EP4243766A1 - Systemes de liberation de proteines par voie buccale - Google Patents

Systemes de liberation de proteines par voie buccale

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Publication number
EP4243766A1
EP4243766A1 EP21805546.5A EP21805546A EP4243766A1 EP 4243766 A1 EP4243766 A1 EP 4243766A1 EP 21805546 A EP21805546 A EP 21805546A EP 4243766 A1 EP4243766 A1 EP 4243766A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
patch
protein
chi
membranes
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21805546.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Claire MONGE
Bernard Verrier
Anne-Lise PARIS
Sofia CARIDADE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4243766A1 publication Critical patent/EP4243766A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
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    • A61P37/08—Antiallergic agents
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    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal

Definitions

  • the invention relates to a delivery system, in the form of a mucoadhesive patch, of a protein by oral route.
  • Oral administration of drugs is the most widely used route of administration.
  • the release of proteins of therapeutic interest by this route is delicate because the proteins are highly sensitive to the action of enzymes in the gastrointestinal tract.
  • the oral mucosa represents an attractive alternative route of administration, as it bypasses the first-pass effect, exhibits low enzyme activity and a physiological pH range, and is anatomically accessible and well vascularized.
  • a buccal delivery system could thus provide either local (mucosa) or systemic (transmucosal) release of the protein.
  • a mucoadhesive patch composed of a combination of two polysaccharides: a chitosan (CHI), and an anionic polysaccharide, such as hyaluronic acid (HyA).
  • CHI chitosan
  • HyA hyaluronic acid
  • the patch of the invention which adheres to the buccal or sublingual mucosa, is a so-called “buccal” or “sublingual” patch.
  • the invention thus provides a mucoadhesive patch intended for the buccal or sublingual release of a protein or of a polypeptide, said patch comprising at least 100 bilayers each composed of a layer of chitosan (CHI) and of a layer of an anionic polysaccharide having a molecular weight between 500 and 1000 kDa or a salt thereof, the layer in contact with the mucosa and the layer in contact with the buccal or sublingual environment of the patch being composed of chitosan (CHI), said protein or said polypeptide being incorporated into said patch and/or adsorbed to the surface of said patch.
  • CHI chitosan
  • CHI chitosan
  • the invention provides a buccal or sublingual mucoadhesive patch comprising a protein or a polypeptide, said patch comprising between 100 and 200 bilayers each composed of a layer of chitosan (CHI) and a layer of one anionic polysaccharide having a molecular weight between 500 and 1000 kDa or a salt thereof, said anionic polysaccharide being hyaluronic acid, the layer in contact with the mucosa and the layer in contact with the buccal or sublingual environment of the patch being composed of chitosan (CHI), said protein or said polypeptide being incorporated into said patch and/or adsorbed on the surface of said patch, and intended to be released buccally or sublingually.
  • CHI chitosan
  • CHI chitosan
  • the patch is self-supporting and dissolves in saliva due to the presence of enzymes capable of degrading the two polysaccharides.
  • Another object of the invention is a process for manufacturing such a patch, comprising the steps consisting in: i) forming a multilayer membrane CHI/anionic polysaccharide by means of a layer-by-layer deposition process (“Layer By Layer ”) on a substrate; ii) detaching the multilayer membrane from the substrate; iii) bringing the multilayer membrane into contact with a protein, whereby the multilayer membrane becomes loaded with protein.
  • Layer By Layer a layer-by-layer deposition process
  • Another object of the invention relates to a patch according to the invention capable of being obtained by a method as described here.
  • Fig. 1 Thickness and degradation profiles of self-supporting membranes (CHI/HyA)ioo.
  • A Thickness of the membranes as a function of variations in the molecular weight of HyA (660 or 1020 kDa, corresponding respectively to HyA.LW and HyA.HW) or deposition time: Short Cycles or Long Cycles. The statistical significance of the differences between two groups was determined using a one-way ANOVA test: ns, non-significant; ****p ⁇ 0.0001.
  • B Degradation profiles of membranes immersed in artificial saliva, expressed as percentage of mass loss as a function of different membrane production parameters.
  • a, b, c, d, e membrane surface; lower sections: cutaway images depth (z-section) of the same membranes. Horizontal scale bar corresponding to 50 pm.
  • Fig. 2 Membrane degradation products show no toxicity to human epithelial cells. Cellular viability after incubation of (A) HeLa and (B) Ho-lu-1 cells with degradation products for 24 hours.
  • Membrane membranes (CHI/HyA)ioo; Membrane.
  • HCl membranes (CHI/HyA)ioo treated with hydrochloric acid (HCl). The statistical significance of the differences between two groups was determined using a one-way ANOVA test: ns, not significant.
  • Fig. 3 Controlled inflammation of the sublingual mucosa by HCl treatment of the membranes.
  • Mucosal thickness (A) and recruitment of CMHII-positive (CMHII+) cells (B) were assessed in whole mucosa (epithelium and lamina intestinal) after application of membrane or l-fluoro-2, 4-dinitrobenzene (DNFB).
  • the native membranes (Patch) were administered for 30 min or 60 min and the membranes treated with HCl (Patch HCl) or NaCl (Patch NaCl) were applied for 30 min.
  • Fig. 4 Schematic representation of protein incorporation by pH variation in a layer-by-layer (LbL) assembly. After functionalization by protein trapping, the LbL membrane becomes a bioactive patch, ready to be applied.
  • CHI chitosan
  • HyA hyaluronic acid.
  • Fig. 5 Incorporation and release profiles from the membrane of ovalbumin labeled with Alexa Fluor 647 (OVA Alexa F - 647 ).
  • OVA Alexa F - 647 OVA Alexa F - 647 .
  • A Levels of AlexaF 647 OVA incorporation into the (CHI/HyA)ioo-CHI patch after incubation with 0.5 ⁇ g protein in HCl and rinsing with different buffers.
  • C upper part
  • Fig. 6 Patch retention time on the sublingual mucosa.
  • B Molecular fluorescence tomography of OVA AF647 in solution or incorporated into the patch (CHI/HyA)ioo. The fluorescence signal was detected 2, 10, or 30 min after administration.
  • Fig. 7 Tissue penetration of AF647 OVA after patch administration. Confocal microscopy of mouse tongue sections with nuclear labeling of cells with DAPI, 2 min after administration of OVA AF647 in solution or 2 min, 10 min, 30 min and 60 min after administration of OVA AF647 incorporated into the patch (CHI/HyA)ioo. OVA AF647 was observed in the keratinized layers 10 min after administration (white arrows) and in the submucosa 30 min after administration (dotted arrow). Scale bar: 20 ⁇ m. Dotted lines corresponding to the limit of the mucosa.
  • Fig. 8 The chemo-attraction capacities of the cytokine CCL20 are preserved in the patch.
  • a concentration of 25 ng.mL' 1 was used to evaluate the migration of DC 2.4 cells.
  • Growth medium, salivary enzymes alone and membranes (CHI/HyA)ioo were used for negative controls.
  • the statistical significance of the differences between two groups was determined using an ANO VA test with a controlled factor: ns, not significant; *, p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01.
  • Fig. 9 Thickness and degradation profiles of self-supporting membranes (CHI/HyA)ioo-
  • CHI or (VIS/HyA)ioo-VIS CHI or (VIS/HyA)ioo-VIS.
  • A Thickness of the membranes according to the number of bilayers: 50, 100, or 200 bilayers with a final layer of HyA. Thickness of membranes made of 100 bilayers with a final layer produced with CHI from Sigma or with Viscosan® (VIS) from Flexichem. Each type of membrane was measured at least 20 times. Statistical significance between two groups was determined using a one-way ANOVA test: ns, not significant, ****, p ⁇ 0.0001.
  • Fig. 10 Incorporation and release profiles of OVA 647 from the membrane.
  • A Incorporation levels of Ah647 OVA into the (CHI/HyA)100-CHI patch after incubation with 0.5 ⁇ g protein in NaCl and rinsing with different buffers.
  • B Release profiles of OVA AH647 from the patch over a 2h washout time with different solutions. Data are the average of triplicates from three independent experiments.
  • C upper part
  • C, lower part Optical section of the patch in depth, along the (z) axis. The dotted lines represent the boundaries of the patch.
  • D Fluorescence intensity of OVA Ah647 and patch (CHI FITC ) along the arrow shown in Figure C (lower part).
  • Fig. H Diagram illustrating the confinement of the protein or polypeptide by swelling or tightening of the multilayer membrane.
  • the inventors have developed a mucoadhesive patch for the buccal or sublingual release of a protein ensuring better control of the dose of protein administered and of its absorption by the mucous membranes.
  • the inventors have also highlighted the non-toxic nature of such a patch and the absence of inflammation of the mucous membranes after the application of such a patch.
  • the present invention therefore relates to a mucoadhesive patch intended for the buccal or sublingual release of a protein or a polypeptide, said patch comprising at least 100 bilayers each composed of a layer of chitosan (CHI) and a layer of an anionic polysaccharide having a molecular weight between 500 and 1000 kDa or one of its salts, the layer in contact with the mucosa and the layer in contact with the buccal or sublingual environment of the patch being composed of chitosan (CHI), said protein or said polypeptide being incorporated into said patch and/or adsorbed on the surface of said patch.
  • CHI chitosan
  • CHI chitosan
  • patch is meant a multilayer adhesive system or a multilayer adhesive membrane comprising a biologically active compound, such as a protein or a polypeptide.
  • mucoadhesive is meant a patch as defined in the present application which can stick to a mucosa, preferably a buccal or sublingual mucosa.
  • self-supporting we mean a structure devoid of support, the rigidity of which alone allows its stability.
  • subject means all human persons or animals, preferably mammals, such as equines, ovidae, bovids, dogs, cats, etc.
  • the patch according to the invention allows the release of any protein or polypeptide of interest.
  • protein is typically meant a polypeptide of at least 100 amino acids, or polypeptides associated with each other.
  • the proteins can preferably have a molecular weight between 20 and 200 kDa. More specifically, the proteins can have a molecular weight lower than 70 kDa, or a higher molecular weight, for example 100 to 200 kDa.
  • antibodies such as immunoglobulins G.
  • Polypeptides which may be protein fragments, typically have 10 to 100 amino acids, more preferably 20 to 80 or 20 to 60 amino acids.
  • the protein or polypeptide is an allergen.
  • Allergens as defined herein include antigens capable of stimulating an allergic reaction in a subject.
  • Allergens can be contained or derived from foods such as milk, eggs, sesame, wheat, soy, fish, shellfish, peanuts, tree nuts. Allergens can also be contained or derived from non-food items such as dust mites, pollen, insect bites, animal fur, wool, drugs, etc.
  • the allergens are preferably polypeptides or proteins forming all or part of an antigen capable of being recognized by a cell of the immune system, and with respect to which it is sought to induce tolerance to the allergen.
  • the protein to be delivered is ovalbumin. Mention may also be made, among the preferred food allergens, of beta-lactoglobulin, alpha-lactabumin, caseins.
  • An object of the invention is thus aimed at an allergen for use in the desensitization of a subject allergic to said allergen, said allergen being administered in the form of a patch as described here.
  • Desensitization of the subject also called allergy immunotherapy, allows the subject to become tolerant to a particular allergen in the long term.
  • the patch according to the invention comprises at least 100 bilayers each composed of a layer of chitosan (CHI) and a layer of an anionic polysaccharide having a molecular weight of between 500 and 1000 kDa or one of the salts, where the layer in contact with the mucosa and the layer in contact with the buccal or sublingual environment are composed of chitosan (CHI).
  • CHI chitosan
  • the patch according to the invention is formed of a multilayer adhesive membrane comprising at least 100 bilayers each composed of said chitosan and said anionic polysaccharide where the two layers located at the two ends or at the periphery of this membrane are composed of chitosan (CHI).
  • CHI chitosan
  • the patch comprises from 100 to 200 CHI/anionic polysaccharide bilayers.
  • the patch comprises 100 or 200 CHI/anionic polysaccharide bilayers, and even more preferably 100 CHI/anionic polysaccharide bilayers.
  • the patch has a thickness of 10 to 20 ⁇ m, preferably of 11 to 19 ⁇ m, 12 to 18 ⁇ m, 13 to 17 ⁇ m, 14 to 16 ⁇ m, and even more preferably from about 15 pm.
  • Chitosan is a polysaccharide composed of the random distribution of 13-(1-4)-linked D-glucosamine (deacetylated unit) and N-acetyl-D-glucosamine (acetylated unit). It is produced by chemical (in an alkaline medium) or enzymatic deacetylation of chitin, which is the component of the exoskeleton of arthropods (crustaceans) or of the endoskeleton of cephalopods (squid%) or even of the wall of fungi .
  • This raw material is typically demineralized by treatment with hydrochloric acid, then deproteinized in the presence of sodium hydroxide or potash and finally bleached with an oxidizing agent.
  • the degree of acetylation is the percentage of acetylated units relative to the number of total units, it can be determined by Fourier transform infrared spectroscopy (IR-TF) or by titration with a strong base.
  • IR-TF Fourier transform infrared spectroscopy
  • the chitosan chosen in the invention has a degree of deacetylation (DD) greater than or equal to 75%, preferably greater than or equal to 78%. Chitosan has the advantage of being one of the only easily usable natural cationic polysaccharides which also has good adhesive properties.
  • Anionic polysaccharides are polymers of the carbohydrate family consisting of several oses linked together by osidic bonds. According to the invention, the polysaccharide or one of its salts has a molecular weight of between 500 and 1000 kDa.
  • anionic polysaccharides mention may be made, for example, of glycosaminoglycans (GAGs), fucoidan, alginates, carrageenans and ulvans.
  • GAGs Glycosaminoglycans
  • the basic unit of GAGs is a disaccharide, consisting of a hexose (hexuronic acid in general) bound to a hexosamine.
  • hexose hexuronic acid in general
  • hexosamine hexuronic acid in general
  • One of the characteristics of these oligosaccharide chains is their very great heterogeneity. Indeed, the variable length of the chains and their structural modifications (sulfations, epimerizations) leads to an uncountable number of combinations.
  • the GAGs are classified into 5 main families: heparins (Hp) and heparan sulphates (HS), hyaluronic acid (HA), chondroitin sulphates (CS), dermatans sulfates and keratan sulfates.
  • Hp heparins
  • HS heparan sulphates
  • HA hyaluronic acid
  • CS chondroitin sulphates
  • dermatans sulfates and keratan sulfates.
