EP4034886A1 - Prédiction du contenu de la rétine en acides gras polyinsaturés oméga-3 à travers le dosage de 7 molécules d'esters de cholestérol - Google Patents

Prédiction du contenu de la rétine en acides gras polyinsaturés oméga-3 à travers le dosage de 7 molécules d'esters de cholestérol

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Publication number
EP4034886A1
EP4034886A1 EP20790373.3A EP20790373A EP4034886A1 EP 4034886 A1 EP4034886 A1 EP 4034886A1 EP 20790373 A EP20790373 A EP 20790373A EP 4034886 A1 EP4034886 A1 EP 4034886A1
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EP
European Patent Office
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fatty acids
omega
polyunsaturated fatty
content
retina
Prior art date
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Pending
Application number
EP20790373.3A
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German (de)
English (en)
Inventor
Cécile DELCOURT
Niyazi ACAR
Lionel BRETILLON
Soufiane AJANA
Hélène JACQMIN-GADDA
Boris HEJBLUM
Bénédicte MERLE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Bordeaux
Institut National Superieur des Sciences Agronomiques de lAlimentation et de lEnvironnement
Universite de Bourgogne
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Bordeaux
Institut National Superieur des Sciences Agronomiques de lAlimentation et de lEnvironnement
Universite de Bourgogne
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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Filing date
Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the invention relates to the field of ophthalmology and more specifically to the prediction of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina.
  • Age-related macular degeneration is a degenerative disease of the central part of the retina, called the macula. It mainly affects the elderly and is responsible for 50% of blindness cases in industrialized countries. About 600,000 people are affected by the disease in France. Advanced forms of AMD (called neovascular AMD and atrophic AMD) are associated with loss of vision, and are usually preceded by early, asymptomatic abnormalities.
  • AMD Age-related macular degeneration
  • the etiology of AMD is multifactorial, and involves genetic as well as environmental factors such as diet. In this context, the role of omega-3 or omega-3 polyunsaturated fatty acids is arousing growing interest for 3 reasons:
  • DHA docosahexaenoic acid
  • omega-3 polyunsaturated fatty acids includes in particular a precursor fatty acid, ⁇ -linoleic acid (or C18: 3n-3 or ALA) and three derivatives with long chain, eicosapentaenoic acid (or C20: 5n-3 or EPA), docosapentaenoic acid (or C22: 5n-3 or DPAn-3) and docosahexaenoic acid (DHA or C22: 6n-3).
  • ALA is an essential nutrient for humans, because animal organisms are unable to synthesize it de novo, and therefore depend exclusively on food intake.
  • Knowing the concentrations of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina is indeed important information for: 1. identifying subjects whose retina is impoverished and who could therefore be at risk of AMD, and 2. monitoring the effectiveness of nutritional supplementation based on omega-3 polyunsaturated fatty acids in restoring physiological levels of these fatty acids in the retina.
  • a first study was limited to studying the associations of the retinal contents of omega-3 polyunsaturated fatty acids with the blood contents of various fatty acids, without attempting to predict the fatty acid content.
  • omega-3 polyunsaturates in the retina nor to investigate the lipid structures that carry fatty acids in the blood (phospholipids, cholesterol esters, triglycerides ...) (Gorusupudi et al. J Lipid Res 2016; 57: 499-508).
  • the second identified cholesterol esters as a whole as circulating markers of retinal DHA content (Bretillon et al. Exp Eye Res 2008; 87: 521-528).
  • the third showed that the DHA content of erythrocytes was not a good circulating marker for the DHA content of the retina (Acar et al. PLoS ONE 2012; 7: e35102).
  • omega-3 polyunsaturated fatty acids Two approaches are commonly used to indirectly evaluate the content of the retina in omega-3 polyunsaturated fatty acids.
  • the first is based on food intake which, through food questionnaires, allow a subject to assess the consumption of a particular food rich in omega-3 polyunsaturated fatty acids and to extrapolate it to tissue enrichment.
  • the second consists of an evaluation of the contents of circulating omega-3 polyunsaturated fatty acids and again, to extrapolate blood enrichment to tissue enrichment.
  • This assessment in the blood compartment can be more or less global and concern both whole blood, erythrocytes, total plasma or different plasma compartments (mostly phospholipids and cholesterol esters).
  • omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina it is currently impossible to measure the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina reliably. It is therefore necessary to have a tool for evaluating omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina, other than the dietary intake method which is complex to implement and imprecise and than the method based on the lipid composition of plasma / of the different compartments of the plasma which does not allow to obtain reliable results concerning the fatty acid content in the retina.
  • the invention makes it possible to estimate the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina through the blood assay of at least one cholesterol ester.
  • the inventors have, by refinement in the use of cholesterol esters as a marker of the content of omega 3 polyunsaturated fatty acids in the retina, used dosage values of a cholesterol ester, preferably of seven cholesterol esters, instead of the 25 present in the blood.
  • the construction and use of a mathematical model advantageously makes it possible to predict the concentration of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina from a dosage value of a cholesterol ester, preferably of 7 cholesterol esters in the blood.
  • This approach is advantageously focused on a small number of plasma cholesterol esters, and is more efficient and reliable for determining the retinal content of omega-3 polyunsaturated fatty acids.
  • the present invention relates to a method for determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of a subject comprising the quantification of the content of at least one cholesterol ester in a blood sample of said subject , the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina being correlated with the content of cholesterol esters.
  • a subject of the invention is also a method of preventing a retinal pathology linked to a deficiency in omega-3 polyunsaturated fatty acids by determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina according to the determination method according to the invention.
  • the invention also relates to a method of monitoring the treatment of a pathology linked to a deficiency in omega-3 polyunsaturated fatty acids comprising the steps of administering at least one treatment and of determining the content of polyunsaturated fatty acids.
  • omega-3 from the retina according to the determination method of the invention.
  • the invention also relates to a method for diagnosing omega-3 polyunsaturated fatty acid deficiencies comprising determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of a patient to whom treatment has been administered, according to the method of determination of the invention.
  • the present invention relates to a method for determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of a subject comprising determining the content of at least one cholesterol ester in a blood sample of said subject, the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids of the retina being correlated with the content of said at least one cholesterol ester, said at least one cholesterol ester being cholesteryl 5,8,11, 14,17-eicosapentaenoate.
  • the inventors of the present invention have demonstrated that the determination of the content of cholesteryl 5,8,11,14,17- eicosapentaenoate (C20: 5 w3 methyl ester), preferably contained in the plasma can predict the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in a subject's retina.
  • content in omega-3 polyunsaturated fatty acids of the retina is understood to mean the sum in weight percentage of the total fatty acids of all the omega-3 polyunsaturated fatty acids present in the retina, namely, the sum of weight percentage of total fatty acids ⁇ -linoleic acid (or C18: 3n-3 or ALA), eicosapentaenoic acid (or C20: 5w-3 or EPA), docosapentaenoic acid (or C22: 5 w-3 or DPA w-3) and docosahexaenoic acid (DHA or C22: 6 w-3).
  • the content of at least six additional cholesterol esters is determined.
  • the cholesterol esters are chosen from cholesteryl tetradecanoate, cholesteryl pentadecanoate, cholesteryl hexadecanoate, cholesteryl 7-hexadecenoate, cholesteryl 9-hexadecenoate, cholesteryl heptadecanoate, cholesteryl-9-octaderylecanoate, trans-cholesteryl 7-hexadecenoate cholesteryl cis- 9-octadecenoate, cholesteryl 11 -octadecenoate, cholesteryl 9,12- octadecadienoate, cholesteryl eicosanoate, cholesteryl 6,9,12- octadecatrienoate, cholesteryl 11 -eicosenoate, cholesteryl 9,12,15 octadecatrienoate, cholesteryl 11, 14-eicosadieno
  • the 6 additional cholesterol esters are cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate, cholesteryl 9,12-octadecadienoate, cholesteryl 6,9,12- octadecatrienoate, cholesteryl 8,11, 14-eicosatrienoate, cholesteryl 5,8,11, 14-eicosatetraenoate.
  • the content of 7 cholesterol esters is determined.
  • the inventors have in fact identified, in addition to cholesteryl 5,8,11, 14,17-eicosapentaenoate, six additional cholesterol esters which are cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, cholesteryl 4,7,10, 13,16,19- docosahexaenoate, cholesteryl 9,12-octadecadienoate, cholesteryl 6,9,12- octadecatrienoate, cholesteryl 8,11, 14-eicosatrienoate, cholesteryl 5,8,11, 14- eicosatetraenoate), among the twenty-five present in the blood which make it possible to obtain a reliable and precise determination of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina.
  • content of at least one cholesterol ester means the weight percentage of at least one fatty acid of the cholesterol esters.
  • a person skilled in the art can use any known method to determine the cholesterol ester content.
  • one method consists of a trans-esterification step.
  • the transesterification step corresponds to an acid catalysis in which the sterol part of the cholesterol ester is exchanged for an alkyl group.
  • the alkyl group is chosen from methyl, propyl, or butyl.
  • the trans-esterification step is a step of trans-methylation of fatty acids from cholesterol esters.
  • the cholesterol ester content can in fact be determined by the formation of methyl esters of fatty acids from cholesterol esters. Methyl esters of cholesterol esters are obtained after trans-methylation of fatty acids of the corresponding cholesterol ester.
  • the methyl esters of the fatty acids of the cholesterol esters are formed after transmethylation of the fatty acids according to the method of Morrison & Smith (Morrison & Smith J lipid Res 1964; 53: 600-608).
  • the methyl esters of fatty acids of cholesterol esters identified according to the present invention are 9,12,15-octadecatrienoic acid methyl ester (C18: 3 w-3 methyl ester), 4,7,10,13, 16,19-docosahexaenoic acid methyl ester (C22: 6 w-3 methyl ester), 9,12-octadecadienoic acid methyl ester (C18: 2 w-6 methyl ester), 6,9,12-octadecatrienoic acid methyl ester (C18: 3 w-6 methyl ester), 8,11,14-eicosatrienoic acid methyl ester (C20: 3 w-6 methyl ester), 5,8,11,14- eicosatetraenoic
  • the relative weight content of each of the 25 fatty acid methyl esters of the cholesterol esters is determined.
  • the relative weight content of the methyl esters of fatty acids is analyzed and determined by any method known to those skilled in the art, typically by gas chromatography coupled with flame ionization detection, as described in Acar et al. . (Acar et al PLoS One 2012; 7 (4): e35102).
  • the relative proportions of the 25 species of methyl esters are calculated and expressed as a percentage of the total fatty acids of the cholesterol esters. Typically, the proportions are calculated, using any data integration software known to those skilled in the art, for example using the EZChrom Elite software (Agilent technologies, Massy, France) and are expressed as a percentage of the acids total fat cholesterol esters.
  • This step makes it possible to determine the weight percentage of at least one fatty acid of the cholesterol esters and therefore to determine the content of each cholesterol ester.
  • correlation means the calculation of the estimated value of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina from the content of at least one cholesterol ester, preferably from the content of at least 7 cholesterol esters and more preferably from the content of 7 cholesterol esters.
  • the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina is estimated using an algorithm based on the content of at least 1 cholesterol ester, preferably based on the content of at least 7 cholesterol esters and preferably still using an algorithm based on the content of 7 cholesterol esters.
  • the calculation is carried out by any algorithm which makes it possible to predict, for a new sample, the content of omega-3 polyunsaturated fatty acid in the retina from the assay of at least 1 cholesterol ester, preferably from at least 7 cholesterol esters and more preferably from 7 cholesterol esters.
  • the algorithm is based on a linear regression according to the formula:
  • the algorithm is based on the sparse group partial least squares method ( sgPLS) described by Liquet et al. (Liquet B et al. Bioinformatics. 2016 Jan 1; 32 (1): 35-42).
  • the algorithm comprises and preferably consists of 4 steps:
  • the sums and ratios present in the mathematical formula reproduced below are calculated from the dosages of the 7 molecules of interest derived from 25 fatty acid methyl esters of cholesterol esters.
  • the 7 molecules of interest derived from the 25 fatty acid methyl esters of cholesterol esters are as follows: 9,12,15-octadecatrienoic acid methyl ester (C18: 3 w-3 methyl ester), 5,8 , 11, 14,17-eicosapentaenoic acid methyl ester (C20: 5 w-3 methyl ester), 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid methyl ester (C22: 6 w-3 methyl ester), 9 , 12-octadecatrienoic acid methyl ester (C18: 2 w -6 methyl ester), 6,9,12-octadecatrienoic acid methyl ester (C18: 3 w -6 methyl ester), 8,11, 14- eicosatrienoic acid methyl ester ( C20: 3w -6 methyl ester), 5,8,11,14-eicosatrienoic acid methyl ester (C20: 4w -6
  • 5w3_EC corresponds to the cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate content
  • - Tot_w3_EC corresponds to the sum of the cholesteryl 9,12,15- octadecatrienoate, cholesteryl 5,8,11, 14,17-eicosapentaenoate cholesteryl contents
  • ratio_w6_w3_EC corresponds to the ratio of the sum of the contents of cholesteryl 9,12-octadecadienoate, cholesteryl 6,9,12-octadecatrienoate, cholesteryl 11, 14-eicosadienoate, cholesteryl 5,8,11, 14-eicosatetraate, cholesteryl 7,10, 13,16- docosatetraenoate, cholesteryl 4,7,10,13,16-docosapentaenoate on the sum of the contents of cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, cholesteryl 5,8,11, 14,17- eicosapentaenoate, cholesteryl 7, 10 , 13, 16,19-docosapentaenoate, cholesteryl
  • ratio_dietw3_w 6_EC corresponds to the ratio of the sum of the content of cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, cholesteryl 5,8,11, 14,17-eicosapentaenoate and cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate on the cholesteryl 9,12- octadecadienoate content
  • ratio_EPADPAw 3DHA_AA_EC corresponds to the ratio of the sum of cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate, cholesteryl 7,10,13,16,19- docosapentaenoate, cholesteryl 4,7 , 10,13,16,19-docosahexaenoate on the content of cholesteryl 5,8,11,14-eicosatetraenoate
  • ratio_AA_EPA_EC corresponds to the ratio of the cholesteryl 5,8,11,14- eicosatetraenoate content to the cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate content
  • - tot_w 3_LC_EC corresponds to the sum of the contents of cholesteryl 5,8,11,14,17- eicosapentaenoate, cholesteryl 7,10,13,16,19-docosapentaenoate, cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate .
