EP4337178A1 - Nanoclusters de cuivre, leurs procédés d'obtention et leur application dans le traitement de la maladie de menkes - Google Patents

Nanoclusters de cuivre, leurs procédés d'obtention et leur application dans le traitement de la maladie de menkes

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Publication number
EP4337178A1
EP4337178A1 EP22727382.8A EP22727382A EP4337178A1 EP 4337178 A1 EP4337178 A1 EP 4337178A1 EP 22727382 A EP22727382 A EP 22727382A EP 4337178 A1 EP4337178 A1 EP 4337178A1
Authority
EP
European Patent Office
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copper
nanoclusters
histidine
acetate
solution
Prior art date
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Pending
Application number
EP22727382.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Ariane BOUDIER
Igor CLAROT
François FEILLET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National Polytechnique de Lorraine
Centre Hospitalier Universitaire de Nancy
Original Assignee
Institut National Polytechnique de Lorraine
Centre Hospitalier Universitaire de Nancy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National Polytechnique de Lorraine, Centre Hospitalier Universitaire de Nancy filed Critical Institut National Polytechnique de Lorraine
Publication of EP4337178A1 publication Critical patent/EP4337178A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present disclosure relates to the field of chemistry, and more particularly to pharmaceutical chemistry.
  • the invention relates to copper nanoclusters, their methods of obtaining and their applications in the treatment of diseases involving a copper deficiency, and more particularly in the treatment of Menkes disease.
  • Menkes disease is a rare X-linked genetic transmission disease (X 21 .1 ), which mainly affects boys and which has an occurrence corresponding to one birth in 300,000 in Europe, i.e. two births each year in France. Menkes disease results from a copper deficiency in the patient. Copper is a key trace element in the composition of many key metabolic enzymes and is therefore essential for the survival of the body. In the case of Menkes disease, a copper transporter, the protein ATPase 7A, is not functional. As a result, the copper provided by food cannot be absorbed, which leads to a profound copper deficit in the body.
  • this transporter allows the passage of copper into the brain, which means that the administration of copper to the blood level cannot cure these patients because it does not treat the neurological impairment of the disease.
  • Menkes' disease present with major hypotonia, epilepsy resistant to anticonvulsant treatments, episodes of hypothermia, hypotension, etc.
  • cutaneous-phanerial abnormalities with a lack of pigmentation, pale and dry skin, fragile, dry and abnormal hair (kinky hairs).
  • vascular abnormalities causing subdural hematomas as well as bone mineralization problems.
  • Menkes disease remains incurable and death generally occurs early in childhood (life span less than 5 years).
  • the inventors had the original idea of proposing the use of copper nanoclusters in the treatment of Menkes' disease. Indeed, to the knowledge of the inventors, no one to date has thought of using copper nanoclusters for the treatment of this disease. In this regard, the inventors have developed an original process for the synthesis of copper nanoclusters. Various synthetic methods have been described in the literature to obtain nanoclusters, and in particular copper nanoclusters. Thus in the document by Hu Yanling et al. (“Microchimica Acta, Springer Vienna, Vol. 186, no. 1, December 7, 2018, p. 1-8”) copper nanoclusters were synthesized from histidine, copper chloride and ascorbic acid.
  • copper nanoclusters described as having very good fluorescence properties, have a spherical shape and a diameter of approximately 3 to 4 nm, said diameter being evaluated by transmission electron microscopy.
  • clusters of platinum, silver, gold and copper are described for their use in the detection of iron ions by fluorescence/luminescence. It is in particular described in this document that copper clusters, synthesized from histidine, copper acetate and ascorbic acid, have an average particle size of 1.9 nm, said size being measured by electron microscopy. transmission. This document is silent as to the stability of the clusters obtained.
  • This disclosure provides copper nanoclusters for use in the treatment of Menkes disease.
  • the copper nanoclusters which are the subject of the present invention are capable of passing the blood-brain barrier, and therefore of supplying copper to the brain of patients. Moreover, they do not accumulate, at the doses currently used in murine models, in organs such as the liver, spleen, kidneys or lungs.
  • the copper nanoclusters of the invention also have several other advantageous properties which will be described in more detail below.
  • nanoclusters of the invention by virtue of their advantageous properties, are therefore promising candidates for improving the quality and life expectancy of patients suffering from Menkes' disease.
  • Another object of the invention is to provide a simple and rapid process for synthesizing the nanoclusters of the invention.
  • His histidine
  • Ac acetate ions
  • Ascorbate ions ascorbate ions
  • hydrodynamic diameter ranging from 0.6 to 2.0 nm, and preferably 1.3 nm
  • - have a metallic core diameter ranging from 0.5 to 1.5 nm, and preferably from 1.0 nm,
  • copper nanoclusters having spectrophotometric properties, with a shoulder on the UV-Visible spectrum at 325 ⁇ 10 nm and a fluorescence spectrum with excitation wavelengths ranging from 365 to 395 nm and emission wavelengths ranging from from 445 to 475 nm, said copper nanoclusters being designated by the formula “CuNC@HisAc” or by the formula “CuNC@HisAcAsc”.
  • the copper nanoclusters that are the subject of the invention are metallic nanoclusters.
  • a metallic nanocluster consists of the association of tens of metallic element atoms (in this case copper in the invention) with a metallic core diameter less than or equal to 2.0 nanometers (nm).
  • the CuNC@HisAc nanoclusters of the invention consist of a metallic copper core covered/covered/surrounded by a mixed layer/crown comprising histidine, acetate ions and optionally ascorbate ions.
  • the terms “crown” or “layer” comprising histidine, acetate ions and optionally ascorbate ions can be used interchangeably in the application.
  • the term “mixed” is used to indicate that the crown or the layer which surrounds the copper core comprises both histidine, acetate ions and possibly ascorbate ions.
  • the copper core comprises over its entire surface a layer/crown of histidine, acetate ions and possibly ascorbate ions.
  • the whole CuNC@HisAc copper nanocluster has a spherical shape.
  • the formula "CuNC@HisAc” within the meaning of the invention designates a nanocluster consisting of a metallic copper core covered with a mixed layer comprising histidine, acetate ions and optionally ascorbate ions.
  • the formula "CuNC@HisAc” without further precision in the present application also encompasses the formula "CuNC@HisAcAsc” which is a particular embodiment of a copper nanocluster of the invention, namely a nanocluster consisting of a copper metal core covered with a mixed layer comprising histidine, acetate ions and ascorbate ions.
  • the mixed crown comprising histidine, acetate ions and possibly ascorbate ions in particular gives the nanoclusters of the invention very high stability and low reactivity.
  • a "low reactivity” means a low degradation in particular linked to oxidation (for example due to the oxygen in the air).
  • the mixed layer/crown surrounding the metallic copper core comprises histidine, acetate ions and ascorbate ions.
  • the copper nanoclusters of the invention thus advantageously comprise three ligands at the surface of the copper core, namely histidine, acetate and ascorbate. These histidine ligands, acetate ions and ascorbate ions are linked to the metallic copper core by coordination bonds.
  • the stability of the nanoclusters of the invention means maintaining the structure and properties of the nanoclusters over time at a storage temperature of 4°C. Maintaining the structure means in particular that the composition of the nanocluster (metallic core surrounded by the mixed layer/crown as defined above), its shape and its diameter (of metallic and hydrodynamic core) are preserved over time.
  • the "liquid form" of copper nanoclusters refers to a liquid solution or mixture of copper nanoclusters.
  • the stability of 5 to 12 weeks mentioned above is for copper nanoclusters in liquid form.
  • dry form is meant a solid form which can be reduced to powder if necessary.
  • the stability of 12 to 18 months mentioned above relates to copper nanoclusters in dry form.
  • the nanoclusters of the invention have spectrophotometric properties, in particular fluorescence, which are characteristic of this scale, namely a metal core diameter of less than or equal to 2 nm, which is intermediate between the molecule and the nanoparticle.
  • the metallic core diameter or metallic diameter designates, as its name suggests, the diameter formed by the metal copper.
  • the hydrodynamic diameter takes into account the diameter of the copper core and its layer/crown including histidine, acetate ions and possibly ascorbate ions.
  • the hydrodynamic diameter therefore designates the diameter of the CuNC@HisAc copper nanocluster of the invention.
  • the nanoclusters of the invention have a metal core diameter and a hydrodynamic diameter that are almost equivalent (respectively 1.0 and 1.3 nm).
  • nanoclusters of the invention are designated interchangeably in the present application by “nanoclusters", “copper nanoclusters”, “CuNC@HisAc nanoclusters”, it being understood that “CuNC@HisAc nanoclusters” encompasses the particular embodiment "CuNC@ nanoclusters HisAcAsc”.
  • the copper nanoclusters are in liquid form or in dry form.
  • the dry form of the nanoclusters is advantageous in particular in that it allows easy storage, preservation and transport of the nanoclusters of the invention.
  • the copper nanoclusters of the invention are further characterized in that they have at least one of the following characteristics:
  • the copper nanoclusters of the invention have all of the characteristics described above.
  • nanoclusters of the invention are not sequestered in said organs is in particular due to their small size (hydrodynamic diameter less than or equal to 2.0 nm.
  • the size of the nanoclusters of the invention allows circulation in the blood longer, compared to larger compounds.
  • the nanoclusters of the invention have surface properties making them capable of crossing the blood-brain barrier using the cerebral blood capillary transport systems.
  • histidine makes it possible in particular to help in addressing from the nanocluster to the brain because histidine is transformed there into histamine.
  • the “good bioavailability” means that when the copper nanoclusters are administered subcutaneously, they reach the general circulation well and are well distributed to the target organs.
  • biocompatibility is meant the fact that the copper nanoclusters are well accepted by the various organs of the body and allow a restoration of the biological functions linked to cuproproteins without being toxic for these organs.
  • nanoclusters are biodegradable means that their degradation releases substances which are metabolized or eliminated without problem by the body (copper, histidine, acetate and possibly ascorbate).
  • nanoclusters can be freeze-dried makes it possible in particular to store, preserve and transport them easily.
  • the fact that the nanoclusters are lyophilizable is attributable to the fact that the nanoclusters are perfectly stable.
  • the stability of the nanoclusters is as defined above.
  • the advantageous properties of the nanoclusters of the invention are in particular due to the original combination of its constituents, namely copper, histidine, acetate ions and possibly ascorbate ions.
  • copper nanoclusters have never been described to date comprising a crown/mixed layer of histidine, acetate ions and possibly acorbate ions surrounding a metallic copper core, and which have the advantageous properties described above.
  • the present invention also relates to a method for preparing copper nanoclusters as defined above, characterized in that it comprises the following steps:
  • the histidine/copper (II) acetate molar ratio being greater than or equal to 50 , and preferably ranges from 50 to 200,
  • the ascorbic acid/copper acetate molar ratio (II) being greater than or equal to 130, and preferably ranges from 130 to 700,
  • the copper nanoclusters obtained at the end of the process are covered on their surface with a mixed layer comprising histidine, acetate ions and ascorbate ions.
  • the molar ratios as defined above, respectively between histidine and acetate copper, and between ascorbic acid and copper acetate, are important in that they allow histidine, acetate, and ascorbate ligands to bind to the copper metal core.
  • nanoclusters are obtained comprising three ligands at the surface of the copper core, these three ligands being linked to the surface of the copper core by coordination bonds.
  • Ascorbic acid is a reducing agent.
  • the reaction between the mixture of copper acetate and histidine with ascorbic acid is more particularly a reduction reaction of the mixture of copper acetate and histidine with ascorbic acid.
  • Ascorbic acid makes it possible in particular to obtain copper nanoclusters devoid of any toxicity.
  • the present invention results in particular from the unexpected discovery of the inventors that the original combination of the reagents used, namely copper acetate, histidine and ascorbic acid, and in the proportions as defined above, makes it possible to obtain copper nanoclusters with particularly advantageous properties.
  • the excellent stability of the nanoclusters of the invention is an example of this.
  • the copper nanoclusters can be more particularly prepared according to the “in solution” protocol or according to the “solid phase” protocol. Each of these two synthetic routes is in accordance with the method described above.
  • the preparation process as defined above is more particularly characterized in that it is carried out under inert gas and in that:
  • the copper acetate is in the form of a solution and the histidine is in the form of a powder
  • the solution of copper acetate and histidine is adjusted to a pH value ranging from 11 to 13, and preferably is 12,
  • a solution of copper acetate, histidine and ascorbic acid is prepared by adding ascorbic acid to the solution of copper acetate and histidine, the pH of which has been adjusted to the above-mentioned values,
  • the solution of copper acetate, histidine and ascorbic acid is stirred for 2 to 6 hours, and preferably 4 hours, at a temperature ranging from 35°C to 45°C, and preferably 40°C,
  • a solution comprising CuNC@HisAc copper nanoclusters is obtained at the end of the previous stirring step, - the solution which includes the copper nanoclusters is optionally dialyzed in order to obtain a purified solution of copper nanoclusters,
  • the solution which includes the copper nanoclusters, possibly dialyzed, is optionally freeze-dried in order to obtain a dry form of copper nanoclusters.
  • the solution comprising the copper nanoclusters, optionally dialyzed, has a stability over time ranging from 5 to 12 weeks at a storage temperature of 4°C.
  • dialysis makes it possible to remove anything that is not linked to the metallic copper core, such as, for example, possibly an excess of histidine or ascorbic acid or even residual copper possibly present in the solution of nanoclusters.
  • the layer comprising the histidine, the acetate ions and possibly the ascorbate ions, is linked to the metallic copper core by coordination bonds.
  • the dry form of the copper nanoclusters obtained after freeze-drying, has a stability over time of at least 12 months, and preferably 12 to 18 months, at a storage temperature of 4°C under nitrogen. .
  • the dry form of copper nanoclusters can be reconstituted at any time, by mixing in a reconstitution solvent, such as purified water.
