EP3918328A1 - Method for measuring the modulation of the activation of a g protein-coupled receptor with gtp analogues - Google Patents

Method for measuring the modulation of the activation of a g protein-coupled receptor with gtp analogues

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Publication number
EP3918328A1
EP3918328A1 EP20708542.4A EP20708542A EP3918328A1 EP 3918328 A1 EP3918328 A1 EP 3918328A1 EP 20708542 A EP20708542 A EP 20708542A EP 3918328 A1 EP3918328 A1 EP 3918328A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
gtp
antibody
galpha
hydrolyzable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20708542.4A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Thomas ROUX
Eric Trinquet
Elodie DUPUIS
Sara BDIOUI
Jean-Philippe Pin
Philippe RONDARD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Cisbio Bioassays SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Cisbio Bioassays SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Cisbio Bioassays SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3918328A1 publication Critical patent/EP3918328A1/en
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4719—G-proteins
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the invention relates to a new method for measuring the modulation of the activation of a receptor coupled to a G protein (RCPG or GPCR in English), for example a method for determining the capacity of a molecule to modulate the activation of a GPCR.
  • the method according to the invention makes it possible in particular to detect the appearance or disappearance of a solid G protein bound to a GTP analogue in a preparation of RCPG.
  • Receptors coupled to G proteins are a family of membrane receptors in mammals and throughout the animal kingdom. G proteins are heterotrimeric proteins (3 subunits: alpha, beta and gamma) which are activated by RCPGs. Through GPCRs, G proteins play a role in transducing a signal from outside the cell to inside the cell (i.e. cellular response to an external stimulus). Their commonly described mechanism of action is presented in Figure 1 and summarized below:
  • the alpha subunit of the G protein is linked to the nucleotide GDP (full G protein linked to GDP);
  • G protein initiates a process of activation of the G protein consisting of two steps: 1) the release of GDP from the G protein to give an empty G protein, and the formation of an inactive GPCR / protein-G-empty complex , and 2) the binding of GTP which leads to the formation of an active G protein, in the form of GTP (full G protein bound to GTP).
  • the G protein bound to the receptor is in a form called “empty form”. This state is described in the literature as being transient since it is described that the GTP nucleotide binds rapidly to the alpha subunit of the G protein.
  • the beta / gamma subunits of the activated G protein dissociate from the alpha subunit; [0005]
  • the alpha subunit of the full G protein bound to GTP then binds to the effectors in order to activate them.
  • the effectors in turn activate signaling pathways leading to a cellular response;
  • the GTP is then hydrolyzed to GDP by the alpha subunit of the G protein and the alpha subunit reassociates with the beta / gamma subunits to reform the full G protein bound to GDP (inactive state).
  • RET Resonance Energy Transfer
  • FRET fluorescent Resonance Energy Transfer
  • BRET acronym for “Bioluminescence Resonance Energy Transfer
  • the acceptor is linked to RCPG, which is fused with a 6HIS tag, using an anti 6HIS antibody (WO 2004/035614).
  • the present invention aims to provide a new method for the in vitro screening of molecules capable of modulating RCPGs.
  • This new method is in particular based on the ability to discriminate (i) a form of full Galpha protein linked to a non-hydrolysable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a member of a pair of RET partners and an empty form of G protein or (ii) a solid Galpha protein form linked to a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a member of a RET partner pair and a full Galpha protein form linked to GDP.
  • the present invention has the advantages of 1) using a
  • the invention relates to a method for determining the ability of a molecule to modulate the activation of a receptor coupled to a G protein (GPCR), said method comprising the following steps:
  • ligand of the alpha subunit of a G protein (Galpha protein) labeled with a second member of the pair of RET partners said ligand being capable of binding to the full Galpha protein bound to the non-hydrolyzable GTP or slowly hydrolyzable marked by the first member of a couple of partners of RET,
  • step c) introduction (i) into a second container, of the same reagents as in step a) and of the molecule to be tested or (ii) into the first container, of the molecule to be tested;
  • step c) measuring the RET signal emitted in the second container or in the first container obtained in step c);
  • Figure 1 shows the mechanism of action for activating a GPCR
  • Figures 2A to 2D illustrate 4 test formats according to the invention.
  • FIGS. 3A and 3B illustrate an activation test according to the 1 A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 4A and 4B illustrate an activation test according to the 1 A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 5A and 5B illustrate an activation test according to the 1 A format on Delta Opioid RCPG with the detection couple: GTPgO-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 6A and 6B illustrate an activation test according to the 1 A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 7A and 7B illustrate an activation test according to the 1 A format on Delta Opioid RCPG with the detection couple: GTPgN-C3 + DSV36S-d2.
  • FIG. 8 illustrates a binding test on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgN-octyl-C3 + DSV36S-d2.
  • FIG. 9 illustrates a link test according to the 1 A format on RCPG Delta
  • FIGS. 10A and 10B illustrate the effect of the concentration of membrane and of GTP-donor on an activation test according to the 1 A format on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S -d2.
  • FIGS. 11 A and 11 B illustrate an activation test according to the 1A format on RCPG Dopamine D2 with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 12A and 12B illustrate an activation test according to the 1 A format on RCPG Dopamine D2 with the detection pair: GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
  • FIG. 13A-13B Figures 13A and 13B illustrate an activation test according to format 1B on Delta Opioid RCPG with the detection couple: GTPgO-Linker- Cy5 (P) + DSV36S-Lumi4Tb.
  • FIGS. 14A and 14B illustrate an activation test according to the 1B format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgS-Linker-Cy5 (R) + DSV36S-Lumi4Tb.
  • FIGS. 15A and 15B illustrate an activation test according to the 1B format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-L18-Fluorescein + DSV36S-Lumi4Tb.
  • FIGS. 16A and 16B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 17A and 17B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 18A and 18B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV38S-d2.
  • FIGS. 19A and 19B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 20A and 20B illustrate an activation test according to the 2A format on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgO-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
  • Figures 21 A and 21 B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
  • Figures 22A, 22B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 23A and 23B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 24A and 24B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 25A and 25B illustrate an activation test according to the 2B format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-Cy5 + DSV36S-Lumi4Tb.
  • Figures 26A and 26B illustrate an activation test according to the 2B format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-AF488 +
  • FIGS. 27A and 27B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 + DSV36S-d2.
  • G protein denotes a heterotrimeric protein composed of three subunits called Galpha protein, Gbeta protein and Ggamma protein.
  • Galpha protein or “Galpha” denotes the alpha subunit of the G protein.
  • the Galpha protein has two domains, the GTPase domain, and the alpha helix domain.
  • Galphas known to activate adenylate cyclase to increase cAMP synthesis
  • Galphai known to inhibit adenylate cyclase
  • Galphaolf
  • the Galpha protein is chosen from the protein GalphaM, Galphai2, Galphai3, Galphaol, Galphao2, Galphaq, Galpha12,
  • Galpha15, Galpha16 and Galphagus preferably chosen from the protein GalphaM, Galphai2 and Galphai3.
  • full Galpha protein denotes a
  • Galpha protein bound to GTP or to non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP (labeled according to the invention or unlabeled) or to GDP. This is called “full G alpha protein linked to GTP”, “full G alpha protein linked to non-hydrolysable or slowly hydrolyzable GTP” or “full Galpha protein linked to GDP”.
  • the full Galpha protein (bound to GDP or to GTP) is represented in FIG. 1.
  • a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a first member of a pair of RET partners which is capable of binding to the Galpha protein, resulting in a full Galpha protein bound to non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners.
  • GDP denotes guanosine diphosphate
  • GTP denotes guanosine triphosphate
  • non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP denotes an analogue of GTP which is not hydrolyzed or little hydrolyzed to GDP. Mention may be made, for example, of GTPgammaS (CAS no. 37589-80-3), GppNHp (CAS no. 148892-91 -5) or GppCp (CAS no. 10470-57-2).
  • non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a member of a RET partner pair or "labeled non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP” or “labeled GTP analog” denote either a non-hydrolyzable or slowly GTP hydrolyzable labeled by a member of a donor RET partner pair ("GTP-donor"), ie a non-GTP hydrolyzable or slowly hydrolyzable labeled with a member of an acceptor RET partner pair ("GTP-acceptor").
  • empty Galpha protein denotes a
  • Galpha protein which is not bound to GTP or GDP or to GTP not
  • hydrolyzable or slowly hydrolyzable (modified according to the invention or unmodified), in particular a Galpha protein which is not bound to the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a partner couple member of RET.
  • the empty Galpha protein is described in the literature as a transient state between the solid form bound to GDP and the solid form bound to GTP or to non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP.
  • the empty Galpha protein is shown in Figure 1.
  • membrane preparation denotes a preparation comprising cell membranes or fragments of cell membranes or artificial systems mimicking cell membranes which carry (or which express on their surface) one or more RCPG and one or more Galpha protein (s).
  • membrane preparation encompasses whole cells, permeabilized whole cells, lysed cells, purified cell membranes and GPCR / Galpha Protein complexes purified and reconstituted in nanodisks (also called
  • Nanoscale phospholipid bilayers or mixtures of detergents which carry (or which express on their surface) one or more GPCRs and one or more Galpha protein (s).
  • antibody also called “immunoglobulin” denotes a heterotetramer consisting of two heavy chains of about 50-70 kDa each (called the H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each ( say L chains for Light), linked together by intra- and inter-chain disulfide bridges.
  • Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain, called VL for the light chain, VH for the heavy chain, and in the C-terminal position, of a constant region, consisting of a single domain called CL for the light chain and three or four domains called CH1, CH2, CH3, CH4, for the heavy chain.
  • Each variable domain generally comprises 4 "hinge regions” (called FR1, FR2, FR3, FR4) and 3 regions directly responsible for binding with the antigen, called “CDR” (called CDR1, CDR2, CDR3).
  • an "antibody” according to the invention may be of mammalian origin (eg human or mouse or camelid), humanized, chimeric, recombinant. It is preferably a monoclonal antibody produced recombinantly by cells genetically modified according to techniques widely known to those skilled in the art.
  • the antibody can be of any isotype, for example IgG, IgM, IgA, IgD or IgE, preferably IgG.
  • chimeric antibody is meant an antibody whose sequences of the variable regions of the light chains and of the heavy chains belong to a different species from that of the sequences of constant regions of the light chains and of the heavy chains.
  • the sequences of the variable regions of the heavy and light chains are preferably of murine origin, while the sequences of the constant regions of the heavy and light chains belong to a non-murine species.
  • all species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular man, monkey, suidae, bovidae, equidae, felidae, canidae or even birds, this list not being exhaustive.
  • the chimeric antibodies according to the invention contain sequences of constant regions of heavy and light chains of human origin and sequences of variable regions of heavy and light chains of murine origin.
  • humanized antibody is meant an antibody of which all or part of the sequences of the regions involved in the recognition of the antigen (the hypervariable regions or CDR: Complementarity Determining Region) and sometimes certain amino acids of the FR regions (regions Framework) are of non-human origin while the sequences of constant regions and variable regions not involved in antigen recognition are of human origin.
  • human antibody is meant an antibody containing only human sequences, both for the variable and constant regions of the light chains and for the variable and constant regions of the heavy chains.
  • antibody fragment means any part of an immunoglobulin obtained by enzymatic digestion or obtained by bioproduction comprising at least one disulfide bridge and which is capable of binding to the antigen recognized by the whole antibody , for example Fv, Fab, Fab ', Fab'-SFI, F (ab') 2 , diabodies, linear antibodies (also called “Single Domain Antibodies” or sdAb, or nanobodies), antibodies with a single chain (e.g. scFv).
  • F (ab ') 2 Enzymatic digestion of immunoglobulins by pepsin generates an F (ab ') 2 fragment and an Fc fragment split into several peptides.
  • F (ab ') 2 is formed from two Fab' fragments linked by inter-chain disulfide bridges.
  • the Fab parts consist of the variable regions and the CH1 and CL domains.
  • the Fab 'fragment consists of the Fab region and a hinge region.
  • Fab'-SFI refers to an Fab 'fragment in which the cysteine residue of the hinge region carries a free thiol group.
  • affinity refers to the strength of the set of non-covalent interactions between a molecule, for example an antibody or an antibody fragment and the recognized antigen, for example an antigen such as the protein.
  • G alpha. Affinity is generally represented by the dissociation constant (Kd).
  • the dissociation constant (Kd) can be measured by well known methods, for example in FRET or in SPR.
  • identity or “homology” is calculated by comparing two sequences aligned in a comparison window.
  • the alignment of the sequences makes it possible to determine the number of positions (nucleotides or amino acids) in common for the two sequences in the comparison window.
  • the number of positions in common is therefore divided by the total number of positions in the comparison window and multiplied by 100 to obtain the percentage of identity.
  • the determination of the percent sequence identity can be done manually or by well known computer programs.
  • the identity or the homology corresponds to at least one substitution, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substitutions , of an amino acid residue, preferably at least one substitution of an amino acid residue carried out conservatively.
  • substitution of an amino acid residue carried out conservatively consists of replacing a amino acid residue by another amino acid residue, having a side chain having similar properties.
  • the families of amino acids possessing side chains with similar properties are well known, one can quote for example the basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), the acid side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid) , polar and uncharged side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg, glycine, cysteine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine ,
  • the basic side chains eg, lysine, arginine, histidine
  • the acid side chains eg, aspartic acid, glutamic acid
  • polar and uncharged side chains eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • nonpolar side chains eg
  • tryptophan beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • beta-branched side chains e.g., threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine.
  • antibodies with the same function therefore have certain amino acids which can be substituted by other amino acids at constant regions and / or variable regions, without losing the ability to bind to the antigen. It is preferable that this substitution is carried out within the DNA sequence which encodes the antibody or the antibody fragment, that is to say that the substitution is conservative in nature.
  • a person skilled in the art uses his general knowledge to determine the number of substitutions that can be made and their location in order to be able to retain the function of
  • the antibody or antibody fragment In order to determine the capacity of one or more antibody variants or antibody fragment to bind specifically to an antigen, several suitable methods, well known to those skilled in the art and described in the prior art, can be used.
  • the antibodies or the fragments of antibodies can therefore be tested by binding methods, such as for example the ELISA method, the affinity chromatography method, etc.
  • the antibody variants or antibody fragments can be generated, for example, by the “phage display” method making it possible to generate a phage library. A large number of methods are known in order to generate a “phage display” library and target the antibody variants or antibody fragments having the desired functional characteristics.
  • the antibody or the antibody fragment used in the context of the present invention binds to the G alphai, G alphao and / or G alphaz protein, for example it binds to the G alphail protein, to the G protein alphai2 and / or the G protein alphai3.
  • the alphail G protein of human origin carries the UniProt P63096-1 identifier for isoform 1 and the UniProt P63096-2 identifier for isoform 2.
  • the gene encoding the human G alphail protein is known as the name "GNAI1" (Gene ID: 2770, NCBI).
  • the term "molecule capable of modulating the activation of RCPG” denotes a molecule capable of activating or inhibiting a GPCR, and therefore of inducing transduction or of preventing transduction. a signal from outside the cell to the inside of the cell via the RCPG. It can be an agonist, an antagonist, a reverse agonist, a positive allosteric modulator, or a negative allosteric modulator.
  • test molecule is a molecule
  • molecule designates both the terms “molecule capable of modulating the activation of GPCR” and “molecule to be tested”.
  • RET Resonance Energy Transfer
  • FRET Fluorescence Reassay
  • the term “ligand” denotes a molecule capable of binding to a target molecule.
  • the target molecule is the full Galpha protein linked to the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners.
  • the ligand is not necessarily specific for the full Galpha protein bound to the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners.
  • the ligand used in the context of the invention may also be capable of binding to the Galpha protein linked to GDP, to the Galpha protein linked to GTP, to the Galpha protein linked to non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable non-GTP. labeled, or even empty Galpha protein.
  • the ligand may be of a protein nature (eg a protein or a peptide) or of a nucleotide nature (eg a DNA or an RNA).
  • the ligand is advantageously chosen from an antibody, an antibody fragment, a peptide or an aptamer, preferably an antibody or an antibody fragment.
  • the ligand can be labeled directly or indirectly according to methods well known to those skilled in the art, for example as described below, but preferably, the ligand is labeled directly. , by covalent bonding with a member of a pair of RET partners.
  • RET partners denotes a pair consisting of an energy donor compound (hereinafter “donor compound”) and an energy acceptor compound (hereinafter “acceptor compound”); when in proximity to each other and when excited at the excitation wavelength of the donor compound, these compounds emit a RET signal. It is known that for two compounds to be partners of RET, the emission spectrum of the donor compound must partially cover the excitation spectrum of the acceptor compound. For example, one speaks of “pairs of FRET partners” when a fluorescent donor compound and an acceptor compound are used, or of “pairs of BRET partners” when a bioluminescent donor compound and an acceptor compound are used.
  • RET signal denotes any measurable signal representative of a RET between a donor compound and an acceptor compound.
  • a FRET signal can therefore be a variation in the intensity or the luminescence lifetime of the donor fluorescent compound or of the acceptor compound when the latter is fluorescent.
  • container denotes a well of a plate, a test tube or any other container suitable for mixing a membrane preparation with the reagents necessary for the implementation of the method according to the invention.
  • the invention relates to a method for determining the capacity of a
  • GPCR G protein
  • ligand of the alpha subunit of a G protein (Galpha protein) labeled with a second member of the pair of RET partners said ligand being capable of binding to the full Galpha protein bound to the non-hydrolyzable GTP or slowly hydrolyzable labeled by the first member of a pair of RET partners,
  • step c) introduction (i) into a second container, of the same reagents as in step a) and of the molecule to be tested or (ii) into the first container, of the molecule to be tested;
  • step c) measuring the RET signal emitted in the second container or in the first container obtained in step c);
  • Step a) consists of introducing, into a first one containing the following three or four elements:
  • ligand of the alpha subunit of a G protein (Galpha protein) labeled by a second member of the pair of RET partners said ligand being capable of binding to the full Galpha protein bound to non-hydrolyzable GTP or slowly hydrolyzable marked by the first member of a pair of
  • the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is chosen from GTPgammaS (GTPyS or GTPgS), GppNHp and GppCp.
  • GTPgammaS to be labeled at a position other than the third phosphate (gamma phosphate).
  • the three or four elements can be introduced into the container sequentially in any order, or simultaneously or almost simultaneously.
  • the mixture of the 3 elements makes it possible to obtain a reaction solution suitable for the implementation of a RET.
  • Other elements can be added to the container in order to adapt the solution to the implementation of RET. For example, one can add coelenterazine h (benzyl-coelenterazine) or bisdeoxycoelenterazine
  • the ligand of the protein is a ligand of the protein
  • Galpha binds specifically to the SwitchII domain of the Galpha protein, in particular to the 215-294 peptide of the Galpha protein.
  • the Galpha protein is chosen from GalphaM, Galphai2 and Galphai3 and the ligand of the Galpha protein is a KB1753 peptide of sequence Ser-Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr-His-Gly-lle-Trp-Val-Gly -Glu-Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Arg (SEQ ID No: 1).
  • the Galpha protein is chosen from GalphaM, Galphai2 and Galphai3 and the ligand of the Galpha protein competes for binding to said Galpha protein with the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) .
  • the ability of the ligand to compete for binding to said Galpha protein with the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) can be tested by a competition method.
  • a “competition method” consists in testing a ligand of the Galpha protein for its ability to block the binding between the KB1753 peptide (SEQ ID No: 1) and the Galpha protein, or to enter into competition with the KB1753 peptide (SEQ ID No: 1) for binding to the Galpha protein.
  • a ligand of the Galpha protein which competes with the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) for binding to the Galpha protein binds to the same epitope as the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) or to an epitope which is sufficiently close to the epitope recognized by the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) to prevent binding of the ligand of the Galpha protein for reasons of steric hindrance.
  • Many types of competition methods can be used to determine whether a Galpha protein ligand competes with the KB1753 peptide (SEQ ID No: 1), for example by ELISA test.
  • the ELISA competition method involves the use of a purified Galpha protein bound to a solid surface or to cells, a ligand of the Galpha protein to be tested which binds to the Galpha protein and the KB1753 peptide. Mark.
  • the reference peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) is used at an unsaturated concentration (with respect to its dissociation constant Kd for the Galpha protein) and the signal is measured in the absence or in the presence of increasing concentrations of the ligand of the Galpha protein to be tested.
  • a ligand of the Galpha protein of interest When a ligand of the Galpha protein of interest is present in excess, it can block the specific binding of the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) to the Galpha protein by at least 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or 75% or more. In some cases the bond is blocked by at least 80-85%, 85-90%,
  • TR-FRET involves the use of a purified and tagged Galpha protein, an anti-Tag ligand (advantageously an antibody) labeled by the first member of the partner pair of TR-FRET (advantageously the donor) capable of binding to the tag of the Galpha protein, of the KB1753 peptide (SEQ ID NO: 1) labeled by the second member of the partner pair of TR-FRET (advantageously the acceptor by an indirect labeling method with a biotin on peptide and streptavidin-acceptor) and a ligand for the Galpha protein to be tested.
  • an anti-Tag ligand an antibody labeled by the first member of the partner pair of TR-FRET (advantageously the donor) capable of binding to the tag of the Galpha protein
  • SEQ ID NO: 1 labeled by the second member of the partner pair of TR-FRET (advantageously the acceptor by an indirect labeling method with a biotin on peptide and streptavidin-acceptor)
  • the KB1753 peptide (SEQ ID NO: 1) is used at an unsaturated concentration (compared to its finding of Kd dissociation for the Galpha protein) and the TR-FRET signal is measured in the absence or in the presence of increasing concentrations of the protein.
  • ligand of the Galpha protein to be tested.
  • it can block the specific binding of peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) to the Galpha protein by at least 40-45%, 45-50%, 50- 55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or 75% or more. In some cases, the binding is blocked by at least 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, or 97% or more.
  • the inhibition is orthosteric (i.e., the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) and the ligand of the Galpha protein bind to the same epitope of the Galpha protein). If the Kd evolves in a non-linear and saturable manner as the concentration of ligand of the Galpha protein increases, the inhibition is allosteric (that is, the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) and the ligand do not bind on the same epitope of the alpha G protein).
  • the ligand of the Galpha protein can be an antibody or a fragment
  • Galpha protein is an antibody or an antibody fragment capable of binding to the G alpha protein, which comprises:
  • variable domain of a heavy chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 3, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO : 4, and
  • variable domain of a light chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 5, a CDR2 of DTS amino acid sequence (either the three amino acids "Asp Thr Ser" or the three amino acids aspartic acid, threonine, serine), and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • Antibodies capable of binding to the alpha G protein may include:
  • an FR1 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 7,
  • an FR2 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 8,
  • an FR3 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 9, and / or
  • an FR4 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 10.
  • Antibodies capable of binding to the alpha G protein may include:
  • an FR1 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 11,
  • an FR2 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 12,
  • an FR3 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 13, and / or
  • an FR4 having at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 14.
  • variable domain of the heavy chain includes:
  • variable domain of the light chain includes:
  • variable domain of the heavy chain may exhibit at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 15, and the variable domain of the light chain may have at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.
  • the ligand of the Galpha protein can be an antibody or antibody fragment in which:
  • variable domain of the heavy chain has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95%
  • variable domain of the light chain has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95%
  • the CDR1 of the variable domain of the heavy chain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 2
  • the CDR2 of the variable domain of the heavy chain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3
  • the CDR3 of the heavy chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 4
  • the CDR1 of the light chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 5
  • the CDR2 of the variable domain of the light chain consists of the amino acid sequence DTS
  • CDR3 of the light chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 6.
  • the ligand of the Galpha protein is an antibody un
  • variable domain of the chain heavy consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15 (ie the variable domain of the heavy chain has 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 15) and the variable domain of the light chain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.
  • the antibody described in the examples under the reference DSV36S comprises a variable domain of the heavy chain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15 and a domain light chain variable which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.
  • antibody or antibody fragment capable of binding to the G alpha protein according to the third particular embodiment described above is called “antibody or reference antibody fragment” hereinafter in the fourth embodiment. particular achievement.
  • the ligand of the Galpha protein is an antibody or of an antibody fragment which competes for binding to the G alpha protein with the antibody or antibody fragment of reference, hereinafter “antibody or fragment of a competitor antibody”.
  • a “competition method” consists in testing an antibody (or an antibody fragment) for its capacity to block the binding between an antibody or reference antibody fragment and an antigen or to enter into competition with an antibody or fragment of an antibody. reference antibody for binding to the antigen.
  • an antibody which competes with the reference antibody or antibody fragment binds to the same epitope as the reference antibody or antibody fragment or to an epitope which is sufficiently close to the antibody. epitope recognized by the antibody or reference antibody fragment to prevent binding of the antibody or reference antibody fragment for reasons of steric hindrance.
  • competition methods can be used to determine whether an antibody or antibody fragment competes with a reference antibody or antibody fragment, for example: by competition ELISA test, by the direct or indirect sandwich method, by direct or indirect solid phase radioimmunoassay (RIA), by direct solid phase immunoenzymatic assay or indirect (EIA), etc.
  • competition ELISA test by the direct or indirect sandwich method, by direct or indirect solid phase radioimmunoassay (RIA), by direct solid phase immunoenzymatic assay or indirect (EIA), etc.
  • RIA solid phase radioimmunoassay
  • EIA direct solid phase immunoenzymatic assay or indirect
  • the competitive ELISA method involves the use of a purified antigen bound to a solid surface or to cells, the test antibody that binds to unlabeled antigen, and an antibody or antibody fragment from marked reference.
  • the antibody or antibody fragment of reference is present in an unsaturated concentration (with respect to its dissociation constant Kd for the Galpha protein) and the signal is measured at increasing concentrations of the antibody or of the fragment of. antibody to be tested.
  • an antibody can block or inhibit (e.g. reduce) the specific binding of a reference antibody or antibody fragment to an antigen by at least 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or 75% or more. In some cases, binding is inhibited by at least 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, or 97% or more.
  • the antibodies or fragments of competing antibodies used in the method according to the invention can, for example, be obtained with the antibody or fragment of the reference antibody by the implementation of the protocol described in Example 26.
  • the antibody described in the examples under the reference DSV38S (DSV antibody available from Cisbio Bioassays on request) is a competing antibody which can be used in the method according to the invention.
  • Competitor antibody fragments as defined above are jointly called “antibodies or antibody fragments used in the method according to the invention” below.
  • the antibody or the antibody fragment used in the method according to the invention can bind to the G alpha protein in an isolated form and / or present in a membrane environment, for example it can bind to a G alpha protein present in a preparation of membranes carrying one or more RCPGs and one or more G alpha proteins. It is not necessary for the alpha G protein to be complexed with the RCPG for the antibody according to the invention to be able to bind to the alpha G protein.
  • the antibody or the antibody fragment used in the method according to the invention can bind to the G alpha protein with a dissociation constant (Kd) measured in FRET less than or equal to 20 nM.
  • Kd dissociation constant
  • dissociation less than 20 nM is preferable for the proper implementation of a RET.
  • the antibody or the antibody fragment used in the method according to the invention can bind to the G alpha protein with a dissociation constant (Kd) measured in FRET less than or equal to 20 nM, for example a affinity constant less than or equal to 10 nM or even less than or equal to 5 nM, for example ranging from 0 to 20 nM (0 being excluded), ranging from 0 to 10 nM (0 being excluded), ranging from 0 to 5 nM (0 being excluded).
  • Kd dissociation constant
  • the antibody or the antibody fragment used in the method according to the invention is particularly advantageous in the implementation of the method according to the invention.
