EP4259812A1 - Procédé de préparation de frambinone - Google Patents

Procédé de préparation de frambinone

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EP4259812A1
EP4259812A1 EP21839418.7A EP21839418A EP4259812A1 EP 4259812 A1 EP4259812 A1 EP 4259812A1 EP 21839418 A EP21839418 A EP 21839418A EP 4259812 A1 EP4259812 A1 EP 4259812A1
Authority
EP
European Patent Office
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carried out
frambinone
process according
bioconversion
hydroxybenzaldehyde
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP21839418.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Valéry DAMBRIN
Mirjana Gelo-Pujic
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Specialty Operations France SAS
Original Assignee
Specialty Operations France SAS
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Definitions

  • the present invention aims at the manufacture of natural frambinone by a new access route with good yields and high specificity.
  • step (a) of bioconversion of p-coumaric acid allowing the preparation of p-hydroxybenzaldehyde
  • the present invention also relates to the use of natural frambinone according to the present invention as a flavor or perfume.
  • the pH of the medium is adjusted to 8.4, a coumaric acid solution is introduced so as to obtain a final concentration of between 5 and 50 g/L.
  • the reaction medium is maintained at 37° C. and 170 rpm for 24 h. After 24 h of bioconversion, the biomass is removed by centrifugation, the supernatant is filtered and analyzed by HPLC. 4-hydroxy benzaldehyde is obtained, with a yield of between 60 and 99%.
  • Benzalacetone obtained according to Example 2 is mixed in each medium obtained after the growth period as described above.
  • the mixture is incubated at 30° C. with stirring (200 revolutions/min) for 48 hours (references 1 to 2) or 72 hours (reference 3).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation de frambinone naturelle comprenant : - une étape (a) de bioconversion d'acide p-coumarique permettant la préparation de p- hydroxybenzaldéhyde, - une étape (b) dans laquelle le p-hydroxybenzaldéhyde obtenu à l'issue de l'étape (a) est condensé avec de l'acétone pour permettre la formation de p-hydroxybenzalacetone, - une étape (c) dans laquelle le p-hydroxybenzalacetone obtenu à l'issue de l'étape (b) est transformé en frambinone par bioconversion ou biocatalyse.

Description

DESCRIPTION
Procédé de préparation de frambinone
Domaine de l’invention
La présente invention concerne un procédé de préparation de frambinone naturelle.
Art antérieur
La frambinone, ou 4-(4-hydroxyphényl)-2-butanone, est le principal composé aromatique de la framboise, mais également présent dans les canneberges ou les mûres.
La frambinone est utilisée en parfumerie, cosmétique ou dans l’industrie agro -alimentaire afin de donner une odeur fruitée.
Ce composé aromatique naturel peut être extrait des fruits à raison de 1 à 4 mg par kilogramme de framboise. Compte tenu de la très faible abondance de ce composé aromatique dans le fruit, des procédés de synthèse ont été développés, notamment :
Par alkylation du phénol en présence de buténone telle que décrite dans PR1227595, Par condensation du phénol en présence de 4-hydroxy-2-butanone, telle que décrite dans DE 2145308, CN104355977 ou CN104496778. Le 4-hydroxy-2-butanone est préparé par condensation d’acétone et de formaldéhyde.
Par condensation du phénol en présence de 2-acétyl-2-hydroxyméthyle d’acétate d’éthyle, telle que décrite dans PR 2221433. Le composé 2-acétyl-2-hydroxyméthyle d’acétate d’éthyle est préparé à partir de formaldehyde, et d’acéto-acétate d’éthyle, Par condensation du phénol avec l,3-dichloro-2-butène, telle que décrite dans JP01242549, ou
Par déméthylation, en présence d’acide bromhydrique, d’anisylacétone telle que décrite dans le document CN104193607.
A la connaissance des inventeurs, seuls des procédés synthétiques existent pour tenter de pallier à la faible abondance de la frambinone naturelle. Cependant les arômes synthétiques sont moins appréciés par les consommateurs que les arômes d’origine naturelle. La présente invention vise la fabrication de la frambinone naturelle par une nouvelle voie d’accès avec de bons rendements et une spécificité élevée.
