EP4100867A1 - Procédé de détection de microorganismes dans un échantillon - Google Patents

Procédé de détection de microorganismes dans un échantillon

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Publication number
EP4100867A1
EP4100867A1 EP21701817.5A EP21701817A EP4100867A1 EP 4100867 A1 EP4100867 A1 EP 4100867A1 EP 21701817 A EP21701817 A EP 21701817A EP 4100867 A1 EP4100867 A1 EP 4100867A1
Authority
EP
European Patent Office
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image
sample
instant
interest
comparison
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21701817.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Caroline Paulus
Thomas Bordy
Olivier CIONI
Camille DEFORCEVILLE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP4100867A1 publication Critical patent/EP4100867A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/698—Matching; Classification
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V10/00—Arrangements for image or video recognition or understanding
    • G06V10/20—Image preprocessing
    • G06V10/25—Determination of region of interest [ROI] or a volume of interest [VOI]
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V10/00—Arrangements for image or video recognition or understanding
    • G06V10/20—Image preprocessing
    • G06V10/26—Segmentation of patterns in the image field; Cutting or merging of image elements to establish the pattern region, e.g. clustering-based techniques; Detection of occlusion
    • G06V10/267—Segmentation of patterns in the image field; Cutting or merging of image elements to establish the pattern region, e.g. clustering-based techniques; Detection of occlusion by performing operations on regions, e.g. growing, shrinking or watersheds
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V10/00—Arrangements for image or video recognition or understanding
    • G06V10/70—Arrangements for image or video recognition or understanding using pattern recognition or machine learning
    • G06V10/82—Arrangements for image or video recognition or understanding using pattern recognition or machine learning using neural networks

Definitions

  • the technical field of the invention is the characterization of microorganisms, in particular the characterization of yeasts or bacteria.
  • microorganisms such as yeasts or bacteria, or their derivatives
  • yeasts are widespread in various sectors, such as bakery, wine production, brewing or even the manufacture of dairy products.
  • the application of yeasts or bacteria concerns many foods by means of probiotics, the latter being for example added to cereals or to animal feed.
  • many industrial fields can use microorganisms. This is for example agriculture or horticulture, with the development of phytosanitary products or fertilizers more respectful of the environment, or the production of biofuels obtained from plants.
  • Other applications relate to the field of pharmacy, medical diagnostics.
  • the step of characterizing such microorganisms constitutes an essential link in the production chain.
  • Microbiological controls are frequently used, on samples taken from culture media, in order to detect and enumerate living microorganisms. Cultivation on Petri dishes is still widely used, but has certain drawbacks, in particular the preparation, the duration of the analysis and the impossibility of detecting living and non-cultivable microorganisms.
  • Document WO2018 / 215337 describes a device and a method making it possible to carry out a classification between living, dead or living but non-cultivable yeasts.
  • Document EP3462381 describes a device and a method for detecting microorganisms in a food sample. The inventors propose an alternative method, so as to carry out an enumeration of living microorganisms, and developing, in a sample.
  • a first object of the invention is a method for characterizing a sample, comprising microorganisms preferably placed in contact with a medium suitable for their development, the method comprising the following steps: a) illumination of the sample by a light source ; b) using an image sensor, obtaining images of the sample, each image representing the sample at a measurement instant; c) comparison of an image of the sample, at a measurement instant, with a reference image, representing the sample at a reference instant, so as to establish a comparison image, the comparison image being representative a variation of the sample between the measurement instant and the reference instant, the reference instant being chosen from among the measurement instants; d) repeating step c) for different measurement instants, so as to obtain different comparison images, each comparison image possibly being associated with a measurement instant; e) from the comparison images, defining at least one region of interest, each region of interest corresponding to a part of at least one comparison image in which a variation of the sample is detected; f) on several images of the sample, resulting from step b
  • Step f) can include forming as many stacks of thumbnails as there are distinct regions of interest defined during step e). During step f), each stack of thumbnails is associated with a region of interest.
  • thumbnailnail is understood to mean an image portion, of size smaller than the size of the image.
  • Each image has pixels.
  • Each thumbnail can have a number of pixels at least 10 times or at least 100 times less than the number of pixels in the image.
  • the supervised artificial intelligence algorithm can be a neural network.
  • the neural network can be a convolutional neural network.
  • step e) comprises:
  • the variation image can thus be formed by a combination of comparison images.
  • Each pixel of the variation image is established from the value, at said pixel, of a comparison image.
  • Step e) can include a determination of coordinates of interest, in the variation image, each coordinate of interest potentially corresponding to a microorganism. Each region of interest is then defined around each coordinate of interest. The shape and size of each region of interest are preferably predetermined.
  • the process may comprise, following sub-step e-ii):
  • step e-iii) comprises a definition of at least one region of interest around each coordinate of interest determined during sub-step e-ii).
  • each thumbnail comprises a single region of interest defined during step e).
  • the sample can be placed between the light source and the image sensor.
  • no image formation optics are arranged between the sample and the image sensor.
  • an optical system extends between the sample and the image sensor, the optical system defining an object plane and an image plane, the method being such that:
  • the image sensor defines a detection plane, the detection plane being offset with respect to the image plane; - and / or the sample defines a sample plane, the sample plane being offset from the object plane.
  • step b) comprises, at each measurement instant:
  • the image of the sample can for example be obtained from the modulus and / or the phase and / or the real part and / or the imaginary part of the complex image obtained during sub-step b -ii).
  • the reconstruction plane is a plane along which the sample extends.
  • the reconstruction plane is parallel to a detection plane along which the image sensor extends.
  • the method may comprise, following step h), a step i) of counting regions of interest considered as comprising microorganisms developing in the sample.
  • the method may include training of the supervised artificial intelligence algorithm, the training being carried out using calibration samples comprising developing microorganisms whose location is known.
  • the measurement instants are between an initial instant and a final instant.
  • the reference instant can correspond to the initial instant or to the final instant.
  • the reference instant is an instant before or after each instant of measurement. It may for example be the instant immediately preceding or the instant immediately subsequent to each instant of measurement.
  • a second object of the invention is a device for characterizing a sample, the sample comprising microorganisms, the device comprising:
  • the device may include characteristics described in connection with the first subject of the invention.
  • FIG. 1 is an example of a device allowing an implementation of the invention.
  • FIG. 2 shows schematically the main steps of a method implemented by the invention.
  • FIGS. 3A to 3L are images of a sample obtained at different successive instants, forming a series of images. These are images obtained by using a device as shown in FIG. 1.
  • FIG. 4A shows an example of a region of interest comprising microorganisms growing in the sample.
  • FIG. 4B shows intensity profiles of several images of the same series of images of the sample, in the region of interest shown in FIG. 4A.
  • FIG. 4C shows intensity profiles of several comparison images, resulting from image comparisons of the series of images described in connection with FIG. 4B.
  • FIG. 4D shows a horizontal profile of a variation image established for the series of images described in connection with FIG. 4B.
  • each profile is determined along a dotted line drawn in Figure 4A.
  • Fig. 5A is a variation image corresponding to the series of images shown in Figs. 3A to 3L.
  • Figure 5B is the variation image shown in Figure 5A after detection of regions of interest.
  • Figure 6 is a region of interest defined from image 5B.
  • FIGS. 7A to 7H are thumbnails extracted from the images of the same series of images, each thumbnail corresponding to the region of interest shown in FIG. 6.
  • FIGS. 8A to 8C are examples of stacks of thumbnails forming the input data of an algorithm of the convolutional neural network type.
  • FIG. 9 is a diagram of an architecture of a convolutional neural network.
  • Figures 10A to 10F show a stack of vignettes representative of the development of microorganisms.
  • Figures 10G to 10L show a stack of thumbnails representative of a movement in the sample.
  • FIG. 11 is a graph showing the evolution of the performance of the method as a function of the temporal extent of the series of images.
  • FIGS. 12A to 12C are a comparison of detection of microorganisms respectively according to a reference method, according to a method based on an analysis of the morphology of the variation image, and according to a method according to the invention.
  • FIGS. 12D to 12F are a comparison of detection of microorganisms respectively according to a reference method, according to a method based on an analysis of the morphology of the variation image, and according to a method according to the invention.
  • FIGS. 12G to 121 are a comparison of detection of microorganisms respectively according to a reference method, according to a method based on an analysis of the morphology of the variation image, and according to a method according to the invention.
  • FIG. 13A is a graph showing, for different samples, a number of microorganisms enumerated respectively with a method based on an analysis of the morphology of the variation image (y-axis) and a reference method (x-axis).
  • FIG. 13B is a graph showing, for different samples, a number of microorganisms enumerated respectively with a method according to the invention (y-axis) and a reference method (x-axis).
  • FIG. 14 is another example of a device allowing an implementation of the invention.
  • FIG. 1 represents an example of a device according to the invention.
  • a light source 11 is able to emit a light wave 12, called an incident light wave, propagating in the direction of a sample 10, along a propagation axis Z.
  • the light wave is emitted according to a spectral illumination band Dl .
  • Sample 10 is a sample that it is desired to characterize. It comprises in particular 10 fc microorganisms. Sample 10 may contain nutrients allowing the development of microorganisms.
  • the sample 10 may for example comprise ground food, the latter being intended for food, for example for animal nutrition. It is for example fat, meat, and vegetable fibers, in particular in the form of flour.
  • the mixture can also include food supplements, for example vitamins.
  • the mixture also contains microorganisms, in particular bacteria or yeasts, used as a food supplement, in the form of probiotics.
  • An objective of the invention is to evaluate a quantity of microorganisms developing in the sample.
  • the term quantity refers to a number or a concentration.
  • microorganism is meant in particular a yeast, a bacterium, a spore, a fungus or a cell, whether it is a eukaryotic or prokaryotic cell, or a microalgae.
  • Sample 10 can be solid. It can for example take the form of a powder, obtained by grinding food containing microorganisms.
  • the sample can comprise culture medium, suitable for the development of microorganisms. It may be a culture medium which is liquid or takes the form of an agar.
