec notamment des plasties de l’abdomen, de la poitrine, des fesses, du dos, voire, pourquoi pas, du cuir chevelu ou de tout autre partie du corps comprenant de la peau. [00033] In connection with the origin of the skin explant, this may come from a plastic surgery from any part of the body, in particular with skin plastic surgery. the abdomen, chest, buttocks, back, or even, why not, the scalp or any other part of the body comprising skin.
[00034] L’explant de peau est préparé comme décrit dans la demande internationale WO 2019/170281. [00035] Dans le détail, cet expiant de peau a été inclus, à l’exception de l’épiderme, dans une matrice liquide apte à se solidifier comme le plasma sanguin, une solution dérivée de plasma sanguin (ex. une dilution de plasma sanguin dans du tampon physiologique, notamment une dilution de plasma sanguin à au moins 10%, 20%, 30%, voire à au moins 40% (poids/poids total de la matrice)), une solution de fibrinogène, une solution de collagène, une solution de gélatine, des solutions de polymères synthétiques, des solutions de polymères naturels (ex. agarose (agarose ou agar-agar à faible/bas points de fusion), amidon, polysaccharides), et leurs mélanges. Pour plus de détail en lien avec les matrices aptes à se solidifier et les méthodes pour y placer les expiants de peau, on pourra consulter le brevet Européen n° EP 2 882290 Bl. [00036] Line matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide comprenant au moins un composé ou une composition spécifique dont la concentration dans ladite solution liquide est telle que, lors de la mise en œuvre de conditions appropriées, notamment des conditions particulières de température, la solution liquide prend une consistance de type solide ou gélifiée. Ledit composé ou une composition spécifique peut être d'origine animale, végétale ou synthétique, sa nature et sa concentration sont déterminés en fonction des caractéristiques physico-chimiques souhaitées de la matrice lorsqu'elle est solidifiée, notamment la souplesse et la résistance de la matrice. [00034] The skin explant is prepared as described in international application WO 2019/170281. [00035] In detail, this skin explant was included, with the exception of the epidermis, in a liquid matrix capable of solidifying like blood plasma, a solution derived from blood plasma (eg a dilution of plasma blood in physiological buffer, in particular a dilution of blood plasma to at least 10%, 20%, 30%, or even to at least 40% (weight/total weight of the matrix)), a solution of fibrinogen, a solution of collagen , gelatin solution, synthetic polymer solutions, natural polymer solutions (e.g. agarose (low/low melting point agarose or agar-agar), starch, polysaccharides), and mixtures thereof. For more details in connection with the matrices able to solidify and the methods for placing the explants of skin therein, one can consult the European patent n° EP 2 882290 Bl. liquid solution comprising at least one specific compound or composition whose concentration in said liquid solution is such that, when appropriate conditions are implemented, in particular particular temperature conditions, the liquid solution takes on a consistency of the solid or gel type . Said compound or a specific composition can be of animal, vegetable or synthetic origin, its nature and its concentration are determined according to the desired physico-chemical characteristics of the matrix when it is solidified, in particular the flexibility and the resistance of the matrix. .
[00037] Idéalement, ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est choisie parmi toute solution liquide, de préférence nutritive, capable de se solidifier ou de se gélifier dans des conditions particulières compatibles avec la survie et la culture de cellules de peau qui composent ledit expiant. [00037] Ideally, said liquid matrix capable of being able to solidify is chosen from any liquid solution, preferably nutrient, capable of solidifying or gelling under specific conditions compatible with the survival and culture of skin cells which make up said atoning.
[00038] Une telle matrice est utilisée dans un procédé d’inclusion comprenant les étapes suivantes i) la flottaison d'un expiant de peau cylindrique dans une matrice liquide choisie parmi une solution dérivée de plasma sanguin, solution de fibrinogène ou de collagène, ou d'une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, ou un mélange de ces solutions, cette matrice liquide étant contenue dans ledit insert, cette flottaison laissant la surface épidermique de l’expiant de peau émergée, tandis que le derme est immergé ; ii) l'induction rapide de la solidification de ladite entourant l’explant de peau; et, iii) La culture in vitro ou ex vivo, ou la maintenance en survie de 1 de l’explant de peau dans ladite matrice ainsi solidifiée. [00038] Such a matrix is used in an inclusion process comprising the following steps i) the flotation of a cylindrical skin explant in a liquid matrix chosen from a solution derived from blood plasma, fibrinogen or collagen solution, or a solution of agar-agar or low melting point agarose, or a mixture of these solutions, this liquid matrix being contained in said insert, this flotation leaving the epidermal surface of the explant with emerged skin, while the dermis is immersed; ii) rapid induction of solidification of said surrounding skin explant; and, iii) The in vitro or ex vivo culture, or the survival maintenance of 1 of the skin explant in the said matrix thus solidified.
[00039] De préférence, ladite matrice liquide ou solidifiée ne contient aucun facteur de croissance, ni sérum. [00040] A l'étape i), la flottaison d’un expiant de peau cylindrique est effectuée dans une matrice liquide comprenant une première solution choisie parmi une solution dérivée de plasma sanguin, une solution de fibrinogène ou une solution de collagène, et une deuxième solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion. Lorsque la matrice liquide contient une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, cette deuxième solution est préalablement chauffée pendant une durée et à une température suffisante pour être liquide et pour rester liquide à environ 37°C pendant le temps suffisant pour être mélangée à la première solution dans ledit insert et jusqu'au dépôt dudit expiant de peau. Preferably, said liquid or solidified matrix does not contain any growth factor or serum. [00040] In step i), the flotation of a cylindrical skin explant is carried out in a liquid matrix comprising a first solution chosen from a solution derived from blood plasma, a fibrinogen solution or a collagen solution, and a second low melting point agar-agar or agarose solution. When the liquid matrix contains a solution of agar-agar or agarose with a low melting point, this second solution is previously heated for a time and at a temperature sufficient to be liquid and to remain liquid at around 37°C during the sufficient time to be mixed with the first solution in said insert and until said skin explant is deposited.
[00041] De préférence, ladite deuxième solution est préalablement chauffée à sa température de fusion, ou légèrement supérieure, de préférence entre 65°C et 70 °C. Preferably, said second solution is preheated to its melting point, or slightly higher, preferably between 65°C and 70°C.
[00042] De préférence de l'agar-agar ou agarose à bas point de fusion est un agar-agar ou agarose dont la température maximale de gélification est comprise entre 24°C et 28°C, et la température de fusion est supérieure à 65,5°C en solution à 1,5 %. [00042]Agar-agar or agarose with a low melting point is preferably an agar-agar or agarose whose maximum gelation temperature is between 24° C. and 28° C., and the melting temperature is greater than 65.5°C in 1.5% solution.
[00043] De préférence et comme exemple, mais sans limitation, cet agarose est l'agarose nommé LMP Agarose (« Low melting point » (GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGIES). Preferably and as an example, but without limitation, this agarose is the agarose named LMP Agarose (“Low melting point” (GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGIES).
[00044] De préférence, ladite deuxième solution est une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, dont la concentration en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion est comprise entre 1% et 5% (de préférence dans une solution physiologique), de manière plus préférée comprise entre 2% et 5%, entre 3% et 4,5%, entre 3,5% et 4, 5% ou encore entre 3,8% et 4,2% ou entre 3,9% et 4,1%, 4% étant la concentration la plus préférée. [00044] Preferably, said second solution is an agar-agar or low-melting-point agarose solution, the concentration of agar-agar or low-melting-point agarose of which is between 1% and 5% (preferably in a physiological solution), more preferably between 2% and 5%, between 3% and 4.5%, between 3.5% and 4.5% or alternatively between 3.8% and 4.2% or between 3.9% and 4.1%, 4% being the most preferred concentration.
[00045] Cette deuxième solution en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion à ladite concentration et une fois chauffée à sa température de fusion, ou légèrement supérieure, permet d'être conservée sous forme liquide pendant au moins 1 heure et, de préférence pendant au moins 4heures, 10 heures ou 16 heures à 37 °C. This second agar-agar or low-melting-point agarose solution at said concentration and once heated to its melting temperature, or slightly higher, can be stored in liquid form for at least 1 hour and, preferably for at least 4 hours, 10 hours or 16 hours at 37°C.
[00046] De préférence, dans ladite matrice liquide comprenant ladite première et ladite deuxième solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, la concentration finale en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion est comprise entre 0,1% et 2%, de préférence entre 0,2% et 1,8%. Preferably, in said liquid matrix comprising said first and said second agar-agar or low-melting-point agarose solution, the final concentration of agar-agar or low-melting-point agarose is between 0.1% and 2%, preferably between 0.2% and 1.8%.
[00047] Une telle concentration permet d'obtenir non seulement une matrice qui une fois solidifiée permet de conserver la structure 3D et de maintenir en survie ledit expiant de peau, mais également d'obtenir une matrice solide mais suffisamment souple pour être non cassante et résistante à des chocs ponctuels. La solidification de cette matrice liquide se faisant après dépôt de l’expiant de peau en laissant le dispositif ainsi obtenu à température comprise entre 37 °C et la température ambiante, de préférence à 20 °C. [00047] Such a concentration makes it possible not only to obtain a matrix which, once solidified, makes it possible to preserve the 3D structure and to maintain said skin explant in survival, but also to obtain a solid matrix but sufficiently flexible to be non-brittle and resistant to occasional shocks. The solidification of this liquid matrix taking place after deposition of the skin explant, leaving the device thus obtained at a temperature between 37°C and room temperature, preferably at 20°C.
[00048] Selon un mode de réalisation particulier, dans ladite matrice liquide comprenant ladite première et ladite deuxième solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, la concentration finale en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion est comprise entre 1% et 2%, de préférence entre 1, 25% et 1, 75%, de préférence entre 1,4% et 1,6%, 1,5% étant la concentration la plus préférée. According to a particular embodiment, in said liquid matrix comprising said first and said second agar-agar or low-melting-point agarose solution, the final concentration of agar-agar or low-melting-point agarose melting is between 1% and 2%, preferably between 1.25% and 1.75%, preferably between 1.4% and 1.6%, 1.5% being the most preferred concentration.
[00049] Selon un autre mode de réalisation particulier, dans ladite matrice liquide comprenant ladite première et ladite deuxième solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion, la concentration finale en agar-agar ou en agarose à bas point de fusion est comprise entre 0,1% et 2%, de préférence entre 0, 2% et 1,75%, 0,25% étant la concentration la plus préférée. Une telle concentration permet d'obtenir une matrice qui une fois solidifiée permet de conserver la structure 3D et de maintenir en survie ledit expiant de peau, mais également d'obtenir une matrice suffisamment souple pour être non cassante et résistante à des effets mécaniques appliqués à l’expiant, par exemple lors d'un effet mimant le massage de la peau pour l'application d'une préparation telle que, par exemple, une crème. La solidification de cette matrice liquide se fait après dépôt de la biopsie de peau en laissant le dispositif ainsi obtenu à température comprise entre 37 ° C et la température ambiante, de préférence à 20 °C. [00050] De préférence, le volume de ladite matrice liquide est de 1/3 à 2/3 du volume total de l'insert, de préférence de 2/5 à 3/5 du volume total, La moitié du volume total de l'insert étant le volume préféré. According to another particular embodiment, in said liquid matrix comprising said first and said second agar-agar or low-melting-point agarose solution, the final concentration of agar-agar or low-melting-point agarose melting temperature is between 0.1% and 2%, preferably between 0.2% and 1.75%, 0.25% being the most preferred concentration. Such a concentration makes it possible to obtain a matrix which, once solidified, makes it possible to preserve the 3D structure and to maintain said skin explant in survival, but also to obtain a matrix which is sufficiently flexible to be non-brittle and resistant to mechanical effects applied to the explant, for example during a effect mimicking the massage of the skin for the application of a preparation such as, for example, a cream. The solidification of this liquid matrix takes place after deposition of the skin biopsy, leaving the device thus obtained at a temperature between 37° C. and room temperature, preferably at 20° C. [00050] Preferably, the volume of said liquid matrix is from 1/3 to 2/3 of the total volume of the insert, preferably from 2/5 to 3/5 of the total volume, Half of the total volume of the 'insert being the preferred volume.
