EP3788056A1 - Automated synthesis reactor system with a recirculation loop - Google Patents

Automated synthesis reactor system with a recirculation loop

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Publication number
EP3788056A1
EP3788056A1 EP18758651.6A EP18758651A EP3788056A1 EP 3788056 A1 EP3788056 A1 EP 3788056A1 EP 18758651 A EP18758651 A EP 18758651A EP 3788056 A1 EP3788056 A1 EP 3788056A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reactor
solid phase
peptide synthesis
phase peptide
recirculation loop
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP18758651.6A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Olivier Ludemann-Hombourger
Isabelle MARTINUZZI
Christelle BOBIER
Eric FRANCOMME
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Polypeptide Laboratories France
Original Assignee
Polypeptide Laboratories France
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Polypeptide Laboratories France filed Critical Polypeptide Laboratories France
Publication of EP3788056A1 publication Critical patent/EP3788056A1/en
Pending legal-status Critical Current

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    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/045—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers using devices to improve synthesis, e.g. reactors, special vessels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/359—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light using near infrared light
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G01N2021/8411—Application to online plant, process monitoring
    • G01N2021/8416—Application to online plant, process monitoring and process controlling, not otherwise provided for

Definitions

  • the present invention relates to an automated reactor system for performing solid phase peptide synthesis, and more particularly to an automated solid phase peptide synthesizer using a liquid recirculation loop reactor for real time measurement of species. in the reactor via measuring cells.
  • Peptides are linked amino acid chains that are the building blocks for most living organisms. As a result, the study of peptides and proteins and the ability to synthesize peptides and proteins are of great interest in the biological sciences and medicine.
  • Solid phase peptide synthesis was initiated in 1963, when RB Merrifield published the synthesis of a four-amino acid sequence using a solid phase method (RB MERRIFIELD, Solid Phase Peptide Synthesis I. Synthesis of a tetrapeptide, J. Am Chem Soc, 1963, 85 (14), pp 2149-2154).
  • the deprotection of the Fmoc group is carried out in a basic medium whereas the deprotection of the Boc group is carried out in an acid medium.
  • the Fmoc / tBu strategy is the most used because the final cut of the solid support peptide uses concentrated TFA (trifluoroacetic acid) while the Boc / Bnl strategy requires the use of concentrated hydrofluoric acid, much more dangerous and delicate to manipulate.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Boc / Bnl strategy requires the use of concentrated hydrofluoric acid, much more dangerous and delicate to manipulate.
  • Patent application WO2012056300 protects a method for real-time monitoring of solid phase peptide synthesis (SPPS) under ambient conditions to characterize peptide intermediates or on-line products.
  • SPPS solid phase peptide synthesis
  • the described technical solution enables real-time monitoring to trace the process of SPPS step reactions by using a light source, an electrospray unit, and a mass spectrometer.
  • the use of these analysis techniques have significant disadvantages, namely a sampling of dispersed samples in a solvent which also involves the destruction of said samples, unlike the method according to the invention. We are talking about a destructive method of analysis.
  • the solution cited is not quantitative and does not make it possible to know if the resin is washed well between the different steps (washing after coupling or washing the piperidine) but only to know whether the amino acid is coupled to the resin or if the amino acid is deprotected on the resin.
  • Patent application WO 2017049128 discloses a system for the control of solid phase peptide synthesis by using detectors which allow the reaction to be subsequently controlled by process modification, such as the removal of the reagent.
  • the detectors used measure in the phase liquid through a detection zone in the system, and one or more signals can be generated corresponding to the fluids.
  • the patent WO2017049128 uses an electromagnetic radiation detector placed downstream of a reactor to detect a fluid leaving the reactor to produce a signal.
  • the parameters can be modulated before or during the solid phase peptide synthesis reaction process.
  • the disadvantage of this method is that the control is carried out downstream of the reactor and not in the reactor or in a recirculation loop.
  • this method monitors the deprotection but not the monitoring of the coupling and finally, this technique does not allow the analysis in real time multi-pass and, unlike the system according to the invention, this solution involves be in large excess of reagents and solvents, which consumes a lot of reagents and is not at all economically viable.
  • Destructive analytical methods of colorimetric or spectrophotometric type, have the disadvantage of being irreversible. In addition, they generate modified products and, more importantly, they lower the yield of the final peptide because they are performed on aliquots of resin-peptide. However, these methods are widely used because they are fast and do not require expensive instrumentation.
  • Non-destructive analytical methods can also be used in batch processes. For example, there can be mentioned the monitoring of infrared reactions, based on the appearance or disappearance of functional groups, which can be applied to monitor solid phase chemical synthesis, especially in the field of organic synthesis and to monitor the coupling and deprotection during peptide synthesis. Infrared and Raman spectroscopy are widely used techniques for the detection and characterization of reaction products because they allow products to be analyzed directly on solid supports.
  • assembly reactor is a real need, in particular because unlike already existing methods, it would allow a total control of the synthesis and a step-by-step follow-up of the solid phase peptide synthesis for an optimum control of the reaction time, the use of solvents, reagents and a significant cost reduction.
  • a new real-time detection method would avoid favoring side reactions by stopping the step as soon as the reaction is complete.
  • the present invention provides such a system and methods and overcomes the limitations mentioned above.
  • the invention relates to a reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis, the reactor system comprising: an inlet pipe (1) dedicated to the introduction of resin, an inlet pipe (2) dedicated to the introduction of the synthesis and washing solvent, an inlet pipe (3) dedicated to the introduction of the deprotecting agent of the supplied amino acid, an inlet pipe (4) dedicated to the introduction of reagents, an assembly reactor (9) and a recirculation loop (10) of the reactor liquid comprising at least one measuring cell (1 1) for indirect quantification of the progress of the reaction on the solid phase .
  • the measuring cell (1 1) is a spectrophotometric measuring cell, and preferably the measuring cell (11) is a Raman spectroscopy measuring cell and even more preferably the cell of measurement.
  • measurement (1 1) is a measuring cell of near-infrared.
  • Near-infrared spectroscopy also abbreviated to SPIR (Near-Infrared Spectroscopy or NIR spectroscopy) is a quantitative and qualitative analysis technique used in chemistry. The technique uses a spectrum extending at wavelengths of 700-2500 nm (1) or between wave numbers 14286 and 4000 cm 1 (v).
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the assembly reactor (9) a filtration system.
  • a filtration system according to the invention is advantageously a filtration system of sintered stainless material and / or a filter cloth.
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises a reactor (5) for preactivating the amino acids and / or dissolving the powders and an inlet (6) connecting the reactor (5) to the assembly reactor (9).
  • the reactor system for performing solid phase peptide synthesis further comprises an additional solvent inlet line (7) and an additional reactant inlet line (8) on the reactor preactivation (5).
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the recirculation loop (10) at least one conductivity measuring cell.
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the recirculation loop (10) at least one ultraviolet absorbance measuring cell.
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the recirculation loop (10) a Raman spectroscopy measuring cell.
  • These measuring cells may be additional to the measuring cells already present in the recirculation mouth.
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises a self-priming pump at the inlet line (7) dedicated to the introduction of the synthesis solvent.
  • the reactor system for performing solid phase peptide synthesis further comprises a level sensor for measuring the level of resins and / or liquid in the reactor.
  • the level sensor allows a continuous level measurement of the liquids present in the reactor and thus to have a real-time monitoring of the washing to optimize the efficiency and reduce the volume of solvent used.
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the assembly reactor (9) a pressure sensor.
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the assembly reactor (9) a conductivity cell at the bottom of the reactor.
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the assembly reactor (9) a pH measuring cell at the bottom of the reactor.
  • the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises a solvent dispersion device located at the end of the line, at the reactor (9).
  • Another aspect of the invention is a solid phase peptide synthesis method comprising the following steps:
  • the process before the coupling step in the assembly reactor, the process comprises a preliminary step of preactivating the amino acid in a dissolution reactor, the real-time monitoring of the step pre-activation in the reactor by measuring a detector, introducing the preactivated mixture into the assembly reactor.
  • the real-time monitoring of the coupling step is done by measuring a detector selected from a near-infrared detector, a conductivity meter, a UV detector, a detector of Raman spectroscopy and / or a pH detector.
  • the real-time monitoring of the deprotection step is done by measuring a detector selected from a near-infrared detector, a conductivity meter, a UV detector, a detector of Raman spectroscopy and / or a pH detector.
