EP4244619A1 - Procede de mesure du potentiel ecotoxique d'un effluent aqueux et dispositif de mise en oeuvre du procede - Google Patents

Procede de mesure du potentiel ecotoxique d'un effluent aqueux et dispositif de mise en oeuvre du procede

Info

Publication number
EP4244619A1
EP4244619A1 EP21814833.6A EP21814833A EP4244619A1 EP 4244619 A1 EP4244619 A1 EP 4244619A1 EP 21814833 A EP21814833 A EP 21814833A EP 4244619 A1 EP4244619 A1 EP 4244619A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compartment
water
effluent
aqueous effluent
overflow
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP21814833.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Antoine MOTTIER
Florence MOUCHET
Éric PINELLI
Laury GAUTHIER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National Polytechnique de Toulouse INPT
Universite de Toulouse
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Institut National Polytechnique de Toulouse INPT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Toulouse III Paul Sabatier, Institut National Polytechnique de Toulouse INPT filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4244619A1 publication Critical patent/EP4244619A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/18—Water
    • G01N33/186—Water using one or more living organisms, e.g. a fish
    • G01N33/1866—Water using one or more living organisms, e.g. a fish using microorganisms

Definitions

  • the present invention belongs to the field of ecotoxicology, more particularly to the measurement of the ecotaxic potential of an aqueous effluent.
  • the object of the present invention relates to a method for measuring the ecotaxic potential of an aqueous effluent and to a device comprising a battery of instrumented and transportable mesocosms.
  • the invention also relates to the use of the device for measuring the ecotaxic potential of an effluent as well as to a kit of instrumented and transportable mesocosms.
  • An object of the invention is a method for measuring the ecotoxic potential of an aqueous effluent on a simplified ecosystem, in which the medium is continuously supplied with aqueous effluent, thus being representative of real environmental conditions.
  • the invention thus comprises a method for measuring the ecotoxic potential of an aqueous effluent comprising the steps: a) formation of an artificial trophic chain in an aquatic medium comprising a substrate, said substrate comprising a mineral fraction and optionally a organic fraction and being preferably reconstituted, said trophic chain comprising at least one microorganism and at least one macroorganism and is formed by introduction and sequential stabilization/timing of said micro- and macroorganisms; b) determination of the ecotoxic potential of the aqueous effluent, characterized in that the medium is open or semi-open and is supplied continuously with aqueous effluent.
  • a fraction of the aqueous effluent can be recovered at the outlet from the medium (via a recirculation loop) and can constitute a fraction of the aqueous effluent supplying the medium, so that the aqueous effluent entering the aquatic environment can consist of a mixture between the aqueous effluent and water from the mesocosm.
  • aqueous effluent refers indiscriminately to the effluent entering the environment and including, or not including, a fraction of the aqueous effluent recovered at the outlet of the environment.
  • the method can thus comprise a step c) of partial recycling of the aqueous effluent in the medium.
  • the term "ecotoxic potential” means the intrinsic characteristic of the effluent which gives it its ability to induce dysfunctions at different levels of living organisms. These dysfunctions are the expression of significant response variations, measured and quantified, for each biotic and abiotic parameter studied, between the reference tanks and those exposed to the effluent.
  • the biotic parameters studied to determine the ecotoxic potential of the effluent can for example be chosen from the group comprising the mortality rate, the growth rate, the genotoxicity, the teratogenicity, the emergence rate, the decomposition rate and/or or behavior.
  • the abiotic parameters studied to determine the ecotoxic potential of the effluent can for example be chosen from the group comprising the variation(s) of pH, conductivity, redox potential, dissolved oxygen, concentrations of nitrogenous forms ( ammonium, nitrate, nitrite), concentrations of total and dissolved organic carbon, and/or concentrations of metallic and/or organic contaminants. Variations can be quantified and it is thus possible to determine whether a variation is significantly different from a control.
  • the device for implementing the method can comprise at least one control tank, preferably at least 3 control tanks, and at least as many tanks exposed to the effluent studied.
  • ecotoxic potential can be expressed in relation to the drift of the physico-chemical and biological parameters recorded; ie the variations in response for each parameter studied between the control (reference) tanks and those exposed to the effluent.
  • the drift is quantified and compared to the control conditions using statistical analyses.
  • the determination of the ecotoxic potential thus takes into account the evaluation of different types of contaminants after exposure of organisms belonging to the different trophic levels of an aquatic ecosystem.
  • the determination of the ecotoxic potential is obtained by measuring the level of toxicity on living organisms (acute, chronic and genetic toxicity) in relation to the control and measurement of variations in physico-chemical conditions such as the carbon cycle, decomposition, carbon dissolved organic, pH, dissolved oxygen concentration and/or effluent conductivity relative to control.
  • the ecotoxic potential of the aqueous effluent is determined between 4 and 6 weeks after the introduction of the first elements of the artificial trophic chain (z.e after the introduction of the consortium of microorganisms) into the medium.
  • the ecotoxic potential can be determined by measuring biotic and/or abiotic parameters.
  • the biotic parameters can be selected from the group comprising mortality rate, growth rate, genotoxicity, teratogenicity, emergence rate, decomposition rate and/or behavior.
  • the abiotic parameters can be chosen from the group comprising the variation(s) of pH, conductivity, redox potential, dissolved oxygen, concentrations of nitrogenous forms (ammonium, nitrate, nitrite), concentrations of organic carbon total and dissolved, and/or concentrations of metallic and/or organic contaminants.
  • the determination of the ecotoxic potential can be carried out by comparing the biotic and abiotic parameters measured with those of a control aquatic environment, in which the method according to the invention is applied identically, with the difference that the control aquatic environment is supplied continuously with clear water, that is to say with water coming from the same source, but free of contaminants.
  • aquatic environment means a container (generally a tank), which may be transparent, into which the substrate and the artificial trophic chain are introduced.
  • the aquatic environment comprises an inlet and an outlet, allowing the circulation of water, a consequence of the continuous supply of the environment.
  • aqueous effluent we mean a liquid composed mainly of water, the purpose of the process of which is to measure its ecotoxic potential. It can be any type of water resulting from or impacted by human activity, including industrial activity, agriculture and domestic use. This is water that may include chemical substances, particles and materials tested separately in a reference water.
  • the aqueous effluent can include organic or inorganic matter, suspended or dissolved. Thus, it may be natural water (water from streams such as rivers or rivers, lakes, and more generally surface water and groundwater), waste water, for example from treatment plants. treatment (STEP) treated or untreated, of leachates and percolates of industrial waste, materials or agricultural waste (green, white water), water from the food industry.
  • the aqueous effluent can be diluted or undiluted.
  • the term "continuously fed” means a permanent renewal, without interruption, of the aqueous effluent, diluted or undiluted, throughout the duration of the implementation of the process.
  • the effluent can be transported using machinery. Thus, the effluent circulates in the medium.
  • the dynamic approach of the process implemented makes it possible to take into account any change in the intrinsic composition of the aqueous effluent to be tested, both qualitative (effluent composition) and quantitative (effluent flow rates).
  • the method according to the invention thus makes it possible to evaluate all the variations of the effluent. This is an advantage over a closed system (as opposed to open or semi-open) in which a single effluent, with fixed characteristics, can be evaluated.
  • Another advantage of the process according to the invention is that it is carried out in an open or semi-open environment, which makes it possible to approximate environmental conditions more closely.
  • the aqueous effluent continuously supplying the medium is diluted or undiluted (ie crude).
  • the aqueous effluent can thus be taken directly from the outlet of a treatment plant or else be taken from a watercourse or a pipe. Whatever its origin, it can be diluted prior to its introduction into the environment.
  • the aqueous effluent is preferably diluted with water of food quality (dechlorinated) or reconstituted made from demineralized water and chemical salts, and used to supply all the control tanks.
  • the dilution depends on subject of study, for example for a WWTP effluent, the dilution depends on the average flow of the watercourse into which the effluent is discharged. The dilution can vary from 50th to 500th, depending on the type of watercourse.
  • the aqueous effluent feed rate is within a range of 0.3 to 1 L per day.
  • the quantity of water in the medium is preferably kept constant, thus the inlet and outlet flow rates in aqueous effluent are equal.
  • the method according to the invention may also comprise a step of diluting the aqueous effluent, prior to feeding it with the medium.
  • the method according to the invention may also comprise a step of regulating the temperature of the aqueous effluent and/or of the medium, preferably at a temperature comprised within a range ranging from 15 to 25°C.
  • a temperature comprised within a range ranging from 15 to 25°C Generally, the temperature of the aquatic environment is maintained at a temperature comprised in an interval ranging from 15 to 25° C. throughout the duration of the implementation of the method.
  • open environment we mean that the aqueous effluent which circulates in the environment is not recycled and by "semi-open", that part of the effluent is recovered at the outlet of the environment and reinjected , preferably via a recirculation loop.
  • part of the recycled effluent is used to supply the environment continuously.
  • the use of the recirculation loop only increases the residence time of the effluent in the system, without diluting the effluent to be tested.
  • a semi-open environment can also have the advantages of consuming (and therefore wasting) less water, but also of limiting temperature regulation, when it is necessary.
  • the aqueous effluent in open operation, is not recycled and all of the aqueous effluent supplying the medium is discharged at the outlet of the medium.
  • a fraction of the aqueous effluent supplying the medium is recirculated and used to supply the medium.
  • the recycled fraction of the aqueous effluent can be of the order of 1 to 90% of the effluent, preferably 30 to 60% and even more preferably 40%.
  • the recycled fraction is recovered at the medium outlet and then mixed upstream with the aqueous effluent supplying the medium.
  • the method according to the invention may further comprise a step c) of partial recycling of the effluent, preferably recycling from 1 to 90% of the effluent and even more preferably from 30 to 60% and even more preferred 40%.
  • a step c) of partial recycling of the effluent preferably recycling from 1 to 90% of the effluent and even more preferably from 30 to 60% and even more preferred 40%.
  • the aquatic medium comprises a substrate.
  • the substrate can be natural or reconstituted, preferably reconstituted.
  • the substrate comprises a mineral fraction and optionally an organic fraction.
  • the mineral fraction can comprise a standardized sand of known grain size, such as SNL sand. It can include silica, kaolinite, calcium carbonate and generally includes at least silica in the form of sand of varying grain size.
  • the mineral fraction comprises fine sand (for example sand from Fontainebleau, VWR, 1/16th to 2mm, CAS 7631-86-9 or: CF EN196-01 “CEN AF AC AFNOR standardized sand”, coast) mixed with coarser sand (for example SNL sand, AFNOR and ISO 9001: 2008 certified).
  • the mass percentage of the mineral fraction in the substrate can be greater than or equal to 90%, relative to the total mass of the substrate.
  • the organic fraction may comprise tree leaves from the riparian forest of temperate countries.
  • the organic fraction comprises alder leaves (Alnus sp).
  • the mass percentage of the organic fraction in the substrate is less than or equal to 10%, relative to the total mass of the substrate.
  • the different constituent elements of the substrate can be chosen according to the needs of the organisms that make up the artificial trophic chain.
  • a chain containing chironomidae larvae can include alder leaves to allow leaf biodegradation to be studied.
  • the substrate may include fine-grained sand. It is for example possible to get as close as possible to reality to have a mixture of grain sizes.
  • the term “trophic chain” is understood to mean a set of links which exist between the various links which compose it. This is the set of relationships that are established between organisms based on how they feed.
  • a trophic chain can thus include producers (algae for example), primary consumers (herbivores, phytophagous), secondary consumers (carnivores) and decomposers (or detritivores).
  • producers algae for example
  • primary consumers herebivores, phytophagous
  • secondary consumers carnivores
  • decomposers or detritivores
  • the term “artificial trophic chain” means trophic links added intentionally by man for the purposes of experimentation in mesocosms. Pollutants which degrade little or not at all (heavy metals) will concentrate at the top of the food chain, in predators.
  • the decomposers are generally included in the bacterial consortium for example, or else by the chironomidae. It is a function that can be carried out by several links in
  • the artificial food chain may include:
  • consortium of microorganisms means a consortium comprising bacteria, microscopic fungi and unicellular algae.
  • bacteria can be chosen from the group comprising Nitrobacter, Nitrosomonas, Pseudomonas and Bacillus
  • fungi can be chosen from the group comprising Hyphomycetes, Eumycetes and Ascomycetes and the microalgae can be freshwater diatoms.
  • primary consumer we mean an organism that feeds at the expense of autotrophic organisms (microorganisms contained in the biofilm consortium). It can preferably be chosen from the group comprising invertebrates (such as for example chironomids, tubifex, daphnia, freshwater shrimp, gammarids or limnes), amphibians (such as for example Xenopus larvae (Xenopus sp) ), and mixtures thereof.
  • invertebrates such as for example chironomids, tubifex, daphnia, freshwater shrimp, gammarids or limnes
  • amphibians such as for example Xenopus larvae (Xenopus sp)
  • mixtures thereof such as for example Xenopus larvae (Xenopus sp)
  • “Secondary consumer” means an organism that feeds on primary consumers. It can preferably be chosen from the group comprising larvae of amphibians (such as, for example, Pleurodeles sp or Ambystoma sp), fish (such as, for example, groups of poecilidae or cyprinids), and mixtures thereof. Preferably, the secondary consumer will be only one among the carnivores listed above.
  • step a) of the method according to the invention may comprise the sub-steps: - i) placing in a medium (ie an analysis compartment), the substrate and water, preferably food-grade water (dechlorinated) or reconstituted made from demineralized water and mineral salts ,
  • the stabilization of the medium can have a duration ranging from 1 to 3 weeks, preferably 2 weeks.
  • stabilization of the medium means the period during which the peak concentration of nitrites in the medium is monitored. The concentrations of nitrates, nitrites, pH and O2 are measured to demonstrate the stabilization of the system, so that the biofilm is operational.
  • the peak of nitrites must have passed, daily measurements are taken and it is from the moment when the peak goes down that it is estimated that stabilization has been reached (concentration of nitrites less than 1 mg /L). Bacteria transform everything that is ammonium in the medium into nitrites, then into nitrates.
  • the consortium thus consumes the nitrates to make biomass.
  • the development of the biofilm is evaluated by observing the change in color of the sediment reflecting the level of colonization.
  • the medium is said to be stabilized when the nitrite concentration in the medium drops and is less than 1 mg/L.
  • the temporization of the medium can have a duration ranging from 1 to 3 weeks, preferably 2 weeks.
  • chironomids are introduced, a period of at least one week of exposure is preferable, for Xenopus, at least 12 days of exposure are preferable.
  • the duration of exposure depends on the species introduced (particularly stages of development) and the biological parameter measured, the parameters must be adapted.
  • delay means the time necessary for the primary consumer to consume the lower link without this step being limiting.
  • the various trophic links are raised independently in suitable culture media under controlled conditions.
  • the consortium bacteria, algae, fungi
  • the consortium is introduced into the system at the appropriate time (10 5 /mL, number of individuals per volume, in control before injection).
  • invertebrates can be reared for 48 hours in standardized water (AFNOR, 2004) from their production to the experimental stage (stage depending on the parameter studied).
  • AFNOR standardized water
  • ISO standardized water
  • the experimental stage will be determined by the biological model, and will depend on the species. For example, genotoxicity and growth are measured in xenopus at stage 54 of the development table of Nieuwkoop and Faber (1956). In chironomids, the emergence rate is measured at the emerged adult stage. A person skilled in the art will be able to adapt the experimental stage according to the parameter or parameters that he wishes to measure in determining the ecotaxic potential of the aqueous effluent.
  • the method according to the invention may also comprise a step d) of measuring the percentage of degradation of the organic fraction of the substrate.
  • This step d) makes it possible to measure the impact of the pollutants tested on the detrital activity of the fungi, evaluated by measuring the percentage of degraded leaf surface.
  • the percentage of degradation of the organic fraction of the substrate is generally measured between 6 and 10 weeks after the introduction of the first elements of the artificial trophic chain (i.e. the consortium of microorganisms).
  • the method according to the invention may also comprise a prior step of sterilizing the substrate, preferably at a temperature greater than or equal to 121°C, for a period greater than or equal to 20 minutes.
  • the invention also relates to a device for implementing the method according to the invention.
  • the invention thus relates to a device for measuring the ecotoxic potential of an aqueous effluent comprising a water supply device and a battery of instrumented and transportable mesocosms.
  • the water supply device may include:
  • Connected means a direct or indirect connection between two elements of the device.
  • the device comprises an equal number of feed compartments and mesocosms.
  • a feeding compartment is usually connected to a single mesocosm.
  • the power channel is connected to each power compartment. This type of feed allows for an equal feed rate from each of the feed compartments. Depending on the dilution of the aqueous effluent, its influence on the flow/volume involved in the mesocosms can be considered negligible.
  • the supply device may include one or more second arrivals of aqueous effluent.
  • the second arrival in aqueous effluent can supply one or more supply compartments.
  • the second aqueous effluent inlet may comprise a pump.
  • the second aqueous effluent inlet can be connected to one or more supply compartments.