[00051] Dans un autre mode de réalisation préféré, à l'étape a), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient entre 1 mM et 5 mM de Ca2+, de préférence entre 1,5 mM et 4,5 mM de Ca2+ Selon un mode de réalisation préféré, à l'étape a) ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient entre 1 mM et 2 mM de Ca2+, de préférence entre 1,2 mM et 1,4 mM de Ca2+. Selon un autre mode de réalisation préféré, à l'étape a) ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient entre 2 mM et 3 mM de Ca2+, de préférence entre 2,5 mM et 2,8 mM de Ca2+ et plus préférentiellement 2,8 mM de Ca2+. In another preferred embodiment, in step a), said liquid matrix capable of being able to solidify contains between 1 mM and 5 mM of Ca2+, preferably between 1.5 mM and 4.5 mM of Ca2+ According to a preferred embodiment, in step a) said liquid matrix capable of being able to solidify contains between 1 mM and 2 mM of Ca2+, preferably between 1.2 mM and 1.4 mM of Ca2+. According to another preferred embodiment, in step a) said liquid matrix capable of being able to solidify contains between 2 mM and 3 mM of Ca2+, preferably between 2.5 mM and 2.8 mM of Ca2+ and more preferentially 2 .8 mM Ca2+.
[00052] De préférence également, ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient entre 5 et 500 mg/mL d'acide ascorbique, de préférence entre 25 et 75 mg/mL, 50 mg/mL d'acide ascorbique étant la concentration la plus préférée. Also preferably, said liquid matrix capable of being able to solidify contains between 5 and 500 mg/mL of ascorbic acid, preferably between 25 and 75 mg/mL, 50 mg/mL of ascorbic acid being the highest concentration. most preferred.
[00053] De préférence encore, ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est un milieu contenant entre 1 mM et 5 mM de Ca2+ et contenant entre 5 et 500 mg/mL d'acide ascorbique. [00053] More preferably, said liquid matrix capable of being able to solidify is a medium containing between 1 mM and 5 mM of Ca2+ and containing between 5 and 500 mg/mL of ascorbic acid.
[00054] Dans un mode de réalisation préféré, ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contenue dans l'insert à l'étape a), est une matrice liquide, dont la première solution du mélange (la deuxième solution étant la solution d'agar-agar ou d'agarose) est de préférence nutritive, et également apte à pouvoir se solidifier sous l'action d'une augmentation ou d'une diminution de la température et/ou par l'addition d'un composé ou d'une composition spécifique. In a preferred embodiment, said liquid matrix capable of being able to solidify contained in the insert in step a), is a liquid matrix, the first solution of the mixture of which (the second solution being the solution of agar-agar or agarose) is preferably nutritious, and also capable of being able to solidify under the action of an increase or decrease in temperature and/or by the addition of a compound or a specific composition.
[00055] De préférence ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier ne contient aucun facteur de croissance ni sérum animal ou humain. [00056] De préférence, à l'étape a), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier ne recouvre pas la face supérieure de l'épiderme avant que cette matrice ne soit solidifiée à l'étape b). Preferably, said liquid matrix capable of being able to solidify does not contain any growth factor or animal or human serum. Preferably, in step a), said liquid matrix capable of being able to solidify does not cover the upper face of the epidermis before this matrix is solidified in step b).
[00057] Selon un autre mode de réalisation également préféré, à l'étape a) dudit procédé d’inclusion, l’expiant de peau est ensuite placé sur une matrice liquide apte à pouvoir se solidifier, notamment comme ci-dessus indiqué, et laquelle matrice liquide est choisie parmi toute solution liquide apportant tous les ingrédients nutritifs et/ou nécessaires à sa culture, en particulier à la maintenance de l'état de physiologie initiale des cellules qui le constituent. Cette solution est capable de se solidifier ou de se gélifier dans des conditions particulières compatibles avec la survie et la culture de l’expiant de peau. According to another equally preferred embodiment, in step a) of said inclusion process, the skin explant is then placed on a liquid matrix capable of being able to solidify, in particular as indicated above, and which liquid matrix is chosen from any liquid solution providing all the nutritious and/or necessary ingredients for its culture, in particular for maintaining the initial physiological state of the cells which constitute it. This solution is capable of solidifying or gelling under specific conditions compatible with the survival and culture of the skin explant.
[00058] De préférence, ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles mélangée à une solution d'agar-agar ou d'agarose. Preferably, said liquid matrix capable of being able to solidify is a liquid solution derived from blood plasma treated with an anticoagulant agent with reversible properties mixed with an agar-agar or agarose solution.
[00059] De préférence, ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient un plasma sanguin, du fibrinogène, ou du collagène, mélangé à une solution d'agar-agar ou d'agarose à bas point de fusion. Preferably, said liquid matrix capable of being able to solidify contains blood plasma, fibrinogen, or collagen, mixed with an agar-agar or low-melting-point agarose solution.
[00060] Selon un mode de réalisation également préféré du procédé d’inclusion, à l'étape a), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution dérivée de plasma sanguin contenant de 25 % à 60 %, de préférence entre 35 % et 45 % (v/v) de plasma sanguin, de 70 % à 35 % d'une solution physiologique, telle qu'une solution de NaCl à 0,9 %, de 5 % à 12 %, de préférence 8 %, d'une solution saline de CaC12 à 1 %, d'un agent anti-fibrinolytique en concentration suffisante pour obtenir l'activité anti- fibrinolytique recherchée, de préférence entre 5 % et 2 %, de préférence l'agent anti- fibrinolytique étant choisi parmi l'acide tranaxémique ou de l'aprotinine, et d'une solution d'agarose à bas point de fusion entre 0,5% et 4%, de préférence entre 1 % et 2 %. According to an equally preferred embodiment of the inclusion process, in step a), said liquid matrix capable of being able to solidify is a solution derived from blood plasma containing from 25% to 60%, preferably between 35 % and 45% (v/v) of blood plasma, from 70% to 35% of a physiological solution, such as a 0.9% NaCl solution, from 5% to 12%, preferably 8%, a 1% CaC12 saline solution, an anti-fibrinolytic agent in a concentration sufficient to obtain the desired anti-fibrinolytic activity, preferably between 5% and 2%, preferably the anti-fibrinolytic agent being chosen from tranaxemic acid or aprotinin, and an agarose solution with a low melting point between 0.5% and 4%, preferably between 1% and 2%.
[00061] Selon un mode de réalisation également préféré du procédé d’inclusion, à l'étape a), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une solution liquide de fibrinogène et de thrombine, ou de collagène ou de plasma sanguin, mélangée à une solution de gélatine, comprenant des gels polymériques synthétiques, naturels tels que les gels d'agarose, en particulier les gels d'agarose ou d'agar-agar à faible/bas points de fusion, les gels d'amidon ou de polysaccharides et pour laquelle l'incubation à 37°C permet sa solidification. According to an equally preferred embodiment of the inclusion process, in step a), said liquid matrix capable of being able to solidify is a liquid solution of fibrinogen and thrombin, or collagen or blood plasma, mixed to a gelatin solution, including synthetic, natural polymeric gels such as agarose gels, in particular low/low melting point agarose or agar-agar gels, starch or polysaccharide gels and for which incubation at 37°C allows its solidification.
[00062] Selon un mode de réalisation également préféré du procédé d’inclusion, à l'étape a) ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier contient une solution liquide dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles, de préférence par du citrate de sodium ; et la solidification de ladite matrice à l'étape b) pour cette solution pouvant être obtenue en présence d'ions calcium, de préférence également en présence de thrombine. [00062] According to an equally preferred embodiment of the inclusion process, in step a) said liquid matrix capable of being able to solidify contains a liquid solution derived from blood plasma treated with an anticoagulant agent with reversible properties, preferably by sodium citrate; and the solidification of said matrix in step b) for this solution obtainable in the presence of calcium ions, preferably also in the presence of thrombin.
[00063] Lorsque la matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est une matrice liquide contenant une solution de plasma sanguin, une solution de fibrinogène ou de collagène, la solidification de ladite matrice à l'étape b) peut être réalisée pour cette solution par ajout de thrombine ou par augmentation de la température, ou encore à l'aide des facteurs sécrétés par des cellules apportées à la matrice, telles que les fibroblastes primaires. When the liquid matrix capable of being able to solidify is a liquid matrix containing a solution of blood plasma, a solution of fibrinogen or collagen, the solidification of said matrix in step b) can be carried out for this solution by adding thrombin or by increasing the temperature, or else using factors secreted by cells supplied to the matrix, such as primary fibroblasts.
[00064] Selon un mode de réalisation également préféré du procédé d’inclusion, à l'étape b), ladite matrice liquide apte à pouvoir se solidifier est solidifiée après au maximum de 8 heures, de préférence moins de 2 heures ou moins d'une heure, une durée de moins de 30 min, de préférence de moins de 10 min étant la durée la plus préférée pour engager la phase de solidification de la matrice liquide après dépôt de la biopsie de peau sur cette matrice liquide à l'étape a). [00064] According to an equally preferred embodiment of the inclusion process, in step b), said liquid matrix capable of being able to solidify is solidified after a maximum of 8 hours, preferably less than 2 hours or less than one hour, a duration of less than 30 min, preferably of less than 10 min being the most preferred duration to initiate the solidification phase of the liquid matrix after depositing the skin biopsy on this liquid matrix in step a ).
[00065] Pour revenir au procédé selon l’invention, et dans le cas d’un expiant de peau de forme cylindrique, on optera ainsi plutôt pour un expiant de peau présentant un diamètre compris entre 10 mm et 50 mm, de préférence entre 15 mm et 40 mm. [00065] To return to the process according to the invention, and in the case of a skin explant of cylindrical shape, one will thus rather opt for a skin explant having a diameter of between 10 mm and 50 mm, preferably between 15 mm and 40mm.
