EP4291896A1 - Immunological test for the detection of viral infections - Google Patents
Immunological test for the detection of viral infectionsInfo
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- the present application relates to a method for diagnosing a viral infection affecting human beings. This process is carried out on a biological sample from an individual likely to be infected by said virus, in particular by a coronavirus, and more specifically by the SARS-CoV-2 coronavirus (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2).
- a virus is an infectious agent capable of integrating into the cells of an organism, called “host cells”, and of reproducing there using the cellular machinery of said host cells. Many viruses are pathogenic, i.e. they cause a disease in their host called “viral infection”.
- Viral infections in humans are characterized by clinical signs and symptoms such as fever, chills, headache, body aches, cough and fatigue. These clinical signs are common to viral infections generated by distinct viruses, and do not make it possible to distinguish the virus at the origin of the pathology.
- the importance of the identification of the pathogenic virus is essential in the event of a highly contagious virus, in order to be able to isolate infected people and warn people who have been in contact with an infected person.
- the SARS-CoV-2 virus is an enveloped, RNA-positive virus that belongs to the family Coronaviridae, subfamily Coronavirinae, genus Betacoronavirus and subgenus Sarbecovirus. Like SARS-CoV, SARS-CoV-2 is a bat virus that has adapted to humans in ways that have yet to be elucidated.
- the viral RNA approximately 30,000 bases long, was sequenced for the first time on January 5, 2020 by a team from Fudan University in Shanghai (China).
- This single-stranded RNA notably encodes a large RNA-dependent RNA polymerase (RdRp for RNA-dependent RNA polymerase) and several structural proteins including a surface glycoprotein (S for "Spike protein”) responsible for the crown appearance of the virus in electron microscopy.
- RdRp RNA-dependent RNA polymerase
- S surface glycoprotein
- detection techniques are of two types: those based on the detection of the nucleic acid of the virus, and those based on the detection of antigens (proteins or sugars) of the virus, within the biological sample.
- PCR polymerase chain reaction
- Real-time RT-PCR involves 3 steps: (i) extraction of nucleic acids from the sample, (ii) reverse transcription of sample RNAs into complementary DNAs through the use of a reverse transcriptase (RT) and (iii) amplification of the viral genome using specific primers for certain genes of this virus by real-time PCR technique.
- RT reverse transcriptase
- This "real-time” amplification provides an estimate of the viral load of the sample expressed as a Ct value, the term Ct or cycle threshold corresponding to the number of PCR cycles from which a fluorescent signal is detected in PCR: the lower the Ct value, the earlier the signal appears during the amplification process and the higher the estimated viral load.
- the quantitative RT-PCR reaction comprising the 3 steps mentioned above requires 3 to 4 hours from the arrival of the sample at the laboratory, which currently constitutes an incompressible response time for the technical.
- PCR-based molecular tests can get a result in about an hour. These are commercial tests such as BioFire® (BioMérieux), Cobas LIAT® (Roche Diagnostics), QIAstat Respiratory Panel-A (Q.IAGEN) or Xpert® Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid). Apart from their cost, their main limitation remains the difficulty of using them in the context of large series, which reserves them more for the investigation of emergency situations and serious cases.
- Digital PCR is a technological variant of the PCR test that allows several tens of thousands of PCR reactions to be carried out simultaneously within a microfluidic chip or an aerosol of micronized droplets in an oil emulsion.
- dPCR Digital PCR
- real-time digital RT-PCR provides semi-quantification of the viral load of PCR signals.
- the amplification of the genetic material is done at a constant temperature, which does not require, unlike PCR-based techniques, the use of a thermal cycler. This is referred to as isothermal amplification techniques.
- TMA transcription-mediated amplification
- RT-LAMP for Loop-mediated isothermal amplification
- a reverse transcriptase a DNA polymerase with strong strand displacement activity and 4 to 6 primers targeting different regions of the genome to be detected; the reading is done by colorimetric or fluorescence detection. Due to their modest cost, commercial tests based on this principle are currently experiencing a boom for the detection of SARS-CoV-2 RNA. These tests are easy to implement and provide a result in less than an hour. Nevertheless, in addition to the possibility of false positives, the main limitation of LAMP tests remains the difficulty of using them on a large scale, which leads to their being reserved for emergency situations.
- the NEAR technique for Nicking and extension amplification reaction uses a DNA polymerase, two specific primers for the target to be detected and a restriction enzyme capable of cutting only a single DNA strand (nicking enzyme).
- This technique marketed by Abbott Diagnostics for the rapid diagnosis of SARS-CoV-2 infection (ID NOW COVID-19 test), is very simple to implement and gives a result in less 15 minutes. It is, like the previous one, a technique intended for individual determinations in an emergency situation. Its lack of sensitivity has been pointed out in some studies.
- NGS Next Generation Sequencing
- Such antigen tests have been developed to detect SARS-CoV-2 specific antigens (1). They detect the presence of one of the proteins of the SARS-CoV-2 virus, usually but not exclusively, the nucleocapsid protein NP, in a biological sample.
- the samples used for the diagnosis of viral infections in particular by the SARS-CoV-2 virus, depend on the stage of infection.
- naso- or oropharyngeal samples obtained by deep swab of the nose or throat are the most used and the most sensitive. They require a perfectly mastered sampling technique. The sampler must protect themselves properly (FFP2 mask, protective glasses or visor, double gloves, overcoat, hand hygiene before and after the procedure) to avoid nosocomial contamination.
- Deep nasopharyngeal sampling can be, if not painful, at least very unpleasant for the patient; it nevertheless remains the best standardized, sensitive and constitutes the reference examination, in particular in symptomatic subjects suspected of Covid-19 disease.
- induced sputum and not saliva
- tracheal aspirations or bronchoalveolar lavage (BAL) in intensive care patients
- BAL bronchoalveolar lavage
- the virus can also be sought in the blood and in the stool, especially during severe infections. Diagnostic tests to detect SARS-CoV-2
- the reference test today is the detection by RT-PCR of the SARS-CoV-2 virus in samples of nasopharyngeal secretions. This test is sensitive but requires a few hours to get the results.
- Figure 2 presents the different types of existing tests and their relative advantages in terms of sensitivity and speed of obtaining the result.
- saliva samples are generally not concentrated enough in virus for detection to be carried out by an immunological test, even though the viral infection is present and is validated by an RT-PCR test.
- the present invention relates to a new method for diagnosing a viral infection, based on the use of a combined biological sample of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule, the detection of the virus being carried out by an immunological test, and the sensitivity of the diagnostic method being satisfactory thanks to this combination of two types of biological samples.
- the present invention relates to a method for the in vitro diagnosis of a viral infection due to the presence of a virus in an individual, comprising a step of detecting at least one specific antigen of said virus by an immunological test carried out on a biological sample. of said individual, characterized in that said biological sample consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of said individual.
- the virus detected is the SARS-CoV-2 coronavirus.
- the present invention also relates to a diagnostic kit for implementing the method described above, comprising: i) medical devices for taking and collecting anterior saliva and nasal samples, ii) an immunological test comprising at least one antibody binding to at least one specific antigen of the virus, as well as the reagents necessary for the implementation of this test.
- FIG. 1 Illustration of an immuno-chromatographic test (COVID19Speed-Antigen Test from BioSpeedia). The sample is placed in cup S located at the bottom of the figure. Line C corresponds to the Check that the test is working properly; its absence is synonymous with an invalid test.
- the T line (Test) corresponds to the detection of the N protein of the SARS-CoV-2 virus. The test shown on the left shows negative reactivity. The test presented at the center shows a weakly positive reactivity. The test shown on the right shows positive reactivity.
- Figure 2 Distribution of the main direct diagnostic tests for SARS-CoV-2 infection according to their sensitivity and response time.
- the repetition of tests that are easy to implement and quickly returned can be more effective in terms of public health, in order to detect infected subjects and isolate them, than very sensitive techniques.
- Figure 3 Performing the sampling and the test according to the invention, with a kit comprising a swab for saliva sampling. Diagnostic findings are presented.
- Page 1 of the instructions for use of the diagnostic kit including the list of devices: (1 ) Swabs for buccal sampling (larger end), (2) Swabs for nasal sampling, (3) Tubes of Extraction, (4) Dropper Caps, (5) Extraction Buffer Cassettes and Bottle.
- Page 3 of the instructions for use of the diagnostic kit presenting the main steps for collecting secretions from the anterior nasal vestibule with a swab (nasal sampling)
- Page 4 of the instructions for use of the diagnostic kit reading of the positive/negative results of the method according to the invention.
- line C is for the internal control which should be positive
- line T is for the sample test.
- the circle S represents the well in which two drops of biological sample were deposited to carry out the test.
- Figure 4. Performing the sample and the test according to the invention, with a kit comprising a container for sampling saliva by salivation.
- Page 4 of the instructions for use of the diagnostic kit reading of the positive/negative results of the method according to the invention.
- Colored bands appear at the control line (C) and at the test line (T).
- the test is positive for the SARS-CoV-2 virus antigen.
- the present invention relates to a method for the in vitro diagnosis of a viral infection due to the presence of a virus in an individual, comprising a step of detecting at least one specific antigen of said virus by an immunological test carried out on a biological sample. of said individual, characterized in that said biological sample consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of said individual.
- This in vitro diagnostic process is particularly suitable for a large-scale screening campaign among the general population, since it has the following advantages: ease of execution, non-invasiveness of the prior sampling of the biological sample, and rapidity of obtaining the results (less than an hour).
- the sensitivity (or selectivity) of a diagnostic test measures its ability to give a positive result when a hypothesis is verified. It is opposed to specificity, which measures the ability of a diagnostic test to give a negative result when the hypothesis is not verified.
- the results obtained with the diagnostic method according to the invention were compared with the results obtained with an RT-PCR test on a nasopharyngeal sample of 193 individuals, which at present is the "gold standard" of the test. detection of the SARS-CoV-2 virus.
- the biological sample used in this test consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of the same individual, hereinafter referred to as the individual tested.
- the diameter of the swab is larger and therefore the level of introduction of the distal end of the latter is shallower; some swabs have a collar to help assess the depth of their introduction.
- a fine swab can also be used for nasal sampling of the anterior vestibule.
- secretions from the anterior nasal vestibule anterior nostril secretions, anterior nasal swab, and nasal secretions, and all designate a biological sample obtained by sampling the secretions present in the nasal vestibule:
- saliva With regard to saliva, it is taken either by salivation in a container, or using a swab introduced into the mouth of the tested individual.
- the method according to the invention will be carried out on a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule, which may comprise any proportion of each element, for example 50/50 by volume of saliva and nasal secretions, or even 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 40/60, 30/70, 20/80 or 10/90 saliva/nasal secretions by volume.
- the saliva is, prior to its collection, enriched with nasal and/or nasopharyngeal secretions and/or sputum. This may be achieved by various actions of the tested individual, such as:
- nasopharyngeal secretions means the secretions taken from the nasopharynx
- sputum means the secretions from the bronchi of the individual.
- the method of the invention is characterized in that it is carried out on a biological sample consisting of a combination of saliva and nasal secretions. These nasal secretions may be mixed with saliva before its collection (by the individual tested) or after two separate samples, one of saliva and the other of secretions from the anterior nasal vestibule.
- this combined biological sample is easy to obtain, without invasive (traumatic) intervention for the patient, unlike the nasopharyngeal swab.
- the biological sample is obtained by self-sampling(s) of the tested individual; according to a second alternative of the process, the biological sample is obtained by sampling(s) by health personnel. According to a third alternative, the biological sample is a combination of self-sampling(s) and samples taken by health personnel.
- the diagnostic method according to the invention can be used to detect any viral infection, in particular any pulmonary viral infection, such as in particular an infection by the influenza virus generating influenza.
- the method according to the invention is an in vitro diagnostic method for the SARS-CoV-2 coronavirus.
- SARS-CoV-2 virus for the purposes of the invention, the term “SARS-CoV-2 virus”, “SARS-CoV-2 coronavirus” or “SARS-CoV-2” is understood to mean
- any variant of this SARS-CoV-2 coronavirus in particular the following variants: British variant (VOC 202012/01), South African (501 Y. V2) and Brazilian (B.1.1.28), as well as the variants listed in Table 1 below.
- the method is characterized in that the biological sample is fluidized before carrying out the detection step.
- This fluidification of the biological sample is an optional step of the diagnostic method.
- This thinning of the biological sample is obtained by adding a thinner, chosen from those well known to those skilled in the art.
- plasticizers based on N-acetyl-cysteine or on dithiothreitol such as Digest-EUR® (Eurobio) or Sputasol (ThermoFisher).
- the dose of plasticizer used is easily determined by the person skilled in the art.
- the in vitro diagnostic method comprises the following steps: a) fluidification of a biological sample from an individual likely to be infected by a virus; b) detection of at least one specific antigen of said virus by an immunological test carried out on said fluidized biological sample, characterized in that said biological sample consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of said individual.
- the in vitro diagnostic process is characterized in that the detection step is carried out using an immunological test.
- Said immunological test is characterized by (i) the nature of the antibody or antibodies included in said test and (ii) the type of immunological test (reagents, visualization of results). These two characteristics are developed below.
- the immunological test comprises at least one antibody specifically recognizing at least one antigen of the SARS-CoV-2 virus.
- the antigen detected may be of any molecular nature, making it possible to specifically identify the SARS-CoV-2 virus in a biological sample. It will in particular be a protein antigen.
- immunological test is meant within the meaning of the invention a test making it possible to detect at least one SARS-CoV-2 virus antigen thanks to at least one antibody specifically recognizing this antigen, said antibody being coupled to a reagent capable of be detected, or to an enzyme reacting to the addition of a detection reagent.
- Said detection reagent may in particular be a colored, fluorescent, luminescent reagent, or any type of detection reagent that can be detected and/or quantified by techniques well known to those skilled in the art.
