EP3877537A1 - Procédé biocatalytique de production de 2h-hbo et d'analogues beta subtitues à partir de lgo utilisant une cyclohexanone monooxygénase - Google Patents

Procédé biocatalytique de production de 2h-hbo et d'analogues beta subtitues à partir de lgo utilisant une cyclohexanone monooxygénase

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EP3877537A1
EP3877537A1 EP19818241.2A EP19818241A EP3877537A1 EP 3877537 A1 EP3877537 A1 EP 3877537A1 EP 19818241 A EP19818241 A EP 19818241A EP 3877537 A1 EP3877537 A1 EP 3877537A1
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EP
European Patent Office
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lgo
hbo
cyclic
hydroxymethyl
linear
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Pending
Application number
EP19818241.2A
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German (de)
English (en)
Inventor
Florent ALLAIS
Louis MOUTERDE
John Dale Stewart
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
University of Florida
University of Florida Research Foundation Inc
Original Assignee
Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
University of Florida
University of Florida Research Foundation Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech, University of Florida, University of Florida Research Foundation Inc filed Critical Institut des Sciences et Industries du Vivant et de lEnvironnement AgroParisTech
Publication of EP3877537A1 publication Critical patent/EP3877537A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/99—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with other acceptors (1.6.99)
    • C12Y106/99001—NADPH dehydrogenase (1.6.99.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13022—Cyclohexanone monooxygenase (1.14.13.22)

Definitions

  • the invention relates to the field of the production of 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone (2H-HBO) from levoglucosenone (LGO). More particularly, the invention relates to an eco-compatible process for the synthesis of 2H-HBO optionally substituted at b with the lactone function from LGO or from a saturated form of LGO such as dihydrolevoglucosenone (2H-LGO) or hydrate of LGO (OH-LGO) by biocatalytic reaction using a cyclohexanone monooxygenase (CHMO).
  • 2H-HBO 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone
  • LGO levoglucosenone
  • CHMO cyclohexanone monooxygenase
  • Lignocellulosic biomass is one of the most exploited green sources of carbon compounds.
  • LGO Levoglucosenone
  • HBO 4-hydroxymethyl-a, p-butenolide
  • 2H-HBO 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone
  • Typical LGO enhancement routes in HBO and / or 2H-HBO are illustrated in Figure 1. These pathways use metals, on the one hand, and oxygenated water, on the other hand, two reagents whose undesirable effects are well known, both for the environment and in a context of industrial exploitation.
  • the inventors have developed a new process for the production of 2H-HBO from 2H-LGO using a natural enzyme, namely a cyclohexanone monooxygenase (CHMO), to replace hydrogen peroxide.
  • a natural enzyme namely a cyclohexanone monooxygenase (CHMO)
  • CHMO cyclohexanone monooxygenase
  • the CHMO activity can for example be carried by an enzyme derived from Acinetobacter sp. or Pseudomonas aeruginosa or any enzyme with the same activity.
  • the inventors propose a biocatalytic process for the production of 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone (2H-HBO) optionally substituted at b of the lactone function from levoglucosenone (LGO) in a saturated form represented by formula (I)
  • R represents an H or an OH group, NH2, SH, linear, cyclic or branched alkyl, OR1 (with Ri linear, cyclic or branched alkyl, silyl, acyl, benzyl, benzoyl), NHR1 (with Ri linear, cyclic alkyl or branched), NR1R2 (with Ri and R2 alkyl linear, cyclic or branched), SR1 (with Ri alkyl linear, cyclic or branched) or thioacetal, using a natural enzyme with CHMO activity.
  • OR1 with Ri linear, cyclic or branched alkyl, silyl, acyl, benzyl, benzoyl
  • NHR1 with Ri linear, cyclic alkyl or branched
  • NR1R2 with Ri and R2 alkyl linear, cyclic or branched
  • SR1 with Ri alkyl linear, cyclic or branched
  • LGO is used in its saturated form (eg 2H-LGO also called Cyrene ® ).
  • LGO in a saturated form is meant a levoglucosenone molecule whose carbons in positrons a and b of the ketone function are saturated.