  • the real-time monitoring of the washing step is done by measuring a detector selected from a near-infrared detector, a conductivity meter, a UV detector, a detector of Raman spectroscopy and / or a pH detector.
  • the real-time monitoring of the preactivation step is done by measuring a detector selected from a near-infrared detector, a conductivity meter, a UV detector, a detector of Raman spectroscopy and / or a pH detector.
  • the washing in step (i) is carried out by percolation.
  • the percolation is done with a level control via a radar type sensor.
  • the concentration measurement of the deprotection agent is measured in real time at the outlet of the reactor. This measurement is done during percolation to follow its evolution and stop the introduction of the solvent and finish the emptying.
  • Another aspect of the invention is the use of a level sensor for determining the height of the liquid in the reactor relative to the height of the resin bed for a percolation step in order to optimize in real time the washing and minimize solvent consumption.
  • Another aspect of the invention is the use of a percolation system in the real-time monitoring method according to the invention for the filtration of a solvent.
  • the real-time monitoring during the use of a percolation system is via a sensor, including a radar-type sensor, allowing the monitoring of the reaction and the control of the quantities of solvents and reagents in time. to limit the costs.
  • the invention also relates to a method and a method for real-time monitoring of a chemical reaction comprising a reactor system according to the invention, a control unit (13) controlled by a software allowing the automation of the control system. reactor through advanced online control in an assembly reactor and in a recirculation loop.
  • This real-time monitoring method is advantageously used for peptide synthesis reactions, more preferably solid phase peptide synthesis.
  • the invention is a device comprising the computer means for implementing the method of the invention.
  • the method according to the invention is at least partly implemented by computer means provided in the system according to the invention.
  • the control unit (13) comprises a central control unit of the reactor system according to the invention.
  • This plant is advantageously embedded on the system according to the invention.
  • this control unit includes a fixed computer terminal (for example, a PC, a Macintosh or a Unix) and / or mobile (for example smartphone / tablet type) provided with one or more software / applications adapted for allow the automatic management of the system control according to the invention following the data provided by the different sensors.
  • the software / application triggers control signals within the electronic unit and stopping or not the current stage.
  • said appropriate software / applications of the system according to the invention can also collect information on the nature and the quantity of the reagents and solvents used for the peptide synthesis, for the purpose of inventory management of said reagents and solvents.
  • the integration by these software / applications adapted to a given future period, can allow to integrate a forecast element for the maintenance of stocks of reagents and solvents to the levels required to ensure a smooth running of all stages of synthesis in the desired times, but not penalizing financially.
  • an infrared sensor or an infrared measuring cell is an infrared sensing device that detects infrared wavelengths.
  • the device and method of the invention has many advantages over already existing solutions.
  • a reactor system and a synthesis method according to the invention also makes it possible to stop the reaction as soon as it is complete by limiting the side reactions and to optimize the purity of the synthesized peptide.
  • the monitoring can also be carried out thanks to the conductivity and the temperature in addition to the near-infrared sensors inside the reactor, but it will preferably be carried out on the liquid phase because, thanks to the recirculation loop on the reactor, Many sensors can be placed in addition to the Fourier Transform Near-Infrared Spectroscopy (FTNIR) sensors, such as conductivity and UV sensors.
  • FNIR Fourier Transform Near-Infrared Spectroscopy
  • Another advantage of the system and method according to the invention is that only one calibration is used for all Fmoc protected natural amino acids.
  • the system and method according to the invention also makes it possible to precisely quantify the deprotection agent and the release of the dibenzofulvenes during the deprotection steps of the Fmoc protected amino acids in order to know when the reaction is complete.
  • the system and method according to the invention also make it possible to follow the washing and the reduction of the reagent concentrations to a threshold in order to know when the washing is finished. Thanks to this advanced online control, it is possible not only to follow the evolution of the reactions, but also to use them for automation.
  • the reactor will be able to operate automatically for several stages depending on the online monitoring results.
  • the reactor can operate automatically and thus give rise to a more efficient washing of the resin, operating in a percolation mode.
  • the system and method according to the invention uses a percolation process to wash the solvent and optimize the online monitoring by the amount of the reagents and solvents used.
  • the liquid is introduced from the top of the reactor to the resin at the same flow rate as the outlet flow of the reactor by means of the control of the height of the liquid. which must remain constant in the reactor during all the washing.
  • This washing mode comprises a packed resin bed and a distribution system for the entry of the liquid at the top of the reactor for a good distribution of the liquid on the surface of the resin.
  • This washing mode is the most efficient and allows a significant reduction in solvent consumption compared to other existing modes.
  • the reactor is also temperature controlled to be able to change temperature between two different stages in a few minutes.
  • the present invention reduces the cost required for the purchase of starting materials and the treatment of the residual liquid, considerably reducing the amount of reagents, solvents actually consumed and waste liquid (organic solvent), harmful to the environment.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a synthesis reactor system (14) for carrying out a solid phase peptide synthesis with a recirculation loop (10) of the reactor liquid making it possible to measure in real time the evolution of the chemical species in the automatic peptide synthesizer of the present invention.
  • the numerical references of FIG. 1 denote the following elements: An inlet pipe dedicated to the introduction of the resin (1), an inlet pipe dedicated to the introduction of the synthesis solvent (2), optionally supplied by a self-priming pump.
  • a reactor (5) for preactivating the amino acids and / or dissolving the powders and connected to the assembly reactor (9) via an inlet pipe (6), a dedicated inlet pipe at the introduction of the deprotecting agent of the amino acid (3) fed by a self-priming pump and an inlet pipe dedicated to the introduction of the solvent (4) are connected to the assembly reactor (9). ), an additional inlet pipe dedicated to the introduction of the reagents (8) and an inlet pipe dedicated to the introduction of the solvent are connected to the preactivation reactor (5).
  • the recirculation loop (10) of the reactor liquid comprising at least one detector (1 1), preferably a near-infrared spectrophotometric measuring cell, a control module (13) controlled by a software allowing the automation of the control system. reactor through advanced online control in the recirculation loop.
  • a 3-way valve (12) at the output of the sensors on the recirculation loop of the assembly reactor (9) makes it possible, according to the needs, to switch to emptying mode or not.
  • Figure 2 shows a calibration curve of piperidine by UV (390nm) for infrared quantization.
  • Figure 3 shows the calibration curve of the piperidine between 0.01% and 35% v.
  • Figure 4 shows the calibration curve of piperidine between 0.01% and 1% v.
  • Figure 5 shows the follow-up in the liquid phase and in time of the coupling of histidine on a peptide-resin. Observation of the disappearance of reagents and the formation of a product (DICU).
  • Figure 6 shows a follow-up of a deprotection step of histidine.
  • Figure 7 shows washes of piperidine after deprotection of Histidine.
  • Figure 8 shows the disappearance of the deprotecting agent over time for a fixed rate of percolation.
  • the synthesis reactor is a stainless steel reactor with a capacity of 25 liters.
  • a filtration device is placed at the bottom of the reactor to retain the resin and evacuate the solvents.
  • This filtration device is formed of a sintered stainless steel material but could consist of a filter cloth or any other filtration system known to those skilled in the art.
  • the reactor has a stirring blade in order to mix the resin and the liquid as well as possible. This pale agitation can rotate in both directions of rotation.
  • On the top of the reactor are several inputs including an entry dedicated to the introduction of the resin and an entry dedicated to the introduction of synthetic solvent (DMF), synthetic solvent, supplied by a self-priming pump.
  • the feed rate and the volume introduced are measured and quantified by a mass flow meter. Flow rates can range from 35 l / h to 600 l / h.
  • the solvent may be heated or cooled if necessary before entering the reactor via a heat exchanger.
  • a solvent dispersion device is located at the end of the line, at the reactor.
  • An inlet line dedicated to the introduction of the deprotecting agent of the amino acid can also be placed on the top of the assembly reactor. It is carried out thanks to a self-priming pump with a flow rate of 20 to 1000 l / h. The feed rate and the volume introduced are measured and quantified by a mass flow meter.
  • the deprotection agent may be premixed or not with the synthesis solvent before introduction into the reactor.
  • An additional solvent inlet pipe whose volume and flow rate are controlled by a mass flow meter may also be placed at the top of the assembly reactor.
  • a nitrogen inlet pipe for the purpose of rendering the reactor inert or flushing with nitrogen the reactor is placed on the top of the assembly reactor.