- a commonly used immunological test is for example the so-called "ELISA” test for Enzyme-linked immunosorbent assay, in which two types of antibodies are used, one being specific for the antigen to be detected, and the other reacting to the complexes antigen-antibody and being coupled to an enzyme capable of generating the emission of a signal in the presence of a chromogenic or fluorogenic substrate.
- ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
- Some immunochromatographic tests are based on the use of antibodies coupled to nanoparticles, in particular gold nanoparticles.
- the migration of the antibodies, possibly linked to at least one antigen, takes place on a suitable membrane.
- the reading of the results is fast, generally obtained in 10 to 20 minutes.
- the immunological test must be used according to the indications given in the instructions for the test.
- the immunological test used to detect one or more antigen(s) of the SARS-CoV-2 virus is an immunochromatographic test.
- the immunological test is an immunochromatographic test comprising at least one antibody binding specifically to an antigen of the SARS-CoV-2 virus.
- tests that can be used for the implementation of the diagnostic method according to the invention are in particular the tests mentioned in the following non-exhaustive list:
- Non-automated antigen including TROD
- the detection step of the method according to the invention implements one of the following two detection tests for the SARS-CoV-2 virus:
- These two tests are immunochromatographic tests using at least one antibody conjugated with colloidal gold, for the qualitative determination of an antigen specific to SARS-CoV-2 in a human biological sample.
- Antibodies against SARS-CoV-2 are immobilized in the test region (T) on a nitrocellulose membrane.
- T test region
- the target antigen in the sample if present, will react with the gold-conjugated anti-SARS-CoV-2 antibody and form an antibody-antigen complex.
- this complex migrates the along the nitrocellulose membrane, it is captured by an anti-SARS-CoV-2 antibody adsorbed on the membrane in the (T) region of the device (gold-conjugated anti-SARS-CoV-2 antibody) - (antigen SARS-CoV-2) - (SARS-CoV-2 antibody), which causes a light pink to dark pink colored line to appear. If the specimen does not contain SARS-CoV-2 antigen, no colored line will appear in the test line region (T), indicating a negative result.
- Any individual likely to have a viral infection can be tested according to the in vitro diagnostic method of the invention.
- the terms "individual”, “tested individual” and “patient” are used interchangeably, and all designate the human being from whom the biological sample used in the diagnostic method according to the invention is derived. This is in particular an individual likely to be infected with a virus, or having been in contact with another individual whose viral infection has been confirmed.
- the method is an individual likely to be infected by a SARS-CoV-2 virus, or having been in contact with another individual whose viral infection by SARS-CoV-2 has been confirmed.
- this diagnostic method is suitable for adults (especially for people aged over 70) and is particularly suitable for children under the age of 12, and preferably for children aged between 3 and 12 years old.
- the individual tested is over 70 years old.
- the tested individual is more than 3 years old.
- the tested individual is between 3 and 12 years old.
- the individual tested is a person having to undergo diagnostic tests on a regular and repeated basis: this population of individuals includes in particular health personnel in hospitals, or personnel working in homes for the elderly .
- the diagnostic method according to the invention is in any case suitable for the general population, whether in the context of a mass screening program, tests in companies, in communities of young subjects such as schools or universities, or for screening travelers at airports. Diagnostic kit
- the present invention also relates to a diagnostic kit for implementing the method described above, comprising: i) medical devices for taking and collecting anterior saliva and nasal samples, ii) an immunological test comprising at least one antibody binding to at least one specific antigen of the virus, as well as the reagents necessary for the implementation of this test.
- These medical devices are in particular swabs for nasal and/or buccal sampling; and containers for collecting saliva.
- the swabs suitable for collecting saliva have a wider end than those suitable for collecting nasal secretions from the anterior nasal vestibule.
- kit will also include instructions for use.
- An example of such a notice is shown in Figures 3 and 4.
- this kit will comprise a thinning agent intended to thin the biological sample.
- the diagnostic kit is intended for an in vitro diagnostic method for the presence of a SARS-CoV-2 virus.
- the immunological test provided in the kit comprises at least one antibody binding to at least one specific antigen of the SARS-CoV-2 coronavirus.
- this kit can be used by health personnel, but also by non-specialized individuals, practicing self-sampling and thus being able to self-diagnose in a private setting.
- the biological samples tested were obtained according to the protocol described in FIGS. 3A, 3B and 3C.
- Example 2 Method for diagnosing a SARS-CoV-2 virus infection using an immunochromatographic test “COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 And BSD_0505-25” according to different sampling methods
- a reagent such as Digest-EUR® (Eurobio) or Sputasol (ThermoFisher) or N-acetyl-cysteine.
- Immunochromatographic test The test was conducted according to the test insert “COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25”.
- the biological sample consisting of saliva only does not present a sufficient viral load and/or antigenic concentration; the immunological test used is not sensitive enough to detect the SARS-CoV-2 virus on these 4 samples.
- the viral load and/or the antigen concentration is sufficient on a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule for the immunological test to detect the presence of SARS-CoV-2.
- the viral load and/or the antigen concentration is sufficient on a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule, after fluidification, for the immunological test to detect the presence of SARS-CoV-2.
- the viral load and/or the antigenic concentration of the saliva combination is increased both by the presence of the anterior nasal secretions, which makes it possible to obtain a positive result with an immunological test.
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Abstract
The invention relates to a method for in vitro diagnosis of a viral infection due to the presence of a virus in a subject, comprising a step of detecting at least one antigen specific for said virus by means of an immunological test carried out on a biological sample from said subject, characterized in that said biological sample consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of the subject.
Description
TEST IMMUNOLOGIQUE POUR DETECTION D’INFECTIONS VIRALES IMMUNOLOGICAL TEST FOR DETECTION OF VIRAL INFECTIONS
DOMAINE TECHNIQUE TECHNICAL AREA
La présente demande concerne un procédé de diagnostic d’une infection virale touchant les êtres humains. Ce procédé est réalisé sur un échantillon biologique d’un individu susceptible d’être infecté par ledit virus, en particulier par un coronavirus, et plus spécifiquement par le coronavirus SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2). The present application relates to a method for diagnosing a viral infection affecting human beings. This process is carried out on a biological sample from an individual likely to be infected by said virus, in particular by a coronavirus, and more specifically by the SARS-CoV-2 coronavirus (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2).
TECHNIQUE ANTERIEURE PRIOR TECHNIQUE
Un virus est un agent infectieux capable de s’intégrer dans les cellules d’un organisme, dites « cellules hôtes », et de s’y reproduire en utilisant la machinerie cellulaire desdites cellules hôtes. De nombreux virus sont pathogènes, c’est-à-dire qu’ils causent une maladie chez leur hôte dite « infection virale ». A virus is an infectious agent capable of integrating into the cells of an organism, called “host cells”, and of reproducing there using the cellular machinery of said host cells. Many viruses are pathogenic, i.e. they cause a disease in their host called “viral infection”.
Les infections virales chez l’être humain sont caractérisées par des signes cliniques et symptômes tels que fièvre, frissons, maux de tête, courbatures, toux et fatigue. Ces signes cliniques sont communs à des infections virales générées par des virus distincts, et ne permettre de distinguer le virus à l’origine de la pathologie. Viral infections in humans are characterized by clinical signs and symptoms such as fever, chills, headache, body aches, cough and fatigue. These clinical signs are common to viral infections generated by distinct viruses, and do not make it possible to distinguish the virus at the origin of the pathology.
Or, il est indispensable pour les personnels de santé de connaître l’origine virale des infections qu’ils doivent traiter, d’une part pour choisir la thérapie adaptée, et d’autre part pour anticiper la contagion et le risque de dissémination du virus au sein de la population.However, it is essential for health personnel to know the viral origin of the infections they have to treat, on the one hand to choose the appropriate therapy, and on the other hand to anticipate the contagion and the risk of dissemination of the virus. within the population.
L’importance de l’identification du virus pathogène est essentielle en cas de virus très contagieux, afin de pouvoir isoler les personnes infectées et prévenir les personnes ayant été en contact avec une personne infectée. The importance of the identification of the pathogenic virus is essential in the event of a highly contagious virus, in order to be able to isolate infected people and warn people who have been in contact with an infected person.
Parmi les virus particulièrement contagieux, l’année 2020 a été marquée par l’apparition d’une pandémie liée au SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) générant la forme de pneumonie dénommée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Cette épidémie a été déclarée « urgence de santé publique de portée internationale » par l'Organisation mondiale de la santé (OMS) le 30 janvier 2020. Among the particularly contagious viruses, the year 2020 was marked by the appearance of a pandemic linked to SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) generating the form of pneumonia called coronavirus disease 2019 (COVID-19 ). This outbreak was declared a "public health emergency of international concern" by the World Health Organization (WHO) on January 30, 2020.
Le virus SARS-CoV-2 est un virus enveloppé à ARN positif qui appartient à la famille des Coronaviridae, à la sous-famille des Coronavirinae, au genre Betacoronavirus et au sous- genre Sarbecovirus. Comme le SARS-CoV, le SARS-CoV-2 est un virus de chauve-souris qui s’est adapté à l’homme selon des modalités qui restent encore à élucider. L’ARN viral, d’une longueur d’environ 30 000 bases, a été séquencé pour la première fois le 5 janvier 2020 par une équipe de l'université Fudan de Shanghai (Chine). Cet ARN simple brin code notamment une volumineuse ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp pour RNA-dependent RNA
polymerase) et plusieurs protéines structurales dont une glycoprotéine de surface (S pour « Spike protein ») responsable de l’aspect en couronne du virus en microscopie électronique.The SARS-CoV-2 virus is an enveloped, RNA-positive virus that belongs to the family Coronaviridae, subfamily Coronavirinae, genus Betacoronavirus and subgenus Sarbecovirus. Like SARS-CoV, SARS-CoV-2 is a bat virus that has adapted to humans in ways that have yet to be elucidated. The viral RNA, approximately 30,000 bases long, was sequenced for the first time on January 5, 2020 by a team from Fudan University in Shanghai (China). This single-stranded RNA notably encodes a large RNA-dependent RNA polymerase (RdRp for RNA-dependent RNA polymerase) and several structural proteins including a surface glycoprotein (S for "Spike protein") responsible for the crown appearance of the virus in electron microscopy.
A la fin de l’année 2020, sont apparus de nouveaux variants viraux du SARS-CoV-2 dont l’efficacité de la transmission interhumaine est accrue, suite à l’apparition de nouvelles mutations du génome. At the end of 2020, new viral variants of SARS-CoV-2 appeared whose efficiency of human-to-human transmission is increased, following the appearance of new mutations in the genome.
De nombreuses techniques de diagnostic in vitro de la présence d’un virus spécifique chez un être humain hôte (infecté) sont connues de la personne de l’art. Sont présentées ci- dessous les techniques les plus utilisées de diagnostic direct, c’est-à-dire indiquant la présence ou l’absence du virus dans un échantillon biologique issu d’un individu, avec ou sans quantification de la charge virale. Many techniques for in vitro diagnosis of the presence of a specific virus in an (infected) human host are known to those skilled in the art. The most widely used direct diagnostic techniques are presented below, i.e. indicating the presence or absence of the virus in a biological sample from an individual, with or without quantification of the viral load.
Ces techniques de détection sont de deux types : celles basées sur la détection de l’acide nucléique du virus, et celles basées sur la détection d'antigènes (protéines ou sucres) du virus, au sein de l’échantillon biologique. These detection techniques are of two types: those based on the detection of the nucleic acid of the virus, and those based on the detection of antigens (proteins or sugars) of the virus, within the biological sample.
En ce qui concerne la détection du SARS-CoV-2, ces deux types de techniques ont été développées au cours de l’année 2020. Regarding the detection of SARS-CoV-2, these two types of techniques have been developed during the year 2020.
Techniques de détection de l’acide nucléique viral basées sur l’amplification des acides nucléiques Viral nucleic acid detection techniques based on nucleic acid amplification
Ces techniques sont basées sur l’amplification du matériel génétique de l’agent infectieux, ADN ou ARN en fonction de la nature du virus. Il existe trois types de technologies qui sont présentées ci-dessous. These techniques are based on the amplification of the genetic material of the infectious agent, DNA or RNA depending on the nature of the virus. There are three types of technologies which are presented below.
1. Technique basée sur l’amplification par polymérisation en chaîne (PCR), en particulier la RT -PCR en temps réel. 1. Technique based on polymerase chain reaction (PCR), in particular real-time RT-PCR.
La RT-PCR en temps réel comporte 3 étapes : (i) l’extraction des acides nucléiques de l’échantillon, (ii) la transcription inverse des ARN de l’échantillon en ADN complémentaires grâce à l’utilisation d’une réverse transcriptase (RT) et (iii) l’amplification du génome viral grâce à des amorces spécifiques de certains gènes de ce virus par technique de PCR en temps réel. Real-time RT-PCR involves 3 steps: (i) extraction of nucleic acids from the sample, (ii) reverse transcription of sample RNAs into complementary DNAs through the use of a reverse transcriptase (RT) and (iii) amplification of the viral genome using specific primers for certain genes of this virus by real-time PCR technique.
Cette amplification « en temps réel », abrégée rt-PCR ou qPCR (pour real-time PCR ou quantitative PCR), permet d’avoir une estimation de la charge virale de l’échantillon exprimée en valeur de Ct, le terme Ct ou cycle threshold correspondant au nombre de cycles de PCR à partir duquel un signal fluorescent est détecté en PCR : plus la valeur de Ct est faible, plus le signal apparaît précocement au cours du processus d’amplification et plus la charge virale estimée est élevée.
En termes pratiques, la réaction de RT-PCR quantitative comprenant les 3 étapes mentionnées ci-dessus nécessite 3 à 4 heures à partir de l’arrivée de l’échantillon au laboratoire, ce qui constitue pour le moment un délai de réponse incompressible de la technique. This "real-time" amplification, abbreviated rt-PCR or qPCR (for real-time PCR or quantitative PCR), provides an estimate of the viral load of the sample expressed as a Ct value, the term Ct or cycle threshold corresponding to the number of PCR cycles from which a fluorescent signal is detected in PCR: the lower the Ct value, the earlier the signal appears during the amplification process and the higher the estimated viral load. In practical terms, the quantitative RT-PCR reaction comprising the 3 steps mentioned above requires 3 to 4 hours from the arrival of the sample at the laboratory, which currently constitutes an incompressible response time for the technical.
