EP4052037A1 - Analytical medium for immunoassay and method for detecting analytes in such a medium - Google Patents

Analytical medium for immunoassay and method for detecting analytes in such a medium

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Publication number
EP4052037A1
EP4052037A1 EP20785790.5A EP20785790A EP4052037A1 EP 4052037 A1 EP4052037 A1 EP 4052037A1 EP 20785790 A EP20785790 A EP 20785790A EP 4052037 A1 EP4052037 A1 EP 4052037A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microbeads
type
agents
magnetic
capture
Prior art date
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Pending
Application number
EP20785790.5A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Lionel Cima
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Atware
Original Assignee
Atware
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Filing date
Publication date
Application filed by Atware filed Critical Atware
Publication of EP4052037A1 publication Critical patent/EP4052037A1/en
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/492—Determining multiple analytes

Definitions

  • the present invention relates to the detection of the presence of analytes in a liquid sample using magnetic microbeads. It also relates to an analysis medium for the detection of the analytes in the sample making it possible to implement this method.
  • the invention finds its application in the field of immunological assay.
  • the invention relates to a method for simultaneously measuring the respective masses of a first and a second plurality of superparamagnetic nanoparticles, the nanoparticles of the first and of the second pluralities having different superparamagnetic characteristics.
  • a test strip 1 of the state of the art comprises a substrate formed of a material, for example porous, allowing by capillarity to promote the flow of the liquid sample E capable of containing the analytes A.
  • This sample E is poured onto a reception zone 1a to impregnate the substrate and flows laterally from the reception zone 1a of sample 1.
  • Magnetically labeled agents 2 (comprising for example antibodies capable of binding to the analytes) are arranged at or near the reception zone la or near this zone in order to dissolve in the sample E, to bind to the analytes A and to form magnetically labeled analyte-agent complexes.
  • the test strip 1 forming the analysis medium also comprises a capture zone where there reside immobilized capture agents 3, typically the same antibodies as those included in the magnetically labeled agents 2.
  • immobilized capture agents 3 typically the same antibodies as those included in the magnetically labeled agents 2.
  • the complexes and the magnetically labeled agents 2 and unbound migrate from the reception area 1a to the capture area 1c and travel through an intermediate migration area 1b.
  • the complexes are selectively retained by the capture agents 3 at the capture zone le.
  • the agents magnetically labeled 2 and not bound to analytes A continue their migration beyond this zone.
  • Detection of agents magnetically labeled 2 and bound to analytes A in the capture zone indirectly provides a means of detecting the presence of analytes A in the sample.
  • the test strip 1 also comprises a control zone ld disposed downstream of the capture zone the in the direction of the flow of the sample E, and on which reside, immobilized, control agents 4. These agents 4 are configured to bind to magnetically labeled agents 2 and not bound to analytes A to retain them in the control zone ld.
  • Detection of magnetically labeled agents 2 in control area 1d provides a means of indicating that the test has proceeded properly, i.e. that sample E has flowed from the control area well. reception on to capture area on.
  • the analysis medium can alternatively be formed of a column filled with a porous material into which the capture agents 3 are grafted.
  • the migration magnetically labeled and unbound complexes and agents 2 is caused by forcing the flow of sample E through the porous material of the column. It is interesting to note that, in this case, there is no possibility of creating a control zone.
  • the magnetically labeled agents 2 are usually formed of magnetic microbeads of micrometric dimensions comprising superparamagnetic nanoparticles.
  • the microbeads are functionalized (eg with antibodies) to bind to analytes A in the sample.
  • the nanoparticles are of nanometric dimensions (that is to say, the large diameter of which is between a few nanometers and a few tens of nanometers), for example particles of Fe, Ni or Co or other mixtures. These particles can be incorporated with the aid of a binder in the magnetic microbeads.
  • the superparamagnetic materials which enter into the constitution of the microbeads have the particularity of presenting a nonlinear magnetic cycle B (H) when the excitation magnetic field H varies over a sufficiently wide range.
  • a measuring device capable of detecting the presence of superparamagnetic nanoparticles, or even of estimating the quantity of nanoparticles present, is used.
  • two successive measurements are carried out, a first at the level of the capture zone le, a second at the level of the control zone ld when the latter exists.
  • it is possible to verify that the immunological test was carried out correctly detection of a signal at the level of the control zone ld
  • to determine the presence or absence of analytes A in the sample analyzed presence or absence of a signal at the level of the capture zone le.
  • This device comprises four coils arranged in a measuring circuit, including a measuring coil in which the area of the test strip 1 that is to be evaluated is placed.
  • the four coils are electrically arranged in series and are identical to each other.
  • the coils are crossed by high frequency (HF), low frequency (LF) and continuous (DC) currents according to a very precise configuration aimed at developing a different magnetic field in each of the coils.
  • the superparamagnetic material is exposed to a high and low frequency magnetic field and, due to the nonlinear behavior of the material, the response to this excitation contains components at frequencies which are linear combinations of the excitation frequencies.
  • the document provides for the measurement of a measurement voltage component at a frequency corresponding for example to the HF - LF and / or HF + LF frequency. This component becomes proportional to the quantity of superparamagnetic material placed in the measuring coil when a DC component is also applied. This quantity is reversed when the DC component is inverted, which makes it possible to improve the signal-to-noise ratio of the measurement when an excitation sequence is carried out with several DC component values (generally at an average value nothing).
  • a plurality of measurements of an electromotive force taken from the measuring circuit are reproduced.
  • This plurality of measurements is indexed by the distinct direct current values injected into the measurement circuit.
  • These measurements are then combined to form a measurement vector.
  • This vector is itself combined with a signature vector of a standard magnetic mass in order to estimate the mass of superparamagnetic material present in a measurement perimeter of the device. This combination can in particular implement a scalar product of the two vectors.
  • the measuring device When the measuring device is used to provide an estimate of the magnetic mass present in the capture zone le and thus estimate the quantity of analytes A in the sample E, the result provided is sometimes imprecise. This is due to the fact that the quantity of magnetically labeled agents 2 initially present in sample E is generally not well known. Some of these agents 2 can moreover cling to the migration zone and not reach the capture zone le and / or the control zone ld. In addition, the magnetic properties of the microbeads as well as the migration phenomena vary quite strongly as a function of the temperature.
  • the measurement of the absolute magnetic mass present in the capture zone le is information that it is of little reliable to use, in the solutions of the state of the art, to estimate the quantity or the concentration of analytes A in the sample E.
  • An object of the invention is to remedy at least part of the aforementioned drawbacks.
  • the object of the invention provides an analysis medium for immunological assay comprising a substrate for promoting the natural or forced flow of a liquid sample capable of comprising analytes, the substrate having a capture zone.
  • the capture zone comprises, immobilized on or in the substrate, a plurality of first capture agents capable of selectively retaining complexes bound to the analytes and a plurality of second capture agents capable of selectively retaining reference agents.
  • the substrate also comprises, upstream of the capture zone in the direction of flow, a plurality of test agents marked with a first type of magnetic microbeads, the test agents being able to bind to the analytes, and a plurality of reference agents labeled with a second type of magnetic microbead, the first type of magnetic microbead and the second type of magnetic microbead having different superparamagnetic properties;
  • the first capture agents are respectively associated with complexes comprising analytes and test agents labeled with a first type of magnetic microbeads
  • the second capture agents are associated with reference agents labeled with a second type of magnetic microbeads, the first type of magnetic microbeads and the second type of magnetic microbeads having different superparamagnetic properties
  • the substrate is formed from a porous material; the substrate is in the form of a strip; the substrate is in the form of a quantity of material arranged in a column.
  • the invention provides a method for detecting the presence of analytes in a liquid sample, the method comprising the following steps:
  • test agents labeled with a first type of magnetic microbeads the test agents being able to bind to the analytes, and reference agents labeled with a second type of magnetic microbeads, the first and second types of magnetic microbeads having different superparamagnetic characteristics;
  • the combined magnetic response corresponds to the second derivative of the function connecting the excitation field to the magnetic induction of the microspheres of the first type and of the microbeads of the second type;
  • the step of processing the measurement vector comprises a search, in a base of standard vectors, for a standard vector closest to the measurement vector, each standard vector of the base being associated with a known quantity of microbeads of the first type and microbeads of the second type;
  • the step of processing the measurement vector comprises the digital search for the respective magnetic masses of the nanoparticles making up the microbeads of each type;
  • the processing step comprises the identification of a first peak and of a second peak of the magnetic response respectively associated with the microbeads of the first type and with microbeads of the second type to determine the slopes connecting the first peak and the second peak at the origin;
  • the processing step comprises the readjustment of the combined magnetic response in order to make a second peak of this response associated with the microbeads of the second type correspond to a reference peak of the signature of the microbeads of the second type or of the standard vectors.
  • FIG. 2 represents the second derivative of the relation linking an excitation magnetic field to the magnetic induction caused by this field in two superparamagnetic materials having different properties
  • FIGS. 3a and 3b represent an analysis medium in accordance with an embodiment of the invention, before and after its use, respectively;
  • FIG. 4 represents the superparamagnetic characteristic of a capture zone Ia of an analysis medium 1 for samples E comprising increasing amounts of analytes A;
  • FIG. 5 represents the effect of the variability of the distance on the superparamagnetic characteristic recorded by a measuring device.
  • Microbeads of the first and second type are Microbeads of the first and second type.
  • microbeads having different superparamagnetic characteristics. These microbeads will be respectively designated microbeads of the first type M1 and microbeads of the second type M2.
  • these microbeads of the first type M1 and of the second type M2 are formed from a binder incorporating superparamagnetic nanoparticles.
  • Each type of microbeads M1, M2 contains a fixed amount, from one microbead to another, of superparamagnetic nanoparticles.
  • the M1 microbeads of the first type are functionalized (for example by antibodies chosen to be able to bind to the analytes A of the sample E which will be subjected to the test) and thus form test agents T.
  • the second type M2 microbeads are functionalized to prevent this binding (or more generally, prevent any binding with any form of analyte if several types of analytes are likely to be present in the sample E) and thus form reference agents R.
  • the reference agents R are therefore incapable of forming complexes with analytes.
  • the microbeads of the first type and of the second type M1, M2 exhibit well-defined superparamagnetic characteristics.
  • Such a graph of the function f, this function itself (or one of its derivatives) forms in a way a unique signature of the superparamagnetic characteristic of a type of microbead.
  • the superparamagnetic characteristics of the first type M1 and of the second type M2 of microbeads are distinct from one another.
  • the magnetic induction of the nanoparticles of the microbeads of the first type M1 and of the second type M2 are distinct.
  • the graphs or the functions respectively relating, for these two types of microbeads, the excitation field H to the magnetic induction B are different from one another.
  • nanoparticles of different natures for both types of microbeads.
  • These nanoparticles can in particular be of different chemical compositions (for example particles of Fe304 in one case and of Fe200180 in the other case). They may alternatively have different sizes (for example having a large diameter of 7 nm in one case and 10 nm in the other case). These properties of size and chemical nature can of course also be mixed.
  • FIG. 2 shows the respective superparamagnetic characteristics of two types of microbeads respectively, a first type of microbeads comprising Fe304 nanoparticles of 7 nm in diameter (in dotted lines) and the second type of microbeads comprising the same types of microbeads. nanoparticles, but this time 10 nm in diameter (solid line).
  • the curves shown are sensitivity curves, that is to say of the second derivative of the function f linking an excitation field H to the magnetic induction B of the nanoparticles.
  • the superparamagnetic characteristics of the microspheres exhibit a general appearance of a similar sinusoidal arch. They both pass through the center of the frame and have magnetization extrema B +, B- for field values H +, H-.
  • the superparamagnetic characteristics of the two types of microbeads differ greatly from one another, in particular by the height of the extrema B R +, B R - (for microbeads of the second type), B T +, B T - (for microbeads of the first type) and by the values of the excitation field H R +, H R - (for the microbeads of the second type) and Ht +, H T - (for the microbeads of the first type) to which the nanoparticles must be submitted to reach these extrema.
  • the magnetic microbeads M1 of the first type (which will magnetically mark test agents T) will advantageously be chosen so that their superparamagnetic characteristics evolve over an interval [H T -, H T + ] relatively narrow, and we will choose the magnetic microbeads of the second type M2 (forming the reference agent R) so that its superparamagnetic characteristics evolve over a relatively wide [H R -, H R +] interval.
  • the nanoparticles of the microbeads of the first and second type M1, M2 differ in their sizes, it will be ensured that those having the largest diameter are at least 20% larger in size than those having the smallest diameter. , and advantageously at least 30%, or even more than 40%. It is thus ensured to clearly mark the differences in superparamagnetic characteristics between these two types of microbeads M1, M2.
  • an analysis medium 1 is presented for an application in the field of immunological assay, making it possible to implement the principles which have just been explained.
  • the analysis medium 1 is formed in this embodiment of a planar substrate, here in the form of a strip, to receive the liquid sample E at the level of a reception zone la, here arranged at one end of this substrate.
  • the substrate 1 is composed of porous material promoting the lateral flow of the solution, by capillary action, from the reception zone 1a to the distal end of the strip 1.
  • the reception zone adjoins a zone on which are placed a plurality of test agents T marked with a first type M1 of magnetic microbeads and a plurality of reference agent R marked with a second type M2 of magnetic beads.
  • test agents T are able to bind to the analytes A of the sample E, in the case of course where these analytes A are indeed present. This is not the case with reference agents R.
  • a test agent T binds to an analyte A, they form a set referred to as “complex” in the remainder of this application, magnetically labeled with a M1 microbead of the first. type.
  • test agents T as well as the reference agents R migrate laterally, entrained by the phenomenon of lateral flow already mentioned, and progress through a migration zone 1b to reach a zone. of capture the disposed downstream of the analysis medium 1, in the direction of flow.
  • test agents T and the reference agents R are placed on the substrate 1 next to the reception zone 1a, provision may be made to place these agents directly on the zone of. reception the or more downstream of this area, near the capture area on.
