EP4110946A1 - Method and device for carrying out a qpcr method - Google Patents

Method and device for carrying out a qpcr method

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Publication number
EP4110946A1
EP4110946A1 EP21706217.3A EP21706217A EP4110946A1 EP 4110946 A1 EP4110946 A1 EP 4110946A1 EP 21706217 A EP21706217 A EP 21706217A EP 4110946 A1 EP4110946 A1 EP 4110946A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
qpcr
cycle
reaction
determined
curve
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP21706217.3A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Christoph FAIGLE
Torsten SACHSE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4110946A1 publication Critical patent/EP4110946A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR

Definitions

  • the invention relates to the use of a polymerase chain reaction process (PCR process), in particular for detecting the presence of a pathogen.
  • PCR process polymerase chain reaction process
  • the present invention also relates to the evaluation of qPCR measurements.
  • PCR methods are carried out in automated systems.
  • the PCR systems make it possible to amplify and detect certain DNA strand sections to be detected, which can be assigned to a pathogen, for example.
  • a PCR method generally comprises a cyclical application of the steps of denaturation, annealing and elongation.
  • a DNA double strand is split into single strands and these are each completed again by the addition of nucleotides in order to duplicate the DNA strand sections in each cycle.
  • the qPCR method enables the pathogen load to be quantified using this process.
  • the nucleotides are at least partially provided with fluorescent molecules which, when attached to the single strand of the DNA strand segment to be detected, activate a fluorescent property. After the double strands have been built up, a fluorescence intensity value can be determined after each cycle, which depends on the number of DNA strand segments produced.
  • a qPCR curve can then be determined from the determined intensity values, which curve has a sigmoid shape when the DNA strand section to be detected is present in the substance to be examined.
  • the measured qPCR curves can be afflicted with artifacts, so that, as a rule, several parallel measurements are carried out in order to enable a more precise evaluation of the qPCR curves by averaging the measured values.
  • a method for operating a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method comprising the following steps:
  • the qPCR method has a cyclical repetition of the steps of denaturation, annealing and elongation.
  • denaturing is at a high temperature
  • the entire double-stranded DNA in the substance to be examined is split into two single strands.
  • the annealing step one of the primers added to the substance is bound to the single strands, which primers specify the starting point of the amplification of the DNA strand segments to be detected.
  • elongation step a second complementary DNA strand section is built up from free nucleotides on the single strands provided with the primer. After each of these cycles, the amount of DNA in the DNA strand segments to be detected has ideally doubled.
  • the qPCR curve obtained in this way has three distinct phases, namely a baseline in which the intensity of the fluorescence of the fluorescent light emitted by built-in markers cannot yet be distinguished from the background fluorescence, an exponential phase in which the fluorescence intensity varies over the Baseline increases, that is to say becomes visible, with the fluorescence signal increasing exponentially in proportion to the amount of DNA strand segments to be detected due to the doubling of the DNA strands in each cycle, and a plateau phase in which the reagents, i. H. the primer and the free nucleotides are no longer available in the required concentrations and no further duplication takes place.
  • the so-called ct (cycle threshold) value is decisive for the detection of a predetermined DNA strand section to be detected, which can correspond to a pathogen, for example.
  • the ct value determines the beginning of the exponential phase and is determined by exceeding a specific limit value that is defined for the DNA strand segment to be detected and which is identical for all samples for the DNA strand segment to be detected, or it is calculated by the second Derivation of the qPCR curve determined in the exponential phase and corresponds to the intensity value of the steepest rise in the qPCR curve. If the target value is known, the initial concentration of the DNA strand section to be detected in the substance to be examined can be determined by back-calculation. In reality, the qPCR curves are very imprecise and subject to considerable fluctuations.
  • a baseline drift can occur, which describes the increase in background fluorescence over the measurement cycles. This means that even if there is no amplification, the fluorescence signal increases. Further influencing factors that have a negative effect on the accuracy of the qPCR curve can result, for example, from thermal noise, fluctuations or metering tolerances in the reagent concentration, air inclusions and artifacts in the fluorescence volume.
  • One idea of the above method is to take into account a reaction efficiency in each step of the PCR method, so that an evaluation of the qPCR curve can be improved.
  • the reaction efficiency is largely determined by the reaction liquid in the respective reaction chamber, so that there is a clear relationship between the luminescence and the detected intensity value and the amount of the DNA strand segment to be detected.
  • the DNA strand sections are not doubled in each PCR cycle, as would be the case in the ideal case, but only multiplied by a factor between 1 and 2.
  • the reaction efficiency of this amplification corresponds to the proportion of this factor of the amplification that exceeds 1.
  • the reaction efficiency is determined after each cycle, and the intensity value determined in each case is corrected with the reaction efficiency. That way you get one at a time Reaction efficiency of 1 idealized qPCR curve, which can be evaluated in a simplified manner in a subsequent step.
  • the qPCR curves are generated in that averaged intensity values per cycle are combined into a curve which, after the measurement, is fitted to a sigmoid curve in order to evaluate the corrected qPCR curve, in particular in order to derive the CT value from it obtain.
  • the PCR method can be carried out by passing a reaction liquid into a reaction chamber, in particular in each cycle, the reaction efficiency depending on an area of one or more bubbles, in particular air bubbles, in the reaction chamber, in particular the reaction chamber for an elongation process of the PCR. Process, is determined.
  • the reaction efficiency is particularly impaired by bubbles in the reaction chamber, since the amount of the reaction mixture is reduced thereby. Since the number and size of bubbles in the reaction chamber can vary from cycle to cycle, the resulting reduction in reaction efficiency can also vary. Assuming that the formation of bubbles in the reaction chamber is the decisive effect for reducing the reaction efficiency, a bubble volume quotient can be defined which indicates the bubble volume as a proportion of the total volume of the reaction chamber and accordingly proportionally reduces the reaction efficiency.
  • an image of the reaction chamber is recorded with the aid of a camera, the area of the one or more bubbles being determined with the aid of pattern recognition methods applied to the image of the reaction chamber.
  • the bubble detection can be carried out by known methods such as thresholding (e.g. Otsu's method), edge detection, Hough transformation, data-based methods based on neural networks and the like. Since the geometry of the reaction chamber is known, an assessment of the displaced volume of the reaction liquid in each cycle can be carried out by evaluating a camera image of the reaction chamber on the basis of the bubble expansion.
  • reaction efficiency can be determined with the aid of the brightness of one or more pixels of the image which correspond to the reaction liquid and the proportion of the area of the one or more bubbles in relation to the total area of the reaction chamber.
  • the reaction efficiency can be determined as a function of an area of one or more bubbles in the reaction chamber for at least two of the PCR sub-process steps of denaturation, annealing and elongation.
  • the intensity value of the remaining reaction volume it can be provided to select only the brightness of those pixels which definitely do not belong to a bubble or to a halo (edge area) of a bubble.
  • the mean value of the brightness of the reaction chamber can be used, with the brightness being able to be determined with the aid of the bubble volume quotient, taking into account a bubble volume which generally does not have fluorescence.
  • the determination of which of the pixels belong to a bubble volume, which to the halo and which to the reaction liquid can be carried out with the aid of data-based methods for what is known as semantic segmentation.
  • semantic segmentation each pixel of an image is assigned a class from a number of predefined classes. With such a classifier, a camera image of the reaction chamber can be evaluated in a simple manner.
  • the bubble formation in the various steps of the PCR method namely the denaturation of the annealing and the elongation
  • different bubble sizes can be taken into account in the individual reaction steps of a PCR cycle, the respective bubble sizes for each of the process steps reducing the reaction efficiency.
  • camera images can be evaluated in each PCR cycle, ie at the end of the Denaturation, at the end of the annealing, at the beginning of the elongation and at the end of the elongation a fluorescence measurement can be carried out.
  • the first three values should have the same brightness for the same bubble volume and only differ from the intensity value of the fourth value if additional fluorescence is produced.
  • the displaced bubble volume can now be taken into account for each process step within a PCR cycle, the quotient of the intensity values of successive process steps being proportional to the change in the reaction volume in the corresponding chamber. Assuming that the denatured and elongated DNA strand sections that are not amplified will rejoin the original double strands after elongation, the result at the end of a PCR cycle is a value of the reaction efficiency that depends on the brightness quotient between the individual process steps. This can then be used to correct the recorded qPCR curve.
  • the corrected qPCR curve can be used to determine whether or not a DNA strand section to be detected is present.
  • the qPCR method can be operated in that when the presence of the DNA strand section to be detected is detected, it is signaled that a ct value can be determined, the ct value is determined from the parameterized presence function.
  • Figure 1 is a schematic representation of a cycle of a PCR
  • FIG. 2 shows a system for carrying out a PCR method
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a typical qPCR curve with an intensity value profile
  • FIG. 4 shows a measured course of a qPCR curve
  • FIGS. 5a and 5b ideal courses of the qPCR curve for the case of a substance that cannot be detected or a substance that can be detected.
  • FIG. 6 shows a flow chart to illustrate a method for operating a qPCR measurement
  • FIG. 7 shows a photograph of a reaction chamber with a bubble
  • FIG. 8 shows a flow chart to illustrate a further one
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a known PCR method with the steps of denaturing the annealing and the elongation.
  • the double-stranded DNA in a substance is broken into two single strands at a high temperature of, for example, over 90 ° C.
  • a so-called primer is attached to the single strands at a specific DNA position which marks the beginning of a DNA strand section to be detected. This primer represents the starting point of an amplification of the DNA strand segment.
  • the complementary DNA strand segment is built up on the single strands starting at the position marked by the primer from the substance added, see above that at the end of the elongation step the previously split single strands have been supplemented to form complete double strands.
  • an intensity value By providing the free nucleotides or the primer with fluorescent molecules that only have fluorescent properties when they are bound to the DNA strand section, it is possible to obtain an intensity value by means of a suitable measurement by determining an intensity of a fluorescence following the elongation step S3 . An intensity value is assigned to the measured intensity of the fluorescent light.
  • steps S1 to S3 is carried out cyclically and the intensity values are recorded in order to obtain an intensity value profile as a qPCR curve.
  • a system 10 for carrying out a PCR method is shown in FIG.