  • a reconstitution solvent such as purified water.
  • Reconstitute/reconstitute means the simple operation of mixing the dry form or the lyophilisate with a solvent.
  • the solution of copper nanoclusters obtained after reconstitution of the dry form, has a stability over time ranging from 5 to 12 weeks at a storage temperature of 4°C.
  • the inert gas is nitrogen
  • the copper acetate solution is prepared by adding copper acetate to ultra-pure filtered water
  • the copper acetate solution has a concentration ranging from 0.5 to 5.0 mM
  • the concentration of histidine is greater than the concentration of the copper acetate solution
  • the pH of the solution of copper acetate and histidine is adjusted using sodium hydroxide
  • the solution which includes the CuNC@HisAc copper nanoclusters, possibly dialyzed has a copper concentration ranging from 16 to 160 pg/mL
  • the solution which includes the copper nanoclusters, possibly dialyzed, is freeze-dried in order to obtain a dry form of copper nanoclusters.
  • the method of the invention has all of the characteristics described above.
  • the preparation process as defined above is more particularly characterized in that:
  • a powdery mixture of copper acetate and histidine is obtained by mixing each of the powders of copper acetate and histidine,
  • the ascorbic acid is added to the reactor comprising the homogeneous powder mixture of copper acetate and histidine,
  • the liquid mixture which includes the copper nanoclusters is optionally dialyzed in order to obtain a purified liquid mixture of copper nanoclusters
  • the liquid mixture which includes the copper nanoclusters, optionally dialyzed, is optionally freeze-dried in order to obtain a dry form of copper nanoclusters.
  • the stability data described above for the copper nanoclusters, in liquid form or in dry form, obtained at the end of the solution protocol are valid for the copper nanoclusters in liquid form or in dry form obtained at the end of the solid phase protocol.
  • the copper acetate powder above used is blue in color and the histidine powder is white in color.
  • the aim is to obtain a light blue colored powder that is as homogeneous as possible.
  • the concentration of histidine is higher than the concentration of copper acetate
  • the water added to the reactor is ultra pure filtered water
  • the inert gas is nitrogen
  • the liquid mixture which includes the copper nanoclusters, optionally dialyzed has a copper concentration ranging from 1600 to 4000 pg/mL,
  • the liquid mixture which includes the copper nanoclusters, possibly dialyzed, is lyophilized in order to obtain a dry form of copper nanoclusters.
  • the lyophilisate is stored under nitrogen.
  • the method of the invention has all of the characteristics described above.
  • the dry form of copper nanoclusters obtained after lyophilization (according to the “solution” protocol or the “solid phase” protocol) is stored under nitrogen, preferably in vials, and preferably at 4°C. Under such conditions, the powder of copper nanoclusters can be stored for a period of at least 12 months, and preferably 12 to 18 months, without altering the stability of the copper nanoclusters.
  • the present invention also relates to copper nanoclusters as defined above or obtained according to the processes as defined above, for use as a medicine.
  • the present invention relates more particularly to copper nanoclusters as defined above or obtained according to the methods as defined above for use in the treatment of pathologies linked to a copper deficiency.
  • the copper nanoclusters of the invention are more particularly intended for patients suffering from an ATPase7A deficiency.
  • Patients with ATPase7A deficiency include patients with Menkes disease, namely children.
  • the copper nanoclusters are therefore more particularly intended for pediatric use.
  • the patients suffering from an ATPase7A deficiency mention may also be made of adult patients suffering from the attenuated form of Menkes' disease, namely adult patients suffering from occipital horn syndrome (OCS).
  • OCS occipital horn syndrome
  • the copper nanoclusters are also suitable for use in the treatment of occipital horn syndrome.
  • a further subject of the invention is a pharmaceutical composition containing a therapeutically effective quantity of copper nanoclusters as defined above or obtained according to the processes as defined above.
  • the quantity of copper nanoclusters may vary depending on the mode of administration envisaged, the age and the weight of the patient.
  • the copper nanoclusters or the pharmaceutical composition of the invention may be in a form suitable for being administered subcutaneously or intravenously. According to a preferred embodiment of the invention, the copper nanoclusters are in a form suitable for administration by the subcutaneous route, preferably once a day.
  • the copper nanoclusters or the pharmaceutical composition of the invention are in a form suitable for continuous administration via a subcutaneous pump.
  • the subcutaneous pump has been used for many years in the treatment of childhood diabetes.
  • the drug is thus administered continuously, via a pump, which the patient wears, and which administers, via a subcutaneous catheter, the drug continuously.
  • the invention also relates to a method for the therapeutic treatment of Menkes disease comprising the administration to a subject of a therapeutically effective quantity of copper nanoclusters or of a pharmaceutical composition as defined above.
  • Fig. 1 is a schematic representation of a CuNC@HisAc copper nanocluster of the invention, consisting of a metallic copper core surrounded by a mixed crown comprising histidine and acetate.
  • FIG. 2 is a schematic representation of a CuNC@HisAcAsc copper nanocluster of the invention, consisting of a metallic copper core surrounded by a mixed crown comprising histidine, acetate and ascorbate.
  • FIG. 3 is an ion chromatography analysis of CuNC@HisAc copper nanoclusters, showing the presence of acetate ions on the surface of the copper metal core.
  • FIG. 4 is an infrared spectrophotometric analysis showing the presence of ascorbate ions on the surface of the metallic copper core.
  • FIG. 5 illustrates the hydrodynamic diameter (in nanometers) of CuNC@HisAc copper nanoclusters evaluated by dynamic light scattering.
  • FIG. 6 illustrates the metallic diameter (in nanometers) of CuNC@HisAc copper nanoclusters evaluated by transmission electron microscopy.
  • FIG. 7 illustrates the hydrodynamic diameter (in nanometers) of CuNC@HisAc copper nanoclusters evaluated by Taylor dispersion.
  • FIG. 8 is a UV-Vis spectrum of CuNC@HisAc copper nanoclusters.
  • FIG. 9 is a fluorescence spectrum of CuNC@HisAc copper nanoclusters.
  • FIG. 10 represents the cerebral copper concentration (in pg/g) in mice depending on the treatment (treated or untreated) and the dose of copper nanoclusters received: WT (“Wild-type”), NT (hemizygous mice untreated), 4X 3x/week (mice hemizygous mice treated with a 4x dose of copper nanoclusters, injected 3 days per week) and 4X 5x/week (hemizygous mice treated with a 4x dose of copper nanoclusters, injected 5 days per week). The number of mice treated is indicated for each group of mice by the letter n.
  • FIG. 11 represents the survival of the animals on a Kaplan-Meir curve as a function of the treatment (treated or untreated) and the dose of copper nanoclusters received: WT (“Wild-type”), NT (untreated hemizygous mice) , 1X (hemizygous mice treated with the dose of copper nanoclusters 1x, injected 3 days per week), 2X (hemizygous mice treated with the dose of copper nanoclusters 2x, injected 3 days per week), 4X 3x/week (hemizygous mice treated at a dose of 4x copper nanoclusters, injected 3 days a week) and 4X 5x/week (hemizygous mice treated at a dose of 4x copper nanoclusters, injected 5 days a week).
  • the number of mice treated is indicated for each group of mice by the letter n.
  • FIG. 12 shows histological labeling of copper by rhodanine staining on a section of kidney tissue from untreated hemizygous mice (HE NT) and hemizygous mice treated with a solution of copper nanoclusters at a 2x dose (HE X2) .
  • FIG. 13 shows histological labeling of copper by rhodanine staining on a section of liver tissue from untreated hemizygous mice (HE NT), from hemizygous mice treated with a solution of copper nanoclusters at a 2x dose (HE X2) .
  • FIG. 14 shows the analysis of the respiratory chain in the brain of untreated hemizygous mice (HE NT) and hemizygous mice treated with a solution of copper nanoclusters at a 2x dose (HE 2x).
  • FIG. 15 illustrates the hydrodynamic diameter (in nanometres), evaluated by dynamic light scattering, of copper clusters obtained according to the synthesis protocol described in document CN 105 965 028. The hydrodynamic diameter was evaluated immediately after the synthesis of the clusters of copper.
  • Fig. 16 illustrates the hydrodynamic diameter (in nanometres), evaluated by dynamic light scattering, of copper clusters obtained according to the synthesis protocol described in document CN 105 965 028. The hydrodynamic diameter was evaluated 24 hours after the synthesis of the copper clusters (storage at 4°C in the dark).
  • FIG. 17 is a photo of the three batches of copper clusters obtained according to the synthesis protocol described in document CN 105 965028 after 24 hours of storage at 4° C. in the dark.
  • This example respectively describes the two possible synthetic routes for preparing the copper nanoclusters of the invention, namely the “solution protocol” and the “solid phase protocol”.
  • the synthesis is carried out under inert gas (nitrogen).
  • the glassware is washed with aqua regia (1 volume of 65% nitric acid to 2 volumes of 37% hydrochloric acid).
  • a quantity of 45 mg of copper acetate is placed in a 100 mL volumetric flask. Ultra pure filtered water is added up to the mark of the flask. A solution of copper acetate with a concentration of 2.5 mM is obtained.
  • the copper acetate solution is transferred to a suitable bottle. This solution can be stored for one month at 4°C.
  • a quantity of 500 ⁇ L of the copper acetate stock solution as prepared in the previous step is added to a round-necked flask that can hold up to 50 mL of solution. Then, a quantity of 4500 pL of ultrapure filtered water is added to the flask.
  • the copper acetate solution obtained is called 1x.
  • 2x and 4x copper acetate solutions are also prepared by placing 1000 ⁇ L and 2000 ⁇ L respectively of copper acetate stock solution in the flask and making up to 5000 ⁇ L with filtered ultrapure water.
  • the 1x copper acetate solution is stirred at 130 rpm with the multi-plate shaker. A quantity of 39 mg of histidine is added to the copper acetate solution. The solution of copper acetate and histidine is stirred for 15 minutes. The solution takes on a bluish tint. After stirring for 15 minutes, the pH of the solution of copper acetate and histidine is adjusted to 12 with 10 drops of 1 M NaOH.
  • the flask (reactor) is placed in a water bath at 40° C. with stirring (speed set at 6) for 4 hours.
  • the solution takes on an orange hue.
  • Copper concentrations obtained with 1x to 10x copper acetate solutions for copper nanocluster solutions range from 16 to 160 pg/mL.
  • the synthesis yield is 100%: there is no residual copper Cu 2+ in the solution of nanoclusters.
  • the 3 copper nanocluster solutions obtained respectively from a 1x, 2x and 4x copper acetate solution, are referred to in the following as: 1x, 2x and 4x copper nanocluster solution. Solutions can be lyophilized.
  • the copper nanoclusters obtained in the previous step are purified by dialysis.
  • a dialysis cell is prepared (X12 Float a lyzer G2 CE MWCO 100-500 D, Reference 1511160), and a 150 mL beaker is filled with 100 mL of filtered ultrapure water.
  • the dialysis cell is filled with ultrapure water filtered using a Pasteur pipette.
  • the dialysis cell is placed in the beaker with stirring (130 rpm). Let the cell hydrate and wash for 1 hour.
  • the water is then replaced by a new volume of 100 mL of ultrapure filtered water.
  • the dialysis cell is emptied using a Pasteur pipette and then filled with the solution of 1x copper nanoclusters, which is left under stirring overnight (for 12 hours) at a temperature between 2 and 6°C
  • the dialyzed solution of 1x copper nanoclusters thus obtained is transferred into a suitable bottle.
  • the copper concentrations of dialyzed copper nanocluster solutions are identical to those of non-dialysed solutions, and range from 16 to 160 pg/mL (with 1x to 10x copper acetate solutions).
  • Solutions can be lyophilized.
  • Copper (II) acetate, L(-)-Histidine and ascorbic acid are the same as those used in the solution protocol.
  • sodium hydroxide is not required.
  • the synthesis is carried out under inert gas (nitrogen) and protected from light.
  • the glassware is washed with aqua regia (1 volume of 65% nitric acid to 2 volumes of 37% hydrochloric acid).
  • the water used is ultra pure water filtered through a 0.2 ⁇ m pore diameter filter.
  • a quantity of 23 mg of copper acetate is weighed and then placed inside an agate mortar.
  • a quantity of 1.7 g of histidine is then weighed.
  • One volume of histidine powder for one volume of copper acetate powder is added, taking care to grind the powders well using the pestle until a mixture of color and homogeneous appearance is obtained. This operation is repeated as long as there is histidine.
  • the final mixture of the two powders should have a light blue color and the powder should be homogeneous.
  • the mixture of the two powders is then transferred to a 50 mL single-neck flask (NS 19/26 ground joint) using a spatula.
  • a quantity of 3 g of ascorbic acid is weighed and transferred to the flask.
  • An olive-shaped magnetic stirrer is placed at the bottom of the flask.
  • a quantity of 5 mL of ultrapure water is filtered using a 5 mL plastic syringe and is added drop by drop to the reactor.
  • the reactor is closed with a cap with a folding skirt (diameter 19.4 mm) and is placed under nitrogen without creating overpressure using a balloon.
  • the reactor is wrapped in aluminum foil and then stirred (200 rpm) for the reaction time. It is necessary to wait 24 hours before the end of the reaction.
  • the product obtained which is in the form of a liquid, has a yellow color.
  • This liquid is then transferred into a suitable plastic bottle (the final volume is just over 5 mL).
  • the liquid comprising the copper nanoclusters is either stored cool or transferred to the freeze dryer. Lyophilization is carried out in 1 mL fractions. After freeze-drying, the content of the vial (which includes the copper nanoclusters in dry form) is placed under nitrogen and is stored at 4°C. The dry form of the copper nanoclusters can be reconstituted at any time in 1 mL of purified water. The solution of copper nanoclusters thus obtained is stored under nitrogen.