  • the analysis medium 1 it is not necessary for the analysis medium 1 to be originally provided with the reference agents R and the test agents T. These can be mixed beforehand with the sample E before the latter. is spilled on the receiving area 1a of the test strip 1. In all cases, however, care should be taken to bring the sample together with the test agents T and the reference agents R, whether this bringing together is carried out before or after the impregnation of the analysis medium 1 by the sample. E.
  • the capture zone 1c of the analysis medium comprises for its part a plurality of first capture agents C1 and a plurality of second capture agents C2, these agents both being immobilized on the substrate.
  • the first C1 capture agents are able to selectively retain the complexes formed of analytes A and test agents T, that is to say magnetically labeled with M1 microbeads of the first type.
  • the second capture agents C2 are for their part capable of selectively retaining reference agents R, therefore labeled with M2 microbeads of the second type.
  • selective it is meant that these capture agents retain and immobilize only the agents to which they are able to bind.
  • the analysis medium can thus comprise a single capture zone comprising it, immobilized in a mixed manner both the plurality of first capture agents C1 and the plurality of second capture agents C2.
  • FIG. 3a represents an analysis medium 1 in accordance with the invention during the pouring of the sample E onto the substrate.
  • FIG. 3b represents for its part this same medium 1 after the lateral flow of the sample E has caused the migration of the reference R and test agents T towards the capture zone le. It is noted that the complexes are well retained at the level of this capture zone le by the first capture agents C1.
  • the test agents T not having bound to analytes A continued their migrations towards a so-called “trash” zone ld of the medium 1.
  • the reference agents R are for their part retained in the capture zone Ic by the second capture agents C2, so as to saturate these second agents C2 in this zone.
  • the analysis medium allows this medium to be devoid of a capture zone.
  • the migration controls therefore consist of the reference agents R labeled with the M2 microbeads of the second type and detected at the level of the capture zone le, and not by the test agents T not bound to analytes and detected at the level of d. a control zone 1d as in the state of the art cited at the beginning of the present description. In this way, the use of the analysis medium no longer requires two successive measurements, one at the level of the capture zone and the other at the level of the control zone, but a single measurement at the capture area level on.
  • the analysis medium 1 can take the form of a column, open at each end, and in which a porous material forming a substrate has been placed.
  • This substrate comprises, immobilized in at least part of its thickness in the column, the first and second capture agents C1, C2. These capture agents C1, C2 have the same properties as those described in relation to the first embodiment.
  • the thick portion of the substrate in which these agents are immobilized forms the capture zone 1c of the analysis medium 1 according to this embodiment.
  • This capture zone 1c of the analysis medium 1 is therefore here “volume” as opposed to the “surface” capture zone of the first embodiment.
  • test agents T and reference R can be placed in the column, upstream of the capture zone le, before the application of the. sample E, or mixed with this sample E before forcing its flow through the substrate at least partially filling the column.
  • test agents T and reference R Regardless of the manner in which the sample E is brought into contact with the test agents T and reference R, one seeks to promote the bonds between the test agents T and the analytes A. One then forces the flow of the sample through the column and the substrate, to migrate the T test agents, complexes, R reference agents to the capture zone le. Selectively retained in this zone, using the capture agents C1, C2, the test agents T bound to the analytes and the reference agents R.
  • the portion of the porous substrate crossed by the sample E and devoid of capture agent C1, C2 constitutes a migration zone lb of the analysis medium 1, similar to that of the first embodiment.
  • the T test agents not bound to analytes, and therefore not retained in the capture zone 1c, are discharged from the column with the remainder of the liquid sample E.
  • the capture zone 1c is dimensioned to fit entirely within the measurement perimeter of a measuring device.
  • Each type of microbeads M1, M2 contains a constant amount from one microbead to another of superparamagnetic nanoparticles, so that determining the amount of microbeads of one type and / or the other type is equivalent to determining the mass of nanoparticles present in all microbeads of one type and / or the other type.
  • this method comprises placing the sample E in the presence of test agents T magnetically labeled with the microbeads of the first type M1 and in the presence of reference agents R magnetically labeled by the microbeads of the second. type M2.
  • These microbeads of the first and second type M1, M2 comprise nanoparticles having different superparamagnetic characteristics.
  • This step of bringing together makes it possible in particular to bind the test agents T to the analytes, if they are present in the sample E, to form complexes.
  • the method comprises, before or after the bringing together step, the application of the liquid sample E on or in the analysis medium 1.
  • the porous nature of the substrate forming this medium promotes natural or else forced flow. , depending on the nature of the medium, the solution and the migration of the complexes, of the reference agents R, of the unbound T test agents towards the capture zone le.
  • the first capture agents C1 bind to the complexes which they selectively retain in this zone.
  • the unbound T test agents are not retained by the first C1 capture agents, or even by the second C2 capture agents immobilized in this zone le. They therefore continue their migrations towards the garbage zone ld of strip 1 or evacuated from the column.
  • the second capture agents C2 selectively retain the reference agents R in the capture zone le, that is to say that only the reference agents R are retained by the second capture agents C2.
  • a measurement step is implemented aimed at obtaining the combined superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first type M1 (associated with the complexes) and of the second type M2 microbeads (associated with the microbeads. reference agents R) placed in the capture area on.
  • a measuring device of the type described in the European document cited in the introduction to this application. This device makes it possible to estimate, in the form of a measurement vector, the second derivative of the relation f linking the excitation magnetic field H and the magnetic induction B in the superparamagnetic material.
  • the establishment of the sensitivity function (the second derivative of the function f connecting the excitation field H to the magnetic induction B) by the measuring device forms the preferred mode of implementation.
  • the analysis medium 1 is placed in this measuring device so that the capture zone is placed in a measuring coil of this device, or near such a coil, and within the measurement perimeter of the device so as to be fully exposed to the magnetic fields produced.
  • the capture zone is exposed to an excitation magnetic field comprising a first frequency (for example a relatively low frequency), a second frequency different from the first (for example a relatively high frequency) and also comprising a substantially constant component allowing to fix the average intensity of the field.
  • This exposure is repeated successively for different constant components of the excitation field so as to expose the capture zone to a plurality of excitation fields of varied and distinct mean intensities.
  • these excitation fields are controlled by the intensity and frequency of currents at the first, at the second frequency and by a constant current injected into a measuring circuit (including the measuring coil) of the measuring device.
  • a voltage an electromotive force
  • this mixing frequency being a linear combination of the first and second frequencies of the excitation field.
  • the value of this component is related (proportional) to the amount of superparamagnetic material present in the H field produced by the measuring coil, i.e. to the respective masses of the superparamagnetic nanoparticles present in the first and second microbeads. second types.
  • the combined magnetic response of the microbeads of the first type M1 and of the microbeads of the second type M2 present in the capture zone Ic is measured for each magnetic field of excitation H.
  • FIG. 4 shows the superparamagnetic characteristic of a capture zone le of an analysis medium 1 for samples E comprising increasing quantities of d 'analytes E (and therefore magnetic microbeads of the first type M1).
  • the abscissa axis of this graph corresponds to the direct current Idc injected into the measuring circuit of the measuring device, it is representative of the average intensity of the excitation field H to which the capture zone the was exposed during measurement.
  • the ordinate axis corresponds to the voltage component U sampled by the measuring circuit at the mixing frequency. This measurement, at each given direct current value Idc, is proportional to the quantity of magnetic mass present in the capture zone le.
  • the microbeads of the first type M1 comprise Fe304 nanoparticles with a diameter of 7 nm and the second type of microbeads M2 comprising the same natures of nanoparticles with a diameter of 10 nm.
  • the sensitivity functions (the function f '') of these microbeads are those represented in FIG. 2, already commented on.
  • the superparamagnetic characteristic of the capture zone combines the superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first type M1 and the superparamagnetic characteristic of the microbeads of the second type M2 in their respective proportions.
  • a measurement vector Vm representative of the combined superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first and of the second type M1 is available, M2 arranged in the measuring perimeter of the measuring device (and therefore in the capture zone le).
  • this measurement vector Vm is used to determine the absolute or relative quantity of microbeads of first type M1 and of microbeads of second type M2.
  • the measurement vector Vm is exploited by comparing it with a base of standard vectors Vij, a standard vector of index i, j having been obtained using the measuring device for a known quantity of Ni microspheres of the first type M1 and of Nj microbeads of the second type M2, arranged in the measurement perimeter.
  • the comparison therefore seeks to identify the standard vector closest to the measurement vector Vm, i.e. to identify the indices i *, j * which minimize the norm (Vm-Vij) for any pair (i, j ) indexing the base of standard vectors.
  • the amounts of microbeads of the first type M1 and of microbeads of the second type M2 are then respectively provided by the amounts Ni * and Nj * associated with the vector Vi * j * in the vector base.
  • Vm ml * Sl + m2 * S2.
  • Both of these approaches have the advantage of providing an absolute quantity of microbeads of the first type M1 and of microbeads of the second type M2.
  • the quantity of second type M2 microbeads (associated, for the record, with a reference agent R) can be used, if it exceeds a predetermined threshold, as an indicator of the good migration of this agent R, and thus validate the correct progress of the immunological test.
  • the quantity of microbeads of the first type M1 (associated for the record with the test agents T) can make it possible to quantify the presence of the analyte A in the sample E.
  • FIG. 5 illustrates the effect of this variability on the superparamagnetic characteristic recorded by the measuring device.
  • the slope p0 corresponds to the ratio Ul / Il, where II is the current injected into the measuring circuit making it possible to obtain the voltage peak U1 associated with the superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first type M1. It is therefore the slope connecting the origin to a first peak of the magnetic response combined, this first peak being associated with the microbeads of the first type M1.
  • the slope pref corresponds to the ratio Uref / Iref, where Iref is the current injected into the measuring circuit making it possible to obtain the voltage peak Uref associated with the superparamagnetic characteristic of the second type M2 microbeads. It is therefore the slope connecting the origin to a second peak of the magnetic response combined with the second type M2 microbeads at the origin.
  • this processing may require reconstituting the sensitivity function f '' by interpolation of the measurement points forming the measurement vector Vm. In this way, it is possible to reconstitute a readjusted measurement vector, exhibiting a standard cardinality.
  • the measurement method can be applied more generally to simultaneously measure the magnetic masses of a plurality of firsts and of a plurality of. second superparamagnetic nanoparticles with different characteristics.
  • This method implements a step aiming to successively expose the first and second nanoparticles to a plurality of magnetic fields of distinct mean strengths, to measure their combined magnetic responses and to form a measurement vector. It then implements a step aimed at processing this measurement vector to determine the masses magnetic pluralities of the first and second superparamagnetic nanoparticles.

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Abstract

The invention relates to an analytical medium (1) for immunoassay comprising a substrate for promoting the natural or forced flow of a liquid sample (E) likely to comprise analytes (A), the substrate having a capture zone (1c), the analytical medium (1) being characterised in that the capture zone (1c) comprises, immobilised on or in the substrate, a plurality of first capture agents (C1) capable of selectively retaining complexes bound to the analytes (A) and a plurality of second capture agents (C2) capable of selectively retaining reference agents. The invention also relates to a method for detecting the presence of analytes (A) in a liquid sample (E) using this analytical medium (1).

Description

MILIEU D'ANALYSE POUR DOSAGE IMMUNOLOGIQUE ET PROCEDE DE DETECTION D'ANALYTES DANS UN TEL MILIEU ANALYSIS MEDIUM FOR IMMUNOLOGICAL ASSAY AND METHOD FOR DETECTION OF ANALYTES IN SUCH A MEDIUM
DOMAINE DE L' INVENTION FIELD OF THE INVENTION
La présente invention concerne la détection de la présence d'analytes dans un échantillon liquide à l'aide de microbilles magnétiques. Elle concerne également un milieu d'analyse pour la détection des analytes dans l'échantillon permettant de mettre en œuvre ce procédé. L'invention trouve son application dans le domaine du dosage immunologique. The present invention relates to the detection of the presence of analytes in a liquid sample using magnetic microbeads. It also relates to an analysis medium for the detection of the analytes in the sample making it possible to implement this method. The invention finds its application in the field of immunological assay.
Plus généralement, l'invention concerne un procédé de mesures simultanées des masses respectives d'une première et d'une deuxième pluralité de nanoparticules superparamagnétiques, les nanoparticules de la première et de la deuxième pluralités présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes. More generally, the invention relates to a method for simultaneously measuring the respective masses of a first and a second plurality of superparamagnetic nanoparticles, the nanoparticles of the first and of the second pluralities having different superparamagnetic characteristics.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE DE L' INVENTION TECHNOLOGICAL BACKGROUND OF THE INVENTION
Dans le domaine du dosage immunologique, et comme cela est par exemple divulgué par le document de Huang, Zhen, et al. "Application and development of superparamagnetic nanoparticles in sample pretreatment and immunochromatographic assay. " TrAC Trends in Analytical Chemistry 114 (2019): 151-170 il est courant d'employer un milieu d'analyse permettant la détection d'un analyte, voire même la mesure de sa quantité ou de sa concentration, par exemple par écoulement naturel latéral d'un échantillon liquide sur une bandelette de test ou par écoulement forcé à travers une colonne comprenant un matériau poreux. Ainsi, et en référence aux figures la, lb, une bandelette de test 1 de l'état de la technique comprend un substrat formé d'une matière, par exemple poreuse, permettant par capillarité de favoriser l'écoulement de l'échantillon liquide E susceptible de contenir les analytes A. Cet échantillon E est déversé sur une zone de réception la pour imprégner le substrat et s'écoule latéralement à partir de la zone de réception la de l'échantillon 1. Des agents marqués magnétiquement 2 (comprenant par exemple des anticorps aptes à se lier aux analytes) sont disposés au niveau de la zone de réception la ou à proximité de cette zone afin de se dissoudre dans l'échantillon E, se lier aux analytes A et former des complexes analyte-agent marqués magnétiquement. In the field of immunoassay, and as is for example disclosed by the document of Huang, Zhen, et al. "Application and development of superparamagnetic nanoparticles in sample pretreatment and immunochromatographic assay." TrAC Trends in Analytical Chemistry 114 (2019): 151-170 It is common practice to use an analysis medium allowing the detection of an analyte, or even the measuring its quantity or concentration, for example by natural lateral flow of a liquid sample on a test strip or by forced flow through a column comprising a porous material. Thus, and with reference to Figures la, lb, a test strip 1 of the state of the art comprises a substrate formed of a material, for example porous, allowing by capillarity to promote the flow of the liquid sample E capable of containing the analytes A. This sample E is poured onto a reception zone 1a to impregnate the substrate and flows laterally from the reception zone 1a of sample 1. Magnetically labeled agents 2 (comprising for example antibodies capable of binding to the analytes) are arranged at or near the reception zone la or near this zone in order to dissolve in the sample E, to bind to the analytes A and to form magnetically labeled analyte-agent complexes.