  • step 3 Calculation of the mathematical formula from the centered-reduced test sample. 4.
  • the result obtained in step 3 is multiplied by the standard deviation of the concentration of omega-3 polyunsaturated fatty acids. 3 in the retina of the training sample. The values thus obtained are added to the average concentration of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of the training sample.
  • training sample is understood to mean the sample of 46 post-mortem donors, to which the sgPLS method was applied in order to obtain the prediction algorithm.
  • test sample means the blood sample of the subject whose retinal content of omega 3 fatty acids is sought to be determined.
  • the blood sample is chosen from whole blood, serum and plasma.
  • the sample is plasma.
  • the method according to the invention comprises a step of collecting blood and isolating the plasma.
  • a person skilled in the art will be able to use any known method of isolating the plasma.
  • plasma can be separated from red blood cells by centrifugation of a whole blood sample.
  • the method according to the invention further comprises a step of extracting total lipids.
  • the total lipids can be extracted from a blood sample, by any method known to those skilled in the art. Typically, total plasma, blood and serum lipids are extracted by the method of Moilanen & Nikkari (Moilanen & Nikkari Clin Chim Acta 1981; 114 (1): 111-116).
  • the method according to the invention further comprises a step of isolating cholesterol esters from total lipids.
  • cholesterol esters will be isolated from total lipids, by any method known to those skilled in the art.
  • the cholesterol esters are isolated from the total lipids according to a procedure described in Bretillon et al 2008 (Bretillon et al Exp Eye Res 2008; 87 (6): 521-528).
  • the invention relates to a method of preventing a retinal pathology linked to a deficiency in omega-3 polyunsaturated fatty acids comprising the determination of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids of the retina according to the method of determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids according to the invention.
  • retina pathology linked to a deficiency in omega 3 polyunsaturated fatty acids is understood to mean any pathology associated, at least in part, with a decrease in the content of polyunsaturated fatty acids in the retina.
  • omega-3 polyunsaturated fatty acids are essential for the structure and function of the retina (SanGiovanni, JP & Chew, EY The role of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Prog Retin Eye Res 24, 87-138 (2005)).
  • the highest content of omega-3 polyunsaturated fatty acids is found in the outer membranes of retinal photoreceptor cells (Fliesler, SJ & Anderson, RE Chemistry and metabolism of lipids in the vertebrate retina. Prog Lipid Res 22, 79-131 (1983)) ), where they perform important biological functions through anti-inflammatory, anti-apoptotic and anti-angiogenic activities.
  • the concentration of DHA was significantly lower in eyes with retinal pathology than in controls of the same age (Liu, A., Chang, J., Lin, Y., Shen, Z . & Bernstein, PS Long-chain and very long-chain polyunsaturated fatty acids in ocular aging and age-related macular degeneration. J Lipid Res 51, 3217-3229 (2010)).
  • the retinal pathology linked to a deficiency in omega 3 polyunsaturated fatty acids is retinopathy such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity.
  • Ocular neovascularization is the most frequent cause of blindness in all patient populations, regardless of age: retinopathy of prematurity in children, diabetic retinopathy in adults and age-related macular degeneration in the elderly.
  • An animal model was developed to study retinopathy (evaluation of the appearance of retinal new vessels, and the growth of these vessels after injury in a mouse eye).
  • omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids were studied in a mouse model with retinopathy induced by hypoxia.
  • Increasing intake of omega-3 polyunsaturated fatty acids has been shown to reduce pathological angiogenesis.
  • Supplementation with omega-3 polyunsaturated fatty acids would therefore be advantageous in the prevention of retinopathy (Kip M Connor et al., (2007), Increased dietary intake of w-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nature Medicine; doi: 10.1038 / nm1591).
  • ASD Age-related macular degeneration
  • the pathology is age-related macular degeneration (AMD).
  • AMD age-related macular degeneration
  • the early and intermediate stages of AMD include alterations of the pigment epithelium such as hypo- or hyperpigmentation and drusen and are not responsible for significant impairment of visual function.
  • AMD The advanced stages
  • dry AMD the atrophic forms
  • - large drusen also known as "serous”: larger drusen (greater than 125 mm), most often asymptomatic but which may be accompanied by reduced visual abilities in the dark;
  • pigmentary changes such as hypopigmentation or hyperpigmentation of the pigment epithelium. They reflect the death of the cells of the pigment epithelium.
  • Exudative AMD is characterized by the proliferation of choroidal neovessels which cross Bruch's membrane and develop under the pigment epithelium or in the subretinal space.
  • Atrophic AMD (or geographic atrophy) is characterized by one or more patches of depigmentation of the retina, at least 175 mm in diameter, with sharp edges and increased visibility of the choroidal vessels.
  • Advanced forms of AMD correspond to category 4 and include neovascular forms and geographic atrophy. These are patients who usually already have reduced visual acuity.
  • Diabetic retinopathy is a microvascular complication of diabetes representing the leading cause of blindness in the United States and Europe before the age of 50.
  • AGPLC Long chain polyunsaturated fatty acids
  • DHA docosahexaenoic acid
  • AA arachidonic acid
  • ROP Retinopathy of prematurity
  • DHA docosahexaenoic acid
  • AA arachidonic acid
  • prevention or “method of prevention” are not absolute terms and, when they are applied to a retinal pathology associated with a deficiency in omega 3 polyunsaturated fatty acids such as retinopathy, they designate a procedure or plan of action designed, even with a low probability of success but having to induce an overall beneficial effect such as the delay in onset of the pathology, or the reduction in the severity of one or more symptoms or the stabilization the pathology.
  • prevention is understood to mean the prevention of the pathology but also the prevention of the aggravation of the pathology.
  • Prevention of AMD or diabetic retinopathy refers to delaying the onset of the condition.
  • prevention of worsening of AMD or diabetic retinopathy refers to the delay of vision loss or loss of visual acuity in the patient with AMD or diabetic retinopathy.
  • prevention means from preventing the onset of the pathology to preventing the severity of the pathology.
  • an increase in the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina is associated with a decrease in the risk of onset and / or worsening of the pathology and / or severity.
  • the prevention method according to the invention is an in vitro prevention method based on the in vitro determination of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina.
  • the determination is in fact carried out on a blood sample chosen from whole blood, serum and plasma, preferably plasma.
  • the invention also relates to a method of treating a retinal pathology linked to a deficiency in omega-3 polyunsaturated fatty acids comprising:
  • determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of a subject comprising the quantification of the content of at least 1 cholesterol ester in a blood sample of said subject, the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids of the retina being correlated with the content of said at least one cholesterol ester, said at least one cholesterol ester being cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate;
  • the retinal pathology associated with a deficiency of omega-3 polyunsaturated fatty acids is retinopathy such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity.
  • the invention also relates to a method of treating age-related macular degeneration comprising:
  • determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of a subject comprising the quantification of the content of at least 1 cholesterol ester in a blood sample of said subject, the content of fatty acids omega-3 polyunsaturates of the retina being correlated with the content of said at least one cholesterol ester, said at least one cholesterol ester being cholesteryl
  • said treatment may be chosen from nutritional supplementation based on omega-3 polyunsaturated fatty acids, whether or not associated with the administration of vitamins and minerals.
  • the invention also relates to a method of treating diabetic retinopathy comprising:
  • determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of a subject comprising the quantification of the content of at least 1 cholesterol ester in a blood sample of said subject, the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids of the retina being correlated with the content of said at least one cholesterol ester, said at least one cholesterol ester being cholesteryl
  • said treatment may be chosen from nutritional supplementation based on omega-3 polyunsaturated fatty acids, whether or not associated with the administration of vitamins and minerals.
  • the invention also relates to a method of treating retinopathy of prematurity comprising:
  • determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of a subject comprising the quantification of the content of at least 1 cholesterol ester in a blood sample of said subject, the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids of the retina being correlated with the content of said at least one cholesterol ester, said at least one cholesterol ester being cholesteryl
  • said treatment may be chosen from nutritional supplementation based on omega-3 polyunsaturated fatty acids, whether or not associated with the administration of vitamins and minerals.
  • the invention relates to a method for monitoring the treatment of a pathology linked to a deficiency in omega-3 polyunsaturated fatty acids comprising the steps:
  • the invention also relates to a method of monitoring the treatment of a pathology linked to a deficiency in omega-3 polyunsaturated fatty acids comprising the determination of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of a patient in whom a treatment was administered, according to the determination method according to the invention.
  • the treatment is nutritional supplementation based on omega-3 polyunsaturated fatty acids, whether or not associated with the administration of vitamins and minerals.
  • the pathology is retinopathy selected from age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity.
  • omega-3 polyunsaturated fatty acids promote normal retinal structure and function, as well as reduce the incidence and slow down the progression of AMD (SanGiovanni, JP & Chew, EY The role of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Prog Retin Eye Res 24, 87-138 (2005)) but also to prevent all retinopathies (Kip M Connor et al., (2007) ), Increased dietary intake of w-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nature Medecine; doi: 10.1038 / nm1591).
  • an increase in the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the content of the retina is synonymous with effective treatment.
  • the monitoring method according to the invention is an in vitro monitoring method based on the in vitro determination of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids of the. retina.
  • the determination is in fact carried out on a blood sample chosen from whole blood, serum and plasma, preferably plasma.
  • the invention relates to a method for diagnosing omega-3 polyunsaturated fatty acid deficiencies comprising determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina according to the determination method according to the invention.
  • omega-3 polyunsaturated fatty acids is understood to mean a deficiency in polyunsaturated fatty acids compared to a healthy subject, i.e., a subject not exhibiting deficiencies in polyunsaturated fatty acids.
  • a decrease in the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the content of the retina is synonymous with a deficiency of omega-3 polyunsaturated fatty acids.
  • control sample is understood to mean the distribution of values in healthy subjects, i.e., subjects not exhibiting deficiencies in polyunsaturated fatty acids.
  • the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of healthy subjects in the control group is determined by the method according to the invention.
  • the diagnostic method according to the invention is an in vitro diagnostic method based on the in vitro determination of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina.
  • the determination is in fact carried out on a blood sample chosen from whole blood, serum and plasma, preferably plasma.
  • the inventors have determined the circulating lipids having the highest predictive performance in order to determine the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina.
  • the inventors have furthermore demonstrated the association between AMD and retinal status in omega-3 polyunsaturated fatty acids (example 2) as well as the impact of dietary supplementation in omega-3 polyunsaturated fatty acids (example 3), thus showing that the combination of these seven cholesterol esters constitutes a biomarker which makes it possible to develop personalized medicine to identify subjects at risk of retinopathy and more particularly of AMD and / or to monitor supplementation with omega-3 polyunsaturated fatty acids .
  • the predictive capacity of cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate alone was also demonstrated in Example 4.
  • Human eyeballs, plasma and erythrocytes were obtained from 46 donors (bodies donated to Science, 30 women and 16 men, median age 86.5 years, interquartile range 76-92 years). The tissues were collected and prepared according to the procedures already described and known to those skilled in the art. Samples were stored at -80 ° C until further analysis.
  • the subjects were selected from 2 ongoing studies in Bordeaux (Alienor study) and Dijon (Montrachet study), which use similar methods. Between 2009 and 2011, participants were 75 years of age or older and had had an eye exam and blood drawn on an empty stomach. The eye examinations took place in the ophthalmology departments of the Bordeaux and Dijon university hospitals, and consisted of an ophthalmologic history, visual acuity and refraction measurements and two non-mydriatic 45 ° retinographies. The retinal photographs were interpreted according to the international classification and a modification of the classification system used in the multi-ethnic study of atherosclerosis for the size, location and area of druses. Participants were classified according to their worst eye into the following three exclusive groups:
  • the AMD cases had advanced AMD (geographic atrophy or neovascular disease) and the controls were free of any form of early or advanced AMD and had visual acuity better than 20/40.
  • the exclusion criteria for both cases and controls were the presence of glaucoma and the presence of diabetes.
  • Plasma samples were obtained from 55 subjects participating in the double-blind, randomized clinical trial entitled "Influence of lutein on the macula of people of AMD parents (LIMPIA)" - (Korobelnik JF, Rougier MB, Delyfer MN , Bron A, Merle BMJ, Savel H, Chene G, Delcourt C, Creuzot- Garcher C. Effect of Dietary Supplpiration With Lutein, Zeaxanthin, and omega- 3 on Macular Pigment: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmol 2017; 135: 1259 -66). Healthy adult participants aged 40 to 70 were recruited.
  • Each participant was randomized in a 1: 1 ratio to receive either two capsules per day of a dietary supplement containing lutein, zeaxanthin, vitamin C, vitamin E, zinc, copper, resveratrol and also fish oil rich in polyunsaturated fatty acids omega-3 (Nutrof Total, Laboratoires Théa) or a placebo containing paraffin.
  • Blood samples were taken at the start and after 3 and 6 months of supplementation. Whole blood was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to isolate the plasma from the red blood cells. Plasma samples were stored at -80 ° C until further analysis.
  • Case-control study The differences between cases and controls for the predicted content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina, total omega-3 polyunsaturated fatty acids in plasma and red blood cells, were assessed by regression linear mixed adjusted for age, body mass index, smoking, omega-3 supplement use, HDL cholesterol and LDL cholesterol, randomized for case-control pairs.
  • Supplementation Study Plasma cholesterol ester concentrations and the predicted omega-3 polyunsaturated fatty acid content of the retina were compared between supplementation participants and placebo participants using linear regression models adjusted for depending on age, sex, body mass index (BMI), HDL and LDL cholesterol.
  • Example 1 Identification of a biomarker for the content of omeqa-3 polyunsaturated fatty acids in the retina
  • Blood is a complex fluid made up of cellular components including white blood cells and red blood cells, platelets, and a liquid part called plasma.