  • the copper nanoclusters as obtained in example 1 are characterized as to their structure, their sizes, their spectrophotometric properties and their stability.
  • the copper nanoclusters of the invention have a spherical shape. They are more particularly made up of a metallic copper core covered with a mixed crown comprising histidine, acetate ions and possibly ascorbate ions.
  • Figure 1 is a schematic representation of a CuNC@HisAc copper nanocluster of the invention, namely a nanocluster which comprises on the surface of the copper core a mixed crown comprising histidine and acetate ions.
  • Figure 2 is a schematic representation of a particular embodiment, namely a CuNC@HisAcAsc copper nanocluster which comprises on the surface of the copper core a mixed crown comprising histidine, acetate ions and ascorbate ions.
  • the copper nanoclusters of the 1x dialyzed solution as obtained in example 1, point 1/ (“Protocol in solution”) are destroyed (total dissolution and return to the various elements making up the structure of the nanoclusters) by a chemical process ( dissolved in a concentrated acid (HCl) then a concentrated base (NaOH)) then are analyzed by ion chromatography in comparison with a sodium acetate control (retention of the anions making up the nanocluster on a cation exchange resin, separation, identification and quantification (external calibration) of the acetate ions by conductimetry with the aid of a suppressor)).
  • HCl concentrated acid
  • NaOH concentrated base
  • the hydrodynamic (Dh) and/or metallic diameter of the copper nanoclusters was evaluated by dynamic light scattering (figure 5) (angle 173°, laser 530 nm, temperature 25°C on Nanosizer Malvern), by transmission electron microscopy (FIG. 6) (deposition on nickel grids, observations under beams operating at 200 kV (LaB6 cathode) Philips CM 200) and by Taylor dispersion analysis (FIG. 7).
  • the dispersion method of analysis consists of injecting a strip of solute into an open capillary tube (50 ⁇ m) and mobilizing it under the influence of a hydrodynamic flow (positive pressure 1 psi, parabolic velocity profile).
  • the principle of determining the hydrodynamic radius is based on the Taylor-Aris relationship which establishes the link between the spreading of the solute peak (modeling of a Gaussian) and the molecular diffusion coefficient.
  • the average hydrodynamic diameter, just like the metallic diameter, of the CuNC@HisAc copper nanoclusters is less than 1.0 nm.
  • the characteristics listed above with respect to copper nanoclusters relate more particularly to copper nanoclusters coated on their surface with histidine, acetate ions and ascorbate ions.
  • the spectrophotometric properties of the copper nanoclusters were evaluated by UV-Vis spectroscopy and by fluorescence spectroscopy.
  • the copper nanoclusters of the invention have optical properties, in particular fluorescence, characteristic of this intermediate scale between the molecule and the nanoparticle.
  • the stability of the CuNC@HisAc copper nanoclusters was evaluated by dynamic light scattering (angle 173°, laser 530 nm, temperature 25°C on Nanosizer Malvern).
  • the analyzes were carried out on the samples obtained at the end of the protocol in solution and at the end of the protocol in solid phase.
  • the analyzes were carried out on the solutions of 1x, 2x and 4x copper nanoclusters.
  • the analyzes were carried out on the freeze-dried samples and on the solutions reconstituted after freeze-drying, preserved or not under nitrogen.
  • the stability of the nanoclusters is preserved in an environment free of oxygen.
  • Example 3 For the solid-phase synthesis protocol, a stability of the freeze-dried copper nanoclusters of at least 12 months is observed for storage under nitrogen at 4°C. The measurement of the hydrodynamic diameter of the copper nanoclusters at 12 months of storage is 1.6 nm.
  • ATP7A-Mo bl ° mouse model which has a spontaneous mutation of the Menkes Disease gene, the ATP7A gene encoding ATPase 7A.
  • the Menkes disease gene is carried on the X chromosome. Heterozygous females are viable and fertile. The males are either healthy (normal X chromosome, ie wild-type allele) or hemizygous (carrier of the mutation on the X chromosome) and therefore affected by Menkes disease.
  • the majority of hemizygous animals have a defective cross-linking rate for elastin and also a collagen deficit, which explains early ruptures of aortic aneurysms and pulmonary emphysema, which leads to mortality around the age of 5 weeks. life.
  • the absorption of copper in the intestines is reduced by 64% and the concentration of copper in the liver is reduced by 56%.
  • Males also have noradrenaline deficiency in the brain, which is caused by the deficiency of cerebral dopamine-beta-hydroxylase, which is a cupro-dependent enzyme.
  • Heterozygous females have a moderate phenotype with irregular hypopigmented spots on the coat with alternating dark and light areas. They have a normal metabolism and behavior, and are therefore able to reproduce.
  • Healthy males have a black coat while hemizygous males have a light coat, without stains.
  • the latter have a low weight, are generally small and sometimes have deformed hind limbs.
  • solutions of 1x, 2x and 4x copper nanoclusters as obtained in example 1 were respectively injected into male mice by subcutaneous injection at the level of the nape of the neck. 5 groups of 5-week-old animals (defined below) were studied.
  • 1/ WT group wild type mice (healthy males), which do not have a mutation on the ATP7A gene on the X chromosome, were treated at the start of the protocol with the aim of evaluating a possible toxicity of the vehicle used to administer the copper nanocluster.
  • HE 2/ HE NT group hemizygous mice (HE), which possess a mutation of the ATP7A gene present on the X chromosome, are not treated, they serve as controls.
  • 3/ 1x HE group the hemizygous mice are treated with a solution of copper nanoclusters (initial dose: 1x), which was administered 3 days per week.
  • 4/ 2x HE group the hemizygous mice are treated with a solution of 2x copper nanoclusters (1x doubled dose), which was administered 3 days per week.
  • 5/ 4x HE group the hemizygous mice are treated with a solution of 4x copper nanoclusters (1x quadrupled dose), which was administered either 3 days or 5 days per week.
  • Cerebral copper means the copper assayed on a whole brain homogenate. Copper is measured by atomic absorption spectrometry (PinAAcle 900T Atomic Absorption Spectrometer, Perkin Elmer). This figure shows that the cerebral copper concentration is correlated with the dosage of the nanoclusters administered in the animals. Cerebral copper concentration increases with increasing dosage. The mice treated at the 4x dose, 5 days per week show a much higher cerebral copper concentration than those treated at the 4x dose but 3 days per week.
  • mice not treated or treated at low doses (1x and 2x) have a lifespan that does not exceed 45 days, while animals treated with a dose of 4x, 3 days or 5 days per week have a very long lifespan. improved, since the majority of these animals are still alive at more than 100 days of life. Furthermore, no adverse reactions were observed in mice, including the group treated with the 4x dose. No tissue abnormalities were observed in the tissues studied after the animals were killed.
  • mice A difference in animal motor activity was observed between wild-type mice and hemizygous mice.
  • untreated hemizygous mice have a notable decrease in their overall activity (decrease in motor activity, atony, impossibility of standing up, etc.). Indeed, mice experience some difficulty in moving and feeding. This results in difficulty reaching the feeder with an inability to straighten up as wild mice do.
  • the hemizygous mice When the hemizygous mice were treated with the solution of copper nanoclusters at the 1x dose, a gradual decrease in activity is observed, thus resulting in a dominance of wild animals. In this case, the hemizygous mice are prostrate in a corner and no longer move.
  • mice treated with the solution of copper nanoclusters at a 4x dose a significant improvement in the overall activity is observed.
  • Mice treated at the 4x dose sit up and jump more easily. This demonstrates a improvement in the physical fitness of mice treated with a solution of copper nanoclusters at a 4x dose.
  • Hair is a good indicator of the metabolic state of mice. Hair pigmentation, which is a highly observable aspect in hemizygous mice, is analyzed in the following. In hemizygous mice treated with a solution of copper nanoclusters at a 4x dose, under the optical microscope an alternation of dark and light areas is observed on the hairs, which could correspond to the periodicity of the injections carried out previously. Indeed, the administration of copper through the solution of copper nanoclusters restores the production of melanin, because this depends on the activity of tyrosinase which is a cuproprotein. It is the improvement of this enzymatic function which is at the origin of the improvement in the coloring of the coat of mice.
  • the anatomopathological analysis of the kidney shows the presence of low copper deposits in the kidneys of the animals treated at the 2x dose (figure at the top right) without there being any aspect of tissue toxicity at the level kidney tissue (lower right figure).
  • the anatomopathological analysis of the liver shows the presence of weak copper deposits in the liver of the animals treated at the 2x dose (figure at the top right) without there being any aspect of tissue toxicity at the level liver tissue (lower right figure). These data show that there is indeed uptake of copper by the tissues, without causing cellular toxicity in the kidney and liver at the 2x treatment dose.
  • mice In vivo tests carried out in mice show that:
  • Example 4 comparative example
  • the inventors prepared copper nanoclusters by substituting copper acetate with copper chloride or copper sulphate.
  • the protocol used is the protocol in solution described in Example 1, the only difference residing in the use of copper chloride or copper sulphate instead of copper acetate.
  • 1x copper chloride or 1x copper sulfate solutions are respectively prepared to obtain 1x copper nanocluster solutions respectively.
  • the copper concentration of each of the solutions of copper nanoclusters obtained, optionally dialysed, is 16 pg/mL.
  • the three solutions of 1x copper nanoclusters respectively obtained from copper acetate, copper chloride or copper sulphate are compared in terms of stability.
  • the stability was evaluated by dynamic light scattering as indicated in example 2 above.
  • the results obtained show a much higher stability, following the evolution of the hydrodynamic diameter as a function of time, when copper acetate is used compared to chloride or copper sulphate.
  • the copper nanoclusters in solution of the invention have a stability of up to 140 days, whereas the stability of the copper nanoclusters in solution obtained from copper chloride is only 2 days. and that of copper nanoclusters in solution obtained from copper sulphate is only 4 days.
  • Example 9 of the Chinese document describes the preparation of copper clusters from copper acetate 0.01 mol/L, histidine 0.1 mol/L and ascorbic acid 0.1 mol/L.
  • the protocol described in this example has been reproduced identically by the inventors.
  • the syntheses were carried out three times in all.
  • the liquid mixtures of copper clusters obtained at the end of each of the three syntheses are respectively stored in three graduated test tubes with screw caps and are called Lot 1, Lot 2 and Lot 3.
  • the hydrodynamic diameter (Dh) of the copper clusters of each of the batches was evaluated immediately after their synthesis, by dynamic light scattering (angle 173°, laser 530 nm, temperature 25°C on Nanosizer Malvern). The results obtained are illustrated in Figure 15, from which it appears that the hydrodynamic diameter of each of the three batches varies from 70 to 120 nm. Such hydrodynamic diameters therefore do not allow the clusters of the Chinese document to be qualified as “nanoclusters”.
  • the particles obtained according to the protocol of the Chinese document are not nanoclusters (size greater than 2 nm) and are not stable.
  • This disclosure is not limited to the examples described above, only by way of example, but it encompasses all the variants that those skilled in the art may consider within the framework of the protection sought.

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Abstract

La présente invention a pour objet des nanoclusters de cuivre caractérisés en ce qu'ils : - sont recouverts à leur surface d'une couche mixte comprenant de l'histidine (His), des ions acétate (Ac) et éventuellement des ions ascorbate (Asc), - présentent une forme sphérique, - présentent un diamètre hydrodynamique allant de 0,6 à 2,0 nm, et de préférence de 1,3 nm, - présentent un diamètre de cœur métallique allant de 0,5 à 1,5 nm, et de préférence de 1,0 nm, - présentent une stabilité dans le temps allant de 5 à 12 semaines lorsque les nanoclusters sont en solution, - présentent une stabilité dans le temps d'au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois lorsque les nanoclusters sont sous forme sèche, - présentent des propriétés spectrophotométriques, avec un épaulement sur le spectre UV- Visible à 325 ± 10 nm et un spectre de fluorescence avec des longueurs d'onde d'excitation allant de 365 à 395 nm et des longueurs d'onde d'émission allant de 445 à 475 nm, lesdits nanoclusters de cuivre étant désignés par la formule « CuNC@HisAc » ou « CuNC@HisAcAsc ». L'invention concerne encore un procédé de préparation des nanoclusters de cuivre. L'invention a encore pour objet les nanoclusters de cuivre pour une utilisation dans le traitement des pathologies liées à un déficit en cuivre, et en particulier la maladie de Menkes.

Description

Description
Titre : Nanoclusters de cuivre, leurs procédés d’obtention et leur application dans le traitement de la maladie de Menkes
Domaine technique
[0001] La présente divulgation relève du domaine de la chimie, et plus particulièrement de la chimie pharmaceutique. L’invention concerne des nanoclusters de cuivre, leurs procédés d’obtention et leurs applications dans le traitement de maladies impliquant un déficit en cuivre, et plus particulièrement dans le traitement de la maladie de Menkes.
Technique antérieure
[0002] La maladie de Menkes est une maladie génétique rare de transmission liée à l’X (X 21 .1 ), qui touche essentiellement les garçons et qui a une occurrence correspondant à une naissance sur 300 000 en Europe, soit deux naissances chaque année en France. La maladie de Menkes est consécutive à un déficit en cuivre chez le patient. Le cuivre est un oligo-élément clé rentrant dans la composition de nombreuses enzymes clés du métabolisme et est donc indispensable à la survie de l’organisme. Dans le cas de la maladie de Menkes, un transporteur du cuivre, la protéine ATPase 7A, n’est pas fonctionnelle. De ce fait, le cuivre apporté par l’alimentation ne peut être absorbé, ce qui entraîne un déficit profond en cuivre de l’organisme. De plus, ce transporteur permet le passage du cuivre dans le cerveau, ce qui fait que l’administration de cuivre au niveau sanguin ne peut guérir ces patients car cela ne traite pas l’atteinte neurologique de la maladie. Outre le retard profond du développement psychomoteur, les enfants atteints de la maladie de Menkes présentent une hypotonie majeure, une épilepsie rebelle aux traitements anticonvulsivants, des épisodes d’hypothermie, d’hypotension etc. Il existe aussi des anomalies cutanéo- phanériennes avec un défaut de pigmentation, une peau pâle et sèche, des cheveux fragiles, secs et anormaux (Kinky hairs). Il peut également y avoir des anomalies vasculaires causant des hématomes sous-duraux ainsi que des problèmes de minéralisation osseuse. A ce jour la maladie de Menkes reste incurable et le décès survient en général précocement dans l’enfance (durée de vie inférieure à 5 ans).