La bandelette de test 1 formant le milieu d'analyse comprend également une zone de capture le où résident des agents de capture 3 immobilisés, typiquement les mêmes anticorps que ceux compris dans les agents marqués magnétiquement 2. Les complexes et les agents marqués magnétiquement 2 et non liés migrent de la zone de réception la vers la zone de capture le et parcourent une zone intermédiaire de migration lb. The test strip 1 forming the analysis medium also comprises a capture zone where there reside immobilized capture agents 3, typically the same antibodies as those included in the magnetically labeled agents 2. The complexes and the magnetically labeled agents 2 and unbound migrate from the reception area 1a to the capture area 1c and travel through an intermediate migration area 1b.
Les complexes sont sélectivement retenus par les agents de capture 3 au niveau de la zone de capture le. Les agents marqués magnétiquement 2 et non liés à des analytes A poursuivent leur migration au-delà de cette zone. La détection des agents marqués magnétiquement 2 et liés à des analytes A dans la zone de capture le fournit indirectement un moyen de détecter la présence des analytes A dans l'échantillon. The complexes are selectively retained by the capture agents 3 at the capture zone le. The agents magnetically labeled 2 and not bound to analytes A continue their migration beyond this zone. Detection of agents magnetically labeled 2 and bound to analytes A in the capture zone indirectly provides a means of detecting the presence of analytes A in the sample.
La bandelette de test 1 comprend également une zone de contrôle ld disposée en aval de la zone de capture le dans le sens de l'écoulement de l'échantillon E, et sur laquelle résident, immobilisés, des agents de contrôle 4. Ces agents 4 sont configurés pour se lier aux agents marqués magnétiquement 2 et non liés à des analytes A pour les retenir dans la zone de contrôle ld. The test strip 1 also comprises a control zone ld disposed downstream of the capture zone the in the direction of the flow of the sample E, and on which reside, immobilized, control agents 4. These agents 4 are configured to bind to magnetically labeled agents 2 and not bound to analytes A to retain them in the control zone ld.
La détection des agents marqués magnétiquement 2 dans la zone de contrôle ld fournit des moyens permettant d'indiquer que le test s'est déroulé convenablement, c'est-à-dire que l'échantillon E s'est bien écoulé de la zone de réception la jusqu'à la zone de capture le. Detection of magnetically labeled agents 2 in control area 1d provides a means of indicating that the test has proceeded properly, i.e. that sample E has flowed from the control area well. reception on to capture area on.
Comme on l'a déjà énoncé, le milieu d'analyse peut alternativement être formé d'une colonne emplie d'un matériau poreux dans lequel sont greffés les agents de capture 3. Dans ce mode de mise en œuvre du dosage immunologique, la migration des complexes et des agents marqués magnétiquement 2 et non liés est provoquée en forçant l'écoulement de l'échantillon E à travers le matériau poreux de la colonne. Il est intéressant de constater que, dans ce cas, il n'y a pas de possibilité de réaliser de zone de contrôle. As has already been stated, the analysis medium can alternatively be formed of a column filled with a porous material into which the capture agents 3 are grafted. In this embodiment of the immunological assay, the migration magnetically labeled and unbound complexes and agents 2 is caused by forcing the flow of sample E through the porous material of the column. It is interesting to note that, in this case, there is no possibility of creating a control zone.
Quel que soit le mode de mise en œuvre choisi, bandelette ou colonne de test, les agents marqués magnétiquement 2 sont usuellement formés de microbilles magnétiques de dimensions micrométriques comprenant des nanoparticules superparamagnétiques. Les microbilles sont fonctionnalisées (par exemple avec des anticorps) pour se lier à des analytes A de l'échantillon. Les nanoparticules sont de dimensions nanométriques (c'est-à-dire dont le grand diamètre est compris entre quelques nanomètres et quelques dizaines de nanomètres), par exemple des particules de Fe, de Ni ou de Co ou d'autres mélanges. Ces particules peuvent être incorporées à l'aide d'un liant dans les microbilles magnétiques. Whatever the mode of implementation chosen, test strip or column, the magnetically labeled agents 2 are usually formed of magnetic microbeads of micrometric dimensions comprising superparamagnetic nanoparticles. The microbeads are functionalized (eg with antibodies) to bind to analytes A in the sample. The nanoparticles are of nanometric dimensions (that is to say, the large diameter of which is between a few nanometers and a few tens of nanometers), for example particles of Fe, Ni or Co or other mixtures. These particles can be incorporated with the aid of a binder in the magnetic microbeads.
Les matériaux superparamagnétiques qui entrent dans la constitution des microbilles ont la particularité de présenter un cycle magnétique B (H) non linéaire lorsque le champ magnétique d'excitation H varie sur une plage suffisamment étendue. B désigne l'induction magnétique dans le matériau provoqué par ce champ H. Elles présentent également l'avantage de ne pas avoir de rémanence, c'est-à-dire que B(0)=0. The superparamagnetic materials which enter into the constitution of the microbeads have the particularity of presenting a nonlinear magnetic cycle B (H) when the excitation magnetic field H varies over a sufficiently wide range. B designates the magnetic induction in the material caused by this field H. They also have the advantage of not having remanence, that is to say that B (0) = 0.
Pour détecter la présence ou l'absence d'analytes A dans l'échantillon, on utilise un dispositif de mesure apte à repérer la présence des nanoparticules superparamagnétiques, voire même à estimer la quantité présente de nanoparticules. On procède pour cela à deux mesures successives, une première au niveau de la zone de capture le, une deuxième au niveau de la zone de contrôle ld lorsque celle-ci existe. A l'aide du résultat de ces mesures, on est capable de vérifier que le test immunologique s'est déroulé convenablement (détection d'un signal au niveau de la zone de contrôle ld) et de déterminer la présence ou l'absence d'analytes A dans l'échantillon analysé (présence ou absence d'un signal au niveau de la zone de capture le). To detect the presence or absence of analytes A in the sample, a measuring device capable of detecting the presence of superparamagnetic nanoparticles, or even of estimating the quantity of nanoparticles present, is used. To do this, two successive measurements are carried out, a first at the level of the capture zone le, a second at the level of the control zone ld when the latter exists. Using the result of these measurements, it is possible to verify that the immunological test was carried out correctly (detection of a signal at the level of the control zone ld) and to determine the presence or absence of analytes A in the sample analyzed (presence or absence of a signal at the level of the capture zone le).
Pour procéder à ces mesures, on peut employer un dispositif de mesure exploitant la non-linéarité du cycle magnétique des nanoparticules incorporées dans les microbilles, par exemple conforme à celui décrit dans le document EP3314248. Ce dispositif permet notamment d'estimer les quantités de matériaux superparamagnétiques respectivement présentes dans les zones de contrôle ld et de capture le, au cours de deux étapes séparées de mesure. To carry out these measurements, it is possible to use a measuring device exploiting the non-linearity of the magnetic cycle of the nanoparticles incorporated in the microbeads, for example in accordance with that described in document EP3314248. This device makes it possible in particular to estimate the quantities of superparamagnetic materials respectively present in the control ld and capture zones le, during two separate measurement steps.
Ce dispositif comprend quatre bobines arrangées dans un circuit de mesure, dont une bobine de mesure dans laquelle on place la zone de la bandelette de test 1 que l'on souhaite évaluer. This device comprises four coils arranged in a measuring circuit, including a measuring coil in which the area of the test strip 1 that is to be evaluated is placed.
Les quatre bobines sont disposées électriquement en série et sont identiques les unes aux autres. Les bobines sont traversées par des courants à haute fréquence (HF), à basse fréquence (BF) et continu (DC) selon une configuration bien précise visant à développer un champ magnétique différent dans chacune des bobines. On expose le matériau superparamagnétique à un champ magnétique haute et basse fréquences et, du fait du comportement non linéaire du matériau, la réponse à cette excitation contient des composantes à des fréquences qui sont des combinaisons linéaires des fréquences d'excitation. Le document prévoit de procéder à la mesure d'une composante de tension de mesure à une fréquence correspondant par exemple à la fréquence HF - BF et/ou HF + BF. Cette composante devient proportionnelle à la quantité de matériau superparamagnétique disposée dans la bobine de mesure lorsque l'on applique en plus une composante continue. Cette quantité s'inverse lorsque l'on inverse la composante continue, ce qui permet d'améliorer le rapport signal sur bruit de la mesure lorsque l'on réalise une séquence d'excitation avec plusieurs valeurs de composante continue (en général à valeur moyenne nulle). The four coils are electrically arranged in series and are identical to each other. The coils are crossed by high frequency (HF), low frequency (LF) and continuous (DC) currents according to a very precise configuration aimed at developing a different magnetic field in each of the coils. The superparamagnetic material is exposed to a high and low frequency magnetic field and, due to the nonlinear behavior of the material, the response to this excitation contains components at frequencies which are linear combinations of the excitation frequencies. The document provides for the measurement of a measurement voltage component at a frequency corresponding for example to the HF - LF and / or HF + LF frequency. This component becomes proportional to the quantity of superparamagnetic material placed in the measuring coil when a DC component is also applied. This quantity is reversed when the DC component is inverted, which makes it possible to improve the signal-to-noise ratio of the measurement when an excitation sequence is carried out with several DC component values (generally at an average value nothing).
Après avoir convenablement placé le milieu d'analyse dans (ou à proximité) de la bobine de mesure, on reproduit une pluralité de mesures d'une force électromotrice prélevée dans le circuit de mesure. Cette pluralité de mesures est indexée par les valeurs de courant continu distinctes injecté dans le circuit de mesure. Ces mesures sont alors combinées pour former un vecteur de mesure. Ce vecteur est lui-même combiné à un vecteur de signature d'une masse magnétique étalon pour estimer la masse de matière superparamagnétique présente dans un périmètre de mesure du dispositif. Cette combinaison peut notamment mettre en œuvre un produit scalaire des deux vecteurs. After having suitably placed the analysis medium in (or near) the measuring coil, a plurality of measurements of an electromotive force taken from the measuring circuit are reproduced. This plurality of measurements is indexed by the distinct direct current values injected into the measurement circuit. These measurements are then combined to form a measurement vector. This vector is itself combined with a signature vector of a standard magnetic mass in order to estimate the mass of superparamagnetic material present in a measurement perimeter of the device. This combination can in particular implement a scalar product of the two vectors.
Cet état de la technique présente plusieurs limitations. Lorsque le milieu d'analyse est formé d'une colonne emplie d'un matériau poreux, il n'est généralement pas possible de vérifier le bon déroulement du test par une mesure au niveau d'une zone de contrôle. Cette absence de validation du test est désavantageuse . This state of the art has several limitations. When the analysis medium is formed from a column filled with a porous material, it is generally not possible to verify the correct progress of the test by measuring at a control zone. This lack of validation of the test is disadvantageous.
Lorsqu'une telle zone de contrôle existe, comme cela peut être le cas d'un milieu d'analyse se présentant sous la forme d'une bandelette permettant la migration latérale de l'échantillon, son exploitation nécessite de procéder à deux mesures successives, l'une au niveau de la zone de capture le et l'autre niveau de la zone de contrôle ld. Cette duplication de la mesure nécessite de déplacer manuellement la bandelette de test relativement au dispositif de mesure ou d'équiper celui-ci d'un réceptacle mobile de la bandelette. Dans tous les cas, cette exigence ralentit l'obtention du résultat du test immunologique. De plus, la mesure est très sensible à la distance séparant la zone de mesure de la bobine de mesure, ce qui impose de contrôler très précisément et répétablement la position de la bandelette. When such a control zone exists, as may be the case with an analysis medium in the form of a strip allowing lateral migration of the sample, its use requires two successive measurements to be carried out, one at the level of the capture zone and the other at the level of the control zone ld. This duplication of the measurement requires manually moving the test strip relative to the measuring device or equipping the latter with a mobile receptacle for the strip. In any case, this requirement slows down the achievement of the immunoassay result. In addition, the measurement is very sensitive to the distance separating the measurement zone from the measurement coil, which makes it necessary to control the position of the strip very precisely and repeatedly.
Lorsque le dispositif de mesure est exploité pour fournir une estimation de la masse magnétique présente dans la zone de capture le et ainsi estimer la quantité d'analytes A dans l'échantillon E, le résultat fourni est parfois imprécis. Cela tient du fait que la quantité d'agents marqués magnétiquement 2 initialement présente dans l'échantillon E est généralement mal connue. Certains de ces agents 2 peuvent par ailleurs s'accrocher dans la zone de migration et ne pas atteindre la zone de capture le et/ou la zone de contrôle ld. De plus, les propriétés magnétiques des microbilles ainsi que les phénomènes de migration varient assez fortement en fonction de la température. When the measuring device is used to provide an estimate of the magnetic mass present in the capture zone le and thus estimate the quantity of analytes A in the sample E, the result provided is sometimes imprecise. This is due to the fact that the quantity of magnetically labeled agents 2 initially present in sample E is generally not well known. Some of these agents 2 can moreover cling to the migration zone and not reach the capture zone le and / or the control zone ld. In addition, the magnetic properties of the microbeads as well as the migration phenomena vary quite strongly as a function of the temperature.
