EP4232817A2 - Méthode d'évaluation des propriétés mécanobiologiques d'un élément cellulaire - Google Patents

Méthode d'évaluation des propriétés mécanobiologiques d'un élément cellulaire

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EP4232817A2
EP4232817A2 EP21798623.1A EP21798623A EP4232817A2 EP 4232817 A2 EP4232817 A2 EP 4232817A2 EP 21798623 A EP21798623 A EP 21798623A EP 4232817 A2 EP4232817 A2 EP 4232817A2
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EP
European Patent Office
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cell
beads
biological sample
tip
magnetic
Prior art date
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Pending
Application number
EP21798623.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas MINC
Jeremy SALLE
Jing Xie
Javad NAJAFI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Cite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Cite
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Paris Cite filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells

Definitions

  • TITLE Method for evaluating the mechanobiological properties of a cellular element
  • the present invention relates to the field of biology, in particular mechanobiology, and relates more particularly to a method for characterizing the mechanobiological properties of a cell or of one of its elements or compartments.
  • Mechanobiology is an emerging field of research aimed at understanding how the mechanics of cellular organelles, cells, tissues, and/or their environment influence the physiology of organisms.
  • One of the foundations of this field of research and its biomedical applications is to be able to precisely measure and apply mechanical forces to the surface of organelles and cells in complex tissue environments.
  • This method has a range of forces typically between 0.01 pN and 10 pN, and applies to molecular issues (motors or unique biological filaments). On the other hand, it is unsuitable for volume measurements, since the force becomes too weak as soon as one moves away from the focal plane of the laser, and its range of forces does not correspond to the typical cellular and tissue forces (10-1000 pN ). This method also requires the use of expensive infrared lasers whose alignment must be systematically calibrated, often involving long protocols and depending on the user.
  • the atomic force microscopy (AFM) method consists of indenting, using a tip coupled to a calibrated deflector, the surface of cells or tissues to measure their rigidity, for example. It cannot be applied to measurements within the volume of cells or tissues, and creates consequent damage on the cells, in particular in the ranges of forces interesting for studying the mechanobiology of a cell. It is therefore limited in its compatibility with living samples. It is also associated with a complex assembly, requiring precise calibrations and often debated in the communities (different models for interpreting distance-force curves).
  • the aim of the invention is to overcome the lack of robust, versatile and precise methods for applying and measuring forces in biological samples.
  • the inventors here propose a method based on the use of magnetic tips adapted to tissue, cellular and nuclear surface mechanics, making it possible to apply forces in ranges ranging from pN to nN, and this within deep tissues or developing non-human multicellular embryos.
  • This method relies on micro-tips magnets that apply magnetic forces on functionalized paramagnetic microparticles to bind specifically to cellular elements and/or compartments.
  • This approach allows in particular localized applications of forces: (i) within cells, for applications for example for the study of the mechanics of the nucleus (ii) at the surface of a single cell or within tissues or embryos large multicells (iii) with a range of forces 2-3 orders of magnitude exceeding the range of common commercial methods such as optical tweezers and atomic force microscopy and/or (iv) with optimal compatibility with cells and living tissues.
  • the inventors demonstrate here the versatility, the robustness and the applicability of the method according to the invention within invertebrate and vertebrate cells and tissues, within the framework of a deformation of the nucleus within a living cell, of application of surface force on single cells as well as within the lumen of large multicellular assemblies.
  • the method has been validated in several cell types and different developing multicellular embryos. These include embryos from echinoderms (sea urchins), insects (Drosophila), vertebrates (zebrafish) and cultured mammalian cells.
  • the two main competing techniques for probing cell and tissue mechanics are optical tweezers and atomic force microscopy. Compared to the invention, these methods are: (i) limited to measurements on the surface of fine samples (adherent cells or monolayers), (ii) limited to a range of weak forces, not very compatible with the forces necessary for the study of most cells and tissues, (iii) invasive, and therefore not very compatible with the physiology and imaging of living cells over long periods, (iv) very difficult to implement and (v) much more expensive.
  • the invention stands out from other methods for measuring and applying forces, by its versatility in terms of applications for studying mechanobiological properties concerning cellular organelles, the properties of the cellular cytoplasm, surface forces, and this, at the within single cells or cells inserted in a complex and deep tissue. Furthermore, this approach is fully compatible with living samples and with the development and proliferation of living cells and tissues, and allows a much wider force range than optical tweezers methods.
  • the versatility and simplicity of implementation of the method promises an application in biomedical industrial research contexts.
  • the invention could serve as a standard for rapid and accurate classification of mechanical properties of tissues in disease diagnostic contexts, to establish rapid assays to screen the mechanobiological responses of healthy and diseased organs and tissues, to establish mechanical signatures useful in the diagnosis of unhealthy tissues in the field of health, or to develop chemical screenings specifically linked to tissue mechanobiology, in particular to evaluate the effect of drugs or small molecules on mechanobiological responses (stiffness of a healthy tissue or cell or tumor, structural properties of the nucleus, etc.).
  • the subject of the invention is an in vitro or ex vivo method for characterizing at least one mechanobiological property of at least one element, of at least one cellular compartment, of at least one cell or of at least one group of cells in a biological sample, said method comprising: a) the introduction of superparamagnetic beads into the biological sample, said beads comprising a coating able to address the superparamagnetic beads to a cellular element or compartment of interest or to penetrate a cell or a group of cells, b) applying a magnetic field to said superparamagnetic beads so as to apply a force to the biological sample, c) measuring at least one mechanobiological property of the cell element or compartment in the biological sample,
  • said biological sample being a cell or a multicellular biological sample
  • the magnetic field being applied by a magnetic tip, said magnetic tip comprising at least one millimeter or submillimeter magnet extended by a metal tip.
  • the coating is a hydrophobic coating.
  • the superparamagnetic beads comprising a hydrophobic coating are mixed with a biocompatible oil capable of causing the superparamagnetic beads to penetrate into a cell or a group of cells, before being introduced into the biological sample.
  • the coating is a biological coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to an element or cellular compartment of interest, a cell or a group of cells.
  • superparamagnetic beads comprising a biological coating are mixed with a solution, preferably a buffer solution before being introduced into the biological sample.
  • said biological sample is a multicellular biological sample chosen from: a tissue, an organ or an embryo, said biological sample not being of human embryonic origin.
  • the cellular element or compartment is chosen from: the cell membrane, the nuclear envelope, the membrane of an organelle, such as the mitochondria, the endoplasmic reticulum or the golgi apparatus, the lysosomes, the peroxisomes as well as their contents, such as the cytoplasm, the microtubules and/or the centrioles, the centrosomes or the mitotic spindle, preferably the cell membrane or the nuclear envelope.
  • the cell element or compartment is the internal or external cell membrane of at least one cell of the biological sample.
  • the force applied to the biological sample is between 0.001 pN and 5000 nN, between 0.001 pN and 1000 nN, between 0.001 pN and 20 nN, between 0.001 nN and 5000 nN, between 0.01 nM and 1000 nN , between 0.001 pN and 20 nN, or between 10 nN and 1000 nN, preferably between 0.001 pN and 100 nN, preferably between 0.5 pN and 1.5 nN.
  • the distance between the magnetic tip and the biological sample is between 10 micrometers and 1 millimeter.
  • the metal tip is in particular machined with a radius of curvature between 5 and 100 micrometers, preferably between 5 and 50 micrometers.
  • the metal tip preferably has a length between 1 and 30 millimeters, more particularly between 10 and 20 millimeters.
  • the method further comprises (i) a preliminary step in which the biological coating of the beads is selected according to the element or cellular compartment of interest, (ii) a preliminary step of preparation of the tip and/ or superparamagnetic beads and/or (iii) a tip and bead calibration step.
  • the method further comprises (i) a prior step of preparing the tip and/or superparamagnetic beads, (ii) a prior step in which superparamagnetic beads comprising the hydrophobic coating are mixed with a biocompatible oil, and/or (iii) a step of calibrating the tip and the balls.
  • the mechanobiological properties are chosen from: rheology, kinematics, mechanical strength, elasticity, rigidity, plasticity and visco-elastic properties, and any combination thereof.
  • the coating of the superparamagnetic beads is a hydrophobic coating chosen from butyl, methyl, ethyl, octyl, prolpyl, or octadecyl, preferably octadecyl.
  • the biocompatible oil is chosen from a soybean oil, a linseed oil, an oil of the Alkane type (C15-C40) and a fluorocarbon oil.
  • the biological coating of the superparamagnetic beads is a protein coating, comprising at least one bait protein able to recognize a prey protein on the cell element or compartment of interest.
  • the biological coating of the superparamagnetic beads is an antibody or a lectin.
  • the biological coating of the superparamagnetic beads is an antibody chosen from an anti Sodium Potassium ATPase, anti PMCA1, anti Pan Cadherin, anti E Cadherin, anti N Cadherin, anti ADAM22, anti LRP4, anti Fas (APO-1, CD95) antibody. , anti CD27, anti EGFR, anti NPC and anti NUP98.
  • the solution for suspending these beads is preferably a buffer solution, preferably a phosphate buffer.
  • the superparamagnetic beads have a size comprised between 100 nm and 100 ⁇ m, preferably between 100 nm and 50 ⁇ m, preferentially between 100 nm and 1 ⁇ m.
  • the superparamagnetic beads comprise a biological coating and in step a) of the method according to the invention, the superparamagnetic beads are injected into a cellular compartment of the biological sample.
  • the superparamagnetic beads are introduced by microinjection, biolistics or bombardment, preferably by microinjection, preferentially by pneumatic or hydraulic microinjection.
  • the biological sample can be obtained beforehand by sampling.
  • the biological sample may be alive and/or unfixed.
  • the methods according to the invention make it possible in particular to (i) characterize the impact of a drug or a medicament on a biological sample, and/or (ii) identify tumor cells in a biological sample.
  • the methods according to the invention make it possible to (i) characterize the impact of a drug or a medication on a cell, a tissue, an organ or an embryo or one of its elements or compartments, and/or (ii) identify and characterize damaged cells or tissues and/or (iii) identify and characterize tumor cells in a sample, said tumor cells exhibiting different mechanobiological characteristics from normal cells, and/or (iv) studying the mechanical interaction of the cells with each other or with the matrix which surrounds them and/or (v) studying the mechanotransduction of at least one cell.
  • the invention also relates to a kit comprising: a) a magnetic tip comprising a magnetic core comprising a superposition of millimetric or sub-millimetric magnets extended by a steel tip, b) superparamagnetic beads comprising a coating capable of addressing the beads superparamagnetic beads to a cellular element or compartment of interest or to penetrate a cell or a group of cells, c) optionally a solution allowing the suspension and the injection of the superparamagnetic beads into a cell or a cellular tissue, and d) optionally at least one calibration solution for the superparamagnetic beads and the magnetic tip.
  • the coating may be a hydrophobic coating, preferably an octadecyl, and the solution being a biocompatible oil capable of causing the superparamagnetic beads to penetrate into a cell or a group of cells.
  • the kit may comprise superparamagnetic beads comprising a biological coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to an element or cellular compartment of interest, the coating of the superparamagnetic beads preferably being a protein coating, preferentially an antibody or a lectin , the solution being a buffer solution, preferably a phosphate buffer.
  • the end of the steel tip is machined with a radius of curvature of between 5 and 100 micrometers.
  • the radius of curvature of the steel tip is preferably configured to apply a uniaxial magnetic gradient to the biological sample.
  • the magnetic core and the end of the steel tip are configured in such a way as to make it possible to apply a force on the biological sample of between 10 nN and 1000 nN, for a distance between the magnetic tip and the biological sample between 10 micrometers and 1 millimeter.
  • the steel tip has a length between 1 and 30 mm.
  • the magnet of the magnetic core is in neodymium, in ticonal, in alnico, in Neodymium Iron Boron (NdFeB) or in Samarium Cobalt (SmCo), preferably in neodymium.
  • the steel tip is coated with a layer of gold.
  • the kit according to the invention may also comprise a microinjector.
  • the invention also relates to the use of the kit according to the invention, for (i) characterizing the impact of a drug or a medicament on a biological sample, in particular a cell, a tissue, an organ or an embryo non-human or one of its elements or compartments, and/or (ii) identify and characterize damaged cells or tissues and/or (iii) identify and characterize tumor cells in a sample, said tumor cells presenting in particular mechanobiological characteristics different from normal cells, and/or (iv) studying the mechanical interaction of the cells with each other or with the matrix which surrounds them and/or (v) studying the mechanotransduction of at least one cell.
  • the use of the kit makes it possible to (i) - determine the mechanical properties of the surface of the nucleus, within a living cell, such as the elasticity of the nuclear envelope; (ii) determining cell surface stiffness, such as the viscoelastic properties of the cortex; (iii) apply forces within tissues at depths of the order of a hundred micrometers, and measure for example mechanical constants such as mechanical constants of compressive stiffness and surface elasticity; and/or (iv) perform measurements in a volume of deep samples such as developing embryos, tissue explants and organoids.
  • the invention also relates to an in vitro or ex vivo method for characterizing at least one mechanobiological property of at least one element, of at least one cellular compartment, of at least one cell or of at least one group of cells in a biological sample, said method comprising: a) the introduction of superparamagnetic beads into the biological sample, said beads comprising a coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to a cellular element or compartment of interest, b) the application of a magnetic field to said superparamagnetic beads so as to apply a force to the biological sample, c) measurement of at least one mechanobiological property of the cell element or compartment in the biological sample, characterized in that said biological sample is a cell, a tissue or a multicellular embryo, an organ, and said biological sample is not a biological sample of human embryonic origin
  • the magnetic field is applied by a magnetic tip, said magnetic tip comprising at least one millimeter or submillimeter magnet extended by a metal tip.
  • a subject of the invention is also a method, preferably in vitro or ex vivo, for characterizing at least one mechanobiological property of a cellular element or compartment in a biological sample, said method comprising: a) the introduction of superparamagnetic beads into the biological sample, said beads comprising a biological coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to an element or cellular compartment of interest, b) applying a magnetic field to said superparamagnetic beads so as to apply a force on the biological sample, c) measuring at least one mechanobiological property of the cell element or compartment in the biological sample.
  • Figure 1 depicts the magnetic tip principle for force application to the surface of the nucleus, single cells, and multicellular tissues.
  • C Schematic example of the application of forces on a tissue containing magnetic particles associated with the plasma membrane or trapped in the lumen of the epithelium.
  • Figure 2 represents the calibration of the applied magnetic forces.
  • Fig 2A The magnetic balls placed in a viscous medium move towards the tip and their instantaneous speed (represented with a gray gradient) makes it possible to calibrate the force according to the distance with the magnetic tip.
  • Fig 2B Magnetic force created by the tip on magnetic particles (1 ⁇ m in diameter) in media of different viscosities (viscosity indicated in the legend). Viscosity modulation allows the force to be more accurately established over a wider range of distances.
  • Figure 3 depicts the application of forces within cells and embryos and effect(s) on cell division and development.
  • Fig 3 A Movement of magnetic particles within a living sea urchin cell.
  • Figure 4 depicts the measurement of nuclear stiffness within an intact cell. Magnetic beads coated with antibodies directed against the surface proteins of the nucleus (anti-NPC), injected into a living sea urchin cell, bind specifically to the nuclear surface and allow the nucleus to be pulled and deformed. The deformation and the value of the applied force make it possible to calculate the stiffness of the nuclear surface.
  • anti-NPC antibodies directed against the surface proteins of the nucleus
  • Figure 5 depicts the measurement of the surface stiffness of a single cell. Magnetic beads were injected into a stage 1 sea urchin embryo. The presence of the magnet causes the aggregation of the magnetic beads and the deformation of the cell membrane. The deformation and the value of the applied force (here ⁇ 660pN) make it possible to calculate the stiffness of the cell surface.
  • Figure 6 represents the measurement of the mechanical properties of a tissue within a 3D multicellular system.
  • a large magnetic bead injected into the endocardium of the heart of a living zebrafish makes it possible to apply calibrated forces on the surface tissues and to calculate the compression and deformation stiffness of the tissues.
  • Figures 7A and B represent examples of magnetic tips according to the invention.
  • Figure 8 illustrates a method for moving large drops of oil into the cytoplasm of a cell to probe the mechanobiological properties of the cytoplasm.
  • A Diagram where the hydrophobic beads are placed in a drop of oil injected into the cytoplasm.
  • B Calibration of the force applied to the oil drop as a function of the size of the aggregate.
  • C Example of an experiment where the drop of oil is moved by the application of a force (red zone) then returns to its original position when the force is released, due to the viscoelastic properties of the cytoplasm of a sea urchin zygote cell.
  • the method according to the invention is based on the use of superparamagnetic beads and magnetic tips to evaluate the mechanobiological characteristics of at least one cell, one element, or one compartment thereof.
  • the method according to the invention makes it possible to evaluate at least one mechanobiology property of at least one element, of at least one cellular compartment, of at least one cell or of at least one group of cells in a sample biological.
  • the method according to the invention is compatible with all kinds of superparamagnetic particles or beads. There are a large number commercially available, with a range of adjustable surface chemistry. The inventors tested and validated the method according to the invention with about ten balls of different brands, without any sign of defect or limit of the approach.
  • paramagnetic material relates to the behavior of a material which does not possess spontaneous magnetization but which, under the effect of an external magnetic field, acquires a magnetization oriented in the same direction as the applied magnetic field, for example a field as applied by a magnetic tip.
  • a paramagnetic material has a magnetic susceptibility of positive value.
  • the magnetization of these materials can also reverse spontaneously under the influence of temperature, in particular at the Curie temperature of the material. An exchange interaction between the magnetic moments exists which, below a certain temperature, leads to a magnetic order (ferromagnetic, ferrimagnetic or antiferromagnetic).
  • the superparamagnetic beads consist of cores of iron oxides such as magnetite, of micrometric or nanometric size, and generally coated in a polymer shell.
  • the magnetic moment of the balls depends on the number of cores or magnetic domains. Beads consisting of a large number of domains have a strong magnetic moment and are therefore easily attracted to a permanent magnet. As they are superparamagnetic, the beads rapidly acquire magnetization under the effect of a magnetic field. This magnetization disappears immediately with the removal of the field.
  • Such beads are notably marketed by Invitrogen (DynabeadsTM MyOneTM Streptavidin Cl), Chemicell (nano-screenMAG-Streptavidin), Promega (High Capacity Magne ® Streptavidin Beads), Nvigen (MyQuVigenTM - Streptavidin) and Solulink (NanoLinkTM Streptavidin Magnetic Beads).
  • the superparamagnetic core of the beads is included in a layer of polymer (for example polysaccharides) functionalized with a binding domain (for example streptavidin).
  • a binding domain for example streptavidin
  • “Addressing” is understood here as a mechanism allowing the transport of superparamagnetic beads to their intra or extracellular destination of interest. For example, when the beads have a coating consisting of anti-cadherin antibodies, a protein of the plasma membrane, the beads are addressed (i.e. transported/localized then fixed) at the level of the plasma membrane after their injection.
  • coating is meant here a layer deposited on the surface of a material, here a superparamagnetic ball, to give it particular properties.
  • the coating present on the surface of the paramagnetic beads allows the specific addressing of the beads to a compartment or cellular element and possibly their attachment thereto.
  • the coating may in particular be a biological coating, such as a protein, peptide or lipid coating or a hydrophobic coating.
  • the coating is a hydrophobic coating, in particular chosen from long carbon chains such as Butyl, Methyl, Ethyl, Octyl, Prolpyl, or Octadecyl.
  • the hydrophobic coating is composed of carbon chains of the Octadecyl type.
  • the beads are mixed with an oil to be injected into the cytoplasm of the cells of the biological sample.
  • oils can be organic or mineral and are preferably biocompatible.
  • the oils can be chosen from a soybean oil, a linseed oil, an oil of the Alkane type (C15-C40), or a fluorocarbon oil.
  • the beads comprise a biological coating and are shaped to be fixed at the level of the internal face of the biological sample, at the level of the envelope of the nucleus of a cell of the biological sample, at the level of the mitotic spindle and/or at the level of the centrosome of the biological sample.
  • the beads are prepared in such a way as to allow their fixation at the level of the centrosome of the biological sample.
  • the cellular compartment or element is chosen from: the cell membrane, the nuclear membrane, the membrane of an organelle, such as the mitochondria, the endoplasmic reticulum or the golgi apparatus, the lysosomes, the peroxysomes as well as their contents, such as cytoplasm, microtubules and/or centrioles.
  • the coating present on the surface of the beads is a biological coating which allows their addressing and their attachment to the cell membrane or to the nuclear membrane, or to other cell organelles.
  • the attachment of the beads to a cell compartment or element is carried out by non-covalent bond, in particular a bond of the protein-protein type, in particular of the bait protein-prey protein type, or of the antibody-antigen type.
  • prey protein is meant here a cellular protein of interest, which the person skilled in the art would like to target in order to evaluate the mechanobiological characteristics of a cell, of a compartment or element thereof.
  • bait protein or “hook protein” is meant here a protein capable of recognizing, interacting and binding to the prey protein, in particular having a specific affinity to a cell compartment/structure.
  • a prey protein can be a protein constituting the nuclear pores and the bait protein an antibody specifically recognizing this nuclear pore protein.
  • the coating of the superparamagnetic beads is a protein coating, preferably an antibody, a peptide or a lectin.
  • Magnetic beads functionalized with proteins such as antibodies are commercially available.
  • functionalization methods and kits are available in order to coat the beads with a compound of interest. These methods and kits are well known to those skilled in the art.
  • the reaction between the sulfonic ester and carboxylic acid groups allows the creation of covalent bonds between the beads and the compound of interest, while the beads-streptavidin are functionalized via the biotin-streptavidin interaction by antibodies or other proteins. previously covalently coupled to biotin.
  • the coating of the super-paramagnetic beads is an antibody, preferably chosen from an anti Sodium Potassium ATPase, anti PMCA1, anti Pan Cadherin, anti E Cadherin, anti N Cadherin, anti ADAM22, anti LRP4, anti Fas (APO-1, CD95), anti CD27, anti EGFR, anti NPC and anti NUP98.
  • an anti Sodium Potassium ATPase anti PMCA1, anti Pan Cadherin, anti E Cadherin, anti N Cadherin, anti ADAM22, anti LRP4, anti Fas (APO-1, CD95), anti CD27, anti EGFR, anti NPC and anti NUP98.
  • the “hook” proteins used to specifically address the particles to the plasma membrane or the nuclear envelope are chosen from the following table:
  • the superparamagnetic beads have a size comprised between 100 nm and 100 ⁇ m, preferably between 100 nm and 50 ⁇ m, preferentially between 100 nm and 1 ⁇ m.