[0003] La seule option thérapeutique disponible concerne l’utilisation d’un complexe cuivre- histidine (l’histidinate de cuivre) fourni par l'Agence Générale des Equipements et Produits de Santé (AGEPS) de l'Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP). Ce produit est administré par voie parentérale (sous-cutanée). Ce traitement rend le cuivre disponible dans le compartiment sanguin, mais, comme cela est expliqué ci-dessus, ne permet pas son passage au niveau du cerveau et ne guérit donc pas l’atteinte neurologique de cette maladie. Le document « Sr Sheela et al, Clinical Genetics, Wiley-Blackwell Munksgaard, Dk, vol. 68, No. 3, 11 août 2005, pages 278-283 » est une étude indienne effectuée sur un enfant indien âgé de 15 mois, qui souffre de la maladie de Menkes, et qui est traité par des injections quotidiennes sous-cutanées de cuivre histidine pendant deux ans et demi. Le traitement permet d’éliminer les crises d’épilepsie et conduit à une pigmentation améliorée de la peau et des cheveux. Cependant l’enfant continue à manifester des retards graves de développement.
[0004] Il n’existe donc pas à ce jour de solution satisfaisante pour améliorer l’espérance de vie des enfants atteints de la maladie de Menkes et/ou pour améliorer leur qualité de vie. La présente divulgation vient améliorer la situation puisqu’elle propose une solution visant notamment à remédier aux inconvénients susmentionnés.
[0005] Les Inventeurs ont eu l’idée originale de proposer l’utilisation de nanoclusters de cuivre dans le traitement de la maladie de Menkes. En effet, à la connaissance des Inventeurs, personne à ce jour n’a pensé à utiliser des nanoclusters de cuivre pour le traitement de cette maladie. A cet égard les Inventeurs ont mis au point un procédé de synthèse original de nanoclusters de cuivre. Divers procédés de synthèse ont été décrits dans la littérature pour obtenir des nanoclusters, et en particulier des nanoclusters de cuivre. Ainsi dans le document de Hu Yanling et al. (« Microchimica Acta, Springer Vienna, Vol. 186, no. 1 , 7 décembre 2018, p. 1-8 ») des nanoclusters de cuivre ont été synthétisés à partir d’histidine, de chlorure de cuivre et d’acide ascorbique. Ces nanoclusters de cuivre, décrits comme ayant de très bonnes propriétés de fluorescence, présentent une forme sphérique et un diamètre d’environ 3 à 4 nm, ledit diamètre étant évalué par microscopie électronique à transmission. Dans le document CN 105 965 028 des clusters de platine, d’argent, d’or et de cuivre sont décrits pour leur utilisation dans la détection d’ions de fer par fluorescence/luminescence. Il est notamment décrit dans ce document que des clusters de cuivre, synthétisés à partir d’histidine, d’acétate de cuivre et d’acide ascorbique, présentent une taille moyenne de particules de 1 ,9 nm, ladite taille étant mesurée par microscopie électronique à transmission. Ce document est silencieux quant à la stabilité des clusters obtenus.
Résumé
[0006] La présente divulgation propose des nanoclusters de cuivre pour leur utilisation dans le traitement de la maladie de Menkes. En effet, les nanoclusters de cuivre objets de la présente invention sont aptes à passer la barrière hémato-encéphalique, et donc à apporter du cuivre au cerveau des patients. De plus, ils ne s’accumulent pas, aux doses actuellement utilisées sur modèle murin, dans les organes tels que le foie, la rate, les reins ou les poumons. Les nanoclusters de cuivre de l’invention présentent encore plusieurs autres propriétés avantageuses qui seront décrites plus en détails ci-après.
[0007] Les nanoclusters de l’invention, de par leurs propriétés avantageuses, sont donc des candidats prometteurs pour améliorer la qualité et l’espérance de vie des patients souffrant de la maladie de Menkes.
[0008] Un autre but de l’invention est de proposer un procédé simple et rapide de synthèse des nanoclusters de l’invention.
[0009] La présente invention a pour objet des nanoclusters de cuivre caractérisés en ce qu’ils :
- sont recouverts à leur surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine (His), des ions acétate (Ac) et éventuellement des ions ascorbate (Asc),
- présentent une forme sphérique,
- présentent un diamètre hydrodynamique allant de 0,6 à 2,0 nm, et de préférence de 1 ,3 nm,
- présentent un diamètre de cœur métallique allant de 0,5 à 1 ,5 nm, et de préférence de 1 ,0 nm,
- présentent une stabilité dans le temps allant de 5 à 12 semaines, lorsque les nanoclusters sont sous forme liquide,
- présentent une stabilité dans le temps d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois lorsque les nanoclusters sont sous forme sèche,
- présentent des propriétés spectrophotométriques, avec un épaulement sur le spectre UV- Visible à 325 ± 10 nm et un spectre de fluorescence avec des longueurs d’onde d’excitation allant de 365 à 395 nm et des longueurs d’onde d’émission allant de 445 à 475 nm, lesdits nanoclusters de cuivre étant désignés par la formule « CuNC@HisAc » ou par la formule « CuNC@HisAcAsc ».
Les nanoclusters de cuivre objets de l’invention sont des nanoclusters métalliques. Un nanocluster métallique consiste en l’association de dizaines d’atome d’élément métallique (en l’occurrence le cuivre dans l’invention) avec un diamètre de cœur métallique inférieur ou égal à 2,0 nanomètres (nm).
Les nanoclusters CuNC@HisAc de l’invention sont constitués d’un cœur métallique de cuivre couvert/recouvert/entouré d’une couche/couronne mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et éventuellement des ions ascorbate. On peut employer indifféremment dans la demande les termes « couronne » ou « couche » comprenant de l’histidine, des ions acétate et éventuellement des ions ascorbate. Le terme « mixte » est employé pour indiquer que la couronne ou la couche qui entoure le cœur de cuivre comprend à la fois de l’histidine, des ions acétate et éventuellement des ions ascorbate. De même, on peut employer indifféremment les verbes « couvrir/recouvrir/entourer » pour indiquer que le cœur de cuivre comprend sur l’ensemble de sa surface une couche/couronne d’histidine, d’ions acétate et éventuellement d’ions ascorbate. L’ensemble du nanocluster de cuivre CuNC@HisAc présente une forme sphérique.
La formule « CuNC@HisAc » au sens de l’invention désigne un nanocluster constitué d’un cœur métallique de cuivre recouvert d’une couche mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et éventuellement des ions ascorbate. Ainsi la formule « CuNC@HisAc » sans autre précision dans la présente demande englobe également la formule « CuNC@HisAcAsc » qui est un mode de réalisation particulier d’un nanocluster de cuivre de l’invention, à savoir un nanocluster constitué d’un cœur métallique de cuivre recouvert d’une couche mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et des ions ascorbate.
La couronne mixte comprenant l’histidine, les ions acétate et éventuellement les ions ascorbate confère notamment aux nanoclusters de l’invention une très grande stabilité et une faible réactivité.
Une « faible réactivité » signifie une faible dégradation en particulier liée à l’oxydation (par exemple due au dioxygène de l’air).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la couche/couronne mixte entourant le cœur métallique de cuivre comprend de l’histidine, des ions acétate et des ions ascorbate. Les nanoclusters de cuivre de l’invention comprennent ainsi avantageusement trois ligands à la surface du cœur cuivre, à savoir l’histidine, l’acétate et l’ascorbate. Ces ligands histidine, ions acétate et ions ascorbate sont liés au cœur métallique de cuivre par des liaisons de coordination. La stabilité des nanoclusters de l’invention signifie un maintien de la structure et des propriétés des nanoclusters dans le temps à une température de conservation de 4°C. Le maintien de la structure signifie notamment que la composition du nanocluster (cœur métallique entouré de la couche/couronne mixte telle que ci-dessus définie), sa forme et son diamètre (de cœur métallique et hydrodynamique) sont conservés au cours du temps.
La « forme liquide » des nanoclusters de cuivre désigne une solution ou un mélange liquide de nanoclusters de cuivre. La stabilité de 5 à 12 semaines mentionnée ci-dessus concerne les nanoclusters de cuivre sous forme liquide.
On entend par « forme sèche » une forme solide qui peut être réduite en poudre si nécessaire. La stabilité de 12 à 18 mois mentionnée ci-dessus concerne les nanoclusters de cuivre sous forme sèche.
En fonction de leurforme (liquide ou solide), leur stabilité dans le temps sera donc différente. Les nanoclusters de l’invention présentent des propriétés spectrophotométriques, en particulier de fluorescence, qui sont caractéristiques de cette échelle, à savoir un diamètre de cœur métallique inférieur ou égal à 2 nm, qui est intermédiaire entre la molécule et la nanoparticule.
Le diamètre de cœur métallique ou diamètre métallique désigne, comme son nom l’indique, le diamètre formé par le métal cuivre.
Le diamètre hydrodynamique prend en compte le diamètre du cœur cuivre et de sa couche/couronne comprenant l’histidine, les ions acétate et éventuellement les ions ascorbate. Le diamètre hydrodynamique désigne donc le diamètre du nanocluster de cuivre CuNC@HisAc de l’invention.
On peut constater que les nanoclusters de l’invention présentent un diamètre de cœur métallique et un diamètre hydrodynamique quasi équivalents (respectivement de 1 ,0 et 1 ,3 nm).
Les nanoclusters de l’invention sont désignés indifféremment dans la présente demande par « nanoclusters », « nanoclusters de cuivre », « nanoclusters CuNC@HisAc », étant entendu que « nanoclusters CuNC@HisAc » englobe le mode de réalisation particulier « nanoclusters CuNC@HisAcAsc ».
[0010] Selon un mode de réalisation de l’invention, les nanoclusters de cuivre se présentent sous forme liquide ou sous forme sèche.
La forme sèche des nanoclusters est avantageuse notamment en ce qu’elle permet un stockage, une conservation et un transport facile des nanoclusters de l’invention.
[0011] Selon un mode de réalisation avantageux, les nanoclusters de cuivre de l’invention sont encore caractérisés en qu’ils présentent au moins une des caractéristiques suivantes :
- ils sont aptes à passer la barrière hémato-encéphalique,
- ils présentent une bonne biodisponibilité,
- ils sont biocompatibles,
- ils sont biodégradables,
- ils sont lyophilisables,
- ils ne sont pas toxiques pour l’organisme humain,
- ils ne s’accumulent pas dans les organes tels que le foie, la rate, les reins ou les poumons. Selon un mode de réalisation avantageux, les nanoclusters de cuivre de l’invention présentent l’ensemble des caractéristiques ci-dessus décrites.
Le fait que les nanoclusters de l’invention ne soient pas séquestrés dans les dits organes est notamment dû à leur faible taille (diamètre hydrodynamique inférieur ou égal à 2,0 nm. La taille des nanoclusters de l’invention permet une circulation dans le sang plus longue, comparée à des composés de taille plus importante.
Les nanoclusters de l’invention possèdent des propriétés de surface les rendant capable de traverser la barrière hémato-encéphalique en utilisant les systèmes de transport de capillaires sanguins cérébraux. En outre, l’histidine permet notamment d’aider à l’adressage du nanocluster au cerveau car l’histidine y est transformée en histamine.
La « bonne biodisponibilité » signifie que lorsque les nanoclusters de cuivre sont administrés par voie sous-cutanée, ils atteignent bien la circulation générale et sont bien distribués aux organes cibles.
On entend par « biocompatibilité » le fait que les nanoclusters de cuivre sont bien acceptés par les différents organes de l’organisme et permettent une restauration des fonctions biologiques liées au cuproprotéines sans être toxiques pour ces organes.
Le fait que les nanoclusters soient biodégradables signifie que leur dégradation libère des substances qui sont métabolisées ou éliminées sans problème par l’organisme (cuivre, histidine, acétate et éventuellement ascorbate).
Le fait que les nanoclusters soient lyophilisables permet notamment de les stocker, conserver et transporter facilement. Le fait que les nanoclusters soient lyophilisables est imputable au fait que les nanoclusters sont parfaitement stables. La stabilité des nanoclusters est telle que définie ci-dessus.
Les propriétés avantageuses des nanoclusters de l’invention sont notamment dues à la combinaison originale de ses constituants, à savoir le cuivre, l’histidine, les ions acétate et éventuellement les ions ascorbate. A la connaissance des Inventeurs il n’a en effet jamais été décrit à ce jour des nanoclusters de cuivre comprenant une couronne/couche mixte d’histidine, d’ions acétate et éventuellement d’ions acorbate entourant un noyau métallique de cuivre, et qui présentent les propriétés avantageuses ci-dessus décrites.
[0012] La présente invention a encore pour objet un procédé de préparation de nanoclusters de cuivre tels que ci-dessus définis, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
- réaction entre de l’acétate de cuivre (II) et de l’histidine afin d’obtenir un mélange d’acétate de cuivre et d’histidine, le ratio molaire histidine/acétate de cuivre (II) étant supérieur ou égal à 50, et de préférence va de 50 à 200,
- réaction entre le mélange d’acétate de cuivre et d’histidine avec de l’acide ascorbique afin d’obtenir un mélange d’acétate de cuivre, d’histidine et d’acide ascorbique, le ratio molaire acide ascorbique/acétate de cuivre (II) étant supérieur ou égal à 130, et de préférence va de 130 à 700,
- récupération des nanoclusters de cuivre recouverts à leur surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et éventuellement des ions ascorbate.
Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, les nanoclusters de cuivre obtenus à l’issue du procédé sont recouverts à leur surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et des ions ascorbate.
Les ratios molaires tels que définis ci-dessus, respectivement entre l’histidine et l’acétate de cuivre, et entre l’acide ascorbique et l’acétate de cuivre, sont importants en ce sens qu’ils permettent aux ligands histidine, acétate et ascorbate de se lier au cœur métallique de cuivre. On obtient de cette manière des nanoclusters comprenant trois ligands à la surface du cœur cuivre, ces trois ligands étant liés à la surface du cœur de cuivre par des liaisons de coordination.
L’acide ascorbique est un réducteur. La réaction entre le mélange d’acétate de cuivre et d’histidine avec l’acide ascorbique est plus particulièrement une réaction de réduction du mélange d’acétate de cuivre et d’histidine avec de l’acide ascorbique. L’acide ascorbique permet notamment d’obtenir des nanoclusters de cuivre dépourvus de toute toxicité.
[0013] La présente invention résulte notamment de la découverte inattendue des Inventeurs que la combinaison originale des réactifs utilisés, à savoir l’acétate de cuivre, l’histidine et l’acide ascorbique, et dans les proportions telles que ci-dessus définies, permet d’obtenir des nanoclusters de cuivre aux propriétés particulièrement avantageuses. L’excellente stabilité des nanoclusters de l’invention en est un exemple.
[0014] Selon un mode de réalisation de l’invention, les nanoclusters de cuivre peuvent être plus particulièrement préparés selon le protocole « en solution » ou selon le protocole « en phase solide ». Chacune de ces deux voies de synthèse est conforme au procédé ci-dessus décrit.
[0015] Protocole en solution
[0016] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, le procédé de préparation tel que ci-dessus défini est plus particulièrement caractérisé en ce qu’il est effectué sous gaz inerte et en ce que :
- l’acétate de cuivre est sous forme de solution et l’histidine est sous forme de poudre,
- une solution d’acétate de cuivre et d’histidine est préparée par ajout d’histidine dans la solution d’acétate de cuivre,
- la solution d’acétate de cuivre et d’histidine est ajustée à une valeur de pH allant de 11 à 13, et de préférence est de 12,
- l’acide ascorbique est sous forme de poudre,
- une solution d’acétate de cuivre, d’histidine et d’acide ascorbique est préparée par ajout d’acide ascorbique à la solution d’acétate de cuivre et d’histidine dont le pH a été ajusté aux valeurs susmentionnées,
- la solution d’acétate de cuivre, d’histidine et d’acide ascorbique est agitée pendant 2h à 6h, et de préférence 4h, à une température allant de 35°C à 45°C, et de préférence 40°C,
- une solution comprenant des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc est obtenue à l’issue de l’étape précédente d’agitation, - la solution qui comprend les nanoclusters de cuivre est éventuellement dialysée afin d’obtenir une solution purifiée de nanoclusters de cuivre,
- la solution qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysée, est éventuellement lyophilisée afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters de cuivre.
La solution comprenant les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysée, présente une stabilité dans le temps allant de 5 à 12 semaines à une température de conservation de 4°C.
La dialyse permet notamment de supprimer tout ce qui n’est pas lié au cœur métallique de cuivre, comme par exemple éventuellement un excès d’histidine ou d’acide ascorbique ou encore du cuivre résiduel éventuellement présent dans la solution de nanoclusters. La couche comprenant l’histidine, les ions acétate et éventuellement les ions ascorbate, est liée au cœur métallique de cuivre par des liaisons de coordination.
La forme sèche des nanoclusters de cuivre, obtenue à l’issue de la lyophilisation, présente une stabilité dans le temps d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois, à une température de conservation de 4°C sous azote.
La forme sèche des nanoclusters de cuivre peut être reconstituée à tout moment, par mélange dans un solvant de reconstitution, comme par exemple de l’eau purifiée. On entend par « reconstituer/reconstitution » l’opération de mélange simple de la forme sèche ou du lyophilisât avec un solvant.
L’analyse de la solution de nanoclusters de cuivre, obtenue à l’issue de la reconstitution de la forme sèche, montre que les nanoclusters de cuivre présentent l’ensemble des propriétés définies ci-dessus et sont donc exactement les mêmes que ceux directement obtenus à l’issue de leur procédé de préparation.
La solution de nanoclusters de cuivre, obtenue à l’issue de la reconstitution de la forme sèche, présente une stabilité dans le temps allant de 5 à 12 semaines à une température de conservation de 4°C.
[0017] Le procédé de préparation tel que ci-dessus défini est encore caractérisé en qu’il comprend en outre au moins une caractéristique choisie parmi :
- le gaz inerte est de l’azote,
- la solution d’acétate de cuivre est préparée par ajout d’acétate de cuivre dans de l’eau ultra pure filtrée,
- la solution d’acétate de cuivre présente une concentration allant de 0,5 à 5,0 mM,
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration de la solution d’acétate de cuivre,
- le pH de la solution d’acétate de cuivre et d’histidine est ajusté à l’aide d’hydroxyde de sodium, - la solution qui comprend les nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc, éventuellement dialysée, présente une concentration en cuivre allant de 16 à 160 pg/mL,
- la solution qui comprend les nanoclusters de cuivre , éventuellement dialysée, est lyophilisée afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters de cuivre.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de l’invention présente l’ensemble des caractéristiques ci-dessus décrites.
[0018] Protocole en phase solide
[0019] Selon un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, le procédé de préparation tel que ci-dessus défini est plus particulièrement caractérisé en ce que :
- l’acétate de cuivre est sous forme de poudre et l’histidine est sous forme de poudre,
- un mélange pulvérulent d’acétate de cuivre et d’histidine est obtenu par mélange de chacune des poudres d’acétate de cuivre et d’histidine,
- le mélange pulvérulent d’acétate de cuivre et d’histidine est broyé jusqu’à obtention d’un mélange pulvérulent homogène en couleur,
- le mélange pulvérulent homogène d’acétate de cuivre et d’histidine est placé dans un réacteur,
- l’acide ascorbique est sous forme de poudre,
- l’acide ascorbique est ajouté dans le réacteur comprenant le mélange pulvérulent homogène d’acétate de cuivre et d’histidine,
- le mélange pulvérulent d’acétate de cuivre, d’histidine et d’acide ascorbique ainsi obtenu est mis sous agitation, puis de l’eau est ajoutée goutte à goutte dans le réacteur, ladite eau étant de l’eau ultra pure filtrée,
- le réacteur est mis sous gaz inerte et à l’abri de la lumière,
- le mélange d’acétate de cuivre, d’histidine, d’acide ascorbique et d’eau est maintenu sous agitation dans le réacteur pendant 16h à 36h, et de préférence 24h,
- un mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc est obtenu à l’issue de l’étape précédente d’agitation,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre est éventuellement dialysé afin d’obtenir un mélange liquide purifié de nanoclusters de cuivre,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysé, est éventuellement lyophilisé afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters de cuivre.
Les données de stabilité décrites ci-dessus pour les nanoclusters de cuivre, sous forme liquide ou sous forme sèche, obtenus à l’issue du protocole solution sont valables pour les nanoclusters de cuivre sous forme liquide ou sous forme sèche obtenus à l’issue du protocole en phase solide.
La poudre d’acétate de cuivre ci-dessus utilisée est de couleur bleue et la poudre d’histidine est de couleur blanche. Lorsque ces deux poudres sont mélangées on cherche à obtenir une poudre de couleur bleu clair la plus homogène possible.
[0020] Le procédé de préparation tel que ci-dessus défini est encore caractérisé en qu’il comprend en outre au moins une caractéristique choisie parmi :
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration d’acétate de cuivre,
- l’eau ajoutée dans le réacteur est de l’eau ultra pure filtrée,
- le gaz inerte est de l’azote,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysé, présente une concentration en cuivre allant de 1600 à 4000 pg/mL,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysé, est lyophilisé afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters de cuivre.
Le lyophilisât est conservé sous azote.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de l’invention présente l’ensemble des caractéristiques ci-dessus décrites.
[0021] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la forme sèche de nanoclusters de cuivre obtenue à l’issue de la lyophilisation (selon le protocole « solution » ou le protocole « en phase solide ») est conservée sous azote, de préférence dans des flacons, et de préférence à 4°C. Dans de telles conditions, la poudre de nanoclusters de cuivre pourra être conservée pendant une durée d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois, sans altération de la stabilité des nanoclusters de cuivre.
La reconstitution de la poudre de nanoclusters à l’issue de cette période montre que les nanoclusters sont exactement les mêmes que ceux directement obtenus à l’issue de leur préparation (selon le protocole « solution » ou le protocole « en phase solide »). En effet les nanoclusters de cuivre présentent l’ensemble des propriétés définies ci-dessus.
[0022] Selon un autre aspect, la présente invention a également pour objet des nanoclusters de cuivre tels que ci-dessus définis ou obtenus selon les procédés tels que ci- dessus définis, pour une utilisation comme médicament.
[0023] La présente invention a plus particulièrement pour objet des nanoclusters de cuivre tels que ci-dessus définis ou obtenus selon les procédés tels que ci-dessus définis pour une utilisation dans le traitement des pathologies liées à un déficit en cuivre.
[0024] A titre d’exemple(s) de pathologies liées à un déficit en cuivre, on pourra plus particulièrement citer la maladie de Menkes.
[0025] Les nanoclusters de cuivre de l’invention sont plus particulièrement destinés aux patients atteints d’un déficit en ATPase7A.
Parmi les patients atteints d’un déficit en ATPase7A, on pourra citer les patients atteints de la maladie de Menkes, à savoir les enfants. Selon un mode de réalisation de l’invention, les nanoclusters de cuivre sont donc plus particulièrement destinés à une utilisation pédiatrique. Cependant, parmi les patients atteints d’un déficit en ATPase7A, on pourra également citer des patients adultes atteints de la forme atténuée de la maladie de Menkes, à savoir des patients adultes souffrant d’un syndrome de la corne occipitale (SCO). Selon un autre mode de réalisation de l’invention, les nanoclusters de cuivre sont également adaptés pour une utilisation dans le traitement du syndrome de la corne occipitale.
[0026] L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique renfermant une quantité thérapeutiquement efficace des nanoclusters de cuivre tels que ci-dessus définis ou obtenus selon les procédés tels que ci-dessus définis.
La quantité de nanoclusters de cuivre pourra varier selon le mode d’administration envisagé, l’âge et le poids du patient.
[0027] Les nanoclusters de cuivre ou la composition pharmaceutique de l’invention pourront se présenter sous une forme appropriée pour être administrés par voie sous- cutanée ou par voie intraveineuse. Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, les nanoclusters de cuivre sont sous une forme adaptée à une administration par voie sous cutanée, de préférence une fois par jour.
[0028] Selon un mode de réalisation avantageux, les nanoclusters de cuivre ou la composition pharmaceutique de l’invention sont sous une forme adaptée à une administration continue via une pompe sous-cutanée.
A titre d’exemple, la pompe sous-cutanée est utilisée depuis de nombreuses années dans le traitement du diabète de l’enfant. Le médicament est ainsi administré en continu, via une pompe, que le patient porte sur lui, et qui administre, via un cathéter sous-cutané, le médicament de façon continue.
[0029] L’ invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique de la maladie de Menkes comprenant l’administration chez un sujet d’une quantité thérapeutiquement efficace de nanoclusters de cuivre ou d’une composition pharmaceutique telle que ci-dessus définie.
Brève description des dessins
[0030] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
Fig. 1 [0031] [Fig. 1] est une représentation schématique d’un nanocluster de cuivre CuNC@HisAc de l’invention, constitué d’un cœur métallique de cuivre entouré d’une couronne mixte comprenant de l’histidine et de l’acétate.
Fig. 2
[0032] [Fig. 2] est une représentation schématique d’un nanocluster de cuivre CuNC@HisAcAsc de l’invention, constitué d’un cœur métallique de cuivre entouré d’une couronne mixte comprenant de l’histidine, de l’acétate et de l’ascorbate.
Fig. 3
[0033] [Fig. 3] est une analyse par chromatographie ionique des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc, montrant la présence d’ions d’acétate à la surface du cœur métallique de cuivre.
Fig. 4
[0034] [Fig. 4] est une analyse en spectrophotométrie infrarouge montrant la présence d’ions ascorbate à la surface du cœur métallique de cuivre.
Fig. 5
[0035] [Fig. 5] illustre le diamètre hydrodynamique (en nanomètre) des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc évalué par diffusion dynamique de la lumière.
Fig. 6
[0036] [Fig. 6] illustre le diamètre métallique (en nanomètre) des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc évalué par microscopie électronique à transmission.
Fig. 7
[0037] [Fig. 7] illustre le diamètre hydrodynamique (en nanomètre) des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc évalué par dispersion de Taylor.
Fig. 8
[0038] [Fig. 8] est un spectre UV-Visible des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc.
Fig. 9
[0039] [Fig. 9] est un spectre de fluorescence des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc.
Fig. 10
[0040] [Fig. 10] représente la concentration cérébrale de cuivre (en pg/g) chez des souris en fonction du traitement (traité ou non traité) et de la dose de nanoclusters de cuivre reçue : WT (« Wild-type »), NT (souris hémizygotes non traitées), 4X 3x/semaine (souris hémizygotes traitées à la dose de nanoclusters de cuivre 4x, injectée 3 jours par semaine) et 4X 5x/semaine (souris hémizygotes traitées à la dose de nanoclusters de cuivre 4x, injectée 5 jours par semaine). Le nombre de souris traitées est indiqué pour chaque groupe de souris par la lettre n.