[00066] Avantageusement, l’expiant de peau est positionné au sein d’un insert qui peut prendre des formes multiples et notamment correspondre à un insert suspendu ou à un insert sur pilotis. Maintenant, on optera de préférence pour un insert suspendu. Le fond de cet insert est constitué d’une membrane poreuse dont le diamètre est compris entre 5 et 40 mm et de manière plus préférée entre 9,5 et 30 mm. Pour ce qui est de la porosité de cette membrane, elle doit permettre d’empêcher la matrice liquide de la traverser avant sa solidification. Typiquement, cette membrane poreuse présentera une porosité comprise entre 0,4 et 8 pm, de manière préférée entre 0,4 pm et 1,5 pm, avec l’intervalle allant de 0,8 pm et 1,2 pm comme intervalle de porosité préféré. En termes de matière, on pourra ainsi choisir une membrane poreuse choisie parmi les membranes en polyéthylène téréphtalate (PET), en nitrocellulose et en polycarbonate. Finalement, et à titre d’exemple de tels inserts, on pourra citer ceux fournis par les sociétés NUNC, CORNING, BECTON DICKINSON (BD FALCON), MILLIPORE (MILLICELL), qui peuvent prendre la forme d’ inserts avec membrane en polycarbonate, en PET ou en nitrocellulose, lesquels sont pré-emballés dans des plaques multi-puits pour plaque de culture 6, 8, 12 ou 24 puits, et dont la porosité de la membrane peut varier de 0,4 et 8pm. [00066] Advantageously, the explanted skin is positioned within an insert which can take multiple forms and in particular correspond to a suspended insert or to an insert on piles. Now, we will preferably opt for a suspended insert. The bottom of this insert consists of a porous membrane whose diameter is between 5 and 40 mm and more preferably between 9.5 and 30 mm. As for the porosity of this membrane, it must make it possible to prevent the liquid matrix from cross before it solidifies. Typically, this porous membrane will have a porosity of between 0.4 and 8 μm, preferably between 0.4 μm and 1.5 μm, with the range of 0.8 μm and 1.2 μm as the porosity range. prefer. In terms of material, it will thus be possible to choose a porous membrane chosen from polyethylene terephthalate (PET), nitrocellulose and polycarbonate membranes. Finally, and by way of example of such inserts, mention may be made of those supplied by the companies NUNC, CORNING, BECTON DICKINSON (BD FALCON), MILLIPORE (MILLICELL), which can take the form of inserts with a polycarbonate membrane, in PET or nitrocellulose, which are pre-packaged in multi-well plates for 6, 8, 12 or 24 well culture plates, and whose membrane porosity can vary from 0.4 and 8 μm.
[00067] Par « application topique », on entend une application de la composition à tester sur l’épiderme de l’explant de peau. [00067] By "topical application" is meant an application of the composition to be tested on the epidermis of the skin explant.
[00068] Par « injection sous-cutanée », on entend une injection qui est réalisée dans l'hypoderme de l’explant de peau, ce qui lui vaut également l’appellation d’injection « hypodermique ». Ce type d’injection, qui est bien connue de l’homme du métier, nécessite généralement de pratiquer un pli cutané à l'aide des doigts et l’injection sous- cutanée est alors réalisée dans le pli cutané. [00068] “Subcutaneous injection” means an injection which is performed in the hypodermis of the skin explant, which also gives it the name of “hypodermic” injection. This type of injection, which is well known to those skilled in the art, generally requires making a skin fold using the fingers and the subcutaneous injection is then performed in the skin fold.
[00069] Selon un mode de réalisation préféré, l’étape ia) consiste en l’injection sous- cutanée d’une composition comprenant la substance dans un expiant de peau. [00070] La composition en question est une composition à tester qui est sous forme liquide. Avantageusement, le volume de cette composition est compris entre 10 mΐ et 1 ml, de préférence entre 10 mΐ et 500 mΐ et, de manière particulièrement préférée, entre 10 mΐ et 200 mΐ. [00069] According to a preferred embodiment, step ia) consists of the subcutaneous injection of a composition comprising the substance in a skin explant. The composition in question is a composition to be tested which is in liquid form. Advantageously, the volume of this composition is between 10 mΐ and 1 ml, preferably between 10 mΐ and 500 mΐ and, particularly preferably, between 10 mΐ and 200 mΐ.
[00071] L’aiguille pour l’injection de la composition présente typiquement une longueur suffisante pour atteindre l’hypoderme. Ainsi, on utilisera de préférence des aiguilles présentant une longueur supérieure ou égale à 10 mm. A titre d’exemple de telles aiguilles, on pourra utiliser des aiguilles présentant une longueur de 12, 16, 20, 25, 30, 35, 40 ou encore 45 mm. Avantageusement donc, l’aiguille présente une longueur comprise entre 16 et 45 mm, de préférence une longueur allant de 20 à 40 mm. Pour ce qui est du diamètre de l’aiguille à utiliser, il peut être identifié simplement par l’homme de l’art au regard de ses connaissances générales. Typiquement, de telles aiguilles hypodermiques sont du type 18G, 19G, 20G, 21G, 22G, 23G, 25G, 26G, 27G, 28G, 29G, 30G voire 31G. [00071] The needle for injecting the composition typically has a sufficient length to reach the hypodermis. Thus, needles having a length greater than or equal to 10 mm will preferably be used. By way of example of such needles, it is possible to use needles having a length of 12, 16, 20, 25, 30, 35, 40 or even 45 mm. Advantageously therefore, the needle has a length of between 16 and 45 mm, preferably a length ranging from 20 to 40 mm. As regards the diameter of the needle to be used, it can be identified simply by those skilled in the art with regard to his general knowledge. Typically, such hypodermic needles are of the 18G, 19G, 20G, 21G, 22G, 23G, 25G, 26G, 27G, 28G, 29G, 30G or even 31G type.
[00072] Cette étape d’injection peut être réalisée par un expérimentateur, lequel effectue un pincement de sorte de permettre la formation d’un pli cutané et ainsi de faciliter l’injection sous-cutanée. Maintenant, cette étape d’injection peut également être réalisée par un dispositif d’injection automatique. Typiquement, le dispositif permet une injection à une profondeur déterminée, par rapport à la surface de l’épiderme, de sorte d’obtenir une injection sous-cutanée. [00072] This injection step can be performed by an experimenter, who performs pinching so as to allow the formation of a skin fold and thus facilitate subcutaneous injection. Now, this injection step can also be performed by an automatic injection device. Typically, the device allows injection at a determined depth, relative to the surface of the epidermis, so as to obtain a subcutaneous injection.
[00073] L’étape ib) de détermination de la réponse inflammatoire au sein de l’expiant de peau s’effectue par le suivi de marqueurs de l’inflammation qui sont bien connus de l’homme du métier. De tels marqueurs de l’inflammation peuvent être présents au sein de l’expiant de peau, de la matrice dans laquelle est inclue l’expiant de peau et/ou dans le milieu de culture. Atitre de marqueurs de l’inflammation, on peut citer, s’en s’y limiter, les cytokines, ou les protéines antibactériennes. Maintenant, on peut également citer des protéines impliquées dans la biosynthèse des lipides ou toute autre molécule dont le niveau d'expression varie entre un état enflammé et un état non enflammé (cf. notamment SERHAN & WARD, Molecular and Cellular Basis of Inflammation, Humana Press). Il est aussi possible d’analyser le suivi de marqueurs différentiellement exprimés issus d’études transcriptomiques, protéomiques ou lipidomiques. [00074] A titre de cytokines utilisables comme marqueurs de l’inflammation, on peut citer les interleukines et leurs récepteurs. A titre d’exemple d’interleukines, on peut citer IL-1A, IL-1B, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17A, IL-17C, IL-17F, IL-19, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31 et IL-33, et à titre d’exemple de récepteurs d'interleukines, on peut citer IL-10RA, IL-10RB, IL-1R1, IL-5RA (CD125) et IL-9R. [00075] A titre de cytokines utilisables comme marqueurs de l’inflammation, on peut également citer les chimiokines qui sont des cytokines chimiotactiques qui contrôlent les motifs de migration et le positionnement des cellules immunitaires, mais également leurs récepteurs. A titre d’exemples de cytokines, on peut citer C5, Eotaxin, MCP-4, TARC, MCP-1, MIP-3A, CCL22, CCL23, MPMB, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, IL8RA, INP10, L8RB et CXCL3 Concernant les récepteurs de chimiokines, on peut citer CCL13 (MCP-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CX3CR1, CXCR1 et CXCR2. [00073] Step ib) for determining the inflammatory response within the skin explant is carried out by monitoring inflammation markers which are well known to those skilled in the art. Such markers of inflammation may be present within the explant of skin, of the matrix in which the explant of skin is included and/or in the culture medium. By way of markers of inflammation, mention may be made, being limited thereto, of cytokines, or antibacterial proteins. Now, we can also cite proteins involved in the biosynthesis of lipids or any other molecule whose level of expression varies between an inflamed state and a non-inflamed state (cf. in particular SERHAN & WARD, Molecular and Cellular Basis of Inflammation, Humana Press). It is also possible to analyze the monitoring of differentially expressed markers from transcriptomic, proteomic or lipidomic studies. [00074] As cytokines which can be used as markers of inflammation, mention may be made of interleukins and their receptors. By way of example of interleukins, mention may be made of IL-1A, IL-1B, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL- 17A, IL-17C, IL-17F, IL-19, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31 and IL-33, and by way of example of interleukin receptors, mention may be made of IL-10RA, IL-10RB, IL-1R1, IL-5RA (CD125) and IL-9R. [00075] As cytokines which can be used as markers of inflammation, mention may also be made of chemokines which are chemotactic cytokines which control the migration patterns and the positioning of the immune cells, but also their receptors. Examples of cytokines include C5, Eotaxin, MCP-4, TARC, MCP-1, MIP-3A, CCL22, CCL23, MPMB, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, IL8RA, INP10 , L8RB and CXCL3 Concerning chemokine receptors, mention may be made of CCL13 (MCP-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CX3CR1, CXCR1 and CXCR2.
[00076] Il est à noter que d'autres cytokines (que les interleukines et les chimiokines) sont envisageables en tant que marqueurs de G inflammation. A titre d’exemples de tels cytokines, on peut citer MCP-1, GM-CSF, TNFSF5, MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL et IFNA1. [00076] It should be noted that other cytokines (other than interleukins and chemokines) can be envisaged as markers of inflammation. Examples of such cytokines include MCP-1, GM-CSF, TNFSF5, MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL and IFNA1.
[00077] Parmi les protéines antibactériennes, on peut citer les peptides antimicrobiens (P AM) également appelés peptides de défense de l'hôte, qui font partie de la réponse immunitaire innée et présente une longueur inférieure à 50 acides aminés. Contrairement à la majorité des antibiotiques classiques, il apparaît que les peptides antimicrobiens déstabilisent fréquemment les membranes biologiques, peuvent former des canaux transmembranaires et peuvent également renforcer l’immunité en jouant le rôle d’immunomodulateurs. A titre de peptides antimicrobiens, on peut citer notamment les défensines (ex. béta-défensines, cathélicidines telles que LL-37). Maintenant, il existe d’autres protéines antibactériennes que les peptides antimicrobiens, par exemple les protéines S 100 (S100A7 (psoriasine) and S100A15 (koebnerisine)). [00077] Among the antibacterial proteins, mention may be made of antimicrobial peptides (AMPs), also called host defense peptides, which are part of the innate immune response and have a length of less than 50 amino acids. Unlike the majority of conventional antibiotics, it appears that antimicrobial peptides frequently destabilize biological membranes, can form transmembrane channels and can also enhance immunity by acting as immunomodulators. As antimicrobial peptides, mention may in particular be made of defensins (eg beta-defensins, cathelicidins such as LL-37). Now, there are other antibacterial proteins than antimicrobial peptides, for example the S 100 proteins (S100A7 (psoriasin) and S100A15 (koebnerisin)).
