EP4301331A1 - Utilisation d'exopolysaccharides de micro-algues a titre d'agents texturants - Google Patents

Utilisation d'exopolysaccharides de micro-algues a titre d'agents texturants

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Publication number
EP4301331A1
EP4301331A1 EP22708566.9A EP22708566A EP4301331A1 EP 4301331 A1 EP4301331 A1 EP 4301331A1 EP 22708566 A EP22708566 A EP 22708566A EP 4301331 A1 EP4301331 A1 EP 4301331A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
eps
exopolysaccharide
glossomastix
solutions
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22708566.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Olivier GONCALVES
Jeremy Pruvost
Anthony MASSE
Antoine DECAMP
Ian PROBERT
Clément GAIGNARD
Céline LAROCHE
Guillaume Pierre
Cédric DELATTRE
Pascal DUBESSAY
Philippe Michaud
Didier LE CERF
Luc PICTON
Virginie Dulong
Christophe Rihouey
Thierry MAUGARD
Ingrid ARNAUDIN
Nicolas BRIDIAU
Claire TOUCHETEAU
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Rouen
La Rochelle Universite
Universite Clermont Auvergne
Sorbonne Universite
Nantes Université
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Rouen
Universite de Nantes
Universite Clermont Auvergne
Sorbonne Universite
Universite de la Rochelle
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Rouen, Universite de Nantes, Universite Clermont Auvergne, Sorbonne Universite, Universite de la Rochelle filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4301331A1 publication Critical patent/EP4301331A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9706—Algae
    • A61K8/9711—Phaeophycota or Phaeophyta [brown algae], e.g. Fucus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/48—Thickener, Thickening system

Definitions

  • the present invention relates to the field of rheology agents for dispersions, in particular aqueous dispersions in the food or cosmetics fields.
  • Alginates are derived from seaweed and are used as thickeners, gelling agents, emulsifiers and stabilizers in the most varied industrial products, from food jellies, beauty products, to paints and printing inks. In the food industry, they are used in particular as texturizing agents to reconstruct foods by forming hard and thermostable gels, or to provide a creamy texture to foods.
  • the suspensory or anti-settling control of liquid formulations generally requires the addition of viscosity agents (not very effective) and/or gelling agents.
  • the alginates and the viscosifying and gelling agents conventionally used have shear-thinning properties but they have a high viscosity or elastic modulus and a high threshold stress.
  • the control of the suspension or the settling exerted by these agents inevitably leads to a texturing of the formula which generally remains too important even under shear and which thus sometimes appears not compatible with the specific specifications of certain formulations for which it is advisable to have low viscosities under low stresses (organoleptic properties for example).
  • Fluid gels are solutions that exhibit low modulus elastic gel behavior, flowing with high shear fluidity under the action of very low stress. These fluid gel properties can advantageously be used to stabilize the dispersions.
  • WO 2015/004403 describes the production of exopolysaccharides obtained from microorganisms such as microalgae.
  • the micro-algae belonging to the genus Glossomastix can produce one or more polysaccharide(s) which exhibit(s) original rheological properties of the fluid gel (or fragile gel) type.
  • the present invention relates to the use of an exopolysaccharide or mixture of exopolysaccharides derived from the microalgae belonging to the genus Glossomastix. as a texturizing agent.
  • micro-algae refers to microscopic algae, sometimes called microphytes.
  • the microalgae belong to the genus Glossomastix, and more particularly to the species Glossomastix sp. RCC 3688 and Glossomastix sp. RCC 3707, deposited at the Collection de Cultures de Roscoff (RCC).
  • exopolysaccharides of the invention are derived from the following strains:
  • Glossomastix sp. RCC3688 strain deposited at the Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) international depositary authority on December 9, 2020 under number CCAP 2912/2.
  • texturizing agent is understood to mean an agent which, when it is added to a dispersion, makes it possible to stabilize the dispersions. According to one embodiment, this property is achieved when said texturizing agent has fluid gel properties, when it is in aqueous solution.
  • fluid gel is meant a solution which exhibits elastic gel behavior with a low modulus (typically less than 10 Pa) but which flows with high shear fluidity under the action of a very low stress (typically less than 1 Pa) .
  • the fluid gel properties of the exopolysaccharides according to the invention make it possible to control the settling or the creaming of suspensions or emulsions without altering the properties of low viscosities under low stresses.
  • exopolysaccharides make it possible to stabilize dispersions by the formation of a three-dimensional network of physical origin and therefore reversible of polymer chain in the absence of any constraint. Under the action of a weak stress, the system flows in a non-Newtonian and shear-thinning way.
  • the exopolysaccharides according to the invention make it possible to obtain these fluid gel properties, whereas several additives are generally necessary.
  • solutions of these polysaccharides are very strongly shear-thinning even at low concentration, and have relatively low threshold stresses, typically less than 1 Pa up to 10 gL 1 in exopolysaccharides.
  • the dispersions according to the invention typically have a concentration of between 0.1 and 50 g/L in exopolysaccharides, and/or a threshold stress of between 10 ⁇ 2 and 10 Pa.
  • the solution exhibits a gel-like behavior (G'>G”) but with very low modulus values (typically depending on the polysaccharide concentration). Above this threshold stress, the behavior of the solution is of the viscous type (G' ⁇ G").
  • This fluid gel type behavior can be used to stabilize dispersions (solid/liquid/air in an aqueous solution) without significantly affecting the rheological behavior of the dispersion.
  • these 'fluid gel' type solutions behave - at rest as a very low modulus gel which can block or considerably slow down the settling or creaming of suspensions or emulsions for example
  • the system is therefore a shear-thinning liquid with very low gel properties under very low stress.
  • fluid gel-like behavior is obtained for exopolysaccharides from the aforementioned Glossomastix while other microalgae produce polysaccharides that do not exhibit fluid gel-like behavior but rather more classic solution behavior comparable to that of polysaccharides extracted from macro-algae such as alginates.
  • the fluid gel properties are therefore specific to the producing microalgae.
  • exopolysaccharides designates the polysaccharides secreted by the micro-algae in the extracellular medium, the polysaccharides being defined as polymers of oses of the family of carbohydrates consisting of several oses linked together by osidic bonds.
  • the exopolysaccharides which can be used according to the invention are native exopolysaccharides.
  • the exopolysaccharides generally have a molecular weight greater than 100 kDa, typically between 1,000,000 Da and several million Da, in particular 10 9 Da.
  • Osidic composition characterizing a galacturono-rhamno-fucan (11% galacturonic acid, 20% rhamnose, 56% fucose), also having in smaller proportions: glucuronic acid (11%) and galactose (2%).
  • Osidic composition characterizing a galacturono-rhamno-fucan (19% galacturonic acid, 27% rhamnose, 44% fucose), also having in smaller proportions: glucuronic acid (6%) and galactose (4%).
  • said exopolysaccharide therefore has a galacturono-rhamno-fucan type structure
  • the exopolysaccharide has an osidic composition characterizing a galacturono-rhamno-fucan with contents for the various sugars of between 40 and 60% fucose, between 20 and 30% rhamnose and between 10 and 20% galacturonic acid .
  • CCAP International depositary authority Culture Collection of Algae and Protozoa
  • a strain is defined here as a low-level taxonomic rank representing a subtype of microalgae.
  • the exopolysaccharides according to the invention can be obtained in the following way:
  • the microalgae culture medium is an enriched F/2 culture medium.
  • the composition of the enriched F/2 medium is based on that of the F/2 medium described by Guillard and Ryther (Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Flustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239 , 1962), with increased levels of nitrogen and phosphorus sources.
  • the culture conditions include culture in Erlen or airlift, at ambient temperature (for example approximately at 20° C.), under irradiance between 40 and 300 pmolphotons/m 2 /s with a day/night cycle or continuous illumination, under agitation between 0 and 120 rpm, more particularly in airlift without agitation, in an Erlenmeyer flask.
  • exopolysaccharides are excreted by microalgae, they are present in culture media. Their separation can be carried out by collecting culture supernatants in which they are soluble after centrifugation.
  • This collection therefore generally does not require any intracellular extraction step. This has the advantage of reducing the cost of obtaining the raw material.
  • the supernatants are then treated by tangential ultrafiltration by series of dilution concentrations (membrane with a cut-off threshold of 50 kDa).
  • the dilution concentration cycles are carried out until a stable conductivity is obtained (close to 2 pS.cnr 1 in the permeate) in order to eliminate the salts and molecules of low molar mass from the culture medium, then freezing and drying , for example by freeze-drying.
  • the process for obtaining exopolysaccharides comprises the step of obtaining the exopolysaccharide from the micro-algae by:
  • the present invention also relates to a liquid formulation comprising an exopolysaccharide as defined above.
  • said formulation may be a concentrated aqueous solution (10 to 50 g/L) of said exopolysaccharide, of the fluid gel type.
  • Said formulation can be obtained by dissolving the exopolysaccharide in water. It can advantageously be used as a texturizing additive to stabilize dispersions.
  • said formulation may be a dispersion of particles or nanoparticles, comprising said exopolysaccharide at a lower concentration (in particular from 0.01 to 5 g/L, particularly from 0.1 to 5 g/L).
  • said dispersion is a stable aqueous dispersion, chosen in particular from aqueous emulsions or aqueous suspensions.
  • composition refers to any heterogeneous mixture of two liquids or of a solid in a liquid.
  • emulsions Two types of dispersion can thus be distinguished: emulsions and dispersions.
  • emulsion is meant a heterogeneous mixture of two immiscible liquid substances, one being dispersed in the form of small droplets in the other.
  • suspension is meant a mixture in which a finely divided product is combined with a liquid, and in which it is insoluble.
  • the present invention therefore also relates to a method for stabilizing an aqueous dispersion comprising the aforementioned.
  • Stabilization is understood here to mean the inhibition or delay of settling or creaming in particular.
  • Said dispersions may in particular be dispersions in the cosmetics and agri-food fields:
  • Figure 1 represents the viscosity of alginate (filled and empty triangles) and of EPS-Pav (filled and empty circles) at 20 gL -1 between 0.1 and 1000 s -1 .
  • Figure 2 represents the elastic and viscous moduli of Alginate (solid G' and G” empty triangles) and EPS-Pav (solid G' and G” empty circles) at 20 gL -1 between 0.1 and 10 Hz .