  • the battery of mesocosms can comprise at least one mesocosm.
  • the battery of mesocosms includes several mesocosms, some can be qualified as control mesocosms.
  • a control mesocosm is identical to a mesocosm but is not subjected to the aqueous effluent during the implementation of the process.
  • the supply compartments connected to the control mesocosms are not connected to the second aqueous effluent inlet.
  • the water supply is connected to the reservoir tank.
  • the reservoir tank may include an overflow, connected to a water drain (allowing the excess water to be evacuated from the device).
  • the feed trough is connected to each of the feed compartments.
  • the aqueous effluent inlet is connected to the supply compartment.
  • the feeding compartment is connected to the mesocosms (via the feeding overflow).
  • the regulation of the flow rates entering water (inlet of water) and in aqueous effluent (inlet of aqueous effluent) makes it possible to regulate the rate of dilution of the aqueous effluent whose ecotoxic potential is measured.
  • the supply compartment being provided with a supply overflow, itself provided with a filter, preferably a comb, this configuration allows a homogeneous supply of aqueous effluent, diluted or undiluted, in the mesocosm.
  • Tank or “compartment” means a container suitable for storing liquid products. It can be cylindrical or parallelepipedic in shape. It may include openings intended for filling, emptying, cleaning and setting up any step of the method according to the invention.
  • the volume of a tank can vary depending on the use. Those skilled in the art can adapt the dimensions and volume of the tanks on a case-by-case basis.
  • the reservoir tank can have a volume of 500 liters and be made of polyethylene.
  • the feed compartment can have a volume ranging from 0.5 to 3 liters, preferably from 1 to 1.5 liters.
  • the analysis compartment can have a volume ranging from 20 to 50 liters, preferably from 30 to 40 liters.
  • the first temperature control system may include a thermostat.
  • the first temperature control system is connected to the reservoir tank.
  • the first regulation system can be installed in parallel or in series with the reservoir tank on the first recirculation loop. The temperature of the water in the dispensing compartment can thus be regulated.
  • a fraction of the aqueous effluent can be recovered at the outlet of the mesocosm and can circulate in a second water recirculation loop, before d to be reinjected in the dispensing compartment.
  • the second recirculation loop may include a second temperature control system.
  • the temperature of the water in the dispensing compartment can thus be regulated.
  • the first and second temperature control systems may be the same or different.
  • the aqueous effluent can be mixed with clear water in the distribution compartment.
  • the supply gutter is equipped with an overflow allowing the return of water within the reservoir tank in the event of an overflow.
  • the reservoir tank and the supply gutter are arranged so that when the supply gutter overflows, the water flows via the overflow into the reservoir tank. This arrangement makes it possible to maintain constant the height of water in the supply gutter.
  • the distribution means (tank, gutter, distribution compartment) are equipped with a set of valves coupled to a source of clean water (e.g. free of pollutants and other elements possibly present in the effluent aqueous) configured in such a way as to allow control of the dilution of the aqueous effluent before its introduction into the mesocosm (aqueous medium).
  • a source of clean water e.g. free of pollutants and other elements possibly present in the effluent aqueous
  • mesocosm aqueous medium
  • the supply gutter and the splitter(s) can be replaced by a distribution system or be included in a distribution system.
  • the distribution system can be any system allowing distribution of the aqueous effluent between the different mesocosms, with or without dilution. It also allows continuous feeding of each mesocosm, at the same flow rate and variable dilution.
  • the distribution system can be connected to the distribution tank at each of the mesocosms, or connected directly to the buffer tank.
  • the term “battery” of mesocosms means a set of mesocosms comprising at least two mesocosms.
  • a cluster of mesocosms can comprise from 2 to 18 mesocosms, preferably from 3 to n*3 mesocosms, where n is an integer ranging from 1 to 6.
  • n is an integer ranging from 1 to 6.
  • control mesocosm in which the aqueous effluent does not circulate, only clear water, ie free of contaminants, circulates
  • n*3 mesocosms there are 3 control mesocosms and 3 mesocosms subjected to the aqueous effluent.
  • a device with 9 mesocosms there are 3 control mesocosms, three mesocosms subjected to the aqueous effluent and 3 mesocosms subjected to the aqueous effluent either at another concentration/dilution of said effluent, or with another different aqueous effluent.
  • a mesocosm can include:
  • an analysis compartment comprising a substrate, preferably reconstituted, said analysis compartment being provided with an evacuation overflow provided with a filter, preferably a comb,
  • the analysis compartment is connected to the distribution compartment.
  • the drain compartment is connected to a water drain (to drain excess water from the device). This may be the same water drain as that connected to the reservoir tank.
  • the device according to the invention may comprise at least one pump, preferably a peristaltic pump or a water pump.
  • a peristaltic pump for distribution it is a turbine type water pump.
  • the pumps used for recirculation are impeller-type aquarium pumps, which have a very low, adjustable and metered flow rate.
  • the effluent supply is carried out via calibrated and calibrated peristaltic pumps.
  • the device according to the invention may comprise at least one lamp. These can be LED bars with several wavelengths suitable for the growth of diatoms. Preferably, each mesocosm is surmounted by an aquarium lamp.
  • the device 1 according to the invention may include:
  • a supply gutter 113 provided with an overflow;
  • a first recirculation loop 114 comprising a temperature control system (chiller) 115, a reservoir tank 116 and a pump 117, said loop being connected to the supply gutter 113;
  • an analysis compartment 121 comprising a substrate 122, said analysis compartment being provided with an evacuation overflow 123 provided with a comb,
  • a second recirculation loop 125 comprising a pump 126, said loop being connected to the supply compartment 118 and to the evacuation compartment 123;
  • the invention also relates to a use of the device according to the invention to determine the ecotoxic potential of an aqueous effluent.
  • the invention also includes a kit of instrumented and transportable mesocosms comprising:
  • Figure 1 is a schematic representation of the food chain of Example 1.
  • Figure 2 represents a device 1 according to the invention comprising a battery of 4 mesocosms:
  • a first recirculation loop 114 comprising a temperature control system (chiller) 115, a reservoir tank 116 and a pump 117, said loop being connected to the supply gutter 113;
  • an analysis compartment 121 comprising a substrate 122, said analysis compartment being provided with an evacuation overflow 123 provided with a comb,
  • a water drain 126 connected to the reservoir tank 116 and to the drain compartment 124.
  • Figure 3 shows a side view of the device 1 according to the invention.
  • Example 1 implementation of the process according to the invention
  • the substrate is fine sand mixed (Fontainebleau sand, VWR) with coarser sand (SNL sand, AFNOR and ISO 9001: 2008 certified).
  • the mixture is washed three times with tap water and sterilized in an autoclave, 20 mins at 120°C.
  • the water in the tanks is food grade (dechlorinated) or reconstituted (made from demineralised water and chemical salts (ISO 21427-1 standard from 2006): NaHCO 3 (64.75 mg/L) , MgSO 4 (123.25 mg/L), KC1 (5.75 mg/L) and CaCl 2 (294 mg/L) Water AFNOR chironome [CaCl 2 (66.2 mg/L), MgSO 4 (61 .4 mg/L), NaHCO 3 (96 mg/L), KC1 (4 mg/L), CaSO 4 (63 mg/L) and NaBr (1 mg/L), in accordance with the AFNOR standard (2004).
  • Food chain consortium of micro-organisms (bacteria, algae, fungi) - chironomids - xenopus - pleurodeles.
  • Chironome AFNOR water [CaCl 2 (66.2 mg/L), MgSO 4 (61.4 mg/L), NaHCO 3 (96 mg/L), KC1 (4 mg/L), CaSO 4 ( 63 mg/L) and NaBr (1 mg/L), in accordance with the AFNOR standard (2004)].
  • Amphibians ISO 21427-1 standard of 2006: NaHCO 3 (64.75 mg/L), MgSO 4 (123.25 mg/L), KC1 (5.75 mg/L) and CaCl 2 (294 mg/L).
  • Algae Nitzschia palea diatoms are cultured at the EcoLab laboratory (France) in CHU 10 culture medium containing Fe-EDTA as a source of iron (6.4 ⁇ pH ⁇ 6.6), ComCHU-10 (mg/ L) Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O (60 mg/L), MgSO 4 7H 2 O (25 mg/L), K 2 HPO 4 (10 mg/L), Na 2 CO 3 (20 mg/L ), Na 2 SiO 3 5H 2 O (60 mg/L), Fe-EDTA (5 mg/L), H 3 BO 3 (2.86 mg/L), MnSO 4 , H 2 O (1.5 mg /L), CuSO 4 .5H 2 O (0.08 mg/L), ZnSO 4 .7H 2 O (0.25 mg/L), ZnSO 4 .7H 2 O (0.02 mg/L), Co (NO 3 ) 2 .6H 2 O (0.05 mg/L), Na 2 MoO 4 2H 2 O (0.025 mg/L), Na
  • Chironomus riparius Breeding is carried out in the laboratory according to AFNOR (2004) and Environment Canada (1997) standards. It is carried out in aquariums containing a bottom of Fontainebleau sand and culture medium suitable for breeding chironomids, placed at 21 ⁇ 1°C and subjected to a photoperiod of 16 hours day and 8 hours night.
  • the food supply consists of 400 mg of fish food (Tetramin®) per aquarium per day.
  • Tetramin® fish food
  • Xenopus laevis Rearing and obtaining larvae takes place in the laboratory.
  • the male and female breeders are reared separately, in an acclimatized aquarium at 22 ⁇ 1°C and subjected to a photoperiod of 8h day and 16h night. They are fed twice a week with pellets for fish farming (Trouw France SA) and once a week with beef heart.
  • Pleurodeles waltlii Rearing and obtaining larvae takes place in the laboratory. Male and female breeders are reared separately and are grouped together during breeding periods only (September to October and January to March). Breeding takes place in aquariums containing dechlorinated city water, maintained at a temperature of 18°C ⁇ 1°C and subjected to a photoperiod of 8 hours day and 16 hours night. In vivo fertilization is natural (without hormonal injection) and takes place in seasons favorable to reproduction. After laying, the eggs are placed in insulated containers, where hatching will take place about ten days later. During the first few days, the energy supply of the young larvae comes from the reserves contained in their yolk sac.
  • the origin of the effluent, its flow rate and the dilution depend on the nature of the effluent and the dilution to be tested.
  • the effluent tested initially comes from the outlet of a PURIFICATION STATION and is sampled just before its arrival in the river. Then, the same effluent was tested, after undergoing treatment in the treatment plant before being released into the river.
  • a fraction is taken regularly from the buffer tank by an automatic sampler and then stored in a refrigerated container.
  • the effluent tested corresponds to the sum of the fractions over 24 hours.
  • the device used in this example is the one shown in Figures 2 and 3. It comprises 6 mesocosms subjected to the aqueous effluent and 3 control mesocosms (only 4 are shown in Figures 2 and 3).
  • the device operates in a semi-open circuit, part of the aqueous effluent being recycled.
  • Effluent circuit the effluent to be studied is introduced directly into the supply compartment.
  • the dilution of the effluent in the mesocosm is ensured by sending in the same supply compartment dechlorinated water of food quality or reconstituted from a reservoir tank regulated in temperature using a first system. temperature regulation via the water supply gutter located above the mesocosms.
  • the supply gutter is equipped with an overflow which allows excess water to return to the reservoir tank.
  • the mesocosms are fed by the inlet overflow from each inlet compartment until the water escapes through the discharge overflow.
  • This overflow feeds the evacuation compartment connected to a second recirculation loop equipped with a pump allowing a return to the excess water supply compartment.
  • This second recirculation loop allows partial recycling of the diluted aqueous effluent in the supply compartment and then in the analysis compartment, thus promoting good homogenization of the diluted aqueous effluent as well as saving aqueous effluent.
  • Example 2 determination of the ecotoxic potential of the effluent of example 1
  • the determination of the ecotoxic potential is obtained by measuring the level of toxicity on living organisms (acute, chronic and genetic toxicity) in relation to the control and measurement of variations in physico-chemical conditions such as the carbon cycle, decomposition, organic carbon dissolved, pH, dissolved oxygen concentration and/or conductivity of the effluent relative to the control as well.
  • the biotic parameters are:
  • the quantity and quality of the DNA extracts are analyzed using a NanoDrop 2000 UV spectrophotometer (Thermo Scientific).
  • the PCRs are carried out on a Gene-AmpTM 9700 thermocycler PCR system (Applied Biosystems, Lorster City, CA, USA) in a final volume of 50 ml containing: 37.5 ml of PCR water, 5 ml of 10X PCR buffer , 2 ml of extracted DNA, 2 ml of the two primers (10 mM), 1 ml of dNTP (2.5 mM) and 0.5 ml of Taq DNA polymerase (5 U/ml Sigma Aldrich).
  • PCR protocol is applied: 94°C for 120 s, 30 cycles at 94°C for 60 s, at 65°C for 40 s, at 72°C for 30 s and at 72°C for 10 min.
  • Sequencing of 16S rRNA gene amplicons is performed using Illumina's MiSeq technology (2,250 bp) by the Get PlaGe platform (Genotoul, Toulouse, Erance).
  • Bioinformatics analysis is performed using the Eind Rapidly Operational Taxonomy Units (OTU) Galaxy Solution (EROGS) pipeline on Galaxy. The readings are grouped into OTUs using a clustering method (Swarm method).
  • Chimeras are removed and filters are applied to maintain OTUs present in at least 3 samples and representing at least 0.005% of all sequences.
  • OTUs are assigned to different taxonomic levels (from kingdom to species) using the RDP classifier and the NCBI Blast ]i method on the Silva 132 (pintail 80) database.
  • the exposure methods of X laevis and P. waltl. are similar, and are carried out according to the standardized amphibian micronucleus test procedure (ISO 21427-1, 2006) and adapted.
  • the exposure begins with stage 50 larvae from the normal table of Nieuwkoop and Eaber (1956) in the case of X laevis and stage 53 larvae from the chronological table of development (Gallien and Durocher, 1957) in the case of P. waltl.. Batches of approximately 15 individuals from the same clutch are necessary in order to reduce the interindividual genetic variability.
  • the exposure takes place within the mesocosms at a temperature of 20°C ⁇ 0.5°C and with a photoperiod of 16 h.
  • Acute, chronic and genetic toxicities for the mortality and growth tests, the dead larvae are sampled every 24 hours throughout the exposure. Acute toxicity is assessed by visual observation of survival (%). Chronic toxicity is assessed by measuring the length of each larva on a photograph on the first (Tinitial) and last day of exposure (Tfinal) of exposure using the Mesurim software (Madré, 2006).
  • the mortality significance threshold is set at 25%.
  • the statistical processing of the raw data relating to the size of the larvae is carried out using the Sigma stat 3.1 software. At the start and end of exposure, the sizes of the larvae are compared using nonparametric statistical tests for unpaired data. The Kruskall-Wallis statistical test is carried out for the comparison between all the conditions, followed by a Dunn's or Dunnett's test to isolate the group(s) responsible for this difference. The Mann-Whitney statistical test is also used to perform a two-by-two comparison. For genotoxicity, at the end of exposure, an intracardiac puncture is performed on each larva immobilized beforehand by immersion in a solution of tricaine methane sulphonate (MS 222, Sandoz).
  • a bevelled and heparinized micropipette (freeze-dried heparin solution containing 7% sodium chloride) is introduced into the ventricle, the contractions of which allow the blood to rise in the micropipette.
  • a blood smear is then made for each larva using a ground blade.
  • These blood films are immediately dried under compressed air at reduced pressure. They are then fixed in absolute methanol for 10 min and stained for 30 min by immersion in a solution of Groat's hematoxylin (equivolume solution of 10 g of Groat's hematoxylin for 1 liter of 95° alcohol and 20 g of ammoniacal iron haemalum for 1 liter of water at 1.6% concentrated sulfuric acid).
  • This dye is specific for the nuclear material of the cells.
  • the slides After rinsing with running water, the slides are finally dried in the open air before being observed.
  • Blood smears are read using immersion microscopy (Olympus CX41).
  • the number of micronucleated erythrocytes presenting a, two, three or more micronuclei per 1000 erythrocytes (denoted EMN%o).
  • Genotoxicity data are processed according to the recommendations described in the AFNOR 2000 and ISO 2006 standard booklet. Based on the ranks of the median and the quartiles, it allows in particular the processing of results obtained on small samples (n>7 i.e. 35%) whose distribution of values does not obey a normal law.
  • a sample is made up of n values corresponding to the number of smears made per batch.
  • the conduct of the statistical processing consists of determining the ranks of the median M, of the lower quartile QI and of the upper quartile QS by the formulas in Table 1 below.
  • Table 1 formulas for determining the ranks of the median M, the lower quartile QI and the upper quartile QS.
  • the values of the 7°° MNEs are ranked in ascending order, thus determining a rank for each of the values.
  • the values of M, QI, QS are equal to the values of EMN °° of corresponding rank.
  • the confidence interval CI of the median, at the 95% safety threshold, is calculated according to the formula: M ⁇ 1.57 x EIQ / n where M is the value of the median, n is the number of smears per batch and EIQ is the value of the interquartile range (QS - IQ). The difference between the medians of two samples is significant if their confidence intervals have no common point.
  • the result of a batch is considered positive when the median is greater than twice that of the negative control batch and if the confidence intervals do not overlap.
  • the exposure medium is genotoxic to the larvae under the test conditions.
  • the result is considered negative when the confidence interval of the treated batch is not distinct from that of the negative control batch.
  • the exposure medium is not genotoxic to larvae under the test conditions.
  • the Kruskal-Wallis non-parametric test (or one-factor ANOVA on the ranks) is performed, followed by Dunn's test in order to analyze the differences between groups.
  • the size of the head capsule is used to determine the stage of development of the larvae. These are then divided into two groups depending on whether they have reached stage IV of development or not (ie developmental delay) and the distributions of the different exposure conditions are compared using the 2 test.
  • the analysis that we make of the malformations of the mouth parts is based on all of this work, and takes into account the frequency of appearance of each of the malformations, the overall frequency of appearance, and the average score of severity obtained for each treatment.
  • the statistical processing of the data is carried out with the SigmaPlot 12.0 software.
  • the severity scores are compared by analysis of variance (non-parametric test of Kruskall-Wallis, or one-way ANOVA over ranks).
  • the link between the incidence of malformations and the exposure conditions is assessed by the 2 test, by comparing the number of individuals with malformations to the number of “healthy” individuals.
  • the sex ratios are calculated at the end of the exposure according to the proportion of males and females stuck on tape placed above the water surface of each mesocosm. These proportions are compared between the treated and control conditions by ANOVA or non-parametric tests.
  • Example 3 example of a test in real conditions at a wastewater treatment plant south ofdoch
  • the mesocosms according to the invention make it possible to assess the ecotoxic potential of a liquid effluent, and therefore the associated risk, of a molecule or a set of molecules, even at very low concentrations, without having to know the exact nature of the pollutant(s).