  • the size of the beads and their coating are chosen according to the intended use, taking into account the element, the cell compartment, the cell or the set of cells targeted.
  • the balls used are chosen from:
  • Beads of Ipm in diameter (Dynabeads) associated with an anti-nuclear pore antibody (anti-NPC) allowing targeting to the nuclear envelope and deformation of the nucleus.
  • anti-NPC anti-nuclear pore antibody
  • the superparamagnetic particles used are fluorescent beads.
  • the superparamagnetic beads according to the invention may also comprise one or more fluorescent molecules, such as a fluorophore, allowing their visualization under microscopy.
  • incubation with a biotinylated fluorophore can be carried out if visualization of the particles by fluorescence microscopy is necessary.
  • the present invention proposes the use of a magnetic tip making it possible to apply a force to the cell, the element or the cell compartment of interest, by applying a magnetic field to the superparamagnetic beads.
  • magnetic tip is meant a tip comprising a material which is either magnetizable or magnetized. The operation of the magnetic tip is based on a magnetic field gradient created by a tip comprising at least one magnet or electromagnet, intended to create a force on one or more magnetic beads attached to specific structures within or on the surface of cells.
  • the magnet used is a permanent magnet.
  • permanent magnet is meant a hard magnetic material, the remanent magnetization and the coercive field of which are large. This type of magnet makes it possible to exert an attractive force on any ferromagnetic material.
  • a magnet has a north pole and a south pole. Poles of the same nature repel each other, those of different natures attract each other.
  • the magnetic tips are composed of a magnetic core made of a superposition of millimetric or sub-millimetric magnets, whose geometry and magnetization can be modulated.
  • the magnetic tip comprises a magnetic core composed of at least 1, 2, 3 or 4 superimposed magnets, preferably 3 superimposed magnets.
  • the magnet or magnets form the magnetic core and have a diameter of between 1 and 5 millimeters, preferably between 2 and 5 millimeters, between 3 and 4 millimeters, in particular 4 millimeters.
  • the magnetic core has a cylindrical tubular shape.
  • the diameter of the magnetic core is between 1 and 5 millimeters, preferably between 2 and 5 millimeters, between 3 and 4 millimeters, between 2 and 3 millimeters, between 1 and 2 millimeters, between 1 and 3 millimeters, between 3 and 5 millimeters, between 4 and 5 millimeters.
  • the length of the magnetic core is typically between 2 and 3 centimeters.
  • the magnet of the magnetic core is preferably made of neodymium, ticonal, alnico, Neodymium Iron Boron (NdFeB) or Samarium Cobalt (SmCo).
  • the magnets of the magnetic core are made of neodymium.
  • Neodymium magnets in particular can be coated with a thin layer of nickel-copper-nickel to protect them against corrosion.
  • the magnetic core is extended at its proximal end by a metal tip having a radius of curvature of between 5-100 micrometers, preferably between 10 and 90 micrometers, 20 and 70 micrometers, 5 and 50 micrometers, 10 and 50 micrometers, 25 and 50 micrometers.
  • the metal tip has a radius of curvature of between 5 and 50 micrometers.
  • the metal tip has a radius of curvature adapted to the size of the biological sample and/or of the element and/or of the cellular compartment and/or of the mechanobiological property of interest.
  • the metal tip has a length of between 1 and 30 millimeters, more particularly between 10 and 20 millimeters.
  • length is meant the largest dimension of the metal tip, which extends along a longitudinal axis of said tip.
  • the magnetic core, the length of the tip and the radius of curvature of the tip are adapted so as to make it possible to apply a force on the biological sample comprised between 10 nN and 1000 nN.
  • the force applied to the biological sample is between 0.001 pN and 5000 nN, between 0.001 pN and 1000 nN, between 0.001 pN and 20 nN, between 0.001 nN and 5000 nN, between 0.01 nM and 1000 nN, between 0.001 nN and 20 nN, or between 10 nN and 1000 nN, preferably between 0.001 pN and 100 nN, preferably between 0.5 pN and 1.5 nN.
  • the magnetic tip is adapted according to the force to be applied to the sample.
  • the Gradient function is a vector derivative that depends on the tip geometry and the position of the ball relative to the tip axis. For a ball exactly in the axis the Grad is proportional to ⁇ 1/L and 1/R where L is the length of the tip, and R the radius of curvature.
  • This tip allows the magnetic field lines to be channeled across the beads, and therefore a greater magnetic field intensity to be focused onto a smaller region of space.
  • the curvature of the magnetic tip is configured to create a uniaxial magnetic gradient on the biological sample.
  • the magnetic force applied thanks to the curvature of the confined tip with a width of a few tens of micrometers allows the calibration of the system by application of a force focused in one direction, and therefore to ensure that it is possible to measure mechanobiological parameters in a precise and reproducible way.
  • the metal tip has a cylindrical tubular shape.
  • the diameter of the metal tip may in particular be between 0.5 and 1 millimeter. Finer nibs allow for finer spatial precision, and wider nibs allow for a wider force range.
  • the metal tip may have a tapered or beveled proximal end, making it possible to facilitate the passage of the magnetic tip into a tissue.
  • proximal end we mean the portion of the magnetic tip closest to the beads and/or the cell, tissue, cell element or compartment of interest. Conversely, “distal end” means the portion of the magnetic tip furthest from these elements.
  • the metal tip overhanging the magnetic core is made of steel, iron, nickel or cobalt or one of their alloys, preferably steel.
  • the metal tip overhanging the magnetic core is covered with a layer of gold.
  • the gold layer is applied by "electro sputting" to improve the stability of the tip against oxidation in culture media, allowing in particular to abolish the toxic effects on the cells, and to keep the tips for periods of use of several months/years.
  • the magnetic tip comprises a magnetic core composed of three neodymium magnets extended by a sharp steel tip having a radius of curvature of approximately 50 ⁇ m, capable of creating a magnetic gradient.
  • the surface of the steel point can in particular be covered with a layer of gold by electrolysis to prevent oxidation.
  • the magnetic tips are preferably calibrated by tracking the velocity of each of the magnetic beads in a medium of known viscosity, as a function of the distance to the magnetic tip, and using Stokes' relationship to calculate the net magnetic force.
  • the same experiment carried out on aggregates of balls of different sizes at a given distance made it possible to establish force-size relationships.
  • the drag of bead aggregates can be tested by measuring the sedimentation rate in a medium of known viscosity, and is represented by the drag of a spherical particle of radius equal to the geometric mean of the size of the aggregate (Tanimoto et al. al., Nature Physics 2018). A method of calibrating the tip and the balls is particularly described below.
  • the force resulting from the application of the magnetic tip to the balls depends in particular on three factors: (i) the magnetic properties of the tip and its curvature (ii) the magnetic susceptibility of the particles and their volume and/or ( iii) the distance between the tip and the magnetic particle.
  • the invention particularly relates to a method for studying cellular and intracellular mechanics, in particular within a biological sample, in particular a tissue and/or a multicellular embryo, preferably a non-human embryo.
  • the method according to the invention comprises a step of injecting superparamagnetic beads, the injection being able to be carried out using commercial injection systems (for example the InjectMan Eppendorf) of the magnetic particles or beads either within the cytoplasm of the cell, either on the surface of the cell or within the lumen of a tissue or an embryo.
  • the magnetic tip is approached at a controlled distance from the cell and the superparamagnetic beads, in order to be able to apply a precise force to the structure of interest. This application of force can be repeated several times during a cell cycle, maintained, or modulated by changing the position of the magnetic tip.
  • the invention relates more particularly to an in vitro or ex vivo method for characterizing at least one mechanobiological property of at least one element, of at least one cellular compartment, of at least one cell or of at least one group of cells in a biological sample, said method comprising: a) the introduction of superparamagnetic beads into the biological sample, said beads comprising a coating able to address the superparamagnetic beads to a cellular element or compartment of interest or to penetrate a cell or a group of cells, b) applying a magnetic field to said superparamagnetic beads so as to apply a force to the biological sample, c) measuring at least one mechanobiological property of the cell element or compartment in the biological sample,
  • said biological sample being a cell or a multicellular biological sample
  • the magnetic field being applied by a magnetic tip, said magnetic tip comprising at least one millimeter or submillimeter magnet extended by a metal tip.
  • the coating is a hydrophobic coating and, preferably, the superparamagnetic beads comprising a hydrophobic coating are mixed with a biocompatible oil capable of causing the superparamagnetic beads to penetrate into a cell or a group of cells, before being introduced into the biological sample.
  • the coating is a biological coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to an element or cellular compartment of interest, a cell or a group of cells and, preferably, the superparamagnetic beads comprising a biological coating are mixed with a solution, preferably a buffer solution before being introduced into the biological sample.
  • the invention also relates to a method for characterizing one or more mechanobiological properties of a cell or of one of its elements or compartments within a biological sample, said method comprising or consisting essentially of: a) the introduction of superparamagnetic beads into the biological sample, said beads comprising a coating such as a biological coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to an element or cellular compartment of interest, b) the application of a magnetic field on said superparamagnetic beads so as to apply a force to the biological sample, c) measuring one or more mechanobiological properties of the cell element or compartment in the biological sample.
  • the method can particularly be carried out in vivo, ex vivo or in vitro.
  • the invention relates in particular to an in vitro or ex vivo method for characterizing at least one mechanobiological property of at least one element, of at least one cellular compartment, of at least one cell or of at least one group of cells in a biological sample, said method comprising: a) introducing superparamagnetic beads into the biological sample, said beads comprising a coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to a cellular element or compartment of interest, b) l application of a magnetic field to said superparamagnetic beads so as to apply a force to the biological sample, c) the measurement of at least one mechanobiological property of the cell element or compartment in the biological sample, characterized in that that said biological sample is a cell, a tissue or a multicellular embryo, an organ, and said biological sample not being of embryonic origin human area
  • the magnetic field is applied by a magnetic tip, said magnetic tip comprising at least one millimeter or submillimeter magnet extended by a metal tip.
  • the method further comprises (i) a preliminary step in which the biological coating of the beads is selected according to the element or cellular compartment of interest, (ii) a preliminary step of preparation of the tip and/ or superparamagnetic beads and/or (iii) a tip and bead calibration step.
  • the method further comprises (i) a prior step of preparing the tip and/or superparamagnetic beads, (ii) a prior step in which beads superparamagnetic materials comprising the hydrophobic coating are mixed with a biocompatible oil, and/or (iii) a step for calibrating the tip and the beads.
  • the sample on which the method is applied can be an organism, an embryo, an organ, a tissue or a cell.
  • the sample on which the method is applied is preferably selected from a cell, a multicellular sample, a tissue or an organ previously obtained by sampling, or a preferentially non-human embryo.
  • the biological sample is not a biological sample of human embryonic origin.
  • the sample is in living and/or unfixed form.
  • the sample is multicellular, and is in particular a tissue, an organ, a preferentially non-human embryo.
  • the fabric may in particular be of natural or synthetic origin, in two or three dimensions.
  • the tissue can be a layer of cells, for example in cell culture.
  • the superparamagnetic beads are injected into the lumen of a tissue or organ.
  • a tissue or organ For example, it is possible to inject large magnetic beads into the lumen of the heart tissue of a vertebrate model embryo (zebrafish).
  • the targeted cellular element or compartment is the inner or outer cell membrane of the biological sample.
  • the sample can be treated beforehand, for example by using a 50% bleach solution.
  • the sample can also be slightly dried then stuck on a glass slide and immediately covered with a drop of oxygen-permeable oil (for example with Oil 10S Voltalef).
  • the sample tested can come from a subject or come from a cell culture, in particular by using commercially available cell lines.
  • the sample can in particular be a biopsy, carried out on a subject prior to the method according to the invention.
  • the terms "individual”, “host”, “subject” and “patient” are used herein interchangeably, and designate a mammal, more particularly an animal subject and even more particularly a human.
  • the animal can be a domestic animal such as a cat or a dog, a farm animal such as a horse or a cow, or a laboratory animal, such as a mouse, a Drosophila, etc.
  • the method according to the invention is carried out on a cell.
  • the cell studied is a single cell or an isolated cell, a cell included in a multicellular or multicellular tissue, a cell included in an embryo, said embryo preferably being non-human, or a cell included in a biological sample, such as a biopsy or an explant.
  • the cell may be a microorganism, such as a bacterium, yeast, or single-celled fungus.
  • the cell studied is a human, animal or plant cell.
  • the cell is a non-human cell.
  • the cell is a tumor or cancerous cell.
  • the cell can come from a primary tumour, a circulating cancer cell or a metastasis.
  • the sample on which the method according to the invention is carried out is an embryo, preferably a non-human embryo.
  • the embryo is chosen from a sea urchin (Paracentrotus lividus), fruit fly (Drosophila melanogaster) or zebrafish (Danio Rerio) embryo.
  • the compartment or the cellular element targeted by the superparamagnetic beads is chosen from: the cell membrane, the nuclear membrane, the membrane of an organelle, such as the mitochondria, the endoplasmic reticulum or the golgi apparatus, the peroxisomes, lysosomes and their contents, cytoplasm, microtubules and/or centrioles.
  • the targeted cellular compartment or element is the cell membrane or the nuclear membrane.
  • the method according to the invention makes it possible to evaluate the mechanobiological characteristics of these different elements.
  • mechanical-biological characteristics and “mechanical-biological properties” are used here interchangeably and relate to the effects of mechanical stresses (stretching, compression, shearing, etc.) on living cells or tissues.
  • the mechanobiology encompasses rheology, kinematics, mechanical strength, elasticity, plasticity, stiffness, flexibility, and viscoelastic properties, or any combination thereof.
  • the mechanobiological properties are chosen from: rheology, kinematics, mechanical strength, elasticity, plasticity, rigidity, flexibility and viscoelastic properties, or any combination thereof.
  • the mechanobiological property measured is stiffness or elasticity.
  • “Rheology” is the science that studies the deformations and flow of matter. Its purpose is to analyze the mechanical behavior of substances and to establish their laws of behavior. It encompasses many fundamental disciplines such as the strength of materials, fluid mechanics, plasticity and elasticity.
  • the rheological properties of a material or a cellular element correspond to the mechanical behavior and to the relations between the deformations and the stresses of the material.
  • the rheology of cytoplasmic fluid of a cell or lumen of a tissue can be measured by the proposed magnetic tip method. For this, balls of different sizes can be moved by the application of a magnetic force, making it possible to determine the viscosity of the cytoplasm, the dependence of this viscosity according to the size of the moved object, or the shearing force.
  • Typical cytoplasm viscosities range from 10-1000 cP, and depend on the size of the object being moved in the fluid as well as the cell type.
  • the “mechanical resistance” of an element is its global behavior (relationship between stresses — forces or moments — and displacements) and its local behavior (relationship between stresses and deformations).
  • stress intensity increases, there is first elastic deformation (the element deforms in proportion to the force applied and resumes its initial shape when the stress disappears), sometimes followed by a plastic deformation (the element does not return to its initial shape when the stress disappears, there remains a residual deformation), and finally rupture (the stress exceeds the intrinsic resistance of the material).
  • the mechanical resistance of the cellular or nuclear membrane, or of a tissue layer can be probed by the application of the magnetic tips according to the invention.
  • elasticity constants ranging from 10 to 1000 pN/ pm, Young's moduli of the order of 1-100 MPa or fracture threshold deformations for these surfaces of 5-50%.
  • Viscoelasticity is the property of materials that exhibit both viscous and elastic characteristics when subjected to deformation. Elastic materials deform when stressed, and quickly return to their original state once the stress is removed.
  • the behavior of a linear viscoelastic material is thus intermediate between that of an ideal elastic solid symbolized by a spring of modulus E (or G) and that of a Newtonian viscous liquid symbolized by a damper of viscosity q.
  • the elasticity of a material reflects its ability to retain and release energy after deformation.
  • the viscosity of a material reflects its ability to dissipate energy.
  • the viscoelastic properties of the cell or nuclear membrane, or of a tissue layer can be tested by applying the magnetic tips according to the invention. In particular, the precise application of surface forces, and the dynamic measurement of the resulting deformation, makes it possible to characterize the viscoelastic time scales, and the associated viscous and elastic constants.
  • Some materials can in particular exhibit elastic properties at short times and viscous at long times (Materials of the Maxwell type) or conversely they flow at short times and behave like an elastic solid at long times (Materials of the Kelvin Voigt type ).
  • the viscoelastic time scales for the biological materials considered by the invention can vary between 0.1-1000s; viscous friction constants between 100-10000 pN/pm, and elastic constants from 10 to 1000 pN/pm.
  • “Stiffness” or “stiffness” is the characteristic that indicates the resistance to elastic deformation of a body. The more an element is rigid, the more it is necessary to apply a significant force to it to obtain a given deformation. On the other hand, “flexibility” designates the property according to which a flexible material can be easily bent or bent without breaking.
  • the "mechanical strength" of a material is characterized by its elastic limit and/or its tensile strength.
  • the mechanobiological properties can in particular be evaluated by measuring the Young's modulus.
  • An element with a high Young's modulus (or modulus of elasticity) (> 50 GPa) is said to be rigid, one with a low Young's modulus is on the contrary soft, elastic or flexible.
  • the method according to the invention may also comprise a step of preparing the tip and/or the paramagnetic beads. According to one embodiment, the method according to the invention further comprises the preparation or manufacture of a tip comprising or consisting of the assembly of elements necessary and suitable for its magnetic use.
  • the manufacture of the tip mainly comprises the assembly of a magnetic core and a metal tip as described above in the "metal tip” paragraph.
  • the characteristics of the tip can be optimized according to the sample to be evaluated.
  • the magnetic tip is a magnetic clamp.
  • the method according to the invention further comprises the choice and the preparation of the superparamagnetic beads prior to their introduction into the cell, tissue, organ or embryo.
  • the targeting of magnetic particles to a specific subcellular location can be controlled by the addition of "hook" proteins as a biological coating on the surface of the particles, or beads. In most cases these proteins are biotinylated for efficient coupling with the streptavidin group present on the surface of the magnetic particles.
  • the particles are first washed in a saline solution or a buffer solution, for example phosphate buffer (PBS).
  • PBS phosphate buffer
  • the particles are then incubated in a solution containing the “hook” protein.
  • a biotinylated antibody directed against nuclear pores such as anti-NPC antibody (SantaCruz sc-58815) can be used.
  • the excess "hook" proteins are eliminated by washing in a buffer solution, for example PBS.
  • the functionalized particles are finally re-suspended in PBS at a concentration suitable for injection.
  • the concentration of functionalized paramagnetic beads is between 0.5 and 5 mg/ml in the injection solution.
  • biotinylation can be carried out, in particular by the prior use of a biotinylation kit (eg: EZ-link NHS-biotin, Sigma).
  • a biotinylation kit eg: EZ-link NHS-biotin, Sigma.
  • a second incubation with a biotinylated fluorophore for example the Atto-biotin fluorophore (Sigma) can be carried out at this stage if visualization of the particles by fluorescence microscopy is necessary.
  • the excess fluorophore is eliminated by washing in a buffer solution, for example PB S.
  • a buffer solution for example PB S.
  • the functionalized particles are finally re-suspended in PBS at a concentration suitable for injection.
  • the concentration of functionalized paramagnetic beads is between 0.5 and 5 mg/ml in the injection solution.
  • the method according to the invention further comprises a step of verifying the functionalization of the beads before injection, for example by the DLS technique.
  • a suspension of hydrophobic superparamagnetic beads is washed in a 30, 50 and then 70% ethanol solution. This solution is then dried under vacuum and resuspended in the biocompatible oil.
  • the concentration of the beads comprising a hydrophobic coating is between 2 and 20 mg/ml, preferably between 5 and 20 mg/ml in the injection solution, that is to say in the biocompatible oil. calibration
  • the method according to the invention may also comprise a method for calibrating the magnetic tip-superparamagnetic ball couple, preferably prior to testing the sample of interest.
  • This calibration can be carried out by following a protocol consisting of placing the beads in a solution of known viscosity.
  • This method thus involves the use of liquids of calibrated viscosity, such as dilute solutions of sucrose (52%, 12cp; 54% 20cP), Glycerol (68%, 15cP; 71%; 20cP, 80%, 80cP) , Methyl Cellulose 15 (2%, 15cP), or Methyl Cellulose 400 (1.18%, 39cP; 1.60%, 124cP; 2%, 400cP).
  • the diluted magnetic beads are suspended in a flux chamber on a microscope.
  • the balls are then set in motion by the approach of the magnetic tip in the solution, and the distance between the tip and the ball, as well as the speed of the ball are recorded by videomicroscopy.
  • Image analysis scripts established within the framework of this invention make it possible to extract the important parameters (distances and speeds) and thus give the value of the force according to the position and the axis of the ball by compared to the tip. For the same tip, this calibration can be carried out for different types of beads. Thus, once the calibration has been carried out, the script makes it possible to extract the value and the direction of the force automatically, during an experiment on living samples.
  • the force can be modulated by modifying the position of the magnetic tip in the case of a permanent magnet or by modifying the electrical intensity in the case of an electromagnet.
  • the method according to the invention comprises a step comprising or consisting of the introduction of superparamagnetic beads into a cell, a tissue, an organ or an embryo, in particular as described above, said beads comprising a coating making it possible to address specifically the superparamagnetic beads to a given element or compartment, or to penetrate a cell or a group of cells.
  • This step can in particular be based on the use of conventional micro-injectors, available in biology laboratories, such as 3D micro-injectors.
  • the elements to be optimized include, for example, the size of the opening of the micro-capillary, the injection pressure, the compensation pressure and the dwell time. 'injection.
  • the in vivo injection of a solution of 800nm magnetic beads at 5mg/ml is carried out with the following parameters: Capillary opening: 5 to 15 micrometers, Compensation pressure: 5 to 30 hectoPascals, Injection pressure : 15 to 90 hectoPascals, and injection duration: 100 to 500 milliseconds.
  • the addressing of beads comprising a biological coating is most often carried out by adding the magnetic particles in the medium and letting them stick to the outer cell surface.
  • the beads are introduced into the biological sample by microinjection, by a cellular transport pathway (such as cellular endocytosis), by permeabilization of the membrane of the biological sample of interest, by biolistics or by bombardment, preferably by microinjection, preferably by pneumatic or hydraulic microinjection.
  • a cellular transport pathway such as cellular endocytosis
  • permeabilization of the membrane of the biological sample of interest by biolistics or by bombardment, preferably by microinjection, preferably by pneumatic or hydraulic microinjection.