  • the sample 10 is, in this example, contained in a chamber 15.
  • the chamber 15 may have a thickness e, along the axis of propagation, typically varying between 10 ⁇ m and 5 mm, and is preferably between 20 ⁇ m and 500 pm.
  • the sample is maintained on a support 10s at a distance d from an image sensor 16.
  • the concentration of microorganisms can vary between 500 per microliter and 5000 per microliter.
  • the distance D between the light source 11 and the chamber 15 is preferably greater than 1 cm. It is preferably between 2 and 30 cm.
  • the light source, seen by the sample is considered to be point. This means that its diameter (or its diagonal) is preferably less than a tenth, better still a hundredth of the distance between the fluidic chamber 15 and the light source.
  • the light source is a light emitting diode. It is generally associated with diaphragm 18, or spatial filter.
  • the aperture of the diaphragm is typically between 5 ⁇ m and 1 mm, preferably between 50 ⁇ m and 500 ⁇ m. In this example, the diaphragm is supplied by Thorlabs under the reference P150S and its diameter is 150 ⁇ m.
  • the diaphragm can be replaced by an optical fiber, a first end of which is placed facing the light source 11 and a second end of which is placed opposite the sample 10.
  • the device shown in FIG. 1 also comprises a diffuser 17. , arranged between the light source 11 and the diaphragm 18.
  • the function of such a diffuser is to distribute the light beam produced by an elementary light source 11 according to a cone of angle a.
  • the scattering angle a varies between 10 ° and 80 °.
  • the source light can be a laser source, such as a laser diode. In this case, it is not useful to associate a spatial filter or a diffuser with it.
  • the emission spectral band D1 of the incident light wave 12 has a width of less than 100 nm.
  • spectral bandwidth is meant a width at mid-height of said spectral band.
  • the sample 10 is placed between the light source 11 and the image sensor 16 previously mentioned.
  • the latter preferably extends parallel, or substantially parallel to the plane P 10 along which the sample extends.
  • substantially parallel means that the two elements may not be strictly parallel, an angular tolerance of a few degrees, less than 20 ° or 10 ° being allowed.
  • the sample extends along an XY plane, perpendicular to the axis of propagation Z.
  • the image sensor 16 is able to form an image I 0 of the sample 10 according to a detection plane P 0 .
  • a detection plane P 0 is an image sensor comprising a matrix of pixels, of the CCD type or a CMOS.
  • the detection plane P 0 preferably extends perpendicularly to the axis of propagation Z of the incident light wave 12.
  • the distance d between the sample 10 and the matrix of pixels of the image sensor 16 is preferably between 50 ⁇ m and 2 cm, preferably between 100 ⁇ m and 2 mm.
  • the microorganisms 10 fe present in the sample can generate a diffracted wave 13, capable of producing, at the level of the detection plane P 0 , interference, in particular with a part of the incident light wave 12 'transmitted by the sample. Furthermore, the sample can absorb part of the incident light wave 12.
  • the light wave 14, transmitted by the sample, and to which the image sensor 16 is exposed designated by the term "wave exposure ", may include: a component 13 resulting from the diffraction of the incident light wave 12 by the microorganisms present in the sample; a component 12 'resulting from the transmission of the incident light wave 12 by the sample, part of the latter being able to be absorbed in the sample.
  • These components form interferences in the detection plane.
  • the image acquired by the image sensor includes interference figures (or diffraction figures). This image forms a hologram, which is a signature of the content of the sample, and of its evolution over time.
  • the processor is a microprocessor connected to a programmable memory 22 in which is stored a sequence of instructions for perform the image processing and calculation operations described in this description.
  • the processor can be coupled to a screen 24 allowing the display of images acquired by the image sensor 16 or calculated by the processor 20.
  • the inventors are based on the fact that under the effect of the development of microorganisms in the sample, forming colonies, the hologram formed on the image sensor changes. This evolution can be interpreted with the naked eye or by means of simple image processing algorithms when the sample is not very dense. However, when the number of microorganisms is high, the interpretation of the images is more difficult and can lead to errors in the counting of the microorganisms or in their location.
  • the inventors have designed a method for detecting and counting microorganisms developing in a sample. By develop is meant to multiply, so as to form clusters or colonies. The method is based on the observation of the development of these clusters or of these colonies over time.
  • Step 100 Arrangement of the sample on the support.
  • the sample is placed on the support 10s, in the field of observation of the image sensor. It is then illuminated by the light source 11.
  • Step 110 Obtain a series of images of the sample
  • images I oi are acquired successively at different measurement instants t j , extending over an acquisition time range.
  • the index i is a strictly positive integer designating the rank of each image in the series of images.
  • the acquisition time range can be between 1 h and 20 h, or even more.
  • the images I i can be acquired according to a determined acquisition frequency, for example every hour.
  • An image I oi acquired by the image sensor 16, also called a hologram, does not make it possible to obtain a sufficiently precise representation of the observed sample. This is due to the lack of magnification optics between the sample and the image sensor.
  • a holographic propagation operator h can be applied to each image I oi acquired by the image sensor, so as to calculate a quantity representative of the exposure light wave 14. It is then possible to reconstruct a complex expression of the light wave 14 at any coordinate point (x, y, z) in space, and in particular in a reconstruction plane P z located at a distance
  • Ai (x, y, z) / 0, i (x, y, z) * h * denoting the operator product of convolution.
  • the function of the propagation operator ha is to describe the propagation of light between the image sensor 16 and a point of coordinates (x, y, z), located at a distance ⁇ z ⁇ from the image sensor. It is then possible to determine the modulus j (x, y, z) and / or the phase f ⁇ c, g, z ) the light wave 14, at a point in the coordinate space (x, y, z ), with :
  • ⁇ Pi (x, y, z) arg [Ai (x, y, z) ⁇ .
  • the coordinates (x, y) denote a radial position in a radial plane XY perpendicular to the axis of propagation Z.
  • the coordinate z denotes a coordinate along the axis of propagation Z.
  • the complex expression A t is a complex quantity whose argument and modulus are respectively representative of the phase and intensity of the exposure light wave 14 detected by the image sensor 16 at the measurement instant t j .
  • the product of convolution of the image I oi by the propagation operator h makes it possible to obtain a complex image Ai representing a spatial distribution of the complex expression of A (x, y, z) in the reconstruction plane considered.
  • the latter is the plane P 10 along which the sample extends.
  • the set of images l t successively obtained forms a series of images of the sample, each image obtained being representative of the sample at a measurement instant t.
  • Each image l is associated with a measurement instant t, which corresponds to the acquisition instant of the image / 0 (.
  • Each image l represents the sample at the instant t j .
  • Obtaining a complex image can be accompanied by significant reconstruction noise, usually designated by the term “twin image”. Iterative algorithms have been described, making it possible to obtain, by holographic reconstruction, a complex image A t while minimizing the reconstruction noise.
  • Such holographic reconstruction algorithms are for example described in document WO2017162985 (steps 100 to 170, shown diagrammatically in FIG. 2A of WO2017162985) or in document WO2016189257 (steps 100 to 500, diagrammatically in FIG. 4 of WO2016189257).
  • FIGS. 3A to 3L represent images / d obtained by a device such as represented in FIG. 1, during an acquisition time period of 11 hours, from an initial instant t t (FIG. 3A). These images were obtained by holographic reconstruction from I oi images acquired every hour. Each acquired image I oi has undergone a holographic reconstruction, as described in WO2017162985, so as to obtain a reconstructed complex image A it in the plane of the sample. Images / j were thus obtained, respectively representative of the sample at each measurement instant t it by determining the modulus of the complex image.
  • the sample comprises granules of animal nutrition, crushed, comprising Saccharomyces cerevisiae yeasts in a culture medium of YPD (Yeast Peptone Dextrose) type.
  • the experimental parameters were as follows: light source: RGB dial LED Created MC-E Color; image sensor: UI-1492LE-M IDS monochrome CMOS sensor - 3840 x 2748 pixels; distance image sensor - sample: 1 mm; distance light source - sample: 5 cm.
  • the microorganisms take the form of spots which gradually darken.
  • the development of microorganisms is reflected, in the images of the series of images, in a progressive darkening.
  • FIGS. 3A to 3L there is materialized, by a black frame, a region of interest of the image corresponding to the same colony of microorganisms. It is observed that the colony darkens under the effect of the multiplication of microorganisms. Darkening is attributed to increasing scattering and attenuation of light by microorganisms. This feature is used in step 140.
  • Step 120 comparison of images.
  • the objective of this step is to establish comparison images, each comparison image corresponding to a comparison between two images of the series of images of the sample.
  • the comparison can take the form of a subtraction or a ratio.
  • a comparison image I CO mp, i is calculated.
  • Each comparison image is associated with an instant of measurement t j .
  • Each comparison image I comP i represents a variation of the sample between the reference instant t re ⁇ i and the measurement instant t j .
  • the comparison takes the form of a subtraction.
  • the comparison can take the form of a ratio
  • Step 130 Forming a variation image From each comparison image I CO mp, i> determining a variation var I picture, the latter being representative of a sample variation range during the time of acquisition.
  • Each image of the sample is defined according to pixels of coordinates (x, y), in the detection plane formed by the image sensor. The same applies to each comparison image homp.i
  • an image of variation I var is calculated.
  • the value of the variation image I var (x, y) at each pixel (x, y) corresponds to the value of the comparison image I CO mp, i (X y) reflecting maximum darkening among the different images comparison.
  • one selects, for each pixel (x, y), the comparison image I comP i whose value I comP i (x, y), for the pixel considered, translates a maximum difference of two images and the / re /,; under the effect of the development of microorganisms.
  • the reference image / re, i is associated with a reference instant t re ⁇ i prior to the measurement instant t j associated with the image I u and the image reference is subtracted from each image in sample / j , which corresponds to expressions (1) and (2), for each pixel (x, y):
  • the reference image / re / represents the sample at a reference instant t re fi after the instant of measurement of the image / j , and that the reference image is subtracted from each image / j , for each pixel (x, y), the development of microorganisms leads to a brightening of the reference image.
