EP3930741A1 - Utilisation de peptides cycliques fongiques de type destruxine comme agents antibactériens actifs contre clostridium perfringens - Google Patents
Utilisation de peptides cycliques fongiques de type destruxine comme agents antibactériens actifs contre clostridium perfringensInfo
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- EP3930741A1 EP3930741A1 EP20708055.7A EP20708055A EP3930741A1 EP 3930741 A1 EP3930741 A1 EP 3930741A1 EP 20708055 A EP20708055 A EP 20708055A EP 3930741 A1 EP3930741 A1 EP 3930741A1
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Classifications
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- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
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- A61K36/062—Ascomycota
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- A61K38/15—Depsipeptides; Derivatives thereof
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K11/02—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof cyclic, e.g. valinomycins ; Derivatives thereof
Definitions
- TITLE Use of fungal cyclic peptides of the destruxin type as antibacterial agents active against Clostridium perfringens
- the present invention relates to the field of the prevention or treatment of bacterial infections, in particular by Clostridium perfringens.
- Clostridium perfringens is responsible for intestinal infections in humans as well as in animals. In humans, Clostridium perfringens is responsible for food poisoning. Clostridium perfringens is thus one of the most common causes of food poisoning in the United States and Canada (Johnson, EA, Summanen, P., & Finegold, SM (2007). Clostridium. In PR Murray (Ed.) , Manual of Clinical Microbiology (9th ed., Pp. 889-910). Washington, D.C .: ASM Press).
- Clostridium perfringens ranks 4th in number of outbreaks (2006-2007) and 1st (2006) or 3rd (2007) (Table 3) in number of cases among the causes identified in the context of the declaration.
- mandatory (DO) of collective food poisoning (TIAC) (source ANSES, https://www.anses.fr/fr/system/files/MIC2010sa0235Fi.pdf).
- TIAC collective food poisoning
- In farm animals Clostridium perfringens mainly infects pigs and poultry with economic (decrease in yield, mortality and cost of treatment) and health consequences (transmission to humans). In poultry farms, it can cause in its clinical form a very abnormally high mortality (up to 50% of the farm) and in its sub-clinical form infection by Clostridium perfringens generally results in significant economic losses since animal performance is greatly reduced.
- compositions which make it possible to act specifically against this strain so as not to cause changes in the intestinal flora.
- Destruxins are fungal cyclic peptides of the cyclohexadepsipeptide type produced by various fungi mainly of the genus Metarhizium anisopliae but also of the genera Metarhizium brunneum, Beauveria felina, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassice, Alternaria linicola and Aschersonis sp.
- destruxins 35 molecules identified to date
- 7 series series A, B, C, D, E, F and G
- Pedras et al. Phytochemistry 2002, 59, 579-96 There are various destruxins (35 molecules identified to date) grouped into 7 series (series A, B, C, D, E, F and G) (Pedras et al. Phytochemistry 2002, 59, 579-96).
- destruxins of the different series differ according to the type of amino acids, the type of alpha-hydroxy acid and / or on the presence or absence of N-methylation of amino acids.
- destruxins exhibit activity against Clostridium perfringens.
- destruxins unlike other fungal cyclic peptides (Enniatins A, A1, B, B1 and Beauvericine in particular which have a broad spectrum of action with antibacterial activity on several Gram + bacteria), destruxins have shown a selectivity of action against Clostridium perfringens. This selective activity of destruxins makes it possible to consider their use for the treatment and / or prevention of infections linked to Clostridium perfringens, in particular intestinal infections in humans and farm animals, including chickens.
- the present invention relates to a composition comprising at least one destruxin for treating and / or preventing infections by Clostridium perfringens.
- the destruxin is chosen from the destruxins of the A, B, C, D, E, F or G series of fungi, or their derivatives.
- destruxins means cyclic peptides of the cyclohexadepsipeptide type, such as those produced by fungi of the genus Metarhizium anisopliae, Metarhizium brunneum, Beauveria felina, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassice, Alternaria linicola and Aschersonis sp.
- Series A Dx A, Ai, A ⁇ , A3, A4, A 5 , A4 chlorohydrin, desmethylDx A, dihydroDx A;
- Series B B, B1, B2, desmethylDx B, Desmethyl Dx B2, homoDx, protoDx, hydroxyDx B, hydroxyhomoDx B, beta-D-Glucopyranosyl-hydroxyDx B;
- destruxins A, B, C, D, E, F or G and their derivatives the sources of which are in particular indicated in Pedras et al, supra
- destruxins A and B are commercially available (Sigma-Aldrich or A2S, purity> 98%).
- a destruxin according to the invention includes the abovementioned destruxins, as well as their derivatives, in particular defined by general formula (I) below.
- Destuxin for the antibacterial application of the invention is a functional destruxin.
- destruxin or “destruxin with functional activity” is meant a destruxin exhibiting an activity capable of preventing and or treating a bacterial infection. It can be determined whether a protein is functional by any known method, for example by an in vitro assay for the determination of antibacterial activity (MIC, as described in Example 1).
- the destruxin according to the invention can be of fungal or synthetic origin, preferably of fungal origin.
- destruxin of fungal origin includes fungal destruxin as defined above or a derivative thereof.
- R represents a hydrogen atom, a C1 -C6 alkyl group or an aralkyl group
- 2 R, 3 R, 4 R which are identical or different independently represent a hydrogen atom or a C1 -C6 alkyl group
- 5 R represents a group chosen from C2-C6 alkenyl and C1 -C6 alkyl groups optionally substituted by one or more substituents chosen from halogen atoms, hydroxy (OH), carboxy (COOH), -glycosyl groups, and 3 to 6 membered heterocyclic groups comprising one or more heteroatoms selected from N, O and S;
- R represents a hydrogen atom, a methyl group or a benzyl group
- the Alkyl radicals represent saturated hydrocarbon radicals, in straight or branched chain, from 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, isopropyl, tert-butyl, 2-methylbutyl, 2-methylpentyl, 1 -methylpentyl.
- halogen atoms of fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms, preferably fluorine.
- Alkenyl radicals represent hydrocarbon radicals of 2 to 6 carbon atoms, in a straight or branched chain, and comprising one or more ethylenic unsaturations.
- alkenyl radicals mention may in particular be made of the allyl or vinyl radicals.
- aralkyl denotes the groups AlkyleAryl where alkyl is defined as above and aryl denotes a hydrocarbon, mono or bicyclic aromatic system of 6 to 10 carbon atoms.
- alkyl is defined as above
- aryl denotes a hydrocarbon, mono or bicyclic aromatic system of 6 to 10 carbon atoms.
- —AlkyleAryl radicals mention may in particular be made of the benzyl or phenetyl radical.
- composition of the invention may comprise a destruxin in pure form as a mixture, or in the form of a fungus producing a destruxin, or an extract thereof, such as a ground material or a culture supernatant thereof, in particular an extract comprising a destruxin, or mixtures thereof.
- Beauveria feiina and Metarhizium anisopliae are in particular commercially available from DSMZ and ATCC, for example under the references DSM 4678 and ATCC ® 60335 TM or DSM 1490
- Some of these genera are commercially available or available from depositories. They are in particular commercially available from DSMZ and ATCC, for example Beauveria feiina under the reference DSM 4678; Metarrhizium anisopliae under the reference ATCC ® 60335 TM , DSM 1490 and DSM 21704; Metarhizium brunneum under the reference ATCC ® 90448 TM ; Ophiocordyceps sp.
- ATCC ® 24400 TM under the reference ATCC ® 24400 TM ; Alternaria alternata under the reference ATCC® 13963, ATCC® 66981, DSM-12633, DSM-62006, DSM-62010 or DSM-1 102; Alternaria brassicae under the reference ATCC® 58169, ATCC® 38713 or ATCC® 34642; Alternaria linicola under the reference ATCC® 201065, ATCC® 11802 or ATCC® 201658.
- the expression “supernatant” of culture or secretome is understood to mean the culture medium in which the fungus has been cultivated, after separation of said fungus.
- the compounds of formula (I) exhibit specific antibacterial activity against Clostridium perfringens.
- the compounds of formula (I) are therefore useful in the treatment and / or prevention of infections linked to Clostridium perfringens.
- compositions according to the invention can be used in human or veterinary therapy in order to treat an infection caused by Clostridium perfringens, or as a food supplement for animals in order to prevent infection by Clostridium perfringens.
- Clostridium perfringens comprises or consists of the sequence ATCC®13124 TM deposited with VATCC.
- Clostridium perfringens can comprise or consist of a sequence exhibiting a degree of identity of at least 80% to said ATCC®13124 TM sequence, available commercially, in particular at least 85% identity, preferably at least 90%. identity, and more particularly at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% identity, it being understood that said sequence of Clostridium perfringens is functional.
- the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising a destruxin according to the invention with a pharmaceutically acceptable excipient.
- said composition contains an effective amount of the compound according to the invention.
- said composition is administered to a patient or an animal in need thereof.
- the present invention also relates to a destruxin according to the invention for the treatment and / or prevention of bacterial infections linked to Clostridium perfringens, such as intestinal infections, in particular necrotic enteritis.
- compositions according to the invention can be presented in forms intended for parenteral or oral administration.
- solutes or injectable suspensions or multi-dose vials in the form of naked or coated tablets, dragees, capsules, hard capsules, pills, cachets, powders, suppositories or rectal capsules. , solutions or suspensions.
- excipients which are suitable for such administrations are cellulose or microcrystalline cellulose derivatives, alkaline earth carbonates, magnesium phosphate, starches, modified starches, lactose for the solid forms.
- water, aqueous solutions, physiological saline, isotonic solutions are the most convenient vehicles used.
- the dosage can vary within wide limits (0.5 mg to 1000 mg) depending on the therapeutic indication and the route of administration, as well as the age and weight of the subject.
- the present invention also relates to food compositions comprising a destruxin according to the invention.
- Said compositions are particularly suitable for feeding farm animals such as pigs or poultry or any other farm animal likely to be infected with Clostridium perfringens.
- the present invention also relates to the use of a destruxin as a food additive for farm animals including pigs and poultry for the treatment and / or prevention of bacterial infections by infection by the Clostridium perfringens strain.
- the following examples illustrate the invention, without however limiting it.
- the starting products used are known products or products prepared according to known procedures.
- Figure 1 illustrates the evaluation of resistance induction in Clostridium perfringens by destruxins A or B and metronidazole. The appearance of resistant mutants was evaluated in the presence of destruxins A or B or metronidazole as indicated in the text.