  • An example of a saturated molecule in positions a and b is the 2H-LGO (or Gyrene ®).
  • an LGO molecule in a saturated form is represented by the formula (I) as defined above.
  • the LGO in saturated form is 2H-LGO and OH-LGO.
  • the LGO is in a saturated diastereoisomerically pure form represented by formula (II).
  • R represents an H or an OH group, NH2, SH, linear, cyclic or branched alkyl, OR1 (with Ri linear, cyclic or branched alkyl, silyl, acyl, benzyl, benzoyl), NHR1 (with Ri linear, cyclic alkyl or connected), NR1R2 (with Ri and R2 alkyl linear, cyclic or connected), SR1 (with Ri alkyl linear, cyclic or connected) or thioacetal.
  • R represents an H or an OH group, NH2, SH, linear, cyclic or branched alkyl, OR1 (with Ri linear, cyclic or branched alkyl, silyl, acyl, benzyl, benzoyl), NHR1 (with Ri linear, cyclic alkyl or connected), NR1R2 (with Ri and R2 alkyl linear,
  • the subject of the invention relates in particular to a process for the synthesis of 2H-HBO or of OH-HBO from 2H-LGO or of OH-LGO respectively, comprising a biocatalysis reaction using a CHMO followed by hydrolysis acid.
  • this process allows the synthesis of 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone (2H-HBO) optionally substituted at b of the lactone function such as (3S, 4R) -3-hydroxy-4-hydroxymethyl-y-butyrolactone, ( 3S, 4R) -3-methyl-4-hydroxymethyl-y-butyrolactone, (3S, 4R) -3-mercapto-4-hydroxymethyl-y- butyrolactone, (3S, 4R) -3-amino-4-hydroxymethyl-y -butyrolactone, etc.
  • 2H-HBO 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone
  • Any enzyme exhibiting CHMO activity can be used in this process.
  • enzyme exhibiting CHMO activity or "CHMO” is meant in particular the CHMO derived from Acinetobacter sp. or the Pseudomonas aeruginosa CHMO or any enzyme exhibiting the same activity, in particular variants thereof.
  • variant is meant any enzyme having CHMO activity and having a sequence homology of at least 85% with one of the sequences SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.3 defined below. This homology is preferably at least 90%, or even 95% or 98%.
  • Tables 1 and 2 show examples of such variants.
  • the nucleotide sequence of CHMO from strain NCIMB 9871 of Acinetobacter sp. is represented by the sequence SEQ ID NO.1; the corresponding protein sequence is represented by the sequence SEQ ID NO.2.
  • the nucleotide sequence of CHMO originating from the strain Pa1242 of Pseudomonas aeruginosa is represented by the sequence SEQ ID NO.3; the corresponding protein sequence is represented by the sequence SEQ ID NO.4.
  • the cyclohexanone monooxygenase is an enzyme coded by the sequences SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.3 or a variant of one of these enzymes having a sequence homology d '' at least 85% with one of these sequences, provided that the CHMO activity is preserved.
  • the synthesis reaction of 2H-HBO according to the invention firstly comprises the conversion of 2H-LGO into a relatively unstable intermediate, known as “cracked”, which gives rise to a second intermediate , formulated this one (2H-FBO). Acid hydrolysis then makes it possible to obtain 2H-HBO from 2H-FBO.
  • a relatively unstable intermediate known as “cracked”
  • 2H-FBO acid hydrolysis
  • the acid hydrolysis step can be carried out by any method known to a person skilled in the art, for example using hydrochloric acid, in particular in solution in methanol, acetic acid, sulfuric acid. , an Amberiyst® type resin or any acid zeolite.
  • the method according to the invention further comprises a preliminary step of transformation of LGO into a saturated molecule of formula (I), such as 2H-LGO.
  • This transformation step can be carried out using heavy metals such as palladium, nickel or platinum, and dihydrogen.
  • this step is carried out by a hydrogenation reaction not using heavy metals or dihydrogen (H2).