  • Figure 3 represents the viscosity of EPS-3707 (forward curves: filled symbols; return curves: empty symbols). 20 gL -1 , 10 gL -1 ⁇ , 5 gL -1 ⁇ , 1 gL 1 ⁇ and 0.5 gL 1 x.
  • Figure 4 represents the elastic and viscous moduli of EPS-3707 (solid symbols G' and empty symbols G”) between 0.001 and 10Hz. 20 gL -1 , 10 gL -1 ⁇ , 5 gL -1
  • Figure 5 represents the viscosity of EPS-3688 (forward curves: filled symbols; return curves: empty symbols) between 0.1 and 1000 s -1 , 20 gL 1 ⁇ , 10 gL 1 ⁇ , 5 gL 1 ⁇ , 1 gL 1 ⁇ and 0.5 gL 1 x.
  • Figure 6 represents the elastic and viscous moduli of EPS-3688 (solid symbols G' and empty symbols G”) between 0.01 and 10 Hz; 20 gL -1 , 10 gL -1 ⁇ , 5 gL -1
  • Figure 7 shows the complex viscosity of EPS-3707 solutions in water at 20 gL 1 , 10 gL -1 ⁇ , 5 gL -1 ⁇ and 1 gL -1 ⁇ compared to EPS-Pav20 gL -1 (+) and alginate 20 gL -1 (*).
  • Figure 8 shows the complex viscosity of EPS-3688 solutions in water at 20 gL 1 , 10 gL -1 ⁇ , 5 gL -1 ⁇ , 1 gL -1 ⁇ and 0.5 gL -1 x per compared to EPS-Pav20 gL- 1 (+) and alginate 20 gL ⁇ 1 (*).
  • Figure 9 illustrates shear fluidity (viscosity as a function of shear gradient): effect of salinity on the viscosity of ESP-3707 solutions (outward curves: solid symbols; return curves: empty symbols; NaCI 0.15 M: round water: triangles), 20 gL -1 (red), 10 gL 1 (blue), 5 gL 1 (green), 1 gL 1 (black) and 0.5 gL 1 (pink).
  • Figure 10 illustrates the effect of the nature of the salt on the viscosity of the solutions of EPS-3707 at 1 gL 1 in water, KSCN 1 M and NaCI 1 M (outward curves: solid symbols; return curves: empty symbols)
  • Figure 11 illustrates the effect of salinity on oscillation measurements.
  • Left axis elastic (full circle) and viscous (empty circle) modules
  • right axis complex viscosity (triangle) as a function of the frequency of EPS-3707 1 gL -1 in water and NaCl at 0.05; 0.15; 0.5 and 1 M.
  • Figure 16 illustrates the comparison between SLB of EPS solutions at 1 gL -1 in water at 25°C, 37°C and 60°C.
  • Figure 15 illustrates the percentage transmission with aging time of microcrystalline cellulose suspensions at two different tube heights (dotted line: bottom of tube, 2 cm) (full line: top of tube, 5.5 cm) .
  • Figure 16 illustrates the percent transmission with aging time of the 00 emulsions at two different tube heights (dotted line: bottom of tube, 2 cm) (full line: top of tube, 5.5 cm).
  • Alginate (ALG) (with a mannuronate/sodium glucuronate ratio of 1.2) was supplied by Cargill (France)
  • Glossomastix sp. (Strains RCC3688 and RCC3707 cited above) placed in the Pinguiophyceae, are golden microalgae isolated from St Margaret's Bay (UK);
  • Pavlova strain 3438 placed in the Pavlovophyceae is a microalgae isolated from the Black Sea in Varna in Bulgaria. 1 .2 Production of EPS
  • Glossomastix sp. RCC3688 was cultured in Erlen or airlift with an F/2 medium (enriched or not), at 20°C under irradiance between 40 and 300 pmolphotons/m 2 /s with a day/night cycle or continuous illumination with shaking between 0 and 120 rpm.
  • the Glossomastix sp. (RCC3707) is grown in airlift condition in bottles (2 to 5 L) to compensate for its sensitivity to mechanical agitation.
  • the airlift cultures are equipped with a cylindrical air diffuser connected to a network of compressed air sterilized by filtration (0.22 ⁇ m).
  • the cultures are carried out at 20° C. (air-conditioned room) and illuminated by neon lights providing an irradiance of 40 pmol photons. nr 2 .s 1 .
  • the strain is cultured in batch mode and in photoautotrophy with a day/night cycle of 16 h/8 h.
  • the 2 and 5 L batch cultures are produced in “enriched F/2” medium and inoculated respectively with 200 and 500 mL of inoculum in the exponential phase.
  • composition of the enriched F/2 medium is the same as that of the F/2 medium described by Guillard and Ryther (Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229- 239, 1962), except for the contents of nitrogen and phosphorus sources which have been increased.
  • the F/2 medium developed by Guillard and Ryther (1962) is a standard culture medium for the culture of microalgae. It consists for 1 L of artificial sea water of: 100 pL of a 10X solution of microelements, 100 pL of a 10X vitamin solution, 0.0075 g of NaNÜ3 and 0.00055 g of NaH 2 P0 4 .2H 2 0.
  • the “modified F/2” medium has the same composition as the F/2 medium, with the exception of the concentrations of NaNÜ3 (1 gL ⁇ 1 ) and NaFI 2 P0 4 .2FI 2 0 (0.2 gL ⁇ 1 ).
  • the new concentrations of this culture medium were determined by Villay et al. (2013) Bioresource Technology, 146, 732-735 by a stoichiometric analysis of the composition of the medium and comparison with the average molar composition of the microalgae determined by Pruvost & Cornet. C. Posten, C. Walter (Eds.), Microalgal biotechnology, “potential and production”, Walter De Gruyter GmbH and Co KG, Germany (2012). These concentrations were determined in order to reach a biomass concentration of 1 gL -1 .
  • the “enriched F/2” medium has the same composition as the F/2 medium but where the concentrations of NaNÜ3 and NaH 2 P0 4 .2H 2 0 are respectively equal to 1.7 and 0.55 gL ⁇ 1 , respectively. These concentrations were determined with the same method as that used for the “modified F/2” medium, with the objective of achieving a biomass concentration of 2 gL 1 .
  • the enriched F/2 medium that was used is composed for 1 L of artificial seawater of:
  • composition of the artificial sea water used is:
  • the solution of microelements consists of: - Na 2 EDTA 4.16 g
  • the vitamin stock solution consists of: - Cyanocobalamin (Vitamin B I2 ) 0.0005 g
  • the aforementioned Pavlova RCC3438 strain was cultured in a 1.4 L toric PBR, at 20° C., under a continuous irradiance of 150 pmolphotons/m 2 /s and stirring at 100 rpm, with an enriched F/2 medium.
  • the pH was regulated by modifying the C0 2 level in the injected air (gas flow rate of 200 mL/min, with a C0 2 level of 0.5 to 3%).
  • the rheological measurements were carried out with the AR2000 rheometer (TA Instrument, UK), using a standard size double air gap concentric cylinder geometry (aluminum, air gap 500 ⁇ m) except for the highest concentration for which a cone/plane geometry ( diameter 4cm; angle 2°; air gap 57pm) was used. All measurements were performed with a solvent trap to avoid evaporation. Flow procedures were performed at 25°C from 0.1 to 1000 s 1 (for 10 min) and from 1000 to 0.1 s 1 (for 10 min) at various concentrations in water or NaCl medium. (0.05 to 1 M) (with 200 ppm sodium azide to avoid bacteriological degradation). Oscillation procedures were performed at 25°C, 37°C or 60°C.
  • the linearity domain of each EPS solution was determined before performing the frequency sweeps (from 0.001 or 0.01 to 10 Hz).
  • the stress limit value (Oi im ) of the linearity domain was determined graphically.
  • the Hershel-Bulkley model was applied to the flow curves to determine the threshold stress of the EPS solution.
  • the viscoelastic properties of the EPS solutions were also evaluated non-destructively (without mechanical stress) using the Rheolaser Master® from Formulaction (France).
  • This technique is based on a dynamic light scattering technique called Scattering Wave Spectroscopy (DWS).
  • DWS Scattering Wave Spectroscopy
  • a video camera is used as a detector of the backscattered waves to display an interference image called "Speckle". The dark and bright spots on the image obtained result from respectively destructive and constructive interference between the backscattered waves.
  • the Brownian motion of objects depends on the viscoelastic structure of the sample, therefore, the speed of intensity fluctuations on the interference image is also different.
  • the strain rate of the speckle pattern makes it possible to characterize the structural properties of the samples studied.
  • a decorrelation function is used and the mean square displacement (MSD) of the product scatterers is obtained from the decorrelation curve, reflecting the average area explored by the particles at a given decorrelation time. From the MSD curve as a function of the decorrelation time, a lot of information is obtained and parameters such as the elasticity index (El) and the solid-liquid balance (SLB) are determined.
  • the EI is determined as the inverse of the plate height value, and is proportional to the elastic modulus G' at the plate.
  • El gives information on the evolution of the elasticity of the product with time and is calculated automatically between 2.5 ms and 1.5 s of decorrelation.
  • SLB is characteristic of the ratio between the solid-like behavior and the liquid-like behavior of the product. SLB values change in the same way as tan d (ratio of G" to G') obtained in rheology in oscillation mode. SLB is obtained by the value of the slope (in logarithmic scale) at the elastic plateau of the MSD curve. More the sample is “elastic/solid”, the lower the SLB value (0 ⁇ SLS ⁇ 0.5) The higher the value, the more viscous/liquid the sample (0.5 ⁇ SLB ⁇ 1).
  • alginate and EPS analyzes of Glossomastix, RCC3707 and Pavlova sp.
  • RCC3438 were dissolved in 25 mL of water (containing 200 ppm sodium azide) at 0.1, 0.5, 0.75 or 1 gL -1 .
  • 200 ⁇ L of latex particle solution (10% v/v, latex particle size 1 ⁇ m) was added to the polysaccharide solutions and the Brownian motion of the latex particles was studied.
  • the measurements were carried out three times at 25, 37 or 60°C for 2 hours. All data are analyzed with RheoSoft Master v1.4.0.0 software.