En conséquence, la mesure de la masse magnétique absolue présente dans la zone de capture le est une information gu'il est peu fiable d'exploiter, dans les solutions de l'état de la technique, pour estimer la quantité ou la concentration d'analytes A dans l'échantillon E. Consequently, the measurement of the absolute magnetic mass present in the capture zone le is information that it is of little reliable to use, in the solutions of the state of the art, to estimate the quantity or the concentration of analytes A in the sample E.
OBJET DE L' INVENTION OBJECT OF THE INVENTION
Un but de l'invention est de remédier à une partie au moins des inconvénients précités. An object of the invention is to remedy at least part of the aforementioned drawbacks.
BREVE DESCRIPTION DE L' INVENTION BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
En vue de la réalisation de ce but, et selon un premier aspect, l'objet de l'invention propose un milieu d'analyse pour dosage immunologique comprenant un substrat pour favoriser l'écoulement naturel ou forcé d'un échantillon liquide susceptible de comporter des analytes, le substrat présentant une zone de capture. With a view to achieving this aim, and according to a first aspect, the object of the invention provides an analysis medium for immunological assay comprising a substrate for promoting the natural or forced flow of a liquid sample capable of comprising analytes, the substrate having a capture zone.
Selon l'invention, la zone de capture comprend, immobilisées sur ou dans le substrat, une pluralité de premiers agents de capture apte à sélectivement retenir des complexes liés aux analytes et une pluralité de deuxièmes agents de capture apte à sélectivement retenir des agents de référence. According to the invention, the capture zone comprises, immobilized on or in the substrate, a plurality of first capture agents capable of selectively retaining complexes bound to the analytes and a plurality of second capture agents capable of selectively retaining reference agents. .
Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives de l'invention, prises seules ou selon toute combinaison techniquement réalisable : According to other advantageous and non-limiting characteristics of the invention, taken alone or in any technically feasible combination:
- le substrat comprend également, en amont de la zone de capture dans le sens de l'écoulement, une pluralité d'agents de test marqués d'un premier type de microbilles magnétiques, les agents de test étant aptes à se lier aux analytes, et une pluralité d'agents de référence marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques, le premier type de microbilles magnétiques et le deuxième type de microbilles magnétiques ayant des propriétés superparamagnétiques différentes ; - The substrate also comprises, upstream of the capture zone in the direction of flow, a plurality of test agents marked with a first type of magnetic microbeads, the test agents being able to bind to the analytes, and a plurality of reference agents labeled with a second type of magnetic microbead, the first type of magnetic microbead and the second type of magnetic microbead having different superparamagnetic properties;
- les premiers agents de capture sont respectivement associés à des complexes comprenant des analytes et des agents de test marqués d'un premier type de microbilles magnétiques, et les deuxièmes agents de capture sont associés à des agents de référence marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques, le premier type de microbilles magnétiques et le deuxième type de microbilles magnétiques ayant des propriétés superparamagnétiques différentes ; - the first capture agents are respectively associated with complexes comprising analytes and test agents labeled with a first type of magnetic microbeads, and the second capture agents are associated with reference agents labeled with a second type of magnetic microbeads, the first type of magnetic microbeads and the second type of magnetic microbeads having different superparamagnetic properties;
- le substrat est formé d'un matériau poreux ; le substrat se présente sous la forme d'une bandelette ; le substrat se présente sous la forme d'une quantité de matériau disposé dans une colonne. - the substrate is formed from a porous material; the substrate is in the form of a strip; the substrate is in the form of a quantity of material arranged in a column.
Selon un autre aspect, l'invention propose un procédé de détection de la présence d'analytes dans un échantillon liquide, le procédé comprenant les étapes suivantes : According to another aspect, the invention provides a method for detecting the presence of analytes in a liquid sample, the method comprising the following steps:
- mettre l'échantillon en présence d'agents de test marqués d'un premier type de microbilles magnétiques, les agents de test étant aptes à se lier aux analytes, et d'agents de référence marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques, les premier et deuxième types de microbilles magnétiques présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes ; - put the sample in the presence of test agents labeled with a first type of magnetic microbeads, the test agents being able to bind to the analytes, and reference agents labeled with a second type of magnetic microbeads, the first and second types of magnetic microbeads having different superparamagnetic characteristics;
- appliquer l'échantillon à un milieu d'analyse avant ou après l'étape de mise en présence ; - apply the sample to an analysis medium before or after the bringing together step;
- sélectivement retenir sur ou dans une zone de capture du milieu d'analyse une partie au moins des agents de test liés aux analytes et des agents de référence par l'intermédiaire, respectivement, d'une pluralité de premiers agents de capture et d'une pluralité de deuxièmes agents de capture ; - selectively retain on or in a capture zone of the analysis medium at least part of the test agents linked to the analytes and of the reference agents via the intermediary, respectively, a plurality of first capture agents and a plurality of second capture agents;
- successivement exposer la zone de capture à une pluralité de champs magnétiques d'excitation d'intensités moyennes distinctes, mesurer la réponse magnétique combinée des microbilles du premier type et des microbilles du deuxième type présent dans la zone de capture pour chaque champ magnétique d'excitation et ainsi former un vecteur de mesure ; - successively expose the capture zone to a plurality of excitation magnetic fields of distinct mean intensities, measure the combined magnetic response of the microspheres of the first type and of the microspheres of the second type present in the capture zone for each magnetic field of excitation and thus form a measurement vector;
- traiter le vecteur de mesure pour déterminer la quantité absolue ou relative de microbilles du premier type et des microbilles du deuxième type. - process the measurement vector to determine the absolute or relative quantity of microbeads of the first type and of microbeads of the second type.
Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives de l'invention, prises seules ou selon toute combinaison techniquement réalisable : According to other advantageous and non-limiting characteristics of the invention, taken alone or in any technically feasible combination:
- la réponse magnétique combinée correspond à la dérivée seconde de la fonction reliant le champ d'excitation à l'induction magnétique des microbilles du premier type et des microbilles du deuxième type ; the combined magnetic response corresponds to the second derivative of the function connecting the excitation field to the magnetic induction of the microspheres of the first type and of the microbeads of the second type;
- l'étape de traitement du vecteur de mesure comprend une recherche, dans une base de vecteurs étalons, d'un vecteur étalon le plus proche du vecteur de mesure, chaque vecteur étalon de la base étant associé à une quantité connue de microbilles du premier type et de microbilles du deuxième type ; the step of processing the measurement vector comprises a search, in a base of standard vectors, for a standard vector closest to the measurement vector, each standard vector of the base being associated with a known quantity of microbeads of the first type and microbeads of the second type;
- l'étape de traitement du vecteur de mesure comprend la recherche numérique des masses magnétiques respectives des nanoparticules composant les microbilles de chaque type ; l'étape de traitement comprend le repérage d'un premier pic et d'un deuxième pic de la réponse magnétique respectivement associés aux microbilles du premier type et aux microbilles du deuxième type pour déterminer les pentes reliant le premier pic et le deuxième pic à l'origine ; l'étape de traitement comprend le recalage de la réponse magnétique combinée pour faire correspondre un deuxième pic de cette réponse associé aux microbilles du deuxième type à un pic de référence de la signature des microbilles de deuxième type ou des vecteurs étalons. the step of processing the measurement vector comprises the digital search for the respective magnetic masses of the nanoparticles making up the microbeads of each type; the processing step comprises the identification of a first peak and of a second peak of the magnetic response respectively associated with the microbeads of the first type and with microbeads of the second type to determine the slopes connecting the first peak and the second peak at the origin; the processing step comprises the readjustment of the combined magnetic response in order to make a second peak of this response associated with the microbeads of the second type correspond to a reference peak of the signature of the microbeads of the second type or of the standard vectors.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée de l'invention qui va suivre en référence aux figures annexées sur lesquels : Other characteristics and advantages of the invention will emerge from the detailed description of the invention which will follow with reference to the appended figures in which:
- Les figures la et lb représentent un milieu d'analyse de l'état de la technique respectivement avant et après son emploi ; - Figures la and lb represent an analysis medium of the state of the art before and after its use, respectively;
- La figure 2 représente la dérivée seconde de la relation liant un champ magnétique d'excitation à l'induction magnétique provoqué par ce champ dans deux matériaux superparamagnétiques ayant des propriétés différentes ; FIG. 2 represents the second derivative of the relation linking an excitation magnetic field to the magnetic induction caused by this field in two superparamagnetic materials having different properties;
- Les figures 3a et 3b représentent un milieu d'analyse conforme à un mode de mise en œuvre de l'invention respectivement avant et après son emploi ; FIGS. 3a and 3b represent an analysis medium in accordance with an embodiment of the invention, before and after its use, respectively;
- La figure 4 représente la caractéristique superparamagnétique d'une zone de capture le d'un milieu d'analyse 1 pour des échantillons E comprenant des quantités croissantes d'analytes A ; - La figure 5 représente l'effet de la variabilité de la distance sur la caractéristique superparamagnétique relevé par un dispositif de mesure. FIG. 4 represents the superparamagnetic characteristic of a capture zone Ia of an analysis medium 1 for samples E comprising increasing amounts of analytes A; FIG. 5 represents the effect of the variability of the distance on the superparamagnetic characteristic recorded by a measuring device.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L' INVENTION DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Par souci de simplification de la description à venir, les mêmes références sont utilisées pour des éléments identiques ou assurant la même fonction dans l'état de la technique ou dans les différents modes de mise en œuvre de l'invention. For the sake of simplification of the description to come, the same references are used for elements which are identical or perform the same function in the state of the art or in the various embodiments of the invention.
Microbilles du premier et du deuxième type. Microbeads of the first and second type.
D'une manière générale, les principes qui sous-tendent l'invention consistent à employer sur ou dans le milieu d'analyse 1 deux types différents de microbilles, c'est-à-dire des microbilles présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes. Ces microbilles seront respectivement désignées microbilles du premier type Ml et microbilles du deuxième type M2. In general, the principles underlying the invention consist in using on or in the analysis medium 1 two different types of microbeads, that is to say microbeads having different superparamagnetic characteristics. These microbeads will be respectively designated microbeads of the first type M1 and microbeads of the second type M2.
Comme cela a déjà été évoqué en introduction de cette demande, ces microbilles du premier type Ml et du deuxième type M2 sont formées d'un liant incorporant des nanoparticules superparamagnétiques. Chaque type de microbilles Ml, M2 contient une quantité fixe, d'une microbille à l'autre, de nanoparticules superparamagnétiques. Les microbilles Ml du premier type sont fonctionnalisées (par exemple par des anticorps choisis pour être aptes à se lier aux analytes A de l'échantillon E qui sera soumis au test) et ainsi former des agents de test T. Les microbilles de deuxième type M2 sont quant à elles fonctionnalisées pour prévenir cette liaison (ou de manière plus générale, prévenir toute liaison avec toute forme d'analyte si plusieurs types d'analytes sont susceptibles d'être présents dans l'échantillon E) et ainsi former des agents de référence R. Pour le dire autrement, les agents de référence R sont donc inaptes à former des complexes avec des analytes. As has already been mentioned in the introduction to this application, these microbeads of the first type M1 and of the second type M2 are formed from a binder incorporating superparamagnetic nanoparticles. Each type of microbeads M1, M2 contains a fixed amount, from one microbead to another, of superparamagnetic nanoparticles. The M1 microbeads of the first type are functionalized (for example by antibodies chosen to be able to bind to the analytes A of the sample E which will be subjected to the test) and thus form test agents T. The second type M2 microbeads are functionalized to prevent this binding (or more generally, prevent any binding with any form of analyte if several types of analytes are likely to be present in the sample E) and thus form reference agents R. In other words, the reference agents R are therefore incapable of forming complexes with analytes.
Les microbilles du premier type et du deuxième type Ml, M2 présentent des caractéristiques superparamagnétiques bien déterminées. Par « caractéristique superparamagnétique », on désigne la relation ou le graphe liant un champ magnétique d'excitation H de ces nanoparticules à l'induction magnétique B dans le matériau provoqué par ce champ H, B=f(H), ou à la dérivée première, seconde ou troisième de cette relation. Un tel graphe de la fonction f, cette fonction elle-même (ou l'une de ses dérivées) forme en quelque sorte une signature unique de la caractéristique superparamagnétique d'un type de microbille. The microbeads of the first type and of the second type M1, M2 exhibit well-defined superparamagnetic characteristics. The term “superparamagnetic characteristic” denotes the relation or the graph linking an excitation magnetic field H of these nanoparticles to the magnetic induction B in the material caused by this field H, B = f (H), or to the derivative first, second or third of this relation. Such a graph of the function f, this function itself (or one of its derivatives) forms in a way a unique signature of the superparamagnetic characteristic of a type of microbead.
Selon un aspect important de la présente description, les caractéristiques superparamagnétiques du premier type Ml et du deuxième type M2 de microbilles sont distinctes l'une de l'autre. En d'autres termes, soumis à un même champ magnétique d'excitation, l'induction magnétique des nanoparticules des microbilles du premier type Ml et du deuxième type M2 sont distinctes. Les graphes ou les fonctions reliant respectivement pour ces deux types de microbilles le champ H d'excitation à l'induction magnétique B sont différents l'un de l'autre. According to an important aspect of the present description, the superparamagnetic characteristics of the first type M1 and of the second type M2 of microbeads are distinct from one another. In other words, subjected to the same magnetic excitation field, the magnetic induction of the nanoparticles of the microbeads of the first type M1 and of the second type M2 are distinct. The graphs or the functions respectively relating, for these two types of microbeads, the excitation field H to the magnetic induction B are different from one another.