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Farming Of Fish And Shellfish (AREA)

Abstract

La présente invention appartient au domaine de l'écotoxicologie, plus particulièrement à la mesure du potentiel écotoxique d'un effluent aqueux. L'objet de la présente invention se rapporte à un procédé de mesure du potentiel écotoxique d'un effluent aqueux et à un dispositif de mise en œuvre comprenant une batterie de mésocosmes instrumentés et transportables. L'invention se rapport en outre à l'utilisation du dispositif pour mesure le potentiel écotoxique d'un effluent ainsi qu'à un kit de mésocosmes instrumentés et transportables.

Description

PROCEDE DE MESURE DU POTENTIEL ECOTOXIQUE D’UN EFFLUENT AQUEUX ET DISPOSITIF DE MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE
[1] La présente invention appartient au domaine de l’écotoxicologie, plus particulièrement à la mesure du potentiel écotaxique d’un effluent aqueux.
[2] L’objet de la présente invention se rapporte à un procédé de mesure du potentiel écotaxique d’un effluent aqueux et à un dispositif comprenant une batterie de mésocosmes instrumentés et transportables. L’invention se rapporte en outre à l’utilisation du dispositif pour mesurer le potentiel écotaxique d’un effluent ainsi qu’à un kit de mésocosmes instrumentés et transportables.
[3] Le nombre de produits chimiques utilisé par l’homme est en constante augmentation. Ces substances qui sont de natures très variées sont utilisées dans la vie quotidienne et dans de nombreux domaines dont l’industrie, l’agriculture ou dans un cadre domestique. Quelles que soient leurs utilisations, ces produits finissent inexorablement par entrer dans les écosystèmes aquatiques où ils peuvent être responsables de nombreux effets néfastes tant pour l’environnement que pour l’homme.
[4] A la suite de plusieurs scandales sanitaires et catastrophes écologiques de grande ampleur telles que par exemples les catastrophes de la baie de Minamata, de Bhopal ou de Seveso, les différentes marées noires, la pollution au dichlorodiphényltrichloroéthane et son impact direct sur la disparition de plusieurs espèces d’oiseaux (Ramade F, 2007 Introduction à l’écotoxicologie. Ed Tech & Doc Lavoisier, pp 618), une nouvelle discipline s’est développée : l’écotoxicologie. Le but de cette discipline est d’étudier, de connaître et de prédire les effets de composés potentiellement toxiques dans l’environnement. Cette discipline permet de diagnostiquer la gravité d’une pollution, de déterminer les concentrations maximales acceptables d’une substance dans l’environnement et d’évaluer la toxicité d’une nouvelle substance afin d’autoriser ou non sa mise sur le marché.
[5] Aujourd’hui, avec la prise de conscience de protection de l’environnement de plus en plus forte, les normes environnementales sont de plus en plus draconiennes et toute nouvelle substance doit faire l’objet d’évaluations écotoxicologiques de plus en plus nombreuses et de plus en plus poussées avant sa mise sur le marché (avec notamment la réglementation REACH ou règlement européen (règlement n° 1907/2006) entré en vigueur en 2007 pour sécuriser la fabrication et l'utilisation des substances chimiques dans l'industrie européenne).
[6] Il existe deux types de méthodologies pour étudier les effets d’une substance, d’un mélange de produits chimiques ou d’un effluent industriel sur l’environnement : les études au laboratoire et les études in situ. Dans le cas des études de laboratoire, la grande majorité des essais effectués consistent à étudier les effets des contaminants chez une seule espèce à la fois (essais monospécifïques). Ces tests sont utiles car ils permettent d’obtenir rapidement et dans des conditions contrôlées des informations sur la nature écotoxique d’une substance ou d’un mélange. La réglementation actuelle s’appuie sur ces tests pour fixer des seuils et des limites pour les concentrations dans l’environnement. Ces études en laboratoire ne sont que des modèles et ne peuvent pas prendre en compte tous les paramètres, du fait de l’isolement d’une espèce pour réaliser les tests.
[7] A l’opposé, les études de terrain s’appuient sur l’analyse d’indices biologiques, telles que l’indice Multimétrique I2M2, l’indice diatomique (IBD) ou encore macrophytes (IBMR), dans le but d’analyser la qualité des eaux. Cette approche peut être plus ou moins couplée avec des analyses physico-chimiques. Ces études de terrains cherchent à comprendre les impacts réels des contaminants sur les écosystèmes aquatiques. Dans le cas de ces études in situ, l’impact des contaminants est souvent étudié en comparant un site d’intérêt avec un site dit de « référence » (i.e. sans contamination connue). Ces approches sont dépendantes des conditions hydrologiques des masses d’eau.
[8] Plusieurs critiques peuvent être formulées envers les deux types de méthodologies citées précédemment. Tout d’abord, les essais monospécifïques ne sont pas représentatifs des conditions environnementales réelles. Ils sont réalisés la plupart du temps de manière statique (sans renouvellement de milieux) ou semi-statique (changement périodique de milieux) dans de très petits contenants et dans des conditions similaires entre les différents réplicas (température, luminosité, etc.). A l’inverse, les résultats provenant des tests in situ ne sont pas dépourvus d’erreurs d’interprétations puisque d’une part, il est impossible de trouver des sites de référence exempts de toute pollution et que d’autre part, deux sites d’études ne sont jamais identiques en termes de facteurs abiotiques (températures, pH, luminosité, habitats, nutriments, etc.) mais aussi biotiques (présence de parasites, bactéries, virus, etc.). [9] Ainsi, on peut résumer de la manière suivante :
- Les solutions in situ existantes sont très intégratives mais aussi extrêmement dépendantes de la richesse intrinsèque des milieux aquatiques dans lesquels elles sont déployées.
- A l’opposé, les expériences de laboratoire sont parfaitement maîtrisées du point de vue des conditions d’expérimentations mais ne prennent pas en compte les interactions multiples qui caractérisent les écosystèmes naturels. De plus, malgré toutes les précautions pouvant être prises, des modifications physico-chimiques et biologiques du produit ou de l’effluent étudié peuvent avoir lieu lors du transport du site d’étude vers le laboratoire et changer significativement les conclusions quant à la toxicité de son rejet.
[10] A la connaissance des demanderesses, les bureaux d’études qui étudient les effets de rejets industriels doivent actuellement se contenter de travailler à l’aide d’essais monospécifiques ou d’approches in situ utilisant des indicateurs biologiques basés sur des indices biologiques (présence/absence d’espèces polluo-sensibles, abondance spécifique) et sont donc fortement dépendants des facteurs incontrôlables et des approximations discutés ci-dessus.
[11] Ainsi, il existe un besoin pour un procédé et un dispositif innovant d’étude de la qualité des milieux aquatiques qui combine à la fois les avantages des essais monospécifïques (conditions contrôlées et rapidité de la réponse) et les avantages des approches sur le terrain (meilleure représentativité environnementale en prenant en compte les interactions entre les organismes).
[12] Il est du mérite des demanderesses d’avoir développé un nouveau procédé et un nouveau dispositif palliant les défauts des deux types de méthodologies citées ci-dessus.
[13] Un objet de l’invention est un procédé de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux sur un écosystème simplifié, dans lequel le milieu est alimenté de manière continue en effluent aqueux, étant ainsi représentatif des conditions environnementales réelles.
[ 14] L ’invention comprend ainsi un procédé de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux comprenant les étapes : a) formation d’une chaîne trophique artificielle dans un milieu aquatique comprenant un substrat, ledit substrat comprenant une fraction minérale et optionnellement une fraction organique et étant de préférence reconstitué, ladite chaîne trophique comprenant au moins un microorganisme et au moins un macroorganisme et est formée par introduction et stabilisation/temporisation séquentielle desdits micro- et macroorganismes ; b) détermination du potentiel écotoxique de l’effluent aqueux, caractérisé en ce que le milieu est ouvert ou semi-ouvert et est alimenté de manière continue en effluent aqueux.
[15] Lors de la mise en œuvre du procédé, l’alimentation continue en effluent aqueux est constante, de sorte que les débits en effluent à l’entrée et à la sortie du milieu sont égaux.
[16] Avantageusement, une fraction de l’effluent aqueux peut être récupérée en sortie du milieu (via une boucle de recirculation) et peut constituer une fraction de l’effluent aqueux alimentant le milieu, de sorte que l’effluent aqueux entrant dans le milieu aquatique peut être constitué d’un mélange entre l’effluent aqueux et d’eau issue du mésocosme. Dans le présent texte, « effluent aqueux » vise indifféremment l’effluent entrant dans le milieu et comprenant, ou ne comprenant pas, une fraction de l’effluent aqueux récupérée en sortie du milieu. Le procédé peut ainsi comprendre une étape c) de recyclage partiel de l’effluent aqueux dans le milieu.
[17] Au sens de la présente invention, on entend par « potentiel écotoxique », la caractéristique intrinsèque de l’effluent qui lui confère sa capacité à induire des dysfonctionnements à différents niveaux du vivant. Ces dysfonctionnements sont l’expression des variations de réponses significatives, mesurées et quantifiées, pour chaque paramètre biotique et abiotique étudié, entre les cuves de référence et ceux exposés à l’effluent. Les paramètres biotiques étudiés pour déterminer le potentiel écotoxique de l’effluent peuvent par exemple être choisis dans le groupe comprenant le taux de mortalité, le taux de croissance, la génotoxicité, la tératogénicité, le taux d'émergence, le taux de décomposition et/ou le comportement. Les paramètres abiotiques étudiés pour déterminer le potentiel écotoxique de l’effluent peuvent par exemple être choisis dans le groupe comprenant la ou les variation(s) de pH, de conductivité, de potentiel redox, d’oxygène dissous, de concentrations en formes azotées (ammonium, nitrate, nitrite), de concentrations en carbone organique total et dissous, et/ou de concentrations en contaminants métalliques et/ou organiques. Les variations peuvent être quantifiées et il est ainsi possible de déterminer si une variation est significativement différente d’un contrôle. Dans le cadre de l’invention, le dispositif de mise en œuvre du procédé peut comprendre au moins une cuve témoin, de préférence au moins 3 cuves témoins, et au moins autant de cuves exposées à l’effluent étudié. Ainsi, la notion de potentiel écotoxique peut être exprimée par rapport à la dérive des paramètres physico-chimiques et biologiques enregistrés ; c’est à dire les variations de réponse pour chaque paramètre étudié entre les cuves témoins (de référence) et celles exposées à l’effluent. Pour chaque paramètre biotique ou abiotique étudié, la dérive est quantifiée et comparée aux conditions contrôles à l’aide des analyses statistiques.
[18] Ces dysfonctionnements sont comparés par rapport à la référence, les conditions optimums pour la chaîne trophique et dans lequel aucun effluent n’est présent (Bour et al., "Impact of CcCh NP on the fresch water mesocosme studies" environmental nano 2016). La détermination du potentiel écotoxique tient ainsi compte de l’évaluation de différents types de contaminant après exposition d’organismes appartenant aux différents niveaux trophiques d’un écosystème aquatique. De préférence, la détermination du potentiel écotoxique s’obtient par mesure du niveau de toxicité sur le vivant (toxicités aiguë, chronique et génétique) par rapport au contrôle et mesure des variations des conditions physico-chimiques telles que cycle du carbone, décomposition, carbone organique dissous, pH, concentration en oxygène dissous et/ou conductivité de l’effluent par rapport au contrôle.
[19] Avantageusement, le potentiel écotoxique de l’effluent aqueux est déterminé entre 4 et 6 semaines après l’introduction des premiers éléments de la chaîne trophique artificielle (z.e après l’introduction du consortium de microorganismes) dans le milieu.
[20] Avantageusement, le potentiel écotoxique peut être déterminé par la mesure de paramètres biotiques et/ou abiotiques. Les paramètres biotiques peuvent être choisis dans le groupe comprenant le taux de mortalité, le taux de croissance, la génotoxicité, la tératogénicité, le taux d'émergence, le taux de décomposition et/ou le comportement. Les paramètres abiotiques peuvent être choisis dans le groupe comprenant la ou les variation(s) de pH, de conductivité, de potentiel redox, d’oxygène dissous, de concentrations en formes azotées (ammonium, nitrate, nitrite), de concentrations en carbone organique total et dissous, et/ou de concentrations en contaminants métalliques et/ou organiques.