  • the system has three reaction chambers, the denaturation chamber 11, the annealing chamber 12, and the elongation chamber 13 for performing denaturation, annealing or elongation, each of which is connected to an optical system by an intensity value capture.
  • the optical system comprises a respective camera 14, 15, 16 which are connected to a control unit 20 in which the camera images are evaluated.
  • the reaction chambers 11, 12, 13 can be closed off at least on one side with a transparent surface towards which the respective camera 14, 15, 16 is directed.
  • the cameras serve to capture a camera image of the respective reaction chamber and provide it to the control unit 20.
  • the cameras 14, 15, 16 are suitable for recognizing fluorescent light of the PCR method.
  • the control unit 20 is designed to carry out image processing of the recorded camera images and to determine an intensity value therefrom in accordance with one of the methods described below.
  • the intensity value curve has a curve that is shown in FIG. FIG. 3 shows a profile of a normalized intensity over the cycle index z.
  • This course is divided into three sections, namely a baseline section B, in which the fluorescence of the built-in fluorescence molecules cannot yet be distinguished from background fluorescence, an exponential section E, in which the intensity values are visible and increase exponentially, and in a plateau section P, in which the increase in the intensity values flattens out, since the reagents used (solution with nucleotides) have been used up and no further attachment to broken single strands takes place.
  • FIG. 4 shows an example of a curve of the intensity values obtained during a real measurement as a qPCR curve.
  • FIGS. 5a and 5b show ideal courses of a qPCR curve without the presence of a DNA strand segment to be detected or with the presence of a DNA strand segment to be detected.
  • FIG. 6 shows a flow chart to illustrate a method that is carried out in the control unit.
  • the method can be implemented in a data processing device as hardware and / or software.
  • a PCR measurement method is started in step S11.
  • step S12 the steps of denaturation, annealing and elongation are carried out as described above and an intensity value is determined at the end of the elongation step in each cycle. This is done by taking pictures of the elongation chamber 13 with the aid of the camera 16. To determine the intensity value, the formation of bubbles in the reaction chamber can be taken into account for the elongation.
  • FIG. 7 shows, by way of example, a photograph of a reaction chamber with an air bubble in the reaction liquid.
  • the presence of a bubble in the reaction chamber can be determined with the aid of methods known per se. Such methods can Thresholding (Otsu's Method), edge detection, Hough transformation and detection using data-based machine learning methods, such as using deep neural networks and the like.
  • the bubble area of the image can be determined on the basis of the recognized bubble, ie the area which is occupied by the bubble and the halo of the bubble. From the ratio of the bubble area and the total area of the reaction chamber, a bubble volume quotient can be determined which indicates the proportion of the volume in the reaction chamber that is occupied by the bubble and thus displaces a corresponding part of the reaction liquid.
  • a recorded intensity value therefore only results from the remaining reaction liquid and can be reduced by a factor of 1 ⁇ V b according to the volume V b of the bubble, since the brightness of the fluorescence in the reaction chamber is only caused by the remaining reaction liquid.
  • An alternative approach can be to select only the brightness of one or more pixels of the image of the reaction chamber and to neglect pixels that are part of a bubble or an associated halo.
  • the brightnesses of pixels that are to be assigned to the reaction liquid can be averaged in order to obtain a corresponding intensity value for creating the qPCR curve.
  • classification methods in particular using machine learning methods, can be used.
  • semantic segmentation can be carried out with the aid of the machine learning method. With semantic segmentation, one of several classes is assigned to each pixel of a camera image.
  • a data-based method with a classification model can be used, which has been trained with data labeled pixel by pixel.
  • Several n-ary classifications are conceivable for this specific application:
  • T ernary classification, second variant This variant supplements variant 1 with the additional class “Part of the halo of a bubble”. It can make sense to evaluate the pixels in the halo of a bubble separately, since the halo can also outshine part of the actual reaction volume. This method therefore also assumes that the position, size and orientation of the reaction chamber are known and cannot be changed relative to the camera.
  • Quaternary classification This variant corresponds to a combination of variants 2 and 3. This means that pixels in halos can be evaluated separately and changes in the orientation of the reaction chamber relative to the camera can be determined and compensated for.
  • the intensity values thus obtained can be corrected in step S13 by taking a reaction efficiency into account.
  • the reaction efficiency is assumed to be constant, in particular in the ideal case as 1.
  • the reaction efficiency varies in each cycle, so that the intensity values and the qPCR curve determined from them are incorrect.
  • reaction mixture displaced by bubbles in the reaction chamber cannot contribute to the amplification, since it is located in channels or other chambers, but not in the reaction chamber. Thus, the reaction efficiency deteriorates.
  • n i + i P ⁇ (1 + h)
  • ii j corresponds to the number of DNA strand sections in cycle i
  • h is the chemical reaction efficiency between 0 and 1.
  • h is assumed to be 1 in the simplest case. In a special embodiment, this factor can also be determined by an experimental series and thus more precisely approximated.
  • n i + i rii (l + Jj (l - V B i ))
  • step S14 the reaction efficiency determined in this way is used in the cycle as a scaling factor and the qPCR curve is constructed using the corrected intensity values n ac tuai, i from the measured intensity values n CU rve, i: ncurve, i nactual, i ⁇ n
  • step S15 it is checked whether the measuring method should be terminated. This can be the case, for example, after a termination criterion has been reached, such as a predetermined number of measuring cycles. If this is not the case (alternative: no), the method is continued in step S12, otherwise the method is ended with step S16 and the corrected qPCR curve is evaluated.
  • the evaluation in step S16 can be carried out by classifying the corrected qPCR curve with the aid of a predefined classification model. In this way it can be determined whether the corrected qPCR curve indicates the presence or absence of the DNA strand section to be detected, ie indicates whether the DNA strand section to be detected is contained in the substance or not.
  • FIG. 8 shows a flow chart to illustrate a further method that is carried out in the control unit.
  • the method can be implemented in a data processing device as hardware and / or software.
  • the qPCR process is started in step S21.
  • step S22 step S1 of denaturation is carried out in the corresponding denaturation reaction chamber.
  • step S23 a brightness h ü of the fluorescent light is recorded by the corresponding camera 14 of the denaturation chamber 11 at the end of the denaturation.
  • step S2 The annealing process of step S2 is started in step S24.
  • step S25 at the end of the annealing process, a brightness t of the fluorescent light is determined by the corresponding camera 15 of the annealing chamber
  • step S26 the reaction liquid is fed into the elongation chamber 13.
  • step S27 at the beginning of the elongation process, a brightness I ⁇ E , A of the fluorescent light is determined by the corresponding camera 16 of the elongation chamber
  • step S28 The elongation process is started in step S28.
  • step S29 a brightness h eei of the fluorescent light is recorded by the corresponding camera 16 of the elongation chamber 13 at the end of the elongation step.
  • the values h di , h ai , / i eai have the same brightness, since no amplification takes place and only differ from the brightness value h eei if additional fluorescence is produced by the amplification of the elongation process.
  • step S30 an overall reaction efficiency is calculated in step S30.
  • Bubble volume quotients q can thus be determined as quotients of the brightnesses between the individual sub-steps as follows: h d, i + 1
  • the number of DNA strand sections that is available as the beginning of the last sub-step for elongation and fluorescence incorporation thus corresponds to ne, a, i - n i ' d, i ' Ra, i ' Re, i
  • this reaction efficiency can be used as a scaling factor for the measured intensity value at the end of the elongation phase.
  • the reaction efficiency determined in this way is used in the cycle as a scaling factor and the qPCR curve is built up from the measured intensity values n CU rve, i with the aid of the corrected intensity values n ac tuai, i: ncurve, i nactual, i ⁇ n
  • step S32 it is checked whether the measuring method should be terminated. This can be the case, for example, after a termination criterion has been reached, such as a specified number of measuring cycles. If this is not the case (alternative: no), the method is continued in step S22, otherwise the method is ended with step S33 and the corrected qPCR curve is evaluated.
  • a termination criterion such as a specified number of measuring cycles.
  • the evaluation in step S33 can be carried out by classifying the corrected qPCR curve with the aid of a predefined classification model. In this way, it can be determined whether the corrected qPCR curve indicates the presence or absence of the DNA strand segment to be detected, i.e. H. indicates whether the DNA strand section to be detected is contained in the substance or not.

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Abstract

The invention relates to a method for operating a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method, having the following steps: cyclically carrying out (S12; S22, S24, S26, S28) qPCR cycles; measuring (S12, S29) the fluorescence in each qPCR cycle in order to obtain a qPCR curve of intensity values; determining the reaction efficiency (η) for each cycle; correcting (S13, S31) the intensity value of each cycle on the basis of the reaction efficiency (η) determined for the cycle in question in order to obtain a corrected qPCR curve (S14, S31); and operating (S16, S33) the qPCR method on the basis of the corrected qPCR curve.

Description

Beschreibung description
Titel title
Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines gPCR-Verfahrens Method and device for carrying out a gPCR method
Technisches Gebiet Technical area
Die Erfindung betrifft die Anwendung eines Polymerase- Kettenreaktionsverfahrens (PCR-Verfahrens), insbesondere zur Detektion des Vorliegens eines Erregers. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Auswertung von qPCR-Messungen. The invention relates to the use of a polymerase chain reaction process (PCR process), in particular for detecting the presence of a pathogen. The present invention also relates to the evaluation of qPCR measurements.
Technischer Hintergrund Technical background
Zur Detektion von DNA-Strangabschnitten in einer zu untersuchenden Substanz, wie beispielsweise einem Serum oder dergleichen, werden in automatisierten Systemen PCR-Verfahren durchgeführt. Die PCR-Systeme ermöglichen es, bestimmte zu detektierende DNA-Strangabschnitte, die z.B. einem Erreger zuzuordnen sind, zu amplifizieren und zu detektieren. Ein PCR-Verfahren umfasst generell eine zyklische Anwendung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation. Insbesondere wird beim PCR-Prozess ein DNA-Doppelstrang in Einzelstränge aufgespalten und diese jeweils durch Anlagerung von Nukleotiden wieder vervollständigt, um die DNA-Strangabschnitte in jedem Zyklus zu vervielfältigen. For the detection of DNA strand sections in a substance to be examined, such as, for example, a serum or the like, PCR methods are carried out in automated systems. The PCR systems make it possible to amplify and detect certain DNA strand sections to be detected, which can be assigned to a pathogen, for example. A PCR method generally comprises a cyclical application of the steps of denaturation, annealing and elongation. In particular, in the PCR process, a DNA double strand is split into single strands and these are each completed again by the addition of nucleotides in order to duplicate the DNA strand sections in each cycle.