  • the CellTram4r Oil hydraulic system (Eppendorf) makes it possible to work comfortably in higher pressure ranges (>500hPa) in particular by reducing inertia during injection.
  • the hydraulic injection system can be used for experiments in multicellular samples and more particularly in non-human embryos, such as Drosophila embryos.
  • the injection of the beads into the cell is carried out by biolistics or bombardment. This technique consists in propelling the superparamagnetic beads of interest into the cells using a particle gun (for example Biolostic - Biorad PDS-1000/He).
  • the introduction of the beads into the sample of interest is carried out by the introduction of an injection needle.
  • Injection needles are preferably prepared from borosilicate glass capillaries using a drawing machine, for example the P-1000 drawing machine from Sutter Instruments.
  • the capillaries can be treated beforehand with a siliconization solution, for example Sigmacote solution from Sigma.
  • the needles have a diameter of between 1 ⁇ m and 1 mm in diameter and are particularly suited to the diameter of the beads to be injected.
  • the needles are preferably sharpened at an angle of 10° to 30° +/- 2°, preferably about 30° until an opening is obtained, for example using a beveler (EG-40, Narishige).
  • the diameter of the opening of the injection needle can be between 1 ⁇ m and 1 mm, preferably between 5 and 15 micrometers.
  • injection solution comprising the superparamagnetic beads at concentrations preferably of 0.5 to 5 mg/ml for the beads comprising the biological coating in the injection solution, preferably in phosphate buffer, and from 5 to 20 mg/ml for the beads comprising the hydrophobic coating in oil, are introduced, at the rear of the needle, just before assembly on the injection system.
  • step a) of the method according to the invention into at least one cellular compartment of the biological sample.
  • the introduction of superparamagnetic beads is carried out in a single cell of the biological sample.
  • the method according to the invention comprises a step comprising or consisting of the application of a magnetic field to said superparamagnetic beads, so as to apply a force to the biological sample.
  • This makes it possible to evaluate and/or measure mechanobiological properties of the cell element or compartment in the biological sample.
  • the magnetic tip system is compatible with different types of microscopy, making it possible to visualize the application of the magnetic tip near the beads and the displacement of the superparamagnetic beads.
  • the tissue or cell in question is imaged on an inverted or upright microscope system, and after injection or positioning of the magnetic beads, the magnetic tip is brought into the vicinity of the sample to apply a force and magnetic field.
  • the position and/or the orientation of the tip are controlled by means of a micromanipulator, for example such as a commercial 3D micromanipulator.
  • the microscopy images taken must contain the tip and the magnetic particle(s) and allow, through computer scripts, to calculate the exact force depending on the size of the particle, the distance between the magnetic tip and the beads, and of the calibration mentioned above.
  • the monitoring by videomicroscopy of the deformation of the tissue, cellular or nuclear surface, or of the movement of an organelle makes it possible to calculate in fine, the mechanobiological properties of the element studied (elastic rigidity constant, threshold failure, viscous friction, or viscoelastic time scale).
  • the distance between the magnetic tip and the biological sample is between 10 micrometers and 1 millimeter.
  • the microscope used is a wide-field fluorescent microscope or a confocal microscope.
  • the microscope can be equipped with a camera.
  • the microscope can also be controlled by Micro-Manager (Open Imaging).
  • the images are taken at room temperature (18-20°C).
  • the force applied to the cell through the magnetic tip and the superparamagnetic beads must be constant and stable for an instant t.
  • the position of the tip must thus be maintained in a stable manner close to the balls.
  • the tip is positioned between 10 and 500 ⁇ m from the cell or from the cell element or compartment of interest. According to one embodiment, the tip is positioned between 10 and 500 ⁇ m away from the surface of the superparamagnetic beads.
  • the distance between the tip and the multicellular sample is between 10 micrometers and 1 millimeter.
  • This distance can be adapted according to the size of the biological sample and the force to be applied thereto.
  • the force applied to the biological sample is between 0.001 pN and 5000 nN, between 0.001 pN and 1000 nN, between 0.001 pN and 200 nN, between 0.001 pN and 20 nN, between 0.001 nN and 5000 nN, between 0.01 nM and 1000 nN, between 0.001 nN and 200 nN, between 0.001 nN and 20 nM, between 0.1 nN and 200 nN, between 0.1 nN and 20 nN, between 0.5 nN and 200 nN, between 0.5 nN and 20 nN, between 0.5 nN and 10 nN, between 0.5 nN and 5 nN, between 1 nN and 200 nN, between 1 nNN, between 1
  • the force applied to the biological sample is between 0.001 pN and 1000 nN, preferably between 0.001 pN and 200 nN, preferably between 0.5 pN and 1.5 nN.
  • the force applied to the biological sample is between 10 nN and 1000 nN.
  • the method relates to a multicellular biological sample and makes it possible to characterize at least one cellular compartment, a cell or a group of cells.
  • the method makes it possible to characterize the at least one element or the at least one cellular compartment of the multicellular biological sample.
  • the invention relates to the use of the method according to the invention for:
  • the present invention finally relates to a kit making it possible to carry out the method according to the invention.
  • the kit comprises: a) a magnetic tip comprising a magnetic core comprising a superposition of millimetric or sub-millimetric magnets extended by a steel tip, b) superparamagnetic beads comprising a coating capable of addressing the superparamagnetic beads to a element or cellular compartment of interest or to penetrate a cell or a group of cells, c) optionally a solution allowing the suspension and the injection of the superparamagnetic beads into a cell or a cellular tissue, and d) optionally at least one calibration solution for superparamagnetic beads and magnetic tip.
  • the coating is a hydrophobic coating, preferably an octadecyl, the solution being a biocompatible oil capable of causing the superparamagnetic beads to penetrate into a cell or a group of cells.
  • the superparamagnetic beads comprise a biological coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to an element or cellular compartment of interest, the coating of the superparamagnetic beads preferably being a protein coating, preferably an antibody or a lectin, the solution being a buffer solution, preferably a phosphate buffer.
  • the kit comprises: a) a magnetic tip, preferably as described above in the "magnetic tip” paragraph, b) superparamagnetic beads suitable for the specific addressing and fixing of said superparamagnetic beads to an element or given cell compartment, preferably as described above in the “superparamagnetic beads” paragraph, c) optionally a solution allowing the functionalization of the superparamagnetic beads, for example comprising antibodies or a bait protein, d) optionally, one or more solutions intended for the calibration of the beads and of the magnetic tip, e) optionally a solution allowing the placing in suspension and the injection of the superparamagnetic beads into a cell or a cellular tissue; f) optionally, an instrument allowing the injection of the beads, preferably a microinjector or an injection needle prepared from borosilicate glass capillaries.
  • the kit comprises: a) a magnetic tip, preferably as described above in the “magnetic tip” paragraph, b) superparamagnetic beads comprising a hydrophobic coating, preferably as described above in the paragraph “superparamagnetic beads”, d) optionally, one or more solutions intended for calibrating the beads and the magnetic tip, e) an oil allowing the suspension and injection of the superparamagnetic beads into a cell or cell tissue, preferably as described in the paragraph “superparamagnetic beads”; f) optionally, an instrument allowing the injection of the beads, preferably an injection needle prepared from a glass capillary or a microinjector.
  • kits according to the invention may also comprise one or more consumables such as a culture medium or a preservation medium for the tissues or cells, or even an explanatory note.
  • the invention relates to a kit for characterizing at least one mechanobiological property of a cellular element or compartment in a biological sample
  • a magnetic tip comprising a magnetic core comprising a superposition of millimetric or sub-millimetric magnets extended with a steel point
  • superparamagnetic beads comprising a biological coating capable of specifically addressing the superparamagnetic beads to an element or cellular compartment of interest, the coating of the superparamagnetic beads preferably being a protein coating, preferably an antibody or a lectin
  • said biological sample is a cell, multicellular, a tissue, an organ, an embryo and said biological sample not being a biological sample of human embryonic origin.
  • the kit comprises: a) a magnetic tip comprising a magnetic core comprising a superposition of millimetric or sub-millimetric neodymium magnets extended by a machined steel tip with a radius of curvature between 5 and 100 micrometers, b) balls superparamagnetic beads comprising a coating making it possible to specifically address the superparamagnetic beads to a given cell element or compartment, the coating of the superparamagnetic beads being a protein coating, preferably an antibody or a lectin, c) optionally a solution allowing the suspension and the injection of the superparamagnetic beads into a cell or a cellular tissue, and d) optionally, an instrument allowing the injection of the beads, preferably an injection needle prepared from borosilicate glass capillaries.
  • the magnetic core of the tip, the length of the tip and the radius of curvature of the tip are adapted so as to make it possible to apply a force on the biological sample of between 10 nN and 1000 nN.
  • the steel tip has a length between 1 and 30 mm and/or the radius of curvature of the steel tip is between 5 and 100 micrometers.
  • the magnet of the magnetic core is in neodymium, in ticonal, in alnico, in Neodymium Iron Boron (NdFeB) or in Samarium Cobalt (SmCo), preferentially in neodymium.
  • the invention finally relates to the use of the kit as described above, for
  • the magnetic tips are composed of a magnetic core made of a superposition of sub-millimeter or millimeter neodymium magnets, whose geometry and magnetization can be modulated. This heart is extended by a machined steel tip with a radius of curvature that can range from 5-100 micrometers. Finer tips allow finer spatial precision, and wider ones a greater range of forces. To stabilize the tips against oxidation in culture media, and thus abolish the toxic effects on the cells, the tips are covered with a thin layer of gold, in particular with a thickness of 0.5 to 1 micrometer by "electro sputting". The "electrosputting" parameters are to be adapted for each tip size and each metal alloy used in order to obtain a continuous layer of gold.
  • the spikes may in particular be made of steel. Points made in this way can be stored away from dust for several years.
  • the method is compatible with all kinds of super-paramagnetic particles, presenting a range of adjustable surface chemistry, exploiting in particular avidin-biotin bonds, or sulfonation reactions of carboxyl groups.
  • the inventors tested and validated the method of the invention with ten different brands of balls, without any sign of defect or limit of the approach.
  • the choice of particles and the modification of their surface chemistry allow a very wide field of applications.
  • the targeting of magnetic particles to a specific subcellular location can be controlled by the addition of "hook" proteins (having a specific affinity to a compartment/structure) on the surface of the particles. In most cases these proteins are biotinylated for efficient coupling with the streptavidin group present on the surface of the magnetic particles.
  • the particles are washed in a solution of 1M NaCl, 1% Tween then re-suspended in PBS (Phosphate Buffer Saline). If necessary, the particles are then incubated for 15 to 60 min in a solution containing the required “hook” protein.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • a biotinylated antibody directed against the nuclear pores was used and validated (FIG. 5). Excess protein is removed by washing in PBS.
  • a second incubation with a biotinylated fluorophore (Atto-biotin, Sigma) can be carried out at this stage if visualization of the particles by fluorescence microscopy is necessary.
  • the particles are finally re- suspended in PBS at a concentration between 0.5 and 5 mg/ml. This injection solution can be used for several hours.
  • the inventors have in particular used and validated protocols using (i) 800nm beads of the NanoLink brand (Solulink), which have aggregation and bonding properties aspecific to different biological structures such as the nucleus, the centrosomes of the mitotic spindle or the surface of some cells ( Figure 3A-3B).
  • the viscous agents diluted in water having been tested and validated are: Glycerol (Sigma) 60%, viscosity 15 cP (or mPa.s), sucrose (Sigma) 65%, viscosity 15 cP; 2% methylcellulose15 (Fisherscientific); viscosity 15cP; Glycerol 65%, viscosity, 20cP; sucrose 80%, viscosity 20cP; Polyethylene glycol 8000 (Sigma), viscosity 20cP; Methylcellulose 400 2% (Fisherscientific), 400cP ( Figure 2B).
  • This step involves the use of conventional micro-injectors available in biology laboratories.
  • the elements to be optimized include the size of the opening of the injection micro-capillary, the injection pressures and duration.
  • the methods are more direct and most often consist of adding magnetic particles to the medium and letting them stick to the cell surface.
  • Injection needles are prepared from borosilicate glass capillaries (diameter 1 mm) using a drawing machine (P-1000; Sutter Instruments). The capillaries are treated beforehand with a siliconization solution (Sigmacote, Sigma). The needles are sharpened at an angle of 30° until an opening of 5-10 micrometers is obtained using a beveller (EG-40, Narishige). 2 to 3 microliters of injection solution are introduced, at the back of the needle, just before assembly on the injection system.
  • the injection of large beads (20-60 ⁇ m) into the heart tissues of the zebrafish embryo is done by incising the tissues between the sinus and the atrium and pushing the bead into the atrium at the using a needle placed on a micromanipulator under the microscope.
  • the sea urchin embryos are injected into a glass-bottomed chamber containing seawater.
  • the glass is treated beforehand with a 1% protamine solution (Sigma) to ensure sample adhesion.
  • the injection needle is controlled by a motorized micromanipulator (Injectman 4, Eppendorf) and an injection pump (FemtoJet, Eppendorf).
  • Drosophila embryos are harvested one hour maximum after spawning and dechorionated in a 50% bleach solution. They are then slightly dried and glued to a strip of glass. They are immediately covered with a drop of oxygen-permeable oil (Oil 10S Voltalef).
  • the injection is performed using a hydraulic micromanipulator (Narishige) at the anterior end of the embryo before the cellularization phase.
  • the injection pressure is checked manually using a micro-injector (CellTram, Eppendorf).
  • the glass capillaries for injection are stretched with a capillary stretcher (P-1000, Sutter Instrument) and machined with a 40° angle on a diamond wheel (EG-40, Narishige) to obtain an opening of 10 ⁇ m .
  • the injection capillaries are filled with 2 ⁇ L of oil solution and allow the injection of several cells, and are not reused.
  • the injection time defines the size of the drop formed in the cytoplasm.
  • the magnetic tip is approached to the cell and the beads inside the oil form aggregates, which initially move slowly towards the magnet while the oil droplet remains stationary. When the aggregate comes into contact with the oil-cytoplasm interface facing the tip of the magnet, the magnetic force is transmitted to the drop and moves it within the cell. Large aggregates are more suitable for the method, as they generally cannot cross the interface due to the surface tension of the oil, and the hydrophobic properties of the beads. Calibration of the force is done by measuring the size of the aggregate obtained by videomicroscopy.
  • the adult sea urchins come from the marine stations of Roscoff and Villefranche sur mer (France) and are kept for several weeks in artificial seawater aquariums maintained at 16°C. Gametes are obtained by intracoelomic injection of 0.5M KCL. The eggs are stored in seawater at 16C° for a maximum of 12 hours.sperm can be stored undiluted for 1 week at 4C°. The gangue of the eggs is removed by passing them through a mesh of 80 micrometers. Before each experiment, the sperm is activated by dilution and brought into contact with the eggs for fertilization.
  • Drosophila (Drosophila melanogastef) are maintained at 25°C in tubes containing a nutrient medium.
  • fruit flies are transferred to nests containing an agar medium supplemented with fresh yeast.
  • the nests are replaced every 30-60 minutes and the embryos are collected by rinsing the nests with water and separating the embryos from the yeast using a sieve. As the embryos are still developing, they are prepared for injection immediately.
  • Zebrafish (Danio Rerio) embryos are cultured in enriched standard medium (https://zfin.org/zf info/zfbook/chaptl/L3.html); for 2-3 days after fertilization at ⁇ 28°C and prepared for bead injection (see above). They are turned over so that the heart is facing the coverslip under a binocular, then imaged directly under a microscope fitted with magnetic tips.
  • the magnetic tip system is compatible with different types of microscopy.
  • the images shown in Figures 2A, 3A-3C, 4 and 6 were taken on a wide-field fluorescent microscope (TLEclipse; Nikon) equipped with a CMOS camera (Orca-flash4.0LT; Hamamatsu). Samples were imaged with a 20x sec objective (NA, 0.75; Apo; Nikon) and a 1.5x magnifier. The microscope is controlled by Micro-Manager (Open Imaging).
  • Figures 3B and 3C were taken on a confocal microscopy system with a “spinning” head, yokogawa XI, mounted on a Nikon Ti stand, equipped with an EM-CCD camera. The cells are imaged with a Nikon 60X 1.4 NA Plan Apo water objective. Images are taken at room temperature (18-20°C).
  • a new method for applying large forces to cell or nuclear surfaces within living tissue A new method for applying large forces to cell or nuclear surfaces within living tissue.
  • AFM Anamic Force Microscopy
  • optical tips To date, commercial methods for applying forces to living cells, such as AFM (Atomic Force Microscopy) or optical tips, remain poorly suited to deep samples, such as tissues or embryos, in particular because a limited force range (often below or around pN), and the lack of depth access to samples.
  • the applicable forces were calibrated according to different magnetic beads, for distances ranging from ten to hundred microns, corresponding to the scales associated with biological samples, from the cell single to multi-cell sets.
  • a magnetic tip is coupled to a 3D micromanipulator and immersed in a viscous liquid of known viscosity. Fluorescent magnetic beads are put in solution, and image sequences (movies) are recorded to measure the speed of the particles as a function of their distance from the magnetic tip ( Figure 2A). Different media with different viscosity values, allow to extend the calibration range on distances of up to several hundred microns ( Figure 2B).
  • One of the first applications of the method according to the invention is to probe the mechanical properties of the surface of the nucleus, within a living cell.
  • This deep force application is completely incompatible with the commercially available methods mentioned above.
  • This quantitative information is however very valuable, because the properties of the nucleus have been suggested as markers of many processes such as cell differentiation, which are strongly deregulated in cancer cells (Kirby and Lammerding, 2018). Nevertheless, measuring these properties within a living cell is a difficult task and has never been reported in the literature. To validate this approach, a protocol was established to attach to the surface of magnetic beads antibodies against nuclear pores, proteins that are highly conserved in eukaryotes.
  • a second application of the method is in the calculation of cell surface stiffness.
  • the cell surface is bounded by the plasma membrane which contains underneath a cortex made of actin and myosin which is important for surface integrity.
  • the properties of this cortex are also essential for processes such as migration or cell division which can be deregulated in tumor and metastatic cells, for example.
  • the mechanical properties of the cortex thus constitute a target of study of fundamental mechanobiology and applied to medicine. These properties remain difficult to measure precisely, especially in deep tissues.
  • forces can be directly applied to deform the cortex and measure its viscoelastic properties.
  • a stiffness of 16.7 pN/pm and an effective viscosity of 1008.5 pN/pm of the cell membrane are measured.
  • Another important application of the magnetic tip system is to be able to probe forces within tissues at depths of the order of a hundred micrometers.
  • This aspect is essential, because modern models for studying diseases (e.g. organoids, embryoids, cancerous spheroids) are 3D models with size scales of hundreds of microns, where the need to probe the properties of tissues in depth is important.
  • the inventors here demonstrate the possibility of injecting large magnetic beads into the lumen of the cardiac tissues of a vertebrate model embryo (zebrafish). These balls make it possible to apply tension forces of the order of several tens of nN. When the balls are moved by the magnetic tip, they compress the fabric and also deform it.
  • the inventors here present a simple, versatile and robust method for applying magnetic forces suitable for large samples such as tissues or embryos.
  • the first advantage of this method compared to current commercial methods, is that it is a priori compatible with all types of microscopes and micromanipulators available in standard research and development laboratories.
  • the second advantage is that it covers a range of forces and distances much greater than other approaches, spanning 5-6 orders of magnitude, and with working distances of up to several hundred micrometers. This point gives a uniqueness to the approach presented here, as it opens access to measurements in the volume of deep samples such as developing embryos, tissue explants and organoids which serve as new standards in biomedical research. (Simian and Bissell, 2017).
  • the inventors demonstrate a series of potential applications for measuring and studying the surface mechanics of a cell nucleus, an individual cell and that of a tissue. This versatility is made possible by the use of different magnetic particles of different sizes, and by modulations of their surface covering. These methods provide quantifications within living cells or tissues, which cannot be obtained by commercially available methods.
  • the simplicity and versatility of the system promises its application in therapeutic screening or routine diagnosis. For example, in the context of therapeutic screenings, it is possible to directly measure the effect of a compound or a drug on the mechanobiology of a living cell sample. To conclude, this measurement method, given its range of applicability, its flexibility and its simplicity, could be used routinely both to study the fundamentals of mechanobiology and for the development of standard diagnostic methods for medicine.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode pour caractériser des propriétés mécanobiologiques d'un élément ou compartiment cellulaire, ladite méthode reposant sur l'utilisation d'une pointe magnétique et de billes superparamagnétiques.

Description

DESCRIPTION
TITRE : Méthode d’évaluation des propriétés mécanobiologiques d’un élément cellulaire
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte au domaine de la biologie, en particulier de la mécanobiologie, et concerne plus particulièrement une méthode de caractérisation des propriétés mécanobiologiques d’une cellule ou de l’un de ses éléments ou compartiments.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE
La mécanobiologie est un domaine de recherche émergeant visant à comprendre comment la mécanique des organites cellulaires, des cellules, des tissus, et/ou de leur environnement influence la physiologie des organismes. Un des socles de ce domaine de recherche et de ses applications biomédicales est de pouvoir mesurer et appliquer de manière précise des forces mécaniques à la surface des organites et des cellules dans des environnements tissulaires complexes.
Les forces mécaniques au sein et autour des cellules peuvent influencer des processus clés comme la différentiation, la division ou encore la migration cellulaire (Engler et al., 2006; Ladoux and Mège, 2017). De manière importante, de nombreuses maladies comme le cancer, les maladies cardiovasculaires, les maladies génétiques et malformations développementales, sont typiquement associées à des changements drastiques de propriétés mécaniques des cellules et tissus (Carey et al., 2012; Makale, 2007; Murthy et al., 2017) . Au sein des cellules, le noyau possède aussi une forme et une rigidité de surface, essentiel à l’intégrité de l’enveloppe nucléaire et à la préservation de l’information génétique. Ainsi, la forme, la taille et la mécanique du noyau sont très souvent utilisées comme marqueurs de la progression de cancer (Jevtic and Levy, 2014).