  • the assembly reactor may be provided with different sensors:
  • a level sensor (radar type), to measure the level of resin or liquid in the reactor
  • a recirculation loop of the liquid of the assembly reactor makes it possible to measure in real time the evolution of the chemical species in the reactor via measurement cells which are, a conductivity cell, a near-infrared cell (from 1 mm to 30mm optical path) and a UV cell (from 0.5mm to 10mm optical path).
  • measurement cells which are, a conductivity cell, a near-infrared cell (from 1 mm to 30mm optical path) and a UV cell (from 0.5mm to 10mm optical path).
  • the passage of the liquid in the loop takes place many times and the rate of recirculation can be adjusted according to the steps, if the reactions are slow or fast.
  • the liquid of the reactor is drained via the sintered material, through the measurement cells of the recirculation loop, which can then give information on the liquid phase at the outlet of the reactor.
  • the assembly reactor is connected to another reactor that can be used to dissolve the powders or preactivate the amino acids before introduction into the reactor.
  • This reactor is a double-jacketed glass reactor with a capacity of 101. It is equipped with an agitator allowing the dissolution of the powders. It has an optional conductivity sensor and a pressure sensor.
  • An inlet exists on the lid to introduce the powders.
  • a solvent inlet pipe makes it possible to introduce the solvent by means of a self-priming pump, ranging between 20 and 1000 l / h. The flow rate and the volume of introduction are measured by a mass flow meter. A last inlet line is present to introduce a solvent or a coupling agent.
  • the resin is first introduced into the reactor via the dedicated inlet.
  • a predefined volume of synthesis solvent is added at a predefined rate via the dedicated input.
  • the resin-solvent mixture is stirred and once the resin is swollen, the solvent is drained via the outlet at the bottom of the reactor. We repeat the operation several times.
  • the amino acid or the linker in DMF is dissolved or pre-activated in the dissolution reactor. It is stirred. Either add the coupling agent or not. If so, the preactivation step is followed, preferably by means of a conductivity cell.
  • the mixture is introduced into the assembly reactor. Agitation is started in the assembly reactor and the recirculation loop is started. The infrared measurement in the recirculation loop makes it possible to quantify the chemical species of the mixture. The concentration of the reagents decreases and those of the byproducts of the reaction increase in the liquid phase until stabilization. Once the stabilization is reached, the step is finished, then the assembly reactor is emptied via the recirculation loop which, thanks to a 3-way valve at the output of the sensors, makes it possible to switch to the emptying mode.
  • synthesis solvent is introduced into the reactor at a volume and a predefined flow rate.
  • the solvent-resin mixture is stirred and the recirculation loop is started.
  • the emptying of the reactor is started. This step is carried out several times, preferably at least 3 times until the desired residual concentrations in the reactor are reached.
  • the deprotection step begins.
  • the synthesis solvent and the deprotection agent are introduced into the reactor via the dedicated inlet lines.
  • the stirring in the reactor is then started as well as the recirculation loop.
  • the deprotection step in the reactor is monitored in real time by means of the on-line measurement cells.
  • the conductivity increases in the reactor until a stabilization indicating the end of the reaction.
  • Quantification of the species in the reactor can be done, preferably, by means of an infrared cell. In this case, the monitoring of the formation of dibenzofulvene and the consumption of the deprotection agent, here piperidine, is possible.
  • the increase in UV absorbance reveals the formation of dibenzofulvene and its stabilization indicates the end of the deprotection step.
  • the quantification of this species by UV can be carried out if a stabilization of the UV is not sufficient for the interpretation of the signals.
  • a washing step of the deprotection agent follows. This washing step can be done in two ways.
  • the washing step is carried out in successive batches of introduction of the washing solvent, here the DMF, stirring and recirculation loop, and then emptying.
  • the washing solvent here the DMF
  • stirring and recirculation loop At each batch, an infrared cell measures the piperidine concentration in the reactor. When the infrared measurement gives the piperidine threshold reached, a last emptying is carried out.
  • the washing step can also be done, and surprisingly, by percolation through a system comprising
  • the optimization of the DMF washing volumes is achieved.
  • the feed rate of the DMF is preferably equal to the discharge rate of the reactor thus keeping the constant level of liquid within the reactor and as close to the level of the resin bed.
  • the measurement of the concentration of the deprotection agent, for example piperidine, is measured in real time at the outlet of the reactor. Once the threshold of the deprotection agent has been reached, the introduction of the washing solvent is stopped and the emptying is finished.
  • a recirculation loop on the assembly reactor comprising a measuring cell, particularly near-infrared, has many advantages over the solutions of the prior art.
  • the following chemical species can be quantified in a direct and non-indirect manner depending on the stage in which the peptide assembly is located.
  • Fmoc-aa an Fmoc-type group
  • Fmoc-aa-OFI an activation state
  • Fmoc-aa-OBt an activation state
  • Fmoc aa-Oxyma an activation state
  • Fmoc-aa-DIC an activation state
  • a calibration curve must be performed before an infrared quantification method can be created.
  • the inventors have arbitrarily chosen to use an already existing quantification method well known to those skilled in the art for piperidine, namely a method of quantification by UV spectrometer.
  • a spectrophotometer usable according to the invention is that of the company Thermo Scientific reference Genesys 10S UV-Vis.
  • the piperidine concentration is measured at 390 nm.
  • piperidine samples are prepared at various known concentrations between 0.01% and 35% by volume of piperidine in DMF. To have increased accuracy for low piperidine values, many samples were prepared between 0.01% and 1% piperidine.
  • Quantification in the near infrared is a multi-variable calibration using matrix resolution and statistical methods. These methods are directly integrated into the control software of the infrared spectrometer.
  • the multi-variable analysis can be started and the best quantification method proposed by the software can be determined. This method must then be tested and tested by passing other samples at known concentrations and see if the proposed calibration curve effectively quantifies the piperidine in the desired margin of error.
  • FIG. 3 represents the calibration curve where samples with known concentrations of piperidine were analyzed by the infrared quantification method between 0.01% and 35% of piperidine.
  • Figure 4 shows the piperidine calibration curve between 0.01% and 1% piperidine.
  • the invention provides a nonlimiting example of monitoring and infrared quantification of the different species during the different stages of peptide synthesis.
  • the amino acid and I ⁇ OBT are dissolved in the dissolution reactor. They are then introduced into the assembly reactor as well as the DIC. The agitation is started and the recirculation loop is started.
  • the stabilization of the signals takes place after about 2 hours.
  • the final concentration of species, especially Fmoc-aa- * (corresponding to histidine), is close to the expected concentration.
  • the coupling is finished.
  • the emptying of the reactor can take place.
  • a predefined amount of DMF is introduced into the assembly reactor. Stirring is started as well as the recirculation loop.
  • the amount of piperidine present in the reactor is quantified by infrared measurement.
  • the reactor is drained. As long as the value of piperidine obtained is not sufficiently low, washing is repeated until the desired concentration is obtained. Optimization of the washing time of the system by percolation.
  • the chemical synthesis reactor system according to the invention is connected to a percolation system in order to further optimize the washing times and the amounts of washing solvent used.
  • percolation means that the solvent, in particular the washing solvent, is passed through a fixed bed, such as a resin, to carry out an extraction.
  • the percolation is carried out on a resin, for example a 4-methylbenzhydrylamine hydrochloride resin or any other resin known to those skilled in the art (to be confirmed or give another example), simply deposited in fixed bed on the filtration system and distributed homogeneously and horizontally on its surface to avoid any preferential route of the washing solvent through the resin bed.
  • a resin for example a 4-methylbenzhydrylamine hydrochloride resin or any other resin known to those skilled in the art (to be confirmed or give another example
  • the washing solvent such as DMF
  • the washing solvent is fed through a distribution system that avoids disturbing the resin bed so that it remains horizontal on its surface.
  • the liquid level above the resin is controlled closer to the resin bed without disturbing it, in order to reduce the amount of washing solvent used by limiting the remixing phenomena.
  • washing solvent is optimized by determining the kinetics of transfer of the species to be removed between the solid phase (resin) and the liquid phase (washing solvent).
  • the experiment is carried out in a glass reactor 10 cm in diameter provided with a sintered material containing a bed of resin 10 cm in height on which is coupled a peptide.
  • a sintered material containing a bed of resin 10 cm in height on which is coupled a peptide.
  • the resin bed is homogeneous and horizontally there is no preferred path and the washing solvent is distributed so that the resin bed remains horizontal on the surface.