[21] Avantageusement, la détermination du potentiel écotoxique peut être réalisée par comparaison des paramètres biotiques et abiotiques mesurés avec ceux d’un milieu aquatique témoin, dans lequel le procédé selon l’invention est appliqué à l’identique, à la différence que le milieu aquatique témoin est alimenté de manière continue en eau claire, c’est-à-dire sur de l’eau provenant de la même source, mais exempte de contaminant. [22] On entend par « milieu aquatique », un contenant (généralement une cuve), pouvant être transparent, dans lequel sont introduits le substrat et la chaîne trophique artificielle. Le milieu aquatique comprend une entrée et une sortie, permettant la circulation d’eau, conséquence de l’alimentation en continue du milieu.
[23] On entend par « effluent aqueux », un liquide composé principalement d’eau dont la finalité du procédé est d’en mesurer le potentiel écotoxique. Il peut s’agir de tout type d’eau issue de ou impactée par l’activité humaine, dont l’activité industrielle, l’agriculture et l’utilisation domestique. Il s’agit d’eau pouvant comprendre des substances, particules et matériaux chimiques testés isolément dans une eau de référence. L’effluent aqueux peut comprendre de la matière organique ou inorganique, en suspension ou dissoute. Ainsi, il peut s’agir d’eaux naturelles (eau de cours d’eaux tels que rivières ou fleuves, lacs, et plus généralement des eaux de surfaces des et eaux souterraines), d’eaux usées, par exemple issues de stations d’épuration (STEP) traitées ou non traitées, de lixiviats et de percolats de déchets industriels, de matériaux ou de déchets agricoles (eaux vertes, blanches), eaux issues de l’industrie agroalimentaire. L’effluent aqueux peut être dilué ou non dilué.
[24] On entend par « alimenté en continu », un renouvellement permanent, sans interruption, de l’effluent aqueux, dilué ou non dilué, pendant toute la durée de mise en œuvre du procédé. L’effluent peut être acheminé à l’aide d’une machinerie. Ainsi, l’effluent circule dans le milieu. Ainsi, l’approche dynamique du procédé mis en œuvre permet de prendre en compte tout changement de la composition intrinsèque de l’effluent aqueux à tester tant qualitatif (composition d’effluent) que quantitatif (débits d’effluents). Le procédé selon l’invention permet ainsi d’évaluer toutes les variations de l’effluent. C’est un avantage par rapport à un système fermé (par opposition à ouvert ou semi-ouvert) dans lequel un seul effluent, aux caractéristiques fixes, peut être évalué. Un autre avantage du procédé selon l’invention, est qu’il est réalisé en milieu ouvert ou semi-ouvert, ce qui permet de se rapprocher davantage des conditions environnementales.
[25] Avantageusement, l’effluent aqueux alimentant en continu le milieu est dilué ou non dilué (i.e. brut). L’effluent aqueux peut ainsi être prélevé directement à la sortie d’une station d’épuration ou bien être prélevé dans un cours d’eau ou une canalisation. Quelle que soit son origine, il peut être dilué préalablement à son introduction dans le milieu. Lorsqu’il est dilué, l’effluent aqueux est de préférence dilué avec de l’eau de qualité alimentaire (déchlorée) ou reconstituée fabriquée à partir d’eau déminéralisée et de sels chimiques, et servant à alimenter l’ensemble des cuves témoins. La dilution dépend de l’objet d’étude, par exemple pour un effluent de STEP, la dilution dépend du débit moyen du cours d’eau dans lequel l’effluent est rejeté. La dilution peut varier du 50ème au 500ème, en fonction du type de cours d’eau.
[26] Avantageusement, le débit d’alimentation de l’effluent aqueux est compris dans un intervalle allant de 0,3 à 1 L par jour. La quantité d’eau dans le milieu est de préférence maintenue constante, ainsi les débits d’entrée et de sortie en effluent aqueux sont égaux.
[27] Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape de dilution de l’effluent aqueux, préalablement à son alimentation du milieu.
[28] Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape de régulation de la température de l’effluent aqueux et/ou du milieu, de préférence à une température comprise dans un intervalle allant de 15 à 25°C. Généralement, la température du milieu aquatique est maintenue à une température comprise dans un intervalle allant de 15 à 25°C pendant toute la durée de la mise en œuvre du procédé.
[29] On entend par milieu « ouvert », que l’effluent aqueux qui circule dans le milieu n’est pas recyclé et par « semi-ouvert », qu’une partie de l’effluent est récupérée en sortie du milieu et réinjectée, de préférence via une boucle de recirculation. Ainsi en milieu semi- ouvert, une partie de l’effluent recyclé sert à alimenter le milieu en continu. L’usage de la boucle de recirculation permet seulement d’augmenter le temps de séjour de l’effluent dans le système, sans dilution de l’effluent à tester. Un milieu semi-ouvert peut en outre présenter les avantages de consommer (et donc gaspiller) moins d’eau, mais aussi de limiter la régulation de la température, lorsque celle-ci est nécessaire.
[30] Avantageusement, en fonctionnement ouvert, l’effluent aqueux n’est pas recyclé et la totalité de l’effluent aqueux alimentant le milieu est rejeté en sortie du milieu. En fonctionnement semi-ouvert, une fraction de l’effluent aqueux alimentant le milieu est recirculée et utilisée pour alimenter le milieu. La fraction recyclée de l’effluent aqueux peut être de l’ordre de 1 à 90 % de l’effluent, de préférence de 30 à 60 % et de manière encore préférée 40 %. La fraction recyclée est récupérée en sortie du milieu puis mélangée en amont avec l’effluent aqueux alimentant le milieu. Ainsi, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape c) de recyclage partiel de l’effluent, de préférence recyclage de 1 à 90 % de l’effluent et de manière encore préférée de 30 à 60 % et de manière encore préférée 40 %. En particulier, si l’effluent aqueux est très toxique (par exemple d’après les résultats d’analyses préalables), on doit faire une dilution importante ce qui explique les pourcentages de 1 à 90%, 40% permet d’avoir un renouvellement de la cuve compatible.
[31] Avantageusement, le milieu aquatique comprend un substrat. Le substrat peut être naturel ou reconstitué, de préférence reconstitué. Le substrat comprend une fraction minérale et optionnellement une fraction organique. La fraction minérale peut comprendre un sable normalisé de granulométrie connue, tel que le sable SNL. Il peut comprendre de la silice, de la kaolinite, du carbonate de calcium et comprend généralement a minima de la silice sous forme de sable de granulométrie variée. De préférence, la fraction minérale comprend du sable fin (par exemple du sable de Fontainebleau, VWR, l/16ieme à 2mm, CAS 7631-86-9 ou : CF EN196-01 « sable normalisé CEN AF AC AFNOR », littoral) en mélange avec du sable plus grossier (par exemple du sable SNL, certifié AFNOR et ISO 9001 : 2008 ). Généralement, le pourcentage massique de la fraction minérale dans le substrat peut être supérieur ou égal à 90 %, par rapport à la masse totale du substrat. La fraction organique peut comprendre des feuilles d’arbre de la ripisylve des pays tempérés. De préférence, la fraction organique comprend des feuilles d’aulne (Alnus sp) . Généralement, le pourcentage massique de la fraction organique dans le substrat est inférieur ou égal à 10 %, par rapport à la masse totale du substrat. Ainsi, les différents éléments constitutifs du substrat peuvent être choisis en fonction des besoins des organismes qui composent la chaîne trophique artificielle. Par exemple, une chaîne contenant des larves de chironomidae peut comprendre des feuilles d’aulne pour permettre d’étudier la biodégradation des feuilles. Lorsque la chaîne trophique comprend des tubifîcidae, le substrat peut comprendre du sable avec une granulométrie fin. Il est par exemple possible pour se rapprocher au mieux de la réalité d’avoir un mélange de granulométrie.
[32] Dans le cadre de l’invention, on entend par « chaîne trophique », un ensemble de liens qui existe entre les différents maillons qui la composent. Il s’agit de l’ensemble des relations qui s’établissent entre des organismes en fonction de la façon dont ceux-ci se nourrissent. Une chaîne trophique peut ainsi comprendre des producteurs (algues par exemple), des consommateurs primaires (herbivores, phytophages), des consommateurs secondaires (carnivores) et des décomposeurs (ou détritivores). Plus particulièrement, on entend par « chaîne trophique artificielle », de maillons trophiques ajoutés intentionnellement par l’homme pour les besoins de l’expérimentation dans les mésocosmes. Les polluants qui ne se dégradent pas ou peu (métaux lourds) vont se concentrer au sommet de la chaîne trophique, chez les prédateurs. Les décomposeurs sont généralement compris dans le consortium bactérien par exemple, ou bien par les chironomidae. C’est une fonction qui peut être assurée par plusieurs maillons de la chaîne.
[33] Avantageusement, selon l’invention, la chaîne trophique artificielle peut comprendre :
- un consortium de microorganismes,
- au moins un consommateur primaire, apte à se nourrir du consortium de microorganismes, et
- optionnellement au moins un consommateur secondaire, apte à se nourrir des consommateurs primaires.
[34] On entend par « consortium de microorganismes », un consortium comprenant des bactéries, des champignons microscopiques et des algues unicellulaires. Par exemples, les bactéries peuvent être choisies dans le groupe comprenant Nitrobacter, Nitrosomonas, Pseudomonas et Bacillus, les champignons peuvent être choisis dans le groupe comprenant Hyphomycètes, Eumycètes et Ascomycètes et les microalgues peuvent être des diatomées d’eau douce.
[35] On entend par « consommateur primaire », un organisme qui se nourrit au dépend d’organismes autotrophes (microorganismes contenus dans le consortium du biofïlm). Il peut de préférence être choisi dans le groupe comprenant des invertébrés (tels que par exemple des chironomes, tubifex, daphnies, crevettes d’eau douce, gammares ou limnés), des amphibiens (tels que par exemple des larves de xénopes (xenopus sp)), et leurs mélanges.
[36] On entend par « consommateur secondaire », un organisme qui se nourrit des consommateurs primaires. Il peut de préférence être choisi dans le groupe comprenant des larves d’ amphibiens (tels que par exemple des Pleurodèles sp ou des Ambystoma sp), des poissons (tels que par exemple des groupes des poecilidés ou cyprinidés), et leurs mélanges. De préférence, le consommateur secondaire sera un seul parmi les carnivores listés ci- dessus.
[37] Avantageusement, l’étape a) du procédé selon l’invention peut comprendre les sous- étapes : - i) mise en place dans un milieu (i.e. un compartiment d’analyse), du substrat et d’eau, de préférence de l’eau de qualité alimentaire (déchlorée) ou reconstituée fabriquée à partir d’eau déminéralisée et de sels minéraux,
- ii) introduction dans le milieu du consortium de microorganismes,
- iii) stabilisation du milieu pendant une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines,
- iv) introduction dans le milieu des consommateurs primaires, de préférence en plusieurs étapes successives, lorsqu’il y a plusieurs consommateurs primaires,
- v) temporisation du milieu pendant une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines,
- vi) optionnellement introduction dans le milieu des consommateurs secondaires, de préférence en plusieurs étapes successives, lorsqu’il y a plusieurs consommateurs secondaires.
[38] Avantageusement, la stabilisation du milieu peut avoir une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines. On entend par « stabilisation du milieu », la période durant laquelle on surveille le pic de concentration en nitrites dans le milieu. Les concentrations en nitrates, nitrites, pH et O2 sont mesurées pour démontrer la stabilisation du système, pour que le bio film soit opérationnel. Pour la stabilisation soit atteinte, il faut le pic de nitrites soit passé, des mesures quotidiennes sont réalisées et c’est à partir du moment où le pic redescend qu’il est estimé que la stabilisation est atteinte (concentration en nitrites inférieure à 1 mg/L). Les bactéries transforment tout ce qui est ammonium dans le milieu en nitrites, puis en nitrates. Le consortium consomme ainsi les nitrates pour fabriquer de la biomasse. Le développement du biofilm est évalué en observant le changement de couleur du sédiment traduisant le niveau de colonisation. De préférence, le milieu est dit stabilisé lorsque la concentration en nitrites dans le milieu baisse et qu’elle est inférieure à 1 mg/L.
[39] Avantageusement, la temporisation du milieu peut avoir une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines. Par exemple les chironomes sont introduits, une période d’au moins une semaine d’exposition est préférable, pour les xénopes, au moins 12 jours d'exposition sont préférables. La durée d’exposition est fonction des espèces introduites (stades de développement notamment) et du paramètre biologique mesuré, les paramètres doivent être adaptés. Ainsi, on entend par « temporisation », le temps nécessaire à ce que le consommateur primaire consomme le maillon inférieur sans que cette étape ne soit limitante.