Certains tests moléculaires basées sur la PCR permettent d’obtenir un résultat en environ une heure. Il s’agit de tests commerciaux comme BioFire® (BioMérieux), Cobas LIAT® (Roche Diagnostics), QIAstat Respiratory Panel-A (Q.IAGEN) ou Xpert® Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid). Hormis leur coût, leur principale limite reste la difficulté à les utiliser dans le cadre de grandes séries, ce qui les réserve plutôt à l’investigation de situations d’urgence et des cas graves. Some PCR-based molecular tests can get a result in about an hour. These are commercial tests such as BioFire® (BioMérieux), Cobas LIAT® (Roche Diagnostics), QIAstat Respiratory Panel-A (Q.IAGEN) or Xpert® Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid). Apart from their cost, their main limitation remains the difficulty of using them in the context of large series, which reserves them more for the investigation of emergency situations and serious cases.
La PCR digitale (dPCR) est une variante technologique de test PCR qui permet de réaliser simultanément plusieurs dizaines de milliers de réactions PCR au sein d’une puce microfluidique ou d’un aérosol de gouttelettes micronisées dans une émulsion d’huile. Comme la RT-PCR classique, la RT-PCR digitale en temps réel permet d’obtenir une semi- quantification de la charge virale des signaux PCR. Digital PCR (dPCR) is a technological variant of the PCR test that allows several tens of thousands of PCR reactions to be carried out simultaneously within a microfluidic chip or an aerosol of micronized droplets in an oil emulsion. Like conventional RT-PCR, real-time digital RT-PCR provides semi-quantification of the viral load of PCR signals.
2. Techniques moléculaires basées sur l’amplification isotherme 2. Molecular techniques based on isothermal amplification
Lors de ces tests, l’amplification du matériel génétique se fait à température constante, ce qui ne nécessite pas, contrairement aux techniques basées sur la PCR, l’utilisation d’un thermocycleur. On parle alors de techniques d’amplification isotherme. During these tests, the amplification of the genetic material is done at a constant temperature, which does not require, unlike PCR-based techniques, the use of a thermal cycler. This is referred to as isothermal amplification techniques.
L’une des méthodes les plus utilisées est la Transcription-mediated amplification (TMA). Cette technique ne permet pas de semi-quantification car le signal positif est généré en fin de réaction. Sa sensibilité est équivalente à celle de la RT-PCR. One of the most widely used methods is transcription-mediated amplification (TMA). This technique does not allow semi-quantification because the positive signal is generated at the end of the reaction. Its sensitivity is equivalent to that of RT-PCR.
Une autre technique, la RT-LAMP pour Loop-mediated isothermal amplification, combine une transcriptase inverse, une ADN polymérase possédant une forte activité de déplacement de brin et 4 à 6 amorces ciblant différentes régions du génome à détecter ; la lecture se fait par détection colorimétrique ou de fluorescence. Du fait de leur coût modeste, les tests commerciaux basés sur ce principe connaissent actuellement un grand essor pour la détection de l’ARN du SARS-CoV-2. Ces tests sont faciles à mettre en oeuvre et fournissent un résultat en moins d’une heure. Néanmoins, outre la possibilité de faux-positifs, la principale limite des tests LAMP reste la difficulté à les utiliser à grande échelle, ce qui conduit à les réserver plutôt à des situations d’urgence. Another technique, RT-LAMP for Loop-mediated isothermal amplification, combines a reverse transcriptase, a DNA polymerase with strong strand displacement activity and 4 to 6 primers targeting different regions of the genome to be detected; the reading is done by colorimetric or fluorescence detection. Due to their modest cost, commercial tests based on this principle are currently experiencing a boom for the detection of SARS-CoV-2 RNA. These tests are easy to implement and provide a result in less than an hour. Nevertheless, in addition to the possibility of false positives, the main limitation of LAMP tests remains the difficulty of using them on a large scale, which leads to their being reserved for emergency situations.
Enfin, la technique NEAR pour Nicking and extension amplification reaction utilise une ADN polymérase, deux amorces spécifiques de la cible à détecter et une enzyme de restriction capable de ne couper qu’un seul brin d’ADN (nicking enzyme). Cette technique, commercialisée par Abbott Diagnostics pour le diagnostic rapide de l’infection à SARS-CoV- 2 (test ID NOW COVID-19), est très simple à mettre en oeuvre et donne un résultat en moins
de 15 minutes. Il s’agit, comme la précédente, d’une technique destinée à des déterminations individuelles en situation d’urgence. Son manque de sensibilité a été pointé dans certaines études. Finally, the NEAR technique for Nicking and extension amplification reaction uses a DNA polymerase, two specific primers for the target to be detected and a restriction enzyme capable of cutting only a single DNA strand (nicking enzyme). This technique, marketed by Abbott Diagnostics for the rapid diagnosis of SARS-CoV-2 infection (ID NOW COVID-19 test), is very simple to implement and gives a result in less 15 minutes. It is, like the previous one, a technique intended for individual determinations in an emergency situation. Its lack of sensitivity has been pointed out in some studies.
3. Techniques moléculaires basées sur le séquençage haut débit 3. Molecular techniques based on high-throughput sequencing
Les techniques NGS (Next Génération Sequencing) permettent de séquencer à haut débit les acides nucléiques présents dans un échantillon environnemental ou clinique. Plusieurs plateformes commerciales sont actuellement disponibles dans les laboratoires spécialisés de biologie moléculaire. NGS (Next Generation Sequencing) techniques allow high-throughput sequencing of nucleic acids present in an environmental or clinical sample. Several commercial platforms are currently available in specialized molecular biology laboratories.
Néanmoins, la limite de la plupart de ces techniques reste actuellement leur délai de réalisation, de l’ordre de 9 à 12 heures, sans compter le temps d’analyse des résultats. Nevertheless, the limit of most of these techniques currently remains their completion time, of the order of 9 to 12 hours, not counting the time for analyzing the results.
Tests antigèniques rapides Rapid antigen tests
Ces tests immunologiques permettent de détecter, grâce à un ou des anticorps spécifiques, des antigènes spécifiques d’un virus. Il existe des tests antigéniques spécifiques de nombreux virus respiratoires (virus grippaux, virus respiratoire syncytial, ...). These immunological tests make it possible to detect, thanks to one or more specific antibodies, specific antigens of a virus. There are specific antigenic tests for many respiratory viruses (influenza virus, respiratory syncytial virus, etc.).
De tels tests antigéniques ont été développés pour détecter les antigènes spécifiques de SARS-CoV-2 (1 ). Ils détectent la présence d’une des protéines du virus SARS-CoV-2, généralement mais pas uniquement, la protéine de nucléocapside NP, dans un échantillon biologique. Such antigen tests have been developed to detect SARS-CoV-2 specific antigens (1). They detect the presence of one of the proteins of the SARS-CoV-2 virus, usually but not exclusively, the nucleocapsid protein NP, in a biological sample.
Les grands avantages de ces tests sont leur rapidité, leur facilité d’utilisation et d’interprétation. Ils sont majoritairement distribués sous la forme de tests unitaires rapides, également dénommés tests de diagnostic rapide (TDR). The great advantages of these tests are their speed, ease of use and interpretation. They are mainly distributed in the form of rapid unit tests, also called rapid diagnostic tests (RDTs).
La lecture des résultats se fait à l’œil nu (voir Figure 1 ) ou à l’aide d’un lecteur permettant une interprétation objective. Le résultat est disponible en une quinzaine de minutes. Ces tests peuvent être utilisés par des non biologistes sous forme de tests rapides d’orientation diagnostique (TROD) ou sous forme de tests de diagnostic rapide (TDR) au sein des laboratoires d’analyses médicales. Les mêmes normes de sécurité que pour des tests moléculaires (équipements de protection individuels, zone de manipulation dédiée, élimination sécurisée des déchets ...) doivent être appliquées par les manipulateurs. The reading of the results is done with the naked eye (see Figure 1) or using a reader allowing an objective interpretation. The result is available in about fifteen minutes. These tests can be used by non-biologists in the form of rapid diagnostic orientation tests (TROD) or in the form of rapid diagnostic tests (RDT) in medical analysis laboratories. The same safety standards as for molecular tests (personal protective equipment, dedicated handling area, secure disposal of waste, etc.) must be applied by the handlers.
Le principal écueil de ces tests antigèniques est leur manque de sensibilité par rapport aux tests moléculaires, les meilleurs d’entre eux permettant la détection du virus dans des échantillons qui, analysés en RT-PCR classique, présentent des valeurs de Ct de l’ordre de 30 ou inférieures. Cependant, ce type de test permet d’identifier rapidement des personnes présentant des charges virales élevées, par exemple dans les services d’urgence ou parmi les personnels soignants afin de prévenir les départs d’épidémie. Leur utilisation dans le
cadre du dépistage de patients asymptomatiques ou pauci-symptomatiques dits « super contaminateurs », dans un objectif de santé publique (dépistage de masse et dépistage ciblé) est donc recommandé. The main pitfall of these antigenic tests is their lack of sensitivity compared to molecular tests, the best of them allowing the detection of the virus in samples which, analyzed by conventional RT-PCR, present Ct values of the order 30 or lower. However, this type of test makes it possible to quickly identify people with high viral loads, for example in emergency services or among healthcare personnel in order to prevent the outbreak of an epidemic. Their use in the screening of asymptomatic or pauci-symptomatic patients known as “super contaminators”, with a public health objective (mass screening and targeted screening) is therefore recommended.
Echantillons biologiques utilisés pour le diagnostic d’une infection à SARS-CoV-2Biological samples used for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection
Les échantillons utilisés pour le diagnostic d’infection virales, notamment par le virus SARS- CoV-2, dépendent du stade de l’infection. The samples used for the diagnosis of viral infections, in particular by the SARS-CoV-2 virus, depend on the stage of infection.
Durant la phase précoce de l’infection, les prélèvements naso- ou oro-pharyngés obtenus par écouvillonnage profond du nez ou de la gorge (luette) sont les plus utilisés et les plus sensibles. Ils nécessitent une technique de prélèvement parfaitement maîtrisée. Le préleveur doit se protéger correctement (masque FFP2, lunettes ou visière de protection, double gantage, surblouse, hygiène des mains avant et après le geste) pour éviter les contaminations nosocomiales. During the early phase of the infection, naso- or oropharyngeal samples obtained by deep swab of the nose or throat (uvula) are the most used and the most sensitive. They require a perfectly mastered sampling technique. The sampler must protect themselves properly (FFP2 mask, protective glasses or visor, double gloves, overcoat, hand hygiene before and after the procedure) to avoid nosocomial contamination.
Le prélèvement naso-pharyngé profond peut s’avérer sinon douloureux du moins très désagréable pour le patient ; il reste néanmoins le mieux standardisé, sensible et constitue l’examen de référence, notamment chez les sujets symptomatiques suspects de maladie Covid-19. Deep nasopharyngeal sampling can be, if not painful, at least very unpleasant for the patient; it nevertheless remains the best standardized, sensitive and constitutes the reference examination, in particular in symptomatic subjects suspected of Covid-19 disease.
Durant cette même phase précoce, des prélèvements alternatifs de type auto-prélèvements, faciles à répéter chez des patients pauci- ou asymptomatiques, peuvent s’envisager au prix d’une sensibilité dégradée ; c’est le cas du prélèvement de salive au niveau de la gorge recueilli après des efforts de toux, en se raclant la gorge, et sans avoir bu et mangé depuis au moins 30 minutes, voire du prélèvement de salive endo-buccale ou de l’écouvillonnage du vestibule nasal antérieur. During this same early phase, alternative samples of the self-sampling type, easy to repeat in pauci- or asymptomatic patients, can be envisaged at the cost of degraded sensitivity; this is the case of the sample of saliva at the level of the throat collected after efforts of coughing, by clearing the throat, and without having eaten and drunk for at least 30 minutes, or even the sample of endo-oral saliva or the swab from the anterior nasal vestibule.
Ces auto-prélèvements seraient adaptés à un dépistage de masse. Ils présentent en effet l’avantage d’être non-invasifs, non douloureux, et peuvent facilement être réalisés sur des enfants. These self-sampling would be suitable for mass screening. They have the advantage of being non-invasive, non-painful, and can easily be performed on children.
Au stade de pneumonie virale, il faut avoir recours à des prélèvements plus profonds : crachats induits (et non salivaires) chez les patients non intubés, aspirations trachéales ou lavage broncho-alvéolaire (LBA) chez les patients en réanimation ; dans un certain nombre de cas, évalué à 30 % environ, l’ARN viral a été détecté dans les échantillons respiratoires profonds sans être amplifié dans les prélèvements oro- ou naso-pharyngés ; dans les formes très inflammatoires, le virus n’est même plus présent au niveau pulmonaire. At the viral pneumonia stage, deeper samples must be taken: induced sputum (and not saliva) in non-intubated patients, tracheal aspirations or bronchoalveolar lavage (BAL) in intensive care patients; in a certain number of cases, estimated at approximately 30%, the viral RNA was detected in the deep respiratory samples without being amplified in the oro- or nasopharyngeal samples; in highly inflammatory forms, the virus is no longer even present in the lungs.
Le virus peut également être recherché dans le sang et dans les selles, notamment au cours des infections sévères.
Tests diagnostiques pour détecter le SARS-CoV-2 The virus can also be sought in the blood and in the stool, especially during severe infections. Diagnostic tests to detect SARS-CoV-2
En l'absence de couverture vaccinale dont l’efficacité a été démontrée et de traitement spécifique, l'endiguement des épidémies repose principalement sur l'identification rapide et l'isolement des patients atteints de COVID-19 afin d'éviter une nouvelle propagation du virus.In the absence of vaccination coverage, the effectiveness of which has been demonstrated, and of specific treatment, the containment of epidemics relies mainly on the rapid identification and isolation of patients with COVID-19 in order to prevent further spread of the disease. virus.
