EP4168534A1 - Process for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, carrier particles and their use - Google Patents

Process for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, carrier particles and their use

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EP4168534A1
EP4168534A1 EP21733774.0A EP21733774A EP4168534A1 EP 4168534 A1 EP4168534 A1 EP 4168534A1 EP 21733774 A EP21733774 A EP 21733774A EP 4168534 A1 EP4168534 A1 EP 4168534A1
Authority
EP
European Patent Office
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particles
hydrogel
dried
substance
beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21733774.0A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Heiko Zimmermann
Julia NEUBAUER
Michael GEPP
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
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Filing date
Publication date
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
    • C12N2537/10—Cross-linking

Definitions

  • the invention relates to a method for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, in particular a method for producing dried hydrogel particles.
  • the invention also relates to carrier particles for culturing biological cells, in particular special dried hydrogel particles which are produced using the method mentioned, and applications of the carrier particles.
  • the invention can be used in the cultivation of biological cells, in particular in the cultivation (expansion) of multipotent and pluripotent stem cells or of differentiated cells, e.g. for tissue engineering.
  • alginates can be used in layers on two-dimensional substrates or as cell carriers (spherical particles, spheres, carrier beads, micro-carriers) in suspensions (see, for example, [1], [2]).
  • cell carriers spherical particles, spheres, carrier beads, micro-carriers
  • Additives include z. B. peptides or collagen, which affect cell adhesion (see, for example, [3] or [4]).
  • Cell cultivation on micro-carriers in suspensions e.g. B.
  • alginate spheres are produced in that liquid alginate is precipitated into spherical form through crosslinking (see, for example, [1]).
  • a suspension of alginate beads is formed which, depending on the application, has a size distribution with diameters in the range from 200 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the width of the size distribution which can be adjusted depending on the dropping conditions, can have an effect on the subsequent cell cultivation.
  • the crosslinked alginate beads After the crosslinked alginate beads have been washed, they are modified (activated and / or functionalized), e.g. B. by coupling tyramine or adjusting the elasticity of the beads by means of alginate mixtures selected before the production of the alginate beads.
  • the finished modified alginate beads who suspended in a culture medium and placed in a bioreactor.
  • the cells to be cultivated are added to the suspension in the bioreactor, where they colonize the alginate beads and are subjected to a specified cultivation protocol.
  • the conventional method has the following disadvantages and limitations.
  • the production of the modified alginate beads with predetermined properties requires special knowledge, which makes routine provision of the alginate beads in a laboratory for cell cultivation or for industrial use difficult.
  • the alginate balls are made according to the user's specifications, e.g. B. with a certain size distribution, diam ser) and / or modification, manufactured, delivered to the user in suspension and initially stored when the user.
  • the disadvantage is that the transport and storage of the suspension at the user's site can change the alginate beads in an undesirable manner.
  • Alginate beads can aggregate (clump) or disintegrate, which has a detrimental effect on precise, reproducible dosing by the user.
  • the sterility of the alginate beads can be lost during storage.
  • the properties of the finished alginate beads cannot be checked or varied by the user, or only to a very limited extent.
  • the size distribution of alginate beads in a suspension can only be changed retrospectively, if at all, with great effort.
  • the water content of the alginate beads can falsify the cultivation medium in the bioreactor. To avoid this, the number of alginate beads can be kept low, but this leads to a high consumption of media and a small number of cells that can be cultured.
  • the object of the invention is to provide an improved method for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, in particular an improved method for producing dried hydrogel particles, with which the disadvantages of conventional techniques are overcome.
  • the object of the invention is furthermore to provide improved carrier particles for cultivating biological cells with which the disadvantages of conventional carrier particles are overcome.
  • the invention is intended in particular to provide carrier particles which have reproducible properties, have improved storability, can be dosed more precisely, can be modified more easily and / or are suitable for routine use in bioreactors of various designs and tasks.
  • Carrier particles produced according to the invention should in particular allow cell cultivation with increased efficiency, success rate and / or reproducibility.
  • the above object is achieved by a method for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, which method comprises the following steps.
  • An aqueous suspension of spherical hydrogel beads is provided.
  • the hydrogel beads are preferably freshly prepared by crosslinking a precursor polymer with an ionic precipitant.
  • the hydrogel beads can be produced using methods known per se.
  • the suspension liquid of the aqueous suspension of hydrogel beads comprises an aqueous solution with the precipitant, in which the production of the hydrogel beads takes place, and / or a washing and / or Buffer solution with which the hydrogel beads are optionally washed after precipitation.
  • the hydrogel beads are then freeze-dried so that dried hydrogel particles are formed.
  • the freeze-drying of the hydrogel spheres comprises subjecting the hydrogel spheres to a reduced temperature (temperature below room temperature, preferably below 0 ° C.) and a negative pressure (pressure less than atmospheric pressure).
  • the hydrogel beads are preferably freeze-dried in the suspended state with the suspension liquid, the suspension liquid being removed first and then the hydrogel beads being dried.
  • the hydrogel beads can be removed from the suspension liquid of the aqueous suspension prior to freeze-drying, ie the suspension liquid is separated from the hydrogel beads prior to freeze-drying.
  • lyoprotectant substance is added to the suspension liquid, the hydrogel beads in the suspension being loaded with the lyoprotectant substance prior to freeze-drying.
  • the lyoprotectant substance (or: lyoprotectant) is a substance which minimizes or prevents damage to the hydrogel beads, in particular the macromolecules from which the hydrogel beads are built up, by ice formation during freeze-drying.
  • a lyoprotectant substance is used, which causes the hydrogel beads after freeze-drying, i. H. the getrockne th hydrogel particles, under the action of the lyoprotectant substance, have a shape which approximates a spherical particle shape.
  • the hydrogel beads preferably comprise alginate beads (alginate hydrogels).
  • alginate hydrogels The implementation of the invention in practice is not limited to alginate beads, but also accordingly with collagen, gellan or pectin hydrogels.
  • Alginate has proven to be particularly advantageous because it has a shape memory effect and, after freeze-drying and rehydration, forms spherical alginate beads again.
  • approximately spherical particle shape includes a shape of a dried hydrogel particle which represents a spheroid (in particular a sphere or ellipsoid) and a smooth or structured surface topology with characteristic structural dimensions such as, for. B. steps, projections or depressions, which is smaller than a cross-sectional dimension, preferably smaller than 1/10 of the cross-sectional dimension, of the dried hydrogel particle.
  • the above object is achieved by carrier particles for culturing biological cells comprising dried hydrogel particles containing a lyoprotectant substance and having a shape approximating a spherical shape.
  • the carrier particles are preferably made using the method mentioned according to the first general aspect of the invention or one of its embodiments.
  • the carrier particles have a characteristic cross-sectional dimension, such as. B. a diameter in the range of 50 pm to 2 mm.
  • the above object is achieved by using the carrier particles according to the second general aspect of the invention or their embodiments as cell carriers for the cultivation of biological cells.
  • the use of the carrier particles can be provided in a suspension bioreactor, in particular a culture vessel, a microtiter plate, hanging drops, a cell culture bag, a (suspension) bioreactor and / or a dish, such as a Petri dish .
  • the use of the carrier particles preferably comprises the phases of producing the dried particles, rehydration and washing, cell inoculation, cell multiplication and cell passage / harvest.
  • the inventors have found that the inventive loading of the hydrogel beads with the lyoprotectant substance, which causes the approximately spherical particle shape of the dried hydrogel particles, the disadvantages of conventional suspended or dried alginate beads in terms of shelf life, dosability and manageability can be avoided.
  • a gentle freeze-drying is achieved with the structure and function of the spherical hydrogel beads being preserved.
  • the shelf life is improved because sticking or aggregation is avoided, sterility can be better maintained in the dry state and thus germination of the prepared carrier beads can be avoided.
  • These advantages also apply in particular to the conventional approaches of freeze drying of alginate beads, e.g. B. according to [1]
  • the inventors have found that the conventional alginate beads in the dried state were not spherical, but irregularly deformed, e.g. B. folded and / or provided by cracks or protuberances shape, which the nature of the dried Algi nat beads, z. B. by density fluctuations in the bulk material and irregular Klumpenbil training, impaired.
  • Dried hydrogel particles produced according to the invention promote sterile lyophilization and rehydration.
  • the dried hydrogel particles can, for. B. be quantified by a volume measurement, a mass measurement and / or an optical measurement. Since the dried hydrogel particles are opaque, the rehydration in the bioreactor can be checked with the optical measurement.
  • the dried hydrogel particles can be processed in a simplified manner. It is preferably processed in a sterile bench, but no pipetting is required for dosing.
  • the dried hydrogel particles can easily be pre-portioned. Improved quality management is made possible in the process of manufacturing and using the dried hydrogel particles.
  • the dried hydrogel particles can be used as free-flowing bulk material or in tablet form and, in particular, placed directly in a bioreactor (vessel in which the cells are cultivated and which enables biochemical and physical cultivation conditions to be set).
  • the dried hydrogel particles advantageously do not adulterate the total volume of the cultivation medium in the bioreactor.
  • the rehydrated hydrogel beads are preferably used by adding the dried hydrogel particles directly to the cultivation medium in the bioreactor.
  • the cells to be cultivated can already be suspended in the cultivation medium when the dried hydrogel particles are fed in, or they can be fed into the bioreactor after the dried hydrogel particles have been rehydrated.
  • the degree of rehydration of the dried hydrogel particles is preferably determined with an optical transmission measurement or scattered light measurement on the cultivation medium.
  • the cells are particularly preferably fed into the culture medium after the dried hydrogel particles have been completely hydrated.
  • the rehydration of the dried hydrogel particles can optionally be viewed as a further substep of the process according to the invention.
  • the hydrogel beads (rehydrated hydrogel beads) formed during rehydration advantageously have a spherical particle shape even after rehydration.
  • the rehydrated hydrogel beads by the spherical shape as it is given before freeze-drying. This promotes the cultivation of cells on the hydrogel beads in an inoculation phase.
  • spherical, rehydrated hydrogel beads are advantageously characterized by a favorable floating behavior in the suspension and a reduced tendency towards undesired aggregation compared to deformed hydrogel beads.
  • the hydrogel beads are loaded with a protein layer.
  • the protein layer can e.g. B. proteins of the extracellular matrix, so that advantageously an adhesion of the cells to rehydrated hydrogel beads is promoted.
  • the protein layer can comprise a sub-monolayer, a monolayer or a multilayer of protein molecules on the hydrogel beads.
  • the at least one protein to be coupled is added to the suspension liquid and incubated with the hydrogel beads. The incubation advantageously allows a covalent coupling of at least one protein or a mediator molecule with the entire surface, including any pores, of the hydrogel beads.
  • the protein layer is preferably loaded before freeze-drying.
  • the load with the protein layer after freeze drying, especially after rehydration, z. B. in the bioreactor can be supplied from the cultivation medium in the bioreactor or from cells already present in the bioreactor.
  • the hydrogel beads are preferably loaded with at least one mediator molecule (e.g. tyramine) and / or at least one of the proteins that laminin (recombinant and tissue-specific), vitronectin (recombinant and compatible with pluripotent stem cells), collagen (tissue-specific, compatible with multipotent stem cells), proteins from decellularized tissue (very tissue-specific) and complex protein mixtures from the basal matrix (e.g. Gel trex, Matrigel, denovoMatrix).
  • mediator molecule e.g. tyramine
  • laminin recombinant and tissue-specific
  • vitronectin recombinant and compatible with pluripotent stem cells
  • collagen tissue-specific, compatible with multipotent stem cells
  • proteins from decellularized tissue very tissue-specific
  • complex protein mixtures from the basal matrix e.g. Gel trex, Matrigel, denovoMatrix.
  • residues of the lyoprotectant substance are removed after the freeze-drying. If residues of the lyoprotectant substance are separated from the dried hydrogel particles, there are advantages for the later rehydration and subsequent cell cultivation. Influences of the lyoprotectant substance on the cells are advantageously avoided or minimized.
  • the removal of residues of the lyoprotectant substance comprises a complete elimination of the lyoprotectant substance from the dried hydrogel particles or an elimination of the lyoprotectant substance from the surfaces of the dried hydrogel particles.
  • the surfaces of the dried hydrogel particles are particularly preferably free from residues of the lyoprotectant substance.
  • the residues of the lyoprotectant substance, such as. B. the "lyo cake" is removed by mechanical processing of the dried material, including its comminution and sieving.
  • the dried hydrogel particles are separated from one another at the same time as the lyoprotectant substance is separated from the dried hydrogel.
  • residues of the dried lyoprotectant substance can be removed after rehydration of the dried hydrogel particles and before the particles are used in a washing solution, in particular of sodium chloride.
  • washing the rehydrated hydrogel beads further suppresses any influence of the lyoprotectant substance on the subsequent cell cultivation.