  • Fucoidan is a polysaccharide with fucose as its base sugar. It takes its name from the fucus-type algae (brown algae) where it is found.
  • Alginates are polysaccharides obtained from brown algae. Alginates are polymers formed from two monomers linked together by a P-l-4 bond, namely mannuronic acid and guluronic acid.
  • Carrageenans are polysaccharides (galactan) extracted from red algae. Three main categories are marketed today: K-carrageenan, r-carrageenan, and ⁇ -carrageenan, which are differentiated by the number and position of the sulfate groups, as well as by the number of 3,6-anhydrogalactose bridges.
  • Ulvans are sulphated anionic polysaccharides extracted from green algae of the ulva type. They are composed of sodium 3-sulfate ulvanobiuronate type A comprising 3-sulfate rhamnose linked to glucuronic acid through a type 1-4 bond and 3-sulfate Sodium ulvanobiuronate type B comprising 3-sulfate rhamnose linked to iduronic acid by a type 1-4 bond.
  • the anionic polysaccharide or one of its salts is chosen from a glycosaminoglycan (GAG), a fucoidan, an alginate, a carrageenan, and an ulvan. More specifically, the glycosaminoglycan (GAG) or one of its salts is chosen from hyaluronic acid (HA), heparin (Hp), heparan sulphates (Hs), chondroitin sulphates (CS), dermatan sulphates (DS ), and keratan sulfates (KS), preferably hyaluronic acid, and even more preferably sodium hyaluronate.
  • HA hyaluronic acid
  • Hp heparin
  • Hs heparan sulphates
  • CS chondroitin sulphates
  • DS dermatan sulphates
  • KS keratan sulfates
  • the anionic polysaccharide as defined above can be hydrolyzed by salivary enzymes.
  • the mucoadhesive patch according to the present invention can be produced by assembling positively (chitosan) and negatively (anionic polysaccharide) charged layers via an automated dipping process.
  • Such a layer-by-layer (“Layer By Layer” LbL) deposition process is well known to those skilled in the art and is implemented in particular in international application WO 2005/052035 to prepare multilayer films of crosslinked polyelectrolytes.
  • the multilayer membrane thus formed is then brought into contact with a protein or a polypeptide to provide a mucoadhesive patch loaded with protein or polypeptide.
  • An object of the invention therefore relates to a process for manufacturing a patch as described in the present application, comprising the steps consisting in: i) forming a multilayer membrane CH/anionic polysaccharide by means of a layer deposition process by layer (“Layer By Layer”) on a substrate; ii) detaching the multilayer membrane from the substrate; iii) bringing the multilayer membrane into contact with a protein or a polypeptide, whereby the multilayer membrane becomes loaded with protein or polypeptide.
  • Layer By Layer layer
  • Step i) of the process consisting in forming a CH/anionic polysaccharide multilayer membrane is produced by implementing a layer-by-layer technology on a substrate.
  • This automated technology uses a dipping robot, for example the DR-3 robot from Riegler & Kirstein GmbH. More specifically, the solutions of chitosan and the anionic polysaccharide (polyelectrolytes) are prepared in a buffer solution, such as sodium acetate buffer solution. The pH of the solution can be adjusted to around 5.5 with sodium hydroxide (NaOH) and acetic acid (CH3COOH). Furthermore, the substrate used as a support in the dipping robot is prepared on an adhesive tape. A commonly used substrate is polypropylene.
  • the substrate is then immersed sequentially in the solution of chitosan and the anionic polysaccharide with at least one wash step, preferably two wash steps in a buffer solution of sodium acetate, water or buffered saline solution between pH 5 and 6, preferably sodium acetate.
  • the cycle comprising the immersion of the substrate in a chitosan solution, at least one washing step, preferably a single washing step, followed by immersion in an anionic polysaccharide solution and at least one washing step , preferably a single washing step, allows the formation of an anionic CHI/polysaccharide bilayer. This cycle is repeated as many times as necessary to obtain a desired number of bilayers. Immersion and wash times may vary.
  • the immersion time of the substrate in the solutions of polyelectrolytes has a duration of between 2 and 10 minutes, preferably between 2 and 8 minutes, and more advantageously 3 minutes (short cycle, CC) or 6 minutes (Long Cycle, CL).
  • the washing time has a duration comprised between 1 and 10 minutes, preferably between 2 and 4 minutes, and more advantageously 2 minutes (short cycle, CC) or 4 minutes (long cycle, CL).
  • Step ii) of the process consisting in detaching the multilayer membrane from the substrate, in particular polystyrene, can be implemented with an optional prior drying step.
  • the multilayer membrane obtained can then be cut to the desired size.
  • step iii) of the method makes it possible to load the multilayers with protein or polypeptide. More precisely, the loading of the protein or polypeptide into the multilayer membrane is obtained by passive diffusion. Specifically, step iii) is implemented by dissolving the protein or the polypeptide in a suitable buffer solution so as to avoid denaturation of the protein.
  • the multilayer membrane is brought into contact with a protein or polypeptide in an acid solution, preferably of hydrochloric acid (HCl), at a pH of between 2 and 4, preferably at a pH of approximately 3
  • HCl hydrochloric acid
  • the multilayer membrane is brought into contact with a protein or polypeptide in a saline solution, preferably a solution of sodium chloride (NaCl) or a solution of potassium chloride (KCl), at a pH between 5 and 7, preferably at a pH of about 6.5.
  • the bringing into contact of the multilayer membrane with a protein or a polypeptide is implemented by depositing at least one drop of the buffer solution comprising the protein or the polypeptide on the surface of the multilayer membrane.
  • the membrane is then optionally dried to provide a mucoadhesive patch in which the protein or polypeptide is incorporated into the patch and/or adsorbed to the surface of the patch.
  • the patch thus formed is polarized, in that the protein or polypeptide concentration is higher at the level of the upper layers where the protein where the polypeptide has been deposited, relative to the concentration at the lower layers.
  • the method can also comprise an optional step of equilibrating the multilayer membrane before bringing it into contact with the protein or the polypeptide (step designated iii-0).
  • This balancing step consists in soaking the multilayer membrane obtained after step ii) in an acid solution, preferably hydrochloric acid (HCl) at a pH between 2 and 4 or a saline solution, preferably hydrochloric sodium (NaCl), at a pH of between 5 and 7.
  • This optional step of balancing the multilayer membrane at acidic pH makes it possible in particular to inflate the membrane and thus facilitate the loading of protein or polypeptide.
  • the multilayered membrane loaded with protein or polypeptide may possibly tighten when it is soaked in a buffer solution, allowing the protein or polypeptide to be trapped in the patch.
  • the method of the invention therefore comprises, in addition to an intermediate step consisting in equilibrating the multilayer membrane detached according to step ii) with a solution of hydrochloric acid (HCl) at a pH comprised between 2 and 4, of preferably at a pH of about 3 or sodium chloride (NaCl) at a pH of between 5 and 7, preferably at a pH of about 6.5, before performing step iii).
  • HCl hydrochloric acid
  • NaCl sodium chloride
  • a preferred manufacturing method of the invention comprises the steps of: i) forming a CH/anionic polysaccharide multilayer membrane by means of a layer-by-layer deposition process on a substrate; ii) detaching the multilayer membrane from the substrate; iii-0) equilibrating the multilayer membrane detached according to step ii) with an acid solution, preferably hydrochloric acid (HCl), at a pH between 2 and 4, preferably at a pH of about 3 or with a saline solution, preferably sodium chloride (NaCl) at a pH between 5 and 7, preferably at a pH of about 6.5, before the implementation of the step iii). iii) bringing the multilayer membrane into contact with a protein or a polypeptide, whereby the multilayer membrane becomes loaded with protein or polypeptide.
  • an acid solution preferably hydrochloric acid (HCl)
  • HCl hydrochloric acid
  • NaCl sodium chloride
  • the protein or polypeptide can be incorporated into the patch or adsorbed to its surface, as described above.
  • proteins or polypeptides with a molecular weight of less than 70 kDa or 80 kDa are preferably entirely or almost entirely incorporated, that is to say preferably with at least 90% of proteins incorporated, in the patch.
  • a protein or a polypeptide of higher molecular weight can be, in whole or in part, adsorbed on the surface of the patch.
  • the amount of protein or polypeptide incorporated and/or adsorbed depends on the protein or polypeptide and the biological or pharmacological effect desired. This quantity can vary for example from 50 ng/cm 2 to 5 mg/cm 2 , preferably from 10 ng/cm 2 to 1 mg/cm 2 , 1 ⁇ g/cm 2 to 1 mg/cm 2
  • the patch thus obtained can be stored at 4° C. or at room temperature, before application.
  • the patch measures 2-3 cm 2 for an application in a human subject.
  • the patch can be applied for example inside the cheeks, on the palate, the gum or under the tongue. Sublingual application (i.e. on the ventral side of the tongue) is particularly advantageous.
  • the patch is applied in such a way that the layer of chitosan on which the protein or the polypeptide was deposited during the manufacture of the patch, is the layer which is brought into contact with the mucous membrane.
  • Example 1 Manufacture and testing of a mucoadhesive patch
  • CHI Hardware Medium molecular weight chitosan
  • Sigma-Aldrich Prior to its use, CHI was purified by filtration and precipitation steps in water and ethanol, followed by lyophilization to obtain a final molecular weight of 770kDa and a degree of deacetylation (DD) of 78%.
  • DD degree of deacetylation
  • CHI is a positively charged polyelectrolyte. It was compared to another polysaccharide, Viscosan® (VIS), from Flexichem, which has a distinct distribution of N-acetyl groups.
  • Viscosan® Viscosan®
  • HyA sodium hyaluronate
  • HyAuw 610 kDa
  • 1020 kDa 1020 kDa
  • polyelectrolyte solutions were freshly prepared by dissolution in sodium acetate buffer (0.1 M CH3COOH; 0.15 M NaCl, pH 5.5, at room temperature) using concentrations in 1 mg/mL polymer for the production of membranes.
  • CHI medium weight chitosan
  • FITC fluoresceinisothiocyanate
  • CHI F1TC Fluorescein-labeled medium-weight CHI
  • CHI/HyA Self-supporting membranes
  • LbL layer-by-layer
  • DR-3 Riegler & Kirstein GmbH
  • the membranes were fabricated using polystyrene substrates cleaned by sonication in ethanol and distilled water (5 minutes for each solution).
  • the substrates were immersed sequentially in CHI or Viscosan® and in solutions of HyA (HyArw of 610 kDa or HyAuw of 1020 kDa) concentrated at 0.2% (weight/volume) in a sodium acetate buffer (0.2 M CH3COONa, 0.2 M CH3COOH, pH 5.5, at room temperature), with 1 washing step using sodium acetate buffer between each deposit in a polymer solution .
  • the fluorescent membranes (CHI FITC /HyA)ioo-CHI FITC ) were prepared as described previously, with 0.5% of CHI FITC in the chitosan solution at 2mg.mL′ 1 in a sodium acetate buffer of pH 5.5, protected from light.
  • the thickness of the membranes produced was measured after drying and detachment from the substrate.
  • Membrane thickness was determined using a micrometer (High-Accuracy Digimatic Micrometer, Mitutoyo); 20 measurements were taken at different locations at the center of the membranes.
  • MCBL confocal scanning laser microscopy
  • the fluorescent membranes were immobilized on glass slides and incubated in artificial saliva at 37° C. with shaking for 30 min, 3 h, 6 h or 24 h.
  • the degradation was stopped by rinsing with an acetate buffer until observation in MCBL with an LSM710 confocal microscope (Carl Zeiss SAS, France). All images were analyzed using Carl Zeiss Zen software and Image J software.
  • SEM Scanning Electron Microscopy
  • Immortalized Ho-lu-1 cells (a human cell line derived from squamous cell carcinoma cells from the floor of the mouth, from GIMAP, St Etienne, France) were cultured in Dulbecco's Eagle's medium (DMEM) with D-glucose (4.5 g.L-1), pyruvate (1 mmol.L-1) and L-glutamine (2 mmol.L-1), a cocktail of DMEM/Ham's F12 nutrients (1:1) supplemented with 10% (v/v) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1% (v/v) penicillin/streptomycin.
  • DMEM Dulbecco's Eagle's medium
  • FBS heat-inactivated fetal bovine serum
  • HeLa cells human epithelial cell line derived from adenocarcinoma, ATCC® CCL-2 were cultured in DMEM with D-glucose (4.5 g.L-1), pyruvate (1 mmol.L-1) and L-glutamine (2 mmol.L-1) containing 10% (v/v) heat-inactivated FBS and 1% (v/v) penicillin/streptomycin. The cells were maintained at 37°C in a 5% CO2 atmosphere.
  • the cells were seeded in 96-well culture plates.
  • the (CHI/HyA)100-CHI membranes were cut to be resized (3cm 2 per mL of medium), sterilized in 70% ethanol and by exposure to UV light.
  • the membranes were then incubated overnight at 37°C in a culture medium containing salivary enzymes (lysozyme, ⁇ -amylase and hyaluronidase) at 100 pg.mL-1.
  • salivary enzymes lysozyme, ⁇ -amylase and hyaluronidase
  • methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT, 0.5 mg.mL-1) was added to each well for incubation for 3 hours at 37°C.
  • the cells were then incubated overnight, at 37°C and protected from light, in a solubilization solution containing 10% (v/v) Triton X-100 and HCl (0.1 mol. L-1) in anhydrous isopropanol.
  • Absorbance was measured at 570 nm and 690 nm (i-control Infinite® M1000 Pro, Tecan, Switzerland). Positive controls were performed with 0.1% (v/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) and negative controls with cells alone. Data were retained by averaging triplicates for three independent experiments. 1.8 Mouse
  • the membranes were cut to fit the size of mouse tongues (2 mm x 7 mm) and sterilized by UV light.
  • the membranes or liquid formulas were then administered sublingually (ventral part of the tongue) to lightly anesthetized mice (4% isoflurane). After administration, gentle pressure was exerted for 10s (until awakening) on the dorsal part of the tongue to ensure contact of the membrane or the liquid solution with the mucosa. No other restraint was performed. After recovery from anesthesia, the animals were left free to swallow or groom. Water was removed for 30 min after administration and returned for longer experiments.
  • tongue slices were stained with hematoxylin (Gill's formula, Vector) and images were captured using an inverted microscope (Nikon Ti-E). Analysis of mucosal swelling was performed on 2mm lengths extending from the base of the ventral surface. Surface measurements were performed using the polygon tool of the Image J software.