Das qPCR-Verfahren ermöglicht die Erregerlast, nachgewiesen mit diesem Prozess zu quantifizieren. Dazu sind die Nukleotide zumindest teilweise mit Fluoreszenzmolekülen versehen, die bei Anbinden an den Einzelstrang des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts eine Fluoreszenzeigenschaft aktivieren. Nach dem Aufbau der Doppelstränge kann nach jedem Zyklus ein Intensitätswert einer Fluoreszenz ermittelt werden, der von der Anzahl der erzeugten DNA- Strangabschnitte abhängt. The qPCR method enables the pathogen load to be quantified using this process. For this purpose, the nucleotides are at least partially provided with fluorescent molecules which, when attached to the single strand of the DNA strand segment to be detected, activate a fluorescent property. After the double strands have been built up, a fluorescence intensity value can be determined after each cycle, which depends on the number of DNA strand segments produced.
Im Laufe der Amplifikation kann dann aus den ermittelten Intensitätswerten eine qPCR-Kurve ermittelt werden, die bei Vorliegen des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz einen sigmoidförmigen Verlauf hat. Die gemessenen qPCR-Kurven können in der Realität mit Artefakten behaftet sein, so dass in der Regel mehrere parallele Messungen durchgeführt werden, um durch eine Mittelwertbildung der Messwerte eine genauere Auswertung der qPCR-Kurven zu ermöglichen. In the course of the amplification, a qPCR curve can then be determined from the determined intensity values, which curve has a sigmoid shape when the DNA strand section to be detected is present in the substance to be examined. In reality, the measured qPCR curves can be afflicted with artifacts, so that, as a rule, several parallel measurements are carried out in order to enable a more precise evaluation of the qPCR curves by averaging the measured values.
Offenbarung der Erfindung Disclosure of the invention
Erfindungsgemäß sind ein Verfahren zum Durchführen eines qPCR-Verfahrens gemäß Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung und ein qPCR-System gemäß den nebengeordneten Ansprüchen vorgesehen. According to the invention, a method for performing a qPCR method according to claim 1 and a device and a qPCR system according to the independent claims are provided.
Weitere Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. Further refinements are given in the dependent claims.
Gemäß einem ersten Aspekt ist ein Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren vorgesehen, mit folgenden Schritten: According to a first aspect, a method for operating a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method is provided, comprising the following steps:
Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen Cyclical execution of qPCR cycles
Messen der Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten; Measuring the fluorescence at each qPCR cycle to obtain a qPCR curve from intensity values;
Bestimmen einer Reaktionseffizienz für jeden Zyklus; Determining a reaction efficiency for each cycle;
Korrigieren des Intensitätswerts jedes Zyklus abhängig von der für den betreffenden Zyklus bestimmten Reaktionseffizienz, um eine korrigierte qPCR-Kurve zu erhalten; Correcting the intensity value of each cycle depending on the reaction efficiency determined for that cycle in order to obtain a corrected qPCR curve;
Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Verlauf der korrigierten qPCR-Kurve. Operation of the qPCR process depending on the course of the corrected qPCR curve.
Das qPCR-Verfahren weist eine zyklische Wiederholung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation auf. Bei der Denaturierung wird bei einer hohen Temperatur die gesamte doppelsträngige DNA in der zu untersuchenden Substanz in zwei Einzelstränge aufgespalten. In dem Schritt des Annealing wird an die Einzelstränge einer der Substanz zugegebenen Primer angebunden, die den Startpunkt der Amplifizierung der zu detektierenden DNA- Strangabschnitte vorgeben. Bei dem Schritt der Elongation wird ein zweiter komplementärer DNA-Strangabschnitt aus freien Nukleotiden auf den mit dem Primer versehenen Einzelsträngen aufgebaut. Nach jedem dieser Zyklen hat sich also idealerweise die DNA-Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte verdoppelt. The qPCR method has a cyclical repetition of the steps of denaturation, annealing and elongation. When denaturing is at a high temperature, the entire double-stranded DNA in the substance to be examined is split into two single strands. In the annealing step, one of the primers added to the substance is bound to the single strands, which primers specify the starting point of the amplification of the DNA strand segments to be detected. In the elongation step, a second complementary DNA strand section is built up from free nucleotides on the single strands provided with the primer. After each of these cycles, the amount of DNA in the DNA strand segments to be detected has ideally doubled.
Durch die Anwendung des qPCR-Verfahrens werden in die zu detektierenden DNA-Strangabschnitte Fluoreszenzmoleküle als Marker eingebaut, so dass über eine Messung der Intensität der Fluoreszenz nach jedem Elongationsschritt ein zeitlicher Verlauf der Intensitätswerte ermittelt werden kann. Die so erhaltene qPCR-Kurve weist dabei drei distinkte Phasen auf, nämlich eine Baseline, in der die Intensität der Fluoreszenz des von eingebauten Markern emittierten Fluoreszenzlichts noch nicht von der Hintergrund-Fluoreszenz zu unterscheiden ist, einer exponentiellen Phase, in der die Fluoreszenzintensität über die Baseline ansteigt, also sichtbar wird, wobei durch die Verdoppelung der DNA-Stränge in jedem Zyklus das Fluoreszenzsignal proportional zur Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte exponentiell ansteigt, und einer Plateau-Phase, in der die Reagenzien, d. h. der Primer und die freien Nukleotide, nicht mehr in den benötigten Konzentrationen vorhanden sind und keine weitere Verdoppelung stattfindet. By using the qPCR method, fluorescent molecules are built into the DNA strand sections to be detected as markers, so that a time course of the intensity values can be determined by measuring the intensity of the fluorescence after each elongation step. The qPCR curve obtained in this way has three distinct phases, namely a baseline in which the intensity of the fluorescence of the fluorescent light emitted by built-in markers cannot yet be distinguished from the background fluorescence, an exponential phase in which the fluorescence intensity varies over the Baseline increases, that is to say becomes visible, with the fluorescence signal increasing exponentially in proportion to the amount of DNA strand segments to be detected due to the doubling of the DNA strands in each cycle, and a plateau phase in which the reagents, i. H. the primer and the free nucleotides are no longer available in the required concentrations and no further duplication takes place.
Für den Nachweis eines vorgegebenen zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, der beispielsweise einem Erreger entsprechen kann, ist hierbei der sogenannte ct (cycle threshold)-Wert maßgeblich. Der ct-Wert bestimmt den Beginn der exponentiellen Phase und wird durch Überschreiten eines spezifischen Grenzwerts, der für den jeweils zu detektierenden DNA-Strangabschnitt festgelegt ist und der für alle Proben für den zu detektierenden DNA-Strangabschnitt identisch ist, ermittelt oder rechnerisch durch die zweite Ableitung der qPCR-Kurve in der exponentiellen Phase ermittelt und dem Intensitätswert des steilsten Anstiegs der qPCR-Kurve entspricht. Ist der Zielwert bekannt, kann durch Rückrechnung die Anfangskonzentration des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz bestimmt werden. In der Realität sind die qPCR-Kurven sehr ungenau und erheblichen Schwankungen unterworfen. Es kann einerseits ein Baseline-Drift auftreten, mit der das Ansteigen der Hintergrundfluoreszenz über die Messzyklen bezeichnet wird. Das heißt, dass, selbst wenn keine Amplifikation stattfindet, das Fluoreszenzsignal ansteigt. Weitere Einflussfaktoren, die sich negativ auf die Genauigkeit der qPCR-Kurve auswirken, können beispielsweise aus thermischem Rauschen, Schwankungen bzw. Zumesstoleranzen in der Reagenzkonzentration, Lufteinschlüsse und Artefakten im Fluoreszenzvolumen resultieren. The so-called ct (cycle threshold) value is decisive for the detection of a predetermined DNA strand section to be detected, which can correspond to a pathogen, for example. The ct value determines the beginning of the exponential phase and is determined by exceeding a specific limit value that is defined for the DNA strand segment to be detected and which is identical for all samples for the DNA strand segment to be detected, or it is calculated by the second Derivation of the qPCR curve determined in the exponential phase and corresponds to the intensity value of the steepest rise in the qPCR curve. If the target value is known, the initial concentration of the DNA strand section to be detected in the substance to be examined can be determined by back-calculation. In reality, the qPCR curves are very imprecise and subject to considerable fluctuations. On the one hand, a baseline drift can occur, which describes the increase in background fluorescence over the measurement cycles. This means that even if there is no amplification, the fluorescence signal increases. Further influencing factors that have a negative effect on the accuracy of the qPCR curve can result, for example, from thermal noise, fluctuations or metering tolerances in the reagent concentration, air inclusions and artifacts in the fluorescence volume.
In herkömmlichen qPCR-Systemen findet einerseits eine softwarebasierte Korrektur der qPCR-Kurven statt, andererseits kann vorgesehen sein, eine Probe unter gleichen Bedingungen mehrfach zu messen und die resultierenden qPCR- Kurven durch Mittelwertbildung zu glätten. Dies erfordert jedoch einen erhöhten Aufwand. In conventional qPCR systems, on the one hand, a software-based correction of the qPCR curves takes place; on the other hand, provision can be made to measure a sample several times under the same conditions and to smooth the resulting qPCR curves by averaging. However, this requires increased effort.