  • the lyoprotectant substance can in particular comprise trehalose, dimethyl sulfoxide (DMSO), sucrose and / or a poloxamer.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • sucrose sucrose
  • a poloxamer a poloxamer
  • Trehalose and / or sucrose are particularly preferred as lyoprotectant substance, since when they are used carrier particles are obtained which, after rehydration, are characterized by particularly extensive shape and function retention and in cell culture by particularly good cell adhesion.
  • the concentration of the lyoprotectant substance in the suspension liquid with the hydrogel beads originally produced is selected in the range from 1 mg / ml to 500 mg / ml. This concentration range will preferred, since below the concentration of 1 mg / ml an approximation to the spherical Parti kelform is only insufficiently achieved and above 500 mg / ml an excessive load of the cultivation medium in the bioreactor by the lyoprotectant substance can occur.
  • the cell carriers produced according to the invention can be functionalized for the cultivation of biological cells.
  • the hydrogel beads are preferably functionalized before or during their production (encapsulation of active ingredients, magnetic particles, etc.), e.g. B. before or during dropletization to produce the hydrogel beads by precipitation so that the substances are included in the hydrogel matrix, or after their provision and before freeze-drying (e.g. functionalization of the surface with tyramine and / or proteins) .
  • the functionalization comprises the addition of particles and / or substances which give the hydrogel beads further properties that go beyond the carrier function.
  • the hydrogel beads are loaded with magnetic particles and / or biologically active substances (active ingredients).
  • the magnetic particles and / or the active ingredients are particularly preferably fed in before the freeze-drying.
  • the inventors have found that the functionalized hydrogel beads also form spherical cell carriers in the dried state, particles with an approximately spherical shape and rehydrated state.
  • Hydrogel beads each containing one or more magnetic particles, offer before geous enough the possibility of manipulating the cell carrier in the bioreactor by means of magnetic fields.
  • the magnetic particles can consist of permanent magnet materials known per se.
  • biologically active substances for modifying hydrogel beads preference is given to differentiating factors, d. H. biologically active substances that trigger cell differentiation and / or influence a direction of cell differentiation at a certain point in time, used.
  • the dispersion of the initially provided hydrogel beads contains a cohesion-reducing substance, mutual adhesion of the dried hydrogel particles is suppressed.
  • the cohesion-reducing substance comprises polyethylene glycol, the effect of which on biological cells has advantageously been well investigated.
  • a freeze-drying process known per se can be selected for the freeze-drying of the hydrogel beads.
  • a protocol with the following phases is preferably used for freeze-drying, in particular of alginate beads.
  • Freezing rates in the range from 50 ° C./min (rapid freezing), from 1 to 1.5 ° C./min (moderate freezing) to 0.1 to rc / min (slow freezing) are preferably set.
  • the setting in the time-temperature function advantageously allows the hydrogel beads to be frozen gently.
  • a stabilization phase is then provided in which the hydrogel beads are stored at the final temperature for a stabilization interval of at least 90 minutes. Thereafter, in a first drying phase to form the dried hydrogel particles, the frozen hydrogel beads are subjected to a first negative pressure at the end temperature, which is selected in the range from 30 pbar to 60 pbar.
  • a second drying phase follows, in which the dry hydrogel particles are subjected to a second negative pressure which is lower than the first negative pressure at a temperature equal to or greater than the final temperature.
  • an aeration phase in which the dried hydrogel particles are slowly converted to normal pressure according to a time-pressure function with a pressure increase interval of at least 0.5 min to 1 min (1 bar / min).
  • the ventilation phase takes place in a vessel under loading with an inert protective gas or air.
  • FIG. 1 a flow chart showing features of preferred embodiments of the method according to the invention for producing carrier particles
  • FIG. 2 a flow chart showing features of preferred embodiments of the application of carrier particles produced according to the invention
  • FIG. 3 photographic images of rehydrated carrier particles in comparison with conventional carrier particles
  • FIG. 4 a schematic process illustration of an example application of carrier particles produced according to the invention.
  • alginate-based cell carriers carrier particles
  • Alginate beads which according to the invention are loaded with the lyoprotectant substance and subjected to freeze-drying, can for example be produced from commercially available alginate, which typically has a low viscosity due to the relatively short chain lengths of the polymer macromolecules.
  • alginate can be used with a higher viscosity than the commercially available alginate due to longer molecular chains.
  • a specific alginate to be used is selected, for example, as a function of the desired elasticity of the cell carrier during cell cultivation.
  • the invention is not limited to the use of alginate, but can also be implemented accordingly with other Flydrogels, such as collagen, gellan or pectin.
  • Embodiments of the invention are described below in particular with reference to examples for the loading of alginate with lyoprotectant substances, the modification of alginate beads, dried alginate particles and / or rehydrated alginate beads and the freeze-drying protocols. Details of the use of the rehydrated alginate beads in the cultivation of biological cells can be implemented, as is known per se from conventional cell cultivation.
  • FIG. 1 shows schematically the main steps in the production of dried alginate particles according to the invention.
  • alginate beads are prepared in an aqueous suspension in a container.
  • the alginate spheres are frozen, for example, by generating Na alginate droplets with a nozzle and crosslinking the alginate droplets in an aqueous suspension liquid with an ionic precipitant, for example as described in [1].
  • a BaCh solution for example, is used as the precipitant.
  • the size and size distribution of the alginate beads can be adjusted by the dimensions of the nozzle and the operating parameters of the nozzle.
  • the cross-linked alginate droplets form dimensionally stable alginate balls that are suspended in the suspension liquid.
  • the alginate beads are coated with tyramine and / or a protein, such as e.g. B. Matrigel, functionalized.
  • the coating takes place by precipitation from the suspension liquid or direct covalent coupling.
  • the matrix coating offers advantages for the adhesion of cells in a subsequent cell cultivation.
  • a lyoprotectant substance is added to the suspension liquid while the alginate droplets are dripping into the suspension liquid or, alternatively, after the crosslinking and formation of the alginate beads.
  • trehalose 100 mg / ml
  • poloxamer trade name Pluronic F 68, 1 mg / ml
  • sucrose 100 mg / ml
  • the loading of the suspended alginate beads with the lyoprotectant substance takes place, for. B. by storing the Algi nat beads in an aqueous solution containing the lyoprotectant substance, e.g. B. for at least a day.
  • the alginate beads loaded with the lyoprotectant substance are removed from the suspension.
  • the suspension liquid is poured off so that the alginate beads, surrounded by residual liquid, remain in the container.
  • a sieve is used for removal.
  • step P2 the alginate beads are freeze-dried in step P3 immediately after the alginate beads have been loaded with the lyoprotectant substance.
  • the following phases are planned.
  • the alginate beads are frozen in a freezing phase over 150 minutes from room temperature to a final temperature of z. B. - 45 ° C cooled (approx. 0.4 ° C / min).
  • a linear time-temperature function is implemented during the freezing phase.
  • the stabilization phase has the advantage that the sample with the frozen alginate beads is completely frozen through before the drying phases are carried out.
  • a subsequent first drying phase has the function of a drying phase in which the suspension liquid is removed by means of sublimation.
  • the first drying phase is carried out, for example, in a lyophilizer with a cooling unit and a condenser.
  • the final temperature for example ⁇ 45 ° C.
  • the pressure is reduced from atmospheric pressure to a first negative pressure of 50 pbar over a period of 10 minutes, following a linear time-pressure function.
  • the frozen sample is kept at the final temperature and the first negative pressure for a stabilization period of, for example, 80 hours.
  • the dried alginate particles are subjected to a second negative pressure which is lower than the first negative pressure and is, for example, 100 pbar.
  • the lowering to the second negative pressure takes place with a linear time-pressure function over a period of, for example, 300 min.
  • the temperature of the dried alginate particles is equal to the end temperature or an increased temperature, such as, for example Room temperature (20 ° C).
  • the dried sample is kept at the second negative pressure for a stabilization period of, for example, 20 hours during the second drying phase.
  • a ventilation phase is then provided in which the dried alginate particles are converted to normal pressure according to a linear time-pressure function with a pressure increase interval of at least 1 min.
  • the ventilation phase can be provided with air or an inert gas. By using a relatively long pressure increase interval, damage to the dried alginate particles is advantageously avoided.
  • ventilating with air the storage vessel in the chamber is closed beforehand, while when an inert gas is used, it is closed after ventilation.
  • the inert gas used is preferably dry nitrogen or argon.
  • the dried alginate particles are particularly preferably stored in the inert gas or in a vacuum. Practical tests have shown that the dried alginate particles produced according to the invention can be stored e.g. B. at 4 ° C without loss of functionality over several months.
  • the freeze-drying method P3 described by way of example can be modified in relation to the set temperatures and pressures and the form of the time-pressure and time-temperature functions as a function of the specific application conditions. For example, preparatory tests can be used to determine which time and pressure parameters provide optimal drying results for a specific hydrogel, in particular alginate sample.
  • the dried alginate particles are available as finished cell carriers. Due to the addition of the lyoprotectant substance according to the invention, the dried alginate particles have a spherical shape (see, for example, the photographic illustration in FIG. 4), which is advantageously retained even after rehydration.
  • the getrockne th particles can form a cake or a free-flowing bulk material from individual particles.
  • the formation of the free-flowing bulk material is promoted if the suspension of the alginate beads is supplied with a cohesion-reducing substance such as polyethylene glycol in addition to the lyoprotectant substance.
  • a cohesion-reducing substance such as polyethylene glycol in addition to the lyoprotectant substance.
  • polyethylene glycol with the trade name PEG 600 is used at a concentration of 50 mg / ml in order to minimize sticking of the dried alginate particles.
  • a step P4 can optionally be provided for removing the Lyoprotek tant substance, in particular from the surface of the dried alginate particles, e.g. B. be provided by sieving or grinding.
  • an aqueous cultivation medium is prepared in a bioreactor.
  • the composition of the cultivation medium is selected in a manner known per se, depending on the specific application of cell cultivation.
  • the alginate particles produced according to the invention are added to the cultivation medium.
  • the dried alginate particles are metered, for example, by weighing. Tests with dried alginate particles produced according to the invention showed that particles without a polyethylene glycol load initially lay on the surface of the cultivation medium and only sink into the cultivation medium after centrifugation, while particles modified with polyethylene glycol do not float on the cultivation medium would.
  • FIG. 3 shows photographic, light microscopic images of alginate beads which, in accordance with preferred variants of the invention, have been loaded with trehalose (A) or sucrose (B), freeze-dried and rehydrated, in comparison with alginate beads which have been used without lyoprotectant substance (C.
  • the rehydrated particles (A, B) produced according to the invention advantageously clearly have the same spherical shape as the suspended, untreated alginate beads (D).
  • the untreated freeze-dried and rehydrated particles (C) (for example according to [1]), in contrast to the untreated alginate beads, have a jagged, irregular surface.
  • dried alginate particles 1 are placed in a first cultivation vessel 2, e.g. B. a suspension bioreactor with a volume of a few ml (e.g. 10 ml) to several liters (e.g. 31) is given.
  • alginate beads 3 shown by way of example
  • 4 hiPSC cells are transferred from a vessel into the cultivation vessel 2. The cells are then cultivated under specified cultivation conditions, in which the cells first adhere and adhere to the micro-carriers and then multiply (e.g.
  • the alginate beads with attached cells 5 are obtained, i.e. after this extraction (e.g. by an enzymatic treatment) the used micro-carriers 6 and the multiplied hiPS cells 7 are available. These can then be stored in a cell bank 10, further examined and / or processed 9 (e.g. differentiation into cardiomyocytes), and / or transferred to a direct application 8 (e.g. bioprinting).
  • a direct application 8 e.g. bioprinting

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Abstract

The invention relates to a process for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, comprising the steps of providing an aqueous suspension of hydrogel beads and freeze-drying of the hydrogel beads so that dry hydrogel particles are formed, wherein at least one lyoprotectant substance is added to the suspension, the hydrogel beads are loaded in the suspension with the lyoprotectant substance and the dry hydrogel particles receive a shape under the effect of the lyoprotectant substance, which shape approximates a spherical particle shape and is still maintained after rehydrating. The invention also relates to carrier particles for a cultivation of biological cells, which comprise dry hydrogel particles, preferably having a protein coating, and to applications of the carrier particles.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON TRÄGERPARTIKELN FÜR DIE KULTIVIERUNG BIOLOGISCHER ZELLEN, TRÄGERPARTIKEL UND DEREN ANWENDUNG METHOD FOR MANUFACTURING CARRIER PARTICLES FOR THE CULTIVATION OF BIOLOGICAL CELLS, CARRIER PARTICLES AND THEIR APPLICATION
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biolo gischer Zellen, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von getrockneten Hydrogel-Partikeln. Des Weiteren betrifft die Erfindung Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, insbe sondere getrocknete Hydrogel-Partikel, die mit dem genannten Verfahren hergestellt sind, und Anwendungen der Trägerpartikel. Anwendungen der Erfindung sind bei der Kultivierung biologi scher Zellen, insbesondere bei der Kultivierung (Expansion) von multipotenten und pluripotenten Stammzellen oder von differenzierten Zellen, z.B. für das Tissue engineering, gegeben. The invention relates to a method for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, in particular a method for producing dried hydrogel particles. The invention also relates to carrier particles for culturing biological cells, in particular special dried hydrogel particles which are produced using the method mentioned, and applications of the carrier particles. The invention can be used in the cultivation of biological cells, in particular in the cultivation (expansion) of multipotent and pluripotent stem cells or of differentiated cells, e.g. for tissue engineering.