[40] Avantageusement, préalablement à leur introduction dans le milieu, les différents maillons trophiques sont élevés indépendamment dans des milieux de culture adaptés en conditions contrôlées. Le consortium (bactéries, algues, champignons) peut être cultivé à partir de prélèvement en milieu naturel ou à partir de cultures préexistantes. Le consortium est introduit dans le système au moment opportun (105/mL, nombre d’individus par volume, en contrôle avant injection). Parmi les consommateurs primaires, les invertébrés peuvent être élevés 48h dans une eau normalisée (AFNOR, 2004) depuis leur obtention jusqu’au stade expérimental (stade dépendant du paramètre étudié). En ce qui concerne les vertébrés, consommateurs primaires et secondaires, ils peuvent être élevés pendant au moins 2 semaines en eau normalisée (ISO, 2006) depuis leur obtention jusqu’au stade expérimental (stade de développement dépendant du paramètre étudié). Le stade expérimental sera déterminé par le modèle biologique, et sera fonction de l’espèce. Par exemple, la génotoxicité et la croissance sont mesurées chez le xénope au stade 54 de la table de développement de Nieuwkoop and Faber (1956). Chez le chironome le taux d'émergence est mesuré au stade adulte émergé. L’homme du métier saura adapter le stade expérimental en fonction du ou des paramètres qu’il souhaite mesurer dans la détermination du potentiel écotaxique de l’effluent aqueux.
[41] Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape d) de mesure du pourcentage de dégradation de la fraction organique du substrat. Cette étape d) permet de mesurer l’impact des polluants testés sur l’activité détritique des champignons, évaluée par la mesure du pourcentage de surface foliaire dégradée. Le pourcentage de dégradation de la fraction organique du substrat est généralement mesuré entre 6 et 10 semaines après l’introduction des premiers éléments de la chaîne trophique artificielle (i.e. le consortium de microorganismes).
[42] Avantageusement, le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une étape préalable de stérilisation du substrat, de préférence à une température supérieure ou égale à 121 °C, pendant une durée supérieure ou égale à 20 minutes.
[43] Selon un autre aspect, l’invention se rapporte également à un dispositif de mise en œuvre du procédé selon l’invention. [44] L’invention se rapporte ainsi à un dispositif de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux comprenant un dispositif d’alimentation en eau et une batterie de mésocosmes instrumentés et transportables.
[45] Avantageusement, le dispositif d’alimentation en eau peut comprendre :
- une première arrivée d’eau,
- une gouttière d’alimentation munie d’un trop plein,
- une seconde arrivée en effluent aqueux,
- au moins un compartiment d’alimentation muni d’une surverse d’alimentation munie d’un filtre, de préférence un peigne,
- une première boucle de recirculation reliée à la gouttière d’alimentation et munie d’un premier système de régulation de température et d’une cuve réservoir, et
- une évacuation d’eau.
[46] On entend par « relié » une connexion directe ou indirecte entre deux éléments du dispositif.
[47] Avantageusement, le dispositif comprend un nombre égal de compartiments d’alimentation et de mésocosmes. Un compartiment d’alimentation est généralement relié à un seul mésocosme. Lorsque le dispositif comprend plusieurs compartiments d’alimentation, la gouttière d’alimentation est reliée à chacun compartiment d’alimentation. Ce type d’alimentation permet d’avoir un débit d’alimentation égal de chacun des compartiments d’alimentation. En fonction de la dilution de l’effluent aqueux, on peut considérer comme négligeable son influence sur les débit/volume mis enjeu dans les mésocosmes.
[48] Avantageusement, le dispositif d’alimentation peut comprendre une ou plusieurs secondes arrivées en effluent aqueux. La seconde arrivée en effluent aqueux peut alimenter un ou plusieurs compartiments d’alimentation. La seconde arrivée en effluent aqueux peut comprendre une pompe. La seconde arrivée en effluent aqueux peut être reliée à un seul ou plusieurs compartiments d’alimentation.
[49] Avantageusement, la batterie de mésocosmes peut comprendre au moins un mésocosme. Lorsque la batterie de mésocosmes comprend plusieurs mésocosmes, certains peuvent être qualifiés de mésocosmes témoins. Un mésocosme témoin est identique à un mésocosme mais n’est pas soumis à l’effluent aqueux lors de la mise en œuvre du procédé. Ainsi, les compartiments d’alimentations reliés au mésocosmes témoins ne sont pas reliés à la seconde arrivée en effluent aqueux.
[50] Avantageusement, l’arrivée en eau est reliée à la cuve réservoir. La cuve réservoir peut comprendre un trop-plein, relié à une évacuation d’eau (permettant d’évacuer le surplus d’eau du dispositif). La gouttière d’alimentation est reliée à chacun des compartiments d’alimentation. L’arrivée en effluent aqueux est reliée au compartiment d’alimentation. Le compartiment d’alimentation est relié au mésocosmes (via la surverse d’alimentation).
[51] Avantageusement, la régulation des débits entrant en eau (arrivée d’eau) et en effluent aqueux (arrivée d’effluent aqueux) permet de régler le taux de dilution de l’effluent aqueux dont le potentiel écotoxique est mesuré.
[52] Avantageusement, le compartiment d’alimentation étant muni d’une surverse d’alimentation, elle-même munie d’un filtre, de préférence un peigne, cette configuration permet une alimentation homogène en effluent aqueux, dilué ou non dilué, dans le mésocosme.
[53] On entend par « cuve » ou « compartiment », un récipient apte au stockage de produits liquides. Elle peut être de forme cylindrique ou parallélépipédique. Elle peut comprendre des ouvertures destinées au remplissage, à la vidange, au nettoyage et à la mise en place de toute étape du procédé selon l’invention. Le volume d’une cuve peut varier en fonction de l’utilisation. L’homme du métier pourra adapter les dimensions et le volume des cuves au cas par cas. Par exemple, la cuve réservoir peut avoir un volume de 500 litres et être en polyéthylène. Le compartiment d’alimentation peut avoir un volume allant de 0,5 à 3 litres, de préférence de 1 à 1,5 litres. Le compartiment d’analyse peut avoir un volume allant de 20 à 50 litres, de préférence de 30 à 40 litres.
[54] Avantageusement, le premier système de régulation de température peut comprendre un thermostat. Le premier système de régulation de température est relié à la cuve réservoir. Le premier système de régulation peut être installé en parallèle ou en série de la cuve réservoir sur la première boucle de recirculation. La température de l’eau du compartiment de distribution peut ainsi être régulée.
[55] Avantageusement, lors de la mise en œuvre du procédé dans le dispositif selon l’invention, une fraction de l’effluent aqueux peut être récupérée à la sortie du mésocosme et peut circuler dans une seconde boucle de recirculation en eau, avant d’être réinjectée dans le compartiment de distribution. La seconde boucle de recirculation peut comprendre un second système de régulation de température. La température de l’eau du compartiment de distribution peut ainsi être régulée. Les premier et second systèmes de régulation de température peuvent être identiques ou différents.
[56] Avantageusement, l’effluent aqueux peut être mélangé à de l’eau claire dans le compartiment de distribution. La gouttière d’alimentation est munie d’un trop-plein permettant le retour de l’eau au sein de la cuve réservoir en cas de débordement. La cuve réservoir et la gouttière d’alimentation sont agencés de sorte que lorsque la gouttière d’alimentation déborde, l’eau s’écoule via le trop plein dans la cuve réservoir. Cet agencement permet de maintenir constante la hauteur d’eau dans la gouttière d’alimentation.
[57] Avantageusement, le ou les moyens de distribution (cuve, gouttière, compartiment de distribution) sont équipés d’un ensemble de vannes couplées à une source d’eau propre (z.e. exempte de polluants et autres éléments éventuellement présents dans l’effluent aqueux) configuré de sorte à permettre un contrôle de la dilution de l’effluent aqueux avant son introduction dans le mésocosme (milieu aqueux). Ainsi, il est possible d’obtenir un débit identique dans chaque mésocosme tout en ayant une dilution identique ou différente de l’effluent aqueux d’un mésocosme à un autre.
[58] Avantageusement, la gouttière d’alimentation et le ou les répartiteurs peuvent être remplacés par un système de distribution ou être compris dans un système de distribution. Le système de distribution peut être tout système permettant une répartition de l’effluent aqueux entre les différents mésocosmes, avec ou sans dilution. Il permet en outre une alimentation continue de chaque mésocosme, à débit identique et dilution variable. Le système de distribution peut être relié à la cuve de distribution à chacun des mésocosmes, ou relié directement à la cuve tampon.
[59] Dans le cadre de l’invention, on entend par « batterie » de mésocosmes, un ensemble de mésocosmes comprenant au moins deux mésocosmes. Une batterie de mésocosmes peut comprendre de 2 à 18 mésocosmes, de préférence de 3 à n*3 mésocosmes, ou n est un nombre entier allant de 1 à 6. Par exemple, dans une batterie à 2 mésocosmes, il y a un mésocosme témoin (dans lequel l’effluent aqueux ne circule pas, seule de l’eau claire, i.e. exempte de contaminant, circule) et un mésocosme soumis à l’effluent aqueux dont on souhaite déterminer le potentiel écotoxique. Dans un dispositif à n*3 mésocosmes (dans lequel n = 2), il y a 3 mésocosmes témoins et 3 mésocosmes soumis à l’effluent aqueux. Dans un dispositif à 9 mésocosmes, il y a 3 mésocosmes témoin, trois mésocosmes soumis à l’effluent aqueux et 3 mésocosmes soumis à l’effluent aqueux soit à une autre concentration/ dilution dudit effluent, ou avec un autre effluent aqueux différent.
[60] On entend par« transportables », que les mésocosmes peuvent être démontés et déplacé afin d’être aisément accessible par l’effluent.
[61] Avantageusement, un mésocosme peut comprendre :
- un compartiment d’analyse comprenant un substrat, de préférence reconstitué, ledit compartiment d’analyse étant munie d’une surverse d’évacuation munie d’un filtre, de préférence un peigne,
- un compartiment d’évacuation d’eau relié à la surverse d’évacuation et
- optionnellement une seconde boucle de recirculation, ladite boucle étant reliée au compartiment de distribution et au compartiment d’évacuation.
[62] Avantageusement, le compartiment d’analyse est relié au compartiment de distribution. Le compartiment d’évacuation est relié à une évacuation d’eau (pour évacuer le surplus d’eau du dispositif). Il peut s’agir de la même évacuation d’eau que celle reliée à la cuve réservoir.
[63 ] Avantageusement, le dispositif selon 1 ’ invention peut comprendre au moins une pompe, de préférence une pompe péristaltique ou une pompe à eau. Par exemple, pour la distribution il s’agit d’une pompe à eau de type à turbine. Par exemple, les pompes utilisées pour la recirculation sont des pompes d’aquarium de type à turbine, dont le débit est très faible, réglable et mesuré. L’apport en effluent est réalisé via des pompes péristaltiques étalonnages et étalonnées.
[64] Avantageusement, le dispositif selon l’invention peut comprendre au moins une lampe. Il peut s’agir de barres de LED avec plusieurs longueurs d'onde adaptées à la croissance des diatomées. De préférence, chaque mésocosme est surmonté d’une lampe à aquarium.
[65] Avantageusement, le dispositif 1 selon l’invention peut comprendre :
- une première arrivé d’eau 111 ;
- une seconde arrivée en effluent aqueux 112 ;
- une gouttière d’alimentation 113 munie d’un trop plein ; - une première boucle de recirculation 114 comprenant un système de régulation de température (chiller) 115, une cuve réservoir 116 et une pompe 117, ladite boucle étant relié à la gouttière d’alimentation 113 ;
- au moins un compartiment d’alimentation 118 munie d’une surverse 119 munie d’un peigne ;
- au moins un mésocosme 120 comprenant :
• un compartiment d’analyse 121 comprenant un substrat 122, ledit compartiment d’analyse étant munie d’une surverse d’évacuation 123 munie d’un peigne,
• un compartiment d’évacuation d’eau 124 relié à la surverse d’évacuation 123, et
• une seconde boucle de recirculation 125 comprenant une pompe 126, ladite boucle étant reliée au compartiment d’alimentation 118 et au compartiment d’évacuation 123 ; et
- une évacuation d’eau 127 reliée à la cuve réservoir 116 et au compartiment d’évacuation 124.
[66] L’invention se rapporte également à une utilisation du dispositif selon l’invention pour déterminer le potentiel écotoxique d’un effluent aqueux.
[67] L’invention comprend aussi un kit de mésocosmes instrumentés et transportables comprenant :
- au moins un mésocosme telle que défini précédemment,
- un dispositif d’alimentation en eau tel que défini précédemment,
- un substrat tel que défini précédemment,
- optionnellement, un consortium de microorganismes tel que défini précédemment,
- optionnellement, au moins un consommateur primaire tel que défini précédemment,
- optionnellement, au moins un consommateur secondaire tel que défini précédemment, - un système d’évacuation d’eau, et
- optionnellement au moins une boucle de recirculation.
[68] [Fig. 1] La figure 1 est une représentation schématique de la chaîne trophique de l’exemple 1.
[69] [Fig. 2] La figure 2 représente un dispositif 1 selon l’invention comprenant une batterie de 4 mésocosmes :
- une première arrivé d’eau 111 ;
- une seconde arrivée en effluent aqueux 112 ;
- une gouttière d’alimentation 113 munie d’un trop plein ;
- une première boucle de recirculation 114 comprenant un système de régulation de température (chiller) 115, une cuve réservoir 116 et une pompe 117, ladite boucle étant relié à la gouttière d’alimentation 113 ;
- au moins un compartiment d’alimentation 118 munie d’une surverse 119 munie d’un peigne ;