- FIG 2 illustrates the evaluation of the permeabilizing effect of destruxins on Clostridium perfringens.
- Clostridium perfringens was exposed for 2 hours to destruxins A or B, nisin, enniatin A1 or CTAB at a dose corresponding to 5 times their MIC.
- the permeabilization of the bacterial membrane was measured using propidium iodide as explained in the text. The permeabilization is expressed as a percentage, the CTAB serving as a positive control and giving 100% permeabilization.
- the values shown in the graph correspond to the means +/- standard deviation.
- Figure 3 shows the determination of the critical insertion pressure of destruxins in a monolayer formed of lipids extracted from Clostridium perfringens.
- the critical insertion pressures of destruxins A and B, nisin, enniatin A1 and CTAB were measured as indicated in the text at a dose corresponding to 5 times their MIC.
- Figure 4 illustrates the determination of the insertion capacity of destruxins in a monolayer formed of lipids extracted from Clostridium perfringens and exhibiting an initial surface pressure corresponding to the membrane of the bacteria.
- the insertion of destruxins A and B, nisin, enniatin A1 and CTAB into a monolayer lipid mimicking the Clostridium perfringens membrane was measured as indicated in the text at a dose corresponding to 5 times their MIC.
- the values shown in the graph correspond to the mean +/- standard deviation.
- FIG 5 shows the morphological phenotype of Clostridium perfringens bacteria (ATCC 13124) incubated with different conventional antibiotics with a known mechanism of action.
- Clostridium perfringens (ATCC 13124) has been exposed to various conventional antibiotics acting on the synthesis of macromolecules shown in the graph or to destruxin A (at a dose corresponding to 5 times their MIC). After 2 hours of exposure, the bacteria were labeled as indicated in the text before observation under a fluorescence microscope of the phenotypes obtained.
- the antimicrobial activity of destruxins A and B was evaluated on various strains of commercial bacteria and fungi listed in Table 2 and obtained from ATCC, DSMZ or the Institut Pasteur (CIP).
- the antimicrobial activity was measured by determination of the Minimum Inhibitory Concentration or MIC according to the instructions of the National Committee of Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997) and as described in the following publications: Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33; Benkhaled et al., Polym. Chem., 2018, 9, 3127-3141; Olleik et al., Eur J Med Chem, 2019, 165, 133-141.
- the MIC is determined by exposure of bacteria or fungi to increasing doses of destruxins A or B or reference antibiotics obtained by cascade dilution to 1 ⁇ 2 of these molecules in the culture medium.
- each bacterial or fungal strain was cultured on a Petri dish containing the specific culture medium of the strain studied. A colony was picked and used to inoculate 3 ml of culture medium. After incubation at 37 ° C. with stirring (200 rotations per minute (rpm)) for 16 h, the optical density (OD) was read at 600 nm in order to estimate the bacterial density. The bacterial suspension was then diluted to 1/100 in 3 ml of culture medium before incubation at 37 ° C. with stirring at 200 rpm for 2-3 h until an OD 600 nm of 0.6 is obtained.
- the bacteria were then diluted in order to reach a density of 10 E5 bacteria per milliliter (10 E5 bacteria / ml).
- the density used was 10 E3 cells per ml for Candida albicans and 10 E4 conidia per millet for the other fungi.
- 100 mI of this bacterial suspension were then added to wells of a 96-well polypropylene plate (Greiner BioOne) already containing 100 mI of destruxins A or B or reference antibiotics diluted in cascade to 1 ⁇ 2 in medium of culture.
- the 96-well plates were then incubated according to the strain tested under the temperature and time conditions indicated in Table 2.
- the MIC was measured using an anaerobic chamber (Coy Laboratory Products, Grass Lake, Ml).
- CMB Minimum Bactericidal Concentration
- Table 2 Strains tested and culture conditions used.
- LB Luria-Bertoni medium
- MH Mueller-Hinton medium
- BHI Brain Heart Infusion medium
- TS Tryptocasein Soja medium
- PD Potato Dextrose
- RPMI Roswell Park Memorial Institute medium
- Middlebrook 7H9 and 7H10 selective medium for Mycobacterium.
- Table 3 MIC values of DesA, DesB, Bafilomycin A1 and Bafilomycin B obtained on various bacterial and fungal strains tested. MICs are expressed in micromolar or mM (micromole per liter).
- Clostridium perfringens strain ATCC 13124
- ATCC 13124 Clostridium perfringens strain
- V-ATPase two antibiotics with the same molecular target as the destruxins in eukaryotic cells
- Table 4 MIC values of DesA, DesB, Bafilomycin A1, B1 and metronidazole obtained on various anaerobic bacterial strains. MICs are expressed in micromolar or mM (micromole per liter).
- Clostridium strains tested are insensitive to destruxins A and B (MIC> 100 mM).
- Table 5 MIC values of various conventional antibiotics and destruxins A and B against the Clostridium perfringens strain (ATCC13124).
- MICs are expressed in micromolar or mM (micromole per liter) and mg / l (milligram per liter).
- Table 6 Comparison of MIC values of destruxins A and B and enniatin A1 against various bacterial and fungal strains. MICs are expressed in micromolar or mM (micromole per liter).
- destruxin A and destruxin B have MICs on clinical strains of Clostridium perfringens (isolated from infected patients or animals) similar to or lower than those obtained on the strain Clostridium perfringens (ATCC 13124 ).
- destruxins A and B have the same activity, see are more active on strains isolated from patients or animals than on the reference strain ATCC, demonstrating their possible use in the treatment of humans and animals infected with Clostridium perfringens or in the preventive treatment of Clostridium perfringens infections in farm animals including pigs and poultry.
- metronidazole quickly leads to the appearance of resistance with a significant increase in its MIC: multiplication of the MIC by 10 after 7 days of contact and multiplication by 50-100 after 9 days of contact.
- destruxins A and B do not cause the appearance and / or selection of mutants of Clostridium perfringens resistant to their action.
- destruxins A and B have an extremely selective action, showing activity only against commercial and clinical strains of Clostridium perfringens with a very low MIC / CMB (0.75-3 mM).
- This very narrow selectivity is a major advantage of destruxins because, unlike conventional antibiotics which strongly disrupt the intestinal commensal flora, the use of destruxins will not lead to intestinal dysbiosis. This could also allow preventive treatment of farm animals including pigs and poultry with destruxins to prevent infection by Clostridium perfringens without risking disturbing the beneficial commensal flora of the animals.
- dextruxins The safety of dextruxins was first measured by a hemolysis test performed on human red blood cells as published in the paper Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33. Red blood cells obtained from Divbioscience ( Netherlands) were washed 3 times in phosphate buffer (PBS, pH 7) then diluted to 8% (volume: volume) in PBS. 100 ml of this cell suspension were added in 96-well plates and then 100 ml of PBS containing increasing doses of destruxins A or B were added to each well. After 1 h incubation at 37 ° C, the plates were centrifuged at 800 xg for 5 min.
- PBS phosphate buffer
- destruxins were also evaluated using human intestinal cells mimicking the small intestine (Caco-2 cells (ATCC HTB-37) or colon (T84 cells (ATCC CCL-248)). and pig small intestine cells (DSM ACC701).
- Cells were routinely grown in Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with 10% (volume: volume) feta calf serum.
- Cells were seeded in flasks. of 25 cm2 and maintained at 37 ° C in a CO 2 incubator with change of medium every other day and passage when cells reached 80-90% confluence.
- the cells For the safety tests, the cells, Caco-2, T84 or IPEC-J2 cells were trypsinized and seeded in 96-well plates. Once confluent, the cells were exposed to increasing doses of destruxins A or B or other molecules for 48 hours. After 48 hours of incubation, cell viability was measured using the Sigma-Aldrich toxicity assay kit based on resazurin (ref TOX8-1 KT). After 4 h of incubation with the reagent of the kit, the cell viability was measured by reading the fluorescence of the wells (excitation at 530 nm / emission at 590 nm). The concentration causing 50% cell death (IC50) was calculated graphically using GraphPad ® Prism 7 software.
- the transepithelial passage (apical to basal) and the intracellular accumulation of the various antibiotics were measured after addition in the apical compartment (corresponding to the intestinal lumen) of 100 mM of compound diluted in PBS containing calcium and magnesium (PBS ++). After 4 hours of incubation at 37 ° C, the transepithelial electrical resistance was measured using a voltohmeter (EVOM from Millipore) and the apical, basal and intracellular media were collected and analyzed by HPLC chromatography in order to quantify the antibiotic content.
- enniatin A1 which nevertheless belongs to the same family of fungal cyclic peptides (depsipeptides) causes hemolysis of human red blood cells with 51% hemolysis. observed at 100 mM of enniatin A1.
- Table 8 Evaluation of the hemolytic effect of destruxins A and B, enniatin A1, bafilomycin A1 or metronidazole on human red blood cells. The values given in the table indicate the percentage of hemolysis observed after 1 hour of contact with 100 mM of antibiotic.
- Table 9 Assessment of the toxicity of destruxins A and B, enniatin A1, bafilomycin A1 or metronidazole to human and porcine intestinal cells.
- the values given in the table correspond to the IC50 expressed in pmol / l (mM) (mean +/- standard deviation).
- the safety factor (calculated by dividing the IC50 obtained in the toxicity test by the MIC obtained with Clostridium perfringens (ATCC 13124)) is at least 66.
- bafilomycin A1 and enniatin A1 exhibit low dose toxicity against human and porcine cells (from 1.8 to 1 1.8 mM for the bafilomycin A1 and 3.1 to XX mM for enniatin A1).
- the MICs against Clostridium perfringens (ATCC 13124) being 25 mM for bafilomycin A1 and 6.25 mM for enniatin A1, unlike destruxins or metronidazole, these molecules do not present any safety factors (safety factor less than 1 for bafilomycin A1 and for eniatin A1).
- the absence of toxicity of destruxins A and B therefore also distinguishes them from enniatin A1, another fungal cyclic peptide of the depsipeptide type with antibacterial action which is very toxic to it.
- the tissue integrity after 4 hours of exposure to destruxins A or B was evaluated by measuring the transepithelial electrical resistance of human or porcine intestinal cells cultured on inserts using an EVOM-type device (Table 1 1). Data show that destruxins, like metronidazole, have little or no effect on transepithelial electrical resistance (decrease between 2 and 17% for destruxins and between 0 and 34% for metronidazole) indicating that these molecules cause little or no damage. impairment of intestinal integrity.