Ces découvertes récentes ont conduit au développement d’une nouvelle discipline pluridisciplinaire, la mécanobiologie, à l’interface entre l’ingénierie, la biologie et la médecine, qui consiste à étudier la régulation et le rôle des forces nucléaires, cellulaires et tissulaires pour caractériser le comportement des systèmes vivants et leur dérégulation dans différentes maladies (Lim et al., 2010). La mécanobiologie implique l’application et la mesure de forces sur les cellules et/ou tissus vivants (Roca-Cusachs et al., 2017). A ce jour, deux méthodes commerciales sont disponibles : (i) les pinces optiques et (ii) la microscopie par force atomique. La méthode de pinces optiques est une méthode proposée pour appliquer des forces ou sonder les propriétés mécaniques de la surface ou de l’intérieur des cellules. Cette méthode possède une gamme de forces typiquement comprise entre 0,01 pN et 10 pN, et s’applique à des problématiques moléculaires (moteurs ou filaments biologiques uniques). Elle est en revanche inadaptée à des mesures en volume, puisque la force devient trop faible dès que l’on s’éloigne du plan focal du laser, et sa gamme de forces ne correspond pas aux forces typiques cellulaires et tissulaires (10-1000 pN). Cette méthode nécessite par ailleurs l’utilisation de laser infrarouge coûteux et dont l’alignement doit systématiquement être calibré, impliquant souvent des protocoles longs et dépendant de l’utilisateur.
La méthode de microscopie par force atomique (AFM) consiste à indenter, à l’aide d’une pointe couplée à un déflecteur calibré, la surface de cellules ou tissus pour en mesurer par exemple la rigidité. Elle ne peut pas être appliquée à des mesures au sein du volume des cellules ou tissus, et créé des dommages conséquents sur les cellules, notamment dans les gammes de forces intéressantes pour étudier la mécanobiologie d’une cellule. Elle est donc limitée dans sa compatibilité avec des échantillons vivants. Elle est aussi associée à un montage complexe, nécessitant des calibrations précises et souvent débattues dans les communautés (différents modèles d’interprétation des courbes distances-forces).
Ainsi, les méthodes disponibles à ce jour sont largement limitées à l’application de forces sur échantillons fins, et la gamme de forces utilisable dans ces techniques reste limitée à quelques piconewton (pN) au maximum sur des échantillons vivants. Elles sont par ailleurs coûteuses et difficiles à implémenter en routine, et peu compatibles avec l’imagerie dynamique.
Ainsi, il existe un besoin de développer de nouvelles stratégies permettant d’étudier et de caractériser les propriétés mécanobiologiques cellulaires, et notamment de mettre à disposition une méthode permettant d’apporter des informations précises sur la biomécanique cellulaire et tissulaire et pouvant s’utiliser dans une gamme d’applications large.
RESUME DE L’INVENTION
L’invention a pour but de pallier au manque de méthodes robustes, versatiles et précises d’application et de mesures de forces dans des échantillons biologiques. Les inventeurs proposent ici une méthode fondée sur l’utilisation de pointes magnétiques adaptées à la mécanique de surface tissulaire, cellulaire et nucléaire, permettant d’appliquer des forces dans des gammes allant du pN jusqu’au nN, et ce au sein de tissus profonds ou d’embryons multicellulaires non humains en développement. Cette méthode s’appuie sur des micro-pointes aimantées qui appliquent des forces magnétiques sur des microparticules paramagnétiques fonctionnalisées pour se lier spécifiquement à des éléments et/ou compartiments cellulaires. Cette approche permet notamment des applications localisées de forces : (i) au sein des cellules, pour des applications par exemple pour l’étude de la mécanique du noyau (ii) à la surface d’une cellule unique ou au sein de tissus ou embryons multicellulaires de grandes tailles (iii) avec une gamme de forces surpassant de 2-3 ordres de grandeurs la gamme des méthodes commerciales courantes comme les pinces optiques et la microscopie par force atomique et/ou (iv) avec une compatibilité optimale avec les cellules et tissus vivants. Les inventeurs démontrent ici la versatilité, la robustesse et l’applicabilité de la méthode selon l’invention au sein de cellules et tissus invertébrés et vertébrés, dans le cadre d’une déformation du noyau au sein d’une cellule vivante, d’application de force de surface sur cellules uniques ainsi qu’au sein de la lumière de larges ensembles multicellulaires.
La méthode a été validée dans plusieurs types cellulaires et différents embryons multicellulaires en développement. Ceux-ci incluent des embryons d’échinodermes (oursins), d’insectes (drosophiles), de vertébrés (Poisson zèbre) et des cellules mammifères en culture.
Les deux principales techniques concurrentes pour sonder la mécanique de cellules et tissus sont les pinces optiques, et la microscopie par force atomique. Par rapport à l’invention, ces méthodes sont : (i) limitées à des mesures en surface d’échantillons fins (cellules adhérentes ou monocouches), (ii) limitées à une gamme de forces faible, peu compatible avec les forces nécessaires à l’étude de la plupart des cellules et tissus, (iii) invasives, et donc peu compatibles avec la physiologie et l’imagerie de cellules vivantes sur de longues périodes, (iv) très difficiles d’implémentation et (v) beaucoup plus coûteuses.
L’invention se démarque des autres méthodes de mesure et d’application de forces, par sa versatilité en termes d’applications pour étudier des propriétés mécanobiologiques concernant les organites cellulaires, les propriétés du cytoplasme cellulaire, les forces de surface, et ce, au sein de cellules uniques ou de cellules insérées dans un tissus complexe et profond. En outre, cette approche est entièrement compatible avec des échantillons vivants et avec le développement et la prolifération de cellules et tissus vivants, et permet une gamme de force bien plus large que les méthodes de pinces optiques.
Au-delà des informations sur la physiologie de nombreux tissus et embryons, la versatilité et la simplicité d’implémentation de la méthode, promet une application dans des contextes de recherches industrielles biomédicales. Par exemple l’invention pourra servir de standard pour une classification rapide et précise des propriétés mécaniques de tissus dans des contextes de diagnostic de maladies, pour établir des essais rapides pour cribler les réponses mécanobiologiques d’organes et de tissus sains et malades, pour établir des signatures mécaniques utiles dans le diagnostic de tissus malsains dans le domaine de la santé, ou pour développer des criblages chimiques spécifiquement liés à la mécanobiologie tissulaire, en particulier pour évaluer l’effet de médicaments ou de petites molécules sur des réponses mécanobiologiques (rigidité d’un tissu ou d’une cellule saine ou tumorale, propriétés structurales du noyau, etc.).
L’invention a pour objet une méthode in vitro ou ex vivo pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’au moins un élément, d’au moins un compartiment cellulaire, d’au moins une cellule ou d’au moins un groupe de cellules dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant : a) l’introduction de billes superparamagnétiques dans l’échantillon biologique, lesdites billes comprenant un revêtement apte à adresser les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt ou à pénétrer une cellule ou un groupe de cellules, b) l’application d’un champ magnétique sur lesdites billes superparamagnétiques de manière à appliquer une force sur l’échantillon biologique, c) la mesure d’au moins une propriété mécanobiologique de l’élément ou compartiment cellulaire dans l’échantillon biologique,
- ledit échantillon biologique étant une cellule ou un échantillon biologique multicellulaire, et
- le champ magnétique étant appliqué par une pointe magnétique, ladite pointe magnétique comprenant au moins un aimant millimétrique ou submillimétrique prolongé par une pointe métallique.
Selon un aspect, le revêtement est un revêtement hydrophobe. En particulier, les billes superparamagnétiques comprenant un revêtement hydrophobe sont mélangées à une huile biocompatible apte à faire pénétrer les billes superparamagnétiques dans une cellule ou un groupe de cellules, avant d’être introduites dans l’échantillon biologique.
Selon un aspect, le revêtement est un revêtement biologique apte à adresser de manière spécifique les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, une cellule ou un groupe de cellules. En particulier, les billes superparamagnétiques comprenant un revêtement biologique sont mélangées à une solution, de préférence une solution tampon avant d’être introduites dans l’échantillon biologique.
De préférence, ledit échantillon biologique est un échantillon biologique multicellulaire choisi parmi : un tissu, un organe ou un embryon, ledit échantillon biologique n’étant pas d’origine embryonnaire humain. En particulier, l’élément ou compartiment cellulaire est choisi parmi : la membrane cellulaire, l’enveloppe nucléaire, la membrane d’un organite, tel que la mitochondrie, le réticulum endoplasmique ou l’appareil de golgi, les lysosomes, les peroxysomes ainsi que leur contenu, tel que le cytoplasme, les microtubules et/ou les centrioles, les centrosomes ou le fuseau mitotique, de préférence la membrane cellulaire ou l’enveloppe nucléaire. En particulier, l’élément ou compartiment cellulaire est la membrane cellulaire interne ou externe d’au moins une cellule de l’échantillon biologique.
Selon un aspect, la force appliquée sur l’échantillon biologique est comprise entre 0,001 pN et 5000 nN, entre 0,001 pN et 1000 nN, entre 0,001 pN et 20 nN, entre 0,001 nN et 5000 nN, entre 0,01 nM et 1000 nN, entre 0,001 pN et 20 nN, ou entre 10 nN et 1000 nN, de préférence entre 0,001 pN et 100 nN, préférentiellement entre 0,5 pN et 1,5 nN.
De préférence, la distance entre la pointe magnétique et l’échantillon biologique est comprise entre 10 micromètres et 1 millimètre.
La pointe métallique est en particulier usinée avec un rayon de courbure compris entre 5 et 100 micromètres, préférentiellement entre 5 et 50 micromètres. La pointe métallique a de préférence une longueur comprise entre 1 et 30 millimètres, plus particulièrement entre 10 et 20 millimètres.
Selon un aspect, la méthode comprend en outre (i) une étape préalable dans laquelle le revêtement biologique des billes est sélectionné en fonction de l’élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, (ii) une étape préalable de préparation de la pointe et/ou des billes superparamagnétiques et/ou (iii) une étape de calibration de la pointe et des billes.
Selon un autre aspect, la méthode comprend en outre (i) une étape préalable de préparation de la pointe et/ou des billes superparamagnétiques, (ii) une étape préalable dans laquelle des billes superparamagnétiques comprenant le revêtement hydrophobe sont mélangées à une huile biocompatible, et/ou (iii) une étape de calibration de la pointe et des billes.
De préférence, les propriétés mécanobiologiques sont choisies parmi : la rhéologie, la cinématique, la résistance mécanique, l’élasticité, la rigidité, la plasticité et les propriétés visco- élastiques, et toutes combinaisons de celles-ci. Selon un aspect, le revêtement des billes superparamagnétiques est un revêtement hydrophobe choisi parmi le butyl, le methyl, l’ethyl, l’octyl, le prolpyl, ou l’octadecyl, de préférence l’octadecyl. De préférence, l’huile biocompatible est choisie parmi une huile de Soja, une huile de Lin, une huile de type Alcanes (C15-C40) et une huile fluorocarbonée.
Selon un autre aspect, le revêtement biologique des billes superparamagnétiques est un revêtement protéique, comprenant au moins une protéine appât apte à reconnaitre une protéine proie sur l’élément ou compartiment cellulaire d’intérêt. De préférence, le revêtement biologique des billes superparamagnétiques est un anticorps ou une lectine. Préférentiellement, le revêtement biologique des billes superparamagnétiques est un anticorps choisi parmi un anticorps anti Sodium Potassium ATPase, anti PMCA1, anti Pan Cadherin, anti E Cadherin, anti N Cadherin, anti ADAM22, anti LRP4, anti Fas (APO-1, CD95), anti CD27, anti EGFR, anti NPC et anti NUP98. La solution pour mettre en suspension ces billes est de préférence une solution tampon, de préférence un tampon phosphate.
De préférence, les billes superparamagnétiques ont une taille comprise entre 100 nm et 100 pm, de préférence entre 100 nm et 50 pm, préférentiellement entre 100 nm et 1 pm.
Selon un aspect, les billes superparamagnétiques comprennent un revêtement biologique et dans l’étape a) de la méthode selon l’invention, les billes superparamagnétiques sont injectées dans un compartiment cellulaire de l’échantillon biologique.
En particulier, les billes superparamagnétiques sont introduites par microinjection, biolistique ou bombardement, de préférence par microinjection, préférentiellement par microinjection pneumatique ou hydraulique.
L’échantillon biologique peut être préalablement obtenu par échantillonnage. L’échantillon biologique peut être vivant et/ou non fixé.
Les méthodes selon l’invention permettent notamment de (i) caractériser l’impact d’une drogue ou d’un médicament sur un échantillon biologique, et/ou (ii) identifier des cellules tumorales dans un échantillon biologique.
En particulier, les méthodes selon l’invention permettent de (i) caractériser l’impact d’une drogue ou d’un médicament sur une cellule, un tissu, un organe ou un embryon ou de l’un de ses éléments ou compartiments, et/ou (ii) identifier et caractériser des cellules ou tissus endommagés et/ou (iii) identifier et caractériser des cellules tumorales dans un échantillon, lesdites cellules tumorales présentant des caractéristiques mécanobiologiques différentes des cellules normales, et/ou (iv) étudier l’interaction mécanique des cellules entre elles ou avec la matrice qui les entoure et/ou (v) étudier la mécanotransduction d’au moins une cellule.
L’invention a également pour objet un kit comprenant : a) une pointe magnétique comprenant un cœur magnétique comprenant une superposition d’aimants millimétriques ou submillimétriques prolongé par une pointe d’acier, b) des billes superparamagnétiques comprenant un revêtement apte à adresser les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt ou à pénétrer une cellule ou un groupe de cellules, c) optionnellement une solution permettant la mise en suspension et l’injection des billes superparamagnétiques dans une cellule ou un tissu cellulaire, et d) optionnellement au moins une solution de calibration des billes superparamagnétiques et de la pointe magnétique.
Ce qui peut être notamment utilisé pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’au moins un élément, d’au moins un compartiment cellulaire, d’au moins une cellule ou d’au moins un groupe de cellules dans un échantillon biologique,
Dans ce kit, le revêtement peut être un revêtement hydrophobe, de préférence un octadecyl, et la solution étant une huile biocompatible apte à faire pénétrer les billes superparamagnétiques dans une cellule ou un groupe de cellules. Alternativement ou additionnellement, le kit peut comprendre des billes superparamagnétiques comprenant un revêtement biologique apte à adresser spécifiquement les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, le revêtement des billes superparamagnétiques étant de préférence un revêtement protéique, préférentiellement un anticorps ou une lectine, la solution étant une solution tampon, de préférence un tampon phosphate.
Dans le kit selon l’invention, l’extrémité de la pointe d’acier est usinée avec un rayon de courbure compris entre 5 et 100 micromètres. Le rayon de courbure de la pointe d’acier est de préférence configuré pour appliquer un gradient magnétique uniaxial sur l’échantillon biologique. En particulier, le cœur magnétique et l’extrémité de la pointe d’acier sont configurés de façon à permettre d’appliquer une force sur l’échantillon biologique comprise entre 10 nN et 1000 nN, pour une distance entre la pointe magnétique et l’échantillon biologique comprise entre 10 micromètres et 1 millimètre. De préférence, la pointe d’acier a une longueur comprise entre 1 et 30 mm. Selon un aspect, l’aimant du cœur magnétique est en néodyme, en ticonal, en alnico, en Neodyme Fer Bore (NdFeB) ou en Samarium Cobalt (SmCo), de préférence en néodyme.
Selon un aspect, la pointe d’acier est recouverte d’une couche d’or.
Le kit selon l’invention peut comprendre en outre un microinjecteur.
L’invention concerne également l’utilisation du kit selon l’invention, pour (i) caractériser l’impact d’une drogue ou d’un médicament sur un échantillon biologique, en particulier une cellule, un tissu, un organe ou un embryon non humain ou de l’un de ses éléments ou compartiments, et/ou (ii) identifier et caractériser des cellules ou tissus endommagés et/ou (iii) identifier et caractériser des cellules tumorales dans un échantillon, lesdites cellules tumorales présentant en particulier des caractéristiques mécanobiologiques différentes des cellules normales, et/ou (iv) étudier l’interaction mécanique des cellules entre elles ou avec la matrice qui les entoure et/ou (v) étudier la mécanotransduction d’au moins une cellule.
En particulier, l’utilisation du kit permet de (i) - déterminer les propriétés mécaniques de la surface du noyau, au sein d’une cellule vivante, telle que l’élasticité de l’enveloppe nucléaire ; (ii) déterminer la rigidité de la surface cellulaire, telle que les propriétés viscoélastiques du cortex ; (iii) appliquer des forces au sein de tissus à des profondeurs de l’ordre de la centaine de micromètres, et mesurer par exemple des constantes mécaniques telles que des constantes mécaniques de rigidité de compression et d’élasticité de surface ; et/ou (iv) réaliser des mesures dans un volume d’échantillons profonds comme les embryons en développement, les expiants de tissus et les organoïdes.
L’invention a également pour objet une méthode in vitro ou ex vivo pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’au moins un élément, d’au moins un compartiment cellulaire, d’au moins une cellule ou d’au moins un groupe de cellules dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant : a) l’introduction de billes superparamagnétiques dans l’échantillon biologique lesdites billes comprenant un revêtement apte à adresser de manière spécifique les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, b) l’application d’un champ magnétique sur lesdites billes superparamagnétiques de manière à appliquer une force sur l’échantillon biologique, c) la mesure d’au moins une propriété mécanobiologique de l’élément ou compartiment cellulaire dans l’échantillon biologique, caractérisée en ce que ledit échantillon biologique est une cellule, un tissu ou un embryon multicellulaire, un organe, et ledit échantillon biologique n’étant pas un échantillon biologique d’origine embryonnaire humain
- le champ magnétique est appliqué par une pointe magnétique, ladite pointe magnétique comprenant au moins un aimant millimétrique ou submillimétrique prolongé par une pointe métallique.
L’invention a également pour objet une méthode, de préférence in vitro ou ex vivo, pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’un élément ou compartiment cellulaire dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant : a) l’introduction de billes superparamagnétiques dans l’échantillon biologique lesdites billes comprenant un revêtement biologique apte à adresser de manière spécifique les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, b) l’application d’un champ magnétique sur lesdites billes superparamagnétiques de manière à appliquer une force sur l’échantillon biologique, c) la mesure d’au moins une propriété mécanobiologique de l’élément ou compartiment cellulaire dans l’échantillon biologique.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1 représente le principe de pointe magnétique pour l’application de force à la surface du noyau, de cellules uniques et de tissus multicellulaires. A. Schéma présentant le dispositif de pointe magnétique : un aimant permanent prolongé d’une pointe métallique est monté sur un micromanipulateur 3D. La pointe est approchée d’un échantillon vivant placé dans un milieu de culture et observé au microscope. B. Exemple schématique d’application de force sur une culture cellulaire contenant des particules magnétiques spécifiquement adressées à la membrane plasmique ou à l’enveloppe nucléaire. C. Exemple schématique d’application de forces sur un tissu contenant des particules magnétiques associées à la membrane plasmique ou piégées dans la lumière de l’épithélium.
Figure 2 représente la calibration des forces magnétiques appliquées.
Fig 2A Les billes magnétiques placées dans un milieu visqueux se déplacent vers la pointe et leur vitesse instantanée (représentée avec un gradient de gris) permet de calibrer la force en fonction de la distance avec la pointe magnétique. Fig 2B Force magnétique créée par la pointe sur des particules magnétiques (1pm de diamètre) dans des milieux de viscosités différentes (viscosité indiquée dans la légende). La modulation de la viscosité permet d’établir de manière plus précise la force sur une gamme de distances plus grande.
Figure 3 représente l’application de forces au sein de cellules et d’embryons et effet(s) sur la division cellulaire et le développement.
Fig 3 A Déplacement de particules magnétiques au sein d’une cellule vivante d’oursin.
Fig 3B Déplacement de billes magnétiques au sein d’un embryon de drosophile.
Fig 3C Divisions successives de cellules d’oursins injectées avec des billes fluorescentes.
Fig 3D Application de forces à la surface de cellule épithéliale unique au sein d’un tissu embryonnaire de Drosophile injecté avec des billes magnétiques.
Figure 4 représente la mesure de la rigidité du noyau au sein d’une cellule intacte. Des billes magnétiques couvertes d’anticorps dirigés contre les protéines de surfaces du noyau (anti- NPC), injectées au sein d’une cellule vivante d’oursin, se lient spécifiquement à la surface nucléaire et permettent de tirer et de déformer le noyau. La déformation et la valeur de la force appliquée permettent de calculer la rigidité de la surface nucléaire.
Figure 5 représente la mesure de la rigidité de la surface d’une cellule unique. Des billes magnétiques ont été injectées dans un embryon d’oursin au stade 1 de de développement. La présence de l’aimant provoque l’agrégation des billes magnétiques et la déformation de la membrane cellulaire. La déformation et la valeur de la force appliquée (ici ~ 660pN) permettent de calculer la rigidité de la surface cellulaire.
Figure 6 représente la mesure des propriétés mécaniques d’un tissu au sein d’un système multicellulaire 3D. Une large bille magnétique injectée au sein de l’endocardium du cœur d’un poisson zèbre vivant permet d’appliquer des forces calibrées sur les tissus de surface et de calculer la rigidité de compression et de déformation des tissus.
Figures 7A et B représentent des exemples de pointes magnétiques selon l’invention.
Figure 8 illustre une méthode pour déplacer de larges gouttes d’huile dans le cytoplasme d’une cellule pour sonder les propriétés mécanobiologiques du cytoplasme. A. Schéma ou les billes hydrophobes sont placées dans une goutte d’huile injectées dans le cytoplasme. B. Calibration de la force appliquée à la goutte d’huile en fonction de la taille de l’agrégat. C. Exemple d’expérience où la goutte d’huile est déplacée par l’application d’une force (zone rouge) puis retourne vers sa position d’origine lorsque la force est relâchée, de part les propriétés visco- élastiques du cytoplasme d’une cellule zygote d’oursin.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
La méthode selon l’invention s’appuie sur l’utilisation de billes superparamagnétiques et de pointes magnétiques pour évaluer les caractéristiques mécanobiologiques d’au moins une cellule, d’un élément, ou d’un compartiment de celle-ci. Notamment, la méthode selon l’invention permet d’évaluer au moins une propriété mécanobiologie d’au moins un élément, d’au moins un compartiment cellulaire, d’au moins une cellule ou d’au moins un groupe de cellules dans un échantillon biologique. Ces différents éléments sont plus particulièrement décrits ci-après.
Billes superparamagnétiques
La méthode selon l’invention est compatible avec toutes sortes de particules ou billes superparamagnétiques. Il en existe commercialement un grand nombre, présentant une gamme de chimie de surface modulable. Les inventeurs ont testé et validé la méthode selon l’invention avec une dizaine de billes de marques différentes, sans aucun signe de défaut ou de limite de l’approche.