  • Blood lipids are found mainly in the membranes of red blood cells and in particles of plasma lipoproteins.
  • the Red blood cell membranes are almost exclusively made up of phospholipids. Due to a lifespan of approximately 120 days, the fatty acid composition of phospholipids in red blood cells is representative of the long-term dietary intake of lipids.
  • plasma lipoproteins transport biologically important lipid compounds, such as chylomicrons and very low density lipoproteins (VLDL) which are structures mainly transporting triglycerides formed in the intestine and in the liver respectively from lipids and of dietary carbohydrates.
  • VLDL very low density lipoproteins
  • LDL and HDL low density lipoproteins
  • LDL and HDL high density lipoproteins
  • phospholipids especially the phosphatidylcholine subclass
  • cholesterol esters especially the phosphatidylcholine subclass
  • lipidomic analysis a set of data on the lipids present in the 4 blood compartments (red blood cells, total plasma, plasma phosphatidylcholines and plasma cholesterol esters), corresponding to 332 different species was generated.
  • the model with the lowest prediction error was obtained using an extension of the partial least squares regression method (sgPLS or sparse group PLS) and was characterized by a coefficient of correlation of 0.62 between the observed and predicted values of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina, obtained by cross-validation.
  • This predictor of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina is based on an algorithm combining the plasma concentrations of 7 species of cholesterol esters.
  • cholesterol esters identified are from the family of omega-3 polyunsaturated fatty acids, that is to say cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate, cholesteryl9,12,15-octadecatrienoate , cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate.
  • the four other cholesterol esters are from the family of omega-6 polyunsaturated fatty acids, namely cholesteryl 9,12-octadecadienoate, cholesteryl 6,9,12-octadecatrienoate, cholesteryl 8,11, 14-eicosatrienoate, cholesteryl 5,8,11,14-eicosatetraenoate.
  • the methyl esters of the aforementioned cholesterol esters are used in order to determine and measure the relative amount of the fatty acids of the cholesterol esters.
  • the method for determining the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids is detailed below:
  • the method for determining omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina can be broken down into several steps:
  • methyl esters of fatty acids from cholesterol esters, in other words, methyl esters are formed from the fatty acid resulting from the hydrolysis of the cholesterol ester; 5. Determination of the relative amounts of fatty acid methyl esters of cholesterol esters;
  • a blood sample is taken from a human subject by venipuncture in a tube treated with EDTA, citrate or heparin.
  • the tube containing the whole blood is centrifuged at 3000 revolutions per minute for 10 minutes at 4 ° C. in order to separate the plasma from the red blood cells.
  • the upper phase containing the plasma is taken and stored in a dry tube. Total plasma lipids can be extracted immediately or the plasma sample can be frozen pending further procedures.
  • Total plasma lipids are extracted by the method of Moilanen & Nikkari (Moilanen & Nikkari Clin Chim Acta 1981; 114 (1): 111 -116).
  • a glass tube 5 milliliters of a mixture of chloroform / methanol (1: 1, v: v) are added to a volume of about 450 microliters of plasma.
  • the tube is vortexed for 1 minute and then centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes.
  • the upper phase is isolated in another glass tube using a Pasteur pipette.
  • Four milliliters of chloroform are added to this second tube as well as 3 milliliters of acid sodium chloride (17mmol / L).
  • the tube is vortexed for 1 minute and then centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes.
  • the upper phase is removed using a Pasteur pipette while the lower phase containing the extract of plasma lipids is isolated in a glass pill container.
  • the extract of total lipids is first dried under a flow of nitrogen and then diluted in chloroform at a concentration of 10 mg / ml. Cholesterol esters can be isolated immediately from total lipids or frozen while awaiting further procedures.
  • Cholesterol esters are isolated from total lipids according to a procedure described in Bretillon et al 2008 (Bretillon et al Exp Eye Res 2008; 87 (6): 521-528). A glass plate covered with silica gel is washed beforehand in a migration tank containing 100 ml of ethyl acetate. It is then placed in an oven at 120 ° for 30 minutes to be activated.
  • the total lipids extracted are deposited on the plate in the form of a band of about 3 cm using a glass syringe then the plate is placed for 25 to 30 minutes in a chromatographic migration tank containing 101 milliliters of a mixture of hexane / ethyl ether / ethyl acetate (80: 20: 1, v: v: v). The plate is then removed from the tank and left in a hood for a few minutes. It is then exposed to a vaporization of 2 ', 7'-dichlorofluorescein and then observed under ultraviolet light at 366 nm.
  • the silica band containing the cholesterol esters located about 8 to 9 cm from the deposit is marked with a pencil and then scraped with a razor blade to be collected in a glass tube in which 1 milliliter of toluene is added.
  • Isolated cholesterol esters can be transmethylated immediately for chromatographic analysis or stored at 4 ° C pending further procedures.
  • the methyl esters of the fatty acids of the cholesterol esters are formed by transmethylation according to the method of Morrison & Smith (Morrison & Smith J Lipid Res 1964; 53: 600-608).
  • One milliliter of a mixture of Boron trifluoride / methanol (1: 1, v: v) is added to the tube containing the silica gel with the cholesterol esters and the toluene.
  • the tube is placed in an oven at 95 ° C. for 2 hours. It is then cooled to room temperature. After adding 5 milliliters of sodium bicarbonate and 5 milliliters of hexane, the tube is vortexed for 1 minute and then centrifuged at 3000 revolutions per minute for 3 minutes.
  • the upper phase is isolated in a glass tube using a Pasteur pipette. After drying the methyl esters of the fatty acids of the cholesterol esters under a nitrogen flow, they are diluted in 1 milliliter of hexane. The fatty acid methyl esters of cholesterol esters can be analyzed immediately by gas chromatography or stored at 4 ° C pending further procedures. Determination of the fatty acid profile of cholesterol esters The fatty acid profile of cholesterol esters is determined by gas chromatography coupled with flame ionization detection according to Acar et al (Acar et al PloS One 2012; 7 (4): e35102).
  • the methyl esters of the fatty acids of the cholesterol esters are injected into a gas chromatograph equipped with a CPSIL-88 column (100m x 0.25mm internal diameter, film thickness 0.20mm, Varian, Les Ulis, France ). Hydrogen is used as a carrier gas at a pressure of 210kPa.
  • the temperature of the chromatograph oven is 60 ° C for 5 minutes, then increased to 165 ° C at 15 ° C per minute. After being held at 165 ° C for 1 minute, it rose to 225 ° C at 2 ° C per minute. It is maintained at 225 ° C for 17 minutes.
  • the temperatures of the injector and the detector are set at 250 ° C.
  • Methyl esters of fatty acids are identified by comparison of their retention times with those of commercial standards. The relative proportions of the 25 species of methyl esters are calculated using the EZChrom Elite software (Agilent Technologies, Massy, France) and are expressed as a percentage of the total fatty acids of the cholesterol esters.
  • the mathematical algorithm makes it possible to predict, for a new sample (test sample), the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina from the assay of the 7 molecules of cholesterol esters in the plasma presented above.
  • This algorithm is based on the sparse group partial least squares ⁇ sgPLS ⁇ method described by Liquet et al (Liquet B et al. Bioinformatics. 2016 Jan 1; 32 (1): 35.42), which was applied to retinal, plasma and red blood cell samples collected from 46 human donors (training sample).
  • step 3 In order to obtain the prediction of the concentration of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina, the result obtained in step 3 is multiplied by the standard deviation of the concentration of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina. retina of the learning sample. The values thus obtained are added to the average concentration of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina of the training sample.
  • the cholesterol ester species of the omega-3 polyunsaturated fatty acid family have positively contributed to the estimation of the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina, whereas those of the omega-3 polyunsaturated fatty acids. family of omega-6 polyunsaturated fatty acids have lowered this estimated content, which is consistent with the well-established competitive metabolism of omega-3 and omega-6.
  • Example 2 Association between AMD and retinal status of omeqa-3 polyunsaturated fatty acids
  • Example 3 Sensitivity to dietary supplementation with omeqa-3 polyunsaturated aras acids of the predicted content of omeqa-3 polyunsaturated qras acids of the retina The sensitivity to dietary supplementation with omega-3 polyunsaturated fatty acids of the predicted content of omega-3 polyunsaturated fatty acids of the retina was therefore evaluated.
  • a blood biomarker of the omega-3 polyunsaturated fatty acid status of the retina based on the measurement of 7 plasma lipid species, inversely correlated with the risk of advanced AMD and increased with supplementation of polyunsaturated fatty acids omega-3, has been identified.
  • This blood biomarker is thus a reliable and precise tool for the preparation and conduct of clinical trials but also makes it possible to prevent the appearance of retinal pathologies linked to a deficiency in omega-3 polyunsaturated fatty acids as well as to diagnose deficiencies in omega-3 polyunsaturated fatty acids.
  • Example 4 Calculation of the predictive capacity of cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate (C20: 5 w3 methyl ester)
  • the inventors checked whether it was possible to determine the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina from a single cholesterol ester, cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate (C20: 5 w3 methyl ester) rather than from the 7 cholesterol esters identified by the sgPLS method.
  • the predictive capacity of cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate was evaluated by calculating the correlation coefficient between the content of omega-3 polyunsaturated fatty acids in the retina and those observed, estimated by cross-validation. in the training sample of 46 donors. A correlation coefficient r equal to 0.59 is obtained.
  • cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate is a blood biomarker of the omega-3 polyunsaturated fatty acid status of the retina, in the same way as the 7 esters of cholesterol identified.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d'un sujet comprenant la détermination de la teneur en au moins un ester de cholestérol dans un échantillon sanguin dudit sujet, le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine étant corrélé à la teneur dudit au moins un ester de cholestérol, ledit au moins un ester de cholestérol étant le cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate.

Description

Prédiction du contenu de la rétine en acides gras polyinsaturés oméga-3 à travers le dosage de 7 molécules d’esters de cholestérol
Domaine technique [0001] L’invention relève du domaine de l’ophtalmologie et plus précisément de la prédiction du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine.
Technique antérieure
[0002] La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une pathologie dégénérative de la partie centrale de la rétine, appelée macula. Elle touche principalement les personnes âgées et est responsable de 50% des cas de cécité dans les pays industrialisés. Environ 600000 personnes sont touchées par la maladie en France. Les formes avancées de DMLA (appelées DMLA néovasculaire et DMLA atrophique) sont associées à une perte de la vision, et sont généralement précédées par des anomalies précoces et asymptomatiques. [0003] L’étiologie de la DMLA est multifactorielle, et implique des facteurs génétiques mais aussi environnementaux comme l’alimentation. Dans ce contexte, le rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 ou oméga-3 suscite un intérêt croissant pour 3 raisons :
- les acides gras polyinsaturés oméga-3, et en particulier l’acide docosahexaénoïque (DHA), sont des constituants majeurs de la rétine où ils préviennent certains processus pathologiques observés dans la DMLA comme l’inflammation, la néovascularisation et la mort cellulaire ;
- des études ont montré un appauvrissement du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine de sujets atteints de DMLA ; - plus de 20 études épidémiologiques ont montré de manière très concordante une réduction du risque de DMLA de 40% chez les sujets ayant un apport alimentaire élevé en acides gras polyinsaturés oméga-3.
Ces données suggèrent donc un effet protecteur des acides gras polyinsaturés oméga-3 contre la DMLA. [0004] La famille des acides gras polyinsaturés oméga-3 regroupe notamment un acide gras précurseur, l’acide a-linoléique (ou C18:3n-3 ou ALA) et trois dérivés à longue chaîne, l’acide eicosapentaénoïque (ou C20:5n-3 ou EPA), l’acide docosapentaénoïque (ou C22:5n-3 ou DPAn-3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6n-3). L’ALA est un nutriment indispensable pour l’homme, car les organismes animaux sont incapables de le synthétiser de novo, et dépendent donc exclusivement d’un apport alimentaire. La synthèse de IΈRA, du DPAn-3 et du DHA à partir de l’ALA est possible chez l’homme mais très limitée. Il est donc recommandé d’apporter également ces acides gras à travers une alimentation riche en poissons et fruits de mer. Malgré ces recommandations, les apports alimentaires en acides gras polyinsaturés oméga-3 des français restent en deçà des recommandations issues des agences sanitaires.
[0005] Il est donc indispensable de pouvoir déterminer le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine.
[0006] Connaître les concentrations en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine est en effet une information importante pour : 1. identifier les sujets dont la rétine en est appauvrie et qui pourraient donc être à risque de DMLA, et 2. suivre l’efficacité d’une supplémentation nutritionnelle à base d’acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la restauration des teneurs physiologiques en ces acides gras dans la rétine.
[0007] Pour des raisons éthiques évidentes, il est cependant impossible de réaliser des biopsies de la rétine chez l’homme in vivo en vue d’un dosage biochimique de son contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3. Par conséquent, une mesure indirecte s’impose.
[0008] La mesure dans le sang ou le plasma des acides gras polyinsaturés oméga- 3 n’est par ailleurs pas suffisante pour déterminer le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine.
[0009] Il est donc nécessaire d’obtenir une méthode de détermination de la teneur en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine robuste et fiable.
[0010] Trois études ont tenté de corréler le contenu en acides gras circulants à celui de la rétine. Une première étude s’est limitée à étudier les associations des teneurs rétiniennes en acides gras polyinsaturés oméga-3 avec les teneurs sanguines en divers acides gras, sans tenter de prédire le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine, ni investiguer les structures lipidiques qui portent les acides gras dans le sang (phospholipides, esters de cholestérol, triglycérides...) (Gorusupudi et al. J Lipid Res 2016;57:499-508). La seconde a identifié les esters de cholestérol dans leur ensemble en tant que marqueurs circulants du contenu en DHA de la rétine (Bretillon et al. Exp Eye Res 2008;87:521- 528). La troisième a montré que le contenu en DHA des érythrocytes n’était pas un bon marqueur circulant du contenu en DHA de la rétine (Acar et al. PLoS ONE 2012;7:e35102).