  • the following example shows a percolation wash on the reactor of the invention with a resin bed height of 5.6 cm.
  • Figure 8 shows the disappearance of the deprotection agent over time for a fixed rate of percolation.

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Abstract

The present invention relates to an automated system of reactors for carrying out a solid-phase peptide synthesis, and more particularly a solid-phase peptide synthesizer which is automated, by means of a reactor with a liquid-recirculation loop making it possible to measure, in real time, chemical species in the reactor via measuring cells. This system comprises inlet pipes, namely: the pipes (1) dedicated to the introduction of resin, (2) dedicated to the introduction of the synthesis and washing solvent, (3) dedicated to the introduction of the agent for deprotecting the amino acid introduced, (4) dedicated to the introduction of the reagents, and comprises an assembly reactor (9) and a loop for recirculation (10) of the liquid of the reactor.

Description

SYSTEME AUTOMATISE DE REACTEUR DE SYNTHESE AVEC UNE BOUCLE DE RECIRCULATION  AUTOMATED SYNTHESIS REACTOR SYSTEM WITH A RECIRCULATION LOOP
Domaine technique Technical area
La présente invention concerne un système automatisé de réacteurs pour réaliser une synthèse de peptides en phase solide, et plus particulièrement un synthétiseur de peptides en phase solide automatisé au moyen d’un réacteur à boucle de recirculation du liquide permettant de mesurer en temps réel des espèces chimiques dans le réacteur via des cellules de mesures.  The present invention relates to an automated reactor system for performing solid phase peptide synthesis, and more particularly to an automated solid phase peptide synthesizer using a liquid recirculation loop reactor for real time measurement of species. in the reactor via measuring cells.
Les peptides sont des chaînes d'acides aminés liés qui sont les éléments de base pour la plupart des organismes vivants. En conséquence, l'étude des peptides et des protéines et la capacité de synthétiser des peptides et des protéines sont d'un grand intérêt dans les sciences biologiques et la médecine.  Peptides are linked amino acid chains that are the building blocks for most living organisms. As a result, the study of peptides and proteins and the ability to synthesize peptides and proteins are of great interest in the biological sciences and medicine.
La synthèse de peptides en phase solide a vu le jour en 1963, lorsque RB Merrifield a publié la synthèse d'une séquence constituée de quatre acides aminés en utilisant un procédé en phase solide (RB MERRIFIELD, Solid Phase Peptide Synthesis I. la synthèse d'un tétrapeptide, J. Am. Chem. Soc, 1963, 85 (14), pp 2149-2154).  Solid phase peptide synthesis was initiated in 1963, when RB Merrifield published the synthesis of a four-amino acid sequence using a solid phase method (RB MERRIFIELD, Solid Phase Peptide Synthesis I. Synthesis of a tetrapeptide, J. Am Chem Soc, 1963, 85 (14), pp 2149-2154).
Depuis son introduction en 1963 par Merrifield, la synthèse en phase solide a considérablement reculé les limites de la synthèse peptidique connues en phase homogène. Merrifield a eu l’idée de combiner la méthodologie utilisant les esters activés avec l’ancrage du premier acide aminé sur une matrice polymère insoluble. Ce nouveau mode de synthèse permettait donc d’éviter les réactions indésirables puisqu’avec l’immobilisation d’un des partenaires sur la phase solide, une seule face d’un acide aminé est disponible pour le couplage. Un autre avantage de l’immobilisation d’un acide aminé sur un polymère insoluble est que cela permet l’utilisation d’un excès du réactif en solution. L’excès de réactif n’est plus considéré comme une impureté pour le produit final et permet d’obtenir des rendements de couplage proche de 100%. L’avantage sûrement le plus conséquent de la synthèse en phase solide, est que toutes les étapes de purification entre chaque couplage sont supprimées puisque le produit désiré reste accroché sur le polymère insoluble, jusqu'à obtention du peptide désiré. Le peptide est ensuite séparé du polymère par coupure chimique. L’avancée réalisée par la chimie peptidique en phase solide a contribué au développement de nombreux supports solides, ainsi qu’au développement de nouvelles chimies pour l’activation et la protection des acides aminés. Actuellement deux grandes stratégies sont utilisées pour la synthèse peptidique en phase solide. Ces deux stratégies reposent sur l’utilisation de deux types de protections temporaires dites orthogonales Fmoc/Boc, pour la protection de la fonction amine. La différence principale entre les deux types de groupes protecteurs est liée à leur mode de déprotection. La déprotection du groupement Fmoc s’effectue en milieu basique alors que la déprotection du groupement Boc s’effectue en milieu acide. Actuellement la stratégie Fmoc/tBu est la plus utilisée car la coupure finale du peptide du support solide utilise du TFA (acide trifluoroacétique) concentré alors que la stratégie Boc/Bnl nécessite l’utilisation d’acide fluorhydrique concentré, beaucoup plus dangereux et délicat à manipuler. Bien que ces deux types de protection se déprotègent selon deux protocoles différents, le protocole utilisé pour le couplage des différents acides aminés est le même. La synthèse peptidique en phase solide consiste donc en une succession de couplages et de déprotections jusqu’à obtention du peptide désiré qui sera ensuite séparé du polymère par coupure chimique. Since its introduction in 1963 by Merrifield, solid phase synthesis has considerably reduced the limits of known peptide synthesis in the homogeneous phase. Merrifield came up with the idea of combining the methodology using the activated esters with the anchoring of the first amino acid on an insoluble polymer matrix. This new mode of synthesis thus made it possible to avoid undesirable reactions since with the immobilization of one of the partners on the solid phase, only one side of an amino acid is available for the coupling. Another advantage of immobilizing an amino acid on an insoluble polymer is that it allows the use of an excess of the reagent in solution. The excess of reagent is no longer regarded as an impurity for the final product and makes it possible to obtain coupling yields close to 100%. The advantage surely the most The consequence of solid phase synthesis is that all the purification steps between each coupling are suppressed since the desired product remains attached to the insoluble polymer until the desired peptide is obtained. The peptide is then separated from the polymer by chemical cleavage. The progress made by solid phase peptide chemistry has contributed to the development of many solid supports, as well as to the development of new chemistries for the activation and protection of amino acids. Currently two major strategies are used for peptide synthesis in solid phase. These two strategies are based on the use of two types of temporary orthogonal protections Fmoc / Boc, for the protection of the amine function. The main difference between the two types of protecting groups is related to their mode of deprotection. The deprotection of the Fmoc group is carried out in a basic medium whereas the deprotection of the Boc group is carried out in an acid medium. Currently the Fmoc / tBu strategy is the most used because the final cut of the solid support peptide uses concentrated TFA (trifluoroacetic acid) while the Boc / Bnl strategy requires the use of concentrated hydrofluoric acid, much more dangerous and delicate to manipulate. Although these two types of protection are deprotected according to two different protocols, the protocol used for the coupling of the different amino acids is the same. The solid phase peptide synthesis therefore consists of a succession of couplings and deprotections until the desired peptide is obtained which will then be separated from the polymer by chemical cleavage.
Lors de la synthèse de peptides en phase solide, les techniques qui permettent d’évaluer l’efficacité d’un couplage ou d’une déprotection reposent sur des tests colorimétriques qui ne sont pas quantitatifs. Pour pouvoir analyser la chaîne peptidique de façon quantitative il faut séparer la molécule du support solide pour ensuite l’analyser avec les techniques habituelles RMN, FIPLC et la spectroscopie de masse. Ce procédé, qui consiste à couper la molécule du support avant de pouvoir l’analyser, n’est pas satisfaisant dans l’optique de comprendre les phénomènes qui sont à l’origine des problèmes rencontrés lors de la synthèse de séquences dites difficiles. Bien que la spectrométrie de masse puisse offrir une analyse à haut débit, l’un des inconvénients majeurs de l’utilisation des méthodes spectroscopiques standards pour le suivi en ligne est qu’il nécessite la solubilisation de l'échantillon étudié donc libéré de son support solide. La détermination du composé est donc généralement réalisée à la fin de la synthèse. In solid phase peptide synthesis, techniques for evaluating the efficiency of coupling or deprotection are based on colorimetric assays that are not quantitative. In order to be able to analyze the peptide chain quantitatively, the molecule must be separated from the solid support and then analyzed using the usual NMR, FIPLC and mass spectroscopy techniques. This process, which consists in cutting the molecule of the support before being able to analyze it, is not satisfactory in order to understand the phenomena which are at the origin of the problems encountered during the synthesis of so-called difficult sequences. Although mass spectrometry can offer a high-throughput analysis, one of the major drawbacks of using standard spectroscopic methods for online monitoring is that it requires the solubilization of the studied sample, thus released from its support. solid. The determination of the compound is therefore generally carried out at the end of the synthesis.