  • antibodies or antibody fragments used in the method according to the invention can be obtained by implementing the protocol described in Example 26.
  • antibodies used in the method according to the invention bind to the Switchll domain of the G alpha protein, and more particularly to the 215-294 peptide of the G alpha protein.
  • the first container may optionally contain a RCPG agonist.
  • GPCR agonists are widely described in the literature, for example in Table 1 of application WO2011 / 018586.
  • Step b) consists of measuring the RET signal emitted in the first
  • the signal measured corresponds to the signal obtained in the container in the absence of the molecule to be tested.
  • the measurement can be done by conventional methods widely known to those skilled in the art and do not pose any particular problem.
  • a device which can detect and measure the RET signal, like for example the PHERAstar FS microplate reader (BMG Labtech) with the reading mode TR-FRET or bioluminescence.
  • step c) consists of introducing into a second one containing the same reagents as in step a) and the molecule to be tested.
  • the second container is prepared in the same way as the first container, the only difference being the presence in the second container of the molecule to be tested.
  • This embodiment is advantageous because it allows the measurement of the RET signal emitted in the first container and in the second container to be carried out simultaneously. This embodiment also allows the simultaneous measurement of the RET signal emitted in one or more second containers. Thus, this embodiment is
  • step c) consists in introducing the molecule to be tested into the first containing the molecule.
  • This embodiment has the advantage of using only a single container for the implementation of the method according to the invention.
  • Step d) consists of measuring the RET signal emitted in the second
  • the signal measured corresponds to the signal obtained in the container in the presence of the molecule to be tested.
  • the measurement can be done by methods
  • a device which can detect and measure the RET signal, such as the PHERAstar FS microplate reader (BMG Labtech) with the reading mode TR-FRET or
  • Step e) consists in comparing the signals obtained in steps b) and d), a modulation of the signal obtained in step d) with respect to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is able to modulate the activation of the RCPG.
  • Signal modulation can be either an increase in the signal or a decrease in the signal.
  • a person skilled in the art can easily compare the signals of steps b) and d) and define a threshold allowing him to qualify the modulation, for example a difference between the signals greater than 5%, greater than 10%, greater than 15%, greater than 20% or greater than 25%.
  • the greater the difference between the signals the greater the ratio between the signals and the greater the modulation of the activation of the RCPG (eg activation or inhibition).
  • the difference between the signals is however likely to vary depending on the pair of RET partners used for the implementation of the method according to the invention.
  • the level of modulation of the activation of RCPG makes it possible to identify molecules that are more or less agonist, antagonist, inverse agonist positive allosteric modulator or negative allosteric modulator.
  • the first container does not
  • step e) does not contain a GPCR agonist and in step e) a decrease in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is a GPCR agonist.
  • test molecule is an antagonist or a negative allosteric modulator of GPCR
  • test molecule is an agonist or a positive allosteric modulator of GPCR.
  • the first container does not include a GPCR agonist and in step e) an increase in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is a GPCR agonist.
  • step e) includes a GPCR agonist and in step e): a decrease in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is an antagonist or a negative allosteric modulator of RCPG;
  • step d) an increase in the signal obtained in step d) relative to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is a positive agonist or allosteric modulator of GPCR.
  • the ligand can be labeled directly or indirectly.
  • the direct labeling of the ligand by a member of a pair of RET partners can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art, based on the presence of reactive groups on the ligand.
  • a member of a pair of RET partners for example a fluorescent compound when a FRET is used
  • reactive groups on the ligand for example, when the ligand is an antibody or an antibody fragment, the following reactive groups can be used: terminal amino group, groups
  • carboxylates of aspartic and glutamic acids amino groups of lysines, guanidine groups of arginines, thiol groups of cysteines, phenol groups of tyrosines, indole rings of tryptophanes, thioether groups of methionines, imidazole groups of histidines.
  • the reactive groups can form a covalent bond with a reactive group carried by the ligand.
  • the appropriate reactive groups, carried by the ligand are well known to those skilled in the art, for example a donor compound or an acceptor compound functionalized by a maleimide group will, for example, be capable of bonding covalently with the thiol groups carried by cysteines carried by a protein or a peptide, for example an antibody or an antibody fragment.
  • a donor / acceptor compound bearing an N-hydroxysuccinimide ester will be able to covalently attach to an amine present in a protein or peptide.
  • indirectly bioluminescent for example by introducing into the measurement medium an antibody or an antibody fragment, itself covalently linked to an acceptor / donor compound, this second antibody or antibody fragment specifically recognizing the ligand.
  • Another very conventional indirect labeling means consists in attaching biotin to the ligand to be labeled, then incubating this biotinylated ligand in the presence of streptavidin labeled with an acceptor / donor compound.
  • Suitable biotinylated ligands can be prepared by techniques well known to those skilled in the art; the company Cisbio Bioassays markets, for example, streptavidin labeled with a fluorophore, the trade name of which is “d2” (ref. 610SADLA).
  • the ligand is labeled with (i) a compound
  • the ligand is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP can be labeled directly or indirectly.
  • the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is directly labeled.
  • the direct labeling of non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP by a member of a pair of RET partners can be carried out by the methods based on the presence of reactive groups on non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP.
  • the reactive groups can form a covalent bond with a reactive group carried by a member of a pair of RET partners.
  • the appropriate reactive groups, carried by the member of a pair of RET partners, are well known to those skilled in the art, for example a donor compound or an acceptor compound functionalized by a maleimide group will for example be capable of binding covalently with thiol groups.
  • a donor / acceptor compound bearing an N-hydroxysuccinimide ester will be able to covalently attach to an amine.
  • hydrolyzable is labeled with (i) a fluorescent donor compound, or (ii) a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • a fluorescent donor compound or (ii) a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound quencher
  • the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is labeled with a donor fluorescent compound.
  • slowly hydrolyzable is labeled with a fluorescent donor compound and the Galpha protein ligand is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher) and ligand of the Galpha protein is labeled with a fluorescent donor or luminescent donor compound.
  • the ligand and the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP are each labeled with a member of a pair of FRET partners, that is to say a fluorescent donor compound or a fluorescent acceptor compound. of energy.
  • Fluorescent energy-donor compounds with a long lifespan (> 0.1 ms, preferably in the range from 0.5 to 6 ms), in particular lanthanide complexes, that is to say to say chelates, macrocycles or cryptates of rare earths are advantageous since they make it possible to carry out measurements in resolved time, that is to say to measure signals of TR-FRET (in English, "Time Resolved FRET ») By avoiding a large part of the background noise emitted by the measurement medium. They are for this reason and generally preferred for the implementation of the method according to the invention.
  • these compounds are complexes of
  • the complexes of europium (Eu3 +), terbium (Tb3 +), dysprosium (Dy3 +), samarium (Sm3 +), neodymium (Nd3 +), ytterbium (Yb3 +) or even erbium (Er3 +) are rare earth complexes also suitable for the purposes of the invention, the complexes of europium (Eu3 +) and terbium (Tb3 +) being particularly preferred.
  • rare earth chelates or cryptates suitable for the purposes of the invention are:
  • Lanthanide cryptates comprising one or more pyridine units.
  • Lanthanide cryptates are marketed by the company Cisbio Bioassays.
  • 316,909 describe chelates composed of a nonadentate ligand such as terpyridine.
  • Lanthanide chelates are marketed by the company Perkin Elmer.
  • 1,154,990 can also be used.
  • NCS reactive group
  • - Ruthenium chelates in particular the complexes consisting of a ruthenium ion and several bipyridines such as ruthenium (II) tris (2,2′-bipyridine).
  • the fluorescent donor compound is a FRET partner chosen from: a europium cryptate, a europium chelate, a terbium chelate, a terbium cryptate, a ruthenium chelate, a quantum dot, allophycocyanins , rhodamines, cyanines, squaraines,
  • the fluorescent donor compound is a FRET partner chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate; a ruthenium chelate; and a quantum dot; the chelates and cryptates of europium and terbium being particularly preferred.
  • fluorescent donor compound that may be used in the FRET method of the invention are represented by the general formulas (1) and (2a, 2b, 2c) below:
  • non-hydrolyzable GTPs or
  • X O, NH or CH 2 ;
  • Y 0, NH or CH 2 ;
  • L is a divalent linking group
  • Ln 3+ is a lanthanide complex optionally carrying a reactive group G 3 .
  • lanthanide complex is understood to mean a chelate, a macrocycle, a cryptate or any organic species capable of complexing an atom of the lanthanide family, the lanthanide (Ln) being chosen from: Eu, Sm, Tb, Gd , Dy, Nd, Er, preferably the lanthanide is Tb, Sm or Eu and even more preferably Eu or Tb.
  • Ln lanthanide
  • said alkylene, cycloalkylene or arylene groups optionally containing one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s), and said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted with 1 to 5, preferably 1 to 3, C 1 -C 8 alkyl, C 6 -C 14 aryl, sulfonate or oxo groups.
  • the divalent linking group L is chosen from the following groups:
  • n, m, p, q are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5 and e is an integer ranging from 1 to 6, preferably from 1 to 4.
  • the divalent linking group L is chosen from a direct link, a linear or branched C1-C6 alkylene group or a group of formula:
  • the divalent linking group L is preferably chosen from:
  • n and p are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5.
  • the reactive group G 3 is chosen from one of the following groups: a
  • acrylamide an optionally activated amine (eg cadaverine or ethylenediamine), activated ester, aldehyde, alkyl halide, anhydride, aniline, azide, aziridine, carboxylic acid, diazoalkane, haloacetamide , halotriazine, such as monochlorotriazine, dichlorotriazine, hydrazine (including hydrazides), imido ester, isocyanate, isothiocyanate, maleimide, sulfonyl halide, thiol, ketone, acid halide , a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a hydroxysulfosuccinimidyl ester, a
  • Ar is a 5 or 6 membered saturated or unsaturated heterocycle, comprising 1 to 3 heteroatoms, optionally substituted by a halogen atom.
  • the reactive group G3 is chosen from an amine
  • a succinimidyl ester (optionally protected as -NHBoc), a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, a halotriazine, an isothiocyanate, a maleimide group, or a carboxylic acid (optionally protected as a group - CC> 2Me, -CC> 2tBu).
  • the acid will have to be activated as an ester in order to react with a species nucleophile.
  • the lanthanide complex Ln3 + is advantageously chosen from one of the complexes below:
  • the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17, C24 to C32 and C36 to C44. More advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17 and C36 to C44. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C11 to C17. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C11. Very advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is the C2 complex or the C3 complex.
  • the GTP analog labeled with a fluorescent donor compound can be chosen from GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl- C2 (GTP-gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl- C1 1 (GTP-gamma-N-octyl-C1 1), GTPgN-octyl-C3 (GTP-gamma-N-octyl-C3), GTPgO-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPgO -hexyl-C3 (GTP-gamma-O-hexyl-C3) or GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-oct)
  • the fluorescent acceptor compounds can be chosen from the following group: allophycocyanins, in particular those known under the
  • luminescent organic molecules such as rhodamines, cyanines (for example Cy5),
  • fluorescent acceptor compounds are chosen from allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives,
  • the “Alexa” compounds are sold by the company Invitrogen; the “Atto” compounds are marketed by the company Attotec; the “DY” compounds are marketed by the company Dyomics; the “Cy” compounds are sold by the company Amersham Biosciences; the other compounds are marketed by various suppliers of chemical reagents, such as the companies Sigma, Aldrich or Acros.
  • the following fluorescent proteins can also be used as fluorescent acceptor compound: cyans fluorescent proteins (AmCyanl, Midori-lshi Cyan, mTFP1), green fluorescent proteins (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen ), the proteins
  • fluorescent yellow EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellowl, mBanana
  • fluorescent orange and red proteins Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRedTanger2 ,Red-Monomer, monomer mRFP1, JRed, mCherry, mStrawberry, FIcRedl, mRaspberry, FIcRed-Tandem, mPlim, AQ143
  • far red fluorescent proteins mKate, mKate2, tdKatushka2
  • fluorescent acceptor is a FRET partner chosen from:
  • GFP GFP variants chosen from GFP10, GFP2 and eGFP
  • YFP YFP variants chosen from eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus and YPet, mOrange, DsRed.
  • the fluorescent acceptor compound is a FRET partner chosen from: rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron derivatives -dipyrromethene and nitrobenzoxadiazole.
  • fluorescent acceptor compound likely to be used in the FRET method of the invention are represented by the general formulas (3) and (4a, 4b, 4c) below:
  • non-hydrolyzable GTPs or
  • GTPgO-Linker-Cy5 P
  • GTP-gO-hexyl-Cy5 diS03- Jena Bioscience - NU-834-CY5
  • GTPgS-Linker -Cy5 R
  • GTP-gS-EDA-Cy5 Jena Bioscience - NU- 1610-CY5
  • GTPgN-octyl-AF488 GTP-gN-octyl-AF488)
  • GTPgN-L18-Fluorescein GTP-gN-EDA-pentyl-Fluoresceine
  • GTPgN-octyl-CY5 GTP-gN-octyl-Cy5
  • the ligand is labeled with a member of a pair of BRET partners, that is to say a luminescent donor compound or a fluorescent energy acceptor compound.
  • the direct labeling of the ligand with a luminescent donor compound or a fluorescent acceptor compound of protein type, member of a pair of BRET partners can be carried out by the conventional methods known to those skilled in the art and in particular described in the article by Tarik Issad and Ralf Jockers (Bioluminescence Résonance Energy Transfer to Monitor Protein-Protein Interactions, Transmembrane Signaling Protocols pp 195-209, Part of the Methods in Molecular Biology TM book MIMB series, volume 332) to which those skilled in the art may refer.
  • hydrolyzable by a fluorescent acceptor compound of organic molecule type, member of a pair of BRET partners can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art, based on the presence of reactive groups on the ligand as mentioned above. above.
  • the reactive groups can form a covalent bond with a reactive group carried by a member of a BRET partner pair.
  • the appropriate reactive groups, carried by the member of a pair of BRET partners, are well known to those skilled in the art, for example an acceptor compound functionalized by a maleimide group will for example be capable of binding covalently with the thiol groups carried by the cysteines carried by a protein or a peptide, for example an antibody or an antibody fragment.
  • an acceptor compound bearing an N-hydroxysuccinimide ester will be able to covalently bind to an amine present in a protein or peptide.
  • BRET is within the reach of those skilled in the art.
  • donor-acceptor pairs that can be used to study BRET phenomena are described in particular in the article by Dasiel O. Borroto-Escuela (BIOLUMINISCENCE
  • the luminescent donor compound is a BRET partner chosen from: Luciferase (read), Renilla Luciferase (Rluc), variants of Renilla Luciferase (Rluc8) and Firefly Luciferase.
  • the fluorescent acceptor compound is a BRET partner chosen from: allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazole, quantum dot, GFP, GFP variants (GFP10, GFP2, eGFP), YFP, YFP variants (eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus, YPet) , mOrange, DsRed.
  • BRET partner chosen from: allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazole, quantum dot, GFP, GFP variants (GFP
  • the membrane preparations of cells expressing the studied receptors and the Galphai protein were purchased from Perkin Elmer or
  • the DSV36S antibody comprises a heavy chain variable domain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 14 and a light chain variable domain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15. antibodies were labeled with compatible fluorescent probes for TR-FRET detection
  • the two antibodies DSV36S and DSV38S bind to the switch II domain of the Galphai protein.
  • PPHT PPHT
  • Naltrindole RCPG Delta Opioid antagonist
  • GTPgN-octyl-AF4878 were synthesized at Cisbio Bioassays.
  • GTPgO-Linker-Cy5 (P) and GTPgS-Linker-Cy5 (R) acceptor fluorophores were purchased from Jena Bioscience under the respective references NU-834-CY5 and NU-1610-CY5.
  • DSV36S-d2 antibody (10nM); DSV36S-Lumi4Tb antibody (0.5 or 1 nM);
  • DSV38S-d2 antibody (10nM).
  • Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogs labeled with fluorescent donor or acceptor probes were prepared 4X to aim for the final concentrations in the wells mentioned in the captions of each figure.
  • the non-specific signal (fluorescence background noise) was measured with wells containing an excess of GTPgS (100mM).
  • the HTRF signal was measured on the PHERAstar reader (BMG Labtech) with the following configuration:
  • HTRF Ratio Signal at 665nm or Signal at 520nm / Signal at 620nm * 10,000.
  • Figure 2A illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with a donor RET partner and an anti-G protein ligand labeled with an acceptor RET partner in which activation of RCPG with an agonist compound induces a decrease in the binding of the GTP-donor analog to the G protein and therefore a decrease in the RET signal (format 1A).
  • Figure 2B illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with an acceptor RET partner and an anti-G protein ligand labeled with a donor RET partner in which the activation of RCPG with an agonist compound induces a decrease in the binding of the GTP-acceptor analog to the G protein and therefore a decrease in the RET signal (1 B format).
  • Figure 2C illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with a donor RET partner and an anti-G protein ligand labeled with an acceptor RET partner in which the activation of RCPG with an agonist compound induces an increase the binding of the GTP-donor analog to the G protein and therefore an increase in the RET signal (2A format).
  • Figure 2D illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with an acceptor RET partner and an anti-G protein ligand labeled with a donor RET partner in which the activation of RCPG with an agonist compound induces an increase in the binding of the GTP-acceptor analog to the G protein and therefore a
  • DPR decrease in the TR-FRET signal between GTP-donor and
  • Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
  • Example 8 Effect of the membrane and donor GTP concentration on the activation test according to the 1 A format on Delta Opioid RCPG (DPR): decrease in the TR-FRET signal between donor GTP and Galphai antiprotein antibody -acceptor under agonist stimulation.
  • DPR Delta Opioid RCPG
  • TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the GTPgN-octyl-C2 analog is capable of binding to the Galphai protein and generating a TR-FRET signal with the anti Galphai DSV36S-d2 antibody (FIG. 10A).
  • the right panel shows an increase in signal amplitude (S / N) by increasing the concentration of GTPgN-octyl-C2 from 2 to 6nM.
  • D2S Dopamine D2S (D2S): decrease in the TR-FRET signal between GTP-donor and
  • Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CFIO-D2S membranes / well; Buffer: 50mM RisHCl pFI7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
  • DPR Delta Opioid GPCR
  • DPR Opioid
  • Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 500mM NaCl; 0.1% BSA.
  • DSV38S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM;
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM;
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM;
  • the increase in the TR-FRET signal (Ratio HTRF) generated by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor increases (i.e. the empty Galpha protein form decreases).
  • the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-donor to the G protein which then passes into the GTP-donor form and causes
  • FIG. 17B shows a second condition where the activation by a fixed concentration of RCPG agonist SNC162 (200nM) was inhibited by an increasing concentration of RCPG antagonist (Naltrindole). This activation inhibition is observed by the decrease in the TR-FRET signal (HTRF Ratio).
  • Dopamine D2S increase in the TR-FRET signal between GTP-donor and anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10 pg CHO-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 1 mM GDP; 0.1% BSA.
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10 pg CHO-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 100mM NaCl; 0.1% BSA.
  • DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10 pg CHO-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 100mM NaCl; 1 mM GDP; 0.1% BSA.
  • the increase in the TR-FRET signal (Ratio HTRF) generated by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor increases (i.e. the empty Galpha protein form decreases).
  • the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-donor to the G protein which then passes into the GTP-donor form and causes
  • DPR Delta Opioid RCPG
  • the increase in the TR-FRET signal (FITRF Ratio) generated by the stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-acceptor increases (ie that the empty Galpha protein form decreases).
  • the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-acceptor to the G protein which then passes into the GTP-acceptor form and causes
  • DPR Opioid
  • Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
  • the increase in the TR-FRET signal (Ratio HTRF) generated by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor increases (i.e. the empty Galpha protein form decreases).
  • the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-donor to the G protein which then passes into the GTP-donor form and causes
  • Example 26 Protocol for obtaining anti-G alphail protein antibodies used in the process according to the invention
  • TST-G alphail protein G alphail protein of UniProt P63096-1 sequence tagged at the N-terminal with the TwinStreptag (TST) (IBA) tag via a TEV linker
  • TST TwinStreptag
  • TST TwinStreptag
  • mice were immunized by injection of the TST-G protein
  • alphail diluted beforehand in buffer containing GTPgS (20mM HEPES pH8, 100mM NaCl, 3mM MgCl2, 11mM CHAPS, 100mM GTPgS). The first injection was followed by three boosters every month.
  • alphail previously diluted to 20pg / mL in buffer containing GTPgS (20mM Tris HCl pH8.5, 140mM NaCI, 2mM EDTA, 10mM MgCl2, 0.1% BSA, 1mM GTPgS) was adsorbed via the TwinStreptag tag on 96-well plates containing Strep-Tactin®XT (IBA, Catalog: 2-4101-001). For this, 100mI of protein were added to each well and then incubated for 2h at 37 ° C followed by three washes in 1X PBS buffer, 0.05% Tween20.
  • GTPgS 20mM Tris HCl pH8.5, 140mM NaCI, 2mM EDTA, 10mM MgCl2, 0.1% BSA, 1mM GTPgS
  • the anti tag antibodies bind to the tagged orthogonal protein and therefore not to the G alphail protein attached to the bottom of the wells; in which case no HRP signal or a decrease in HRP signal is detected.
  • mice with the best antibody titers and the least signal drop in the anti tag control case were selected for the next step of lymphocyte hybridization, also called fusion.
  • the spleen of the mice was recovered and a mixture of lymphocytes and plasmocysts from this spleen was fused in vitro with a myeloma cell line in the presence of a polyethylene glycol type cell fusion catalyst.
  • a mutant myeloma cell line lacking the HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) enzyme was used to allow selection of hybrid cells, called hybridomas.
  • hybridoma clones of interest were then injected into mice (intraperitoneal injection) to allow the production of antibodies in large quantities in the ascitic fluid.
  • the antibodies were then purified by affinity chromatography on columns with resins exhibiting protein A.
  • All the reagents are diluted in 50 mM TrisHCl buffer pH 7.4, 10 mM MgCl2, 0.1% BSA, 10 mM NaCl.
  • the Gai1 protein is prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 2.5nM.
  • the GTPgS nucleotide is prepared 2X to obtain a final concentration in the 10 mM wells.
  • These 2 reagents are prepared in the same solution and preincubated for 30 minutes at room temperature before being distributed into the wells.
  • the above purified antibodies are prepared 4X to aim for final concentrations in the wells of between 0.01 and 1 mM.
  • DSV36S-d2 antibody is prepared 4X to aim for a final concentration of 10nM.
  • the anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody is prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 0.5nM.
  • the antibodies according to the invention are capable of inhibiting the HTRF signal obtained with the DSV36S-d2 antibody. Conversely, the antibodies which are not according to the invention are not capable of inhibiting the signal generated by DSV36S-d2.

Abstract

The invention concerns a method for determining the ability of a molecule to modulate the activation of a G protein-coupled receptor (GPCR), the method comprising the following steps: a) introducing, into a first container: - a membrane preparation bearing one or more GPCR(s) and one or more Galpha protein(s), - a source of non-hydrolysable or slowly hydrolysable GTP labelled by a first member of a pair of RET partners, - a ligand of the alpha sub-unit of a G protein (Galpha protein) labelled by a second member of the pair of RET partners, the ligand being capable of binding with the full Galpha protein bound to the non-hydrolysable or slowly hydrolysable GTP labelled by the first member of a pair of RET partners, - optionally, a GPCR agonist; b) measuring the RET signal emitted in the first container; c) introducing, (i) into a second container, the same reagents as in step a) and the molecule to be tested or, (ii) into the first container, the molecule to be tested; d) measuring the RET signal emitted in the second container or in the first container obtained in step c); e) comparing the signals obtained in steps b) and d), a modulation in the signal obtained in step d) relative to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is capable of modulating the activation of the GPCR.

Description

Description Description
Titre de l'invention : Méthode pour mesurer la modulation de l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G avec des analogues du GTP Title of the invention: Method for measuring the modulation of the activation of a receptor coupled to a G protein with analogues of GTP
Domaine Technique Technical area
[0001] L’invention concerne un nouveau procédé pour mesurer la modulation de l’activation d’un récepteur couplé à une protéine G (RCPG ou GPCR en anglais), par exemple un procédé pour déterminer la capacité d’une molécule à moduler l’activation d’un RCPG. Le procédé selon l’invention permet notamment de détecter l’apparition ou la disparition d’une protéine G pleine liée à un analogue du GTP dans une préparation de RCPG. The invention relates to a new method for measuring the modulation of the activation of a receptor coupled to a G protein (RCPG or GPCR in English), for example a method for determining the capacity of a molecule to modulate the activation of a GPCR. The method according to the invention makes it possible in particular to detect the appearance or disappearance of a solid G protein bound to a GTP analogue in a preparation of RCPG.
Technique antérieure Prior art
[0002] Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont une famille de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal. Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, bêta et gamma) qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un rôle de transduction d’un signal de l’extérieur de la cellule vers l’intérieur de la cellule (i.e. réponse cellulaire à un stimulus externe). Leur mécanisme d’action communément décrit est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après : [0002] Receptors coupled to G proteins (RCPG or GPCR in English) are a family of membrane receptors in mammals and throughout the animal kingdom. G proteins are heterotrimeric proteins (3 subunits: alpha, beta and gamma) which are activated by RCPGs. Through GPCRs, G proteins play a role in transducing a signal from outside the cell to inside the cell (i.e. cellular response to an external stimulus). Their commonly described mechanism of action is presented in Figure 1 and summarized below:
[0003] - dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP) ; - in its inactive, resting state, the alpha subunit of the G protein is linked to the nucleotide GDP (full G protein linked to GDP);
[0004] - après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous unité alpha de la [0004] - After activation of the RCPG, the latter binds to the alpha subunit of the
protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes : 1 ) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée « forme vide ». Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu’il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous unités bêta/gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous unité alpha ; [0005] - la sous unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire ; G protein and initiates a process of activation of the G protein consisting of two steps: 1) the release of GDP from the G protein to give an empty G protein, and the formation of an inactive GPCR / protein-G-empty complex , and 2) the binding of GTP which leads to the formation of an active G protein, in the form of GTP (full G protein bound to GTP). In the first step, the G protein bound to the receptor is in a form called “empty form”. This state is described in the literature as being transient since it is described that the GTP nucleotide binds rapidly to the alpha subunit of the G protein. Furthermore, the beta / gamma subunits of the activated G protein dissociate from the alpha subunit; [0005] The alpha subunit of the full G protein bound to GTP then binds to the effectors in order to activate them. The effectors in turn activate signaling pathways leading to a cellular response;
[0006] - le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous unité alpha de la protéine G et la sous unité alpha se réassocie aux sous unité bêta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif). [0006] The GTP is then hydrolyzed to GDP by the alpha subunit of the G protein and the alpha subunit reassociates with the beta / gamma subunits to reform the full G protein bound to GDP (inactive state).
[0007] Il existe plusieurs sous types de protéines G alpha présentant des profils de sélectivité différents pour les différents effecteurs et induisant ainsi l’activation de voies de signalisation préférentielles. [0007] There are several subtypes of G alpha proteins with different selectivity profiles for the different effectors and thus inducing the activation of preferential signaling pathways.