Fig. 11
[0041] [Fig. 11] représente la survie des animaux sur une courbe de Kaplan-Meir en fonction du traitement (traité ou non traité) et de la dose de nanoclusters de cuivre reçue : WT (« Wild-type »), NT (souris hémizygotes non traitées), 1X (souris hémizygotes traitées à la dose de nanoclusters de cuivre 1x, injectée 3 jours par semaine), 2X (souris hémizygotes traitées à la dose de nanoclusters de cuivre 2x, injectée 3 jours par semaine), 4X 3x/semaine (souris hémizygotes traitées à la dose de nanoclusters de cuivre 4x, injectée 3 jours par semaine) et 4X 5x/semaine (souris hémizygotes traitées à la dose de nanoclusters de cuivre 4x, injectée 5 jours par semaine). Le nombre de souris traitées est indiqué pour chaque groupe de souris par la lettre n.
Fig. 12
[0042] [Fig. 12] montre un marquage histologique du cuivre par coloration à la rhodanine sur une coupe de tissus de reins issus de souris hémizygotes non traitées (HE NT) et de souris hémizygotes traitées avec une solution de nanoclusters de cuivre à la dose 2x (HE X2).
Fig. 13
[0043] [Fig. 13] montre un marquage histologique du cuivre par coloration à la rhodanine sur une coupe de tissus de foie issus de souris hémizygotes non traitées (HE NT), de souris hémizygotes traitées avec une solution de nanoclusters de cuivre à la dose 2x (HE X2).
Fig. 14
[0044] [Fig. 14] montre l’analyse de la chaîne respiratoire dans le cerveau de souris hémizygotes non traitées (HE NT) et de souris hémizygotes traitées avec une solution de nanoclusters de cuivre à la dose 2x (HE 2x).
Fig. 15
[0045] [Fig. 15] illustre le diamètre hydrodynamique (en nanomètre), évalué par diffusion dynamique de la lumière, de clusters de cuivre obtenus selon le protocole de synthèse décrit dans le document CN 105 965 028. Le diamètre hydrodynamique a été évalué immédiatement après la synthèse des clusters de cuivre.
Fig. 16 [0046] [Fig. 16] illustre le diamètre hydrodynamique (en nanomètre), évalué par diffusion dynamique de la lumière, de clusters de cuivre obtenus selon le protocole de synthèse décrit dans le document CN 105 965 028. Le diamètre hydrodynamique a été évalué 24 heures après la synthèse des clusters de cuivre (stockage à 4°C dans le noir).
Fig. 17
[0047] [Fig. 17] est une photo des trois lots de clusters de cuivre obtenus selon le protocole de synthèse décrit dans le document CN 105 965028 après 24 heures de stockage à 4°C dans le noir.
Description des modes de réalisation
[0048] Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel, des éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente divulgation, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
Exemples
[0049] Exemple 1
[0050] Préparation des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc
Cet exemple décrit respectivement les deux voies de synthèse possibles pour préparer les nanoclusters de cuivre de l’invention, à savoir le « protocole en solution » et le « protocole en phase solide ».
[0051] 1/ Protocole en solution
[0052] Réactifs utilisés
- Acétate de cuivre (II) [Cu(CH3COO)2], M = 181 ,63 g/mol (Cas 142-71-2) ;
- L(-)-Histidine, M=155,15 g/mol (Cas 71-00-1 ) ;
- Acide ascorbique, M= 176,12 g/mol (Cas 50-81-7);
- Solution de NaOH 1 M, M= 40,00 g/mol (Cas 1310-73-2).
[0053] Précautions à prendre
La synthèse est réalisée sous gaz inerte (azote). La verrerie est lavée à l’eau régale (1 volume d’acide nitrique 65% pour 2 volumes d’acide chlorhydrique 37%).
Les nanoclusters de cuivre étant destinés à être étudiés in vivo, il est nécessaire de travailler sous une hotte propre et de nettoyer tous les équipements utilisés avec de l’éthanol 70% v/v. L’eau ultra pure utilisée est filtrée sur un filtre de diamètre de pores 0,2 pm.
[0054] Préparation d’une solution mère d'acétate de cuiyre
Une quantité de 45 mg d’acétate de cuivre est disposée dans une fiole jaugée de 100 mL. De l’eau ultra pure filtrée est ajoutée jusqu’au trait de jauge de la fiole. Une solution d'acétate de cuivre d’une concentration de 2,5 mM est obtenue.
Après complète solubilisation, la solution d’acétate de cuivre est transvasée dans un flaconnage adapté. Cette solution peut être conservée pendant un mois à 4 °C.
[0055] Synthèse des nanoclusters de cuiyre stabilisés avec de l'histidine
Une quantité de 500 pL de la solution mère d’acétate de cuivre telle que préparée à l’étape précédente est ajoutée dans un ballon à col rond pouvant contenir jusqu’à 50 mL de solution. Puis, une quantité de 4500 pL d’eau ultra pure filtrée est ajoutée dans le ballon. La solution d’acétate de cuivre obtenue est appelée 1x.
Des solutions d’acétate de cuivre 2x et 4x sont également préparées en disposant une quantité respective de 1000 pL et 2000 pL de solution mère d’acétate de cuivre dans le ballon et en complétant à 5000 pL avec de l’eau ultra pure filtrée.
La solution d’acétate de cuivre 1x est agitée à 130 rpm avec l’agitateur multi plaques. Une quantité de 39 mg d’histidine est ajoutée à la solution d’acétate de cuivre. La solution d’acétate de cuivre et d’histidine est agitée pendant 15 minutes. La solution prend une teinte bleutée. Après 15 minutes d’agitation le pH de la solution d’acétate de cuivre et d’histidine est ajusté à 12 avec 10 gouttes de NaOH 1 M.
Une quantité de 139 mg d’acide ascorbique est ajoutée au mélange réactionnel.
Le ballon (réacteur) est placé dans un bain marie à 40°C sous agitation (vitesse réglée à 6) pendant 4 heures. La solution prend une teinte orangée.
La solution de nanoclusters de cuivre ainsi obtenue est conservée au frais, à 4°C.
Les opérations ci-dessus décrites sont répétées respectivement avec les solutions d’acétate de cuivre 2x et 4x.
Les concentrations de cuivre obtenues avec des solutions d’acétate de cuivre 1x à 10x pour les solutions de nanoclusters de cuivre vont de 16 à 160 pg/mL.
Le rendement de synthèse est de 100% : il n’y a pas de cuivre résiduel Cu2+ dans la solution de nanoclusters.
Les 3 solutions de nanoclusters de cuivre, obtenues respectivement à partir d’une solution d’acétate de cuivre 1x, 2x et 4x, sont dénommées dans ce qui suit : solution de nanocluster de cuivre 1x, 2x et 4x. Les solutions peuvent être lyophilisées.
[0056] Dialyse des nanoclusters de cuiyre
Les nanoclusters de cuivre obtenus à l’étape précédente sont purifiés par dialyse. Une cellule de dialyse est préparée (X12 Float a lyzer G2 CE MWCO 100-500 D, Référence 1511160), et un bêcher de 150 mL est rempli avec 100 mL d’eau ultra pure filtrée. La cellule de dialyse est remplie avec de l’eau ultrapure filtrée à l’aide d’une pipette pasteur. La cellule de dialyse est placée dans le bêcher sous agitation (130 rpm). On laisse la cellule s’hydrater et se laver pendant 1 h.
L’eau est ensuite remplacée par un nouveau volume de 100 mL d’eau ultra pure filtrée. La cellule de dialyse est vidée à l’aide d’une pipette pasteur puis est remplie avec la solution de nanoclusters de cuivre 1x, qui est laissée sous agitation toute la nuit (pendant 12h) à une température entre 2 et 6 °C
La solution dyalisée de nanoclusters de cuivre 1x ainsi obtenue est transférée dans un flaconnage adapté.
Les mêmes opérations sont répétées respectivement avec les solutions de nanoclusters de cuivre 2x et 4x.
Les concentrations en cuivre des solutions de nanoclusters de cuivre dialysées sont identiques à celles des solutions non dialysées, et vont de16 à 160 pg/mL (avec des solutions d’acétate de cuivre 1x à 10x).
Les solutions peuvent être lyophilisées.
[0057] 21 Protocole en phase solide
[0058] Réactifs utilisés
L’acétate de cuivre (II), la L(-)-Histidine et l’acide ascorbique sont les mêmes que ceux utilisés dans le protocole solution. Dans le protocole en phase solide l’hydroxyde de sodium n’est pas nécessaire.
[0059] Précautions à prendre
La synthèse est réalisée sous gaz inerte (azote) et à l’abri de la lumière. La verrerie est lavée à l’eau régale (1 volume d’acide nitrique 65% pour 2 volumes d’acide chlorhydrique 37%). L’eau utilisée est de l’eau ultra pure filtrée sur un filtre de diamètre de pores 0,2 pm.
[0060] Synthèse des nanoclusters de cuiyre stabilisés avec de l'histidine
Une quantité de 23 mg d’acétate de cuivre est pesée puis est placée à l’intérieur d’un mortier en agate. Une quantité de 1 ,7 g d’histidine est ensuite pesée. Un volume de poudre d’histidine pour un volume de poudre d’acétate de cuivre est ajouté en prenant soin de bien broyer les poudres à l’aide du pilon jusqu’à obtenir un mélange de couleur et d’aspect homogène. Cette opération est répétée tant qu’il y a de l’histidine. Le mélange final des deux poudres doit avoir une couleur bleu clair et la poudre doit être homogène. Le mélange des deux poudres est ensuite transféré dans un ballon monocol de 50 mL (col rodé NS 19/26) à l’aide d’une spatule. Une quantité de 3 g d’acide ascorbique est pesée et transférée dans le ballon. Un agitateur magnétique en forme d’olive est placé au fond du ballon. Une quantité de 5 mL d’eau ultra pure est filtrée à l’aide d’une seringue en plastique de 5 mL et est ajoutée goutte à goutte dans le réacteur. Un mélange liquide est obtenu.
Le réacteur est fermé à l’aide d’un bouchon à jupe rabattable (diamètre 19,4 mm) et est mis sous azote sans créer de surpression à l’aide d’un ballon de baudruche. Le réacteur est entouré d’un papier aluminium puis est placé sous agitation (200 rpm) le temps de la réaction. Il faut attendre 24h avant la fin de la réaction. A la fin de la réaction, le produit obtenu, qui se trouve sous la forme d’un liquide, a une couleur jaune. Le liquide obtenu, comprenant les nanoclusters de cuivre, présente une concentration en cuivre de 1600 pg/mL.
Ce liquide est ensuite transféré dans un flaconnage en plastique adapté (le volume final est d’un peu plus de 5 mL). Le liquide comprenant les nanoclusters de cuivre est soit stocké au frais, soit transféré au lyophilisateur. La lyophilisation est effectuée par fractions de 1 mL. Après la lyophilisation, le contenu du flacon (qui comprend les nanoclusters de cuivre sous forme sèche) est placé sous azote et est stocké à 4°C. La forme sèche des nanoclusters de cuivre peut être reconstituée à tout moment dans 1 mL d’eau purifiée. La solution de nanoclusters de cuivre ainsi obtenue est conservée sous azote.
[0061] Exemple 2
[0062] Caractérisation des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc (en solution ou sous forme sèche et remis en solution)
[0063] Les nanoclusters de cuivre tels qu’obtenus à l’exemple 1 sont caractérisés quant à leur structure, leurs tailles, leurs propriétés spectrophotométriques et leur stabilité.
[0064] Structure des nanoclusters de cuiyre
Les nanoclusters de cuivre de l’invention présentent une forme sphérique. Ils sont plus particulièrement constitués d’un cœur métallique de cuivre couvert d’une couronne mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et éventuellement des ions ascorbate. La figure 1 est une représentation schématique d’un nanocluster de cuivre CuNC@HisAc de l’invention, à savoir un nanocluster qui comprend à la surface du cœur de cuivre une couronne mixte comprenant de l’histidine et des ions acétate. La figure 2 est une représentation schématique d’un mode de réalisation particulier, à savoir un nanocluster de cuivre CuNC@HisAcAsc qui comprend à la surface du cœur de cuivre une couronne mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et des ions ascorbate.
La présence d’ions acétate à la surface des nanoclusters de cuivre a été démontrée par purification par chromatographie d'exclusion stérique puis quantification en chromatographie ionique.
Les nanoclusters de cuivre de la solution dialysée 1x telle qu’obtenue à l’exemple 1 , point 1/ (« Protocole en solution ») sont détruits (dissolution totale et retour aux différents éléments composant la structure des nanoclusters) par un procédé chimique (mise en solution dans un acide concentré (HCl) puis une base concentrée (NaOH)) puis sont analysés par chromatographie ionique en comparaison à un témoin acétate de sodium (rétention des anions composant le nanocluster sur une résine échangeuse cationique, séparation, identification et quantification (étalonnage externe) des ions acétate par conductimétrie avec l’aide un suppresseur)).
Les résultats obtenus avec l’analyse par chromatographie ionique sont illustrés à la figure 3 . Le pic à 4,45 min associé aux ions acétate (témoin, voir tracé du haut) est retrouvé dans les nanoclusters de cuivre (voir tracé du bas).
La présence d’ions ascorbate à la surface des nanoclusters de cuivre a été démontrée par analyse en spectrophotométrie infrarouge après purification des nanoclusters en solution par chromatographie d’exclusion stérique.
Les résultats obtenus avec l’analyse par spectrophotométrie infra-rouge sont illustrés à la figure 4. Les longueurs d’onde caractéristiques des ions acétate à 1400 et 1500 cm-1 sont retrouvés lors de l’analyse des nanoclusters.