L'utilisation d'une telle stratégie de clivage et d'analyse en tant que moyen de contrôle de la qualité de la synthèse présente donc plusieurs inconvénients. Il est d’abord destructeur car les échantillons sont consommés, de plus, des réactions secondaires avec les réactifs de clivage peuvent se produire, conduisant à des difficultés dans la détermination des produits peptidiques par spectrométrie de masse en raison des spectres compliqués qui sont obtenus.  The use of such a strategy of cleavage and analysis as a means of controlling the quality of the synthesis therefore has several disadvantages. It is first destructive because the samples are consumed, in addition, secondary reactions with cleavage reagents can occur, leading to difficulties in determining peptide products by mass spectrometry because of the complicated spectra that are obtained.
De nombreux brevets dans l’art antérieur ont essayé de faire de l’analyse en temps réel des synthèses peptidiques en cours de réalisation.  Numerous patents in the prior art have attempted to make real-time analysis of peptide syntheses in progress.
La demande de brevet WO2012056300 protège un procédé de surveillance en temps réel de la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) sous atmosphère ambiante pour caractériser des intermédiaires peptidiques ou des produits en ligne. La solution technique décrite permet la surveillance en temps réel à tracer le processus des réactions d'étape du SPPS par utilisation d’une source de lumière, d’une unité d'électronébulisation, et d’un spectromètre de masse. Cependant l’utilisation de ces techniques d’analyses ont des inconvénients importants, à savoir une prise d’échantillons dispersés dans un solvant qui implique également la destruction desdits échantillons, contrairement à la méthode selon l’invention. On parle de méthode d’analyse destructive. De plus la solution citée n’est pas quantitative et ne permet pas de savoir si la résine est bien lavée entre les différentes étapes (lavage après couplage ou lavage de la pipéridine) mais seulement de savoir si l’on couple l’acide aminé sur la résine ou encore si l’on déprotège l’acide aminé sur la résine.  Patent application WO2012056300 protects a method for real-time monitoring of solid phase peptide synthesis (SPPS) under ambient conditions to characterize peptide intermediates or on-line products. The described technical solution enables real-time monitoring to trace the process of SPPS step reactions by using a light source, an electrospray unit, and a mass spectrometer. However, the use of these analysis techniques have significant disadvantages, namely a sampling of dispersed samples in a solvent which also involves the destruction of said samples, unlike the method according to the invention. We are talking about a destructive method of analysis. In addition, the solution cited is not quantitative and does not make it possible to know if the resin is washed well between the different steps (washing after coupling or washing the piperidine) but only to know whether the amino acid is coupled to the resin or if the amino acid is deprotected on the resin.
La demande de brevet WO 2017049128 décrit un système pour le contrôle d'une synthèse de peptide en phase solide par utilisation de détecteurs qui permettent de contrôler après coup la réaction par modification du processus, comme l’élimination du réactif. Les détecteurs utilisés mesure dans la phase liquide à travers une zone de détection dans le système, et un ou plusieurs signaux peuvent être générés correspondant aux fluides. Pour cela, le brevet WO2017049128 utilise un détecteur de rayonnement électromagnétique placé en aval d'un réacteur pour détecter un fluide en sortie du réacteur afin de produire un signal. Ainsi les paramètres peuvent être modulés avant ou pendant le processus de réaction de synthèse peptidique en phase solide. L’inconvénient de cette méthode est que le contrôle se réalise en aval du réacteur et non pas dans le réacteur ou dans une boucle de recirculation. De plus, cette méthode surveille la déprotection mais non pas le suivi du couplage et enfin, cette technique ne permet pas de faire de l’analyse en temps réel en multi-passage et, contrairement au système selon l’invention, cette solution implique d’être en large excès de réactifs et de solvants, ce qui consomme beaucoup de réactifs et n’est pas du tout viable économiquement. Patent application WO 2017049128 discloses a system for the control of solid phase peptide synthesis by using detectors which allow the reaction to be subsequently controlled by process modification, such as the removal of the reagent. The detectors used measure in the phase liquid through a detection zone in the system, and one or more signals can be generated corresponding to the fluids. For this, the patent WO2017049128 uses an electromagnetic radiation detector placed downstream of a reactor to detect a fluid leaving the reactor to produce a signal. Thus the parameters can be modulated before or during the solid phase peptide synthesis reaction process. The disadvantage of this method is that the control is carried out downstream of the reactor and not in the reactor or in a recirculation loop. In addition, this method monitors the deprotection but not the monitoring of the coupling and finally, this technique does not allow the analysis in real time multi-pass and, unlike the system according to the invention, this solution involves be in large excess of reagents and solvents, which consumes a lot of reagents and is not at all economically viable.
Les méthodes analytiques destructives, de type colorimétriques ou spectrophotométriques, présentent l’inconvénient d’être irréversibles. De plus, elles génèrent des produits modifiés et, plus important encore, elles abaissent le rendement du peptide final car elles sont réalisées sur des aliquotes de résine- peptide. Cependant, ces méthodes sont largement utilisées car elles sont rapides et ne nécessitent pas d'instrumentation coûteuse.  Destructive analytical methods, of colorimetric or spectrophotometric type, have the disadvantage of being irreversible. In addition, they generate modified products and, more importantly, they lower the yield of the final peptide because they are performed on aliquots of resin-peptide. However, these methods are widely used because they are fast and do not require expensive instrumentation.
Des méthodes analytiques non destructives peuvent être également être utilisés dans des procédés batch. Par exemple, on peut citer le suivi des réactions par infrarouge, basé sur l'apparition ou la disparition de groupes fonctionnels, qui peut être appliqué pour surveiller la synthèse chimique en phase solide, notamment dans le domaine de la synthèse organique et pour surveiller le couplage et la déprotection pendant une synthèse peptidique. Les spectroscopies infrarouge et Raman sont des techniques largement utilisées pour la détection et la caractérisation des produits de réaction car elles permettent d’analyser directement les produits sur les supports solides. On peut aussi citer le développement des techniques FT-IR, (Fourier Transform InfraRed spectroscopy ou spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier), qui permet d’obtenir le spectre d'absorption, d'émission, la photoconductivité ou la diffusion Raman dans l'infrarouge d'un échantillon solide, liquide ou gazeux. Non-destructive analytical methods can also be used in batch processes. For example, there can be mentioned the monitoring of infrared reactions, based on the appearance or disappearance of functional groups, which can be applied to monitor solid phase chemical synthesis, especially in the field of organic synthesis and to monitor the coupling and deprotection during peptide synthesis. Infrared and Raman spectroscopy are widely used techniques for the detection and characterization of reaction products because they allow products to be analyzed directly on solid supports. We can also mention the development of FT-IR techniques (Fourier Transform InfraRed spectroscopy or Fourier Transform Infrared Spectroscopy), which makes it possible to obtain the spectrum of absorption, emission, photoconductivity or Raman scattering in the infrared of a solid, liquid or gaseous sample.
Néanmoins, l'utilisation de ces techniques pour les réactions en phase solide est limitée notamment du fait de leur coûts élevés et du fait qu’elles ne peuvent mesurer qu’une seule position dans un échantillon.  Nevertheless, the use of these techniques for solid phase reactions is limited in particular because of their high costs and the fact that they can only measure a single position in a sample.
Le développement d’un nouveau système et de méthode de suivi et d’analyse non destructive en temps réel capable d'acquérir rapidement et simultanément des informations sur grand nombre d'échantillons, mais qui surveillerait également l’ensemble de tous les réactifs dans le réacteur d’assemblage constitue un vrai besoin, notamment du fait que contrairement aux méthodes déjà existantes, elle permettrait un control total de la synthèse et un suivi étape par étape de la synthèse peptidique en phase solide pour un contrôle optimum du temps des réactions, de l’utilisation des solvants, des réactifs et une réduction significative des coûts. De plus, une nouvelle méthode de détection en temps réel permettrait d’éviter de favoriser des réactions secondaires en stoppant l’étape dès que la réaction est terminée.  The development of a new real-time non-destructive monitoring and analysis system capable of acquiring information quickly and simultaneously on a large number of samples, but which would also monitor all of the reagents in the field. assembly reactor is a real need, in particular because unlike already existing methods, it would allow a total control of the synthesis and a step-by-step follow-up of the solid phase peptide synthesis for an optimum control of the reaction time, the use of solvents, reagents and a significant cost reduction. In addition, a new real-time detection method would avoid favoring side reactions by stopping the step as soon as the reaction is complete.