Le diagnostic précoce est important dans ce contexte, non seulement pour le diagnostic et le suivi virologique éventuel des patients hospitalisés, mais aussi pour assurer la sécurité sanitaire des soignants, des premiers intervenants et de la population en général. Early diagnosis is important in this context, not only for the diagnosis and possible virological monitoring of hospitalized patients, but also to ensure the health safety of caregivers, first responders and the general population.
Le test de référence est aujourd’hui la détection par RT-PCR du virus SARS-CoV-2 dans des échantillons de sécrétions nasopharyngées. Ce test est sensible mais requiert quelques heures pour obtenir les résultats. The reference test today is the detection by RT-PCR of the SARS-CoV-2 virus in samples of nasopharyngeal secretions. This test is sensitive but requires a few hours to get the results.
Or, en fonction du contexte clinique et épidémiologique, d’autres types de stratégie diagnostique peuvent être considérées. However, depending on the clinical and epidemiological context, other types of diagnostic strategy may be considered.
En effet, dans le but de limiter la transmission interhumaine d’un virus contagieux, la sensibilité des tests de diagnostic peut devenir un critère de second plan, au regard de la praticabilité et de la rapidité de rendu des résultats desdits tests. La figure 2 présente les différents types de tests existants et leurs intérêts relatifs en termes de sensibilité et de rapidité d’obtention du résultat. Indeed, in order to limit the human-to-human transmission of a contagious virus, the sensitivity of diagnostic tests can become a secondary criterion, with regard to the practicability and the speed of rendering the results of said tests. Figure 2 presents the different types of existing tests and their relative advantages in terms of sensitivity and speed of obtaining the result.
Dans le cas du SARS-CoV-2, différentes études (2-4) contribuent à démontrer que la transmission interhumaine n’obéit pas à des règles suivant une distribution normale, mais qu’un faible nombre d’individus infectés pendant un laps de temps très court (deux jours avant et cinq jours après le pic de charge virale au niveau oro-naso-pharyngé) est à l’origine de la majorité des évènements de contamination. On désigne parfois ces individus par le terme de « super-contaminateurs ». In the case of SARS-CoV-2, various studies (2-4) contribute to demonstrating that interhuman transmission does not obey rules following a normal distribution, but that a small number of individuals infected during a period of very short time (two days before and five days after the viral load peak at the oro-naso-pharyngeal level) is the cause of the majority of contamination events. These individuals are sometimes referred to as “super-spreaders”.
En parallèle, des travaux récents de modélisation basés sur la cinétique de l’excrétion virale et la durée d’incubation de l’infection à SARS-CoV-2 ont cherché à préciser quel est l’impact de la rapidité de rendu du résultat sur la diminution de la transmission, appréciée par la réduction du taux de reproduction (RO) (5, 6). Les auteurs constatent que les exigences propres aux tests de dépistage pour la surveillance et le contrôle de l’épidémie sont différentes de celles des tests de diagnostic clinique. En effet, les tests qui ciblent les personnes symptomatiques nécessitent une sensibilité et une spécificité élevées et ne sont pas limités par le coût. Parce qu'ils sont symptomatiques, ces individus peuvent s'isoler dès l’apparition des symptômes, de telle sorte qu'un diagnostic retardé a moins de répercussion sur la transmission. En revanche, chez les personnes asymptomatiques ou pauci- symptomatiques, un retard de rendu de résultat, même très court (un jour), compromet l’efficacité du programme de dépistage, surtout si le sujet est à l’acmé de son excrétion
virale. A ce stade, le délai de rendu de résultats est beaucoup plus important que la sensibilité du test car même un test peu sensible sera capable de repérer l’infection. In parallel, recent modeling work based on the kinetics of viral excretion and the incubation period of SARS-CoV-2 infection has sought to clarify the impact of the speed of rendering the result on the decrease in transmission, assessed by the reduction in the reproductive rate (RO) (5, 6). The authors find that the specific requirements of screening tests for epidemic surveillance and control are different from those of clinical diagnostic tests. Indeed, tests that target symptomatic people require high sensitivity and specificity and are not limited by cost. Because they are symptomatic, these individuals can self-isolate as soon as symptoms appear, so that delayed diagnosis has less impact on transmission. On the other hand, in asymptomatic or pauci-symptomatic people, a delay in reporting results, even very short (one day), compromises the effectiveness of the screening program, especially if the subject is at the height of his excretion. viral. At this stage, the time to return results is much more important than the sensitivity of the test because even a low sensitivity test will be able to identify the infection.
Il est donc essentiel de mettre en oeuvre des stratégies de dépistage qui identifient les individus les plus à risque de disséminer l’infection, dans un temps court. It is therefore essential to implement screening strategies that identify the individuals most at risk of disseminating the infection, in a short time.
Les tests destinés aux campagnes de dépistage à grande échelle, dans le cadre d’une surveillance épidémiologique, doivent répondre aux critères suivants : la facilité d’exécution, la rapidité de rendu du résultat, le caractère peu invasif du prélèvement et un coût faible. En effet, lors de ces campagnes de dépistage, l’objectif est de détecter les sujets les plus à risque de transmission, et notamment les sujets dits super-contaminateurs. Un autre objectif est de pouvoir répéter ces tests le plus souvent possible. Tests intended for large-scale screening campaigns, within the framework of epidemiological surveillance, must meet the following criteria: ease of execution, speed of rendering the result, minimally invasive nature of the sample and low cost. Indeed, during these screening campaigns, the objective is to detect the subjects most at risk of transmission, and in particular the subjects known as super-contaminators. Another goal is to be able to repeat these tests as often as possible.
Afin de rendre cette stratégie acceptable pour le plus grand nombre, il faut pouvoir recourir à des auto-prélèvements d’échantillons biologiques (salive, prélèvements de la cavité nasale antérieure ...) donnant des résultats moins sensibles mais beaucoup plus adaptés à des surveillances continues. In order to make this strategy acceptable to the greatest number, it is necessary to be able to resort to self-sampling of biological samples (saliva, samples from the anterior nasal cavity, etc.) giving results that are less sensitive but much more suitable for monitoring. continue.
Ainsi, dans un contexte de stratégie de dépistage à grande échelle et en continu, il est urgent de proposer des tests de diagnostic direct peu invasifs en termes d’échantillons biologiques, et permettant un rendu de résultats plus rapide que les tests par RT-PCR.Thus, in the context of a large-scale and continuous screening strategy, it is urgent to offer direct diagnostic tests that are minimally invasive in terms of biological samples, and allow results to be returned more quickly than RT-PCR tests. .
Il a été proposé d’utiliser des échantillons de salive pour détecter le SARS-CoV-2 (9, 10).It has been proposed to use saliva samples to detect SARS-CoV-2 (9, 10).
Néanmoins, ces échantillons de salive ne sont généralement pas assez concentrés en virus pour que la détection puisse être réalisée par un test immunologique, et ce alors que l’infection virale est présente et est validée par un test de RT-PCR. Nevertheless, these saliva samples are generally not concentrated enough in virus for detection to be carried out by an immunological test, even though the viral infection is present and is validated by an RT-PCR test.
La présente invention concerne un nouveau procédé de diagnostic d’une infection virale, basé sur l’utilisation d’un échantillon biologique combiné de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur, la détection du virus étant réalisée par un test immunologique, et la sensibilité du procédé de diagnostic étant satisfaisante grâce à cette combinaison de deux types d’échantillons biologiques. The present invention relates to a new method for diagnosing a viral infection, based on the use of a combined biological sample of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule, the detection of the virus being carried out by an immunological test, and the sensitivity of the diagnostic method being satisfactory thanks to this combination of two types of biological samples.
RESUME DE L’INVENTION SUMMARY OF THE INVENTION
La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d’une infection virale due à la présence d’un virus chez un individu, comprenant une étape de détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur un échantillon biologique dudit individu, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu. The present invention relates to a method for the in vitro diagnosis of a viral infection due to the presence of a virus in an individual, comprising a step of detecting at least one specific antigen of said virus by an immunological test carried out on a biological sample. of said individual, characterized in that said biological sample consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of said individual.
Selon une mise en oeuvre particulière, le virus détecté est le coronavirus SARS-CoV-2.
La présente invention concerne également une trousse de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, comprenant : i) des dispositifs médicaux pour effectuer et collecter des prélèvements salivaires et narinaires antérieurs, ii) un test immunologique comprenant au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du virus, ainsi que les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de ce test. According to a particular implementation, the virus detected is the SARS-CoV-2 coronavirus. The present invention also relates to a diagnostic kit for implementing the method described above, comprising: i) medical devices for taking and collecting anterior saliva and nasal samples, ii) an immunological test comprising at least one antibody binding to at least one specific antigen of the virus, as well as the reagents necessary for the implementation of this test.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figure 1. Illustration d’un test immuno-chromatographique (COVID19Speed-Antigen Test de la Société BioSpeedia). Le prélèvement est déposé dans la cupule S située au bas de la figure. La ligne C correspond au Contrôle de bon fonctionnement du test ; son absence est synonyme d’un test invalide. La ligne T (Test) correspond à la détection de la protéine N du virus SARS- CoV-2. Le test présenté à gauche montre une réactivité négative. Le test présenté au centre montre une réactivité faiblement positive. Le test présenté à droite montre une réactivité positive. Figure 1. Illustration of an immuno-chromatographic test (COVID19Speed-Antigen Test from BioSpeedia). The sample is placed in cup S located at the bottom of the figure. Line C corresponds to the Check that the test is working properly; its absence is synonymous with an invalid test. The T line (Test) corresponds to the detection of the N protein of the SARS-CoV-2 virus. The test shown on the left shows negative reactivity. The test presented at the center shows a weakly positive reactivity. The test shown on the right shows positive reactivity.
Figure 2. Distribution des principaux tests de diagnostic direct de l’infection à SARS-CoV-2 en fonction de leur sensibilité et de leur délai de réponse. Dans le cadre d’un dépistage non ciblé, la répétition de tests faciles à mettre en oeuvre et de rendu rapide peut être plus efficace en termes de santé publique, pour détecter les sujets infectés et les isoler, que des techniques très sensibles. Figure 2. Distribution of the main direct diagnostic tests for SARS-CoV-2 infection according to their sensitivity and response time. In the context of non-targeted screening, the repetition of tests that are easy to implement and quickly returned can be more effective in terms of public health, in order to detect infected subjects and isolate them, than very sensitive techniques.
Figure 3. Réalisation du prélèvement et du test selon l’invention, avec un kit comprenant un écouvillon pour prélèvement de salive. Les conclusions diagnostiques sont présentées. Figure 3. Performing the sampling and the test according to the invention, with a kit comprising a swab for saliva sampling. Diagnostic findings are presented.
3A) Page 1 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique, comprenant la liste des dispositifs : (1 ) Ecouvillons pour le prélèvement buccal (extrémité plus large), (2) Ecouvillons pour le prélèvement nasal, (3) Tubes d’extraction, (4) Capuchons compte-gouttes, (5) Cassettes et flacon de tampon d’extraction. 3A) Page 1 of the instructions for use of the diagnostic kit, including the list of devices: (1 ) Swabs for buccal sampling (larger end), (2) Swabs for nasal sampling, (3) Tubes of Extraction, (4) Dropper Caps, (5) Extraction Buffer Cassettes and Bottle.
3B) Page 2 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique, présentant les grandes étapes du prélèvement de salive avec écouvillon (prélèvement buccal) 3B) Page 2 of the instructions for use of the diagnostic kit, presenting the main stages of saliva sampling with a swab (oral sampling)
3C) Page 3 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique, présentant les grandes étapes du prélèvement de sécrétions du vestibule nasal antérieur avec écouvillon (prélèvement nasal) 3C) Page 3 of the instructions for use of the diagnostic kit, presenting the main steps for collecting secretions from the anterior nasal vestibule with a swab (nasal sampling)
3D) Page 4 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : lecture des résultats positif / négatif du procédé selon l’invention. Dans cet exemple, la ligne C est celle du contrôle interne qui doit être positif, la ligne T est celle du test de l’échantillon. Le cercle S représente le puits dans lequel deux gouttes d’échantillon biologique ont été déposées pour effectuer le test.
Figure 4. Réalisation du prélèvement et du test selon l’invention, avec un kit comprenant un contenant pour prélèvement de salive par salivation. 3D) Page 4 of the instructions for use of the diagnostic kit: reading of the positive/negative results of the method according to the invention. In this example, line C is for the internal control which should be positive, line T is for the sample test. The circle S represents the well in which two drops of biological sample were deposited to carry out the test. Figure 4. Performing the sample and the test according to the invention, with a kit comprising a container for sampling saliva by salivation.
4A) Page 1 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique, présentant le matériel4A) Page 1 of the instructions for use of the diagnostic kit, presenting the equipment
4B) Page 2 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique - Prélèvement de salive par salivation dans un contenant adapté, représenté en haut de la figure 4B) Page 2 of the instructions for use of the diagnostic kit - Collection of saliva by salivation in a suitable container, shown at the top of the figure
4C) Page 3 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : prélèvement nasal et combinaison avec le prélèvement de salive. 4C) Page 3 of the diagnostic kit instructions for use: nasal swab and combination with saliva swab.
Les différents schémas présentés en figure 4C sont commentés ci-dessous. The various diagrams presented in FIG. 4C are commented on below.
(1 ) et (2) Retirer l’écouvillon de son emballage puis (3) l’insérer dans la partie antérieure de la narine du patient (zone intermédiaire entre la partie humide et sèche). TOUTE la partie floquée doit être introduite dans le vestibule de la narine antérieure. Cette étape ne doit pas être douloureuse mais un réflexe lacrymal peut être observé. (1) and (2) Remove the swab from its packaging then (3) insert it into the anterior part of the patient's nostril (intermediate zone between the wet and dry part). ALL the flocked part must be introduced into the vestibule of the anterior nostril. This step should not be painful but a tear reflex can be observed.