[0008] Les RCPG sont associés à de nombreuses fonctions physiologiques [0008] GPCRs are associated with numerous physiological functions
importantes et sont considérés comme l'une des cibles thérapeutiques important and are considered one of the therapeutic targets
privilégiées pour un grand nombre de pathologies. Ainsi, de nombreux tests de criblage in vitro ont été développés pour identifier des molécules capables de moduler les RCPG. Les tests mis au point exploitent différents mécanismes d’activation des protéines G et mettent en œuvre des technologies variées (Zhang et al.; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372). preferred for a large number of pathologies. Thus, numerous in vitro screening tests have been developed to identify molecules capable of modulating RCPGs. The tests developed exploit different mechanisms of activation of G proteins and use various technologies (Zhang et al .; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372).
[0009] On peut citer notamment les tests d’affinité qui utilisent des ligands [0009] Mention may be made in particular of the affinity tests which use ligands
radiomarqués pour mesurer l’affinité du ligand au RCPG, les tests de radiolabeled to measure ligand affinity for RCPG, tests for
scintigraphie de proximité qui utilisent des billes de scintigraphie sur lesquelles des RCPG ont été fixés ou les tests fonctionnels utilisant du GTP faiblement ou non hydrolysable comme le GTPyS. Ces tests sont néanmoins difficiles à mettre en œuvre et nécessitent parfois des étapes de filtration sur membrane qui peut limiter leur utilisation comme tests de criblage à haut débit (HTS). proximity scintigraphy which use scintigraphy beads onto which GPCRs have been attached or functional tests using weakly or non-hydrolyzable GTP such as GTPyS. These tests are nonetheless difficult to perform and sometimes require membrane filtration steps which may limit their use as high throughput screening tests (HTS).
[0010] D’autres tests ont été développés pour mettre en évidence l’activation des RCPG. Ces tests se basent notamment sur les techniques de transfert d’énergie (RET - acronyme anglais de « Résonance Energy Transfer »), comme le FRET (acronyme anglais de « Fluorescence Résonance Energy Transfer ») (Clinical Chemistry, 1995, 41 , 1391 ) ou le BRET (acronyme anglais de « Bioluminescence Résonance Energy Transfer ») (Proceedings of the National Academy of [0010] Other tests have been developed to demonstrate the activation of GPCRs. These tests are based in particular on energy transfer techniques (RET - acronym for “Resonance Energy Transfer”), such as FRET (acronym for “Fluorescence Resonance Energy Transfer”) (Clinical Chemistry, 1995, 41, 1391). or BRET (acronym for "Bioluminescence Resonance Energy Transfer") (Proceedings of the National Academy of
Sciences, 1999, 96(1 ), 151 ). Ces deux techniques font appel à des notions de molécules capables de donner de l’énergie (on parle de donneurs) ou d’accepter de l’énergie (on parle d’accepteurs) (Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847). On peut citer par exemple les techniques de transfert d’énergie mettant en évidence l’interaction entre un RCPG et la protéine G en utilisant soit un donneur fusionné au RCPG et un accepteur fusionné à la protéine G (WO Sciences, 1999, 96 (1), 151). These two techniques use notions of molecules capable of giving energy (we speak of donors) or of accepting energy (we speak of acceptors) (Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847). Mention may be made, for example, of energy transfer techniques demonstrating the interaction between a RCPG and the G protein using either a donor fused to the RCPG and an acceptor fused to the G protein (WO
2006/086883 et WO 2003/008435) soit un accepteur fusionné à la sous-unité alpha de la protéine G et un donneur fusionné à la sous-unité bêta et / ou gamme de la protéine G (Bunemann et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 2003, 26, 16077- 16082). Ces techniques sont néanmoins contraignantes puisqu’elles nécessitent la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d’étudier les RCPG et les protéines G exprimés de façon endogène par les cellules (i.e. non modifiés et non sur-exprimés). D’autre part, afin de discriminer les différents sous types de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces 2006/086883 and WO 2003/008435) or an acceptor fused to the alpha subunit of the G protein and a donor fused to the beta subunit and / or range of the G protein (Bunemann et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 2003, 26, 16077-16082). These techniques are nevertheless restrictive since they require the preparation of fusion proteins and they do not make it possible to study the GPCRs and the G proteins expressed endogenously by the cells (i.e. unmodified and not over-expressed). On the other hand, in order to discriminate between the different subtypes of G alpha proteins that can be activated by the receptor, these
techniques nécessitent la préparation d’échantillons membranaires multiples (une préparation spécifique pour chaque sous type de protéine G alpha). techniques require the preparation of multiple membrane samples (a specific preparation for each G alpha protein subtype).
[0011] Les techniques de transfert d’énergie ont également été utilisées pour la mise au point de tests visant à visualiser la modulation de la forme GTP (active) de la protéine G ou de la forme GDP (inactive) de la protéine G. On peut tout d’abord citer par exemple l’utilisation d’un format avec la protéine G fusionnée à une étiquette biotine ainsi liée à un donneur lui-même couplé à une protéine streptavidine et un accepteur lié à un analogue GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (WO 2006/035208). D’autre part, un autre format utilise des peptides BioKey® biotinylé (KaroBio) discriminant la forme GTP de la forme GDP et qui sont liés à un donneur grâce à une protéine streptavidine couplée au donneur. L’accepteur est lié au RCPG, qui est fusionné avec une étiquette 6HIS, à l’aide d’un anticorps anti 6HIS (WO 2004/035614). Ces techniques sont également contraignantes puisqu’elles nécessitent aussi la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d’étudier les RCPG et les protéines G exprimés de façon endogène par les cellules. De même, afin de discriminer les différents sous type de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d’échantillons membranaires multiples. Energy transfer techniques have also been used for the development of tests aimed at visualizing the modulation of the GTP (active) form of the G protein or of the GDP (inactive) form of the G protein. We can first of all cite for example the use of a format with the G protein fused to a biotin tag thus linked to a donor itself coupled to a streptavidin protein and an acceptor linked to a non-hydrolyzable or slowly GTP analogue. hydrolyzable (WO 2006/035208). On the other hand, another format uses biotinylated BioKey® peptides (KaroBio) which discriminate the GTP form from the GDP form and which are linked to a donor thanks to a streptavidin protein coupled to the donor. The acceptor is linked to RCPG, which is fused with a 6HIS tag, using an anti 6HIS antibody (WO 2004/035614). These techniques are also restrictive since they also require the preparation of fusion proteins and they do not make it possible to study GPCRs and G proteins expressed endogenously by cells. Likewise, in order to discriminate between the different subtypes of G alpha proteins that can be activated by the receptor, these techniques require the preparation of multiple membrane samples.
[0012] Il existe donc un réel besoin de disposer d’une méthode sensible et fiable qui permet de déterminer facilement la modulation de l’activation d’un RCPG, par exemple pour déterminer facilement la capacité d’une molécule à moduler l’activation d’un RCPG, et / ou de déterminer quelle sous type de protéine G est activé par le RCPG. [0012] There is therefore a real need for a sensitive and reliable method which makes it possible to easily determine the modulation of the activation of a GPCR, for example to easily determine the capacity of a molecule to modulate. activating a GPCR, and / or determining which G protein subtype is activated by GPCR.
Résumé de l’invention Summary of the invention
[0013] La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode pour le criblage in vitro de molécules capables de moduler les RCPG. Cette nouvelle méthode est notamment basée sur la capacité à discriminer (i) une forme de protéine Galpha pleine liée à un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d’un couple de partenaires de RET et une forme vide de protéine G ou (ii) une forme de protéine Galpha pleine liée à un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d’un couple de partenaires de RET et une forme de protéine Galpha pleine liée au GDP. The present invention aims to provide a new method for the in vitro screening of molecules capable of modulating RCPGs. This new method is in particular based on the ability to discriminate (i) a form of full Galpha protein linked to a non-hydrolysable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a member of a pair of RET partners and an empty form of G protein or (ii) a solid Galpha protein form linked to a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a member of a RET partner pair and a full Galpha protein form linked to GDP.
[0014] En particulier la présente invention a comme avantages 1 ) d’utiliser une [0014] In particular, the present invention has the advantages of 1) using a
méthode de détection à base de fluorescence donc non radioactive ; 2) de ne nécessiter aucune étape de lavage et ainsi de simplifier sa mise en œuvre notamment pour des activités de criblage de composés à haut débit ; 3) de permettre de travailler notamment sur des protéines G et RCPG non modifiés ; 4) de permettre la discrimination de différents sous-types de protéines Galpha activées par le RCPG dans une même préparation membranaire comportant ces différents sous types (la discrimination étant apportée par l’utilisation de ligands de détection discriminant les sous-types de protéines Galpha). detection method based on fluorescence and therefore non-radioactive; 2) not to require any washing step and thus to simplify its implementation, in particular for high-throughput compound screening activities; 3) to make it possible to work in particular on unmodified G and RCPG proteins; 4) to allow the discrimination of different subtypes of Galpha proteins activated by GPCR in the same membrane preparation comprising these different subtypes (the discrimination being brought about by the use of detection ligands discriminating the subtypes of Galpha proteins) .
[0015] Selon un premier aspect, l’invention concerne une méthode pour déterminer la capacité d’une molécule à moduler l’activation d’un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : [0015] According to a first aspect, the invention relates to a method for determining the ability of a molecule to modulate the activation of a receptor coupled to a G protein (GPCR), said method comprising the following steps:
a) introduction, dans un premier contenant : a) introduction, in a first container:
- d’une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - a membrane preparation carrying one or more GPCRs and one or more Galpha protein (s),
- d’une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET, - a source of non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners,
- d’un ligand de la sous-unité alpha d’une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d’un couple de partenaires de RET, - a ligand of the alpha subunit of a G protein (Galpha protein) labeled with a second member of the pair of RET partners, said ligand being capable of binding to the full Galpha protein bound to the non-hydrolyzable GTP or slowly hydrolyzable marked by the first member of a couple of partners of RET,
- éventuellement d’un agoniste du RCPG ; - possibly a GPCR agonist;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ; b) measurement of the RET signal emitted in the first container;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu’à l’étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à tester ; c) introduction (i) into a second container, of the same reagents as in step a) and of the molecule to be tested or (ii) into the first container, of the molecule to be tested;
d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l’étape c) ; d) measuring the RET signal emitted in the second container or in the first container obtained in step c);
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l’activation du RCPG. e) comparison of the signals obtained in steps b) and d), modulation of the signal obtained in step d) with respect to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is capable of modulating the activation of the RCPG.
Brève description des figures Brief description of the figures
[0016] La figure 1 représente le mécanisme d’action d’activation d’un RCPG et de la [0016] Figure 1 shows the mechanism of action for activating a GPCR and the
protéine G. G.
[0017] Les figures 2A à 2D illustrent 4 formats d’essai selon l’invention. [0017] Figures 2A to 2D illustrate 4 test formats according to the invention.
[0018] Les figures 3A et 3B illustrent un test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2. [0018] FIGS. 3A and 3B illustrate an activation test according to the 1 A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0019] Les figures 4A et 4B illustrent un test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S- d2. [0019] FIGS. 4A and 4B illustrate an activation test according to the 1 A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0020] Les figures 5A et 5B illustrent un test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgO-hexyl-C2 + DSV36S- d2. [0020] FIGS. 5A and 5B illustrate an activation test according to the 1 A format on Delta Opioid RCPG with the detection couple: GTPgO-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
[0021] Les figures 6A et 6B illustrent un test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C2 + DSV36S-d2. [0021] FIGS. 6A and 6B illustrate an activation test according to the 1 A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
[0022] Les figures 7A et 7B illustrent un test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C3 + DSV36S-d2. [0022] FIGS. 7A and 7B illustrate an activation test according to the 1 A format on Delta Opioid RCPG with the detection couple: GTPgN-C3 + DSV36S-d2.
[0023] La figure 8 illustre un test de liaison sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C3 + DSV36S-d2. FIG. 8 illustrates a binding test on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgN-octyl-C3 + DSV36S-d2.
[0024] La figure 9 illustre un test de liaison selon le format 1 A sur RCPG Delta [0024] FIG. 9 illustrates a link test according to the 1 A format on RCPG Delta
Opioïde avec le couple de détection : GTPgO-hexyl-C3 + DSV36S-d2. [0025] Les figures 10A et 10B illustrent l’effet de la concentration en membrane et en GTP-donneur sur un test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2. Opioid with the detection couple: GTPgO-hexyl-C3 + DSV36S-d2. FIGS. 10A and 10B illustrate the effect of the concentration of membrane and of GTP-donor on an activation test according to the 1 A format on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S -d2.
[0026] Les figures 11 A et 11 B illustrent un test d’activation selon le format 1A sur RCPG Dopamine D2 avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S- d2. [0026] FIGS. 11 A and 11 B illustrate an activation test according to the 1A format on RCPG Dopamine D2 with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0027] Les figures 12A et 12B illustrent un test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Dopamine D2 avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S- d2. [0027] FIGS. 12A and 12B illustrate an activation test according to the 1 A format on RCPG Dopamine D2 with the detection pair: GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0028] [Fig. 13A-13B] Les figures 13A et 13B illustrent un test d’activation selon le format 1 B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgO-Linker- Cy5(P) + DSV36S-Lumi4Tb. [0028] [Fig. 13A-13B] Figures 13A and 13B illustrate an activation test according to format 1B on Delta Opioid RCPG with the detection couple: GTPgO-Linker- Cy5 (P) + DSV36S-Lumi4Tb.
[0029] Les figures 14A et 14B illustrent un test d’activation selon le format 1 B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgS-Linker-Cy5(R) + DSV36S-Lumi4Tb. [0029] FIGS. 14A and 14B illustrate an activation test according to the 1B format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgS-Linker-Cy5 (R) + DSV36S-Lumi4Tb.
[0030] Les figures 15A et 15B illustrent un test d’activation selon le format 1 B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-L18-Fluorescein + DSV36S-Lumi4Tb. [0030] FIGS. 15A and 15B illustrate an activation test according to the 1B format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-L18-Fluorescein + DSV36S-Lumi4Tb.
[0031] Les figures 16A et 16B, illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S- d2. [0031] FIGS. 16A and 16B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0032] Les figures 17A et 17B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S- d2. [0032] FIGS. 17A and 17B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0033] Les figures 18A et 18B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV38S- d2. [0033] FIGS. 18A and 18B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV38S-d2.
[0034] Les figures 19A et 19B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C11 + DSV36S- d2. [0034] FIGS. 19A and 19B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-C11 + DSV36S-d2.
[0035] Les figures 20A et 20B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgO-hexyl-C2 + DSV36S- d2. [0036] Les figures 21 A et 21 B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C2 + DSV36S-d2. FIGS. 20A and 20B illustrate an activation test according to the 2A format on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgO-hexyl-C2 + DSV36S-d2. Figures 21 A and 21 B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
[0037] Les figures 22A, 22B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S- d2. [0037] Figures 22A, 22B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0038] Les figures 23A et 23B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S- d2. [0038] FIGS. 23A and 23B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0039] Les figures 24A et 24B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S- d2. [0039] FIGS. 24A and 24B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0040] Les figures 25A et 25B illustrent un test d’activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-Cy5 + DSV36S- Lumi4Tb. [0040] FIGS. 25A and 25B illustrate an activation test according to the 2B format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-Cy5 + DSV36S-Lumi4Tb.
[0041] Les figures 26A et 26B illustrent un test d’activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-AF488 + [0041] Figures 26A and 26B illustrate an activation test according to the 2B format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTPgN-octyl-AF488 +
DSV36S-Lumi4Tb. DSV36S-Lumi4Tb.
[0042] Les figures 27A et 27B illustrent un test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTP-gN-octyl- thiosuccinimidyl-C2 + DSV36S-d2. [0042] FIGS. 27A and 27B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection couple: GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 + DSV36S-d2.
Description détaillée detailed description
[0043] Définitions [0043] Definitions
[0044] Au sens de l’invention, le terme « protéine G » désigne une protéine hétéro- trimérique composée de trois sous-unités appelées protéine Galpha, protéine Gbêta et protéine Ggamma. [0044] For the purposes of the invention, the term "G protein" denotes a heterotrimeric protein composed of three subunits called Galpha protein, Gbeta protein and Ggamma protein.
[0045] Au sens de l’invention, le terme « Protéine Galpha » ou « Galpha » désigne la sous-unité alpha de la protéine G. La protéine Galpha possèdent deux domaines, le domaine GTPase, et le domaine hélice alpha. Il existe au moins 20 protéines Galpha différentes, qui peuvent se classer parmi les principales familles de protéines suivantes : Galphas (connu pour activer l'adénylate cyclase afin d'augmenter la synthèse de l'AMPc), Galphai (connu pour inhiber l'adénylate cyclase), Galphaolf (associé aux récepteurs olfactifs), Galphat (connu pour la transduction des signaux visuels dans la rétine en conjonction avec la rhodopsine), Galphaq (connu pour stimuler la phospholipase C) ou la famille Galpha12 / 13 (connue pour réguler le cytosquelette, les jonctions cellulaires, et d’autres processus liés au mouvement de la cellule). Dans un mode de For the purposes of the invention, the term “Galpha protein” or “Galpha” denotes the alpha subunit of the G protein. The Galpha protein has two domains, the GTPase domain, and the alpha helix domain. There are at least 20 different Galpha proteins, which can be classified into the following major protein families: Galphas (known to activate adenylate cyclase to increase cAMP synthesis), Galphai (known to inhibit adenylate cyclase), Galphaolf (associated with olfactory receptors), Galphat (known for transduction of visual signals in the retina in conjunction with rhodopsin), Galphaq (known to stimulate phospholipase C), or the Galpha12 / 13 family (known to regulate the cytoskeleton, cell junctions, and other processes related to blood movement. cell). In a mode of
réalisation préféré de l’invention, la protéine Galpha est choisie parmi la protéine GalphaM , Galphai2, Galphai3, Galphaol , Galphao2, Galphaq, Galpha12, preferred embodiment of the invention, the Galpha protein is chosen from the protein GalphaM, Galphai2, Galphai3, Galphaol, Galphao2, Galphaq, Galpha12,
Galpha13, Galphas, Galphaz, Galphatl , Galphat2, Galpha11 , Galpha14, Galpha13, Galphas, Galphaz, Galphatl, Galphat2, Galpha11, Galpha14,
Galpha15, Galpha16 et Galphagus, de préférence choisie parmi la protéine GalphaM , Galphai2 et Galphai3. Galpha15, Galpha16 and Galphagus, preferably chosen from the protein GalphaM, Galphai2 and Galphai3.
[0046] Au sens de l’invention, le terme « Protéine Galpha pleine » désigne une [0046] For the purposes of the invention, the term "full Galpha protein" denotes a
protéine Galpha liée au GTP ou au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (marqué selon l’invention ou non-marqué) ou au GDP. On parle alors de « protéine G alpha pleine liée au GTP », de « protéine G alpha pleine liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable » ou de « protéine Galpha pleine liée au GDP ». La protéine Galpha pleine (liée au GDP ou au GTP) est représentée à la Figure 1. Dans le cadre de la présente invention, on utilise un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET qui est capable de se liée à la protéine Galpha, ce qui permet d’obtenir une protéine Galpha pleine liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET. Galpha protein bound to GTP or to non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP (labeled according to the invention or unlabeled) or to GDP. This is called “full G alpha protein linked to GTP”, “full G alpha protein linked to non-hydrolysable or slowly hydrolyzable GTP” or “full Galpha protein linked to GDP”. The full Galpha protein (bound to GDP or to GTP) is represented in FIG. 1. In the context of the present invention, use is made of a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a first member of a pair of RET partners which is capable of binding to the Galpha protein, resulting in a full Galpha protein bound to non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners.
[0047] Le terme « GDP » désigne la guanosine diphosphate. The term "GDP" denotes guanosine diphosphate.
[0048] Le terme « GTP » désigne la guanosine triphosphate. The term "GTP" denotes guanosine triphosphate.
[0049] Le terme « GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable » désigne un analogue du GTP qui n’est pas hydrolysé ou peu hydrolysé en GDP. On peut citer par exemple le GTPgammaS (CAS no. 37589-80-3), le GppNHp (CAS no. 148892-91 -5) ou le GppCp (CAS no. 10470-57-2). The term "non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP" denotes an analogue of GTP which is not hydrolyzed or little hydrolyzed to GDP. Mention may be made, for example, of GTPgammaS (CAS no. 37589-80-3), GppNHp (CAS no. 148892-91 -5) or GppCp (CAS no. 10470-57-2).
[0050] Les termes « GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d’un couple de partenaire de RET » ou « GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué » ou « analogue de GTP marqué » désignent soit un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d’un couple de partenaire de RET donneur (« GTP-donneur »), soit un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d’un couple de partenaire de RET accepteur (« GTP-accepteur »). The terms "non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a member of a RET partner pair" or "labeled non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP" or "labeled GTP analog" denote either a non-hydrolyzable or slowly GTP hydrolyzable labeled by a member of a donor RET partner pair ("GTP-donor"), ie a non-GTP hydrolyzable or slowly hydrolyzable labeled with a member of an acceptor RET partner pair ("GTP-acceptor").
[0051] Au sens de l’invention, le terme « Protéine Galpha vide » désigne une [0051] For the purposes of the invention, the term "empty Galpha protein" denotes a
protéine Galpha qui n’est pas liée au GTP ou au GDP ou au GTP non Galpha protein which is not bound to GTP or GDP or to GTP not
hydrolysable ou lentement hydrolysable (modifié selon l’invention ou non- modifié), en particulier une protéine Galpha qui n’est pas liée au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre de couple de partenaire de RET. La protéine Galpha vide est décrite dans la littérature comme un état transitoire entre la forme pleine liée au GDP et la forme pleine liée au GTP ou au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable. La protéine Galpha vide est représentée à la Figure 1. hydrolyzable or slowly hydrolyzable (modified according to the invention or unmodified), in particular a Galpha protein which is not bound to the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a partner couple member of RET. The empty Galpha protein is described in the literature as a transient state between the solid form bound to GDP and the solid form bound to GTP or to non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP. The empty Galpha protein is shown in Figure 1.
[0052] Au sens de l’invention, le terme « préparation membranaire » désigne une préparation comprenant des membranes cellulaires ou des fragments de membranes cellulaires ou des systèmes artificiels mimant des membranes cellulaires qui portent (ou qui expriment à leur surface) un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha. Ainsi, le terme « préparation membranaire » englobe les cellules entières, les cellules entières perméabilisées, les cellules lysées, les membranes cellulaires purifiées et les complexes RCPG / Protéine Galpha purifiés et reconstitués dans des nanodisques (aussi appelés For the purposes of the invention, the term “membrane preparation” denotes a preparation comprising cell membranes or fragments of cell membranes or artificial systems mimicking cell membranes which carry (or which express on their surface) one or more RCPG and one or more Galpha protein (s). Thus, the term "membrane preparation" encompasses whole cells, permeabilized whole cells, lysed cells, purified cell membranes and GPCR / Galpha Protein complexes purified and reconstituted in nanodisks (also called
« nanoscale phospholipid bilayers ») ou des mélanges de détergents qui portent (ou qui expriment à leur surface) un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha. “Nanoscale phospholipid bilayers”) or mixtures of detergents which carry (or which express on their surface) one or more GPCRs and one or more Galpha protein (s).
[0053] Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1 , CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde. Chaque domaine variable comprend généralement 4 « régions charnières » (appelées FR1 , FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la liaison avec l’antigène, dites « CDR » (appelées CDR1 , CDR2, CDR3). The term "antibody", also called "immunoglobulin" denotes a heterotetramer consisting of two heavy chains of about 50-70 kDa each (called the H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each ( say L chains for Light), linked together by intra- and inter-chain disulfide bridges. Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain, called VL for the light chain, VH for the heavy chain, and in the C-terminal position, of a constant region, consisting of a single domain called CL for the light chain and three or four domains called CH1, CH2, CH3, CH4, for the heavy chain. Each variable domain generally comprises 4 "hinge regions" (called FR1, FR2, FR3, FR4) and 3 regions directly responsible for binding with the antigen, called “CDR” (called CDR1, CDR2, CDR3).
[0054] Un « anticorps » selon l’invention peut être d’origine mammifère (ex. humain ou de souris ou de camélidé), humanisé, chimérique, recombinant. Il s’agit de préférence d’un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement connues de l’homme de l’art. L’anticorps peut être de n’importe quel isotype, par exemple IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, de préférence IgG. [0054] An "antibody" according to the invention may be of mammalian origin (eg human or mouse or camelid), humanized, chimeric, recombinant. It is preferably a monoclonal antibody produced recombinantly by cells genetically modified according to techniques widely known to those skilled in the art. The antibody can be of any isotype, for example IgG, IgM, IgA, IgD or IgE, preferably IgG.
[0055] Par « anticorps chimérique », on entend un anticorps dont les séquences des régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non-murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine. By "chimeric antibody" is meant an antibody whose sequences of the variable regions of the light chains and of the heavy chains belong to a different species from that of the sequences of constant regions of the light chains and of the heavy chains. For the purposes of the invention, the sequences of the variable regions of the heavy and light chains are preferably of murine origin, while the sequences of the constant regions of the heavy and light chains belong to a non-murine species. In this regard, for constant regions, all species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular man, monkey, suidae, bovidae, equidae, felidae, canidae or even birds, this list not being exhaustive. Preferably, the chimeric antibodies according to the invention contain sequences of constant regions of heavy and light chains of human origin and sequences of variable regions of heavy and light chains of murine origin.
[0056] Par « anticorps humanisé », on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine. By "humanized antibody" is meant an antibody of which all or part of the sequences of the regions involved in the recognition of the antigen (the hypervariable regions or CDR: Complementarity Determining Region) and sometimes certain amino acids of the FR regions (regions Framework) are of non-human origin while the sequences of constant regions and variable regions not involved in antigen recognition are of human origin.
[0057] Par « anticorps humain », on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes. [0058] On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfure et qui est capable de se lier à l’antigène reconnu par l’anticorps entier, par exemple Fv, Fab, Fab', Fab'-SFI, F(ab')2, les diabodies, les anticorps linéaires (aussi appelés « Single Domain Antibodies » ou sdAb, ou nanobodies), les anticorps avec une seule chaîne (ex. les scFv). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SFI fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre. By "human antibody" is meant an antibody containing only human sequences, both for the variable and constant regions of the light chains and for the variable and constant regions of the heavy chains. The term "antibody fragment" means any part of an immunoglobulin obtained by enzymatic digestion or obtained by bioproduction comprising at least one disulfide bridge and which is capable of binding to the antigen recognized by the whole antibody , for example Fv, Fab, Fab ', Fab'-SFI, F (ab') 2 , diabodies, linear antibodies (also called "Single Domain Antibodies" or sdAb, or nanobodies), antibodies with a single chain ( e.g. scFv). Enzymatic digestion of immunoglobulins by pepsin generates an F (ab ') 2 fragment and an Fc fragment split into several peptides. F (ab ') 2 is formed from two Fab' fragments linked by inter-chain disulfide bridges. The Fab parts consist of the variable regions and the CH1 and CL domains. The Fab 'fragment consists of the Fab region and a hinge region. Fab'-SFI refers to an Fab 'fragment in which the cysteine residue of the hinge region carries a free thiol group.
[0059] Le terme « affinité » fait référence à la force de l’ensemble des interactions non-covalentes entre une molécule, par exemple un anticorps ou un fragment d’anticorps et l’antigène reconnu, par exemple un antigène tel que la protéine G alpha. L’affinité est généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple en FRET ou en SPR. The term "affinity" refers to the strength of the set of non-covalent interactions between a molecule, for example an antibody or an antibody fragment and the recognized antigen, for example an antigen such as the protein. G alpha. Affinity is generally represented by the dissociation constant (Kd). The dissociation constant (Kd) can be measured by well known methods, for example in FRET or in SPR.