Une telle distinction de comportement superparamagnétique peut être obtenue en choisissant pour l'un et l'autre type de microbilles des nanoparticules de natures différentes. Ces nanoparticules peuvent notamment être de compositions chimiques différentes (par exemple des particules de Fe304 dans un cas et de Fe200180 dans l'autre cas). Elles peuvent alternativement présenter des tailles différentes (par exemple présentant un grand diamètre de 7 nm dans un cas et de 10 nm dans l'autre cas). On peut bien entendu également mixer ces propriétés de taille et de nature chimique. Such a distinction of superparamagnetic behavior can be obtained by choosing nanoparticles of different natures for both types of microbeads. These nanoparticles can in particular be of different chemical compositions (for example particles of Fe304 in one case and of Fe200180 in the other case). They may alternatively have different sizes (for example having a large diameter of 7 nm in one case and 10 nm in the other case). These properties of size and chemical nature can of course also be mixed.
On a ainsi respectivement représenté sur la figure 2, les caractéristiques superparamagnétiques respectives de deux types de microbilles, un premier type de microbilles comprenant des nanoparticules de Fe304 de 7nm de diamètre (en traits pointillés) et le deuxième type de microbilles comprenant les mêmes natures de nanoparticules, mais cette fois de 10 nm de diamètre (en trait plein). Les courbes représentées sont des courbes de sensibilité, c'est-à-dire de la dérivée seconde de la fonction f liant un champ d'excitation H à l'induction magnétique B des nanoparticules . Thus, FIG. 2 shows the respective superparamagnetic characteristics of two types of microbeads respectively, a first type of microbeads comprising Fe304 nanoparticles of 7 nm in diameter (in dotted lines) and the second type of microbeads comprising the same types of microbeads. nanoparticles, but this time 10 nm in diameter (solid line). The curves shown are sensitivity curves, that is to say of the second derivative of the function f linking an excitation field H to the magnetic induction B of the nanoparticles.
On note que sur la figure 2, les caractéristiques superparamagnétiques des microbilles présentent un aspect général d'arche sinusoïdale similaire. Elles passent l'une et l'autre par le centre du repère et présentent des extrema d'aimantation B+, B- pour des valeurs de champ H+, H-. Toutefois les caractéristiques superparamagnétiques des deux types de microbilles diffèrent grandement l'une de l'autre, notamment par la hauteur des extrema BR+, BR- (pour les microbilles de deuxième type), BT+, BT- (pour les microbilles de premier type) et par les valeurs du champ d'excitation HR+, HR-(pour les microbilles de deuxième type) et Ht+, HT- (pour les microbilles de premier type) à laquelle les nanoparticules doivent être soumises pour atteindre ces extrema. It is noted that in FIG. 2, the superparamagnetic characteristics of the microspheres exhibit a general appearance of a similar sinusoidal arch. They both pass through the center of the frame and have magnetization extrema B +, B- for field values H +, H-. However, the superparamagnetic characteristics of the two types of microbeads differ greatly from one another, in particular by the height of the extrema B R +, B R - (for microbeads of the second type), B T +, B T - (for microbeads of the first type) and by the values of the excitation field H R +, H R - (for the microbeads of the second type) and Ht +, H T - (for the microbeads of the first type) to which the nanoparticles must be submitted to reach these extrema.
Pour des raisons qui deviendront apparentes dans la suite de cette description, on choisira avantageusement les microbilles magnétiques Ml du premier type (qui marqueront magnétiquement des agents de test T) pour que ses caractéristiques superparamagnétiques évoluent sur un intervalle [HT-, HT+] relativement étroit, et on choisira les microbilles magnétiques du deuxième type M2 (formant l'agent de référence R) pour que ses caractéristiques superparamagnétiques évoluent dans un intervalle [HR-, HR+] relativement large. For reasons which will become apparent in the remainder of this description, the magnetic microbeads M1 of the first type (which will magnetically mark test agents T) will advantageously be chosen so that their superparamagnetic characteristics evolve over an interval [H T -, H T + ] relatively narrow, and we will choose the magnetic microbeads of the second type M2 (forming the reference agent R) so that its superparamagnetic characteristics evolve over a relatively wide [H R -, H R +] interval.
De manière générale, lorsque les nanoparticules des microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 diffèrent par leurs tailles, on fera en sorte que celles présentant le plus grand diamètre soient de dimension au moins 20 % plus importante que celles présentant le plus petit diamètre, et avantageusement au moins 30%, voire même plus de 40%. On s'assure ainsi de bien marquer les différences de caractéristiques superparamagnétiques entre ces les deux types de microbilles Ml, M2. In general, when the nanoparticles of the microbeads of the first and second type M1, M2 differ in their sizes, it will be ensured that those having the largest diameter are at least 20% larger in size than those having the smallest diameter. , and advantageously at least 30%, or even more than 40%. It is thus ensured to clearly mark the differences in superparamagnetic characteristics between these two types of microbeads M1, M2.
Lorsque la caractéristique superparamagnétique, représentée dans la figure 2 sous forme de fonctions continues, est échantillonnée en une pluralité de valeurs selon l'axe des abscisses et représentée sous la forme d'un vecteur, on désignera ce vecteur par le terme « signature ». When the superparamagnetic characteristic, represented in FIG. 2 in the form of continuous functions, is sampled in a plurality of values along the abscissa axis and represented in the form of a vector, this vector will be designated by the term “signature”.
1er mode de réalisation du milieu d'analyse - bandelette de test. 1 st embodiment of the analysis medium - test strip.
En référence aux figures 3a, 3b on présente un milieu d'analyse 1 pour une application dans le domaine du dosage immunologique, permettant de mettre en œuvre les principes qui viennent d'être exposés. With reference to FIGS. 3a, 3b, an analysis medium 1 is presented for an application in the field of immunological assay, making it possible to implement the principles which have just been explained.
Le milieu d'analyse 1 est formé dans ce mode de réalisation d'un substrat plan, ici sous la forme d'une bandelette, pour recevoir l'échantillon liquide E au niveau d'une zone de réception la, ici disposée à une extrémité de ce substrat. Le substrat 1 est composé de matière poreuse favorisant l'écoulement latéral de la solution, par capillarité, de la zone de réception la à l'extrémité distale de la bandelette 1. Dans l'exemple représenté, la zone de réception la jouxte une zone sur laquelle sont disposées une pluralité d'agents de test T marqués d'un premier type Ml de microbilles magnétiques et une pluralité d'agent de référence R marqués d'un deuxième type M2 de microbilles magnétiques. The analysis medium 1 is formed in this embodiment of a planar substrate, here in the form of a strip, to receive the liquid sample E at the level of a reception zone la, here arranged at one end of this substrate. The substrate 1 is composed of porous material promoting the lateral flow of the solution, by capillary action, from the reception zone 1a to the distal end of the strip 1. In the example shown, the reception zone adjoins a zone on which are placed a plurality of test agents T marked with a first type M1 of magnetic microbeads and a plurality of reference agent R marked with a second type M2 of magnetic beads.
Les agents de test T sont aptes à se lier aux analytes A de l'échantillon E, dans le cas bien sûr où ces analytes A sont bien présents. Ce n'est pas le cas des agents de référence R. Lorsqu'un agent de test T se lie à un analyte A, ils forment un ensemble désigné « complexe » dans la suite de cette demande, marqué magnétiquement par une microbille Ml du premier type. The test agents T are able to bind to the analytes A of the sample E, in the case of course where these analytes A are indeed present. This is not the case with reference agents R. When a test agent T binds to an analyte A, they form a set referred to as “complex” in the remainder of this application, magnetically labeled with a M1 microbead of the first. type.
Qu'ils soient liés ou non aux analytes A, les agents de test T ainsi que les agents de référence R migrent latéralement, entraînés par le phénomène d'écoulement latéral déjà évoqué, et progressent à travers une zone de migration lb pour atteindre une zone de capture le disposée en aval du milieu d'analyse 1, dans le sens de l'écoulement. Whether or not they are bound to the analytes A, the test agents T as well as the reference agents R migrate laterally, entrained by the phenomenon of lateral flow already mentioned, and progress through a migration zone 1b to reach a zone. of capture the disposed downstream of the analysis medium 1, in the direction of flow.
En alternative à l'exemple représenté sur ces figures dans lequel les agents de tests T et les agents de référence R sont disposés sur le substrat 1 à côté de la zone de réception la, on pourra prévoir de placer ces agents directement sur la zone de réception la ou plus en aval de cette zone, à proximité de la zone de capture le. As an alternative to the example shown in these figures in which the test agents T and the reference agents R are placed on the substrate 1 next to the reception zone 1a, provision may be made to place these agents directly on the zone of. reception the or more downstream of this area, near the capture area on.
On précise également qu'il n'est pas nécessaire que le milieu d'analyse 1 soit originellement muni des agents de référence R et des agents de test T. Ceux-ci peuvent être mélangés préalablement à l'échantillon E avant que celui-ci ne soit déversé sur la zone de réception la de la bandelette de test 1. Dans tous les cas néanmoins, on veillera à mettre l'échantillon en présence des agents de test T et des agents de référence R, que cette mise en présence soit réalisée avant ou après l'imprégnation du milieu d'analyse 1 par l'échantillon E. It is also specified that it is not necessary for the analysis medium 1 to be originally provided with the reference agents R and the test agents T. These can be mixed beforehand with the sample E before the latter. is spilled on the receiving area 1a of the test strip 1. In all cases, however, care should be taken to bring the sample together with the test agents T and the reference agents R, whether this bringing together is carried out before or after the impregnation of the analysis medium 1 by the sample. E.
La zone de capture le du milieu analyse comporte quant à elle une pluralité de premiers agents de capture Cl et une pluralité de deuxièmes agents de capture C2, ces agents étant l'un et l'autre immobilisés sur le substrat. The capture zone 1c of the analysis medium comprises for its part a plurality of first capture agents C1 and a plurality of second capture agents C2, these agents both being immobilized on the substrate.
Les premiers agents de capture Cl sont aptes à sélectivement retenir les complexes formés d'analytes A et d'agents de test T, c'est-à-dire marqués magnétiquement par des microbilles Ml de premier type. Les deuxièmes agents de capture C2 sont quant à eux aptes à sélectivement retenir des agents de référence R, marqués donc par des microbilles M2 du deuxième type. Par « sélectivement », on signifie que ces agents de capture retiennent et immobilisent uniquement les agents pour lesquels ils sont aptes à se lier. The first C1 capture agents are able to selectively retain the complexes formed of analytes A and test agents T, that is to say magnetically labeled with M1 microbeads of the first type. The second capture agents C2 are for their part capable of selectively retaining reference agents R, therefore labeled with M2 microbeads of the second type. By “selectively”, it is meant that these capture agents retain and immobilize only the agents to which they are able to bind.
Selon l'invention, le milieu d'analyse peut ainsi comporter une unique zone de capture le comportant, immobilisés de manière mélangée à la fois la pluralité de premiers agents de capture Cl et la pluralité de deuxièmes agents de capture C2. According to the invention, the analysis medium can thus comprise a single capture zone comprising it, immobilized in a mixed manner both the plurality of first capture agents C1 and the plurality of second capture agents C2.
Pour être complet, on précise que la figure 3a représente un milieu d'analyse 1 conforme à l'invention lors du déversement de l'échantillon E sur le substrat. La figure 3b représente quant à elle ce même milieu 1 après que l'écoulement latéral de l'échantillon E ait provoqué la migration des agents de référence R et de test T vers la zone de capture le. On note que les complexes sont bien retenus au niveau de cette zone de capture le par les premiers agents de capture Cl. Les agents de test T ne s'étant pas liés à des analytes A ont poursuivi leurs migrations vers une zone dite « poubelle » ld du milieu 1. Les agents de référence R sont quant à eux retenus dans la zone de capture le par les deuxièmes agents de capture C2, de manière à saturer ces deuxièmes agents C2 dans cette zone. To be complete, it should be specified that FIG. 3a represents an analysis medium 1 in accordance with the invention during the pouring of the sample E onto the substrate. FIG. 3b represents for its part this same medium 1 after the lateral flow of the sample E has caused the migration of the reference R and test agents T towards the capture zone le. It is noted that the complexes are well retained at the level of this capture zone le by the first capture agents C1. The test agents T not having bound to analytes A continued their migrations towards a so-called “trash” zone ld of the medium 1. The reference agents R are for their part retained in the capture zone Ic by the second capture agents C2, so as to saturate these second agents C2 in this zone.
Dans tous les cas, une telle configuration du milieu d'analyse permet à ce milieu d'être dépourvu de zone de capture. Les témoins de migration sont donc constitués par les agents de référence R marqués par les microbilles M2 du deuxième type et détectés au niveau de la zone de capture le, et non par les agents de test T non liés à des analytes et détectés au niveau d'une zone de contrôle ld comme dans l'état de la technique cité en introduction de la présente description. De la sorte, l'exploitation du milieu d'analyse ne nécessite plus de procéder à deux mesures successives, l'une au niveau de la zone de capture le et l'autre niveau de la zone de contrôle, mais à une unique mesure au niveau de la zone de capture le. In all cases, such a configuration of the analysis medium allows this medium to be devoid of a capture zone. The migration controls therefore consist of the reference agents R labeled with the M2 microbeads of the second type and detected at the level of the capture zone le, and not by the test agents T not bound to analytes and detected at the level of d. a control zone 1d as in the state of the art cited at the beginning of the present description. In this way, the use of the analysis medium no longer requires two successive measurements, one at the level of the capture zone and the other at the level of the control zone, but a single measurement at the capture area level on.
2ème mode de réalisation du milieu d'analyse - colonne de test. 2nd embodiment of the analysis medium - test column.