- enniatin A1 and bafilomycin A1 cause sharp reductions in transepithelial electrical resistance (decrease between 67 and 83% for enniatin A1 and 61 and 75% for bafilomycin A1), indicating significant impairment. intestinal tissue integrity.
- Table 11 Evaluation using human and porcine intestinal epithelial cells of the tissue damage caused by destruxins A and B, enniatin A1, bafilomycin A1 and metronidazole.
- the human and porcine intestinal cells cultured on inserts were exposed for 4 h to 100 mM of each molecule added in the apical compartment of the inserts. After 4 h, tissue integrity was evaluated by measuring the transepithelial electrical resistance. The values are in ohm.cm2 (mean +/- standard deviation).
- destruxins A and B The intracellular accumulation and transepithelial passage of destruxins A and B is poor, which is a good thing. In fact, following their ingestion, destruxins A and B will mainly remain in the intestinal lumen, which is an advantage for their use in the topical treatment and / or the prevention of intestinal infections caused by Clostridium perfringens.
- destruxins A and B The mechanism of action of destruxins A and B has been studied by various techniques. Most of the antimicrobial peptides (AMPs) reported in the literature are known to insert into the bacterial membrane forming pores and causing permeabilization / lysis of the bacterial membrane. The capacity of destruxins A and B to permeabilize the membrane of Clostridium perfringens (ATCC 13124) was therefore evaluated. Nisin, a PAM known to permeabilize the bacterial membrane was used as a positive control for permeabilization. Enniatin A1's ability to form pores has also been evaluated.
- AMPs antimicrobial peptides
- the evaluation of permeabilization is done using propidium iodide, a molecule that becomes fluorescent once it comes into contact with DNA (Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33). Since the bacterial membrane is impermeable to propidium iodide, it can only come into contact with DNA if the membrane is permeabilized.
- the principle of the test is as follows. A liquid culture of Clostridium perfringens (ATCC 13124) is centrifuged at 3000 rpm for 5 min. The bacterial pellet is then resuspended in PBS at a concentration of 10 e9 bacteria / ml.
- Propidium iodide (Sigma Aldrich) is then added to this bacterial suspension to a final concentration of 60 mM. 100 ml of this suspension are then added to the wells of a 96-well black fluorescence plate (Greiner) containing 100 ml of test molecules diluted in PBS at a concentration corresponding to 5 times their MIC. After 120 min of incubation at 37 ° C. under anaerobic condition, the fluorescence of the wells was read using a fluorescence microplate reader (excitation at 530 nm and emission at 590 nm). The permeabilization of the bacterial membrane of Clostridium perfringens (ATCC 13124) was expressed as a percentage, the CTAB serving as a reference and giving 100% permeabilization.
- the lipid film formed compresses a probe positioned on the surface of the PBS causing an increase in the surface pressure measured using a surface microtensiometer (pTROUGH SX, Kibron Inc).
- the lipids are thus added until the desired surface pressure called initial surface pressure is reached (Pi, the unit of which is mN / m).
- initial surface pressure the desired surface pressure
- the antibiotics to be tested are injected into the PBS subphase using another Hamilton syringe. If the antibiotic injected is capable of inserting itself into the lipid film, an increase in the surface pressure follows until a maximum value corresponding to the maximum surface pressure (Pmax in mN / m) is reached.
- the affinity of an antibiotic for the lipid film is evaluated by measuring the critical insertion pressure (Pc).
- Pc corresponds to the initial surface pressure which does not allow the insertion of the antibiotic.
- Pc is determined graphically by measuring the DeltaP caused by the insertion of the antibiotic at different values of Pi (approximately 10, 15, 20, 25 and 30 mN / m).
- a bacterial suspension of Clostridium perfringens was diluted 1/100 and cultured at 37 ° C under anaerobic condition until reaching an optical density at 600 nm of 0.2. The bacteria were then treated for 2 hours with destruxins A or B or with various conventional antibiotics for which the molecular target is known. The dose of antibiotic used is 5 times their MIC.
- the bacterial membrane was labeled 10 min in ice using the red fluorescent molecule FM4-64FX (from ThermoFisher, used at 12 pg / ml) and the bacterial DNA with the blue fluorescent molecule.
- DAPI from Sigma Aldrich, used at 2 ⁇ g / ml. The bacteria were then centrifuged at 7,500 rpm for 30 sec and washed with PBS. The bacteria are then fixed with a 4% paraformaldehyde solution for 15 minutes in ice before being centrifuged again and washed with PBS.
- the lipid monolayer technique was then used to confirm the absence of insertion of destruxins A and B into the membrane of Clostridium perfringens ( Figures 3 and 4).
- the determination of the critical insertion pressure (Pc) shows that destruxins A and B insert very weakly into a lipid monolayer formed from total lipids extracted from Clostridium perfringens (ATCC 13124) with a Pc value of 26.9 and 27.1 mN / m for destruxin A and destruxin B.
- Table 12 Determination of the critical insertion pressure of destruxins A and B, enniatin A1, nisin and CTAB.
- peptides antimicrobials are little or not selective, acting either on all Gram + and Gram- bacteria, or on Gram-i- or Gram- bacteria, or on a set of phylogenetically close bacteria.
- Destuxins A and B are therefore very original since they act only on Clostrium perfringens (clinical strains and ATCC) without acting on bacteria which are phylogenetically similar like the other Clostridium strains tested in Tables 3 and 4.
- the selectivity of destruxins A and B against Clostrium perfringens derives from their original mechanism of action.
- Table 13 Determination of the antimicrobial activity of the secretome obtained from the mold Beauveria felina (DSM 4678).
- the antimicrobial activity of secretomes of Beauveria felina was tested on various Gram-i- and Gram- strains by cascade dilution. Activity is expressed as the percentage of diluted secretome exhibiting activity.
- the data in Table 13 show that the secretomes of Beauveria felina (DSM 4678) are indeed active against Clostridium perfringens (ATCC 13124) but also against other Gram-i-pathogenic strains such as Bacillus cereus (DSM 31) and Staphylococcus aureus (ATCC 6538P). This suggests that the secretomes contain other molecules, in addition to destruxins A and B, which are active against Gram + bacteria. Although the loss of selectivity against Clostridium perfringens is detrimental, the fact that the secretomes of Beauveria felina (DSM 4678) are active against various Gram + pathogens infecting animals and humans is a positive point. The use of more purified fractions of the secretome, enriched in destruxins, should make it possible to regain selectivity against Clostridium perfringens.
- destruxins A and B demonstrate an ultra-selective activity of destruxins A and B against bacteria of the genus Clostrium perfringens responsible for intestinal infections in humans and farm animals including pigs and poultry. Due to the lack of toxicity of destruxins A and B at antibacterial doses, the use of destruxins A and B can be envisaged in the treatment of human infections by Clostridium perfringens but also in the treatment of intestinal infection by Clostridium perfringens of farm animals, including pigs and poultry.
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'une destruxine ou leurs dérivés pour prévenir ou lutter contre Clostridium perfringens, en thérapie humaine ou vétérinaire, ou en nutrition animale.
Description
TITRE : Utilisation de peptides cycliques fongiques de type destruxine comme agents anti bactériens actifs contre Clostridium perfringens
La présente invention concerne le domaine de la prévention ou du traitement des infections bactériennes, notamment par Clostridium perfringens.
Clostridium perfringens est responsable d’infections intestinales chez l’Homme ainsi que chez l’animal. Chez l’Homme, Clostridium perfringens est responsable de toxi-infections alimentaires. Clostridium perfringens est ainsi l’une des causes les plus courantes d’intoxication alimentaire aux États-Unis et au Canada (Johnson, E. A., Summanen, P., & Finegold, S. M. (2007). Clostridium. In P. R. Murray (Ed.), Manual of Clinical Microbiology { 9th ed., pp. 889-910). Washington, D.C. : ASM Press). En France, Clostridium perfringens occupe le 4e rang en nombre de foyers (2006- 2007) et le 1 er (2006) ou le 3e rang (2007) (Tableau 3) en nombre de cas parmi les causes identifiées dans le cadre de la déclaration obligatoire (DO) des toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) (source ANSES, https://www.anses.fr/fr/system/files/MIC2010sa0235Fi.pdf). Chez les animaux d’élevage, Clostridium perfringens infecte principalement les porcs et les volailles avec des conséquences économiques (baisse de rendement, mortalité et coût du traitement) et sanitaires (transmission à l’Homme). Dans les élevages de volailles, il peut causer dans sa forme clinique une mortalité très anormalement élevée (jusqu’à 50% de l’élevage) et dans sa forme sub-clinique une infection par Clostridium perfringens se traduit généralement par des pertes économiques importantes puisque les performances des animaux sont largement diminuées.
Il est désirable de mettre au point des compositions permettant d’agir spécifiquement contre cette souche afin de ne pas entraîner de modifications de la flore intestinale.
Les destruxines sont des peptides cycliques fongiques de type cyclohexadepsipeptides produits par divers champignons principalement du genre Metarhizium anisopliae mais aussi des genres Metarhizium brunneum, Beauveria felina, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassice, Alternaria linicola et Aschersonis sp.
Il existe diverses destruxines (35 molécules identifiées à ce jour) regroupées en 7 séries (séries A, B, C, D, E, F et G) (Pedras et al. Phytochemistry 2002, 59, 579-96).
Elles sont formées de cinq acides aminés (de conformation spatiale S) et d’un acide alpha-hydroxylé (de conformation spatiale R). Les destruxines des différentes séries diffèrent selon le type d’acides aminés, le type d’acide alpha-hydroxylé et/ou sur la
présence ou non de N-méthylation des acides aminés. Ces molécules sont connues pour avoir diverses activités biologiques (Wang et al., Molécules 2018, 23, 169; doi:10.3390) telles que des activités insecticides, cytotoxiques, immunosuppresive, antiproliférative, antivirale (Pedras et al., Phytochemistry, 2002, 59, 579-96 et Wang et al., Molécules 2018, 23, 169; doi:10.3390) et certaines demandes de brevet auraient allégué une activité contre l’ostéoporose (CN101433214B, CN106810601 A, W02002064155A1 ). Néanmoins, leur effet antibactérien n’a jamais été rapporté (Wang et al., Molécules 2018, 23, 169; doi:10.3390). L’activité contre la bactérie Hélicobacter pylori rapportée (Kao et al., Process. Biochem. 2015, 50, 134-139) ne correspond pas à une activité antibactérienne mais à une activité d’inhibition de la vacuolisation causée par H pylori dans les cellules gastriques.