[0011] Aucune de ces études n’a considéré le contenu global en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine (elles ont ciblé le DHA ou bien des ratios de concentrations d’acides gras oméga-6 / acides gras oméga-3).
[0012] Elles n’ont pas non plus permis de construire un modèle d’estimation du vrai contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 tel qu’il pourrait être mesuré à travers une analyse directe.
[0013] A ce jour, deux approches sont couramment utilisées pour évaluer de façon indirecte le contenu de la rétine en acides gras polyinsaturés oméga-3. La première est basée sur des apports alimentaires qui, à travers des questionnaires alimentaires, permettent chez un sujet d’évaluer la consommation de tel ou tel aliment riche en acides gras polyinsaturés oméga-3 et de l’extrapoler à un enrichissement tissulaire. La seconde consiste en une évaluation des teneurs en acides gras polyinsaturés oméga-3 circulants et là encore, d’extrapoler un enrichissement sanguin à un enrichissement tissulaire. Cette évaluation dans le compartiment sanguin peut être plus ou moins globale et concerner aussi bien le sang total, les érythrocytes, le plasma total ou bien différents compartiments du plasma (phospholipides et esters de cholestérol en majorité).
[0014] L’utilisation des apports alimentaires est confrontée à un grand nombre de difficultés, et en particulier à celles liées aux méthodes d’évaluation alimentaire : longueur et complexité des questionnaires alimentaires, biais de mémoire, difficultés de prise en compte de la grande complexité et de la variabilité quotidienne du régime alimentaire humain, imprécisions dans l’estimation des quantités d’aliments ingérées et dans la teneur en nutriments des aliments... [0015] Concernant l’utilisation de la composition lipidique du plasma/des différents compartiments du plasma, celle-ci est basée sur la supposition que la composition en acides gras des tissus périphériques (dont la rétine) suit le même schéma que celle du plasma. Or, il est connu que la relation entre les lipides alimentaires, les lipides plasmatiques et les lipides tissulaires est non linéaire car modulée par plusieurs autres facteurs tels que le métabolisme, la génétique, l’âge, le sexe ou le mode de vie (tabagisme, consommation d’alcool, activité physique). A ce jour, aucune étude n’a montré la validité absolue ou non de tel ou tel compartiment dans l’estimation du contenu en acides gras de la rétine, mis à part les deux études préliminaires précédemment citées montrant l’invalidité de l’utilisation des érythrocytes chez le sujet humain adulte et au contraire l’intérêt des esters de cholestérol dans leur ensemble.
Problème technique
[0016] Ainsi, et malgré un intérêt médical majeur, il est impossible à ce jour de mesurer le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine de façon fiable. Il est donc nécessaire de disposer d’un outil d’évaluation des acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine, autre que la méthode des apports alimentaires complexe à mettre en œuvre et imprécise et que la méthode basée sur la composition lipidique du plasma/des différents compartiments du plasma qui ne permet pas d’obtenir des résultats fiables concernant la teneur en acides gras dans la rétine.
[0017] Avantageusement, l’invention permet d’estimer le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine à travers le dosage sanguin d’au moins un ester de cholestérol.
[0018] Les inventeurs ont, par l’affinement dans l’usage des esters de cholestérol en tant que marqueur du contenu en acides gras polyinsaturés oméga 3 de la rétine, utilisé des valeurs de dosage d’un ester de cholestérol, préférentiellement de sept esters de cholestérol, au lieu des 25 présents dans le sang.
[0019] La méthode, basée sur la détermination de la teneur en esters de cholestérol permet une meilleure robustesse de la prédiction, et ce comparativement aux études et approches ayant déterminé les teneurs en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans les globules rouges et le sang total (r = 0,62 versus r = 0,40 pour les acides gras oméga-3 des lipides totaux du plasma et r = 0,14 pour les acides gras oméga-3 des globules rouges).
[0020] En effet, la construction et l'utilisation d’un modèle mathématique, permet avantageusement de prédire la concentration en acides gras polyinsaturés oméga- 3 de la rétine à partir d’une valeur de dosage d’un ester de cholestérol, préférentiellement de 7 esters de cholestérol dans le sang.
[0021] Cette approche est avantageusement axée sur un petit nombre d’esters de cholestérol plasmatiques, et est plus efficace et fiable pour déterminer le contenu rétinien en acides gras polyinsaturés oméga-3.
[0022] Ainsi, la présente invention a pour objet une méthode de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un sujet comprenant la quantification de la teneur en au moins un ester de cholestérol dans un échantillon sanguin dudit sujet, le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine étant corrélé à la teneur en esters de cholestérol.
[0023] L’invention a également pour objet une méthode de prévention d’une pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 par la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine selon la méthode de détermination selon l’invention.
[0024] L’invention concerne également une méthode de suivi de traitement d’une pathologie liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant les étapes d’administration d’au moins un traitement et de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine selon la méthode de détermination de l’invention.
[0025] L’invention concerne également une méthode de diagnostic de carences en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un patient à qui on a administré un traitement, selon la méthode de détermination de l’invention.
Exposé de l’invention [0026] Méthode de détermination du contenu en acides gras polvinsaturés oméqa-3
[0027] La présente invention concerne une méthode de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un sujet comprenant la détermination de la teneur en au moins un ester de cholestérol dans un échantillon sanguin dudit sujet, le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine étant corrélé à la teneur dudit au moins un ester de cholestérol, ledit au moins un ester de cholestérol étant le cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate.
[0028] En effet, et avantageusement, les inventeurs de la présente invention ont démontré que la détermination de la teneur en cholesteryl 5,8,11 ,14,17- eicosapentaenoate (C20:5 w3 methyl ester), préférentiellement contenu dans le plasma permet de prédire le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un sujet.
[0029] On entend par « contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine » la somme en pourcentage pondéral des acides gras totaux de l’ensemble des acides gras polyinsaturés oméga-3 présents dans la rétine, à savoir, la somme en pourcentage pondéral des acides gras totaux de l’acide a-linoléique (ou C18:3n- 3 ou ALA), de l’acide eicosapentaénoïque (ou C20:5 w-3 ou EPA), de l’acide docosapentaénoïque (ou C22:5 w-3 ou DPA w-3) et de l'acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6 w-3).
[0030] Selon un mode de réalisation de la méthode de détermination, la teneur en au moins six esters de cholestérol supplémentaires est déterminée.
[0031] Les esters de cholestérol sont choisis parmi le cholesteryl tetradecanoate, le cholesteryl pentadecanoate, le cholesteryl hexadecanoate, le cholesteryl 7- hexadecenoate, le cholesteryl 9-hexadecenoate, le cholesteryl heptadecanoate, le cholesteryl octadecanoate, le cholesteryl trans-9-octadecenoate, le cholesteryl cis- 9-octadecenoate, le cholesteryl 11 -octadecenoate, le cholesteryl 9,12- octadecadienoate, le cholesteryl eicosanoate, le cholesteryl 6,9,12- octadecatrienoate, le cholesteryl 11 -eicosenoate, le cholesteryl 9,12,15- octadecatrienoate, le cholesteryl 11 ,14-eicosadienoate, le cholesteryl 5,8,11- eicosatrienoate, le cholesteryl 8,11 ,14-eicosatrienoate, le cholesteryl 5,8,11 ,14- eicosatetraenoate, , le cholesteryl 15-tetracosenoate, le cholesteryl 7,10,13,16- docosatetraenoate, le cholesteryl 4,7,10,13,16-docosapentaenoate, le cholesteryl 7,10,13,16,19-docosapentaenoate, et le cholesteryl 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoate. [0032] La nomenclature des esters de cholestérol est détaillée dans le tableau 1.
[0033] [tableau 1]
[0034] Selon un mode de réalisation, les 6 esters de cholestérol supplémentaires sont le cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, le cholesteryl 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoate, le cholesteryl 9,12-octadecadienoate, le cholesteryl 6,9,12- octadecatrienoate, le cholesteryl 8,11 ,14-eicosatrienoate, le cholesteryl 5,8,11 ,14- eicosatetraenoate.
[0035] Ainsi, et selon un mode de réalisation, la teneur en 7 esters de cholestérol est déterminée.
[0036] Les inventeurs ont en effet, identifié outre le cholesteryl 5,8,11 ,14,17- eicosapentaenoate, six esters de cholestérol supplémentaires que sont le cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, le cholesteryl 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoate, le cholesteryl 9,12-octadecadienoate, le cholesteryl 6,9,12- octadecatrienoate, le cholesteryl 8,11 ,14-eicosatrienoate, le cholesteryl 5,8,11 ,14- eicosatetraenoate), parmi les vingt-cinq présents dans le sang qui permettent d’obtenir une détermination fiable et précise du contenu en acides gras polyinsaturés omega-3 de la rétine.
[0037] On entend par « teneur en au moins un ester de cholestérol », le pourcentage pondéral en au moins un acide gras des esters de cholestérol.
[0038] L’homme du métier pourra utiliser toute méthode connue pour déterminer la teneur en ester de cholestérol.
[0039] Selon un mode de réalisation et pour déterminer la teneur en ester de cholestérol, une méthode consiste en une étape de trans-estérification.
[0040] L’étape de trans-estérification correspond à une catalyse acide dans laquelle la partie stérol de l'ester de cholestérol est échangée contre un groupement alkyl. Le groupement alkyl est choisi parmi le méthyl, le propyl, ou le butyl.
[0041] Selon un mode de réalisation, l’étape de trans-estérification est une étape de trans-méthylation des acides gras des esters de cholestérol.
[0042] La teneur en ester de cholestérol peut en effet être déterminée par la formation des esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol. Les esters méthyliques des esters de cholestérol sont obtenus après trans-méthylation des acides gras de l’ester de cholestérol correspondant.
[0043] Typiquement, les esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol sont formés après transméthylation des acides gras selon la méthode de Morrison & Smith (Morrison & Smith J lipid Res 1964 ;53 :600-608). [0044] Les esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol identifiés selon la présente invention sont le 9,12,15-octadecatrienoic acid methyl ester (C18:3 w-3 methyl ester), le 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid methyl ester (C22:6 w-3 methyl ester), le 9,12-octadecadienoic acid methyl ester (C18:2 w-6 methyl ester), le 6,9,12-octadecatrienoic acid methyl ester (C18:3 w-6 methyl ester), le 8,11 ,14-eicosatrienoic acid methyl ester (C20:3 w-6 methyl ester), le 5,8,11 ,14- eicosatetraenoic acid methyl ester (C20:4 w-6 methyl ester), le 5,8,11 ,14,17- eicosapentaenoate acid methyl ester (C20:5 w-3 methyl ester).
[0045] Selon un mode de réalisation, le contenu pondéral relatif de chacun des 25 esters méthyliques d’acides gras des esters de cholestérol est déterminé.
[0046] Le contenu pondéral relatif des esters méthyliques des acides gras est analysé et déterminé par toute méthode connue de l’homme du métier, typiquement par chromatographie en phase gazeuse couplée à une détection à ionisation de flamme, telle que décrit dans Acar et al. (Acar et al PLoS One 2012;7(4) : e35102).
[0047] Les proportions relatives des 25 espèces d’esters méthyliques sont calculées et exprimées en pourcentage des acides gras totaux des esters de cholestérol. Typiquement, les proportions sont calculées, à partir de tout logiciel d’intégration de données connu de l’homme du métier, par exemple à l’aide du logiciel EZChrom Elite (Agilent technologies, Massy, France) et sont exprimées en pourcentage des acides gras totaux des esters de cholestérol.
[0048] Cette étape permet de déterminer le pourcentage pondéral en au moins un acide gras des esters de cholestérol et donc de déterminer la teneur en chaque ester de cholestérol
[0049] On entend par « corrélation », le calcul de la valeur estimée du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine à partir de la teneur d’au moins un ester de cholestérol, préférentiellement à partir de la teneur d’au moins 7 esters de cholestérol et préférentiellement encore à partir de la teneur en 7 esters de cholestérol.
[0050] Typiquement, le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine est estimé à l’aide d’un algorithme basé sur la teneur d’au moins 1 ester de cholestérol, préférentiellement basé sur la teneur d’au moins 7 esters de cholestérol et préférentiellement encore à l’aide d’un algorithme basé sur la teneur de 7 esters de cholestérol.
[0051 ] Typiquement, le calcul est réalisé par tout algorithme qui permet de prédire, pour un nouvel échantillon, le contenu en acide gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine à partir du dosage d’au moins 1 ester de cholestérol, préférentiellement à partir d’au moins 7 esters de cholestérol et préférentiellement encore à partir de 7 esters de cholestérol.
[0052] A titre illustratif, et pour la détermination de la teneur en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine à partir d’un ester de cholestérol, l’algorithme est basé sur une régression linéaire selon la formule :
[0053] [Math. 1]
(4.1717 x C20: 5 w3 EC) où C20:5 w3 EC correspond à la teneur en cholesteryl 5,8,11 ,14,17- eicosapentaenoate, centrée et réduite suivant la distribution dans l’échantillon d’apprentissage (voir Tableau 2 ci-dessous).
[0054] A titre illustratif également, et pour la détermination de la teneur en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine à partir d’au moins 7 esters de cholestérol, l’algorithme est basé sur la méthode sparse groupe partial least squares (sgPLS) décrite par Liquet et al. (Liquet B et al. Bioinformatics. 2016 Jan 1 ;32(1) :35-42).
[0055] L’algorithme comprend et préférentiellement consiste en 4 étapes :
[0056] 1 . Plusieurs sommes et ratios sont calculés à partir du dosage d’au moins sept esters de cholestérol. Le dosage d’esters de cholestérol contenus dans le plasma est un dosage indirect. Les esters de cholestérol subissent une trans estérification qui conduit à des esters méthyliques d’acides gras. Les esters méthyliques d’acides gras ainsi obtenus sont quantifiés par des méthodes connues, par exemple par chromatographie en phase gazeuse. La quantité relative en un ester méthylique d’acide gras correspond à un pourcentage des esters méthyliques d’acides gras totaux.