  • the reference image / re / represents the sample at a reference instant t re fi after the instant of measurement of the image / j , and that the reference image is subtracted from each image / j , for each pixel (x, y)
  • the variation image is established by using, for each pixel (x, y), the comparison image whose value corresponds to an extremum, for the pixel, among the set of comparison images / comp j .
  • the extremum reflects an increase in diffusion under the effect of the development of microorganisms.
  • the comparison image I CO mp, i is calculated, the extremum is either a maximum or a minimum.
  • the variation image I var can therefore be formed from different comparison images I comP i .
  • the reference image / re / is the initial image I t of the series of images.
  • the variation image is such that:
  • variation image is defined for the whole of the series of images resulting from step 110.
  • Figure 4A shows a region of interest of one of the images shown in Figures 3A-3L, centered on growing microorganisms.
  • region of interest is meant a part of an image of the sample comprising a microorganism or a colony of microorganisms.
  • Intensity profiles were performed on the same region of interest, considering different images successively obtained, along the line shown in dotted lines in FIG. 4A.
  • the profiles correspond to images obtained respectively 0 hour (see figure 3A - reference), 3 hours (see figure 3D - - reference / 4 ), 7 hours (see figure 3H - reference I 8 ) and 9 hours (see FIG. 3J - - reference I 10 ) after the initial instant t t .
  • the initial instant corresponds to FIG. 3A.
  • the profiles are shown in Figure 4B. It is observed that the presence of each microorganism results in lower gray levels.
  • Comparison images were formed by subtracting the initial image ( Figure 3A) so as to establish comparison images I CO mp, i, hompA > I comp, 8 > homp, io > as defined according to the expression ( 1).
  • the profiles of each comparison image are shown in Figure 4C.
  • the profile of the comparison image I CO mp, i is equal to 0.
  • an image of variation l var according to expression (5) has been formed.
  • the profile of the variation image I var is shown in FIG. 4D.
  • the variation image l var is essentially formed from the values of the pixels of the comparison images I CO mp, 8 and
  • FIG. 5A shows the image of variation I var described in the previous paragraph. Dark traces are observed, some of which correspond to colonies of developing microorganisms.
  • the objective of the following steps is to determine, from the traces detected on the image of variation I var , those which correspond to a developing microorganism.
  • Step 140 Determination and localization of regions of interest from the variation image
  • the objective of this step is to detect regions of interest containing respectively at least one trace detected on the variation image.
  • step 140 comprises a binarization of the variation image I var , on the basis of a predetermined threshold.
  • Figure 5B shows the binarized l var variation image.
  • each dark spot of the variation image likely to correspond to a microorganism or a colony of microorganisms, appears in the form of a light trace, the coordinates of which can be determined, for example the coordinates of the centroid .
  • coordinates of interest x 7 , y ;
  • Each coordinate of interest can correspond to a microorganism (or to a colony of microorganisms), or to a displacement of a particle in the sample 10.
  • each region of interest ROI j Around each coordinate of interest (x ; -, y), we define a region of interest ROI j .
  • the size of each region of interest is preferably predefined.
  • each region of interest is a square with sides 65 pixels.
  • the definition of the dimensions of the regions of interest ROI j can be carried out beforehand, for example on the basis of experimental tests.
  • Each region of interest can be defined so that its center corresponds respectively to each coordinate of interest (x, y ; ).
  • FIG. 6 represents an example of a region of interest defined around a coordinate of interest, the latter being the centroid of a white trace of the variation image after binarization, the trace being surrounded by a dotted circle on Figure 5B.
  • Step 150 Extraction of thumbnails.
  • a vignette V j is defined from each image of the sample / j , resulting from step 110.
  • Each vignette V t corresponds respectively to a part of the image I l in each region d 'ROI j interest defined during step 140.
  • a stack of vignettes V is obtained, each vignette corresponding to an extraction of region d 'ROI j interest in the sample image / d .
  • the vignettes Vi formed from different images I u in the same region of interest ROI j , form a stack of vignettes V j .
  • FIGS. 7A to 7H are examples of vignettes V tj associated with the same region of interest ROI j respectively extracted from different images. There is a variation in the appearance of the thumbnails between Figure 7A and Figure 7H. Thus, each stack of vignettes V j . is representative of a local variation of the sample, in the same region of interest ROI j .
  • Step 160 Classification of each stack of vignettes V j .
  • each stack of vignettes is used as input data IN of a convolutional neural network CNN, whose output layer OUT makes it possible to determine whether the stack of vignettes corresponds to the development of a microorganism. or not.
  • Figures 8A, 8B and 8C are examples of thumbnail stacks.
  • FIG. 9 schematically shows an example of different layers of a convolutional neural network.
  • a convolutional neural network is known to those skilled in the art. It is for example described in Karpathy "Large-scale video classification with convolutional neural networks", 2014 IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition.
  • the convolutional neural network comprises: an input layer IN: this layer is formed by a stack of vignettes V j ; several convolutional layers CONVi ... CONV k .
  • Each convolution layer compotes a first level, formed of images obtained by convolution of at least one image of the previous layer by a filter. In this example, the size of the filter is 3 x 3.
  • the parameters of each filter are established during a learning phase described below.
  • the images forming the first level are then subjected to transformations, which may include:
  • ⁇ “pooling”, this involves replacing the values of a group of pixels by a single value, for example the average, or the maximum value, or the minimum value of the group considered.
  • a “max pooling” is applied, which corresponds to replacing the values of groups of pixels from 2 by 2 by the maximum value in the group; a linear rectification, usually designated "RELU", making it possible in particular to remove certain values from the images of the first level. For example, negative values can be removed by replacing them with the value 0.
  • each component of the vector VECT is a characteristic (or “feature”) of the stack of vignettes V j forming the input IN of the network.
  • the VECT vector is used as the input vector of an NN neural network of the “fully connected” type, a term commonly used by those skilled in the art.
  • Each of the components of the VECT vector forms a node feeding the neural network NN.
  • the neural network NN comprises an output layer OUT directly connected to the vector VECT.
  • the output layer has y n nodes. Each node corresponds to a class.
  • a value of each node of the output layer is determined by applying an activation function to a linear combination of the values of the nodes of the input layer.
  • the output layer OUT comprises two classes: the stack of labels corresponds to a developing microorganism; the stack of stickers does not correspond to a developing microorganism.
  • each node y n is such that: where x m is the value of each node of the previous layer (terms of the vector VECT); b m is a bias associated with each node of the preceding layer x m f n is an activation function associated with the node of rank n of the layer considered; w mn is a weighting term for the node of rank m of the preceding layer and the node of rank n of the layer considered.
  • each activation function f n is determined by those skilled in the art. It may for example be an activation function f n is a function of hyperbolic or sigmoid tangent type.
  • the OUT layer comprises values making it possible to confirm or deny that the presence of microorganisms developing in the region of interest ROI j associated with the stack of vignettes V j .
  • the network may include a final END layer, usually designated by the term “Softmax”, comprising as many components as there are classes, each component representing a probability of belonging to each class.
  • Step 170 counting
  • step 160 the microorganisms developing in the sample are counted, the latter being confirmed during step 160.
  • the convolutional neural network has previously been the subject of training (step 90), so as to determine the parameters of the convolutional filters as well as the parameters linked to each node, that is to say the terms x m , b m , f n and w mn defined in connection with expression (7).
  • the training is carried out using series of images of known samples.
  • the inventors trained using 7000 thumbnail stacks of known class. 80% of the images were used to perform the actual training, while the remaining 20% were used to validate the algorithm.
  • FIGS. 10A to 10F correspond to a stack of labels corresponding to the development of a microorganism.
  • FIGS. 10G to 10L correspond to a stack of labels corresponding to movement in the sample, in a part of the sample not comprising a microorganism.
  • the use of a supervised artificial intelligence algorithm makes it possible to discriminate, among the local variations detected by analyzing the variation image, those which actually correspond to the growth of microorganisms and those which correspond only to a movement effect and not to the development of microorganisms.
  • FIG. 11 represents an evolution of the precision of the result supplied by the convolutional neural network (ordinate axis), as a function of the time period during which images are acquired (abscissa axis - unit: hour).
  • the precision of the result is 87.8%, that is, 87.8% of the results are correct.
  • the time period is 12 hours, the accuracy reaches 98%. Precision is the rate of correctly classified thumbnail stacks.
  • the samples contained Saccharomyces cerevisiae yeasts distributed in a food matrix such as animal feed pellets. The values resulting from the application of the method described above were then compared with the reference values.
  • step 130 an algorithm based on the formation of a variation image, as described in step 130, was also used.
  • the counting of the developing microorganisms is then carried out by filtering and morphological processing operations. of the variation image: Gaussian filtering - Otsu filtering (known to those skilled in the art) - morphological processing (dilation / erosion) - cleaning of regions of interest considered to be aberrant.
  • Gaussian filtering - Otsu filtering known to those skilled in the art
  • morphological processing diilation / erosion
  • FIGS. 12A, 12B and 12C correspond respectively to the application, on a sample, of the manual selection (reference method), of the algorithm based on a morphological analysis, and of the method described in connection with steps 100 to 170. It can be seen that the latter (FIG. 12C) is consistent with the reference method (FIG. 12A). In each image, the microorganisms detected are represented by a white point.
  • Figures 12D, 12E and 12F correspond respectively to the application, on another part of the sample, of manual selection (reference method), of the algorithm based on a morphological analysis and of the method described in connection with the steps 100 to 170. It can be seen that the latter (FIG. 12F) is more consistent with the reference method (FIG. 12D).
  • FIGS. 12G, 12H and 121 correspond respectively to the application, to another part of the sample, of manual selection (reference method), of the algorithm based on a morphological analysis and of the method described in connection with the steps 100 to 170. It can be seen that the latter (FIG. 121) is consistent with the reference method (FIG. 12G).
  • the inventors carried out counts on 104 different samples. These samples included Saccharomyces cerevisiae yeasts arranged in three different media, each medium comprising animal nutrition granules.