In der vorliegenden Beschreibung wird auf den folgenden Stand der Technik Bezug genommen, der den technischen Hintergrund der Erfindung darstellt: In the present description, reference is made to the following prior art, which represents the technical background of the invention:
[1] Dissertation "Untersuchung von strukturbildenden zellulären Prozessen im Kontext des Tissue Engineerings: Alginat-basierte Gerüststrukturen" Michael Gepp, Universität des Saarlandes, 2017; [1] Dissertation "Investigation of structure-forming cellular processes in the context of tissue engineering: Alginate-based framework structures" Michael Gepp, Saarland University, 2017;
[2] EP 2361968 Al; [2] EP 2361968 A1;
[3] US 6642363 Bl; und [3] US 6642363 B1; and
[4] M. Gepp et al. in J. Appl. Phycol." (2017) 29:2451-2461. [4] M. Gepp et al. in J. Appl. Phycol. "(2017) 29: 2451-2461.
Die Verwendung von Polysaccharid-Polymeren, insbesondere von Alginat-Hydrogelen (auch kurz als Alginate bezeichnet), als Träger für Zellkulturen ist allgemein bekannt (siehe [1] und darin zi tierte Literatur). Alginate können schichtförmig auf zweidimensionalen Substraten oder als Zell- Carrier (kugelförmige Partikel, Kügelchen, Carrier-Beads, Micro-Carrier) in Suspensionen verwen det werden (siehe z. B. [1], [2]). In Abhängigkeit von der konkreten Kultivierungsaufgabe und den zu kultivierenden Zellen können Alginate durch Zusatzstoffe modifiziert werden. Zusatzstoffe um fassen z. B. Peptide oder Kollagen, welche die Zelladhäsion beeinflussen (siehe z. B. [3] oder [4]). Die Zellkultivierung auf Micro-Carriern in Suspensionen, z. B. in Bioreaktoren, hat Vorteile für die Bildung von dreidimensionalen Zellanordnungen (z. B. 3D-Aggregate, Sphäroide, Mikro-Carrier- Zell-Hybride) unter nahezu physiologischen Bedingungen, und sie erlaubt eine effiziente Prozess führung, da ein günstigeres Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis eingestellt werden kann. Die herkömmliche Zellkultivierung unter Verwendung von Alginaten als Micro-Carrier in einem Bioreaktor umfasst beispielsweise die folgenden Schritte. Zunächst werden Alginat-Kügelchen hergestellt, indem flüssiges Alginat durch Vernetzung in Kugelform ausgefällt wird (siehe z. B. [1]). Es wird eine Suspension von Alginat-Kügelchen gebildet, die, je nach Anwendung, eine Größenver teilung mit Durchmessern im Bereich von 200 pm bis 500 pm aufweisen. Die Breite der Größen verteilung, die in Abhängigkeit von Vertropfungsbedingungen einstellbar ist, kann sich auf die nachfolgende Zellkultivierung auswirken. Nach einem Waschen der vernetzten Alginat-Kügelchen erfolgt deren Modifizierung (Aktivierung und/oder Funktionalisierung), z. B. durch Ankopplung von Tyramin oder eine Einstellung der Elastizität der Kügelchen mittels vor der Herstellung der Alginat-Kügelchen gewählter Alginatmischungen. Die fertig modifizierten Alginat-Kügelchen wer den in einem Kultivierungsmedium suspendiert und in einen Bioreaktor gegeben. Die zu kultivie renden Zellen werden der Suspension im Bioreaktor zugesetzt, wo sie die Alginat-Kügelchen be siedeln und einem vorgegebenen Kultivierungsprotokoll unterzogen werden. The use of polysaccharide polymers, in particular alginate hydrogels (also referred to as alginates for short), as carriers for cell cultures is generally known (see [1] and the literature cited therein). Alginates can be used in layers on two-dimensional substrates or as cell carriers (spherical particles, spheres, carrier beads, micro-carriers) in suspensions (see, for example, [1], [2]). Depending on the specific cultivation task and the cells to be cultivated, alginates can be modified by additives. Additives include z. B. peptides or collagen, which affect cell adhesion (see, for example, [3] or [4]). Cell cultivation on micro-carriers in suspensions, e.g. B. in bioreactors, has advantages for the formation of three-dimensional cell arrangements (e.g. 3D aggregates, spheroids, micro-carrier cell hybrids) under almost physiological conditions, and it allows efficient process management, since a more favorable surface to volume ratio can be adjusted. Conventional cell cultivation using alginates as micro-carriers in a bioreactor comprises the following steps, for example. First of all, alginate spheres are produced in that liquid alginate is precipitated into spherical form through crosslinking (see, for example, [1]). A suspension of alginate beads is formed which, depending on the application, has a size distribution with diameters in the range from 200 μm to 500 μm. The width of the size distribution, which can be adjusted depending on the dropping conditions, can have an effect on the subsequent cell cultivation. After the crosslinked alginate beads have been washed, they are modified (activated and / or functionalized), e.g. B. by coupling tyramine or adjusting the elasticity of the beads by means of alginate mixtures selected before the production of the alginate beads. The finished modified alginate beads who suspended in a culture medium and placed in a bioreactor. The cells to be cultivated are added to the suspension in the bioreactor, where they colonize the alginate beads and are subjected to a specified cultivation protocol.
Das herkömmliche Verfahren hat die folgenden Nachteile und Beschränkungen. Die Herstellung der modifizierten Alginat-Kügelchen mit vorbestimmten Eigenschaften erfordert Spezialkennt nisse, was eine routinemäßige Bereitstellung der Alginat-Kügelchen in einem Labor zur Zellkulti vierung oder für eine industrielle Anwendung erschwert. Typischerweise werden die Alginat-Kü gelchen nach Vorgaben des Anwenders, z. B. mit einer bestimmten Größenverteilung, Durchmes ser) und/oder Modifizierung, hergestellt, zum Anwender in Suspension geliefert und beim Anwen der zunächst gelagert. Von Nachteil ist jedoch, dass der Transport und die Lagerung der Suspen sion beim Anwender die Alginat-Kügelchen in unerwünschter Weise verändern können. The conventional method has the following disadvantages and limitations. The production of the modified alginate beads with predetermined properties requires special knowledge, which makes routine provision of the alginate beads in a laboratory for cell cultivation or for industrial use difficult. Typically, the alginate balls are made according to the user's specifications, e.g. B. with a certain size distribution, diam ser) and / or modification, manufactured, delivered to the user in suspension and initially stored when the user. The disadvantage, however, is that the transport and storage of the suspension at the user's site can change the alginate beads in an undesirable manner.
Alginat-Kügelchen können aggregieren (verklumpen) oder zerfallen, was sich nachteilig auf eine genaue, reproduzierbare Dosierung durch den Anwender auswirkt. Bei der Lagerung kann die Ste rilität der Alginat-Kügelchen verloren gehen. Des Weiteren können Eigenschaften der fertigen Al ginat-Kügelchen vom Anwender nicht oder nur sehr beschränkt geprüft oder variiert werden. Bei spielsweise lässt sich die Größenverteilung von Alginat-Kügelchen in einer Suspension nachträg lich, wenn überhaupt, nur unter großem Aufwand verändern. Der Wasseranteil der Alginat-Kügel chen kann das Kultivierungsmedium im Bioreaktor verfälschen. Um dies zu vermeiden, kann die Zahl der Alginat-Kügelchen gering gehalten werden, was jedoch zu einem hohen Medienver brauch und einer kleinen Zahl kultivierbarer Zellen führt. Im Ergebnis zeichnen sich herkömmliche Verfahren zur Zellkultivierung durch eine geringe Effektivität, hohe Prozesskosten, keine Skalier- barkeit, eine beschränkte Erfolgsquote und eine geringe Reproduzierbarkeit aus. Es ist auch bekannt, Alginat-Kügelchen einer Trocknung zu unterziehen ([1]). Getrocknete Alginat- Kügelchen lassen sich besser lagern als in Suspension. Des Weiteren können getrocknete Alginat- Kügelchen mit dem Kultivierungsmedium im Bioreaktor rehydratisiert werden. Die Beschränkun gen der herkömmlichen Anwendungen von Alginat-Kügelchen konnten damit in der Praxis jedoch bisher nicht überwunden werden. Auch bei der Anwendung von herkömmlich getrockneten und rehydratisierten Alginat-Kügelchen hat sich gezeigt, dass die getrockneten Alginat-Kügelchen schwer handhabbar sind und die Zuverlässigkeit einer erfolgreichen Zellkultivierung und die Re produzierbarkeit des Kultivierungsergebnisses selbst bei Anwendung gleichbleibender Kultivie rungsprotokolle beschränkt sind. Alginate beads can aggregate (clump) or disintegrate, which has a detrimental effect on precise, reproducible dosing by the user. The sterility of the alginate beads can be lost during storage. Furthermore, the properties of the finished alginate beads cannot be checked or varied by the user, or only to a very limited extent. For example, the size distribution of alginate beads in a suspension can only be changed retrospectively, if at all, with great effort. The water content of the alginate beads can falsify the cultivation medium in the bioreactor. To avoid this, the number of alginate beads can be kept low, but this leads to a high consumption of media and a small number of cells that can be cultured. As a result, conventional methods for cell cultivation are characterized by low effectiveness, high process costs, no scalability, a limited success rate and low reproducibility. It is also known to subject alginate beads to a drying process ([1]). Dried alginate beads are easier to store than in suspension. Furthermore, dried alginate beads can be rehydrated with the cultivation medium in the bioreactor. However, it has not yet been possible to overcome the limitations of the conventional uses of alginate beads in practice. Even when using conventionally dried and rehydrated alginate beads, it has been shown that the dried alginate beads are difficult to handle and that the reliability of successful cell cultivation and the reproducibility of the cultivation result are limited, even if constant cultivation protocols are used.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen, insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von getrockneten Hydrogel-Partikeln, bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techni ken überwunden werden. Die Aufgabe der Erfindung ist es des Weiteren, verbesserte Trägerparti kel für eine Kultivierung biologischer Zellen bereitzustellen, mit denen Nachteile herkömmlicher Trägerpartikel überwunden werden. Die Erfindung soll insbesondere Trägerpartikel bereitstellen, die reproduzierbare Eigenschaften haben, eine verbesserte Lagerungsfähigkeit aufweisen, ge nauer dosierbar sind, einfacher modifizierbar sind und/oder für eine routinemäßige Anwendung in Bioreaktoren verschiedener Bauformen und Aufgaben geeignet sind. Erfindungsgemäß herge stellte Trägerpartikel sollen insbesondere eine Zellkultivierung mit erhöhter Effizienz, Erfolgsquote und/oder Reproduzierbarkeit erlauben. The object of the invention is to provide an improved method for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, in particular an improved method for producing dried hydrogel particles, with which the disadvantages of conventional techniques are overcome. The object of the invention is furthermore to provide improved carrier particles for cultivating biological cells with which the disadvantages of conventional carrier particles are overcome. The invention is intended in particular to provide carrier particles which have reproducible properties, have improved storability, can be dosed more precisely, can be modified more easily and / or are suitable for routine use in bioreactors of various designs and tasks. Carrier particles produced according to the invention should in particular allow cell cultivation with increased efficiency, success rate and / or reproducibility.
Diese Aufgaben werden jeweils durch ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen und durch Trägerpartikel gelöst, welche die Merkmale der unab hängigen Ansprüche aufweisen. Bevorzugte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. These objects are each achieved by a method for producing carrier particles for the cultivation of biological cells and by carrier particles which have the features of the independent claims. Preferred embodiments and applications of the invention emerge from the dependent claims.
Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen gelöst, das die folgenden Schritte umfasst. Es wird eine wässrige Suspension von sphärischen Hydrogel-Kügel chen bereitgestellt. Vorzugsweise werden die Hydrogel-Kügelchen durch Vernetzung eines Vor läuferpolymers mit einem ionischen Fällungsmittel frisch hergestellt. Die Herstellung der Hydro gel-Kügelchen kann mit an sich bekannten Verfahren erfolgen. Die Suspensionsflüssigkeit der wässrigen Suspension von Hydrogel-Kügelchen umfasst eine wässrige Lösung mit dem Fällungs mittel, in der die Herstellung der Hydrogel-Kügelchen erfolgt, und/oder eine Wasch- und/ oder Pufferlösung, mit der die Hydrogel-Kügelchen nach der Fällung optional gewaschen werden. An schließend erfolgt eine Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen, so dass getrocknete Hydrogel- Partikel gebildet werden. Die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen umfasst eine Beaufschla gung der Hydrogel-Kügelchen mit einer reduzierten Temperatur (Temperatur unterhalb der Raumtemperatur, vorzugsweise unter 0°C) und mit einem Unterdrück (Druck geringer als Atmo sphärendruck). Die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen erfolgt vorzugsweise im suspendier ten Zustand mit der Suspensionsflüssigkeit, wobei zunächst die Suspensionsflüssigkeit entfernt und dann die Hydrogel-Kügelchen getrocknet werden. Alternativ können die Hydrogel-Kügelchen vor der Gefriertrocknung aus der Suspensionsflüssigkeit der wässrigen Suspension entnommen werden, d. h. die Suspensionsflüssigkeit wird vor der Gefriertrocknung von den Hydrogel-Kügel chen getrennt. According to a first general aspect of the invention, the above object is achieved by a method for producing carrier particles for the cultivation of biological cells, which method comprises the following steps. An aqueous suspension of spherical hydrogel beads is provided. The hydrogel beads are preferably freshly prepared by crosslinking a precursor polymer with an ionic precipitant. The hydrogel beads can be produced using methods known per se. The suspension liquid of the aqueous suspension of hydrogel beads comprises an aqueous solution with the precipitant, in which the production of the hydrogel beads takes place, and / or a washing and / or Buffer solution with which the hydrogel beads are optionally washed after precipitation. The hydrogel beads are then freeze-dried so that dried hydrogel particles are formed. The freeze-drying of the hydrogel spheres comprises subjecting the hydrogel spheres to a reduced temperature (temperature below room temperature, preferably below 0 ° C.) and a negative pressure (pressure less than atmospheric pressure). The hydrogel beads are preferably freeze-dried in the suspended state with the suspension liquid, the suspension liquid being removed first and then the hydrogel beads being dried. Alternatively, the hydrogel beads can be removed from the suspension liquid of the aqueous suspension prior to freeze-drying, ie the suspension liquid is separated from the hydrogel beads prior to freeze-drying.
Gemäß der Erfindung wird der Suspensionsflüssigkeit mindestens eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt, wobei die Hydrogel-Kügelchen in der Suspension vor der Gefriertrocknung mit der Lyoprotektant-Substanz beladen werden. Die Lyoprotektant-Substanz (oder: Lyoprotektivum) ist eine Substanz, die eine Beschädigung der Hydrogel-Kügelchen, insbesondere der Makromoleküle, aus denen die Hydrogel-Kügelchen aufgebaut sind, durch Eisbildung bei der Gefriertrocknung mi nimiert oder die Beschädigung verhindert. Des Weiteren wird eine Lyoprotektant-Substanz ver wendet, die bewirkt, dass die Hydrogel-Kügelchen nach der Gefriertrocknung, d. h. die getrockne ten Hydrogel-Partikel, unter der Wirkung der Lyoprotektant-Substanz eine Form aufweisen, wel che an eine sphärische Partikelform angenähert ist. According to the invention, at least one lyoprotectant substance is added to the suspension liquid, the hydrogel beads in the suspension being loaded with the lyoprotectant substance prior to freeze-drying. The lyoprotectant substance (or: lyoprotectant) is a substance which minimizes or prevents damage to the hydrogel beads, in particular the macromolecules from which the hydrogel beads are built up, by ice formation during freeze-drying. Furthermore, a lyoprotectant substance is used, which causes the hydrogel beads after freeze-drying, i. H. the getrockne th hydrogel particles, under the action of the lyoprotectant substance, have a shape which approximates a spherical particle shape.
Die Hydrogel-Kügelchen umfassen vorzugsweise Alginat-Kügelchen (Alginat-Hydrogele). Die Um setzung der Erfindung in der Praxis ist jedoch nicht auf Alginat-Kügelchen beschränkt, sondern entsprechend auch mit Kollagen-, Gellan- oder Pektin-Hydrogelen. Alginat hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, da es einen Formspeicher-Effekt (Memory-Effekt) aufweist und nach dem Gefriertrocknen und der Rehydratisierung wieder sphärische Alginat-Kügelchen bildet. The hydrogel beads preferably comprise alginate beads (alginate hydrogels). The implementation of the invention in practice is not limited to alginate beads, but also accordingly with collagen, gellan or pectin hydrogels. Alginate has proven to be particularly advantageous because it has a shape memory effect and, after freeze-drying and rehydration, forms spherical alginate beads again.
Der Begriff "annähernd sphärische Partikelform" schließt eine Gestalt eines getrockneten Hydro- gel-Partikels ein, die einen Sphäroiden (insbesondere Kugel oder Ellipsoid) repräsentiert und eine glatte oder strukturierte Oberflächentopologie mit charakteristischen Strukturdimensionen wie z. B. Stufen, Vorsprüngen oder Vertiefungen, aufweist, die kleiner als eine Querschnittsdimension, vorzugsweise kleiner als 1/10 der Querschnittsdimension, des getrockneten Hydrogel-Partikels ist. Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, die getrocknete Hydrogel-Partikel umfas sen, die eine Lyoprotektant-Substanz enthalten und eine Form aufweisen, die an eine sphärische Form angenähert ist. Die Trägerpartikel sind vorzugsweise mit dem genannten Verfahren gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder einer seiner Ausführungsformen her gestellt. Vorzugsweise haben die Trägerpartikel eine charakteristische Querschnittsdimension, wie z. B. einen Durchmesser, im Bereich von 50 pm bis 2 mm. The term "approximately spherical particle shape" includes a shape of a dried hydrogel particle which represents a spheroid (in particular a sphere or ellipsoid) and a smooth or structured surface topology with characteristic structural dimensions such as, for. B. steps, projections or depressions, which is smaller than a cross-sectional dimension, preferably smaller than 1/10 of the cross-sectional dimension, of the dried hydrogel particle. According to a second general aspect of the invention, the above object is achieved by carrier particles for culturing biological cells comprising dried hydrogel particles containing a lyoprotectant substance and having a shape approximating a spherical shape. The carrier particles are preferably made using the method mentioned according to the first general aspect of the invention or one of its embodiments. Preferably, the carrier particles have a characteristic cross-sectional dimension, such as. B. a diameter in the range of 50 pm to 2 mm.
Gemäß einem dritten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch An wendungen der Trägerpartikel gemäß dem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder ihren Ausführungsformen als Zell-Carrier für die Kultivierung biologischer Zellen gelöst. Ge mäß bevorzugten Varianten kann die Anwendung der Trägerpartikel in einem Suspensions-Biore- aktor, insbesondere einem Kultivierungsgefäß, einer Mikrotiterplatte, hängenden Tropfen, einem Zellkulturbeutel, einem (Suspensions-)bioreaktor und/oder einer Schale, wie zum Beispiel einer Petrischale, vorgesehen sein. Vorzugsweise umfasst die Anwendung der Trägerpartikel die Phasen Herstellung der getrockneten Partikel, Rehydratisierung und Waschung, Zellinokulation, Zellver mehrung und Zellpassage/Ernte. According to a third general aspect of the invention, the above object is achieved by using the carrier particles according to the second general aspect of the invention or their embodiments as cell carriers for the cultivation of biological cells. According to preferred variants, the use of the carrier particles can be provided in a suspension bioreactor, in particular a culture vessel, a microtiter plate, hanging drops, a cell culture bag, a (suspension) bioreactor and / or a dish, such as a Petri dish . The use of the carrier particles preferably comprises the phases of producing the dried particles, rehydration and washing, cell inoculation, cell multiplication and cell passage / harvest.
Die Erfinder haben festgestellt, dass durch die erfindungsgemäße Beladung der Hydrogel-Kügel chen mit der Lyoprotektant-Substanz, welche die annähernd sphärische Partikelform der Getrock neten Hydrogel-Partikel bewirkt, die Nachteile herkömmlicher suspendierter oder getrockneter Alginat-Kügelchen in Bezug auf die Lagerfähigkeit, Dosierbarkeit und Handhabbarkeit vermieden werden. Es wird eine schonende Gefriertrocknung mit einem Struktur- und Funktionserhalt der sphärische Hydrogel-Kügelchen bewirkt. The inventors have found that the inventive loading of the hydrogel beads with the lyoprotectant substance, which causes the approximately spherical particle shape of the dried hydrogel particles, the disadvantages of conventional suspended or dried alginate beads in terms of shelf life, dosability and manageability can be avoided. A gentle freeze-drying is achieved with the structure and function of the spherical hydrogel beads being preserved.
Die Lagerfähigkeit ist verbessert, da ein Verkleben oder Aggregieren vermieden wird, im trocke nen Zustand die Sterilität besser aufrechterhalten werden kann und somit ein Verkeimen der prä parierten Carrier-Beads vermieden werden kann. Diese Vorteile gelten insbesondere auch gegen über den herkömmlichen Ansätzen einer Gefriertrocknung von Alginat-Kügelchen, z. B. gemäß [1] So haben die Erfinder festgestellt, dass die herkömmlichen Alginat-Kügelchen im getrockneten Zu stand keine sphärische, sondern eine irregulär deformierte, z. B. gefaltete und/oder durch Risse oder Ausstülpungen versehene Gestalt haben, welche die Beschaffenheit der getrockneten Algi nat-Kügelchen, z. B. durch Dichteschwankungen im Schüttmaterial und irreguläre Klumpenbil dung, beeinträchtigt. Erfindungsgemäß hergestellte getrocknete Hydrogel-Partikel begünstigen eine sterile Lyophilisation und Rehydratisierung. Die Dosierbarkeit ist verbessert, da die getrockneten Hydrogel-Partikel ein homogenes Material bilden, das vollständig rieselfähig ist oder einen schnittfähigen Kuchen (Lyo-Kuchen, auch als ge trocknete Produktmatrix bezeichnet) bildet. Die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Konzent rationseinstellung der Carrier-Beads im Bioreaktor wird verbessert. Die getrockneten Hydrogel- Partikel können z. B. durch eine Volumenmessung, eine Massemessung und/oder eine optische Messung quantifiziert werden. Da die Getrockneten Hydrogel-Partikel opak sind, kann mit der op tischen Messung die Rehydratisierung im Bioreaktor geprüft werden. The shelf life is improved because sticking or aggregation is avoided, sterility can be better maintained in the dry state and thus germination of the prepared carrier beads can be avoided. These advantages also apply in particular to the conventional approaches of freeze drying of alginate beads, e.g. B. according to [1] The inventors have found that the conventional alginate beads in the dried state were not spherical, but irregularly deformed, e.g. B. folded and / or provided by cracks or protuberances shape, which the nature of the dried Algi nat beads, z. B. by density fluctuations in the bulk material and irregular Klumpenbil training, impaired. Dried hydrogel particles produced according to the invention promote sterile lyophilization and rehydration. Dosability is improved because the dried hydrogel particles form a homogeneous material that is completely free-flowing or forms a cake that can be cut (Lyo cake, also known as the dried product matrix). The accuracy and reproducibility of the concentration setting of the carrier beads in the bioreactor is improved. The dried hydrogel particles can, for. B. be quantified by a volume measurement, a mass measurement and / or an optical measurement. Since the dried hydrogel particles are opaque, the rehydration in the bioreactor can be checked with the optical measurement.
Die getrockneten Hydrogel-Partikel können vereinfacht verarbeitet werden. Die Verarbeitung er folgt vorzugsweise in einer Sterilbank, wobei jedoch zur Dosierung kein Pipettieren erforderlich ist. Die getrockneten Hydrogel-Partikel können vereinfacht vorportioniert werden. Im Prozess der Herstellung und Anwendung der getrockneten Hydrogel-Partikel wird ein verbessertes Qualitäts management ermöglicht. The dried hydrogel particles can be processed in a simplified manner. It is preferably processed in a sterile bench, but no pipetting is required for dosing. The dried hydrogel particles can easily be pre-portioned. Improved quality management is made possible in the process of manufacturing and using the dried hydrogel particles.
Die getrockneten Hydrogel-Partikel können als rieselfähiges Schüttgut oder in Tablettenform an gewendet und insbesondere direkt in einen Bioreaktor (Gefäß, in dem die Zellkultivierung erfolgt und das eine Einstellung von biochemischen und physikalischen Kultivierungsbedingungen ermög licht) eingebracht werden. Vorteilhafterweise verfälschen die getrockneten Hydrogel-Partikel nicht das Gesamtvolumen des Kultivierungsmediums im Bioreaktor. The dried hydrogel particles can be used as free-flowing bulk material or in tablet form and, in particular, placed directly in a bioreactor (vessel in which the cells are cultivated and which enables biochemical and physical cultivation conditions to be set). The dried hydrogel particles advantageously do not adulterate the total volume of the cultivation medium in the bioreactor.