[0057] Dans un mode de réalisation, les sommes et ratios présents dans la formule mathématique ci-après reproduite (math. 2), sont calculés à partir des dosages des 7 molécules d’intérêt issues des 25 esters méthyliques d’acides gras des esters de cholestérol.
[0058] Les 7 molécules d’intérêt issues des 25 esters méthyliques d’acides gras des esters de cholestérol sont les suivantes : 9,12,15-octadecatrienoic acid methyl ester (C18:3 w-3 methyl ester), 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoic acid methyl ester (C20:5 w-3 methyl ester), 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid methyl ester (C22:6 w-3 methyl ester), 9,12-octadecatrienoic acid methyl ester (C18:2 w -6 methyl ester), 6,9,12-octadecatrienoic acid methyl ester (C18:3 w -6 methyl ester), 8,11 ,14- eicosatrienoic acid methyl ester (C20:3 w -6 methyl ester), 5,8,11 ,14-eicosatrienoic acid methyl ester (C20:4 w -6 methyl ester).
[0059] La formule mathématique est ci-après détaillée
[0060] [Math. 2] :
(0,117939545 x C20:5w3_EC) + (0,000429538 x C22:6w3_EC) + (0,127303513 x Tot_w3_EC) - (0,089285375 x ratio_w6_w3_EC) + (0,12438627 x ratio_dietw3_w6_EC) + (0,095117859 x ratio_EPADPAw3DHA_AA_EC) - (0,086291782 x ratio_AA_EPA_EC) + (0,115467043 x tot_ w3_LC_EC) dans laquelle :
- C20:5w3_EC correspond à la teneur en cholesteryl 5,8,11 ,14,17- eicosapentaenoate ;
- C22:6w3_EC correspond à la teneur en cholesteryl 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoate
- Tot_w3_EC correspond à la somme des teneurs en cholesteryl 9,12,15- octadecatrienoate, cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate cholesteryl
7.10.13.16.19-docosapentaenoate, cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate
- ratio_w6_w3_EC correspond au ratio de la somme des teneurs en cholesteryl 9,12-octadecadienoate, cholesteryl 6,9,12-octadecatrienoate, cholesteryl 11 ,14- eicosadienoate, cholesteryl 5,8,11 ,14-eicosatetraenoate, cholesteryl 7,10,13,16- docosatetraenoate, cholesteryl 4,7,10,13,16-docosapentaenoate sur la somme des teneurs en cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, cholesteryl 5,8,11 ,14,17- eicosapentaenoate, cholesteryl 7, 10, 13, 16,19-docosapentaenoate, cholesteryl
4.7.10.13.16.19-docosahexaenoate - ratio_dietw3_w 6_EC correspond au ratio de la somme des teneur en cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate et cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate sur la teneur en cholesteryl 9,12- octadecadienoate - ratio_EPADPAw 3DHA_AA_EC correspond au ratio de la somme des teneurs en cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate, cholesteryl 7,10,13,16,19- docosapentaenoate, cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate sur la teneur en cholesteryl 5,8,11 ,14-eicosatetraenoate
- ratio_AA_EPA_EC correspond au ratio de la teneur en cholesteryl 5,8,11,14- eicosatetraenoate sur la teneur en cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate
- tot_w 3_LC_EC correspond à la somme des teneurs en cholesteryl 5,8,11,14,17- eicosapentaenoate, cholesteryl 7,10,13,16,19-docosapentaenoate, cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate.
[0061] 2. L’ensemble des paramètres sont centrés et réduits en utilisant les moyennes et écart-types de l’échantillon d’apprentissage (l’échantillon test étant supposé issu de la même distribution que l’échantillon d’apprentissage).
Les moyennes et écarts-types de l'échantillon d'apprentissage sont fournis dans le tableau suivant :
[0062] [Tableau 2]
[0063] 3. Calcul de la formule mathématique à partir de l’échantillon test centré- réduit. [0064] 4. Afin d’obtenir la prédiction de la concentration en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine, le résultat obtenu à l’étape 3 est multiplié par l’écart-type de la concentration en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine de l’échantillon d’apprentissage. Les valeurs ainsi obtenues sont additionnées à la moyenne de la concentration en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine de l’échantillon d’apprentissage.
[0065] L’écart-type et la moyenne de la concentration en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine de l’échantillon d’apprentissage sont les suivantes :
- Moyenne : 16,64348
- Ecart-type : 2,915459
[0066] On entend par « échantillon d’apprentissage », l’échantillon de 46 donneurs post-mortem, auquel la méthode sgPLS a été appliquée afin d’obtenir l’algorithme de prédiction.
[0067] On entend par « échantillon test » l’échantillon sanguin du sujet dont on cherche à déterminer la teneur rétinienne en acides gras oméga 3.
[0068] Selon la méthode selon l’invention, l’échantillon sanguin est choisi parmi le sang total, le sérum et le plasma.
[0069] Préférentiellement, l’échantillon est le plasma.
[0070] Dans un mode de réalisation, la méthode selon l’invention comprend une étape de prélèvement sanguin et d’isolement du plasma. L’homme du métier pourra utiliser toute méthode connue d’isolement du plasma. Typiquement, le plasma pourra être séparé des globules rouges par centrifugation d’un échantillon de sang total.
[0071 ] La méthode selon l’invention comprend en outre une étape d’extraction des lipides totaux.
[0072] Les lipides totaux pourront eux être extraits à partir d’un échantillon sanguin, par toute méthode connue de l’homme du métier. Typiquement, les lipides totaux du plasma, du sang et du sérum sont extraits par la méthode de Moilanen & Nikkari (Moilanen & Nikkari Clin Chim Acta 1981 ;114(1) :111-116). [0073] La méthode selon l’invention comprend en outre une étape d’isolement des esters de cholestérol à partir des lipides totaux.
[0074] Typiquement, les esters de cholestérol seront isolés à partir des lipides totaux, par toute méthode connue de l’homme du métier. A titre illustratif, les esters de cholestérol sont isolés à partir des lipides totaux selon une procédure décrite dans Bretillon et al 2008 (Bretillon et al Exp Eye Res 2008 ;87(6) :521-528).
[0075] Méthode de prévention d’une pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polvinsaturés oméqa-3
[0076] L’invention concerne une méthode de prévention d’une pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine selon la méthode de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 selon l’invention.
[0077] On entend par « pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga 3 » toute pathologie associée, au moins en partie, à une diminution du contenu en acides gras polyinsaturés de la rétine.
[0078] En effet, en tant que composants majeurs de la rétine humaine, les acides gras polyinsaturés oméga-3, et en particulier le DHA, sont essentiels à la structure et à la fonction de la rétine (SanGiovanni, J. P. & Chew, E.Y. The rôle of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Prog Retin Eye Res 24, 87-138 (2005)). La plus forte teneur en acides gras polyinsaturés oméga-3 se trouve dans les membranes externes des cellules photoréceptrices rétiniennes (Fliesler, S. J. & Anderson, R.E. Chemistry and metabolism of lipids in the vertebrate retina. Prog Lipid Res 22, 79-131 (1983)), où ils exercent des fonctions biologiques importantes par le biais d'activités anti-inflammatoires, anti- apoptotiques et anti-angiogéniques. Dans des études post-mortem, la concentration de DHA était significativement plus basse dans les yeux atteints d’une pathologie rétienne que chez les témoins du même âge (Liu, A., Chang, J., Lin, Y., Shen, Z. & Bernstein, P. S. Long-chain and very long-chain polyunsaturated fatty acids in ocular aging and age-related macular degeneration. J Lipid Res 51 , 3217-3229 (2010)). [0079] Selon un mode de réalisation, la pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga 3 est une rétinopathie telle que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie du prématuré.
[0080] La néovascularisation oculaire est la cause la plus fréquence de cécité, et ce chez toutes les populations de patients, quel que soit leur âge : rétinopathie du prématuré chez les enfants, rétinopathie diabétique chez les adultes et dégénérescence maculaire liée à l’âge chez les personnes âgées. Un modèle animal a été élaboré afin d’étudier la rétinopathie (évaluation de l’apparition des néovaisseaux rétiniens, et de la croissance de ces vaisseaux après lésion sur un œil de souris).
[0081] L’influence des acides gras polyinsaturés oméga-3 et oméga-6 sur la croissance vasculaire après lésion et la néovascularisation pathologique ainsi induite ont été étudiés sur un modèle de souris présentant une rétinopathie induite par hypoxie. Il a été démontré que l’augmentation des apports en acides gras polyinsaturés oméga-3 réduit l’angiogenèse pathologique. La prise d’une supplémentation en acides gras polyinsaturés oméga-3 serait donc avantageuse dans la prévention de la rétinopathie (Kip M Connor et al., (2007), Increased dietary intake of w-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nature Medecine ; doi:10.1038/nm1591).
[0082] Dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)
[0083] Selon un mode de réalisation, la pathologie est la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA).
[0084] Il a en effet été démontré que le contenu en acides gras polyinsaturés de la rétine de sujet atteints de la DMLA était diminué (Liu, A., Chang, J., Lin, Y., Shen, Z. & Bernstein, P. S. Long-chain and very long chain polyunsaturated fatty acids in ocular aging and age-related macular degeneration. J Lipid Res 51 , 3217-3229 (2010).
[0085] De nombreuses publications ont également décrit la réduction du risque de DMLA associée à un apport alimentaire élevé en acides gras polyinsaturés oméga- 3 (Chong, E.W., Kreis, A.J., Wong,T.Y., Simpson, J. A. & Guymer, R. H. Dietary omega-3 fatty acid and fish intake in the primary prévention of age-related maculair degeneration : a systematic review and metaanalysis. Arch Ophthalmol 126, 826- 833 (2008)), ainsi que la réduction du risque de DMLA associée à une concentration sanguine élevée en acides gras polyinsaturés oméga-3 (Merle BM, DElyfer MN, Korobelnik JF, Rougier MB, Malet F, Feart C, Le Goff M, Peuchant E, Letenneur L, Dartigues JF, Colin J, Barberger-Gateau P, Delcourt C. High Concentrations of plasma n3 Fatty Acids Are Associated with Decreased Risk for Late Age-Related macular Degeneration. J Nutr 143:505-11 (2013).
[0086] Les stades précoces et intermédiaires de la DMLA comportent des altérations de l’épithélium pigmentaire à type d’hypo- ou d’hyperpigmentation et des drusen et ne sont pas responsables d’altération importante de la fonction visuelle.
[0087] Les stades avancés (DMLA) correspondent aux formes exsudatives (humides ou néovasculaires) et aux formes atrophiques (sèches), responsables d’altérations sévères de la vision centrale. Selon les études, la prévalence de DMLA exsudative représente 35 à 65 % des stades avancés.
[0088] DMLA précoce et intermédiaire :
[0089] Les DMLA précoce et intermédiaire associent un ou plusieurs des éléments suivants entre eux :
- drusen intermédiaires : petites taches jaunâtres asymptomatiques observées dans la région périmaculaire (diamètre compris entre 63 mm et 125 mm ) ;
- grands drusen (également dits « séreux ») : drusen de plus grande taille (supérieur à 125 mm), le plus souvent asymptomatiques mais pouvant s’accompagner d’une diminution des capacités visuelles à l’obscurité ;
- altérations pigmentaires à type d'hypopigmentation ou d’hyperpigmentation de l'épithélium pigmentaire. Elles traduisent la mort des cellules de l’épithélium pigmentaire.
[0090] DMLA exsudative
[0091] La DMLA exsudative est caractérisée par la prolifération de néovaisseaux choroïdiens qui traversent la membrane de Bruch et se développent sous l’épithélium pigmentaire ou dans l’espace sous-rétinien. [0092] DMLA atrophique [0093] La DMLA atrophique (ou atrophie géographique) est caractérisée une ou plusieurs plages de dépigmentation de la rétine, d’au moins 175 mm de diamètre, avec des bords nets et une visibilité accrue des vaisseaux choroïdiens.
[0094] La classification simplifiée en quatre stades pour le diagnostic et le suivi de la DMLA peut être utilisée et ce telle que représentée dans le tableau 3 (Ferris FL, 3rd, Wilkinson CP, Bird A, Chakravarthy U, Chew E, Csaky K, Sadda SR. Clinical classification of age-related macular degeneration. Ophthalmology 2013;120:844- 51).
[0095] [tableau 3]
0096] Les formes avancées de DMLA correspondent à la catégorie 4 et incluent les formes néovasculaires et l’atrophie géographique. Il s’agit de patients ayant en général déjà une baisse de l’acuité visuelle.
[0097] Rétinopathie diabétique
[0098] La rétinopathie diabétique (RD) est une complication micro vasculaire du diabète représentant la première cause de cécité aux États-Unis et en Europe avant 50 ans.
[0099] L’excès de sucre dans le sang fragilise la paroi des capillaires. Il s’ensuit la rupture puis l’éclatement des vaisseaux rétiniens. Au fur et à mesure, des zones étendues de la rétine ne sont plus oxygénées. En réaction, la rétine produit de nouveaux vaisseaux encore plus fragiles. Le phénomène s'amplifie et s'étend jusqu'à la macula où se situe le centre de la vision. La macula s'épaissit, il se produit un œdème maculaire, responsable alors d’une baisse de l’acuité visuelle qui peut être très importante et que partiellement réversible (Fédération Française des Diabétiques, la rétinopathie diabétique et les maladies des yeux).
[0100] Les acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPLC), tels que l’acide docosahexaénoïque (DHA, C:22 6n-3) et l’acide arachidonique (AA, C20:4n-6) jouent un rôle clé dans la pathogenèse du diabète, au même titre que les métabolismes du glucose et des lipides.
[0101] Il a été démontré que les AGPLC de la famille n-3 inhibent de nombreux processus cellulaires et biochimiques impliqués dans la physiopathologie de la rétinopathie diabétique et préviennent les dommages vasculaires rétiniens causés par le diabète (Koehrer P, Saab S, Berdeaux O, Isaico R, Grégoire S, et al. (2014) Erythrocyte Phospholipid and Polyunsaturated Fatty Acid Composition in Diabetic Retinopathy. PLoS ONE 9(9): e106912. doi:10.1371/journal.pone.0106912 ).