De façon inattendue, il a maintenant été démontré que les destruxines présentent une activité contre Clostridium perfringens. De plus, à l’inverse d’autres peptides cycliques fongiques (Enniatines A, A1 , B, B1 et Beauvericine notamment qui ont un spectre d’action large avec une activité antibactérienne sur plusieurs bactéries Gram+), les destruxines ont montré une sélectivité d’action contre Clostridium perfringens. Cette activité sélective des destruxines permet d’envisager leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des infections liées à Clostridium perfringens notamment les infections intestinales chez l’Homme et l’animal d’élevage, dont le poulet.
Selon un premier objet, la présente invention concerne une composition comprenant au moins une destruxine pour traiter et/ou prévenir les infections par Clostridium perfringens. Selon un mode de réalisation, la destruxine est choisie parmi les destruxines des séries A, B, C, D, E, F ou G de champignon, ou leurs dérivés.
On entend par « destruxines » des peptides cycliques de type cyclohexadepsipeptide, tels que ceux produits par les champignons du genre Metarhizium anisopliae, Metarhizium brunneum, Beauveria felina, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassice, Alternaria linicola et Aschersonis sp.
On peut notamment citer les destruxines des séries A, B, C, D, E, F et G décrites par Pedras et al. Phytochemistry, 2002, 59, 579-96, et notamment les destruxines :
Série A : Dx A, Ai, Aå, A3, A4, A5, A4 chlorohydrin, desmethylDx A, dihydroDx A ; Série B : B, B1, B2, desmethylDx B, Desmethyl Dx B2, homoDx, protoDx, hydroxyDx B, hydroxyhomoDx B, beta-D-Glucopyranosyl-hydroxyDx B ;
- Série C : C, C2, desmethylDx C ;
- Série D : D, D1, D2
Série E : E, Ei, E2, E chlorhydrin, E2 chlorohydrin, E diol, E1 diol ;
- Série F : F ;
PseudoDx A , PseudoDx B .
Selon un mode de réalisation particulier, on peut notamment citer les destruxines A, B, C, D, E, F ou G et leurs dérivés (dont les sources sont notamment indiquées dans Pedras et al, supra) notamment les destruxine A et B. Les destruxines A et B sont disponibles commercialement (Sigma-Aldrich ou A2S, pureté>98%).
Une destruxine selon l’invention inclut les destruxines pré-citées, ainsi que leurs dérivés, notamment définis par la formule générale (I) ci-dessous.
La destruxine pour l’application antibactérienne de l’invention est une destruxine fonctionnelle.
Par “destruxine fonctionnelle” ou “destruxine à activité fonctionnelle”, on entend une destruxine présentant une activité susceptible de prévenir et ou traiter une infection bactérienne. On peut déterminer si une protéine est fonctionnelle, par toute méthode connue, par exemple par un essai in vitro de détermination de l’activité antibactérienne (CMI, tel que décrit dans l’exemple 1 ).
La destruxine selon l’invention peut être d’origine fongique ou de synthèse, de préférence d’origine fongique.
L’expression“destruxine d’origine fongique” inclut la destruxine de champignon telle que celles définies ci-avant ou un dérivé de celle-ci.
A titre de destruxine selon l’invention, on peut notamment citer les composés de formule (I) :
[Chem 1 ]
Dans laquelle
1R représente un atome d’hydrogène, un groupe C1 -C6 alkyle ou un groupe aralkyle ;
2R, 3R, 4R identiques ou différents représentent indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupe C1 -C6 alkyle ;
5R représente un groupe choisi parmi les groupes C2-C6 alkènyle et C1 -C6 alkyle éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi les atomes d’halogène, les groupes hydroxy (OH), carboxy (COOH), -glycosylé, et les groupes hétérocycliques de 3 à 6 membres comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S ;
Et plus particulièrement:
1R représente un atome d’hydrogène, un groupe méthyle ou un groupe benzyle ;
2R, 3R, 4R identiques ou différents représentent indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupe méthyle ;
5R représente un groupe choisi parmi -CH=CH2, -CHOHCH2CI, CH=CH2, -CHMe2, - COHMe2, -C(0-beta-D-glycosyl)Me2, -CHMeCH2OH, -CHMeCOOH, [Chem2]
— CH— CH 2
O , -CHOHCH2CI, -CHOHCH2OH, -CHOHMe, -CHMe2.
Selon la présente invention, les radicaux Alkyle représentent des radicaux hydrocarbonés saturés, en chaîne droite ou ramifiée, de 1 à 6 atomes de carbone, tels que les radicaux méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, isopropyle, tert-butyl, 2-méthylbutyle, 2- méthylpentyle, 1 -méthylpentyle.
Parmi les atomes d'Halogène, on cite plus particulièrement les atomes de fluor, de chlore, de brome et d'iode, de préférence le fluor.
Les radicaux Alkènyle représentent des radicaux hydrocarbonés de 2 à 6 atomes de carbone, en chaîne droite ou ramifiée, et comprenant une ou plusieurs insaturations éthyléniques. Parmi les radicaux Alkènyle, on peut notamment citer les radicaux allyle ou vinyle.
Le terme aralkyle désigne les groupes AlkyleAryle où alkyle est défini comme ci-avant et aryle désigne un système aromatique hydrocarboné, mono ou bicyclique de 6 à 10 atomes de carbone. Parmi les radicaux -AlkyleAryle, on peut notamment citer le radical benzyle ou phénétyle.
La composition de l’invention peut comprendre une destruxine sous forme pure en mélange, ou sous forme d’un champignon produisant une destruxine, ou un extrait de celui-ci, tel qu’un broyât ou un surnageant de culture de celui-ci, notamment un extrait comprenant une destruxine, ou leurs mélanges.
Wang et al. {supra) décrit notamment différentes destruxines et les champignons les produisant (pages 14 et 15). A titre de champignon produisant une destruxine, on peut
citer les espèces Metarrhizium, Beauveria, Ophiocordyceps, Alternaria et Aschersoni et notamment les genres Metarrhizium anisopliae, Metarhizium brunneum, Beauveria feiina, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassicae, Alternaria linicola, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassicae et Aschersonis sp ; notamment Beauveria feiina , Metarrhizium anisopliae, Metarhizium brunneum, Ophiocordyceps sp., Alternaria alternata, Alternaria brassicae, Alternaria linicola ; et leurs mélanges, ou les extrait de ceux-ci, et/ou les surnageant de culture de ceux-ci.
Certains de ces genres sont disponibles commercialement ou disponibles auprès d’organismes de dépôt : Beauveria feiina et Metarhizium anisopliae sont notamment disponibles commercialement, chez DSMZ et ATCC, par exemple sous les références DSM 4678 et ATCC® 60335™ ou DSM 1490
Certains de ces genres sont disponibles commercialement ou disponibles auprès d’organismes de dépôt. Ils sont notamment disponibles commercialement, chez DSMZ et ATCC, par exemple Beauveria feiina sous la référence DSM 4678 ; Metarrhizium anisopliae sous la référence ATCC® 60335™, DSM 1490 et DSM 21704 ; Metarhizium brunneum sous la référence ATCC®90448™; Ophiocordyceps sp. sous la référence ATCC®24400™; Alternaria alternata sous la référence ATCC® 13963, ATCC® 66981 , DSM-12633, DSM- 62006, DSM-62010 ou DSM-1 102; Alternaria brassicae sous la référence ATCC® 58169, ATCC® 38713 ou ATCC® 34642 ; Alternaria linicola sous la référence ATCC® 201065, ATCC® 11802 ou ATCC® 201658.
On entend par « surnageant » de culture ou sécrétome, le milieu de culture dans lequel a été cultivé le champignon, après séparation dudit champignon.
Selon la présente invention, les composés de formule (I) présentent une activité antibactérienne spécifique contre Clostridium perfringens.
Les composés de formule (I) sont donc utiles dans le traitement et/ou la prévention des infections liées à Clostridium perfringens.
Les compositions selon l’invention peuvent être utilisées en thérapie humaine ou vétérinaire afin de traiter une infection causée par Clostridium perfringens, ou à titre de complément alimentaire pour animaux afin de prévenir l’infection par Clostridium perfringens.
De façon avantageuse et contrairement aux antibiotiques tel que le métronidazole classiquement utilisé pour traiter les infections par Clostridium perfringens, l’administration de destruxine n’induit pas de sélection de bactéries résistantes (voir Figure 1 ).
Clostridium perfringens comprend ou consiste en la séquence ATCC®13124™ déposée auprès de VATCC. Par exemple, Clostridium perfringens peut comprendre ou consister en une séquence présentant un degré d’identité d’au moins 80% à ladite séquence ATCC®13124™, disponible commercialement, notamment au moins 85% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, et plus particulièrement au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité, étant entendu que ladite séquence de Clostridium perfringens est fonctionnelle.
Selon un autre objet, la présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant une destruxine selon l’invention avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, ladite composition contient une quantité efficace du composé selon l’invention. De préférence, ladite composition est administrée à un patient ou un animal qui en a besoin.
La présente invention concerne également une destruxine selon l’invention pour le traitement et/ou la prévention d’infections bactériennes liées à Clostridium perfringens, telles que les infections intestinales, notamment les entérites nécrotiques.
Les compositions pharmaceutiques selon l’invention peuvent être présentées sous des formes destinées à l’administration par voie parentérale ou orale.
Elles seront donc présentées sous forme de solutés ou de suspensions injectables ou flacons multi-doses, sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules, de pilules, de cachets, de poudres, de suppositoires ou de capsules rectales, de solutions ou de suspensions.
Les excipients qui conviennent pour de telles administrations sont les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalino-terreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides.
Pour l’usage parentéral, l’eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques sont les véhicules les plus commodément utilisés.
La posologie peut varier dans les limites importantes (0,5 mg à 1000 mg) en fonction de l’indication thérapeutique et de la voie d’administration, ainsi que de l’âge et du poids du sujet.
Selon un autre objet, la présente invention concerne également les compositions alimentaires comprenant une destruxine selon l’invention. Lesdites compositions conviennent particulièrement à l’alimentation des animaux d’élevage tels que le porc ou
les volailles ou tout autre animal d’élevage susceptible d’être infecté par Clostridium perfringens.