Die Anwendung der rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen erfolgt vorzugsweise, indem die ge trockneten Hydrogel-Partikel direkt in das Kultivierungsmedium im Bioreaktor gegeben werden. Die zu kultivierenden Zellen können bei Zufuhr der getrockneten Hydrogel-Partikel im Kultivie rungsmedium bereits suspendiert sein oder nach der Rehydratisierung der getrockneten Hydro gel-Partikel in den Bioreaktor zugeführt werden. Der Rehydratisierungsgrad der getrockneten Hydrogel-Partikel wird vorzugsweise mit einer optischen Transmissionsmessung- oder Streulicht messung am Kultivierungsmedium ermittelt. Besonders bevorzugt erfolgt die Zufuhr der Zellen in das Kultivierungsmedium, nachdem die getrockneten Hydrogel-Partikel vollständig hydratisiert sind. The rehydrated hydrogel beads are preferably used by adding the dried hydrogel particles directly to the cultivation medium in the bioreactor. The cells to be cultivated can already be suspended in the cultivation medium when the dried hydrogel particles are fed in, or they can be fed into the bioreactor after the dried hydrogel particles have been rehydrated. The degree of rehydration of the dried hydrogel particles is preferably determined with an optical transmission measurement or scattered light measurement on the cultivation medium. The cells are particularly preferably fed into the culture medium after the dried hydrogel particles have been completely hydrated.
Die Rehydratisierung der getrockneten Hydrogel-Partikel, z. B. in Wasser, kann optional als weite rer Teilschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens betrachtet werden. Vorteilhafterweise weisen die bei der Rehydratisierung gebildeten Hydrogel-Kügelchen (rehydratisierte Hydrogel-Kügelchen) auch nach der Rehydratisierung eine sphärische Partikelform auf. Vorzugsweise zeichnen sich die rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen durch die Kugelform aus, wie sie vor der Gefriertrocknung gegeben ist. Damit wird in einer Inokulationsphase die Kultivierung von Zellen auf den Hydrogel- Kügelchen begünstigt. Des Weiteren zeichnen sich kugelförmige, rehydratisierte Hydrogel-Kügel chen vorteilhafterweise durch ein günstiges Schwebe-Verhalten in der Suspension und eine im Vergleich zu deformierten Hydrogel-Kügelchen verminderte Neigung zu unerwünschten Aggrega tionen aus. The rehydration of the dried hydrogel particles, e.g. B. in water, can optionally be viewed as a further substep of the process according to the invention. The hydrogel beads (rehydrated hydrogel beads) formed during rehydration advantageously have a spherical particle shape even after rehydration. Preferably the rehydrated hydrogel beads by the spherical shape as it is given before freeze-drying. This promotes the cultivation of cells on the hydrogel beads in an inoculation phase. Furthermore, spherical, rehydrated hydrogel beads are advantageously characterized by a favorable floating behavior in the suspension and a reduced tendency towards undesired aggregation compared to deformed hydrogel beads.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Hydrogel-Kügelchen mit einer Proteinschicht beladen. Diese Modifizierung erfolgt vorzugsweise nach Herstellung der Hyd rogel-Kügelchen und vor der Gefriertrocknung. Die Proteinschicht kann z. B. Proteine der extrazel lulären Matrix umfassen, so dass vorteilhafterweise eine Adhäsion der Zellen auf rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen begünstigt wird. Die Proteinschicht kann eine sub-Monolage, eine Monolage oder eine Multilage von Proteinmolekülen auf den Hydrogel-Kügelchen umfassen. Beispielsweise wird nach der Herstellung der Hydrogel-Kügelchen in einer Suspension der Suspensionsflüssigkeit das mindestens eine, zu koppelnde Protein zugesetzt und mit dem Hydrogel-Kügelchen inkubiert. Vorteilhafterweise erlaubt die Inkubation eine kovalente Kopplung von mindestens einem Protein oder einem Vermittlermolekül mit der gesamten Oberfläche, einschließlich eventueller Poren, der Hydrogel-Kügelchen. According to a preferred embodiment of the invention, the hydrogel beads are loaded with a protein layer. This modification is preferably carried out after the hydrogel beads have been produced and before freeze-drying. The protein layer can e.g. B. proteins of the extracellular matrix, so that advantageously an adhesion of the cells to rehydrated hydrogel beads is promoted. The protein layer can comprise a sub-monolayer, a monolayer or a multilayer of protein molecules on the hydrogel beads. For example, after the hydrogel beads have been produced in a suspension, the at least one protein to be coupled is added to the suspension liquid and incubated with the hydrogel beads. The incubation advantageously allows a covalent coupling of at least one protein or a mediator molecule with the entire surface, including any pores, of the hydrogel beads.
Die Beladung mit der Proteinschicht erfolgt vorzugsweise vor der Gefriertrocknung. Bei ausge wählten Anwendungen der Erfindung kann die Beladung mit der Proteinschicht nach der Gefrier trocknung, insbesondere nach der Rehydratisierung, z. B. im Bioreaktor, erfolgen. Beispielsweise kann mindestens ein Protein aus dem Kultivierungsmedium im Bioreaktor oder von bereits im Bio reaktor vorhandenen Zellen geliefert werden. The protein layer is preferably loaded before freeze-drying. In selected applications of the invention, the load with the protein layer after freeze drying, especially after rehydration, z. B. in the bioreactor. For example, at least one protein can be supplied from the cultivation medium in the bioreactor or from cells already present in the bioreactor.
Vorzugsweise werden die Hydrogel-Kügelchen mit mindestens einem Vermittlermolekül (z.B. Ty ramin) und/oder mindestens einem der Proteine beladen, die Laminin (rekombinant und gewebe spezifisch), Vitronektin, (rekombinant und kompatibel mit pluripotenten Stammzellen), Kollagen (gewebespezifisch, kompatibel mit multipotenten Stammzellen), Proteine aus dezellularisiertem Gewebe (sehr gewebespezifisch) und komplexe Proteinmischungen aus der Basalmatrix (z.B. Gel trex, Matrigel, denovoMatrix) umfassen. The hydrogel beads are preferably loaded with at least one mediator molecule (e.g. tyramine) and / or at least one of the proteins that laminin (recombinant and tissue-specific), vitronectin (recombinant and compatible with pluripotent stem cells), collagen (tissue-specific, compatible with multipotent stem cells), proteins from decellularized tissue (very tissue-specific) and complex protein mixtures from the basal matrix (e.g. Gel trex, Matrigel, denovoMatrix).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nach der Gefrier trocknung Rückstände der Lyoprotektant-Substanz entfernt. Wenn Rückstände der Lyoprotektant- Substanz von den getrockneten Hydrogel-Partikeln getrennt werden, ergeben sich Vorteile für die spätere Rehydratisierung und die nachfolgende Zellkultivierung. Vorteilhafterweise werden Ein flüsse der Lyoprotektant-Substanz auf die Zellen vermieden oder minimiert. Die Entfernung von Rückständen der Lyoprotektant-Substanz umfasst eine vollständige Beseitigung der Lyoprotek tant-Substanz aus den getrockneten Hydrogel-Partikeln oder eine Beseitigung der Lyoprotektant- Substanz von den Oberflächen der getrockneten Hydrogel-Partikel. Besonders bevorzugt sind die Oberflächen der getrockneten Hydrogel-Partikel frei von Rückständen der Lyoprotektant-Sub stanz. According to a further preferred embodiment of the invention, residues of the lyoprotectant substance are removed after the freeze-drying. If residues of the lyoprotectant substance are separated from the dried hydrogel particles, there are advantages for the later rehydration and subsequent cell cultivation. Influences of the lyoprotectant substance on the cells are advantageously avoided or minimized. The removal of residues of the lyoprotectant substance comprises a complete elimination of the lyoprotectant substance from the dried hydrogel particles or an elimination of the lyoprotectant substance from the surfaces of the dried hydrogel particles. The surfaces of the dried hydrogel particles are particularly preferably free from residues of the lyoprotectant substance.
Besonders bevorzugt werden die Rückstände der Lyoprotektant-Substanz, wie z. B. der „Lyo- Kuchen", durch eine mechanische Bearbeitung des getrockneten Materials, umfassend dessen Zerkleinerung und ein Sieben, entfernt. Vorteilhafterweise werden dabei gleichzeitig mit der Tren nung der Lyoprotektant-Substanz vom getrockneten Hydrogel die getrockneten Hydrogel-Partikel voneinander getrennt. The residues of the lyoprotectant substance, such as. B. the "lyo cake" is removed by mechanical processing of the dried material, including its comminution and sieving. Advantageously, the dried hydrogel particles are separated from one another at the same time as the lyoprotectant substance is separated from the dried hydrogel.
Alternativ oder zusätzlich können gemäß einer weiteren Variante der Erfindung Rückstände der getrockneten Lyoprotektant-Substanz nach der Rehydratisierung der getrockneten Hydrogel-Par tikel und vor der Anwendung der Partikel in einer Waschlösung, insbesondere aus Natriumchlorid, entfernt werden. Vorteilhafterweise wird durch das Waschen der rehydratisierten Hydrogel-Kü gelchen ein Einfluss der Lyoprotektant-Substanz auf die nachfolgende Zellkultivierung weiter un terdrückt. Alternatively or additionally, according to a further variant of the invention, residues of the dried lyoprotectant substance can be removed after rehydration of the dried hydrogel particles and before the particles are used in a washing solution, in particular of sodium chloride. Advantageously, washing the rehydrated hydrogel beads further suppresses any influence of the lyoprotectant substance on the subsequent cell cultivation.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass verschiedene Lyoprotektant-Substanzen für die erfindungsgemäße Modifizierung der Hydrogel-Kügelchen verfügbar sind. Die Lyoprotektant- Substanz kann insbesondere Trehalose, Dimethylsulfoxid (DMSO), Sucrose und/oder ein Poloxa- mer umfassen. Diese Lyoprotektiva, die einzeln oder in Kombination verwendbar sind, haben den Vorteil, dass ihre Wirkung auf biologische Zellen gut untersucht ist. Unerwünschte Auswirkungen auf die Zellkultur können damit vermieden oder minimiert werden. Trehalose und/oder Sucrose werden besonders bevorzugt als Lyoprotektant-Substanz verwendet, da bei deren Anwendung Trägerpartikel gewonnen werden, die sich nach der Rehydratisierung durch einen besonders weit gehenden Form- und Funktionserhalt und in der Zellkultur durch eine besonders gute Zellenadhä sion auszeichnen. Another advantage of the invention is that various lyoprotectant substances are available for the modification of the hydrogel beads according to the invention. The lyoprotectant substance can in particular comprise trehalose, dimethyl sulfoxide (DMSO), sucrose and / or a poloxamer. These lyoprotectants, which can be used individually or in combination, have the advantage that their effect on biological cells has been well studied. Undesired effects on the cell culture can thus be avoided or minimized. Trehalose and / or sucrose are particularly preferred as lyoprotectant substance, since when they are used carrier particles are obtained which, after rehydration, are characterized by particularly extensive shape and function retention and in cell culture by particularly good cell adhesion.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Konzentration der Lyoprotektant-Substanz in der Suspensionsflüssigkeit mit den ursprünglich hergestellten Hydro gel-Kügelchen im Bereich von 1 mg/ml bis 500 mg/ml gewählt. Dieser Konzentrationsbereich wird bevorzugt, da unterhalb der Konzentration von 1 mg/ml eine Annäherung an die sphärische Parti kelform nur unzureichend erzielte wird und oberhalb von 500 mg/ml eine übermäßige Belastung des Kultivierungsmediums im Bioreaktor durch die Lyoprotektant-Substanz auftreten kann. According to a further preferred embodiment of the invention, the concentration of the lyoprotectant substance in the suspension liquid with the hydrogel beads originally produced is selected in the range from 1 mg / ml to 500 mg / ml. This concentration range will preferred, since below the concentration of 1 mg / ml an approximation to the spherical Parti kelform is only insufficiently achieved and above 500 mg / ml an excessive load of the cultivation medium in the bioreactor by the lyoprotectant substance can occur.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann eine Funktionalisierung der erfindungsgemäß hergestellten Zell-Carrier für die Kultivierung biologischer Zellen vorgesehen sein. Vorzugsweise erfolgt eine Funktionalisierung der Hydrogel-Kügelchen vor oder während de ren Herstellung (Einkapselung von Wirkstoffen, magnetischen Partikeln, etc.), z. B. vor oder wäh rend einer Vertropfung zur Herstellung der Hydrogel-Kügelchen durch Ausfällen, damit die Sub stanzen in der Hydrogelmatrix eingeschlossen sind, oder nach deren Bereitstellung und vor der Gefriertrocknung (z. B. Funktionalisierung der Oberfläche mit Tyramin und/oder Proteinen). Die Funktionalisierung umfasst den Zusatz von Partikeln und/oder Substanzen, welche den Hydrogel- Kügelchen weitere, über die Trägerfunktion hinausgehende Eigenschaften verleihen. Gemäß be vorzugten Varianten der Erfindung werden die Hydrogel-Kügelchen mit magnetischen Partikeln und/oder biologisch wirksamen Substanzen (Wirkstoffen) beladen. Besonders bevorzugt erfolgt die Zufuhr der magnetischen Partikel und/oder der Wirkstoffe vor der Gefriertrocknung. Die Erfin der haben festgestellt, dass auch die funktionalisierten Hydrogel-Kügelchen im getrockneten Zu stand Partikel mit einer annähernd sphärischen Form und rehydratisierten Zustand kugelförmige Zell-Carrier bilden. According to a further advantageous embodiment of the invention, the cell carriers produced according to the invention can be functionalized for the cultivation of biological cells. The hydrogel beads are preferably functionalized before or during their production (encapsulation of active ingredients, magnetic particles, etc.), e.g. B. before or during dropletization to produce the hydrogel beads by precipitation so that the substances are included in the hydrogel matrix, or after their provision and before freeze-drying (e.g. functionalization of the surface with tyramine and / or proteins) . The functionalization comprises the addition of particles and / or substances which give the hydrogel beads further properties that go beyond the carrier function. According to preferred variants of the invention, the hydrogel beads are loaded with magnetic particles and / or biologically active substances (active ingredients). The magnetic particles and / or the active ingredients are particularly preferably fed in before the freeze-drying. The inventors have found that the functionalized hydrogel beads also form spherical cell carriers in the dried state, particles with an approximately spherical shape and rehydrated state.