(4) Demander au patient de se pincer la narine pour positionner l’écouvillon contre la paroi nasale tout en tournant doucement l’écouvillon 10 fois (environ 10 secondes) ; l’écouvillon doit toucher la paroi nasale pendant toute cette étape. Retirer l’écouvillon en maintenant la narine pincée. (4) Ask the patient to pinch their nostril to position the swab against the nasal wall while gently rotating the swab 10 times (approximately 10 seconds); the swab must touch the nasal wall throughout this step. Withdraw the swab keeping the nostril pinched.
(5) Prendre le tube dans le portoir et immerger la tête de l’écouvillon jusqu’au fond du tube.(5) Take the tube from the rack and immerse the swab head to the bottom of the tube.
(6) Mélanger soigneusement en tournant l’écouvillon au moins 10 fois ET en le pressant dans le tampon d’extraction en appuyant sur les parois du tube d’extraction (dripper) puis le ressortir en essorant fermement la tête de l'écouvillon le long de la paroi intérieure du tube d'extraction pour retenir autant de solution que possible dans le tube. Jeter l'écouvillon dans un conteneur pour produits présentant un risque biologique et fermer le tube d’extraction à l’aide du capuchon compte-gouttes. Attendre 2 minutes que le réactif agisse. (6) Mix carefully by turning the swab at least 10 times AND pressing it into the extraction buffer by pressing on the walls of the extraction tube (dripper) then take it out by firmly wringing the head of the swab the along the inside wall of the extraction tube to retain as much solution as possible in the tube. Discard the swab into a biohazard container and close the extraction tube with the dropper cap. Wait 2 minutes for the reagent to act.
(7) Prenez le tube et déposez 2 gouttes de la solution d'échantillon traité dans le puits « S » (tube d’extraction à la verticale). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulle d'air. L'échantillon commencera à migrer le long de la membrane. (7) Pick up the tube and place 2 drops of the treated sample solution into the “S” well (extraction tube upright). Make sure there are no air bubbles. The sample will begin to migrate along the membrane.
4D) Page 4 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : lecture des résultats positif / négatif du procédé selon l’invention. 4D) Page 4 of the instructions for use of the diagnostic kit: reading of the positive/negative results of the method according to the invention.
Négatif : Seule la ligne de contrôle (C) est visible. Aucun antigène du virus SARS-CoV-2 n'est détecté. Le résultat n'exclut pas une infection par le COVID-19 (voir la section limitations).Negative: Only the control line (C) is visible. No SARS-CoV-2 virus antigen is detected. The result does not exclude infection with COVID-19 (see limitations section).
Positif : Des bandes colorées apparaissent à la ligne de contrôle (C) et à la ligne de test (T). Le test est positif pour l'antigène du virus SARS-CoV-2. Positive: Colored bands appear at the control line (C) and at the test line (T). The test is positive for the SARS-CoV-2 virus antigen.
Invalide : La ligne de contrôle (C) est absente, ou seule la ligne (T) apparaît. Si cela se produit, le test doit être répété en utilisant une nouvelle cassette de test.
DESCRIPTION DETAILLEE Invalid: The control line (C) is absent, or only the line (T) appears. If this happens, the test should be repeated using a new test cassette. DETAILED DESCRIPTION
La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d’une infection virale due à la présence d’un virus chez un individu, comprenant une étape de détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur un échantillon biologique dudit individu, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu. The present invention relates to a method for the in vitro diagnosis of a viral infection due to the presence of a virus in an individual, comprising a step of detecting at least one specific antigen of said virus by an immunological test carried out on a biological sample. of said individual, characterized in that said biological sample consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of said individual.
Ce procédé de diagnostic in vitro est particulièrement adapté pour une campagne de dépistage de grande ampleur parmi la population générale, puisqu’il présente les avantages suivants : facilité d’exécution, non-invasivité du prélèvement préalable de l’échantillon biologique, et rapidité d’obtention des résultats (moins d’une heure). This in vitro diagnostic process is particularly suitable for a large-scale screening campaign among the general population, since it has the following advantages: ease of execution, non-invasiveness of the prior sampling of the biological sample, and rapidity of obtaining the results (less than an hour).
Alors que la personne de l’art considérait qu’un test antigénique ne serait pas suffisamment sensible pour être appliqué à un échantillon biologique consistant en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur, les inventeurs ont invalidé ce préjugé technique en démontrant qu’un test immunologique réalisé sur ce type d’échantillon présente les caractéristiques suivantes, par rapport aux résultats obtenus par un test RT- PCR réalisé sur un échantillon biologique constitué d’un prélèvement nasopharyngé : While the person skilled in the art considered that an antigenic test would not be sensitive enough to be applied to a biological sample consisting of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule, the inventors invalidated this technical prejudice by demonstrating that An immunological test carried out on this type of sample has the following characteristics, compared to the results obtained by an RT-PCR test carried out on a biological sample consisting of a nasopharyngeal swab:
• sensibilité (Se) de 0,875 ; • sensitivity (Se) of 0.875;
• spécificité (Sp) de 0,99. • specificity (Sp) of 0.99.
Comme cela est bien connu par la personne de l’art, la sensibilité (ou sélectivité) d'un test diagnostique mesure sa capacité à donner un résultat positif lorsqu'une hypothèse est vérifiée. Elle s'oppose à la spécificité, qui mesure la capacité d'un test diagnostique à donner un résultat négatif lorsque l’hypothèse n’est pas vérifiée. As is well known to those skilled in the art, the sensitivity (or selectivity) of a diagnostic test measures its ability to give a positive result when a hypothesis is verified. It is opposed to specificity, which measures the ability of a diagnostic test to give a negative result when the hypothesis is not verified.
Dans le cas présent, les résultats obtenus avec le procédé diagnostique selon l’invention ont été comparés aux résultats obtenus avec un test RT-PCR sur un échantillon nasopharyngé de 193 individus, qui à l’heure actuelle est le « gold standard » du test de détection du virus SARS-CoV-2. In the present case, the results obtained with the diagnostic method according to the invention were compared with the results obtained with an RT-PCR test on a nasopharyngeal sample of 193 individuals, which at present is the "gold standard" of the test. detection of the SARS-CoV-2 virus.
Echantillon biologique Biological sample
L’échantillon biologique utilisé dans ce test consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur d’un même individu, désigné ci-après l’individu testé.The biological sample used in this test consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of the same individual, hereinafter referred to as the individual tested.
Les définitions des différents types d’échantillons pour la recherche du SARS-CoV-2 ont été présentées dans l’avis du Haut Conseil de la Santé Publique du 11 /08/2020 (7). The definitions of the different types of samples for the search for SARS-CoV-2 were presented in the opinion of the Haut Conseil de la Santé Publique of 08/11/2020 (7).
Le prélèvement naso-pharyngé et le prélèvement nasal se différencient par la taille et la longueur de l’embout de l’écouvillon introduit dans la narine :
- pour réaliser un prélèvement naso-pharyngé, l’écouvillon de recueil des sécrétions est très fin et introduit dans la narine jusqu’au niveau du nasopharynx ; The nasopharyngeal swab and the nasal swab differ in the size and length of the swab tip introduced into the nostril: - to take a nasopharyngeal sample, the secretion collection swab is very thin and inserted into the nostril up to the level of the nasopharynx;
- pour le prélèvement nasal antérieur, le diamètre de l’écouvillon est plus important et de ce fait, le niveau d’introduction de l’extrémité distale de ce dernier est moins profond ; certains écouvillons présentent une collerette pour aider à apprécier la profondeur de leur introduction. Un écouvillon fin peut également être mis en oeuvre pour le prélèvement nasal du vestibule antérieur. - for anterior nasal sampling, the diameter of the swab is larger and therefore the level of introduction of the distal end of the latter is shallower; some swabs have a collar to help assess the depth of their introduction. A fine swab can also be used for nasal sampling of the anterior vestibule.
La valeur diagnostique du prélèvement dans le vestibule nasal antérieur a fait l’objet d’une revue publiée récemment (8). The diagnostic value of sampling in the anterior nasal vestibule has been the subject of a recently published review (8).
Au sens de l’invention, les termes suivants sont utilisés indifféremment : sécrétions du vestibule nasal antérieur , sécrétions narinaires antérieures , prélèvement nasal antérieur , et sécrétions nasales , et désignent tous un échantillon biologique obtenu par prélèvement des sécrétions présentes dans le vestibule nasal : For the purposes of the invention, the following terms are used interchangeably: secretions from the anterior nasal vestibule, anterior nostril secretions, anterior nasal swab, and nasal secretions, and all designate a biological sample obtained by sampling the secretions present in the nasal vestibule:
- en utilisant un écouvillon introduit dans la narine, et en recueillant les sécrétions présentes sur les parois du vestibule, et/ou - by using a swab introduced into the nostril, and by collecting the secretions present on the walls of the vestibule, and/or
- en demandant à l’individu testé de procéder à un reniflement ou un raclement de gorge préalablement à la collecte de sa salive. - by asking the tested individual to sniff or clear their throat before collecting their saliva.
En ce qui concerne la salive, elle est prélevée soit par salivation dans un récipient, soit à l’aide d’un écouvillon introduit dans la bouche de l’individu testé. With regard to saliva, it is taken either by salivation in a container, or using a swab introduced into the mouth of the tested individual.
Le procédé selon l’invention sera réalisé sur une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieure, qui pourra comprendre toute proportion de chaque élément, par exemple 50/50 en volume de salive et de sécrétions nasales, ou encore 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 40/60, 30/70, 20/80 ou 10/90 de salive/sécrétions nasales en volume. The method according to the invention will be carried out on a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule, which may comprise any proportion of each element, for example 50/50 by volume of saliva and nasal secretions, or even 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 40/60, 30/70, 20/80 or 10/90 saliva/nasal secretions by volume.
Selon une mise en oeuvre du procédé de l’invention, la salive est, préalablement à son prélèvement, enrichie en sécrétions nasales et/ou nasopharyngées et/ou expectorations. Ceci pourra être réalisé par différentes actions de l’individu testé, telles que : According to one implementation of the method of the invention, the saliva is, prior to its collection, enriched with nasal and/or nasopharyngeal secretions and/or sputum. This may be achieved by various actions of the tested individual, such as:
- une étape de reniflement, bouche fermée, destinée à faire descendre dans la bouche les sécrétions nasopharyngées, et/ou - a sniffing step, mouth closed, intended to lower nasopharyngeal secretions into the mouth, and/or
- un raclement de gorge, bouche fermée, destiné à faire remonter dans la bouche les sécrétions accumulées dans l’arrière gorge. - a clearing of the throat, mouth closed, intended to bring back into the mouth the secretions accumulated in the back of the throat.
Au sens de l’invention, on entend par sécrétions nasopharyngées les sécrétions prélevées au niveau du nasopharynx, et par expectorations les sécrétions issues des bronches de l’individu. For the purposes of the invention, nasopharyngeal secretions means the secretions taken from the nasopharynx, and sputum means the secretions from the bronchi of the individual.
Le procédé de l’invention est caractérisé en ce qu’il est réalisé sur un échantillon biologique constitué d’une combinaison de salive et de sécrétions nasales. Ces sécrétions nasales pourront être mélangées à la salive avant son prélèvement (par l’individu testé) ou après
deux prélèvements distincts, l’un de salive et l’autre de sécrétions du vestibule nasal antérieur. The method of the invention is characterized in that it is carried out on a biological sample consisting of a combination of saliva and nasal secretions. These nasal secretions may be mixed with saliva before its collection (by the individual tested) or after two separate samples, one of saliva and the other of secretions from the anterior nasal vestibule.
Dans le cas où la salive est combinée aux sécrétions nasales avant prélèvement, cette combinaison est facile à homogénéiser dans la bouche par l’individu testé, avant le prélèvement de salive par écouvillon ou par salivation dans un récipient. In the case where saliva is combined with nasal secretions before collection, this combination is easy to homogenize in the mouth by the individual tested, before the collection of saliva by swab or by salivation in a container.
Avantageusement, cet échantillon biologique combiné est facile à obtenir, sans intervention invasive (traumatisante) pour le patient, contrairement à l’écouvillonnage nasopharyngé.Advantageously, this combined biological sample is easy to obtain, without invasive (traumatic) intervention for the patient, unlike the nasopharyngeal swab.
Selon une première alternative du procédé, l’échantillon biologique est obtenu par auto- prélèvement(s) de l’individu testé ; selon une seconde alternative du procédé, l’échantillon biologique est obtenu par prélèvement(s) par du personnel de santé. Selon une troisième alternative, l’échantillon biologique est une combinaison d’auto-prélèvement(s) et de prélèvements réalisés par du personnel de santé. According to a first alternative of the method, the biological sample is obtained by self-sampling(s) of the tested individual; according to a second alternative of the process, the biological sample is obtained by sampling(s) by health personnel. According to a third alternative, the biological sample is a combination of self-sampling(s) and samples taken by health personnel.
Infection virale Viral infection
Le procédé de diagnostic selon l’invention peut être utilisé pour détecter toute infection virale, notamment toute infection virale pulmonaire, telle que notamment une infection par le virus influenza générant une grippe. The diagnostic method according to the invention can be used to detect any viral infection, in particular any pulmonary viral infection, such as in particular an infection by the influenza virus generating influenza.
Selon une mise en oeuvre préférée de l’invention, le procédé selon l’invention est un procédé de diagnostic in vitro du coronavirus SARS-CoV-2. According to a preferred implementation of the invention, the method according to the invention is an in vitro diagnostic method for the SARS-CoV-2 coronavirus.