Selon un autre objet, la présente invention concerne également l’utilisation d’une destruxine à titre d’additif alimentaire pour les animaux d’élevage dont le porc et les volailles pour le traitement et/ou la prévention des infections bactériennes par une infection par la souche Clostridium perfringens.
Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois la limiter. Les produits de départs utilisés sont des produits connus ou préparés selon des modes opératoires connus.
FIGURES
[Fig 1] La Figure 1 illustre l’évaluation de l’induction de résistance chez Clostridium perfringens par les destruxines A ou B et le métronidazole. L’apparition de mutants résistants a été évaluée en présence de destruxines A ou B ou de métronidazole comme indiqué dans le texte.
[Fig 2] La Figure 2 illustre l’évaluation de l’effet perméabilisant des destruxines sur Clostridium perfringens. Clostridium perfringens a été exposée pendant 2h aux destruxines A ou B, à la nisine, à l’enniatine A1 ou au CTAB à une dose correspondant à 5 fois leur CMI. La perméabilisation de la membrane bactérienne a été mesurée à l’aide d’iodure de propidium comme expliqué dans le texte. La perméabilisation est exprimée en pourcentage, le CTAB servant de contrôle positif et donnant 100 % de perméabilisation. Les valeurs portées dans le graphique correspondent aux moyennes +/- écart-type.
[Fig 3] La Figure 3 représente la détermination de la pression critique d’insertion des destruxines dans une monocouche formée de lipides extraits de Clostridium perfringens. Les pressions critiques d’insertion des destruxines A et B, de la nisine, de l’enniatine A1 et du CTAB ont été mesurées comme indiqué dans le texte à une dose correspondant à 5 fois leur CMI.
[Fig 4] La Figure 4 illustre la détermination de la capacité d’insertion des destruxines dans une monocouche formée de lipides extraits de Clostridium perfringens et présentant une pression initiale de surface correspondant à la membrane des bactéries. L’insertion des destruxines A et B, de la nisine, de l’enniatine A1 et du CTAB dans une monocouche
lipidique mimant la membrane de Clostridium perfringens a été mesuré comme indiqué dans le texte à une dose correspondant à 5 fois leur CMI. Les valeurs portées dans le graphique correspondent à la moyenne +/- écart-type.
[Fig 5] La Figure 5 représente le phénotype morphologique de la bactérie Clostridium perfringens (ATCC 13124) incubée avec différents antibiotiques conventionnels de mécanisme d’action connu. Clostridium perfringens (ATCC 13124) a été exposé à divers antibiotiques conventionnels agissant sur la synthèse de macromolécules indiquée dans le graphique ou à la destruxine A (à une dose correspondant à 5 fois leur CMI). Après 2h d’exposition, les bactéries ont été marquées comme indiqué dans le texte avant observation au microscope à fluorescence des phénotypes obtenus.
Exemples
I- Exemple 1 : Evaluation de l’activité antibactérienne
Matériels et Méthodes :
L’activité antimicrobienne des destruxines A et B a été évalué sur divers souches de bactéries et champignons commerciales listées dans le Tableau 2 et obtenues chez ATCC, DSMZ ou l’institut Pasteur (CIP). L’activité antimicrobienne a été mesurée par détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice ou CMI suivant les instructions du National Committee of Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997) et tel que décrit dans les publications suivantes : Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33; Benkhaled et al., Polym. Chem., 2018, 9, 3127-3141 ; Olleik et al., Eur J Med Chem, 2019, 165, 133-141.
La détermination de la CMI se fait par exposition des bactéries ou champignons à des doses croissantes de destruxines A ou B ou d’antibiotiques de références obtenues par dilution en cascade au ½ de ces molécules dans le milieu de culture.
Brièvement, chaque souche bactérienne ou fongique a été cultivée sur boite de Pétri contenant le milieu de culture spécifique de la souche étudiée. Une colonie a été prélevée et utilisée pour ensemencer 3 ml de milieu de culture. Après incubation à 37°C sous agitation (200 rotations par minutes (rpm)) durant 16h, la densité optique (DO) a été lue à 600 nm afin d’estimer la densité bactérienne. La suspension bactérienne a alors été
diluée au 1/100 dans 3 ml de milieu de culture avant incubation à 37°C sous agitation à 200 rpm pendant 2-3h jusqu’à obtenir une DOeoonm de 0.6.
Les bactéries ont alors été diluées afin d’atteindre une densité de 10E5 bactéries par millilitre (10E5 bactéries/ml). Pour les souches fongiques, la densité utilisée a été de 10E3 cellules par ml pour Candida albicans et 10E4 conidies par mil pour les autres champignons. 100 mI de cette suspension bactérienne ont alors été ajoutés à des puits d’une plaque de 96 puits en polypropylène (Greiner BioOne) contenants déjà 100 mI de destruxines A ou B ou d’antibiotiques de référence dilués en cascade au ½ dans du milieu de culture. Les plaques 96 puits ont ensuite été incubées selon la souche testée dans les conditions de température et de temps indiquées dans le Tableau 2.
Dans le cas des souches anaérobies (dont toutes les souches de Clostridium), la CMI a été mesurée en utilisant une chambre anaérobie (Coy Laboratory Products, Grass Lake, Ml).
Pour les souches micro-anaérobies {H. pylori et E. faecalis) la CMI a été mesurée en utilisant les systèmes micro-anaérobiques BD GasPack.
En fin d’incubation, la DOeoonm a été lue à l’aide d’un lecteur de microplaque (Synergy Mx, Biotek), la CMI correspondant à la plus faible concentration de destruxines A ou B ou d’antibiotique de référence capable d’inhiber l’augmentation de DOeoonm causée par la croissance bactérienne ou fongique. Le test a été répété 3 fois de manière indépendante (n=3).
La Concentration Minimale Bactéricide (CMB) correspondant à la plus faible concentration entraînant la mort de plus de 99.9 % des bactéries ou champignons a également été mesurée. La CMB a été mesurée en étalant sur boite de Pétri de 10 mI du contenu des puits des plaques 96 puits utilisées lors de la mesure de la CMI. Après incubation dans les conditions propres à chaque souche et listées dans le Tableau 2, le nombre de colonies bactériennes/fongiques a été déterminé. Les concentrations d’antibiotique donnant une seule colonie ou pas de colonie ont été considérées comme étant les CMB.
L’induction de résistance a également été évaluée comme décrit dans les publications suivantes : Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33; Benkhaled et al.,
Polym. Chem., 2018, 9, 3127-3141. Pour cela, la bactérie Clostridium perfringens (ATCC13124) a été exposée à la destruxine A, à la destruxine B ou au métronidazole durant 18 jours consécutifs. Chaque jour, la CMI a été mesurée comme indiqué précédemment. Le dernier puits où une croissance bactérienne a eu lieu (correspondant donc à la CMI divisée par deux) a été utilisé pour préparer l’inoculum permettant de mesurer la CMI le jour suivant.
Table 2 : Souches testées et conditions de culture utilisées.
LB : milieu Luria-Bertoni ; MH : milieu Mueller-Hinton ; BHI : milieu Brain Heart Infusion ; TS : milieu Tryptocasein Soja ; PD : Potato Dextrose ; RPMI : Roswell Park Memorial Institute medium ; Middlebrook 7H9 et 7H10: milieu sélectif des Mycobacterium.
[Table 1]
Résultats : Les activités antimicrobiennes de la destruxine A, de la destruxine B et d’antibiotiques de références utilisés pour comparaison sont données dans les Tableaux 3 à 6.
Tableau 3: Valeurs des CMI de la DesA, DesB, Bafilomycine A1 et Bafilomycine B obtenues sur diverses souches bactériennes et fongiques testées. Les CMI sont exprimées en micromolaire ou mM (micromole par litre).
[Table 2]
L’analyse des résultats du Tableau 3 montre que :
- Parmi toutes les souches bactériennes et fongiques testées, seule la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124) est sensible à la destruxine A et la destruxine B avec de très bonne valeur de CMI (respectivement 1.5 et 3 pmol/l) démontrant la sélectivité des destruxines A et B contre la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124).
- La bafilomycine A1 et la bafilomycine B, deux antibiotiques ayant la même cible moléculaire que les destruxines dans les cellules eucaryotes (la V-ATPase) ne sont pas sélectives de Clostridium perfringens et sont ainsi actives contre de nombreuses souches bactériennes et fongiques indiquées dans le Tableau 3.
Tableau 4 : Valeurs des CMI de la DesA, DesB, Bafilomycine A1 , B1 et du métronidazole obtenues sur diverses souches bactériennes anaérobies. Les CMI sont exprimées en micromolaire ou mM (micromole par litre).
[Table 3]
Les données du Tableau 4 confirment que :
- Parmi toutes les souches bactériennes anaérobies testées, seule la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124) est sensible à la destruxine A et la destruxine B avec de très bonne valeur de CMI (respectivement 1.5 et 3 pmol/l) démontrant la sélectivité des destruxines A et B contre cette souche.
- De manière importante, toutes les autres souches de Clostridium testées (autre que Clostridium perfringens) sont insensibles aux destruxines A et B (CMI > 100 mM).
- Les données du Tableau 4 confirment que, contrairement aux destruxines, le métronidazole, un antibiotique conventionnel actif sur de nombreuses bactéries anaérobies Gram+ et Gram-, n’est pas sélectif de Clostridium perfringens et est actif sur toutes les souches de Clostridium testés dans le Tableau 4.
Tableau 5 : Valeurs des CMI de divers antibiotiques conventionnels et des destruxines A et B contre la souche Clostridium perfringens (ATCC13124). Les
CMI sont exprimées en micromolaire ou mM (micromole par litre) et en mg/l (milligramme par litre).
[Table 4]
L’analyse des résultats du Tableau 5 montre que les CMI de la destruxine A et de la destruxine B obtenues sur la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124) sont proches ou inférieures à celles d’antibiotiques conventionnels utilisés pour traiter les infections bactériennes. De manière importante, les CMI de la destruxine A (1.5 mM ou 0.86 mg/l) et de la destruxine B (3 mM ou 1.78 mg/l) sont nettement inférieures à celle du métronidazole
(9.37 mM ou 1 .6 mg/l), l’antibiotique conventionnel classiquement utilisé dans le traitement des infections intestinales causées par Clostridium perfringens.