[00078] Typiquement, les marqueurs de l’inflammation sont choisis parmi les molécules sécrétées par les cellules structurales (ex. kératinocytes, cellules stromales), les adipocytes et les cellules du système immunitaire (ex. macrophages, cellules dendritiques, lymphocytes T, mastocytes). A titre d’exemple de tels marqueurs de l’inflammation, on peut citer MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL et IFNA1TNFA, MCP1, VEGF, IP- 10, MDC, MIP-1B, IL-17A, IL-17C, IL-17F, TNFB, IL-27, MCP-4, MPMA, IL-22, IL-1B, IL- 12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23, IL-31, EOTAXIN, IL-6, IL-4, IL-13, IL- 5, IL-8, IL-15, BETA-HEXOSAMINISASE, HISTAMINE, TRYPTASE et CHYMASE. [00078] Typically, the markers of inflammation are chosen from molecules secreted by structural cells (eg keratinocytes, stromal cells), adipocytes and cells of the immune system (eg macrophages, dendritic cells, T lymphocytes, mast cells ). By way of example of such markers of inflammation, mention may be made of MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL and IFNA1TNFA, MCP1, VEGF, IP-10, MDC, MIP-1B, IL-17A, IL-17C, IL-17F, TNFB, IL-27, MCP-4, MPMA, IL-22, IL-1B, IL-12/ IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23, IL-31, EOTAXIN, IL-6, IL-4, IL-13, IL-5, IL-8, IL-15, BETA-HEXOSAMINISASE, HISTAMINE, TRYPTASE and CHYMAS.
[00079] De préférence, on choisira des marqueurs de l’inflammation présents dans le milieu de culture. A titre d’exemple de tels marqueurs, on peut citer TNFA, MCP-1, EOTAXIN-3, VEGF, PM0, IL-2, MIP-3A, MPMB, IL-17A, MIP-1A, IL-22, IL-1B, IL- 12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23EOTAXIN, IL-6, IL-8, BETA- HEXOSAMINISASE, HISTAMINE et TRYPTASE. [00080] L’étape ic) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes peut être réalisée à l’aide de techniques bien connues de l’homme du métier. Des techniques utilisables pour cette étape incluent des techniques d’ELISA ou colorimétriques permettant de mesurer la présence de médiateurs inflammatoires contenus dans les granules des mastocytes, comme l’histamine ou la tryptase, ou secrétés de novo comme des médiateurs lipidiques ou des cytokines/chimiokines, ou encore sur des techniques de fluorescence, immunofluorescence ou fluorochromes spécifiques des granules des mastocytes. Preferably, markers of inflammation present in the culture medium will be chosen. Examples of such markers include TNFA, MCP-1, EOTAXIN-3, VEGF, PM0, IL-2, MIP-3A, MPMB, IL-17A, MIP-1A, IL-22, IL- 1B, IL-12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23EOTAXIN, IL-6, IL-8, BETA-HEXOSAMINISASE, HISTAMINE and TRYPTASE. [00080] Step ic) for determining the level of mast cell degranulation can be carried out using techniques well known to those skilled in the art. Techniques that can be used for this step include ELISA or colorimetric techniques making it possible to measure the presence of inflammatory mediators contained in the granules of mast cells, such as histamine or tryptase, or secreted de novo such as lipid mediators or cytokines/chemokines , or even on fluorescence, immunofluorescence or fluorochromes techniques specific to mast cell granules.
[00081] Avantageusement, cette étape ic) est réalisée dans un délai maximum de 6 heures suivant l’étape ia) d’administration, de préférence dans un délai maximum de 4 heures. [00081] Advantageously, this step ic) is carried out within a maximum period of 6 hours following the administration step ia), preferably within a maximum period of 4 hours.
[00082] Les inventeurs ont en effet montré que, si les granulocytes étaient bien fonctionnels, le suivi de la dégranulation était optimal durant cet intervalle. A noter que les inventeurs ont également montré qu’il n’était pas possible d’induire une nouvelle dégranulation des mastocytes par la suite. [00082] The inventors have indeed shown that, if the granulocytes were well functional, the monitoring of the degranulation was optimal during this interval. It should be noted that the inventors have also shown that it was not possible to induce a new degranulation of the mast cells thereafter.
[00083] Avantageusement, une seule étape ia) d’administration d’une composition comprenant la substance est réalisé par expiant de peau. [00083] Advantageously, a single step ia) of administration of a composition comprising the substance is carried out per explant of the skin.
[00084] Selon un mode de réalisation préférée, l’étape ic) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’expiant de peau est effectuée par une analyse de la fluorescence. [00084] According to a preferred embodiment, step ic) for determining the level of mast cell degranulation within the skin explant is carried out by fluorescence analysis.
[00085] Avantageusement, cette étape ic) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes utilise l’avidine. [00085] Advantageously, this step ic) for determining the level of mast cell degranulation uses avidin.
[00086] L’avidine est en effet une glycoprotéine qui se fixe très spécifiquement à l’héparine contenue dans les granules des mastocytes (THARP et al., J. Histochem. Cytochem ., vol.33, p :27-32 , 1985). Ainsi, durant le processus de dégranulation, les granules, dès lors qu’ils sont externalisés, deviennent directement accessibles à l’avidine. Maintenant, et dans le cas d’une fixation des tissus, les granules intracellulaires sont accessibles à l’avidine dès lors que l’on opère une perméabilisation des tissus. Cette avidine peut être complexée à un fluorochrome (avidine-FITC, avidine-Alexa488, avidine-sulfurhodamine 101 ou tout autre molécule fluorescente) ou à une molécule bioluminescente. Maintenant, il est également possible d’utiliser l’avidine seule (non complexée) et en combinaison avec une molécule qui lui est complémentaire. On peut citer, à titre d’exemple d’une telle molécule de la biotine complexée à un fluorochrome, à une molécule bioluminescente ou à tout autre molécules identifiable. [00086] Avidin is in fact a glycoprotein which binds very specifically to the heparin contained in the granules of mast cells (THARP et al., J. Histochem. Cytochem., vol.33, p: 27-32, 1985 ). Thus, during the degranulation process, the granules, when they are externalized, become directly accessible to avidin. Now, and in the case of tissue fixation, the intracellular granules are accessible to avidin as soon as tissue permeabilization is performed. This avidin can be complexed with a fluorochrome (avidin-FITC, avidin-Alexa488, avidin-sulfurhodamine 101 or any other fluorescent molecule) or with a bioluminescent molecule. Now it is also possible to use avidin alone (not complexed) and in combination with a molecule which is complementary to it. Mention may be made, by way of example of such a molecule, of biotin complexed with a fluorochrome, with a bioluminescent molecule or with any other identifiable molecule.
[00087] Maintenant, la détermination du niveau de dégranulation des mastocytes pourra utiliser d’autres marqueurs, notamment du noyau ou de la membrane plasmique, de sorte à faciliter l’identification des granulocytes extemalisés des mastocytes. Il sera aussi possible de doser dans le milieu de culture de la tryptase, de l’histamine, de la beta- hexosaminidase, de la chymase ou bien tout autres molécules préformées au sein des granules du mastocytes et relarguées lors de la dégranulation. [00088] Typiquement, la détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau pourra être réalisée en suivant le protocole décrit dans GAUDENZIO étal. (J. Clin. Invest., vol.126, p :3981-3998, 2016) [00087] Now, the determination of the level of degranulation of the mast cells can use other markers, in particular of the nucleus or the plasma membrane, so as to facilitate the identification of the granulocytes externalized from the mast cells. It will also be possible to assay tryptase, histamine, beta-hexosaminidase, chymase or any other molecules preformed within the mast cell granules and released during degranulation in the culture medium. [00088] Typically, the determination of the level of mast cell degranulation within the skin explant can be carried out by following the protocol described in GAUDENZIO et al. (J. Clin. Invest., vol.126, p:3981-3998, 2016)
[00089] Avantageusement, l’étape ic) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes s’effectuera sur au moins une coupe histologique réalisée à partir de l’explant de peau. [00089] Advantageously, step ic) of determining the level of mast cell degranulation will be carried out on at least one histological section made from the skin explant.
[00090] Pour se faire, on pourra utiliser les méthodes bien connues d’immunohistochimie qui utilise la fixation de l’explant de peau, l’inclusion de l’explant (par ex. paraffine, O.C.T., EPON) avant sa conservation, et enfin la réalisation de coupes histologiques sur le bloc d’inclusion. Le détail de telles méthodes est décrit par exemple dans « Immunohistochemistry: Basics and Methods » de Igor BUCHWALOW (Editions SPRINGER). [00090] To do this, well-known immunohistochemistry methods can be used, which use the fixation of the skin explant, the inclusion of the explant (e.g. paraffin, O.C.T., EPON) before its conservation, and finally, performing histological sections on the inclusion block. The detail of such methods is described for example in “Immunohistochemistry: Basics and Methods” by Igor BUCHWALOW (SPRINGER Editions).
[00091] Les coupes histologiques utilisables pourront présenter une épaisseur très importante allant jusqu’à 500 pm. Avantageusement, la coupe histologique présentera ainsi une épaisseur comprise entre 1 et 500 pm. Maintenant, il est possible d’utiliser des coupes présentant des dimensions plus classiques avec une épaisseur comprise entre 2 et 25pm. [00091] The histological sections that can be used may have a very large thickness of up to 500 μm. Advantageously, the histological section will thus have a thickness of between 1 and 500 μm. Now, it is possible to use cuts with more classic dimensions with a thickness between 2 and 25pm.
[00092] Pour ce qui est de la détermination du niveau de granulation des mastocytes au sein de l’explant à proprement parler, on détermine, pour chaque mastocyte identifié, s’il est associé à une dégranulation faible, modérée ou forte, puis la proportion (pourcentage) de mastocytes associée à chacun de ces types de dégranulation (faible, modérée et forte). Le niveau de dégranulation pourra aussi être analysé de manière automatisée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image ou bien d’un algorithme informatique ou bien de techniques d’intelligence artificielle dite de machine-learning ou deep-learning. As regards the determination of the level of mast cell granulation within the explant itself, it is determined, for each identified mast cell, whether it is associated with weak, moderate or strong degranulation, then the proportion (percentage) of mast cells associated with each of these types of degranulation (weak, moderate and strong). The level of degranulation can also be analyzed automatically using a image analysis software or a computer algorithm or artificial intelligence techniques called machine-learning or deep-learning.