La présente invention fournit un tel système et de telles méthodes et résout les limitations mentionnées ci-dessus. RESUME DE L'INVENTION  The present invention provides such a system and methods and overcomes the limitations mentioned above. SUMMARY OF THE INVENTION
L’invention se rapporte à un système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide, le système de réacteur comportant : une conduite d’entrée (1 ) dédiée à l’introduction de résine, une conduite d’entrée (2) dédiée à l’introduction du solvant de synthèse et de lavage, une conduite d’entrée (3) dédiée à l’introduction de l’agent de déprotection de l’acide aminé amenée, une conduite d’entrée (4) dédiée à l’introduction des réactifs, un réacteur d’assemblage (9) et une boucle de recirculation (10) du liquide du réacteur comprenant au moins une cellule de mesure (1 1 ) de quantification indirecte de l’avancée de la réaction sur la phase solide. Selon un mode de réalisation préféré, la cellule de mesure (1 1 ) est une cellule de mesure spectrophotométrique, et de manière préférentielle la cellule de mesure (11 ) est une cellule de mesure par spectroscopie Raman et de manière encore plus préférentielle la cellule de mesure (1 1 ) est une cellule de mesure de de proche-infrarouge. The invention relates to a reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis, the reactor system comprising: an inlet pipe (1) dedicated to the introduction of resin, an inlet pipe (2) dedicated to the introduction of the synthesis and washing solvent, an inlet pipe (3) dedicated to the introduction of the deprotecting agent of the supplied amino acid, an inlet pipe (4) dedicated to the introduction of reagents, an assembly reactor (9) and a recirculation loop (10) of the reactor liquid comprising at least one measuring cell (1 1) for indirect quantification of the progress of the reaction on the solid phase . According to a preferred embodiment, the measuring cell (1 1) is a spectrophotometric measuring cell, and preferably the measuring cell (11) is a Raman spectroscopy measuring cell and even more preferably the cell of measurement. measurement (1 1) is a measuring cell of near-infrared.
La spectroscopie par proche infrarouge, aussi abrégée SPIR (Near- Infrared spectroscopy ou NIR spectroscopy) est une technique d’analyse quantitative et qualitative utilisée dans la chimie. La technique utilise un spectre s’étendant à des longueurs d’onde de 700-2500 nm (l) soit entre les nombres d’onde 14286 et 4000 cm 1 (v). Near-infrared spectroscopy, also abbreviated to SPIR (Near-Infrared Spectroscopy or NIR spectroscopy) is a quantitative and qualitative analysis technique used in chemistry. The technique uses a spectrum extending at wavelengths of 700-2500 nm (1) or between wave numbers 14286 and 4000 cm 1 (v).
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre dans le réacteur d’assemblage (9) un système de filtration.  According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the assembly reactor (9) a filtration system.
Un système de filtration selon l’invention est avantageusement un système de filtration en matériau inox fritté et/ou une toile filtrante.  A filtration system according to the invention is advantageously a filtration system of sintered stainless material and / or a filter cloth.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre un réacteur (5) de préactivation des acides aminés et/ou de dissolution des poudres et une entrée (6) reliant le réacteur (5) au réacteur d’assemblage (9).  According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises a reactor (5) for preactivating the amino acids and / or dissolving the powders and an inlet (6) connecting the reactor (5) to the assembly reactor (9).
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre une conduite d’entrée de solvant supplémentaire (7) et une conduite d’entrée de réactif supplémentaire (8) sur le réacteur de préactivation (5).  According to another preferred embodiment, the reactor system for performing solid phase peptide synthesis further comprises an additional solvent inlet line (7) and an additional reactant inlet line (8) on the reactor preactivation (5).
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre dans la boucle de recirculation (10) au moins une cellule de mesure de la conductivité.  According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the recirculation loop (10) at least one conductivity measuring cell.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre dans la boucle de recirculation (10) au moins une cellule de mesure de l’absorbance en ultraviolet. Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre dans la boucle de recirculation (10) une cellule de mesure par spectroscopie Raman. According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the recirculation loop (10) at least one ultraviolet absorbance measuring cell. According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the recirculation loop (10) a Raman spectroscopy measuring cell.
Ces cellules de mesure peuvent être supplémentaire aux cellules de mesure déjà présente dans la bouche de recirculation.  These measuring cells may be additional to the measuring cells already present in the recirculation mouth.
Selon un mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre une pompe auto- amorçante au niveau de la conduite d’entrée (7) dédiée à l’introduction du solvant de synthèse.  According to a preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises a self-priming pump at the inlet line (7) dedicated to the introduction of the synthesis solvent.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre capteur de niveau pour mesurer le niveau des résines et/ou de liquide dans le réacteur.  In another preferred embodiment, the reactor system for performing solid phase peptide synthesis further comprises a level sensor for measuring the level of resins and / or liquid in the reactor.
Le capteur de niveau permet une mesure continue de niveau des liquides présents dans le réacteur et ainsi d’avoir un suivi en temps réel du lavage pour en optimiser l’efficacité et réduire le volume de solvant employé.  The level sensor allows a continuous level measurement of the liquids present in the reactor and thus to have a real-time monitoring of the washing to optimize the efficiency and reduce the volume of solvent used.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre dans le réacteur d’assemblage (9) un capteur de pression.  According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the assembly reactor (9) a pressure sensor.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre dans le réacteur d’assemblage (9) une cellule de conductivité au fond du réacteur.  According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the assembly reactor (9) a conductivity cell at the bottom of the reactor.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre dans le réacteur d’assemblage (9) une cellule de mesure du pH au fond du réacteur.  According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises in the assembly reactor (9) a pH measuring cell at the bottom of the reactor.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide comprend en outre un dispositif de dispersion du solvant situé en fin de ligne, au niveau du réacteur (9).  According to another preferred embodiment, the reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis further comprises a solvent dispersion device located at the end of the line, at the reactor (9).
Un autre aspect de l’invention est un procédé de synthèse peptidique en phase solide comprenant les étapes suivantes :  Another aspect of the invention is a solid phase peptide synthesis method comprising the following steps:
a) Couplage par agitation dans un réacteur d’assemblage et lancement de la boucle de recirculation, b) Suivi en temps réel de l’étape de couplage par mesure d’un détecteur dans une boucle de recirculation pour quantifier les espèces chimiques du mélange, a) coupling by stirring in an assembly reactor and launching of the recirculation loop, b) Real-time monitoring of the coupling step by measuring a detector in a recirculation loop to quantify the chemical species in the mixture,
c) Lavage du réacteur d’assemblage,  c) Washing of the assembly reactor,
d) Déprotection par introduction d’un solvant de synthèse et d’un agent de déprotection dans le réacteur et lancement de l’agitation dans le réacteur et dans la boucle de recirculation,  d) Deprotection by introducing a synthesis solvent and a deprotecting agent into the reactor and starting agitation in the reactor and in the recirculation loop,
e) Suivi en temps réel de l’étape de déprotection dans le réacteur par mesure d’un détecteur,  e) Real-time monitoring of the deprotection step in the reactor by measuring a detector,
f) Lavage de l’agent de déprotection,  f) Washing the deprotection agent,
g) Suivi en temps réel de l’étape de lavage (f) de la concentration de l’agent de déprotection dans le réacteur par mesure d’un détecteur,  g) Real-time monitoring of the washing step (f) of the concentration of the deprotection agent in the reactor by measuring a detector,
Selon un mode préféré de l’invention, avant l’étape de couplage dans le réacteur d’assemblage, le procédé comprend une étape préliminaire de préactivation de l’acide aminé dans un réacteur de dissolution, le suivi en temps réel de l’étape de préactivation dans le réacteur par mesure d’un détecteur, l’introduction du mélange préactivé dans le réacteur d’assemblage. According to a preferred embodiment of the invention, before the coupling step in the assembly reactor, the process comprises a preliminary step of preactivating the amino acid in a dissolution reactor, the real-time monitoring of the step pre-activation in the reactor by measuring a detector, introducing the preactivated mixture into the assembly reactor.