Tel qu’utilisé ici, le terme « paramagnétisme » concerne le comportement d'un matériau qui ne possède pas d'aimantation spontanée mais qui, sous l'effet d'un champ magnétique extérieur, acquiert une aimantation orientée dans le même sens que le champ magnétique appliqué, par exemple un champ tel qu’appliqué par une pointe magnétique. Un matériau paramagnétique possède une susceptibilité magnétique de valeur positive. L’aimantation de ces matériaux peut également se renverser spontanément sous l’influence de la température, notamment à la température de Curie du matériau. Une interaction d’échange entre les moments magnétiques existe qui, en dessous d’une certaine température, conduit à un ordre magnétique (ferromagnétique, ferrimagnétique ou antiferromagnétique). Au-dessus de cette température, les moments fluctuent et ces matériaux se caractérisent par une susceptibilité magnétique scalaire positive de Tordre de 10’5 à 10’3. Par « supraparamagnétisme » ou « superparamagnétisme » est entendu un comportement des matériaux paramagnétiques de dimensions micrométriques ou nanométriques.
Selon un mode de réalisation particulier, les billes superparamagnétiques sont constituées de cœurs d’oxydes de fer tel que de la magnétite, de taille micrométrique ou nanométrique, et généralement enrobés dans une enveloppe de polymère. Le moment magnétique des billes dépend du nombre de cœurs ou domaines magnétiques. Les billes constituées par un grand nombre de domaines ont un fort moment magnétique et sont donc facilement attirées par un aimant permanent. Comme elles sont superparamagnétiques, les billes acquièrent rapidement une aimantation sous l’effet d’un champ magnétique. Cette aimantation disparaît immédiatement avec la suppression du champ.
De telles billes sont notamment commercialisée par Invitrogen (Dynabeads ™ MyOne ™ Streptavidin Cl), Chemicell (nano-screenMAG-Streptavidin), Promega (High Capacity Magne ® Streptavidin Beads), Nvigen (MyQuVigen™ - Streptavidin) et Solulink (NanoLink™ Streptavidin Magnetic Beads).
Selon un mode de réalisation, le cœur superparamagnétique des billes est inclus dans une couche de polymère (par exemple des polysaccharides) fonctionnalisé avec un domaine de liaison (par exemple de la streptavidine). Ce domaine de liaison est utilisé pour la fixation du revêtement qui va assurer l’adressage des billes à un élément ou compartiment cellulaire particulier.
L’« adressage » est entendu ici comme un mécanisme permettant le transport des billes superparamagnétiques vers leur destination intra ou extracellulaire d’intérêt. Par exemple, lorsque les billes ont un revêtement constitué par des anticorps anti-cadhérine, une protéine de la membrane plasmique, les billes sont adressées (i.e. transportées/localisées puis fixées) au niveau de la membrane plasmique après leur injection.
Par « revêtement » est entendu ici une couche déposée à la surface d'un matériau, ici une bille superparamagnétique, pour lui conférer des propriétés particulières. Notamment, le revêtement présent à la surface des billes paramagnétiques permet l’adressage spécifique des billes à un compartiment ou élément cellulaire et éventuellement leur fixation sur celui-ci. Le revêtement peut notamment être un revêtement biologique, tel qu’un revêtement protéique, peptidique ou lipidique ou un revêtement hydrophobe.
Selon un aspect, le revêtement est un revêtement hydrophobe, en particulier choisi parmi des longues chaînes carbonées comme le Butyl, le Methyl, l’Ethyl, l’Octyl, le Prolpyl, ou l’Octadecyl.
De préférence, le revêtement hydrophobe est composé de chaines de carbone de type Octadecyl.
De préférence, lorsque les billes superparamagnétiques comprennent un revêtement hydrophobe, les billes sont mélangées à une huile pour être injectées dans le cytoplasme des cellules de l’échantillon biologique. Les huiles utilisables peuvent être organiques ou minérales et sont de préférence biocompatibles. Par exemple, les huiles peuvent être choisies parmi une huile de Soja, une huile de Lin, une huile de type Alcanes (C15-C40), ou une huile fluorocarbonée.
Selon un autre aspect, les billes comprennent un revêtement biologique et sont conformées pour être fixées au niveau de la face interne de l’échantillon biologique, au niveau de l’enveloppe du noyau d’une cellule de l’échantillon biologique, au niveau du fuseau mitotique et/ou au niveau du centrosome de l’échantillon biologique. De préférence, les billes sont préparées de manière à permettre leur fixation au niveau du centrosome de l’échantillon biologique.
De préférence, le compartiment ou élément cellulaire est choisi parmi : la membrane cellulaire, la membrane nucléaire, la membrane d’un organite, tel que la mitochondrie, le réticulum endoplasmique ou l’appareil de golgi, les lysosomes, les peroxy somes ainsi que leur contenu, tel que le cytoplasme, les microtubules et/ou les centrioles.
De préférence, le revêtement présent à la surface des billes est un revêtement biologique qui permet leur adressage et leur fixation à la membrane cellulaire ou à la membrane nucléaire, ou à d’autres organites cellulaires.
De préférence, la fixation des billes à un compartiment ou élément cellulaire est réalisée par liaison non-covalente, notamment une liaison de type protéine -protéine, en particulier de type protéine appât- protéine proie, ou de type anticorps-antigène.
Par « protéine proie » est entendu ici une protéine cellulaire d’intérêt, que l’homme du métier souhaiterait cibler pour évaluer des caractéristiques mécanobiologiques d’une cellule, d’un compartiment ou élément de celle-ci.
Par « protéine appât » ou « protéine hameçon » est entendu ici une protéine capable de reconnaître, d’interagir et de se lier à la protéine proie, en particulier ayant une affinité spécifique à un compartiment/structure cellulaire.
L’homme du métier sait identifier des couples protéine appât- protéine proie d’intérêt. Par exemple, pour adresser spécifiquement les billes superparamagnétiques à la membrane nucléaire, une protéine proie peut être une protéine constituant les pores nucléaires et la protéine appât un anticorps reconnaissant spécifiquement cette protéine des pores nucléaires.
Selon un mode de réalisation, le revêtement des billes superparamagnétiques est un revêtement protéique, de préférence un anticorps, un peptide ou une lectine. Des billes magnétiques fonctionnalisées avec des protéines telles que des anticorps sont disponibles commercialement. Alternativement, des méthodes et kits de fonctionnalisation sont disponibles afin de recouvrir les billes d’un composé d’intérêt. Ces méthodes et kits sont bien connus de l’homme du métier. Par exemple, la réaction entre les groupes ester sulfonique et acide carboxylique permet de créer des liaisons covalentes entre les billes et le composé d’intérêt, tandis que les billes-streptavidine sont fonctionnalisées via l’interaction biotine- streptavidine par des anticorps ou autres protéines préalablement couplés de façon covalente à de la biotine.
Pour les anticorps n’étant pas disponibles en version biotinylée, leur biotinylisation préalable est possible, notamment via l’utilisation de méthode et de kit de biotinylation, par exemple le kit EZ-link NHS-biotin commercialisé par Sigma.
Selon un mode de réalisation, le revêtement des billes super-paramagnétiques est un anticorps, de préférence choisi parmi un anticorps anti Sodium Potassium ATPase, anti PMCA1, anti Pan Cadherin, anti E Cadherin, anti N Cadherin, anti ADAM22, anti LRP4, anti Fas (APO-1, CD95), anti CD27, anti EGFR, anti NPC et anti NUP98.
De manière préférée, les protéines « hameçons » utilisées pour adresser spécifiquement les particules à la membrane plasmique ou l’enveloppe nucléaire sont choisies parmi le tableau suivant :
[Table 1]
De préférence, les billes superparamagnétiques ont une taille comprise entre 100 nm et 100 pm, de préférence entre 100 nm et 50 pm, préférentiellement entre 100 nm et 1 pm.
La taille des billes ainsi que leur revêtement sont choisis selon l’utilisation envisagée, en tenant compte de l’élément, du compartiment cellulaire, de la cellule ou de l’ensemble de cellules visé.
Selon un mode de réalisation particulier, les billes utilisées sont choisies parmi :
(i) des billes de 800 nm, en particulier couvertes de streptavidine, présentant des propriétés d’agrégation et de collages aspécifiques à différentes structures biologiques comme le noyau, les centrosomes du fuseau mitotique ou la surface de certaines cellules. (ii) des billes de 100 nm couvertes de streptavidine ne présentant pas d’interactions spécifiques avec les structures cellulaires utilisées pour la calibration et les expériences contrôles.
(iii) des billes magnétiques de 200 nm incluant une couche fluorescente de type « quantum dots » recouverts par des moteurs moléculaires purifiés (dynéines), permettant en particulier un adressage plus précis à certaines structures intracellulaires. (iv) des billes passivées à la BSA Bovine Serum Albumin) de Ipm de diamètre, permettant en particulier un déplacement inerte dans le cytoplasme des cellules. (v) des billes de 30-50 pm, en particulier couvertes d’une couche d’agarose, permettant notamment de déformer des portions larges d’un tissus, par exemple au sein du cœur d’un embryon.
(vi) Des billes de Ipm de diamètre (Dynabeads) associées à un anticorps anti -pores nucléaires (anti-NPC) permettant l’adressage à l’enveloppe nucléaire et la déformation du noyau.
De préférence, les particules superparamagnétiques utilisées sont des billes fluorescentes. Ainsi, les billes supraparamagnétiques selon l’invention peuvent comprendre en outre une ou plusieurs molécules fluorescentes, tel qu’un fluorophore, permettant leur visualisation en microscopie.
Ainsi, facultativement, pour les particules non fluorescentes, une incubation avec un fluorophore biotynilé (Atto-biotin, Sigma) peut être réalisée si la visualisation des particules en microscopie à fluorescence est nécessaire.
Pointe magnétique
La présente invention propose l’utilisation d’une pointe magnétique permettant d’appliquer une force sur la cellule, l’élément ou le compartiment cellulaire d’intérêt, par l’application d’un champ magnétique sur les billes superparamagnétiques.
Par «pointe magnétique» est entendu une pointe comprenant un matériau qui est soit magnétisable, soit magnétisé. Le fonctionnement de la pointe magnétique repose sur un gradient de champ magnétique créé par une pointe comprenant au moins un aimant ou électroaimant, destiné à créer une force sur une ou plusieurs billes magnétiques attachées à des structures spécifiques au sein ou à la surface de cellules.
De préférence, l’aimant utilisé est un aimant permanent. Par « aimant permanent » est entendu un matériau magnétique dur, dont l'aimantation rémanente et le champ coercitif sont grands. Ce type d’aimant permet d'exercer une force d'attraction sur tout matériau ferromagnétique. Un aimant possède un pôle nord et un pôle sud. Les pôles de même nature se repoussent, ceux de natures différentes s'attirent.
Selon un mode de réalisation, les pointes magnétiques sont composées d’un cœur magnétique fait d’une superposition d’aimants millimétriques ou submillimétriques, dont la géométrie et la magnétisation peuvent être modulées.
En particulier, la pointe magnétique comprend un cœur magnétique composé d’au moins 1, 2, 3 ou 4 aimants superposés, de préférence 3 aimants superposés. De préférence, le ou les aimants forment le cœur magnétique et ont un diamètre compris entre 1 et 5 millimètres, de préférence entre 2 et 5 millimètres, entre 3 et 4 millimètres, notamment de 4 millimètres.
De préférence, le cœur magnétique a une forme tubulaire cylindrique. En particulier, le diamètre du cœur magnétique est compris entre 1 et 5 millimètres, de préférence entre 2 et 5 millimètres, entre 3 et 4 millimètres, entre 2 et 3 millimètres, entre 1 et 2 millimètres, entre 1 et 3 millimètres, entre 3 et 5 millimètres, entre 4 et 5 millimètres. La longueur du cœur magnétique est typiquement comprise entre 2 et 3 centimètres.
L’aimant du cœur magnétique est de préférence en néodyme, en ticonal, en alnico, en Neodyme Fer Bore (NdFeB) ou en Samarium Cobalt (SmCo). De manière préférée, les aimants du cœur magnétique sont en néodyme.
Les aimants en néodyme peuvent particulièrement être recouverts d’une fine couche de nickel- cuivre-nickel afin de les protéger contre la corrosion.
Le cœur magnétique est prolongé à son extrémité proximale par une pointe métallique présentant un rayon de courbure compris entre 5-100 micromètres, de préférence entre 10 et 90 micromètres, 20 et 70 micromètres, 5 et 50 micromètres, 10 et 50 micromètres, 25 et 50 micromètres. De manière préférée, la pointe métallique présente un rayon de courbure compris entre 5 et 50 micromètres.
Selon un aspect, la pointe métallique présente un rayon de courbure adapté à la taille de l’échantillon biologique et/ou de l’élément et/ou du compartiment cellulaire et/ou de la propriété mécanobiologique d’intérêt.
Selon un aspect, la pointe métallique a une longueur comprise entre 1 et 30 millimètres, plus particulièrement entre 10 et 20 millimètres. Par longueur, on entend la plus grande dimension de la pointe métallique, qui s’étend selon un axe longitudinal de ladite pointe.
Selon un aspect, le cœur magnétique, la longueur de la pointe et le rayon de courbure de la pointe sont adaptés de façon à permettre d’appliquer une force sur l’échantillon biologique comprise entre 10 nN et 1000 nN.
Notamment, la force appliquée sur l’échantillon biologique est comprise entre 0,001 pN et 5000 nN, entre 0,001 pN et 1000 nN, entre 0,001 pN et 20 nN, entre 0,001 nN et 5000 nN, entre 0,01 nM et 1000 nN, entre 0,001 nN et 20 nN, ou entre 10 nN et 1000 nN, de préférence entre 0,001 pN et 100 nN, préférentiellement entre 0,5 pN et 1,5 nN. La pointe magnétique est adaptée selon la force à appliquer sur l’échantillon. En effet, la force appliquée sur une bille super paramagnétique de volume V de susceptibilité magnétique % pour un champ B est: F=V%*Grad(B2/(2po)), ou poest la susceptibilité du vide. La fonction Gradient est une dérivée vectorielle qui dépend de la géométrie de la pointe et de la position de la bille par rapport à l’axe de la pointe. Pour une bille exactement dans l’axe le Grad est proportionnel à ~ 1/L et 1/R ou L est la longueur de la pointe, et R le rayon de courbure.
L’optimisation de la longueur et de la courbure de la pointe permet d’obtenir des forces plus élevées malgré la distance lointaine de travail, et donc de travailler sur des échantillons plus gros et/ou plus loin, ce qui n’a jamais été réalisé à présent dans l’état de l’art.
Cette pointe permet de canaliser les lignes de champ magnétique sur les billes, et donc de focaliser une intensité de champ magnétique plus grande sur une région de l’espace plus petite.
En particulier, la courbure de la pointe magnétique est configurée pour créer un gradient magnétique uniaxial sur l’échantillon biologique.
La force magnétique appliquée grâce à la courbure de la pointe confinée d’une largeur de quelques dizaines de micromètres permet la calibration du système par application d’une force focalisée dans une direction, et donc de s’assurer que l’on peut mesurer des paramètres mécanobiologiques de manière précise et reproductible.
De préférence, la pointe métallique a une forme tubulaire cylindrique. Le diamètre de la pointe métallique peut notamment être compris entre 0,5 et 1 millimètre. Les pointes plus fines permettent une précision spatiale plus fine, et les plus larges une gamme de forces plus large.
Selon un mode de réalisation, la pointe métallique peut présenter une extrémité proximale effilée ou biseautée, permettant de faciliter le passage de la pointe magnétique dans un tissu.
Par « extrémité proximale », on entend la portion de la pointe magnétique la plus rapprochée des billes et/ou de la cellule, du tissu, de l’élément ou compartiment cellulaire d’intérêt. Inversement, par « extrémité distale », on entend la portion de la pointe magnétique la plus éloignée de ces éléments.
De préférence, la pointe métallique surplombant le cœur magnétique est en acier, fer, nickel ou cobalt ou l’un de leur alliage, préférentiellement en acier.
Selon un mode de réalisation, la pointe métallique surplombant le cœur magnétique est recouverte d’une couche d’or. En particulier, la couche d’or est appliquée par « electro sputting » pour améliorer la stabilité de la pointe vis-à-vis de l’oxydation dans les milieux de cultures, permettant notamment d’abolir les effets toxiques sur les cellules, et de conserver les pointes pour des durées d’utilisation de plusieurs mois/années.
Selon un mode de réalisation particulier, la pointe magnétique comprend un cœur magnétique composé de trois aimants en néodyme prolongés par une pointe d'acier aiguisée présentant un rayon de courbure d’environ 50 pm, apte à créer un gradient magnétique. La surface de la pointe en acier peut notamment être recouverte d'une couche d'or par électrolyse pour éviter l'oxydation.
Les pointes magnétiques sont de préférence calibrées en suivant la vitesse de chacune des billes magnétiques dans un milieu de viscosité connue, en fonction de la distance à la pointe magnétique, et en utilisant la relation de Stokes pour calculer la force magnétique nette. La même expérience réalisée sur des agrégats de billes de tailles différentes à une distance donnée a permis d'établir des relations force-taille. La traînée des agrégats de billes peut être testée en mesurant la vitesse de sédimentation dans un milieu de viscosité connue, et est représentée par la traînée d'une particule sphérique de rayon égal à la moyenne géométrique de la taille de l'agrégat (Tanimoto et al., Nature Physics 2018). Une méthode de calibration de la pointe et des billes est particulièrement décrite ci-après.
La force résultante de l’application de la pointe magnétique sur les billes dépend en particulier de trois facteurs : (i) des propriétés magnétiques de la pointe et sa courbure (ii) de la susceptibilité magnétique des particules et de leur volume et/ou (iii) de la distance entre la pointe et la particule magnétique.
Méthode et Utilisation
L’invention concerne particulièrement une méthode pour étudier la mécanique cellulaire et intracellulaire, notamment au sein d’un échantillon biologique, notamment un tissu et ou un embryon multicellulaire, préférentiellement un embryon non humain.
La méthode selon l’invention comprend une étape d’injection de billes superparamagnétiques, l’injection pouvant être réalisée à l’aide de systèmes d’injection commerciaux (par exemple l’InjectMan Eppendorf) des particules ou billes magnétiques soit au sein du cytoplasme de la cellule, soit à la surface de la cellule, soit au sein de la lumière d’un tissu ou d’un embryon. Par exemple, par le biais d’un micromanipulateur 3D, on approche la pointe magnétique à une distance contrôlée de la cellule et des billes superparamagnétiques, pour pouvoir appliquer une force précise sur la structure d’intérêt. Cette application de force peut être répétée plusieurs fois au cours d’un cycle cellulaire, maintenue, ou modulée en changeant la position de la pointe magnétique.
L’invention concerne plus particulièrement une méthode in vitro ou ex vivo pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’au moins un élément, d’au moins un compartiment cellulaire, d’au moins une cellule ou d’au moins un groupe de cellules dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant : a) l’introduction de billes superparamagnétiques dans l’échantillon biologique, lesdites billes comprenant un revêtement apte à adresser les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt ou à pénétrer une cellule ou un groupe de cellules, b) l’application d’un champ magnétique sur lesdites billes superparamagnétiques de manière à appliquer une force sur l’échantillon biologique, c) la mesure d’au moins une propriété mécanobiologique de l’élément ou compartiment cellulaire dans l’échantillon biologique,
- ledit échantillon biologique étant une cellule ou un échantillon biologique multicellulaire, et
- le champ magnétique étant appliqué par une pointe magnétique, ladite pointe magnétique comprenant au moins un aimant millimétrique ou submillimétrique prolongé par une pointe métallique.
Selon un aspect le revêtement est un revêtement hydrophobe et, de préférence, les billes superparamagnétiques comprenant un revêtement hydrophobe sont mélangées à une huile biocompatible apte à faire pénétrer les billes superparamagnétiques dans une cellule ou un groupe de cellules, avant d’être introduites dans l’échantillon biologique.
Selon un autre aspect, le revêtement est un revêtement biologique apte à adresser de manière spécifique les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, une cellule ou un groupe de cellule et, de préférence, les billes superparamagnétiques comprenant un revêtement biologique sont mélangées à une solution, de préférence une solution tampon avant d’être introduites dans l’échantillon biologique.
L’invention concerne également une méthode permettant de caractériser une ou plusieurs propriétés mécanobiologiques d’une cellule ou de l’un de ses éléments ou compartiments au sein d’un échantillon biologique, ladite méthode comprenant ou consistant essentiellement en : a) l’introduction de billes superparamagnétiques dans l’échantillon biologique, lesdites billes comprenant un revêtement tel qu’un revêtement biologique apte à adresser de manière spécifique les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, b) l’application d’un champ magnétique sur lesdites billes superparamagnétiques de manière à appliquer une force sur l’échantillon biologique, c) la mesure d’une ou plusieurs propriétés mécanobiologiques de l’élément ou compartiment cellulaire dans l’échantillon biologique.
La méthode peut particulièrement être exécutée in vivo, ex vivo ou in vitro.
L’invention concerne en particulier une méthode in vitro ou ex vivo pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’au moins un élément, d’au moins un compartiment cellulaire, d’au moins une cellule ou d’au moins un groupe de cellules dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant : a) l’introduction de billes superparamagnétiques dans l’échantillon biologique, lesdites billes comprenant un revêtement apte à adresser de manière spécifique les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, b) l’application d’un champ magnétique sur lesdites billes superparamagnétiques de manière à appliquer une force sur l’échantillon biologique, c) la mesure d’au moins une propriété mécanobiologique de l’élément ou compartiment cellulaire dans l’échantillon biologique, caractérisée en ce que ledit échantillon biologique est une cellule, un tissu ou un embryon multicellulaire, un organe, et ledit échantillon biologique n’étant pas d’origine embryonnaire humain
- le champ magnétique est appliqué par une pointe magnétique, ladite pointe magnétique comprenant au moins un aimant millimétrique ou submillimétrique prolongé par une pointe métallique.
Selon un aspect, la méthode comprend en outre (i) une étape préalable dans laquelle le revêtement biologique des billes est sélectionné en fonction de l’élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, (ii) une étape préalable de préparation de la pointe et/ou des billes superparamagnétiques et/ou (iii) une étape de calibration de la pointe et des billes.
Selon un autre aspect, la méthode comprend en outre (i) une étape préalable de préparation de la pointe et/ou des billes superparamagnétiques, (ii) une étape préalable dans laquelle des billes superparamagnétiques comprenant le revêtement hydrophobe sont mélangées à une huile biocompatible, et/ou (iii) une étape de calibration de la pointe et des billes.
Les différentes étapes de la méthode selon l’invention sont plus particulièrement décrites ci- après.
Echantillon biologique et caractéristiques mécanobiologiques étudiés
L’échantillon sur lequel est appliquée la méthode peut être un organisme, un embryon, un organe, un tissu ou une cellule.