Au sens de l’invention, on entend par « virus SARS-CoV-2 », « coronavirus SARS-CoV-2 » ou encore « SARS-CoV-2 » For the purposes of the invention, the term “SARS-CoV-2 virus”, “SARS-CoV-2 coronavirus” or “SARS-CoV-2” is understood to mean
(i) le coronavirus identifié en décembre 2019 dans la ville de Wuhan (province de Hubei, en Chine), générant la forme de pneumonie dénommée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Sa séquence génomique a été rendue publique le 5 janvier 2020 par une équipe de l'université Fudan de Shanghai (Chine), et (i) the coronavirus identified in December 2019 in the city of Wuhan (Hubei province, China), generating the form of pneumonia known as coronavirus disease 2019 (COVID-19). Its genomic sequence was made public on January 5, 2020 by a team from Fudan University in Shanghai (China), and
(ii) tout variant de ce coronavirus SARS-CoV-2, en particulier les variants suivants : variant britannique (VOC 202012/01 ), sud-africain (501 Y. V2) et brésilien (B.1.1.28), ainsi que les variants listés dans le tableau 1 ci-dessous. (ii) any variant of this SARS-CoV-2 coronavirus, in particular the following variants: British variant (VOC 202012/01), South African (501 Y. V2) and Brazilian (B.1.1.28), as well as the variants listed in Table 1 below.
Tableau 1. Variants du SARS-CoV-2 répertoriés à ce jour
Table 1. SARS-CoV-2 variants identified to date
Pré-traitement de l’échantillon biologique Pre-treatment of the biological sample
Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, le procédé est caractérisé en ce que l’échantillon biologique est fluidifié avant réalisation de l’étape de détection. Cette fluidification de l’échantillon biologique est une étape optionnelle du procédé de diagnostic.
Cette fluidification de l’échantillon biologique est obtenue par ajout d’un fluidifiant, choisi parmi ceux bien connus de la personne de l’art. According to a preferred implementation of the invention, the method is characterized in that the biological sample is fluidized before carrying out the detection step. This fluidification of the biological sample is an optional step of the diagnostic method. This thinning of the biological sample is obtained by adding a thinner, chosen from those well known to those skilled in the art.
On peut citer notamment les fluidifiants à base de N-acétyl-cystéine ou de dithiothréitol, tels que Digest-EUR® (Eurobio) ou Sputasol (ThermoFisher). Mention may in particular be made of plasticizers based on N-acetyl-cysteine or on dithiothreitol, such as Digest-EUR® (Eurobio) or Sputasol (ThermoFisher).
La dose de fluidifiant utilisé est facilement déterminable par la personne de l’art. The dose of plasticizer used is easily determined by the person skilled in the art.
Selon une mise en oeuvre, le procédé de diagnostic in vitro selon l’invention comprend les étapes suivantes : a) fluidification d’un échantillon biologique d’un individu susceptible d’être infecté par un virus ; b) détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur ledit échantillon biologique fluidifié, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu. According to one implementation, the in vitro diagnostic method according to the invention comprises the following steps: a) fluidification of a biological sample from an individual likely to be infected by a virus; b) detection of at least one specific antigen of said virus by an immunological test carried out on said fluidized biological sample, characterized in that said biological sample consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of said individual.
Test immunologique utilisé pour les étapes de détection Immunoassay used for detection steps
Le procédé de diagnostic in vitro est caractérisé en ce que l’étape de détection est réalisée grâce à un test immunologique. The in vitro diagnostic process is characterized in that the detection step is carried out using an immunological test.
Ledit test immunologique est caractérisé par (i) la nature du ou des anticorps compris dans ledit test et (ii) le type de test immunologique (réactifs, visualisation des résultats). Ces deux caractéristiques sont développées ci-dessous. Said immunological test is characterized by (i) the nature of the antibody or antibodies included in said test and (ii) the type of immunological test (reagents, visualization of results). These two characteristics are developed below.
Selon une mise en oeuvre préférée, le test immunologique comprend au moins un anticorps reconnaissant de manière spécifique au moins un antigène du virus SARS-CoV-2. According to a preferred implementation, the immunological test comprises at least one antibody specifically recognizing at least one antigen of the SARS-CoV-2 virus.
La notion de « reconnaissance spécifique anticorps/antigène » signifie, au sens de l’invention, que chaque anticorps du test reconnaît et se lie à un épitope d’un antigène du virus SARS-CoV-2 de manière spécifique. The concept of “specific antibody/antigen recognition” means, within the meaning of the invention, that each antibody of the test recognizes and binds to an epitope of an antigen of the SARS-CoV-2 virus in a specific manner.
L’antigène détecté pourra être de toute nature moléculaire, permettant d’identifier spécifiquement le virus SARS-CoV-2 dans un échantillon biologique. Il s’agira en particulier d’un antigène protéique. The antigen detected may be of any molecular nature, making it possible to specifically identify the SARS-CoV-2 virus in a biological sample. It will in particular be a protein antigen.
Par « test immunologique » on entend au sens de l’invention un test permettant de détecter au moins un antigène de virus SARS-CoV-2 grâce à au moins un anticorps reconnaissant de manière spécifique cet antigène, ledit anticorps étant couplé à un réactif pouvant être détecté, ou à une enzyme réagissant à l’ajout d’un réactif de détection.
Ledit réactif de détection pourra être en particulier un réactif coloré, fluorescent, luminescent, ou tout type de réactif de détection pouvant être détecté et/ou quantifié par des techniques bien connues de l’Homme du métier. By “immunological test” is meant within the meaning of the invention a test making it possible to detect at least one SARS-CoV-2 virus antigen thanks to at least one antibody specifically recognizing this antigen, said antibody being coupled to a reagent capable of be detected, or to an enzyme reacting to the addition of a detection reagent. Said detection reagent may in particular be a colored, fluorescent, luminescent reagent, or any type of detection reagent that can be detected and/or quantified by techniques well known to those skilled in the art.
Un test immunologique couramment utilisé est par exemple le test dit « ELISA » pour Enzyme-linked immunosorbent assay, dans lequel deux types d’anticorps sont utilisés, l’un étant spécifique de l’antigène à détecter, et l’autre réagissant aux complexes antigène- anticorps et étant couplé à une enzyme capable de générer l'émission d'un signal en présence d’un substrat chromogène ou fluorogène. A commonly used immunological test is for example the so-called "ELISA" test for Enzyme-linked immunosorbent assay, in which two types of antibodies are used, one being specific for the antigen to be detected, and the other reacting to the complexes antigen-antibody and being coupled to an enzyme capable of generating the emission of a signal in the presence of a chromogenic or fluorogenic substrate.
D’autres tests immunologiques classiques sont dits de type ‘immunochromatographique’. Ces tests associent une détection antigènique par anticorps, avec une migration sur membrane chromatographique du complexe antigène/anticorps. Other classic immunological tests are said to be of the 'immunochromatographic' type. These tests combine antigen detection by antibody, with migration on chromatographic membrane of the antigen/antibody complex.
Certains tests immunochromatographiques sont basés sur l’utilisation d’anticorps couplés à des nanoparticules, notamment des nanoparticules d’or. La migration des anticorps, éventuellement liés à au moins un antigène, s’effectue sur une membrane adaptée. La lecture des résultats est rapide, en général obtenue en 10 à 20 minutes. Some immunochromatographic tests are based on the use of antibodies coupled to nanoparticles, in particular gold nanoparticles. The migration of the antibodies, possibly linked to at least one antigen, takes place on a suitable membrane. The reading of the results is fast, generally obtained in 10 to 20 minutes.
Le test immunologique devra être utilisé selon les indications données par la notice du test.The immunological test must be used according to the indications given in the instructions for the test.
Selon une mise en oeuvre préférée du procédé selon l’invention, le test immunologique utilisé pour détecter un ou plusieurs antigène(s) du virus SARS-CoV-2 est un test immunochromatographique. According to a preferred implementation of the method according to the invention, the immunological test used to detect one or more antigen(s) of the SARS-CoV-2 virus is an immunochromatographic test.
En particulier, le test immunologique est un test immunochromatographique comprenant au moins un anticorps se liant spécifiquement à un antigène du virus SARS-CoV-2. In particular, the immunological test is an immunochromatographic test comprising at least one antibody binding specifically to an antigen of the SARS-CoV-2 virus.
Bien que la plupart des tests immunochromatographiques spécifiques du virus SARS-CoV-2 actuellement disponibles sur le marché soient indiqués pour détecter les virus SARS-CoV-2 dans des échantillons naso-pharyngés, ces tests peuvent également être utilisés, dans le cadre du procédé selon l’invention, sur des échantillons biologiques tels que décrits dans la présente demande, à savoir une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur. Although most immunochromatographic tests specific for SARS-CoV-2 virus currently available on the market are indicated for detecting SARS-CoV-2 viruses in nasopharyngeal specimens, these tests can also be used, as part of the method according to the invention, on biological samples as described in the present application, namely a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule.
Ainsi, les tests pouvant être utilisés pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon l’invention sont notamment les tests cités dans la liste non-exhaustive suivante : Thus, the tests that can be used for the implementation of the diagnostic method according to the invention are in particular the tests mentioned in the following non-exhaustive list:
- Rapid SARS-CoV-2 Antigen Test Card 07AG6020B MP BIOMEDICAL MP biomédical France- Rapid SARS-CoV-2 Antigen Test Card 07AG6020B MP BIOMEDICAL MP biomedical France
- 2019-nCoV Antigen Test Kit (colloïdal gold method) TEST ANTIGENIQUE DU 2019-nCoV Guangdong Hecin Scientific EXOPHARM - 2019-nCoV Antigen Test Kit (colloidal gold method) ANTIGENIC TEST FOR 2019-nCoV Guangdong Hecin Scientific EXOPHARM
- AFIAS Covid -19 Ag Boditech Med Eurobio - AFIAS Covid-19 Ag Boditech Med Eurobio
- AMP SARS COV 2 Ag AMEDA Labordiagnostik AB-LAB - AMP SARS COV 2 Ag AMEDA Labordiagnostik AB-LAB
- Antigène Coronavirus (SARS-CoV-2) -Prélèvement Nasopharyngé Tody Laboratories BeDiaGenomics
- Antigène Coronavirus (SARS-CoV-2) -Prélèvement Nasopharyngé Tody Laboratories EUROCOMPUB - Coronavirus antigen (SARS-CoV-2) - Nasopharyngeal sample Tody Laboratories BeDiaGenomics - Coronavirus antigen (SARS-CoV-2) - Nasopharyngeal sample Tody Laboratories EUROCOMPUB
- BIOCREDIT COVID-19 Ag RapiGEN TANITCARE - BIOCREDIT COVID-19 Ag RapiGEN TANITCARE
- BIOSYNEX® COVID-19 Ag + BSS BIOSYNEX Swiss BIOSYNEX - BIOSYNEX® COVID-19 Ag + BSS BIOSYNEX Swiss BIOSYNEX
- BIOSYNEX® COVID-19 Ag BSX BIOSYNEX Swiss BIOSYNEX - BIOSYNEX® COVID-19 Ag BSX BIOSYNEX Swiss BIOSYNEX
- Biosynex Covid-19 Ag BSS Biosynex Swiss BIOSYNEX - Biosynex Covid-19 Ag BSS Biosynex Swiss BIOSYNEX
- CLINITEST® Rapid COVID-19 Antigen Test Healgen Scientific Siemens Healthcare - CLINITEST® Rapid COVID-19 Antigen Test Healgen Scientific Siemens Healthcare
- COVID-19 Ag Color CERTEST BIOTEC Groupe Servibio - COVID-19 Ag Color CERTEST BIOTEC Servibio Group
- COVID-19 Antigen Rapid Test HANGZHOU ALLTEST BIOTECH Eurocompub - COVID-19 Antigen Rapid Test HANGZHOU ALLTEST BIOTECH Eurocompub
- COVID-19 Antigen Rapid Test (Nasopharyngeal Swab) ACRO BIOTECH SERVIBIO - COVID-19 Antigen Rapid Test (Nasopharyngeal Swab) ACRO BIOTECH SERVIBIO
- COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech CHONDROFRANCE - COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech CHONDROFRANCE
- COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech ALTHEA - COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech ALTHEA
- COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech CLI NISCI ENCES - COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech CLI NISCI ENCES
- COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech DEA - COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech DEA
- COVID-19 Antigen rapid test kit SAFECARE Biotech TANITCARE - COVID-19 Antigen rapid test kit SAFECARE Biotech TANITCARE
- COVID-19 Cassette de Test rapide antigènique Clongene Biotech HAPPY BUSINESS ZRT- COVID-19 Clongene Biotech HAPPY BUSINESS ZRT Antigen Rapid Test Cassette
- COVID-19 Test Kit (Gold colloïdal method) Hangzhou Singclean Medical Products TANITCARE- COVID-19 Test Kit (Gold colloidal method) Hangzhou Singclean Medical Products TANITCARE
- COVID-19 antigen rapid test Prima Lab MYLAN SAS - COVID-19 antigen rapid test Prima Lab MYLAN SAS
- COVID-19-CHECK-1 Antigen VEDALAB - COVID-19-CHECK-1 Antigen VEDALAB
- COVID-VIRO® AAZ BIOGARAN - COVID-VIRO® AAZ BIOGARAN
- COVID-VIRO® Test Rapide Antigène COVID-19 AAZ - COVID-VIRO® COVID-19 AAZ Antigen Rapid Test
- COVIgen® Test antigènique de détection rapide du SARS-CoV-2 (COVID-19) Hangzhou Clongene Biotech PREVENTYS - COVIgen® Antigen test for the rapid detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Hangzhou Clongene Biotech PREVENTYS
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD FASUAL CARE - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette HANGZHOU REALY TECH CO., LTD FASUAL CARE
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Art Import - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Art Import
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD EUROCOMPUB - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette HANGZHOU REALY TECH CO., LTD EUROCOMPUB
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD IMOP Santé - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette HANGZHOU REALY TECH CO., LTD IMOP Health
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HANGZHOU REALY TECH CO., LTD CONSUL TRADE - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette (swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD CONSUL TRADE
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- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD C2 CORNER - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD C2 CORNER
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Planète Médicale - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Medical Planet
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD ADVENT GROUP - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD ADVENT GROUP
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Guanxi - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Guanxi
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD SOMVAN EUROPE - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD SOMVAN EUROPE
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Wemade - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Wemade
- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD VALTRADE - Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Antigen Rapid Test Cassette HANGZHOU REALY TECH CO., LTD VALTRADE
- CerTest SARS-CoV-2 ONE STEP SARS-CoV-2 Ag CARD TEST CERTEST BIOTEC THERADIAG- CerTest SARS-CoV-2 ONE STEP SARS-CoV-2 Ag CARD TEST CERTEST BIOTEC THERADIAG
- Coronavirus Ag rapide test cassette (swab) ZHEJIANG ORIENT GENE BIOTECH BioRad- Coronavirus Ag rapid test cassette (swab) ZHEJIANG ORIENT GENE BIOTECH BioRad
- Covid -19 antigen rapid test Spartacus biomed Spartacus biomed - Covid -19 antigen rapid test Spartacus biomed Spartacus biomed
- Covid Antigen Test Kit Guangdong Wesail Biotech Parnasia groupe - Covid Antigen Test Kit Guangdong Wesail Biotech Parnasia group
- Dispositif de test rapide de l 'antigène COVID-19 Rapid response BTNX clinisciences- COVID-19 Rapid response BTNX clinisciences antigen rapid test device
- Antigènique non automatisé (dont TROD) - Non-automated antigen (including TROD)
- EBS SARS-CoV-2 Ag Rapid Test EUROBIO Scientific - EBS SARS-CoV-2 Ag Rapid Test EUROBIO Scientific
- Epithod® 616 Covid-19 Ag Test Kit DxGen Groupe AIT - Epithod® 616 Covid-19 Ag Test Kit DxGen AIT Group
- Epithod® SARS-CoV-2 qAg Test Kit DxGen Corp. Groupe AIT - Epithod® SARS-CoV-2 qAg Test Kit DxGen Corp. AIT Group
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- un des deux tests rapides pour la détection d'antigènes du coronavirus SARS-CoV-2 développés par Biospeedia. - one of the two rapid tests for the detection of SARS-CoV-2 coronavirus antigens developed by Biospeedia.