Eine Idee des obigen Verfahrens besteht darin, eine Reaktionseffizienz in jedem Schritt des PCR-Verfahrens zu berücksichtigen, so dass eine Auswertung der qPCR-Kurve verbessert werden kann. Die Reaktionseffizienz bestimmt sich maßgeblich durch die in der jeweiligen Reaktionskammer befindlichen Reaktionsflüssigkeit, so dass ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Lumineszenz und dem erfassten Intensitätswert und der Menge des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts besteht. Im Unterschied zu herkömmlichen PCR-Verfahren ist vorgesehen, nach jedem Reaktionszyklus der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation ein Bild der Reaktionskammer aufzunehmen und daraus einen Blasenvolumenquotienten zu ermitteln, der einen Volumenanteil einer Luftblase in der Reaktionskammer angibt, die nicht zur Reaktion mit dem zu detektierenden DNA-Strangabschnitt beiträgt. Dadurch werden die DNA-Strangabschnitte nicht in jedem PCR-Zyklus verdoppelt, wie es für den Idealfall der Fall wäre, sondern nur mit einem Faktor zwischen 1 und 2 vervielfältigt. Die Reaktionseffizienz dieser Amplifizierung entspricht dem über 1 hinausgehenden Anteil dieses Faktors der Amplifizierung. One idea of the above method is to take into account a reaction efficiency in each step of the PCR method, so that an evaluation of the qPCR curve can be improved. The reaction efficiency is largely determined by the reaction liquid in the respective reaction chamber, so that there is a clear relationship between the luminescence and the detected intensity value and the amount of the DNA strand segment to be detected. In contrast to conventional PCR methods, provision is made for taking a picture of the reaction chamber after each reaction cycle of the steps of denaturation, annealing and elongation and determining a bubble volume quotient from this, which indicates a volume fraction of an air bubble in the reaction chamber that does not react with contributes to the DNA strand section to be detected. As a result, the DNA strand sections are not doubled in each PCR cycle, as would be the case in the ideal case, but only multiplied by a factor between 1 and 2. The reaction efficiency of this amplification corresponds to the proportion of this factor of the amplification that exceeds 1.
Entsprechend obigem Verfahren wird die Reaktionseffizienz also nach jedem Zyklus ermittelt, und der jeweils ermittelten Intensitätswert wird mit der Reaktionseffizienz korrigiert. Auf diese Weise erhält man eine auf eine Reaktionseffizienz von 1 idealisierte qPCR-Kurve, die in vereinfachter Weise in einem nachfolgenden Schritt ausgewertet werden kann. According to the above method, the reaction efficiency is determined after each cycle, and the intensity value determined in each case is corrected with the reaction efficiency. That way you get one at a time Reaction efficiency of 1 idealized qPCR curve, which can be evaluated in a simplified manner in a subsequent step.
Im Stand der Technik werden die qPCR-Kurven dadurch generiert, dass gemittelte Intensitätswerte pro Zyklus zu einer Kurve kombiniert werden, die nach der Messung an eine sigmoidale Kurve gefittet wird, um die korrigierte qPCR-Kurve auszuwerten, insbesondere um daraus den CT-Wert zu erhalten. Dabei wird die Reaktionseffizienz in der Standardberechnung als immer gleich, insbesondere als eine Verdopplung (Reaktionseffizient = 1), angenommen. Da realeIn the prior art, the qPCR curves are generated in that averaged intensity values per cycle are combined into a curve which, after the measurement, is fitted to a sigmoid curve in order to evaluate the corrected qPCR curve, in particular in order to derive the CT value from it obtain. The reaction efficiency in the standard calculation is always assumed to be the same, in particular as a doubling (reaction efficiency = 1). There real ones
Reaktionseffizienten kleiner 1 sind, ist die so ermittelte sigmoidale Kurve fehlerhaft. The sigmoid curve determined in this way is incorrect.
Weiterhin kann das PCR-Verfahren durch Leiten einer Reaktionsflüssigkeit in eine Reaktionskammer, insbesondere in jedem Zyklus, durchgeführt werden, wobei die Reaktionseffizienz abhängig von einer Fläche einer oder mehrerer Blasen, insbesondere Luftblasen, in der Reaktionskammer, insbesondere der Reaktionskammer für einen Elongationsprozess des PCR-Prozesses, bestimmt wird. Furthermore, the PCR method can be carried out by passing a reaction liquid into a reaction chamber, in particular in each cycle, the reaction efficiency depending on an area of one or more bubbles, in particular air bubbles, in the reaction chamber, in particular the reaction chamber for an elongation process of the PCR. Process, is determined.
Die Reaktionseffizienz wird insbesondere durch Blasen in der Reaktionskammer beeinträchtigt, da die Menge des Reaktionsgemischs dadurch reduziert wird. Da die Anzahl und Größe von Blasen in der Reaktionskammer von Zyklus zu Zyklus variieren können, kann die dadurch bewirkte Reduzierung der Reaktionseffizienz ebenfalls variieren. Unter der Annahme, dass die Blasenbildung in der Reaktionskammer der maßgebliche Effekt zur Reduzierung der Reaktionseffizienz ist, kann ein Blasenvolumenquotient definiert werden, der das Blasenvolumen als Anteil des Gesamtvolumens der Reaktionskammer angibt und entsprechend proportional die Reaktionseffizienz reduziert. The reaction efficiency is particularly impaired by bubbles in the reaction chamber, since the amount of the reaction mixture is reduced thereby. Since the number and size of bubbles in the reaction chamber can vary from cycle to cycle, the resulting reduction in reaction efficiency can also vary. Assuming that the formation of bubbles in the reaction chamber is the decisive effect for reducing the reaction efficiency, a bubble volume quotient can be defined which indicates the bubble volume as a proportion of the total volume of the reaction chamber and accordingly proportionally reduces the reaction efficiency.
Es kann vorgesehen sein, dass ein Bild der Reaktionskammer mithilfe einer Kamera aufgenommen wird, wobei die Fläche der einen oder den mehreren Blasen mithilfe von auf das Bild der Reaktionskammer angewendeten Mustererkennungsverfahren bestimmt wird. It can be provided that an image of the reaction chamber is recorded with the aid of a camera, the area of the one or more bubbles being determined with the aid of pattern recognition methods applied to the image of the reaction chamber.
Die Blasendetektion kann durch bekannte Verfahren, wie Thresholding (z. B. Otsu's Method), Kantenerkennung, Hough-Transformation, datenbasierte Verfahren basierend auf neuronalen Netzen und dergleichen durchgeführt werden. Da die Geometrie der Reaktionskammer bekannt ist, kann durch Auswertung eines Kamerabildes der Reaktionskammer anhand der Blasenausdehnung eine Abschätzung des verdrängten Volumens der Reaktionsflüssigkeit in jedem Zyklus durchgeführt werden. The bubble detection can be carried out by known methods such as thresholding (e.g. Otsu's method), edge detection, Hough transformation, data-based methods based on neural networks and the like. Since the geometry of the reaction chamber is known, an assessment of the displaced volume of the reaction liquid in each cycle can be carried out by evaluating a camera image of the reaction chamber on the basis of the bubble expansion.
Insbesondere kann die Reaktionseffizienz mithilfe der Helligkeit eines oder mehrerer Pixel des Bildes, die der Reaktionsflüssigkeit entsprechen, und des Anteils der Fläche der einen oder mehreren Blasen an der gesamten Fläche der Reaktionskammer bestimmt werden. In particular, the reaction efficiency can be determined with the aid of the brightness of one or more pixels of the image which correspond to the reaction liquid and the proportion of the area of the one or more bubbles in relation to the total area of the reaction chamber.
Gemäß einer Ausführungsform kann die Reaktionseffizienz abhängig von einer Fläche einer oder mehrerer Blasen in der Reaktionskammer für mindestens zwei der PCR-Teilprozessschritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation bestimmt werden. According to one embodiment, the reaction efficiency can be determined as a function of an area of one or more bubbles in the reaction chamber for at least two of the PCR sub-process steps of denaturation, annealing and elongation.
Zur Bestimmung des Intensitätswertes des verbleibenden Reaktionsvolumens kann vorgesehen sein, nur die Helligkeit derjenigen Pixel auszuwählen, die sicher nicht zu einer Blase oder zu einer Halo (Randbereich) einer Blase gehört. Alternativ kann der Mittelwert der Helligkeit der Reaktionskammer verwendet werden, wobei die Helligkeit unter Berücksichtigung eines Blasenvolumens, das in der Regel keine Fluoreszenz aufweist, mithilfe des Blasenvolumenquotienten bestimmt werden kann. Die Ermittlung, welche der Pixel zu einem Blasenvolumen gehören, welche zur Halo und welche zur Reaktionsflüssigkeit, kann mithilfe datenbasierter Verfahren für eine sogenannte semantische Segmentierung durchgeführt werden. Bei der semantischen Segmentierung wird jedem Pixel eines Bildes eine Klasse aus einer Anzahl von vorgegebenen Klassen zugeordnet. Mit einem solchen Klassifikator lässt sich ein Kamerabild der Reaktionskammer in einfacher Weise auswerten. To determine the intensity value of the remaining reaction volume, it can be provided to select only the brightness of those pixels which definitely do not belong to a bubble or to a halo (edge area) of a bubble. Alternatively, the mean value of the brightness of the reaction chamber can be used, with the brightness being able to be determined with the aid of the bubble volume quotient, taking into account a bubble volume which generally does not have fluorescence. The determination of which of the pixels belong to a bubble volume, which to the halo and which to the reaction liquid can be carried out with the aid of data-based methods for what is known as semantic segmentation. In semantic segmentation, each pixel of an image is assigned a class from a number of predefined classes. With such a classifier, a camera image of the reaction chamber can be evaluated in a simple manner.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, die Blasenbildung in den verschiedenen Schritten des PCR-Verfahrens, nämlich der Denaturierung des Annealing und der Elongation, separat zu betrachten. Dadurch können unterschiedliche Blasengrößen in den einzelnen Reaktionsschritten eines PCR-Zyklusses berücksichtigt werden, wobei die jeweiligen Blasengrößen für jeden der Prozessschritte eine Reduzierung der Reaktionseffizienz bewirkt. So können in jedem PCR-Zyklus Kamerabilder ausgewertet werden, d.h. am Ende der Denaturierung, am Ende des Annealing, zu Beginn der Elongation und am Ende der Elongation eine Fluoreszenzmessung durchgeführt werden. Die ersten drei Werte sollten bei gleichem Blasenvolumen dieselbe Helligkeit aufweisen und sich von dem Intensitätswert des vierten Werts nur dann unterscheiden, wenn zusätzliche Fluoreszenz entsteht. It can also be provided that the bubble formation in the various steps of the PCR method, namely the denaturation of the annealing and the elongation, is considered separately. As a result, different bubble sizes can be taken into account in the individual reaction steps of a PCR cycle, the respective bubble sizes for each of the process steps reducing the reaction efficiency. In this way, camera images can be evaluated in each PCR cycle, ie at the end of the Denaturation, at the end of the annealing, at the beginning of the elongation and at the end of the elongation a fluorescence measurement can be carried out. The first three values should have the same brightness for the same bubble volume and only differ from the intensity value of the fourth value if additional fluorescence is produced.