L’échantillon sur lequel est appliquée la méthode est de préférence sélectionné parmi une cellule, un échantillon multicellulaire, un tissu ou un organe préalablement obtenu par échantillonnage, ou un embryon préférentiellement non-humain.
En particulier, l’échantillon biologique n’est pas un échantillon biologique d’origine embryonnaire humain.
De préférence, l’échantillon est sous forme vivante et/ou non fixé.
Selon un aspect, l’échantillon est multicellulaire, et est en particulier un tissu, un organe, un embryon préférentiellement non-humain. Le tissu peut être en particulier d’origine naturelle ou synthétique, en deux ou trois dimensions. En particulier le tissu peut être une couche de cellules, par exemple en culture cellulaire.
Selon un aspect particulier, les billes superparamagnétiques sont injectées dans la lumière d’un tissu ou organe. Par exemple, il est possible d’injecter de larges billes magnétiques au sein du lumen des tissus cardiaques d’un embryon de modèle vertébré (Poisson zèbre).
De préférence, l’élément ou compartiment cellulaire ciblé est la membrane cellulaire interne ou externe de l’échantillon biologique.
L’échantillon peut être préalablement traité, par exemple en utilisant une solution d’eau de javel 50%. L’échantillon peut également être légèrement asséché puis collé sur une lamelle de verre et immédiatement recouvert d’une goutte d’huile perméable à l’oxygène (par exemple avec l’Oil 10S Voltalef).
L’échantillon testé peut provenir d’un sujet ou être issu d’une culture cellulaire, notamment en utilisant des lignées cellulaires disponibles commercialement.
L’échantillon peut être notamment une biopsie, réalisée sur un sujet préalablement à la méthode selon l’invention. Les termes « individu », « hôte », « sujet » et « patient », sont utilisés ici de manière interchangeable, et désignent un mammifère, plus particulièrement un sujet animal et plus particulièrement encore un humain. Lorsqu’il s’agit d’un animal, l’animal peut être un animal domestique tel qu’un chat ou un chien, un animal d’élevage tel qu’un cheval ou une vache, ou un animal de laboratoire, tel qu’une souris, une drosophile, etc.
Selon un mode de réalisation, la méthode selon l’invention est réalisée sur une cellule. De préférence, la cellule étudiée est une cellule unique ou une cellule isolée, une cellule comprise dans un tissu pluricellulaire ou multicellulaire, une cellule comprise dans un embryon, ledit embryon étant de préférence non-humain, ou une cellule comprise dans un échantillon biologique, tel qu’une biopsie ou un expiant. La cellule peut autrement être un microorganisme, tel qu’une bactérie, une levure ou un champignon unicellulaire.
En particulier, la cellule étudiée est une cellule humaine, animale ou végétale. Selon un mode de réalisation, la cellule est une cellule non humaine.
Selon un mode de réalisation particulier, la cellule est une cellule tumorale ou cancéreuse. La cellule peut être issue d’une tumeur primaire, une cellule cancéreuse circulante ou une métastase.
Selon un mode de réalisation particulier, l’échantillon sur lequel est réalisé la méthode selon l’invention est un embryon, de préférence un embryon non humain.
En particulier, l’embryon est choisi parmi un embryon d’oursin (Paracentrotus lividus), de drosophile Drosophila melanogaster) ou de poisson Zèbre (Danio Rerio).
De préférence, le compartiment ou l’élément cellulaire ciblé par les billes superparamagnétiques est choisi parmi : la membrane cellulaire, la membrane nucléaire, la membrane d’un organite, tel que les mitochondries, le réticulum endoplasmique ou l’appareil de golgi, les peroxysomes, les lysosomes ainsi que leur contenu, le cytoplasme, les microtubules et/ou les centrioles.
De préférence, le compartiment ou l’élément cellulaire ciblé est la membrane cellulaire ou la membrane nucléaire.
La méthode selon l’invention permet d’évaluer les caractéristiques mécanobiologiques de ces différents éléments.
Les termes « caractéristiques mécanobiologiques » et « propriétés mécanobiologiques » sont utilisés ici de manière interchangeable et concernent les effets des contraintes mécaniques (étirements, compressions, cisaillements...) sur les cellules ou les tissus vivants. La mécanobiologie englobe la rhéologie, la cinématique, la résistance mécanique, l’élasticité, la plasticité, la rigidité, la flexibilité et les propriétés viscoélastiques, ou toute combinaison de celles-ci.
Selon un mode de réalisation, les propriétés mécanobiologiques sont choisies parmi : la rhéologie, la cinématique, la résistance mécanique, l’élasticité, la plasticité, la rigidité, la flexibilité et les propriétés viscoélastiques, ou toute combinaison de celles-ci. De préférence, la propriété mécanobiologique mesurée est la rigidité ou l’élasticité.
La « rhéologie » est la science qui étudie les déformations et l'écoulement de la matière. Elle a pour objet d'analyser les comportements mécaniques des substances et d'établir leurs lois de comportement. Elle englobe de nombreuses disciplines fondamentales telles que la résistance des matériaux, la mécanique des fluides, la plasticité et l’élasticité. Les propriétés rhéologiques d’une matière ou d’un élément cellulaire correspondent au comportement mécanique et aux relations entre les déformations et les contraintes de la matière. La rhéologie du fluide cytoplasmique d’une cellule ou de la lumière d’un tissu peut être mesurée par la méthode de pointe magnétique proposée. Pour cela des billes de tailles différentes peuvent être déplacées par l’application d’une force magnétique, permettant de déterminer la viscosité du cytoplasme, la dépendance de cette viscosité suivant la taille de l’objet déplacé, ou la force de cisaillement. Les viscosités typiques du cytoplasme s’étendent entre 10-1000 cP, et dépendent de la taille de l’objet déplacé dans le fluide ainsi que du type cellulaire.
La « résistance mécanique » d’un élément est son comportement global (relation entre sollicitations — forces ou moments — et déplacements) et son comportement local (relation entre contraintes et déformations). Lorsque l'intensité de la contrainte augmente, il y a d'abord déformation élastique (l’élément se déforme proportionnellement à l'effort appliqué et reprend sa forme initiale lorsque la sollicitation disparaît), suivie parfois d'une déformation plastique (l’élément ne reprend pas sa forme initiale lorsque la sollicitation disparaît, il subsiste une déformation résiduelle), et enfin rupture (la sollicitation dépasse la résistance intrinsèque du matériau). La résistance mécanique de la membrane cellulaire ou nucléaire, ou d’une couche tissulaire peut être sondée par l’application des pointes magnétiques selon l’invention. Notamment l’application précise de forces de surface, et la mesure concomitante de la déformation, permet de déterminer les relations contraintes déformations de ces surfaces biologiques, et de calculer par exemple des constantes d’élasticité, s’échelonnant depuis 10 à 1000 pN/pm, des modules de Young de l’ordre de 1-100 MPa ou des déformations seuil de ruptures pour ces surfaces de 5-50%. La « viscoélasticité » est la propriété de matériaux qui présentent des caractéristiques à la fois visqueuses et élastiques, lorsqu'ils subissent une déformation. Les matériaux élastiques se déforment lorsqu'ils sont contraints, et retournent rapidement à leur état d'origine une fois la contrainte retirée. En rhéologie, le comportement d'un matériau viscoélastique linéaire est ainsi intermédiaire entre celui d'un solide élastique idéal symbolisé par un ressort de module E (ou G) et celui d'un liquide visqueux newtonien symbolisé par un amortisseur de viscosité q. L'élasticité d'un matériau traduit sa capacité à conserver et restituer de l'énergie après déformation. La viscosité d'un matériau traduit sa capacité à dissiper de l'énergie. Les propriétés viscoélastiques de la membrane cellulaire ou nucléaire, ou d’une couche tissulaire peuvent être testées par l’application des pointes magnétiques selon l’invention. Notamment l’application précise de forces de surface, et la mesure en dynamique de la déformation résultante, permet de caractériser les échelles de temps viscoélastiques, et les constantes visqueuses et élastiques associées. Certains matériaux peuvent notamment exhiber des propriétés élastiques à temps courts et visqueuses à temps long (matériaux de type Maxwell) ou à l’inverse ils s’écoulent à temps courts et se comportent comme un solide élastique à temps longs (Matériaux de type Kelvin Voigt). Les échelles de temps viscoélastiques pour les matériaux biologiques considérés par l’invention peuvent varier entre 0.1- 1000s ; les constantes de frictions visqueuses entre 100- 10000 pN/pm, et les constantes élastiques de 10 à 1000 pN/pm.
La « rigidité » ou « raideur » est la caractéristique qui indique la résistance à la déformation élastique d'un corps. Plus un élément est rigide, plus il faut lui appliquer une force importante pour obtenir une déformation donnée. A contrario, la « flexibilité » désigne la propriété selon laquelle un matériau souple peut être aisément courbé ou plié sans se rompre.
La « résistance mécanique » d'un matériau est caractérisée par sa limite d'élasticité et/ou sa résistance à la traction.
Les propriétés mécanobiologiques peuvent notamment être évaluées par la mesure du module de Young. Un élément ayant un module de Young (ou module d’élasticité) élevé (> à 50 GPa) est dit rigide, celui dont le module de Young est faible est au contraire souple, élastique ou flexible.
Préparation de la pointe magnétique et des billes paramagnétiques
Selon un mode de réalisation, la méthode selon l’invention peut comprendre en outre une étape de préparation de la pointe et/ou des billes paramagnétiques. Selon un mode de réalisation, la méthode selon l’invention comprend en outre la préparation ou fabrication d’une pointe comprenant ou consistant en l’assemblage d’éléments nécessaires et adaptés à son utilisation magnétique.
La fabrication de la pointe comprend principalement l’assemblage d’un cœur magnétique et d’une pointe métallique tels que décrits ci -dessus dans le paragraphe « pointe métallique ».
Ainsi il pourra être optimisé les caractéristiques de la pointe selon l’échantillon à évaluer.
Selon un mode de réalisation, la pointe magnétique est une pince magnétique.
Selon un mode de réalisation, la méthode selon l’invention comprend en outre le choix et la préparation des billes superparamagnétiques préalablement à leur introduction dans la cellule, tissu, organe ou embryon.
L’adressage des particules magnétiques à une localisation subcellulaire spécifique peut être contrôlé par l’ajout de protéines « hameçons » en tant que revêtement biologique à la surface des particules, ou billes. Dans la plupart des cas ces protéines sont biotynilées pour un couplage efficace avec le groupement streptavidine présent à la surface des particules magnétiques.
En pratique, dans un premier temps, les particules sont lavées dans une solution saline ou une solution tampon, par exemple du tampon phosphate (PBS). Les particules sont ensuite incubées dans une solution contenant la protéine « hameçon ». Par exemple, pour un adressage à l’enveloppe nucléaire, un anticorps biotinylé dirigé contre les pores nucléaires tel que l’anticorps anti-NPC (SantaCruz sc-58815) peut être utilisé.
De préférence, l’excès de protéines « hameçons » est éliminé par un lavage dans une solution tampon, par exemple du PBS.
Les particules fonctionnalisées sont finalement re-suspendues dans du PBS à une concentration adaptée pour l’injection.
De préférence, la concentration des billes paramagnétiques fonctionnalisées est comprise entre 0.5 et 5 mg/ml dans la solution d’injection.
Pour les anticorps n’étant pas disponibles en version biotinylée, leur biotinylation peut être réalisée, notamment par l’utilisation préalable d’un kit de biotinylation (ex : EZ-link NHS- biotin, Sigma). Facultativement, lorsque les billes utilisées sont non fluorescentes, une seconde incubation avec un fluorophore biotynilé, par exemple le fluorophore Atto-biotin (Sigma) peut être réalisée à cette étape si la visualisation des particules en microscopie à fluorescence est nécessaire.
De préférence, l’excès de fluorophore est éliminé par un lavage dans une solution tampon, par exemple du PB S.
Les particules fonctionnalisées sont finalement re-suspendues dans du PBS à une concentration adaptée pour l’injection.
De préférence, la concentration des billes paramagnétiques fonctionnalisées est comprise entre 0.5 et 5 mg/ml dans la solution d’injection.
Il est possible de vérifier la fonctionnalisation des billes, par diffusion dynamique de la lumière (DLS pour « Dynamic Light Scattering ») qui permet de mesurer la distribution en taille d’objets en suspension dans une solution. Ainsi il est possible de comparer la taille des billes initiales et la taille des billes fonctionnalisées, les billes fonctionnalisées ayant une taille supérieure aux billes non fonctionnalisées.
Selon un mode de réalisation, la méthode selon l’invention comprend en outre une étape de vérification de la fonctionnalisation des billes avant injection, par exemple par la technique de DLS.
Dans le cas de billes superparamagnétiques comprenant un revêtement hydrophobe, des billes commerciales sont disponibles comme par exemple les billes Magtivio, MagSi-proteomics C18, qui fournissent un revêtement fait de chaines carbonées de type Octadecyl C18. En vue de leur injection, les billes sont séchées à l’éthanol, puis re-suspendues dans de l’huile biocompatible, de préférence de l’huile de soja, à une concentration comprise entre 5 et 20 mg/ml.
Pour injecter les gouttelettes d'huile comprenant les billes superparamagnétiques comprenant un revêtement hydrophobe dans le cytoplasme, une suspension de billes superparamagnétiques hydrophobes est lavée dans une solution d'éthanol à 30, 50 puis 70 %. Cette solution est ensuite séchée sous vide et remise en suspension dans l'huile biocompatible.
De préférence, la concentration des billes comprenant un revêtement hydrophobe est comprise entre 2 et 20 mg/ml, de préférence entre 5 et 20 mg/ml dans la solution d’injection, c’est-à-dire dans l’huile biocompatible. Calibration
Pour connaître la force précise appliquée sur une bille par la présence de la pointe magnétique et évaluer ainsi les propriétés mécanobiologiques de l’élément ou compartiment cellulaire, il peut être nécessaire de calibrer le couple pointe -bille(s).
Ainsi, la méthode selon l’invention peut comprendre en outre une méthode de calibration du couple pointe magnétique-billes superparamagnétiques, de préférence préalablement au test de l’échantillon d’intérêt.
Cette calibration peut être réalisée en suivant un protocole consistant à placer les billes dans une solution de viscosité connue. Lorsque la pointe magnétique est placée dans la solution, les billes se déplacent à une vitesse qui permet de calculer la force de friction visqueuse de Stokes (F=67tr|RV, Î] : viscosité du liquide, R rayon de la bille, V vitesse de la bille) qui équilibre la force magnétique. Cette méthode, implique ainsi l’utilisation de liquides de viscosité calibrée, tels que des solutions diluées de sucrose (52%, 12cp ; 54% 20cP), de Glycérol (68%, 15cP ; 71% ; 20cP, 80%, 80cP), de Méthyl Cellulose 15 (2%, 15cP ), ou de Méthyl Cellulose 400 (1,18%, 39cP; 1,60%, 124cP ; 2%, 400cP). Les billes magnétiques diluées sont placées en suspension dans une chambre à flux sur un microscope. Les billes sont alors mises en mouvement par l’approche de la pointe magnétique dans la solution, et la distance entre la pointe et la billes, ainsi que la vitesse de la bille sont enregistrées par vidéomicro scopie. Des scripts d’analyse d’images établis dans le cadre de cette invention, permettent d’extraire les paramètres importants (distances et vitesses) et donnent ainsi la valeur de la force en fonction de la position et de l’axe de la bille par rapport à la pointe. Pour une même pointe, cette calibration peut être effectuée pour différents types de billes. Ainsi, une fois la calibration effectuée, le script permet d’extraire la valeur et la direction de la force de manière automatique, pendant une expérience sur des échantillons vivants.
Avec ce système, la force peut être modulée en modifiant la position de la pointe magnétique dans le cas d’un aimant permanent ou en modifiant l’intensité électrique dans le cas d’un électroaimant.
Introduction des billes magnétiques
La méthode selon l’invention comprend une étape comprenant ou consistant en l’introduction de billes superparamagnétiques dans une cellule, un tissu, un organe ou un embryon, notamment tel que décrit ci-dessus, lesdites billes comprenant un revêtement permettant d’adresser spécifiquement les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment donné, ou de pénétrer une cellule ou un groupe de cellules.
Cette étape peut notamment s’appuyer sur l’utilisation de micro-injecteurs classiques, disponibles dans les laboratoires de biologies, tel que des micro-injecteurs 3D.
Pour injecter des billes au sein d’une cellule ou d’un tissu, les éléments à optimiser incluent, par exemple, la taille de l’ouverture du micro-capillaire, la pression d’injection, la pression de compensation et la durée d’injection. Par exemple, l’injection in vivo d’une solution de billes magnétiques de 800nm à 5mg/ml est réalisée avec les paramètres suivants : Ouverture du capillaire : 5 à 15 micromètres, Pression de compensation : 5 à 30 hectoPascals, Pression d’injection : 15 à 90 hectoPascals, et durée d’injection : 100 à 500 millisecondes. Ces protocoles ont été affinés dans le cadre de cette invention.
Pour les mesures en surfaces des cellules, l’adressage des billes comprenant un revêtement biologique est réalisé le plus souvent en ajoutant les particules magnétiques dans le milieu et en les laissant se coller à la surface cellulaire externe.
Selon un mode de réalisation, les billes sont introduites dans l’échantillon biologique par microinjection, par une voie de transport cellulaire (telle que l’endocytose cellulaire), par perméabilisation de la membrane de l’échantillon biologique d’intérêt, par biolistique ou par bombardement, de préférence par microinjection, préférentiellement par microinjection pneumatique ou hydraulique.
En particulier, deux systèmes d’injection pneumatiques peuvent être utilisés de manière indifférenciée : le FemtoJet4 (Eppendorf) et la PicoPump PV820 (WPI). Ces deux systèmes ont l’avantage de pouvoir contrôler précisément la pression d’injection et de compensation ainsi que la durée de l’injection.
Alternativement, le système hydraulique CellTram4r Oil (Eppendorf) permet de travailler confortablement dans des gammes de pression plus élevés (>500hPa) notamment en réduisant l’inertie lors de l’injection.
Le choix entre les systèmes s’effectue en fonction du type d’échantillon, du type d’aiguille et du type de suspension à injecter. Par exemple, le système d’injection hydraulique peut être utilisé pour les expériences dans des échantillons multicellulaires et plus particulièrement dans des embryons non humains, tels que des embryons de drosophile. Selon un mode de réalisation l’injection des billes dans la cellule est réalisée par biolistique ou bombardement. Cette technique consiste à propulser les billes superparamagnétiques d'intérêt dans les cellules à l'aide d'un canon à particules (par exemple Biolostic - Biorad PDS-1000/He).
Selon un mode de réalisation, l’introduction des billes dans l’échantillon d’intérêt est réalisée par l’introduction d’une aiguille d’injection.
Les aiguilles d’injection sont de préférence préparées à partir de capillaires en verre borosilicaté en utilisant une étireuse, par exemple l’étireuse P- 1000 de Sutter Instruments. Les capillaires peuvent être traités au préalable avec une solution de siliconisation, par exemple la solution Sigmacote de Sigma.
De préférence, les aiguilles ont un diamètre compris entre 1 pm et 1 mm de diamètre et sont particulièrement adaptées au diamètre des billes à injecter. Les aiguilles sont de préférence aiguisées selon un angle de 10° à 30° +/- 2°, de préférence d’environ 30° jusqu’à obtenir une ouverture, par exemple à l’aide d’une biseauteuse (EG-40, Narishige). Le diamètre de l’ouverture de l’aiguille d’injection peut être comprise entre 1 pm et 1 mm, de préférence entre 5 et 15 micromètres.
De préférence 1 à 5 microlitres de solution d’injection comprenant les billes superparamagnétiques aux concentrations de préférence de 0,5 à 5 mg/ml pour les billes comprenant le revêtement biologique dans la solution d’injection, de préférence dans du tampon phosphate, et de 5 à 20 mg/ml pour les billes comprenant le revêtement hydrophobe dans l’huile, sont introduits, à l’arrière de l’aiguille, juste avant le montage sur le système d’injection.
Selon un aspect, plusieurs billes sont injectées lors de l’étape a) de la méthode selon l’invention dans au moins un compartiment cellulaire de l’échantillon biologique.
Selon un autre aspect, l’introduction de billes superparamagnétiques est réalisée dans une cellule unique de l’échantillon biologique.
Application et mesure de forces au sein d’échantillons vivants.
La méthode selon l’invention comprend une étape comprenant ou consistant en l’application d’un champ magnétique sur lesdites billes superparamagnétiques, de manière à appliquer une force sur l’échantillon biologique. Ceci permet d’évaluer et/ou mesurer des propriétés mécanobiologiques de l’élément ou compartiment cellulaire dans l’échantillon biologique. Le système de pointe magnétique est compatible avec différents types de microscopie, permettant de visualiser l’application de la pointe magnétique à proximité des billes et le déplacement des billes superparamagnétiques.
Le tissu ou la cellule en question sont imagés sur un système de microscopie inversé ou droit, et après injection ou positionnement des billes magnétiques, la pointe magnétique est amenée dans le voisinage de l’échantillon pour appliquer une force et un champ magnétique. La position et/ou l’orientation de la pointe sont contrôlées par le biais d’un micromanipulateur, par exemple tel qu’un micromanipulateur 3D commercial. Les images de microscopie prises doivent contenir la pointe et la ou les particules magnétiques et permettent par le biais de scripts informatiques, de calculer la force exacte en fonction de la taille de la particule, de la distance entre la pointe magnétique et les billes, et de la calibration mentionnée ci-dessus. Suivant le procédé, le suivi par vidéomicro scopie de la déformation de la surface tissulaire, cellulaire ou nucléaire, ou du mouvement d’une organite, permet de calculer in fine, les propriétés mécanobiologiques de l’élément étudié (constante de rigidité élastique, seuil de rupture, friction visqueuse, ou échelle de temps visco-élastique).
En particulier, la distance entre la pointe magnétique et l’échantillon biologique est comprise entre 10 micromètres et 1 millimètre.
Selon un mode de réalisation, le microscope utilisé est un microscope fluorescent à champ large ou un microscope confocal. Le microscope peut être équipé d’une caméra. Le microscope peut également être piloté par Micro-Manager (Open Imaging).
De préférence, les images sont prises à température ambiante (18-20°C).
Afin d’obtenir les informations les plus robustes possible, la force appliquée sur la cellule par le biais de la pointe magnétique et des billes superparamagnétiques doit être constante et stable pendant un instant t. La position de la pointe doit ainsi être maintenue de façon stable à proximité des billes.