  • CMHII staining the tongue slices were first incubated with a peroxidase blocking reagent (Dako), then with rat anti- biotinylated mice (BD pharmigen), revealed using the Vectastain Elite ABC kit (Vector) and the peroxidase substrate AEC (Vector), and finally counterlabeled with hematoxylin (Gill's formula, Vector).
  • CMHII+ The number of CMHII positive cells (CMHII+) was counted over 2mm lengths extending from the base of the ventral surface of the sublingual membrane, using the Cell Counter plugin of the Image J software.
  • mice Each group consisted of 3 mice. Two groups received native membranes or membranes treated with HCl. Three other groups of mice received sublingually lOpL of CHI (770 kDa, 2 mg.mL-1 in an acetate buffer of pH 5.5, Sigma, USA), lOpL of HyA (610 kDa, 0.95 cm3. kg-l, 2 mg.mL-1, in an acetate buffer of pH 5.5, HTL, France), or lOpL of a combination of the two polymers. The groups of control mice received sublingually either lOpL of PBS or acetate buffer at pH 5.5 for the negative controls, or 12.5 ⁇ L of DNFB at 0.5% (volume/volume) in chloroform for the controls. positive.
  • the tongues were excised 6 hours after application of the membranes or solutions, frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Briefly, the tongues were incubated in RIPA buffer [Tris HCl (50 mmol.L-1), NaCl (150 mmol.L-1), Triton X-100 (1%), sodium deoxycholate (0.5% ), SDS (0.1%) EDTA (1 mmol.L-1) and a protease inhibitor cocktail (1%, Thermo Scientific)] for 2 h on ice, after homogenization using scissors.
  • RIPA buffer Tris HCl (50 mmol.L-1), NaCl (150 mmol.L-1), Triton X-100 (1%), sodium deoxycholate (0.5% ), SDS (0.1%) EDTA (1 mmol.L-1) and a protease inhibitor cocktail (1%, Thermo Scientific)
  • the preparations were then homogenized using a bead beater (2 x 5 min, 30 Hz, 4°C) (TissueLyser II, Qiagen, Germany) and sonication (2 min, 60 Hz), followed by centrifugation for 10 min at 10,000 rpm and 4°C.
  • the total protein concentration in the supernatants was then determined using the BCA protein assay kit (ThermoFisher Scientific, USA).
  • Interleukin 1 beta (IL-ip), IL-6 and tumor necrosis factor alpha (TNF-a) were simultaneously quantified in each sample (V-Plex Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit, MSD, USA) by electroluminescence at using the Mesoscale Discovery system (Meso QuickPlex SQ 120, MSD, USA). Data were retained by averaging duplicates with three mice for each condition.
  • IL-ip Interleukin 1 beta
  • TNF-a tumor necrosis factor alpha
  • the protein used was either ovalbumin labeled with Alexa Fluor 647 (OVA Ah647 ) at 5 pg.mL' 1 (500 ng loaded) or the cytokine CCL20 at 500 ng.mL' 1 (50 ng loaded) in 1 mM of HCl or NaCl buffer.
  • OVA Ah647 ovalbumin labeled with Alexa Fluor 647
  • cytokine CCL20 500 ng.mL' 1 (50 ng loaded) in 1 mM of HCl or NaCl buffer.
  • the membranes were incubated overnight at 4°C. After rinsing with an acetate buffer of pH 5.5 and drying under air flow, the functionalized membranes are designated “bioactive patch”.
  • the Ah647 OVA was incorporated into the membranes as described above. Protein release was monitored at different pHs, with Dulbecco's acetate buffer pH 5.5, pH 7.4 PBS (dPBS) or artificial saliva pH 6.5 being used as rinse solutions. Immediately after the addition of the rinsing solutions, the proteins were removed and preserved to evaluate the quantity of unbound proteins (“quick rinse”, QR). The release of the Ah647 OVA from the membrane was carried out for 2 hours with points at 10, 20, 30, 40, 60, 90 and 120 min. Analysis of the released Ah647 OVA was performed by fluorescence spectroscopy (Infinite M1000, Tecan) with the Alexa Fluor 647 excitation/emission wavelength set at 650/668 nm. A standard curve for the labeled protein was made in dPBS, acetate buffer, HCl and artificial saliva at the previously mentioned wavelengths.
  • mice For tomographic analyzes of protein retention time in the oral region of mice, groups of 2 mice were anesthetized in a chamber receiving a 4% isoflurane flow for 5 minutes.
  • 10 ⁇ l of OVA Ah647 solution was deposited at the base of the ventral surface of the tongues of the mice.
  • the latter were placed on the ventral surface of the tongues.
  • 5 ⁇ g of OVA Ah647 was administered.
  • the mice were placed in the chamber tomography (FMT 4000, Perkin Elmer) under isoflurane, in head-first supine position for the acquisition of images 2, 10 or 30 minutes after administration.
  • the penetration of Ah647 OVA into the sublingual mucosa was evaluated after administration of a liquid formulation (10 ⁇ l) or a patch (CHIFITC-HyA)100-CHI.
  • OVA Ah647 was incorporated by incubation in HCl as described in 1.12. Groups of 2 mice received the different formulations and were euthanized 2, 10, 30 or 60 minutes after administration.
  • the sublingual mucosa (ventral surface of the tongue and floor of the mouth) were removed, embedded in an OCT® matrix and stored at -80°C. 40 ⁇ m sections were made, labeled with the DAPI nuclear probe and then observed under a confocal microscope (LSM 710, Zeiss, Germany).
  • a mouse dendritic cell line (DC 2.4, #SCC142 Millipore) was used to test the in vitro chemotactic effect of the CCL20 chemokine delivered by the engineered membranes.
  • Cells were cultured in RPMI medium supplemented with GlutaMAX, with 10% FBS, 10 mM HEPES, 50 pM P-mercaptoethanol and a mixture of non-essential amino acids (IX) (hereinafter called GM) at 37°C and under atmosphere with 5% CO2.
  • the chemical test was carried out in ThinCertTM cell culture inserts (Greiner Bio-One; ref: 665 610) placed in 12-well plates, for 20 minutes.
  • the membranes, the CCL20 chemokine and the membranes loaded with CCL20 chemokine were incubated for 24 hours in a solution of salivary enzymes (0.1 mg.mL' 1 of ⁇ -amylase, hyaluronidase and lysozyme dissolved in GM without FBS) at 37° C. with slow stirring. Then, the inserts of the 12-well plate were inoculated with a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells/insert and incubated for 10 minutes at 37°C.
  • the native membranes (CHI/HyA)ioo were produced by varying 3 parameters: the molecular weight (MW) of HyA, the deposition time of polyelectrolytes and rinsing solutions, and the properties of the CHI. The influence of such parameters was first examined on the membrane thickness. It has been shown that the growth of native membranes (CHI/HyA)ioo is linear with membranes of 50 bilayers (4.5 +/- 1.39 ⁇ m), 100 bilayers (10.30 +/- 7.67 ⁇ m) and of 200 bilayers (17.04 +/- 7.96 pm) (Fig. 9). At least 50 bilayers were needed for easy handling without any post-procedure treatment.
  • the influence of the conditions used for the construction of the membranes was also examined on the degradation. Additionally, as the intention is to use the membranes for sublingual applications, an artificial saliva was produced.
  • the artificial saliva was composed of a physiological solution containing a-amylase, lysozyme and F-hyaluronidase, three enzymes found in human saliva.
  • the degradation of the membranes produced was monitored over a period of 24 hours and quantified to be expressed as a percentage of weight loss.
  • Membranes made with Viscosan® degraded faster than membranes based on CHI (Fig. 9B), as expected due to the rapid biodegradability of the Viscosan®.
  • CHI-based membranes Although the general degradation profile of CHI-based membranes was not drastically affected by HyA molecular weight, nor deposition times (Fig. IB); in the initial phase of the degradation process (in the first hour) a delay was observed with the membranes constructed in CL condition (inset of Fig. IB). After 24 hours, all the membranes have reached a level of weight loss ranging from 75% to 95%.
  • the membranes (CHI/HyALw)ioo were observed by SEM and by confocal microscopy. Observing the images from these two techniques, an initial surface erosion was observed at 30 min, followed by the formation of superficial holes at 1h, and finally deeper holes at 3h (Fig. IC and 1D). Enzymatic degradation of the membrane surface was also observed from 30 min of immersion in artificial saliva, under hydrated conditions where the membrane swelled to about 30 pm (Fig. 1D). No degradation was observed after 24 h in the acetate buffer (Fig. 1D, control).
  • membranes made of CHI instead of Viscosan® to ensure prolonged diffusion of the cargo protein from the early stages of degradation. in contact with the mucosa.
  • Membranes produced under CC condition were also selected to decrease production time, and the 610 kDa HyArw was randomly chosen as no difference in thickness or degradation was observed compared to HyAuw.
  • all membranes used for animal experimentation had a first and last layer of CHI.
  • the (CHI/HyALw)100-CHI membranes were simply designated as (CHLHyA)100.
  • cytotoxicity of membrane degradation products was evaluated on two human epithelial cell lines (HeLa and Ho-lu-1) over a 24-hour incubation period. No toxicity was observed on both cell lines as the viability remained around 100% (Fig. 2A-B). This result is explained by the known biocompatibility of the two polysaccharides used to produce the membranes which have not been chemically modified. The combination of polymers did not affect their biological safety. Consequently, the membranes can be applied in vivo to the sublingual mucous membranes of mice, without causing any cytotoxic effect on the epithelial cells of the tissue. 2.3 Inflammation of the mouse sublingual mucosa
  • the inflammatory response induced in vivo by the patch was evaluated in mice by evaluating different main characteristics of the inflammatory state.
  • 0.5% l-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) was used as it has been shown to induce inflammation when administered sublingually [LeBorgne et al., 2006], An increase in mucosal thickness was observed 30 min after DNFB administration and decreased slightly after 2 h (Fig. 3 A). It should be noted that the swelling of the lamina limbalium was maintained for 6 hours while the thickness of the epithelium had already decreased after 2 hours.
  • CHI/HyA membrane-induced swelling
  • native membranes and HCl-treated membranes incubation of 1 h in 1 mM HCl, pH 3
  • HCl treatment is part of the protein incorporation protocol
  • its influence on the inflammatory response was assessed.
  • the swelling of the mucosa after the application of the native membrane was comparable to the swelling induced by the positive control DNFB at 2 h, whereas the mucosa in contact with the membrane treated with HCl was significantly thinner.
  • immunohistochemical staining for major histocompatibility complex class II (MHCII) was performed.
  • CMHII is a major marker of antigen-presenting cells (APCs), in particular dendritic cells (DCs), B lymphocytes and macrophages.
  • APCs antigen-presenting cells
  • DCs dendritic cells
  • B lymphocytes B lymphocytes
  • macrophages The infiltration rate of CMHII+ cells in the mucosa increased significantly 30 minutes after administration of the native membrane (Fig. 3B-C) and returned to the control level after 60 minutes.
  • the HCl-treated membranes applied for 30 min did not induce CMHII+ cell infiltration, with the infiltration remaining similar to the control, as observed for mucosal swelling (Fig. 3A).
  • Mucoadhesion of the patches was assessed in vivo by visualization of the membrane resting on the sublingual mucosa 20 min after administration (Fig. 6A).
  • Monitoring of Ah647 OVA by molecular fluorescence tomography demonstrated the rapid dispersal of the protein after administration as a liquid formulation (Fig. 6B).
  • OVA Ah647 was already distributed along the digestive tract and no signal was detectable in the mouth after 10 min.
  • OVA Ah647 was detected as a concentrated signal in the mouth for at least 30 min.
  • a chemoattractant cytokine (CCL20) was loaded into the assembly and sampled after membrane degradation in artificial saliva.
  • the cytokine CCL20 was used as a chemoattractant for murine dendritic cells (DC 2.4) which possess the associated CCR6 receptor (data not shown).
  • DC 2.4 murine dendritic cells
  • the chemoattractant capacities of the cytokine were preserved inside the patch as a similar migration was observed for CCL20 in solution and CCL20 collected after patch dissolution (Fig 8). The bioactivity of the protein was therefore preserved by the patch and the cytokine exhibited a significant chemoattractant effect on the targeted cells.
  • Example 2 Evaluation of the rate of incorporation in patches (CHIZHyA)100
  • the membranes (CHI/HyA)100 were cut in such a way as to obtain squares of icm 2 which were incubated either in an HCl buffer solution of pH 3, or in an NaCl buffer solution of pH 6.5, both containing bovine serum albumin (BSA) concentrated at 10mg.mL′ 1 .
  • the squares of membranes (CHI/HyA)100 being entirely covered with a volume of liquid of the order of 200 pl, they each contain at equilibrium approximately 2 mg of absorbed BSA.
  • CHI/HyA100 loaded with BSA were then incubated in a release buffer (acetate buffer, pH 5.5) devoid of BSA in order to measure the quantity of proteins released, and this by using an assay kit of protein based on bicinchoninic acid (BCA) over a period of 4 hours.
  • Optical density measurements (562nm) were thus carried out by taking the release buffer from the start (tO) and after 5, 10, 20, 30, 60, 120 and 240 min of incubation, the release buffer being replaced after each sample. The measurement of a blank obtained with wells containing only the incubation solution was systematically subtracted.
  • the protein concentration per mL could be determined for each release time, then related to a quantity of BSA for 200 ⁇ l. Finally, the quantity of proteins incorporated within the membrane was estimated by subtracting the quantity of BSA determined for 200 ⁇ l from the theoretical 2 mg of BSA initially absorbed.
  • the quantity of BSA incorporated per cm 2 in membranes (CHI/HyA)100 was determined using the assay of the BSA released from membranes pre-incubated in a concentrated solution of BSA at different pHs. Very similar release profiles were observed between BSA incorporated at pH 3 and BSA incorporated at pH 6.5, with respectively 0.79mg and 0.75mg released instantaneously (tO), 0.18mg and 0.16mg additional released after 5 minutes, and again 0.03mg and 0.01mg released after 10 minutes. After 20 minutes of release, the BSA released between times t10 and t20 was no longer detectable, indicating that most of the release occurs within 10 minutes.