Tableau 6 : Comparaison des valeurs de CMI des destruxines A et B et de l’enniatine A1 contre divers souches bactériennes et fongiques. Les CMI sont exprimées en micromolaire ou mM (micromole par litre).
[Table 5]
Les données du Tableau 6 montrent que l’enniatine A1 , un peptide cyclique fongique appartenant à la famille des depsipeptides comme les destruxines, ne présente pas la sélectivité étroite des destruxines contre le Clostridium perfringens puisque l’enniatine A1 est active contre diverses souches Gram+ et la levure Candida albicans comme indiqué dans le Tableau 6. Ceci démontre que les propriétés antimicrobiennes des destruxines, particulièrement leur sélectivité contre Clostridium perfringens ne sont pas partagées par d’autres membres de la même famille de peptide, les depsipeptides fongiques.
Tableau 7 : Valeurs des CMI de la destruxine A et de la destruxine B contre divers souches cliniques de Clostridium perfringens isolées de patients humains ou d’animaux. Les CMI sont exprimées en micromolaire ou mM (micromole par litre).
[Table 6]
L’analyse des résultats du Tableau 7 montre que la destruxine A et la destruxine B possèdent des CMI sur souches cliniques de Clostridium perfringens (isolées de patients ou d’animaux infectés) proches ou inférieures à celles obtenues sur la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124). Ainsi, les destruxines A et B ont la même activité, voir sont plus actives sur les souches isolées de patients ou d’animaux que sur la souche ATCC de référence, démontrant leur possible utilisation dans le traitement des humains et animaux infectés par Clostridium perfringens ou dans le traitement préventif des infections par Clostridium perfringens des animaux d’élevage dont le porc et les volailles.
Les concentrations minimales bactéricides de la destruxine A et de la destruxine B ont été déterminées sur la souche Clostridium perfringens (ATCC 13124) et sur les souches cliniques de Clostridium perfringens isolées de patients ou d’animaux. Dans tous les cas, les valeurs de CMB sont identiques aux valeurs de CMI obtenues, démontrant que les destruxines A et B ont une action bactériolytique sur Clostridium perfringens.
De manière très importante, l’évaluation de l’induction de résistance chez la bactérie Clostrium perfringens (ATCC 13124) exposée aux destruxines A ou B ou au métronidazole durant 18 jours montre que (Figure 1 ):
- les CMI des destruxine A et B n’évoluent pas ou peu (avec un doublement de la valeur de la CMI) durant les 18 jours consécutifs de contact
- A l’inverse, le métronidazole entraîne rapidement l’apparition de résistance avec une augmentation importante de sa CMI : multiplication de la CMI par 10 après 7 jours de contact et multiplication par 50-100 après 9 jours de contact.
Ceci démontre que, contrairement à un antibiotique conventionnel tel que le métronidazole, les destruxines A et B n’entraînent pas l’apparition et/ou la sélection de mutants de Clostridium perfringens résistant à leur action.
En conclusion des tests d’activité antimicrobienne des destruxines A et B, il apparaît que :
- Contrairement aux antibiotiques conventionnels, dont le métronidazole, les destruxines A et B ont une action extrêmement sélective, ne présentant d’activité que contre les souches commerciales et cliniques de Clostridium perfringens avec une CMI / CMB très faible (0.75-3 mM). Cette sélectivité très étroite est un atout majeur des destruxines car, contrairement aux antibiotiques conventionnels qui perturbent fortement la flore commensale intestinale, l’utilisation des destruxines n’entrainera pas de dysbiose intestinale. Ceci pourrait également permettre un traitement préventif des animaux d’élevage dont le porc et les volailles par les destruxines pour prévenir l’infection par Clostridium perfringens sans risquer de perturber la flore commensale bénéfique des animaux.
- La sélectivité des destruxines A et B contre Clostridium perfringens n’est pas présente chez d’autres membres de la famille de depsipeptides fongiques dont l’enniatine A1 démontrant que tous les membres de la famille des depsipeptides n’ont pas les mêmes activités antimicrobiennes.
- Contrairement aux antibiotiques conventionnels, tel le métronidazole, l’exposition répétée aux destruxines A et B ne conduit pas à l’apparition de souches résistantes. De plus, ces résultats montrent que les destruxines sont actives contre la souche de Clostridium perfringens (ATCC13124) rendue résistante au métronidazole. Ces deux observations renforcent l’intérêt thérapeutique et/ou préventif des destruxines dans le contexte actuel d’augmentation constante du nombre de souches bactériennes résistantes ou multi-résistantes aux antibiotiques conventionnels.
II- Exemple 2 : Evaluation de l’innocuité et du passage transépithélial des destruxines A et B à l’aide de cellules intestinales humaines et animales
Matériels et Méthodes :
L’innocuité des dextruxines a été d’abord mesurée par un test d’hémolyse réalisé sur globules rouges humains comme publié dans le papier Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33. Des globules rouges obtenus chez Divbioscience (Pays Bas) ont été lavés 3 fois dans du tampon phosphate (PBS, pH 7) puis dilués à 8 % (volume : volume) dans du PBS. 100 mI de cette suspension cellulaire ont été ajoutés dans des plaques 96 puits puis 100 mI de PBS contenant des doses croissantes de destruxines A ou B ont été ajoutés dans chaque puits. Après 1 h d’incubation à 37°C, les plaques ont été centrifugées à 800 g pendant 5 min. 100 mI de surnageant ont alors été transférés dans une nouvelle plaque 96 puits avant lecture de la densité optique à 405 nm. Le pourcentage d’hémolyse causé par les destruxines a été quantifié en utilisant le Triton- Xi 00 (Sigma Aldrich) comme contrôle positif donnant 100 % d’hémolyse.
L’innocuité et l’absorption intestinale des destruxines ont également été évaluée à l’aide de cellules intestinales humaines mimant l’intestin grêle (cellules Caco-2 (ATCC HTB-37) ou le colon (cellules T84 (ATCC CCL-248) et de cellules d’intestin grêle de porc (DSM ACC701 ). Les cellules ont été cultivées en routine dans du milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium supplémenté avec 10 % (volume : volume) de sérum de veau fêtai. Les cellules ont été ensemencées en flasques de 25 cm2 et maintenues à 37°C dans un incubateur à C02 avec changement de milieu tous les deux jours et passage lorsque les cellules atteignaient 80-90% de confluence.
Pour les tests d’innocuité, les cellules les cellules Caco-2, T84 ou IPEC-J2 ont été trypsinisées et ensemencées en plaques de 96 puits. Une fois confluentes, les cellules ont été exposées à des doses croissantes de destruxines A ou B ou d’autres molécules durant 48h. Après 48h d’incubation, la viabilité cellulaire a été mesurée à l’aide du kit de dosage de la toxicité de Sigma-Aldrich basé sur la résazurine (réf TOX8-1 KT). Après 4h d’incubation avec le réactif du kit, la viabilité cellulaire a été mesurée par lecture de la fluorescence des puits (excitation à 530 nm / émission à 590 nm). La concentration causant 50% de mortalité cellulaire (IC50) a été calculée graphiquement à l’aide du logiciel GraphPad® Prism 7 software. L’analyse statistique des données a été faite par le test-t et le test ANOVA du logiciel.
Pour les tests d’absorption intestinale, les cellules Caco-2, T84 ou IPEC-J2 ont été ensemencées sur des inserts de culture Greiner de 1 cm2 de diamètre et de porosité 0.4 pm. Après 21 jours de culture, l’étanchéité de l’épithélium intestinal a été confirmée par mesure de la résistance électrique transépithéliale à l’aide d’un voltohmètre (EVOM de Millipore). Le passage transépithélial (apical vers basal) et l’accumulation intracellulaire des divers antibiotiques (destruxines A ou B, bafilomycine A1 , métronidazole, enniatine A1 ) ont été mesurés après ajout dans le compartiment apical (correspondant à la lumière intestinale) de 100 mM de composé dilué dans du PBS contenant du calcium et du magnésium (PBS++). Après 4h d’incubation à 37°C, la résistance électrique transépithéliale a été mesurée à l’aide d’un voltohmètre (EVOM de Millipore) et les milieux apical, basal et intracellulaire ont été collectés et analysés par chromatographie HPLC afin de quantifier la teneur en antibiotique.
Résultats :
Le test d’hémolyse (Tableau 8) montre que les destruxines A et B (comme la bafilomycine A1 et le métronidazole) n’induisent aucune hémolyse, même pour des doses de 100 mM (0 % d’hémolyse à 100 mM). A l’inverse, en accord avec sa toxicité déjà connue et rapportée dans la littérature, l’enniatine A1 qui appartient pourtant à la même famille de peptides cycliques fongiques (les depsipeptides) entraîne une hémolyse des globules rouges humains avec 51 % d’hémolyse observé à 100 mM d’enniatine A1 .
L’évaluation de la toxicité des destruxines A et B sur les cellules intestinales humaines (Caco-2 et T84) et de porc (IPEC-J2) (Tableau 9) montre que, comme le métronidazole, les destruxines ne sont pas toxiques même à 100 mM vis-à-vis de ces cellules. A l’inverse, comme rapporté dans la littérature, l’enniatine A1 est toxique vis-à-vis de ces cellules intestinales. De la même façon, la bafilomycine A1 est toxique contre toutes les cellules intestinales testées avec des IC50 comprises entre 1.8 et 1 1.8 mM.
Tableau 8 : Evaluation de l’effet hémolytique des destruxines A et B, de l’enniatine A1 , de la bafilomycine A1 ou du métronidazole vis-à-vis des globules rouges humains. Les valeurs portées dans le tableau indiquent le pourcentage d’hémolyse observée après 1 h de contact avec 100 mM d’antibiotique.
[Table 7]
Tableau 9 : Evaluation de la toxicité des destruxines A et B, de l’enniatine A1 , de la bafilomycine A1 ou du métronidazole vis-à-vis des cellules intestinales humaines et porcines. Les valeurs portées dans le tableau correspondent aux IC50 exprimées en pmol/l (mM) (moyenne +/- écart-type).