[00093] Dans le détail, un mastocyte présentant un faible niveau de dégranulation correspond à un mastocyte présentant de 0 à 2 granules autour de lui (ou à une cellule présentant un contour lisse) ; un mastocyte présentant un niveau de dégranulation modéré correspond à un mastocyte présentant de 3 à 6 granules autour de lui (ou à une cellule présentant un contour avec un aspect granuleux) ; et un mastocyte présentant un haut niveau de dégranulation correspond à un mastocyte présentant plus de 6 granules autour de lui (ou à une cellule présentant une forme exposée). [00094] Au fins de contrôle, les même étape ia), ib) et ic) pourront être réalisée avec un contrôle négatif (ex. PB S) et/ou avec une composition comprenant un contrôle positif correspondant à une substance connue pour induire une inflammation ou, plus spécifiquement une dégranulation des mastocytes comme par exemple des complexes IgE/antigènes, IgE/anti-IgE, du composé 48/80, de la substance P, des sécrétagogues divers, des produits issus de pathogènes ou bien des molécules thérapeutiques connues pour induire des réactions au site d’injection (ex anakinra, cétrorélix ou icantibant). [00093] In detail, a mast cell exhibiting a low level of degranulation corresponds to a mast cell exhibiting 0 to 2 granules around it (or to a cell exhibiting a smooth outline); a mast cell presenting a moderate level of degranulation corresponds to a mast cell presenting from 3 to 6 granules around it (or to a cell presenting an outline with a granular appearance); and a mast cell with a high level of degranulation is a mast cell with more than 6 granules around it (or a cell with an exposed shape). [00094] For control purposes, the same steps ia), ib) and ic) may be carried out with a negative control (eg PB S) and/or with a composition comprising a positive control corresponding to a substance known to induce a inflammation or, more specifically, degranulation of mast cells such as, for example, IgE/antigen, IgE/anti-IgE complexes, compound 48/80, substance P, various secretagogues, products from pathogens or known therapeutic molecules to induce reactions at the injection site (eg anakinra, cetrorelix or icantibant).
[00095] L’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire, et plus spécifiquement du potentiel allergique ou pseudo-allergique de la substance peut alors être simplement réalisée au regard du résultat des étapes ib) et ic). [00096] Ainsi, il sera possible de déterminer si la substance présente un potentiel inflammatoire au regard d’une augmentation des marqueurs inflammatoires à l’issu de l’étape ib). [00095] Step ii) of determining the inflammatory potential, and more specifically the allergic or pseudo-allergic potential of the substance can then be simply carried out with regard to the result of steps ib) and ic). [00096] Thus, it will be possible to determine whether the substance has an inflammatory potential with regard to an increase in inflammatory markers at the end of step ib).
[00097] Il sera possible alors de déterminer si ce potentiel inflammatoire est associé ou non à un potentiel allergique ou pseudo-allergique à l’issu de l’étape ic), ceci au regard des proportions de mastocytes subissant une dégranulation faible, modérée, ou forte au terme de cette étape. [00097] It will then be possible to determine whether or not this inflammatory potential is associated with an allergic or pseudo-allergic potential at the end of step ic), this with regard to the proportions of mast cells undergoing low, moderate, or strong at the end of this stage.
[00098] Ainsi, une substance associée à une proportion de granulocytes présentant pour plus de 50% un faible niveau de dégranulation et/ou pour moins de 10% un fort niveau de dégranulation présentera un potentiel allergique ou pseudo-allergique faible, voire nul. [00099] Les inventeurs ont ainsi montré que, dans l’expiant en culture, il existe un niveau de base de dégranulation des mastocytes qui est comparable à celui observé in vivo chez l’animal, ce qui n’avait rien d’évident et qui conforte l’intérêt du présent modèle. Thus, a substance associated with a proportion of granulocytes presenting for more than 50% a low level of degranulation and/or for less than 10% a high level of degranulation will present a low allergic or pseudo-allergic potential, or even zero. The inventors have thus shown that, in the explant in culture, there is a basic level of mast cell degranulation which is comparable to that observed in vivo in animals, which was not obvious and which reinforces the interest of this model.
[000100] A l’inverse, une substance associée à une proportion de granulocytes présentant pour plus de 50% un fort niveau de dégranulation présentera elle un potentiel allergique ou pseudo-allergique élevé. [000100] Conversely, a substance associated with a proportion of granulocytes presenting for more than 50% a high level of degranulation will present a high allergic or pseudo-allergic potential.
[000101] Là encore, les inventeurs ont montré que le niveau de dégranulation observé dans l’expiant de culture est comparable à celui observé in vivo chez l’animal avec un inducteur de dégranulation. A noter en outre qu’on observe, à la différence de la situation observée avec le niveau de base de dégranulation, une répartition spatiale inhomogène des mastocytes subissant une dégranulation. La proportion de mastocytes subissant une forte dégranulation est alors d’autant plus élevée que l’on se trouve à proximité du site d’injection. Ce résultat confirme là encore la pertinence du modèle selon l’invention. [000101] Here again, the inventors have shown that the level of degranulation observed in the culture explant is comparable to that observed in vivo in animals with a degranulation inducer. It should also be noted that, unlike the situation observed with the basic level of degranulation, an inhomogeneous spatial distribution of mast cells undergoing degranulation is observed. The proportion of mast cells undergoing severe degranulation is then all the higher as one is close to the injection site. This result again confirms the relevance of the model according to the invention.
[000102] Finalement, une substance associée à une proportion de granulocytes intermédiaire, et ne dépassant aucun des deux précédents seuils, présentera un potentiel allergique ou pseudo-allergique intermédiaire, voir modéré. [000102] Finally, a substance associated with an intermediate proportion of granulocytes, and not exceeding either of the two preceding thresholds, will present an intermediate, or even moderate, allergic or pseudo-allergic potential.
[000103] Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape id) de détermination du niveau de dégranulation d’une culture de mastocytes après incubation de celle-ci en présence de différentes concentrations de la substance. [000104] L’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire de la substance permettra alors en lien avec cette étape id), outre la confirmation d’une dégranulation par les mastocytes en présence de la substance, de déterminer la concentration efficace médiane (CE50) de la substance pour l’induction de la dégranulation des mastocytes. [000103] According to a preferred embodiment, the method further comprises a step id) of determining the level of degranulation of a culture of mast cells after incubation of the latter in the presence of different concentrations of the substance. [000104] Step ii) of determining the inflammatory potential of the substance will then make it possible, in connection with this step id), in addition to the confirmation of degranulation by the mast cells in the presence of the substance, to determine the median effective concentration (EC50 ) substance for induction of mast cell degranulation.
[000105] Typiquement, on utilisera une culture de mastocytes primaires, de préférence humains. [000105] Typically, a culture of primary mast cells, preferably human, will be used.
[000106] Une telle culture de mastocytes peut être obtenue par des méthodes bien connues de l’homme du métier. A titre d’exemple, on pourra utiliser le protocole décrit dans GAUDENZIO et al. (J. Allergy Clin. Immunol ., vol.131(5), p : 1400-7, 2013) et dans GAUDENZIO et al. (précédemment cité, 2016) qui est décrite dans les exemples. Pour se faire, les mastocytes sont dérivés dans du milieu de culture approprié à partir de progéniteurs hématopoïétiques (ex. cellules CD34+, CD133+) présents dans le sang circulant de donneurs sains (ex. sang périphérique d’adulte, sang issu de cordon ombilical). [000106] Such a culture of mast cells can be obtained by methods well known to those skilled in the art. By way of example, the protocol described in GAUDENZIO et al. (J. Allergy Clin. Immunol., vol.131(5), p: 1400-7, 2013) and in GAUDENZIO et al. (previously cited, 2016) which is described in the examples. To do this, the mast cells are derived in the appropriate culture medium from hematopoietic progenitors (eg CD34 + , CD133 + cells) present in the circulating blood of healthy donors (eg adult peripheral blood, blood from the umbilical cord).
[000107] La détermination de la dégranulation des mastocytes en culture pourra alors se faire alors par des techniques bien connues de l’homme du métier dont il a été fait mention précédemment. Typiquement, on effectue on dosage de marqueurs des mastocytes avant et après la stimulation (ex. environ 1 heure). A titre de marqueurs des mastocytes préformés dans les granules sécrétoires, on peut citer labeta-hexosaminidase, la tryptase ou la chymase, ou encore l’histamine. Maintenant, il est aussi possible de doser la sécrétion de cytokines et chimiokines parmi lesquelles MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL et IFNA1, TNFA, MCP1, VEGF, PM0, MDC, MIP-1B, IL-17A, IL-17C, IL-17F, TNFB, IL-27, MCP-4, MIP-1A, IL-22, IL-1B, IL-12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL- 23, IL-31, EOTAXIN, IL-6, IL-4, IL-13, IL-5, IL-8 et IL-15. Le dosage de ces marqueurs des granulocytes peut être réalisé par tests colorimétriques ou des tests de type ELIS A en plaques 96 ou 384 puits. De manière complémentaire il est possible de détecter, par cytométrie en flux, l’augmentation de marqueurs d’exocytose à la surface des mastocytes de type lamp-1, annexine 5 ou bien par marquage à l’avidine fluorescente ou autres. [000107] The determination of the degranulation of mast cells in culture can then be done by techniques well known to those skilled in the art mentioned above. Typically, a mast cell marker assay is performed before and after stimulation (eg, about 1 hour). As markers of preformed mast cells in the secretory granules, mention may be made of labeta-hexosaminidase, tryptase or chymase, or even histamine. Now, it is also possible to measure the secretion of cytokines and chemokines including MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL and IFNA1, TNFA, MCP1, VEGF, PM0, MDC, MIP-1B, IL-17A, IL-17C, IL-17F, TNFB, IL-27, MCP-4, MIP-1A, IL-22, IL-1B, IL- 12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23, IL-31, EOTAXIN, IL-6, IL-4, IL-13, IL-5, IL-8 and IL-15. The assay of these granulocyte markers can be carried out by colorimetric tests or ELIS A type tests in 96 or 384 well plates. In addition, it is possible to detect, by flow cytometry, the increase in exocytosis markers on the surface of mast cells of the lamp-1 or annexin 5 type, or by labeling with fluorescent avidin or others.
[000108] Un pourcentage de dégranulation est défini par rapport à un contrôle positif qui est la lyse de la totalité des mastocytes d’un puits à l’aide d’un détergeant (ex. le TRITON X100 utilisé à 1%). On définira une molécule avec un potentiel allergique ou pseudo-allergique faible si le pourcentage de dégranulation des mastocytes est compris entre 5 et 15%, avec un potentiel allergique ou pseudo-allergique modérée si le pourcentage de dégranulation des mastocytes est compris entre 15 et 30% et avec un potentiel allergique ou pseudo-allergique fort si le pourcentage de dégranulation des mastocytes est supérieure à 30%. [000108] A percentage of degranulation is defined in relation to a positive control which is the lysis of all the mast cells in a well using a detergent (e.g. TRITON X100 used at 1%). We will define a molecule with a low allergic or pseudo-allergic potential if the percentage of mast cell degranulation is between 5 and 15%, with a moderate allergic or pseudo-allergic potential if the percentage of mast cell degranulation is between 15 and 30 % and with a strong allergic or pseudo-allergic potential if the percentage of mast cell degranulation is greater than 30%.