  • H2 heavy metals or dihydrogen
  • such a reaction can be carried out using an alkene reductase enzyme such as OYE 2.6, as described in application WO2018 / 183706, or any enzyme having the same activity, including variants thereof.
  • the transformation of LGO into a saturated molecule is carried out within a single reaction medium (so-called “one-pot” reaction), this reaction medium containing the catalysts or enzymes necessary for the transformation on the one hand of the LGO into a saturated molecule of formula (I), and on the other hand of the saturated molecule of formula (I) into a molecule of 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone (2H-HBO) possibly substituted at b of the lactone function, such as 2H-HBO. So we can get 2H-HBO from LGO in one easy way.
  • This reaction is shown in Figure 3.
  • the transformation of LGO into 2H-LGO is obtained by the action of an alkene reductase, for example OYE 2.6.
  • the OYE 2.6 alkene reductase sequence is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO. 5; the corresponding protein sequence is represented by the sequence SEQ ID NO.6.
  • the transformation of 2H-LGO into 2H-HBO or of OH-LGO into OH-HBO is obtained by the action of a CHMO, in particular of the CHMO of Acinetobacter sp. or CHMO of Pseudomonas aeruginosa or a variant of these enzymes.
  • the transformation of LGO into 2H-LGO is obtained by the action of an alkene reductase and the transformation of 2H-LGO into 2H-HBO is obtained through the action of a CHMO.
  • Such a “one-pot” reaction can be carried out in a synthetic medium or in biotransformation using whole cells.
  • the cells used can be any type of cell suitable for this use, such as bacteria or animal or plant cells.
  • Figure 1 Classic ways of valuing LGO and / or 2H-LGO into 2H-HBO.
  • Figure 2 Process for the synthesis of 2H-HBO from LGO and / or 2H-LGO by a biocatalysis reaction using CHMO.
  • Figure 3 Method of "one-pot” synthesis of 2H-HBO from LGO by a biocatalysis reaction using CHMO and the alkene reductase OYE 2.6.
  • Figure 4 Process for the synthesis of 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone (2H-HBO) optionally substituted at b of the lactone function from levoglucosenone (LGO) in a saturated form.
  • 2H-HBO 4-hydroxymethyl-y-butyrolactone
  • Cyrène® was verified by thin layer chromatography. The analysis revealed that the Cyrène® was completely transformed into an intermediate being neither 2H-FBO nor 2H-HBO (intermediate called “Criégée”). The solution was then evaporated in vacuo and the raw material analyzed by NMR, confirming the analyzes by thin layer chromatography.
  • Acid hydrolysis (HCl, 2 hours at 45 ° C) makes it possible to convert this intermediate into 2H-FBO then 2H-HBO.
  • Example 2 The same methodology as in Example 2 was used to transform an Escherichia coli BL21 strain using a plasmid carrying a sequence originating from the Pa1242 strain of Pseudomonas aeruginosa.
  • the sequence introduced was described as potentially coding for an enzyme having NAD (P) / FAD-dependent oxidoreductase activity, therefore capable of carrying cyclohexanone monooxygenase activity.
  • the inventors have shown for the first time that this sequence actually has the suspected activity. Indeed, they tested its ability to convert Cyrene to 2H-HBO and thus showed that it does indeed carry cyclohexanone monooxygenase activity.

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Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la production de 4-hydroxyméthyl-γ-butyrolactone (2H- HBO) à partir de lévoglucosénone (LGO). Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé éco-compatible de synthèse de 2H-HBO éventuellement substitué en β de la fonction lactone à partir de LGO ou d'une forme saturée de LGO telle que la dihydrolévoglucosénone (2H-LGO) ou l'hydrate de LGO (OH-LGO) par réaction biocatalytique mettant en œuvre une cyclohexanone monooxygénase (CHMO).