  • the results (El and SLB) are given as the average of three measurements.
  • Turbiscan® Classic MA2000 is an optical analyzer from Formulaction, France. This technique is based on the variation of backscattered or transmitted light signals. Backscatter (BS) and transmitted (T) intensities are measured as a function of sample height and aging time. The size of the tube is 6 cm in height. For the analyses, we determined the percentage of transmission at the bottom of the tube (2 cm) and at the top of the tube (5.5 cm) as a function of aging time. If the percentage of transmission increases and reaches a value close to 100%, this means that settling or creaming occurs with or without flocculation or coalescence.
  • BS Backscatter
  • T transmitted
  • microcrystalline cellulose suspensions ACROS, France, average particle size 90 ⁇ m
  • EPS-Pav Pavlova EPS suspensions
  • orange oil emulsions (Sigma, France) in EPS solutions was also studied.
  • An orange (00) oil emulsion was prepared as follows: 2.5 mL of 00 was added to 22.5 mL of water (the water/oil ratio was 90/10 (V/V )) and homogenized with the Ultra-Turrax homogenizer (T18 Basic, IKA, France) for 5 min at speed 3 (11,000 rpm) (Table 1a).
  • the stability of the 00 emulsions in pure water was checked by size measurements (Mastersizer 3000, Malvern, USA) and the size of the oil droplets (3 ⁇ m ⁇ 0.5) is stable for 15 min.
  • emulsion 00 was quickly added to 5 mL of EPS solutions (at various concentrations) and rapidly homogenized by inverting the tube three times to obtain 6 mL of emulsion 00 in EPS solutions.
  • Tables 1 and 1 bis show the different dispersions (the final concentration of the EPS solutions is given taking into account the dilution due to the mixing of 1 mL of emulsion 00 in 5 mL of EPS solution) and the time and the frequency of analyzes with the Turbiscan®.
  • EPS-Pav emulsions have not been tested because this polysaccharide gives cloudy solutions and is not compatible with optical analysis.
  • EPS solutions in water or in a saline medium have been studied by rheology in flow experiments leading to viscosity properties; or in oscillation experiments to analyze viscoelastic properties.
  • the rheological behavior of EPS solutions was then compared to alginate, a polysaccharide derived from macroalgae.
  • the EPS solutions of Pavlova sp. RCC3438(EPS-Pav) were analyzed by flow experiments between 0.1 and 1000 s 1 at 20 gL -1 in water ( Figure 1).
  • the thixotropic character was also evaluated by a second step of 1000 at 0.1 s 1 .
  • the EPS-Pav solution exhibits viscous, non-Newtonian, and weakly shear-thinning behavior.
  • the EPS-Pav solution has a lower viscosity ho: 0.018 Pa.s for the EPS-Pav and 0.27 Pa.s for the alginate (the Cross model is used to determine ho).
  • the EPS-3688 and EPS-3707 solutions behave like weak gels even at low concentration (1 gL -1 ) with a low threshold stress and low viscoelastic moduli.
  • both EPS-3707 and EPS-3688 lead to weak gels with dynamics of the same order of magnitude.
  • the relaxation time tr, or disentanglement time is 85 s for the EPS-3707 solution with an elastic modulus of 0.02 Pa and about 50 s for the EPS-3688 solution with an elastic modulus of 0.03 Pa.
  • the EPS-3688 solution has slower dynamics compared to the EPS-3707 solution.
  • the relaxation time is about ten times higher.
  • the complex viscosities of EPS solutions in water are compared to alginate and EPS-Pav solutions in Figure 7 (EPS-3707) and Figure 8 (EPS-3688).
  • EPS-3707 alginate and EPS-Pav solutions in Figure 7
  • EPS-3688 Figure 8
  • a strong variation in complex viscosity is also observed over the entire frequency range, whereas for alginate or EPS-Pav solutions, the complex viscosity varies very little.
  • EPS solutions were prepared in NaCI medium, a lyotropic salt (strengthening hydrophobic interactions) or KSCN, a chaotropic salt (weakening hydrophobic interactions) at different concentrations to study the impact of salinity on the rheology of the solutions.
  • the flow curves of EPS-3707 solutions in 0.15 M NaCl are compared to the flow curves in water in Figure 9.
  • the forward (solid symbol) and return (empty symbol) curves are plotted to show the slight thixotropy.
  • the viscosity of the saline solutions is increased compared to the solutions in water except for the 1 gL -1 solution for which the viscosity in 0.15 M NaCl is slightly reduced compared to the viscosity in water.
  • the presence of NaCl leads to the screening of the charges present on the polysaccharides with a reduction in electrostatic interactions and a possible increase in hydrophobic interactions causing a gain in viscosity.
  • Another effect of the presence of NaCl can be observed on the EPS-3707 solution at 20 gL -1 : the thixotropy disappears (the forward and reverse curves are superimposable).
  • the effect on NaCI concentration was also studied on EPS-3707 at 1 gL -1 in 1 M, 0.5M, 0.15M and 0.05M NaCI with little impact on solution viscosities. It can be assumed that a low concentration of NaCl is sufficient to screen the charges.
  • KSCN has an effect on the thixotropy of ESP-3707 solutions. Indeed, the thixotropy of these solutions is increased compared to the solution in water.
  • the EPS 3688 study gives comparable results.
  • Table 3 gives I ⁇ I at different temperatures (25, 37 and 60°C) for each polysaccharide at 1 gL -1 in water and at different concentrations for the EPS-3688 solutions (0.75; 0.5 and 0. 1 gL -1 ).
  • This technique confirms the higher elastic character of EPS-3688 and EPS-3707 than EPS-Pav at 25°C. Indeed, the EI of EPS-3688 and EPS-3707 is greater than the EI of EPS-Pav.
  • concentration on EI was evaluated on EPS-3688 between 0.1 and 1 gL -1 in water and at each temperature. El logically decreases if the concentration decreases like the elastic modulus G'.
  • the Brownian motion of the particles depends on the viscoelastic structure of the sample and as the concentration decreases, the viscoelastic properties also decrease.
  • the increase in temperature shows a difference between the EPS solutions.
  • EPS-3707 and EPS-Pav an increase in temperature causes a slight decrease in EI while for EPS-3688, temperature has no effect on EI (except at 0 .1 gL -1 ).
  • the decrease in EI with increasing temperature seems logical because the Brownian motion of particles accelerates with temperature. But if the EI is unchanged with temperature, it seems that the interactions leading to the weak gel structure are strong enough not to be influenced by temperature.
  • the Solid Liquid Balance (SLB Balance) is obtained by the value of the slope (in logarithmic scale) at the elastic plateau of the MSD curve. If SLB ⁇ 0.5, the elastic behavior is predominant, if 0.5 ⁇ SLB ⁇ 1, the viscous behavior is predominant.
  • Figure 12 compares the SLB of all EPS at 1 gL -1 at different temperatures.
  • SLB 0.53
  • SLB EPS-Pav and alginate clearly exhibit viscous behavior
  • FIG. 13A shows an example of a graph obtained for the analysis of a suspension of microcrystalline cellulose in pure water.
  • the x axis represents the height of the analysis tube, the y axis the transmission and the aging time is represented by the different colors.
  • Figure 13B shows an example of a graph obtained for the analysis of the suspension of microcrystalline cellulose in a solution of alginate at 10 gL -1 in water and Figure 13C in a solution of EPS-3688 at 1 gL -1 in water.
  • the differences between the three examples clearly show the stability of the suspension in a solution of EPS-3688 (even at 1 gL ⁇ 1 ). In pure water, the particles settle rapidly at the bottom of the tube and the transmission at the top of the tube reaches its maximum in a few minutes.
  • the suspension of microcrystalline cellulose in a solution of EPS-3688 at 1 gL 1 is much more stable than in water and in a solution of alginate at 10 gL -1 .
  • the percentage of transmission at the bottom of the tube remains constant, only a slight increase in transmission is observed at the extreme top of the tube (the maximum value is 32% after 5 p.m.), due to the start of settling.
  • transmission increases from the start at the top of the tube (reaching 88% at 5:30 a.m.) and more slowly at the bottom of the tube (reaching 27% after 5:30 a.m.) confirming the rapid start of settling.
  • the EPS-3688 solution is a good suspension stabilizer.
  • FIG. 19A The stability of 00 emulsions with alginate (Fig. 19A), EPS-3707 (Fig. 19B) and EPS-3688 (Fig. 19C) solutions was studied using the Turbiscan® Classic MA2000 .
  • Figures 14A-B-C show a high stability of the emulsions more particularly in the EPS-3688 solution: no transmission peak is observed during the whole experiment. With EPS-3707, a small peak appears around 0.7 mm after 3 hours and in alginate it appears earlier, reflecting instability.
  • Figure 16 clearly shows the good stability of the emulsions with the EPS solutions (no transmission variation at the bottom (2 cm) or at the top of the tube (5.5 cm) throughout the time (40 h)). Whereas for emulsion 00 with the alginate solution, the percentage of transmission increases at the top of the tube from the first minutes. EPS-3707 and EPS-3688 are therefore good emulsion stabilizers.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un exopolysaccharide ou mélange d'exopolysaccharides issu(s) de micro-algue appartenant au genre Glossomastix à titre d'agent texturant.

Description

DESCRIPTION
TITRE : UTILISATION D’EXOPOLYSACCHARIDES DE MICRO-ALGUES A TITRE
D’AGENTS TEXTURANTS
La présente invention concerne le domaine des agents de rhéologie pour les dispersions, notamment les dispersions aqueuses dans les domaines alimentaires ou cosmétiques.
Les alginates sont issus des algues et sont utilisés comme épaississants, gélifiants, émulsifiants et stabilisants de produits industriels les plus variés depuis les gelées alimentaires, les produits de beauté, jusqu'aux peintures et aux encres d'imprimerie. Dans l’industrie alimentaire, ils sont notamment utilisés comme agents texturants pour reconstruire des aliments en formant des gels durs et thermostables, ou pour apporter une texture onctueuse aux aliments.