Selon un mode de réalisation alternatif et non représenté, le milieu d'analyse 1 peut prendre la forme d'une colonne, ouverte à chaque extrémité, et dans laquelle on a disposé un matériau poreux formant substrat. Ce substrat comprend, immobilisés dans au moins une partie de son épaisseur dans la colonne, les premiers et deuxièmes agents de captures Cl, C2. Ces agents de captures Cl, C2 présentent les mêmes propriétés que ceux décrits en relation avec le premier mode de réalisation. La partie d'épaisseur du substrat dans lesquelles sont immobilisés ces agents forme la zone de capture le du milieu d'analyse 1 selon ce mode de réalisation. Cette zone de capture le du milieu d'analyse 1 est donc ici « volumique » par opposition à la zone de capture « surfacique » du premier mode de réalisation. De manière similaire à ce qui a été présenté dans le cadre du premier mode de réalisation, les agents de test T et de référence R peuvent être disposés dans la colonne, en amont de la zone de capture le, avant l'application de l'échantillon E, ou mélangés à cet échantillon E avant de forcer son écoulement à travers le substrat emplissant au moins en partie la colonne. According to an alternative embodiment and not shown, the analysis medium 1 can take the form of a column, open at each end, and in which a porous material forming a substrate has been placed. This substrate comprises, immobilized in at least part of its thickness in the column, the first and second capture agents C1, C2. These capture agents C1, C2 have the same properties as those described in relation to the first embodiment. The thick portion of the substrate in which these agents are immobilized forms the capture zone 1c of the analysis medium 1 according to this embodiment. This capture zone 1c of the analysis medium 1 is therefore here “volume” as opposed to the “surface” capture zone of the first embodiment. Similarly to what has been presented in the context of the first embodiment, the test agents T and reference R can be placed in the column, upstream of the capture zone le, before the application of the. sample E, or mixed with this sample E before forcing its flow through the substrate at least partially filling the column.
Quel que soit la manière avec lequel l'échantillon E est mis en présence avec les agents de test T et de référence R, on cherche à favoriser les liaisons entre les agents de test T et les analytes A. On force ensuite l'écoulement de l'échantillon à travers la colonne et le substrat, pour faire migrer les agents de test T, les complexes, les agents de référence R vers la zone de capture le. On retient sélectivement dans cette zone, à l'aide des agents de capture Cl, C2, les agents de test T liés aux analytes et les agents de référence R. Regardless of the manner in which the sample E is brought into contact with the test agents T and reference R, one seeks to promote the bonds between the test agents T and the analytes A. One then forces the flow of the sample through the column and the substrate, to migrate the T test agents, complexes, R reference agents to the capture zone le. Selectively retained in this zone, using the capture agents C1, C2, the test agents T bound to the analytes and the reference agents R.
La portion du substrat poreux traversé par l'échantillon E et dépourvu d'agent de capture Cl, C2 constitue une zone de migration lb du milieu d'analyse 1, similaire à celui du premier mode de réalisation. Les agents de test T non liés à des analytes, et donc non retenus dans la zone de capture le, sont évacués de la colonne avec le reste de l'échantillon liquide E. The portion of the porous substrate crossed by the sample E and devoid of capture agent C1, C2 constitutes a migration zone lb of the analysis medium 1, similar to that of the first embodiment. The T test agents not bound to analytes, and therefore not retained in the capture zone 1c, are discharged from the column with the remainder of the liquid sample E.
Indépendamment du mode de réalisation choisi pour le milieu d'analyse 1, et avantageusement, la zone de capture le est dimensionnée pour s'inscrire entièrement dans le périmètre de mesure d'un dispositif de mesure. Comme cela sera détaillé par dans la suite, on peut de la sorte procéder en une seule étape (c'est-à-dire sans déplacer le milieu d'analyse 1 vis-à-vis du dispositif de mesure) à une mesure d'un signal visant à déterminer simultanément la présence et/ou la quantité de microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2, c'est-à-dire la présence et/ou la quantité de complexes et d'agents de référence R. Independently of the embodiment chosen for the analysis medium 1, and advantageously, the capture zone 1c is dimensioned to fit entirely within the measurement perimeter of a measuring device. As will be detailed below, it is thus possible to proceed in a single step (that is to say without moving the analysis medium 1 vis-à-vis the measuring device) to a measurement of a signal aiming to simultaneously determine the presence and / or the quantity of microbeads of the first and of the second type M1, M2, that is to say the presence and / or the amount of complexes and reference agents R.
Procédé de détection de la présence d'analytes A dans un échantillon E. Method for detecting the presence of analytes A in a sample E.
On présente maintenant un procédé de détection de la présence d'analytes A dans un échantillon E qui tire profit d'un milieu d'analyse 1 conforme à ceux qui viennent d'être présentés. D'une manière générale, et comme cela est bien connu dans le domaine du dosage immunologique, on cherche à déterminer la quantité de microbilles du premier type Ml associées à des agents de test T pour en déduire la présence d'analytes A. Plus spécifiquement, l'invention cherche à déterminer la quantité absolue ou relative des microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2. Chaque type de microbilles Ml, M2 contient une quantité constante d'une microbille à l'autre de nanoparticules superparamagnétiques, si bien que déterminer la quantité de microbilles d'un type et/ou de l'autre type est équivalent à déterminer la masse de nanoparticules présente dans toutes les microbilles d'un type et/ou de l'autre type. We now present a method for detecting the presence of analytes A in a sample E which takes advantage of an analysis medium 1 in accordance with those which have just been presented. In general, and as is well known in the field of immunological assay, we seek to determine the amount of microbeads of the first type M1 associated with test agents T to deduce the presence of analytes A. More specifically. , the invention seeks to determine the absolute or relative quantity of the microbeads of the first and of the second type M1, M2. Each type of microbeads M1, M2 contains a constant amount from one microbead to another of superparamagnetic nanoparticles, so that determining the amount of microbeads of one type and / or the other type is equivalent to determining the mass of nanoparticles present in all microbeads of one type and / or the other type.
Comme on l'a vu, ce procédé comprend la mise de l'échantillon E en présence d'agents de test T marqués magnétiquement par les microbilles du premier type Ml et en présence d'agents de référence R marqués magnétiquement par les microbilles du deuxième type M2. Ces microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 comprennent des nanoparticules présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes. Cette étape de mise en présence permet notamment de lier les agents de test T aux analytes, s'ils sont présents dans l'échantillon E, pour former des complexes. Le procédé comprend, avant ou après l'étape de mise en présence, l'application de l'échantillon liquide E sur ou dans le milieu d'analyse 1. La nature poreuse du substrat formant ce milieu favorise l'écoulement naturel ou bien forcé, selon la nature du milieu, de la solution et la migration des complexes, des agents de référence R, des agents de tests T non liés vers la zone de capture le. As we have seen, this method comprises placing the sample E in the presence of test agents T magnetically labeled with the microbeads of the first type M1 and in the presence of reference agents R magnetically labeled by the microbeads of the second. type M2. These microbeads of the first and second type M1, M2 comprise nanoparticles having different superparamagnetic characteristics. This step of bringing together makes it possible in particular to bind the test agents T to the analytes, if they are present in the sample E, to form complexes. The method comprises, before or after the bringing together step, the application of the liquid sample E on or in the analysis medium 1. The porous nature of the substrate forming this medium promotes natural or else forced flow. , depending on the nature of the medium, the solution and the migration of the complexes, of the reference agents R, of the unbound T test agents towards the capture zone le.
Au niveau de cette zone de capture le, les premiers agents de capture Cl se lient aux complexes qu'ils retiennent sélectivement dans cette zone. Les agents de tests T non liés ne sont pas retenus par les premiers agents de capture Cl, ni même par les deuxièmes agents de capture C2 immobilisés dans cette zone le. Ils poursuivent donc leurs migrations vers la zone poubelle ld de la bandelette 1 ou évacués de la colonne. At the level of this capture zone le, the first capture agents C1 bind to the complexes which they selectively retain in this zone. The unbound T test agents are not retained by the first C1 capture agents, or even by the second C2 capture agents immobilized in this zone le. They therefore continue their migrations towards the garbage zone ld of strip 1 or evacuated from the column.
Simultanément, les deuxièmes agents de capture C2 retiennent sélectivement les agents de référence R dans la zone de capture le, c'est-à-dire que seuls les agents de référence R sont retenus par les deuxièmes agents de capture C2. Simultaneously, the second capture agents C2 selectively retain the reference agents R in the capture zone le, that is to say that only the reference agents R are retained by the second capture agents C2.
Avantageusement, on cherche à disposer dans la zone de capture le une quantité relativement constante d'un test immunologique à l'autre. Cela peut être obtenu en intégrant une quantité contrôlée d'agents de référence R et de deuxièmes agents de capture C2 dans le milieu d'analyse. Advantageously, it is sought to place in the capture zone a relatively constant amount from one immunological test to another. This can be obtained by integrating a controlled quantity of reference agents R and of second capture agents C2 in the analysis medium.
À l'issue de cette étape de migration et de retenue sélective, on met en œuvre une étape de mesure visant à obtenir la caractéristique superparamagnétique combinée des microbilles du premier type Ml (associées aux complexes) et des microbilles de deuxième type M2 (associées aux agents de référence R) disposées dans la zone de capture le. Pour cela, on peut utiliser un dispositif de mesure du type décrit dans le document européen cité en introduction de cette demande. Ce dispositif permet d'estimer sous la forme d'un vecteur de mesure, la dérivée seconde de la relation f liant le champ magnétique H d'excitation et l'induction magnétique B dans le matériau superparamagnétique. On pourrait employer d'autres techniques de mesure pour estimer la fonction f elle-même (plutôt que sa dérivée seconde), ou pour estimer sa dérivée première ou troisième. Toutefois, l'établissement de la fonction de sensibilité (la dérivée seconde de la fonction f reliant le champ d'excitation H à l'induction magnétique B) par le dispositif de mesure forme le mode de mise en œuvre préféré. At the end of this migration and selective retention step, a measurement step is implemented aimed at obtaining the combined superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first type M1 (associated with the complexes) and of the second type M2 microbeads (associated with the microbeads. reference agents R) placed in the capture area on. For this, it is possible to use a measuring device of the type described in the European document cited in the introduction to this application. This device makes it possible to estimate, in the form of a measurement vector, the second derivative of the relation f linking the excitation magnetic field H and the magnetic induction B in the superparamagnetic material. One could use other measurement techniques to estimate the function f itself (rather than its second derivative), or to estimate its first or third derivative. However, the establishment of the sensitivity function (the second derivative of the function f connecting the excitation field H to the magnetic induction B) by the measuring device forms the preferred mode of implementation.
Pour mettre en œuvre l'étape de mesure, et quel que soit le dispositif de mesure employé, on dispose le milieu d'analyse 1 dans ce dispositif de mesure de telle sorte que la zone de capture le soit placée dans une bobine de mesure de ce dispositif, ou à proximité d'une telle bobine, et dans le périmètre de mesure du dispositif afin de pouvoir être entièrement exposée aux champs magnétiques produits. To implement the measuring step, and regardless of the measuring device used, the analysis medium 1 is placed in this measuring device so that the capture zone is placed in a measuring coil of this device, or near such a coil, and within the measurement perimeter of the device so as to be fully exposed to the magnetic fields produced.
On expose la zone de capture le à un champ magnétique d'excitation comprenant une première fréquence (par exemple une relativement basse fréquence), une deuxième fréquence différente de la première (par exemple une relativement haute fréquence) et comprenant également une composante sensiblement constante permettant de fixer l'intensité moyenne du champ. On répète successivement cette exposition pour des composantes constantes distinctes du champ d'excitation de manière à exposer la zone de capture à une pluralité de champs d'excitation d'intensités moyennes variées et distinctes. Pratiquement, ces champs d'excitation sont contrôlés par l'intensité et la fréquence de courants à la première, à la deuxième fréquence et par un courant constant injectés dans un circuit de mesure (comprenant la bobine de mesure) du dispositif de mesure. The capture zone is exposed to an excitation magnetic field comprising a first frequency (for example a relatively low frequency), a second frequency different from the first (for example a relatively high frequency) and also comprising a substantially constant component allowing to fix the average intensity of the field. This exposure is repeated successively for different constant components of the excitation field so as to expose the capture zone to a plurality of excitation fields of varied and distinct mean intensities. In practice, these excitation fields are controlled by the intensity and frequency of currents at the first, at the second frequency and by a constant current injected into a measuring circuit (including the measuring coil) of the measuring device.
A chaque exposition successive, on prélève une tension (une force électromotrice) à des bornes de mesure de ce circuit de mesure, que l'on traite pour en extraire une composante à une fréquence de mélange, cette fréquence de mélange étant une combinaison linéaire des premières et deuxièmes fréquences du champ d'excitation. La valeur de cette composante est liée (proportionnelle) à la quantité de matière de superparamagnétique présent dans le champ H produit par la bobine de mesure, c'est-à-dire aux masses respectives des nanoparticules superparamagnétiques présents dans les microbilles de premier et de deuxième types. Pour l'exprimer différemment, à chaque exposition successive, on mesure la réponse magnétique combinée des microbilles du premier type Ml et des microbilles du deuxième type M2 présentes dans la zone de capture le pour chaque champ magnétique d'excitation H. At each successive exposure, a voltage (an electromotive force) is taken from the measurement terminals of this measurement circuit, which is processed to extract a component therefrom at a mixing frequency, this mixing frequency being a linear combination of the first and second frequencies of the excitation field. The value of this component is related (proportional) to the amount of superparamagnetic material present in the H field produced by the measuring coil, i.e. to the respective masses of the superparamagnetic nanoparticles present in the first and second microbeads. second types. To express it differently, at each successive exposure, the combined magnetic response of the microbeads of the first type M1 and of the microbeads of the second type M2 present in the capture zone Ic is measured for each magnetic field of excitation H.