[Table 8]
Sur la base des données de toxicité, on peut conclure que, comme le métronidazole (antibiotique conventionnel de référence utilisé pour traiter les infections intestinales causées par Clostridium perfringens, les destruxines A et B ne sont pas hémolytiques et ne causent pas de toxicité à l’encontre des cellules humaines et porcines aux doses actives contre Clostridium perfringens. Sur la base de la CMI et des IC50 de la destruxine A et B, le facteur de sécurité (calculé en divisant l’IC50 obtenue dans le test de toxicité par la CMI obtenue avec le Clostridium perfringens (ATCC 13124)) est d’au moins 66. A l’inverse, la bafilomycine A1 et l’enniatine A1 présentent une toxicité à faible dose contre les cellules humaines et porcines (de 1.8 à 1 1.8 mM pour la bafilomycine A1 et de 3.1 à XX mM pour l’enniatine A1 ). Les CMI contre Clostridium perfringens (ATCC 13124) étant de 25 mM pour la bafilomycine A1 et de 6.25 mM pour l’enniatine A1 , à l’inverse des destruxines ou du métronidazole, ces molécules ne présentent pas de facteurs de sécurité (facteur de sécurité inférieur à 1 pour la bafilomycine A1 et pour l’enniatine A1 ).
L’absence de toxicité des destruxines A et B les distingue donc également de l’enniatine A1 , un autre peptide cyclique fongique de type depsipeptides à action antibactérienne qui lui est très toxique.
L’évaluation du transport transépithélial et de l’accumulation intracellulaire des destruxines A et B à l’aide de cellules épithéliales humaines ou porcines (Tableau 10) montre que l’absorption intestinale des destruxines A et B même au bout de 4h d’incubation est faible et comprise entre 0.2 et 3.3 % de la dose initiale. De la même manière, l’accumulation intracellulaire des destruxines A et B au bout de 4h est faible et comprise entre 3.0 et 20.4 % de la dose initiale. Ceci diffère de l’enniatine A1 et de la bafilomycine A1 qui s’accumulent dans les cellules intestinales (de 19.5 à 77.4 % de la dose initiale) en lien avec leur forte toxicité. Tableau 10 : Evaluation à l’aide de cellules épithéliales intestinales humaines et porcines du passage transépithélial et de l’accumulation intracellulaire des destruxines A et B, de l’enniatine A1 , de la bafilomycine A1 et du métronidazole.
Les valeurs indiquées dans le tableau ont été mesurées par HPLC après 4h d’incubation avec les cellules et correspondent au pourcentage de la dose initialement ajoutée aux cellules dans le compartiment apical.
[Table 9]
[Table 10]
[Table 1 1 ]
L’intégrité tissulaire après 4h d’exposition aux destruxines A ou B a été évaluée par mesure de la résistance électrique transépithéliale des cellules intestinales humaines ou porcine cultivées sur inserts à l’aide d’un appareil de type EVOM (Tableau 1 1 ). Les données montrent que les destruxines, comme le métronidazole, affectent peu ou pas la résistance électrique transépithéliale (diminution comprise entre 2 et 17 % pour les destruxines et entre 0 et 34 % pour le métronidazole) indiquant que ces molécules causent peu ou pas d’atteinte de l’intégrité intestinale. A l’inverse, l’enniatine A1 et la bafilomycine A1 entraînent de fortes diminutions de la résistance électrique transépithéliale (diminution comprise entre 67 et 83 % pour l’enniatine A1 et 61 et 75 % pour la bafilomycine A1 ), indiquant une atteinte importante de l’intégrité tissulaire intestinale.
Tableau 11 : Evaluation à l’aide de cellules épithéliales intestinales humaines et porcines de l’atteinte tissulaire causée par les destruxines A et B, de l’enniatine A1 , de la bafilomycine A1 et du métronidazole.
Les cellules intestinales humaines et porcines cultivées sur inserts ont été exposées pendant 4h à 100 mM de chaque molécule ajoutée dans le compartiment apical des inserts. Après 4h, l’intégrité tissulaire a été évaluée par mesure de la résistance électrique transépithéliale. Les valeurs sont en ohm.cm2 (moyennes +/- écart-type).
[Table 12]
En conclusion, il apparait que :
- Les destruxines A et B sont non hémolytiques et peu ou pas toxiques vis-à-vis des cellules intestinales humaines et porcines testées
- L’accumulation intracellulaire et le passage transépithélial des destruxines A et B est faible, ce qui est une bonne chose. En effet, suite à leur ingestion les destruxines A et B resteront majoritairement dans la lumière intestinale ce qui est un avantage pour leur utilisation dans le traitement topique et/ou la prévention des infections intestinales causées par Clostridium perfringens.
III- Exemple 3 : Identification du mécanisme d’action des destruxines A et B
Matériels et Méthodes :
Le mécanisme d’action des destruxines A et B a été étudié par divers techniques. La plupart des peptides antimicrobiens (PAM) rapportés dans la littérature sont connus pour s’insérer dans la membrane bactérienne formant des pores et causant une perméabilisation / lyse de la membrane bactérienne. La capacité des destruxines A et B à perméabiliser la membrane de Clostridium perfringens (ATCC 13124) a donc été évaluée. La nisine, un PAM connu pour perméabiliser la membrane bactérienne a été utilisé en contrôle positif de perméabilisation. La capacité de l’enniatine A1 à former des pores a
aussi été évaluée. L’évaluation de la perméabilisation se fait à l’aide de l’iodure de propidium, une molécule qui devient fluorescente une fois qu’elle rentre en contact avec de l’ADN (Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33). La membrane bactérienne étant imperméable à l’iodure de propidium, celui ne peut rentrer en contact avec de l’ADN que si la membrane est perméabilisée. Le principe du test est le suivant. Une culture liquid de Clostridium perfringens (ATCC 13124) est centrifugée à 3000 rpm pendant 5 min. Le culot bactérien est alors resuspendu dans du PBS à une concentration de 10e9 bactéries / ml. De l’iodure de propidium (Sigma Aldrich) est ensuite ajouté à cette suspension bactérienne à une concentration finale de 60 mM. 100 mI de cette suspension sont ensuite ajoutés dans des puits d’une plaque 96 puits noire pour fluorescence (Greiner) contenant 100 mI de molécules à tester diluées dans du PBS à une concentration correspondant à 5 fois leur CMI. Après 120 min d’incubation à 37°C en condition anaérobie, la fluorescence des puits a été lue à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescence (excitation à 530 nm et émission à 590 nm). La perméabilisation de la membrane bactérienne de Clostridium perfringens (ATCC 13124) a été exprimée en pourcentage, le CTAB servant de référence et donnant 100 % de perméabilisation.
La capacité des destruxines A et B à s’insérer dans les lipides membranaires de Clostridium perfringens a également été étudiée par la technique des monocouches lipidiques ou balance de Langmuir (Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33). Les lipides membranaires totaux de Clostridium perfringens (ATCC 13124) ont été extrait selon la technique de Folch (Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33). Ces lipides ont été déposés à l’aide d’une seringue Hamilton à la surface d’une goutte de PBS formant une monocouche lipidique à l’interface PBS-air. Durant le test, la température est maintenue à 20 +/- 0.2 °C. Le film lipidique formé comprime une sonde positionnée à la surface du PBS entraînant une augmentation de la pression de surface mesurée à l’aide d’un microtensiomètre de surface (pTROUGH SX, Kibron Inc). Les lipides sont ainsi ajoutés jusqu’à atteindre la pression de surface souhaitée nommée pression de surface initiale (Pi dont l’unité est mN/m). Une fois la pression de surface stabilisée, les antibiotiques à tester sont injectées dans la sous-phase de PBS à l’aide d’une autre seringue Hamilton. Si l’antibiotique injecté est capable de s’insérer dans le film lipidique, il s’ensuit une augmentation de la pression de surface jusqu’à atteindre une valeur maximale correspondant à la pression de surface maximale (Pmax en mN/m). La variation de surface causée par l’insertion de l’antibiotique testé (deltaP en mN/m) est calculée en soustrayant Pi à Pmax (DeltaP = Pmax - Pi). L’affinité d’un antibiotique pour
le film lipidique est évaluée par mesure de la pression critique d’insertion (Pc). Pc correspond à la pression de surface initiale qui ne permet pas l’insertion de l’antibiotique. Ainsi, plus la valeur de Pc est élevée et plus l’antibiotique peut s’insérer dans le film lipidique. Pc est déterminée graphiquement en mesurant la DeltaP causée par l’insertion de l’antibiotique à différentes valeurs de Pi (approximativement 10, 15, 20, 25 et 30 mN/m). Après avoir rapporté les points obtenus dans un graphique de type DeltaP (portée sur l’axe des Y) en fonction de Pi (portée sur l’axe des X), Pc est déterminé à partir de l’équation de la droite obtenue quand Y (DeltaP) = 0. Dans certaines expériences, pour mimer la situation physiologique, la DeltaP causée par l’insertion de l’antibiotique dans le film lipidique est mesurée pour une pression de surface Pi fixée à 30 +/- 0.5 mN/m, la pression de la membrane lipidique d’une bactérie entière étant théoriquement de cet ordre (Oyama et al., Nature Biofilms and Microbiomes, 2017, 3, 33).
Le mécanisme d’action des destruxines A et B sur Clostridium perfringens (ATCC 13124) a aussi été étudié par microscopie comme précédemment expliqué (Nonejuie et al., PNAS October 1 , 2013 1 10 (40) 16169-16174). Une suspension bactérienne de Clostridium perfringens (ATCC 13124) a été diluée au 1/100 et cultivée à 37°C en condition anaérobie jusqu’à atteindre une densité optique à 600 nm de 0.2. Les bactéries ont ensuite été traitées pendant 2h avec les destruxines A ou B ou avec divers antibiotiques conventionnels dont on connaît la cible moléculaire. La dose d’antibiotique utilisée correspond à 5 fois leur CMI. Après 2h d’incubation, la membrane bactérienne a été marquée 10 min dans la glace à l’aide de la molécule fluorescente rouge FM4-64FX (de ThermoFisher, utilisée à 12 pg/ml) et l’ADN bactérien avec la molécule fluorescente bleu DAPI (de Sigma Aldrich, utilisée à 2 pg/ml). Les bactéries ont ensuite été centrifugées à 7 500 rpm pendant 30 sec et lavées avec de PBS. Les bactéries sont ensuite fixées à l’aide d’une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min dans la glace avant d’être une nouvelle fois centrifugées et lavées avec du PBS. Finalement, les bactéries sont reprises dans du liquide de montage Vectashield (Vector Laboratories) et déposées entre lame et lamelle avant observation au microscope confocal à l’aide des filtres spécifiques à FM4-64FX et au DAPI (Olympus, Rungis, France).