- au moins un mésocosme 120 comprenant :
• un compartiment d’analyse 121 comprenant un substrat 122, ledit compartiment d’analyse étant munie d’une surverse d’évacuation 123 munie d’un peigne,
• un compartiment d’évacuation d’eau 124 relié à la surverse d’évacuation, et
• une seconde boucle de recirculation 125 , ladite boucle étant reliée au compartiment d’alimentation 118 et au compartiment d’évacuation 124 ; et
- une évacuation d’eau 126 reliée à la cuve réservoir 116 et au compartiment d’évacuation 124.
[70] [Fig. 3] La figure 3 représente une vue de côté du dispositif 1 selon l’invention.
[71] L’invention sera mieux comprise à la lecture des exemples, non limitatifs, qui suivent.
[72] Exemple 1 : mis en œuyre du procédé selon l’invention
[73] Matériel et méthode [74] Le substrat est du sable fin en mélange (sable de Fontainebleau, VWR) avec du sable plus grossier (sable SNL, certifié AFNOR et ISO 9001 : 2008 ). Le mélange représente 5 cm d’épaisseur soit un volume de 50 mm* 275 mm* 477mm = 6 558 750 mm3 soit environ 6,5 L. Le mélange est lavé trois fois avec de l’eau du robinet et stérilisé dans un autoclave, 20 min à 120°C.
[75] Chaque cuve mesure 477 mm * 275 mm * 275 mm = 36 073 125 mm3 soit 36 L.
[76] L’eau des cuves est de qualité alimentaire (déchlorée) ou reconstituée (fabriquée à partir d’eau déminéralisée et de sels chimiques (norme ISO 21427-1 de 2006): de NaHCO3 (64,75 mg/L), MgSO4 (123,25 mg/L), KC1 (5,75 mg/L) et CaCl2 (294 mg/L). Eau AFNOR chironome [CaCl2 (66,2 mg/L), MgSO4 (61,4 mg/L), NaHCO3 (96 mg/L), KC1 (4 mg/L), CaSO4 (63 mg/L) et NaBr (1 mg/L), conformément à la norme AFNOR (2004).
[77] Chaîne trophique : consortium de micro-organismes (bactéries, algues, champignons)- chironomes -xénope - pleurodèles.
[78] Consortium de microorganismes : les microorganismes proviennent de culture fraîches issues de solutions commerciales proposées par les Sociétés Aquaservice, GBL ou Aquastore, JBL, Daphbio bactofraiche. A cela sont ajoutées des diatomées benthiques (Nitzschia Paled) issues de cultures axéniques (10 mL à une concentration de 1.107/mL, 20 mL pour 30 L). Le consortium peut également être issu du milieu naturel
[79] Chironome : eau AFNOR [CaCl2 (66,2 mg/L), MgSO4 (61,4 mg/L), NaHCO3 (96 mg/L), KC1 (4 mg/L), CaSO4 (63 mg/L) et NaBr (1 mg/L), conformément à la norme AFNOR (2004)].
[80] Amphibiens : norme ISO 21427-1 de 2006): NaHCO3 (64,75 mg/L), MgSO4 (123,25 mg/L), KC1 (5,75 mg/L) et CaCl2 (294 mg/L).
[81] Algues : Les diatomées Nitzschia palea sont cultivées au laboratoire EcoLab (France) en milieu de culture CHU 10 contenant du Fe-EDTA comme source de fer (6,4 < pH < 6,6), ComCHU-10 (mg/L) Ca(NO3)2 4H2O (60 mg/L), MgSO4 7H2O (25 mg/L), K2HPO4 (10 mg/L), Na2CO3 (20 mg/L), Na2SiO3 5H2O (60 mg/L), Fe-EDTA (5 mg/L), H3BO3 (2,86 mg/L), MnSO4, H2O (1,5 mg/L), CuSO4, 5H2O (0,08 mg/L), ZnSO4, 7H2O (0,25 mg/L), ZnSO4, 7H2O (0,02 mg/L), Co(NO3)2, 6H2O (0,05 mg/L),Na2MoO4 2H2O (0,025 mg/L), Na2MoO4 2H2O (0,022 mg/L), Biotine B7 CIOHI6N203S (0,01 mg/L), Vitamine B12 : C63H88CONI4OI4P (0,005 mg/L), Thiamine HCl : CI2HI7CIN4OS, HCL (0,00055 mg/L). [82] Chironomus riparius : L’élevage est réalisé au sein du laboratoire d’après les normes AFNOR (2004) et Environnement Canada (1997). Il est réalisé en aquariums contenant un fond de sable de Fontainebleau et du milieu de culture adapté à l’élevage des chironomes, placés à 21 ± 1°C et soumis à une photopériode de 16h de jour et 8h de nuit. L’apport de nourriture consiste en 400 mg de nourriture pour poisson (Tétramin®) par aquarium et par jour. Quelques jours avant le début des expériences, toutes les masses d’œufs présentes en aquarium d’élevage sont récupérées et placées individuellement en piluliers contenant du milieu de culture. Les masses d’œufs ayant éclos le même jour sont gardées et placées en cristallisoir, à raison de deux à quatre masses par cristallisoir. Les jeunes larves sont récupérées 48h après éclosion.
[83] Xenopus laevis : L’élevage et l’obtention de larves ont lieu au laboratoire. Les reproducteurs mâles et femelles sont élevés séparément, en aquarium acclimatés à 22 ± 1°C et soumis à une photopériode de 8h de jour et 16h de nuit. Ils sont nourris deux fois par semaine de granulés pour élevage piscicole (Trouw France SA) et une fois par semaine de cœur de bœuf. L’accouplement et l’obtention de pontes sont stimulés par injection hormonale du couple de reproducteurs préalablement isolés (mâle : 50 UI de Gonadotrophine Sérique de jument 500 [Pregnant Mare’s Serum Gonadotrophin, PMSG ; MSD, France] ; femelle : 750 UI de Gonadotrophine Chorionique Humaine GCH 1500 [Human Chorionic Gonadotropin, HCG ; MSD, France]). Après la ponte, les adultes sont replacés en aquarium d’élevage et seront de nouveau aptes à se reproduire après trois mois de repos. L’éclosion des œufs survient environ 48h après la ponte. Les larves sont alors transférées en aquariums isolés et nourries quotidiennement de paillettes déshydratées commercialisées pour poissons d’ornement (Tétraphyll®) préalablement broyées en fines particules. Le stade 50 de développement (Nieuwkoop and Faber, 1956) survient au bout de deux à trois semaines et est caractérisé par une constriction à la base du membre postérieur.
[84] Pleurodeles waltlii : L’élevage et l’obtention de larves ont lieu au laboratoire. Les reproducteurs mâles et femelles sont élevés séparément et sont regroupés aux périodes de reproduction uniquement (septembre à octobre et janvier à mars). L’élevage se fait en aquariums contenant de l’eau de ville déchlorée, maintenue à une température de 18°C ± 1°C et soumis à une photopériode de 8h de jour et 16h de nuit. La fécondation in vivo est naturelle (sans injection hormonale) et a lieu aux saisons propices à la reproduction. Après la ponte, les œufs sont placés dans des récipients isolés, où l’éclosion aura lieu une dizaine de jours plus tard. Les premiers jours, l’apport énergétique des jeunes larves provient des réserves contenues dans leur sac vitellin. Elles sont ensuite quotidiennement nourries avec des nauplies d’artémies (Artemia salind), petits crustacés vivant en eaux salées, puis dès que leur taille le permet, avec des larves de chironomes congelées. L’obtention de larves au stade 53 de développement, auquel doit débuter l’exposition, survient environ deux mois après la ponte.
[85] L’origine de l’effluent, son débit ainsi que la dilution sont fonctions de la nature de l’effluent et de la dilution à tester. L’effluent testé provient dans un premier temps de la sortie d’une STation d’EPuration et est prélevé juste avant son arrivée dans la rivière. Ensuite, le même effluent a été testé, après avoir subi un traitement dans la station d’épuration avant sa relâche dans la rivière.
[86] Une fraction est prélevée régulièrement dans la cuve tampon par un préleveur automatique puis stocké dans un container réfrigéré. L'effluent testé correspond à la somme des fractions sur 24h.
[87] Le débit de l'effluent et sa dilution reflètent une représentativité environnementale, calculé sur la base de la configuration STEP/rivière in situ.
[88] Le dispositif utilisé dans cet exemple est celui présenté sur les figures 2 et 3. Il comprend 6 mésocosmes soumis à l’effluent aqueux et 3 mésocosmes témoins (seulement 4 sont représentés sur les figures 2 et 3). Le dispositif fonctionne en circuit semi-ouvert, une partie de l’effluent aqueux étant recyclé.
[89] Circuit de l’effluent : l’effluent à étudier est introduit directement dans le compartiment d’alimentation. La dilution de l’effluent dans le mésocosme est assurée par l’envoie dans le même compartiment d’alimentation de l’eau déchlorée de qualité alimentaire ou reconstituée issue d’une cuve réservoir régulée en température à l’aide d’un premier système de régulation de température via la gouttière d’alimentation de l’eau située au- dessus des mésocosmes. La gouttière d’alimentation est munie d’un trop plein qui permet le retour de l’eau en excès vers la cuve réservoir.
[90] Les mésocosmes sont alimentés par la surverse d’alimentation de chaque compartiment d’alimentation jusqu’à ce que l’eau s’échappe par la surverse d’évacuation. Cette surverse alimente le compartiment d’évacuation relié à une seconde boucle de recirculation munie d’une pompe permettant un retour vers le compartiment d’alimentation de l’eau en excès. [91] Cette seconde boucle de recirculation permet un recyclage partiel de l’effluent aqueux dilué dans le compartiment d’alimentation puis dans le compartiment d’analyse favorisant ainsi une bonne homogénéisation de l’effluent aqueux dilué ainsi qu’une économie de l’effluent aqueux.
[92] La sécurité du système est maintenue grâce à un trop-plein sur le compartiment d’évacuation, permettant l'évacuation de l’excès de liquide du dispositif.
[93] Exemple 2 : détermination du potentiel écotoxique de l’effluent de l’exemple 1
[94] La détermination du potentiel écotoxique est obtenue par mesure du niveau de toxicité sur le vivant (toxicités aiguë, chronique et génétique) par rapport au contrôle et mesure des variations des conditions physico-chimiques telles que cycle du carbone, décomposition, carbone organique dissous, pH, concentration en oxygène dissous et/ou conductivité de l’effluent par rapport au contrôle également.
[95] Dans le cadre de cet exemple, les paramètres biotiques et abiotiques suivants ont été mesurés. Les paramètres biotiques sont :
- diversité chez les bactéries,
- mortalité, croissance et génotoxicité chez les amphibiens,
- croissance, développement, sex ratio et tératogénicité chez les chironomes,
- dégradation matière organique avec les feuilles d'aulne.
[96] Les paramètres abiotiques sont :
- températures,
- oxygène dissous,
- conductivité,
- pH,
- COT et
- COD.
[97] 1. Microorganismes :
[98] 100 mL d’eau et 10 mL de sédiments sont échantillonnés à 3 moments différents au cours de l’expérience (avant l’ajout des chironomes et des amphibiens, à mi exposition et à la fin de l'exposition, c’est-à-dire à 15 jours, 4 semaines et 8 semaines). Les échantillons d'eau sont filtrés à 5 mm (Whatman® Nuclepore™ Track-Etched Membranes) afin de récupérer les microorganismes de la colonne d'eau. Les filtres et les échantillons de sédiments ont été congelés dans de l’azote liquide et stockés à 80 C avant d’être traités pour les analyses. L'ADN total est extrait des échantillons d'eau et des sous-échantillons de sédiments à l’aide du kit d’isolation de l’ADN du sol Mobio® power en suivant les instructions du fabricant. En outre, des contrôles d’extraction négatifs sont effectués pour garantir l'absence de contamination de l’ADN pendant le processus. La quantité et la qualité des extraits d'ADN sont analysées à l'aide d'un spectrophotomètre UV NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Les PCR sont effectuées sur un Système PCR Gene-AmpTM 9700 thermocycleur (Applied Biosystems, Lorster City, CA, Etats-Unis) dans un volume final de 50 ml contenant : 37,5 ml d'eau PCR, 5 ml de tampon PCR 10X, 2 ml d'ADN extrait, 2 ml des deux amorces (10 mM), 1 ml de dNTP (2,5 mM) et 0,5 ml d'ADN polymérase Taq (5 U/mL Sigma Aldrich). Le protocole PCR suivant est appliqué : 94 C pendant 120 s, 30 cycles à 94°C pendant 60 s, à 65°C pendant 40 s, à 72°C pendant 30 s et à 72°C pendant 10 min. Le séquençage des amplicons des gènes ARNr 16S est réalisé à l’aide de la technologie MiSeq d'Illumina (2 250 pb) par la plateforme Get PlaGe (Genotoul, Toulouse, Erance). L’analyse bioinformatique est réalisée à l’aide du pipeline EROGS (Eind Rapidly Operational Taxonomie Units (OTU) Galaxy Solution) sur Galaxy. Les lectures sont regroupées en OTU en utilisant une méthode de regroupement (méthode Swarm). Les chimères sont retirées et des filtres sont appliqués pour maintenir les OTU présents dans au moins 3 échantillons et représentant au moins 0,005% de toutes les séquences. Les OTU sont attribués à différents niveaux taxonomiques (du royaume aux espèces) en utilisant le classificateur RDP et la méthode NCBI Blast ]i sur la base de données Silva 132 (pintail 80).
[99] 2. Xénope et pleurodèle
[100] 2.1. Les méthodes d’exposition de X laevis et de P. waltl. sont similaires, et se déroulent selon la procédure normalisée du test micronoyau amphibiens (ISO 21427-1, 2006) et adaptée. L’exposition débute avec des larves de stade 50 de la table normale de Nieuwkoop et Eaber (1956) dans le cas de X laevis et des larves de stade 53 de la table chronologique de développement (Gallien et Durocher, 1957) dans le cas de P. waltl.. Des lots de 15 individus environ issus d’une même ponte, sont nécessaires afin de diminuer la variabilité génétique interindividuelle. L’exposition a lieu au sein des mésocosmes à une température de 20°C ± 0,5°C et avec une photopériode de 16h.