Selon un mode préféré de l’invention, le suivi en temps réel de l’étape de couplage se fait par la mesure d’un détecteur choisi parmi un détecteur de proche- infrarouge, un conductimètre, un détecteur d’UV, un détecteur de spectroscopie Raman et/ou un détecteur de pH.  According to a preferred embodiment of the invention, the real-time monitoring of the coupling step is done by measuring a detector selected from a near-infrared detector, a conductivity meter, a UV detector, a detector of Raman spectroscopy and / or a pH detector.
Selon un mode préféré de l’invention, le suivi en temps réel de l’étape de déprotection se fait par la mesure d’un détecteur choisi parmi un détecteur de proche-infrarouge, un conductimètre, un détecteur d’UV, un détecteur de spectroscopie Raman et/ou un détecteur de pH.  According to a preferred embodiment of the invention, the real-time monitoring of the deprotection step is done by measuring a detector selected from a near-infrared detector, a conductivity meter, a UV detector, a detector of Raman spectroscopy and / or a pH detector.
Selon un mode préféré de l’invention, le suivi en temps réel de l’étape de lavage se fait par la mesure d’un détecteur choisi parmi un détecteur de proche- infrarouge, un conductimètre, un détecteur d’UV, un détecteur de spectroscopie Raman et/ou un détecteur de pH. Selon un mode préféré de l’invention, le suivi en temps réel de l’étape de préactivation se fait par la mesure d’un détecteur choisi parmi un détecteur de proche-infrarouge, un conductimètre, un détecteur d’UV, un détecteur de spectroscopie Raman et/ou un détecteur de pH. According to a preferred embodiment of the invention, the real-time monitoring of the washing step is done by measuring a detector selected from a near-infrared detector, a conductivity meter, a UV detector, a detector of Raman spectroscopy and / or a pH detector. According to a preferred embodiment of the invention, the real-time monitoring of the preactivation step is done by measuring a detector selected from a near-infrared detector, a conductivity meter, a UV detector, a detector of Raman spectroscopy and / or a pH detector.
Selon un mode préféré de l’invention, le lavage à l’étape (i) se fait par percolation.  According to a preferred embodiment of the invention, the washing in step (i) is carried out by percolation.
Selon un mode préféré de l’invention, la percolation se fait avec un contrôle de niveau par l’intermédiaire d’un capteur de type radar.  According to a preferred embodiment of the invention, the percolation is done with a level control via a radar type sensor.
Selon un autre mode préféré de l’invention, la mesure de concentration de l’agent de déprotection est mesurée en temps réel en sortie du réacteur. Cette mesure se fait pendant la percolation pour suivre son évolution et arrêter l’introduction du solvant et finir la vidange.  According to another preferred embodiment of the invention, the concentration measurement of the deprotection agent is measured in real time at the outlet of the reactor. This measurement is done during percolation to follow its evolution and stop the introduction of the solvent and finish the emptying.
Un autre aspect de l’invention est l’utilisation d’un capteur de niveau pour déterminer la hauteur du liquide dans le réacteur par rapport à la hauteur du lit de résine pour une étape de percolation afin d’optimiser en temps réel le lavage et minimiser la consommation de solvant.  Another aspect of the invention is the use of a level sensor for determining the height of the liquid in the reactor relative to the height of the resin bed for a percolation step in order to optimize in real time the washing and minimize solvent consumption.
Un autre aspect de l’invention est l’utilisation d’un système de percolation dans le procédé de suivi en temps réel selon l’invention pour la filtration d’un solvant. Le suivi en temps réel pendant l’utilisation d’un système de percolation se fait par l’intermédiaire de capteur, notamment un capteur de type radar, permettant ainsi le suivi de la réaction et le contrôle des quantités de solvants et de réactifs en temps réels pour en limiter les coûts.  Another aspect of the invention is the use of a percolation system in the real-time monitoring method according to the invention for the filtration of a solvent. The real-time monitoring during the use of a percolation system is via a sensor, including a radar-type sensor, allowing the monitoring of the reaction and the control of the quantities of solvents and reagents in time. to limit the costs.
L’invention se rapporte également à une méthode et un procédé de suivi en temps réel d’une réaction chimique comprenant un système de réacteur selon l’invention, une unité de commande (13) piloté par un logiciel permettant l’automatisation du système de réacteur grâce au contrôle avancé en ligne dans un réacteur d’assemblage et dans une boucle de recirculation. Cette méthode de suivi en temps réel est avantageusement utilisée pour des réactions de synthèse peptidique, plus préférentiellement la synthèse peptidique en phase solide.  The invention also relates to a method and a method for real-time monitoring of a chemical reaction comprising a reactor system according to the invention, a control unit (13) controlled by a software allowing the automation of the control system. reactor through advanced online control in an assembly reactor and in a recirculation loop. This real-time monitoring method is advantageously used for peptide synthesis reactions, more preferably solid phase peptide synthesis.
Avantageusement, l’invention est un dispositif comportant les moyens informatiques pour la mise en œuvre du procédé de l’invention. Selon un autre de ses aspects, le procédé selon l’invention est au moins en partie mis en œuvre par des moyens informatiques prévus dans le système selon l’invention. Advantageously, the invention is a device comprising the computer means for implementing the method of the invention. According to another of its aspects, the method according to the invention is at least partly implemented by computer means provided in the system according to the invention.
L’unité de commande (13) comprend une centrale de commande du système de réacteur selon l’invention. Cette centrale est avantageusement embarquée sur le système selon l’invention. Plus préférentiellement, cette centrale de commande inclut un terminal informatique fixe (par exemple, un PC, un Macintosh ou un système Unix) et/ou mobile (par exemple de type smartphone/tablette) pourvu d’un ou plusieurs logiciels/applications adaptées pour permettre la gestion automatique de la commande du système selon l’invention suites aux données fournies par les différents capteurs. Ainsi, dès que les cellules de mesures, ou encore capteurs, du système de synthèse peptidique selon l’invention est en route et reçoit des données des différents capteurs, le logiciel/application déclenche des signaux de commandes au sein de l’unité électronique et l’arrêt ou non de l’étape en cours.  The control unit (13) comprises a central control unit of the reactor system according to the invention. This plant is advantageously embedded on the system according to the invention. More preferably, this control unit includes a fixed computer terminal (for example, a PC, a Macintosh or a Unix) and / or mobile (for example smartphone / tablet type) provided with one or more software / applications adapted for allow the automatic management of the system control according to the invention following the data provided by the different sensors. Thus, as soon as the measurement cells, or sensors, of the peptide synthesis system according to the invention is on the way and receives data from the different sensors, the software / application triggers control signals within the electronic unit and stopping or not the current stage.
Sans que cela soit limitatif, lesdits logiciels/applications adaptés du système selon l’invention peuvent aussi récolter des informations sur la nature et la quantité des réactifs et solvants utilisés pour la synthèse peptidique, aux fins de gestion des stocks desdits réactifs et solvants. L’intégration par ces logiciels/applications adaptés sur une période future donnée, peut permettre d’intégrer un élément prévisionnel pour le maintien des stocks des réactifs et solvants à des niveaux requis pour garantir un bon déroulement de l’ensemble des étapes de synthèses dans les temps voulus, mais non pénalisant sur le plan financier.  Without this being limiting, said appropriate software / applications of the system according to the invention can also collect information on the nature and the quantity of the reagents and solvents used for the peptide synthesis, for the purpose of inventory management of said reagents and solvents. The integration by these software / applications adapted to a given future period, can allow to integrate a forecast element for the maintenance of stocks of reagents and solvents to the levels required to ensure a smooth running of all stages of synthesis in the desired times, but not penalizing financially.
Selon la présente invention, on parle indifféremment de cellule de mesure et de capteur. Par exemple, un capteur infrarouge ou une cellule de mesure infrarouge est un dispositif de détection infrarouge qui détecte les longueurs d'onde infrarouges.  According to the present invention, it is indifferently referred to measuring cell and sensor. For example, an infrared sensor or an infrared measuring cell is an infrared sensing device that detects infrared wavelengths.
Le dispositif et la méthode de l’invention présente de nombreux avantages par rapport aux solutions déjà existantes.  The device and method of the invention has many advantages over already existing solutions.