Description

PROCEDE BIOCATALYTIQUE DE PRODUCTION DE 2H-HBO ET D'ANALOGUES b SUBTITUES A PARTIR DE LGO UTILISANT UNE CYCLOHEXANONE
MONOOXYGENASE
L’invention se rapporte au domaine de la production de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H- HBO) à partir de lévoglucosénone (LGO). Plus particulièrement, l’invention concerne un procédé éco-compatible de synthèse de 2H-HBO éventuellement substitué en b de la fonction lactone à partir de LGO ou d’une forme saturée de LGO telle que la dihydrolévoglucosénone (2H-LGO) ou l’hydrate de LGO (OH-LGO) par réaction biocatalytique mettant en oeuvre une cyclohexanone monooxygénase (CHMO).
Introduction
Afin de s’affranchir des problèmes de dépendance vis-à-vis des énergies fossiles, de nombreux procédés de production de composés chimiques d’intérêt ont été développés dans les dernières décennies à partir de biomasse. La biomasse lignocellulosique est l’une des sources vertes de composés carbonés la plus exploitée.
La lévoglucosénone (LGO) est l’un des produits les plus intéressants pouvant ainsi être obtenus à partir de biomasse, notamment par une technologie de flash pyrolyse de cellulose. La LGO est couramment employée en tant que produit de départ pour la synthèse de divers composés chimiques d’intérêt, en particulier de 4-hydroxyméthyl-a,p-buténolide (HBO) et de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO). Ces composés constituent des intermédiaires chimiques asymétriques (chiraux) à forte valeur ajoutée ; ils sont en effet fréquemment mis en oeuvre dans l’industrie agroalimentaire, pour la production de fragrances et d’arômes, ou encore dans l’industrie pharmaceutique, pour la production de principes actifs de médicaments, tirant profit de leur noyau lactonique et de leur centre chiral.
Dans la continuité de la démarche d’utilisation de produits biochimiques biosourcés et obtenus par des procédés verts, il est souhaitable de développer des procédés industriels de transformation de LGO en HBO et 2H-HBO ou toute autre molécule apparentée, dont l’impact écologique soit le plus faible possible. Etat de la technique
Des voies de valorisation classiques de la LGO en HBO et/ou 2H-HBO sont illustrées à la Figure 1 . Ces voies utilisent d’une part des métaux, et d’autre part de l’eau oxygénée, deux réactifs dont des effets indésirables sont bien connus, tant pour l’environnement que dans un contexte d’exploitation industrielle.
Dans le but de proposer une nouvelle voie de production de la 2H-HBO plus éco-compatible, les inventeurs ont cherché à réduire autant que possible l’utilisation de solvants organiques et de réactifs toxiques.
Des travaux récents des inventeurs ont permis de proposer une nouvelle voie d’hydrogénation de la LGO en 2H-LGO et de la HBO en 2H-HBO n’utilisant pas de métaux mais une enzyme, l’alkène réductase OYE 2.6 (WO2018/183706).
Toutefois, le procédé global de production de 2H-HBO, bien qu’exempt de l’utilisation de métaux, reste consommateur d’eau oxygénée (H2O2), molécule dont l’utilisation est délicate au niveau industriel (danger lors de la manipulation, pollution...).
Avantages de l’invention
Les inventeurs ont développé un nouveau procédé de production de 2H-HBO à partir de 2H- LGO en utilisant une enzyme naturelle, à savoir une cyclohexanone-monooxygénase (CHMO), en remplacement de l’eau oxygénée.
L’activité CHMO peut par exemple être portée par une enzyme issue d’Acinetobacter sp. ou de Pseudomonas aeruginosa ou une toute enzyme ayant la même activité.
Ce procédé présente plusieurs avantages :
Il est éco-compatible, du fait de l’absence de solvant organique et de métaux ;
Il est industriellement viable ;
Il ne présente pas de risques d’exothermicité et/ou d’explosion contrairement à la voie de synthèse faisant intervenir H2O2 ;
Il peut être mis en oeuvre par biotransformation, notamment en utilisant des cellules qui expriment une cyclohexanone monooxygénase. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Les inventeurs proposent un procédé biocatalytique de production de 4-hydroxyméthyl-y- butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone à partir de lévoglucosénone (LGO) sous une forme saturée représentée par la formule (I)
dans laquelle R représente un H ou un groupement OH, NH2, SH, alkyl linéaire, cyclique ou branché, OR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché, silyle, acyle, benzyl, benzoyle), NHR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché), NR1R2 (avec Ri et R2 alkyl linéaire, cyclique ou branché), SR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché) ou thioacétal, utilisant une enzyme naturelle présentant une activité CHMO.