[0060] Au sens de la présente invention, « l'identité » ou « l’homologie » est calculée en comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison. [0060] Within the meaning of the present invention, "identity" or "homology" is calculated by comparing two sequences aligned in a comparison window.
L'alignement des séquences permet de déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides aminés) en commun pour les deux séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de positions en commun est donc divisé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité. La détermination du pourcentage d'identité de séquence peut être effectuée manuellement ou grâce à des programmes informatiques bien connus. The alignment of the sequences makes it possible to determine the number of positions (nucleotides or amino acids) in common for the two sequences in the comparison window. The number of positions in common is therefore divided by the total number of positions in the comparison window and multiplied by 100 to obtain the percentage of identity. The determination of the percent sequence identity can be done manually or by well known computer programs.
[0061] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, l’identité ou l’homologie correspond à au moins une substitution, par exemple 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substitutions, d’un résidu d’acide aminé, de préférence au moins une substitution d’un résidu d’acide aminé réalisée de façon conservative. La « substitution d’un résidu d’acide aminé réalisée de façon conservative » consiste à remplacer un résidu d’acide aminé par un autre résidu d’acide aminé, ayant une chaîne latérale possédant des propriétés similaires. Les familles d’acides aminés possédant des chaînes latérales avec des propriétés similaires sont bien connues, on peut citer par exemple les chaînes latérales basiques (e.g., lysine, arginine, histidine), les chaînes latérales acides (e.g., aspartic acid, glutamic acid), les chaînes latérales polaires et non chargées (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), les chaînes latérales apolaires (e.g., glycine, cysteine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, méthionine, In a particular embodiment of the invention, the identity or the homology corresponds to at least one substitution, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substitutions , of an amino acid residue, preferably at least one substitution of an amino acid residue carried out conservatively. The "substitution of an amino acid residue carried out conservatively" consists of replacing a amino acid residue by another amino acid residue, having a side chain having similar properties. The families of amino acids possessing side chains with similar properties are well known, one can quote for example the basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), the acid side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid) , polar and uncharged side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg, glycine, cysteine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine ,
tryptophan), les chaînes latérales beta-ramifiées (e.g., threonine, valine, isoleucine) et les chaînes latérales aromatiques (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). tryptophan), beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
[0062] Les anticorps ou fragments d’anticorps homologues ou « variants d’anticorps ou de fragments d’anticorps » (c’est-à-dire des anticorps ou fragments [0062] The antibodies or fragments of homologous antibodies or "variants of antibodies or fragments of antibodies" (that is to say antibodies or fragments
d’anticorps ayant la même fonction) possèdent donc certains acides aminés qui peuvent être substitués par d’autres acides aminés au niveau des régions constantes et/ou des régions variables, sans perdre la capacité de liaison à l’antigène. Il est préférable que cette substitution soit réalisée au sein de la séquence d’ADN qui code pour l’anticorps ou le fragment d’anticorps, c’est-à-dire que la substitution soit conservative en nature. L’Homme du métier utilise ses connaissances générales pour déterminer le nombre de substitutions qui peuvent être réalisés et leur localisation afin de pouvoir conserver la fonction de antibodies with the same function) therefore have certain amino acids which can be substituted by other amino acids at constant regions and / or variable regions, without losing the ability to bind to the antigen. It is preferable that this substitution is carried out within the DNA sequence which encodes the antibody or the antibody fragment, that is to say that the substitution is conservative in nature. A person skilled in the art uses his general knowledge to determine the number of substitutions that can be made and their location in order to be able to retain the function of
l’anticorps ou du fragment d’anticorps. Afin de déterminer la capacité d’un ou plusieurs variants d’anticorps ou de fragment d’anticorps à se lier spécifiquement à un antigène, plusieurs méthodes appropriées, bien connues de l’homme du métier et décrites dans l’art antérieur, peuvent être utilisées. Les anticorps ou les fragments d’anticorps peuvent donc être testés par les méthodes de liaison, comme par exemple la méthode ELISA, la méthode par chromatographie d’affinité, etc. Les variants d’anticorps ou de fragments d’anticorps peuvent être générés par exemple par la méthode de « phage display » permettant de générer une librairie de phage. Un grand nombre de méthodes sont connues afin de générer une librairie de « phage display » et cibler les variants d’anticorps ou de fragments d’anticorps ayant les caractéristiques fonctionnelles recherchées. [0063] Avantageusement, l’anticorps ou le fragment d’anticorps utilisé dans le cadre de la présente invention se lie à la protéine G alphai, G alphao et/ou G alphaz, par exemple il se lie à la protéine G alphail , à la protéine G alphai2 et/ou à la protéine G alphai3. La protéine G alphail d’origine humaine porte l’identifiant UniProt P63096-1 pour l’isoforme 1 et l’identifiant UniProt P63096-2 pour l’isoforme 2. Le gène codant pour la protéine G alphail d’origine humaine est connu sous le nom de « GNAI1 » (Gene ID : 2770, NCBI). the antibody or antibody fragment. In order to determine the capacity of one or more antibody variants or antibody fragment to bind specifically to an antigen, several suitable methods, well known to those skilled in the art and described in the prior art, can be used. The antibodies or the fragments of antibodies can therefore be tested by binding methods, such as for example the ELISA method, the affinity chromatography method, etc. The antibody variants or antibody fragments can be generated, for example, by the “phage display” method making it possible to generate a phage library. A large number of methods are known in order to generate a “phage display” library and target the antibody variants or antibody fragments having the desired functional characteristics. Advantageously, the antibody or the antibody fragment used in the context of the present invention binds to the G alphai, G alphao and / or G alphaz protein, for example it binds to the G alphail protein, to the G protein alphai2 and / or the G protein alphai3. The alphail G protein of human origin carries the UniProt P63096-1 identifier for isoform 1 and the UniProt P63096-2 identifier for isoform 2. The gene encoding the human G alphail protein is known as the name "GNAI1" (Gene ID: 2770, NCBI).
[0064] Au sens de l’invention, le terme « molécule capable de moduler l’activation du RCPG » désigne une molécule capable d’activer ou d’inhiber un RCPG, et donc d’induire la transduction ou d’empêcher la transduction d’un signal de l’extérieur de la cellule vers l’intérieur de la cellule via le RCPG. Il peut s’agir d’un agoniste, d’un antagoniste, d’un agoniste inverse, d’un modulateur allostérique positif ou d’un modulateur allostérique négatif. For the purposes of the invention, the term "molecule capable of modulating the activation of RCPG" denotes a molecule capable of activating or inhibiting a GPCR, and therefore of inducing transduction or of preventing transduction. a signal from outside the cell to the inside of the cell via the RCPG. It can be an agonist, an antagonist, a reverse agonist, a positive allosteric modulator, or a negative allosteric modulator.
[0065] Au sens de l’invention, le terme « molécule à tester » est une molécule [0065] For the purposes of the invention, the term "test molecule" is a molecule
susceptible de moduler l’activation du RCPG. likely to modulate the activation of GPCR.
[0066] Dans la présente description, le terme « molécule », sans autre précision, désigne à la fois les termes « molécule capable de moduler l’activation du GPCR » et « molécule à tester ». In the present description, the term "molecule", without further precision, designates both the terms "molecule capable of modulating the activation of GPCR" and "molecule to be tested".
[0067] Le terme « RET » (de l’anglais « Résonance Energy Transfer ») désigne les techniques de transfert d'énergie. [0067] The term "RET" (from the English "Resonance Energy Transfer") refers to energy transfer techniques.
[0068] Le terme « FRET » (de l’anglais « Fluorescence Résonance Energy [0068] The term "FRET" (from the English "Fluorescence Resonance Energy
Transfer ») désigne le transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes. Le FRET est défini comme un transfert d’énergie non radiatif résultant d’une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d’énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d’émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d’absorption de l’accepteur. En accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l’une de l’autre, un signal de FRET sera émis. Transfer ”) designates the transfer of energy between two fluorescent molecules. FRET is defined as a non-radiative energy transfer resulting from a dipole-dipole interaction between an energy donor and acceptor. This physical phenomenon requires energy compatibility between these molecules. This means that the donor's emission spectrum must cover, at least partially, the absorption spectrum of the acceptor. According to Forster's theory, FRET is a process that depends on the distance between the two molecules, donor and acceptor: when these molecules are close to each other, a FRET signal will be emitted.
[0069] Le terme « BRET » (de l’anglais « Bioluminescence Résonance Energy [0069] The term "BRET" (from the English "Bioluminescence Resonance Energy
Transfer ») désigne le transfert d'énergie entre une molécule bioluminescente et une molécule fluorescente. [0070] Au sens de l’invention, le terme « ligand » désigne une molécule capable de se lier à une molécule cible. Dans le cadre de l’invention, la molécule cible est la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET. Dans le cadre de la présente invention, il est nécessaire que le ligand soit capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET. Néanmoins, le ligand n’est pas nécessairement spécifique de la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET. Ainsi, le ligand utilisé dans le cadre de l’invention peut aussi être capable de se lier à la protéine Galpha liée au GDP, à la protéine Galpha liée au GTP, à la protéine Galpha liée au GTP non- hydrolysable ou lentement hydrolysable non-marqué, ou même à la protéine Galpha vide. Le ligand peut être de nature protéique (ex. une protéine ou un peptide) ou de nature nucléotidique (ex. un ADN ou un ARN). Dans le cadre de l’invention, le ligand est avantageusement choisi parmi un anticorps, un fragment d’anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un anticorps ou un fragment d’anticorps. Dans le cadre de la présente invention, le ligand peut être marqué de manière directe ou indirecte selon des méthodes bien connues de l’homme du métier, par exemple comme décrit ci-après, mais de manière préférée, le ligand est marqué de manière directe, par liaison covalente avec un membre d’un couple de partenaires de RET. Transfer ”) designates the transfer of energy between a bioluminescent molecule and a fluorescent molecule. For the purposes of the invention, the term “ligand” denotes a molecule capable of binding to a target molecule. In the context of the invention, the target molecule is the full Galpha protein linked to the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners. In the context of the present invention, it is necessary for the ligand to be capable of binding to the full Galpha protein bound to the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners. However, the ligand is not necessarily specific for the full Galpha protein bound to the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners. Thus, the ligand used in the context of the invention may also be capable of binding to the Galpha protein linked to GDP, to the Galpha protein linked to GTP, to the Galpha protein linked to non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable non-GTP. labeled, or even empty Galpha protein. The ligand may be of a protein nature (eg a protein or a peptide) or of a nucleotide nature (eg a DNA or an RNA). In the context of the invention, the ligand is advantageously chosen from an antibody, an antibody fragment, a peptide or an aptamer, preferably an antibody or an antibody fragment. In the context of the present invention, the ligand can be labeled directly or indirectly according to methods well known to those skilled in the art, for example as described below, but preferably, the ligand is labeled directly. , by covalent bonding with a member of a pair of RET partners.
[0071] Le terme « couple de partenaires de RET » désigne un couple constitué d’un composé donneur d'énergie (ci-après « composé donneur ») et d’un composé accepteur d'énergie (ci-après « composé accepteur »); lorsqu’ils sont à proximité l’un de l’autre et lorsqu’ils sont excités à la longueur d’onde d’excitation du composé donneur, ces composés émettent un signal de RET. Il est connu que pour que deux composés soient partenaires de RET, le spectre d’émission du composé donneur doit recouvrir partiellement le spectre d’excitation du composé accepteur. Par exemple, on parle de « couples de partenaires de FRET » lorsqu’on utilise un composé fluorescent donneur et un composé accepteur ou de « couple de partenaires de BRET » lorsqu’on utilise un composé bioluminescent donneur et un composé accepteur. [0072] Le terme « signal de RET » désigne tout signal mesurable représentatif d’un RET entre un composé donneur et un composé accepteur. Par exemple, un signal de FRET peut donc être une variation de l’intensité ou de la durée de vie de luminescence du composé fluorescent donneur ou du composé accepteur lorsque ce dernier est fluorescent. The term "pair of RET partners" denotes a pair consisting of an energy donor compound (hereinafter "donor compound") and an energy acceptor compound (hereinafter "acceptor compound"); when in proximity to each other and when excited at the excitation wavelength of the donor compound, these compounds emit a RET signal. It is known that for two compounds to be partners of RET, the emission spectrum of the donor compound must partially cover the excitation spectrum of the acceptor compound. For example, one speaks of “pairs of FRET partners” when a fluorescent donor compound and an acceptor compound are used, or of “pairs of BRET partners” when a bioluminescent donor compound and an acceptor compound are used. The term "RET signal" denotes any measurable signal representative of a RET between a donor compound and an acceptor compound. For example, a FRET signal can therefore be a variation in the intensity or the luminescence lifetime of the donor fluorescent compound or of the acceptor compound when the latter is fluorescent.
[0073] Le terme « contenant » désigne un puits d’une plaque, un tube à essai ou de tout autre contenant approprié au mélange d’une préparation membranaire avec les réactifs nécessaires à la mise en œuvre de la méthode selon l’invention. The term "container" denotes a well of a plate, a test tube or any other container suitable for mixing a membrane preparation with the reagents necessary for the implementation of the method according to the invention.
[0074] L’invention concerne une méthode pour déterminer la capacité d’une [0074] The invention relates to a method for determining the capacity of a
molécule à moduler l’activation d’un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : molecule for modulating the activation of a receptor coupled to a G protein (GPCR), said method comprising the following steps:
a) introduction, dans un premier contenant : a) introduction, in a first container:
- d’une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - a membrane preparation carrying one or more GPCRs and one or more Galpha protein (s),
- d’une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET, - a source of non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners,
- d’un ligand de la sous-unité alpha d’une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d’un couple de partenaires de RET, - a ligand of the alpha subunit of a G protein (Galpha protein) labeled with a second member of the pair of RET partners, said ligand being capable of binding to the full Galpha protein bound to the non-hydrolyzable GTP or slowly hydrolyzable labeled by the first member of a pair of RET partners,
- éventuellement d’un agoniste du RCPG ; - possibly a GPCR agonist;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ; b) measurement of the RET signal emitted in the first container;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu’à l’étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à tester ; c) introduction (i) into a second container, of the same reagents as in step a) and of the molecule to be tested or (ii) into the first container, of the molecule to be tested;
d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l’étape c) ; d) measuring the RET signal emitted in the second container or in the first container obtained in step c);
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l’activation du RCPG. e) comparison of the signals obtained in steps b) and d), modulation of the signal obtained in step d) with respect to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is capable of modulating the activation of the RCPG.
[0075] Il n’est pas nécessaire d’ajouter une source de GTP, autre que le GTP non- hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué, lors de la mise en œuvre du procédé selon l’invention. D’ailleurs, avantageusement, aucune autre source de GTP que le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué n’est ajoutée lors de la mise en œuvre du procédé selon l’invention. It is not necessary to add a source of GTP, other than the labeled non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP, when using the. method according to the invention. Moreover, advantageously, no source of GTP other than labeled non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is added during the implementation of the process according to the invention.
[0076] Il n’est pas non plus nécessaire d’ajouter une source de GDP lors de la mise en œuvre du procédé selon l’invention. Néanmoins, une faible quantité de GDP peut être tolérée lors de la mise en œuvre du procédé selon l’invention, par exemple à l’étape a). Dans les formats 1 A et 1 B (Figures 2A et 2B), [0076] It is also not necessary to add a source of GDP when implementing the method according to the invention. However, a small amount of GDP can be tolerated during the implementation of the method according to the invention, for example in step a). In formats 1 A and 1 B (Figures 2A and 2B),
avantageusement, aucune source de GDP n’est ajoutée lors de la mise en œuvre du procédé selon l’invention. Dans les formats 2A et 2B (Figures 2C et 2D), l’ajout de GDP peut permettre une meilleure discrimination du signal entre une condition ne contenant pas d’agoniste et une condition contenant un agoniste. advantageously, no source of GDP is added during the implementation of the method according to the invention. In formats 2A and 2B (Figures 2C and 2D), the addition of GDP may allow better signal discrimination between a condition containing no agonist and a condition containing an agonist.
[0077] Etape a) Step a)
[0078] L’étape a) consiste à introduire, dans un premier contenant les trois ou quatre éléments suivants : Step a) consists of introducing, into a first one containing the following three or four elements:
- une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - a membrane preparation carrying one or more RCPGs and one or more Galpha protein (s),
- une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d’un couple de partenaires de RET, - a source of non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a couple of RET partners,
- un ligand de la sous-unité alpha d’une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capables de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d’un couple de - a ligand of the alpha subunit of a G protein (Galpha protein) labeled by a second member of the pair of RET partners, said ligand being capable of binding to the full Galpha protein bound to non-hydrolyzable GTP or slowly hydrolyzable marked by the first member of a pair of
partenaires de RET, et partners of RET, and
- éventuellement un agoniste du RCPG. - possibly a GPCR agonist.
[0079] Avantageusement, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est choisi parmi le GTPgammaS (GTPyS ou GTPgS), le GppNHp et le GppCp. Le GTPgammaS devant être marqué sur une position autre que le troisième phosphate (phosphate gamma). Les trois ou quatre éléments peuvent être introduits dans le contenant de manière séquentielle dans n’importe quel ordre, ou de manière simultanée ou quasi-simultanée. Le mélange des 3 éléments permet d’obtenir une solution réactionnelle adaptée à la mise en œuvre d’un RET. D’autres éléments peuvent être ajoutés dans le contenant afin d’adapter la solution à la mise en œuvre du RET. Par exemple, on peut ajouter la coelentérazine h (benzyl-coelentérazine) ou la bisdésoxycoelentérazine Advantageously, the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is chosen from GTPgammaS (GTPyS or GTPgS), GppNHp and GppCp. GTPgammaS to be labeled at a position other than the third phosphate (gamma phosphate). The three or four elements can be introduced into the container sequentially in any order, or simultaneously or almost simultaneously. The mixture of the 3 elements makes it possible to obtain a reaction solution suitable for the implementation of a RET. Other elements can be added to the container in order to adapt the solution to the implementation of RET. For example, one can add coelenterazine h (benzyl-coelenterazine) or bisdeoxycoelenterazine
(DeepBlueC™) ou didéshydrocoelenterazine (coelentérazine-400a) ou la D- luciférine. (DeepBlueC ™) or didehydrocoelenterazine (coelenterazine-400a) or D-luciferin.
[0080] Dans un premier mode de réalisation particulier, le ligand de la protéine In a first particular embodiment, the ligand of the protein
Galpha se lie spécifiquement au domaine Switchll de la protéine Galpha, en particulier au peptide 215-294 de la protéine Galpha. Par exemple, la protéine Galpha est choisie parmi GalphaM , Galphai2 et Galphai3 et le ligand de la protéine Galpha est un peptide KB1753 de séquence Ser-Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr- His-Gly-lle-Trp-Val-Gly-Glu-Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Arg (SEQ ID No : 1 ). Galpha binds specifically to the SwitchII domain of the Galpha protein, in particular to the 215-294 peptide of the Galpha protein. For example, the Galpha protein is chosen from GalphaM, Galphai2 and Galphai3 and the ligand of the Galpha protein is a KB1753 peptide of sequence Ser-Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr-His-Gly-lle-Trp-Val-Gly -Glu-Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Arg (SEQ ID No: 1).
[0081] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la protéine Galpha est choisie parmi GalphaM , Galphai2 et Galphai3 et le ligand de la protéine Galpha entre en compétition pour la liaison à ladite protéine Galpha avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ). La capacité du ligand à compéter pour la liaison à ladite protéine Galpha avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) peut être testée par une méthode par compétition. In a second particular embodiment, the Galpha protein is chosen from GalphaM, Galphai2 and Galphai3 and the ligand of the Galpha protein competes for binding to said Galpha protein with the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) . The ability of the ligand to compete for binding to said Galpha protein with the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) can be tested by a competition method.
[0082] Une « méthode par compétition » consiste à tester un ligand de la protéine Galpha pour ses capacités à bloquer la liaison entre le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) et la protéine Galpha, ou à entrer en compétition avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) pour la liaison à la protéine Galpha. En d’autres termes, un ligand de la protéine Galpha qui entre en compétition avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) pour la liaison à la protéine Galpha se lie au même épitope que le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) ou à un épitope qui est suffisamment proches de l'épitope reconnu par le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) pour empêcher la liaison du ligand de la protéine Galpha pour des raisons d’encombrements stériques. De nombreux types de méthodes par compétition peuvent être utilisés pour déterminer si un ligand de la protéine Galpha entre en compétition avec le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ), par exemple par test ELISA. Par exemple, la méthode par compétition par ELISA implique l'utilisation d'une protéine Galpha purifiée liée à une surface solide ou à des cellules, d’un ligand de la protéine Galpha à tester qui se lie à la protéine Galpha et le peptide KB1753 marqué. Habituellement, le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) de référence est utilisé à une concentration non saturante (par rapport à sa constante de dissociation Kd pour la protéine Galpha) et on mesure le signal en absence ou en présence de concentrations croissantes du ligand de la protéine Galpha à tester. Lorsqu’un ligand de la protéine Galpha d’intérêt est présent en excès, il peut bloquer la liaison spécifique du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) à la protéine Galpha d’au moins 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est bloquée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%,A "competition method" consists in testing a ligand of the Galpha protein for its ability to block the binding between the KB1753 peptide (SEQ ID No: 1) and the Galpha protein, or to enter into competition with the KB1753 peptide (SEQ ID No: 1) for binding to the Galpha protein. In other words, a ligand of the Galpha protein which competes with the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) for binding to the Galpha protein binds to the same epitope as the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) or to an epitope which is sufficiently close to the epitope recognized by the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) to prevent binding of the ligand of the Galpha protein for reasons of steric hindrance. Many types of competition methods can be used to determine whether a Galpha protein ligand competes with the KB1753 peptide (SEQ ID No: 1), for example by ELISA test. For example, the ELISA competition method involves the use of a purified Galpha protein bound to a solid surface or to cells, a ligand of the Galpha protein to be tested which binds to the Galpha protein and the KB1753 peptide. Mark. Usually, the reference peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) is used at an unsaturated concentration (with respect to its dissociation constant Kd for the Galpha protein) and the signal is measured in the absence or in the presence of increasing concentrations of the ligand of the Galpha protein to be tested. When a ligand of the Galpha protein of interest is present in excess, it can block the specific binding of the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) to the Galpha protein by at least 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or 75% or more. In some cases the bond is blocked by at least 80-85%, 85-90%,
90 à 95%, 95 à 97% ou 97% ou plus. 90 to 95%, 95 to 97% or 97% or more.
[0083] Un autre exemple de méthode par compétition peut utiliser le TR-FRET. Par exemple, le TR-FRET implique l’utilisation d’une protéine Galpha purifiée et tagguée, d’un ligand anti-Tag (avantageusement un anticorps) marqué par le premier membre du couple de partenaire de TR-FRET (avantageusement le donneur) capable de se lier sur le tag de la protéine Galpha, du peptide KB1753 (SEQ ID NO : 1 ) marqué par le deuxième membre du couple de partenaire de TR-FRET (avantageusement l’accepteur par une méthode de marquage indirecte avec une biotine sur le peptide et de la streptavidine-accepteur) et d’un ligand de la protéine Galpha à tester. Habituellement, le peptide KB1753 (SEQ ID NO : 1 ) est utilisé à une concentration non saturante (par rapport à sa constate de dissociation Kd pour la protéine Galpha) et on mesure le signal TR-FRET en absence ou en présence de concentrations croissantes du ligand de la protéine Galpha à tester. Lorsqu’un ligand de la protéine Galpha d’intérêt est testé, il peut bloquer la liaison spécifique du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) à la protéine Galpha d’au moins 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est bloquée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, 95 à 97% ou 97% ou plus. Si le ligand de la protéine Galpha testé inhibe la liaison du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ), le caractère orthostérique de l’inhibition (en opposition à une inhibition allostérique) peut être confirmé par des expériences de Schild-Plot qui consiste à mesurer la constante de dissociation (Kd) du peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) marqué pour la protéine Galpha en absence ou en présence de concentrations croissantes du ligand de la protéine Galpha. Si le Kd évolue de manière linéaire et non saturable lorsque la concentration de ligand de la protéine Galpha augmente, l’inhibition est orthostérique (c’est-à-dire que le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) et le ligand de la protéine Galpha se lient sur le même épitope de la protéine Galpha). Si le Kd évolue de manière non-linéaire et saturable lorsque la concentration de ligand de la protéine Galpha augmente, l'inhibition est allostérique (c’est-à-dire que le peptide KB1753 (SEQ ID No : 1 ) et le ligand ne se lient pas sur le même épitope de la protéine G alpha). Another example of a competition method can use TR-FRET. For example, TR-FRET involves the use of a purified and tagged Galpha protein, an anti-Tag ligand (advantageously an antibody) labeled by the first member of the partner pair of TR-FRET (advantageously the donor) capable of binding to the tag of the Galpha protein, of the KB1753 peptide (SEQ ID NO: 1) labeled by the second member of the partner pair of TR-FRET (advantageously the acceptor by an indirect labeling method with a biotin on peptide and streptavidin-acceptor) and a ligand for the Galpha protein to be tested. Usually, the KB1753 peptide (SEQ ID NO: 1) is used at an unsaturated concentration (compared to its finding of Kd dissociation for the Galpha protein) and the TR-FRET signal is measured in the absence or in the presence of increasing concentrations of the protein. ligand of the Galpha protein to be tested. When a ligand of the Galpha protein of interest is tested, it can block the specific binding of peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) to the Galpha protein by at least 40-45%, 45-50%, 50- 55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or 75% or more. In some cases, the binding is blocked by at least 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, or 97% or more. If the ligand of the Galpha protein tested inhibits the binding of the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1), the orthosteric character of the inhibition (as opposed to allosteric inhibition) can be confirmed by Schild-Plot experiments which consists of measure the dissociation constant (Kd) of peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) labeled for the Galpha protein in the absence or in the presence of increasing concentrations of the ligand for the Galpha protein. If the Kd evolves in a linear and unsaturable manner as the concentration of ligand of the Galpha protein increases, the inhibition is orthosteric (i.e., the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) and the ligand of the Galpha protein bind to the same epitope of the Galpha protein). If the Kd evolves in a non-linear and saturable manner as the concentration of ligand of the Galpha protein increases, the inhibition is allosteric (that is, the peptide KB1753 (SEQ ID No: 1) and the ligand do not bind on the same epitope of the alpha G protein).
[0084] Le ligand de la protéine Galpha peut être un anticorps ou un fragment The ligand of the Galpha protein can be an antibody or a fragment
d’anticorps. antibodies.
[0085] Ainsi, dans un troisième mode de réalisation particulier, le ligand de la Thus, in a third particular embodiment, the ligand of
protéine Galpha est un anticorps ou un fragment d’anticorps capable de se lier à la protéine G alpha , qui comprend : Galpha protein is an antibody or an antibody fragment capable of binding to the G alpha protein, which comprises:
- un domaine variable d’une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 2, un CDR2 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 3, et un CDR3 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 4, et - a variable domain of a heavy chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 3, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO : 4, and
- un domaine variable d’une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 5, un CDR2 de séquence d’acides aminés DTS (soit les trois acides aminés « Asp Thr Ser» ou encore les trois acides aminés acide aspartique, thréonine, sérine), et un CDR3 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 6. - a variable domain of a light chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 5, a CDR2 of DTS amino acid sequence (either the three amino acids "Asp Thr Ser" or the three amino acids aspartic acid, threonine, serine), and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO: 6.