[0102] Sala-Vila, A. et al. (Dietary Marine w-3 Fatty Acids and Incident Sight- Threatening Retinopathy in Middle-Aged and Older Individuals With Type 2 Diabètes: Prospective Investigation From the PREDIMED Trial. JAMA Ophthalmol 134(10):1142-1149 (2016)), ainsi que Sasaki, M. et al. (The Associations of Dietary Intake of Polyunsaturated Fatty Acids With Diabetic Retinopathy in Well-Controlled Diabètes. Invest Ophthalmol Vis Sci 56(12):7473- 7479 (2015)) ont également mis en évidence des anomalies du métabolisme des acides gras polyinsaturés omega-3 chez des sujets atteins de la rétinopathie diabétique.
[0103] De nombreux articles montrent également une prévention des dysfonctions rétiniennes consécutives au diabète chez l’animal (Shen, J. H. et al. Effect of a- linolenic acid on streptozotocin-induced diabetic retinopathy indices in vivo. Arch Med Res 44(7), 514-520 (2013), Tikhonenko, M. et al. N-3 polyunsaturated Fatty acids prevent diabetic retinopathy by inhibition of retinal vascular damage and enhanced endothélial progenitor cell reparative function. PLoS One 8(1):e55177 (2013), Sapieha, P. et al. Omega-3 polyunsaturated fatty acids preserve retinal function in type 2 diabetic mice. Nutr Diabetes 23;2:e36. doi: 10.1038/nutd.2012.10 (2012), Tikhonenko, M. et al. Remodeling of retinal Fatty acids in an animal model of diabetes: a decrease in long-chain polyunsaturated fatty acids is associated with a decrease in fatty acid elongases Elovl2 and Elovl4. Diabetes 59(1 ):219-227 (2010)).
[0104] Rétinopathie du prématuré
[0105] La rétinopathie du prématuré (ROP) est une maladie neuro-vasculaire affectant les enfants prématurés. Cette pathologie est induite par une variété de facteurs qui induisent une première phase de réduction de la croissance des vaisseaux rétiniens et de dégénérescence micro-vasculaire et une seconde phase de néovascularisation pathologique, qui peut entraîner un décollement de la rétine.
[0106] Le développement du cerveau et de la rétine a lieu au cours du troisième trimestre de grossesse. Les acides gras polyinsaturés à longue chaîne sont sélectivement transférés de la mère au fœtus. Parmi ceux-ci, l’acide docosahexaénoïque (DHA) et l’acide arachidonique (AA) sont les plus abondants.
[0107] Avec les soins courants, les enfants prématurés reçoivent d’insuffisantes quantités de DHA et d’AA comme en témoigne le faible taux sérique de ces acides gras.
[0108] Les résultats d’études in vivo sur des animaux, comparant les apports nutritionnels en oméga-3 et oméga-6 suggèrent que ces lipides alimentaires essentiels affectent la santé rétinienne. Des recherches menées sur les acides gras polyinsaturés à longue chaîne se sont principalement focalisées sur le rôle des oméga-3 et ont démontré que les acides gras polyinsaturés à longue chaîne et plus particulièrement le DHA est essentiel pour le développement du cerveau et des yeux.
[0109] Il a également été constaté que de faibles niveaux sériques d’acide arachidonique seraient impliqués dans la pathogénèse de la rétinopathie du prématuré (Chatarina A. Lôfqvist, PhD; Svetlana Najm, MD; Gunnel Hellgren, PhD; Eva Engstrôm, MD, PhD; Karin Sävman, MD, PhD; Anders K. Nilsson, PhD; Mats X. Andersson, PhD; Anna-Lena Hård, MD, PhD;Lois E. H. Smith, MD, PhD; Ann Hellstrôm, MD, PhD, 2018, Association of Retinopathy of Prematurity With Low Levels of Arachidonic Acid, A Secondary Analysis of a Randomized Clinical Trial, JAMA Ophthalmol. doi:10.1001/jamaophthalmol.2017.6658).
[0110] Cette mise en évidence des anomalies du métabolisme des acides gras polyinsaturés oméga-3 chez les enfants atteints de rétinopathie du prématuré a également été décrite par Pallot, C. et al. (Alteration of érythrocyte membrane polyunsaturated fatty acids in preterm newborns with retinopathy of prematurity. Sci Rep 9, 7930 (2019)) et Martin, C. R. et al. (Decreased postnatal docosahexaenoic and arachidonic acid blood levels in prématuré infants are associated with néonatal morbidities. J Pediatr 159, 743-749, e741-742 (2011 )).
[0111] Deux articles montrent également les effets des acides gras polyinsaturés omega-3 et de leurs dérivés oxygénés sur le phénotype rétinien chez un modèle animal de rétinopathie du prématuré (Connor, K. M. et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med 13, 868-873 (2007) et Stahl, A. et al. Lipid métabolites in the pathogenesis and treatment of neovascular eye disease. Br J Ophthalmol 95, 1496-1501 (2011 )).
[0112] Méthode de prévention
[0113] Les termes « prévention » ou « méthode de prévention » ne sont pas des termes absolus et, lorsqu’ils sont appliqués à une pathologie rétinienne associée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga 3 telle qu’une rétinopathie, ils désignent une procédure ou un plan d’action conçu, même avec une probabilité de succès faible mais devant induire un effet bénéfique global tel que le retard d’apparition de la pathologie, ou la diminution de la gravité d’un ou plusieurs symptômes ou la stabilisation de la pathologie.
[0114] Typiquement, dans le cas de la DMLA et de la rétinopathie diabétique, la prévention s’entend de la prévention de la pathologie mais également de la prévention de l’aggravation de la pathologie.
[0115] La prévention de la DMLA ou de la rétinopathie diabétique s’entend du retard de l’apparition de la pathologie.
[0116] La prévention de l’aggravation de la DMLA ou de la rétinopathie diabétique s’entend du retard de la perte de vision ou de la perte d’acuité visuelle chez le patient atteint de DMLA ou de rétinopathie diabétique. [0117] Typiquement, dans le cas de la rétinopathie du prématuré, la prévention s’entend de la prévention de l’apparition de la pathologie à la prévention de la sévérité de la pathologie.
[0118] Typiquement, une augmentation du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine est associée à une diminution du risque d’apparition et/ou d’aggravation de la pathologie et/ou de sévérité.
[0119] La méthode de prévention selon l’invention est une méthode de prévention in vitro basée sur la détermination in vitro du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine. La détermination est en effet réalisée sur un échantillon sanguin choisi parmi le sang total, le sérum et le plasma, préférentiellement le plasma.
[0120] Méthode de traitement d’une pathologie rétinienne liée à un déficit en oméqa-3
[0121] L’invention concerne également une méthode de traitement d’une pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant:
- la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un sujet comprenant la quantification de la teneur en au moins 1 ester de cholestérol dans un échantillon sanguin dudit sujet, le contenu en en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine étant corrélé à la teneur dudit au moins un ester de cholestérol, ledit au moins un ester de cholestérol étant le cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate ;
- l’administration d’un traitement chez le sujet en ayant besoin.
[0122] Typiquement, la pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 est une rétinopathie telle que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré.
[0123] Ainsi, l’invention concerne également une méthode de traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge comprenant :
- la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un sujet comprenant la quantification de la teneur en au moins 1 ester de cholestérol dans un échantillon sanguin dudit sujet, le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine étant corrélé à la teneur dudit au moins un ester de cholestérol, ledit au moins un ester de cholestérol étant le cholesteryl
5,8,11,14,17-eicosapentaenoate ;
- l’administration d’un traitement chez le sujet en ayant besoin.
[0124] Typiquement, ledit traitement pourra être choisi parmi une supplémentation nutritionnelle à base d’acides gras polyinsaturés oméga-3 associée ou non à l’administration de vitamines et minéraux.
[0125] L’invention concerne également une méthode de traitement de la rétinopathie diabétique comprenant :
- la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un sujet comprenant la quantification de la teneur en au moins 1 ester de cholestérol dans un échantillon sanguin dudit sujet, le contenu en en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine étant corrélé à la teneur dudit au moins un ester de cholestérol, ledit au moins un ester de cholestérol étant le cholesteryl
5,8,11,14,17-eicosapentaenoate ;
- l’administration d’un traitement chez le sujet en ayant besoin.
[0126] Typiquement, ledit traitement pourra être choisi parmi une supplémentation nutritionnelle à base d’acides gras polyinsaturés oméga-3 associée ou non à l’administration de vitamines et minéraux.
[0127] L’invention concerne également une méthode de traitement de la rétinopathie du prématuré comprenant :
- la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un sujet comprenant la quantification de la teneur en au moins 1 ester de cholestérol dans un échantillon sanguin dudit sujet, le contenu en en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine étant corrélé à la teneur dudit au moins un ester de cholestérol, ledit au moins un ester de cholestérol étant le cholesteryl
5,8,11,14,17-eicosapentaenoate ;
- l’administration d’un traitement chez le sujet en ayant besoin.
[0128] Typiquement, ledit traitement pourra être choisi parmi une supplémentation nutritionnelle à base d’acides gras polyinsaturés oméga-3 associée ou non à l’administration de vitamines et minéraux. [0129] Méthode de suivi de traitement d’une pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polvinsaturés oméqa-3
[0130] L’invention concerne une méthode de suivi de traitement d’une pathologie liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant les étapes :
- d’administration d’au moins un traitement ;
- de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine selon la méthode de détermination selon l’invention.
[0131] L’invention concerne également une méthode de suivi de traitement d’une pathologie liée à une déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un patient à qui il a été administré un traitement, selon la méthode de détermination selon l’invention.
[0132] Typiquement, le traitement est une supplémentation nutritionnelle à base d’acides gras polyinsaturés oméga-3 associée ou non à l’administration de vitamines et minéraux.
[0133] Selon un mode de réalisation, la pathologie est une rétinopathie choisie parmi la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie du prématuré.
[0134] Parmi les stratégies préventives émergentes, les acides gras polyinsaturés oméga-3 permettent de promouvoir une structure et une fonction rétiennes normales, ainsi que de réduire l’incidence et de ralentir la progression de la DMLA (SanGiovanni, J. P. & Chew, E.Y. The rôle of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Prog Retin Eye Res 24, 87-138 (2005)) mais également de prévenir toutes les rétinopathies (Kip M Connor et al., (2007), Increased dietary intake of w-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nature Medecine ; doi:10.1038/nm1591).
[0135] Typiquement, une augmentation du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 du contenu de la rétine est synonyme d’efficacité du traitement.
[0136] La méthode de suivi selon l’invention est une méthode de suivi in vitro basée sur la détermination in vitro du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine. La détermination est en effet réalisée sur un échantillon sanguin choisi parmi le sang total, le sérum et le plasma, préférentiellement le plasma.
[0137] Méthode de diagnostic de carences en acides gras polvinsaturés oméqa-3
[0138] L’invention concerne une méthode de diagnostic de carences en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine selon la méthode de détermination selon l’invention.
[0139] On entend par « carences en acides gras polyinsaturés oméga-3 », un déficit en acide gras polyinsaturés par rapport à un sujet sain, i.e., un sujet ne présentant pas de carences en acides gras polyinsaturés.
[0140] Typiquement, une diminution du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 du contenu de la rétine est synonyme de carence en acides gras polyinsaturés oméga-3.
[0141] Dans un mode de réalisation, la comparaison avec un échantillon témoin est réalisée. On entend par « échantillon témoin », la distribution des valeurs chez des sujets sains, i.e., des sujets ne présentant pas de carences en acides gras polyinsaturés. Le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine des sujets sains du groupe témoin est déterminé par la méthode selon l’invention.
[0142] La méthode de diagnostic selon l’invention est une méthode de diagnostic in vitro basée sur la détermination in vitro du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine. La détermination est en effet réalisée sur un échantillon sanguin choisi parmi le sang total, le sérum et le plasma, préférentiellement le plasma.
Exemples
[0143] Dans les exemples qui suivent, les inventeurs ont déterminé les lipides circulants ayant la performance prédictive la plus élevée afin de déterminer le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine.
[0144] Dans ces exemples, des données émanant de prélèvement d’yeux et de sang de donneurs ont permis d’établir un algorithme basé sur la concentration plasmatique de sept espèces d’esters de cholestérol, permettant de déterminer le contenu rétinien en acides gras oméga-3 (exemple 1).
[0145] Les inventeurs ont par ailleurs démontré l’association entre DMLA et statut rétinien en acides gras polyinsaturés oméga-3 (exemple 2) ainsi que l’impact d’une supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés oméga-3 (exemple 3), montrant ainsi que la combinaison de ces sept esters de cholestérol constitue un biomarqueur qui permet de mettre au point une médecine personnalisée pour identifier les sujets à risque de rétinopathie et plus particulièrement de DMLA et/ou de surveiller les supplémentations en acides gras polyinsaturés oméga-3. La capacité prédictive du seul cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate a également été démontrée à l’exemple 4.
[0146] Matériels et Méthodes
[0147] Dans les exemples qui suivent, les matériels et méthodes ci-après détaillés ont été utilisés.
[0148] Les études sur des sujets humains ont été menées conformément aux directives de la Déclaration d'Helsinki. Des consentements écrits ont été obtenus et les protocoles ont été acceptés par les comités d'éthique locaux (CPP Sud Est I, hôpital universitaire, Saint Etienne, France; CPP Est III, hôpital universitaire, Dijon, France; CPP Sud-Ouest et Outre Mer III, hôpital universitaire, Bordeaux, France).
[0149] Etude Donneurs
Des globes oculaires, du plasma et des érythrocytes humains ont été obtenus de 46 donneurs (corps donnés à la Science, 30 femmes et 16 hommes, âge médian 86,5 ans, intervalle interquartile 76-92 ans). Les tissus ont été collectés et préparés selon les procédures déjà décrites et connues de l’homme du métier. Les échantillons ont été conservés à -80 ° C jusqu'à d'autres analyses.