Es kann nun für jeden Prozessschritt innerhalb eines PCR-Zyklusses das verdrängte Blasenvolumen berücksichtigt werden, wobei der Quotient der Intensitätswerte von aufeinander folgenden Prozessschritten proportional zur Veränderung des Reaktionsvolumens in der entsprechenden Kammer ist. Unter der Annahme, dass die denaturierten und elongierten DNA-Strangabschnitte, die nicht amplifiziert werden, sich nach der Elongation wieder zu den ursprünglichen Doppelsträngen zusammenfügen, ergibt sich nach Ende eines PCR-Zyklusses ein von den Helligkeitsquotienten zwischen den einzelnen Prozessschritten abhängiger Wert der Reaktionseffizienz. Dieser kann dann bei der Korrektur der aufgezeichneten qPCR-Kurve verwendet werden. The displaced bubble volume can now be taken into account for each process step within a PCR cycle, the quotient of the intensity values of successive process steps being proportional to the change in the reaction volume in the corresponding chamber. Assuming that the denatured and elongated DNA strand sections that are not amplified will rejoin the original double strands after elongation, the result at the end of a PCR cycle is a value of the reaction efficiency that depends on the brightness quotient between the individual process steps. This can then be used to correct the recorded qPCR curve.
Weiterhin kann mithilfe der korrigierten qPCR-Kurve basierend auf einem Klassifikationsverfahren bestimmt werden, ob ein zu detektierenden DNA- Strangabschnitt vorhanden ist oder nicht. Furthermore, based on a classification method, the corrected qPCR curve can be used to determine whether or not a DNA strand section to be detected is present.
Gemäß einer Ausführungsform kann das qPCR-Verfahren betrieben werden, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts, signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt wird. According to one embodiment, the qPCR method can be operated in that when the presence of the DNA strand section to be detected is detected, it is signaled that a ct value can be determined, the ct value is determined from the parameterized presence function.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen Brief description of the drawings
Ausführungsformen werden nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen: Embodiments are explained in more detail below with reference to the accompanying drawings. Show it:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines Zyklus eines PCR-Figure 1 is a schematic representation of a cycle of a PCR
Verfahrens; Figur 2 ein System zur Durchführung eines PCR-Verfahrens; Procedure; FIG. 2 shows a system for carrying out a PCR method;
Figur 3 eine schematische Darstellung einer typischen qPCR-Kurve mit einem Intensitätswerteverlauf; FIG. 3 shows a schematic representation of a typical qPCR curve with an intensity value profile;
Figur 4 ein gemessener Verlauf einer qPCR-Kurve; FIG. 4 shows a measured course of a qPCR curve;
Figur 5a und 5b ideale Verläufe der qPCR-Kurve für den Fall einer nicht nachweisbaren Substanz bzw. einer nachweisbaren Substanz; und FIGS. 5a and 5b ideal courses of the qPCR curve for the case of a substance that cannot be detected or a substance that can be detected; and
Figur 6 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung; FIG. 6 shows a flow chart to illustrate a method for operating a qPCR measurement;
Figur 7 eine fotografische Aufnahme einer Reaktionskammer mit einer Blase; FIG. 7 shows a photograph of a reaction chamber with a bubble;
Figur 8 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines weiterenFIG. 8 shows a flow chart to illustrate a further one
Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung. Procedure for operating a qPCR measurement.
Beschreibung von Ausführungsformen Description of embodiments
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung eines an sich bekannten PCR- Verfahrens mit den Schritten der Denaturierung des Annealing und der Elongation. FIG. 1 shows a schematic representation of a known PCR method with the steps of denaturing the annealing and the elongation.
In dem Schritt des Annealing S1 wird bei einer hohen Temperatur von beispielsweise über 90°C die doppelsträngige DNA in einer Substanz in zwei Einzelstränge aufgebrochen. In einem nachfolgenden Annealing-Schritt S2 wird an die Einzelstränge an einer bestimmten DNA-Position, die einen Beginn eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts markiert, ein sogenannter Primer angebunden. Dieser Primer stellt den Startpunkt einer Amplifizierung des DNA- Strangabschnitts dar. In einem Elongationsschritt S3 wird beginnend an der von dem Primer markierten Position aus der Substanz zugesetzten freien Nukleotiden der komplementäre DNA- Strangabschnitts an den Einzelsträngen aufgebaut, so dass am Ende des Elongationsschrittes die zuvor aufgespaltenen Einzelstränge zu vollständigen Doppelsträngen ergänzt worden sind. In the annealing step S1, the double-stranded DNA in a substance is broken into two single strands at a high temperature of, for example, over 90 ° C. In a subsequent annealing step S2, a so-called primer is attached to the single strands at a specific DNA position which marks the beginning of a DNA strand section to be detected. This primer represents the starting point of an amplification of the DNA strand segment. In an elongation step S3, the complementary DNA strand segment is built up on the single strands starting at the position marked by the primer from the substance added, see above that at the end of the elongation step the previously split single strands have been supplemented to form complete double strands.
Durch Versehen der freien Nukleotide bzw. des Primers mit Fluoreszenzmolekülen, die nur in dem an den DNA-Strangabschnitt gebundenen Zustand Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, ist es möglich, durch Ermitteln einer Intensität einer Fluoreszenz im Anschluss an den Elongationsschritt S3 einen Intensitätswert durch eine geeignete Messung zu erhalten. Der gemessenen Intensität des Fluoreszenzlichts wird ein Intensitätswert zugeordnet. By providing the free nucleotides or the primer with fluorescent molecules that only have fluorescent properties when they are bound to the DNA strand section, it is possible to obtain an intensity value by means of a suitable measurement by determining an intensity of a fluorescence following the elongation step S3 . An intensity value is assigned to the measured intensity of the fluorescent light.
Das Verfahren der Schritte S1 bis S3 wird zyklisch ausgeführt und die Intensitätswerte aufgezeichnet, um einen Intensitätswerteverlauf als eine qPCR- Kurve zu erhalten. The method of steps S1 to S3 is carried out cyclically and the intensity values are recorded in order to obtain an intensity value profile as a qPCR curve.
In Figur 2 ist ein System 10 zur Durchführung eines PCR-Verfahrens dargestellt. Das System weist drei Reaktionskammern, die Denaturierung-Kammer 11, die Annealing-Kammer 12, und die Elongations-Kammer 13 für die Durchführung der Denaturierung, des Annealing bzw. der Elongation auf, die jeweils mit einem optischen System verbunden ist, um einen Intensitätswert zu erfassen. Das optische System umfasst eine jeweilige Kamera 14, 15, 16, die mit einer Steuereinheit 20 verbunden sind, in der die Kamerabilder ausgewertet werden. Dazu können die Reaktionskammern 11, 12, 13 zumindest einseitig mit einer transparenten Fläche abgeschlossen sein, auf die die jeweilige Kamera 14, 15, 16 gerichtet ist. Die Kameras dienen dazu, ein Kamerabild der jeweiligen Reaktionskammer zu erfassen und der Steuereinheit 20 bereitzustellen. Die Kameras 14, 15, 16 sind geeignet, ein Fluoreszenzlicht des PCR-Verfahrens zu erkennen. Die Steuereinheit 20 ist ausgebildet, eine Bildverarbeitung der aufgezeichneten Kamerabilder durchzuführen und daraus entsprechend einem der nachfolgend beschriebenen Verfahren einen Intensitätswert zu ermitteln. A system 10 for carrying out a PCR method is shown in FIG. The system has three reaction chambers, the denaturation chamber 11, the annealing chamber 12, and the elongation chamber 13 for performing denaturation, annealing or elongation, each of which is connected to an optical system by an intensity value capture. The optical system comprises a respective camera 14, 15, 16 which are connected to a control unit 20 in which the camera images are evaluated. For this purpose, the reaction chambers 11, 12, 13 can be closed off at least on one side with a transparent surface towards which the respective camera 14, 15, 16 is directed. The cameras serve to capture a camera image of the respective reaction chamber and provide it to the control unit 20. The cameras 14, 15, 16 are suitable for recognizing fluorescent light of the PCR method. The control unit 20 is designed to carry out image processing of the recorded camera images and to determine an intensity value therefrom in accordance with one of the methods described below.
Der Intensitätswerteverlauf hat im Idealfall einen Verlauf, der in Figur 3 dargestellt ist. Figur 3 zeigt einen Verlauf einer normalisierten Intensität über dem Zyklusindex z. Dieser Verlauf unterteilt sich in drei Abschnitte, nämlich einen Baseline- Abschnitt B, in dem die Fluoreszenz der eingebauten Fluoreszenzmoleküle noch nicht von einer Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden ist, einen exponentiellen Abschnitt E, in dem die Intensitätswerte sichtbar sind und exponentiell ansteigen, und in einem Plateau-Abschnitt P, in dem sich der Anstieg der Intensitätswerte abflacht, da die verwendeten Reagenzien (Lösung mit Nukleotiden) aufgebraucht sind und keine weitere Anbindung an aufgebrochenen Einzelsträngen stattfindet. In the ideal case, the intensity value curve has a curve that is shown in FIG. FIG. 3 shows a profile of a normalized intensity over the cycle index z. This course is divided into three sections, namely a baseline section B, in which the fluorescence of the built-in fluorescence molecules cannot yet be distinguished from background fluorescence, an exponential section E, in which the intensity values are visible and increase exponentially, and in a plateau section P, in which the increase in the intensity values flattens out, since the reagents used (solution with nucleotides) have been used up and no further attachment to broken single strands takes place.