[000109] Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape ie) de détermination du potentiel agoniste de la substance vis-à-vis du récepteur MRGPRX2 (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). [000110] Une telle étape peut être réalisée simplement par l’homme du métier et est décrite dans les exemples. Pour se faire, des cellules sont transformées de sorte à exprimer le récepteur MRGPRX2 humain (voir par exemple les numéros d’ Accession Q96LB1, NP_001290544.1, NP_473371.1, ACG60653.1, EAW68359.1 ou encore AAH63450.1). L’activation du récepteur MRGPRX2 résultant en une diminution de la concentration intracellulaire en ions calcium, le suivi de cette concentration en ions calcium intracellulaire permet d’extrapoler l’activité du récepteur MRGPRX2 et, en présence de la substance, le potentiel agoniste de cette dernière vis-à-vis du récepteur MRGPRX2. Cette mesure de l’activation du récepteur peut aussi être faite par bioluminescence (ex. Fluo-4). Ainsi, si après ajout de la molécule stimulante, il est détecté une augmentation de signal fluorescent, alors la molécule peut être considérée comme un agoniste du récepteur MRGPRX2. [000109] According to another preferred embodiment, the method further comprises a step ie) of determining the agonist potential of the substance with respect to the MRGPRX2 receptor (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). [000110] Such a step can be carried out simply by a person skilled in the art and is described in the examples. To do this, cells are transformed to express the human MRGPRX2 receptor (see for example Accession numbers Q96LB1, NP_001290544.1, NP_473371.1, ACG60653.1, EAW68359.1 or even AAH63450.1). The activation of the MRGPRX2 receptor resulting in a decrease in the intracellular concentration of calcium ions, the monitoring of this concentration of intracellular calcium ions makes it possible to extrapolate the activity of the MRGPRX2 receptor and, in the presence of the substance, the agonist potential of this last with respect to the MRGPRX2 receptor. This measurement of receptor activation can also be made by bioluminescence (eg Fluo-4). Thus, if after addition of the stimulating molecule, an increase in fluorescent signal is detected, then the molecule can be considered as an agonist of the MRGPRX2 receptor.
[000111] A la lueur des résultats obtenus en lien avec les étapes ib), ic) et id), cette étape ie) permet de savoir si la dégranulation des mastocytes révèle un potentiel allergique ou un potentiel pseudo-allergique. En effet, le récepteur MRGPRX2 est le récepteur responsable des pseudo-allergies. Dès lors, ces réactions pseudo-allergiques pourraient être prévenues, en cas de nouvelle administration de la substance, par réduction de la dose ou de la vitesse d’administration ou co-injection d’un antagoniste du récepteur MRGPRX2. [000111] In the light of the results obtained in connection with steps ib), ic) and id), this step ie) makes it possible to know whether the degranulation of the mast cells reveals an allergic potential or a pseudo-allergic potential. Indeed, the MRGPRX2 receptor is the receptor responsible for pseudo-allergy. Therefore, these pseudo-allergic reactions could be prevented, in the event of new administration of the substance, by reducing the dose or the rate of administration or co-injection of an antagonist of the MRGPRX2 receptor.
[000112] Aussi, l’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire de la substance permet alors de déterminer si la dégranulation des mastocytes induite par la substance résulte ou non d’une réaction pseudo-allergique. Dès lors qu’une substance est identifiée comme présentant un potentiel pseudo-allergique, l’étape ii) permet donc d’identifier les substances qu’il convient par exemple de combiner avec au moins un stabilisateur de mastocytes en vue de faciliter leur injection. [000112] Also, step ii) of determining the inflammatory potential of the substance then makes it possible to determine whether or not the degranulation of the mast cells induced by the substance results from a pseudo-allergic reaction. As soon as a substance is identified as presenting a pseudo-allergic potential, step ii) therefore makes it possible to identify the substances which it is appropriate, for example, to combine with at least one mast cell stabilizer in order to facilitate their injection.
[000113] Les stabilisateurs de mastocytes sont des médicaments utilisés pour prévenir ou contrôler certains troubles allergiques qui sont bien connus de l’homme du métier. Ces composés bloquent la dégranulation des mastocytes, stabilisant la cellule et empêchant ainsi la libération d'histamine et des médiateurs associés. A titre d’exemple de stabilisateurs de mastocytes, on peut citer la loratidine, la desloratidine, le cromoglycate de sodium, le kétotifène, l’olopatadine, la rupatadine, le mepoluzimab, l’omolizumab, le pzmirolast, le nédocromil, l’azélastine, les p2-agonistes, la quercétine, la lutéoline, la rutine ou encore la vitamine D. [000114] Dès lors, et dans le cas d’une réaction p seudo-all ergi que, les résultats obtenus au terme de l’étape id) permettent également de déterminer la concentration de substance à utiliser de sorte à ne pas induire de dégranulation des mastocytes ou une faible dégranulation. [000115] Les exemples suivants sont donnés uniquement à titre d’illustration de l’objet de la présente invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. [000113] Mast cell stabilizers are drugs used to prevent or control certain allergic disorders which are well known to those skilled in the art. These compounds block mast cell degranulation, stabilizing the cell and thus preventing the release of histamine and related mediators. Examples of mast cell stabilizers include loratidine, desloratidine, sodium cromoglycate, ketotifen, olopatadine, rupatadine, mepoluzimab, omolizumab, pzmirolast, nedocromil, azelastine , p2-agonists, quercetin, luteolin, rutin or even vitamin D. [000114] Consequently, and in the case of a p seudo-all ergi reaction, the results obtained at the end of step id) also make it possible to determine the concentration of substance to be used so as not to induce degranulation mast cells or mild degranulation. [000115] The following examples are given solely by way of illustration of the object of the present invention, of which they in no way constitute a limitation.
Exemples Examples
[000116] 1 -Préparation des expiants de peau [000116] 1 - Preparation of explants of skin
[000117] Des expiants de peau sont préparés à partir de prélèvements complets de peau issus de différents donneurs, lesquels prélèvements comprenaient l’épiderme, le derme et l’hypoderme (1,5 à 2cm). Les expiants (épiderme, derme et hypoderme) ont ensuite été découpés à l’aide d’un emporte-pièce métallique pour obtenir des cylindres de 11 à 20 mm de diamètre dans lesquels l’épaisseur d’hypoderme est ajustée à la valeur voulue (0,5 à 1cm). Enfin, ces expiants ont été maintenus en flottaison dans une solution saline tamponnée jusqu’à l’étape de « inclusion » dans la matrice solidifiée. Cette étape d’inclusion a été faite avec un procédé similaire à celui utilisé pour le modèle NATIVESKIN™. Brièvement, l’expiant de peau est délicatement déposé sur un insert (cupule MILLICELL™ 8 puits) disposant au fond d’une membrane poreuse (en PET, porosité 1 pm) et contenant une solution dérivée de plasma sanguin traité avec un agent anticoagulant aux propriétés réversibles en présence d’ions calcium (citrate de sodium). Cette solution contient 42 % de plasma sanguin, 50 % d’une solution de NaCl à 0,9 %, 8 % d’une solution saline de CaC12 à 1%, un agent anti-fibrinolytique (acide tranexamique ou aprotinine), et de l’agarose fondu à bas point de fusion à 0,7% (Agarose LMP GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGIES) (fondu à l’étuve à 65,5 °C). L’agent anti- fibrinolytique a pour fonction d’inhiber les enzymes susceptibles de dégrader la matrice de plasma, ces enzymes étant sécrétées par l’expiant de peau, et ainsi de maintenir l’intégrité de l’expiant. [000117] Explants of skin are prepared from complete samples of skin from different donors, which samples included the epidermis, the dermis and the hypodermis (1.5 to 2 cm). The explants (epidermis, dermis and hypodermis) were then cut using a metal punch to obtain cylinders 11 to 20 mm in diameter in which the thickness of the hypodermis is adjusted to the desired value ( 0.5 to 1cm). Finally, these explants were kept floating in a buffered saline solution until the stage of “inclusion” in the solidified matrix. This inclusion step was done with a process similar to that used for the NATIVESKIN™ model. Briefly, the explanted skin is delicately deposited on an insert (8-well MILLICELL™ cup) with a porous membrane at the bottom (in PET, porosity 1 μm) and containing a solution derived from blood plasma treated with an anticoagulant agent with reversible properties in the presence of calcium ions (sodium citrate). This solution contains 42% blood plasma, 50% 0.9% NaCl solution, 8% 1% CaC12 saline solution, an anti-fibrinolytic agent (tranexamic acid or aprotinin), and melted agarose with a low melting point at 0.7% (Agarose LMP GIBCOBRL, LIFE TECHNOLOGIES) (melted in an oven at 65.5° C.). The function of the anti-fibrinolytic agent is to inhibit the enzymes capable of degrading the plasma matrix, these enzymes being secreted by the skin explant, and thus to maintain the integrity of the explant.
[000118] 2 -Mastocytes et expiant de peau [000118] 2 - Mast cells and expiant of skin
[000119] 2 1 -Identification de mastocytes au sein de l’expiant de peau [000120] La présence de mastocytes au sein de l’expiant a été analysée par un marquage à l’avidine et à l’aide d’un anticorps anti-tryptase. Les mastocytes sont retrouvés en nombre identique entre le premier et le 5eme jour de culture. Suite à l’injection d’un composé pro-inflammatoire (ex. une formulation vaccinale), une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires a été observée dans le milieu de culture. [000119] 2 1 - Identification of mast cells within the skin explant [000120] The presence of mast cells within the explant was analyzed by labeling with avidin and using an anti-tryptase antibody. The mast cells are found in identical numbers between the first and the 5th day of culture. Following the injection of a pro-inflammatory compound (eg a vaccine formulation), an increase in the secretion of pro-inflammatory cytokines was observed in the culture medium.
G00012P 22-Mise en évidence d’une activité de dégranulation des mastocytes au sein de l’expiant de peau G00012P 22-Demonstration of mast cell degranulation activity within the skin explant
[000122] Suite à l’injection sous cutanée de 100 pL d’une solution à 50 pg/mL de composé 48/80 (un agoniste de MRGPRX2) ou d’eau contrôle dans l’expiant de peau, la dégranulation des mastocytes a été quantifiée lh, 4h, 6h ou 24h post-injection. Le meilleur signal par rapport à la condition contrôle a été observé entre 0 et 4h post injection. Il a été observé qu’à partir de 6h il a une dégranulation spontanée des mastocytes même en l’absence de stimulation, ce qui pourrait affecter l’analyse ultérieure. Ces résultats montrent donc que l’expiant de peau comprend des mastocytes, lesquels se maintiennent dans le temps et sont capables de dégranulation. En conséquence, l’expiant de peau permet donc la détermination du potentiel allergique ou pseudo-allergique d’une substance sans recourir à un modèle animal. [000122] Following the subcutaneous injection of 100 pL of a 50 pg/mL solution of compound 48/80 (an MRGPRX2 agonist) or control water into the explanted skin, mast cell degranulation was quantified 1 h, 4 h, 6 h or 24 h post-injection. The best signal compared to the control condition was observed between 0 and 4 hours post injection. It has been observed that from 6 a.m. there is spontaneous degranulation of mast cells even in the absence of stimulation, which could affect subsequent analysis. These results therefore show that the explanted skin includes mast cells, which are maintained over time and are capable of degranulation. Consequently, the skin explant allows the determination of the allergic or pseudo-allergic potential of a substance without resorting to an animal model.