Brève description
Un premier objet de la présente invention concerne un procédé de préparation de frambinone naturelle comprenant :
- une étape (a) de bioconversion d’acide p-coumarique permettant la préparation de p- hydroxybenzaldéhyde,
- une étape (b) dans laquelle le p-hydroxybenzaldéhyde obtenu à l’issue de l’étape (a) est condensé avec de l’acétone pour permettre la formation de p-hydroxybenzalacetone,
- une étape (c) dans laquelle le p-hydroxybenzalacetone obtenu à l’issue de l’étape (b) est transformé en frambinone par bioconversion ou biocatalyse.
Un autre objet de la présente invention concerne une frambinone naturelle susceptible d’être obtenue par le procédé de la présente invention.
La présente invention porte également sur l’utilisation de frambinone naturelle selon la présente invention en tant qu’ arôme ou parfum.
Enfin la présente invention porte sur une composition comprenant de la frambinone naturelle selon la présente invention choisie de préférence dans le groupe constitué par les produits alimentaires, les boissons, les formulations cosmétiques, les formulations pharmaceutiques et les parfums.
Description détaillée
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, l’expression « compris entre ... et... » inclut les bornes. Dans le cadre de la présente invention, sauf indication contraire, l'expression «comprenant... » comprend la signification de «consistant en... ». Sauf indications contraires, les pourcentages et ppm sont des pourcentages et ppm massiques.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « ppm » signifie « partie par million ». Cette unité représente une fraction massique : 1 ppm = 1 mg/kg. La frambinone naturelle selon l’invention, et obtenue par le procédé de l’invention, est une substance aromatisante naturelle selon l’article 9.2. c) du règlement CE1334/2008. C’est-à-dire une substance aromatisante obtenue par des procédés physiques, enzymatiques ou microbiologiques à partir de matières d’origine végétale, animale, ou microbiologique prises en l’état ou après leur transformation pour la consommation humaine par un ou plusieurs des procédés traditionnels de préparation des denrées alimentaires. Une substance aromatisante naturelle correspond à une substance qui est naturellement présente et a été identifiée dans la nature.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « fermentation » se réfère à un procédé microbiologique faisant intervenir un microorganisme De manière générale, la réaction est conduite dans un fermenteur dans un milieu de culture microbien. Dans la cadre de la présente invention, le terme « fermentation » se réfère à un procédé comprenant une étape de croissance au cours de laquelle un microorganisme est mis dans un milieu favorisant sa croissance, puis une étape de bioconversion dans laquelle ledit microorganisme est mis en présence du substrat à transformer, de préférence le microorganisme est une bactérie ou une levure
Dans le cadre de la présente invention, et sauf indication contraire, le terme « biocatalyse » se réfère à une étape de procédé dans laquelle un substrat est transformé par catalyse enzymatique.
Un premier objet de la présente invention concerne un procédé de préparation de frambinone naturelle comprenant :
- une étape (a) de bioconversion d’acide p-coumarique permettant la préparation de p- hydroxybenzaldéhyde,
- une étape (b) dans laquelle le p-hydroxybenzaldéhyde obtenu à l’issue de l’étape (a) est condensé avec de l’acétone pour permettre la formation de p-hydroxybenzalacétone,
- une étape (c) dans laquelle le p-hydroxybenzalacétone obtenu à l’issue de l’étape (b) est transformé en frambinone par bioconversion ou biocatalyse.
Etape (a) :
Le procédé de préparation de frambinone comprend une étape (a) de bioconversion d’acide p- coumarique pour permettre la préparation de p-hydroxbenzaldéhyde selon le schéma suivant :
Acide p-coiimanc p- ydrox beazaldéliydê
L’étape (a) est une étape de bioconversion, de préférence l’étape (a) est un procédé microbiologique. En général, la réaction de bioconversion est réalisée par fermentation en présence d’un microorganisme. De préférence le microorganisme est choisi parmi les bactéries appartenant à l’ordre des Actinomycetales, de préférence appartenant à la famille des Streptomycetacae , Pseudonocardiacae, très préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus. De manière préférée la réaction de bioconversion est conduite en présence d’une souche disponible sous le numéro ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329 ou IMI 390106.