  • the total measured quantity of BSA released corresponds to 1.01 mg for the BSA incorporated at pH 3 and to 0.92 mg for the BSA incorporated at pH 6.5. Consequently, the squares of membrane (CHI/HyA)100 having initially absorbed approximately 2mg of BSA retain Img of BSA after 4 hours of rinsing, i.e. approximately 0.99mg of BSA retained for the incorporation carried out at pH 3 and approximately 1.08mg of for the incorporation carried out at pH 6.5. The incorporation rate is therefore 50% under both conditions. 2. Incorporation of immunoglobulins (IgG) into membranes (CHI/HyA)100
  • Membranes (CHI/HyA)100 were cut out so as to obtain 1cm 2 squares which were incubated for Ih either in 200pl of an HCl equilibration solution of pH 3 (MbA samples) or in 200pl an NaCl-Hepes equilibration solution of pH 6.5 (MbB samples).
  • the squares of MbA membrane were then incubated in 150 ⁇ l of an HCl-based incorporation solution of pH 3 containing 2 ⁇ g.mL' 1 of type G immunoglobulin (IgG; donkey secondary antibodies directed against IgG goat and coupled to the fluorochrome Alexa 633; Invitrogen, Molecular probes A21082-lot 73A2-1), and the squares of MbB membrane were incubated in 150 ⁇ l of an incorporation solution based on NaCl-Hepes of pH 6.5 also containing 2 pg.mL' 1 IgG.
  • IgG type G immunoglobulin

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Abstract

La présente invention porte sur un patch mucoadhésif destiné à la libération buccale ou sublinguale d'une protéine ou d'un polypeptide, ledit patch comprenant au moins 100 bicouches composées chacune d'une couche de chitosan (CHI) et d'une couche d'un polysaccharide anionique. L'invention porte également sur un procédé de fabrication d'un tel patch.

Description

SYSTEMES DE LIBERATION DE PROTEINES PAR VOIE BUCCALE
L’invention concerne un système de libération, sous la forme d’un patch mucoadhésif, d’une protéine par voie buccale.
Arrière-plan technologique
L'administration orale de médicaments est la voie d'administration la plus largement utilisée. Cependant, la libération de protéines d’intérêt thérapeutique par cette voie est délicate car les protéines sont hautement sensibles à l’action des enzymes du tractus gastro-intestinal. La muqueuse buccale représente une voie d’administration alternative séduisante, car elle permet de contourner l'effet de premier passage, présente une faible activité enzymatique et une plage physiologique de pH, et est anatomiquement accessible et bien vascularisée. Un système de libération par voie buccale pourrait ainsi fournir soit une libération locale (muqueuse) soit une libération systémique (transmucosale) de la protéine.
Il existe toujours un besoin non satisfait d’un système mucoadhésif présentant des capacités de perméation optimisées, qui contribuerait à une réduction significative de la dose thérapeutique administrée ainsi qu'à un meilleur contrôle de l’absorption.
Résumé de l’invention
Pour répondre à ce besoin, les inventeurs ont développé un patch mucoadhésif composé d'une combinaison de deux polysaccharides : un chitosan (CHI), et un polysaccharide anionique, tel que l’acide hyaluronique (HyA).
Le patch de l’invention, qui adhère à la muqueuse buccale ou sublinguale, est un patch dit « buccal » ou «sublingual ».
L’invention fournit ainsi un patch mucoadhésif destiné à la libération buccale ou sublinguale d’une protéine ou d’un polypeptide, ledit patch comprenant au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un de ses sels, la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual du patch étant composées de chitosan (CHI), ladite protéine ou ledit polypeptide étant incorporé dans ledit patch et/ou adsorbé à la surface dudit patch.
Dans un mode de réalisation préféré, l’invention fournit un patch mucoadhésif, buccal ou sublingual, comprenant une protéine ou un polypeptide, ledit patch comprenant entre 100 et 200 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un de ses sels, ledit polysaccharide anionique étant de l’acide hyaluronique, la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual du patch étant composées de chitosan (CHI), ladite protéine ou ledit polypeptide étant incorporé dans ledit patch et/ou adsorbé à la surface dudit patch, et destiné être libéré par voie buccale ou sublinguale.
Le patch est autoportant et se dissout dans la salive en raison de la présence d’enzymes capables de dégrader les deux polysaccharides.
Un autre objet de l’invention est un procédé de fabrication d’un tel patch, comprenant les étapes consistant à : i) former une membrane multicouches CHI/polysaccharide anionique au moyen d’un procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat ; ii) détacher la membrane multicouches du substrat ; iii) mettre au contact la membrane multicouches avec une protéine, par ce en quoi la membrane multicouches se charge en protéine.
Un autre objet de l’invention porte sur un patch selon l’invention susceptible d’être obtenu par un procédé tel que décrit ici.
Fig. 1 : Epaisseur et profils de dégradation des membranes autoportantes (CHI/HyA)ioo. (A) Epaisseur des membranes en fonction des variations du poids moléculaire de HyA (660 ou 1020 kDa, correspondant respectivement à HyA.LW et HyA.HW) ou de temps de dépôt : Cycles Courts ou Cycles Long. La signification statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l'aide d'un test ANOVA à un facteur contrôlé : ns, non-significatif ; **** p < 0,0001. (B) Profils de dégradation des membranes immergées dans de la salive artificielle, exprimés en pourcentage de perte de masse en fonction des différents paramètres de production des membranes. (C) Images en microscopie électronique à balayage (MEB) de membranes (CHI/HyAô6o)-CHI cycles courts, immergées dans la salive artificielle durant 30 min, Ih ou 3h. Barre d’échelle correspondant à 44 pm. (D) Images de membranes (CHIFITC/HyA66o)-CHIFITC cycles courts obtenues par microscopie confocale après 30 min, 3h, 6h ou 24h dans la salive artificielle. La condition contrôle correspond à l’immersion de la membrane dans un tampon acétate durant 24h. a, b, c, d, e : surface de la membrane ; sections inférieures : images de coupe de profondeur (z-section) des mêmes membranes. Barre d’échelle horizontale correspondant à 50 pm..
Fig. 2 : Les produits de dégradation des membranes ne montrent aucune toxicité pour les cellules épithéliales humaines. Viabilité cellulaire après incubation de cellules (A) HeLa et (B) Ho-lu-1 avec des produits de dégradation durant 24h. Membrane : membranes (CHI/HyA)ioo ; Membrane. HCl: membranes (CHI/HyA)ioo traitées à l’acide chlorhydrique (HCl). La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif.
Fig. 3 : Inflammation contrôlée de la muqueuse sublinguale par un traitement à l’HCl des membranes. L’épaisseur de muqueuse (A) et le recrutement des cellules CMHII positives (CMHII+) (B) ont été évalués dans la muqueuse entière (épithélium et lamina propria) après l’application d’une membrane ou de l-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB). Les membranes natives (Patch) ont été administrées durant 30 min ou 60 min et les membranes traitées par HCl (Patch HCl) ou NaCl (Patch NaCl) ont été appliquées durant 30 min. Chaque valeur fournie correspond à la moyenne d’au moins 3 mesures provenant de 3 individus indépendants (N=3). La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif ; p < 0,05. (C) Images représentatives du recrutement de cellules CMHII+ au niveau de la muqueuse, obtenues par marquage histologique. Barre d’échelle : 170 pm. (D/E/F) Niveaux de cytokines inflammatoires dans la langue et les tissus sublinguaux mesurés 6h après l’administration de membranes aux souris : IL-ip (D), IL-6 (E) and TNF-a (F). La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif ; p < 0,05, *** p < 0,001, ****, p < 0,0001.
Fig. 4 : Représentation schématique de l’incorporation de protéines par variation de pH dans un assemblage couche par couche (LbL). Après fonctionnalisation par piégeage des protéines, la membrane LbL devient un patch bioactif, prêt à être appliqué. CHI : chitosan, HyA : acide hyaluronique.
Fig. 5 : Incorporation et profils de libération depuis la membrane de l’ovalbumine marquée avec Alexa Fluor 647 (OVAAlexa F-647). (A) Niveaux d’incorporation d’OVAAlexaF 647 dans le patch (CHI/HyA)ioo-CHI après une incubation avec 0,5 pg de protéines dans de l’HCl et rinçage avec différents tampons. (B) Profils de libération de 0VAAlexaF 647 depuis le patch sur une durée de rinçage de 2h avec différentes solutions. Les données correspondent à la moyenne avec erreur type (± SEM) de triplicats provenant de trois expériences indépendantes (N=3). (C, partie supérieure) Image de microscopie confocale de la surface du patch contenant l’0VAAlexa F 647, barre d’échelle correspondant à 50 pm. (C, partie inférieure) Coupe optique du patch en profondeur, suivant l’axe (z). Les lignes pointillées représentent les limites du patch. (D) Intensité de fluorescence de l’0VAAlexa 17647 et du patch (CHI.MW FITC) le long de la flèche représentée en (C, partie inférieure).
Fig. 6 : Temps de rétention du patch sur la muqueuse sublinguale. (A) Coloration du patch (CHI/HyA)ioo à l’hématoxyline mis en contact avec la muqueuse sublinguale, 20 minutes après l’administration du patch. Barre d’échelle correspondant à 100 pm. M = muqueuse, P = Patch (B) Tomographie de fluorescence moléculaire de l’OVAAF647 en solution ou incorporée dans le patch (CHI/HyA)ioo. Le signal de fluorescence a été détecté 2, 10, ou 30 min après administration.
Fig. 7 : Pénétration tissulaire de l’OVAAF647 après l’administration du patch. Microscopie confocale de coupes de langues de souris avec un marquage nucléaire des cellules au DAPI, 2 min après administration de l’OVAAF647 en solution ou 2 min, 10 min, 30 min et 60 min après administration de l’OVAAF647 incorporée dans le patch (CHI/HyA)ioo. L’OVAAF647 a été observée dans les couches kératinisées 10 min après administration (flèches blanches) et dans la sous-muqueuse 30 min après administration (flèche pointillée). Barre d’échelle : 20 pm. Lignes pointillées correspondant à la limite de la muqueuse.
Fig. 8 : Les capacités de chimio-attraction de la cytokine CCL20 sont préservées dans le patch. Chimiotaxie in vitro de CCL20 libérée depuis le patch comparé à CCL20 en solution. Une concentration de 25 ng.mL'1 a été utilisée pour évaluer la migration des cellules DC 2.4. Du milieu de croissance, des enzymes salivaires seuls et des membranes (CHI/HyA)ioo ont été utilisés pour les contrôles négatifs. La significativité statistique des différences entre deux groupes a été déterminée en utilisant un test ANO VA à un facteur contrôlé : ns, non significatif ; *, p < 0,05, ** p < 0,01.
Fig. 9 : Epaisseur et profils de dégradation des membranes autoportantes (CHI/HyA)ioo-
CHI or (VIS/HyA)ioo-VIS. (A) Epaisseur des membranes selon le nombre de bicouches : 50, 100, ou 200 bicouches avec une dernière couche d’HyA. Epaisseur des membranes faites de 100 bicouches avec une dernière couche produite avec du CHI provenant de Sigma ou avec du Viscosan® (VIS) provenant de Flexichem. Chaque type de membrane a été mesuré au moins 20 fois. La significativité statistique entre deux groupes a été déterminée à l’aide d’un test ANOVA à un seul facteur contrôlé : ns, non significatif, ****, p < 0,0001. (B) Profil de dégradation des membranes immergées dans de la salive artificielle exprimée en pourcentage de perte de poids en fonction des différents types de membranes faites de CHI ou de VIS. Chaque valeur fournie correspond à la moyenne de triplicats provenant de trois expériences indépendantes (N=3).
Fig. 10 : Incorporation et profils de libération de l’OVA647 depuis la membrane. (A) Niveaux d’incorporation d’OVAAh647 dans le patch (CHI/HyA)ioo-CHI après incubation avec 0,5 pg de protéines dans du NaCl et rinçage avec différents tampons. (B) Profils de libération de l’OVAAH647 depuis le patch sur une durée de rinçage de 2h avec différentes solutions. Les données correspondent à la moyenne de triplicats provenant de trois expériences indépendantes. (C, partie supérieure) Image de microscopie confocale de la surface du patch contenant l’OVAAH647, barre d’échelle correspondant à 50 pm. (C, partie inférieure) Coupe optique du patch en profondeur, suivant l’axe (z). Les lignes pointillées représentent les limites du patch. (D) Intensité de fluorescence de l’OVAAh647 et du patch (CHIFITC) le long de la flèche représentée en Figure C (partie inférieure).
Fig. H : Schéma illustrant l’emprisonnement de la protéine ou polypeptide par gonflement ou resserrage de la membrane multicouches.
Description détaillée de l’invention
Tel qu’illustré, dans les exemples ci-après, les inventeurs ont développé un patch mucoadhésif pour la libération buccale ou sublinguale d’une protéine assurant un meilleur contrôle de la dose de protéine administrée et de son absorption par les muqueuses. Les inventeurs ont également mis en avant le caractère non toxique d’un tel patch et l’absence d’inflammation des muqueuses après l’application d’un tel patch.
La présente invention porte donc sur un patch mucoadhésif destiné à la libération buccale ou sublinguale d’une protéine ou d’un polypeptide, ledit patch comprenant au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un de ses sels, la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual du patch étant composées de chitosan (CHI), ladite protéine ou ledit polypeptide étant incorporé dans ledit patch et/ou adsorbé à la surface dudit patch.
Définitions
Par « patch », on entend un système adhésif multicouches ou une membrane adhésive multicouches comprenant un composé biologiquement actif, tel qu’une protéine ou un polypeptide.
Par « mucoadhésif », on entend un patch tel que défini dans la présente demande pouvant se coller à une muqueuse, de préférence une muqueuse buccale ou sublinguale.
Par « autoportant », on entend une structure dénuée de support dont la rigidité permet à elle- seule sa stabilité.
Le terme « sujet » signifie toutes personnes humaines ou animaux, de préférence mammifères, tels que des équidés, ovidés, bovidés, les chiens, les chats etc.
Protéines et polypeptides
Le patch selon l’invention permet la libération de toute protéine ou polypeptide d’intérêt. Par « protéine », on entend typiquement un polypeptide d’au moins 100 acides aminés, ou des polypeptides associés entre eux. Les protéines peuvent de préférence avoir un poids moléculaire compris entre 20 et 200 kDa. Plus spécifiquement, les protéines peuvent avoir un poids moléculaire inférieur à 70 kDa, ou un poids moléculaire plus élevé, par exemple de 100 à 200kDa.
Parmi les protéines d’intérêt, on peut citer par exemple des anticorps (tels que des immunoglobulines G).