Le contrôle suspenseur ou anti-décantation (‘anti-settling’) des formulations liquides nécessite généralement l’addition d’agents de viscosité (peu efficaces) et/ou d’agents gélifiants. Les alginates et les agents viscosifiants et gélifiants classiquement utilisés présentent des propriétés rhéofluidifiantes mais ils présentent une viscosité ou un module élastique élevés et une forte contrainte seuil. Le contrôle de la suspension ou de la décantation exercé par ces agents conduit immanquablement à une texturation de la formule qui demeure généralement trop importante même sous cisaillement et qui apparaît ainsi parfois non compatible avec le cahier des charges spécifique de certaines formulations pour lesquelles il convient d’avoir de faibles viscosités sous faibles contraintes (propriétés organoleptiques par exemple).
Les gels fluides sont des solutions qui présentent un comportement de gel élastique à faible module, s’écoulant avec une forte rhéofluidité sous l’action d’une très faible contrainte. Ces propriétés de gel fluide peuvent avantageusement être mises à profit pour stabiliser les dispersions.
WO 2015/004403 décrit la production d’exopolysaccharides obtenus de micro organismes tels que des micro-algues.
Il est donc désirable de mettre à disposition de nouveaux agent texturants d’origine naturelle, présentant de telles propriétés. Il a maintenant été découvert que de façon inattendue, les micro-algues appartenant au genre Glossomastix peuvent produire un ou des polysaccharide(s) qui présente(nt) des propriétés rhéologiques originales de type gel fluide (ou gel fragile).
Selon un premier objet, la présente invention concerne l’utilisation d’un exopolysaccharide ou mélange d’exopolysaccharides issu(s) de la micro-algue appartenant au genre Glossomastix. à titre d’agent texturant.
Tel qu’utilisé ici, le terme « micro-algue » fait référence aux algues microscopiques, parfois appelées microphytes.
Selon l’invention, les micro-algues appartiennent au genre Glossomastix, et plus particulièrement aux espèces Glossomastix sp. RCC 3688 et Glossomastix sp. RCC 3707, déposées à la Collection de Cultures de Roscoff (RCC).
Plus précisément, les exopolysaccharides de l’invention sont issus des souches suivantes :
Glossomastix sp. RCC3688, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 2912/2.
Glossomastix sp. RCC3707, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 2912/1 .
Lesdites souches ont été déposées par SATT Ouest Valo, 14 C rue du Pâtis Tatelin, Métropolis 2, CS 80804, 35708 Rennes Cedex, France, le 9 décembre 2020, auprès de l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Association for Marine Science (S AMS), Scottish Marine Institute, Oban, Argyll, PA37 1QA, UK.
On entend par « agent texturant » un agent qui permet, lorsqu’il est ajouté à une dispersion de stabiliser les dispersions. Selon un mode de réalisation, cette propriété est réalisée lorsque ledit agent texturant présente des propriétés de gel fluide, lorsqu’il est en solution aqueuse. On entend par gel fluide une solution qui présente un comportement de gel élastique à faible module (typiquement inférieur à 10 Pa) mais qui s’écoule avec une forte rhéofluidité sous l’action d’une très faible contrainte (typiquement inférieure à 1 Pa).
En absence de cette contrainte, le module élastique (G’) est toujours supérieur au module visqueux (G”)· Il y a inversion entre ces deux modules à partir d’une certaine contrainte seuil faible (de l’ordre de 1 Pa ou moins selon la concentration en polysaccharide).
Avantageusement, les propriétés de gel fluide des exopolysaccharides selon l’invention permettent de contrôler la décantation ou le crémage de suspensions ou d’émulsions sans altérer les propriétés de faibles viscosités sous faibles contraintes.
Ces exopolysaccharides permettent de stabiliser des dispersions par la formation d’un réseau tridimensionnel d’origine physique et donc réversible de chaîne polymère en l’absence de toute contrainte. Sous l’action d’une faible contrainte, le système s’écoule de façon non-newtonienne et rhéofluidifiante.
A titre d’additif unique, les exopolysaccharides selon l’invention permettent d’obtenir ces propriétés de gel fluide, alors que plusieurs additifs sont généralement nécessaires.
Les solutions de ces polysaccharides sont très fortement rhéofludifiantes même à faible concentration, et présentent des contraintes seuils relativement faibles, typiquement inférieures à 1 Pa jusqu’à 10 g.L 1 en exopolysaccharides.
Ainsi, les dispersions selon l’invention présentent typiquement une concentration comprise entre 0,1 et 50 g/L en exopolysaccharides, et/ou une contrainte seuil comprise entre 10-2 et 10 Pa.
En dessous de cette contrainte, la solution présente un comportement de type gel (G’>G”) mais avec des valeurs de module très faibles (typiquement selon la concentration en polysaccharides). Au-dessus de cette contrainte seuil, le comportement de la solution est de type visqueux (G’<G”).
Ce comportement de type gel fluide peut être mis à profit pour stabiliser des dispersions (solide/liquide/air dans une solution aqueuse) sans affecter notablement le comportement rhéologique de la dispersion. En d’autres termes, ces solutions de type ‘gel fluide’ se comportent - au repos comme un gel à très faible module qui peut bloquer ou ralentir considérablement la décantation ou le crémage de suspensions ou d’émulsion par exemple
- et sous faible contrainte (> contraintes seuils) comme une solution visqueuse et très rhéofluidifiante.
Le système est donc un liquide rhéofluidifiant aux propriétés de gel très faible sous très faible contrainte.
Ce comportement atypique obtenu avec les exopolysaccharides selon l’invention peut être mis en évidence par l’étude rhéologique en écoulement et en oscillation, ainsi que par rheolaser, par application ou adaptation de la méthodologie décrite dans les exemples. Cette étude peut notamment être conduite avec des concentrations allant de 0,1 g/L à 20 g/L dans l’eau distillée ou en présence d’une force ionique (par exemple NaCI 0,1 mol/L).
De façon inattendue, le comportement de type gel fluide est obtenu pour les exopolysaccharides issus de Glossomastix précités alors que d’autres micro-algues produisent des polysaccharides qui ne présente pas de comportement de type gel fluide mais plutôt un comportement en solution plus classique comparable à celui de polysaccharides extraits de macro-algues comme les alginates. Les propriétés de gel fluide sont donc spécifiques de la micro-algue productrice.
Ce comportement de gel fluide peut être mis à profit pour la stabilisation de dispersion. Avantageusement, il a été mis en évidence que la stabilisation de la dispersion n’est possible qu’avec les polysaccharides dont la solution présente un comportement de type gel fluide sur une durée significative (supérieure à 10 heures notamment).
Au sens de l’invention, le terme « exopolysaccharides » désigne les polysaccharides secrétés par les micro-algues dans le milieu extracellualire, les polysaccharides étant définis comme des polymères d’oses de la famille des glucides constitués de plusieurs oses liés entre eux par des liaisons osidiques.
Selon un mode de réalisation, les exopolysaccharides utilisables selon l’invention sont des exopolysaccharides natifs. Typiquement, les exopolysaccharides ont généralement un poids moléculaire supérieur à 100 kDa, typiquement compris entre 1 000 000 Da et plusieurs millions de Da, notamment 109 Da.
Typiquement, ils présentent les constituants suivants :
EPS de Glossomastix sp, RCC3688 :
Composition osidique caractérisant un galacturono-rhamno-fucane (11% acide galacturonique, 20% rhamnose, 56% fucose), présentant également en moindres proportions : acide glucuronique (11%) et galactose (2%).
EPS de Glossomastix sp. RCC3707 :
Composition osidique caractérisant un galacturono-rhamno-fucane (19% acide galacturonique, 27% rhamnose, 44% fucose), présentant également en moindres proportions : acide glucuronique (6%) et galactose (4%).
Selon un mode de réalisation, ledit exopolysaccharide présente donc une structure de type galacturono-rhamno-fucane,
En particulier, l’exopolysaccharide présente une composition osidique caractérisant un galacturono-rhamno-fucane avec des teneurs pour les différents sucres compris entre 40 et 60% de fucose, entre 20 et 30% de rhamnose et entre 10 et 20% d’acide galacturonique.
On décrit aussi ici les exopolysaccharides issus de la micro-algue Pavlov a et notamment l’espèce Pavlova sp,, telle que Pavlova sp,, RCC3438 souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 940/5.
Ladite souche a été déposée par SATT Ouest Valo, 14 C rue du Pâtis Tatelin, Métropolis 2, CS 80804, 35708 Rennes Cedex, France, le 9 décembre 2020, auprès de l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Scottish Association for Marine Science (SAMS), Scottish Marine Institute, Oban, Argyll, PA37 1QA, UK.
Une souche est définie ici comme un rang taxonomique de bas niveau représentant un sous-type de micro-algue. Selon un mode de réalisation, les exopolysaccharides selon l’invention peuvent être obtenus de la façon suivante :
Typiquement, ils peuvent être obtenus par culture des micro-algues correspondantes. Cette culture peut être faite selon des méthodologies classiques, telles que par exemple en erlenmeyer, en photobioréacteur cylindrique ou torique, ou en airlift. La culture des micro-algues est maîtrisée par les industriels, permettant ainsi de générer aisément les exopolysaccharides souhaitDe préférence, le milieu de culture des micro-algues est un milieu de culture F/2 enrichi. La composition du milieu F/2 enrichi est basée sur celle du milieu F/2 décrit par Guillard et Ryther (Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Flustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239, 1962), avec des teneurs en sources d’azote et phosphore augmentées.
Un exemple représentatif de milieu F/2 enrichi est décrit dans les exemples.
Avantageusement, les conditions de culture comprennent la culture en erlen ou en airlift, à température ambiante (par exemple environ à 20°C), sous irradiance entre 40 et 300 pmolphotons/m2/s avec un cycle jour/nuit ou illumination continue, sous agitation entre 0 et 120 rpm, plus particulièrement en airlift sans agitation, en erlenmeyer.
Les exopolysaccharides étant excrétés par les micro-algues, ils sont présents dans les milieux de culture. Leur séparation peut être effectuée par collecte des surnageants de culture dans lesquels ils sont solubles après centrifugation.
Cette collecte ne requiert donc généralement aucune étape d’extraction intracellulaire. Ceci a pour avantage de réduire le coût d’obtention de la matière première.