[101] 2.2. Toxicités aiguë, chronique et génétique : pour les essais de mortalité et de croissance, les larves mortes sont prélevées chaque 24h tout au long de l’exposition. La toxicité aiguë est évaluée par observation visuelle de la survie (%). La toxicité chronique est évaluée par mesure de la longueur de chaque larve sur photographie au premier (Tinitial) et dernier jour d’exposition (Tfinal) d’exposition à l’aide du logiciel Mesurim (Madré, 2006). Cette mesure permet le calcul du taux de croissance selon l’équation suivante : [(( moyCdtoXTfinai - moyCdt°XTmitiai) - (moyCdt°T Tfmai - moyCdtoT’Tmitiai)) / (moyCdt°T Tfmai - moyCdtoT-Tmitiai)] * 100] avec taille moyenne des larves de la condition X à Tfinal : moyCdt°XTfinai et à T0 : moyCdtoXTinitiai ; taille moyenne des larves de la condition T- à T 12 : moyCdtoT’Tfinai et à T0 : moyCdt°T Tinitial. Le seuil de significativité de la mortalité est établi à 25%. Le traitement statistique des données brutes relatives à la taille des larves est réalisé à l’aide du logiciel Sigma stat 3.1. En début et fin d’exposition, les tailles des larves sont comparées à l’aide de tests statistiques non paramétriques pour données non appariées. Le test statistique de Kruskall- Wallis est effectué pour la comparaison entre toutes les conditions, suivi d’un test de Dunn ou de Dunnett pour isoler le(s) groupe(s) responsable(s) de cette différence. Le test statistique de Mann-Whitney est également utilisé pour effectuer une comparaison deux à deux. Pour la génotoxicité, à la fin de l’exposition, une ponction intracardiaque est pratiquée sur chaque larve au préalable immobilisée par immersion dans une solution de tricaïne méthane sulfonate (MS 222, Sandoz). Une micropipette taillée en biseau et héparinée (solution d’héparine lyophilisée à 7%o de chlorure de sodium), est introduite dans le ventricule, dont les contractions permettent la montée du sang dans la micropipette. Un frottis sanguin est alors réalisé pour chaque larve à l’aide d’une lame rodée. Ces étalements sanguins sont immédiatement séchés sous air comprimé à pression réduite. Ils sont ensuite fixés au méthanol absolu pendant 10 mn et colorés pendant 30 mn par immersion dans une solution d’hématoxyline de Groat (solution équivolume de 10 g d’hématoxyline de Groat pour 1 litre d’alcool 95° et de 20 g d’hémalum de fer ammoniacal pour 1 litre d’eau à 1,6% d’acide sulfurique concentré). Ce colorant est spécifique du matériel nucléaire des cellules. Après rinçage à l’eau courante, les lames sont finalement séchées à l’air libre avant d’être observées. La lecture des frottis sanguins est réalisée en microscopie à immersion (Olympus CX41). Pour chaque larve, on détermine ainsi le nombre d’érythrocytes micronucléés présentant un, deux, trois ou davantage de micronoyaux pour 1000 érythrocytes (noté EMN%o). Les données de génotoxicité sont traitées selon les recommandations décrites dans le fascicule de la norme AFNOR 2000 et ISO 2006. Basée sur les rangs de la médiane et des quartiles, elle permet en particulier le traitement de résultats obtenus sur de petits échantillons (n>7 soit 35%) dont la distribution des valeurs n’obéit pas à une loi normale. Un échantillon est constitué par n valeurs correspondant au nombre de frottis réalisés par lot. Pour chaque lot ou échantillon, la conduite du traitement statistique consiste en la détermination des rangs de la médiane M, du quartile inférieur QI et du quartile supérieur QS par les formules du Tableau 1 ci-dessous.
[102] [Table 1]
103] Tableau 1 : formules de détermination des rangs de la médiane M, du quartile inférieur QI et du quartile supérieur QS.
[104] Les valeurs des EMN 7°° sont classées par ordre croissant, déterminant ainsi un rang à chacune des valeurs. Les valeurs de M, QI, QS sont égales aux valeurs de EMN °° de rang correspondant. L’intervalle de confiance IC de la médiane, au seuil de sécurité de 95% est calculé selon la formule : M ± 1,57 x EIQ / n où M est la valeur de la médiane, n est le nombre de frottis par lot et EIQ est la valeur de l’écart interquartile (QS - QI). La différence entre les médianes de deux échantillons est significative si leurs intervalles de confiance n’ont pas de point commun. Le résultat d’un lot est considéré positif lorsque la médiane est supérieure au double de celle du lot témoin négatif et si les intervalles de confiance ne se chevauchent pas. Le milieu d’exposition est génotoxique pour les larves dans les conditions du test. Le résultat est considéré négatif lorsque l’intervalle de confiance du lot traité n’est pas distinct de celui du lot témoin négatif. Le milieu d’exposition n’est pas génotoxique pour les larves dans les conditions du test.
[105] 3. Chironome :
[106] 3.1. Toxicité chronique (développement, croissance) : l’inhibition de croissance et le retard de développement des larves de chironome sont déterminés à la fin d’une exposition de 7 jours. Les larves sont photographiées sous loupe binoculaire et mesurées grâce à un logiciel d’analyse d’image afin d’évaluer l’inhibition de croissance. Les larves sont ensuite décapitées à la base de la capsule céphalique. Celle-ci est alors photographiée et mesurée dans sa grande largeur. La taille de la capsule céphalique permet de déterminer le stade de développement des larves, indiquant alors un éventuel retard de développement. Les tailles des larves sont comparées par analyse de la variance. L’égalité des variances et la normalité de distribution de la population sont vérifiées en premier lieu (test de Shapiro-Wilk). En cas de distribution non normale, le test non paramétrique de Kruskal- Wallis (ou ANOVA à un facteur sur les rangs) est réalisé, suivi du test de Dunn afin d’analyser les différences entre groupes. La taille de la capsule céphalique permet de déterminer le stade de développement des larves. Celles-ci sont alors réparties en deux groupes suivant qu’elles ont atteint le stade IV de développement ou non (i.e. retard de développement) et les répartitions des différentes conditions d’exposition sont comparées grâce au test du 2.
[107] 3.2 Tératogénicité : l’évaluation de l’impact tératogène des NP est donc réalisée sur les capsules céphaliques des larves au stade IV de développement, suite à une exposition de 7 jours. Pour cela, les capsules sont récupérées après décapitation des larves et stockées en éthanol (70%). Les capsules céphaliques sont décolorées par traitement avec une solution d’hydroxyde de potassium (KOH 15%) (Sigma, France) chauffée à 95°C pendant 12 minutes. La réaction est stoppée en remplaçant la solution par de l’éthanol à 70% durant 12h. Les capsules sont alors montées sur lame de microscope avec du milieu de montage Eukitt®(Fluka, France). L’observation microscopique des capsules céphaliques permet ensuite d’évaluer les malformations des parties buccales (mentum et mandibules) chez le chironome. En 1988, Warwick et Tisdale décrivent dans leurs travaux les parties buccales de chironome ne présentant pas d’anomalies, ainsi que l’ensemble des anomalies observées jusqu’alors. Dix ans plus tard, Vermeulen et al. (1998) proposent une méthode de notation des malformations en fonction de leur gravité. Brièvement, chaque dent est virtuellement découpée en quarts, et chaque quart atteint d’une anomalie entraîne un score de 1. La somme des anomalies donne alors le score final de la capsule céphalique étudiée. L’analyse que nous faisons des malformations des parties buccales est basée sur l’ensemble de ces travaux, et prend en compte la fréquence d’apparition de chacune des malformations, la fréquence d’apparition globale, et le score moyen de gravité obtenu pour chaque traitement. Le traitement statistique des données est effectué avec le logiciel SigmaPlot 12.0. Les scores de gravité sont comparés par analyse de la variance (test non paramétrique de Kruskall -Wallis, ou ANOVA à un facteur sur les rangs). Le lien entre l’incidence des malformations et les conditions d’exposition est évalué par le test du 2, en comparant le nombre d’individus ayant des malformations au nombre d’individus « sains ».
[108] Les sex ratios sont calculés à la fin de l’exposition en fonction de la proportion de mâles et de femelle collés sur du scotch placé au-dessus de la surface de l’eau de chaque mésocosme. Ces proportions sont comparées entre les conditions traitées et contrôle par des ANOVA ou des tests non paramétriques.
[109] Ecomarqueur : dégradation matière organique, Des feuilles d’aulne sont récupérées en période de défeuillaison (mois de novembre ; vallon de Ramade, Haute-Garonne, France, 43°31'04.2"N l°25'32.r'E) puis séchées à l’étuve (72h, 50°C, Thermo Jouan EB 170) au laboratoire. Des lots de 3,2 g (poids sec) sont constitués, placés en eau déionisée et stérilisés par autoclavage avant introduction dans les microcosmes afin de limiter l’apport de microorganismes non intentionnels. A la fin de l’exposition, les feuilles sont prélevées, séchées, scannées et pesées pour déterminer la différence de poids sec et de surface foliaire.
[110] Les résultats montrent que le traitement appliqué sur l’effluent avant sa relâche dans la rivière n’a pas eu d’effet significatif sur la dégradation des feuilles d’aulne. Une légère diminution de la quantité globale de pigments chlorophylliens de ces feuilles a été observée lors de l’exposition à l’effluent de la STEP non traité par rapport à l’effluent traité et aux mésocosmes témoins. La diversité microbienne évaluée dans les sédiments est supérieure dans les mésocosmes comprenant l’effluent non traité par rapport à l’effluent traité et au témoin.
[H l] Ces résultats de diversité microbienne montrent que si certains pigments sont ubiquistes et présents dans tous les échantillons (Chlorophylle a, Pheophytine a, Fucoxanthine, Chlorophylle b, Pheophorbide a, P-Carotène ; Antheraxanthine ; Diadinoxanthine, Alloxanthine, Violaxanthine, Cantaxanthine), la présence d’autres pigments semblent particulièrement corrélés à l’effluent de la STEP et sont caractéristiques de familles spécifiques (Myxoxanthophylle = cyanobactéries ; Prasinoxanthine = Prasinophycae). L’analyse de ces pigments révèle donc que malgré l’introduction d’un inoculum bactérien commun aux trois conditions en début d’expérimentation, des divergences sont observées en cours d’expérimentation et traduisent l’implantation de micro-organismes nouveaux qui proviennent des effluents. [112] Par ailleurs, les résultats ont montré que le nombre de chironomes émergés est significativement plus faible dans l’effluent provenant de la STEP par rapport à l’effluent traité et au contrôle. En revanche, il n’y aucune différence significative dans le sex ratio déterminé chez les adultes exposés à l’effluent, qu’il soit traité ou pas, par rapport au contrôle.
[113] La croissance des larves de xénope n’a été que peu impactée par l’effluent de la STEP et a contrario les larves exposées à l’effluent traité avant sa relâche dans la rivière ont présenté une croissance légèrement supérieure aux autres conditions au temps intermédiaire. A la fin de l’exposition aux effluents, aucune différence significative de croissance en taille entre les différentes conditions n’a été observée chez les larves de X laevis.
[114] En revanche, les résultats mettent en évidence une légère génotoxicité de l’effluent de la STEP non traité par rapport à l’effluent traité et au contrôle.
[115] Exemple 3 : exemple d’essai en condition réelles sur une station d’épuration au sud de Toulouse
[116] Dans cette étude, un effluent aqueux est analysé et comparé sur deux saisons (été /hiver) afin de déterminer l’efficacité d’un nouveau système de traitement des eaux usées urbaines (appelé B AM) versus un système conventionnel (appelé STEP).
[117] Le choix des deux saisons a été réalisé sur la base de l’hypothèse avérée qu’une station d’épuration classique rejette plus de composés pharmaceutiques l’hiver que l’été. Cette hypothèse formulée sur la base de la littérature a pu être vérifiée dans cette étude. Par ailleurs, dans un souci de réalisme écologique, il a été choisi de diluer les rejets issus de chaque système de traitement au l/300e. Cette dilution correspondant à celui des rejets de la STEP dans la Garonne à débit moyen de celle-ci. A ces dilutions, même en hiver, les produits analysés étaient tous en limite de détection au moment de l’analyse.
[118] Le dispositif utilisé pour la mise en œuvre de cette étude est le même que celui de l’exemple 2.
[119] Les paramètres biotiques et abiotiques mesurés sont les mêmes que dans l’exemples 2. Ils ont été déterminés selon les mêmes méthodes que dans l’exemple 2.
[120] Les résultats ont permis de mettre en évidence une différence notable de l’écotoxicité des effluents issus du traitement classique entre les différentes campagnes étudiées (été vs hiver) avec des effets plus marqués en hiver. Notamment en termes de génotoxicité chez les larves de xénopes, et des retards à l’éclosion des larves de chironomes. Les mésocosmes ont aussi permis de montrer que le B AM réduisait de façon significative et très efficacement l’écotoxicité des effluents par rapport à la STEP, qu’elle que soit la période étudiée.
[121] En bilan, les mésocosmes selon l’invention permettent d’évaluer le potentiel écotoxique d’un effluent liquide, et donc le risque associé, d’une molécule ou d’un ensemble de molécules même à des très faibles concentrations, sans avoir à connaitre la nature exacte du ou des polluants.
[122] Au cours de la campagne estivale, l’effluent de la STEP non traité s’est révélé écotoxique vis -à-vis des larves de chironomes en provoquant une baisse significative de leur émergence et vis-à-vis des larves de xénope en induisant un faible potentiel génotoxique. En outre, l’effluent de la STEP provoque des modifications importantes dans la composition du biofïlm présent dans le sédiment. Le traitement de cet effluent est démontré efficace puisqu’il montre une réduction des effets délétères chez les chironomes et les xénopes et que les modifications de la composition du biofïlm dans le sédiment sont faibles.