Les polypeptides, qui peuvent être des fragments de protéines, ont typiquement de 10 à 100 acides aminés, de préférence encore de 20 à 80 ou 20 à 60 acides aminés.
Dans un mode de réalisation préféré, la protéine ou le polypeptide est un allergène.
Les allergènes comme définis dans la présente invention comprennent des antigènes capables de stimuler une réaction allergique chez un sujet. Les allergènes peuvent être contenus ou être dérivés d’aliments tels que le lait, les œufs, le sésame, le blé, le soja, le poisson, les fruits de mer, les cacahuètes, les noix. Les allergènes peuvent être également contenus ou être dérivés de produits non-alimentaires tels que les acariens, le pollen, les piqûres d’insectes, la fourrure d’animaux, la laine, les médicaments, etc. Les allergènes sont de préférence des polypeptides ou protéines formant tout ou partie d’un antigène capable d’être reconnu par une cellule du système immunitaire, et vis-à-vis duquel on cherche à induire une tolérance à l’allergène.
Dans un exemple de réalisation préféré, la protéine à délivrer est l’ovalbumine. On peut encore citer, parmi les allergènes alimentaires préférés, la bétalactoglobuline, l'alphalactabumine, les caséines.
Un objet de l’invention vise ainsi un allergène pour une utilisation dans la désensibilisation d’un sujet allergique audit allergène, ledit allergène étant administré sous la forme d’un patch tel que décrit ici. La désensibilisation du sujet, appelé également immunothérapie des allergies, permet au sujet de devenir tolérant à un allergène particulier à long terme.
Patch multicouches
Le patch selon l’invention comprend au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un des sels, où la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual sont composées de chitosan (CHI).
Le patch selon l’invention est formé d’une membrane adhésive multicouches comprenant au moins 100 bicouches composées chacune dudit chitosan et dudit polysaccharide anionique où les deux couches situées aux deux extrémités ou à la périphérie de cette membrane sont composées de chitosan (CHI).
Selon un mode particulier de l’invention, le patch comprend de 100 à 200 bicouches CHI/polysaccharide anionique. Selon un mode préféré, le patch comprend 100 ou 200 bicouches CHI/poly saccharide anionique, et de manière encore plus préférée 100 bicouches CHI/polysaccharide anionique.
Selon un autre mode particulier de l’invention, le patch a une épaisseur de 10 à 20 pm, de préférence de 11 à 19 pm, 12 à 18 pm, 13 à 17 pm, 14 à 16 pm, et de manière encore plus préférée d’environ 15 pm.
Le chitosan est un polyoside composé de la distribution aléatoire de D-glucosamine liée en 13- (1-4) (unité désacétylée) et de N-acétyl-D-glucosamine (unité acétylée). Il est produit par désacétylation chimique (en milieu alcalin) ou enzymatique de la chitine, qui est le composant de l'exosquelette des arthropodes (crustacés) ou de l'endosquelette des céphalopodes (calmars...) ou encore de la paroi des champignons. Cette matière première est typiquement déminéralisée par traitement à l'acide chlorhydrique, puis déprotéinée en présence de soude ou de potasse et enfin décolorée grâce à un agent oxydant. Le degré d'acétylation (DA) est le pourcentage d'unités acétylées par rapport au nombre d'unités totales, il peut être déterminé par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IR-TF) ou par un titrage par une base forte. De préférence, le chitosan choisi dans l’invention présente un degré de déacétylation (DD) supérieur ou égal à 75%, de préférence supérieur ou égal à 78%. Le chitosan présente l’avantage d’être un des seuls polysaccharides cationiques naturels facilement utilisable disposant en outre de bonnes propriétés adhésives.
Les polysaccharides anioniques sont des polymères de la famille des glucides constitués de plusieurs oses liés entre eux par des liaisons osidiques. Selon l’invention, le polysaccharide ou un de ses sels a un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa. Parmi les polysaccharides anioniques, on peut citer par exemple les glycosaminoglycanes (GAGs), le fucoïdane, les alginates, les carraghénanes, et les ulvanes.
Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont polymères saccharidiques linéaires à longue chaîne présents pratiquement dans tous les tissus. L’unité de base des GAGs est un disaccharide, constitué d’un hexose (acide hexuronique en général) lié à une hexosamine. Une des caractéristiques de ces chaînes oligosaccharides est leur très grande hétérogénéité. En effet, la longueur variable des chaînes et leurs modifications structurales (sulfatations, épimérisations) conduit à un nombre de combinaisons indénombrable. Selon la nature des oses et la manière dont les disaccharides sont reliés entre eux, les GAGs sont classés en 5 grandes familles : les héparines (Hp) et les héparanes sulfates (HS), l’acide hyaluronique (AH), les chondroïtines sulfates (CS), les dermatanes sulfates et les kératanes sulfates.
Le fucoïdane est un polysaccharide ayant pour sucre de base le fucose. Il tient son nom des algues de type fucus (algues brunes) où il est retrouvé.
Les alginates sont des polysaccharides obtenus à partir d’algues brunes. Les alginates sont des polymères formés de deux monomères liés ensemble par une liaison P-l-4, à savoir l’acide mannuronique et l’acide guluronique.
Les carraghénanes sont des polysaccharides (galactane) extraits d’algues rouges. Trois grandes catégories sont commercialisées aujourd’hui le K-carraghénane, le r-carraghénane, et le À- carraghénane qui se différencient par le nombre et la position des groupements sulfates, ainsi que par le nombre de ponts 3,6-anhydrogalactose.
Les ulvanes sont des polysaccharides anioniques sulfatés extraits d’algues vertes de type ulve. Ils sont composés de 3-sulfate ulvanobiuronate de sodium de type A comprenant du 3-sulfate rhamnose lié à de l'acide glucuronique par une liaison de type 1-4 et de 3-sulfate ulvanobiuronate de sodium de type B comprenant du 3 -sulfate rhamnose lié à de l'acide iduronique par une liaison de type 1-4.
Selon un mode particulier de l’invention, le polysaccharide anionique ou un de ses sels est choisi parmi un glycosaminoglycane (GAG), un fucoïdane, un alginate, un carraghénane, et un ulvane. Plus spécifiquement, le glycosaminoglycane (GAG) ou un de ses sels est choisi parmi l’acide hyaluronique (AH), l’héparine (Hp), les héparanes sulfates (Hs), les chondroïtines sulfates (CS), les dermatanes sulfates (DS), et les kératanes sulfates (KS), préférentiellement l’acide hyaluronique, et de manière encore plus préférée le hyaluronate de sodium.
De préférence, le polysaccharide anionique tel que défini ci-dessus est hydrolysable par les enzymes salivaires.
Fabrication du patch mucoadhésif
Le patch mucoadhésif selon la présente invention peut être produit par un assemblage de couches chargées positivement (chitosan) et négativement (polysaccharide anionique) via un procédé de trempage automatisé. Un tel procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer » LbL) est bien connu de l’homme du métier et est notamment mis en œuvre dans la demande internationale WO 2005/052035 pour préparer des films multicouches de polyélectrolytes réticulés.
La membrane multicouches ainsi formée est ensuite mise en contact avec une protéine ou un polypeptide pour fournir un patch mucoadhésif chargé en protéine ou polypeptide.
Un objet de l’invention porte donc sur un procédé de fabrication d’un patch tel que décrit dans la présente demande, comprenant les étapes consistant à : i) former une membrane multicouches CH/polysaccharide anionique au moyen d’un procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat ; ii) détacher la membrane multicouches du substrat ; iii) mettre au contact la membrane multicouches avec une protéine ou un polypeptide, par ce en quoi la membrane multicouches se charge en protéine ou polypeptide.
L’étape i) du procédé consistant à former une membrane multicouches CH/polysaccharide anionique est produite par la mise en œuvre d’une technologie couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat. Cette technologie automatisée utilise un robot de trempage, par exemple le robot DR-3 de la société Riegler & Kirstein GmbH. Plus spécifiquement, les solutions de chitosan et du polysaccharide anionique (polyélectrolytes) sont préparées dans une solution tampon, telle qu’une solution tampon d’acétate de sodium. Le pH de la solution peut être ajusté à environ 5,5 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH) et de l’acide acétique (CH3COOH). Par ailleurs, le substrat utilisé comme support dans le robot de trempage est préparé sur un ruban adhésif. Un substrat couramment utilisé est le polypropylène. Le substrat est ensuite immergé de manière séquentielle dans la solution de chitosan et du polysaccharide anionique avec au moins une étape de lavage, de préférence deux étapes de lavage dans une solution tampon d’acétate de sodium, d’eau ou de solution saline tamponnée entre pH 5 et 6, de préférence d’acétate de sodium. Le cycle comprenant l’immersion du substrat dans une solution de chitosan, au moins une étape de lavage, , de préférence une seule étape de lavage, suivie de l’immersion dans une solution de polysaccharide anionique et d’au moins une étape de lavage, de préférence une seule étape de lavage, permet la formation d’une bicouche CHI/polysaccharide anionique. Ce cycle est répété autant de fois que nécessaire pour obtenir un nombre de bicouche souhaité. Les temps d’immersion et de lavage peuvent varier. Selon un mode particulier, le temps d’immersion du substrat dans les solutions de polyélectrolytes (CHI et polysaccharide anionique) a une durée comprise entre 2 et 10 minutes, de préférence entre 2 et 8 minutes, et plus avantageusement 3 minutes (Cycle court, CC) ou 6 minutes (Cycle long, CL). Selon un autre mode particulier, le temps de lavage a une durée comprise entre 1 et 10 minutes, de préférence entre 2 et 4 minutes, et plus avantageusement 2 minutes (Cycle court, CC) ou 4 minutes (Cycle long, CL).
L’étape ii) du procédé consistant à détacher la membrane multicouches du substrat, en particulier du polystyrène, peut être mise en œuvre avec une étape optionnelle préalable de séchage. La membrane multicouches obtenue peut être ensuite découpée selon la taille désirée.
La mise en œuvre de l’étape iii) du procédé permet de charger la multicouches en protéine ou polypeptide. Plus précisément, le chargement de la protéine ou polypeptide dans la membrane multicouches est obtenu par diffusion passive. Particulièrement, l’étape iii) est mise en œuvre en solubilisant la protéine ou le polypeptide dans une solution tampon adaptée de manière à éviter la dénaturation de la protéine. Selon un mode particulier, la membrane multicouches est mise en contact avec une protéine ou polypeptide dans une solution acide, de préférence d’acide chlorhydrique (HCl), à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3. Selon un autre mode particulier, la membrane multicouches est mise en contact avec une protéine ou polypeptide dans une solution saline, de préférence une solution de chlorure de sodium (NaCl) ou une solution de chlorure de potassium (KC1), à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5.
De préférence, la mise en contact de la membrane multicouches avec une protéine ou un polypeptide est mise en œuvre en déposant au moins une goutte de la solution tampon comprenant la protéine ou le polypeptide sur la surface de la membrane multicouches. La membrane est ensuite optionnellement séchée pour fournir un patch mucoadhésif dans lequel la protéine ou le polypeptide est incorporé dans le patch et/ou adsorbé à la surface du patch.
De préférence, et en particulier dans le cas où la protéine ou le polypeptide reste au moins partiellement adsorbé à la surface, le patch ainsi formé est polarisé, en ce que la concentration en protéine ou polypeptide est supérieure au niveau des couches supérieures où la protéine ou le polypeptide a été déposé, par rapport à la concentration au niveau des couches inférieures.
Le procédé peut également comprendre une étape optionnelle d’équilibrage de la membrane multicouches avant sa mise en contact avec la protéine ou le polypeptide (étape désignée iii-0). Cette étape d’équilibrage consiste à tremper la membrane multicouches obtenue après l’étape ii) dans une solution acide, de préférence d’acide chlorhydrique (HCl) à un pH compris entre 2 et 4 ou une solution saline, de préférence de chlorure de sodium (NaCl), à un pH compris entre 5 et 7. Cette étape optionnelle d’équilibrage de la membrane multicouches à pH acide permet notamment de gonfler la membrane et de faciliter ainsi le chargement en protéine ou en polypeptide. La membrane multicouches chargée en protéine ou en polypeptide peut éventuellement se resserrer lorsqu’elle est trempée dans une solution tampon permettant alors l’emprisonnement de la protéine ou du polypeptide dans le patch.
Selon un mode particulier, le procédé de l’invention comprend donc outre une étape intermédiaire consistant à équilibrer la membrane multicouches détachée selon l’étape ii) avec une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3 ou de chlorure de sodium (NaCl) à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5, avant la mise en œuvre de l’étape iii).
Un procédé de fabrication préféré de l’invention comprend les étapes consistant à : i) former une membrane multicouches CH/polysaccharide anionique au moyen d’un procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat ; ii) détacher la membrane multicouches du substrat ; iii-0) équilibrer la membrane multicouches détachée selon l’étape ii) avec une solution acide, de préférence d’acide chlorhydrique (HCl), à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3 ou avec une solution saline, de préférence de chlorure de sodium (NaCl) à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5, avant la mise en œuvre de l’étape iii). iii) mettre au contact la membrane multicouches avec une protéine ou un polypeptide, par ce en quoi la membrane multicouches se charge en protéine ou polypeptide.
Chargement du patch
La protéine ou polypeptide peut être incorporé dans le patch ou adsorbé à sa surface, comme décrit ci-dessus.
Typiquement, les protéines ou polypeptides de poids moléculaire inférieur à 70 kDa ou 80kDa sont de préférence entièrement ou pratiquement entièrement incorporées, c’est-à-dire de préférence avec au moins 90% de protéines incorporées, dans le patch. Une protéine ou un polypeptide de poids moléculaire plus élevé peut être, en tout ou partie, adsorbée à la surface du patch.
La quantité de protéine ou polypeptide incorporée et/ou adsorbée dépend de la protéine ou polypeptide et de l’effet biologique ou pharmacologique souhaité. Cette quantité peut varier par exemple de 50 ng/cm2 à 5 mg/cm2, de préférence de 10 ng/cm2 à 1 mg/cm2, 1 pg/cm2 à 1 mg/cm2
Applications
Le patch ainsi obtenu peut être conservé à 4°C ou à température ambiante, avant application. Typiquement le patch mesure 2-3 cm2 pour une application chez un sujet humain. Le patch peut être appliqué par exemple à l’intérieur des joues, sur le palais, la gencive ou sous la langue. Une application sublinguale (c’est-à-dire sur la face ventrale de la langue) est particulièrement avantageuse. De préférence, le patch est appliqué de telle sorte que la couche de chitosan sur laquelle la protéine ou le polypeptide a été déposé lors de la fabrication du patch, est la couche qui est mise en contact avec la muqueuse.