En effet, les inventeurs ont au préalable mis en évidence qu’une condition indispensable à la réaction de Baeyer-Villiger de la LGO par une CHMO est que la LGO soit utilisée sous sa forme saturée (par exemple 2H-LGO, aussi appelée Cyrène®).
Par « LGO sous une forme saturée », on désigne une molécule de lévoglucosénone dont les carbones en positons a et b de la fonction cétone sont saturés. Un exemple de molécule saturée en positions a et b est la 2H-LGO (ou Cyrène®). Dans sa définition générale, une molécule de LGO sous une forme saturée est représentée par la formule (I) telle que définie ci-dessus.
Dans un mode de réalisation préféré, la LGO sous une forme saturée est 2H-LGO et OH-LGO.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la LGO est sous une forme saturée diastéréoisomériquement pure représentée par la formule (II). dans laquelle R représente un H ou un groupement OH, NH2, SH, alkyl linéaire, cyclique ou branché, OR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché, silyle, acyle, benzyl, benzoyle), NHR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché), NR1R2 (avec Ri et R2 alkyl linéaire, cyclique ou branché), SR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché) ou thioacétal.
Ainsi, l’objet de l’invention concerne notamment un procédé de synthèse de 2H-HBO ou de OH-HBO à partir de 2H-LGO ou de OH-LGO respectivement, comprenant une réaction de biocatalyse utilisant une CHMO suivie d’une hydrolyse acide. Plus généralement, ce procédé permet la synthèse de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone tel que (3S,4R)-3-hydroxy-4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone, (3S,4R)-3-méthyl-4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone, (3S,4R)-3-mercapto-4-hydroxyméthyl-y- butyrolactone, (3S,4R)-3-amino-4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone, etc.
Toute enzyme présentant une activité CHMO peut être mise en oeuvre dans ce procédé.
Par « enzyme présentant une activité CHMO » ou « CHMO », on entend en particulier la CHMO issue d’Acinetobacter sp. ou la CHMO de Pseudomonas aeruginosa ou toute enzyme présentant la même activité, notamment des variants de celles-ci. Par « variant », on entend toute enzyme présentant une activité CHMO et présentant une homologie de séquence d’au moins 85% avec l’une des séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.3 définies ci-après. Cette homologie est de préférence d’au moins 90%, voire de 95% ou 98%.
Les Tableaux 1 et 2 présentent des exemples de tels variants.
Tableau 1 : Variants de la CHMO d’Acinetobacter sp. NCIMB9871
Tableau 2 : Variants de la CHMO de Pseudomonas aeruginosa strain Pa1242
La séquence nucléotidique de la CHMO issue de la souche NCIMB 9871 d’Acinetobacter sp. est représentée par la séquence SEQ ID NO.1 ; la séquence protéique correspondante est représentée par la séquence SEQ ID NO.2.
La séquence nucléotidique de la CHMO issue de la souche Pa1242 de Pseudomonas aeruginosa est représentée par la séquence SEQ ID NO.3 ; la séquence protéique correspondante est représentée par la séquence SEQ ID NO.4. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l’invention, la cyclohexanone monooxygénase est une enzyme codée par les séquences SEQ ID NO.1 ou SEQ ID NO.3 ou un variant de l’une de ces enzymes présentant une homologie de séquence d’au moins 85% avec l’une de ces séquences, pour autant que l’activité CHMO soit conservée.
Dans un mode de réalisation particulier, la réaction de synthèse de la 2H-HBO selon l’invention comprend tout d’abord la conversion de la 2H-LGO en un intermédiaire relativement instable, dit « criégée », qui donne lieu à un second intermédiaire, formylé celui-ci (2H-FBO). Une hydrolyse acide permet ensuite l’obtention de la 2H-HBO à partir de la 2H-FBO. Une telle réaction est illustrée dans son ensemble à la Figure 2.