In Figur 4 ist beispielhaft ein bei einer realen Messung erhaltener Verlauf der Intensitätswerte als qPCR-Kurve dargestellt. Man erkennt starke Schwankungen, die sich aus einer Hintergrundfluoreszenz, thermisches Rauschen, Schwankungen in den Reagenzkonzentrationen sowie Bläschen und Artefakte im Fluoreszenzvolumen ergeben können. Man erkennt, dass die Bestimmung des Baseline-Abschnitts, des exponentiellen Abschnitts und des Plateau-Abschnitts der qPCR-Kurve nicht ohne weiteres möglich ist. FIG. 4 shows an example of a curve of the intensity values obtained during a real measurement as a qPCR curve. One recognizes strong fluctuations which can result from background fluorescence, thermal noise, fluctuations in the reagent concentrations as well as bubbles and artifacts in the fluorescence volume. It can be seen that the determination of the baseline section, the exponential section and the plateau section of the qPCR curve is not easily possible.
Figuren 5a und 5b zeigen ideale Verläufe einer qPCR-Kurve ohne Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts bzw. mit Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts. FIGS. 5a and 5b show ideal courses of a qPCR curve without the presence of a DNA strand segment to be detected or with the presence of a DNA strand segment to be detected.
In Figur 6 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens dargestellt, das in der Steuereinheit ausgeführt wird. Das Verfahren kann in einer Datenverarbeitungseinrichtung als Hardware und/oder Software implementiert sein. FIG. 6 shows a flow chart to illustrate a method that is carried out in the control unit. The method can be implemented in a data processing device as hardware and / or software.
Im Schritt S11 wird ein PCR-Messverfahren gestartet. A PCR measurement method is started in step S11.
In Schritt S12 werden die Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation wie oben beschrieben durchgeführt und am Ende des Elongationsschrittes in jedem Zyklus ein Intensitätswert ermittelt. Dies erfolgt durch Aufnahmen der Elongations-Kammer 13 mithilfe der Kamera 16. Zur Bestimmung des Intensitätswertes kann eine Blasenbildung in der Reaktionskammer für die Elongation berücksichtigt werden. In Figur 7 ist beispielhaft eine fotografische Aufnahme einer Reaktionskammer mit einer Luftblase in der Reaktionsflüssigkeit gezeigt. In step S12, the steps of denaturation, annealing and elongation are carried out as described above and an intensity value is determined at the end of the elongation step in each cycle. This is done by taking pictures of the elongation chamber 13 with the aid of the camera 16. To determine the intensity value, the formation of bubbles in the reaction chamber can be taken into account for the elongation. FIG. 7 shows, by way of example, a photograph of a reaction chamber with an air bubble in the reaction liquid.
Mithilfe von an sich bekannten Verfahren kann das Vorliegen einer Blase in der Reaktionskammer bestimmt werden. Derartige Verfahren können Thresholding (Otsu's Method), Kantenerkennung, Hough-Transformation sowie Erkennung mithilfe von datenbasierten Maschine-Learning-Verfahren, wie beispielsweise unter Nutzung von tiefen neuronalen Netzen und dergleichen, vorgenommen werden. Anhand der erkannten Blase kann die Blasenfläche der Abbildung bestimmt werden, d.h. die Fläche, die durch die Blase und die Halo der Blase eingenommen wird. Aus dem Verhältnis der Blasenfläche und der gesamten Fläche der Reaktionskammer kann ein Blasenvolumenquotient ermittelt werden, der den Anteil des Volumens in der Reaktionskammer angibt, der durch die Blase belegt wird und damit einen entsprechenden Teil der Reaktionsflüssigkeit verdrängt. Ein erfasster Intensitätswert ergibt sich daher nur aus der verbleibenden Reaktionsflüssigkeit und kann entsprechend dem Volumen Vb der Blase um den Faktor 1 - Vb reduziert werden, da die Helligkeit der Fluoreszenz in der Reaktionskammer nur von der verbleibenden Reaktionsflüssigkeit bewirkt wird. The presence of a bubble in the reaction chamber can be determined with the aid of methods known per se. Such methods can Thresholding (Otsu's Method), edge detection, Hough transformation and detection using data-based machine learning methods, such as using deep neural networks and the like. The bubble area of the image can be determined on the basis of the recognized bubble, ie the area which is occupied by the bubble and the halo of the bubble. From the ratio of the bubble area and the total area of the reaction chamber, a bubble volume quotient can be determined which indicates the proportion of the volume in the reaction chamber that is occupied by the bubble and thus displaces a corresponding part of the reaction liquid. A recorded intensity value therefore only results from the remaining reaction liquid and can be reduced by a factor of 1 −V b according to the volume V b of the bubble, since the brightness of the fluorescence in the reaction chamber is only caused by the remaining reaction liquid.
Ein alternativer Ansatz kann darin bestehen, nur die Helligkeit von einem oder mehreren Pixel der Abbildung der Reaktionskammer auszuwählen und Pixel, die Teil einer Blase oder einer dazugehörigen Halo sind, zu vernachlässigen. Die Helligkeiten von Pixeln, die der Reaktionsflüssigkeit zuzuordnen sind, können gemittelt werden, um einen entsprechenden Intensitätswert zum Erstellen der qPCR-Kurve zu erhalten. Um für die Mittelung relevante Pixel auszuwählen, können Klassifikationsverfahren, insbesondere unter Nutzung von Machine- Learning-Verfahren, verwendet werden. Dabei kann mithilfe der Machine- Learning-Verfahren eine sogenannte semantische Segmentierung durchgeführt werden. Bei der semantischen Segmentierung wird jedem Pixel eines Kamerabildes eine von mehreren Klassen zugeordnet. An alternative approach can be to select only the brightness of one or more pixels of the image of the reaction chamber and to neglect pixels that are part of a bubble or an associated halo. The brightnesses of pixels that are to be assigned to the reaction liquid can be averaged in order to obtain a corresponding intensity value for creating the qPCR curve. In order to select pixels relevant for the averaging, classification methods, in particular using machine learning methods, can be used. So-called semantic segmentation can be carried out with the aid of the machine learning method. With semantic segmentation, one of several classes is assigned to each pixel of a camera image.
Hierfür kann ein datenbasiertes Verfahren mit einem Klassifikationsmodell verwendet werden, welches mit pixelweise gelabelten Daten trainiert worden ist. Für diesen konkreten Anwendungsfall sind mehrere n-näre Klassifizierungen denkbar: For this purpose, a data-based method with a classification model can be used, which has been trained with data labeled pixel by pixel. Several n-ary classifications are conceivable for this specific application:
1. Binäre Klassifikation: Jedem Pixel wird die Klasse „Teil einer Blase“ oder „nicht Teil einer Blase“ zugeordnet. Die Grauwertermittlung findet dann nur über die Piel der Klasse „nicht Teil einer Blase“ statt, die im Reaktionsvolumen liegen. Dieses Verfahren setzt somit voraus, dass Position, Größe und Orientierung der Reaktionskammer bekannt und relativ zur Kamera unveränderlich sind. 1. Binary classification: Each pixel is assigned the class “part of a bubble” or “not part of a bubble”. The gray value determination then only takes place via the points of the class “not part of a bubble” that lie in the reaction volume. This method therefore assumes that the position, size and orientation of the reaction chamber are known and cannot be changed relative to the camera.
2. Ternäre Klassifikation: Diese Variante ergänzt die Variante 1 mit der zusätzlichen Klasse „nicht Teil des Reaktionsvolumens“. Dadurch setzt dieses Verfahren nicht länger voraus, dass Position, Größe und Orientierung der Reaktionskammer bekannt und relativ zur Kamera unveränderlich sind. 2. Ternary classification: This variant supplements variant 1 with the additional class “not part of the reaction volume”. This sets this method no longer assumes that the position, size, and orientation of the reaction chamber are known and immutable relative to the camera.
3. T ernäre Klassifikation, zweite Variante: Diese Variante ergänzt die Variante 1 mit der zusätzlichen Klasse „Teil des Halos einer Blase“. Es kann sich als sinnvoll heraussteilen, die Pixel im Halo einer Blase separat auszuwerten, da das Halo auch einen Teil des eigentlichen Reaktionsvolumens überstrahlen kann. Dieses Verfahren setzt somit auch voraus, dass Position, Größe und Orientierung der Reaktionskammer bekannt und relativ zur Kamera unveränderlich sind. 3. T ernary classification, second variant: This variant supplements variant 1 with the additional class “Part of the halo of a bubble”. It can make sense to evaluate the pixels in the halo of a bubble separately, since the halo can also outshine part of the actual reaction volume. This method therefore also assumes that the position, size and orientation of the reaction chamber are known and cannot be changed relative to the camera.
4. Quarternäre Klassifikation: Diese Variante entspricht einer Kombination der Varianten 2 und 3. Hiermit können also sowohl Pixel in Halos separat ausgewertet werden als auch Veränderungen in der relativen Orientierung der Reaktionskammer zur Kamera festgestellt und kompensiert werden. 4. Quaternary classification: This variant corresponds to a combination of variants 2 and 3. This means that pixels in halos can be evaluated separately and changes in the orientation of the reaction chamber relative to the camera can be determined and compensated for.
5. Binäre Klassifikation. Bei dieser Variante wird jedem Pixel wird die Klasse „Teil des Randes einer Blase“ oder „nicht Teil des Randes einer Blase“ zugeordnet. Dies entspricht einer Kantenerkennung (Edge Detection). Die Grauwertermittlung findet dann nur über die Piel statt, die völlig von Pixeln der Klasse „Teil des Randes einer Blase“ umgeben sind. Dies setzt somit voraus, dass Position, Größe und Orientierung der Reaktionskammer bekannt und relativ zur Kamera unveränderlich sind. 5. Binary classification. With this variant, the class “part of the edge of a bubble” or “not part of the edge of a bubble” is assigned to each pixel. This corresponds to edge detection. The gray value determination then only takes place via the peaks that are completely surrounded by pixels of the class “part of the edge of a bubble”. This presupposes that the position, size and orientation of the reaction chamber are known and cannot be changed relative to the camera.