  • Baseline counts were determined by scanning the sample under a microscope. The reference counts were compared with the morphological analysis algorithm and the algorithm according to steps 100 to 170 previously described. Each algorithm was implemented using 11 images acquired during a time period of 10 hours, with an acquisition rate of 1 image per hour.
  • FIG. 13A shows, for each sample, the reference count (x-axis) and the count performed with the morphological analysis algorithm (y-axis).
  • the average of the absolute differences between the reference values and the values given by the morphological analysis algorithm is equal to 12.9%.
  • FIG. 13B shows, for each sample, the reference count (x-axis) as a function of the count performed with the algorithm implementing the convolutional neural network (y-axis).
  • the average of the absolute differences between the reference values and the values given by the algorithm based on neural networks is equal to 9.9%.
  • each type of food matrix is respectively identified by a triangle, round or square type symbol.
  • an image formation optic is disposed between the sample and the image sensor.
  • the device comprises an optical system 19, defining an object plane P 0 b j and an image plane Pi m .
  • the image sensor 16 is then arranged in a so-called defocused configuration, according to which the sample extends along a plane offset from the object plane, and / or the image sensor extends along a plane offset from the object plane. at the image level.
  • defocused configuration is meant a configuration comprising an offset of the sample and / or of the image sensor with respect to a focusing configuration, according to which the detection plane Po is combined with a plane Pio along which s 'expands the sample.
  • the offset d is preferably less than 500 ⁇ m, or even less than 200 ⁇ m. It is preferably greater than 10 ⁇ m or 20 ⁇ m.
  • the object plane P 0 b j coincides with a plane Pio along which the sample extends and the image plane Pi m is offset with respect to the detection plane Po according to an offset d .
  • the method described in connection with steps 100 to 170 is applicable to images acquired according to such a configuration.
  • a lensless imaging configuration is preferred, due to the larger field of view that it provides.
  • the detection plane coincides with the image plane and the sample plane coincides with the object plane. Each image is thus acquired according to a focused configuration.
  • the invention can be implemented, without limitation, in the field of food processing, or in the control of industrial processes, in the control of the environment, or in the field of microbiology or clinical diagnosis. in biology, or in environmental control, or in the field of food processing or industrial process control.

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Abstract

Procédé de caractérisation d'un échantillon, comportant des microorganismes, le procédé comportant une obtention d'images de l'échantillon en différents instants de mesure. A partir des images obtenues on forme des images de comparaison, chaque image de comparaison correspondant à une comparaison d'une image obtenue à un instant de mesure et une image obtenue à un instant de référence. A partir des images de comparaison, on détermine des régions d'intérêt dans chaque image de l'échantillon. Le procédé comporte une extraction d'une même région d'interêt dans plusieurs images, pour former des vignettes. Les vignettes correspondant à une même région d'intérêt sont utilisées en tant que données d'entrée d'un algorithme d'intelligence artificielle supervisé, de façon à déterminer la présence de microorganismes se développant.

Description

Description
Titre : Procédé de détection de microorganismes dans un échantillon
DOMAINE TECHNIQUE Le domaine technique de l'invention est la caractérisation de microorganismes, notamment la caractérisation de levures ou de bactéries.
ART ANTERIEUR
L'utilisation de microorganismes tels des levures ou des bactéries, ou leurs dérivés, trouve de nombreuses applications dans de nombreux domaines. Dans le domaine de l'agroalimentaire, par exemple, l'utilisation de levures est répandue dans différents secteurs, tels la boulangerie, la production de vin, la brasserie ou encore la fabrication de produits laitiers. L'application de levures ou de bactéries concerne de nombreux aliments par le biais de probiotiques, ces derniers étant par exemple ajoutés à des céréales ou à des aliments pour animaux. En dehors de l'agroalimentaire, de nombreux domaines industriels peuvent mettre en oeuvre des microorganismes. Il s'agit par exemple de l'agriculture ou de l'horticulture, avec le développement de produits phytosanitaires ou de fertilisants plus respectueux de l'environnement, ou encore de la production de biocombustibles obtenus à partir de végétaux. D'autres applications concernent le domaine de la pharmacie, du diagnostic médical A des fins de contrôle qualité, l'étape de caractérisation de tels microorganismes constitue un maillon essentiel de la chaîne de production. Des contrôles microbiologiques sont fréquemment utilisés, sur des échantillons prélevés dans des milieux de culture, de façon à détecter et dénombrer les microorganismes vivants. La mise en culture sur des boîtes de Pétri est toujours très utilisée, mais comporte certains inconvénients, en particulier la préparation, la durée de l'analyse et l'impossibilité de détecter des microorganismes vivants et non cultivables.
Le document WO2018/215337 décrit un dispositif et un procédé permettant d'effectuer une classification entre les levures vivantes, mortes ou vivantes mais non cultivables. Le document EP3462381 décrit un dispositif et un procédé permettant de détecter des microorganismes dans un échantillon alimentaire. Les inventeurs proposent une méthode alternative, de façon à effectuer un dénombrement de microorganismes vivants, et se développant, dans un échantillon. EXPOSE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est un procédé de caractérisation d'un échantillon, comportant des microorganismes disposés de préférence au contact d'un milieu propice à leur développement, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon par une source de lumière ; b) à l'aide d'un capteur d'image, obtention d'images de l'échantillon, chaque image représentant l'échantillon à un instant de mesure ; c) comparaison d'une image de l'échantillon, à un instant de mesure, avec une image de référence, représentant l'échantillon à un instant de référence, de façon à établir une image de comparaison, l'image de comparaison étant représentative d'une variation de l'échantillon entre l'instant de mesure et l'instant de référence, l'instant de référence étant choisi parmi les instants de mesure; d) répétition de l'étape c) pour différents instants de mesure, de façon à obtenir différentes images de comparaison, chaque image de comparaison pouvant être associée à un instant de mesure ; e) à partir des images de comparaison, définition d'au moins une région d'intérêt chaque région d'intérêt correspondant à une partie d'au moins une image de comparaison dans laquelle une variation de l'échantillon est détectée ; f) sur plusieurs images de l'échantillon, résultant de l'étape b), extraction de vignettes chaque vignette comportant une région d'intérêt définie au cours de l'étape e), de façon à former au moins une pile de vignettes chaque pile de vignettes correspondant à une même région d'intérêt extraite de plusieurs images de l'échantillon ; g) utilisation de chaque pile de vignettes formées lors de l'étape f) en tant que données d'entrée d'un algorithme d'intelligence artificielle supervisé ; h) à partir de l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé, confirmation ou non confirmation de la présence de microorganismes se développant dans chaque région d'intérêt définie dans l'étape e).
L'étape f) peut comporter une formation d'autant de piles de vignettes que de régions d'intérêt distinctes définies lors de l'étape e). Au cours de l'étape f), chaque pile de vignettes est associée à une région d'intérêt.
Par vignette, il est entendu une portion d'image, de taille inférieure à la taille de l'image. Chaque image comporte des pixels. Chaque vignette peut comporter un nombre de pixels au moins 10 fois ou au moins 100 fois inférieur au nombre de pixels de l'image. L'algorithme d'intelligence artificielle supervisé peut être un réseau de neurones. Le réseau de neurones peut être un réseau de neurones convolutifs.
Selon un mode de réalisation, chaque image étant définie selon des pixels, l'étape e) comporte :
- e-i) pour chaque pixel, sélection d'une image de comparaison dont la valeur, audit pixel, est soit minimale, soit maximale ;
- e-ii) formation d'une image de variation, dont la valeur, en chaque pixel, est déterminée par l'image de comparaison sélectionnée lors de la sous-étape e-i) ;
- e-iii) définition d'au moins une d'intérêt à partir de l'image de variation.
L'image de variation peut ainsi être formée par une combinaison d'images de comparaison. Chaque pixel de l'image de variation est établi à partir de la valeur, audit pixel, d'une image de comparaison.
L'étape e) peut comporter une détermination de coordonnées d'intérêt, dans l'image de variation, chaque coordonnée d'intérêt correspondant potentiellement à un microorganisme. Chaque région d'intérêt est alors définie autour de chaque coordonnée d'intérêt. La forme et la dimension de chaque région d'intérêt sont de préférence prédéterminés.
Le procédé peut comporter, suite à la sous-étape e-ii) :
- segmentation de l'image de variation, entre une première partie, et une deuxième partie, complémentaire de la première partie, la segmentation étant effectuée par rapport à un seuil d'intensité ;
- à partir de l'image de variation segmentée, détermination de coordonnées d'intérêt correspondant potentiellement à un microorganisme ; de telle sorte que l'étape e-iii) comporte une définition d'au moins une région d'intérêt autour de chaque coordonnée d'intérêt déterminée au cours de la sous-étape e-ii).
Selon une possibilité, lors de l'étape f), chaque vignette comporte une seule région d'intérêt définie au cours de l'étape e).
L'échantillon peut être disposé entre la source de lumière et le capteur d'image.
Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d'image n'est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image.
Selon un mode de réalisation, un système optique s'étend entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique définissant un plan objet et un plan image, le procédé étant tel que:
- le capteur d'image définit un plan de détection, le plan de détection étant décalé par rapport au plan image ; - et/ou l'échantillon définit un plan d'échantillon, le plan d'échantillon étant décalé par rapport au plan objet.
Selon un mode de réalisation, l'étape b) comporte, à chaque instant de mesure :
- b-i) acquisition d'une image par le capteur d'image à l'instant de mesure ;
- b-ii) application d'un opérateur de reconstruction holographique à l'image acquise de façon à obtenir une image complexe dans un plan de reconstruction ;
- b-iii) obtention de l'image de l'échantillon, à l'instant de mesure, à partir de l'image complexe résultant de la sous-étape b-ii).
L'image de l'échantillon peut par exemple être obtenue à partir du module et/ou de la phase et/ou de la partie réelle et/ou de la partie imaginaire de l'image complexe obtenue au cours de la sous-étape b-ii).