Les figures et exemples illustrent l’invention sans en limiter la portée.
Exemple 1 : Fabrication et tests d’un patch mucoadhésif
1. Matériel et méthodes
1.1 Matériel Le chitosan (CHI) de poids moléculaire moyen a été acheté chez Sigma-Aldrich. Avant son utilisation, le CHI a été purifié par des étapes de filtration et de précipitation dans l’eau et l’éthanol, suivi par une lyophilisation pour obtenir un poids moléculaire final de 770kDa et un degré de désacétylation (DD) de 78%. A pH faible (<6,5), le CHI est un polyélectrolyte chargé positivement. Il a été comparé à un autre polysaccharide, le Viscosan® (VIS), provenant de Flexichem et qui présente une répartition distincte des groupements N-acétylés. Les deux types de hyaluronate de sodium (HyA), de 610 kDa (HyAuw) et 1020 kDa (HyAuw), ont été achetés chez HTL, France et utilisés tels que reçus. Tous les autres réactifs et solvants ont été utilisés sans purification.
Pour toutes les expériences, les solutions de polyélectrolytes ont été préparées extemporanément par dissolution dans un tampon d’acétate de sodium (0,1 M CH3COOH; 0,15 M NaCl, pH 5,5, à température ambiante) en utilisant des concentrations en polymère de 1 mg/mL pour la production des membranes.
1.2 Chitosan Fluorescent
20 mL de chitosan de poids moyen (CHI, 770 kDa, 10 mg.mL'1 dans de l’acide acétique 0,1 mol.L'1) ont été mis en contact pour réagir avec 20 mL de fluorescéinisothiocyanate (FITC, 1 mg.mL'1 dans du méthanol déshydraté), durant 3h à température ambiante et à l’abri de la lumière. Le pH a ensuite été augmenté jusqu’à 10 pour précipiter le CHI, suivi de centrifugations de 15 minutes à 11000 g et de plusieurs lavages à l’eau jusqu’à ce qu’aucune fluorescence ne soit détectée dans le surnageant. Le CHI a ensuite été dissous dans 20 mL d’acide acétique 0,1 mol.L'1 et le reste de FITC non lié a été éliminé par dialyse (Spectrum, USA) effectuée dans de l’eau pendant 3 jours à l’obscurité, l’eau étant remplacée quotidiennement. Les quantités de CHI et de FITC ont été déterminées par spectrophotoscopie à 490 nm et 270 nm respectivement. Le CHI de poids moyen marqué à la Fluorescéine (CHIF1TC) a été aliquoté à 2 mg.mL'1 dans de l’acide acétique 0,1 mol.L'1 et conservé à -20°C.
1.3 Fabrication des membranes CHI/HyA
Les membranes autoportantes (CHI/HyA) ont été produites en employant la méthodologie couche par couche (LbL) à l’aide d’un robot de trempage (DR-3, Riegler & Kirstein GmbH). Les membranes ont été fabriquées en utilisant des substrats de polystyrène nettoyés par sonication dans l’éthanol et l’eau distillée (5 minutes pour chaque solution). Les substrats ont été immergés séquentiellement dans du CHI ou du Viscosan® et dans des solutions de HyA (HyArw de 610 kDa ou HyAuw de 1020 kDa) concentrés à 0,2% (poids/volume) dans un tampon d’acétate de sodium (CH3COONa 0,2 M, CH3COOH 0,2 M, pH 5,5, à température ambiante), avec 1 étape de lavage utilisant un tampon d’acétate de sodium entre chaque dépôt dans une solution de polymères. Ces immersions ont été répétées 100 fois avec un temps de dépôt de 3 minutes pour les polymères d’origine naturelle et 2 minutes pour chaque étape de lavage. Ensuite les membranes ont été laissées à sécher à température ambiante. Enfin, les membranes ont été détachées facilement de leur substrat sous-jacent respectif, simplement en les décollant à l'aide d'une pincette. Les membranes fluorescentes (CHIFITC/HyA)ioo-CHIFITC) ont été préparées tel que décrit précédemment, avec 0,5% de CHIFITC dans la solution de chitosan à 2mg.mL'1 dans un tampon d’acétate de sodium de pH 5,5, à l’abris de la lumière.
1.4 Epaisseur des membranes LbL
L’épaisseur des membranes produites a été mesurée après séchage et détachement du substrat. L’épaisseur de membrane a été déterminée en utilisant un micromètre (High- Accuracy Digimatic Micrometer, Mitutoyo) ; 20 mesures ont été réalisées à différents endroits au niveau du centre des membranes.
1.5 Salive artificielle et études de dégradation enzymatique
Des membranes de 1cm2 ont été pesées avant expérience. Une salive artificielle a été préparée avec de l’a-amylase, de 1’ hyaluronidase et du lysozyme, dissous dans un tampon (0,15 MNaCl, 20mM HEPES, pH 6,5). Toutes les enzymes ont une concentration finale de 100 pg.mL'1. Les échantillons ont été trempés dans la salive artificielle et incubés à 37°C sous agitation lente durant 30min, Ih, 3h, 6h ou 24h. Après chaque période d’incubation, les membranes ont été séchées à 37°C et pesées. Le pourcentage de perte de masse (WL) des membranes selon les différentes conditions a été déterminé suivant TEquation 1, avec Wi représentant le poids sec initial de la membrane et Wf représentant le poids de la membrane sèche après chaque point prédéterminé dans le temps. Trois expériences indépendantes ont été réalisées en triplicat pour chaque condition et la valeur moyenne a été retenue comme pourcentage de perte de poids.
WL=(Wi-Wf)/Wi x 100 (Equation 1 )
Pour l’observation des membranes en microscopie confocale à balayage laser (MCBL), les membranes fluorescentes ont été immobilisées sur des lames de verres et incubées dans de la salive artificielle à 37°C sous agitation durant 30min, 3h, 6h ou 24h. La dégradation a été stoppée par rinçage avec un tampon acétate jusqu’à observation en MCBL avec un microscope confocal LSM710 (Carl Zeiss SAS, France). Toutes les images ont été analysées à l’aide des logiciels Carl Zeiss Zen et du logiciel Image J. 1.6 Microscopie électronique à balayage (MEB)
L’analyse morphologique des échantillons (avant et après dégradation) a été réalisée à l’aide d’un microscope électronique à balayage (Merlin Compact VP, Zeiss) à un voltage accéléré de 5 kV. Les deux côtés des membranes ont été observées. Avant observation, tous les échantillons ont été recouverts de cuivre (Balzers MED 010).
1.7 Tests de cytotoxicité
Des cellules Ho-lu-1 immortalisées (une lignée cellulaire humaine dérivée de cellules de carcinome squameux du plancher de la bouche, provenant du GIMAP, St Etienne, France) ont été cultivées dans un milieu Dulbecco’ s Eagle’s medium (DMEM) avec du D-glucose (4,5 g.L- 1), du pyruvate (1 mmol.L-1) et de la L-glutamine (2 mmol.L-1), un cocktail de nutriments DMEM/Ham’s F12 (1 : 1) supplémenté avec 10% (volume/volume) de sérum de veau fœtal (FBS) inactivé par la chaleur et 1% (volume/volume) de pénicilline/streptomycine. Les cellules HeLa (lignée cellulaire épithéliale humaine dérivée d’adénocarcinome, ATCC® CCL-2) ont été cultivées dans du DMEM avec du D-glucose (4,5 g.L-1), du pyruvate (1 mmol.L-1) et de la L-glutamine (2 mmol.L-1) contenant 10% (volume/volume) de FBS inactivé par la chaleur et 1% (volume/volume) de pénicilline/streptomycine. Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2.
Deux jours avant les tests de cytotoxicité, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture 96 puits. En parallèle, les membranes (CHI/HyA)100-CHI ont été coupées pour être redimensionnées (3cm2 par mL de milieu), stérilisées dans l’éthanol 70% et par exposition à une lumière UV. Les membranes ont ensuite été incubées sur la nuit à 37°C dans un milieu de culture contenant des enzymes salivaires (lysozyme, a-amylase and hyaluronidase) à 100 pg.mL-1. Le milieu de culture a ensuite été retiré des puits et remplacé par le milieu contenant les produits de dégradation. Les cellules ont été incubées à 37°C durant 24h. Puis, du bromure de méthylthiazolyldiphényl-tétrazolium (MTT, 0,5 mg.mL-1) a été ajouté à chaque puits pour une incubation de 3h à 37°C. Les cellules ont ensuite été incubées sur la nuit, à 37°C et à l’abris de la lumière, dans une solution de solubilisation contenant 10% (volume/volume) de Triton X- 100 et de HCl (0,1 mol.L-1) dans de l’isopropanol anhydre. L’absorbance a été mesurée à 570 nm et 690 nm (i-control Infinite® M1000 Pro, Tecan, Suisse). Des contrôles positifs ont été réalisés avec 0,1% (volume/volume) de dodécyl sulfate de sodium (SDS) et des contrôles négatifs avec des cellules seules. Les données ont été retenues en faisant la moyenne de triplicats pour trois expériences indépendantes. 1.8 Souris
Des études in vivo ont été réalisées sur des souris CB6F1 femelles âgées de 6 à 8 semaines (Charles River Laboratories, France) et sur des souris SHK-1 mâles (Charles River Laboratories, France) pour des expériences de tomographie. Tous les animaux ont été maintenus dans des conditions exemptes de pathogènes. Toutes les études sur animaux ont été conduites en conformité avec les directives de l’Union Européenne et approuvées par les comités éthiques régionaux et nationaux.
1.9 Administration sublinguale de membranes ou solutions
Les membranes ont été coupées pour être ajustées à la taille des langues de souris (2 mm x 7 mm) et stérilisées par lumière UV. Les membranes ou formules liquides ont ensuite été administrées par voie sublinguale (partie ventrale de la langue) à des souris légèrement anesthésiées (isoflurane 4%). Après administration, une pression douce a été exercée durant 10s (jusqu’au réveil) sur la partie dorsale de la langue pour assurer le contact de la membrane ou de la solution liquide avec la muqueuse. Aucune autre contention n’a été réalisée. Après récupération de l’anesthésie, les animaux ont été laissés libres d’avaler ou de se toiletter. L’eau a été retirée durant les 30 min suivant l’administration et rendue pour des expériences plus longues.
1.10 Analyse histologique du gonflement des muqueuses et du recrutement des cellules CMHII positives
Des membranes natives, des membranes traitées à l’HCl ou des membranes traitées au NaCl ont été administrées durant 30 min ou 60 min. Un volume de 12.5 pl d’une solution de 1-fluoro- 2,4-dinitrobenzène (DNFB) à 0,5% a été utilisée comme contrôle positif pour l’inflammation. Le groupe contrôle négatif n’a été soumis à aucune manipulation. Chaque groupe était composé de 3 souris. Sur toute la durée du traitement, les souris étaient alertes et l’eau a été retirée durant les 30 premières minutes. A chaque point dans le temps, les langues ont été placées dans une matrice OCT® (Optimal Cutting Temperature, Tissue Tek) et conservées à -80°C jusqu’à la cryosection. Pour l’étape de cryosection, des tranches de 6pm d’épaisseur ont été réalisées à l’aide d’un cryostat (Leica) et fixées sur lames de verre avec de l’acétone à -20°C. Pour l’analyse du gonflement de la muqueuse, les tranches de langue ont été colorées à l’hématoxyline (formule de Gill, Vector) et les images ont été capturées en utilisant un microscope inversé (Nikon Ti-E). L’analyse du gonflement des muqueuses a été effectuée sur des longueurs de 2mm s’étendant depuis la base de la surface ventrale. Des mesures de surface ont été réalisées en utilisant l’outil polygone du logiciel Image J. Pour la coloration du CMHII, les tranches de langue ont été premièrement incubées avec un réactif bloquant la peroxydase (Dako), puis avec des anticorps de rat anti-souris biotinylés (BD pharmigen), révélés à l’aide du kit Vectastain Elite ABC (Vector) et le substrat de peroxydase AEC (Vector), et finalement contremarquées à l’hématoxyline (Formule de Gill, Vector). Les tranches ont été examinées à l’aide d’un microscope Nikon Ti-E. Le nombre de cellules CMHII positives (CMHII+) a été compté sur des longueurs de 2mm s’étendant depuis la base de la surface ventrale de la membrane sublinguale, en utilisant le plugin Cell Counter du logiciel Image J.
1.11. Préparation des échantillons pour la quantification des cytokines
Chaque groupe était composé de 3 souris. Deux groupes ont reçu des membranes natives ou des membranes traitées à l’HCl. Trois autres groupes de souris ont reçu par voie sublinguale lOpL de CHI (770 kDa, 2 mg.mL-1 dans un tampon acétate de pH 5,5, Sigma, USA), lOpL de HyA (610 kDa, 0,95 cm3.kg-l, 2 mg.mL-1, dans un tampon acétate de pH 5,5, HTL, France), ou lOpL d’une combinaison des deux polymères. Les groupes de souris contrôle ont reçu par voie sublinguale soit lOpL de PBS ou de tampon acétate de pH 5,5 pour les contrôles négatifs, soit 12,5pL de DNFB à 0,5% (volume/volume) dans du chloroforme pour les contrôles positifs. Les langues ont été excisées 6h après l’application des membranes ou des solutions, congelées dans de l’azote liquide et conservées à -80°C. Brièvement, les langues ont été incubées dans un tampon RIPA [Tris HCl (50 mmol.L-1), NaCl (150 mmol.L-1), Triton X-100 (1 %), désoxycholate de sodium (0,5 %), SDS (0,1 %) EDTA (1 mmol.L-1) et un cocktail inhibiteur de protéases (1 %, Thermo Scientific)] pendant 2h sur de la glace, après homogénéisation à l’aide de ciseaux. Les préparations ont ensuite été homogénéisées à l’aide d’un batteur à billes (2 x 5 min, 30 Hz, 4°C) (TissueLyser II, Qiagen, Allemagne) et une sonication (2 min, 60 Hz), suivi par une centrifugation de 10 min à 10 000 rpm et 4°C. La concentration protéique totale dans les surnageants a ensuite été déterminée en utilisant le kit BCA protein assay (ThermoFisher Scientific, USA). L’interleukine 1 beta (IL-ip), IL-6 et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a) ont été quantifiés simultanément dans chaque échantillon (V-Plex Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit, MSD, USA) par électroluminescence à l’aide du système Mesoscale Discovery (Meso QuickPlex SQ 120, MSD, USA). Les données ont été retenues en faisant la moyenne de duplicats avec trois souris pour chaque condition.