Le même type de conversion impliquant la formation d’un intermédiaire instable est observé lors de la réaction de synthèse de OH-HBO à partir de la OH-LGO et plus généralement lors de la synthèse de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone à partir de lévoglucosénone (LGO) sous une forme saturée.
L’étape d’hydrolyse acide peut être réalisée par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple mettant en œuvre de l'acide chlorhydrique, notamment en solution dans le méthanol, de l’acide acétique, de l'acide sulfurique, une résine de type Amberiyst® ou encore tout zéolite acide.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention comprend en outre une étape préalable de transformation de la LGO en une molécule saturée de formule (I), telle que la 2H-LGO. Cette étape de transformation peut être réalisée à l’aide de métaux lourds tels que le palladium, le nickel ou le platine, et de dihydrogène. Dans un mode de réalisation préféré, cette étape est réalisée par une réaction d’hydrogénation n’utilisant pas de métaux lourds, ni de dihydrogène (H2). Dans le cas où le procédé consiste en la conversion de LGO en 2H-LGO, une telle réaction peut être réalisée en utilisant une enzyme alkène réductase telle que la OYE 2.6, comme cela est exposé dans la demande WO2018/183706, ou toute enzyme présentant la même activité, notamment des variants de celle-ci.
Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la transformation de la LGO en une molécule saturée est réalisée au sein d’un seul milieu réactionnel (réaction dite « one-pot »), ce milieu réactionnel contenant les catalyseurs ou enzymes nécessaires à la transformation d’une part de la LGO en une molécule saturée de formule (I), et d’autre part de la molécule saturée de formule (I) en une molécule de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone, telle que la 2H-HBO. Ainsi, on peut obtenir de manière simplifiée de la 2H-HBO à partir de LGO en une seule étape. Cette réaction est représentée à la Figure 3.
Dans un mode de réalisation préféré de ce procédé one-pot, la transformation de la LGO en 2H-LGO est obtenue grâce à l’action d’une alkène réductase, par exemple la OYE 2.6.
La séquence de l’alkène réductase OYE 2.6. est représentée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO. 5 ; la séquence protéique correspondante est représentée par la séquence SEQ ID NO.6.
Dans un autre mode de réalisation préféré de ce procédé one-pot, la transformation de la 2H- LGO en 2H-HBO ou de la OH-LGO en OH-HBO est obtenue grâce à l’action d’une CHMO, en particulier de la CHMO d’Acinetobacter sp. ou de la CHMO de Pseudomonas aeruginosa ou d’un variant de ces enzymes.
Dans un mode de réalisation tout à fait préféré de ce procédé one-pot, la transformation de la LGO en 2H-LGO est obtenue grâce à l’action d’une alkène réductase et la transformation de la 2H-LGO en 2H-HBO est obtenue grâce à l’action d’une CHMO.
Une telle réaction « one-pot » peut être réalisée en milieu synthétique ou en biotransformation en utilisant des cellules entières. Pour la biotransformation, les cellules utilisées peuvent être tout type de cellules appropriées à cet usage telles que des bactéries ou des cellules animales ou végétales.
Les différents modes de réalisation décrits précédemment se rapportent à une même réaction générale et leur combinaison est prévue dans le cadre de cette divulgation.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d’illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Voies classiques de valorisation de la LGO et/ou de la 2H-LGO en 2H-HBO. Figure 2 : Procédé de synthèse de 2H-HBO à partir de LGO et/ou de 2H-LGO par une réaction de biocatalyse utilisant la CHMO.
Figure 3: Procédé de synthèse « one-pot » de 2H-HBO à partir de LGO par une réaction de biocatalyse utilisant la CHMO et l’alkène réductase OYE 2.6.