Résultats :
L’effet perméabilisant sur Clostridium perfringens (ATCC 13124) des destruxines A et B a été évalué à l’aide de l’iodure de propidium et est illustré dans la Figure 2. Alors que la nisine et l’enniantine A1 causent une perméabilisation de l’ordre de 50-60 % de
Clostridium perfringens (ATCC 13124), les destruxines sont sans effet, ne causant aucune perméabilisation.
La technique des monocouches lipidiques a ensuite été utilisée pour confirmer l’absence d’insertion des destruxines A et B dans la membrane de Clostridium perfringens (Figures 3 et 4). La détermination de la pression critique d’insertion (Pc) (Figure 3 et Tableau 12) montre que les destruxines A et B s’insèrent très faiblement dans une monocouche lipidiques formée à partir de lipides totaux extraits de Clostridium perfringens (ATCC 13124) avec une valeur de Pc 26.9 et 27.1 mN/m pour la destruxine A et la destruxine B. Ceci signifie que les destruxines A et B ne peuvent pas s’insérer dans la membrane de Clostridium perfringens dont la pression de surface théorique est de 30 mN/m, comme montré dans la Figure 4 et en accord avec les données de perméabilisation (Figure 2). A l’inverse, l’enniatine A1 , la nisine et le CTAB présentent tous les trois des Pc supérieures à 30 mN/m (40.1 , 36.9 et 46.8 mN/m, respectivement) indiquant qu’ils peuvent donc s’insérer dans une monocouche lipidique formée de lipides de Clostridium perfringens à la pression initiale de 30 mN/m (Figure 4), en accord avec leur capacité à perméabiliser la bactérie (Figure 2).
Tableau 12 : Détermination de la pression critique d’insertion des destruxines A et B, de l’enniatine A1 , de la nisine et du CTAB.
Les pressions critiques d’insertion (Pc) des différentes molécules injectées à 5 fois leur CMI ont été déterminées à partir de la Figure 3.
[Table 13]
Les résultats de l’étude du mécanisme d’action des destruxines A et B sur Clostridium perfringens (ATCC 13124) sont portés dans la Figure 5. La microscopie montre que les destruxines agissent comme le chloramphénicol en provoquant une hypercondensation de l’ADN bactérien. Ceci suggère que, comme le chloramphénicol, les destruxines agissent en inhibant la synthèse protéique, un mécanisme d’action original pour un PAM.
En conclusion :
Ayant montré l’activité sélective des destruxines A et B sur Clostrium perfringens, les raisons de cette sélectivité ont été investiguées. Classiquement, les peptides
antimicrobiens (PAM) sont peu ou pas sélectifs, agissant soit sur toutes les bactéries Gram+ et Gram-, soit que sur les bactéries Gram-i- ou Gram-, soit sur un ensemble de bactéries proches phylogénétiquement. Les destruxines A et B sont donc très originaux puisqu’ils n’agissent que sur Clostrium perfringens (souches cliniques et ATCC) sans agir sur des bactéries proches phylogénétiquement comme les autres souches de Clostridium testés dans les Tableaux 3 et 4. La sélectivité des destruxines A et B contre Clostrium perfringens provient de leur mécanisme d’action original.
Ainsi, alors que la majorité des PAM déjà connus agissent en perméabilisant la membrane des bactéries, les destruxines A et B ne perméabilisent pas la membrane bactérienne de Clostridium perfringens (Figure 2). De même, alors que la majorité des PAM sont capables de s’insérer dans les lipides bactériens (activité suivie par la technique des monocouches lipidiques), les destruxines A et B ne pénètrent pas un film de lipides bactériens (Figures 3 et 4).
Des tests par microscopie ont permis de déterminer le mécanisme d’action de ces molécules expliquant leur action spécifique contre les bactéries du genre Clostrium perfringens (Figure 5). L’existence d’une cible spécifique restant à identifier et présente uniquement dans Clostrium perfringens explique certainement la sélectivité des destruxines A et B contre Clostrium perfringens. De manière importante, l’absence de perméabilisation membranaire et d’insertion dans les lipides des destruxines A et B les distinguent des autres peptides cycliques fongiques à action antibactérienne testés tel que l’enniatine A1 qui est capable de s’insérer dans les lipides et de perméabiliser la membrane bactérienne (Figures 2, 3 et 4). Cette différence de mécanisme d’action entre les destruxines A et B et l’enniatine A1 explique la différence de sélectivité de ces molécules, une action de type perméabilisation membranaire n’étant pas ou peu sélective comme le montre l’action non sélective de l’enniatine A1 qui est active contre Clostridium perfringens mais aussi contre d’autres bactéries Gram-i- et contre Candida albicans comme illustrée dans le Tableau 6.
IV- Exemple 4 : Evaluation de l’activité antibactérienne et de l’innocuité de surnageant (sécrétomes) de champignons producteurs de destruxines.
Matériels et Méthodes :
Afin de tester les effets antimicrobiens d’extrait de champignons producteurs de destruxines, la moisissure Beauve a felina (DSM 4678) a été utilisée. Les sécrétomes de cette moisissure ont été obtenu après inoculation de milieu de culture dextrosé à la pomme de terre ou Potato Dextrose (PD) par le champignon et culture à 25°C pendant 2 semaines sous agitation (200 rpm). Les sécrétomes obtenus ont été centrifugés à 3000 rpm pendant 5 min puis stérilisés par filtration sur filtre de 0.2 pm. Les sécrétomes stériles ont ensuite été utilisés pour réaliser des tests antimicrobiens comme détaillé dans l’exemple 1 par dilution au 1 / 2 à partir des sécrétomes purs. Résultats :
L’activité antimicrobienne des sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) a été évaluée sur certaines souches bactériennes Gram+ et Gram- comme illustrées dans le Tableau 13.
Tableau 13 : Détermination de l’activité antimicrobienne du sécrétome obtenu à partir de la moisissure Beauveria felina (DSM 4678).
L’activité antimicrobienne des sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) a été testée sur divers souches Gram-i- et Gram- par dilution en cascade. L’activité est exprimée en pourcentage de sécrétome dilué présentant une activité.
[Table 13]
Les données du Tableau 13 montrent que les sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) sont bien actifs contre Clostridium perfringens (ATCC 13124) mais également contre d’autres souches Gram-i- pathogènes tel que Bacillus cereus (DSM 31 ) et
Staphylococcus aureus (ATCC 6538P). Ceci suggère que les sécrétomes contiennent d’autres molécules, en plus des destruxines A et B, qui sont actives contre les bactéries Gram+. Même si la perte de sélectivité contre Clostridium perfringens est préjudiciable, le fait que les sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) soient actifs contre divers pathogènes Gram+ infectant les animaux et les humains est un point positif. L’utilisation de fractions plus purifiées du sécrétome, enrichies en destruxines, devrait permettre de retrouver la sélectivité contre Clostridium perfringens.
BILAN
Les résultats ci-dessus démontrent donc une activité ultra sélective des destruxines A et B à l’encontre des bactéries du genre Clostrium perfringens responsable d’infections intestinales chez l’Homme et l’animal d’élevage dont le porc et les volailles. Du fait de l’absence de toxicité des destruxines A et B aux doses antibactériennes, l’utilisation des destruxines A et B est envisageable dans le traitement des infections humaines par Clostridium perfringens mais également dans le traitement de l’infection intestinale par Clostridium perfringens des animaux d’élevage, dont le porc et les volailles. Le fait que les sécrétomes de Beauveria felina (DSM 4678) soient actifs contre Clostridium perfringens permet de proposer également d’utiliser des extraits plus ou moins purifiés de ce champignon ou d’autres champignons producteurs de destruxines (tel que Metarrhizium, Beauveria, Ophiocordyceps, Alternaria et Aschersoni et notamment les genres Metarrhizium anisopliae, Metarhizium brunneum, Beauveria felina, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassicae, Alternaria linicola, Aschersonis sp, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassice et Aschersonis sp) afin de prévenir l’infection des animaux d’élevage (dont le porc et les volailles) par Clostridium perfringens.
Claims
1. Composition comprenant au moins une destruxine pour traiter et/ou prévenir les infections par Clostridium perfringens.
2. Composition selon la revendication 1 telle que la destruxine est choisie parmi les destruxines des séries A, B, C, D, E, F ou G de champignon, ou leurs dérivés.
3. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes telle que la destruxine répond à la formule (I) :
Dans laquelle
1R représente un atome d’hydrogène, un groupe C1 -C6 alkyle ou un groupe aralkyle ;
2R, 3R, 4R identiques ou différents représentent indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupe C1 -C6 alkyle ;
5R représente un groupe choisi parmi les groupes C2-C6 alkènyle et C1 -C6 alkyle éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi les atomes d’halogène, les groupes hydroxy (OH), carboxy (COOH), -glycosylé, et les groupes hétérocycliques de 3 à 6 membres comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S.
4. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes telle qu’elle comprend un champignon produisant une destruxine, ou un extrait de celui-ci, tel qu’un broyât ou surnageant de culture de celui-ci.
5. Composition selon la revendication 4 telle que ledit champignon est choisi parmi les genres Metarrhizium anisopliae, Metarhizium brunneum, Beauveria felina, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassice,
Alternaria linicola, Aschersonis sp, Ophiocordyceps coccidiicola, Alternaria brassice et Aschersonis sp
ou un extrait de ceux-ci, et/ou le surnageant de culture de ceux-ci.
6. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes telle qu’il s’agit d’un complément alimentaire pour les animaux d’élevage dont le porc et les volailles.
7. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 telle qu’il s’agit d’une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire à visée antibiotique comprenant en outre un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
8. Une destruxine ou un champignon produisant une destruxine, ou un extrait de celui-ci, tels que définis selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 pour son utilisation en thérapeutique humaine ou vétérinaire pour le traitement des infections bactériennes par une infection par la souche Clostridium perfringens.
9. La destruxine ou un champignon produisant une destruxine, ou un extrait de celui-ci, pour son utilisation selon la revendication 8 telle que la destruxine est définie selon l’une quelconque des revendications 1 ou 5.
10. La destruxine ou un champignon produisant une destruxine, ou un extrait de celui-ci, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 9 telle que l’infection est une infection intestinale telle que l’entérite nécrotique.
11. Utilisation d’une destruxine ou un champignon produisant une destruxine, ou un extrait de celui-ci tels que définis selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, à titre d’additif alimentaire pour les animaux d’élevage tels que le porc et les volailles, pour le traitement et/ou la prévention des infections bactériennes par une infection par la souche Clostridium perfringens.
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