[0150] Etude cas-témoin
Les sujets ont été sélectionnés parmi 2 études en cours à Bordeaux (étude Alienor) et à Dijon (étude Montrachet), qui utilisent des méthodes similaires. Entre 2009 et 2011 , les participants étaient âgés de 75 ans ou plus et avaient subi un examen oculaire et un prélèvement de sang à jeun. Les examens oculaires ont eu lieu dans les services d’ophtalmologie des hôpitaux universitaires de Bordeaux et de Dijon, et ont consisté en un historique ophtalmologique, des mesures de l’acuité visuelle et de la réfraction et deux rétinographies non mydriatiques à 45°. Les photographies rétiniennes ont été interprétées conformément à la classification internationale et à une modification du système de classement utilisé dans l'étude multi-ethnique de l'athérosclérose pour la taille, l'emplacement et la superficie des druses. Les participants ont été classés en fonction de leur pire œil dans les trois groupes exclusifs suivants:
- pas de DM LA,
- DMLA précoce (présence de drusen séreux (> 125 microns) et / ou drusen réticulaire et / ou anomalies pigmentaires) ;
- DMLA avancée (atrophie géographique ou maladie néovasculaire ).
Les cas de DMLA étaient atteints de DMLA avancée (atrophie géographique ou maladie néovasculaire) et les témoins étaient exempts de toute forme de DMLA précoce ou avancée et présentaient une acuité visuelle supérieure à 20/40. Les critères d'exclusion pour les deux cas et les témoins étaient la présence de glaucome et la présence de diabète.
Trente et un cas ont été identifiés parmi les participants ayant subi un examen ophtalmologique et un prélèvement sanguin à jeun entre 2009 et 2011 et les témoins ont été appariés dans un rapport 1 :1 pour l'âge (+/- 2 ans), le sexe et l'utilisation de médicaments hypolipidémiants.
Les échantillons de plasma ont été conservés à -80 C jusqu'à l'analyse des lipides. [0151] Etude de supplémentation
Des échantillons de plasma ont été obtenus de 55 sujets participant à l’essai clinique en double aveugle et randomisé intitulé « influence de la lutéine sur la macula de personnes issues de parents AMD (LIMPIA) »-( Korobelnik JF, Rougier MB, Delyfer MN, Bron A, Merle BMJ, Savel H, Chene G, Delcourt C, Creuzot- Garcher C. Effect of Dietary Supplémentation With Lutein, Zeaxanthin, and omega- 3 on Macular Pigment: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmol 2017;135:1259-66). Des participants adultes en bonne santé âgés de 40 à 70 ans ont été recrutés. Chaque participant a été randomisé dans un rapport de 1 :1 pour recevoir soit deux capsules par jour d’un complément alimentaire contenant de la lutéine, de la zéaxanthine, de la vitamine C, de la vitamine E, du zinc, du cuivre, du resvératrol et également de l’huile de poisson riche en acides gras polyinsaturés oméga-3 (Nutrof Total, Laboratoires Théa) ou un placebo contenant de la paraffine. Des échantillons de sang ont été prélevés au début et après 3 et 6 mois de supplémentation. Le sang total a été centrifugé à 3 000 tours/minute pendant 10 minutes à 4°C pour isoler le plasma des globules rouges. Les échantillons de plasma ont été conservés à -80°C jusqu'à une analyse plus poussée.
[0152] Analyses statistiques
Etude donneurs : Le modèle avec l'erreur de prédiction la plus faible a été obtenu à l'aide d’une extension de la méthode de la régression des moindres carrés partiels (sgPLS ou sparse groupe PLS) décrite par Liquet et al (Liquet B et al. Bioinformatics. 2016 Jan 1 ;32(1):35-42). .
Étude cas-témoin : Les différences entre les cas et les témoins pour le contenu prédit en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine, les acides gras polyinsaturés oméga-3 totaux dans le plasma et dans les globules rouges, ont été évaluées par régression linéaire mixte ajustée en fonction de l'âge, de l'indice de masse corporelle, du tabagisme, de l'utilisation du supplément en oméga-3, du HDL cholestérol et LDL cholestérol, avec un facteur aléatoire pour les paires cas-témoins. Etude de supplémentation : Les concentrations plasmatiques d'esters de cholestérol et le contenu prédit en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine ont été comparés entre les participants sous supplémentation et les participants sous placebo à l'aide de modèles de régression linéaire ajustés en fonction de l'âge, du sexe, de l'indice de masse corporelle (IMC), du cholestérol HDL et LDL.
[0153] Toutes les valeurs p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les analyses pour les études de contrôle de cas et de supplémentation ont été effectuées à l'aide du logiciel SAS (SAS, version 9.4; SAS Institute Inc., Cary, Caroline du Nord, États-Unis).
[0154] Exemple 1 : Identification d’un biomarqueur du contenu en acides gras polyinsaturés oméqa-3 de la rétine
[0155] Rationnel
Le sang est un fluide complexe composé d’éléments cellulaires comprenant des globules blancs et des globules rouges, des plaquettes et une partie liquide appelée plasma. Les lipides sanguins se trouvent principalement dans les membranes des globules rouges et dans les particules de lipoprotéines plasmatiques. Les membranes des globules rouges sont presque exclusivement constituées de phospholipides. En raison d'une durée de vie d'environ 120 jours, la composition en acides gras des phospholipides des globules rouges est représentative de l'apport alimentaire à long terme des lipides. Par ailleurs, les lipoprotéines plasmatiques transportent des composés lipidiques biologiquement importants, tels que les chylomicrons et les lipoprotéines de très basse densité (VLDL) qui sont des structures transportant principalement les triglycérides formés dans l’intestin et dans le foie respectivement à partir de lipides et de glucides alimentaires. Leurs compositions en acides gras sont associées à l'apport alimentaire à très court terme. En revanche, les lipoprotéines de basse densité (LDL) et de haute densité (HDL) sont impliquées dans le transport à double sens des lipides entre le foie et les tissus périphériques. Ils sont enrichis en phospholipides (en particulier la sous-classe de phosphatidylcholine) et en esters de cholestérol. Les compositions en acides gras des LDL et des HDL sont considérées comme des indices de la consommation de graisses alimentaires à moyen terme.
[0156] Afin de déterminer si les lipides d'un ou de plusieurs de ces compartiments sanguins pourraient constituer des indicateurs fiables du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine et de la supplémentation acides gras polyinsaturés oméga-3, l’étude BLISAR (Biomarkers of Llpid Status And Metabolism in Retinal ageing) a été menée entre 2015 et 2018.
[0157] Résultats
[0158] Le sang et les tissus oculaires de 46 donneurs humains provenant de l’Université de Saint-Étienne (corps donnés à la Science) ont été analysés afin de déterminer leur composition en acides gras par lipidomique. En plus des lipides plasmatiques rétiniens et totaux, les marqueurs à long et à moyen terme des lipides alimentaires ont été étudiés en isolant et en analysant les compositions en acides gras du plasma (lipides totaux, phosphatidylcholines et esters de cholestérol) ainsi que des globules rouges. Les profils en acides gras confirment l’importance quantitative des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine (16,8% contre 3,4% dans les globules rouges et 2,9% dans les lipides totaux du plasma).
[0159] Par une analyse lipidomique, un ensemble de données sur les lipides présents dans les 4 compartiments sanguins (globules rouges, plasma total, phosphatidylcholines plasmatiques et esters de cholestérol plasmatiques), correspondant à 332 espèces différentes a été généré.
[0160] Le modèle avec l'erreur de prédiction la plus faible a été obtenu à l'aide d’une extension de la méthode de la régression des moindres carrés partiels (sgPLS ou sparse groupe PLS) et a été caractérisé par un coefficient de corrélation de 0,62 entre les valeurs observées et prédites du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine, obtenu par validation croisée. Ce prédicteur du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine est basé sur un algorithme combinant les concentrations plasmatiques de 7 espèces d’esters de cholestérol.
[0161] Trois des esters de cholestérol identifiés sont de la famille des acides gras polyinsaturés oméga-3, c’est-à-dire le cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate, le cholesteryl9,12,15-octadecatrienoate, le cholesteryl 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoate.
[0162] Les quatre autres esters de cholestérol sont de la famille des acides gras polyinsaturés oméga-6 à savoir le cholesteryl 9,12-octadecadienoate, le cholesteryl 6,9,12-octadecatrienoate, le cholesteryl 8,11 ,14-eicosatrienoate, le cholesteryl 5,8,11 ,14-eicosatetraenoate.
[0163] Les esters méthyliques des esters de cholestérol susmentionnés sont utilisés afin de déterminer et mesurer la quantité relative des acides gras des esters de cholestérol. La méthode de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 est ci-après détaillée :
[0164] Méthode de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméqa-3 de la rétine
[0165] La méthode de détermination des acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine se décompose en plusieurs étapes :
1. Prélèvement sanguin et isolement du plasma ;
2. Extraction des lipides totaux à partir du plasma ;
3. Isolement des esters de cholestérol à partir des lipides totaux ;
4. Formation des esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol, dit autrement, on forme des esters méthyliques à partir de l’acide gras issu de l’hydrolyse de l’ester de cholestérol ; 5. Détermination des quantités relatives de 25 esters méthyliques d’acides gras des esters de cholestérol ;
6. Calcul de la valeur estimée du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine à partir des quantités relatives des esters méthyliques d’acides gras de 7 esters de cholestérol.
[0166] Prélèvement sanguin et isolement du plasma
Un échantillon de sang est prélevé chez un sujet humain par ponction veineuse dans un tube traité à l'EDTA, au citrate ou à l'héparine. Le tube contenant le sang total est centrifugé à 3000 tours par minute pendant 10 minutes à 4°C afin de séparer le plasma des globules rouges. La phase supérieure contenant le plasma est prélevée et stockée dans un tube sec. Les lipides totaux du plasma peuvent être extraits immédiatement ou l'échantillon de plasma peut être congelé en attendant la suite des procédures.
[0167] Extraction des lipides totaux du plasma
Les lipides totaux du plasma sont extraits par la méthode de Moilanen & Nikkari (Moilanen & Nikkari Clin Chim Acta 1981 ;114(1 ):111 -116). Dans un tube en verre, 5 millilitres d'un mélange de chloroforme/méthanol (1 :1 , v:v) sont ajoutés à un volume d'environ 450 microlitres de plasma. Le tube est agité au vortex pendant 1 minute puis centrifugé à 3000 tours par minute pendant 3 minutes. La phase supérieure est isolée dans un autre tube en verre à l'aide d'une pipette pasteur. Quatre millilitres de chloroforme sont ajoutés dans ce second tube ainsi que 3 millilitres de chlorure de sodium acide (17mmol/L). Le tube est agité au vortex pendant 1 minute puis centrifugé à 3000 tours par minute pendant 3 minutes. La phase supérieure est éliminée à l'aide d'une pipette pasteur alors que la phase inférieure contenant l'extrait des lipides plasmatiques est isolé dans un pilulier en verre. L'extrait de lipides totaux est d'abord séché sous un flux d'azote puis dilué dans du chloroforme à une concentration de 10mg/ml. Les esters de cholestérol peuvent être isolés immédiatement à partir des lipides totaux ou bien congelés en attendant la suite des procédures.
[0168] Isolement des esters de cholestérol à partir des lipides totaux
Les esters de cholestérol sont isolés à partir des lipides totaux selon une procédure décrite dans Bretillon et al 2008 (Bretillon et al Exp Eye Res 2008;87(6):521-528). Une plaque de verre recouverte de gel de silice est préalablement lavée dans une cuve de migration contenant 100mL d'acétate d'éthyle. Elle est ensuite placée à l'étuve à 120°, pendant 30 minutes pour être activée. Les lipides totaux extraits sont déposés sur la plaque sous forme d'une bande d'environ 3cm à l'aide d'une seringue en verre puis la plaque est placée pendant 25 à 30 minutes dans une cuve chromatographique de migration contenant 101 millilitres d'un mélange d'hexane/éther éthylique/acétate d'éthyle (80:20:1 , v:v:v). La plaque est ensuite retirée de la cuve et laissée sous une hotte pendant quelques minutes. Elle est ensuite exposée à une vaporisation de 2',7'-dichlorofluorescéine puis observée sous une lumière ultraviolette à 366nm. La bande de silice contenant les esters de cholestérol située à environ 8 à 9 cm du dépôt est marquée à l'aide d'un crayon puis grattée à l'aide d'une lame de rasoir pour être récupérée dans un tube en verre dans lequel est ajouté 1 millilitre de toluène. Les esters de cholestérol isolés peuvent être transméthylés immédiatement en vue d'une analyse chromatographique ou bien conservés à 4°C en attendant la suite des procédures.
[0169] Formation des esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol
Les esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol sont formés par transméthylation selon la méthode de Morrison & Smith (Morrison & Smith J Lipid Res 1964;53:600-608). Un millilitre d'un mélange de Trifluorure de Bore/méthanol (1 :1 , v:v) est ajouté au tube contenant le gel de silice avec les esters de cholestérols et le toluène. Le tube est placé dans une étuve à 95°C pendant 2 heures. Il est ensuite refroidi à température ambiante. Après ajout de 5 millilitres de bicarbonate de sodium et 5 millilitres d'hexane, le tube est agité au vortex pendant 1 minute puis centrifugé à 3000 tours par minute pendant 3 minutes. La phase supérieure est isolée dans un tube en verre à l'aide d'une pipette pasteur. Après séchage des esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol sous un flux d'azote, ceux-ci sont dilués dans 1 millilitre d'hexane. Les esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol peuvent être analysés immédiatement par chromatographie en phase gazeuse ou stockés à 4°C en attendant la suite des procédures. [0170] Détermination du profil en acides gras des esters de cholestérol Le profil en acides gras des esters de cholestérol est déterminé par chromatographie en phase gazeuse couplée à une détection à ionisation de flamme selon Acar et al (Acar et al PloS One 2012;7{4): e35102). Les esters méthyliques des acides gras des esters de cholestérol sont injectés dans un chromatographe en phase gazeuse équipé d'une colonne CPSIL-88 (100m x 0,25mm de diamètre interne, épaisseur de film 0,20 mm, Varian, Les Ulis, France). L'hydrogène est utilisé en tant que gaz vecteur à une pression de 210kPa. La température du four du chromatographe est de 60°C pendant 5 minutes, puis montée jusqu'à 165°C à 15°C par minute. Après être maintenue à 165°C pendant 1 minute, elle est montée jusqu'à 225°C à 2°C par minute. Elle est maintenue à 225°C pendant 17 minutes. Les températures de l'injecteur et du détecteur sont réglées à 250°C. Les esters méthyliques d'acides gras sont identifiés par comparaison de leurs temps de rétention à ceux de standards commerciaux. Les proportions relatives des 25 espèces d'esters méthyliques sont calculées à l'aide du logiciel EZChrom Elite (Agilent Technologies, Massy, France) et sont exprimés en pourcentage des acides gras totaux des esters de cholestérol.