Indépendamment du procédé de préparation de frambinone, la bactérie utilisée dans l’étape (a) est préalablement mise en culture. La mise en culture de la bactérie est généralement réalisée en milieu aqueux, en présence d’éléments nutritifs. En général, le milieu de culture comprend une source de carbone, de préférence du glucose, une source organique ou inorganique d’azote, des sels inorganiques et des facteurs de croissance. La concentration en source de carbone est généralement comprise entre 5 et 50 g.L4, de préférence entre 20 et 34 g.L4. La source d’azote, telle qu’un extrait de levure, et les facteurs de croissance sont en général ajoutés à une concentration comprise entre 2 et 20 g.L , de préférence entre 5 et 10 g.L4. En outre, des ions magnésium, tels que du sulfate de magnésium, peuvent être ajoutés à une concentration comprise entre 0,1 et 5 g.L4, de préférence comprise entre 0,5 et 1 g.L4. La température est, en général comprise entre 25 et 50°C, de préférence comprise entre 28°C et 45°C. Le pH de la mise en culture est compris entre 7 et 9.
La période de culture dure en générale entre 5 et 40 heures. La période de culture dure en général jusqu’à ce que la source de carbone, en général du glucose, soit presque intégralement consommée, de préférence telle que la concentration en source de carbone soit inférieure ou égale à 1 g.L4. Le pH du milieu de culture est alors ajusté. De préférence le pH est ajusté de manière à atteindre une valeur supérieure ou égale à 8. De préférence le pH est inférieur ou égale à 11, préférentiellement inférieur ou égale à 10.
L’acide p-coumarique est ensuite ajouté au milieu de culture obtenu lors de cette étape préalable de mise en culture. La concentration de l’acide p-coumarique dans le milieu de culture est en général comprise entre 5 g.L4 et 50 g.L4. L’ajout de l’acide p-coumarique peut être réalisé en une seule fois. L’acide p-coumarique peut également être ajouté en plusieurs fois. L’acide p- coumarique peut être ajouté seul ou en solution dans un milieu aqueux, de préférence à une concentration comprise entre 5 et 40 g.L , de préférence comprise entre 15 et 30 g.L4. La température de l’étape (a) est, en général, comprise entre 25 et 50°C, de préférence entre 28°C et 45°C.
La durée d’incubation dans le fermenteur est généralement comprise entre 5 et 50 heures, de préférence entre 15 et 25 heures. Le pH dans le fermenteur est généralement compris entre 7 et 9. L’acide p-coumarique est consommé et le p-hydroxybenzaldéhyde est obtenu dans le milieu. D’autres sous-produits de la réaction peuvent également être obtenus dans le milieu de fermentation tels que de l’acide p-hydroxybenzoïque, ou de l’alcool p-hydroxybenzylique.
A la fin de l’étape (a) de bioconversion, le p-hydroxybenzaldéhyde est récupéré après retrait de la biomasse, par toute méthode connue de l’homme du métier. Le p-hydroxybenzaldéhyde peut être utilisé sans purification supplémentaire dans l’étape (b) ou peut être purifié par toute méthode connue de l’homme du métier avant utilisation dans l’étape (b).
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape (b) peut être réalisée sans purification intermédiaire, le p-hydroxybenzaldéhyde obtenu à l’issue de l’étape (a) peut être directement soumis aux conditions de l’étape (b). De manière surprenante, les impuretés ou sous-produits de l’étape (a) n’ont pas ou peu d’impact sur les résultats de conversion de l’étape (b). Alternativement, l’étape (b) peut être réalisée en présence de la biomasse issue de l’étape (a).
Etape (b) :
Le procédé de préparation de frambinone comprend une étape (b) de condensation du p- hydroxybenzaldéhyde avec de l’acétone selon le schéma suivant :
Selon un aspect, l’étape (b) de condensation est réalisée en présence d’un biocatalyseur, de préférence de l’albumine, et plus particulièrement en présence d’albumine de sérum bovin (BSA).
De préférence la réaction est conduite dans l’acétone. En générale l’acétone est utilisée en excès par rapport à la quantité de p-hydroxybenzaldéhyde. La réaction peut être conduite en présence d’un autre solvant choisi parmi l’eau, un milieu aqueux tamponné, de préférence à pH 8, de l’éthanol, du n-octane, ou de l’acétate d’éthyle, de préférence choisi parmi l’eau, un milieu aqueux tamponné, de préférence à pH 8, de l’éthanol ou de l’acétate d’éthyle. Selon un aspect avantageux, le solvant est choisi parmi les solvants compatibles pour des applications cosmétiques ou alimentaires.
La réaction est généralement conduite en présence d’une base, de préférence choisie parmi imidazole, proline, L-Histidine ou guanidine*HCl.