[0086] Le domaine variable de la chaîne lourde de l’anticorps ou du fragment The variable domain of the heavy chain of the antibody or of the fragment
d’anticorps capable de se lier à la protéine G alpha peut comprendre : Antibodies capable of binding to the alpha G protein may include:
- un FR1 présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 7, - an FR1 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 7,
- un FR2 présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 8, an FR2 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 8,
- un FR3 présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 9, et/ou - an FR3 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 9, and / or
- un FR4 présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 10. - an FR4 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 10.
[0087] Le domaine variable de la chaîne légère de l’anticorps ou du fragment The variable domain of the light chain of the antibody or of the fragment
d’anticorps capable de se lier à la protéine G alpha peut comprendre : Antibodies capable of binding to the alpha G protein may include:
- un FR1 présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 11 , - an FR1 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 11,
- un FR2 présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 12, an FR2 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 12,
- un FR3 présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 13, et/ou - an FR3 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 13, and / or
- un FR4 présentant au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 14. - an FR4 having at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 14.
[0088] Dans un mode de réalisation particulier de l’anticorps ou du fragment In a particular embodiment of the antibody or of the fragment
d’anticorps capable de se lier à la protéine G alpha: of antibodies capable of binding to the alpha G protein:
• le domaine variable de la chaîne lourde comprend : • the variable domain of the heavy chain includes:
- un FR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 7 (i.e. 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 7), - an FR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 7 (i.e. 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 7),
- un FR2 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 8, - an FR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 8,
- un FR3 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 9, et - an FR3 of amino acid sequence SEQ ID NO: 9, and
- un FR4 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 10 ; et - an FR4 of amino acid sequence SEQ ID NO: 10; and
• le domaine variable de la chaîne légère comprend : • the variable domain of the light chain includes:
- un FR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 11 , - an FR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 11,
- un FR2 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 12, - an FR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 12,
- un FR3 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 13, et - an FR3 of amino acid sequence SEQ ID NO: 13, and
- un FR4 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 14. [0089] Dans un mode de réalisation particulier de l’anticorps ou du fragment d’anticorps capable de se lier à la protéine G alpha, le domaine variable de la chaîne lourde peut présenter au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 15, et le domaine variable de la chaîne légère peut présenter d’homologie au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 16. - an FR4 of amino acid sequence SEQ ID NO: 14. In a particular embodiment of the antibody or of the antibody fragment capable of binding to the alpha G protein, the variable domain of the heavy chain may exhibit at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 15, and the variable domain of the light chain may have at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.
[0090] Ainsi, le ligand de la protéine Galpha peut être un anticorps ou fragment d’anticorps dans lequel : Thus, the ligand of the Galpha protein can be an antibody or antibody fragment in which:
- le domaine variable de la chaîne lourde présente au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% - the variable domain of the heavy chain has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95%
d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d’homologie d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 15 ; homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 15;
- le domaine variable de la chaîne légère présente au moins 80% d’homologie, de préférence au moins 90% d’homologie, par exemple au moins 95% - the variable domain of the light chain has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95%
d’homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d’homologie d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 16 ; et homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 16; and
- le CDR1 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 2, le CDR2 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 3, le CDR3 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 4, le CDR1 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 5, le CDR2 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d’acides aminés DTS, et le CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 6. - the CDR1 of the variable domain of the heavy chain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, the CDR2 of the variable domain of the heavy chain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, the CDR3 of the heavy chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, the CDR1 of the light chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 5, the CDR2 of the variable domain of the light chain consists of the amino acid sequence DTS, and CDR3 of the light chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 6.
[0091] Avantageusement, le ligand de la protéine Galpha est un anticorps un Advantageously, the ligand of the Galpha protein is an antibody un
anticorps ou fragment d’anticorps dans lequel le domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 15 (i.e. le domaine variable de la chaîne lourde présente 100% d’homologie avec la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 15) et le domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d’acide aminé SEQ ID NO : 16. antibody or antibody fragment in which the variable domain of the chain heavy consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15 (ie the variable domain of the heavy chain has 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 15) and the variable domain of the light chain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.
[0092] L’anticorps décrit dans les exemples sous la référence DSV36S (anticorps DSV disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande) comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 15 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d’acide aminé SEQ ID NO : 16. The antibody described in the examples under the reference DSV36S (DSV antibody available from Cisbio Bioassays on request) comprises a variable domain of the heavy chain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15 and a domain light chain variable which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 16.
[0093] L’anticorps ou fragment d’anticorps capable de se lier à la protéine G alpha selon le troisième mode de réalisation particulier décrit ci-dessus est appelé « anticorps ou fragment d’anticorps de référence » ci-après dans le quatrième mode de réalisation particulier. The antibody or antibody fragment capable of binding to the G alpha protein according to the third particular embodiment described above is called “antibody or reference antibody fragment” hereinafter in the fourth embodiment. particular achievement.
[0094] Dans un quatrième mode de réalisation particulier, le ligand de la protéine Galpha est un anticorps ou d’un fragment d’anticorps qui entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l’anticorps ou fragment d’anticorps de référence, ci-après « anticorps ou fragment d’anticorps compétiteur ». In a fourth particular embodiment, the ligand of the Galpha protein is an antibody or of an antibody fragment which competes for binding to the G alpha protein with the antibody or antibody fragment of reference, hereinafter “antibody or fragment of a competitor antibody”.
[0095] La capacité d’un anticorps ou d’un fragment d’anticorps à entrer en [0095] The ability of an antibody or an antibody fragment to enter into
compétition avec l’anticorps ou fragment d’anticorps de référence pour la liaison à la protéine G alpha peut être testée par une méthode par compétition. Une « méthode par compétition » consiste à tester un anticorps (ou un fragment d’anticorps) pour ses capacités à bloquer la liaison entre un anticorps ou fragment d’anticorps de référence et un antigène ou à entrer en compétition avec un anticorps ou fragment d’anticorps de référence pour la liaison à l’antigène. En d’autres termes, un anticorps qui entre en compétition avec l’anticorps ou fragment d’anticorps de référence se lie au même épitope que l’anticorps ou fragment d’anticorps de référence ou à un épitope qui est suffisamment proches de l'épitope reconnu par l’anticorps ou fragment d’anticorps de référence pour empêcher la liaison de l’anticorps ou fragment d’anticorps de référence pour des raisons d’encombrements stériques. competition with the antibody or reference antibody fragment for binding to the alpha G protein can be tested by a competition method. A “competition method” consists in testing an antibody (or an antibody fragment) for its capacity to block the binding between an antibody or reference antibody fragment and an antigen or to enter into competition with an antibody or fragment of an antibody. reference antibody for binding to the antigen. In other words, an antibody which competes with the reference antibody or antibody fragment binds to the same epitope as the reference antibody or antibody fragment or to an epitope which is sufficiently close to the antibody. epitope recognized by the antibody or reference antibody fragment to prevent binding of the antibody or reference antibody fragment for reasons of steric hindrance.
[0096] De nombreux types de méthodes par compétition peuvent être utilisés pour déterminer si un anticorps ou un fragment d’anticorps entre en compétition avec un anticorps ou fragment d’anticorps de référence, par exemple: par test ELISA par compétition, par la méthode du sandwich direct ou indirect, par dosage radio immunologique (RIA) direct ou indirect en phase solide, par dosage immuno enzymatique en phase solide directe ou indirecte (EIA), etc. Par exemple, la méthode ELISA par compétition implique l'utilisation d'un antigène purifié lié à une surface solide ou à des cellules, l’anticorps à tester qui se lie à l'antigène non marqué et un anticorps ou fragment d’anticorps de référence marqué. Many types of competition methods can be used to determine whether an antibody or antibody fragment competes with a reference antibody or antibody fragment, for example: by competition ELISA test, by the direct or indirect sandwich method, by direct or indirect solid phase radioimmunoassay (RIA), by direct solid phase immunoenzymatic assay or indirect (EIA), etc. For example, the competitive ELISA method involves the use of a purified antigen bound to a solid surface or to cells, the test antibody that binds to unlabeled antigen, and an antibody or antibody fragment from marked reference.
Habituellement, l’anticorps ou fragment d’anticorps de référence est présent en concentration non saturante (par rapport à sa constante de dissociation Kd pour la protéine Galpha) et on mesure le signal à des concentrations croissantes de l’anticorps ou du fragment d’anticorps à tester. Lorsqu’un anticorps est présent en excès, il peut bloquer ou inhiber (par exemple réduire) la liaison spécifique d’un anticorps ou fragment d’anticorps de référence à un antigène d’au moins 40- 45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est inhibée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, 95 à 97% ou 97% ou plus. Usually, the antibody or antibody fragment of reference is present in an unsaturated concentration (with respect to its dissociation constant Kd for the Galpha protein) and the signal is measured at increasing concentrations of the antibody or of the fragment of. antibody to be tested. When an antibody is present in excess, it can block or inhibit (e.g. reduce) the specific binding of a reference antibody or antibody fragment to an antigen by at least 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or 75% or more. In some cases, binding is inhibited by at least 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, or 97% or more.
[0097] Les anticorps ou fragments d’anticorps compétiteurs mis en œuvre dans le procédé selon l’invention peuvent, par exemple, être obtenus avec l’anticorps ou fragment d’anticorps de référence par la mise en œuvre du protocole décrit dans l’Exemple 26. L’anticorps décrit dans les exemples sous la référence DSV38S (anticorps DSV disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande) est un anticorps compétiteur qui peut être s en œuvre dans le procédé selon l’invention. The antibodies or fragments of competing antibodies used in the method according to the invention can, for example, be obtained with the antibody or fragment of the reference antibody by the implementation of the protocol described in Example 26. The antibody described in the examples under the reference DSV38S (DSV antibody available from Cisbio Bioassays on request) is a competing antibody which can be used in the method according to the invention.
[0098] Les anticorps ou fragments d’anticorps de référence et les anticorps ou The antibodies or fragments of reference antibodies and the antibodies or
fragments d’anticorps compétiteurs tels que définis ci-dessus sont appelés conjointement « anticorps ou fragments d’anticorps mis en œuvre dans le procédé selon l’invention » ci-après. Competitor antibody fragments as defined above are jointly called "antibodies or antibody fragments used in the method according to the invention" below.
[0099] L’anticorps ou le fragment d’anticorps mis en œuvre dans le procédé selon l’invention peut se lier a la protéine G alpha sous une forme isolée et/ou présente dans un environnement membranaire, par exemple il peut se lier a une protéine G alpha présente dans une préparation de membranes portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéines G alpha. Il n’est pas nécessaire que la protéine G alpha soit complexée avec le RCPG pour que l’anticorps selon l’invention puisse se lier à la protéine G alpha. [0100] L’anticorps ou le fragment d’anticorps mis en œuvre dans le procédé selon l’invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM. Une constante de The antibody or the antibody fragment used in the method according to the invention can bind to the G alpha protein in an isolated form and / or present in a membrane environment, for example it can bind to a G alpha protein present in a preparation of membranes carrying one or more RCPGs and one or more G alpha proteins. It is not necessary for the alpha G protein to be complexed with the RCPG for the antibody according to the invention to be able to bind to the alpha G protein. The antibody or the antibody fragment used in the method according to the invention can bind to the G alpha protein with a dissociation constant (Kd) measured in FRET less than or equal to 20 nM. A constant of
dissociation inférieure à 20 nM est préférable pour la bonne mise en œuvre d’un RET. Avantageusement, l’anticorps ou le fragment d’anticorps mis en œuvre dans le procédé selon l’invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM, par exemple une constante d’affinité inférieure ou égale à 10 nM ou encore inférieure ou égale à 5 nM, par exemple allant de 0 à 20 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 10 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 5 nM (0 étant exclu). Un procédé pour mesurer le Kd d’un anticorps ou d’un fragment d’anticorps selon l’invention en FRET est décrit à l’Exemple 27. dissociation less than 20 nM is preferable for the proper implementation of a RET. Advantageously, the antibody or the antibody fragment used in the method according to the invention can bind to the G alpha protein with a dissociation constant (Kd) measured in FRET less than or equal to 20 nM, for example a affinity constant less than or equal to 10 nM or even less than or equal to 5 nM, for example ranging from 0 to 20 nM (0 being excluded), ranging from 0 to 10 nM (0 being excluded), ranging from 0 to 5 nM (0 being excluded). A method for measuring the Kd of an antibody or an antibody fragment according to the invention in FRET is described in Example 27.
[0101] L’anticorps ou le fragment d’anticorps mis en œuvre dans le procédé selon l’invention est particulièrement avantageux dans la mise en œuvre du procédé selon l’invention. [0101] The antibody or the antibody fragment used in the method according to the invention is particularly advantageous in the implementation of the method according to the invention.
[0102] Par exemple, des anticorps ou fragments d’anticorps mis en œuvre dans le procédé selon l’invention peuvent être obtenus par la mise en œuvre du protocole décrit dans l’Exemple 26. [0102] For example, antibodies or antibody fragments used in the method according to the invention can be obtained by implementing the protocol described in Example 26.
[0103] Les inventeurs ont également montrés que les anticorps ou fragments [0103] The inventors have also shown that the antibodies or fragments
d’anticorps mis en œuvre dans le procédé selon l’invention se lient au domaine Switchll de la protéine G alpha, et plus particulièrement au peptide 215-294 de la protéine G alpha. of antibodies used in the method according to the invention bind to the Switchll domain of the G alpha protein, and more particularly to the 215-294 peptide of the G alpha protein.
[0104] Le premier contenant peut éventuellement contenir un agoniste du RCPG. [0104] The first container may optionally contain a RCPG agonist.
Des agonistes de RCPG sont largement décrits dans la littérature, par exemple dans le Tableau 1 de la demande WO2011/018586. GPCR agonists are widely described in the literature, for example in Table 1 of application WO2011 / 018586.
[0105] Etape b) [0105] Step b)
[0106] L’étape b) consiste à mesurer le signal de RET émis dans le premier [0106] Step b) consists of measuring the RET signal emitted in the first
contenant, c’est-à-dire le contenant obtenu à l’étape a). Le signal mesuré correspond au signal obtenu dans le contenant en absence de la molécule à tester. La mesure peut se faire par des méthodes conventionnelles largement connues de l’homme du métier et ne pose pas de problème particulier. On utilise généralement un appareil qui permet de détecter et de mesurer le signal de RET, comme par exemple le lecteur de microplaques PHERAstar FS (BMG Labtech) avec le mode de lecture TR-FRET ou bioluminescence. container, that is to say the container obtained in step a). The signal measured corresponds to the signal obtained in the container in the absence of the molecule to be tested. The measurement can be done by conventional methods widely known to those skilled in the art and do not pose any particular problem. Usually a device is used which can detect and measure the RET signal, like for example the PHERAstar FS microplate reader (BMG Labtech) with the reading mode TR-FRET or bioluminescence.
[0107] Etape c) [0107] Step c)
[0108] Dans un mode de réalisation, l’étape c) consiste à introduire dans un second contenant les mêmes réactifs qu’à l’étape a) et la molécule à tester. [0108] In one embodiment, step c) consists of introducing into a second one containing the same reagents as in step a) and the molecule to be tested.
Avantageusement, le second contenant est préparé de la même manière que le premier contenant, la seule différence étant la présence dans le deuxième contenant de la molécule à tester. Ce mode de réalisation est avantageux car il permet d’effectuer la mesure du signal de RET émis dans le premier contenant et dans le deuxième contenant de manière simultanée. Ce mode de réalisation permet également d’effectuer la mesure simultanée du signal de RET émis dans un ou plusieurs seconds contenants. Ainsi, ce mode de réalisation est Advantageously, the second container is prepared in the same way as the first container, the only difference being the presence in the second container of the molecule to be tested. This embodiment is advantageous because it allows the measurement of the RET signal emitted in the first container and in the second container to be carried out simultaneously. This embodiment also allows the simultaneous measurement of the RET signal emitted in one or more second containers. Thus, this embodiment is
particulièrement avantageux puisqu’il permet de tester plusieurs molécules différentes en parallèle. particularly advantageous since it allows several different molecules to be tested in parallel.
[0109] Dans un autre mode de réalisation, l’étape c) consiste à introduire dans le premier contenant la molécule à tester. Ce mode de réalisation présente l’avantage de n’utiliser qu’un seul contenant pour la mise en œuvre de la méthode selon l’invention. [0109] In another embodiment, step c) consists in introducing the molecule to be tested into the first containing the molecule. This embodiment has the advantage of using only a single container for the implementation of the method according to the invention.
[0110] Etape d) [0110] Step d)
[0111] L’étape d) consiste à mesurer le signal de RET émis dans le second [0111] Step d) consists of measuring the RET signal emitted in the second
contenant ou dans le premier contenant obtenu à l’étape c). Le signal mesuré correspond au signal obtenu dans le contenant en présence de la molécule à tester. Comme à l’étape b), la mesure peut se faire par des méthodes container or in the first container obtained in step c). The signal measured corresponds to the signal obtained in the container in the presence of the molecule to be tested. As in step b), the measurement can be done by methods
conventionnelles largement connues de l’homme du métier et ne pose pas de problème particulier. On utilise généralement un appareil qui permet de détecter et de mesurer le signal de RET, comme par exemple le lecteur de microplaques PHERAstar FS (BMG Labtech) avec le mode de lecture TR-FRET ou conventional products widely known to those skilled in the art and do not pose any particular problem. Usually a device is used which can detect and measure the RET signal, such as the PHERAstar FS microplate reader (BMG Labtech) with the reading mode TR-FRET or
bioluminescence. bioluminescence.
[0112] Etape e) [0112] Step e)
[0113] L’étape e) consiste à comparer les signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l’activation du RCPG. La modulation du signal peut être soit une augmentation du signal soit une diminution du signal. Step e) consists in comparing the signals obtained in steps b) and d), a modulation of the signal obtained in step d) with respect to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is able to modulate the activation of the RCPG. Signal modulation can be either an increase in the signal or a decrease in the signal.
[0114] L’homme du métier peut aisément comparer les signaux des étapes b) et d) et définir un seuil lui permettant de qualifier la modulation, par exemple un écart entre les signaux supérieur à 5%, supérieur à 10%, supérieur à 15%, supérieur à 20% ou supérieur à 25%. On peut par exemple calculer le ratio entre les signaux des étapes b) et d). De manière générale, pour un couple de partenaires de RET donné, plus l’écart entre les signaux est important, plus le ratio entre les signaux sera important et plus la modulation de l’activation du RCPG (ex. activation ou inhibition) est importante. L’écart entre les signaux est toutefois susceptible de varier en fonction du couple de partenaires de RET utilisé pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention. Le niveau de modulation de l’activation du RCPG permet d’identifier des molécules plus ou moins agonistes, antagonistes, agonistes inverse modulateur allostérique positif ou modulateur allostérique négatif. A person skilled in the art can easily compare the signals of steps b) and d) and define a threshold allowing him to qualify the modulation, for example a difference between the signals greater than 5%, greater than 10%, greater than 15%, greater than 20% or greater than 25%. One can for example calculate the ratio between the signals of stages b) and d). In general, for a given pair of RET partners, the greater the difference between the signals, the greater the ratio between the signals and the greater the modulation of the activation of the RCPG (eg activation or inhibition). . The difference between the signals is however likely to vary depending on the pair of RET partners used for the implementation of the method according to the invention. The level of modulation of the activation of RCPG makes it possible to identify molecules that are more or less agonist, antagonist, inverse agonist positive allosteric modulator or negative allosteric modulator.
[0115] Dans un premier mode de réalisation particulier, le premier contenant ne [0115] In a first particular embodiment, the first container does not
contient pas un agoniste du RCPG et à l’étape e) une diminution du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG. does not contain a GPCR agonist and in step e) a decrease in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is a GPCR agonist.
[0116] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, le premier contenant [0116] In a second particular embodiment, the first containing
comprend un agoniste du RCPG et à l’étape e) : includes a GPCR agonist and in step e):
- une augmentation du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ; - an increase in the signal obtained in step d) relative to that obtained in step b) indicating that the test molecule is an antagonist or a negative allosteric modulator of GPCR;
- une diminution du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG. - a decrease in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is an agonist or a positive allosteric modulator of GPCR.
[0117] Dans un troisième mode de réalisation particulier, le premier contenant ne comprend pas un agoniste du RCPG et à l’étape e) une augmentation du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG. In a third particular embodiment, the first container does not include a GPCR agonist and in step e) an increase in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is a GPCR agonist.
[0118] Dans un quatrième mode de réalisation particulier, le premier contenant [0118] In a fourth particular embodiment, the first containing
comprend un agoniste du RCPG et à l’étape e) : - une diminution du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ; includes a GPCR agonist and in step e): a decrease in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is an antagonist or a negative allosteric modulator of RCPG;
- une augmentation du signal obtenu à l’étape d) par rapport à celui obtenu à l’étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG. - an increase in the signal obtained in step d) relative to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is a positive agonist or allosteric modulator of GPCR.
[0119] Marquage du ligand par un membre d’un couple de partenaires de RET [0119] Labeling of the ligand by a member of a pair of RET partners
[0120] Le ligand peut être marqué de manière directe ou indirecte. [0120] The ligand can be labeled directly or indirectly.
[0121] Le marquage direct du ligand par un membre d’un couple de partenaires de RET, par exemple un composé fluorescent quand on met en œuvre un FRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l’homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur le ligand. Par exemple, lorsque le ligand est un anticorps ou un fragment d’anticorps, les groupes réactifs suivants peuvent être utilisés : le groupe amino terminal, les groupes The direct labeling of the ligand by a member of a pair of RET partners, for example a fluorescent compound when a FRET is used, can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art, based on the presence of reactive groups on the ligand. For example, when the ligand is an antibody or an antibody fragment, the following reactive groups can be used: terminal amino group, groups
carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines. carboxylates of aspartic and glutamic acids, amino groups of lysines, guanidine groups of arginines, thiol groups of cysteines, phenol groups of tyrosines, indole rings of tryptophanes, thioether groups of methionines, imidazole groups of histidines.
[0122] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par le ligand. Les groupes réactifs appropriés, portés par le ligand, sont bien connus de l’homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par une protéine ou un peptide, par exemple un anticorps ou un fragment d’anticorps. De même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine présente une protéine ou un peptide. [0122] The reactive groups can form a covalent bond with a reactive group carried by the ligand. The appropriate reactive groups, carried by the ligand, are well known to those skilled in the art, for example a donor compound or an acceptor compound functionalized by a maleimide group will, for example, be capable of bonding covalently with the thiol groups carried by cysteines carried by a protein or a peptide, for example an antibody or an antibody fragment. Likewise, a donor / acceptor compound bearing an N-hydroxysuccinimide ester will be able to covalently attach to an amine present in a protein or peptide.
[0123] Le ligand peut également être marqué par un composé fluorescent ou The ligand can also be labeled with a fluorescent compound or
bioluminescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu de mesure un anticorps ou un fragment d’anticorps, lui-même lié de manière covalente à un composé accepteur / donneur, ce deuxième anticorps ou fragment d’anticorps reconnaissant de manière spécifique le ligand. [0124] Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur le ligand à marquer, puis d’incuber ce ligand biotinylé en présence de streptavidine marquée par un composé accepteur / donneur. Des ligands biotinylés appropriés peuvent être préparés par des techniques bien connues de l’homme du métier ; la société Cisbio Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec un fluorophore dont la dénomination commerciale est « d2 » (réf. 610SADLA). indirectly bioluminescent, for example by introducing into the measurement medium an antibody or an antibody fragment, itself covalently linked to an acceptor / donor compound, this second antibody or antibody fragment specifically recognizing the ligand. Another very conventional indirect labeling means consists in attaching biotin to the ligand to be labeled, then incubating this biotinylated ligand in the presence of streptavidin labeled with an acceptor / donor compound. Suitable biotinylated ligands can be prepared by techniques well known to those skilled in the art; the company Cisbio Bioassays markets, for example, streptavidin labeled with a fluorophore, the trade name of which is “d2” (ref. 610SADLA).
[0125] Dans le cadre de l’invention, le ligand est marqué par (i) un composé [0125] In the context of the invention, the ligand is labeled with (i) a compound
fluorescent donneur ou luminescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). De préférence, le ligand est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). fluorescent donor or luminescent donor, or (ii) a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher). Preferably, the ligand is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
[0126] Marquage du GTP non-hvdrolvsable ou lentement hvdrolvsable par un [0126] Marking of the non-hvdrolvsable or slowly hvdrolvsable GTP by a
membre d’un couple de partenaires de RET member of a couple of RET partners
[0127] Le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable peut être marqué de manière directe ou indirecte. De préférence, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué de manière directe. [0127] The non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP can be labeled directly or indirectly. Preferably, the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is directly labeled.
[0128] Le marquage direct du GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable par un membre d’un couple de partenaires de RET, par exemple un composé fluorescent quand on met en œuvre un FRET, peut être effectué par les méthodes reposant sur la présence de groupes réactifs sur le GTP non- hydrolysable ou lentement hydrolysable. The direct labeling of non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP by a member of a pair of RET partners, for example a fluorescent compound when a FRET is used, can be carried out by the methods based on the presence of reactive groups on non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP.
[0129] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d’un couple de partenaires de RET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d’un couple de partenaires de RET, sont bien connus de l’homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols. De même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine. [0129] The reactive groups can form a covalent bond with a reactive group carried by a member of a pair of RET partners. The appropriate reactive groups, carried by the member of a pair of RET partners, are well known to those skilled in the art, for example a donor compound or an acceptor compound functionalized by a maleimide group will for example be capable of binding covalently with thiol groups. Likewise, a donor / acceptor compound bearing an N-hydroxysuccinimide ester will be able to covalently attach to an amine.
[0130] Dans le cadre de l’invention, le GTP non-hydrolysable ou lentement [0130] In the context of the invention, the non-hydrolyzable or slowly GTP
hydrolysable est marqué par (i) un composé fluorescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). De préférence, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent donneur. hydrolyzable is labeled with (i) a fluorescent donor compound, or (ii) a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher). Preferably, the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is labeled with a donor fluorescent compound.
[0131] Dans un mode de réalisation particulier, le GTP non-hydrolysable ou [0131] In a particular embodiment, the non-hydrolyzable GTP or
lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent donneur et le ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). Dans un autre mode de réalisation particulier, le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher) et ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur. slowly hydrolyzable is labeled with a fluorescent donor compound and the Galpha protein ligand is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher). In another particular embodiment, the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher) and ligand of the Galpha protein is labeled with a fluorescent donor or luminescent donor compound.
[0132] Marquage pour la mise en œuyre d’un FRET [0132] Marking for the implementation of a FREIGHT
[0133] Dans un mode de réalisation particulier, le ligand et le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable sont chacun marqués par un membre d’un couple de partenaires de FRET, c’est à dire un composé fluorescent donneur ou un composé fluorescent accepteur d’énergie. In a particular embodiment, the ligand and the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP are each labeled with a member of a pair of FRET partners, that is to say a fluorescent donor compound or a fluorescent acceptor compound. of energy.
[0134] La sélection du couple de partenaires de FRET pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. Par exemple, des couples donneur- accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd édition 338), auquel l’homme du métier pourra se référer. [0134] The selection of the pair of FRET partners to obtain a FRET signal is within the abilities of those skilled in the art. For example, donor-acceptor pairs used to study phenomena FRET are described in the book by Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition 338), to which the skilled person may refer.