De préférence, lors de la sous-étape b-ii), le plan de reconstruction est un plan selon lequel s'étend l'échantillon. De préférence, le plan de reconstruction est parallèle à un plan de détection selon lequel s'étend le capteur d'image.
Selon une possibilité, le procédé peut comporter, suite à l'étape h), une étape i) de comptage de régions d'intérêt considérées comme comportant des microorganismes se développant dans l'échantillon.
Préalablement à l'étape h), le procédé peut comporter un apprentissage de l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé, l'apprentissage étant réalisé en utilisant des échantillons de calibration comportant des microorganismes se développant dont la localisation est connue. Selon un mode de réalisation préféré, lors de l'étape b), les instants de mesure sont compris entre un instant initial et un instant final. Lors de l'étape c), l'instant de référence peut correspondre à l'instant initial ou à l'instant final.
Selon un mode de réalisation, lors de l'étape c), l'instant de référence est un instant antérieur ou postérieur à chaque instant de mesure. Il peut par exemple s'agir de l'instant immédiatement antérieur ou de l'instant immédiatement postérieur à chaque instant de mesure.
Un deuxième objet de l'invention est un dispositif de caractérisation d'un échantillon, l'échantillon comportant des microorganismes, le dispositif comportant :
- une source de lumière ;
- un capteur d'image ;
- un support configuré pour maintenir l'échantillon ;
- un processeur, programmé pour mettre en oeuvre les étapes c) à h) du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. Le dispositif peut comporter des caractéristiques décrites en lien avec le premier objet de l'invention.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous.
FIGURES
La figure 1 est un exemple de dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention.
La figure 2 schématise les principales étapes d'un procédé mis en oeuvre par l'invention.
Les figures 3A à 3L sont des images d'un échantillon obtenues à différents instants successifs, formant une série d'images. Il s'agit d'images obtenues en mettant en oeuvre un dispositif tel que représenté sur la figure 1.
La figure 4A montre un exemple de région d'intérêt comportant des microorganismes se développant dans l'échantillon.
La figure 4B montre des profils d'intensité de plusieurs images d'une même série d'images de l'échantillon, dans la région d'intérêt représentée sur la figure 4A.
La figure 4C montre des profils d'intensité de plusieurs images de comparaison, résultant de comparaisons d'images de la série d'images décrite en lien avec la figure 4B.
La figure 4D montre un profil horizontal d'une image de variation établie pour la série d'images décrite en lien avec la figure 4B.
Sur les figures 4B à 4D, chaque profil est déterminé le long d'une ligne en pointillés tracés sur la figure 4A.
La figure 5A est une image de variation correspondant à la série d'images représentée sur les figures 3A à 3L.
La figure 5B est l'image de variation représentée sur la figure 5A après détection des régions d'intérêt.
La figure 6 est une région d'intérêt définie à partir de l'image 5B.
Les figures 7A à 7H sont des vignettes extraites des images d'une même série d'images, chaque vignette correspondant à la région d'intérêt représentée sur la figure 6.
Les figures 8A à 8C sont des exemples de piles de vignettes formant les données d'entrée d'un algorithme de type réseau de neurones convolutifs.
La figure 9 schématise une architecture d'un réseau de neurones convolutifs.
Les figures 10A à 10F montrent une pile de vignettes représentatives du développement de microorganismes. Les figures 10G à 10L montrent une pile de vignettes représentatives d'un déplacement dans l'échantillon.
La figure 11 est un graphe montrant l'évolution de la performance du procédé en fonction de l'étendue temporelle de la série d'images.
Les figures 12A à 12C sont une comparaison de détection de microorganismes respectivement selon une méthode de référence, selon un procédé basé sur une analyse de la morphologie de l'image de variation, et selon un procédé selon l'invention.
Les figures 12D à 12F sont une comparaison de détection de microorganismes respectivement selon une méthode de référence, selon un procédé basé sur une analyse de la morphologie de l'image de variation, et selon un procédé selon l'invention.
Les figures 12G à 121 sont une comparaison de détection de microorganismes respectivement selon une méthode de référence, selon un procédé basé sur une analyse de la morphologie de l'image de variation, et selon un procédé selon l'invention.
La figure 13A est un graphe montrant, pour différents échantillons, un nombre de microorganismes dénombrés respectivement avec un procédé basé sur une analyse de la morphologie de l'image de variation (axe des ordonnées) et un procédé de référence (axe des abscisses).
La figure 13B est un graphe montrant, pour différents échantillons, un nombre de microorganismes dénombrés respectivement avec un procédé selon l'invention (axe des ordonnées) et un procédé de référence (axe des abscisses).
La figure 14 est un autre exemple de dispositif permettant une mise en oeuvre de l'invention.
EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l'invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L'onde lumineuse est émise selon une bande spectrale d'illumination Dl.
L'échantillon 10 est un échantillon que l'on souhaite caractériser. Il comprend notamment des microorganismes 10fc. L'échantillon 10 peut comporter des nutriments permettant le développement des microorganismes. L'échantillon 10 peut par exemple comporter des aliments broyés, ces derniers étant destinés à l'alimentation, par exemple à la nutrition animale. Il s'agit par exemple de matière grasse, de viande, et des fibres végétales, en particulier sous forme de farine. Le mélange peut également comporter des compléments alimentaires, par exemple des vitamines. Le mélange comporte également des microorganismes, en particulier des bactéries ou levures, utilisées en tant que complément alimentaire, sous forme de probiotiques.
Un objectif de l'invention est d'évaluer une quantité de microorganismes se développant dans l'échantillon. Le terme quantité désigne un nombre ou une concentration. Par microorganisme, on entend notamment une levure, une bactérie, une spore, un champignon ou une cellule, qu'il s'agisse d'une cellule eucaryote ou procaryote, ou une microalgue. L'échantillon 10 peut être solide. Il peut par exemple prendre la forme d'une poudre, obtenue par broyage d'aliments comportant des microorganismes. Selon un mode de réalisation, l'échantillon peut comporter milieu de culture, propice au développement de microorganismes. Il peut s'agir d'un milieu de culture liquide ou prenant la forme d'une gélose.
L'échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre 15. La chambre 15 peut avoir une épaisseur e, selon l'axe de propagation, variant typiquement entre 10 pm et 5 mm, et est de préférence comprise entre 20 pm et 500 pm. L'échantillon est maintenu sur un support 10s à une distance d d'un capteur d'image 16. La concentration de microorganismes peut varier entre 500 par microlitre et 5000 par microlitre.
La distance D entre la source de lumière 11 et la chambre 15 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre la chambre fluidique 15 et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 pm et 1 mm, de préférence entre 50 pm et 500 pm. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 pm. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l'échantillon 10. Le dispositif représenté sur la figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d'angle a. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 80°. Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur.
De préférence, la bande spectrale d'émission Dl de l'onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale.
L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et le capteur d'image 16 précédemment évoqué. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Dans cet exemple, l'échantillon s'étend selon un plan XY, perpendiculaire à l'axe de propagation Z.
Le capteur d'image 16 est apte à former une image I0 de l'échantillon 10 selon un plan de détection P0. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un capteur d'image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection P0 s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d'image 16 est préférentiellement comprise entre 50 pm et 2 cm, de préférence comprise entre 100 pm et 2 mm.
On remarque, dans ce mode de réalisation, l'absence d'optique de grossissement ou de formation d'image entre le capteur d'image 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d'image 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image acquise par le capteur d'image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de détection.
Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12, les microorganismes 10fe présents dans l'échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection P0, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12' transmise par l'échantillon. Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l'onde lumineuse 14, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d'image 16, désignée par le terme "onde d'exposition", peut comprendre : une composante 13 résultant de la diffraction de l'onde lumineuse incidente 12 par les microorganismes présents dans l'échantillon ; une composante 12' résultant de la transmission de l'onde lumineuse incidente 12 par l'échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon. Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l'image acquise par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction). Cette image forme un hologramme, qui est une signature du contenu de l'échantillon, et de son évolution dans le temps.
Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image I0 acquise par le capteur d'image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l'affichage d'images acquises par le capteur d'image 16 ou calculées par le processeur 20.
Les inventeurs se sont basés sur le fait que sous l'effet du développement des microorganismes dans l'échantillon, formant des colonies, l'hologramme formé sur le capteur d'image évolue. Cette évolution peut être interprétable à l'œil nu ou au moyen d'algorithmes de traitement d'images simples lorsque l'échantillon est peu dense. Cependant, lorsque le nombre de microorganismes est important, l'interprétation des images est plus difficile et peut engendrer des erreurs sur le comptage des microorganismes ou sur leur localisation.
Les inventeurs ont conçu un procédé permettant de détecter et de dénombrer des microorganismes se développant dans un échantillon. Par se développer, on entend se multiplier, de façon à former des amas ou des colonies. Le procédé est basé sur l'observation du développement de ces amas ou de ces colonies au cours du temps.
Les principales étapes du procédé sont décrites en lien avec la figure 2.
Etape 100 : Disposition de l'échantillon sur le support.
L'échantillon est disposé sur le support 10s, dans le champ d'observation du capteur d'image. Il est ensuite illuminé par la source de lumière 11.
Etape 110 : Obtention d'une série d'images de l'échantillon
Au cours de cette étape, des images Io i sont acquises successivement en différents instants de mesure tj, s'étendant selon une plage temporelle d'acquisition. L'indice i est un entier strictement positif désignant le rang de chaque image dans la série d'images. La plage temporelle d'acquisition peut être comprise entre lh et 20h, voire davantage. Les images I i peuvent être acquises selon une fréquence d'acquisition déterminée, par exemple toutes les heures.
Une image Io i acquise par le capteur d'image 16, également appelée hologramme, ne permet pas d'obtenir une représentation suffisamment précise de l'échantillon observé. Cela est dû à l'absence d'optique de grossissement entre l'échantillon et le capteur d'image. On peut appliquer, à chaque image Io i acquise par le capteur d'image, un opérateur de propagation holographique h, de façon à calculer une grandeur représentative de l'onde lumineuse d'exposition 14. Il est alors possible de reconstruire une expression complexe de l'onde lumineuse 14 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, et en particulier dans un plan de reconstruction Pz situé à une distance |z| du capteur d'image 16, dite distance de reconstruction, ce plan de reconstruction étant de préférence le plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon, avec :
Ai(x,y,z) = /0,i(x,y, z) * h * désignant l'opérateur produit de convolution.