En répétant ce traitement pour chacune des étapes d'exposition, on peut former un vecteur de mesure échantillonnant, pour différentes valeurs de courant continu (représentatives d'un champ d'excitation), la caractéristique superparamagnétique combinée des microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 présentes dans la zone de capture le. By repeating this processing for each of the exposure steps, it is possible to form a measurement vector sampling, for different direct current values (representative of an excitation field), the combined superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first and of the second type. Ml, M2 present in the capture area on.
A titre d'exemple de caractéristiques superparamagnétiques qui peuvent être relevées par cette approche, on a représenté sur la figure 4 la caractéristique superparamagnétique d'une zone de capture le d'un milieu d'analyse 1 pour des échantillons E comprenant des quantités croissantes d'analytes E (et donc de microbilles magnétiques du premier type Ml). L'axe des abscisses de ce graphique correspond au courant continu Idc injecté dans le circuit de mesure du dispositif de mesure, il est représentatif de l'intensité moyenne du champ d'excitation H auquel la zone de capture le a été exposée au cours de la mesure. L'axe des ordonnées correspond à la composante de tension U prélevée par le circuit de mesure à la fréquence de mélange. Cette mesure, à chaque valeur de courant continu Idc donnée, est proportionnelle à la quantité de masse magnétique présente dans la zone de capture le. Dans cet exemple, les microbilles du premier type Ml comprennent des nanoparticules de Fe304 de 7nm de diamètre et le deuxième type de microbilles M2 comprenant les mêmes natures de nanoparticules de 10 nm de diamètre. Les fonctions de sensibilité (la fonction f'') de ces microbilles sont celles représentées sur la figure 2 déjà commentée. As an example of superparamagnetic characteristics which can be detected by this approach, FIG. 4 shows the superparamagnetic characteristic of a capture zone le of an analysis medium 1 for samples E comprising increasing quantities of d 'analytes E (and therefore magnetic microbeads of the first type M1). The abscissa axis of this graph corresponds to the direct current Idc injected into the measuring circuit of the measuring device, it is representative of the average intensity of the excitation field H to which the capture zone the was exposed during measurement. The ordinate axis corresponds to the voltage component U sampled by the measuring circuit at the mixing frequency. This measurement, at each given direct current value Idc, is proportional to the quantity of magnetic mass present in the capture zone le. In this example, the microbeads of the first type M1 comprise Fe304 nanoparticles with a diameter of 7 nm and the second type of microbeads M2 comprising the same natures of nanoparticles with a diameter of 10 nm. The sensitivity functions (the function f '') of these microbeads are those represented in FIG. 2, already commented on.
On observe sur cette représentation que, que pour une quantité d'analytes et de microbilles de premier type Ml donnée, la caractéristique superparamagnétique de la zone de capture combine la caractéristique superparamagnétique des microbilles du premier type Ml et la caractéristique superparamagnétique des microbilles du deuxième type M2 dans leurs proportions respectives. Plus le nombre microbilles du deuxième type M2 est important, plus la caractéristique superparamagnétique associée à ces microbilles est marquée dans la caractéristique combinée. On comprend donc l'intérêt de choisir la nature distincte des microbilles de premier et de deuxième type Ml, M2, et de faire en sorte que les extrema de la composante prélevée apparaissent pour des courants Idc dans des gammes de valeur différentes. On peut de la sorte facilement séparer la contribution de chaque type de microbilles de la caractéristique superparamagnétique combinée. En tout état de cause, on dispose à l'issue de l'étape de mesure d'un procédé conforme à l'invention d'un vecteur de mesure Vm représentatif de la caractéristique superparamagnétique combinée des microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 disposées dans le périmètre de mesure du dispositif de mesure (et donc dans la zone de capture le). It is observed in this representation that, for a quantity of analytes and of microbeads of the first type M1 given, the superparamagnetic characteristic of the capture zone combines the superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first type M1 and the superparamagnetic characteristic of the microbeads of the second type M2 in their respective proportions. The greater the number of microbeads of the second type M2, the more marked the superparamagnetic characteristic associated with these microbeads in the combined characteristic. We can therefore understand the advantage of choosing the distinct nature of the microbeads of the first and second type M1, M2, and of ensuring that the extrema of the component sampled appear for currents Idc in ranges of different values. In this way, the contribution of each type of microbead can easily be separated from the combined superparamagnetic characteristic. In any event, at the end of the measurement step of a method according to the invention, a measurement vector Vm representative of the combined superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first and of the second type M1 is available, M2 arranged in the measuring perimeter of the measuring device (and therefore in the capture zone le).
Dans une étape suivante, ce vecteur de mesure Vm est exploité pour déterminer la quantité absolue ou relative de microbilles de premier type Ml et de microbilles de deuxième type M2. In a following step, this measurement vector Vm is used to determine the absolute or relative quantity of microbeads of first type M1 and of microbeads of second type M2.
Selon une première approche, le vecteur de mesure Vm est exploité en le comparant à une base de vecteurs étalons Vij, un vecteur étalon d'indice i, j ayant été obtenu à l'aide du dispositif de mesure pour une quantité connue de Ni microbilles du premier type Ml et de Nj microbilles de deuxième type M2, disposées dans le périmètre de mesure. La comparaison cherche donc à identifier le vecteur étalon le plus proche du vecteur de mesure Vm, c'est- à-dire à identifier les indices i*, j* qui minimisent la norme (Vm-Vij) pour tout couple (i,j) indexant la base de vecteurs étalons. Les quantités de microbilles du premier type Ml et de microbilles de deuxième type M2 sont alors respectivement fournies par les quantités Ni* et Nj* associées au vecteur Vi*j* dans la base de vecteurs. According to a first approach, the measurement vector Vm is exploited by comparing it with a base of standard vectors Vij, a standard vector of index i, j having been obtained using the measuring device for a known quantity of Ni microspheres of the first type M1 and of Nj microbeads of the second type M2, arranged in the measurement perimeter. The comparison therefore seeks to identify the standard vector closest to the measurement vector Vm, i.e. to identify the indices i *, j * which minimize the norm (Vm-Vij) for any pair (i, j ) indexing the base of standard vectors. The amounts of microbeads of the first type M1 and of microbeads of the second type M2 are then respectively provided by the amounts Ni * and Nj * associated with the vector Vi * j * in the vector base.
Selon une autre approche, on peut rechercher numériquement les quantités respectives de microbilles, en posant que le vecteur de mesure Vm est formé de la somme, respectivement pondérée par les masses magnétiques ml, m2 des nanoparticules composant les microbilles de chaque type, des signatures SI, S2 de chaque type de microbilles Ml, M2 : According to another approach, one can search numerically for the respective quantities of microbeads, by assuming that the measurement vector Vm is formed from the sum, respectively weighted by the magnetic masses ml, m2 of the nanoparticles making up the microbeads of each type, of the signatures SI , S2 of each type of microbeads M1, M2:
Vm = ml*Sl + m2*S2. On peut par application d'une décorrélation/séparation de sources déterminer simultanément la masse ml et la masse m2, et obtenir facilement les quantités respectives de microbilles de chaque type. Il peut ainsi s'agir de mettre en œuvre une technique d'optimisation numérique visant à déterminer les masses magnétiques ml, m2 tel que la norme (Vm-ml*Sl-m2*S2) soit minimale. Vm = ml * Sl + m2 * S2. By applying a decorrelation / separation of sources, it is possible to simultaneously determine the mass ml and the mass m2, and easily obtain the respective quantities of microbeads of each type. It may thus be a question of implementing a numerical optimization technique aiming to determine the magnetic masses ml, m2 such that the standard (Vm-ml * Sl-m2 * S2) is minimal.
L'une et l'autre de ces approches présentent l'avantage de fournir une quantité absolue de microbilles du premier type Ml et de microbilles du deuxième type M2. La quantité de microbilles de deuxième type M2 (associée, pour mémoire, à un agent de référence R) peut être utilisée, si elle dépasse un seuil prédéterminé, comme indicateur de la bonne migration de cet agent R, et ainsi valider le bon déroulement du test immunologique. La quantité de microbilles de premier type Ml (associés pour mémoire aux agents de tests T) peut permettre de quantifier la présence de l'analyte A dans l'échantillon E. Both of these approaches have the advantage of providing an absolute quantity of microbeads of the first type M1 and of microbeads of the second type M2. The quantity of second type M2 microbeads (associated, for the record, with a reference agent R) can be used, if it exceeds a predetermined threshold, as an indicator of the good migration of this agent R, and thus validate the correct progress of the immunological test. The quantity of microbeads of the first type M1 (associated for the record with the test agents T) can make it possible to quantify the presence of the analyte A in the sample E.
De manière avantageuse, on peut également calculer le ratio entre les deux quantités de microbilles et ainsi obtenir un résultat indépendant des quantités de départ de ces microbilles, ou bien de l'influence d'autres paramètres (tel que la température) sur la migration des agents R, T et sur leurs propriétés superparamagnétiques. On note en particulier qu'une minorité d'agents de référence R, d'agents de test T ou de complexes peuvent rester accrochés au cours de la migration dans la zone de migration lb. Il n'est donc pas exclu que cette zone comprenne des quantités de ces agents R, T et de complexes, que l'on peut raisonnablement estimer être identiques. En conséquence, les quantités absolues de microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 retenues dans la zone de capture le peut varier d'un test à l'autre. En fournissant une valeur relative, sous la forme du ratio proposé ci-dessus, on peut masquer ce phénomène d'accroche et fournir un résultat du test immunologique plus fiable. Advantageously, it is also possible to calculate the ratio between the two quantities of microbeads and thus obtain a result independent of the starting quantities of these microbeads, or of the influence of other parameters (such as temperature) on the migration of the microspheres. R, T agents and their superparamagnetic properties. It is noted in particular that a minority of reference agents R, of test agents T or of complexes can remain attached during the migration in the migration zone 1b. It is therefore not excluded that this zone comprises quantities of these agents R, T and of complexes, which can reasonably be considered to be identical. Consequently, the absolute quantities of microbeads of the first and of the second type M1, M2 retained in the capture zone Ic may vary from one test to another. By providing a relative value, in the form of the ratio proposed above, we can mask this hooking phenomenon and provide a more reliable immunological test result.
Selon une variante avantageuse de l'invention, on cherche à compenser une éventuelle variabilité de la distance séparant la zone de capture le, sur laquelle ou dans laquelle sont disposées les microbilles Ml, M2, et la bobine de mesure, générant notamment le champ d'excitation à l'origine de la mesure. La figure 5 illustre l'effet de cette variabilité sur la caractéristique superparamagnétique relevé par le dispositif de mesure. According to an advantageous variant of the invention, an attempt is made to compensate for any variability in the distance separating the capture zone le, on which or in which the microspheres M1, M2, and the measuring coil are placed, in particular generating the field d excitation at the origin of the measurement. FIG. 5 illustrates the effect of this variability on the superparamagnetic characteristic recorded by the measuring device.
Bien que la relation liant le courant injecté dans le circuit de mesure du dispositif de mesure au champ d'excitation généré soit bien établie, la position relative de la zone de capture le vis-à-vis de ce champ peut parfois être moins bien maitrisée, et l'intensité de ce champ au niveau de la zone de capture le peut varier d'une mesure à l'autre. On observe sur la figure 5 la variation de la sensibilité relevée lors d'une variation de cette distance D, car la pente générale de la fonction f'' diminue avec l'augmentation de cette distance D. On observe aussi la variation de la position des extrema (le courant nécessaire pour saturer les nanoparticules devant être augmenté lorsque ces particules sont plus éloignées). Although the relationship linking the current injected into the measuring circuit of the measuring device to the generated excitation field is well established, the relative position of the capture zone vis-à-vis this field can sometimes be less well controlled. , and the intensity of this field at the level of the capture zone it can vary from one measurement to another. We observe in FIG. 5 the variation of the sensitivity recorded during a variation of this distance D, because the general slope of the function f '' decreases with the increase of this distance D. We also observe the variation of the position extrema (the current required to saturate the nanoparticles to be increased when these particles are farther away).
Des études complémentaires ont toutefois montré que le rapport des pentes pO/pref restait quant à lui relativement invariant avec la distance D. However, additional studies have shown that the slope ratio pO / pref remained relatively invariant with the distance D.
La pente p0 correspond au ratio Ul/Il, où II est le courant injecté dans le circuit de mesure permettant d'obtenir le pic de tension U1 associé à la caractéristique superparamagnétique des microbilles de premier type Ml. Il s'agit donc de la pente reliant l'origine à un premier pic de la réponse magnétique combinée, ce premier pic étant associé aux microbilles de premier type Ml. The slope p0 corresponds to the ratio Ul / Il, where II is the current injected into the measuring circuit making it possible to obtain the voltage peak U1 associated with the superparamagnetic characteristic of the microbeads of the first type M1. It is therefore the slope connecting the origin to a first peak of the magnetic response combined, this first peak being associated with the microbeads of the first type M1.
La pente pref correspond au ratio Uref/Iref, où Iref est le courant injecté dans le circuit de mesure permettant d'obtenir le pic de tension Uref associé à la caractéristique superparamagnétique des microbilles de deuxième type M2. Il s'agit donc de la pente reliant l'origine à un deuxième pic de la réponse magnétique combinée aux microbilles de deuxième type M2 à l'origine. The slope pref corresponds to the ratio Uref / Iref, where Iref is the current injected into the measuring circuit making it possible to obtain the voltage peak Uref associated with the superparamagnetic characteristic of the second type M2 microbeads. It is therefore the slope connecting the origin to a second peak of the magnetic response combined with the second type M2 microbeads at the origin.