[0135] Composés fluorescents donneurs [0135] Fluorescent donor compounds
[0136] Les composés fluorescents donneurs d’énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise dans la gamme allant de 0,5 à 6 ms), en particulier les complexes de lanthanide c’est-à-dire les chélates, les macrocycles ou cryptâtes de terres rares sont avantageux puisqu’ils permettent d’effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET (en langue anglaise, « Time Resolved FRET ») en s’affranchissant d’une grande partie du bruit de fond émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention. Avantageusement, ces composés sont des complexes de [0136] Fluorescent energy-donor compounds with a long lifespan (> 0.1 ms, preferably in the range from 0.5 to 6 ms), in particular lanthanide complexes, that is to say to say chelates, macrocycles or cryptates of rare earths are advantageous since they make it possible to carry out measurements in resolved time, that is to say to measure signals of TR-FRET (in English, "Time Resolved FRET ») By avoiding a large part of the background noise emitted by the measurement medium. They are for this reason and generally preferred for the implementation of the method according to the invention. Advantageously, these compounds are complexes of
lanthanides. Ces complexes (tels que chélates ou cryptâtes) sont lanthanides. These complexes (such as chelates or cryptates) are
particulièrement appropriés en tant que membre du couple de FRET donneur d’énergie. [0137] Les complexes d’europium (Eu3+), de terbium (Tb3+), de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodymium (Nd3+), d’ytterbium (Yb3+) ou encore d’erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l’invention, les complexes d’europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) étant particulièrement préférés. particularly suitable as a member of the energy donor FRET couple. [0137] The complexes of europium (Eu3 +), terbium (Tb3 +), dysprosium (Dy3 +), samarium (Sm3 +), neodymium (Nd3 +), ytterbium (Yb3 +) or even erbium (Er3 +) are rare earth complexes also suitable for the purposes of the invention, the complexes of europium (Eu3 +) and terbium (Tb3 +) being particularly preferred.
[0138] De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés Perkin Elmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays. A very large number of rare earth complexes have been described and several are currently sold by the companies Perkin Elmer, Invitrogen and Cisbio Bioassays.
[0139] Des exemples de chélates ou cryptâtes de terres rares appropriés aux fins de l’invention sont : [0139] Examples of rare earth chelates or cryptates suitable for the purposes of the invention are:
[0140] - Les cryptâtes de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. [0140] - Lanthanide cryptates, comprising one or more pyridine units.
De tels cryptâtes de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les cryptâtes de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont Such rare earth cryptates are described for example in patents EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 and in international application WO 01/96 877. Cryptates of terbium (Tb3 +) and europium ( Eu3 +) are
particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptâtes de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d’exemple non limitatif les cryptâtes d’europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) : particularly suitable for the purposes of the present invention. Lanthanide cryptates are marketed by the company Cisbio Bioassays. By way of nonlimiting example, mention may be made of the europium cryptates of formulas below (which can be coupled to the compound to be labeled via a reactive group, here for example an NH 2 group):
[0141] [0141]
[0142] [0142]
[0143] [0143]
[0144] [0144]
[0145] - Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 [0145] The lanthanide chelates described in particular in US Patents 4
761 481 , US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481 , US 4 801 722, US 4 794 191 , US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5761,481, US 5,032,677, US 5,055,578, US 5,106,957, US 5,116,989, US 4,761,481, US 4,801,722, US 4,794,191, US 4,637,988, US 4,670,572, US 4 837,169, US 4,859,777. Patents EP 0 403 593, US 5,324,825, US 5,202,423, US 5
316 909 décrivent des chélates composés d’un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société Perkin Elmer. 316,909 describe chelates composed of a nonadentate ligand such as terpyridine. Lanthanide chelates are marketed by the company Perkin Elmer.
[0146] - Des complexes de lanthanides constitués d’un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024“Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo”, peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO [0146] - Lanthanide complexes consisting of a chelating agent, such as tetraazacyclododecane, substituted with a chromophore comprising aromatic rings, such as those described by Poole R. et al. in Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 “Synthesis and characterization of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for use in cellulo”, can also be used. It is also possible to use the complexes described in application WO
2009/10580. 2009/10580.
[0147] - Les cryptâtes de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP [0147] The lanthanide cryptates described in patents EP 1 154 991 and EP
1 154 990 sont également utilisables. 1,154,990 can also be used.
[0148] - Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) : [0148] - The terbium cryptate of formula below (which can be coupled to a compound to be labeled via a reactive group, here for example an NH 2 group):
[0149] [0149]
[0150] et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO [0150] and the synthesis of which is described in international application WO
2008/063721 (composé 6a page 89). 2008/063721 (compound 6a page 89).
[0151] - Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays. [0152] - Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous[0151] The terbium cryptate Lumi4-Tb from the company Lumiphore, marketed by Cisbio Bioassays. [0152] - The quantum dye from Research Organics, of formula below
(qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) : (which can be coupled to the compound to be labeled via a reactive group, here NCS):
[0153] [0153]
[0154] - Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d’un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(ll) tris(2,2’- bipyridine). [0154] - Ruthenium chelates, in particular the complexes consisting of a ruthenium ion and several bipyridines such as ruthenium (II) tris (2,2′-bipyridine).
[0155] - Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain [0155] - The terbium chelate DTPA-cs124 Tb, marketed by the company Life technologies with the formula below (which can be coupled to the compound to be labeled via a reactive group R) and whose synthesis is described in the American patent
US 5 622 821. US 5,622,821.
[0156] [0156]
[0157] - Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et [0157] - The terbium chelate of formula below and described by Latva and
al (Journal of Luminescence 1997, 75(2): 149-169) : al (Journal of Luminescence 1997, 75 (2): 149-169):
[0158] [0158]
[0159] Avantageusement, le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d’europium, un chélate d’europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les Advantageously, the fluorescent donor compound is a FRET partner chosen from: a europium cryptate, a europium chelate, a terbium chelate, a terbium cryptate, a ruthenium chelate, a quantum dot, allophycocyanins , rhodamines, cyanines, squaraines,
coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole. coumarins, proflavins, acridins, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives and nitrobenzoxadiazole.
[0160] De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d’europium; un chélate d’europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dot ; les chélates et les cryptâtes d’europium et de terbium étant particulièrement préférés. [0160] In a particularly advantageous manner, the fluorescent donor compound is a FRET partner chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate; a ruthenium chelate; and a quantum dot; the chelates and cryptates of europium and terbium being particularly preferred.
[0161] Des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqués par un [0161] Non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTPs labeled with a
composé fluorescent donneur susceptibles d’être utilisé dans la méthode FRET de l’invention sont représentés par les formules générales (1 ) et (2a, 2b, 2c) ci- dessous : fluorescent donor compound that may be used in the FRET method of the invention are represented by the general formulas (1) and (2a, 2b, 2c) below:
[01 62] [01 62]
[0163] Le marquage des analogues du GTP peut être effectué sur différentes [0163] The labeling of the GTP analogues can be carried out on different
positions du GTP : GTP positions:
- en position gamma du phosphate (O, NH, CH2), ou - in the gamma position of the phosphate (O, NH, CH 2 ), or
- sur les positions 2’ et 3’ du ribose - on positions 2 ’and 3’ of ribose
[0164] Dans un mode de réalisation particulier, des GTP non-hydrolysable ou [0164] In a particular embodiment, non-hydrolyzable GTPs or
lentement hydrolysable marqués par un composé fluorescent donneur susceptibles d’être utilisé dans la méthode FRET de l’invention sont représentés par la formule générale (I) : slowly hydrolyzable labeled with a fluorescent donor compound capable of being used in the FRET method of the invention are represented by the general formula (I):
[0165] [0165]
dans laquelle : in which :
X = O, NH ou CH2 ; X = O, NH or CH 2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ; Y = 0, NH or CH 2 ;
L est un groupe de liaison divalent ; L is a divalent linking group;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3. Ln 3+ is a lanthanide complex optionally carrying a reactive group G 3 .
[0166] On entend par « complexe de lanthanide » un chélate, un macrocycle, un cryptate ou toute espèce organique capable de complexer un atome de la famille des lanthanides, le lanthanide (Ln) étant choisi parmi : Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, Er, de préférence le lanthanide est Tb, Sm ou Eu et de manière encore plus préférée Eu ou Tb. [0167] Les composés pour lesquels Y = O sont appelés analogues GTP-gamma-O. Les composés pour lesquels Y = NH sont appelés analogues GTP-gamma-N.The term “lanthanide complex” is understood to mean a chelate, a macrocycle, a cryptate or any organic species capable of complexing an atom of the lanthanide family, the lanthanide (Ln) being chosen from: Eu, Sm, Tb, Gd , Dy, Nd, Er, preferably the lanthanide is Tb, Sm or Eu and even more preferably Eu or Tb. The compounds for which Y = O are called GTP-gamma-O analogs. Compounds for which Y = NH are called GTP-gamma-N analogs.
Les composés pour lesquels Y = CH2 sont appelés analogues GTP-gamma-C. Compounds for which Y = CH 2 are called GTP-gamma-C analogs.
[0168] Le groupe de liaison divalent L est avantageusement choisi parmi : The divalent linking group L is advantageously chosen from:
- une liaison directe; - a direct link;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ; - a linear or branched C 1 -C 20 , preferably C 1 -C 8 , alkylene group optionally containing one or more double or triple bonds;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8 ; ou - a C 5 -C 8 cycloalkylene group; or
. un groupe arylène en C6-C14 ; . a C 6 -C 14 arylene group;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l’oxygène, l’azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo. said alkylene, cycloalkylene or arylene groups optionally containing one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxamido group (s), and said alkylene, cycloalkylene or arylene groups being optionally substituted with 1 to 5, preferably 1 to 3, C 1 -C 8 alkyl, C 6 -C 14 aryl, sulfonate or oxo groups.
[0169] Encore plus avantageusement, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi les groupes suivants : Even more advantageously, the divalent linking group L is chosen from the following groups:
[0170] [0170]
[0171] dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4. [0172] De manière tout à fait avantageuse, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi une liaison directe, un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C-i-Ce ou un groupe de formule : [0171] in which n, m, p, q are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5 and e is an integer ranging from 1 to 6, preferably from 1 to 4. Very advantageously, the divalent linking group L is chosen from a direct link, a linear or branched C1-C6 alkylene group or a group of formula:
[0173] [0173]
[0174] Le groupe de liaison divalent L est de préférence choisi parmi : The divalent linking group L is preferably chosen from:
[0175] [0175]
le groupe -(CH2)n- étant tout particulièrement préféré. the group - (CH2) n- being very particularly preferred.
[0176] Le groupe L peut également avantageusement être un groupe de formule : The group L can also advantageously be a group of formula:
dans laquelle m, n et p sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5. wherein m, n and p are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5.
[0177] Le groupe réactif G3 est choisi parmi l’un des groupes suivants : un The reactive group G 3 is chosen from one of the following groups: a
acrylamide, une amine éventuellement activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d’alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d’acide, un ester de succinimidyle, un ester d’hydroxysuccinimidyle, un ester d’hydroxysulfosuccinimidyle, un acrylamide, an optionally activated amine (eg cadaverine or ethylenediamine), activated ester, aldehyde, alkyl halide, anhydride, aniline, azide, aziridine, carboxylic acid, diazoalkane, haloacetamide , halotriazine, such as monochlorotriazine, dichlorotriazine, hydrazine (including hydrazides), imido ester, isocyanate, isothiocyanate, maleimide, sulfonyl halide, thiol, ketone, acid halide , a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a hydroxysulfosuccinimidyl ester, a
azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules : azidonitrophenyl, an azidophenyl, a 3- (2-pyridyldithio) -propionamide, a glyoxal, a triazine, an acetylenic group, and in particular a group chosen from the groups of formulas:
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. in which w varies from 0 to 8 and v is equal to 0 or 1, and Ar is a 5 or 6 membered saturated or unsaturated heterocycle, comprising 1 to 3 heteroatoms, optionally substituted by a halogen atom.
De manière préférée, le groupe réactif G3 est choisi parmi une amine Preferably, the reactive group G3 is chosen from an amine
(éventuellement protégée sous forme -NHBoc), un ester de succinimidyle, un ester d’hydroxysuccinimidyle un haloacétamide, une hydrazine, une halotriazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d’un groupe -CC>2Me, -CC>2tBu). Dans ce dernier cas, l’acide devra être activé sous forme d’ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile. (optionally protected as -NHBoc), a succinimidyl ester, a hydroxysuccinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, a halotriazine, an isothiocyanate, a maleimide group, or a carboxylic acid (optionally protected as a group - CC> 2Me, -CC> 2tBu). In the latter case, the acid will have to be activated as an ester in order to react with a species nucleophile.
Le complexe de lanthanide Ln3+ est avantageusement choisi parmi l’un des complexes ci-après : The lanthanide complex Ln3 + is advantageously chosen from one of the complexes below:
[0178] [0178]
[0179] Avantageusement, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17, C24 à C32 et C36 à C44. De manière plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17 et C36 à C44. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C4 et C11 à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l’un des complexes C1 à C4 et C11. De manière tout à fait avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est le complexe C2 ou le complexe C3. Advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17, C24 to C32 and C36 to C44. More advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17 and C36 to C44. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C17. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C11 to C17. Even more advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is chosen from one of the complexes C1 to C4 and C11. Very advantageously, the lanthanide complex Ln 3+ is the C2 complex or the C3 complex.
[0180] La préparation des analogues de GTP susmentionnés est décrite soit dans la littérature, soit dans la demande de brevet français déposée le 30 janvier 2019 sous le numéro FR 19 00856. The preparation of the aforementioned GTP analogs is described either in the literature or in the French patent application filed on January 30, 2019 under number FR 19 00856.
[0181] Avantageusement, l’analogue de GTP marqué par un composé fluorescent donneur peut être choisi parmi GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl- C1 1 (GTP-gamma-N-octyl-C1 1 ), GTPgN-octyl-C3 (GTP-gamma-N-octyl-C3), GTPgO-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPgO-hexyl-C3 (GTP-gamma-O- hexyl-C3) ou GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl- thiosuccinimidyl-C2), présentés ci-dessous. Advantageously, the GTP analog labeled with a fluorescent donor compound can be chosen from GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl- C2 (GTP-gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl- C1 1 (GTP-gamma-N-octyl-C1 1), GTPgN-octyl-C3 (GTP-gamma-N-octyl-C3), GTPgO-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPgO -hexyl-C3 (GTP-gamma-O-hexyl-C3) or GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-C2), shown below.
5 [0182] 5 [0182]
[0183] Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’analogue de GTP [0183] In a particularly preferred embodiment, the analogue of GTP
marqué par un composé fluorescent donneur est le GTP-gN-octyl- thiosuccinimidyl-C2. labeled with a fluorescent donor compound is GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
[0184] Composés fluorescents accepteurs [0184] Fluorescent acceptor compounds
[0185] Les composés fluorescents accepteurs peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la [0185] The fluorescent acceptor compounds can be chosen from the following group: allophycocyanins, in particular those known under the
dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les trade name XL665; luminescent organic molecules, such as rhodamines, cyanines (for example Cy5),
squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives (marketed under the name
« Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les “Bodipy”), the fluorophores known under the name “Atto”, the fluorophores known under the name “DY”, the compounds known under the name “Alexa”, nitrobenzoxadiazole. Advantageously, the
composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le fluorescent acceptor compounds are chosen from allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives,
nitrobenzoxadiazole. nitrobenzoxadiazole.
[0186] Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être The expressions “cyanines” and “rhodamines” must be
respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L’homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce. respectively understood as “cyanine derivatives” and “rhodamine derivatives”. Those skilled in the art are familiar with these various fluorophores, which are commercially available.
[0187] Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » sont commercialisés par la société Attotec ; les composés « DY » sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros. The “Alexa” compounds are sold by the company Invitrogen; the “Atto” compounds are marketed by the company Attotec; the “DY” compounds are marketed by the company Dyomics; the "Cy" compounds are sold by the company Amersham Biosciences; the other compounds are marketed by various suppliers of chemical reagents, such as the companies Sigma, Aldrich or Acros.
[0188] Les protéines fluorescentes suivantes peuvent également être utilisées en tant que composé fluorescent accepteur : les protéines fluorescentes cyans (AmCyanl , Midori-lshi Cyan, mTFP1 ), les protéines fluorescentes vertes (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), les protéines [0188] The following fluorescent proteins can also be used as fluorescent acceptor compound: cyans fluorescent proteins (AmCyanl, Midori-lshi Cyan, mTFP1), green fluorescent proteins (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen ), the proteins
fluorescentes jaunes (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellowl , mBanana), les protéines fluorescentes oranges et rouges (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2, mRFP1 , JRed, mCherry, mStrawberry, FIcRedl , mRaspberry, FIcRed-Tandem, mPlim, AQ143), les protéines fluorescentes dans le rouge lointain (mKate, mKate2, tdKatushka2). fluorescent yellow (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellowl, mBanana), fluorescent orange and red proteins (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRedTanger2 ,Red-Monomer, monomer mRFP1, JRed, mCherry, mStrawberry, FIcRedl, mRaspberry, FIcRed-Tandem, mPlim, AQ143), far red fluorescent proteins (mKate, mKate2, tdKatushka2).
[0189] Avantageusement, pour le ligand de la protéine Galpha, le composé Advantageously, for the ligand of the Galpha protein, the compound
fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les fluorescent acceptor is a FRET partner chosen from:
allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines,
coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole et un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed. coumarins, proflavins, acridins, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazole and a quantum dot, GFP, GFP variants chosen from GFP10, GFP2 and eGFP, YFP, YFP variants chosen from eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus and YPet, mOrange, DsRed.
[0190] Avantageusement, pour l’analogue de GTP marqué, le composé fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole. Advantageously, for the labeled GTP analog, the fluorescent acceptor compound is a FRET partner chosen from: rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron derivatives -dipyrromethene and nitrobenzoxadiazole.
[0191] Des GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqués par un [0191] Non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTPs labeled with a
composé fluorescent accepteur susceptibles d’être utilisé dans la méthode FRET de l’invention sont représentés par les formules générales (3) et (4a, 4b, 4c) ci- dessous : fluorescent acceptor compound likely to be used in the FRET method of the invention are represented by the general formulas (3) and (4a, 4b, 4c) below:
[0192] [0192]
[0193] Le marquage des analogues du GTP peut être effectué sur différentes [0193] The labeling of the GTP analogues can be carried out on different
positions du GTP : GTP positions:
- en position gamma du phosphate (O, NH, CH2) ; ou - in the gamma position of the phosphate (O, NH, CH 2 ); or
- sur les positions 2’ et 3’ du ribose. - on the 2 ’and 3’ positions of ribose.
[0194] Dans un mode de réalisation particuliers, des GTP non-hydrolysable ou [0194] In a particular embodiment, non-hydrolyzable GTPs or
lentement hydrolysable marqué par un composé fluorescent accepteur slowly hydrolyzable labeled with a fluorescent acceptor compound
susceptibles d’être utilisé dans la méthode de l’invention peuvent être choisi parmi les GTPgO-Linker-Cy5(P) (GTP-gO-hexyl-Cy5 diS03-) (Jena Bioscience - NU-834-CY5), GTPgS-Linker-Cy5(R) (GTP-gS-EDA-Cy5) (Jena Bioscience - NU- 1610-CY5), GTPgN-octyl-AF488 (GTP-gN-octyl-AF488) (Cisbio Bioassays), GTPgN-L18-Fluorescein (GTP-gN-EDA-pentyl-Fluoresceine) (Cisbio Bioassays) et GTPgN-octyl-CY5 (GTP-gN-octyl-Cy5) (Cisbio Bioassays) et sont représentés par les formules suivantes : that can be used in the method of the invention can be chosen from GTPgO-Linker-Cy5 (P) (GTP-gO-hexyl-Cy5 diS03-) (Jena Bioscience - NU-834-CY5), GTPgS-Linker -Cy5 (R) (GTP-gS-EDA-Cy5) (Jena Bioscience - NU- 1610-CY5), GTPgN-octyl-AF488 (GTP-gN-octyl-AF488) (Cisbio Bioassays), GTPgN-L18-Fluorescein ( GTP-gN-EDA-pentyl-Fluoresceine) (Cisbio Bioassays) and GTPgN-octyl-CY5 (GTP-gN-octyl-Cy5) (Cisbio Bioassays) and are represented by the following formulas:
[0195] [0195]
[0196] Marquage pour la mise en œuyre d’un BRET [0196] Marking for the implementation of a BRET
[0197] Dans un mode de réalisation particulier, le ligand est marqué par un membre d’un couple de partenaires de BRET, c’est à dire un composé luminescent donneur ou un composé fluorescent accepteur d’énergie. [0197] In a particular embodiment, the ligand is labeled with a member of a pair of BRET partners, that is to say a luminescent donor compound or a fluorescent energy acceptor compound.
[0198] Le marquage direct du ligand par un composé luminescent donneur ou un composé fluorescent accepteur de type protéine, membre d’un couple de partenaires de BRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l’homme du métier et notamment décrites dans l'article de Tarik Issad et Ralf Jockers (Bioluminescence Résonance Energy Transfer to Monitor Protein-Protein Interactions, Transmembrane Signaling Protocols pp 195-209, Part of the Methods in Molecular Biology™ book sériés MIMB, volume 332) auquel l’homme du métier pourra se référer. The direct labeling of the ligand with a luminescent donor compound or a fluorescent acceptor compound of protein type, member of a pair of BRET partners, can be carried out by the conventional methods known to those skilled in the art and in particular described in the article by Tarik Issad and Ralf Jockers (Bioluminescence Résonance Energy Transfer to Monitor Protein-Protein Interactions, Transmembrane Signaling Protocols pp 195-209, Part of the Methods in Molecular Biology ™ book MIMB series, volume 332) to which those skilled in the art may refer.
[0199] Le marquage direct du ligand ou du GTP non-hydrolysable ou lentement The direct labeling of the ligand or of the non-hydrolyzable GTP or slowly
hydrolysable par un composé fluorescent accepteur de type molécule organique, membre d’un couple de partenaires de BRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l’homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur le ligand comme cité ci-dessus. hydrolyzable by a fluorescent acceptor compound of organic molecule type, member of a pair of BRET partners, can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art, based on the presence of reactive groups on the ligand as mentioned above. above.
[0200] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d’un couple de partenaires de BRET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d’un couple de partenaires de BRET, sont bien connus de l’homme du métier, par exemple un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par une protéine ou un peptide, par exemple un anticorps ou un fragment d’anticorps. De même, un composé accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine présente une protéine ou un peptide. [0200] The reactive groups can form a covalent bond with a reactive group carried by a member of a BRET partner pair. The appropriate reactive groups, carried by the member of a pair of BRET partners, are well known to those skilled in the art, for example an acceptor compound functionalized by a maleimide group will for example be capable of binding covalently with the thiol groups carried by the cysteines carried by a protein or a peptide, for example an antibody or an antibody fragment. Likewise, an acceptor compound bearing an N-hydroxysuccinimide ester will be able to covalently bind to an amine present in a protein or peptide.
[0201] La sélection du couple de partenaires de BRET pour obtenir un signal de [0201] The selection of the pair of BRET partners to obtain a signal of
BRET est à la portée de l'homme du métier. Par exemple, des couples donneur- accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de BRET sont notamment décrits dans l'article de Dasiel O. Borroto-Escuela (BIOLUMINISCENCE BRET is within the reach of those skilled in the art. For example, donor-acceptor pairs that can be used to study BRET phenomena are described in particular in the article by Dasiel O. Borroto-Escuela (BIOLUMINISCENCE
RESONANCE ENERGY TRANSFER (BRET) METHODS TO STUDY G RESONANCE ENERGY TRANSFER (BRET) METHODS TO STUDY G
PROTEIN-COUPLED RECEPTOR-RECEPTOR TYROSINE KINASE PROTEIN-COUPLED RECEPTOR-RECEPTOR TYROSINE KINASE
HETERORECEPTOR COMPLEXES, Methods Cell Biol. 2013 ; 117: 141-164), auquel l’homme du métier pourra se référer. HETERORECEPTOR COMPLEXES, Methods Cell Biol. 2013; 117: 141-164), to which those skilled in the art may refer.
[0202] Composés luminescents donneurs [0202] Luminescent donor compounds
[0203] Dans un mode de réalisation particulier, le composé luminescent donneur est un partenaire de BRET choisi parmi : la Luciférase (lue), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase. [0203] In a particular embodiment, the luminescent donor compound is a BRET partner chosen from: Luciferase (read), Renilla Luciferase (Rluc), variants of Renilla Luciferase (Rluc8) and Firefly Luciferase.
[0204] Composés fluorescents accepteur [0204] Fluorescent acceptor compounds
[0205] Dans un mode de réalisation particulier, le composé fluorescent accepteur est un partenaire de BRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP (GFP10, GFP2, eGFP), la YFP, les variants YFP (eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus, YPet), le mOrange, le DsRed. In a particular embodiment, the fluorescent acceptor compound is a BRET partner chosen from: allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazole, quantum dot, GFP, GFP variants (GFP10, GFP2, eGFP), YFP, YFP variants (eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus, YPet) , mOrange, DsRed.
[0206] EXEMPLES [0206] EXAMPLES
[0207] Matériel [0207] Material
[0208] - les préparations membranaires de cellules exprimant les récepteurs étudiés et la protéine Galphai ont été achetées chez Perkin Elmer ou [0208] the membrane preparations of cells expressing the studied receptors and the Galphai protein were purchased from Perkin Elmer or
Euroscreen. Le tableau ci-dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons utilisés : Euroscreen. The table below lists the cell backgrounds and references of the different samples used:
[0209] [Table 1] [0209] [Table 1]
[0210] - les anticorps DSV36S et DSV38S ont été générés par Cisbio Bioassays et sont disponibles auprès de Cisbio Bioassays sur demande (sous les références respectives DSV36S et DSV38S). L’anticorps DSV36S comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 14 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d’acide aminé SEQ ID NO : 15. Les anticorps ont été marqués avec les sondes fluorescentes compatibles pour une détection TR-FRET [0210] - the DSV36S and DSV38S antibodies were generated by Cisbio Bioassays and are available from Cisbio Bioassays on request (under the respective references DSV36S and DSV38S). The DSV36S antibody comprises a heavy chain variable domain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 14 and a light chain variable domain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15. antibodies were labeled with compatible fluorescent probes for TR-FRET detection
(accepteur rouge - d2 ou donneur Lumi4Tb). Les deux anticorps DSV36S et DSV38S se lient au niveau du domaine switch II de la protéine Galphai. (red acceptor - d2 or Lumi4Tb donor). The two antibodies DSV36S and DSV38S bind to the switch II domain of the Galphai protein.
[0211] - les nucléotides GTP, GDP et GTPYS ont été achetés chez Sigma Aldrich [0211] - the nucleotides GTP, GDP and GTPYS were purchased from Sigma Aldrich
(références catalogues respectives G8877, G7127 et G8634). (respective catalog references G8877, G7127 and G8634).
[0212] - les agonistes des RCPG Delta Opioïde (SNC162) et Dopamine D2S[0212] - agonists of GPCR Delta Opioid (SNC162) and Dopamine D2S
(PPHT) et l’antagoniste du RCPG Delta Opioïde (Naltrindole) ont été achetés chez Tocris (références catalogues respectives 1529 et 0740). (PPHT) and the RCPG Delta Opioid antagonist (Naltrindole) were purchased from Tocris (catalog number 1529 and 0740, respectively).