Typiquement, les surnageants sont ensuite traités par ultrafiltration tangentielle par des séries de concentrations dilutions (membrane de seuil de coupure de 50 kDa). Les cycles de concentrations dilutions sont effectués jusqu’à obtention d’une conductivité stable (proche de 2 pS.cnr1 dans le perméat) afin d’éliminer les sels et molécules de faible masse molaire issues du milieu de culture, puis congélation et séchage, par lyophilisation par exemple.
Ainsi selon un mode de réalisation, le procédé d’obtention des exopolysaccharides comprend l’étape d’obtention de l’exopolysaccharide à partir de la micro-algue par :
- culture de ladite micro-algue,
- collecte du surnageant de culture, - ultrafiltration (concentration/dilution),
- et éventuellement lyophilisation.
Selon un autre objet, la présente invention concerne également une formulation liquide comprenant un exopolysaccharide tel que défini ci-avant.
Selon un premier mode de réalisation, ladite formulation peut être une solution aqueuse concentrée (10 à 50 g/L) dudit exopolysaccharide, de type gel fluide.
Ladite formulation peut être obtenue par mise en solution de l’exopolysaccharide dans de l’eau. Elle peut avantageusement être utilisée en tant qu’additif texturant pour stabiliser les dispersions.
Selon un autre mode de réalisation, ladite formulation peut être une dispersion de particules ou nanoparticules, comprenant ledit exopolysacharide à concentration moindre (notamment de 0.01 à 5 g/L, particulièrement de 0,1 à 5 g/L). Typiquement, il s’agit d’une dispersion obtenue par ajout d’un exopolysaccharide selon l’invention, par exemple sous forme de la solution concentrée précitée, afin de la stabiliser.
Typiquement, ladite dispersion est une dispersion aqueuse stable, choisie notamment parmi les émulsions aqueuses ou les suspensions aqueuses.
Le terme « dispersion » utilisé ici fait référence à tout mélange hétérogène de deux liquides ou d’un solide dans un liquide.
On peut ainsi distinguer deux types de dispersion : les émulsions et les dispersions.
On entend par « émulsion » un mélange hétérogène de deux substances liquides non miscibles, l'une étant dispersée sous forme de petites gouttelettes dans l'autre.
On entend par « suspension » un mélange dans lequel un produit finement divisé est combiné avec un liquide, et dans lequel il est non soluble.
Selon un autre objet, la présente invention concerne donc également un procédé de stabilisation d’une dispersion aqueuse comprenant le précitée.
On entend ici par stabilisation, l’inhibition ou le retardement de la décantation ou du crémage notamment. Lesdites dispersions peuvent être notamment des dispersions dans les domaines cosmétique et agroalimentaire:
Figures :
[Fig. 1] La Figure 1 représente la viscosité de l'alginate (triangles pleins et vides) et de l'EPS-Pav(cercles pleins et vides) à 20 g.L-1 entre 0,1 et 1000 s-1 .
[Fig. 2] La Figure 2 représente les modules élastiques et visqueux d'Alginate (triangles G’ pleins et G” vides) et EPS-Pav (cercles G’ pleins et G” vides) à 20 g.L-1 entre 0,1 et 10 Hz.
[Fig. 3] La Figure 3 représente la viscosité de l'EPS-3707 (courbes aller : symboles pleins ; courbes retour : symboles vides). 20 g.L-1 ·, 10 g.L-1 ¨, 5 g.L-1 ▲, 1 g.L·1 ■ et 0,5 g.L·1 x.
[Fig. 4] La Figure 4 représente les modules élastiques et visqueux d'EPS-3707 (symboles pleins G’ et vides G”) entre 0,001 et 10Hz. 20 g.L-1 ·, 10 g.L-1 ¨, 5 g.L-1
▲ , 1 g.L·1 ■ et 0,5 g.L·1 x.
[Fig. 5] La Figure 5 représente la viscosité de l'EPS-3688 (courbes aller: symboles pleins ; courbes retour: symboles vides) entre 0,1 et 1000 s-1, 20 g.L 1 ·, 10 g.L 1 ¨, 5 g.L 1 ▲, 1 g.L 1 ■ et 0,5 g.L 1 x.
[Fig. 6] La Figure 6 représente les modules élastiques et visqueux d'EPS-3688 (symboles pleins G’ et vides G”) entre 0,01 et 10 Hz ; 20 g.L-1 ·, 10 g.L-1 ¨, 5 g.L-1
▲ , 1 g.L 1 ■ et 0,5 g.L 1 x.
[Fig. 7] La Figure 7 représente la viscosité complexe des solutions EPS-3707 dans l'eau à 20 g.L 1 ·, 10 g.L-1 ¨, 5 g.L-1 ▲ et 1 g.L-1 ■ par rapport à EPS-Pav20 g.L-1 (+) et alginate 20 g.L-1 (*).
[Fig. 8] La Figure 8 représente la viscosité complexe des solutions EPS-3688 dans l'eau à 20 g.L 1 ·, 10 g.L-1 ¨, 5 g.L-1 ▲, 1 g.L-1 ■ et 0,5 g.L-1 x par rapport à EPS-Pav20 g.L-1 (+) et alginate 20 g.L·1 (*).
[Fig. 9] La Figure 9 illustre la rhéofluidité (viscosité en fonction du gradient de cisaillement): effet de la salinité sur la viscosité de solutions ESP-3707 (courbes aller : symboles pleins ; courbes retour : symboles vides ; NaCI 0,15 M : ronds ; eau : triangles), 20 g.L-1 (rouge), 10 g.L 1 (bleu), 5 g.L 1 (vert), 1 g.L 1 (noir) et 0,5 g.L 1 (rose).
[Fig. 10] La Figure 10 illustre l’effet de la nature du sel sur la viscosité des solutions d'EPS-3707 à 1 g.L 1 dans l'eau, KSCN 1 M et NaCI 1 M (courbes aller : symboles pleins ; courbes retour : symboles vides)
[Fig. 11] La Figure 11 illustre l’effet de la salinité sur les mesures d'oscillation. Axe gauche : modules élastique (cercle plein) et visqueux (cercle vide), axe droit : viscosité complexe (triangle) en fonction de la fréquence de EPS-3707 1 g.L-1 dans l'eau et NaCI à 0,05 ; 0,15 ; 0,5 et 1 M.
[Fig. 12] La Figure 16 illustre la comparaison entre SLB de solutions EPS à 1 g.L-1 dans l'eau à 25°C, 37°C et 60 °C .
[Fig. 13] La figure 13 représente les courbes de transmission (%) en fonction de la hauteur du tube (axe x) et du temps de vieillissement (courbes de t = 0 à t max) de suspensions de cellulose microcristalline A) dans l'eau B) dans une solution d’alginate à 10 g.L 1 C) dans une solution d’EPS-3688 à 1 g.L 1.
[Fig. 14] La figure 14 représente les courbes de transmission (%) en fonction de la hauteur du tube (axe x) et du temps de vieillissement (courbes de t = 0 à t max) A) d’émulsions 00 dans l'alginate 20 g.L 1; et B) d’émulsion 00 avec l’EPS-3707 1 g.L·1 ; et C) avec l’EPS-3688 1 g.L·1.
-[Fig. 15] La Figure 15 illustre le pourcentage de transmission avec le temps de vieillissement des suspensions de cellulose microcristalline à deux hauteurs différentes du tube (ligne pointillée : bas du tube, 2 cm) (ligne complète: haut du tube, 5,5 cm).
[Fig. 16] La Figure 16 illustre le pourcentage de transmission avec le temps de vieillissement des émulsions 00 à deux hauteurs différentes du tube (ligne pointillée : bas du tube, 2 cm) (ligne complète: haut du tube, 5,5 cm).
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention :
Exemple 1 : Etude des EPS et leurs propriétés
1.1 Matières premières
L'alginate (ALG) (avec un rapport mannuronate / glucuronate de sodium de 1 ,2) a été fourni par Cargill (France)
1 .2 Production des EPS
Glossomastix sp., (Souches RCC3688 et RCC3707 précitées) placées dans les Pinguiophyceae, sont des microalgues dorées isolées de St Margaret's Bay (Royaume-Uni) ;
Pavlova souche 3438 placée dans les Pavlovophyceae est une microalgue isolée de la Mer Noire à Varna en Bulgarie. 1 .2 Production d'EPS
Glossomastix sp. RCC3688 a été cultivée en erlen ou en airlift avec un milieu F/2 (enrichi ou non), à 20°C sous irradiance entre 40 et 300 pmolphotons/m2/s avec un cycle jour/nuit ou illumination continue sous agitation entre 0 et 120 rpm.
La souche Glossomastix sp. (RCC3707) est cultivée en condition airlift dans des bouteilles (2 à 5 L) pour pallier à sa sensibilité à l’agitation mécanique. Les cultures airlift sont équipées d’un diffuseur d’air cylindrique relié à un réseau d’air comprimé stérilisé par filtration (0,22 pm). Les cultures sont réalisées à 20 °C (local climatisé) et illuminées par des néons fournissant une irradiance de 40 pmol photons. nr2.s 1. La souche est cultivée en mode batch et en photoautotrophie avec un cycle jour/nuit de 16 h/8 h. Les cultures batch 2 et 5 L sont réalisées en milieu « F/2 enrichi » et inoculées respectivement par 200 et 500 mL d’inoculum en phase exponentielle.
La composition du milieu F/2 enrichi est la même que celle du milieu F/2 décrit par Guillard et Ryther (Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239, 1962), excepté les teneurs en sources d’azote et phosphore qui ont été augmentées.
Selon un mode de réalisation, Le milieu F/2 développé par Guillard and Ryther (1962) est un milieu de culture standard pour la culture des microalgues. Il est constitué pour 1 L d’eau de mer artificielle de : 100 pL d’une solution de microéléments 10X, de 100 pL d’une solution de vitamines 10X, de 0,0075 g de NaNÜ3 et de 0,00055 g de NaH2P04.2H20.