1.12 Incorporation de protéines par gonflement en fonction du pH Dans le but d’évaluer la capacité des membranes à incorporer des protéines à différentes valeurs de pH, les membranes ont été équilibrées avec 1 mM d’HCl (pH 3-3,5), une solution saline tamponnée au phosphate (PB S IX, Gibco® by life technologies™ pH7,4) ou avec un tampon de chlorure de sodium (NaCl 0,15 mol.L'1, HEPES 0,02 mol.L'1, pH 6,5) à température ambiante pendant Ih. Avant expérimentation, des membranes de 12 mm de diamètre ont été stérilisées par une exposition aux UV de 20 min. Après équilibrage de l’excès d’HCl, le PBS ou le tampon NaCl a été retiré et une goutte de protéine a été déposée sur le dessus de la membrane. La protéine utilisée était soit de l’ovalbumine marquée avec Alexa Fluor 647 (OVAAh647) à 5 pg.mL'1 (500 ng chargés) ou la cytokine CCL20 à 500 ng.mL'1 (50 ng chargés) dans 1 mM d’HCl ou un tampon NaCl. Les membranes ont été incubées sur la nuit à 4°C. Après rinçage avec un tampon acétate de pH 5,5 et séchage sous flux d’air, les membranes fonctionnalisées sont désignées « patch bioactif ».
1.13 Etude de la libération d’ovalbumine
Avant les expériences, l’OVAAh647 a été incorporée dans les membranes tel que décrit ci-dessus. La libération des protéines a été suivie à différents pH, du tampon acétate à pH 5,5, PBS à pH 7,4 de Dulbecco (dPBS) ou de la salive artificielle à pH 6,5 étant utilisés comme solutions de rinçage. Immédiatement après l’ajout des solutions de rinçage, les protéines ont été retirées et conservées pour évaluer la quantité de protéines non liées (« quick rinse », QR). La libération de l’OVAAh647 depuis la membrane a été réalisée durant 2h avec des points à 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min. L’analyse de l’OVAAh647 libérée a été réalisée par spectroscopie de fluorescence (Infinite M1000, Tecan) avec la longueur d'onde d'excitation/émission d’ Alexa Fluor 647 fixée à 650/668 nm. Une courbe d’étalonnage pour la protéine marquée a été réalisée dans le dPBS, le tampon acétate, l’HCl et la salive artificielle aux longueurs d’onde mentionnées précédemment.
1.14 Analyse tomographique de la muco-adhésion du patch et du temps de rétention des protéines
Pour les analyses tomographiques du temps de rétention protéique dans la région buccale des souris, des groupes de 2 souris ont été anesthésiés dans une chambre recevant durant 5 minutes un flux d’isoflurane à 4%. Pour l’administration de la solution, 10 pl de solution d’OVAAh647 ont été déposés à la base de la face ventrale des langues des souris. Concernant l’administration des patchs, ces derniers ont été placés sur la surface ventrale des langues. Pour chaque formulation, 5pg d’OVAAh647 a été administré. Les souris ont été placées dans la chambre tomographique (FMT 4000, Perkin Elmer) sous isoflurane, en position couchée tête la première pour l'acquisition d'images 2, 10 ou 30 minutes après l'administration.
1.15 Pénétration de l’ovalbumine dans la muqueuse sublinguale
La pénétration de 1’ OVAAh647 dans la muqueuse sublinguale a été évaluée après administration d’une formulation liquide (10 pl) ou d’un patch (CHIFITC-HyA)lOO-CHI. OVAAh647 a été incorporée par incubation dans le HCl, comme décrit en 1.12. Des groupes de 2 souris ont reçus les différentes formulations et ont été euthanasiés 2, 10, 30 ou 60 minutes après l’administration. Le muqueuse sublinguale (face ventrale de la langue et plancher de la bouche) ont été prélevés, inclus dans une matrice OCT® et stockés à -80°C. des coupes de 40 pm ont été effectuées, marquées par la sonde nucléaire DAPI puis observées au microscope confocal (LSM 710, Zeiss, Germany).
1.16 Test chimiotactique
Une lignée de cellules dendritiques de souris (DC 2.4, #SCC142 Millipore) a été utilisée pour tester l’effet chimiotactique in vitro de la chimiokine CCL20 délivrée par les membranes mises au point. Des cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI supplémenté en GlutaMAX, avec 10% de FBS, 10 mM d’HEPES, 50 pM de P-mercaptoéthanol et un mélange d’acides aminés non essentiels (IX) (appelé par la suite GM) à 37°C et sous atmosphère avec 5% de CO2. Le test chimitactique a été réalisé dans des inserts de culture cellulaire ThinCertTM (Greiner Bio- One ; ref: 665 610) disposés dans des plaques 12 puits, durant 20 minutes. Avant la mise en œuvre du test, les membranes, la chimiokine CCL20 et les membranes chargées en chimiokine CCL20 (500 ng.mL'1) ont été incubées pendant 24h dans une solution d’enzymes salivaires (0, 1 mg.mL'1 d’a-amylase, d’hyaluronidase et de lysozyme dissous dans du GM sans FBS) à 37°C sous agitation lente. Puis, les inserts de la plaque 12 puits ont été ensemencés avec une densité de 2,0.105 cellules/insert et incubés pendant 10 minutes à 37°C. Ensuite, les chambres inférieures de la plaque 12 puits ont été soigneusement remplies avec 1 mL de solution chimiotactique ou de solution contrôle, pour une incubation de 10 minutes à 37°C. Le contrôle positif correspondait à des cellules dendritiques (DC) incubées en présence de GM seulement. Finalement, les faces internes de chaque insert ont été essuyées à l’aide de coton-tige. Les échantillons ont été observés avec un microscope inversé (Nikon Ti-E) après fixation (au paraformaldéhyde 4%) et coloration au DAPI. Les résultats obtenus représentent la moyenne des triplicats de 3 expériences indépendantes. 1.17 Analyse statistique
Toutes les données ont été analysées et rentrées dans la version 7.0 du logiciel Graphpad Prism. Les quantités indiquées représentent la moyenne ± écart type (SD) d’au moins trois réplicats ; à l’exception des données de libération représentant des moyennes ± erreur type (SEM). p < 0,05 a été considéré statistiquement significatif après un test ANOVA à un seul facteur contrôlé, avec le test à comparaisons multiples de Tukey ou avec le test à comparaisons multiples de Dunnett pour les tests de cytotoxicité.
2. Résultats
2.1 Dégradation des membranes autoportantes dans la salive artificielle
Les membranes natives (CHI/HyA)ioo ont été produites en faisant varier 3 paramètres : le poids moléculaire (MW) de HyA, le temps de dépôt des polyélectrolytes et des solutions de rinçage, et les propriétés du CHI. L’influence de tels paramètres a été premièrement examinée sur l’épaisseur de membrane. Il a été montré que la croissance des membranes natives (CHI/HyA)ioo est linéaire avec des membranes de 50 bicouches (4,5 +/-l,39pm), de 100 bicouches (10,30 +/- 7.67pm) et de 200 bicouches (17,04 +/- 7,96 pm) (Fig. 9). Au moins 50 bicouches ont été nécessaires pour une manipulation aisée sans aucun traitement postprocédure. Aucune différence significative n’a été trouvée au niveau de l’épaisseur de membrane en faisant varier le MW de HyA (610 KDa ou 1000 kDa) (Fig. 1 A). Concernant le temps de dépôt, à savoir les cycles longs (CL, 6 min pour les polyélectrolytes et 4 min pour le tampon de rinçage) et les cycles courts (CC, 3 min pour les polyélectrolytes et 2 min pour le tampon de rinçage), des différences significatives ont été observées au niveau de l’épaisseur de membrane où une augmentation d’environ 32% a été vérifiée lorsque les membranes ont été produites sous des conditions de CL (Fig. 1 A).
L’influence des conditions employées pour la construction des membranes a aussi été examinée sur la dégradation. De plus, comme l'intention est d'utiliser les membranes pour des applications sublinguales, une salive artificielle a été produite. La salive artificielle était composée d’une solution physiologique contenant de l’a-amylase, du lysozyme et de F hyaluronidase, trois enzymes retrouvées dans la salive humaine. La dégradation des membranes produites a été suivie sur une période de 24h et quantifiée pour être exprimée en pourcentage de perte de poids. Les membranes élaborées avec du Viscosan® se sont dégradées plus rapidement que les membranes à base de CHI (Fig. 9B), comme attendu du fait de la biodégradabilité rapide du Viscosan®. Bien que le profil général de dégradation des membranes à base de CHI n’ait pas été affecté drastiquement par le poids moléculaire de HyA, ni les temps de dépôt (Fig. IB) ; dans la phase initiale du processus de dégradation (dans la première heure) un retard a été constaté avec les membranes construites en condition CL (encart de la Fig. IB). Au bout de 24h, toutes les membranes ont atteint un niveau de perte de poids allant de 75% à 95%.
Afin d’obtenir des informations morphologiques concernant leur dégradation, les membranes (CHI/HyALw)ioo ont été observées en MEB et en microscopie confocale. En observant les images provenant de ces deux techniques, une érosion initiale de surface a été observée à 30 min, suivi par la formation de trous superficiels à Ih, et finalement de trous plus profonds à 3h (Fig. IC et 1D). La dégradation enzymatique de la surface de la membrane a été aussi observée à partir de 30 min d’immersion dans la salive artificielle, dans des conditions hydratées où la membrane a gonflé jusqu’à environ 30 pm (Fig. 1D). Aucune dégradation n’a été observée après 24h dans le tampon acétate (Fig. 1D, contrôle).
Du fait que ces membranes ont été conçues pour une administration de la protéine à travers les muqueuses, les inventeurs ont choisi des membranes faites de CHI à la place du Viscosan® pour assurer une diffusion prolongée de la protéine cargo dès les premiers stades de la dégradation au contact de la muqueuse. Les membranes produites en condition de CC ont également été sélectionnées pour diminuer le temps de production, et la HyArw de 610 kDa a été choisie au hasard car aucune différence d'épaisseur ni de dégradation n'a été observée par rapport à la HyAuw. Pour assurer une mucoadhésion optimale, toutes les membranes utilisées pour l'expérimentation animale avaient une première et dernière couche de CHI. Ainsi, pour les études suivantes, les membranes (CHI/HyALw)100-CHI ont été simplement désignées par (CHLHyA)lOO.
2.2 Cytotoxicité envers les cellules épithéliales humaines
La cytotoxicité des produits de dégradation des membranes a été évaluée sur deux lignées cellulaires épithéliales humaines (HeLa et Ho-lu-1) sur une période d’incubation de 24h. Aucune toxicité n’a été observée sur les deux lignées cellulaires car la viabilité est restée autour de 100 % (Fig. 2A-B). Ce résultat s’explique par la biocompatibilité connue des deux polysaccarides utilisés pour produire les membranes qui n’ont pas été chimiquement modifiées. La combinaison des polymères n’a pas affecté leur innocuité biologique. Par conséquent, les membranes peuvent être appliquées in vivo sur des muqueuses sublinguales de souris, sans entrainer d’effet cytotoxique sur les cellules épithéliales du tissu. 2.3 Inflammation de la muqueuse sublinguale de souris
La réponse inflammatoire induite in vivo par le patch a été évaluée sur des souris par le biais de l'évaluation de différentes caractéristiques principales de l'état inflammatoire. Premièrement, la surface de gonflement de l'épithélium et de la lamina propria de la muqueuse sublinguale des souris dans différentes conditions a été observée. Comme contrôle positif de l'inflammation, du l-fluoro-2,4-dinitrobenzène (DNFB) à 0,5% a été utilisé car il a été démontré qu'il induit une inflammation lorsqu'il est administré par voie sublinguale [LeBorgne et al., 2006], Une augmentation de l'épaisseur de la muqueuse a été observée 30 min après l'administration de DNFB et a légèrement diminué après 2h (Fig. 3 A). Il est à noter que le gonflement de la lamina propria s'est maintenu pendant 6h alors que l'épaisseur de l'épithélium a déjà diminué après 2h. Afin de quantifier le gonflement induit par la membrane (CHI/HyA)100, des membranes natives et des membranes traitées à l’HCl (incubation d’ ih dans 1 mM de HCl, pH 3) ont été appliquées sur la muqueuse sublinguale pendant 30 ou 60 min. Le traitement à l'HCl faisant partie du protocole d'incorporation des protéines, son influence sur la réponse inflammatoire a été évaluée. Le gonflement de la muqueuse après l'application de la membrane native était comparable au gonflement induit par le témoin positif DNFB à 2h, alors que la muqueuse en contact avec la membrane traitée à l'HCl était significativement plus fine. Afin de corréler le gonflement des tissus avec l'infiltration des cellules immunitaires, une coloration immunohistochimique du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII) a été réalisée. Le CMHII est un marqueur majeur des cellules présentatrices d’antigènes (CPA), en particulier des cellules dendritiques (CD), des lymphocytes B et des macrophages. Le taux d'infiltration des cellules CMHII+ dans la muqueuse a augmenté significativement 30 minutes après l'administration de la membrane native (Fig. 3B-C) et est revenu au niveau du contrôle après 60 minutes. Il est intéressant de noter que les membranes traitées à l’HCl appliquées pendant 30 min n'ont pas provoqué d'infiltration de cellules CMHII+, l’infiltration restant similaire à celle du témoin, comme observé pour le gonflement de la muqueuse (Fig. 3 A).
Pour identifier le profil d'inflammation à moyen terme induit par les membranes natives et les membranes traitées à l'HCl, les profils d'expression des cytokines inflammatoires ont été quantifiés 6h après l'administration du patch. Dans toutes les conditions testées (polymères en solution, ou membranes avec ou sans traitement à l’HCl), les niveaux d'IL-ip, IL-6 et TNF-a étaient similaires aux niveaux du contrôle, ce qui signifie qu'aucune signalisation inflammatoire n'a été induite 6h après l'application du patch.