[0213] - les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été [0213] - the 384-well Low volume white plates with a white background were
achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075). [0214] - Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores donneurs ou accepteurs (GTPgN-C2 ; GTPgN- C3 ; GTPgN-octyl-C2 ; GTPgN-octyl-C11 ; GTPgN-octyl-C3 ; GTPgO-hexyl-C2 ; GTPgO-hexyl-C3 ; GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 ; GTPgN-octyl-Cy5 ; purchased from Greiner Bio One (Catalog reference 784075). [0214] - Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogues labeled with donor or acceptor fluorophores (GTPgN-C2; GTPgN-C3; GTPgN-octyl-C2; GTPgN-octyl-C11; GTPgN-octyl-C3; GTPgO-hexyl -C2; GTPgO-hexyl-C3; GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2; GTPgN-octyl-Cy5;
GTPgN-octyl-AF488) ont été synthétisés à Cisbio Bioassays. GTPgN-octyl-AF488) were synthesized at Cisbio Bioassays.
[0215] - Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable [0215] - Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogues
marqués avec des fluorophores accepteurs GTPgO-Linker-Cy5(P) et GTPgS- Linker-Cy5(R) ont été achetés chez Jena Bioscience sous les références respectives NU-834-CY5 et NU-1610-CY5. labeled with GTPgO-Linker-Cy5 (P) and GTPgS-Linker-Cy5 (R) acceptor fluorophores were purchased from Jena Bioscience under the respective references NU-834-CY5 and NU-1610-CY5.
[0216] Méthode [0216] Method
[0217] Préparation des réactifs [0217] Preparation of reagents
[0218] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 10mM, BSA 0,1 %, NaCI 10mM ou 100mM ou 300mM ou 500mM (concentration spécifiée dans la légende de chaque figure), 0 ou 0.5 ou 1 mM GDP [0218] All the reagents were diluted in 50mM TrisHCl buffer pH 7.4, 10mM MgCl2, 0.1% BSA, 10mM or 100mM or 300mM or 500mM NaCl (concentration specified in the legend of each figure), 0 or 0.5 or 1 mM GDP
(concentration spécifiée dans la légende de chaque figure). Les membranes ont été préparées 4X pour distribuer 1 ou 10pg/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure). Le nucléotide GTPgS (condition signal non (concentration specified in the legend of each figure). The membranes were prepared 4X to dispense 1 or 10 µg / well (amount specified in the legend of each figure). The GTPgS nucleotide (signal condition not
spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 100mM. Les composés à tester (agonistes ou antagonistes) ont été préparés 10X pour obtenir les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les graphiques. Les anticorps anti-Galphai utilisés pour la détection ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits suivantes : specific) was prepared 6.67X to obtain a final concentration in the wells of 100mM. The compounds to be tested (agonists or antagonists) were prepared 10X to obtain the final concentrations in the wells mentioned in the graphs. The anti-Galphai antibodies used for the detection were prepared 4X to aim for the final concentrations in the following wells:
anticorps DSV36S-d2 (10nM) ; anticorps DSV36S-Lumi4Tb (0.5 ou 1 nM) ; DSV36S-d2 antibody (10nM); DSV36S-Lumi4Tb antibody (0.5 or 1 nM);
anticorps DSV38S-d2 (10nM). Les analogues GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables marqués avec des sondes fluorescentes donneur ou accepteur ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure. DSV38S-d2 antibody (10nM). Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogs labeled with fluorescent donor or acceptor probes were prepared 4X to aim for the final concentrations in the wells mentioned in the captions of each figure.
[0219] Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits [0219] Distribution of reagents in the 384-well plates
[0220] · Membranes exprimant le RCPG et la protéine G : 5pL [0220] · Membranes expressing RCPG and G protein: 5 pL
· Tampon ou nucléotide GTPgS (pour la condition signal non spécifique) : 3pL GTPgS buffer or nucleotide (for the nonspecific signal condition): 3pL
• Analogue GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables - donneur ou accepteur : 5pL • Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analog - donor or acceptor: 5 pL
• Ligand anti Galphai-donneur ou accepteur : 5pL • Tampon ou Composés à tester (agonistes et / ou antagonistes) : 2mI_. • Anti Galphai-donor or acceptor ligand: 5 pL • Buffer or Compounds to be tested (agonists and / or antagonists): 2mI_.
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits contenant un excès de GTPgS (100mM). The non-specific signal (fluorescence background noise) was measured with wells containing an excess of GTPgS (100mM).
[0221 ] Lecture du signal HTRF [0221] Reading the HTRF signal
[0222] Les plaques ont été incubées à 21 °C pendant 20h (hormis si autrement [0222] The plates were incubated at 21 ° C for 20 hours (except if otherwise
spécifié dans les figures) puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante : specified in the figures) then the HTRF signal was measured on the PHERAstar reader (BMG Labtech) with the following configuration:
• Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm) • Module: HTRF (337nm excitation, 665nm and 620nm emission)
• Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs • Excitation: laser, 40 flashes or lamp, 100 flashes
• Fenêtre de lecture : délais : 60ps - Intégration : 400ps. • Reading window: delays: 60ps - Integration: 400ps.
[0223] Traitement du signal [0223] Signal processing
[0224] A partir des signaux bruts à 665nm (pour accepteur rouge - Cy5) ou 520nm (pour accepteurs verts - AF488 ou Fluorescéine) et 620nm, le Ratio HTRF a été calculé selon la formule suivante : [0224] From the raw signals at 665nm (for red acceptor - Cy5) or 520nm (for green acceptors - AF488 or Fluorescein) and 620nm, the HTRF Ratio was calculated according to the following formula:
Ratio HTRF = Signal à 665nm ou Signal à 520nm / Signal à 620nm * 10,000. HTRF Ratio = Signal at 665nm or Signal at 520nm / Signal at 620nm * 10,000.
[0225] Formats d’essais [0225] Test formats
[0226] La figure 2A illustre le principe d’essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET donneur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET accepteur dans lequel l’activation du RCPG avec un composé agoniste induit une diminution de la liaison de l’analogue GTP-donneur à la protéine G et donc une diminution du signal de RET (format 1A). [0226] Figure 2A illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with a donor RET partner and an anti-G protein ligand labeled with an acceptor RET partner in which activation of RCPG with an agonist compound induces a decrease in the binding of the GTP-donor analog to the G protein and therefore a decrease in the RET signal (format 1A).
[0227] La figure 2B illustre le principe d’essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET accepteur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET donneur dans lequel l’activation du RCPG avec un composé agoniste induit une diminution de la liaison de l’analogue GTP-accepteur à la protéine G et donc une diminution du signal de RET (format 1 B). [0227] Figure 2B illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with an acceptor RET partner and an anti-G protein ligand labeled with a donor RET partner in which the activation of RCPG with an agonist compound induces a decrease in the binding of the GTP-acceptor analog to the G protein and therefore a decrease in the RET signal (1 B format).
[0228] La figure 2C illustre le principe d’essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET donneur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET accepteur dans lequel l’activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la liaison de l’analogue GTP-donneur à la protéine G et donc une augmentation du signal de RET (format 2A). [0228] Figure 2C illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with a donor RET partner and an anti-G protein ligand labeled with an acceptor RET partner in which the activation of RCPG with an agonist compound induces an increase the binding of the GTP-donor analog to the G protein and therefore an increase in the RET signal (2A format).
[0229] La figure 2D illustre le principe d’essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET accepteur et un ligand anti protéine G marqué avec un partenaire de RET donneur dans lequel l’activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la liaison de l’analogue GTP-accepteur à la protéine G et donc une [0229] Figure 2D illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with an acceptor RET partner and an anti-G protein ligand labeled with a donor RET partner in which the activation of RCPG with an agonist compound induces an increase in the binding of the GTP-acceptor analog to the G protein and therefore a
augmentation du signal de RET (format 2B). increase in RET signal (2B format).
[0230] Exemples 1 à 7 - Test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Delta [0230] Examples 1 to 7 - Activation test according to the 1 A format on RCPG Delta
Opioïde (DPR) : diminution du signal TR-FRET entre GTP-donneur etOpioid (DPR): decrease in the TR-FRET signal between GTP-donor and
Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d’un agoniste. Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
[0231] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 ou CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées : [0231] Firstly, the ability of the GTP-donor / anti-Galphai acceptor antibody pairs to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of HEK293 cells or CHO-K1 expressing the Delta Opioid RCPG and the Galphai protein. The following experimental conditions were used:
- Exemple 1 / Figure 3A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S- d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. - Example 1 / Figure 3A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 2 / Figure 4A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ; - Example 2 / Figure 4A: GTPgN-octyl-C11 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 3 / Figure 5A : GTPgO-hexyl-C2 (6nM final dans le puits) ; - Example 3 / Figure 5A: GTPgO-hexyl-C2 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 4 / Figure 6A : GTPgN-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : - Example 4 / Figure 6A: GTPgN-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. 50mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 5 / Figure 7A : GTPgN-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 1 pg membranes HEK-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. - Example 5 / Figure 7A: GTPgN-C3 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (10nM final in the well); 1 µg HEK-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 6 / Figure 8 : GTPgN-octyl-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S- d2 (1 OnM final dans le puits) ; 1 pg membranes HEK-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. - Example 6 / Figure 8: GTPgN-octyl-C3 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (1 final OnM in the well); 1 µg HEK-DOR membranes / well; Buffer : 50mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 7 / Figure 9 : GTPgO-hexyl-C3 (6nM final dans le puits) ; DSV36S- d2 (1 OnM final dans le puits) ; 1 pg membranes HEK-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1%. - Example 7 / Figure 9: GTPgO-hexyl-C3 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (1 final OnM in the well); 1 µg HEK-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
[0232] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2, GTPgN- octyl-C11 , GTPgO-hexyl-C2, GTPgN-C2, GTPgN-C3, GTPgN-octyl-C3, GTPgO- hexyl-C3 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR- FRET avec l’anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 3A à 9). [0232] The membranes were incubated in the absence or in the presence of a strong excess of GTPgS (100mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the analogs GTPgN-octyl-C2, GTPgN- octyl-C11, GTPgO-hexyl-C2, GTPgN-C2, GTPgN-C3, GTPgN-octyl- C3, GTPgO-hexyl-C3 are able to bind to the Galphai protein and generate a TR-FRET signal with the anti Galphai-acceptor antibody (FIGS. 3A to 9).
[0233] Dans un second temps, la capacité d’un agoniste du RCPG à moduler la [0233] Secondly, the ability of a GPCR agonist to modulate
proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l’agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 3B (Exemple 1 ), 4B (Exemple 2), 5B (Exemple 3), 6B (Exemple 4) et 7B (Exemple 5). Avec les analogues GTPgN- octyl-C3 (Exemple 6) et GTPgO-hexyl-C3 (Exemple 7), cette modulation du signal par un agoniste n’a pas été testée. proportion of Galpha protein bound to the GTP-donor was tested with the same membranes and experimental conditions mentioned above. The decrease in the TR-FRET signal (Ratio HTRF) generated by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor decreases (i.e. the empty Galpha protein form increases). Thus, the RCPG receptor activated by its agonist causes the GTP-donor to exit the G protein which then passes into empty form and causes the decrease in the TR-FRET signal. These results are shown in Figures 3B (Example 1), 4B (Example 2), 5B (Example 3), 6B (Example 4) and 7B (Example 5). With the analogs GTPgN-octyl-C3 (Example 6) and GTPgO-hexyl-C3 (Example 7), this modulation of the signal by an agonist has not been tested.
[0234] Exemple 8 - Effet de la concentration en membrane et en GTP-donneur sur le test d’activation selon le format 1 A sur RCPG Delta Opioïde (DPR) : diminution du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps antiprotéine Galphai-accepteur sous stimulation d’un agoniste. [0234] Example 8 - Effect of the membrane and donor GTP concentration on the activation test according to the 1 A format on Delta Opioid RCPG (DPR): decrease in the TR-FRET signal between donor GTP and Galphai antiprotein antibody -acceptor under agonist stimulation.
[0235] Dans un premier temps, la capacité du couple GTPgN-octyl-C2 / Anticorps anti-Galphai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai (1 ou 10 pg / puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à 2 ou 6nM final dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l’anticorps anti Galphai DSV36S-d2 (Figure 10A). Par ailleurs, le panel de gauche montre une augmentation de l’amplitude de signal (S/B = Signal Total / Signal Non [0235] First of all, the ability of the GTPgN-octyl-C2 / anti-Galphai DSV36S-d2 antibody pair to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations. of CHO-K1 cells expressing the Delta Opioid RCPG and the Galphai protein (1 or 10 μg / well). GTPgN-octyl-C2 was used at 2 or 6nM final in the wells. The membranes were incubated in the absence or in the presence of a large excess of GTPgS (100mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the GTPgN-octyl-C2 analog is capable of binding to the Galphai protein and generating a TR-FRET signal with the anti Galphai DSV36S-d2 antibody (FIG. 10A). In addition, the left panel shows an increase in signal amplitude (S / N = Total Signal / Non Signal
Spécifique) en augmentant la quantité de membrane de 1 à 10pg par puits. Le panel de droite montre une augmentation de l’amplitude du signal (S/B) en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-C2 de 2 à 6nM. Specific) by increasing the amount of membrane from 1 to 10 pg per well. The right panel shows an increase in signal amplitude (S / N) by increasing the concentration of GTPgN-octyl-C2 from 2 to 6nM.
[0236] Dans un second temps, la capacité d’un agoniste du RCPG à moduler la [0236] Secondly, the ability of a GPCR agonist to modulate
proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio FITRF) engendrée par la stimulation avec l’agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur la figure 10B. Par ailleurs, le panel de gauche montre une augmentation de l’amplitude de signal (S/B = Signal Véhicule sans agoniste / Signal Agoniste) en augmentant la quantité de membrane de 1 à 10pg par puits. Le panel de droite montre une augmentation de l’amplitude du signal (S/B) en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-C2 de 2 à 6nM. proportion of Galpha protein bound to the GTP-donor was tested with the same membranes and experimental conditions mentioned above. The decrease in the TR-FRET signal (FITRF Ratio) caused by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor decreases (i.e. the empty Galpha protein form increases). Thus, the RCPG receptor activated by its agonist causes the GTP-donor to exit the G protein which then passes into empty form and causes the decrease in the TR-FRET signal. These results are shown in Figure 10B. Furthermore, the left panel shows an increase in the signal amplitude (S / N = Vehicle signal without agonist / Signal agonist) by increasing the amount of membrane from 1 to 10 pg per well. The right panel shows an increase in signal amplitude (S / N) by increasing the concentration of GTPgN-octyl-C2 from 2 to 6nM.
[0237] Exemples 9 et 10 - Test d’activation selon le format 1 A sur RCPG [0237] Examples 9 and 10 - Activation test according to the 1 A format on RCPG
Dopamine D2S (D2S) : diminution du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Dopamine D2S (D2S): decrease in the TR-FRET signal between GTP-donor and
Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d’un agoniste. Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
[0238] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CFIO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées : [0238] Firstly, the ability of GTP-donor / anti-Galphai acceptor antibody pairs to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CFIO- cells. K1 expressing GPCR Dopamine D2S and the Galphai protein. The following experimental conditions were used:
- Exemple 9 / Figure 11 A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; - Example 9 / Figure 11 A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CFIO-D2S / puits ; Tampon : T risHCI 50mM pFI7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CFIO-D2S membranes / well; Buffer: 50mM RisHCl pFI7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 10 / Figure 12A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CH0-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. - Example 10 / Figure 12A: GTPgN-octyl-C11 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10 pg CH0-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
[0239] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2 et GTPgN- octyl-C11 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR- FRET avec l’anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 11 A à 12A). [0239] The membranes were incubated in the absence or in the presence of a strong excess of GTPgS (100mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the analogs GTPgN-octyl-C2 and GTPgN-octyl-C11 are able to bind to the Galphai protein and generate a TR-FRET signal with the anti Galphai-acceptor antibody (Figure 11A to 12A).
[0240] Dans un second temps, la capacité d’un agoniste du RCPG à moduler la [0240] Secondly, the ability of a GPCR agonist to modulate
proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio FITRF) engendrée par la stimulation avec l’agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP-donneur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la sortie du GTP-donneur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 11 B (Exemple 9) et 12B (Exemple 10). proportion of Galpha protein bound to the GTP-donor was tested with the same membranes and experimental conditions mentioned above. The decrease in the TR-FRET signal (FITRF Ratio) caused by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor decreases (i.e. the empty Galpha protein form increases). Thus, the RCPG receptor activated by its agonist causes the GTP-donor to exit the G protein which then passes into empty form and causes the decrease in the TR-FRET signal. These results are shown in Figures 11B (Example 9) and 12B (Example 10).
[0241 ] Exemples 11 à 13 - Test d’activation selon le format 1 B sur RCPG Delta Opioïde (DPR) : diminution du signal TR-FRET entre GTP-accepteur et Anticorps anti-protéine Galphai-donneur sous stimulation d’un agoniste. [0241] Examples 11 to 13 - Activation test according to format 1 B on Delta Opioid GPCR (DPR): decrease in the TR-FRET signal between GTP-acceptor and anti-Galphai-donor protein antibody under stimulation of an agonist.
[0242] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-accepteur / Anticorps anti-Galphai donneur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules FIEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées : [0242] First, the ability of the GTP-acceptor / anti-Galphai donor antibody pairs to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of FIEK293 cells expressing the RCPG Delta Opioid and the Galphai protein. The following experimental conditions were used:
- Exemple 11 / Figure 13A : GTPgO-Linker-Cy5(P) (250nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 1 pg membranes FIEK- DOR / puits ; Tampon : T risHCI 50mM pFI7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. Lecture après 3h d’incubation à 21 °C. - Example 11 / Figure 13A: GTPgO-Linker-Cy5 (P) (250nM final in the well); DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final in the well); 1 µg FIEK-DOR membranes / well; Buffer: 50mM RisHCl pFI7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA. Reading after 3 hours of incubation at 21 ° C.
- Exemple 12 / Figure 14A : GTPgS-Linler-Cy5(R) (250nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 10pg membranes FIEK-DOR / puits ; Tampon : T risHCI 50mM pFI7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. Lecture après 1 h d’incubation à 21 °C. - Exemple 13 / Figure 15A : GTPgN-L18-Fluorescein (31 nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final dans le puits) ; 1 pg membranes HEK- DOR / puits ; Tampon : T risHCI 50mM pFI7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; BSA 0,1 %. - Example 12 / Figure 14A: GTPgS-Linler-Cy5 (R) (250nM final in the well); DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final in the well); 10pg FIEK-DOR membranes / well; Buffer: 50mM RisHCl pFI7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA. Reading after 1 h incubation at 21 ° C. - Example 13 / Figure 15A: GTPgN-L18-Fluorescein (31 nM final in the well); DSV36S-Lumi4Tb (0.25nM final in the well); 1 µg HEK-DOR membranes / well; Buffer: 50mM RisHCl pFI7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 0.1% BSA.
[0243] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgO-Linker-Cy5(P), GTPgS-Linler-Cy5(R) et GTPgN-L18-Fluorescein sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l’anticorps anti Galphai- donneur (Figure 13A à 15A). [0243] The membranes were incubated in the absence or in the presence of a strong excess of GTPgS (100mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the analogs GTPgO-Linker-Cy5 (P), GTPgS-Linler-Cy5 (R) and GTPgN-L18-Fluorescein are able to bind to the Galphai protein and generate a TR-FRET signal with the anti Galphaidonor antibody (Figure 13A to 15A).
[0244] Dans un second temps, la capacité d’un agoniste du RCPG à moduler la [0244] Secondly, the ability of a GPCR agonist to modulate the
proportion de protéine Galpha liée au GTP-accepteur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. La diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l’agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP- accepteur diminue (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide augmente). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la sortie du GTP-accepteur de la protéine G qui passe alors sous forme vide et entraîne la diminution du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 13B (Exemple 11 ), 14B (Exemple 12), 15B (Exemple 13). Avec l’analogue GTPgS-Linler-Cy5(R) (Exemple 12), cette modulation du signal par un agoniste est très faible. proportion of Galpha protein bound to the GTP-acceptor was tested with the same membranes and experimental conditions mentioned above. The decrease in the TR-FRET signal (HTRF Ratio) generated by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-acceptor decreases (i.e. that the empty Galpha protein form increases). Thus, the RCPG receptor activated by its agonist causes the release of the GTP-acceptor of the G protein which then passes into empty form and causes the decrease in the TR-FRET signal. These results are shown in Figures 13B (Example 11), 14B (Example 12), 15B (Example 13). With the GTPgS-Linler-Cy5 (R) analog (Example 12), this modulation of the signal by an agonist is very low.
[0245] Exemples 14 à 19 - Test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta [0245] Examples 14 to 19 - Activation test according to the 2A format on RCPG Delta
Opioïde (DPR) : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-donneur etOpioid (DPR): increase in the TR-FRET signal between GTP-donor and
Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d’un agoniste. Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
[0246] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées : [0246] Firstly, the ability of GTP-donor / acceptor anti-Galphai antibody pairs to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CHO- cells. K1 expressing the Delta Opioid GPCR and the Galphai protein. The following experimental conditions were used:
- Exemple 14 / Figure 16A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; - Example 14 / Figure 16A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 500mM ; BSA 0,1 %. DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 500mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 15 / Figure 17A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ;- Example 15 / Figure 17A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM;
BSA 0,1 %. 0.1% BSA.
- Exemple 16 / Figure 18A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; - Example 16 / Figure 18A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well);
DSV38S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; DSV38S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM;
BSA 0,1 %. 0.1% BSA.
- Exemple 17 / Figure 19A : GTPgN-octyl-C11 (6nM final dans le puits) ; - Example 17 / Figure 19A: GTPgN-octyl-C11 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM;
BSA 0,1 %. 0.1% BSA.
- Exemple 18 / Figure 20A : GTPgO-hexyl-C2 (6nM final dans le puits) ; - Example 18 / Figure 20A: GTPgO-hexyl-C2 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM;
BSA 0,1 %. 0.1% BSA.
- Exemple 19 / Figure 21 A : GTPgN-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : - Example 19 / Figure 21 A: GTPgN-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer :
TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1 %. 50mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA.
[0247] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2, GTPgN- octyl-C11 , GTPgO-hexyl-C2, GTPgN-C2 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l’anticorps anti Galphai-accepteur (Figures 16A à 21 A). [0247] The membranes were incubated in the absence or in the presence of a strong excess of GTPgS (100mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the analogs GTPgN-octyl-C2, GTPgN-octyl-C11, GTPgO-hexyl-C2, GTPgN-C2 are capable of binding to the Galphai protein. and generating a TR-FRET signal with the anti-Galphai-acceptor antibody (Figures 16A to 21A).
[0248] Dans un second temps, la capacité d’un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. [0248] In a second step, the capacity of an RCPG agonist to modulate the proportion of Galpha protein bound to the GTP-donor was tested with the same membranes and experimental conditions mentioned above.
L’augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l’agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP- donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne The increase in the TR-FRET signal (Ratio HTRF) generated by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor increases (i.e. the empty Galpha protein form decreases). Thus, the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-donor to the G protein which then passes into the GTP-donor form and causes
l’augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 16B (Exemple 14), 17B (Exemple 15), 18B (Exemple 16), 19B (Exemple 17), 20B (Exemple 18) et 21 B (Exemple 19). Par ailleurs, la figure 17B (Exemple 15) montre une deuxième condition où l’activation par une concentration fixe d’agoniste du RCPG SNC162 (200nM) a été inhibée par une concentration croissante d’antagoniste du RCPG (Naltrindole). Cette inhibition d’activation est observée par la diminution du signal TR-FRET (Ratio HTRF). the increase in the TR-FRET signal. These results are shown in the figures 16B (Example 14), 17B (Example 15), 18B (Example 16), 19B (Example 17), 20B (Example 18) and 21 B (Example 19). Furthermore, FIG. 17B (Example 15) shows a second condition where the activation by a fixed concentration of RCPG agonist SNC162 (200nM) was inhibited by an increasing concentration of RCPG antagonist (Naltrindole). This activation inhibition is observed by the decrease in the TR-FRET signal (HTRF Ratio).
[0249] Exemples 20 à 22 - Test d’activation selon le format 2A sur RCPG [0249] Examples 20 to 22 - Activation test according to the 2A format on RCPG
Dopamine D2S (D2S) : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d’un agoniste. Dopamine D2S (D2S): increase in the TR-FRET signal between GTP-donor and anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
[0250] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CFIO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées : [0250] Firstly, the ability of the GTP-donor / acceptor anti-Galphai antibody pairs to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CFIO- cells. K1 expressing GPCR Dopamine D2S and the Galphai protein. The following experimental conditions were used:
- Exemple 20 / Figure 22A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; - Example 20 / Figure 22A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 10mM ; GDP 1 mM ; BSA 0,1 %. DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10 pg CHO-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 1 mM GDP; 0.1% BSA.
- Exemple 21 / Figure 23A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; - Example 21 / Figure 23A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 100mM ; BSA 0,1 %. DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10 pg CHO-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 100mM NaCl; 0.1% BSA.
- Exemple 22 / Figure 24A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; - Example 22 / Figure 24A: GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well);
DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 100mM ; GDP 1 mM ; BSA 0,1 %. DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10 pg CHO-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 100mM NaCl; 1 mM GDP; 0.1% BSA.
[0251] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l’anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 22A à 24A). [0251] The membranes were incubated in the absence or in the presence of a strong excess of GTPgS (100mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the GTPgN-octyl-C2 analog is able to bind to the Galphai protein and generate a TR-FRET signal with the anti-Galphai-acceptor antibody (Figure 22A to 24A).
[0252] Dans un second temps, la capacité d’un agoniste du RCPG à moduler la [0252] Secondly, the ability of a GPCR agonist to modulate the
proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. proportion of Galpha protein bound to the donor GTP was tested with the same membranes and experimental conditions mentioned above.
L’augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l’agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP- donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraine la liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne The increase in the TR-FRET signal (Ratio HTRF) generated by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor increases (i.e. the empty Galpha protein form decreases). Thus, the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-donor to the G protein which then passes into the GTP-donor form and causes
l’augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 22B (Exemple 20), 23B (Exemple 21 ) et 24B (Exemple 22). the increase in the TR-FRET signal. These results are shown in Figures 22B (Example 20), 23B (Example 21) and 24B (Example 22).
[0253] Exemples 23 et 24 - Test d’activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde (DPR) : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-accepteur et Anticorps anti-protéine Galphai-donneur sous stimulation d’un agoniste. [0253] Examples 23 and 24 - Activation test according to format 2B on Delta Opioid RCPG (DPR): increase in the TR-FRET signal between GTP-acceptor and anti-Galphai-donor protein antibody under stimulation of an agonist.
[0254] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-accepteur / Anticorps anti-Galphai donneur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CFIO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées : [0254] First, the ability of the GTP-acceptor / anti-Galphai donor antibody pairs to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CFIO- cells. K1 expressing the Delta Opioid GPCR and the Galphai protein. The following experimental conditions were used:
- Exemple 23 / Figure 25A : GTPgN-octyl-Cy5 (50nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (1 nM final dans le puits) ; 10pg membranes CFIO-DOR / puits ; Tampon : T risHCI 50mM pFI7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1 %. Lecture après 3h d’incubation à 21 °C. - Example 23 / Figure 25A: GTPgN-octyl-Cy5 (50nM final in the well); DSV36S-Lumi4Tb (1 nM final in the well); 10pg CFIO-DOR membranes / well; Buffer: 50mM RisHCl pFI7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA. Reading after 3 hours of incubation at 21 ° C.