Figure 4 : Procédé de synthèse de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone à partir de lévoglucosénone (LGO) sous une forme saturée.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Production de 2H-HBO à partir de 2H-LGO en milieu synthétique
Dans une solution contenant 20 mM Cyrène®, 50 mM Glucose, 0,5 mM NADP+, 0,25 mM FADH2 et 62,5 U Glucose dehydrogenase (GDH) dans un volume final de 25 mL de tampon phosphate 0.1 M pH 8,0 a été ajouté 150 pL de CHMO purifiée. La solution a été magnétiquement agitée (200 rpm) sur une période de 12 heures à 37 °C.
La consommation totale du Cyrène® a été vérifiée par chromatographie sur couche mince. L'analyse a révélé que le Cyrène® a été totalement transformé en un intermédiaire n'étant ni 2H-FBO ni 2H-HBO (intermédiaire dit « Criégée »). La solution a ensuite été évaporée sous vide et le matériel brut analysé par RMN, confirmant les analyses par chromatographie sur couche mince.
Une hydrolyse acide (HCl, 2 heures à 45 °C) permet de convertir cet intermédiaire en 2H-FBO puis 2H-HBO.
Un contrôle négatif a été réalisé reprenant les mêmes conditions sans ajout de CHMO. Dans ces conditions, aucune transformation de Cyrène® n’a été observée (chromatographie sur couche mince), ce qui confirme la spécificité d’action de la CHMO sur la transformation du Cyrène®.
EXEMPLE 2 : Bioproduction de 2H-HBO à partir de 2H-LGO en système cellulaire chez des bactéries exprimant la CHMO d’Acinetobacter sp.
Des bactéries Escherichia coli BL21( DE3) contenant un plasmide portant un gène de résistance à l’Ampicilline et codant l’enzyme CHMO d 'Acinetobacter sp. ont été mises en culture dans 1 ml_ LB medium contenant de l'ampicilline à une concentration de 100 pg/L et incubés à 37 °C / 200 rpm sur une période de 12 heures. 500 mI_ de cette solution ont ensuite été transférés dans 50 ml_ LB medium contenant de l'ampicilline à une concentration de 100 pg/L, incubée à 37 °C sous agitation jusqu'à atteindre une ϋqboo = 0,9. La solution a ensuite été centrifugée à 4500 rpm à 4 °C sur une période de 15 minutes. Le surnageant a été éliminé et les cellules resuspendues dans 50 mL de milieu M9 minimal. IPTG et le Cyrène® ont ensuite été ajoutés à des concentrations finales de 0,15 mM et 10-40 mM respectivement.
La consommation totale du Cyrène® a été vérifiée par chromatographie sur couche mince (concentration maximale de 5,2 g/L) (NB : le système peut accepter jusqu’à 10 g/L mais à une telle concentration la conversion du Cyrène® n’est pas totale). L'analyse par chromatographie sur couche mince a révélé que le Cyrène® a été intégralement transformé en un intermédiaire dit « Criégée » différent de la 2H-FBO et de la 2H-HBO alors qu’à 10 g/L nous avons un mélange contenant du Cyrène®, l’intermédiaire en question, 2H-FBO et 2H-HBO. Une hydrolyse acide (HCl, 2 heures à 45 °C) permet la transformation de l'intermédiaire dit « Criégée » en 2H-FBO puis en molécule d’intérêt, la 2H-HBO (validée par analyse RMN).
EXEMPLE 3 : Bioproduction de 2H-HBO à partir de 2H-LGO en système cellulaire chez des bactéries exprimant la CHMO de la souche Pa1242 de Pseudomonas aeruginosa
La même méthodologie qu’à l’Exemple 2 a été employée pour transformer une souche Escherichia coli BL21 à l’aide d’un plasmide porteur d’une séquence provenant de la souche Pa1242 de Pseudomonas aeruginosa. La séquence introduite était décrite comme codant potentiellement pour une enzyme ayant une activité oxidoréductase NAD(P)/FAD-dépendent, donc susceptible de porter une activité cyclohexanone monooxygénase.
Les inventeurs ont montré pour la première fois que cette séquence a réellement l’activité suspectée. En effet, ils ont testé sa capacité à convertir le Cyrène en 2H-HBO et ont ainsi montré qu’elle porte bien une activité cyclohexanone monooxygénase.