L'opérateur de propagation h a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d'image 16 et un point de coordonnées (x, y, z), situé à une distance \z\ du capteur d'image. Il est alors possible de déterminer le module j(x, y, z) et/ou la phase f^c,g,z) l'onde lumineuse 14, en un point de l'espace de coordonnées (x, y, z), avec :
Mj(x, y, z) = abs [Ai(x,y, z)] , -
<Pi(x,y, z) = arg [Ai(x,y,z)\.
Les opérateurs abs et arg désignent respectivement le module et l'argument.
L'opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que : avec f2=-l.
Autrement dit, l'expression complexe At de l'onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, est telle que :
Dans la suite de cette description, les coordonnées (x, y) désignent une position radiale dans un plan radial XY perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La coordonnée z désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z.
L'expression complexe At est une grandeur complexe dont l'argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l'intensité de l'onde lumineuse d'exposition 14 détectée par le capteur d'image 16 à l'instant de mesure tj. Le produit de convolution de l'image Io i par l'opérateur de propagation h permet d'obtenir une image complexe Ai représentant une distribution spatiale de l'expression complexe de A (x,y, z) dans le plan de reconstruction considéré. De préférence, ce dernier est le plan P10 selon lequel s'étend l'échantillon.
A partir de l'image complexe Au on peut obtenir une image lt représentative de l'échantillon, en considérant par exemple le module, et/ou la phase, et/ou la partie réelle, et/ou la partie imaginaire de l'image complexe At. L'ensemble des images lt successivement obtenues forme une série d'images de l'échantillon, chaque image obtenue étant représentative de l'échantillon à un instant de mesure t . Chaque image l est associée à un instant de mesure t , qui correspond à l'instant d'acquisition de l'image /0 (.Chaque image l représente l'échantillon à l'instant tj.
L'obtention d'une image complexe peut s'accompagner d'un bruit de reconstruction important, usuellement désigné par le terme « twin image ». Des algorithmes itératifs ont été décrits, permettant d'obtenir, par reconstruction holographique, une image complexe At tout en minimisant le bruit de reconstruction. De tels algorithmes de reconstruction holographique sont par exemple décrits dans le document WO2017162985 (étapes 100 à 170, schématisées dans la figure 2A de WO2017162985) ou dans le document WO2016189257 (étapes 100 à 500, schématisées sur la figure 4 de WO2016189257).
Les figures 3A à 3L représentent des images /j obtenues par un dispositif tel que représenté sur la figure 1, durant une période temporelle d'acquisition de 11 heures, à partir d'un instant initial tt (fig. 3A). Ces images ont été obtenues par reconstruction holographique à partir d'images Io i acquises toutes les heures. Chaque image acquise Io i a fait l'objet d'une reconstruction holographique, telle que décrite dans WO2017162985, de façon à obtenir une image complexe reconstruite Ait dans le plan de l'échantillon. On a ainsi obtenu des images /j, respectivement représentatives de l'échantillon à chaque instant de mesure tit en déterminant le module de l'image complexe. Sur ces figures, l'échantillon comporte des granulés de nutrition animale, broyés, comprenant des levures Saccharomyces cerevisiae dans un milieu de culture de type YPD (Yeast Peptone Dextrose). Les paramètres expérimentaux étaient les suivants : source de lumière : LED à cadrans RGB Créé MC-E Color ; capteur d'image : capteur CMOS monochrome IDS UI-1492LE-M - 3840 x 2748 pixels ; distance capteur d'image - échantillon : 1 mm ; distance source de lumière - échantillon : 5 cm. Sur ces images, les microorganismes prennent une forme de taches s'assombrissant peu à peu. Ainsi, le développement de microorganismes se traduit, sur les images de la série d'images, d'un assombrissement progressif.
Sur chacune des figures 3A à 3L, on a matérialisé, par un cadre noir, une région d'intérêt de l'image correspondant à une même colonie de microorganismes. On observe que la colonie s'assombrit sous l'effet de la multiplication des microorganismes. L'assombrissement est attribué à la diffusion croissante et à l'atténuation de la lumière par les microorganismes. Cette particularité est utilisée dans l'étape 140.
Etape 120 : comparaison d'images.
L'objectif de cette étape est d'établir des images de comparaison, chaque image de comparaison correspondant à une comparaison entre deux images de la série d'images de l'échantillon. La comparaison peut prendre la forme d'une soustraction ou d'un ratio. Dans cet exemple, on effectue une comparaison de chaque image I 1 avec une image de référence /re/,;, correspondant à un instant de référence tre^ L'image de référence /re/,; peut par exemple être l'image initiale représentant l'échantillon au début de la plage temporelle d'acquisition : tref i = t . Ainsi, pour chaque image de l'échantillon /j, on calcule une image de comparaison IcomP i telle que :
Icomp.i — h — I ref.i ~ h ~ 11 (1)
L'instant de référence peut également être l'instant final, auquel cas IcomP i = If — l où / correspond au rang l'instant final.
Selon une variante, l'image de référence /re/,; est l'image de l'échantillon à l'instant de mesure précédent l'instant correspondant à l'image /; : tref i = t i-1. On obtient alors :
Icomp.i — h — I ref.i ~ h ~ h- 1 (2)
On comprend qu'au cours de l'étape 120, pour chaque image de l'échantillon lt obtenue lors de l'étape 110, on calcule une image de comparaison ICOmp,i· Chaque image de comparaison est associée à un instant de mesure tj. Chaque image de comparaison IcomP i = représente une variation de l'échantillon entre l'instant de référence tre^ i et l'instant de mesure tj.
Dans cet exemple, la comparaison prend la forme d'une soustraction. En variante, la comparaison peut prendre la forme d'un ratio
Etape 130 : Formation d'une image de variation A partir de chaque image de comparaison ICOmp,i> on détermine une image de variation Ivar, cette dernière étant représentative d'une variation de l'échantillon durant la plage temporelle d'acquisition.
Chaque image de l'échantillon est définie selon des pixels de coordonnées (x,y), dans le plan de détection formé par le capteur d'image. Il en est de même de chaque image de comparaison homp.i A partir des différentes images de comparaison IcomP i résultant de l'étape 120, on calcule une image de variation Ivar. La valeur de l'image de variation Ivar (x, y) en chaque pixel (x, y) correspond à la valeur de l'image de comparaison ICOmp,i (X y) traduisant un assombrissement maximal parmi les différentes images de comparaison.
Pour constituer l'image de variation, on sélectionne, pour chaque pixel (x, y), l'image de comparaison IcomP i dont la valeur IcomP i (x, y), pour le pixel considéré, traduit une différence maximale de deux images l et /re/,; sous l'effet du développement des microorganismes.
Lorsque, pour calculer chaque image de comparaison, l'image de référence /re ,i est associée à un instant de référence tre^ i antérieur à l'instant de mesure tj associé à l'image Iu et que l'image de référence est soustraite de chaque image de l'échantillon /j, ce qui correspond aux expressions (1) et (2), pour chaque pixel (x, y) :
Lorsque, pour calculer chaque image de comparaison, l'image de référence /re/,; représente l'échantillon à un instant de référence tref i postérieur à l'instant de mesure de l'image /j, et que l'image de référence est soustraite de chaque image /j, pour chaque pixel (x, y), le développement des microorganismes entraîne un éclaircissement de l'image de référence. Dans ce cas,
Ivar (X y) = max (icomp.i ( y)) (4)
D'une façon générale, l'image de variation est établie en utilisant, pour chaque pixel (x, y), l'image de comparaison dont la valeur correspond à un extremum, pour le pixel, parmi l'ensemble des images de comparaison /comp j. L'extremum traduit une augmentation de la diffusion sous l'effet du développement des microorganismes. En fonction de la façon selon laquelle l'image de comparaison ICOmp,i est calculée, l'extremum est soit d'un maximum, soit d'un minimum. Ainsi, l'image de variation Ivar peut donc être formée à partir de différentes images de comparaison lcomP i.
Dans la suite de la description, on considère que l'image de référence /re/,; est l'image initiale It de la série d'images. Ainsi, l'image de variation est telle que :
On remarque que l'image de variation est définie pour l'ensemble de la série d'images résultant de l'étape 110.
La figure 4A montre une région d'intérêt d'une des images représentées sur les figures 3A à 3L, centrée sur des microorganismes se développant. Par région d'intérêt, on entend une partie d'une image de l'échantillon comportant un microorganisme ou une colonie de microorganismes. Des profils d'intensité ont été réalisés sur la même région d'intérêt, en considérant différentes images successivement obtenues, selon la ligne représentée en pointillés sur la figure 4A. Les profils correspondent à des images obtenues respectivement 0 heure (cf. figure 3A - référence ), 3 heures (cf. figure 3D - - référence /4), 7 heures (cf. figure 3H - référence I8) et 9 heures (cf. figure 3J - - référence I10) après l'instant initial tt. L'instant initial correspond à la figure 3A. Les profils sont représentés sur la figure 4B. On observe que la présence de chaque microorganisme se traduit par des niveaux de gris plus faibles.
Des images de comparaison ont été formées en soustrayant l'image initiale (figure 3A) de façon à établir des images de comparaison ICOmp, i, hompA > I comp,8> homp, io> telles que définies selon l'expression (1). Les profils de chaque image de comparaison sont représentés sur la figure 4C. Le profil de l'image de comparaison ICOmp, i est égal à 0. A partir des images de comparaison, on a formé une image de variation lvar selon l'expression (5). Le profil de l'image de variation Ivar est représenté sur la figure 4D. Dans cet exemple, on constate que l'image de variation lvar est essentiellement formée à partir des valeurs des pixels des images de comparaison ICOmp, 8 et
Icomp, 10-
La figure 5A montre l'image de variation Ivar décrite dans le paragraphe précédent. On observe des traces sombres, dont certaines correspondent à des colonies de microorganismes se développant.