Die so erhaltenen Intensitätswerte können in Schritt S13 korrigiert werden, indem eine Reaktionseffizienz berücksichtigt wird. Beim Stand der Technik wird die Reaktionseffizienz als konstant, insbesondere im Idealfall als 1 angenommen. Für reale Systeme ist jedoch davon auszugehen, dass die Reaktionseffizienz in jedem Zyklus variiert, so dass die Intensitätswerte und die daraus ermittelte qPCR-Kurve fehlerhaft sind. The intensity values thus obtained can be corrected in step S13 by taking a reaction efficiency into account. In the prior art, the reaction efficiency is assumed to be constant, in particular in the ideal case as 1. For real systems, however, it can be assumed that the reaction efficiency varies in each cycle, so that the intensity values and the qPCR curve determined from them are incorrect.
Es wird hierin davon ausgegangen, dass das durch Blasen in der Reaktionskammer verdrängte Reaktionsgemisch nicht zur Amplifikation beitragen kann, da es sich in Kanälen oder anderen Kammern, jedoch nicht in der Reaktionskammer befindet. Somit verschlechtert sich die Reaktionseffizienz. It is assumed herein that the reaction mixture displaced by bubbles in the reaction chamber cannot contribute to the amplification, since it is located in channels or other chambers, but not in the reaction chamber. Thus, the reaction efficiency deteriorates.
Die Anzahl der DNA-Strangabschnitte pro Zyklus bei gleichbleibendem Reaktionsvolumen wird wie folgt definiert: ni+i = Pί(1 + h) wobei iij der Anzahl der DNA-Strangabschnitte im Zyklus i entspricht und h der chemischen Reaktionseffizienz zwischen 0 und 1. h wird im einfachsten Fall als 1 angenommen. In einer besonderen Ausführung kann dieser Faktor ebenso durch eine experimentelle Reihe bestimmt werden und so genauer angenähert werden. The number of DNA strand sections per cycle with constant reaction volume is defined as follows: n i + i = Pί (1 + h) where ii j corresponds to the number of DNA strand sections in cycle i and h is the chemical reaction efficiency between 0 and 1. h is assumed to be 1 in the simplest case. In a special embodiment, this factor can also be determined by an experimental series and thus more precisely approximated.
Wird nun das verdrängte Blasenvolumen VB als Quotient zwischen der von der Blase eingenommenen Fläche zur Gesamtfläche der Reaktionskammer als Blasenvolumenquotient angegeben, ergibt sich: ni+i = rii(l + Jj(l — VB i)) If the displaced bubble volume VB is given as the quotient between the area occupied by the bubble and the total area of the reaction chamber as the bubble volume quotient, the result is: n i + i = rii (l + Jj (l - V B i ))
Die tatsächliche Anzahl der neuen DNA-Strangabschnitte liegt damit bei Vorliegen einer Blase unterhalb der angenommenen Anzahl von kopierten DNA- Strangabschnitten. Für jeden Zyklusschritt lässt sich nun eine Reaktionseffizienz berechnen: If a bubble is present, the actual number of new DNA strand sections is thus below the assumed number of copied DNA strand sections. A reaction efficiency can now be calculated for each cycle step:
In Schritt S14 wird die so ermittelte Reaktionseffizienz in dem Zyklus als Skalierungsfaktor genutzt und die qPCR-Kurve mithilfe der korrigierten Intensitätswerte nactuai,i aus den gemessenen Intensitätswerten nCUrve,i aufgebaut: ncurve,i nactual,i ~ n In step S14, the reaction efficiency determined in this way is used in the cycle as a scaling factor and the qPCR curve is constructed using the corrected intensity values n ac tuai, i from the measured intensity values n CU rve, i: ncurve, i nactual, i ~ n
In Schritt S15 wird überprüft, ob das Messverfahren abgebrochen werden soll. Dies kann beispielsweise nach Erreichen eines Abbruchkriteriums, wie z.B. einer vorgegebenen Anzahl von Messzyklen, der Fall sein. Ist dies nicht der Fall (Alternative: Nein), so wird das Verfahren in Schritt S12 fortgesetzt, anderenfalls wird das Verfahren mit Schritt S16 beendet und eine Auswertung der korrigierten qPCR-Kurve vorgenommen. Die Auswertung in Schritt S16 kann durch Klassifikation der korrigierten qPCR- Kurve mithilfe eines vorgegebenen Klassifikationsmodells erfolgen. Dadurch kann das bestimmt werden, ob die korrigierte qPCR-Kurve ein Vorhandensein oder ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt, d. h. angibt, ob der zu detektierenden DNA-Strangabschnitt in der Substanz enthalten ist oder nicht. In step S15 it is checked whether the measuring method should be terminated. This can be the case, for example, after a termination criterion has been reached, such as a predetermined number of measuring cycles. If this is not the case (alternative: no), the method is continued in step S12, otherwise the method is ended with step S16 and the corrected qPCR curve is evaluated. The evaluation in step S16 can be carried out by classifying the corrected qPCR curve with the aid of a predefined classification model. In this way it can be determined whether the corrected qPCR curve indicates the presence or absence of the DNA strand section to be detected, ie indicates whether the DNA strand section to be detected is contained in the substance or not.
In Figur 8 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines weiteren Verfahrens dargestellt, das in der Steuereinheit ausgeführt wird. Das Verfahren kann in einer Datenverarbeitungseinrichtung als Hardware und/oder Software implementiert sein. FIG. 8 shows a flow chart to illustrate a further method that is carried out in the control unit. The method can be implemented in a data processing device as hardware and / or software.
In Schritt S21 wird das qPCR-Verfahren gestartet. The qPCR process is started in step S21.
In Schritt S22 wird der Schritt S1 der Denaturierung in der entsprechenden Denaturierungsreaktionskammer durchgeführt. In step S22, step S1 of denaturation is carried out in the corresponding denaturation reaction chamber.
In Schritt S23 wird am Ende der Denaturierung eine Helligkeit hü des Fluoreszenzlichtes durch die entsprechende Kamera 14 der Denaturierungs- Kammer 11 aufgenommen. In step S23, a brightness h ü of the fluorescent light is recorded by the corresponding camera 14 of the denaturation chamber 11 at the end of the denaturation.
In Schritt S24 wird der Annealing-Prozess des Schritts S2 gestartet. The annealing process of step S2 is started in step S24.
In Schritt S25 wird am Ende des Annealing-Prozesses eine Helligkeit t des Fluoreszenzlichtes durch die entsprechende Kamera 15 der Annealing-KammerIn step S25, at the end of the annealing process, a brightness t of the fluorescent light is determined by the corresponding camera 15 of the annealing chamber
12 aufgenommen. 12 added.
In Schritt S26 wird die Reaktionsflüssigkeit in die Elongations-Kammer 13 geleitet. In step S26, the reaction liquid is fed into the elongation chamber 13.
In Schritt S27 wird zu Beginn des Elongationsprozesses eine Helligkeit IΊE,A des Fluoreszenzlichtes durch die entsprechende Kamera 16 der Elongations-KammerIn step S27, at the beginning of the elongation process, a brightness IΊE , A of the fluorescent light is determined by the corresponding camera 16 of the elongation chamber
13 aufgenommen. 13 added.
In Schritt S28 wird der Elongationsprozess gestartet. In Schritt S29 wird am Ende des Elongationsschrittes eine Helligkeit he e i des Fluoreszenzlichtes durch die entsprechende Kamera 16 der Elongations-Kammer 13 aufgenommen. The elongation process is started in step S28. In step S29, a brightness h eei of the fluorescent light is recorded by the corresponding camera 16 of the elongation chamber 13 at the end of the elongation step.
Theoretisch haben die Werte hd i, ha i, /ie a idieselbe Helligkeit, da keine Amplifikation stattfindet und unterscheiden sich von dem Helligkeitswert he e i nur, wenn zusätzliche Fluoreszenz durch die Amplifikation des Elongationsprozess entsteht. Theoretically, the values h di , h ai , / i eai have the same brightness, since no amplification takes place and only differ from the brightness value h eei if additional fluorescence is produced by the amplification of the elongation process.
Im Folgenden wird in Schritt S30 eine Gesamtreaktionseffizienz berechnet. Subsequently, an overall reaction efficiency is calculated in step S30.