[0065] Taille des nanoclusters de cuiyre
Le diamètre hydrodynamique (Dh) et/ou métallique des nanoclusters de cuivre a été évalué par diffusion dynamique de la lumière (figure 5) (angle 173°, laser 530 nm, température 25°C sur Nanosizer Malvern), par microscopie électronique à transmission (figure 6) (dépôt sur grilles en nickel, observations sous faisceaux opérant à 200 kV (LaB6 cathode) Philips CM 200) et par analyse par dispersion de Taylor (figure 7). La méthode d’analyse par dispersion consiste à injecter une bande de soluté dans un tube capillaire ouvert (50 pm) et à la mobiliser sous l’influence d’un flux hydrodynamique (pression positive 1 psi, profil de vitesse parabolique). Le principe de la détermination du rayon hydrodynamique repose sur la relation de Taylor-Aris qui établit le lien entre l’étalement du pic de soluté (modélisation d’une gaussienne) et le coefficient de diffusion moléculaire.
Les résultats obtenus pour l’évaluation du diamètre hydrodynamique (Dh) des nanoclusters de cuivre par diffusion dynamique de la lumière sont illustrés à la figure 5.
Les résultats obtenus pour l’évaluation du diamètre métallique des nanoclusters de cuivre par microscopie électronique à transmission sont illustrés à la figure 6. On observe une population majoritaire avec un diamètre moyen inférieur à 1 ,0 nm.
Les résultats obtenus pour l’évaluation du diamètre hydrodynamique (Dh) des nanoclusters de cuivre par dispersion de Taylor sont illustrés à la figure 7.
Il ressort de ces figures que le diamètre hydrodynamique moyen, tout comme le diamètre métallique, des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc est inférieur à 1 ,0 nm. Les caractéristiques énumérées ci-dessus à propos des nanoclusters de cuivre concernent plus particulièrement des nanoclusters de cuivre recouverts à leur surface d’histidine, d’ions acétate et d’ions ascorbate. [0066] Propriétés spectrophotométriques
Les propriétés spectrophotométriques des nanoclusters de cuivre ont été évaluées par spectroscopie UV-Visible et par spectroscopie de fluorescence.
Les résultats obtenus pour la spectroscopie UV-Visible sont illustrés à la figure 8. On constate qu’il existe un épaulement sur le spectre UV-vis à 325 ± 10 nm qui confirme l’existence des nanoclusters.
Les résultats obtenus pour la spectroscopie par fluorescence sont illustrés à la figure 9. Une fluorescence des nanoclusters de cuivre existe avec une longueur d’onde d’excitation et d’émission respectivement de 380 ± 15 nm et 460 ± 15 nm qui confirme l’existence des nanoclusters.
Les nanoclusters de cuivre de l’invention présentent des propriétés optiques, en particulier de fluorescence, caractéristiques de cette échelle intermédiaire entre la molécule et la nanoparticule.
[0067] Stabilité des nanoclusters de cuiyre
La stabilité des nanoclusters de cuivre CuNC@HisAc a été évaluée en diffusion dynamique de la lumière (angle 173°, laser 530 nm, température 25°C sur Nanosizer Malvern).
Les analyses ont été effectuées sur les échantillons obtenus à l’issue du protocole en solution et à l’issue du protocole en phase solide.
Plus particulièrement, concernant le protocole en solution, les analyses ont été effectuées sur les solutions de nanoclusters de cuivre 1x, 2x et 4x.
Concernant le protocole en phase solide, les analyses ont été effectuées sur les échantillons lyophilisés et sur les solutions reconstituées après lyophilisation, conservés ou non sous azote. La stabilité des nanoclusters est préservée en environnement exempt de dioxygène.
Les résultats ne sont pas les mêmes selon que les nanoclusters de cuivre sont conservés sous forme liquide ou sous forme solide.
Pour le protocole de synthèse en solution on observe une stabilité des nanoclusters de cuivre en solution allant jusqu’à :
- 140 jours pour les nanoclusters de cuivre préparés à partir d’une solution d’acétate de cuivre 1x et 2x ;
- 40 jours pour les nanoclusters de cuivre préparés à partir d’une solution d’acétate de cuivre 4x.
Pour le protocole de synthèse en phase solide on observe une stabilité des nanoclusters de cuivre lyophilisés d’au moins 12 mois pour une conservation sous azote à 4°C. La mesure du diamètre hydrodynamique des nanoclusters de cuivre à 12 mois de conservation est de 1 ,6 nm. [0068] Exemple 3
[0069] Essais in vivo chez la souris
[0070] Généralités
Des essais in vivo ont été effectués sur le modèle ATP7A-Mobl° de souris, qui possède une mutation spontanée du gène de la Maladie de Menkes, le gène ATP7A codant pour l’ATPase 7A. Le gène de la maladie de Menkes est porté par le chromosome X. Les femelles hétérozygotes sont viables et fertiles. Les mâles quant à eux, sont soit sains (chromosome X normal, i.e. allèle sauvage) soit hémizygotes (porteur de la mutation sur le chromosome X) et donc atteints de la maladie de Menkes. La majorité des animaux hémizygotes possèdent un taux de réticulation défectueux pour l’élastine et également un déficit en collagène, ce qui explique des ruptures précoces d’anévrisme aortique et un emphysème pulmonaire, ce qui entraîne une mortalité vers l’âge de 5 semaines de vie. L’absorption du cuivre dans les intestins est réduite de 64% et la concentration du cuivre dans le foie est réduite de 56%. Les mâles possèdent également un déficit en noradrénaline au niveau cérébral, ce qui est causé par le déficit en dopamine-beta-hydroxylase cérébrale, qui est une enzyme cupro-dépendante.
Les femelles hétérozygotes ont un phénotype modéré avec des tâches hypopigmentées irrégulières sur le pelage avec une alternance de zones sombres et de zones claires. Elles possèdent un métabolisme et un comportement normaux, et sont donc capables de se reproduire.
Les mâles sains possèdent un pelage noir tandis que les mâles hémizygotes possèdent un pelage clair, sans tâche. De plus, ces derniers ont un faible poids, sont généralement petits et possèdent parfois des membres postérieurs déformés.
[0071 ] Tests effectués
Les solutions de nanoclusters de cuivre 1x, 2x et 4x telles qu’obtenus à l’exemple 1 (protocole solution) ont été respectivement injectées aux souris mâles par piqûre sous- cutanée au niveau de la nuque. 5 groupes d’animaux âgés de 5 semaines (définis ci- dessous) ont été étudiés.
1/ Groupe WT : les souris sauvages (« Wild Type ») (mâles sains), qui ne possèdent pas de mutation sur le gène ATP7A au niveau du chromosome X, ont été traitées au démarrage du protocole dans le but d’évaluer une éventuelle toxicité de l’excipient utilisé pour administrer le nanocluster de cuivre.
2/ Groupe HE NT : les souris hémizygotes (HE), qui possèdent une mutation du gène ATP7A présent sur le chromosome X, ne sont pas traitées, elles servent de contrôle.
3/ Groupe HE 1x : les souris hémizygotes sont traitées avec une solution de nanoclusters de cuivre (dose initiale : 1 x), qui a été administrée 3 jours par semaine. 4/ Groupe HE 2x : les souris hémizygotes sont traitées avec une solution de nanoclusters de cuivre 2x (dose 1x doublée), qui a été administrée 3 jours par semaine.
5/ Groupe HE 4x : les souris hémizygotes sont traitées avec une solution de nanoclusters de cuivre 4x (dose 1x quadruplée), qui a été administrée soit 3 jours, soit 5 jours par semaine.
[0072] Dosage du cuiyre cérébral chez les souris hémizyqotes
Les résultats obtenus quant à la concentration de cuivre cérébral sont illustrés à la figure 10. On entend par « cuivre cérébral » le cuivre dosé sur un homogénat de cerveau entier. Le cuivre est mesuré par spectrométrie d’absorption atomique (PinAAcle 900T Atomic Absorption Spectrometer, Perkin Elmer). Il ressort de cette figure que la concentration du cuivre cérébral est corrélée à la posologie des nanoclusters administrée chez les animaux. La concentration de cuivre cérébral augmente avec l’augmentation de la posologie. Les souris traitées à la dose 4x, 5 jours par semaine présentent une concentration en cuivre cérébral bien plus importante que celles traitées à la dose 4x mais 3 jours par semaine.
[0073] Espérance de vie des souris hémizyqotes
Les résultats obtenus sur la survie des souris hémizygotes sont illustrés à la figure 11 . Les animaux non traités ou traités à des doses faibles (1x et 2x) ont une durée de vie qui ne dépasse pas les 45 jours alors que les animaux traités à la dose 4x, 3 jours ou 5 jours par semaine ont une durée de vie très améliorée, puisque la majorité de ces animaux sont toujours vivant à plus de 100 jours de vie. Par ailleurs, aucune réaction adverse n’a été observée chez les souris, y compris avec le groupe traité avec la dose 4x. Aucune anomalie tissulaire n’a été observée sur les tissus étudiés après la mise à mort des animaux.
[0074] Analyse de la motricité des souris hémizyqotes
Une différence de l’activité motrice des animaux a été observée entre les souris sauvages et les souris hémizygotes. Au cours du vieillissement, les souris hémizygotes non traitées ont une diminution notable de leur activité globale (diminution de l’activité motrice, atonie, impossibilité de se dresser...). En effet, les souris éprouvent une certaine difficulté à se déplacer et à se nourrir. Ceci se traduit par une difficulté à atteindre la mangeoire avec une impossibilité à se redresser comme le font les souris sauvages.
Lorsque les souris hémizygotes ont été traitées avec la solution de nanoclusters de cuivre à la dose 1x, une diminution progressive de l’activité est observée, entraînant ainsi une dominance des animaux sauvages. Dans ce cas, les souris hémizygotes sont prostrées dans un coin et ne se déplacent plus.
A contrario, dans le groupe des souris hémizygotes traitées avec la solution de nanoclusters de cuivre à la dose 4x, on observe une amélioration importante de l’activité globale. Les souris traitées à la dose 4x se redressent et sautent plus facilement. Cela démontre une amélioration de la forme physique des souris traitées avec une solution de nanoclusters de cuivre à la dose 4x.
[0075] Analyse de la pigmentation du poil par microscopie optique
Le poil est un bon indicateur de l’état métabolique des souris. La pigmentation du poil, qui est un aspect fortement observable chez les souris hémizygotes, est analysée dans ce qui suit. Chez les souris hémizygotes traitées avec une solution de nanoclusters de cuivre à la dose 4x, on observe au microscope optique sur les poils une alternance de zones sombres et de zones claires, ce qui pourrait correspondre à la périodicité des injections effectuées précédemment. En effet, l’administration de cuivre par le biais de la solution de nanoclusters de cuivre restaure la production de mélanine, car celle-ci dépend de l’activité de la tyrosinase qui est une cuproprotéine. C’est l’amélioration de cette fonction enzymatique qui est à l’origine de l’amélioration de la coloration du pelage des souris.
[0076] Marquage du cuiyre à la rhodanine : résultats préliminaires
L’étude anatomopathologique du contenu en cuivre des différents tissus, via un marquage à la rhodanine, a permis de montrer l’absence d’accumulation pathologique de cuivre dans les différents tissus étudiés (foie, rein, cerveau). Dans le but de détecter la présence ou non de cuivre dans les organes de stockage comme le foie et le rein ou dans les organes où il est nécessaire pour observer des effets notables comme le cerveau, le cuivre a été marqué à l’aide d’une coloration à la rhodanine, permettant de détecter les dépôts de cuivre au sein des tissus cibles. Cette étude permet également d’identifier une possible toxicité (au niveau du foie et des reins) en mettant en évidence des lésions histologiques de ces organes liées à la présence de cuivre dans les cellules hépatiques et/ou rénales. Ces études ont été faites chez les souris hémizygotes non traitées et traitées à la dose 2x de nanoclusters de cuivre. Les résultats observés sont illustrés aux figures 12 (rein) et 13 (foie).
L’analyse anatomopathologique du rein (figure 12) montre la présence de faibles dépôts de cuivre au niveau du rein des animaux traités à la dose 2x (figure en haut à droite) sans qu’il y ait d’aspect de toxicité tissulaire au niveau du tissu rénal (figure en bas à droite).
L’analyse anatomopathologique du foie (figure 13) montre la présence de faibles dépôts de cuivre au niveau du foie des animaux traités à la dose 2x (figure en haut à droite) sans qu’il y ait d’aspect de toxicité tissulaire au niveau du tissu hépatique (figure en bas à droite). Ces données montrent que l’on a bien une captation du cuivre par les tissus, sans entraîner de toxicité cellulaire au niveau du rein et du foie à la dose de traitement 2x.
[0077] Analyse de la chaîne respiratoire cérébrale
[0078] La respiration cellulaire est une des fonctions altérées lors d’une carence en cuivre. Il a été montré qu’un défaut d’insertion du cuivre dans la chaîne respiratoire entraîne un défaut de fonctionnalité du complexe I et du complexe IV, et également un défaut de la phosphorylation oxydative. Dans la maladie de Menkes, les zones cérébrales atteintes sont principalement les noyaux gris. De ce fait, la respiration mitochondriale a été mesurée dans le striatum de souris incluses dans l’étude (souris sauvage, hémizygotes non traitées, hémizygotes traitées à la dose 2x) grâce à un oxygraphe à haute résolution (Oroboros, O2k, Laboratoire NGERE). Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 14. On peut observer sur cette figure une nette amélioration de l’activité de la chaîne respiratoire chez la souris traitée (courbe supérieure) par rapport à la souris non traitée (courbe inférieure). Cette amélioration est particulièrement visible au niveau du complexe IV (C IV) qui comporte des protéines liées au cuivre.