Le milieu « F/2 modifié » a la même composition que le milieu F/2, à l’exception des concentrations en NaNÜ3 (1 g.L_1) et NaFI2P04.2FI20 (0,2 g.L-1). Les nouvelles concentrations de ce milieu de culture ont été déterminées par Villay et al. (2013) Bioresource Technology, 146, 732-735 par une analyse stoechiométrique de la composition du milieu et comparaison avec la composition molaire moyenne des microalgues déterminée par Pruvost & Cornet. C. Posten, C. Walter (Eds.), Microalgal biotechnology, “potential and production”, Walter De Gruyter GmbH and Co KG, Germany (2012). Ces concentrations ont été déterminées afin d’atteindre une concentration en biomasse de 1 g.L-1.
Le milieu « F/2 enrichi » a la même composition que le milieu F/2 mais où les concentrations en NaNÜ3 et NaH2P04.2H20 sont respectivement égales à 1 ,7 et 0,55 g.L-1, respectivement. Ces concentrations ont été déterminées avec la même méthode que celle employée pour le milieu « F/2 modifié », avec l’objectif d’atteindre une concentration en biomasse de 2 g.L 1.
Le milieu F/2 enrichi qui a été utilisé est composé pour 1 L d’eau de mer artificielle de :
100 pL d’une solution de microéléments 100 pL d’une solution de vitamines
- NaN03 1 ,7 g
- NaH2P04,2H20 0,55 g
La composition de l'eau de mer artificielle utilisée est:
NaCI 28,13 g
KCI 0,77 g
CaCI ,2H20 1 ,60 g MgCI2,6H20 4,80 g NaHCOs 0,11 g MgS04,7H20 3,50 g Eau distillée qsp 1 000 mL
La solution de microéléments est constituée de : - Na2EDTA 4,16 g
FeCI3,6H20 3,15 g
CUS04,5H20 0,01 g
ZnS04,7H20 0,022 g
COCI2,6H20 0,01 g
MnCI2,4H20 0,18 g
Na2Mo04,2H20 0,006 g
Eau distillée qsp 1 00 mL
La solution mère de vitamines est constituée de : - Cyanocobalamine (Vitamine BI2) 0,0005 g
Thiamine HCl (Vitamine Bi) 0,1 g
Biotine 0,0005 g
Eau distillée qsp 100 mL
La souche Pavlova RCC3438 précitée a été cultivée en PBR torique de 1 ,4L, à 20°C, sous une irradiance continue de 150pmolphotons/m2/s et une agitation de 100rpm, avec un milieu F/2 enrichi. Le pH a été régulé par modification du taux de C02 dans l'air injecté (débit de gaz de 200 mL/min, avec un taux de C02 de 0.5 à 3%). 1.3 Rhéologie
Les mesures rhéologiques ont été effectuées avec le rhéomètre AR2000 (TA Instrument, UK), en utilisant une géométrie de cylindre concentrique double entrefer de taille standard (aluminium, entrefer 500pm) sauf pour la concentration la plus élevée pour laquelle une géométrie cône/plan (diamètre 4cm; angle 2 °; entrefer 57pm) a été utilisée. Toutes les mesures ont été effectuées avec un piège à solvant pour éviter toute évaporation. Les procédures d'écoulement ont été effectuées à 25 °C de 0,1 à 1000 s 1 (pendant 10 min) et de 1000 à 0,1 s 1 (pendant 10 min) à diverses concentrations dans l'eau ou en milieu NaCI (0,05 à 1 M) (avec 200 ppm d'azide de sodium pour éviter la dégradation bactériologique). Les procédures d'oscillation ont été effectuées à 25 °C, 37 °C ou 60 °C. Le domaine de linéarité de chaque solution d'EPS a été déterminé avant d'effectuer les balayages en fréquence (de 0,001 ou 0,01 à 10 Hz). La valeur limite de contrainte (Oiim) du domaine de linéarité a été déterminée graphiquement. Le modèle de Hershel-Bulkley a été appliqué sur les courbes d'écoulement pour déterminer la contrainte seuil de la solution d”EPS.
[Math 1] s = s0 + Kgh
Avec s la contrainte de cisaillement, g le taux de cisaillement, s0 la contrainte seuil, K l'indice de cohérence et n l'indice de rhéofluidité.
Les analyses ont été effectuées avec le logiciel Rheology Advantage Instrument Control AR V3.0.0.
1 .4 Rheolaser Master®
Les propriétés viscoélastiques des solutions d'EPS ont également été évaluées de manière non destructive (sans contrainte mécanique) à l'aide du Rheolaser Master® de la société Formulaction (France). Cette technique est basée sur une technique de diffusion dynamique de la lumière appelée Spectroscopie à ondes diffusantes (DWS). Un laser (l= 650 nm) éclaire l'échantillon contenant des objets (particules, gouttelettes ou fibres), les photons pénètrent dans l'échantillon et sont rétrodiffusés par les objets. Une caméra vidéo est utilisée comme détecteur des ondes rétrodiffusées pour afficher une image d'interférence appelée «Speckle». Les taches sombres et lumineuses sur l'image obtenue résultent d'interférences respectivement destructives et constructives entre les ondes rétrodiffusées. Le mouvement brownien des objets dépend de la structure viscoélastique de l'échantillon, par conséquent, la vitesse des fluctuations d'intensité sur l'image d’interférence est également différente. Ainsi, la vitesse de déformation du motif de speckle permet de caractériser les propriétés structurelles des échantillons étudiés. Ensuite, une fonction de décorrélation est utilisée et le déplacement carré moyen (MSD) des diffuseurs du produit est obtenu à partir de la courbe de décorrélation, reflétant la surface moyenne explorée par les particules à un temps de décorrélation donné. De la courbe MSD en fonction du temps de décorrélation, de nombreuses informations sont obtenues et des paramètres tels que l'indice d'élasticité (El) et la balance solide-liquide (SLB) sont déterminés. L’EI est déterminé comme l'inverse de la valeur de hauteur de plateau, et est proportionnel au module élastique G’ au plateau. El donne des informations sur l'évolution de l'élasticité du produit avec le temps et est calculé automatiquement entre 2,5 ms et 1 ,5 s de décorrélation. SLB est caractéristique du rapport entre le comportement de type solide et le comportement de type liquide du produit. Les valeurs SLB changent de la même manière que tan d (rapport de G" sur G’) obtenu en rhéologie en mode oscillation. SLB est obtenu par la valeur de la pente (en échelle logarithmique) au plateau élastique de la courbe MSD. Plus l'échantillon est «élastique / solide», plus la valeur SLB est faible (0 < SLS < 0,5). Plus la valeur est élevée, plus l'échantillon est visqueux / liquide (0,5 < SLB < 1).
Pour les analyses Rheolaser Master®, l'alginate et les EPS de Glossomastix, RCC3707 et Pavlova sp. RCC3438ont été dissous dans 25 mL d'eau (contenant 200 ppm d'azide de sodium) à 0,1 , 0,5, 0,75 ou 1 g.L-1. Ensuite, 200 pL de solution de particules de latex (10% v/v, taille des particules de latex de 1 pm) ont été ajoutés aux solutions de polysaccharides et le mouvement brownien des particules de latex a été étudié. Les mesures ont été effectuées trois fois à 25, 37 ou 60 °C pendant 2h. Toutes les données sont analysées avec le logiciel RheoSoft Master v1 .4.0.0. Les résultats (El et SLB) sont donnés comme la moyenne de trois mesures.
1 .5 Stabilité des dispersions: Turbiscan®
Turbiscan® Classic MA2000 est un analyseur optique de la société Formulaction, France. Cette technique est basée sur la variation de signaux lumineux rétrodiffusés ou transmis. Les intensités de rétrodiffusion (BS) et transmises (T) sont mesurées en fonction de la hauteur de l'échantillon et du temps de vieillissement. La taille du tube est de 6 cm de hauteur. Pour les analyses, nous avons déterminé le pourcentage de transmission en bas du tube (2 cm) et en haut du tube (5,5 cm) en fonction du temps de vieillissement. Si le pourcentage de transmission augmente et atteint une valeur proche de 100%, cela signifie que la décantation ou le crémage se produisent accompagné ou non de floculation ou de coalescence.
1 .5.1 Suspensions de cellulose microcristalline
La stabilité des suspensions microcristallines de cellulose (ACROS, France, taille moyenne des particules 90pm) dans les solutions d'EPS a été étudiée par cette technique. Les suspensions ont été préparées en mélangeant 0,1 g de cellulose microcristalline dans 6 mL de solutions d'EPS à différentes concentrations dans l'eau (tableau 1). La stabilité des suspensions a été comparée aux solutions d'alginate et à l'eau pure. Les suspensions d'EPS de Pavlova (EPS -Pav) n'ont pas été testées car ce polysaccharide donne des solutions troubles et il n'est pas compatible avec l'analyse optique.
1 .5.2 Émulsions d'huile d'orange
La stabilité des émulsions d'huile d'orange (Sigma, France) dans les solutions d'EPS a également été étudiée. Une émulsion d'huile d'orange (00) a été préparée comme suit : 2,5 mL d'00 ont été ajoutés à 22,5 ml d'eau (le rapport eau / huile était de 90/10 (V/V)) et homogénéisés avec l'homogénéisateur Ultra-Turrax (T18 Basic, IKA , France) pendant 5 min à la vitesse 3 (11 000 tr / min) (tableau 1 bis). La stabilité des émulsions 00 dans l'eau pure a été contrôlée par des mesures de taille (Mastersizer 3000, Malvern, USA) et la taille des gouttelettes d'huile (3 pm ± 0,5) est stable pendant 15 min. Ensuite, 1 mL d'émulsion 00 a été rapidement ajouté à 5 mL de solutions EPS (à diverses concentrations) et rapidement homogénéisé en inversant le tube trois fois pour obtenir 6 mL d'émulsion 00 dans des solutions EPS. Les tableaux 1 et 1 bis reprennent les différentes dispersions (la concentration finale des solutions d'EPS est donnée en tenant compte de la dilution due au mélange de 1 mL d'émulsion 00 dans 5 mL de solution d'EPS) et le temps et la fréquence des analyses avec le Turbiscan®. Les émulsions EPS -Pav n'ont pas été testées car ce polysaccharide donne des solutions troubles et il n'est pas compatible avec l'analyse optique.