[000123] 3 -Détermination du potentiel inflammatoire d’une substance (exemple le cetrotide ou cétrorélix) [000124] 3 1 -Potentiel inflammatoire [000123] 3 - Determination of the inflammatory potential of a substance (e.g. cetrotide or cetrorelix) [000124] 3 1 - Inflammatory potential
[000125] 100 pL d’une solution de CETROTIDE présentant une concentration de cétrorélix de 0,25mg/l mL (inhibiteur de l’hormone lutéinisante qui entre en compétition en se liant à son récepteur) a été injectés dans le tissu adipeux d’un expiant tel que décrit précédemment à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 27G de 12 mm de longueur. A titre de contrôle négatif et positif, 100 pL d’une solution de PB S et 100 pL d’une solution concentrée de composé 48/80 (50 pg/mL) qui est un contrôle positif agoniste de MRGPRX2 a été injecté dans le tissu adipeux de d’un expiant chacun et comme décrit précédemment. [000126] Le milieu de culture ou bien la matrice de soutient des expiants sont prélevés et un dosage de cytokines par méthodes de type ELISA ou tout autre type de méthode destinée à détecter et quantifier la présence de cytokines sont utilisés. [000125] 100 pL of a CETROTIDE solution with a cetrorelix concentration of 0.25 mg/l mL (inhibitor of luteinizing hormone which competes by binding to its receptor) was injected into the adipose tissue of an explant as described previously using a syringe and a 27G needle 12 mm in length. As a negative and positive control, 100 pL of a solution of PB S and 100 pL of a concentrated solution of compound 48/80 (50 pg/mL) which is a positive control agonist of MRGPRX2 was injected into the tissue. adipose of one explant each and as previously described. [000126] The culture medium or the matrix supporting the explants are sampled and a cytokine assay by ELISA type methods or any other type of method intended to detect and quantify the presence of cytokines is used.
[000127] Les résultats ont permis de confirmer le potentiel inflammatoire du cétrorélix. [000128] 3 2-Potentiel allergique ou pseudo-allergique de la substance [000127] The results made it possible to confirm the inflammatory potential of cetrorelix. [000128] 3 2-Allergic or pseudo-allergic potential of the substance
[000129] 100 pL d’une solution de CETROTIDE présentant une concentration de cétrorélix de 0,25mg/l mL (inhibiteur de l’hormone lutéinisante qui entre en compétition en se liant à son récepteur) a été injectés dans le tissu adipeux d’un expiant tel que décrit précédemment à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 27G de 12 mm de longueur. A titre de contrôle négatif et positif, 100 pL d’une solution de PB S et 100 pL d’une solution concentrée de composé 48/80 (50 pg/mL) a été injecté dans le tissu adipeux de d’un expiant chacun et comme décrit précédemment. [000129] 100 pL of a CETROTIDE solution with a cetrorelix concentration of 0.25 mg/l mL (inhibitor of luteinizing hormone which competes by binding to its receptor) was injected into the adipose tissue of an explant as described previously using a syringe and a 27G needle 12 mm in length. As a negative and positive control, 100 pL of a solution of PB S and 100 pL of a concentrated solution of compound 48/80 (50 pg/mL) were injected into the adipose tissue of one explant each and as previously described.
[000130] Les expiants ont ensuite été cultivé (incubateur à 37°C, 5% de C02 et atmosphère saturée en eau) pendant 1 à 4h avant qu’ils ne soient fixés (solution de paraformaldéhyde 4%) et inclus dans un bloc de paraffine en vue d’ effectuer une analyse histologique. [000130] The explants were then cultured (incubator at 37° C., 5% C02 and atmosphere saturated with water) for 1 to 4 hours before they were fixed (4% paraformaldehyde solution) and included in a block of paraffin for histological analysis.
[000131] Dans le détail, les expiants de peau sont déshydratés par un premier bain d’alcool puis par un second bain de xylène. Enfin, un premier bain de paraffine permet de remplacer l’eau préalablement contenue dans l’explant de peau par la paraffine. Les échantillons imprégnés de paraffine sont sortis de leur bain et transférés dans un récipient dont le fond est tapissé de papier absorbant, afin d’être apportés à proximité de la station d’inclusion. Les échantillons, enfermés dans des cassettes d’histologie, sont plongés dans la paraffine liquide à 56°C pour faire refondre la paraffine qui les imprègne. Pour chaque échantillon, la cassette d’histologie est ouverte, l’échantillon est éventuellement coupé en deux. Un moule d’inclusion est rempli de paraffine liquide et l’échantillon (ou les 2 morceaux d’échantillon) est placé dans le moule et orienté dans le sens désiré pour la coupe. Le moule est en même temps transféré sur un support réfrigéré afin de solidifier la paraffine du fond du moule et d’y maintenir l’échantillon. Le couvercle de la cassette d’histologie sur lequel figure la référence de l’échantillon est placé par-dessus, de telle façon que la paraffine le traverse (possibilité d’ajouter de la paraffine si besoin), puis le tout est placé au froid (réfrigérateur, freezer, chambre froide...) plusieurs minutes (5 à 6), afin de solidifier la paraffine en bloc, emprisonnant de fait l’échantillon dans la bonne orientation avec le couvercle de la cassette d’histologie qui deviendra le support du bloc. Une fois le bloc de paraffine bien solidifié, il est démoulé. L’excès de paraffine est éventuellement gratté à l’aide d’une spatule sur les côtés du couvercle de la cassette d’inclusion. Des coupes sériées d’épaisseur variant de 4 à 5 pm sont alors réalisées sur toute la longueur du bloc de paraffine contenant l’échantillon. [000131] In detail, the skin explants are dehydrated by a first alcohol bath then by a second xylene bath. Finally, a first paraffin bath replaces the water previously contained in the skin explant with paraffin. The paraffin-impregnated samples are taken out of their bath and transferred to a container whose bottom is lined with absorbent paper, in order to be brought close to the inclusion station. The samples, enclosed in histology cassettes, are immersed in liquid paraffin at 56°C to melt the paraffin which impregnates them. For each sample, the histology cassette is opened, the sample is possibly cut in two. An embedding mold is filled with liquid paraffin and the sample (or the 2 pieces of sample) is placed in the mold and oriented in the desired direction for sectioning. The mold is at the same time transferred to a refrigerated support in order to solidify the paraffin at the bottom of the mold and to hold the sample there. The lid of the histology cassette on which the reference of the sample appears is placed on top, so that the paraffin passes through it (possibility of adding paraffin if necessary), then the whole thing is placed in the cold (refrigerator, freezer, cold room...) several minutes (5 to 6), in order to solidify the paraffin into a block, effectively trapping the sample in the correct orientation with the lid of the histology cassette which will become the support for the block. Once the paraffin block has solidified, it is unmolded. The excess paraffin is possibly scraped using a spatula from the sides of the lid of the embedding cassette. Serial sections with a thickness varying from 4 to 5 μm are then made over the entire length of the paraffin block containing the sample.
[000132] En vue de déterminer le niveau de dégranulation des mastocytes au sein du tissu dans les différentes conditions, on effectue un marquage à l’aide d’avidine couplée à un fluorochrome qui permet de détecter les granules des mastocytes. La première étape permet de déparaffmer et une réhydrater les coupes fixées et imprégnées en paraffine. Les coupes sont incubées 30 minutes à température ambiante en tampon Citrate pH6, puis saturées et perméabilisées pendant 40 minutes à 37°C avec une solution de sérum de chèvre et de Triton à 0.1%. Les coupes sont ensuite incubées pendant une heure à température ambiante en chambre humide avec 5 m g/mL Avidin-Sulforhodamin 101 (Avidine TEXAS RED ; MERCK). Une coloration des noyaux cellulaires est alors effectuée en incubant les coupes avec du DAPI (D9542, SIGMA) au 1/1000 pendant 3 minutes à température ambiante. Le milieu de montage est ajouté et une lamelle est déposée sur les coupes. Les lames sont ensuite analysées au microscope à fluorescence de sorte à déterminer le niveau de dégranulation des mastocytes dans les différents expiantes. [000132] In order to determine the level of mast cell degranulation within the tissue under the various conditions, labeling is carried out using avidin coupled with a fluorochrome which makes it possible to detect the mast cell granules. The first step deparaffinizes and rehydrates the sections fixed and impregnated with paraffin. The sections are incubated for 30 minutes at room temperature in Citrate pH6 buffer, then saturated and permeabilized for 40 minutes at 37° C. with a 0.1% solution of goat serum and Triton. The sections are then incubated for one hour at room temperature in a humid chamber with 5 mg/ml Avidin-Sulforhodamin 101 (Avidin TEXAS RED; MERCK). Staining of the cell nuclei is then carried out by incubating the sections with DAPI (D9542, SIGMA) at 1/1000 for 3 minutes at ambient temperature. Mounting medium is added and a coverslip is placed on the sections. The slides are then analyzed under a fluorescence microscope in order to determine the level of mast cell degranulation in the different explants.
[000133] Les résultats de ces expériences sont présentés dans le tableau 1. [000133] The results of these experiments are shown in Table 1.
[000134] [Tableau 1] [000134] [Table 1]
[000135] Les résultats ont permis de déterminer le niveau de dégranulation des mastocytes identifiés dans les échantillons et, après intégration, d’en déduire le potentiel inflammatoire de chaque substance injectée. En l’espèce, les résultats confirment que le potentiel inflammatoire du cetrotide est associé à une dégranulation des mastocytes. En conséquence, le cetrotide possède un potentiel allergique ou pseudo-allergique élevé[000135] The results made it possible to determine the level of degranulation of the mast cells identified in the samples and, after integration, to deduce the inflammatory potential of each substance injected. In this case, the results confirm that the inflammatory potential of cetrotide is associated with mast cell degranulation. Accordingly, cetrotide has a high allergic or pseudo-allergic potential.
[000136] 3.3-Confirmation du potentiel allergique ou pseudo-allergique de la substance[000136] 3.3-Confirmation of the allergic or pseudo-allergic potential of the substance
[000137] Une culture de mastocytes humain primaire a été obtenue selon le protocole décrit dans GAUDENZIO et al. (J. Allergy Clin. Immunol ., vol.131(5), p : 1400-7, 2013) et dans GAUDENZIO et al. (Précédemment cité, 2016). Sommairement, on a isolé, sur gradient de Ficoll, les PBMC issus de prélèvements du sang de différents donneurs. On a ensuite isolé parmi eux les progéniteurs hématopoïétiques exprimant le marqueur CD34+ par tri-magnétique (potentiellement réalisable aussi par FACS). On a alors procédé à la mise en culture de ces cellules, puis à leur maturation vers des mastocytes en les cultivant dans un milieu de culture sans sérum supplémenté notamment en IL-6, IL-3 et SCF recombinants pendant une période d’environ 3 mois. [000137] A culture of primary human mast cells was obtained according to the protocol described in GAUDENZIO et al. (J. Allergy Clin. Immunol., vol.131(5), p: 1400-7, 2013) and in GAUDENZIO et al. (Previously cited, 2016). Briefly, PBMCs from blood samples from different donors were isolated on a Ficoll gradient. The hematopoietic progenitors expressing the CD34+ marker were then isolated among them by tri-magnetic (potentially also feasible by FACS). These cells were then cultured, then matured into mast cells by cultivating them in a serum-free culture medium supplemented in particular with recombinant IL-6, IL-3 and SCF for a period of approximately 3 month.