Claims

29 Revendications
[Revendication 1] Procédé de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux comprenant les étapes :
- a) formation d’une chaîne trophique artificielle dans un milieu aquatique comprenant un substrat, ledit substrat comprenant une fraction minérale et optionnellement une fraction organique et étant de préférence reconstitué, ladite chaîne trophique comprenant au moins un microorganisme et au moins un macroorganisme et est formée par introduction et stabilisation/temporisation séquentielle desdits micro- et macroorganismes ;
- b) détermination du potentiel écotoxique de l’effluent aqueux, caractérisé en ce que le milieu est ouvert ou semi-ouvert et est alimenté de manière continue en effluent aqueux.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1, dans lequel le débit d’alimentation de l’effluent aqueux non dilué est compris dans un intervalle allant de de 0,3 à 1 L par jour.
[Revendication 3] Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre une étape de dilution de l’effluent aqueux, préalablement à son alimentation du milieu.
[Revendication 4] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape de régulation de la température de l’effluent aqueux, de préférence à une température allant de 15 à 25°C.
[Revendication 5] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape c) de recyclage partiel de l’effluent, de préférence recyclage de 1 à 90 % de l’effluent.
[Revendication 6] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la chaîne trophique artificielle comprend :
- un consortium de microorganismes,
- au moins un consommateur primaire, apte à se nourrir du consortium de microorganismes,
- optionnellement au moins un consommateur secondaire, apte à se nourrir des consommateurs primaires.
[Revendication 7] Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l’étape a) comprend les sous étapes : 30
- i) mise en place dans un milieu (i.e. un compartiment d’analyse), du substrat et d’eau, de préférence de l’eau de qualité alimentaire ou reconstituée fabriquée à partir d’eau déminéralisée et de sels minéraux,
- ii) introduction dans le milieu du consortium de microorganismes,
- iii) stabilisation du milieu pendant une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines,
- iv) introduction dans le milieu des consommateurs primaires, de préférence en plusieurs étapes successives, lorsqu’il y a plusieurs consommateurs primaires,
- v) temporisation du milieu pendant une durée allant de 1 à 3 semaines, de préférence 2 semaines,
- vi) optionnellement introduction dans le milieu des consommateurs secondaires, de préférence en plusieurs étapes successives, lorsqu’il y a plusieurs consommateurs secondaires.
[Revendication 8] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la température du milieu est comprise dans un intervalle allant de 15 à 25°C.
[Revendication 9] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une étape d) de mesure du pourcentage de dégradation de la fraction organique du substrat.
[Revendication 10] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape préalable de stérilisation du substrat, de préférence à une température supérieure ou égale à 121 °C, pendant une durée supérieure ou égale à 20 minutes.
[Revendication 11] Dispositif de mesure du potentiel écotoxique d’un effluent aqueux comprenant un dispositif d’alimentation en eau et une batterie de mésocosmes instrumentés et transportables.
[Revendication 12] Dispositif selon la revendication précédente dans lequel le dispositif d’alimentation comprend :
- une première arrivée d’eau,
- une gouttière d’alimentation munie d’un trop plein,
- une seconde arrivée en effluent aqueux,
- au moins un compartiment d’alimentation muni d’une surverse d’alimentation munie d’un peigne, - une première boucle de recirculation reliée à la gouttière d’alimentation et munie d’un premier système de régulation de température et d’une cuve réservoir, et
- une évacuation d’eau.
[Revendication 13] Dispositif selon la revendication précédente, dans lequel un mésocosme comprend :
- un compartiment d’analyse comprenant un substrat, de préférence reconstitué, ledit compartiment d’analyse étant munie d’une surverse d’évacuation munie d’un peigne,
- un compartiment d’évacuation d’eau relié à la surverse d’évacuation et
- optionnellement une seconde boucle de recirculation, ladite boucle étant reliée au compartiment de distribution et au compartiment d’évacuation.
[Revendication 14] Dispositif (1) selon la revendication précédente comprenant :
- une arrivé d’eau (111) ;
- une arrivée en effluent aqueux (112) ;
- une gouttière d’alimentation (113) munie d’un trop plein ;
- une première boucle de recirculation (114) comprenant un système de régulation de température (115), une cuve réservoir (116) et une pompe (117), ladite boucle étant relié à la gouttière d’alimentation (113) ;
- au moins un compartiment d’alimentation (118) munie d’une surverse (119) munie d’un peigne ;
- au moins un mésocosme (120) comprenant :
• un compartiment d’analyse (121) comprenant un substrat (122), ledit compartiment d’analyse étant muni d’une surverse d’évacuation (123) munie d’un peigne,
• un compartiment d’évacuation d’eau (124) relié à la surverse d’évacuation (123), et
• une seconde boucle de recirculation (125) comprenant une pompe (126), ladite boucle étant reliée au compartiment d’alimentation (118) et au compartiment d’évacuation (124) ; et
- une évacuation d’eau (127) reliée à la cuve réservoir (116) et au compartiment d ’ évacuation (124).
[Revendication 15] Utilisation du dispositif selon l’une quelconque des revendications 11 à 14 pour déterminer le potentiel écotoxique d’un effluent aqueux.
[Revendication 16] Kit de mésocosmes instrumentés et transportables comprenant :
- au moins un mésocosme telle que défini à la revendication 13,
- un dispositif d’alimentation en eau selon la revendication 12,
- un substrat tel que défini à la revendication 1,
- optionnellement, un consortium de microorganismes,
- optionnellement, au moins un consommateur primaire,
- optionnellement, au moins un consommateur secondaire,
- un système d’évacuation d’eau, et
- optionnellement au moins une boucle de recirculation.
EP21814833.6A 2020-11-13 2021-11-05 Procede de mesure du potentiel ecotoxique d'un effluent aqueux et dispositif de mise en oeuvre du procede Withdrawn EP4244619A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2011665A FR3116285A1 (fr) 2020-11-13 2020-11-13 Procede de mesure du potentiel ecotoxique d’un effluent aqueux et dispositif de mise en œuvre du procede
PCT/FR2021/051953 WO2022101567A1 (fr) 2020-11-13 2021-11-05 Procede de mesure du potentiel ecotoxique d'un effluent aqueux et dispositif de mise en oeuvre du procede

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP4244619A1 true EP4244619A1 (fr) 2023-09-20

Family

ID=74860027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP21814833.6A Withdrawn EP4244619A1 (fr) 2020-11-13 2021-11-05 Procede de mesure du potentiel ecotoxique d'un effluent aqueux et dispositif de mise en oeuvre du procede

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4244619A1 (fr)
FR (1) FR3116285A1 (fr)
WO (1) WO2022101567A1 (fr)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101207158B1 (ko) * 2012-04-20 2012-11-30 전남대학교산학협력단 생물 독성 생태 환경 실험을 위한 폐쇄식 생태수조
CN206736016U (zh) * 2017-03-17 2017-12-12 江苏德立环保工程股份有限公司 一种农村污水处理出水水质生物预警系统

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022101567A1 (fr) 2022-05-19
FR3116285A1 (fr) 2022-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pérez-Ruzafa et al. Evidence of a planktonic food web response to changes in nutrient input dynamics in the Mar Menor coastal lagoon, Spain
Hansen et al. Bacteria associated with a marine planktonic copepod in culture. II. Degradation of fecal pellets produced on a diatom, a nanoflagellate or a dinoflagellate diet
Rzeznik-Orignac et al. Spatio-temporal structure of the nematode assemblages of the Brouage mudflat (Marennes Oléron, France)
Hwang et al. Grazing effects of a freshwater bivalve (Corbicula leana Prime) and large zooplankton on phytoplankton communities in two Korean lakes
Srisunont et al. Uptake, release, and absorption of nutrients into the marine environment by the green mussel (Perna viridis)
Hussenot Emerging effluent management strategies in marine fish-culture farms located in European coastal wetlands
Michalec et al. Changes in the swimming behavior of Pseudodiaptomus annandalei (Copepoda, Calanoida) adults exposed to the diatom toxin 2-trans, 4-trans decadienal
Camargo et al. Determination of biological and physicochemical parameters of Artemia franciscana strains in hypersaline environments for aquaculture in the Colombian Caribbean
Franco-Nava et al. Effect of fish size and hydraulic regime on particulate organic matter dynamics in a recirculating aquaculture system: elemental carbon and nitrogen approach
Albariño et al. The effect of sunlight on leaf litter quality reduces growth of the shredder Klapopteryx kuscheli.
Hyvärinen et al. Pulsed flow-through cultivation of Margaritifera margaritifera: Effects of water source and food quantity on the survival and growth of juveniles
Wiklund et al. Effects of warming and shifts of pelagic food web structure on benthic productivity in a coastal marine system
EP4244619A1 (fr) Procede de mesure du potentiel ecotoxique d&#39;un effluent aqueux et dispositif de mise en oeuvre du procede
Manríquez et al. Behavioural and physiological responses of the surf clam Mesodesma donacium to brine discharges
Tang et al. Seasonal distribution of DMSP among seston, dissolved matter and zooplankton along a transect in the Long Island Sound estuary
Almada et al. Experimental evidence of the grazing impact of Boeckella poppei on phytoplankton in a maritime Antarctic lake
Bischoff Solid waste reduction of closed recirculated aquaculture systems by secondary culture of detritivorous organisms
Greve et al. Development and validation of an ecotoxicity test using field collected eggs of the riverine mayfly Ephoron virgo
Dalsgaard 5th NordicRAS Workshop on Recirculating Aquaculture Systems. Berlin, Germany, 7-8 October 2019: Book of Abstracts
Solomon et al. Study of dry season zooplankton of Lower River Benue at Makurdi, Nigeria
Ehrenhaus et al. Changes in the phytoplankton of Lake Planetario after a restoration process
Calandrini et al. Growth of Anagnostidinema amphibium LBABL-2 (Oscillatoriales, Cyanobacteria) in different abiotic stress conditions
Bielsa et al. The effect of untreated sewage discharge in food availability, egg production, and female survival of the copepod Acartia tonsa in a southwestern Atlantic estuary
Langenfeld The effects of microplastics on freshwater phytoplankton and zooplankton communities in a boreal lake
Griffin Influence of food type on the production and settling rate of faecal pellets produced by an estuarine copepod

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20230523

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20250422

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20250823