Selon un mode de réalisation, la pointe est positionnée entre 10 et 500 pm de la cellule ou de l’élément ou compartiment cellulaire d’intérêt. Selon un mode de réalisation, la pointe est positionnée entre 10 et 500 pm à distance de la surface des billes superparamagnétiques.
De préférence, la distance entre la pointe et l’échantillon multicellulaire est comprise entre 10 micromètres et 1 millimètre. Cette distance peut être adaptée en fonction de la taille de l’échantillon biologique et de la force à appliquer sur celui-ci. Selon un aspect, la force appliquée sur l’échantillon biologique est comprise entre 0,001 pN et 5000 nN, entre 0,001 pN et 1000 nN, entre 0,001 pN et 200 nN, entre 0,001 pN et 20 nN, entre 0,001 nN et 5000 nN, entre 0,01 nM et 1000 nN, entre 0,001 nN et 200 nN, entre 0,001 nN et 20 nM, entre 0,1 nN et 200 nN, entr 0,1 nN et 20 nN, entre 0,5 nN et 200 nN, entre 0,5 nN et 20 nN, entre 0,5 nN et 10 nN, entre 0,5 nN et 5 nN, entre 1 nN et 200 nN, entre 1 nN et 20 nN, entre 1 nN et 5 nN, entre 5 nN et 50 nN, ou entre 10 nN et 1000 nN, entre 50 nN et 500 nN, 0,001 pN et 100 nN, préférentiellement entre 0,5 pN et 1,5 nN, de manière toute préférée entre 0,5 nN et 1,5 nN.
En particulier, la force appliquée sur l’échantillon biologique est comprise entre 0,001 pN et 1000 nN, de préférence entre 0,001 pN et 200 nN, préférentiellement entre 0,5 pN et 1,5 nN.
De manière préférée, la force appliquée sur l’échantillon biologique est comprise entre 10 nN et 1000 nN.
Champ d’application de la méthode
L’utilisation des billes superparamagnétiques et de la pointe magnétique permettent d’explorer l'impact de l'environnement mécanique (stimulus) sur les cellules, d’étudier la perception de stimulus et les mécanismes de réponse des cellules et leur participation aux processus mécaniques et biologiques.
Selon un aspect particulier, la méthode porte sur un échantillon biologique multicellulaire et permet de caractériser au moins un compartiment cellulaire, une cellule ou un groupe de cellules.
Selon un autre aspect, la méthode permet de caractériser l’au moins un élément ou l’au moins un compartiment cellulaire de l’échantillon biologique multicellulaire.
L’invention concerne l’utilisation de la méthode selon l’invention pour :
(i) caractériser les propriétés mécanobiologiques d’une cellule ou de l’un de ses éléments ou compartiments, d’un ensemble cellulaire et/ou
(ii) caractériser l’impact d’une drogue ou d’un médicament sur une cellule, un tissu, un organe ou un embryon ou de l’un de ses éléments ou compartiments, et/ou
(iii) identifier et caractériser des cellules ou tissus endommagés, par exemple des cellules cardiaques endommagées dans le cadre de maladies cardiaques ou génétiques, et/ou (iv) identifier et caractériser des cellules tumorales dans un échantillon, lesdites cellules tumorales présentant des caractéristiques mécanobiologiques différentes des cellules normales, et/ou
(vi) comprendre l’interaction mécanique des cellules entre elles ou avec la matrice qui les entoure qui leur permet de former des tissus cohérents, et/ou
(vii) étudier la mécanotransduction, c’est-à-dire la façon dont la cellule intègre le signal mécanique et le transforme en signal biochimique lui permettant de réagir, de s’adapter et même de modifier l’expression de ses gènes. La mécanotransduction est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires comme le changement de forme, la différenciation, la croissance, la prolifération et l'apoptose. Trois types de mécanotransduction sont actuellement décrits en fonction de la transduction qu'emploie la cellule pour adapter sa réponse aux facteurs environnementaux. La première est l'ouverture de canaux ioniques suite au stress mécanique, la seconde est l'initiation d'une cascade de signalisation et la troisième emprunte un pont physique entre les points focaux et la chromatine.
Kit et utilisation du kit
La présente invention concerne finalement un kit permettant de réaliser la méthode selon l’invention.
Selon un aspect, le kit comprend : a) une pointe magnétique comprenant un cœur magnétique comprenant une superposition d’aimants millimétriques ou submillimétriques prolongé par une pointe d’acier, b) des billes superparamagnétiques comprenant un revêtement apte à adresser les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt ou à pénétrer une cellule ou un groupe de cellules, c) optionnellement une solution permettant la mise en suspension et l’injection des billes superparamagnétiques dans une cellule ou un tissu cellulaire, et d) optionnellement au moins une solution de calibration des billes superparamagnétiques et de la pointe magnétique.
Selon un aspect, le revêtement est un revêtement hydrophobe, de préférence un octadecyl, la solution étant une huile biocompatible apte à faire pénétrer les billes superparamagnétiques dans une cellule ou un groupe de cellules. Selon un autre aspect les billes superparamagnétiques comprennent un revêtement biologique apte à adresser spécifiquement les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, le revêtement des billes superparamagnétiques étant de préférence un revêtement protéique, préférentiellement un anticorps ou une lectine, la solution étant une solution tampon, de préférence un tampon phosphate.
En particulier, le kit comprend : a) une pointe magnétique, de préférence telle que décrite ci-dessus dans le paragraphe « pointe magnétique », b) des billes superparamagnétiques adaptées à l’adressage spécifique et à la fixation desdites billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire donné, de préférence telles que décrites ci-dessus dans le paragraphe « billes superparamagnétiques », c) optionnellement une solution permettant la fonctionnalisation des billes superparamagnétiques, par exemple comprenant des anticorps ou une protéine appât, d) optionnellement, une ou plusieurs solutions destinées à la calibration des billes et de la pointe magnétique, e) optionnellement une solution permettant la mise en suspension et l’injection des billes superparamagnétiques dans une cellule ou un tissu cellulaire ; f) optionnellement, un instrument permettant l’injection des billes, de préférence un microinjecteur ou une aiguille d’injection préparée à partir de capillaires en verre borosilicaté.
En particulier, le kit comprend : a) une pointe magnétique, de préférence telle que décrite ci-dessus dans le paragraphe « pointe magnétique », b) des billes superparamagnétiques comprenant un revêtement hydrophobe, de préférence telles que décrites ci-dessus dans le paragraphe « billes superparamagnétiques », d) optionnellement, une ou plusieurs solutions destinées à la calibration des billes et de la pointe magnétique, e) une huile permettant la mise en suspension et l’injection des billes superparamagnétiques dans une cellule ou un tissu cellulaire, de préférence telle que décrite dans le paragraphe « billes superparamagnétiques » ; f) optionnellement, un instrument permettant l’injection des billes, de préférence une aiguille d’injection préparée à partir d’un capillaire en verre ou un microinjecteur.
Les kits selon l’invention peuvent en outre comprendre un ou plusieurs consommables tels qu’un milieu de culture ou un milieu de préservation pour les tissus ou cellules, ou encore une notice explicative.
De préférence, l’invention a trait à un kit pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’un élément ou compartiment cellulaire dans un échantillon biologique comprenant : a) une pointe magnétique comprenant un cœur magnétique comprenant une superposition d’aimants millimétriques ou submillimétriques prolongé par une pointe d’acier b) des billes superparamagnétiques comprenant un revêtement biologique apte à adresser spécifiquement les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, le revêtement des billes superparamagnétiques étant de préférence un revêtement protéique, préférentiellement un anticorps ou une lectine, c) optionnellement une solution permettant la mise en suspension et l’injection des billes superparamagnétiques dans une cellule ou un tissu cellulaire, et d) optionnellement au moins une solution de calibration des billes superparamagnétiques et de la pointe magnétique. et caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est une cellule, multicellulaire, un tissu, un organe, un embryon et ledit échantillon biologique n’étant pas un échantillon biologique d’origine embryonnaire humain.
Préférentiellement, le kit comprend : a) une pointe magnétique comprenant un cœur magnétique comprenant une superposition d’aimants millimétriques ou submillimétriques en néodyme prolongé par une pointe d’acier usinée avec un rayon de courbure compris entre 5 et 100 micromètres, b) des billes superparamagnétiques comprenant un revêtement permettant d’adresser spécifiquement les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire donné, le revêtement des billes superparamagnétiques étant un revêtement protéique, de préférence un anticorps ou une lectine, c) optionnellement une solution permettant la mise en suspension et l’injection des billes superparamagnétiques dans une cellule ou un tissu cellulaire, et d) optionnellement, un instrument permettant l’injection des billes, de préférence une aiguille d’injection préparée à partir de capillaires en verre borosilicaté.
En particulier, le cœur magnétique de la pointe, la longueur de la pointe et le rayon de courbure de la pointe sont adaptés de façon à permettre d’appliquer une force sur l’échantillon biologique comprise entre 10 nN et 1000 nN.
En particulier, la pointe d’acier a une longueur comprise entre 1 et 30 mm et/ou le rayon de courbure de la pointe d’acier est compris entre 5 et 100 micromètres.
Selon un aspect, l’aimant du cœur magnétique est en néodyme, en ticonal, en alnico, en Neodyme Fer Bore (NdFeB) ou en Samarium Cobalt (SmCo), préférentiellement en néodyme.
L’invention concerne finalement l’utilisation du kit tel que décrit ci-dessus, pour
(i) caractériser les propriétés mécanobiologiques d’une cellule ou de l’un de ses éléments ou compartiments, et/ou
(ii) caractériser l’impact d’une drogue ou d’un médicament sur une cellule, un tissu, un organe ou un embryon, en particulier un embryon non humain, ou de l’un de ses éléments ou compartiments, et/ou
(iii) identifier les cellules tumorales dans un échantillon, lesdites cellules tumorales présentant des caractéristiques mécanobiologiques différentes des cellules normales,
(iv) identifier et caractériser des cellules ou tissus endommagés, et/ou
(vi) étudier l’interaction mécanique des cellules entre elles ou avec la matrice qui les entoure, et/ou
(vii) étudier la mécanotransduction, c’est-à-dire la façon dont la cellule intègre le signal mécanique et le transforme en signal biochimique lui permettant de réagir, de s’adapter et même de modifier l’expression de ses gènes.
EXEMPLES
MATERIEL ET METHODES
Fabrication des pointes magnétiques
Les pointes magnétiques sont composées d’un cœur magnétique fait d’une superposition d’aimants submillimétriques ou millimétriques en néodyme, dont la géométrie et la magnétisation peuvent être modulées. Ce cœur est prolongé par une pointe d’acier usinée avec un rayon de courbure pouvant aller de 5-100 micromètres. Les pointes plus fines permettent une précision spatiale plus fine, et les plus larges une gamme de forces plus grandes. Pour stabiliser les pointes vis-à-vis de l’oxydation dans les milieux de cultures, et ainsi abolir les effets toxiques sur les cellules, les pointes sont recouvertes d’une fine couche d’or, en particulier d’une épaisseur de 0.5 à 1 micromètre par « electro sputting ». Les paramètres « d’electrosputting » sont à adapter pour chaque taille de pointes et chaque alliage métallique utilisés afin d’obtenir une couche d’or continue. Les pointes peuvent notamment être en acier. Des pointes ainsi fabriquées peuvent être conservées à l’abri de la poussière pendant plusieurs années.
Préparation et choix des particules magnétiques.
La méthode est compatible avec toutes sortes de particules super-paramagnétiques, présentant une gamme de chimie de surface modulable, exploitant notamment des liaisons avidin-biotin, ou des réactions de sulfonation de groupement carboxyle. Les inventeurs ont notamment testé et validé la méthode de l’invention avec une dizaine de marques de billes différentes, sans aucun signe de défaut ou de limite de l’approche. Le choix des particules et de la modification de leur chimie de surface permettant un champ très large d’applications.
L’adressage des particules magnétiques à une localisation subcellulaire spécifique peut être contrôlé par l’ajout de protéines « hameçons » (ayant une affinité spécifique à un compartiment/structure) à la surface des particules. Dans la plupart des cas ces protéines sont biotynilées pour un couplage efficace avec le groupement streptavidin présent à la surface des particules magnétiques.
En pratique, dans un premier temps, les particules sont lavées dans une solution à IM NaCl, 1% Tween puis re-suspendues dans du PBS (Phosphate Buffer Saline). Si nécessaire, les particules sont ensuite incubées de 15 à 60 min dans une solution contenant la protéine « hameçon » requise. Par exemple, pour un adressage à l’enveloppe nucléaire, un anticorps biotinylé dirigé contre les pores nucléaire (mouse anti-NPC antibody - SantaCruz sc-58815) a été utilisé et validé (figure 5). L’excès de protéine est éliminé par un lavage dans du PBS. Facultativement, pour les particules non fluorescentes, une seconde incubation avec un fluorophores biotynilé (Atto-biotin, Sigma) peut être réalisée à cette étape si la visualisation des particules en microscopie à fluorescence est nécessaire. Les particules sont finalement re- suspendues dans du PBS à une concentration comprise entre 0.5 et 5 mg/ml. Cette solution d’injection peut être utilisée pendant plusieurs heures.
Des exemples de protéines « hameçons » pouvant être utilisées pour adresser les particules à la membrane plasmique ou l’enveloppe nucléaire sont notamment décrits dans le Tableau 1.
Pour les anticorps n’étant pas disponibles en version biotinylés, l’utilisation préalable d’un kit de biotinylation est requise (ex : EZ-link NHS-biotin, Sigma).
Les inventeurs ont notamment utilisé et validé des protocoles utilisant (i) des billes de 800nm de la marque NanoLink (Solulink), qui présentent des propriétés d’agrégation et de collages aspécifiques à différentes structures biologiques comme le noyau, les centrosomes du fuseau mitotique ou la surface de certaines cellules (Figure 3A-3B). (ii) Des billes de lOOnm couverte de streptavidine (Chemicell) ne présentant pas d’interactions spécifiques avec les structures cellulaires utilisé pour la calibration et les expériences contrôles, (ii) Des Quantum dots magnétiques streptavidine de 200nm (Nvigen) recouverts par des moteurs moléculaires purifiés (dynéines) permettant un adressage plus précis à certaines structures intracellulaires, (iii) Des billes passivées à la BSA (Bovine Serum Albumin) de 1 pm de diamètre (Dynabeads) permettant un déplacement inerte dans le cytoplasme des cellules (Figure 3C). (iv) Des billes de 30-50 pm (Magne) permettant de déformer des portions larges d’un tissus au sein du cœur d’un embryon de poisson zèbre (Figure 3D), (v) Des billes de 1 pm de diamètre (Dynabeads) associées à un anticorps anti -pores nucléaires (anti-NPC) permettant l’adressage à l’enveloppe nucléaire et la déformation du noyau (Figure 4).
Calibration de la force appliquée
Pour connaitre la force précise appliquée sur une bille par la présence de la pointe magnétique, il est nécessaire de calibrer le couple pointe magnétique-billes (Figure 2). Cette calibration permet de connaitre la force exacte en fonction de la distance entre la bille et la pointe magnétique. Pour cela une suspension de billes diluée (1.25%) est placée dans une solution de viscosité connue. Les agents visqueux dilués dans l’eau ayant été testés et validés sont : Glycerol (Sigma) 60% de viscosité 15 cP (or mPa.s), sucrose (Sigma) 65%, viscosité 15cP ; Methycellulosel5 2% (Fisherscientific); viscosité 15cP ; Glycerol 65%, viscosité, 20cP ; sucrose 80%, viscosité 20cP ; Polyéthylèneglycol 8000 (Sigma), viscosité 20cP ; Methylcellulose 400 2% (Fisherscientific), 400cP (Figure 2B). Lorsque la pointe magnétique est placée dans la solution, les billes se déplacent à une vitesse qui permet de calculer la force de friction visqueuse de Stokes (F=67tr|RV, r] : viscosité du liquide, R rayon de la bille, V vitesse de la bille) qui équilibre la force magnétique. Un script d’analyse d’image développé sur le logiciel Matlab (Mathworks), permet : (i) le suivi dynamique de la particule, et le calcul de sa vitesse, et (ii) de positionner précisément le centre de la pointe comme référence. Ce script extrait ainsi directement la relation force magnétique-distance à la pointe magnétique, ainsi que des raffinements de cette force suivant l’angle entre la trajectoire de la bille et l’axe principale de rotation de la pointe magnétique. Pour une même pointe, cette calibration peut être effectuée pour différents types de billes. Ainsi, une fois la calibration effectuée, le script permet d’extraire la valeur et la direction de la force de manière automatique, pendant une expérience au sein d’échantillons vivants. Ceci est notamment décrit dans la publication de Tanimoto et al., Nature Physics 2018.
Injection des billes magnétiques
Cette étape implique l’utilisation de micro-injecteurs classiques disponibles dans les laboratoires de biologie. Pour injecter des billes au sein d’une cellule ou d’un tissu, les éléments à optimiser incluent, la taille de l’ouverture du micro-capillaire d’injection, les pressions et durée d’injection. Pour les mesures en surface des cellules ou tissus, les méthodes sont plus directes et consistent le plus souvent à ajouter les particules magnétiques dans le milieu et les laisser se coller à la surface cellulaire.
Les aiguilles d’injection sont préparées à partir de capillaires en verre borosilicaté (diamètre 1 mm) en utilisant une étireuse (P- 1000 ; Sutter Instruments). Les capillaires sont traités au préalable avec une solution de siliconisation (Sigmacote, Sigma). Les aiguilles sont aiguisées selon un angle de 30° jusqu’à obtenir une ouverture de 5-10 micromètres à l’aide d’une biseauteuse (EG-40, Narishige). 2 à 3 microlitres de solution d’injection sont introduits, à l’arrière de l’aiguille, juste avant le montage sur le système d’injection.
L’injection de larges billes (20-60pm) au sein des tissus cardiaques de l’embryon de poisson zèbre se fait en incisant les tissus entre le sinus et l’atrium et en poussant la bille au sein de l’atrium à l’aide d’une aiguille placée sur micromanipulateur sous le microscope.
Les embryons d’oursin sont injectés dans une chambre à fond en verre contenant de l’eau de mer. Le verre est préalablement traité avant une solution de protamine 1% (Sigma) pour assurer l’adhésion de l’échantillon. L’aiguille d’injection est contrôlée par un micromanipulateur motorisé (Injectman 4, Eppendorf) et une pompe d’injection (FemtoJet, Eppendorf).
Les embryons de drosophile sont récoltés Ih maximum après la ponte et dechorionés dans une solution d’eau de javel 50%. Ils sont ensuite légèrement asséchés puis collés sur une lamelle de verre. Ils sont immédiatement recouverts d’une goutte d’huile perméable à l’oxygen (Oil 10S Voltalef). L’injection est réalisée grâce à un micromanipulateur hydraulique (Narishige) à l’extrémité antérieure de l’embryon avant la phase de cellularisation. Le contrôle de la pression d’injection est effectué manuellement à l’aide d’un micro-injecteur (CellTram, Eppendorf).
Injection des billes mélangées à l’huile
Pour mesurer les propriétés du cytoplasme à l’échelle de grands objets passifs des gouttelettes d'huile « magnétisées » dans le cytoplasme sont utilisées. Pour cela, des œufs d’oursin non fécondés sont placés sur des boite de pétri de culture cellulaire avec un fond en verre, préalablement recouvertes d’une solution de protamine. Pour injecter les gouttelettes d'huile « magnétisées » dans le cytoplasme, une suspension de 10 pl de billes superparamagnétiques hydrophobes de diamètre de 1,2 pm (Magtivio, MagSi-proteomics Cl 8) est lavée dans 100 pl de solution d'éthanol à 30, 50 puis 70 %. Cette solution est ensuite séchée sous vide pendant 20 minutes et remise en suspension dans 5 pl d'huile de soja (Huile de soja, Naissance). Les capillaires en verre pour l’injection sont étirés avec un étireur de capillaire (P-1000, Sutter Instrument) et usinées avec un angle de 40° sur une roue en diamant (EG-40, Narishige) pour obtenir une ouverture de 10 pm. Les capillaires d’injection sont remplies de 2 pL de solution d’huile et permettent d’injecter plusieurs cellules, et ne sont pas réutilisés. Le temps d’injection définit la taille de la goutte formée dans le cytoplasme. Après injection, la pointe magnétique est approchée de la cellule et les billes à l'intérieur de l'huile forment des agrégats, qui se déplacent dans un premier temps lentement vers l'aimant pendant que la gouttelette d'huile reste stationnaire. Lorsque l’agrégat entre en contact avec l'interface huile-cytoplasme face à la pointe de l'aimant, la force magnétique est transmise à la goutte et la déplace au sein de la cellule. Les gros agrégats sont plus propices à la méthode, car ils ne peuvent généralement pas traverser l'interface en raison de la tension superficielle de l'huile, et des propriétés hydrophobes des billes. La calibration de la force se fait par le biais de la mesure de la taille de l’agrégat obtenu par vidéomicroscopie.
Culture cellulaire et tissulaire
Les oursins adultes (Paracentrotus lividu.s) proviennent des stations marines de Roscoff et Villefranche sur mer (France) et sont conservés plusieurs semaines dans des aquariums d’eau de mer artificielle maintenus à 16C°. Les gamètes sont obtenus par injection intracoelomique de KCL 0.5M. Les œufs sont conservés dans l’eau de mer à 16C° pendant maximum 12h. Le sperme peut être conservé non dilué pendant 1 semaine à 4C°. La gangue des œufs est retirée en les passant dans un maillage de 80 micromètres. Avant chaque expérience le sperme est activé par dilution et mis en contact avec les œufs pour la fécondation.
Les Drosophiles (Drosophila melanogastef) sont maintenues à 25C° dans des tubes contenant un milieu nutritif. Pour la collecte des embryons, les drosophiles sont transférées dans des pondoirs contenant un milieu gélosé supplémenté en levure fraiche. Les pondoirs sont remplacés toutes les 30-60 minutes et les embryons sont collectés en rinçant les pondoirs à l’eau et en séparant les embryons de la levure à l’aide d’un tamis. Les embryons étant en cours de développement, ils sont préparés pour l’injection immédiatement.
Les embryons de Poisson Zèbre (Danio Rerio) sont cultivés dans un milieu standard enrichi (https://zfin.org/zf info/zfbook/chaptl/L3.html); pendant 2-3 jours après fertilisation à ~28°C et préparés pour l’injection de billes (voir ci-dessus). Ils sont retournés pour que le cœur soit face à la lamelle sous une binoculaire, puis imagés directement au microscope muni de pointes magnétiques.