2.4 Incorporation/libération d’une protéine modèle, l’ovalbumine Pour évaluer les membranes (CHI/HyA)100 en tant que systèmes de diffusion de protéines, celles-ci ont été fonctionnalisées avec une protéine modèle, l'ovalbumine, marquée avec le fluorophore Alexa Fluor 647 (OVAAh647). L'OVAAh647 a été incorporée dans les membranes après équilibrage des membranes dans de l’HCl 1 mM, pH 3 (selon le schéma de la Fig. 4). Le rinçage des membranes avec un tampon d'acétate de pH 5,5 (tampon de rinçage de la superposition des membranes) a permis l'incorporation de 98% de l'OVAAh647 alors que le rinçage avec du PB S (pH 7,4) a entraîné une légère diminution de l'incorporation (94%) (Fig. 5 A). La cinétique de libération sur 2h a confirmé ces écarts puisque, dans le tampon acétate, moins de 7% de l'OVAAh647 a été libéré du patch contre 31% dans le PBS (Fig. 5A-B). Lors de l'immersion dans la salive artificielle, 35 % de l'0 VAAh647 a été libéré du patch en 2h, et environ 90 % après 24 heures d'immersion (données non présentées). Le profil d'incorporation de l'OVAAh647 à un pH de 3 suivie d'un rinçage au tampon d'acétate a montré qu'environ 80 % de la protéine était incorporée dans les 10 premiers micromètres sous la surface, ce qui correspond à un tiers de l'épaisseur totale hydratée (Fig. 5C-D). Les membranes fonctionnalisées sont ainsi devenues un patch asymétrique, la surface présentant la protéine étant celle qui est en contact avec la muqueuse. Comme certaines protéines peuvent être sensibles au pH acide (dénaturation, perte d'activité...), l'incorporation de l'0 VAAh647 a également été effectuée à un pH physiologique de 7,4 dans le PBS au lieu de l’HCl à pH 3. Cependant, il n'a pas été possible de manipuler ou de visualiser le patch après l'incorporation des protéines en raison du gonflement important de la membrane. En outre, l'instabilité de la structure a conduit à un taux d'incorporation inférieur à 60 % (données non présentées). Au lieu de cela, un tampon NaCl (NaCl 0,15 mol.L-1, HEPES 0,02 mol.L-1, pH 6,5) a été utilisé pour l'incorporation des protéines. Pour le rinçage des membranes, les mêmes solutions ont été testées (tampon acétate, PBS et salive artificielle). Comme observé pour la charge à pH acide, le rinçage avec un tampon à l'acétate a conduit à 94% d'incorporation de protéines alors que le rinçage avec du PBS n'a conduit qu'à 85% d'incorporation d'OVAAh647 (Fig. 10A). Les profils de libération ont confirmé que le tampon à l'acétate assure la rétention des protéines à l'intérieur de la membrane, car moins de 10% environ de l'OVAAh647 est libéré de la membrane, tandis que le PBS entraîne une libération rapide d'environ 36 % de l'OVAAh647 (figure 10B). La libération de la protéine après 2h de rinçage dans la salive artificielle a atteint 69%. Lorsqu'elle est incorporée avec du tampon NaCl, la distribution de la protéine à l’intérieur du patch s'est avérée plus homogène que l'incorporation avec l’HCl, et ne présentait aucun gradient de pénétration en profondeur, le long de l'axe Z (Fig 10C, D). 2.5 Mucoadhésion et temps de rétention de la de protéine cargo
La mucoadhésion des patchs a été évaluée in vivo par visualisation de la membrane reposant sur la muqueuse sublinguale 20 min après l'administration (Fig. 6A). Le suivi de l'OVAAh647 par tomographie de fluorescence moléculaire a mis en évidence la rapidité de dispersion de la protéine après administration sous forme de formulation liquide (Fig. 6B). Pendant les premières minutes d'acquisition de l'image, l'OVAAh647 était déjà distribuée le long du tube digestif et aucun signal n'était détectable dans la bouche après 10 min. Lorsqu'il était coadministré avec la membrane mucoadhésive, l'OVAAh647 a été détectée sous la forme d’un signal concentré dans la bouche pendant au moins 30 min.
2.6 Présentation sur la muqueuse et pénétration de la protéine cargo
La pénétration tissulaire de l'OVAAh647 a été suivie par microscopie confocale. L'intensité du signal 2 min après l'administration était beaucoup plus faible sous forme liquide que celle présentée par la membrane (Fig. 7). L'OVAAh647 a pénétré dans la couche kératinisée 10 min après l'administration du patch ainsi que dans le CHIFITC (flèches blanches, Fig 7). Le patch n'était pas détectable 30 minutes après l'application, mais l'OVAAh647 était présent profondément dans la muqueuse (flèche blanche pointillée, Fig 7). Même si une accumulation a été détectée dans l'épithélium (couche superficielle), l'OVAAh647 a été observée dans la lamina propria et la sous-muqueuse. Le signal était à peine détectable 60 minutes après l'administration. Cette diminution du signal de fluorescence de la protéine 60 minutes après l'administration par rapport à 30 minutes pourrait s'expliquer par la clairance de la protéine dans le tissu et son absorption par des cellules immunitaires telles que les CPA.
2.7 Bioactivité de la protéine incorporée
Pour évaluer la fonctionnalité et la bioactivité d'une protéine incorporée dans la membrane (CHI/HyA)100, une cytokine chimio-attractive (CCL20) a été chargée dans l'assemblage et prélevée après dégradation de la membrane dans la salive artificielle. La cytokine CCL20 a été utilisée comme chimioattracteur pour les cellules dendritiques murines (DC 2.4) qui possèdent le récepteur CCR6 associé (données non présentées). Les capacités chimioattractives de la cytokine ont été préservées à l'intérieur du patch car une migration similaire a été observée pour la CCL20 en solution et la CCL20 collectée après la dissolution du patch (Fig 8). La bioactivité de la protéine a donc été préservée par le patch et la cytokine a présenté un effet chimioattracteur significatif sur les cellules ciblées. Exemple 2 : Evaluation du taux d’incorporation dans des patchs (CHIZHyA)lOO
1. Incorporation de serumalbumine bovine (BSA)
Matériels et méthodes
Les membranes (CHI/HyA)100 ont été découpées de façon à obtenir des carrés d’ icm2 qui ont été incubés soit dans une solution tampon HCl de pH 3, soit dans une solution tampon NaCl de pH 6,5, contenant toutes deux de l’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à lOmg.mL'1. Les carrés de membranes (CHI/HyA)100 étant entièrement recouvert d’un volume de liquide de l’ordre de 200pl, ils contiennent chacun à l’équilibre environ 2mg de BSA absorbée. Les carrés de membranes (CHI/HyA)100 chargés en BSA ont ensuite été incubés dans un tampon de libération (tampon acétate, pH 5.5) dépourvu de BSA afin de mesurer la quantité de protéines libérées, et ce en employant un kit de dosage de protéine basé sur l’acide bicinchoninique (BCA) sur une durée de 4h. Des mesures de densité optique (562nm) ont ainsi été réalisées en prélevant le tampon de libération dès le début (tO) et après 5, 10, 20, 30, 60, 120 et 240 min d’incubation, le tampon de libération étant remplacé après chaque prélèvement. La mesure d’un blanc obtenu avec des puits contenant seulement la solution d’incubation a été systématiquement retranché. A l’aide d’une courbe étalon, la concentration en protéines par mL a pu être déterminée pour chaque temps de libération, puis rapportée à une quantité de BSA pour 200pl. Enfin, la quantité de protéines incorporée au sein de la membrane a été estimée en soustrayant la quantité de BSA déterminée pour 200pl aux 2mg théoriques de BSA initialement absorbés.
Résultats
La quantité de BSA incorporée par cm2 dans des membranes (CHI/HyA)100 a été déterminée à l’aide du dosage de la BSA libérée depuis des membranes pré-incubées dans une solution concentrée de BSA à différents pH. Des profils de libération très similaires ont été observés entre la BSA incorporée à pH 3 et la BSA incorporée à pH 6,5, avec respectivement 0,79mg et 0,75mg libérés instantanément (tO), 0,18mg et 0,16mg supplémentaires libérés après 5 minutes, et encore 0,03mg et 0,01mg libérés au bout de 10 minutes. Après 20 minutes de libération, la BSA libérée entre les temps tlO et t20 n’était plus détectable, ce qui indique que l’essentiel de la libération se produit en 10 minutes. La quantité totale mesurée de BSA libérée correspond à l,01mg pour la BSA incorporée à pH 3 et à 0,92mg pour la BSA incorporée à pH 6,5. Par conséquent, les carrés de membrane (CHI/HyA)100 ayant initialement absorbé environ 2mg de BSA conservent Img de BSA après 4h de rinçage, soit environ 0,99mg de BSA retenue pour l’incorporation effectuée à pH 3 et environ l,08mg de pour l’incorporation effectuée à pH 6,5. Le taux d’incorporation est donc de 50% dans les deux conditions. 2. Incorporation d’immunoglobulines (IgG) dans les membranes (CHI/HyA)100
Matériels et méthodes
Des membranes (CHI /HyA)100 ont été découpées de façon à obtenir des carrés d’ 1cm2 qui ont été incubés durant Ih soit dans 200pl d’une solution d’équilibration d’HCl de pH 3 (échantillons MbA) soit dans 200pl d’une solution d’équilibration NaCl-Hepes de pH 6,5 (échantillons MbB). Les carrés de membrane MbA ont ensuite été incubés dans 150pl d’une solution d’incorporation à base d’HCl de pH 3 contenant 2pg.mL'1 d’immunoglobuline de type G (IgG ; anticorps secondaires d’âne dirigés contre les IgG de chèvre et couplés au fluorochrome Alexa 633 ; Invitrogen, Molecular probes A21082-lot 73A2-1), et les carrés de membrane MbB ont été incubés dans 150pl d’une solution d’incorporation à base de NaCl-Hepes de pH 6,5 contenant aussi 2pg.mL'1 IgG. En parallèle, des carrés de membrane sèche (CHI /HyA)100 (MbC et MbD), n’ayant pas subi l’étape d’équilibration, ont été respectivement incubés dans les mêmes solutions d’incorporation que les échantillons MbA et MbB. Les incubations dans les solutions d’incorporation ont été réalisées sur la nuit, à 4°C. Le jour suivant, les membranes ont été rincées 3 fois 2 minutes dans un tampon acétate (0,lM CH3COOH, 0,lM CH3COONa, pH 5,5) puis séchées sous flux d’air (PSM) à l’abri de la lumière. Les membranes ont enfin été observées au microscope confocal à fluorescence (Zeiss, LSM 710) à l’aide d’un objectif x20. Résultats
Les membranes (Alexa 633nm) avec ou sans étape préalable d’équilibration à différents pH ont été observées (images non fournies). La présence d’IgG a pu être détectée de manière comparable et dans toutes les conditions, essentiellement à la surface des membranes MbA, MbB, MbC et MbD qui était opposée à la paroi de la plaque lors des incubations. Néanmoins, le marquage des IgG est plus prononcé pour les échantillons MbA, ce qui indique que l’étape préalable d’équilibration présenterait un avantage uniquement pour une incorporation à pH 3. Par ailleurs, la quantité d’IgG incorporée dans les membranes a pu être estimée à environ 400ng par cm2.
Références
Caridade et al, Biomacromolecules. 2013, 14(5): 1653-60
Caridade et al, Acta Biomater. 2015,15: 139-49 - LeBorgne et al., Immunity. 24 (2006) 191-201

Claims

REVENDICATIONS
1. Patch mucoadhésif buccal ou sublingual, destiné à la libération buccale ou sublinguale d’une protéine ou d’un polypeptide, ledit patch comprenant au moins 100 bicouches composées chacune d’une couche de chitosan (CHI) et d’une couche d’un polysaccharide anionique ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 1000 kDa ou un de ses sels, la couche en contact avec la muqueuse et la couche en contact avec l’environnement buccal ou sublingual du patch étant composées de chitosan (CHI), ladite protéine ou ledit polypeptide étant incorporé dans ledit patch et/ou adsorbé à la surface dudit patch.
2. Patch selon la revendication 1, comprenant de 100 à 200 bicouches CHI/polysaccharide anionique.
3. Patch selon la revendication 1 ou 2, ayant une épaisseur de 10 à 20 pm, de préférence environ 15 pm.
4. Patch selon Tune quelconques des revendications 1 à 3, dans lequel le polysaccharide anionique ou un de ses sels est choisi parmi un glycosaminoglycane (GAG), un fucoïdane, un alginate, un carraghénane, et un ulvane.
5. Patch selon la revendication 4, dans lequel le glycosaminoglycane (GAG) ou un de ses sels est choisi parmi l’acide hyaluronique (AH), l’héparine (Hp), les héparanes sulfates (Hs), les chondroïtines sulfates (CS), les dermatanes sulfates (DS), et les kératanes sulfates (KS), préférentiellement l’acide hyaluronique, et de manière encore plus préférée le hyaluronate de sodium.
6. Patch selon Tune des revendications 1 à 5, dans lequel la protéine ou le polypeptide est un allergène, de préférence l’ovalbumine.
7. Allergène pour une utilisation dans la désensibilisation d’un sujet allergique audit allergène, ledit allergène étant administré sous la forme d’un patch tel que défini à la revendication 6.
8. Procédé de fabrication d’un patch tel que défini à Tune des revendications 1 à 6, comprenant les étapes consistant à :
28 i) former une membrane multicouches CH/polysaccharide anionique au moyen d’un procédé de dépôt couche par couche (« Layer By Layer ») sur un substrat ; ii) détacher la membrane multicouches du substrat ; iii) mettre au contact la membrane multicouches avec une protéine ou un polypeptide, par ce en quoi la membrane multicouches se charge en protéine ou polypeptide.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la membrane multicouches est mise en contact avec une protéine ou polypeptide selon l’étape iii) dans une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3.
10. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la membrane multicouches est mise en contact avec une protéine ou polypeptide selon l’étape iii) dans une solution de chlorure de sodium (NaCl) à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, comprenant en outre une étape intermédiaire consistant à équilibrer la membrane multicouches détachée selon l’étape ii) avec une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à un pH compris entre 2 et 4, de préférence à un pH d’environ 3 ou de chlorure de sodium (NaCl) à un pH compris entre 5 et 7, de préférence à un pH d’environ 6,5, avant la mise en œuvre de l’étape iii).
12. Patch selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, susceptible d’être obtenu par un procédé tel que défini selon l’une quelconque des revendications 8 à 11.
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