Hydrogel-Kügelchen, die jeweils einen oder mehrere magnetische Partikel enthalten, bieten vor teilhafterweise die Möglichkeit einer Manipulation der Zell-Carrier im Bioreaktor mittels magneti schen Feldern. Die magnetischen Partikel können aus an sich bekannten Permanent-Magnet-Ma- terialien bestehen. Hydrogel beads, each containing one or more magnetic particles, offer before geous enough the possibility of manipulating the cell carrier in the bioreactor by means of magnetic fields. The magnetic particles can consist of permanent magnet materials known per se.
Als biologisch wirksame Substanzen zur Modifizierung von Hydrogel-Kügelchen werden vorzugs weise Differenzierungsfaktoren, d. h. biologisch wirksame Substanzen, die eine Zelldifferenzierung auslösen und/oder eine Richtung der Zelldifferenzierung zu einem bestimmten Zeitpunkt beein flussen, verwendet. As biologically active substances for modifying hydrogel beads, preference is given to differentiating factors, d. H. biologically active substances that trigger cell differentiation and / or influence a direction of cell differentiation at a certain point in time, used.
Wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Dispersion der ur sprünglich bereitgestellten Hydrogel-Kügelchen eine kohäsionsmindernde Substanz enthält, wird ein gegenseitiges Anhaften der getrockneten Hydrogel-Partikel unterdrückt. Vorteilhafterweise wird damit eine Schüttfähigkeit der getrockneten Hydrogel-Partikel begünstigt. Besonders bevor zugt umfasst die kohäsionsmindernde Substanz Polyethylenglykol, dessen Wirkung auf biologi sche Zellen vorteilhafterweise gut untersucht ist. If, according to a further preferred embodiment of the invention, the dispersion of the initially provided hydrogel beads contains a cohesion-reducing substance, mutual adhesion of the dried hydrogel particles is suppressed. Advantageously this promotes pourability of the dried hydrogel particles. Particularly preferably, the cohesion-reducing substance comprises polyethylene glycol, the effect of which on biological cells has advantageously been well investigated.
Für die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen kann ein an sich bekanntes Gefriertrocknungs- Verfahren gewählt werden. Bevorzugt wird zur Gefriertrocknung, insbesondere von Alginat-Kügel chen, ein Protokoll mit den folgenden Phasen angewendet. Zunächst erfolgt eine Einfrierphase, in der die in Suspension bereitgestellten Hydrogel-Kügelchen gemäß einer vorbestimmten Zeit-Tem- peratur-Funktion mit einem Einfrierintervall von mindestens 120 min und einer End-Temperatur unterhalb von - 20°C und oberhalb von - 80°C eingefroren. Vorzugsweise werden Einfrierraten im Bereich von 50°C/min (schnelles Einfrieren), über 1 bis l,5°C/min (moderates Einfrieren) bis 0,1 bis rc/min (langsames Einfrieren) eingestellt. Die Einstellung in der Zeit-Temperatur-Funktion er laubt vorteilhafterweise ein schonendes Einfrieren der Hydrogel-Kügelchen. Anschließend ist eine Stabilisierungsphase vorgesehen, in der die Hydrogel-Kügelchen für die Dauer eines Stabilisie rungsintervalls von mindestens 90 min bei der End-Temperatur gelagert werden. Danach werden die gefrorenen Hydrogel-Kügelchen in einer ersten Trocknungsphase zur Bildung der getrockneten Hydrogel-Partikel, bei der End-Temperatur mit einem ersten Unterdrück beaufschlagt, der im Be reich von 30 pbar bis 60 pbar gewählt ist. Es folgt eine zweite Trocknungsphase, in der die trocke nen Hydrogel-Partikel bei einer Temperatur gleich oder größer als die End-Temperatur mit einem zweiten Unterdrück beaufschlagt werden, der geringer als der erste Unterdrück ist. Schließlich er folgt eine Belüftungsphase, in der die getrockneten Hydrogel-Partikel gemäß einer Zeit-Druck- Funktion mit einem Druckanstiegsintervall von mindestens 0.5 min bis 1 min (1 bar/min) in einen Normaldruck langsam überführt werden. Die Belüftungsphase erfolgt in einem Gefäß unter Be aufschlagung mit einem inerten Schutzgas oder Luft. A freeze-drying process known per se can be selected for the freeze-drying of the hydrogel beads. A protocol with the following phases is preferably used for freeze-drying, in particular of alginate beads. First there is a freezing phase in which the hydrogel beads provided in suspension are frozen according to a predetermined time-temperature function with a freezing interval of at least 120 min and a final temperature below -20 ° C and above -80 ° C . Freezing rates in the range from 50 ° C./min (rapid freezing), from 1 to 1.5 ° C./min (moderate freezing) to 0.1 to rc / min (slow freezing) are preferably set. The setting in the time-temperature function advantageously allows the hydrogel beads to be frozen gently. A stabilization phase is then provided in which the hydrogel beads are stored at the final temperature for a stabilization interval of at least 90 minutes. Thereafter, in a first drying phase to form the dried hydrogel particles, the frozen hydrogel beads are subjected to a first negative pressure at the end temperature, which is selected in the range from 30 pbar to 60 pbar. A second drying phase follows, in which the dry hydrogel particles are subjected to a second negative pressure which is lower than the first negative pressure at a temperature equal to or greater than the final temperature. Finally, there follows an aeration phase in which the dried hydrogel particles are slowly converted to normal pressure according to a time-pressure function with a pressure increase interval of at least 0.5 min to 1 min (1 bar / min). The ventilation phase takes place in a vessel under loading with an inert protective gas or air.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beige fügten Zeichnungen beschrieben. Die Zeichnungen zeigen in: Further details and advantages of the invention are described below with reference to the accompanying drawings. The drawings show in:
Figur 1: ein Flussdiagramm, das Merkmale bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsge mäßen Verfahrens zur Herstellung von Trägerpartikeln zeigt; FIG. 1: a flow chart showing features of preferred embodiments of the method according to the invention for producing carrier particles;
Figur 2: ein Flussdiagramm, das Merkmale bevorzugter Ausführungsformen der Anwendung er findungsgemäß hergestellter Trägerpartikel zeigt; Figur 3: photographische Bilder von rehydratisierten Trägerpartikeln im Vergleich zu herkömmli chen Trägerpartikeln; und FIG. 2: a flow chart showing features of preferred embodiments of the application of carrier particles produced according to the invention; FIG. 3: photographic images of rehydrated carrier particles in comparison with conventional carrier particles; and
Figur 4: eine schematische Verfahrensdarstellung einer Beispiel-Anwendung erfindungsgemäß hergestellter Trägerpartikel. FIG. 4: a schematic process illustration of an example application of carrier particles produced according to the invention.
Die Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf Alginat-basierte Zell-Carrier (Trä gerpartikel) beschrieben. Alginat-Kügelchen, welche erfindungsgemäß mit der Lyoprotektant-Sub- stanz beladen und der Gefriertrocknung unterzogen werden, können beispielsweise aus kommer ziell verfügbaren Alginat hergestellt werden, das typischerweise eine geringe Viskosität durch re lativ geringe Kettenlängen der Polymer-Makromoleküle aufweist. Alternativ kann Alginat mit ei ner im Vergleich zum kommerziell verfügbaren Alginat höheren Viskosität aufgrund längerer Mo lekülketten verwendet werden. Die Auswahl eines konkret zu verwendenden Alginat erfolgt bei spielsweise in Abhängigkeit von der gewünschten Elastizität der Zell-Carrier bei der Zellkultivie rung. Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung von Alginat beschränkt, sondern entsprechend auch mit anderen Flydrogelen, wie zum Beispiel Kollagen-, Gellan- oder Pektin realisierbar. The invention is described below with reference to alginate-based cell carriers (carrier particles) by way of example. Alginate beads, which according to the invention are loaded with the lyoprotectant substance and subjected to freeze-drying, can for example be produced from commercially available alginate, which typically has a low viscosity due to the relatively short chain lengths of the polymer macromolecules. Alternatively, alginate can be used with a higher viscosity than the commercially available alginate due to longer molecular chains. A specific alginate to be used is selected, for example, as a function of the desired elasticity of the cell carrier during cell cultivation. The invention is not limited to the use of alginate, but can also be implemented accordingly with other Flydrogels, such as collagen, gellan or pectin.
Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden insbesondere unter Bezug auf Beispiele für die Beladung von Alginat mit Lyoprotektant-Substanzen, die Modifizierung von Alginat-Kügel chen, getrockneten Alginat-Partikeln und/oder rehydratisierten Alginat-Kügelchen und die Proto kolle der Gefriertrocknung beschrieben. Einzelheiten der Anwendung der rehydratisierten Alginat- Kügelchen bei der Kultivierung biologischer Zellen können realisiert werden, wie es an sich von der herkömmlichen Zellkultivierung bekannt ist. Embodiments of the invention are described below in particular with reference to examples for the loading of alginate with lyoprotectant substances, the modification of alginate beads, dried alginate particles and / or rehydrated alginate beads and the freeze-drying protocols. Details of the use of the rehydrated alginate beads in the cultivation of biological cells can be implemented, as is known per se from conventional cell cultivation.
Figur 1 zeigt schematisch die Flauptschritte der erfindungsgemäßen Fierstellung von getrockneten Alginat-Partikeln. Bei Schritt PI werden Alginat-Kügelchen in einer wässrigen Suspension in einem Behälter hergestellt. Die Fierstellung der Alginat-Kügelchen erfolgt beispielsweise durch Erzeu gung von Na-Alginat-Tröpfchen mit einer Düse und Vernetzung der Alginat-Tröpfchen in einer wässrigen Suspensionsflüssigkeit mit einem ionischen Fällungsmittel, beispielsweise wie in [1] be schrieben ist. Als Fällungsmittel wird beispielsweise eine BaCh-Lösung verwendet. Die Größe und Größenverteilung der Alginat-Kügelchen kann durch die Dimension der Düse und Betriebsparame ter der Düse eingestellt werden. Die vernetzten Alginat-Tröpfchen bilden formstabile Alginat-Kü gelchen, die in der Suspensionsflüssigkeit suspendiert sind. Vorzugsweise werden die Alginat-Kügelchen nach der Ausfällung durch Beschichtung mit Tyramin und/oder einem Protein, wie z. B. Matrigel, funktionalisiert. Die Beschichtung erfolgt durch Nie derschlag aus der Suspensionsflüssigkeit oder direkter kovalenter Ankopplung. Die Matrigelbe- schichtung bietet Vorteile für die Adhäsion von Zellen bei einer nachfolgenden Zellkultivierung. FIG. 1 shows schematically the main steps in the production of dried alginate particles according to the invention. In step PI, alginate beads are prepared in an aqueous suspension in a container. The alginate spheres are frozen, for example, by generating Na alginate droplets with a nozzle and crosslinking the alginate droplets in an aqueous suspension liquid with an ionic precipitant, for example as described in [1]. A BaCh solution, for example, is used as the precipitant. The size and size distribution of the alginate beads can be adjusted by the dimensions of the nozzle and the operating parameters of the nozzle. The cross-linked alginate droplets form dimensionally stable alginate balls that are suspended in the suspension liquid. Preferably, the alginate beads are coated with tyramine and / or a protein, such as e.g. B. Matrigel, functionalized. The coating takes place by precipitation from the suspension liquid or direct covalent coupling. The matrix coating offers advantages for the adhesion of cells in a subsequent cell cultivation.