Cependant, sur l'image de variation, certaines traces sont formées non pas sous l'effet du développement des microorganismes dans l'échantillon, mais sous l'effet d'un déplacement de microorganismes ou autres particules à l'intérieur de l'échantillon (notamment lorsque ce dernier prend la forme d'une poudre), ou d'un déplacement d'une particule externe à l'échantillon, par exemple une poussière entre l'échantillon et le capteur d'image.
L'objectif des étapes suivantes est de déterminer, à partir des traces détectées sur l'image de variation Ivar, celles qui correspondent à un microorganisme se développant.
Etape 140 : Détermination et localisation de régions d'intérêt à partir de l'image de variation
L'objectif de cette étape est de détecter des régions d'intérêt contenant respectivement au moins une trace détectée sur l'image de variation.
Dans cet exemple, l'étape 140 comporte une binarisation de l'image de variation lvar, sur la base d'un seuil prédéterminé. La figure 5B montre l'image de variation lvar binarisée. Sur cette image, chaque tache sombre de l'image de variation, susceptible de correspondre à un microorganisme ou à une colonie de microorganismes, apparaît sous la forme d'une trace claire, dont on peut déterminer des coordonnées, par exemple les coordonnées du centroïde. Ainsi, à partir de l'image de variation, on détermine des coordonnées d'intérêt (x7,y;). Chaque coordonnée d'intérêt peut correspondre à un microorganisme (ou à une colonie de microorganismes), ou à un déplacement d'une particule dans l'échantillon 10.
Autour de chaque coordonnée d'intérêt (x;-, y ), on définit une région d'intérêt ROIj. La dimension de chaque région d'intérêt est de préférence prédéfinie. Dans cet exemple, chaque région d'intérêt est un carré de 65 pixels de côté. La définition des dimensions des régions d'intérêt ROIj peut être effectuée préalablement, par exemple sur la base d'essais expérimentaux. Chaque région d'intérêt peut être définie de façon que son centre corresponde respectivement à chaque coordonnée d'intérêt (x ,y;).
La figure 6 représente un exemple de région d'intérêt définie autour d'une coordonnée d'intérêt, cette dernière étant le centroïde d'une trace blanche de l'image de variation après binarisation, la trace étant entourée par un cercle en pointillés sur la figure 5B.
Etape 150 : Extraction de vignettes.
Au cours de cette étape, on définit une vignette V j à partir de chaque image de l'échantillon /j, résultant de l'étape 110. Chaque vignette Vt correspond respectivement à une partie de l'image Il dans chaque région d'intérêt ROIj définie au cours de l'étape 140. Ainsi, pour chaque région ROIj d'intérêt définie au cours de l'étape 140, on obtient une pile de vignettes V , chaque vignette correspondant à une extraction de la région d'intérêt ROIj dans l'image de l'échantillon /j. Les vignettes Vi formées à partir de différentes images Iu dans une même région d'intérêt ROIj, forment une pile de vignettes Vj.
Ni correspond aux nombres d'images de l'échantillon prises en compte. Les figures 7A à 7H sont des exemples de vignettes Vt j associées à une même région d'intérêt ROIj respectivement extraites de différentes images. On observe une variation de l'aspect des vignettes entre la figure 7A et la figure 7H. Ainsi, chaque pile de vignettes Vj. est représentative d'une variation locale de l'échantillon, dans une même région d'intérêt ROIj.
Etape 160 : Classification de chaque pile de vignettes Vj. Au cours de cette étape, chaque pile de vignettes est utilisée en tant que donnée d'entrée IN d'un réseau de neurones convolutifs CNN, dont la couche de sortie OUT permet de déterminer si la pile de vignettes correspond au développement d'un microorganisme ou non.
Les figures 8A, 8B et 8C sont des exemples de piles de vignettes.
La figure 9 schématise un exemple de différentes couches d'un réseau de neurones convolutifs. Un tel réseau est connu de l'homme du métier. Il est par exemple décrit dans Karpathy "Large- scale video classification with convolutional neural networks", 2014 IEEE Conférence on Computer Vision and Pattern Récognition. De façon connue en soi, le réseau de neurones convolutif comporte : une couche d'entrée IN : cette couche est formée par une pile de vignettes Vj ; plusieurs couches de convolution CONVi...CONVk. Chaque couche de convolution compote un premier niveau, formé d'images obtenues par convolution d'au moins une image de la couche précédente par un filtre. Dans cet exemple, la taille du filtre est 3 x 3. Les paramètres de chaque filtre sont établis lors d'une phase d'apprentissage décrite par la suite. Les images formant le premier niveau font ensuite l'objet de transformations, pouvant comprendre :
■ un "pooling", il s'agit de remplacer les valeurs d'un groupe de pixels par une seule valeur, par exemple le moyenne, ou la valeur maximale, ou la valeur minimale du groupe considéré. Dans cet exemple, on applique un "max pooling", ce qui correspond au remplacement des valeurs de groupes de pixels de 2 par 2 par la valeur maximale dans le groupe ; une rectification linéaire, usuellement désigné "RELU", permettant notamment de supprimer certaines valeurs des images du premier niveau. On peut par exemple supprimer les valeurs négatives en les remplaçant par la valeur 0.
Dans cet exemple, on a utilisé trois couches CONVk successives, avec 1 < k < 3. A l'issue des trois couches de convolution, on dispose d'une couche VECT, formée d'un vecteur de dimension (1 ;9216). Chaque composante du vecteur VECT est une caractéristique (ou « feature ») de la pile de vignettes Vj formant l'entrée IN du réseau. Le vecteur VECT est utilisé en tant que vecteur d'entrée d'un réseau de neurones NN de type « fully connected » (directement connecté), terme usuel pour l'homme du métier. Chacune des composantes du vecteur VECT forme un nœud alimentant le réseau de neurones NN. Dans cet exemple, le réseau de neurones NN comporte une couche de sortie OUT directement connectée au vecteur VECT. La couche de sortie comporte des nœuds yn. Chaque nœud correspond à une classe. De façon connue par l'homme du métier, on détermine une valeur de chaque nœud de la couche de sortie en appliquant une fonction d'activation à une combinaison linéaire des valeurs des nœuds de la couche d'entrée. Dans cet exemple, la couche de sortie OUT comporte deux classes : la pile de vignettes correspond à un microorganisme se développant ; la pile de vignettes ne correspond pas à un microorganisme se développant.
Ainsi, au niveau de la couche de sortie la valeur de chaque nœud yn est telle que : où xm est la valeur de chaque nœud de la couche précédente (termes du vecteur VECT); bm est un biais associé à chaque nœud de la couche précédente xm fn est une fonction d'activation associé au nœud de rang n de la couche considérée; wm n est un terme de pondération pour le noeud de rang m de la couche précédente et le nœud de rang n de couche considérée.
La forme de chaque fonction d'activation fn est déterminée par l'homme du métier. Il peut par exemple s'agir d'une fonction d'activation fn est une fonction de type tangente hyperbolique ou sigmoïde.
La couche OUT comporte des valeurs permettant de confirmer ou d'infirmer que la présence de microorganismes se développant dans la région d'intérêt ROIj associée à la pile de vignettes Vj. Le réseau peut comporter une couche finale END, usuellement désignée par le terme « Softmax », comportant autant de composante que de classes, chaque composante représentant une probabilité d'appartenance à chaque classe.
Etape 170 : comptage
Au cours de cette étape, on dénombre les microorganismes se développant dans l'échantillon, ces derniers étant confirmés au cours de l'étape 160.
Le réseau de neurones convolutifs a préalablement fait l'objet d'un apprentissage (étape 90), de façon à déterminer les paramètres des filtres de convolution ainsi que les paramètres liés à chaque nœud, c'est-à-dire les termes xm, bm, fn et wmn définis en lien avec l'expression (7).
L'apprentissage est effectué en utilisant des séries d'images d'échantillons connus. Les inventeurs ont effectué un apprentissage en utilisant 7000 piles de vignettes dont la classe était connue. 80% des images ont été utilisées pour effectuer l'apprentissage proprement dit, tandis que les 20% restantes ont été utilisées pour valider l'algorithme.
Les figures 10A à 10F correspondent à une pile de vignettes correspondant au développement d'un microorganisme. Les figures 10G à 10L correspondent à une pile de vignettes correspondant à un mouvement dans l'échantillon, dans une partie de l'échantillon ne comportant pas de microorganisme. Le recours à algorithme d'intelligence artificielle supervisé permet de discriminer, parmi les variations locales détectées en analysant l'image de variation, celles qui correspondent effectivement à la croissance de microorganismes et celles qui ne correspondent qu'à un effet de mouvement et non au développement de microorganismes.
En effectuant l'apprentissage, les inventeurs ont constaté que la période temporelle d'acquisition des images a une influence sur le résultat. La figure 11 représente une évolution de la précision du résultat fourni par le réseau de neurones convolutifs (axe des ordonnées), en fonction de la période temporelle durant laquelle des images sont acquises (axe des abscisses - unité : heure). Lorsque la période temporelle est de 4h, la précision du résultat est de 87.8 %, c'est-à-dire que 87.8 % des résultats sont corrects. Lorsque la période temporelle est de 12h, la précision atteint 98%. La précision correspond au taux de piles de vignettes correctement classées.
Les inventeurs ont testé le procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170 sur des échantillons. Chaque échantillon a fait l'objet d'un comptage manuel visuel, au microscope, par un utilisateur expérimenté, ce comptage permettant d'obtenir une valeur de référence. Les échantillons comportaient des levures Saccharomyces cerevisiae réparties dans une matrice alimentaire de type granulés d'alimentation pour animal. On a ensuite comparé les valeurs résultant de l'application du procédé précédemment décrit avec les valeurs de référence.