Protocoles testés et validés
(i) Injection et déplacement de particules de 100 nm couvertes de streptavidine (Chemicell) ne présentant pas d’interactions spécifiques avec les structures cellulaires utilisées pour la calibration et les expériences contrôles (Figures 2 et 3).
(ii) Injection et déplacement de particules magnétiques couplées à des Quantum dots et à la streptavidine de 200 nm (Nvigen) recouvertes par des moteurs moléculaires purifiés (dynéines) permettant un adressage aux microtubules et au centrosome.
(iii) Injection et déplacement de particules passivées à la BSA (Bovine Serum Albumin) de 1 pm de diamètre (Dynabeads) permettant un déplacement inerte dans le cytoplasme des cellules (Figure 3).
(iv) Injection et déplacement de billes de Ipm de diamètre (Dynabeads) associées à un anticorps anti -pores nucléaires (anti-NPC) permettant l’adressage à l’enveloppe nucléaire et la déformation du noyau. Elles ont notamment été utilisées pour déformer la membrane nucléaire et mesurer ses propriétés (Figure 4).
(v) Injection et déplacement de billes de 800 nm de la marque NanoLink (Solulink), qui présentent des propriétés d’agrégation et d’adhésion aspécifiques à différentes structures biologiques. Elles ont notamment été utilisées pour déformer la membrane cellulaire et mesurer ses propriétés (Figure 5). (vi) Injection et déplacement de très larges billes de 30-50pm (Magne) permettant de déformer des portions larges d’un tissus au sein du cœur d’un embryon de poisson zèbre (Figure 6).
Imagerie
Le système de pointes magnétiques est compatible avec différents types de microscopie. Les images présentées Figures 2A, 3A-3C, 4 et 6 ont été prises sur un microscope fluorescent à champ large (TLEclipse; Nikon) équipé d’un camera CMOS (Orca-flash4.0LT; Hamamatsu). Les échantillons ont été imagés avec un objectif 20x sec (NA, 0.75; Apo; Nikon) et un grossisseur 1.5x. Le microscope est piloté par Micro-Manager (Open Imaging). Les Figures 3B et 3C ont été prises sur un système de microscopie confocal à tête « spinning », yokogawa XI, monté sur un statif Nikon Ti, muni d’une caméra EM-CCD. Les cellules sont imagées avec un objectif Nikon 60X 1.4 NA Plan Apo à eau. Les images sont prises à température ambiante (18-20°C).
RESULTATS
Une nouvelle méthode pour appliquer de larges forces aux surfaces cellulaires ou nucléaires au sein de tissus vivants.
A ce jour, les méthodes commerciales d’applications de forces sur cellules vivantes, telles que l’AFM (Microscopie à Force Atomique) ou les pointes optiques, restent peu adaptées à des échantillons profonds, comme des tissus ou des embryons, notamment à cause d’une gamme de force limitée (souvent en dessous ou autour du pN), et du manque d’accès en profondeur des échantillons. Les inventeurs proposent ici une méthode fondée sur l’utilisation de pointes magnétiques, permettant d’appliquer des forces calibrées sur des particules magnétiques associées à la surface d’un tissu, d’une cellule unique, ou d’un noyau au sein d’une cellule (Figure 1).
Pour établir les possibilités d’application du système de pointes magnétiques, les forces applicables ont été calibrées en fonction de différentes billes magnétiques, pour des distances allant de la dizaine à la centaine de microns, correspondant aux échelles associées aux échantillons biologiques, depuis la cellule unique jusqu’aux ensembles multicellulaires. Pour cela, une pointe magnétique est couplée à un micromanipulateur en 3D et immergée dans un liquide visqueux de viscosité connue. Des billes magnétiques fluorescentes sont mises en solution, et des séquences d’images (films) sont enregistrées pour mesurer la vitesse des particules en fonction de leur distance à la pointe magnétique (Figure 2A). Différents milieux avec des valeurs de viscosité différentes, permettent d’étendre la gamme de calibration sur des distances allant jusqu’à plusieurs centaines de microns (Figure 2B). La vitesse de la particule en fonction de sa distance à la pointe est extraite par le biais d’un script d’analyse d’image ad- hoc, et permet de calculer la force magnétique en utilisant la loi de Stokes : F=67tr|RV, avec Î la viscosité du liquide, R, le rayon de la bille et V la vitesse de la bille. En utilisant différentes billes ayant des tailles allant de 1-50 pm, une gamme de force allant de la fraction du pN jusqu’à la centaine de nN, couvrant une gamme d’amplitude sur 5-6 ordres de grandeur, est démontrée, établissant ainsi la versatilité en termes d’amplitude de forces applicables par ce système (Tableau 1).
Pour valider l’applicabilité de cette méthode au sein d’échantillon profond, des billes magnétiques ont ensuite été injectées au sein d’échantillons unicellulaires et multicellulaires ayant des tailles caractéristiques de l’ordre de 100 microns (Figure 3A-3B). Ces expériences montrent que des billes injectées au sein de ces cellules ou dans le lumen de larges embryons peuvent être déplacées facilement. Par ailleurs, en suivant par vidéomicroscopie les divisions cellulaires ou le développement des embryons sur plusieurs heures (Figure 3C-3D), les cellules injectées vont pouvoir se diviser, et les tissus se développer normalement, suggérant que l’injection et la manipulation de billes n’affectent pas la physiologie des cellules et tissus.
Application à des mesures mécaniques de la surface du noyau cellulaire.
Une des premières applications de la méthode selon l’invention est d’aller sonder les propriétés mécaniques de la surface du noyau, au sein d’une cellule vivante. Cette application de force en profondeur est totalement incompatible avec les méthodes commerciales disponibles mentionnées ci-dessus. Ces informations quantitatives sont pourtant très précieuses, car les propriétés du noyau ont été suggérées comme marqueurs de nombreux processus comme la différentiation cellulaire, fortement dérégulées dans les cellules cancéreuses (Kirby and Lammerding, 2018). Néanmoins, mesurer ces propriétés au sein d’une cellule vivante est une tâche difficile et n’a jamais été rapportée dans la littérature. Pour valider cette approche, un protocole a été établi pour attacher à la surface des billes magnétiques des anticorps contre les pores nucléaires, des protéines hautement conservées chez les eucaryotes. Ces billes injectées au sein d’une cellule peuvent se lier et s’accumuler spécifiquement à la surface du noyau et permettent par l’approche d’une pointe magnétique de déformer le noyau. La mesure de la déformation en fonction de la force appliquée permet de calculer directement une élasticité (rigidité) de l’enveloppe nucléaire. Ainsi, par exemple, dans l’expérience présentée dans la Figure 4, une force de 560.4 pN est appliquée et la déformation résultante est de ~8.7pm ; ce qui permet d’obtenir une rigidité effective de l’enveloppe nucléaire 62.2 pN/ pm directement au sein d’une cellule vivante.
Application à des mesures mécaniques sur la surface cellulaire sur cellule unique.
Une seconde application de la méthode est dans le calcul de la rigidité de la surface cellulaire. La surface cellulaire est limitée par la membrane plasmique qui contient en dessous un cortex fait d’actine et de myosine qui est important pour l’intégrité de surface. Les propriétés de ce cortex sont également essentielles pour des processus comme la migration ou la division cellulaire qui peuvent être dérégulés dans les cellules tumorales et métastatiques, par exemple. A ce jour, les propriétés mécaniques du cortex constituent ainsi une cible d’étude de la mécanobiologie fondamentale et appliquée à la médecine. Ces propriétés restent difficiles à mesurer précisément, notamment au sein de tissus profonds. En injectant des billes magnétiques au sein d’une cellule et en les approchant de la surface cellulaire, des forces peuvent être directement appliquées pour déformer le cortex et en mesurer ses propriétés visco-élastiques. Ainsi, à partir de l’expérience présentée dans la figure 5, une rigidité de 16.7 pN/pm et une viscosité effective de 1008,5 pN/pm de la membrane cellulaire sont mesurées.
Application à des mesures mécaniques de tissus multicellulaires.
Une autre application importante du système de pointe magnétique est de pouvoir aller sonder des forces au sein de tissus à des profondeurs de l’ordre de la centaine de micromètres. Cet aspect est essentiel, car les modèles modernes d’étude de maladies (e.g. organoïdes, embryoïdes, sphéroïdes cancéreux) sont des modèles 3D avec des échelles de tailles de centaines de microns, où le besoin de sonder les propriétés des tissus en profondeur est important. Pour cela, les inventeurs démontrent ici la possibilité d’injecter de larges billes magnétiques au sein du lumen des tissus cardiaques d’un embryon de modèle vertébré (Poisson zèbre). Ces billes permettent d’appliquer des forces de tension de l’ordre de plusieurs dizaines de nN. Lorsque les billes sont déplacées par la pointe magnétique, elles viennent compresser le tissu et aussi le déformer. Ces expériences permettent ainsi de mesurer des constantes mécaniques de rigidité de compression de 16.3 mN/m et une élasticité de surface du tissu de 12.1 mN/m, correspondant à une élasticité de ~1.7 kPa, correspondant à un ordre de grandeur typique pour des tissus cardiaques mesuré par d’autres moyens (Kshitiz et al., 2012).
DISCUSSION
Les inventeurs présentent ici une méthode simple, versatile et robuste d’application de forces magnétiques adaptée à des échantillons larges comme des tissus ou des embryons. Le premier avantage de cette méthode par rapport aux méthodes commerciales actuelles, est qu’elle est à priori compatible avec tous types de microscopes et de micromanipulateurs disponibles dans des laboratoires standards de recherche et développement. Le second avantage est qu’elle couvre une gamme de forces et de distances bien supérieure aux autres approches, s’étalant sur 5-6 ordres de grandeur, et avec des distances de travail allant jusqu’à plusieurs centaines de micromètres. Ce point donne une unicité à l’approche présentée ici, car elle ouvre l’accès à des mesures dans le volume d’échantillons profonds comme les embryons en développement, les expiants de tissus et les organoïdes qui servent de nouveaux standards dans la recherche biomédicale (Simian and Bissell, 2017).
Les inventeurs démontrent une série d’applications potentielles pour mesurer et étudier la mécanique de la surface d’un noyau d’une cellule, d’une cellule individuelle et celle d’un tissu. Cette versatilité est rendue possible par l’utilisation de différentes particules magnétiques de tailles différentes, et par des modulations de leur recouvrement de surface. Ces méthodes apportent des quantifications au sein de cellules ou de tissus vivants, qui ne peuvent pas être obtenues par les méthodes disponibles dans le commerce. La simplicité et la versatilité du système promet son application dans des criblages thérapeutiques ou du diagnostic de routine. Par exemple, dans le cadre de criblages thérapeutiques, il est possible de mesurer directement l’effet d’un composé ou d’une drogue sur la mécanobiologie d’un échantillon cellulaire vivant. Pour conclure, cette méthode de mesure, au vu de sa gamme d’applicabilité, sa souplesse et sa simplicité, pourrait servir en routine autant pour étudier les fondamentaux de la mécanobiologie que pour le développement de méthodes de diagnostics standards pour la médecine.
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Claims

Revendications
1. Méthode in vitro ou ex vivo pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’au moins un élément, d’au moins un compartiment cellulaire, d’au moins une cellule ou d’au moins un groupe de cellules dans un échantillon biologique, ladite méthode comprenant : a) l’introduction de billes superparamagnétiques dans l’échantillon biologique, lesdites billes comprenant un revêtement apte à adresser les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt ou à pénétrer une cellule ou un groupe de cellules, b) l’application d’un champ magnétique sur lesdites billes superparamagnétiques de manière à appliquer une force sur l’échantillon biologique, c) la mesure d’au moins une propriété mécanobiologique de l’élément ou compartiment cellulaire dans l’échantillon biologique,
- ledit échantillon biologique étant une cellule ou un échantillon biologique multicellulaire, et
- le champ magnétique étant appliqué par une pointe magnétique, ladite pointe magnétique comprenant au moins un aimant millimétrique ou submillimétrique prolongé par une pointe métallique.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le revêtement est un revêtement hydrophobe.
3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle les billes superparamagnétiques comprenant un revêtement hydrophobe sont mélangées à une huile biocompatible apte à faire pénétrer les billes superparamagnétiques dans une cellule ou un groupe de cellules, avant d’être introduites dans l’échantillon biologique.
4. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le revêtement est un revêtement biologique apte à adresser de manière spécifique les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, une cellule ou un groupe de cellule.
5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle les billes superparamagnétiques comprenant un revêtement biologique sont mélangées à une solution, de préférence une solution tampon avant d’être introduites dans l’échantillon biologique.
6. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon biologique multicellulaire choisi parmi : un tissu, un organe ou un embryon, ledit échantillon biologique n’étant pas d’origine embryonnaire humain.
7. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la force appliquée sur l’échantillon biologique est comprise entre 0,001 pN et 5000 nN, entre 0,001 pN et 1000 nN, entre 0,001 pN et 20 nN, entre 0,001 nN et 5000 nN, entre 0,01 nM et 1000 nN, entre 0,001 nN et 20 nN, ou entre 10 nN et 1000 nN, de préférence entre 0,001 pN et 100 nN, préférentiellement entre 0,5 pN et 1,5 nN.
8. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle la distance entre la pointe magnétique et l’échantillon biologique est comprise entre 10 micromètres et 1 millimètre.
9. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle la pointe métallique est usinée avec un rayon de courbure compris entre 5 et 100 micromètres, préférentiellement entre 5 et 50 micromètres.
10. Méthode selon l’une des revendications 1 à 9, dans laquelle la pointe métallique a une longueur comprise entre 1 et 30 millimètres, plus particulièrement entre 10 et 20 millimètres.
11. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle la méthode comprend en outre (i) une étape préalable dans laquelle le revêtement biologique des billes est sélectionné en fonction de l’élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, (ii) une étape préalable de préparation de la pointe et/ou des billes superparamagnétiques et/ou (iii) une étape de calibration de la pointe et des billes.
12. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle la méthode comprend en outre (i) une étape préalable de préparation de la pointe et/ou des billes superparamagnétiques, (ii) une étape préalable dans laquelle des billes superparamagnétiques comprenant le revêtement hydrophobe sont mélangées à une huile biocompatible, et/ou (iii) une étape de calibration de la pointe et des billes.
13. Méthode l’une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle l’élément ou compartiment cellulaire est choisi parmi : la membrane cellulaire, l’enveloppe nucléaire, la membrane d’un organite, tel que la mitochondrie, le réticulum endoplasmique ou l’appareil de golgi, les lysosomes, les peroxysomes ainsi que leur contenu, tel que le cytoplasme, les microtubules et/ou les centrioles, les centrosomes ou le fuseau mitotique, de préférence la membrane cellulaire ou l’enveloppe nucléaire.
14. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle les propriétés mécanobiologiques sont choisies parmi : la rhéologie, la cinématique, la résistance mécanique, l’élasticité, la rigidité, la plasticité et les propriétés visco-élastiques, et toutes combinaisons de celles-ci.
15. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, 6 à 10 et 13 à 14, dans laquelle le revêtement des billes superparamagnétiques est un revêtement hydrophobe choisi parmi le butyl, le methyl, l’ethyl, l’octyl, le prolpyl, ou l’octadecyl, de préférence l’octadecyl.
16. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, 6 à 10 et 13 à 15, dans laquelle l’huile biocompatible est choisie parmi une huile de Soja, une huile de Lin, une huile de type Alcanes (C15-C40) et une huile fluorocarbonée.
17. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1, 4 à 11 et 13 à 14, dans laquelle le revêtement biologique des billes superparamagnétiques est un revêtement protéique, comprenant au moins une protéine appât apte à reconnaître une protéine proie sur l’élément ou compartiment cellulaire d’intérêt.
18. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle le revêtement biologique des billes superparamagnétiques est un anticorps ou une lectine.
19. Méthode selon la revendication 17 ou 18, dans laquelle le revêtement biologique des billes superparamagnétiques est un anticorps choisi parmi un anticorps anti Sodium Potassium ATPase, anti PMCA1, anti Pan Cadherin, anti E Cadherin, anti N Cadherin, anti ADAM22, anti LRP4, anti Fas (APO-1, CD95), anti CD27, anti EGFR, anti NPC et anti NUP98.
20. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1, 4 à 11 et 13 à 19, dans laquelle la solution est une solution tampon, de préférence un tampon phosphate.
21. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle l’élément ou compartiment cellulaire est la membrane cellulaire interne ou externe d’au moins une cellule de l’échantillon biologique.
22. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 21, dans laquelle les billes superparamagnétiques ont une taille comprise entre 100 nm et 100 pm, de préférence entre 100 nm et 50 pm, préférentiellement entre 100 nm et 1 pm.
23. Méthode selon la revendication selon l’une quelconque des revendications 1, 4 à 11 et 13 à 12, dans laquelle les billes superparamagnétiques comprennent un revêtement biologique et dans laquelle, dans l’étape a), les billes superparamagnétiques sont injectées dans un compartiment cellulaire de l’échantillon biologique.
24. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 23, dans laquelle les billes superparamagnétiques sont introduites par microinjection, biolistique ou bombardement, de préférence par microinjection, préférentiellement par microinjection pneumatique ou hydraulique.
25. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 24, dans laquelle l’échantillon biologique est préalablement obtenu par échantillonnage.
26. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 25, dans laquelle l’échantillon biologique est vivant et/ou non fixé.
27. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 26, pour (i) caractériser l’impact d’une drogue ou d’un médicament sur un échantillon biologique, et/ou (ii) identifier des cellules tumorales dans un échantillon biologique.
28. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 27, pour (i) caractériser l’impact d’une drogue ou d’un médicament sur une cellule, un tissu, un organe ou un embryon ou de l’un de ses éléments ou compartiments, et/ou (ii) identifier et caractériser des cellules ou tissus endommagés et/ou (iii) identifier et caractériser des cellules tumorales dans un échantillon, lesdites cellules tumorales présentant des caractéristiques mécanobiologiques différentes des cellules normales, et/ou (iv) étudier l’interaction mécanique des cellules entre elles ou avec la matrice qui les entoure et/ou (v) étudier la mécanotransduction d’au moins une cellule.
29. Kit pour caractériser au moins une propriété mécanobiologique d’au moins un élément, d’au moins un compartiment cellulaire, d’au moins une cellule ou d’au moins un groupe de cellules dans un échantillon biologique, comprenant : a) une pointe magnétique comprenant un cœur magnétique comprenant une superposition d’aimants millimétriques ou submillimétriques prolongé par une pointe d’acier, b) des billes superparamagnétiques comprenant un revêtement apte à adresser les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt ou à pénétrer une cellule ou un groupe de cellules, c) optionnellement une solution permettant la mise en suspension et l’injection des billes superparamagnétiques dans une cellule ou un tissu cellulaire, et d) optionnellement au moins une solution de calibration des billes superparamagnétiques et de la pointe magnétique.
30. Kit selon la revendication 29, dans lequel le revêtement est un revêtement hydrophobe, de préférence un octadecyl, la solution étant une huile biocompatible apte à faire pénétrer les billes superparamagnétiques dans une cellule ou un groupe de cellules.
31. Kit selon la revendication 29, dans lequel les billes superparamagnétiques comprennent un revêtement biologique apte à adresser spécifiquement les billes superparamagnétiques à un élément ou compartiment cellulaire d’intérêt, le revêtement des billes superparamagnétiques étant de préférence un revêtement protéique, préférentiellement un anticorps ou une lectine, la solution étant une solution tampon, de préférence un tampon phosphate.
32. Kit selon l’une quelconque des revendications 29 à 31, dans lequel l’extrémité de la pointe d’acier est usinée avec un rayon de courbure compris entre 5 et 100 micromètres.
33. Kit selon l’une quelconque des revendications 29 à 32, dans lequel le rayon de courbure de la pointe d’acier est configuré pour appliquer un gradient magnétique uniaxial sur l’échantillon biologique.
34. Kit selon l’une des revendications 29 à 33, dans lequel le cœur magnétique et l’extrémité de la pointe d’acier sont configurés de façon à permettre d’appliquer une force sur l’échantillon biologique comprise entre 10 nN et 1000 nN, pour une distance entre la pointe magnétique et l’échantillon biologique comprise entre 10 micromètres et 1 millimètre.
35. Kit selon l’une quelconque des revendication 29 à 34, dans lequel la pointe d’acier a une longueur comprise entre 1 et 30 mm.
36. Kit selon l’une quelconque des revendication 29 à 35, dans lequel l’aimant du cœur magnétique est en néodyme, en ticonal, en alnico, en Neodyme Fer Bore (NdFeB) ou en Samarium Cobalt (SmCo).
37. Kit selon la revendication 36, dans lequel l’aimant du cœur magnétique est en néodyme.
38. Kit selon l’une des revendication 29 à 37, dans lequel la pointe d’acier est recouverte d’une couche d’or.
39. Kit selon l’une quelconque des revendications 29 à 38, comprenant en outre un microinjecteur.
40. Utilisation du kit selon l’une quelconque des revendications 29 à 39, pour (i) caractériser l’impact d’une drogue ou d’un médicament sur un échantillon biologique, en particulier une cellule, un tissu, un organe ou un embryon non humain ou de l’un de ses éléments ou compartiments, et/ou
(ii) identifier et caractériser des cellules ou tissus endommagés et/ou
(iii) identifier et caractériser des cellules tumorales dans un échantillon, lesdites cellules tumorales présentant en particulier des caractéristiques mécanobiologiques différentes des cellules normales, et/ou
(iv) étudier l’interaction mécanique des cellules entre elles ou avec la matrice qui les entoure et/ou
(v) étudier la mécanotransduction d’au moins une cellule.
41. Utilisation d’un kit selon la revendication 40, pour :
- déterminer les propriétés mécaniques de la surface du noyau, au sein d’une cellule vivante, telle que l’élasticité de l’enveloppe nucléaire ;
- déterminer la rigidité de la surface cellulaire, telle que les propriétés viscoélastiques du cortex ;
-appliquer des forces au sein de tissus à des profondeurs de l’ordre de la centaine de micromètres, et mesurer par exemple des constantes mécaniques telles que des constantes mécaniques de rigidité de compression et d’élasticité de surface ; et/ou
-réaliser des mesures dans un volume d’échantillons profonds comme les embryons en développement, les expiants de tissus et les organoïdes.
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WO2019043693A1 (fr) * 2017-08-29 2019-03-07 Yeda Research And Development Co. Ltd. Système et procédé de séparation de composés chiraux par interactions magnétiques

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JOHANNES S KANGER ET AL: "Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles", CHROMOSOME RESEARCH, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 16, no. 3, 8 May 2008 (2008-05-08), pages 511 - 522, XP019601643, ISSN: 1573-6849 *
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