Bereits während des Eintropfens der Alginat-Tröpfchen in die Suspensionsflüssigkeit oder alterna tiv nach der Vernetzung und Bildung der Alginat-Kügelchen wird der Suspensionsflüssigkeit eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt. Bei Tests der Erfinder wurde als Lyoprotektant-Substanz bei spielsweise Trehalose (100 mg/ml), Poloxamer (Handelsname Pluronic F 68, 1 mg/ml), und/oder Sucrose (100 mg/ml) in einer wässrigen NaCI-Lösung (0,9%) verwendet. Die Beladung der suspen dierten Alginat-Kügelchen mit der Lyoprotektant-Substanz erfolgt z. B. durch Lagerung der Algi nat-Kügelchen in einer wässrigen Lösung, welche die Lyoprotektant-Substanz, z. B. für mindestens einen Tag. A lyoprotectant substance is added to the suspension liquid while the alginate droplets are dripping into the suspension liquid or, alternatively, after the crosslinking and formation of the alginate beads. In tests by the inventors, trehalose (100 mg / ml), poloxamer (trade name Pluronic F 68, 1 mg / ml), and / or sucrose (100 mg / ml) in an aqueous NaCl solution (0 , 9%) used. The loading of the suspended alginate beads with the lyoprotectant substance takes place, for. B. by storing the Algi nat beads in an aqueous solution containing the lyoprotectant substance, e.g. B. for at least a day.
Optional werden bei Schritt P2 die mit der Lyoprotektant-Substanz beladenen Alginat-Kügelchen aus der Suspension entnommen. Beispielsweise wird die Suspensionsflüssigkeit abgegossen, so dass im Behälter die Alginat-Kügelchen, umgeben von Restflüssigkeit, Zurückbleiben. Alternativ wird zur Entnahme ein Sieb verwendet. Optionally, in step P2, the alginate beads loaded with the lyoprotectant substance are removed from the suspension. For example, the suspension liquid is poured off so that the alginate beads, surrounded by residual liquid, remain in the container. Alternatively, a sieve is used for removal.
Wenn Schritt P2 nicht vorgesehen ist, erfolgt unmittelbar nach der Beladung der Alginat-Kügel chen mit der Lyoprotektant-Substanz bei Schritt P3 die Gefriertrocknung der Alginat-Kügelchen. Dabei sind die folgenden Phasen vorgesehen. If step P2 is not provided, the alginate beads are freeze-dried in step P3 immediately after the alginate beads have been loaded with the lyoprotectant substance. The following phases are planned.
Zunächst werden die Alginat-Kügelchen in einer Einfrierphase über 150 min von Raumtemperatur auf eine End-Temperatur von z. B. - 45 °C abgekühlt (ca. 0,4°C/min). Während der Einfrierphase wird beispielsweise eine lineare Zeit-Temperatur-Funktion realisiert. First, the alginate beads are frozen in a freezing phase over 150 minutes from room temperature to a final temperature of z. B. - 45 ° C cooled (approx. 0.4 ° C / min). For example, a linear time-temperature function is implemented during the freezing phase.
Anschließend folgt eine Stabilisierungsphase, in der die Alginat-Kügelchen für die Dauer eines Sta bilisierungsintervalls von 120 min bei der End-Temperatur gelagert werden. Die Stabilisierungs phase hat den Vorteil, dass die Probe mit den eingefrorenen Alginat-Kügelchen komplett durchge froren wird, bevor die Trocknungsphasen ausgeführt werden. This is followed by a stabilization phase in which the alginate beads are stored at the final temperature for a stabilization interval of 120 min. The stabilization phase has the advantage that the sample with the frozen alginate beads is completely frozen through before the drying phases are carried out.
Eine nachfolgende erste Trocknungsphase hat die Funktion einer Antrocknungsphase, in der die Suspensionsflüssigkeit mittels Sublimation entfernt wird. Die erste Trocknungsphase wird bei spielsweise in einem Lyophilisator mit einer Kühleinheit und einem Kondensator durchgeführt. Während der ersten Trocknungsphase wird die End-Temperatur, zum Beispiel - 45 °C, aufrecht erhalten, während der Druck einer linearen Zeit-Druck-Funktion folgend über eine Dauer von 10 min vom Atmosphärendruck auf einen ersten Unterdrück von 50 pbar abgesenkt wird. Anschlie ßend wird in der ersten Trocknungsphase die gefrorene Probe für eine Stabilisierungsdauer von zum Beispiel 80 Stunden bei der End-Temperatur und dem ersten Unterdrück gehalten. A subsequent first drying phase has the function of a drying phase in which the suspension liquid is removed by means of sublimation. The first drying phase is carried out, for example, in a lyophilizer with a cooling unit and a condenser. During the first drying phase, the final temperature, for example −45 ° C., is maintained, while the pressure is reduced from atmospheric pressure to a first negative pressure of 50 pbar over a period of 10 minutes, following a linear time-pressure function. Subsequently, in the first drying phase, the frozen sample is kept at the final temperature and the first negative pressure for a stabilization period of, for example, 80 hours.
In einer nachfolgenden zweiten Trocknungsphase werden die getrockneten Alginat-Partikel mit einem zweiten Unterdrück beaufschlagt, der geringer als der erste Unterdrück ist und zum Bei spiel 100 pbar beträgt. Die Absenkung auf den zweiten Unterdrück erfolgt mit einer linearen Zeit- Druck-Funktion über eine Dauer von zum Beispiel 300 min. Während der zweiten Trocknungs phase ist die Temperatur der getrockneten Alginat-Partikel gleich der End-Temperatur oder eine erhöhte Temperatur, wie zum Beispiel Raumtemperatur (20 °C). Nach der Absenkung auf den zweiten Unterdrück wird die getrocknete Probe während der zweiten Trocknungsphase für eine Stabilisierungsdauer von zum Beispiel 20 Stunden bei dem zweiten Unterdrück gehalten. In a subsequent, second drying phase, the dried alginate particles are subjected to a second negative pressure which is lower than the first negative pressure and is, for example, 100 pbar. The lowering to the second negative pressure takes place with a linear time-pressure function over a period of, for example, 300 min. During the second drying phase, the temperature of the dried alginate particles is equal to the end temperature or an increased temperature, such as, for example Room temperature (20 ° C). After it has been lowered to the second negative pressure, the dried sample is kept at the second negative pressure for a stabilization period of, for example, 20 hours during the second drying phase.
Anschließend ist eine Belüftungsphase vorgesehen, in der die getrockneten Alginat-Partikel ge mäß einer linearen Zeit-Druck-Funktion mit einem Druckanstiegsintervall von mindestens 1 min in einen Normaldruck überführt werden. Die Belüftungsphase kann mit Luft oder einem Inertgas vorgesehen sein. Durch die Anwendung eines relativ langen Druckanstiegsintervalls wird vorteil hafterweise eine Beschädigung der getrockneten Alginat-Partikel vermieden. Bei Belüftung mit Luft erfolgt vorher das Verschließen des Lagerungsgefäßes in der Kammer, während bei Nutzung eines Inertgases das Verschließen nach der Belüftung erfolgt. A ventilation phase is then provided in which the dried alginate particles are converted to normal pressure according to a linear time-pressure function with a pressure increase interval of at least 1 min. The ventilation phase can be provided with air or an inert gas. By using a relatively long pressure increase interval, damage to the dried alginate particles is advantageously avoided. When ventilating with air, the storage vessel in the chamber is closed beforehand, while when an inert gas is used, it is closed after ventilation.
Als Inertgas wird vorzugsweise trockener Stickstoff oder Argon verwendet. Besonders bevorzugt werden die getrockneten Alginat-Partikel in dem Inertgas oder im Vakuum gelagert. Praktische Tests haben eine Lagerungsfähigkeit der erfindungsgemäß hergestellten getrockneten Alginat- Partikel z. B. bei 4 °C ohne Funktionalitätsverlust über mehrere Monate ergeben. The inert gas used is preferably dry nitrogen or argon. The dried alginate particles are particularly preferably stored in the inert gas or in a vacuum. Practical tests have shown that the dried alginate particles produced according to the invention can be stored e.g. B. at 4 ° C without loss of functionality over several months.
Das beispielhaft beschriebene Verfahren der Gefriertrocknung P3 kann in Bezug auf die eingestell ten Temperaturen und Drucke und die Form der Zeit-Druck-und Zeit-Temperatur-Funktionen in Abhängigkeit von den konkreten Anwendungsbedingungen modifiziert werden. Beispielsweise kann durch Vorbereitungstests ermittelt werden, welche Zeit-und Druck-Parameter für eine kon krete Hydrogel-, insbesondere Alginat-Probe, optimale Trocknungsergebnisse liefert. Im Ergebnis der Gefriertrocknung P3 liegen die getrockneten Alginat-Partikel als fertige Zell-Car- rier vor. Aufgrund des erfindungsgemäßen Zusatzes der Lyoprotektant-Substanz haben die ge trockneten Alginat-Partikel eine sphärische Form (siehe zum Beispiel photographische Abbildung in Figur 4), die vorteilhafterweise auch nach der Rehydratisierung erhalten bleibt. Die getrockne ten Partikel können als Kuchen Zusammenhängen oder ein rieselfähiges Schüttgut aus einzelnen Teilchen bilden. Die Bildung des rieselfähigen Schüttguts wird begünstigt, wenn der Suspension der Alginat-Kügelchen zusätzlich zu der Lyoprotektant-Substanz eine kohäsionsmindernde Sub stanz, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, zugeführt wird. Es wird beispielsweise Polyethylengly kol mit dem Flandelsnamen PEG 600 mit einer Konzentration von 50 mg/ml verwendet, um ein Zusammenhaften der getrockneten Alginat-Partikel zu minimieren. The freeze-drying method P3 described by way of example can be modified in relation to the set temperatures and pressures and the form of the time-pressure and time-temperature functions as a function of the specific application conditions. For example, preparatory tests can be used to determine which time and pressure parameters provide optimal drying results for a specific hydrogel, in particular alginate sample. As a result of the freeze-drying P3, the dried alginate particles are available as finished cell carriers. Due to the addition of the lyoprotectant substance according to the invention, the dried alginate particles have a spherical shape (see, for example, the photographic illustration in FIG. 4), which is advantageously retained even after rehydration. The getrockne th particles can form a cake or a free-flowing bulk material from individual particles. The formation of the free-flowing bulk material is promoted if the suspension of the alginate beads is supplied with a cohesion-reducing substance such as polyethylene glycol in addition to the lyoprotectant substance. For example, polyethylene glycol with the trade name PEG 600 is used at a concentration of 50 mg / ml in order to minimize sticking of the dried alginate particles.
In Abhängigkeit von der Konzentration der verwendeten Lyoprotektant-Substanz kann diese nach der Gefriertrocknung P3 Reste auf der Oberfläche der getrockneten Alginat-Partikel bilden. Ent sprechend kann, wie in Figur 1 gezeigt ist, optional ein Schritt P4 zur Entfernung der Lyoprotek tant-Substanz insbesondere von der Oberfläche der getrockneten Alginat-Partikel vorgesehen sein, z. B. durch Sieben oder Mahlen vorgesehen sein. Depending on the concentration of the lyoprotectant substance used, this can form residues on the surface of the dried alginate particles after freeze-drying P3. Accordingly, as shown in FIG. 1, a step P4 can optionally be provided for removing the Lyoprotek tant substance, in particular from the surface of the dried alginate particles, e.g. B. be provided by sieving or grinding.
Eine Anwendung der getrockneten Alginat-Partikel als Zell-Carrier bei der Kultivierung biologi scher Zellen ist schematisch in Figur 2 gezeigt. Zunächst erfolgt bei Schritt Kl die Vorbereitung ei nes wässrigen Kultivierungsmediums in einem Bioreaktor. Die Zusammensetzung des Kultivie rungsmediums wird in an sich bekannter Weise in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Zellkultivierung gewählt. Dem Kultivierungsmedium werden die erfindungsgemäß hergestell ten Alginat-Partikel zugesetzt. Die Dosierung der getrockneten Alginat-Partikel erfolgt beispiels weise mittels Wägung. Tests mit erfindungsgemäß hergestellten, getrockneten Alginat-Partikeln ergaben, dass Partikel ohne eine Polyethylenglykol-Beladung zunächst auf der Oberfläche des Kul tivierungsmedium lagen und erst nach einem Zentrifugieren in das Kultivierungsmedium einsan ken, während bei mit Polyethylenglykol modifizierten Partikeln kein Aufschwimmen auf dem Kul tivierungsmedium beobachtet wurde. An application of the dried alginate particles as a cell carrier in the cultivation of biological cells is shown schematically in FIG. First, in step K1, an aqueous cultivation medium is prepared in a bioreactor. The composition of the cultivation medium is selected in a manner known per se, depending on the specific application of cell cultivation. The alginate particles produced according to the invention are added to the cultivation medium. The dried alginate particles are metered, for example, by weighing. Tests with dried alginate particles produced according to the invention showed that particles without a polyethylene glycol load initially lay on the surface of the cultivation medium and only sink into the cultivation medium after centrifugation, while particles modified with polyethylene glycol do not float on the cultivation medium would.