Selon donc une autre approche avantageuse, le vecteur de mesure Vm est traité pour repérer les maxima U1 et Uref, ainsi que les courants II et Iref pour lesquels ces maxima sont atteints afin de déterminer les pentes p0 et pref. Si le maxima U1 ne peut être identifié (cas où la quantité de microbilles de premier type Ml est nulle), on prendra par défaut pO = pref. A l'issue de ce traitement, on peut alors fournir la quantité relative de microbilles de premier type Ml vs de microbilles de deuxième type M2 en retournant par exemple le ratio r = p0/pref - 1, même lorsque la distance séparant ces microbilles du dispositif de mesure est mal maîtrisée. Avantageusement, pour procéder à cette analyse, on peut reconstituer la fonction f'' de sensibilité par interpolation des points de mesure formant le vecteur de mesureAccording to another advantageous approach, the measurement vector Vm is processed to identify the maxima U1 and Uref, as well as the currents II and Iref for which these maxima are reached in order to determine the slopes p0 and pref. If the maximum U1 cannot be identified (case where the quantity of microbeads of the first type M1 is zero), we will take pO = pref by default. At the end of this treatment, we can then provide the relative quantity of microbeads of the first type M1 vs of microbeads of the second type M2 by returning for example the ratio r = p0 / pref - 1, even when the distance separating these microbeads from the measuring device is poorly understood. Advantageously, to carry out this analysis, it is possible to reconstitute the sensitivity function f '' by interpolation of the measurement points forming the measurement vector
Vm. Vm.
On peut utiliser les mêmes principes sous-jacents à l'approche précédente pour recaler les vecteurs de mesure, les vecteurs étalons et les signatures fournis par le dispositif de mesure, afin de rendre ces vecteurs plus indépendants de la distance. The same principles underlying the previous approach can be used to realign the measurement vectors, the standard vectors and the signatures supplied by the measurement device, in order to make these vectors more independent of the distance.
En prenant l'hypothèse que la quantité de microbilles de deuxième type M2 (associées aux agents de référence R retenus dans la zone de capture le) est sensiblement constante, on peut déterminer les facteurs fx, fy de recalage à appliquer respectivement selon l'axe des abscisses (courant Idc) et selon l'axe des ordonnées (tension mesurée U) au graphe représentant le vecteur de mesure pour faire coïncider les maxima (Iref, Uref) de ce vecteur de mesure avec les maxima du vecteur de signature S2 des microbilles de deuxième type M2. Ce traitement permet d'élaborer un vecteur de mesure recalé que l'on peut exploiter selon l'une des deux premières approches présentées ci-dessus, afin de déterminer la quantité absolue de microbilles de premier type Ml (associées aux agents de tests T). A nouveau, ce traitement peut nécessiter de reconstituer la fonction de sensibilité f'' par interpolation des points de mesure formant le vecteur de mesure Vm. On peut de la sorte reconstituer un vecteur de mesure recalé, présentant une cardinalité standard. By assuming that the quantity of second type M2 microbeads (associated with the reference agents R retained in the capture zone le) is substantially constant, we can determine the adjustment factors fx, fy to be applied respectively along the x-axis (current Idc) and along the y-axis (measured voltage U) to the graph representing the measurement vector to make the maxima (Iref, Uref) coincide of this measurement vector with the maxima of the signature vector S2 of the second type M2 microbeads. This processing makes it possible to develop a readjusted measurement vector which can be used according to one of the first two approaches presented above, in order to determine the absolute quantity of microbeads of the first type M1 (associated with the test agents T) . Once again, this processing may require reconstituting the sensitivity function f '' by interpolation of the measurement points forming the measurement vector Vm. In this way, it is possible to reconstitute a readjusted measurement vector, exhibiting a standard cardinality.
Bien entendu l'invention n'est pas limitée aux modes de mise en œuvre décrits et on peut y apporter des variantes de réalisation sans sortir du cadre de l'invention tel que défini par les revendications . Of course, the invention is not limited to the embodiments described and variant embodiments can be provided without departing from the scope of the invention as defined by the claims.
Bien que l'on ait présenté ici une application de la méthode de mesure dans le domaine du dosage immunologique, le procédé de mesure peut s'appliquer plus généralement pour mesurer simultanément les masses magnétiques d'une pluralité de premières et d'une pluralité de deuxièmes nanoparticules superparamagnétiques présentant des caractéristiques différentes. Ce procédé met en œuvre une étape visant à successivement exposer les premières et deuxièmes nanoparticules à une pluralité de champs magnétiques d'intensités moyennes distinctes, mesurer leurs réponses magnétiques combinées et former un vecteur de mesure. Il met ensuite en œuvre une étape visant à traiter ce vecteur de mesure pour déterminer les masses magnétiques des pluralités des premières et des deuxièmes nanoparticules superparamagnétiques. Although an application of the measurement method has been presented here in the field of immunoassay, the measurement method can be applied more generally to simultaneously measure the magnetic masses of a plurality of firsts and of a plurality of. second superparamagnetic nanoparticles with different characteristics. This method implements a step aiming to successively expose the first and second nanoparticles to a plurality of magnetic fields of distinct mean strengths, to measure their combined magnetic responses and to form a measurement vector. It then implements a step aimed at processing this measurement vector to determine the masses magnetic pluralities of the first and second superparamagnetic nanoparticles.

Claims

REVENDICATIONS
1.Milieu d'analyse (1) pour dosage immunologique comprenant un substrat pour favoriser l'écoulement naturel ou forcé d'un échantillon liquide (E) susceptible de comporter des analytes (A), le substrat présentant une zone de capture (le), le milieu d'analyse (1) étant caractérisé en ce que la zone de capture (le) comprend, immobilisées sur ou dans le substrat, une pluralité de premiers agents de capture (Cl) apte à sélectivement retenir des complexes liés aux analytes (A) et une pluralité de deuxièmes agents de capture (C2) apte à sélectivement retenir des agents de référence (R) fonctionnalisés pour prévenir une liaison avec les analytes, de manière à permettre de procéder en une seule étape à une mesure d'un signal visant à déterminer simultanément la présence et/ou la concentration de complexes et d'agents de référence. 1.Analysis medium (1) for immunoassay comprising a substrate to promote the natural or forced flow of a liquid sample (E) likely to contain analytes (A), the substrate having a capture zone (the) , the analysis medium (1) being characterized in that the capture zone (Ie) comprises, immobilized on or in the substrate, a plurality of first capture agents (C1) capable of selectively retaining complexes bound to the analytes ( A) and a plurality of second capture agents (C2) capable of selectively retaining functionalized reference agents (R) to prevent binding with the analytes, so as to allow a measurement of a signal to be carried out in a single step. aimed at simultaneously determining the presence and / or concentration of complexes and reference agents.
2.Milieu d'analyse (1) selon la revendication 1 dans lequel le substrat comprend également, en amont de la zone de capture (le) dans le sens de l'écoulement, une pluralité d'agents de test (T) marqués d'un premier type de microbilles magnétiques (Ml), les agents de test (T) étant aptes à se lier aux analytes (A), et une pluralité d'agents de référence (R) marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques (M2), le premier type de microbilles magnétiques (Ml) et le deuxième type de microbilles magnétiques (M2) ayant des propriétés superparamagnétiques différentes . 2.Analysis medium (1) according to claim 1 wherein the substrate also comprises, upstream of the capture zone (le) in the direction of flow, a plurality of test agents (T) labeled d. 'a first type of magnetic microbeads (M1), the test agents (T) being able to bind to the analytes (A), and a plurality of reference agents (R) labeled with a second type of magnetic microbeads ( M2), the first type of magnetic microbeads (M1) and the second type of magnetic microbeads (M2) having different superparamagnetic properties.
3.Milieu de l'analyse (1) selon la revendication 1, dans lequel les premiers agents de capture (Cl) sont respectivement associés à des complexes comprenant des analytes (A) et des agents de test (T) marqués d'un premier type de microbilles magnétiques (Ml), et les deuxièmes agents de capture (C2) sont associés à des agents de référence (R) marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques (M2), le premier type de microbilles magnétiques (Ml) et le deuxième type de microbilles magnétiques (M2) ayant des propriétés superparamagnétiques différentes . 3.Analysis medium (1) according to claim 1, wherein the first capture agents (Cl) are respectively associated with complexes comprising analytes (A) and test agents (T) labeled with a first. type of magnetic microbeads (M1), and the second capture agents (C2) are associated with reference agents (R) marked with a second type of magnetic microbeads (M2), the first type of microbeads magnetic beads (M1) and the second type of magnetic microbeads (M2) having different superparamagnetic properties.
4.Milieu d'analyse (1) selon l'une des revendications précédentes dans lequel le substrat est formé d'un matériau poreux . 4.Analysis medium (1) according to one of the preceding claims wherein the substrate is formed of a porous material.
5.Milieu d'analyse (1) selon l'une des revendications précédentes dans lequel le substrat se présente sous la forme d'une bandelette. 5.Analysis medium (1) according to one of the preceding claims wherein the substrate is in the form of a strip.
6.Milieu d'analyse (1) selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel le substrat se présente sous la forme d'une quantité de matériau disposé dans une colonne. 6.Analysis medium (1) according to one of claims 1 to 4 wherein the substrate is in the form of a quantity of material arranged in a column.
7. Procédé de détection de la présence d'analytes (A) dans un échantillon (E) liquide, le procédé comprenant les étapes suivantes: 7. A method of detecting the presence of analytes (A) in a liquid sample (E), the method comprising the following steps:
- mettre l'échantillon (E) en présence d'agents de test (T) marqués d'un premier type de microbilles magnétiques (Ml), les agents de test (T) étant aptes à se lier aux analytes (A), et d'agents de référence (R) marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques (M2), les premier et deuxième types de microbilles magnétiques (Ml, M2) présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes ; - put the sample (E) in the presence of test agents (T) marked with a first type of magnetic microbeads (M1), the test agents (T) being able to bind to the analytes (A), and reference agents (R) labeled with a second type of magnetic microbeads (M2), the first and second types of magnetic microbeads (M1, M2) exhibiting different superparamagnetic characteristics;
- appliquer l'échantillon (E) à un milieu d'analyse (1) avant ou après l'étape de mise en présence ; - applying the sample (E) to an analysis medium (1) before or after the bringing together step;
- sélectivement retenir sur ou dans une zone de capture- selectively retain on or in a capture area
(le) du milieu d'analyse (1) une partie au moins des agents de test (T) liés aux analytes (A) et des agents de référence (R) par l'intermédiaire, respectivement, d'une pluralité de premiers agents de capture (Cl) et d'une pluralité de deuxièmes agents de capture (C2) ; (the) of the analysis medium (1) at least part of the test agents (T) bound to the analytes (A) and of the reference agents (R) via, respectively, a plurality of first agents capture (C1) and a plurality of second capture agents (C2);
- successivement exposer la zone de capture (le) à une pluralité de champs magnétiques d'excitation d'intensités moyennes distinctes, mesurer la réponse magnétique combinée des microbilles du premier type (Ml) et des microbilles du deuxième type (M2) présent dans la zone de capture (le) pour chaque champ magnétique d'excitation et ainsi former un vecteur de mesure ; - successively expose the capture zone (le) to a plurality of excitation magnetic fields of distinct average intensities, measure the combined magnetic response microbeads of the first type (M1) and microbeads of the second type (M2) present in the capture zone (Ie) for each excitation magnetic field and thus form a measurement vector;
- traiter le vecteur de mesure pour déterminer la quantité absolue ou relative de microbilles du premier type (Ml) et des microbilles du deuxième type (M2). - Process the measurement vector to determine the absolute or relative quantity of microbeads of the first type (M1) and of microbeads of the second type (M2).
8. Procédé de détection selon la revendication précédente dans lequel la réponse magnétique combinée correspond à la dérivée seconde de la fonction reliant le champ d'excitation à l'induction magnétique des microbilles du premier type (Ml) et des microbilles du deuxième type (M2). 8. The detection method according to the preceding claim in which the combined magnetic response corresponds to the second derivative of the function connecting the excitation field to the magnetic induction of the microspheres of the first type (M1) and of the microbeads of the second type (M2 ).
9. Procédé de détection selon l'une des revendications 7 et 8, dans lequel l'étape de traitement du vecteur de mesure comprend une recherche, dans une base de vecteurs étalons, d'un vecteur étalon le plus proche du vecteur de mesure, chaque vecteur étalon de la base étant associé à une quantité connue de microbilles du premier type (Ml) et de microbilles du deuxième type (M2). 9. The detection method according to one of claims 7 and 8, wherein the step of processing the measurement vector comprises a search, in a base of standard vectors, for a standard vector closest to the measurement vector, each standard vector of the base being associated with a known quantity of microbeads of the first type (M1) and of microbeads of the second type (M2).
10. Procédé de détection selon l'une des revendications 7 et 8, dans lequel l'étape de traitement du vecteur de mesure comprend la recherche numérique des masses magnétiques respectives des nanoparticules composant les microbilles de chaque type (Ml, M2). 10. The detection method according to one of claims 7 and 8, wherein the step of processing the measurement vector comprises the digital search for the respective magnetic masses of the nanoparticles making up the microbeads of each type (M1, M2).
11. Procédé de détection selon l'une des revendications 7 et 8, dans lequel l'étape de traitement comprend le repérage d'un premier pic et d'un deuxième pic de la réponse magnétique respectivement associés aux microbilles du premier type (Ml) et aux microbilles du deuxième type (M2) pour déterminer les pentes reliant le premier pic et le deuxième pic à l'origine. 11. Detection method according to one of claims 7 and 8, wherein the processing step comprises the identification of a first peak and a second peak of the magnetic response respectively associated with the microspheres of the first type (M1). and with microbeads of the second type (M2) to determine the slopes connecting the first peak and the second peak at the origin.
12. Procédé de détection selon l'une des revendications 7 à 11, dans lequel l'étape de traitement comprend le recalage de la réponse magnétique combinée pour faire correspondre un deuxième pic de cette réponse associé aux microbilles du deuxième type (M2) à un pic de référence de la signature des microbilles de deuxième type (M2) ou des vecteurs étalon. 12. The detection method according to one of claims 7 to 11, wherein the processing step comprises the registration. of the combined magnetic response to make a second peak of this response associated with the microbeads of the second type (M2) correspond to a reference peak of the signature of the microbeads of the second type (M2) or of the standard vectors.
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