La température de l’étape (b) est généralement comprise entre 30°C et 40°C. De manière générale, l’étape (b) est réalisée à pression atmosphérique. En général, l’étape (b) est réalisée sous agitation, de préférence à une vitesse comprise entre 100 et 500 tours/minute, de préférence comprise entre 150 et 300 tours par minute et très préférentiellement entre 180 et 200 tours par minute. La durée d’incubation de l’étape (b) est généralement comprise entre 24 et 96 heures. Selon un autre aspect, l’étape (b) peut être conduite en présence d’un amino-acide, de préférence un amino-acide de la série L, de préférence choisi parmi proline, acide azétidine-2-carboxylique, acide pipéridine-2-carboxylique, acide 4-hydroxypyrrolidine-2-carboxylique, pyrrolidine-2- carboxamide, acide thiazolidine-4-carboxylique, acide 4-acétoxypyrrolidine-2-carboxylique. La quantité d’amino-acide est généralement comprise entre 15% en volume et 40% en volume. Le solvant est en général un mélange de DMSO et d’acétone, ou d’éthanol et d’eau. Selon un aspect avantageux, le solvant est choisi parmi les solvants compatibles pour des applications cosmétiques ou alimentaires.
Ces conditions sont notamment décrites dans le document J. Am. Chem. Soc. 2000, 122 (10), 2395. Cependant, contrairement à ce qui est décrit dans ce document, la réaction permet la formation de la cétone a-P-insaturée de manière majoritaire.
Le p-hydroxybenzalacétone peut être utilisé sans purification supplémentaire dans l’étape (c) ou peut être purifié par toute méthode connue de l’homme du métier avant utilisation dans l’étape (c).
Selon un mode de réalisation particulier, l’étape (c) peut être réalisée sans purification intermédiaire, le p-hydroxybenzalacétone obtenu à l’issue de l’étape (b) peut être directement soumis aux conditions de l’étape (c). De manière surprenante, les impuretés ou sous-produits de l’étape (b) et/ou (a) n’ont pas ou peu d’impact sur les résultats de conversion de l’étape (c).
Etape (c) :
Le procédé de préparation de frambinone comprend une étape (c) dans laquelle p- hydroxybenzalacétone est hydrogéné selon le schéma suivant :
Selon un aspect, l’étape (c) est réalisée par biocatalyse.
Selon un aspect, l’étape (c) est réalisée en présence d’au moins une enzyme, de préférence l’enzyme est une ène-réductase ou énone-réductase. L’étape (c) peut également être réalisée en présence de levure, notamment levure de boulanger. De manière générale, l’étape (c) est réalisée dans des conditions réactionnelles adaptées à la conversion de p-hydroxybenzalacétone en frambinone.
De manière générale, l’étape (c) peut être conduite en présence d’un cofacteur. Un moyen de régénérer le cofacteur peut être utilisé en combinaison dudit cofacteur. A titre illustratif, la réduction de l’étape (c) peut être réalisée en générant NADP+ à partir de NADPH, ainsi n’importe quel système capable de régénérer NADPH peut être utilisé. Des exemples de systèmes capables de régénérer le cofacteur pouvant être employés sont glucose et glucose déshydrogénase, formate et formate déshydrogénase, glucose-6-phosphate et glucose-6-phosphate déshydrogénase, un alcool secondaire et une cétone déshydrogénase, phosphite et phosphite déshydrogénase, hydrogène moléculaire et hydrogénase, flavine adénine dinuclérotide FAD/FADH2. Ces systèmes peuvent être utilisé avec NADP+/NADPH ou NAD+/NADH en tant que cofacteur.
Selon un autre aspect, l’étape (c) est réalisée par fermentation en présence d’un microorganisme. Le microorganisme peut être choisi parmi les bactéries appartenant à l’ordre des Actinomycetales, de préférence appartenant à la famille des Streptomycetacae , Pseudonocardiacae, très préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus. De manière préférée la réaction de bioconversion est conduite en présence d’une souche disponible sous le numéro ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329 ou IMI 390106. Le microorganisme peut également être choisi parmi les levures appartenant au groupe des Saccharomyces ou Candida, de préférence choisi parmi Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica. De manière préférée la réaction est conduite en présence d’une souche disponible sous le numéro ATCC7754 ou ATCC 8661. Le microorganisme utilisé lors de l’étape (c) permet de réduire sélectivement la double liaison carbone-carbone sans réduire la double liaison carbone-oxygène.