Im wässrigen Kultivierungsmedium erfolgt bei Schritt K2 die Rehydratisierung der Alginat-Partikel. Die getrockneten Alginat-Partikel werden durch Aufnahme von Wasser aus dem Kultivierungsme dium in Alginat-Kügelchen umgewandelt, wie beispielhaft in Figur 3 gezeigt ist. Schließlich erfolgt bei Schritt K3 die Zellkultivierung, Zellinkubation und/oder Zelllagerung von biologischen Zellen im Kultivierungsmedium mit den Alginat-Kügelchen. Figur 3 zeigt photographische, lichtmikroskopische Bilder von Alginat-Kügelchen, die gemäß be vorzugten Varianten der Erfindung mit Trehalose (A) oder Sucrose (B) beladen, gefriergetrocknet und rehydratisiert wurden, im Vergleich mit Alginat-Kügelchen, die ohne Lyoprotektant-Substanz (C) gefriergetrocknet und rehydratisiert wurden, und frisch hergestellten Alginat-Kügelchen (D) in Suspension (Durchmesser rd. 400 pm. Die erfindungsgemäß hergestellten und rehydratisierten Partikel (A, B) zeigen vorteilhafterweise deutlich die gleiche Kugelform wie die suspendierten, un behandelten Alginat-Kügelchen (D). Die unbehandelt gefriergetrockneten und rehydratisierten Partikel (C) (z. B. gemäß [1]) weisen hingegen anders als die unbehandelten Alginat-Kügelchen eine zerklüftete, unregelmäßige Oberfläche auf. In the aqueous cultivation medium, the rehydration of the alginate particles takes place in step K2. The dried alginate particles are converted into alginate beads by absorbing water from the cultivation medium, as is shown by way of example in FIG. Finally, in step K3, cell cultivation, cell incubation and / or cell storage of biological cells in the cultivation medium with the alginate beads takes place. FIG. 3 shows photographic, light microscopic images of alginate beads which, in accordance with preferred variants of the invention, have been loaded with trehalose (A) or sucrose (B), freeze-dried and rehydrated, in comparison with alginate beads which have been used without lyoprotectant substance (C. ) were freeze-dried and rehydrated, and freshly produced alginate beads (D) in suspension (diameter about 400 μm. The rehydrated particles (A, B) produced according to the invention advantageously clearly have the same spherical shape as the suspended, untreated alginate beads (D). The untreated freeze-dried and rehydrated particles (C) (for example according to [1]), in contrast to the untreated alginate beads, have a jagged, irregular surface.
Eine weitere Anwendung der getrockneten Alginat-Partikel als Zell-Carrier bei der Zellexpansion von hiPS-Zellen (humane induzierte pluripotente Stammzellen) ist schematisch in Figur 4 gezeigt. Für eine erste Expansionsphase werden getrocknete Alginat-Partikel 1 in ein erstes Kultivierungs gefäß 2, z. B. einen Suspensionsbioreaktor mit einem Volumen von wenigen ml (z.B. 10 ml) bis mehrere Liter (z. B. 31), gegeben. Durch Rehydratisierung werden aus den Alginat-Partikeln 1 Algi nat-Kügelchen 3 (beispielhaft gezeigt) gebildet. Des Weiteren werden aus einem Gefäß 4 hiPSC- Zellen in das Kultivierungsgefäß 2 gegeben. Es erfolgt dann die Zellkultivierung unter vorgegebe nen Kultivierungsbedingungen, in der die Zellen zunächst auf den Micro-Carriern anhaften und adhärieren und sich dann über mehrere Tage (z. B. 7 Tage) um ein Vielfaches vermehren (z.B. um das Siebenfache). In einem letzten Schritt des Prozesses werden die Alginat-Kügelchen mit adhä- rierten Zellen 5 gewonnen, d.h. es liegen nach dieser Gewinnung (z.B. durch eine enzymatische Behandlung) die verbrauchten Micro-Carrier 6 und die vervielfachten hiPS-Zellen 7 vor. Anschlie ßend können diese in einer Zellbank 10 gelagert, weiter untersucht und/oder prozessiert 9 (z.B. Differenzierung in Kardiomyozyten), und/oder zu einer direkten Anwendung 8 überführt (z.B. Bioprinting) werden. Another application of the dried alginate particles as a cell carrier in the cell expansion of hiPS cells (human induced pluripotent stem cells) is shown schematically in FIG. For a first expansion phase, dried alginate particles 1 are placed in a first cultivation vessel 2, e.g. B. a suspension bioreactor with a volume of a few ml (e.g. 10 ml) to several liters (e.g. 31) is given. By rehydration, alginate beads 3 (shown by way of example) are formed from the alginate particles 1. Furthermore, 4 hiPSC cells are transferred from a vessel into the cultivation vessel 2. The cells are then cultivated under specified cultivation conditions, in which the cells first adhere and adhere to the micro-carriers and then multiply (e.g. sevenfold) over several days (e.g. 7 days). In a last step of the process, the alginate beads with attached cells 5 are obtained, i.e. after this extraction (e.g. by an enzymatic treatment) the used micro-carriers 6 and the multiplied hiPS cells 7 are available. These can then be stored in a cell bank 10, further examined and / or processed 9 (e.g. differentiation into cardiomyocytes), and / or transferred to a direct application 8 (e.g. bioprinting).
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merk male der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination oder Unterkombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein. The features of the invention disclosed in the above description, the drawings and the claims can be important both individually and in combination or sub-combination for the implementation of the invention in its various embodiments.

Claims

Ansprüche Expectations
1. Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen, umfassend die Schritte: 1. A method for the production of carrier particles for the cultivation of biological cells, comprising the steps:
- Bereitstellung einer wässrigen Suspension von Hydrogel-Kügelchen, und - Provision of an aqueous suspension of hydrogel beads, and
- Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen, so dass getrocknete Hydrogel-Partikel gebildet werden, dadurch gekennzeichnet, dass - Freeze-drying of the hydrogel beads so that dried hydrogel particles are formed, characterized in that
- der Suspension mindestens eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt wird, wobei die Hydrogel- Kügelchen in der Suspension mit der Lyoprotektant-Substanz beladen werden und die getrockne ten Hydrogel-Partikel unter der Wirkung der Lyoprotektant-Substanz eine Form erhalten, welche an eine sphärische Partikelform angenähert ist. - At least one lyoprotectant substance is added to the suspension, the hydrogel beads in the suspension being loaded with the lyoprotectant substance and the dried hydrogel particles under the action of the lyoprotectant substance being given a shape which approximates a spherical particle shape is.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem 2. The method according to claim 1, wherein
- die Hydrogel-Kügelchen mit einer Proteinschicht beladen sind. - the hydrogel beads are loaded with a protein layer.
3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem 3. The method according to any one of the preceding claims, in which
- nach der Gefriertrocknung Rückstände der Lyoprotektant-Substanz entfernt werden. - After freeze-drying, residues of the lyoprotectant substance are removed.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem 4. The method according to claim 3, wherein
- die Rückstände durch eine mechanische Bearbeitung der getrockneten Partikel, umfassend eine Zerkleinerung und ein Sieben, entfernt werden. - The residues are removed by mechanical processing of the dried particles, comprising comminution and sieving.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem 5. The method according to any one of the preceding claims, in which
- die Lyoprotektant-Substanz mindestens eines von Trehalose, Dimethylsulfoxid, Sucrose und ei nem Poloxamer umfasst. - the lyoprotectant substance comprises at least one of trehalose, dimethyl sulfoxide, sucrose and a poloxamer.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem 6. The method according to any one of the preceding claims, in which
- die Konzentration der Lyoprotektant-Substanz in der Suspension im Bereich von 1 mg/ml bis 500 mg/ml gewählt ist. - The concentration of the lyoprotectant substance in the suspension is selected in the range from 1 mg / ml to 500 mg / ml.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem 7. The method according to any one of the preceding claims, in which
- die getrockneten Hydrogel-Partikel einer Rehydratisierung unterzogen werden, und - Rückstände der getrockneten Lyoprotektant-Substanz vor der Anwendung der Trägerpartikel in einer Waschlösung, insbesondere aus Natriumchlorid, entfernt werden. - the dried hydrogel particles are subjected to rehydration, and - Residues of the dried lyoprotectant substance are removed in a washing solution, in particular made of sodium chloride, before the carrier particles are used.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem 8. The method according to any one of the preceding claims, in which
- die Hydrogel-Kügelchen mindestens eines von magnetischen Partikeln und biologisch wirksamen Substanzen (Wirkstoffen) enthalten, wobei die magnetischen Partikel und/oder die Wirkstoffe beim Gefriertrocknen mit den Hydrogel-Kügelchen getrocknet werden. the hydrogel beads contain at least one of magnetic particles and biologically active substances (active ingredients), the magnetic particles and / or the active ingredients being dried with the hydrogel beads during freeze-drying.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem 9. The method according to claim 8, wherein
- die Hydrogel-Kügelchen Differenzierungsfaktoren enthalten. - the hydrogel beads contain differentiation factors.
10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem 10. The method according to any one of the preceding claims, in which
- der Suspension mindestens eine kohäsionsmindernde Substanz zugesetzt wird, die eine Schütt fähigkeit der getrockneten Hydrogel-Partikel begünstigt. - At least one cohesion-reducing substance is added to the suspension, which favors the pourability of the dried hydrogel particles.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, bei dem 11. The method according to claim 10, wherein
- die kohäsionsmindernde Substanz, vorzugsweise Polyethylenglykol, umfasst. - The cohesion-reducing substance, preferably polyethylene glycol, comprises.
12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen die folgenden Phasen umfasst: 12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the freeze-drying of the hydrogel beads comprises the following phases:
- Einfrierphase, in der die Hydrogel-Kügelchen gemäß einer Zeit-Temperatur-Funktion mit einem Einfrierintervall von mindestens 120 min und einer End-Temperatur unterhalb von - 40 °C einge froren werden, - Freezing phase in which the hydrogel beads are frozen according to a time-temperature function with a freezing interval of at least 120 min and a final temperature below - 40 ° C,
- Stabilisierungsphase, in der die Hydrogel-Kügelchen für die Dauer eines Stabilisierungsintervalls von mindestens 90 min bei der End-Temperatur gelagert werden, - Stabilization phase, in which the hydrogel beads are stored at the final temperature for a stabilization interval of at least 90 minutes,
- erste Trocknungsphase zur Bildung der getrockneten Hydrogel-Partikel, in der die gefrorenen Hydrogel-Kügelchen bei der End-Temperatur mit einem ersten Unterdrück beaufschlagt werden, der im Bereich von 30 pbar bis 60 pbar gewählt ist, - first drying phase for the formation of the dried hydrogel particles, in which the frozen hydrogel beads are subjected to a first negative pressure at the final temperature, which is selected in the range from 30 pbar to 60 pbar,
- zweite Trocknungsphase, in der die getrockneten Hydrogel-Partikel bei einer Temperatur gleich oder größer als die End-Temperatur mit einem zweiten Unterdrück beaufschlagt werden, der ge ringer als der erste Unterdrück ist, und Second drying phase, in which the dried hydrogel particles are subjected to a second negative pressure at a temperature equal to or greater than the final temperature, which is lower than the first negative pressure, and
- Belüftungsphase, in der die getrockneten Hydrogel-Partikel gemäß einer Zeit-Druck-Funktion mit einem Druckanstiegsintervall von mindestens 0,5 min in einen Normaldruck überführt werden. - Aeration phase in which the dried hydrogel particles are converted to normal pressure according to a time-pressure function with a pressure increase interval of at least 0.5 min.
13. Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, umfassend - getrocknete Hydrogel-Partikel mit einer Proteinbeschichtung, wobei die Hydrogel-Partikel eine Lyoprotektant-Substanz enthalten und eine Form aufweisen, die an eine sphärische Form angenä hert ist. 13. Carrier particles for culturing biological cells, comprising - dried hydrogel particles with a protein coating, the hydrogel particles containing a lyoprotectant substance and having a shape which is approximated to a spherical shape.
14. Trägerpartikel gemäß Anspruch 13, bei denen 14. Carrier particles according to claim 13, in which
- die Proteinbeschichtung Matrigel, Kollagen, Laminin und/oder Vitronektin umfasst. - the protein coating comprises matrigel, collagen, laminin and / or vitronectin.
15. Trägerpartikel gemäß Anspruch 13 oder 14, bei denen - die Oberflächen der Partikel frei von Rückständen der Lyoprotektant-Substanz sind. 15. Carrier particles according to claim 13 or 14, in which - the surfaces of the particles are free from residues of the lyoprotectant substance.
16. Trägerpartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, die 16. Carrier particles according to any one of claims 13 to 15, the
- eine charakteristische Querschnittsdimension im Bereich von 50 pm bis 2 mm aufweisen. - Have a characteristic cross-sectional dimension in the range from 50 μm to 2 mm.
17. Trägerpartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, die mindestens eines enthalten von 17. Carrier particles according to one of claims 13 to 16, which contain at least one of
- magnetischen Partikeln, und - magnetic particles, and
- biologisch wirksamen Substanzen (Wirkstoffen). - biologically active substances (active ingredients).
18. Anwendung von Trägerpartikeln gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, die mit einem18. Application of carrier particles according to one of claims 13 to 17, which with a
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 hergestellt sind, als Trägerpartikel für die Kultivie rung biologischer Zellen. Process according to one of claims 1 to 12 are produced as carrier particles for the cultivation of biological cells.
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