L’analyse de l’activité de la chaîne respiratoire cérébrale est un index de la restauration des activités liées aux cuproprotéines cérébrales. En effet, l’activité complexe IV de la chaîne respiratoire est dépendante de la présence de cuproprotéines fonctionnelles. La restauration de l’activité de ce complexe IV (figure 14) montre donc que les nanoclusters de cuivre permettent leur pénétration dans le cerveau, et qu’ils traversent donc bien la barrière hémato-encéphalique. Le cuivre ainsi disponible est utilisable dans les neurones pour restaurer une activité enzymatique cupro-dépendante.
[0079] Conclusion
Les essais in vivo effectués chez la souris montrent que :
- le traitement à l’aide des nanoclusters de cuivre permet une amélioration de la concentration de cuivre cérébral chez les animaux traités,
- l’augmentation de la concentration de cuivre cérébral permet une amélioration de l’activité du complexe IV de la chaîne respiratoire qui est dépendant de la présence de cuivre.
Ces données démontrent que les nanoclusters de cuivre de l’invention passent la barrière hémato-encéphalique et que le cuivre est biodisponible pour restaurer les activités enzymatiques cérébrales dépendantes de la présence de cuivre. En outre l’administration des nanoclusters de cuivre participe à l’amélioration de la survie des animaux traités.
[0080] Exemple 4 : exemple comparatif
[0081 ] Préparation de nanoclusters de cuiyre à partir de chlorure de cuiyre ou de sulfate de cuivre
Les Inventeurs ont préparé des nanoclusters de cuivre en substituant l’acétate de cuivre par du chlorure de cuivre ou du sulfate de cuivre. Le protocole utilisé est le protocole en solution décrit dans l’exemple 1 , la seule différence résidant dans l’utilisation de chlorure de cuivre ou de sulfate de cuivre à la place d’acétate de cuivre.
Des solutions de chlorure de cuivre 1x ou de sulfate de cuivre 1x sont respectivement préparées pour obtenir respectivement des solutions de nanoclusters de cuivre 1x. La concentration en cuivre de chacune des solutions de nanoclusters de cuivre obtenue, éventuellement dyalisée, est de 16 pg/mL.
Les trois solutions de nanoclusters de cuivre 1x respectivement obtenues à partir d’acétate de cuivre, de chlorure de cuivre ou de sulfate de cuivre sont comparées en terme de stabilité. La stabilité a été évaluée en diffusion dynamique de la lumière comme indiqué à l’exemple 2 ci-avant. Les résultats obtenus montrent une stabilité très supérieure, en suivant l’évolution du diamètre hydrodynamique en fonction du temps, lorsque l’acétate de cuivre est utilisé comparativement au chlorure ou au sulfate de cuivre. Comme indiqué dans l’exemple 2 les nanoclusters de cuivre en solution de l’invention présentent une stabilité allant jusqu’à 140 jours alors que la stabilité des nanoclusters de cuivre en solution obtenus à partir de chlorure de cuivre n’est que de 2 jours et celle des nanoclusters de cuivre en solution obtenus à partir de sulfate de cuivre n’est que de 4 jours. En effet, en mesurant le diamètre hydrodynamique en fonction du temps, celui-ci augmente très largement (supérieur à 100 nm dès 2 jours ou dès 4 jours lorsque les nanoclusters de cuivre sont respectivement préparés à base de chlorure de cuivre ou de sulfate de cuivre) démontrant ainsi la déstabilisation des nanoclusters de cuivre.
[0082] Comparaison des nanoclusters de cuiyre de l’invention avec les clusters de cuiyre décrits dans le document CN 105 965 028
L’exemple 9 du document chinois décrit la préparation de clusters de cuivre à partir d’acétate de cuivre 0,01 mol/L, d’histidine 0,1 mol/L et d’acide ascorbique 0,1 mol/L. le protocole décrit dans cet exemple a été reproduit à l’identique par les Inventeurs. Les synthèses ont été effectuées trois fois en tout. Les mélanges liquide de clusters de cuivre obtenus à l’issue de chacune des trois synthèses sont respectivement stockés dans trois tubes à essai gradués avec bouchon à vis et sont appelés Lot 1 , Lot 2 et Lot 3.
Le diamètre hydrodynamique (Dh) des clusters de cuivre de chacun des lots a été évalué immédiatement après leur synthèse, par diffusion dynamique de la lumière (angle 173°, laser 530 nm, température 25°C sur Nanosizer Malvern). Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 15, d’où il ressort que le diamètre hydrodynamique de chacun des trois lots varie de 70 à 120 nm. De tels diamètres hydrodynamiques ne permettent pas donc de qualifier les clusters du document chinois de « nanoclusters ».
Les lots 1 à 3 ont ensuite été stockés pendant 24 heures à 4°C dans le noir. L’analyse du diamètre hydrodynamique (Dh) a été recommencée au bout de 24 h après leur synthèse. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 16. Seules deux courbes sont visibles sur cette figure car le lot 1 est superposé au lot 2. Il ressort de la figure 16 que le diamètre hydrodynamique a fortement augmenté, ce qui montre une mauvaise stabilisation des clusters et une forte tendance à l’agrégation. Cette constatation de la mauvaise stabilité et de l’agrégation s’observe d’un point de vue macroscopique dans la figure 17 au niveau des tubes dans lesquels sont stockés les clusters.
En conclusion, les particules obtenues selon le protocole du document chinois ne sont pas des nanoclusters (taille supérieure à 2 nm) et ne sont pas stables. [0083] La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant, seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée.

Claims

-26-Revendications
[Revendication 1] Nanoclusters de cuivre caractérisés en ce qu’ils :
- sont recouverts à leur surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine (His), des ions acétate (Ac) et éventuellement des ions ascorbate (Asc),
- présentent une forme sphérique,
- présentent un diamètre hydrodynamique allant de 0,6 à 2,0 nm, et de préférence de 1 ,3 nm,
- présentent un diamètre de cœur métallique allant de 0,5 à 1 ,5 nm, et de préférence de 1 ,0 nm,
- présentent une stabilité dans le temps allant de 5 à 12 semaines lorsque les nanoclusters sont sous forme liquide,
- présentent une stabilité dans le temps d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois lorsque les nanoclusters sont sous forme sèche,
- présentent des propriétés spectrophotométriques, avec un épaulement sur le spectre UV- Visible à 325 ± 10 nm et un spectre de fluorescence avec des longueurs d’onde d’excitation allant de 365 à 395 nm et des longueurs d’onde d’émission allant de 445 à 475 nm, lesdits nanoclusters de cuivre étant désignés par la formule « CuNC@HisAc » ou par la formule « CuNC@HisAcAsc ».
[Revendication 2] Nanoclusters de cuivre selon la revendication 1 , caractérisés en ce qu’ils se présentent sous forme liquide ou sous forme sèche.
[Revendication 3] Nanoclusters de cuivre selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en qu’ils présentent au moins une des caractéristiques suivantes :
- ils sont aptes à passer la barrière hémato-encéphalique,
- ils présentent une bonne biodisponibilité,
- ils sont biocompatibles,
- ils sont biodégradables,
- ils sont lyophilisables,
- ils ne sont pas toxiques pour l’organisme humain,
- ils ne s’accumulent pas dans les organes tels que le foie, la rate, les reins ou les poumons.
[Revendication 4] Procédé de préparation de nanoclusters de cuivre selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
- réaction entre de l’acétate de cuivre (II) et de l’histidine afin d’obtenir un mélange d’acétate de cuivre et d’histidine, le ratio molaire histidine/acétate de cuivre (II) étant supérieur ou égal à 50, et de préférence va de 50 à 200, - réaction entre le mélange d’acétate de cuivre et d’histidine avec de l’acide ascorbique afin d’obtenir un mélange d’acétate de cuivre, d’histidine et d’acide ascorbique, le ratio molaire acide ascorbique/acétate de cuivre (II) étant supérieur ou égal à 130, et de préférence va de 130 à 700,
- récupération des nanoclusters de cuivre recouverts à leur surface d’une couche mixte comprenant de l’histidine, des ions acétate et des ions ascorbates.
[Revendication 5] Procédé de préparation selon la revendication 4, caractérisé en ce qu’il est effectué sous gaz inerte et en ce que :
- l’acétate de cuivre est sous forme de solution et l’histidine est sous forme de poudre,
- une solution d’acétate de cuivre et d’histidine est préparée par ajout d’histidine dans la solution d’acétate de cuivre,
- la solution d’acétate de cuivre et d’histidine est ajustée à une valeur de pH allant de 11 à 13, et de préférence est de 12,
- l’acide ascorbique est sous forme de poudre,
- une solution d’acétate de cuivre, d’histidine et d’acide ascorbique est préparée par ajout d’acide ascorbique à la solution d’acétate de cuivre et d’histidine dont le pH a été ajusté aux valeurs susmentionnées,
- la solution d’acétate de cuivre, d’histidine et d’acide ascorbique est agitée pendant 2h à 6h, et de préférence 4h, à une température allant de 35°C à 45°C, et de préférence 40°C,
- une solution comprenant des nanoclusters de cuivre est obtenue à l’issue de l’étape précédente d’agitation,
- la solution qui comprend les nanoclusters de cuivre est éventuellement dialysée afin d’obtenir une solution purifiée de nanoclusters de cuivre,
- la solution qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysée, est éventuellement lyophilisée afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters de cuivre.
[Revendication 6] Procédé selon la revendication 5, caractérisé en qu’il comprend en outre au moins une caractéristique choisie parmi :
- le gaz inerte est de l’azote,
- la solution d’acétate de cuivre est préparée par ajout d’acétate de cuivre dans de l’eau ultra pure filtrée,
- la solution d’acétate de cuivre présente une concentration allant de 0,5 à 5,0 mM,
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration de la solution d’acétate de cuivre,
- le pH de la solution d’acétate de cuivre et d’histidine est ajusté à l’aide d’hydroxyde de sodium,
- la concentration d’acide ascorbique est égale à la concentration d’histidine, - la solution qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysée, présente une concentration en cuivre allant de 16 à 160 pg/mL,
- la solution qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysée, est lyophilisée afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters de cuivre.
[Revendication 7] Procédé de préparation selon la revendication 4, caractérisé en ce que :
- l’acétate de cuivre est sous forme de poudre et l’histidine est sous forme de poudre,
- un mélange pulvérulent d’acétate de cuivre et d’histidine est obtenu par mélange de chacune des poudres d’acétate de cuivre et d’histidine,
- le mélange pulvérulent d’acétate de cuivre et d’histidine est broyé jusqu’à obtention d’un mélange pulvérulent homogène en couleur,
- le mélange pulvérulent homogène d’acétate de cuivre et d’histidine est placé dans un réacteur,
- l’acide ascorbique est sous forme de poudre,
- l’acide ascorbique est ajouté dans le réacteur comprenant le mélange pulvérulent homogène d’acétate de cuivre et d’histidine,
- le mélange pulvérulent d’acétate de cuivre, d’histidine et d’acide ascorbique ainsi obtenu est mis sous agitation, puis de l’eau est ajoutée goutte à goutte dans le réacteur, ladite eau étant de l’eau ultra pure filtrée,
- le réacteur est mis sous gaz inerte et à l’abri de la lumière,
- le mélange d’acétate de cuivre, d’histidine, d’acide ascorbique et d’eau est maintenu sous agitation dans le réacteur pendant 16h à 36 h, et de préférence 24h,
- un mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre est obtenu à l’issue de l’étape précédente d’agitation,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre est éventuellement dialysé afin d’obtenir un mélange liquide purifié de nanoclusters de cuivre,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysé, est éventuellement lyophilisé afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters de cuivre.
[Revendication 8] Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu’il comprend en outre au moins une caractéristique choisie parmi :
- la concentration d’histidine est supérieure à la concentration d’acétate de cuivre,
- la concentration d’acide ascorbique est égale à la concentration d’histidine,
- l’eau ajoutée dans le réacteur est de l’eau ultra pure filtrée,
- le gaz inerte est de l’azote,
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysé, présente une concentration en cuivre allant de 1600 à 4000 pg/mL, -29-
- le mélange liquide qui comprend les nanoclusters de cuivre, éventuellement dialysé, est lyophilisé afin d’obtenir une forme sèche de nanoclusters de cuivre.
[Revendication 9] Procédé selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la forme sèche de nanoclusters de cuivre est conservée sous azote, de préférence dans des flacons, et de préférence à 4°C, ladite poudre pouvant être conservée pendant une durée d’au moins 12 mois, et de préférence de 12 à 18 mois, sans altération de la stabilité des nanoclusters de cuivre.
[Revendication 10] Nanoclusters de cuivre tels que définis à l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou obtenus selon le procédé de l’une quelconque des revendications 4 à 9, pour une utilisation comme médicament.
[Revendication 11] Nanoclusters de cuivre tels que définis à l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou obtenus selon le procédé de l’une quelconque des revendications 4 à 9, pour une utilisation dans le traitement des pathologies liées à un déficit en cuivre.
[Revendication 12] Nanoclusters de cuivre pour une utilisation selon la revendication 11 , caractérisés en ce que la pathologie liée à un déficit en cuivre est la maladie de Menkès.
[Revendication 13] Nanoclusters de cuivre pour une utilisation selon la revendication 12, caractérisés en ce qu’ils sont sous une forme adaptée à une administration par voie sous cutanée, une fois par jour.
[Revendication 14] Nanoclusters de cuivre pour une utilisation selon la revendication 12, caractérisés en ce qu’ils sont sous une forme adaptée à une administration continue via une pompe sous-cutanée.
[Revendication 15] Nanoclusters de cuivre pour une utilisation selon la revendication 12, caractérisés ce qu’ils sont destinés à une utilisation pédiatrique.
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