Au cours de ces essais, on a également utilisé un algorithme basé sur une formation d'une image de variation, telle que décrite dans l'étape 130. Le comptage des microorganismes se développant est alors effectué par des opérations de filtrage et de traitement morphologique de l'image de variation : filtrage gaussien - filtrage d'Otsu (connu de l'homme du métier) - traitement morphologique (dilatation/érosion) - nettoyage de régions d'intérêt considérées comme aberrantes. Un tel algorithme, essentiellement basé sur une analyse morphologique, nécessite une mise au point longue, de façon à optimiser les différentes opérations successivement appliquées.
Les figures 12 A, 12B et 12C correspondent respectivement à l'application, sur un échantillon, de la sélection manuelle (méthode de référence), de l'algorithme basé sur une analyse morphologique, et du procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170. On constate que ce dernier (figure 12C) est cohérent avec la méthode de référence (figure 12A). Sur chaque image, les microorganismes détectés sont représentés par un point blanc.
Les figures 12D, 12E et 12F correspondent respectivement à l'application, sur une autre partie de l'échantillon, de la sélection manuelle (méthode de référence), de l'algorithme basé sur une analyse morphologique et du procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170. On constate que ce dernier (figure 12F) est plus cohérent avec la méthode de référence (figure 12D).
Les figures 12G, 12H et 121 correspondent respectivement à l'application, sur une autre partie de l'échantillon, de la sélection manuelle (méthode de référence), de l'algorithme basé sur une analyse morphologique et du procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170. On constate que ce dernier (figure 121) est cohérent avec la méthode de référence (figure 12G).
Les inventeurs ont réalisé des comptages sur 104 échantillons différents. Ces échantillons comportaient des levures Saccharomyces cerevisiae disposées dans des trois milieux différents, chaque milieu comportant des granules de nutrition animale.
On a déterminé des comptages de référence, effectués en balayant l'échantillon à l'aide d'un microscope. Les comptages de référence ont été comparés avec l'algorithme d'analyse morphologique et l'algorithme selon les étapes 100 à 170 préalablement décrites. Chaque algorithme a été mis en œuvre en utilisant 11 images acquises durant une période temporelle de 10 heures, avec une cadence d'acquisition de 1 image par heure.
La figure 13A montre, pour chaque échantillon, le comptage de référence (axe des abscisses) et le comptage réalisé avec l'algorithme d'analyse morphologique (axe des ordonnées). La moyenne des différences absolues entre les valeurs de référence et les valeurs données par l'algorithme d'analyse morphologique est égale à 12.9 %.
La figure 13B montre, pour chaque échantillon, le comptage de référence (axe des abscisses) en fonction du comptage réalisé avec l'algorithme mettant en œuvre le réseau de neurones convolutif (axe des ordonnées). La moyenne des différences absolues entre les valeurs de référence et les valeurs données par l'algorithme basé sur les réseaux de neurones est égale à 9.9 %.
Sur les figures 13A et 13B, chaque type de matrice alimentaire est respectivement repérée par un symbole de type triangle, rond ou carré.
Selon un mode de réalisation, une optique de formation d'image est disposée entre l'échantillon et le capteur d'image. Selon une variante, illustrée sur la figure 14, le dispositif comporte un système optique 19, définissant un plan objet P0bj et un plan image Pim. Le capteur d'image 16 est alors disposé selon une configuration dite défocalisée, selon laquelle l'échantillon s'étend selon un plan décalé par rapport au plan objet, et/ou le capteur d'image s'étend selon un plan décalé par rapport au plan image. Par configuration défocalisée, on entend une configuration comportant un décalage de l'échantillon et/ou du capteur d'image par rapport à une configuration de mise au point, selon laquelle le plan de détection Po est conjugué d'un plan Pio selon lequel s'étend l'échantillon. Le décalage d est de préférence inférieur à 500 miti, voire à 200 pm. Il est de préférence supérieur à 10 pm ou 20 pm. De la même manière qu'en configuration sans lentille, une telle configuration permet l'obtention d'une image dans laquelle chaque microorganisme apparaît sous la forme d'une figure de diffraction, des interférences se produisant entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et se propageant jusqu'au capteur d'image et une onde de diffraction générée par chaque particule de l'échantillon. Dans l'exemple représenté sur la figure 14, le plan objet P0bj est confondu avec un plan Pio selon lequel s'étend l'échantillon et le plan image Pim est décalé par rapport au plan de détection Po selon un décalage d. Le procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170 est applicable à des images acquises selon une telle configuration. Toutefois, une configuration en imagerie sans lentille est préférée, par le plus grand champ d'observation qu'elle procure. Selon une autre variante, le plan de détection est confondu avec le plan image et le plan de l'échantillon est confondu avec le plan objet. Chaque image est ainsi acquise selon une configuration focalisée.
L'invention peut être mise en oeuvre, de façon non limitative, dans le domaine de l'agroalimentaire, ou dans le contrôle de procédés industriels, dans le contrôle de l'environnement, ou encore dans le domaine de la microbiologie ou du diagnostic clinique de la biologie, ou dans le contrôle de l'environnement, ou encore dans le domaine de l'agroalimentaire ou du contrôle de procédés industriels.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de caractérisation d'un échantillon, comportant des microorganismes disposés au contact d'un milieu propice à leur développement, le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination de l'échantillon (10) par une source de lumière (11); b) à l'aide d'un capteur d'image (16), obtention d'images de l'échantillon (/j), chaque image représentant l'échantillon à un instant de mesure (tj) ; c) comparaison d'une image de l'échantillon, à un instant de mesure (tj), avec une image de référence (Iref), représentant l'échantillon à un instant de référence (tref), de façon à établir une image de comparaison (ICOmp,i), l'image de comparaison étant représentative d'une variation de l'échantillon entre l'instant de mesure (tj) et l'instant de référence (tref), l'instant de référence étant choisi parmi les instants de mesure; d) répétition de l'étape c) pour différents instants de mesure (tj), de façon à obtenir différentes images de comparaison ( homp.i ), chaque image de comparaison étant associée à un instant de mesure (tj); e) à partir des images de comparaison ( ICOmp,i ), définition d'au moins une région d'intérêt ( ROIj ), chaque région d'intérêt correspondant à une partie d'au moins une image de comparaison ( ICOmp,i ), dans laquelle une variation de l'échantillon est détectée; f) sur plusieurs images de l'échantillon, résultant de l'étape b), extraction de vignettes (Vi ), chaque vignette comportant une région d'intérêt (ROIj), définie au cours de l'étape e), de façon à former au moins une pile de vignettes (V)), chaque pile de vignettes correspondant à une même région d'intérêt (ROIj) extraite de plusieurs images (/j) de l'échantillon ; g) utilisation de chaque pile de vignettes formées lors de l'étape f) en tant que données d'entrée d'un algorithme d'intelligence artificielle supervisé ; h) à partir de l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé, confirmation ou non confirmation de la présence de microorganismes se développant dans chaque région d'intérêt définie dans l'étape e).
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé est un réseau de neurones.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le réseau de neurones est un réseau de neurones convolutifs.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel chaque image étant définie selon des pixels (x,y), l'étape e) comporte :
- e-i) pour chaque pixel, sélection d'une image de comparaison (ICOmp,i)> dont la valeur, audit pixel, est soit minimale, soit maximale ;
- e-ii) formation d'une image de variation (Ivar), dont la valeur, en chaque pixel, est déterminée par l'image de comparaison sélectionnée lors de la sous-étape e-i) ;
- e-iii) définition d'au moins une région d'intérêt ( ROIj ) à partir de l'image de variation.
5. Procédé selon la revendication 4, comportant, suite à la sous-étape e-ii) :
- segmentation de l'image de variation, entre une première partie, et une deuxième partie, complémentaire de la première partie, la segmentation étant effectuée par rapport à un seuil d'intensité ;
- à partir de l'image de variation segmentée, détermination de coordonnées d'intérêt (x j,yj) correspondant potentiellement à un microorganisme ; de telle sorte que l'étape e-iii) comporte une définition d'au moins une région d'intérêt (ROIj) autour de chaque coordonnée d'intérêt déterminée au cours de la sous-étape e-ii).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape f), chaque vignette comporte une seule région d'intérêt définie au cours de l'étape e).
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon est disposé entre la source de lumière et le capteur d'image.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel aucune optique de formation d'image n'est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image.
9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel un système optique (19) s'étend entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique définissant un plan objet (P0bj) et un plan image (P,m), le procédé étant tel que :
- le capteur d'image définit un plan de détection (Po), le plan de détection étant décalé par rapport au plan image (Pim);
- et/ou l'échantillon définit un plan d'échantillon (Pio), le plan d'échantillon étant décalé par rapport au plan objet (P0bj).
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, dans lequel l'étape b) comporte, à chaque instant de mesure
- b-i) acquisition d'une image par le capteur d'image (/0 à l'instant de mesure ;
- b-ii) application d'un opérateur de reconstruction holographique à l'image acquise (Io i) de façon à obtenir une image complexe (Ai) dans un plan de reconstruction ;
- b-iii) obtention de l'image de l'échantillon à l'instant de mesure, à partir de l'image complexe (Ai) résultant de la sous-étape b-ii).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant, suite à l'étape h), une étape i) de comptage des régions d'intérêt considérées comme comportant des microorganismes se développant dans l'échantillon.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant, préalablement à l'étape h), un apprentissage de l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé, l'apprentissage étant réalisé en utilisant des échantillons de calibration comportant des microorganismes se développant dont la localisation est connue.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape b), les instants de mesure sont compris entre un instant initial et un instant final, et dans lequel lors de l'étape c), l'instant de référence (tref) correspond à l'instant initial ou à l'instant final.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel lors de l'étape c), l'instant de référence est un instant antérieur ou postérieur à chaque instant de mesure.
15. Dispositif de caractérisation d'un échantillon, l'échantillon comportant des microorganismes, le dispositif comportant :
- une source de lumière (11);
- un capteur d'image (16);
- un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon ;
- un processeur, programmé pour mettre en oeuvre les étapes c) à h) du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
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