[Table 1] : Préparation des émulsions huile d'orange / EPS dans l'eau; Temps et fréquence des analyses avec Turbiscan®
RCC3707 et 0,5 g.L 1 dans l’eau 1 h 20 (1 scan/min) RCC3688 0,5 g.L 1 dans l’eau 2 h (1 scan/min)
1 g.L-1 dans l’eau 45 min (1 scan/min)
Alginate 10 g.L-1 dans l’eau 5h15 (1 scan/6 min) Eau 2h (1 scan/4 min)
[Table 1 bis]: Préparation de suspensions dans l’eau ou dans une solution de NaCI
0,15M ; Durée et fréquence des analyses avec le Turbiscan™
3707 1 g.L-1 eau 40 h (1 scan /h) 0,5 g.L-1 eau 6 h (1 scan/min)
3688
Alginate 1 g.L-1 eau 47 h (1 scan/min) 20 g.L-1 eau 13 h (1 scan/min)
2 Résultats et discussion 2.1 Propriétés rhéologiques
Les propriétés physico-chimiques des solutions d'EPS dans l'eau ou en milieu salin ont été étudiées par rhéologie dans des expériences d'écoulement conduisant aux propriétés de viscosité ; ou dans des expériences d'oscillation afin d'analyser les propriétés viscoélastiques. Le comportement rhéologique des solutions d'EPS a ensuite été comparé à l'alginate, un polysaccharide issu de macroalgues.
2.1 .1 EPS de Pavlova sp.
Pour commencer, les solutions d'EPS de Pavlova sp. RCC3438(EPS-Pav) ont été analysées par des expériences d'écoulement entre 0,1 et 1000 s 1 à 20 g.L-1 dans l'eau (figure 1). Le caractère thixotrope a également été évalué par une deuxième étape de 1000 à 0,1 s 1. Comme le montre la figure 1 , la solution EPS-Pav présente un comportement visqueux, non newtonien et faiblement rhéofluidifiant. Par rapport à une solution d'alginate à la même concentration, la solution EPS -Pav a une viscosité inférieure ho : 0,018 Pa.s pour l’EPS -Pav et 0,27 Pa.s pour l'alginate (le modèle de Cross est utilisé pour déterminer ho). De plus, aucune thixotropie (ou très légère) n'a été observée. Concernant les propriétés viscoélastiques, le balayage en fréquence entre 0,1 et 10 Hz (dans le domaine de linéarité) a montré un comportement majoritairement visqueux de la solution EPS -Pav avec un module visqueux G" supérieur au module élastique G’ sauf à 10 Hz. G’ et G” d'EPS- Pav sont inférieurs à ceux de la solution d'alginate (Fig. 2). 2.1.2 EPS issus de Glossomastix sp. RCC3688 RCC3707 (ci-après EPS-3688 et
EPS-3707)
Le comportement rhéologique de solutions de l'EPS-3688 et de l'EPS-3707 a également été étudié à différentes concentrations. À 20, 10, 5, 1 et 0,5 g.L-1 dans l'eau, les solutions d'EPS-3707 (Fig. 3) et d'EPS-3688 (Fig. 5) présentent un comportement non newtonien comme les fluides à contrainte seuil. Une très légère thixotropie est observée. La viscosité apparente des solutions EPS-3707 et EPS- 3688 à 20 g.L-1 dans l'eau est beaucoup plus élevée que la solution EPS -Pav à la même concentration.
Le modèle de Hershel-Bulkley a été appliqué sur des courbes d'écoulement pour déterminer la contrainte seuil so des solutions d’EPS et les données ont été comparées à la valeur limite de contrainte du domaine de linéarité pendant les procédures d'oscillation (tableau 2). Une bonne corrélation est obtenue entre ces deux données.
Les balayages en fréquence des solutions EPS-3707 (Fig. 4) et des solutions EPS-3688 (Fig. 6) ont montré un comportement atypique par rapport aux solutions EPS-Pavou alginate. En effet, à 20, 10, 5 et 1 g.L-1, un comportement majoritairement élastique est observé entre 0,1 et 10 Hz, avec des valeurs de modules faibles mais avec un module élastique G’ supérieur au module visqueux G”. Ces caractéristiques traduisent le comportement d'un gel faible avec une faible valeur de la contrainte seuil.
Ainsi, les solutions EPS-3688 et EPS-3707 se comportent comme des gels faibles même à faible concentration (1 g.L-1) avec une faible contrainte seuil et de faibles modules viscoélastiques. À 1 g.L-1, les deux EPS-3707 et EPS-3688 conduisent à des gels faibles avec une dynamique du même ordre de grandeur. En effet, le temps de relaxation tr, ou temps de désenchevêtrement (déterminé au point de croisement des courbes G' et G” sur les figures 4 et 6 et donné dans le tableau 2) est de 85 s pour la solution EPS-3707 avec un module élastique de 0,02 Pa et d’environ 50 s pour la solution EPS-3688 avec un module élastique de 0,03 Pa. À une concentration plus faible (0,5 g.L-1), la solution EPS-3688 a une dynamique ralentie par rapport à la solution EPS-3707. Le temps de relaxation est environ dix fois plus élevé. Les viscosités complexes des solutions d'EPS dans l'eau sont comparées aux solutions d'alginate et d'EPS-Pavsur la figure 7 (EPS-3707) et la figure 8 (EPS-3688). Une forte variation de viscosité complexe est également observée sur toute la gamme de fréquence alors que pour les solutions d'alginate ou d'EPS -Pav, la viscosité complexe varie très peu.
[Tableau 2] : Données rhéologiques: contrainte seuil (so), contrainte limite, temps de relaxation tr et module élastique G’ à tr EPS-3707 EPS-3688 EPS-3707 EPS-3688
Concentration so3 sΐύ so3 sΐύ tr (S) G’ tr (S) G’
(g/L) (Pa) (Pa) (Pa) (Pa) (Pa) (Pa)
0,5 0,01 0,006 0,02 0,02 0,8 0,01 10 0,02
1 0,03 0,03 0,06 0,06 85 0,02 50 0,03
5 0,18 0,2 0,5 0,7 140 0,12 >100
10 0,37 0,4 I ,7 2,0 >1000 >100
20 3,44 4 I I ,5 12,6 >1000 >100
2.1 .3 Effet de la salinité sur le comportement rhéologique
Des solutions d'EPS ont été préparées en milieu NaCI, un sel lyotrope (renforçant les interactions hydrophobes) ou KSCN, un sel chaotrope (affaiblissant les interactions hydrophobes) à différentes concentrations pour étudier l'impact de la salinité sur la rhéologie des solutions. Les courbes d'écoulement des solutions EPS- 3707 dans NaCI 0,15 M sont comparées aux courbes d'écoulement dans l'eau sur la figure 9. Les courbes aller (symbole plein) et retour (symbole vide) sont représentées pour montrer la légère thixotropie. La viscosité des solutions salines est augmentée par rapport aux solutions dans l'eau sauf pour la solution à 1 g.L-1 pour laquelle la viscosité dans NaCI 0,15 M est légèrement diminuée par rapport à la viscosité dans l'eau. La présence de NaCI conduit à l’écrantage des charges présentes sur les polysaccharides avec une diminution des interactions électrostatiques et une éventuelle augmentation des interactions hydrophobes provoquant un gain de viscosité. Un autre effet de la présence de NaCI peut être observé sur la solution d'EPS-3707 à 20 g.L-1 : la thixotropie disparaît (les courbes aller et retour sont superposables). L'effet sur la concentration de NaCI a également été étudié sur EPS- 3707 à 1 g.L-1 dans NaCI 1 M, 0,5M, 0,15M et 0,05M avec un faible impact sur les viscosités de la solution. On peut supposer qu'une faible concentration de NaCI est suffisante pour écranter les charges. L'effet d'un sel chaotrope a également été étudié sur les solutions EPS-3707 1 g.L-1 (Fig. 10). Outre un effet de diminution de la viscosité, KSCN a un effet sur la thixotropie des solutions ESP-3707. En effet, la thixotropie de ces solutions est augmentée par rapport à la solution dans l'eau. L’étude d’EPS 3688 donne des résultats comparables.
L'impact de la salinité a été examiné sur la dynamique des solutions d'EPS par des procédures d'oscillation entre 0,01 et 10 Hz (le domaine de linéarité de chaque solution a été vérifié auparavant). En présence de NaCI et quelle que soit la concentration en sel, la dynamique des solutions EPS-3707 1 g.L-1 est accélérée (les temps de relaxation passent de 85 s dans l'eau à 16 s dans NaCI 0,5 M avec 0,016 <G’<0,02 Pa) ; dans le même temps, la viscosité complexe diminue quelle que soit la concentration en NaCI (Fig. 11 ).
2.2 Étude Rheolaser Master®
Pour compléter l'étude rhéologique, des analyses de solutions EPS ont été réalisées avec l'instrument Rheolaser Master®, une méthode non destructive (sans aucune contrainte mécanique). Cette technique basée sur une technique de diffusion dynamique de la lumière appelée Spectroscopie à ondes diffuses (DWS) a conduit à la détermination de différentes données comme l'indice d'élasticité (El) et la balance solide-liquide (SLB). El est proportionnelle au module élastique G ’au plateau. SLB est caractéristique du rapport entre le comportement de type solide et le comportement de type liquide du produit. Les valeurs SLB changent de la même manière que tan d (rapport de G" sur G’).
Le tableau 3 donne IΈI à différentes températures (25, 37 et 60 °C) pour chaque polysaccharide à 1 g.L-1 dans l'eau et à différentes concentrations pour les solutions EPS-3688 (0,75 ; 0,5 et 0,1 g.L-1). Cette technique confirme le caractère élastique plus élevé des EPS-3688 et EPS-3707 que EPS -Pav à 25 °C. En effet, l'EI d'EPS- 3688 et d’EPS-3707 est supérieur à l'EI d'EPS -Pav. L'effet de la concentration sur l'EI a été évalué sur EPS-3688 entre 0,1 et 1 g.L-1 dans l'eau et à chaque température. El diminue logiquement si la concentration diminue comme le module élastique G’. Le mouvement brownien des particules dépend de la structure viscoélastique de l'échantillon et lorsque la concentration diminue, les propriétés viscoélastiques diminuent également. L'augmentation de la température montre une différence entre les solutions d’EPS. Pour l'EPS-3707 et l'EPS -Pav, une augmentation de la température entraîne une légère diminution de l'EI alors que pour l'EPS-3688, la température n'a aucun effet sur l'EI (sauf à 0,1 g.L-1). La diminution de l'EI avec l'augmentation de la température semble logique car le mouvement brownien des particules s'accélère avec la température. Mais si l'EI est inchangée avec la température, il semble que les interactions conduisant à la structure de gel faible sont suffisamment fortes pour ne pas être influencées par la température. Ce comportement a été vérifié par des mesures rhéologiques classiques en balayage en oscillation à 1 Hz et les résultats ont montré que G' était quasi constant à 25, 37 et 60 °C et toujours supérieur à G” (comportement élastique quel que soit la température). [Tableau 3]: El des solutions d'EPS dans l'eau à 25, 37 et 60 °C et module élastique G ’d'EPS-3688 à 1 g.L·1 et 25, 37 et 60 °C.