Durch Blasenbildung unterschiedlicher Blasengröße können jedoch die Helligkeiten in den verschiedenen Reaktionskammern 11, 12, 13 variieren. Diese Variation kann als Indikator verwendet werden, ob und in welcher Größe sich Blasen gebildet haben. Durch die Blasenbildung wird die Reaktionsflüssigkeit verdrängt und somit die Effizienz der einzelnen Teilschritte verringert, da die Reaktionsflüssigkeit nicht in ihrer Gesamtheit für die Umwandlung zur Verfügung steht. Somit können Blasenvolumenquotienten q als Quotienten der Helligkeiten zwischen den einzelnen Teilschritten wie folgt ermittelt werden: h d,i+ 1 However, due to the formation of bubbles of different sizes, the brightnesses in the various reaction chambers 11, 12, 13 can vary. This variation can be used as an indicator of whether and to what extent bubbles have formed. The formation of bubbles displaces the reaction liquid and thus reduces the efficiency of the individual sub-steps, since the reaction liquid is not available in its entirety for the conversion. Bubble volume quotients q can thus be determined as quotients of the brightnesses between the individual sub-steps as follows: h d, i + 1
Rd,i+ 1 — h e,e,i Rd, i + 1 - h e, e, i
K a,i K a, i
Ra,i — h, d,i h, e,a,i Ra, i - h, d, i h, e, a, i
Re,i — h a,i h, e,e,i h = h e,a,i Re, i - h a, i h, e, e, i h = h e, a, i
Falls einer der Quotienten q größer als 1 sein sollte, wird er auf 1 festgelegt, da die im vorherigen Schritt nicht bearbeitete Reaktionsflüssigkeit nicht im nächsten Teilschritt weiter prozessiert werden kann. Somit ergibt sich für jeden Teilschritt die Menge an bearbeiteten DNA- Strangabschnitten (nd i für die Zahl der DNA-Strangabschnitte nach der Denaturierung im i-ten Zyklus, na i für die Zahl der DNA-Strangabschnitte nach dem Annealing im i-ten Zyklus, ne i für die Zahl der DNA-Strangabschnitte nach der Elongation im i-ten Zyklus) nd,i — ni ' d,i na,i — ni ' Ra,i ne,i — ni ' Re,i If one of the quotients q should be greater than 1, it is set to 1, since the reaction liquid not processed in the previous step cannot be processed further in the next sub-step. This results in the amount of processed DNA strand segments for each partial step (n di for the number of DNA strand segments after denaturation in the i-th cycle, n ai for the number of DNA strand segments after annealing in the i-th cycle, n ei for the number of DNA strand sections after elongation in the i-th cycle) nd, i - n i ' d, i na, i - n i ' Ra, i ne, i - n i ' Re, i
Die Zahl an DNA-Strangabschnitten, die als zu Anfang des letzten Teilschritts für die Elongation und Fluoreszenzeinbau zur Verfügung steht, entspricht somit ne,a,i — ni ' d,i ' Ra,i ' Re,i The number of DNA strand sections that is available as the beginning of the last sub-step for elongation and fluorescence incorporation thus corresponds to ne, a, i - n i ' d, i ' Ra, i ' Re, i
Unter der Annahme, dass sich denaturierte und elongierte DNA-Strangabschnitte, die nicht amplifiziert werden, wieder zu den ursprünglichen Doppelsträngen zusammenfügen, ergibt sich nach dem PCR-Zyklus, d. h. am Ende der Elongationsphase, als insgesamt in der Reaktionsflüssigkeit vorhandene Menge an DNA-Strangabschnitten ni+i = hί(1 + h · qd i - qa i · qe i) Assuming that denatured and elongated DNA strand sections that are not amplified rejoin to form the original double strands, the total amount of DNA strand sections present in the reaction liquid results after the PCR cycle, ie at the end of the elongation phase n i + i = h ί (1 + h q di - q ai q ei )
Die tatsächliche Anzahl der neuen DNA-Strangabschnitte liegt also im Fall des Vorliegens einer Blase in der Reaktionskammer unterhalb der theoretisch angenommenen Anzahl von DNA-Strangabschnitten. If a bubble is present in the reaction chamber, the actual number of new DNA strand sections is therefore below the theoretically assumed number of DNA strand sections.
Für jeden Zyklusschritt lässt sich nun eine Gesamtreaktionseffizienz berechnen An overall reaction efficiency can now be calculated for each cycle step
Diese Reaktionseffizienz kann wie in dem Ausführungsbeispiel der Figur 6 als Skalierungsfaktor für den gemessenen Intensitätswert am Ende der Elongationsphase genutzt werden. In Schritt S31 wird die so ermittelte Reaktionseffizienz in dem Zyklus als Skalierungsfaktor genutzt und die qPCR-Kurve mithilfe der korrigierten Intensitätswerte nactuai,i aus den gemessenen Intensitätswerten nCUrve,i aufgebaut: ncurve,i nactual,i ~ n As in the exemplary embodiment in FIG. 6, this reaction efficiency can be used as a scaling factor for the measured intensity value at the end of the elongation phase. In step S31, the reaction efficiency determined in this way is used in the cycle as a scaling factor and the qPCR curve is built up from the measured intensity values n CU rve, i with the aid of the corrected intensity values n ac tuai, i: ncurve, i nactual, i ~ n
In Schritt S32 wird überprüft, ob das Messverfahren abgebrochen werden soll. Dies kann beispielsweise nach Erreichen eines Abbruchkriteriums, wie z.B. einer vorgegebenen Anzahl von Messzyklen, der Fall sein. Ist dies nicht der Fall (Alternative: Nein), so wird das Verfahren in Schritt S22 fortgesetzt, anderenfalls wird das Verfahren mit Schritt S33 beendet und eine Auswertung der korrigierten qPCR-Kurve vorgenommen. In step S32 it is checked whether the measuring method should be terminated. This can be the case, for example, after a termination criterion has been reached, such as a specified number of measuring cycles. If this is not the case (alternative: no), the method is continued in step S22, otherwise the method is ended with step S33 and the corrected qPCR curve is evaluated.
Die Auswertung in Schritt S33 kann durch Klassifikation der korrigierten qPCR- Kurve mithilfe eines vorgegebenen Klassifikationsmodells erfolgen. Dadurch kann das bestimmt werden, ob die korrigierte qPCR-Kurve ein Vorhandensein oder ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt, d. h. angibt, ob der zu detektierenden DNA-Strangabschnitt in der Substanz enthalten ist oder nicht. The evaluation in step S33 can be carried out by classifying the corrected qPCR curve with the aid of a predefined classification model. In this way, it can be determined whether the corrected qPCR curve indicates the presence or absence of the DNA strand segment to be detected, i.e. H. indicates whether the DNA strand section to be detected is contained in the substance or not.

Claims

Ansprüche Expectations
1. Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, mit folgenden Schritten: 1. Process for operating a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) process, comprising the following steps:
Zyklisches Ausführen (S12; S22, S24, S26, S28) von qPCR-Zyklen; Messen (S12, S29) der Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten; Cyclical execution (S12; S22, S24, S26, S28) of qPCR cycles; Measuring (S12, S29) the fluorescence for each qPCR cycle in order to obtain a qPCR curve from intensity values;
Bestimmen einer Reaktionseffizienz ( ) für jeden Zyklus;Determining a response efficiency () for each cycle;
Korrigieren (S13, S31) des Intensitätswerts jedes Zyklus abhängig von der für den betreffenden Zyklus bestimmten Reaktionseffizienz ( ), um eine korrigierte qPCR-Kurve (S14, S31) zu erhalten; Correcting (S13, S31) the intensity value of each cycle depending on the reaction efficiency (13) determined for the cycle in question, in order to obtain a corrected qPCR curve (S14, S31);
Betreiben (S16, S33) des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Verlauf der korrigierten qPCR-Kurve. Operating (S16, S33) the qPCR method as a function of the course of the corrected qPCR curve.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das PCR-Verfahren durch Leiten einer Reaktionsflüssigkeit in eine Reaktionskammer (11, 12, 13), insbesondere in jedem Zyklus, durchgeführt wird, wobei die Reaktionseffizienz ( ) abhängig von einer Fläche einer oder mehrerer Blasen in der Reaktionskammer (11 , 12, 13), insbesondere der Reaktionskammer (13) für einen Elongationsprozess des PCR-Prozesses, bestimmt wird. 2. The method according to claim 1, wherein the PCR method is carried out by passing a reaction liquid into a reaction chamber (11, 12, 13), in particular in each cycle, the reaction efficiency () depending on an area of one or more bubbles in the Reaction chamber (11, 12, 13), in particular the reaction chamber (13) for an elongation process of the PCR process, is determined.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein Bild der Reaktionskammer (11, 12, 13) mithilfe einer Kamera (14, 15, 16) aufgenommen wird, wobei die Fläche der einen oder den mehreren Blasen mithilfe von auf das Bild der Reaktionskammer (11, 12, 13) angewendeten Mustererkennungsverfahren bestimmt wird. 3. The method according to claim 2, wherein an image of the reaction chamber (11, 12, 13) is recorded with the aid of a camera (14, 15, 16), the area of the one or more bubbles with the aid of the image of the reaction chamber (11 , 12, 13) applied pattern recognition method is determined.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Reaktionseffizienz ( ) mithilfe der Helligkeit eines oder mehrerer Pixel des Bildes, die der Reaktionsflüssigkeit entsprechen, und des Anteils der Fläche der einen oder mehreren Blasen an der gesamten Fläche der Reaktionskammer (11, 12, 13) bestimmt wird. 4. The method according to claim 3, wherein the reaction efficiency () using the brightness of one or more pixels of the image that correspond to the reaction liquid, and the proportion of the area of the one or more bubbles in the total area of the reaction chamber (11, 12, 13) is determined.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Reaktionseffizienz ( ) abhängig von einer Fläche einer oder mehrerer Blasen in der Reaktionskammer (11, 12, 13) für mindestens zwei der PCR-5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the reaction efficiency () depending on an area of one or more bubbles in the reaction chamber (11, 12, 13) for at least two of the PCR
Teilprozessschritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation bestimmt wird. Sub-process steps of denaturation, annealing and elongation is determined.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mithilfe der korrigierten qPCR-Kurve basierend auf einem Klassifikationsverfahren bestimmt wird, ob ein zu detektierenden DNA-Strangabschnitt vorhanden ist oder nicht. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the corrected qPCR curve is used to determine, based on a classification method, whether or not a DNA strand section to be detected is present.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das qPCR-Verfahren betrieben wird, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt wird. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the qPCR method is operated in that when the presence of the DNA strand section to be detected is detected, it is signaled that a ct value can be determined, the ct value from the parameterized presence function is determined.
8. Vorrichtung zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, wobei die Vorrichtung ausgebildet ist, folgende Schritte auszuführen: 8. Apparatus for operating a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method, the apparatus being designed to carry out the following steps:
Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen; Cyclical execution of qPCR cycles;
Messen der Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten; Measuring the fluorescence at each qPCR cycle to obtain a qPCR curve from intensity values;
Bestimmen einer Reaktionseffizienz ( ) für jeden Zyklus;Determining a response efficiency () for each cycle;
Korrigieren des Intensitätswerts jedes Zyklus abhängig von der für den betreffenden Zyklus bestimmten Reaktionseffizienz ( ), um eine korrigierte qPCR-Kurve zu erhalten; Correcting the intensity value of each cycle as a function of the reaction efficiency () determined for that cycle in order to obtain a corrected qPCR curve;
Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Verlauf der korrigierten qPCR-Kurve. Operation of the qPCR process depending on the course of the corrected qPCR curve.
9. Computerprogramm, welches dazu eingerichtet ist, alle Schritte eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 auszuführen. 9. A computer program which is set up to carry out all the steps of a method according to any one of claims 1 to 7.
10. Elektronisches Speichermedium, auf welchem ein Computerprogramm nach Anspruch 9 gespeichert ist. 10. Electronic storage medium on which a computer program according to claim 9 is stored.
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