De manière avantageuse, l’étape de détection du procédé selon l’invention met en oeuvre l’un des deux tests de détection du virus SARS-CoV-2 suivants: Advantageously, the detection step of the method according to the invention implements one of the following two detection tests for the SARS-CoV-2 virus:
- COVID19Speed Non-Invasive -Antigen Test BSD_0504-10 & BSD_0504-25, avec écouvillon pour prélèvement de salive dans la bouche ; et - COVID19Speed Non-Invasive -Antigen Test BSD_0504-10 & BSD_0504-25, with swab for saliva collection in the mouth; and
- COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25, comprenant un contenant de recueil de salive ; commercialisés par la société BIOSPEEDIA, dont les caractéristiques et les bonnes performances sont présentées dans la partie expérimentale. - COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25, including saliva collection container; marketed by the company BIOSPEEDIA, whose characteristics and good performances are presented in the experimental part.
Ces deux tests sont des tests immunochromatographiques mettant en oeuvre au moins un anticorps conjugué à l’or colloïdal, pour la détermination qualitative d’un antigène spécifique du SARS-CoV-2 dans un échantillon biologique humain. Les anticorps contre le SARS-CoV-2 sont immobilisés dans la région test (T) sur une membrane de nitrocellulose. L'antigène cible dans l'échantillon, s'il est présent, réagira avec l'anticorps anti-SARS-CoV-2 conjugué à l'or et formera un complexe anticorps-antigène. Lorsque ce complexe migre le
long de la membrane de nitrocellulose, il est capturé par un anticorps anti-SARS-CoV-2 adsorbé sur la membrane dans la région (T) du dispositif (anticorps anti-SARS-CoV-2 conjugué à l’or) - (antigène SARS-CoV-2) - (anticorps SARS-CoV-2), ce qui provoque l’apparition d’une ligne colorée rose pâle à rose foncé. Si l'échantillon ne contient pas l'antigène du SARS-CoV- 2, aucune ligne colorée n'apparaîtra dans la région de la ligne test (T), indiquant un résultat négatif. These two tests are immunochromatographic tests using at least one antibody conjugated with colloidal gold, for the qualitative determination of an antigen specific to SARS-CoV-2 in a human biological sample. Antibodies against SARS-CoV-2 are immobilized in the test region (T) on a nitrocellulose membrane. The target antigen in the sample, if present, will react with the gold-conjugated anti-SARS-CoV-2 antibody and form an antibody-antigen complex. When this complex migrates the along the nitrocellulose membrane, it is captured by an anti-SARS-CoV-2 antibody adsorbed on the membrane in the (T) region of the device (gold-conjugated anti-SARS-CoV-2 antibody) - (antigen SARS-CoV-2) - (SARS-CoV-2 antibody), which causes a light pink to dark pink colored line to appear. If the specimen does not contain SARS-CoV-2 antigen, no colored line will appear in the test line region (T), indicating a negative result.
Population d’individus testés Population of individuals tested
Tout individu susceptible de présenter une infection virale pourra être testé selon le procédé de diagnostic in vitro de l’invention. Any individual likely to have a viral infection can be tested according to the in vitro diagnostic method of the invention.
Dans la présente demande, les termes « individu », « individu testé » et « patient » sont utilisés de manière indifférente, et désignent tous l’être humain dont est issu l’échantillon biologique utilisé dans le procédé de diagnostic selon l’invention. Il s’agit en particulier d’un individu susceptible d’être infecté par un virus, ou ayant été en contact avec un autre individu dont l’infection virale a été confirmée. In the present application, the terms "individual", "tested individual" and "patient" are used interchangeably, and all designate the human being from whom the biological sample used in the diagnostic method according to the invention is derived. This is in particular an individual likely to be infected with a virus, or having been in contact with another individual whose viral infection has been confirmed.
Selon un aspect particulier du procédé, il s’agit d’un individu susceptible d’être infecté par un virus SARS-CoV-2, ou ayant été en contact avec un autre individu dont l’infection virale par SARS-CoV-2 a été confirmée. According to a particular aspect of the method, it is an individual likely to be infected by a SARS-CoV-2 virus, or having been in contact with another individual whose viral infection by SARS-CoV-2 has been confirmed.
Comme cela a déjà été présenté, ce procédé de diagnostic est adapté aux adultes (tout particulièrement à des personnes âgées de plus de 70 ans) et est particulièrement adapté aux enfants âgés de moins de 12 ans, et de manière préférée aux enfants âgés entre 3 et 12 ans. As has already been presented, this diagnostic method is suitable for adults (especially for people aged over 70) and is particularly suitable for children under the age of 12, and preferably for children aged between 3 and 12 years old.
Selon une mise en oeuvre du procédé, l’individu testé est âgé de plus de 70 ans. According to one implementation of the method, the individual tested is over 70 years old.
Selon une autre mise en oeuvre, l’individu testé est âgé de plus de 3 ans. According to another implementation, the tested individual is more than 3 years old.
Selon une autre mise en oeuvre, l’individu testé est âgé de 3 à 12 ans. According to another implementation, the tested individual is between 3 and 12 years old.
Selon une autre mise en oeuvre, l’individu testé est une personne devant subir des tests diagnostiques de manière régulière et répétée : cette population d’individus inclut notamment le personnel de santé dans les hôpitaux, ou le personnel travaillant dans les foyers de personnes âgées. According to another implementation, the individual tested is a person having to undergo diagnostic tests on a regular and repeated basis: this population of individuals includes in particular health personnel in hospitals, or personnel working in homes for the elderly .
Le procédé de diagnostic selon l’invention est en tout état de cause adapté à la population générale, que ce soit dans le cadre d’un programme de dépistage de masse, de tests dans des entreprises, dans des collectivités de sujets jeunes comme les écoles ou les universités, ou pour un criblage des voyageurs dans les aéroports.
Trousse de diagnostic The diagnostic method according to the invention is in any case suitable for the general population, whether in the context of a mass screening program, tests in companies, in communities of young subjects such as schools or universities, or for screening travelers at airports. Diagnostic kit
La présente invention concerne également une trousse de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, comprenant : i) des dispositifs médicaux pour effectuer et collecter des prélèvements salivaires et narinaires antérieurs, ii) un test immunologique comprenant au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du virus, ainsi que les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de ce test. The present invention also relates to a diagnostic kit for implementing the method described above, comprising: i) medical devices for taking and collecting anterior saliva and nasal samples, ii) an immunological test comprising at least one antibody binding to at least one specific antigen of the virus, as well as the reagents necessary for the implementation of this test.
Ces dispositifs médicaux sont notamment des écouvillons pour prélèvement nasal et/ou buccal ; et des contenants pour recueillir de la salive. Comme cela est présenté dans les exemples, les écouvillons adaptés pour le prélèvement de salive présentent une extrémité plus larges que ceux adaptés pour le prélèvement des sécrétions nasales du vestibule nasal antérieur. These medical devices are in particular swabs for nasal and/or buccal sampling; and containers for collecting saliva. As shown in the examples, the swabs suitable for collecting saliva have a wider end than those suitable for collecting nasal secretions from the anterior nasal vestibule.
Avantageusement, ladite trousse comprendra également une notice d’utilisation. Un exemple d’une telle notice est présenté en figures 3 et 4. Advantageously, said kit will also include instructions for use. An example of such a notice is shown in Figures 3 and 4.
Avantageusement, cette trousse comprendra un agent fluidifiant destiné à fluidifier l’échantillon biologique. Advantageously, this kit will comprise a thinning agent intended to thin the biological sample.
Selon une mise en oeuvre particulière, la trousse de diagnostic est destinée à un procédé de diagnostic in vitro de présence d’un virus SARS-CoV-2. Dans ce cas, le test immunologique fourni dans la trousse comprend au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du coronavirus SARS-CoV-2. According to a particular implementation, the diagnostic kit is intended for an in vitro diagnostic method for the presence of a SARS-CoV-2 virus. In this case, the immunological test provided in the kit comprises at least one antibody binding to at least one specific antigen of the SARS-CoV-2 coronavirus.
De manière avantageuse, cette trousse pourra être utilisée par des personnels de santé, mais également par des individus non spécialisés, pratiquant des auto-prélèvements et pouvant ainsi s’auto-diagnostiquer dans le cadre privé. Advantageously, this kit can be used by health personnel, but also by non-specialized individuals, practicing self-sampling and thus being able to self-diagnose in a private setting.
EXEMPLES EXAMPLES
Exemple 1. Population testée et tests de diagnostic classique versus l’invention BioSpeedia Example 1. Population tested and classic diagnostic tests versus the BioSpeedia invention
1.1. Population de patients 1.1. Patient population
Un total de 193 prélèvements de salives combinés avec des échantillons des sécrétions nasales antérieures provenant d’adultes et d’enfants admis au Centre Hospitalier Universitaire de Saint-Etienne (France), ou lors de campagnes de prélèvements, ont été étudiés. L’étude a été prospective. Le recueil et l’analyse des données cliniques et biologiques ont été faits a posteriori.
Le diagnostic de C0VID19 a été défini sur : A total of 193 saliva samples combined with samples of anterior nasal secretions from adults and children admitted to the Center Hospitalier Universitaire de Saint-Etienne (France), or during sampling campaigns, were studied. The study was prospective. The collection and analysis of clinical and biological data were done a posteriori. The diagnosis of C0VID19 was defined on:
(i) des critères cliniques évocateurs, (i) suggestive clinical criteria,
(ii) un test RT-PCR positif sur prélèvement nasopharyngé avec au moins deux cibles génétiques. (ii) a positive RT-PCR test on a nasopharyngeal swab with at least two genetic targets.
1.2. Diagnostic RT-PCR 1.2. RT-PCR diagnosis
Les échantillons prélevés ont été testés au Laboratoire de Virologie du plateau de biologie du CHU de Saint Etienne ou dans des laboratoires de biologie médicale en mettant en oeuvre des méthodes RT-PCR commercialisées, notamment : The samples taken were tested at the Virology Laboratory of the biology platform of the Saint Etienne University Hospital or in medical biology laboratories by implementing marketed RT-PCR methods, in particular:
- Argène (BioMérieux) SARS-COV-2 R-GENE® [PCR1 : SARS-COV-2 N gene (FAM) / Internai control (HEX) / SARS-COV-2 RdRp gene (CY5) / (https://www.biomerieux- diagnostics.com/sars-cov-2-r-gene)] - Argene (BioMérieux) SARS-COV-2 R-GENE® [PCR1: SARS-COV-2 N gene (FAM) / Internal control (HEX) / SARS-COV-2 RdRp gene (CY5) / (https:// www.biomerieux-diagnostics.com/sars-cov-2-r-gene)]
- IDNC0V2q - SARS-CoV-2 RNA détection kit by RT-PCR (https://www.id- solutions.fr/en/detection-kits/idncov2q/) sur CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument #12011319 (https://www.bio-rad.com/fr-fr/sku/12011319-cfx-opus-96-real-time-pcr- instrument? ) - IDNC0V2q - SARS-CoV-2 RNA detection kit by RT-PCR (https://www.id- solutions.fr/en/detection-kits/idncov2q/) on CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument #12011319 (https ://www.bio-rad.com/fr-fr/sku/12011319-cfx-opus-96-real-time-pcr-instrument?)
- CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic (https://www.fda.gov/media/134922/download) - CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic (https://www.fda.gov/media/134922/download)
1.3. Prélèvements et tests immunochromatographiques 1.3. Sampling and immunochromatographic tests
Prélèvements : Specimens :
Les échantillons biologiques testés ont été obtenus selon le protocole décrit en figures 3A, 3B et 3C. The biological samples tested were obtained according to the protocol described in FIGS. 3A, 3B and 3C.
Tests immunochromatographiques : Immunochromatographic tests:
Les tests ont été conduits sur tous les prélèvements obtenus selon les notices des kits « C0VID19Speed Non-Invasive -Antigen Test BSD_0504-10 & BSD_0504-25 » etThe tests were carried out on all the samples obtained according to the instructions for the "C0VID19Speed Non-Invasive -Antigen Test BSD_0504-10 & BSD_0504-25" kits and
« C0VID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25 » : voir figures 3 et 4. “C0VID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25”: see figures 3 and 4.