[Tableau 3]: El de solutions d’EPS dans l’eau à 25, 37 and 60°C et module élastique G’ de EPS-3688 à 1 g.L 1 0,5 g.L 1 et 25, 37 et 60°C
TEMP. CONC. EPS-3688 EPS-3707 EPS- ALGINATE EPS-3688
(°C) (g-L·1) El x 104 El x 104 PA V El x 104 G’ (nm-2) (nm 2) El x 104 (nm 2) (Pa) (nm 2)
25 1 9.7 ± 0,1 9,3 ± 0,3 6,7 ± 0,1 0,21 ± 0,03
0,75 8,9 ± 0,6
0,5 6.8 ± 0,3 0,13 ± 0,02
0,1 5,4 ± 0,1
37 1 10,1 ± 0,7 9,1 ± 0,2 5,2 ± 0,1 5,7 ± 0,1 0,19 ± 0,03
0,75 8.9 ± 0,6
0,5 6.6 ± 0,4 0,13 ± 0,02
0,1 5,0 ± 0,4
60 1 10,7 ± 0,8 6,8 ± 0,3 3,6 ± 0,1 3,9 ± 0,1 0,25 ± 0,03
0,75 9,2 ± 0,3
0,5 7.6 ± 0,6 0,24 ± 0,03
0,1 3.7 ± 0,2
La balance Solide Liquide (Balance SLB) est obtenue par la valeur de la pente (en échelle logarithmique) au plateau élastique de la courbe MSD. Si SLB <0,5, le comportement élastique est prédominant, si 0,5 <SLB <1 , le comportement visqueux est prédominant.
La figure 12 compare la SLB de tous les EPS à 1 g.L-1 à différentes températures. À 25 °C, seul l'EPS-3688 a un comportement de type élastique (SLB = 0,53) ; la SLB d'EPS-3707 est légèrement supérieur à 0,5 (SLB = 0,62), suggérant un comportement viscoélastique, et l’EPS -Pav et l'alginate ont clairement un comportement visqueux (SLB EPS -Pav = 0,94 et SLB alginate = 0,98). À 37 °C, la
SLB d'EPS-3688 et d'EPS-3707 n'est pas modifiée ou même diminue, tandis qu'elle augmente légèrement pour l’EPS -Pav et l'alginate. Enfin, à 60°C, SLB d'EPS-3688 reste toujours constant et proche de 0,5 lorsque la SLB d'EPS-3707 augmente à 0,75. Ainsi, seule la solution EPS-3688 à 1 g.L-1 dans l'eau conserve son comportement élastique si la température augmente à 60 °C.
2.3 Stabilité des dispersions Les solutions EPS-3688 et EPS-3707 pourraient être utilisées comme stabilisateurs de dispersions grâce à leur comportement élastique même à faible concentration.
2.3.1 Suspensions de cellulose microcristalline
La stabilité de dispersion de cellulose microcristalline a été étudiée dans différents milieux (eau, solution d’alginate et d’EPS-3688) à l'aide de l'analyseur Turbiscan®. Cette technique est basée sur la variation de signaux lumineux rétrodiffusés ou transmis. Les intensités de rétrodiffusion (BS) et transmises (T) sont mesurées en fonction de la hauteur de l'échantillon et du temps de vieillissement. Cette technique permet notamment d’évaluer la décantation de particules en suspension. La figure 13A montre un exemple de graphique obtenu pour l'analyse d'une suspension de cellulose microcristalline dans de l'eau pure. L'axe des x représente la hauteur du tube d'analyse, l'axe des y, la transmission et le temps de vieillissement est représenté par les différentes couleurs. La figure 13B montre un exemple de graphique obtenu pour l'analyse de la suspension de cellulose microcristalline dans une solution d’alginate à 10 g.L 1 dans l’eau et la figure 13C dans une solution d'EPS-3688 à 1 g.L-1 dans l'eau. Les différences entre les trois exemples montrent clairement la stabilité de la suspension dans une solution d'EPS-3688 (même à 1 g.L-1). Dans l'eau pure, les particules décantent rapidement au fond du tube et la transmission en haut du tube atteint son maximum en quelques minutes. Dans une solution aqueuse d’alginate à 10 g.L-1, la décantation est moins rapide et dans une solution d’EPS-3688, la transmission reste constante sur toute la hauteur du tube et sur la durée de la mesure (environ 17h). Les suspensions de cellulose microcristalline dans l'Alginate 10 g.L-1, dans l'eau et dans l'EPS-3707 1 g.L-1 dans l'eau ont également été étudiées à différents niveaux du tube de décantation. En traçant le pourcentage de transmission avec le temps de vieillissement à différents niveaux du tube ; en haut (ligne complète) ou en bas (ligne pointillée), les différentes suspensions peuvent être comparées entre elles (Fig. 15). Ainsi, la suspension de cellulose microcristalline dans une solution d’EPS-3688 à 1 g.L 1 est beaucoup plus stable que dans l'eau et dans une solution d'alginate à 10 g.L-1. En effet, le pourcentage de transmission au fond du tube reste constant, seule une légère augmentation de la transmission est observée à l'extrême sommet du tube (la valeur maximale est de 32% après 17h), en raison du début de la décantation. Alors que, dans l'alginate, la transmission augmente dès le début en haut du tube (atteignant 88% en 5h30) et plus lentement en bas du tube (atteignant 27% après 5h30) confirmant le début rapide de la décantation. La solution EPS-3688 est un bon stabilisateur de suspension.
2.3.2 Émulsions d'huile d'orange
La stabilité des émulsions 00 avec les solutions d’alginate (Fig. 19A), d’EPS- 3707 (Fig. 19B) et d'EPS-3688 (Fig. 19C) a été étudiée à l'aide du Turbiscan® Classic MA2000. Les figures 14A-B-C montrent une stabilité élevée des émulsions plus particulièrement dans la solution d’EPS-3688 : aucun pic de transmission n'est observé pendant toute l'expérience. Avec l’EPS-3707, un petit pic apparaît autour de 0,7 mm après 3h et dans l'alginate il apparaît plus tôt traduisant une instabilité. La figure 16 montre clairement la bonne stabilité des émulsions avec les solutions d'EPS (pas de variation de transmission en bas (2 cm) ou en haut du tube (5,5 cm) pendant tout le temps (40h)). Alors que pour l'émulsion 00 avec la solution d'alginate, le pourcentage de transmission augmente en haut du tube dès les premières minutes. Les EPS-3707 et EPS-3688 sont donc de bons stabilisateurs d'émulsion.
Conclusion :
Les études de stabilité ont été réalisées sur une émulsion (huile essentielle d’orange dans eau) et une suspension (nanoparticules de cellulose microcristalline dans eau). Celles-ci ont été possibles par l’utilisation d’un Turbiscan (société Formulaction) qui mesure le signal transmis ou rétrodiffusé par un laser sur toute la longueur d’un tube.
Dans le cas de l’émulsion, la coalescence des gouttelettes d’huile a été suivie en mesurant leur taille dans le temps par Mastersizer 3000 Malvern et par évolution de la transmission (Turbiscan). Comme pour l’étude rhéologique, la nature du stabilisant (différents polysaccharides issus de plusieurs microalgues et polysaccharides de macroalgue) et leur concentration ont été modifiées.
Il a été mis en évidence que la stabilisation de la dispersion n’est possible qu’avec les polysaccharides dont la solution présente un comportement de type gel fluide sur une durée significative.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d’un exopolysaccharide ou mélange d’exopolysaccharides issu(s) de micro-algue appartenant au genre Glossomastix à titre d’agent texturant.
2. Utilisation selon la revendication 1 telle que la microalgue appartenant au genre Glossomastix est choisie parmi les souches :
Glossomastix sp. RCC3688, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 2912/2.
Glossomastix sp. RCC3707, souche déposée à l’autorité de dépôt internationale Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) le 9 décembre 2020 sous le numéro CCAP 2912/1.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 telle que l’exopolysaccharide est un exopolysaccharide natif.
4. Utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes telle que l’exopolysaccharide présente un poids moléculaire moyen supérieur à 100 kDa.
5. Utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes telle que l’exopolysaccharide présente une composition osidique caractérisant un galacturono- rhamno-fucane.
6. Utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes telle G exopolysaccharide est susceptible d’être obtenu à partir de la micro-algue par appartenant au genre Glossomastix par un procédé comprenant :
- la culture de ladite micro-algue,
- la collecte du surnageant de culture,
- l’ultrafiltration (concentration/dilution),
- et éventuellement la lyophilisation.
7. Formulation liquide comprenant un exopolysaccharide tel que défini à l’une quelconque des revendication 1 à 6 telle qu’il s’agit d’une solution aqueuse de concentration comprise entre 10 et 50 g/L dudit exopolysaccharide, de type gel fluide.
8. Formulation selon la revendication 7 telle qu’il s’agit d’une dispersion aqueuse stable.
9. Formulation selon la revendication 7 ou 8 choisie parmi les émulsions aqueuses ou les suspensions aqueuses.
10. Procédé de stabilisation d’une dispersion aqueuse comprenant le mélange de ladite dispersion à une formulation concentrée selon la revendication 8.
EP22708566.9A 2021-03-02 2022-03-02 Utilisation d'exopolysaccharides de micro-algues a titre d'agents texturants Pending EP4301331A1 (fr)

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