[0171] Calcul de la valeur estimée du contenu en acides gras polvinsaturés oméqa-3 de la rétine
Utilisation du % relatif de 7 esters méthyliques d'acides gras des esters de cholestérol : 9,12,15-octadecatrienoic acid methyl ester (C18:3n-3 methyl ester), 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoic acid methyl ester (C20:5n-3 methyl ester), 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid methyl ester (C22:6n-3 methyl ester), 9,12- octadecadienoic acid methyl ester (C18:2n-6 methyl ester), 6,9,12-octadecatrienoic acid methyl ester (C18:3n-6 methyl ester), 8,11 ,14-eicosatrienoic acid methyl ester (C20:3n-6 methyl ester), 5,8,11 ,14-eicosatetraenoic acid methyl ester (C20:4n-6 methyl ester).
L'algorithme mathématique permet de prédire, pour un nouvel échantillon (échantillon test), le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine à partir du dosage des 7 molécules d'esters de cholestérol dans le plasma présentées ci-dessus. Cet algorithme est basé sur la méthode sparse group partial least squares {sgPLS} décrite par Liquet et al (Liquet B et al. Bioinformatics. 2016 Jan 1 ;32(1):35.42), qui a été appliquée à des échantillons de rétine, plasma et globules rouges collectés à partir de 46 donneurs humains (échantillon d'apprentissage).
[0172] L’algorithme mathématique consiste en 4 étapes :
1. Plusieurs sommes et ratios sont calculés à partir des dosages des 7 molécules d’intérêt.
2. L’ensemble des paramètres sont centrés et réduits en utilisant les moyennes et écart-types de l’échantillon d’apprentissage (ce qui suppose que l’échantillon test est issu de la même distribution que l’échantillon d’apprentissage).
3. Le modèle obtenu par sgPLS est appliqué aux valeurs obtenues à l’étape 2.
4. Afin d’obtenir la prédiction de la concentration en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine, le résultat obtenu à l’étape 3 est multiplié par l’écart-type de la concentration en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine de l’échantillon d’apprentissage. Les valeurs ainsi obtenues sont additionnées à la moyenne de la concentration en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine de l’échantillon d’apprentissage.
[0173] Conclusions
[0174] De manière avantageuse, les espèces d'esters de cholestérol de la famille des acides gras polyinsaturés oméga-3 ont contribué de manière positive à l'estimation du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine alors que ceux de la famille des acides gras polyinsaturés oméga-6 ont abaissé ce contenu estimé, ce qui est compatible avec le métabolisme compétitif bien établi d’oméga-3 et oméga-6.
[0175] L’identification d’un biomarqueur basé sur les concentrations plasmatiques de 7 espèces lipidiques spécifiques est novatrice et avantageuse, car les études et tentatives précédentes, basées sur l'analyse de globules rouges ou de lipides plasmatiques totaux, n'ont pas permis d'établir de corrélation étroite entre les lipides circulants et le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine.
[0176] Avantageusement encore, il est possible de confirmer la meilleure robustesse de la prédiction et ce comparativement aux études et approches ayant déterminé les teneurs en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans les globules rouges et le sang total (r = 0,62 versus r = 0,40 pour les acides gras oméga-3 des lipides totaux du plasma et r = 0,14 pour les acides gras oméga-3 des globules rouges). Cela indique qu’une approche plus subtile axée sur un petit nombre d’esters de cholestérol plasmatiques est plus efficace pour estimer le contenu rétinien en acides gras polyinsaturés oméga-3.
[0177] De plus, l'identification des esters de cholestérol en tant que biomarqueurs du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine renforce les observations antérieures réalisées par les inventeurs, suggérant que ces lipides sont la source préférentielle d'acides gras pour la rétine.
[0178] Exemple 2 : Association entre DMLA et statut rétinien en acides gras polyinsaturés oméqa-3
[0179] Au cours de la deuxième phase de l’étude, l’association entre la DMLA et le statut en acides gras polyinsaturés oméga-3 a été étudiée.
[0180] Premièrement, dans une étude cas-témoin post modem, une teneur inférieure en acides gras polyinsaturés oméga-3 a été observée dans les rétines affectées par la DMLA (14,4% ± 1 ,9%) par rapport à celles de donneurs en bonne santé (16,8% ± 3,1%), confirmant ainsi les observations précédentes. Après ajustement pour l'âge, le sexe, le temps après le décès, la différence entre la teneur en acides gras polyinsaturés oméga-3 de rétines affectées par la DMLA et la teneur en acides gras polyinsaturés oméga-3 de rétines contrôles était de -2,41 % (p = 0,04).
[0181] Ensuite, en utilisant la méthode précédemment décrite (mesure des 25 esters de cholestérol du plasma, application de l’algorithme à ces mesures), la teneur prédite en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine a été comparée entre 31 sujets atteints de DMLA avancée et 31 témoins appariés pour l'âge, le sexe et l'utilisation de médicaments hypolipidémiants.
Cette teneur prédite en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine était plus faible dans les cas que chez les témoins (17,8% contre 18,9%). Après ajustement en fonction de l'âge, de l'indice de masse corporelle, du tabagisme, de l'utilisation d’une supplémentation en oméga-3, du cholestérol HDL et du cholestérol LDL, la différence entre le contenu prédit en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine entre les cas de DMLA et les témoins était de -1 ,39% (p = 0,04).
En revanche, dans les globules rouges, la teneur en acides gras polyinsaturés oméga-3 était similaire chez les cas et chez les témoins (6,0% contre 5,6% p = 0,42, après ajustement multivarié). Ces observations concordent parfaitement avec la physiopathologie de la DMLA, caractérisée par la perte du métabolisme riche en acides gras polyinsaturés oméga-3 des cellules photoréceptrices.
[0182] Compte tenu des fonctions cruciales jouées par le DHA dans la structure et la fonction rétiniennes et de son épuisement dans les yeux de patients atteints de DMLA, il est logique de maintenir de hauts niveaux rétiniens d’acides gras polyinsaturés oméga-3 pour prévenir le développement et / ou la progression de la maladie.
[0183] Cette hypothèse a été consolidée par plus de 20 études épidémiologiques montrant un risque significativement réduit de développer une DMLA chez les sujets consommant beaucoup d’acides gras polyinsaturés oméga-3. Toutefois, dans les deux essais randomisés (AREDS2 (Lutein + zeaxanthin and omega-3 fatty acids for age-related macular degeneration: the Age-Related Eye Disease Study 2 (AREDS2) randomized clinical trial. JAMA 2013;309:2005-15 et NAT2 Souied EH, Delcourt C, Querques G, Bassols A, Merle B, Zourdani A, Smith T, Benlian P. Oral Docosahexaenoic Acid in the Prévention of Exudative Age-Related Macular Degeneration: The Nutritional AMD Treatment 2 Study. Ophthalmology 2013;120:1619-31.), la supplémentation en acides gras polyinsaturés oméga-3 n'a pas modifié la progression de la maladie aux stades avancés de la maladie. Une explication possible de ces données contradictoires réside probablement dans la sensibilité des sujets à la supplémentation nutritionnelle. En effet, alors que la supplémentation en acides gras polyinsaturés oméga-3 n’avait aucun effet sur la progression de la DMLA lorsque l’ensemble de la population était prise en compte, il a été montré dans l’étude NAT2 que les sujets qui maintenaient des taux sanguins élevés et constants en acides gras polyinsaturés oméga-3 avaient un risque significativement plus faible de développer une DMLA avancée. Cette découverte souligne la nécessité de surveiller le statut métabolique des sujets participant aux interventions nutritionnelles.
[0184] Exemple 3 : Sensibilité à une supplémentation alimentaire en acides aras polvinsaturés oméqa-3 du contenu prédit en acides qras polyinsaturés oméqa-3 de la rétine [0185] La sensibilité à une supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés oméga-3 du contenu prédit en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine a donc été évaluée.
[0186] À cette fin, des échantillons de sang prélevés dans le cadre de l’essai clinique randomisé LIMPIA dans lequel des participants en bonne santé d’âge moyen recevaient une dose quotidienne de 676 mg d’acides gras polyinsaturés oméga-3 pendant 6 mois, ou un placebo ont été analysés. La plage interquartile du contenu prédit en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine au départ variait de 17,2% à 19,7% des acides gras totaux, avec des valeurs médianes d'environ 18,5% pour les deux groupes, ce qui est conforme aux précédentes observations chez des sujets sains d'âge moyen.
[0187] Après 3 mois de supplémentation, le contenu prédit en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine était significativement augmenté chez les sujets supplémentés (valeurs médianes de 18,8% et 21 ,6% des acides gras totaux des groupes placebo et des groupes supplémentés, respectivement; p <0,001).
[0188] Après 6 mois de supplémentation, cette différence a été maintenue car le contenu prédit en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine correspondait parfaitement à celui calculé à 3 mois (valeurs médianes de 18,9 et 21 ,7% des acides gras totaux des groupes placebo et supplémenté, respectivement; p <0,001). .
[0189] Ainsi, et avantageusement, un biomarqueur sanguin du statut en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine, basé sur la mesure de 7 espèces lipidiques plasmatiques, inversement corrélé au risque de DMLA avancée et augmenté avec la supplémentation en acides gras polyinsaturés oméga-3, a été identifié.
[0190] Ce biomarqueur sanguin est ainsi un outil fiable et précis pour la préparation et la conduite d’essais cliniques mais permet également de prévenir l’apparition de pathologies rétiniennes liées à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 ainsi que de diagnostiquer des carences en acides gras polyinsaturés oméga-3.
[0191] Exemple 4 : Calcul de la capacité prédictive du cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate(C20:5 w3 methyl ester)
[0192] Les inventeurs ont vérifié s’il était possible de déterminer le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine à partir d’un seul ester de cholestérol, le cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate (C20:5 w3 methyl ester) plutôt qu’à partir des 7 esters de cholestérol identifiés par la méthode sgPLS.
[0193] Le résultat de la régression linéaire de la concentration en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine sur le cholesteryl 5,8,11 ,14,17- eicosapentaenoate est détaillé dans le tableau 4 :
[0194] [Tableau 4]
[0195] La capacité prédictive du cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate a été évaluée en calculant le coefficient de corrélation entre les contenus en acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la rétine prédits et ceux observés, estimé par validation croisée dans l’échantillon d’apprentissage de 46 donneurs. Un coefficient de corrélation r égal à 0.59 est obtenu.
[0196] Ce résultat montre que la capacité de prédiction est presque similaire à celle obtenue par la formule mathématique issue de la méthode sgPLS ( r=0.62) avec seulement le cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate.
[0197] Avantageusement encore, il est ici démontré que le cholesteryl 5,8,11,14,17-eicosapentaenoate est un biomarqueur sanguin du statut en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine, au même titre que les 7 esters de cholestérol identifiés.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Méthode de détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un sujet comprenant la détermination de la teneur en au moins un ester de cholestérol dans un échantillon sanguin dudit sujet, le contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine étant corrélé à la teneur dudit au moins un ester de cholestérol, ledit au moins un ester de cholestérol étant le cholesteryl 5,8,11 ,14,17-eicosapentaenoate.
[Revendication 2] Méthode de détermination selon la revendication 1 caractérisée en ce que la teneur de sept esters de cholestérol est déterminée.
[Revendication 3] Méthode de détermination selon la revendication 2, caractérisée en ce que les sept esters de cholestérol sont le cholesteryl 5,8,11 ,14,17- eicosapentaenoate, le cholesteryl 9,12,15-octadecatrienoate, le cholesteryl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate, le cholesteryl 9,12-octadecadienoate, le cholesteryl 6,9,12-octadecatrienoate, le cholesteryl 8,11 ,14-eicosatrienoate, le cholesteryl 5,8,11 ,14-eicosatetraenoate.
[Revendication 4] Méthode de détermination selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l’échantillon sanguin est choisi parmi le sang total, le sérum et le plasma.
[Revendication 5] Méthode de prévention d’une pathologie rétinienne liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine selon la méthode de détermination selon l’une quelconque des revendications 1 à 4.
[Revendication 6] Méthode de prévention selon la revendication 5 caractérisée en ce que la pathologie est une rétinopathie choisie parmi la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré.
[Revendication 7] Méthode de suivi de traitement d’une pathologie liée à un déficit en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine d’un patient à qui il a été administré un traitement, selon la méthode de détermination selon l’une quelconque des revendications 1 à 4.
[Revendication 8] Méthode de suivi de traitement selon la revendication 7 caractérisée en ce que ladite pathologie est une rétinopathie choisie parmi la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré.
[Revendication 9] Méthode de suivi de traitement selon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce que la pathologie est la dégénérescence maculaire liée à l’âge et ledit traitement est une supplémentation nutritionnelle à base d’acides gras polyinsaturés oméga-3 associée ou non à l’administration de vitamines et minéraux.
[Revendication 10] Méthode de diagnostic de carences en acides gras polyinsaturés oméga-3 comprenant la détermination du contenu en acides gras polyinsaturés oméga-3 de la rétine selon la méthode de détermination selon l’une quelconque des revendications 1 à 4.
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