1.4. Résultats et performances du procédé selon l’invention par rapport aux résultats de la RT-PCR 1.4. Results and performance of the method according to the invention compared to the results of RT-PCR
A partir des prélèvements de salives combinés avec les sécrétions du vestibule nasal antérieur, les résultats d’une étude prospective sont les suivants :
Tableau 2
From saliva samples combined with secretions from the anterior nasal vestibule, the results of a prospective study are as follows: Table 2
Les variables descriptives, la sensibilité (Se), la spécificité (Sp) ont été rapportées avec leur intervalle de confiance (IC ou Cl) à 95 %. Des tests paramétriques et non paramétriques ainsi que les graphiques ont été effectués à l'aide du logiciel GraphPad Prism 5 (Californie, USA).Descriptive variables, sensitivity (Se), specificity (Sp) were reported with their 95% confidence interval (CI or Cl). Parametric and non-parametric tests as well as graphs were performed using GraphPad Prism 5 software (California, USA).
Les valeurs de P inférieures à 5% ont été considérées comme statistiquement significatives.P values less than 5% were considered statistically significant.
Les performances du procédé diagnostic selon l’invention par rapport au test RT-PCR réalisé sur des échantillons biologiques constitués de prélèvement nasopharyngés ont été les suivantes : The performances of the diagnostic method according to the invention compared to the RT-PCR test carried out on biological samples consisting of nasopharyngeal samples were as follows:
- sensibilité (Se) de 0,875 [Cl : 0,69 à 0,96] - sensitivity (Se) of 0.875 [Cl: 0.69 to 0.96]
- spécificité (Sp) de 0,99 [Cl : 0,97 à 0,99] - specificity (Sp) of 0.99 [Cl: 0.97 to 0.99]
Exemple 2. Procédé de diagnostic d’une infection à virus SARS-CoV-2 à l’aide d’un test immunochromatographique « COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 Et BSD_0505-25 » selon différents modes de prélèvements Example 2. Method for diagnosing a SARS-CoV-2 virus infection using an immunochromatographic test “COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 And BSD_0505-25” according to different sampling methods
2.1. Prélèvements et procédés mis en oeuvre 2.1. Samples and processes implemented
Prélèvements : Specimens :
Les variables explorées par rapport au procédé décrit en paragraphe 1.3 ont été : The variables explored with respect to the process described in paragraph 1.3 were:
- Echantillon biologique qui consiste une combinaison de salive et de sécrétion du vestibule nasal antérieur ; - Biological sample which consists of a combination of saliva and secretion from the anterior nasal vestibule;
- Fluidification de l’échantillon : échantillon fluidifié par addition d’un réactif comme Digest-EUR® (Eurobio) ou Sputasol (ThermoFisher) ou N-acétyl-cystéine. - Fluidification of the sample: sample fluidized by adding a reagent such as Digest-EUR® (Eurobio) or Sputasol (ThermoFisher) or N-acetyl-cysteine.
Test immunochromatographique :
Le test a été conduit selon la notice du test « COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25 ». Immunochromatographic test: The test was conducted according to the test insert “COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25”.
2.2. Résultats obtenus avec le test « COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 Et BSD_0505-25 « selon différents modes de prélèvements et de traitements 2.2. Results obtained with the “COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 And BSD_0505-25” test according to different sampling and treatment methods
Tous les patients testés ont un diagnostic de COVID19, à la fois clinique et biologique (RT- PCR positive sur écouvillon nasopharyngé). All the patients tested have a diagnosis of COVID19, both clinical and biological (positive RT-PCR on nasopharyngeal swab).
2.2.1. Prélèvements salivaires seuls sans combinaison avec les sécrétions du vestibule nasal antérieur, et non traité par fluidifiant 2.2.1. Salivary samples alone without combination with secretions from the anterior nasal vestibule, and not treated with thinner
Tableau 3
Table 3
N : nucléocapside du SARS-CoV-2 Rdtp : polymérase du SARS-Cov-2 N: SARS-CoV-2 nucleocapsid Rdtp: SARS-Cov-2 polymerase
Conclusion : l’échantillon biologique constitué de salive uniquement ne présente pas une charge virale et/ou la concentration antigénique suffisante ; le test immunologique utilisé n’est pas suffisamment sensible pour détecter le virus SARS-CoV-2 sur ces 4 échantillons. Conclusion: the biological sample consisting of saliva only does not present a sufficient viral load and/or antigenic concentration; the immunological test used is not sensitive enough to detect the SARS-CoV-2 virus on these 4 samples.
2.2.2. Prélèvement salivaire combiné avec un prélèvement de sécrétions du vestibule nasal antérieur, non traité par fluidifiant
Tableau 4
2.2.2. Saliva sample combined with a sample of secretions from the anterior nasal vestibule, not treated with thinner Table 4
Conclusion : la charge virale et/ou la concentration antigènique est suffisante sur une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur pour que le test immunologique détecte la présence de SARS-CoV-2. Conclusion: the viral load and/or the antigen concentration is sufficient on a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule for the immunological test to detect the presence of SARS-CoV-2.
2.2.3. Prélèvement salivaire combiné avec un prélèvement nasal antérieur, après fluidification chez des patients dont le TDR sur sécrétion nasopharyngée est négatif2.2.3. Saliva sampling combined with an anterior nasal swab, after fluidification in patients whose TDR on nasopharyngeal secretion is negative
Tableau 5
Table 5
Conclusion : la charge virale et/ou la concentration antigènique est suffisante sur une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur, après fluidification, pour que le test immunologique détecte la présence de SARS-CoV-2. Conclusion: the viral load and/or the antigen concentration is sufficient on a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule, after fluidification, for the immunological test to detect the presence of SARS-CoV-2.
2.2.4. Etude comparée sur différents modes de prélèvements sur un même sujet2.2.4. Comparative study on different sampling methods on the same subject
Les différents prélèvements ont été obtenus du sujet CPCHU 168 testé RT-PCR positif sur trois cibles : gène ORF (Ct 19,8), Nucléocapside (Ct 21 ,1 ) et Spike (Ct 20,2).
Tableau 6
The various samples were obtained from subject CPCHU 168 tested positive RT-PCR on three targets: ORF gene (Ct 19.8), Nucleocapsid (Ct 21.1) and Spike (Ct 20.2). Table 6
Conclusion : la charge virale et/ou la concentration antigénique de la combinaison salive est augmentée à la fois par la présence des sécrétions narinaires antérieures, ce qui permet d’obtenir un résultat positif avec un test immunologique. Conclusion: the viral load and/or the antigenic concentration of the saliva combination is increased both by the presence of the anterior nasal secretions, which makes it possible to obtain a positive result with an immunological test.
2.2.5. Etude comparée sur différents modes de prélèvements sans fluidification chez des patients PCR positifs sur prélèvements nasopharyngés 2.2.5. Comparative study on different sampling methods without fluidification in PCR positive patients on nasopharyngeal samples
Tableau 7. Exemples comparatifs
Table 7. Comparative examples
Conclusion : la charge virale et/ou la concentration antigénique de la salive est augmentée par la présence des sécrétions narinaires antérieures, et inversement, ce qui permet d’obtenir un résultat positif avec un test immunologique alors que : Conclusion: the viral load and/or the antigenic concentration of saliva is increased by the presence of anterior nasal secretions, and vice versa, which makes it possible to obtain a positive result with an immunological test whereas:
Le résultat basé sur l’analyse du prélèvement nasal antérieur était négatif (voir PA, LC) ou The result based on the analysis of the anterior nasal swab was negative (see PA, LC) or
Le résultat basé sur l’analyse du prélèvement salivaire était négatif (voir LK, ZM, GA et BM).
LISTE DES DOCUMENTS CITES The result based on the analysis of the saliva sample was negative (see LK, ZM, GA and BM). LIST OF CITED DOCUMENTS
1. Haute Autorité de Santé. Revue rapide sur les tests de détection antigénique du virus1. High Authority for Health. Quick review on antigen detection tests for the virus
SARS-CoV-2. 8 octobre 2020. Disponible sur : https://www.has- sante.fr/upload/docs/application/pdf/2020-10/synthese_tests_antigeniques_vd.pdfSARS-CoV-2. October 8, 2020. Available at: https://www.has-sante.fr/upload/docs/application/pdf/2020-10/synthese_tests_antigeniques_vd.pdf
2. He X, Lau EHY, Wu P, et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat Med. 2020;26:672-5. 2. He X, Lau EHY, Wu P, et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. NatMed. 2020;26:672-5.
3. Wong F, Collins JJ. Evidence that coronavirus superspreading is fat-tailed. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117:29416-8. 3. Wong F, Collins JJ. Evidence that coronavirus superspreading is fat-tailed. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117:29416-8.
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8. Comber L, Walsh KA, Jordan K, O'Brien KK, Clyne B, Teljeur C, Drummond L, Carty PG, De Gascun CF, Smith SM, Harrington P, Ryan M, O'Neill M. Alternative clinical specimens for the détection of SARS-CoV-2: A rapid review. Rev Med Virol. 2020 Oct 22. doi: 10.1002/rmv.2185. Epub ahead of print. PMID: 33091200. 8. Comber L, Walsh KA, Jordan K, O'Brien KK, Clyne B, Teljeur C, Drummond L, Carty PG, De Gascun CF, Smith SM, Harrington P, Ryan M, O'Neill M. Alternative clinical specimens for the detection of SARS-CoV-2: A rapid review. Rev Med Virol. 2020 Oct 22. doi: 10.1002/rmv.2185. Epub ahead of print. PMID: 33091200.
9. Kashiwagi K, Ishii Y, Aoki K, Yagi S, Maeda T, Miyazaki T, Yoshizawa S, Aoyagi K, Tateda K. Immunochromatographic test for the détection of SARS-CoV-2 in saliva. J Infect Chemother. 2021 Feb;27(2):384-386. doi: 10.1016/j.jiac.2020.11 .016. Epub 2020 Dec 23. 9. Kashiwagi K, Ishii Y, Aoki K, Yagi S, Maeda T, Miyazaki T, Yoshizawa S, Aoyagi K, Tateda K. Immunochromatographic test for the detection of SARS-CoV-2 in saliva. J Infect Chemother. 2021 Feb;27(2):384-386. doi: 10.1016/j.jiac.2020.11.016. Epub 2020 Dec 23.
10. Chen JH, Yip CC, Poon RW, Chan KH, Cheng VC, Hung IF, Chan JF, Yuen KY, To KK.10. Chen JH, Yip CC, Poon RW, Chan KH, Cheng VC, Hung IF, Chan JF, Yuen KY, To KK.
Evaluating the use of posterior oropharyngeal saliva in a point-of-care assay for the détection of SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect. 2020 Dec;9(1 ):1356-1359. doi:Evaluating the use of posterior oropharyngeal saliva in a point-of-care assay for the detection of SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect. 2020 Dec;9(1):1356-1359. must:
10.1080/22221751 .2020.1775133.
10.1080/22221751 .2020.1775133.
Claims
1. Procédé de diagnostic in vitro d’une infection virale due à la présence d’un virus chez un individu, comprenant une étape de détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur un échantillon biologique dudit individu, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu. 1. Method for in vitro diagnosis of a viral infection due to the presence of a virus in an individual, comprising a step of detecting at least one specific antigen of said virus by an immunological test carried out on a biological sample of said individual, characterized in that said biological sample consists of a combination of saliva and secretions from the anterior nasal vestibule of said individual.
2. Procédé de diagnostic selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la salive, préalablement à son prélèvement, a été enrichie en sécrétions nasales et/ou en sécrétions nasopharyngées et/ou en expectorations. 2. Diagnostic method according to claim 1, characterized in that the saliva, prior to its sampling, has been enriched with nasal secretions and/or nasopharyngeal secretions and/or sputum.
3. Procédé de diagnostic selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le virus est le coronavirus SARS-CoV-2. 3. Diagnostic method according to claim 1 or 2, characterized in that the virus is the SARS-CoV-2 coronavirus.
4. Procédé de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est fluidifié avant réalisation de l’étape de détection. 4. Diagnostic method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the biological sample is fluidized before carrying out the detection step.
5. Procédé de diagnostic selon la revendication 4, caractérisé en ce que l’échantillon biologique est fluidifié par ajout d’un fluidifiant, notamment à base de N-acétyl-cystéine ou du dithiothréitol. 5. Diagnostic method according to claim 4, characterized in that the biological sample is thinned by adding a thinner, in particular based on N-acetyl-cysteine or dithiothreitol.
6. Procédé de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le test immunologique est un test immuno-chromatographique. 6. Diagnostic method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the immunological test is an immunochromatographic test.
7. Procédé de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le test immunologique comprend au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique dudit virus. 7. Diagnostic method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the immunological test comprises at least one antibody binding to at least one specific antigen of said virus.
8. Procédé de diagnostic selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l’individu dont est issu l’échantillon biologique est âgé de plus de 3 ans.
8. Diagnostic method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the individual from whom the biological sample is taken is over 3 years old.
9. Trousse de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 8, comprenant : i) des dispositifs médicaux pour effectuer et collecter des prélèvements salivaires et narinaires antérieurs, ii) un test immunologique comprenant au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du virus, ainsi que les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de ce test. 9. Diagnostic kit for carrying out the method according to one of claims 1 to 8, comprising: i) medical devices for taking and collecting anterior saliva and nasal samples, ii) an immunological test comprising at least one antibody binding to at least one specific antigen of the virus, as well as the reagents necessary for the implementation of this test.
10. Trousse de diagnostic selon la revendication 9, caractérisée en que le test immunologique comprend au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du coronavirus SARS-CoV-2.
10. Diagnostic kit according to claim 9, characterized in that the immunological test comprises at least one antibody binding to at least one specific antigen of the SARS-CoV-2 coronavirus.
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