Une conversion totale est observée pour des concentrations en Cyrène de 1 ,25, 2,5 et 5 g/L et une conversion partielle pour des concentrations de 10 et 20 g/L.
Une analyse RMN a confirmé une pureté élevée, 2H-HBO, de l’ordre de 95%.
Exemple 4 : Bioproduction de OH-HBO à partir de OH-LGO en système cellulaire chez des bactéries exprimant une CHMO
Les expériences ont été menées comme décrits aux Exemples 2 et 3. Une conversion totale est observée pour des concentrations en OH-LGO de 1 g/L. De plus, on observe la production d’un seul énantiomère, tel que cela est représenté à la Figure 4.

Claims

REVENDICATIONS 1 . Procédé de synthèse de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone à partir de lévoglucosénone (LGO) sous une forme saturée représentée par la formule (I)
dans laquelle R représente un H ou un groupement OH, NH2, SH, alkyl linéaire, cyclique ou branché, OR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché, silyle, acyle, benzyl, benzoyle), NHR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché), NR1R2 (avec Ri et R2 alkyl linéaire, cyclique ou branché), SR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché) ou thioacétal, lequel procédé comprend une réaction de biocatalyse utilisant une cyclohexanone monooxygénase suivie d’une hydrolyse acide.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite lévoglucosénone (LGO) sous une forme saturée est diastéréoisomériquement pure et représentée par la formule (II)
dans laquelle R représente un H ou un groupement OH, NH2, SH, alkyl linéaire, cyclique ou branché, OR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché, silyle, acyle, benzyl, benzoyle), NHR1 (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché), NR1R2 (avec Ri et R2 alkyl linéaire, cyclique ou branché), SRi (avec Ri alkyl linéaire, cyclique ou branché) ou thioacétal.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel ledit 4-hydroxyméthyl-y- butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone est le 4- hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) ou l’hydrate de 4-hydroxyméthyl-y- buténolide (OH-HBO).
4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3 dans lequel ladite lévoglucosénone sous une forme saturée est la dihydrolévoglucosénone (2H-LGO) ou l’hydrate de LGO (OH- LGO).
5. Procédé selon l’une des revendications 1 à 4 comprenant une étape préalable de conversion de la LGO en une molécule saturée de formule (I) telle que définie à la revendication 1.
6. Procédé selon la revendication 5 dans lequel la LGO est convertie en 2H-LGO et ladite conversion de la LGO en 2H-HBO est réalisée par une réaction utilisant une alkène réductase.
7. Procédé de synthèse de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) à partir de lévoglucosénone (LGO) consistant à mettre dans un même milieu réactionnel une enzyme permettant la conversion de la LGO en 2H-LGO et une enzyme permettant la conversion de 2H-LGO en une molécule de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H- HBO), ladite enzyme de conversion de 2H-LGO en 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) étant une cyclohexanone monooxygénase.
8. Procédé selon la revendication 7 dans laquelle ladite enzyme permettant la conversion de la LGO en 2H-LGO est un enzyme alkène réductase.
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel ladite enzyme cyclohexanone monooxygénase est issue d’une souche d’Acinetobacter sp., ou d’une souche de Pseudomonas aeruginosa.
10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel ladite cyclohexanone monooxygénase est une enzyme codée par les séquences SEQ ID NO.1 ou SEQ ID NO.3 ou un variant de l’une de ces enzymes présentant une homologie de séquence d’au moins 85% avec l’une de ces séquences.
1 1 . Procédé selon l’une des revendications 6 ou 8, dans lequel ladite alkène réductase est l’alkène réductase OYE 2.6 codée par la séquence SEQ ID NO. 5 ou l’un de ses variants présentant la même activité.
12. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel la réaction de synthèse de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone est réalisée en milieu synthétique.
13. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans lequel la réaction de synthèse de 4-hydroxyméthyl-y-butyrolactone (2H-HBO) éventuellement substitué en b de la fonction lactone est réalisée par biotransformation en utilisant des cellules entières.
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