- Exemple 24 / Figure 26A : GTPgN-octyl-AF488 (50nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (1 nM final dans le puits) ; 10pg membranes CFIO-DOR / puits ; Tampon : T risFHCI 50mM pFI7,4 ; MgCI2 10mM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1 %. Lecture après 3h d’incubation à 21 °C. - Example 24 / Figure 26A: GTPgN-octyl-AF488 (50nM final in the well); DSV36S-Lumi4Tb (1 nM final in the well); 10pg CFIO-DOR membranes / well; Buffer: T risFHCl 50 mM pFI7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA. Reading after 3 hours of incubation at 21 ° C.
[0255] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio FITRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-Cy5 et GTPgN-octyl-AF488 sont capables de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l’anticorps anti Galphai-donneur (Figure 25A à 26A). [0255] The membranes were incubated in the absence or in the presence of a strong excess of GTPgS (100mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio FITRF) observed between these two conditions shows that the analogues GTPgN-octyl-Cy5 and GTPgN-octyl-AF488 are able to bind to the Galphai protein and generate a TR-FRET signal with the anti Galphai-donor antibody (Figures 25A to 26A).
[0256] Dans un second temps, la capacité d’un agoniste du RCPG à moduler la [0256] Secondly, the ability of a GPCR agonist to modulate the
proportion de protéine Galpha liée au GTP-accepteur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. proportion of Galpha protein bound to the GTP-acceptor was tested with the same membranes and experimental conditions mentioned above.
L’augmentation du signal TR-FRET (Ratio FITRF) engendrée par la stimulation avec l’agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP- accepteur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la liaison du GTP-accepteur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-accepteur et entraîne The increase in the TR-FRET signal (FITRF Ratio) generated by the stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-acceptor increases (ie that the empty Galpha protein form decreases). Thus, the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-acceptor to the G protein which then passes into the GTP-acceptor form and causes
l’augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les figures 25B (Exemple 23) et 26B (Exemple 24). the increase in the TR-FRET signal. These results are shown in Figures 25B (Example 23) and 26B (Example 24).
[0257] Exemples 25 - Test d’activation selon le format 2A sur RCPG Delta [0257] Examples 25 - Activation test according to the 2A format on RCPG Delta
Opioïde (DPR) : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Opioid (DPR): increase in the TR-FRET signal between GTP-donor and
Anticorps anti-protéine Galphai-accepteur sous stimulation d’un agoniste. Anti-Galphai-acceptor protein antibody under agonist stimulation.
Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti- Galphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CFIO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Galphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées : First, the ability of the GTP-donor / acceptor anti-Galphai antibody pairs to generate a specific TR-FRET signal by binding to the G protein was demonstrated using membrane preparations of CFIO-K1 cells expressing the GPCR Delta Opioid and the Galphai Protein. The following experimental conditions were used:
- Exemple 25 / Figure 27A : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (7.5nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (10nM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO- DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 60mM ; NaCI 150mM ; BSA 0,1 %. - Example 25 / Figure 27A: GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (7.5nM final in the well); DSV36S-d2 (10nM final in the well); 10 pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 60mM MgCl2; 150mM NaCl; 0.1% BSA.
[0258] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl- C2 est capable de se lier à la protéine Galphai et générer un signal TR-FRET avec l’anticorps anti Galphai-accepteur (Figure 27A). [0258] The membranes were incubated in the absence or in the presence of a strong excess of GTPgS (100mM). The difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the analog GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 is able to bind to the Galphai protein and generate a TR-FRET signal with the antibody anti Galphai-acceptor (Figure 27A).
[0259] Dans un second temps, la capacité d’un agoniste du RCPG à moduler la [0259] Secondly, the ability of a GPCR agonist to modulate the
proportion de protéine Galpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. proportion of Galpha protein bound to the GTP-donor was tested with the same membranes and experimental conditions mentioned above.
L’augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l’agoniste signifie que la proportion de forme protéine Galpha liée au GTP- donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine Galpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne The increase in the TR-FRET signal (Ratio HTRF) generated by stimulation with the agonist means that the proportion of Galpha protein form bound to the GTP-donor increases (i.e. the empty Galpha protein form decreases). Thus, the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-donor to the G protein which then passes into the GTP-donor form and causes
l’augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur la figure 27B (Exemple 25). [0260] Exemple 26 : Protocole pour obtenir des anticorps anti-protéine G alphail utilisés dans le procédé selon l'invention the increase in the TR-FRET signal. These results are shown in Figure 27B (Example 25). [0260] Example 26: Protocol for obtaining anti-G alphail protein antibodies used in the process according to the invention
[0261 ] Immunisation de souris [0261] Immunization of mice
[0262] La protéine TST-G alphail recombinantes (protéine G alphail de séquence UniProt P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) a été produite dans des cellules d’insectes Sf9 (infection avec un baculovirus codant ladite protéine) puis purifiée sur une colonne d’affinité via le tag TwinStreptag (TST) (Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalogue : 2-1208-002)). [0262] The recombinant TST-G alphail protein (G alphail protein of UniProt P63096-1 sequence tagged at the N-terminal with the TwinStreptag (TST) (IBA) tag via a TEV linker) was produced in Sf9 insect cells (infection with a baculovirus encoding said protein) then purified on an affinity column via the TwinStreptag (TST) tag (Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalog: 2-1208-002)).
[0263] Des souris BALB/c ont été immunisées par injection de la protéine TST-G [0263] BALB / c mice were immunized by injection of the TST-G protein
alphail préalablement diluée dans du tampon contenant du GTPgS (HEPES 20mM pH8, NaCI 100mM, MgCI2 3mM, CHAPS 11 mM, GTPgS 100mM). La primo-injection a été suivie de trois rappels à intervalle d’un mois. alphail diluted beforehand in buffer containing GTPgS (20mM HEPES pH8, 100mM NaCl, 3mM MgCl2, 11mM CHAPS, 100mM GTPgS). The first injection was followed by three boosters every month.
[0264] Quinze jours après chaque injection, des ponctions sanguines sur les souris ont permis de vérifier la présence d’une réponse immunitaire. [0264] Fifteen days after each injection, blood punctures on the mice made it possible to verify the presence of an immune response.
[0265] Pour cela, un test de type ELISA a été mis en place. La protéine TST-G For this, an ELISA type test was set up. TST-G protein
alphail préalablement diluée à 20pg/mL dans du tampon contenant du GTPgS (Tris HCl 20mM pH8.5, NaCI 140mM, EDTA 2mM, MgCI2 10mM, BSA 0.1%, GTPgS 1 mM) a été adsorbée via le tag TwinStreptag sur des plaques 96 puits contenant de la Strep-Tactin®XT (IBA, Catalogue : 2-4101 -001 ). Pour cela, 100mI de protéine ont été ajoutés dans chaque puits puis incubées pendant 2h à 37°C suivi de trois lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20. alphail previously diluted to 20pg / mL in buffer containing GTPgS (20mM Tris HCl pH8.5, 140mM NaCI, 2mM EDTA, 10mM MgCl2, 0.1% BSA, 1mM GTPgS) was adsorbed via the TwinStreptag tag on 96-well plates containing Strep-Tactin®XT (IBA, Catalog: 2-4101-001). For this, 100mI of protein were added to each well and then incubated for 2h at 37 ° C followed by three washes in 1X PBS buffer, 0.05% Tween20.
[0266] Les dilutions sérielles d’un facteur 10 à 100 millions des ponctions sanguines ont ensuite été ajoutées à hauteur de 100pL / puits et incubées pendant 2h à 37°C. Les anticorps non fixés à la protéine ont été éliminés par trois étapes de lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20 puis la détection des anticorps fixés a été réalisée à l’aide d’un anticorps secondaire anti-Fc de souris lié à la HRP (horseradish peroxidase) (Sigma #A0168 dilué au 1/10 000 dans du PBS, BSA 0.1 %). Après 1 h d’incubation à 37°C puis trois lavages en tampon PBS 1X, [0266] The serial dilutions by a factor of 10 to 100 million of the blood punctures were then added at a level of 100 μL / well and incubated for 2 h at 37 ° C. The antibodies not bound to the protein were removed by three stages of washing in 1X PBS buffer, 0.05% Tween20 then the detection of the bound antibodies was carried out using an anti-mouse Fc secondary antibody bound to the HRP (horseradish peroxidase) (Sigma # A0168 diluted 1: 10,000 in PBS, 0.1% BSA). After 1 h of incubation at 37 ° C then three washes in 1X PBS buffer,
0.05% Tween20, la révélation de la HRP a été réalisé par dosage colorimétrique à 450nm suite à l’incubation de son substrat TMB (3, 3', 5,5'- Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20min à température ambiante sous agitation. 0.05% Tween20, the revelation of HRP was carried out by colorimetric assay at 450nm following the incubation of its substrate TMB (3, 3 ', 5.5'- Tetramethylbenzidine, Sigma # T0440) for 20min at room temperature with stirring.
[0267] Afin de s’assurer que les anticorps détectés par le test ELISA étaient bien dirigés contre la protéine G alphail et non contre le tag TwinStrepTag, les mêmes ponctions ont été testés sur le test ELISA après pré-incubation avec un excès d’une autre protéine orthogonale tagguée avec le TwinStrepTag [0267] In order to ensure that the antibodies detected by the ELISA test were indeed directed against the alphail G protein and not against the TwinStrepTag tag, the same punctures were tested on the ELISA test after pre-incubation with an excess of another orthogonal protein tagged with the TwinStrepTag
(SNAPTag-TwinStrpeTag). Ainsi, les anticorps anti tag se fixent sur la protéine orthogonale taguée et donc pas sur la protéine G alphail attachée au fond des puits ; auquel cas aucun signal HRP ou une diminution du signal HRP est détecté. (SNAPTag-TwinStrpeTag). Thus, the anti tag antibodies bind to the tagged orthogonal protein and therefore not to the G alphail protein attached to the bottom of the wells; in which case no HRP signal or a decrease in HRP signal is detected.
[0268] Les souris présentant les meilleurs titres d’anticorps et le moins de baisse de signal dans le cas contrôle anti tag ont été sélectionnées pour l’étape suivante d’hybridation lymphocytaire, aussi appelée fusion. La rate des souris a été récupérée et un mélange des lymphocytes et plasmocystes issus de cette rate a été fusionné in vitro avec une lignée cellulaire de myélome en présence d’un catalyseur de la fusion cellulaire du type polyéthylène glycol. Une lignée cellulaire de myélome mutante, manquant l’enzyme HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) a été utilisée pour permettre une sélection des cellules hybrides, appelées hybridomes. Ces cellules ont été cultivées dans un milieu contenant de l’hypoxanthine, de l’aminopterine (methotrexate) et de la thyamine (milieu HAT) pour permettre l’élimination des cellules de myélome non fusionnées et ainsi sélectionner les hybridomes d’intérêt. Les cellules de rate non fusionnées quant à elle meurent puisqu’elles sont incapables de proliférer in vitro. Ainsi, seuls les hybridomes ont survécu. [0268] The mice with the best antibody titers and the least signal drop in the anti tag control case were selected for the next step of lymphocyte hybridization, also called fusion. The spleen of the mice was recovered and a mixture of lymphocytes and plasmocysts from this spleen was fused in vitro with a myeloma cell line in the presence of a polyethylene glycol type cell fusion catalyst. A mutant myeloma cell line lacking the HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) enzyme was used to allow selection of hybrid cells, called hybridomas. These cells were cultured in a medium containing hypoxanthine, aminopterin (methotrexate) and thyamine (HAT medium) to allow removal of unfused myeloma cells and thereby select the hybridomas of interest. However, unfused spleen cells die because they are unable to proliferate in vitro. Thus, only the hybridomas survived.
[0269] Ces hybridomes ont alors été cultivés dans des plaques de culture. Les These hybridomas were then cultured in culture plates. The
surnageants de ces hybridomes ont ensuite été testés pour évaluer leur capacité à produire des anticorps anti protéine G alphail . Pour cela, un test ELISA comme décrit ci-dessus a été réalisé. Supernatants from these hybridomas were then tested to assess their ability to produce anti G alphail protein antibodies. For this, an ELISA test as described above was carried out.
[0270] Afin d’évaluer la sélectivité des anticorps entre les différentes formes de la protéine GalpahM (forme pleine liée au GDP vs forme pleine liée au GTPgS vs forme vide), le test a été réalisé en parallèle sur des conditions de protéine TST- G alphail pré-incubée dans le tampon contenant soit du GDP à 1 mM, soit du GTPgS à 1 mM soit sans nucléotide. Les meilleurs hybridomes ont ensuite été clonés avec une étape de dilution limite afin d’obtenir des clones d’hybridome. [0270] In order to evaluate the selectivity of the antibodies between the different forms of the GalpahM protein (full form linked to GDP vs full form linked to GTPgS vs empty form), the test was carried out in parallel on TST-protein conditions. G alphail pre-incubated in buffer containing either 1 mM GDP or 1 mM GTPgS or nucleotide free. The best hybridomas were then cloned with a limiting dilution step in order to obtain hybridoma clones.
[0271] Les clones d’hybridomes d’intérêt ont ensuite été injectés dans des souris (injection intra péritonéale) afin de permettre la production des anticorps en grande quantité dans le liquide d’ascite. [0271] The hybridoma clones of interest were then injected into mice (intraperitoneal injection) to allow the production of antibodies in large quantities in the ascitic fluid.
[0272] Les anticorps ont ensuite été purifiés par chromatographie d’affinité sur des colonnes avec des résines présentant de la protéine A. [0272] The antibodies were then purified by affinity chromatography on columns with resins exhibiting protein A.
[0273] Capacité des anticorps purifiés ci-dessus à entrer en compétition pour la [0273] Ability of the antibodies purified above to compete for the
liaison à la protéine G alpha avec l’anticorps DSV36S binding to G alpha protein with DSV36S antibody
[0274] Tous les réactifs sont dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 10mM, BSA 0,1 %, NaCI 10mM. La protéine Gai1 est préparée 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS est préparé 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 10mM. Ces 2 réactifs sont préparés dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant d’être distribués dans les puits. Les anticorps purifiés ci-dessus sont préparés 4X pour viser des concentrations finales dans les puits comprises entre 0.01 et 1 mM. L’anticorps DSV36S-d2 est préparé 4X pour viser une concentration finale de 10nM. L’anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb est préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.5nM. [0274] All the reagents are diluted in 50 mM TrisHCl buffer pH 7.4, 10 mM MgCl2, 0.1% BSA, 10 mM NaCl. The Gai1 protein is prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 2.5nM. The GTPgS nucleotide is prepared 2X to obtain a final concentration in the 10 mM wells. These 2 reagents are prepared in the same solution and preincubated for 30 minutes at room temperature before being distributed into the wells. The above purified antibodies are prepared 4X to aim for final concentrations in the wells of between 0.01 and 1 mM. DSV36S-d2 antibody is prepared 4X to aim for a final concentration of 10nM. The anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody is prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 0.5nM.
[0275] Les réactifs sont distribués dans les plaques 384 puits de la manière [0275] The reagents are distributed in the 384-well plates in the manner
suivante : next :
1. 10mI du mélange pré-incubé de protéine G ail + GTPgS sont placés dans chaque puit, 1.10mI of the pre-incubated mixture of garlic + GTPgS protein G are placed in each well,
2. 5mI de l’anticorps purifié sont rajoutés dans chaque puit 2.5mI of the purified antibody are added to each well
3. Les plaques sont incubées pendant 30 minutes à température ambiante 3. The plates are incubated for 30 minutes at room temperature.
4. 5mI du mélange anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et anticorps DSV36S- d2 sont rajoutés dans chaque puit. 4. 5 ml of the mixture of anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody and DSV36S-d2 antibody are added to each well.
[0276] Les plaques sont incubées 1 H à température ambiante avant de lire le signal [0276] The plates are incubated for 1 hour at room temperature before reading the signal.
HTRF. [0277] Les anticorps selon l’invention sont capables d’inhiber le signal HTRF obtenu avec de l’anticorps DSV36S-d2. A l’inverse, les anticorps qui ne sont pas selon l’invention ne sont pas capables d’inhiber le signal généré par le DSV36S-d2. HTRF. [0277] The antibodies according to the invention are capable of inhibiting the HTRF signal obtained with the DSV36S-d2 antibody. Conversely, the antibodies which are not according to the invention are not capable of inhibiting the signal generated by DSV36S-d2.
Listage de séquences Sequence listing
[0278] [Table 3] [0278] [Table 3]

Claims

Revendications Claims
1. Méthode pour déterminer la capacité d'une molécule à moduler l'activation d'un récepteur couplé à une protéine G (RCPG), ladite méthode comprenant les étapes suivantes : 1. A method for determining the capacity of a molecule to modulate the activation of a receptor coupled to a G protein (GPCR), said method comprising the following steps:
a) introduction, dans un premier contenant : a) introduction, in a first container:
- d'une préparation membranaire portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéine(s) Galpha, - a membrane preparation carrying one or more GPCRs and one or more Galpha protein (s),
- d'une source de GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET, - a source of non-hydrolysable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a first member of a pair of RET partners,
- d'un ligand de la sous-unité alpha d'une protéine G (protéine Galpha) marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, ledit ligand étant capable de se lier à la protéine Galpha pleine liée au GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par le premier membre d'un couple de partenaires de RET, - a ligand of the alpha subunit of a G protein (Galpha protein) labeled with a second member of the pair of RET partners, said ligand being capable of binding to the full Galpha protein bound to the non-hydrolyzable GTP or slowly hydrolyzable labeled by the first member of a pair of RET partners,
- éventuellement d'un agoniste du RCPG ; - possibly an agonist of GPCR;
b) mesure du signal de RET émis dans le premier contenant ; b) measurement of the RET signal emitted in the first container;
c) introduction (i) dans un second contenant, des mêmes réactifs qu'à l'étape a) et de la molécule à tester ou (ii) dans le premier contenant, de la molécule à tester ; d) mesure du signal de RET émis dans le second contenant ou dans le premier contenant obtenu à l'étape c) ; c) introduction (i) into a second container, of the same reagents as in step a) and of the molecule to be tested or (ii) into the first container, of the molecule to be tested; d) measuring the RET signal emitted in the second container or in the first container obtained in step c);
e) comparaison des signaux obtenus aux étapes b) et d), une modulation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est capable de moduler l'activation du RCPG. e) comparison of the signals obtained in steps b) and d), modulation of the signal obtained in step d) with respect to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is capable of modulating the activation of the RCPG.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le premier contenant ne contient pas un agoniste du RCPG et à l'étape e) une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG. 2. Method according to claim 1, wherein the first container does not contain an agonist of GPCR and in step e) a decrease in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is an agonist of GPCR.
3. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le premier contenant comprend un agoniste du RCPG et à l'étape e) : 3. Method according to claim 1, wherein the first container comprises a GPCR agonist and in step e):
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ; - an increase in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is an antagonist or a negative allosteric modulator of GPCR;
- une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG. a decrease in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is an agonist or a positive allosteric modulator of RCPG.
4. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le premier contenant ne comprend pas un agoniste du RCPG et à l'étape e) une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste du RCPG. 4. Method according to claim 1, in which the first container does not include an agonist of GPCR and in step e) an increase in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is an agonist of GPCR.
5. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le premier contenant comprend un agoniste du RCPG et à l'étape e) : 5. The method of claim 1, wherein the first container comprises an agonist of RCPG and in step e):
- une diminution du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un antagoniste ou un modulateur allostérique négatif du RCPG ; a decrease in the signal obtained in step d) compared to that obtained in step b) indicating that the test molecule is an antagonist or a negative allosteric modulator of RCPG;
- une augmentation du signal obtenu à l'étape d) par rapport à celui obtenu à l'étape b) indiquant que la molécule à tester est un agoniste ou un modulateur allostérique positif du RCPG. an increase in the signal obtained in step d) relative to that obtained in step b) indicating that the molecule to be tested is an agonist or a positive allosteric modulator of RCPG.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la protéine Galpha est choisie parmi la protéine Galphail, Galphai2, Galphai3, 6. Method according to any one of claims 1 to 5, in which the Galpha protein is chosen from the protein Galphail, Galphai2, Galphai3,
Galphaol, Galphao2, Galphaq, Galphal2, Galphal3, Galphas, Galphaz, Galphatl, Galphat2, Galphail, Galpha 14, Galpha 15, Galpha 16 et Galphagus, de préférence choisie parmi la protéine Galphail, Galphai2 et Galphai3. Galphaol, Galphao2, Galphaq, Galphal2, Galphal3, Galphas, Galphaz, Galphatl, Galphat2, Galphail, Galpha 14, Galpha 15, Galpha 16 and Galphagus, preferably chosen from the protein Galphail, Galphai2 and Galphai3.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le ligand est choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un anticorps ou un fragment d'anticorps. 7. Method according to any one of the preceding claims, in which the ligand is chosen from an antibody, an antibody fragment, a peptide or an aptamer, preferably an antibody or an antibody fragment.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est choisi parmi le GTPgammaS (GTPyS ou GTPgS), le GppNHp et le GppCp. 8. Method according to any one of the preceding claims, in which the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is chosen from GTPgammaS (GTPyS or GTPgS), GppNHp and GppCp.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'un des membres du couple de partenaires de RET est un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur et l'autre membre du couple de partenaires de RET est un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). 9. Method according to any one of the preceding claims, in which one of the members of the pair of RET partners is a fluorescent donor or luminescent donor compound and the other member of the pair of RET partners is a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent donneur et le ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). 10. Method according to any one of claims 1 to 9, wherein the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is labeled with a fluorescent donor compound and the ligand of the Galpha protein is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-acceptor compound. fluorescent (quencher).
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher) et ligand de la protéine Galpha est marqué par un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur. 11. Method according to any one of claims 1 to 9, in which the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher) and ligand of the Galpha protein is labeled with a. fluorescent donor or luminescent donor compound.
12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans laquelle le composé fluorescent donneur est un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole. 12. Method according to any one of claims 9 to 11, in which the fluorescent donor compound is a FRET partner chosen from: a europium cryptate, a europium chelate, a terbium chelate, a terbium cryptate, a ruthenium chelate, a quantum dot, the allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives and nitrobenzoxadiazole.
13. Méthode selon l'une quelconque des revendication 9 à 12, dans laquelle le composé fluorescent accepteur est un partenaire de FRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed. 13. Method according to any one of claims 9 to 12, in which the fluorescent acceptor compound is a FRET partner chosen from: allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazole, a quantum dot, GFP, GFP variants chosen from GFP10, GFP2 and eGFP, YFP, YFP variants selected from eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus and YPet, mOrange, DsRed.
14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans laquelle le composé luminescent donneur est un partenaire de BRET choisi parmi : la Luciférase (lue), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase. 14. Method according to any one of claims 9 to 11, in which the luminescent donor compound is a BRET partner chosen from: Luciferase (read), Renilla Luciferase (Rluc), variants of Renilla Luciferase (Rluc8) and Firefly Luciferase.
15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 et 14, dans laquelle le composé fluorescent accepteur est un partenaire de BRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed. 15. Method according to any one of claims 9 to 11 and 14, in which the fluorescent acceptor compound is a BRET partner chosen from: allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines , fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazole, a quantum dot, GFP, GFP variants chosen from GFP10, GFP2 and eGFP, YFP, YFP variants chosen from eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus and YPet, the mOrange, the DsRed.
16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-10 et 12-15, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET est un composé fluorescent donneur de formule générale (I) : 16. A method according to any one of claims 1-10 and 12-15, wherein the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a first member of a pair of RET partners is a fluorescent donor compound of general formula ( I):
dans laquelle : in which :
X = O, NH ou CH2 ; X = O, NH or CH 2 ;
Y = O, NH ou CH2 ; Y = O, NH or CH 2 ;
L est un groupe de liaison divalent ; L is a divalent linking group;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3. Ln 3+ is a lanthanide complex optionally carrying a reactive group G 3 .
17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-9 et 11-15, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET est choisi parmi GTPgN-octyl-Cy5, GTPgN-octyl-AF488, GTPgN-L15-Fluorescein, GTPgO-Linker-Cy5(P) ou GTPgS-Linker- Cy5(R). 17. Method according to any one of claims 1-9 and 11-15, in which the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a first member of a pair of RET partners is chosen from GTPgN-octyl-Cy5, GTPgN-octyl-AF488, GTPgN-L15-Fluorescein, GTPgO-Linker-Cy5 (P) or GTPgS-Linker-Cy5 (R).
18. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET est choisi parmi GTPgN-C2 (GTP- gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP-gamma-N- octyl-C2), GTPgN-octyl-Cl l (GTP-gamma-N-octyl-Cl l), GTPgN-octyl-C3 (GTP- gamma-N-octyl-C3), GTPgO-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPgO-hexyl-C3 (GTP-gamma-0-hexyl-C3) ou GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N- octyl-thiosuccinimidyl-C2), de préférence GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2. 18. Method according to any one of the preceding claims, in which the non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a first member of a pair of RET partners is chosen from GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2) , GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl-Cl l (GTP-gamma-N-octyl-Cl l), GTPgN-octyl-C3 (GTP- gamma-N-octyl-C3), GTPgO-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPgO-hexyl-C3 (GTP-gamma-0-hexyl-C3) or GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-C2), preferably GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
19. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le ligand de la protéine Galpha est un anticorps ou un fragment d'anticorps qui se lie spécifiquement au domaine SwitchlI de la protéine Galphai, de préférence au peptide 215-294 dans la protéine Galphai. 19. Method according to any one of the preceding claims, in which the ligand of the Galpha protein is an antibody or an antibody fragment which binds specifically to the SwitchII domain of the Galphai protein, preferably to the peptide 215-294 in the. Galphai protein.
20. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la protéine Galpha est choisie parmi Galphai 1, Galphai2 et Galphai3 et le ligand de la protéine Galpha entre en compétition pour la liaison à la protéine Galpha avec le peptide de séquence Ser-Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr-Flis-Gly-Ile-Trp-Val-Gly-Glu- Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Arg (SEQ ID No : 1). 20. Method according to any one of the preceding claims, in which the Galpha protein is chosen from Galphai 1, Galphai2 and Galphai3 and the ligand of the Galpha protein competes for binding to the Galpha protein with the peptide of sequence Ser-. Ser-Arg-Gly-Tyr-Tyr-Flis-Gly-Ile-Trp-Val-Gly-Glu-Glu-Gly-Arg-Leu-Ser-Arg (SEQ ID No: 1).
21. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le ligand de la protéine Galpha est un anticorps choisi parmi : 21. Method according to any one of the preceding claims, in which the ligand of the Galpha protein is an antibody chosen from:
(i) un anticorps ou un fragment d’anticorps capable de se lier à la protéine G alpha, qui comprend : (i) an antibody or an antibody fragment capable of binding to G alpha protein, which comprises:
- un domaine variable d’une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 2, un CDR2 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 3, et un CDR3 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 4, et - a variable domain of a heavy chain comprising a CDR1 of sequence of amino acids SEQ ID NO: 2, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 3, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO: 4, and
- un domaine variable d’une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 5, un CDR2 de séquence d’acides aminés DTS, et un CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 6 ; ou - a variable domain of a light chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 5, a CDR2 of DTS amino acid sequence, and a CDR3 of the variable domain of the light chain consists of the sequence of amino acids SEQ ID NO: 6; or
(ii) un anticorps ou un fragment d’anticorps qui entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l’anticorps ou le fragment d’anticorps selon (i). (ii) an antibody or an antibody fragment which competes for binding to the alpha G protein with the antibody or the antibody fragment according to (i).
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