[000138] Les mastocytes sont considérés comme matures et prêts à l’utilisation lorsqu’ils présentent des granules cytoplasmiques qui sont marqués par l’avidine couplée à un fluorochrome et lorsqu’ils sont capable de dégranuler en réponse à une stimulation par des complexes IgE/antigène (ou IgE/anti-IgE) ou bien par des agonistes du récepteur MRGPRX2 (ex composé 48/80 ou substance P). [000138] Mast cells are considered mature and ready for use when they present cytoplasmic granules which are labeled with avidin coupled to a fluorochrome and when they are capable of degranulating in response to stimulation by IgE complexes /antigen (or IgE/anti-IgE) or by agonists of the MRGPRX2 receptor (eg compound 48/80 or substance P).
[000139] La détermination de la dégranulation des mastocytes en culture a alors été effectuée en réalisant un dosage de marqueurs des granulocytes (ex. en beta hexosaminidase) avant et après leur stimulation (environ 1 heure) par la substance P, le composé 48/80 et un système IgE/anti-IgE. Ce dosage est réalisé par test colorimétrique en plaques 96 puits. [000139] The determination of the degranulation of mast cells in culture was then carried out by carrying out an assay of granulocyte markers (eg beta hexosaminidase) before and after their stimulation (approximately 1 hour) by substance P, compound 48/ 80 and an IgE/anti-IgE system. This assay is carried out by colorimetric test in 96-well plates.
[000140] Les résultats permettent de confirmer ceux obtenus avec l’explant de peau, à savoir que le cetrotide présente un potentiel allergique ou pseudo-allergique fort. G00014113.4-Potentiel allergique ou pseudo-allergique pour le cetrotide [000140] The results make it possible to confirm those obtained with the skin explant, namely that cetrotide has a strong allergic or pseudo-allergic potential. G00014113.4-Allergic or pseudo-allergic potential for cetrotide
[000142] Des cellules HEK 293 ont été transformées de sorte à exprimer le récepteur MRGPRX2 humain (numéro d’ Accession Q96LB1). [000142] HEK 293 cells were transformed to express the human MRGPRX2 receptor (Accession number Q96LB1).
[000143] L’activation du récepteur MRGPRX2 résultant en une diminution de la concentration intracellulaire en ions calcium, le suivi de cette concentration en ions calcium intracellulaires permet d’extrapoler l’activité du récepteur MRGPRX2. Pour se faire, un traceur calcique fluorescent a été utilisé, à savoir le Fluo-4. [000143] The activation of the MRGPRX2 receptor resulting in a decrease in the intracellular concentration of calcium ions, the monitoring of this concentration of intracellular calcium ions makes it possible to extrapolate the activity of the MRGPRX2 receptor. To do this, a fluorescent calcium tracer was used, namely Fluo-4.
[000144] Les cellules transformées ont été placées sur une lame de microscope équipée d’un ou plusieurs puits de culture. L’analyse de la fluorescence par cellule post acquisition se fait sur un logiciel de traitement d’image classique (ex IMAGEJ). [000144] The transformed cells were placed on a microscope slide fitted with one or more culture wells. The analysis of the fluorescence by post acquisition cell is done on a classic image processing software (ex IMAGEJ).
[000145] Les cellules marquées au Fluo-4 sont ensuite incubées en présence de cetrotide. Une analyse de la fluorescence est ensuite faite par un enregistrement vidéo réalisé sur un microscope à fluorescence sur une durée de l’ordre de 300 secondes après avoir débuter de l’incubation. Une séquence de 20 secondes est réalisée afin d’établir la base line avant d’ajouter la molécule à tester. Ensuite la molécule à tester est ajouté pour une durée de 100 secondes, puis 100 m M de substance P sont ajoutés afin de localiser les cellules exprimant MRGPRX2. 100 secondes après, 100 m M d’ionomycine sont ajoutés comme contrôle positif de visualisation de flux calcique. [000145] The cells labeled with Fluo-4 are then incubated in the presence of cetrotide. A fluorescence analysis is then made by a video recording made on a fluorescence microscope over a period of about 300 seconds after starting the incubation. A 20-second sequence is performed to establish the base line before adding the molecule to be tested. Then the molecule to be tested is added for a period of 100 seconds, then 100 m M of substance P are added in order to locate the cells expressing MRGPRX2. 100 seconds later, 100 m M of ionomycin is added as a positive control for visualization of calcium flux.
[000146] Les résultats obtenus ont permis de montrer que, après ajout de cetrotide, il est détecté une augmentation de signal fluorescent dans les mêmes cellules qui répondent à la substance P et donc qui sont transfectées pour exprimer MRGPRX2. En conséquence, le cetrotide peut être considérée comme un agoniste du récepteur MRGPRX2. [000146] The results obtained made it possible to show that, after addition of cetrotide, an increase in fluorescent signal is detected in the same cells which respond to substance P and which are therefore transfected to express MRGPRX2. Accordingly, cetrotide can be considered an agonist of the MRGPRX2 receptor.
[000147] Finalement, les résultats ont permis de démontrer que le cetrotide présente un potentiel pseudo-allergique fort. [000147] Finally, the results demonstrated that cetrotide has a strong pseudo-allergic potential.

Claims

Revendications Claims
1. Un procédé in vitro destiné à déterminer le potentiel inflammatoire d’une substance comprenant les étapes de : ia) administration à un expiant de peau, par voie topique ou par injection sous-cutanée, d’une composition comprenant la substance ; lequel expiant de peau comprend l’épiderme, le derme et les annexes épidermiques ainsi qu’une épaisseur d’au moins 5 millimètres d’hypoderme ; ib) détermination de la réponse inflammatoire au sein de l’expiant de peau ; ic) détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’expiant de peau ; et ii) détermination du potentiel inflammatoire de la substance et son association ou non à un potentiel allergique ou pseudo-allergique. 1. An in vitro method for determining the inflammatory potential of a substance comprising the steps of: ia) administering to explanted skin, either topically or by subcutaneous injection, a composition comprising the substance; which explant of skin comprises the epidermis, the dermis and the epidermal appendages as well as a thickness of at least 5 millimeters of hypodermis; ib) determination of the inflammatory response within the skin explant; ic) determination of the level of mast cell degranulation within the skin explant; and ii) determination of the inflammatory potential of the substance and its association or not with an allergic or pseudo-allergic potential.
2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’étape ia) consiste en l’injection sous-cutanée d’une composition comprenant la substance. 2. The method according to claim 1, characterized in that step ia) consists of the subcutaneous injection of a composition comprising the substance.
3. Le procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l’étape ib) de détermination de la réponse inflammatoire au sein de l’expiant de peau s’effectue par le suivi de marqueurs de l’inflammation choisi dans le groupe comprenant MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL et IFNA1TNFA, MCP1, VEGF, PM0, MDC, MPMB, IL-3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that step ib) for determining the inflammatory response within the skin explant is carried out by monitoring inflammation markers chosen from the group including MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL and IFNA1TNFA, MCP1, VEGF, PM0, MDC, MPMB, IL-
17 A, IL-17C, IL- 17F, TNFB, IL-27, MCP-4, MPMA, IL-22, IL-1B, IL-12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23, IL-31, EOTAXIN, IL-6, IL-4, IL-13, IL-5, IL-8, IL-15, BETA-HEXOSAMINISASE, HISTAMINE, TRYPTASE et CHYMASE. 17A, IL-17C, IL-17F, TNFB, IL-27, MCP-4, MPMA, IL-22, IL-1B, IL-12/IL-23p40, GMCSF, IFNG, IL-12p70, IL-23 , IL-31, EOTAXIN, IL-6, IL-4, IL-13, IL-5, IL-8, IL-15, BETA-HEXOSAMINISASE, HISTAMINE, TRYPTASE and CHYMASE.
4. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’étape ic) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’explant de peau utilise l’avidine. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that step ic) for determining the level of mast cell degranulation within the skin explant uses avidin.
5. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l’étape ic) de détermination du niveau de dégranulation des mastocytes au sein de l’expiant de peau est réalisée dans un délai maximum de 6 heures suivant l’étape ia) d’administration. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that step ic) of determining the level of mast cell degranulation within the skin explant is carried out within a maximum period of 6 hours following step ia) of administration.
6. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire de la substance et plus spécifiquement de son potentiel allergique ou pseudo-allergique est réalisée au regard des proportions de mastocytes subissant une dégranulation faible, modérée, ou forte au terme de l’étape ia), avec : 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that step ii) of determining the inflammatory potential of the substance and more specifically its allergic or pseudo-allergic potential is carried out with regard to the proportions of mast cells undergoing weak, moderate or strong degranulation at the end of stage ia), with:
• une substance associée à une proportion de granulocytes présentant pour plus de 50% un faible niveau de dégranulation et/ou pour moins de 10% un fort niveau de dégranulation présentera un potentiel allergique ou pseudo-allergique faible, voire nul ; • a substance associated with a proportion of granulocytes presenting for more than 50% a low level of degranulation and/or for less than 10% a high level of degranulation will present a weak allergic or pseudo-allergic potential, even zero;
• une substance associée à une proportion de granulocytes présentant pour plus de 50% un fort niveau de dégranulation présentera elle un potentiel allergique ou pseudo-allergique élevé. • a substance associated with a proportion of granulocytes presenting for more than 50% a high level of degranulation will present a high allergic or pseudo-allergic potential.
7. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape id) de détermination du niveau de dégranulation d’une culture de mastocytes après incubation de celle-ci en présence de différentes concentrations de la substance. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it further comprises a step id) of determining the level of degranulation of a mast cell culture after incubation thereof in the presence of different concentrations of the substance.
8. Le procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire de la substance permet en outre de déterminer la concentration efficace médiane (CE50) de la substance pour l’induction de la dégranulation des mastocytes et en ce que le procédé est alors destiné en outre à déterminer la concentration efficace médiane (CE50) de la substance pour l’induction de la dégranulation des mastocytes. 8. The method according to claim 7, characterized in that step ii) of determining the inflammatory potential of the substance also makes it possible to determine the median effective concentration (EC50) of the substance for the induction of mast cell degranulation and in that the method is then further intended to determine the median effective concentration (EC50) of the substance for the induction of mast cell degranulation.
9. Le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape ie) de détermination du potentiel agoniste de la substance vis-à-vis du récepteur MRGPRX2 (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2). 9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that it further comprises a step ie) of determining the agonist potential of the substance against the MRGPRX2 receptor (Mas-Related G-Protein coupled Receptor member X2).
10. Le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l’étape ii) de détermination du potentiel inflammatoire de la substance permet en outre de déterminer si la dégranulation des mastocytes induite par la substance résulte d’une réaction pseudo allergique ou non et en ce que le procédé est alors destiné en outre à déterminer si la dégranulation des mastocytes induite par la substance résulte d’une réaction pseudo allergique ou non. 10. The method according to claim 9, characterized in that step ii) of determining the inflammatory potential of the substance also makes it possible to determine whether the degranulation of the mast cells induced by the substance results from a pseudo allergic reaction or not and in that the method is then further intended to determine whether the degranulation of the mast cells induced by the substance results from a pseudo allergic reaction or not.
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