L’étape (c) est généralement conduite dans un solvant, de préférence choisi dans le groupe constitué de l’eau, les solvants organiques, les liquides ioniques. De préférence les solvants organiques sont choisis dans le groupe constitué de l’acétate d’éthyle, l’acétate de butyle, le 1- octanol, l’heptane, l’octane, l’éther de méthyle-t-butyle (MTBE), l’éthanol, le DMSO. Selon un aspect avantageux, le solvant est choisi parmi les solvants compatibles pour des applications cosmétiques ou alimentaires. Selon un aspect particulier le solvant peut être un solvant aqueux comprenant un mélange d’eau et d’un autre solvant. Le solvant aqueux peut être tamponné ou non-tamponné. De manière générale, l’étape (c) est conduite à un pH inférieur ou égal à 10, de préférence inférieur ou égal à 9, de manière plus préférée inférieur ou égal à 8. De manière générale, l’étape (c) est conduite à un pH supérieur ou égal à 5, de préférence supérieur ou égal à 6, de manière plus préférée supérieur ou égal à 7. Pendant la réaction, le pH peut être amené à varier, il est possible de maintenir le pH à une valeur choisie par ajout d’une base ou d’un acide. Le pH peut également être contrôlé à l’aide d’une solution tampon. L’ordre d’ajout n’est réactif n’est pas particulièrement critique. Les réactifs peuvent être ajoutés ensemble ou séparément dans le solvant choisi. A titre illustratif, le système de régénération du co facteur, le cofacteur, l’ène-réductase ou énone-réductase peuvent être ajoutés en premier dans le solvant.
L’étape (c) est en général conduite à une température comprise entre 15°C et 75°C, de préférence entre 20°C et 55°C, encore plus préférentiellement entre 20°C et45°C. La réaction peut également être conduite à température ambiante. La température ambiante est généralement comprise entre 19°C et 26°C.
En général l’étape (c) est réalisée sous agitation, de préférence à une vitesse comprise entre 100 et 500 tours/minute, de préférence comprise entre 150 et 300 tours par minute et très préférentiellement entre 180 et 200 tours par minute. La durée d’incubation de l’étape (c) est généralement comprise entre 24 et 96 heures.
Selon un aspect particulier, l’enzyme utilisée pour l’étape (c) peut être une enzyme telle que l’enzyme décrite dans bioRxiv 202341; doi: https://doi.org/10.1101/202341.
Selon un aspect particulier, l’enzyme utilisée pour l’étape (c) peut être une enzyme telle que décrite dans le document WO 2010/075574.
Avantageusement, l’enzyme ou le microorganisme utilisé au cours de l’étape (c) est capable de réduire spécifiquement la double liaison carbone-carbone pour obtenir la formation de la cétone. Avantageusement l’enzyme utilisée au cours de l’étape (c) permet d’obtenir de manière très majoritaire la frambinone par rapport au frambinol. Le dérivé frambinol correspond à la structure suivante, dans laquelle la fonction cétone est réduite en fonction alcool.
Il est bien connu de l'homme du métier que les propriétés organoleptiques d'une substance aromatisante peuvent dépendre de la présence et de la quantité de certaines impuretés. C'est pourquoi le procédé de fabrication est essentiel pour la saveur du composé final.
Avantageusement, on a découvert que la frambinone de la présente invention présentait des propriétés organoleptiques satisfaisantes. Il est à noter que le profil organoleptique de la frambinone de la présente invention est équivalent au profil organoleptique de la frambinone extraite de fruits.
Avantageusement, le procédé de la présente invention est capable de produire de manière spécifique et avec de bons rendements de la frambinone naturelle.
Selon un autre aspect, la présente invention couvre l’utilisation de frambinone selon la présente invention ou de frambinone obtenue selon le procédé de l’invention en tant qu’arôme ou parfum. Enfin la présente invention couvre également une composition comprenant de la frambinone selon l’invention choisie de préférence dans le groupe constitué par les produits alimentaires, les boissons, les formulations cosmétiques, les formulations pharmaceutiques et les parfums.
Exemples
Exemple 1 : Préparation de p-hydroxybenzaldéhyde
1. Préculture et culture
Un milieu de préculture et de culture adapté à ATCC39116, comprenant KH2PO4, Na2HPO4*12H2O, MgSO4*7H2O, extrait de levure, glucose et antimousse est préparé. La préculture est réalisée à 170 tours/min et 37°C. La culture est réalisée à 37°C sous agitation.
2. Bioconversion
Le pH du milieu est ajusté à 8.4 on introduit une solution d’acide coumarique de façon à obtenir une concentration finale comprise entre 5 et 50 g/L. Le milieu réactionnel est maintenu à 37 °C et 170 tours/min pendant 24 h. Après 24 h de bioconversion, la biomasse est éliminée par centrifugation, le surnageant est filtré et analysé en HPLC. 4 -hydroxy benzaldehyde est obtenu, avec un rendement compris entre 60 et 99%.
Exemple 2 : Préparation de benzalacétone
On mélange p-hydroxybenzaldéhyde, acétone, un solvant, une base et BSA. Le milieu réactionnel est incubé à une température entre 30°C et 40°C et à 200 tours/min pendant 24h à 96h. La réaction est suivie par HPLC. Benzalacétone est obtenue avec un taux de transformation supérieur ou égale à 90%. Exemple 3 a : Préparation de frambinone par biocatalyse
On mélange benzalacétone obtenu à l’exemple 2, un solvant, GDH, glucose, NADP+, KH2PO4 pH 7 et une ène-réductase. Le mélange est incubé à 30°C sous agitation pendant 24 h. Les milieux ont été analysés par HPLC.
La frambinone est obtenue. Taux de transformation du substrat = 100 %
Sélectivité : 100% de réduction de la double liaison C=C
Exemple 3b : Préparation de frambinone par bioconversion
1. Préculture
Un milieu de préculture adapté aux microorganismes 1 et 2 indiqués dans le tableau ci-dessous, comprenant du glucose, de la peptone et un extrait de malt est préparé. Les microrganismes 1 à 3 sont ensuite ajouté directement au milieu de préculture. La culture est réalisée à 30°C sous agitation (200 tours/min) pendant 24 heures.
Un milieu de préculture et de culture adapté au microorganisme numéro 3 est préparé conformément à l’exemple 1 ci-dessus.
2. Bioconversion
On mélange benzalacétone obtenu selon l’exemple 2 dans chaque milieu obtenu après la période de croissance telle que décrite ci-dessus. Le mélange est incubé à 30°C sous agitation (200 tours/min) pendant 48 heures (références 1 à 2) ou 72 heures (référence 3).
Après 48 h ou 72h de bioconversion, la biomasse est éliminée par centrifugation, le surnageant est filtré et analysé en HPLC. La frambinone est obtenue.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de frambinone naturelle comprenant :
- une étape (a) de bioconversion d’acide p-coumarique permettant la préparation de p- hydroxybenzaldéhyde,
- une étape (b) dans laquelle le p-hydroxybenzaldéhyde obtenu à l’issue de l’étape (a) est condensé avec de l’acétone pour permettre la formation de p-hydroxybenzalacetone,
- une étape (c) dans laquelle le p-hydroxybenzalacetone obtenu à l’issue de l’étape (b) est transformé en frambinone par bioconversion ou biocatalyse.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l’étape (a) et/ou l’étape (c) est un procédé microbiologique.
3. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 dans lequel la réaction de bioconversion est réalisée par fermentation en présence d’un microorganisme, de préférence le microorganisme est choisi parmi bactéries appartenant à l’ordre Actinomycetales, de préférence appartenant à la famille des Streptomycetacae , Pseudonocardiacae, très préférentiellement Streptomyces setonii, Amycolatopsis sp. Streptomyces psammoticus, très préférentiellement, en présence d’une souche disponible sous le numéro ATCC39116, DSMZ 9991, DSMZ 9992, CCTCC 2015329 ou IMI 390106.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel l’étape (b) de condensation est réalisée en présence d’un biocatalyseur, de préférence de l’albumine, et plus particulièrement en présence d’albumine de sérum bovin (BSA).
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel l’étape (b) est conduite en présence d’un amino-acide.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel l’étape (c) est conduite en présence d’une ène-réductase ou d’une énone-réductase.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 dans lequel l’étape (c) est conduite en présence d’un cofacteur.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel l’étape (c) est réalisée en présence d’une levure appartenant au groupe des Saccharomyces ou Candida, de préférence choisi parmi Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 dans lequel le p- hydroxybenzaldéhyde obtenu à l’issue de l’étape (a) est utilisé sans purification supplémentaire dans l’étape (b).
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 dans lequel le p- hydroxybenzalacétone obtenu à l’issue de l’étape (b) est utilisé sans purification supplémentaire dans l’étape (c).
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