L’utilisation d’un réacteur avec un contrôle avancé en ligne au sein de celui- ci, et/ou dans la boucle de circulation permet de suivre chaque étape de la réaction afin de savoir précisément quand l'étape est terminée. On obtient avec ce système un gain de temps important. De plus, les opérateurs sont également moins exposés aux réactifs dangereux car moins d'échantillons doivent être prélevés. Un système de réacteur et un procédé de synthèse selon l’invention permet également de stopper la réaction dès qu’elle est terminée en limitant les réactions secondaires et d’optimiser la pureté du peptide synthétisé. The use of a reactor with advanced online control within it, and / or in the circulation loop makes it possible to follow each step of the reaction in order to know exactly when the step is completed. This system saves a lot of time. In addition, operators are also less exposed to hazardous reagents because fewer samples need to be collected. A reactor system and a synthesis method according to the invention also makes it possible to stop the reaction as soon as it is complete by limiting the side reactions and to optimize the purity of the synthesized peptide.
La surveillance peut être également réalisée grâce à la conductivité et la température en plus des capteurs proches infrarouge à l’intérieur même du réacteur mais elle sera de préférence effectuée sur la phase liquide du fait que, grâce à la boucle de recirculation sur le réacteur, on peut placer de nombreux capteurs en plus de celui du FTNIR (Fourier Transform Near-lnfrared Spectroscopy), comme des capteurs de mesure de conductivité et l’UV.  The monitoring can also be carried out thanks to the conductivity and the temperature in addition to the near-infrared sensors inside the reactor, but it will preferably be carried out on the liquid phase because, thanks to the recirculation loop on the reactor, Many sensors can be placed in addition to the Fourier Transform Near-Infrared Spectroscopy (FTNIR) sensors, such as conductivity and UV sensors.
Un autre avantage du système et du procédé selon l’invention est qu’un seul étalonnage est utilisé pour tous les acides aminés naturels protégés Fmoc. Le système et le procédé selon l’invention permet également de quantifier précisément l'agent de déprotection et la libération des dibenzofulvènes au cours des étapes de déprotection des acides aminées protégés Fmoc afin de savoir quand la réaction est terminée.  Another advantage of the system and method according to the invention is that only one calibration is used for all Fmoc protected natural amino acids. The system and method according to the invention also makes it possible to precisely quantify the deprotection agent and the release of the dibenzofulvenes during the deprotection steps of the Fmoc protected amino acids in order to know when the reaction is complete.
Le système et le procédé selon l’invention permettent également de suivre le lavage et la diminution des concentrations de réactifs jusqu'à un seuil afin de savoir quand le lavage est terminé. Grâce à ce contrôle en ligne avancé, il est possible, non seulement de suivre l'évolution des réactions, mais aussi de s’en servir pour l'automatisation.  The system and method according to the invention also make it possible to follow the washing and the reduction of the reagent concentrations to a threshold in order to know when the washing is finished. Thanks to this advanced online control, it is possible not only to follow the evolution of the reactions, but also to use them for automation.
Selon un mode préféré de l’invention, il est possible de choisir quelles cellules de mesures détermineront la fin d'une étape lorsqu'un seuil est atteint ou lorsque la stabilisation est établie. Ainsi, le réacteur pourra fonctionner automatiquement pendant plusieurs étapes en fonction des résultats de surveillance en ligne.  According to a preferred embodiment of the invention, it is possible to choose which measurement cells will determine the end of a step when a threshold is reached or when the stabilization is established. Thus, the reactor will be able to operate automatically for several stages depending on the online monitoring results.
Grâce à un capteur de type radar, capable de déterminer la hauteur du liquide dans le réacteur par rapport à la hauteur du lit de résine et grâce à la surveillance dans la boucle de recirculation, le réacteur peut fonctionner automatiquement et ainsi donner lieu à un lavage plus efficace de la résine, en opérant selon un mode percolation. Thanks to a radar-type sensor, able to determine the height of the liquid in the reactor relative to the height of the resin bed and thanks to the monitoring in the recirculation loop, the reactor can operate automatically and thus give rise to a more efficient washing of the resin, operating in a percolation mode.
Avantageusement, le système et le procédé selon l’invention utilise un procédé de percolation pour laver le solvant et optimiser la surveillance en ligne par la quantité des réactifs et solvants utilisés.  Advantageously, the system and method according to the invention uses a percolation process to wash the solvent and optimize the online monitoring by the amount of the reagents and solvents used.
Selon un mode préféré de l’invention, quand on utilise une unité ou un procédé de percolation, le liquide est introduit par le haut du réacteur à la résine au même débit que le débit de sortie du réacteur grâce au contrôle de la hauteur du liquide qui doit rester constante dans le réacteur pendant tout le lavage.  According to a preferred embodiment of the invention, when a percolation unit or method is used, the liquid is introduced from the top of the reactor to the resin at the same flow rate as the outlet flow of the reactor by means of the control of the height of the liquid. which must remain constant in the reactor during all the washing.
Ce mode de lavage comprend un lit de résine garni et un système de distribution pour l'entrée du liquide au sommet du réacteur pour une bonne répartition du liquide sur la surface de la résine. Ce mode de lavage est le plus efficace et permet une réduction significative de la consommation de solvant par rapport aux autres modes existants. Le réacteur est également contrôlé en température afin de pouvoir changer de température entre deux étapes différentes en quelques minutes.  This washing mode comprises a packed resin bed and a distribution system for the entry of the liquid at the top of the reactor for a good distribution of the liquid on the surface of the resin. This washing mode is the most efficient and allows a significant reduction in solvent consumption compared to other existing modes. The reactor is also temperature controlled to be able to change temperature between two different stages in a few minutes.
La présente invention réduit le coût requis pour l'achat de produits de départ et le traitement du liquide résiduel, en réduisant considérablement la quantité des réactifs, solvants effectivement consommés et le liquide de déchets (solvant organique), néfaste pour l'environnement.  The present invention reduces the cost required for the purchase of starting materials and the treatment of the residual liquid, considerably reducing the amount of reagents, solvents actually consumed and waste liquid (organic solvent), harmful to the environment.
DESCRIPTION DES FIGURES DESCRIPTION OF THE FIGURES
La présente invention sera mieux comprise à partir de la description détaillée ci-après et les dessins annexés qui sont donnés à titre d'illustration, et donc, ne sont pas limitatifs de la présente invention, et dans laquelle :  The present invention will be better understood from the detailed description below and the accompanying drawings which are given by way of illustration, and therefore, are not limiting of the present invention, and in which:
La figure 1 est une vue schématique montrant un système de réacteur de synthèse (14) pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide avec une boucle de recirculation (10) du liquide du réacteur permettant de mesurer en temps réel l’évolution des espèces chimiques dans le synthétiseur automatique de peptides de la présente invention. Les références numériques de la figure 1 désignent les éléments suivants: Une conduite d’entrée dédiée à l’introduction de la résine (1 ), une conduite d’entrée dédiée à l’introduction du solvant de synthèse (2), optionnellement amené par une pompe auto-amorçante. Selon un mode de réalisation préféré, un réacteur (5) de préactivation des acides aminés et/ou de dissolution des poudres et relié au réacteur d’assemblage (9) par une conduite d’entrée (6), une conduite d’entrée dédiée à l’introduction de l’agent de déprotection de l’acide aminé (3) amenée par une pompe auto-amorçante et une conduite d’entrée dédiée à l’introduction du solvant (4) sont reliés au réacteur d’assemblage (9), une conduite d’entrée supplémentaire dédiée à l’introduction des réactifs (8) et une conduite d’entrée dédiée à l’introduction du solvant sont reliés au réacteur de préactivation (5). La boucle de recirculation (10) du liquide du réacteur comprenant au moins un détecteur (1 1 ), préférentiellement une cellule de mesure spectrophotométrique de proche-infrarouge, un module de commande (13) piloté par un logiciel permettant l’automatisation du système de réacteur grâce au contrôle avancé en ligne dans la boucle de recirculation. Une vanne 3 voies (12) en sortie des capteurs sur la boucle de recirculation du réacteur d’assemblage (9) permet selon les besoins de passer en mode vidange ou non. FIG. 1 is a schematic view showing a synthesis reactor system (14) for carrying out a solid phase peptide synthesis with a recirculation loop (10) of the reactor liquid making it possible to measure in real time the evolution of the chemical species in the automatic peptide synthesizer of the present invention. The numerical references of FIG. 1 denote the following elements: An inlet pipe dedicated to the introduction of the resin (1), an inlet pipe dedicated to the introduction of the synthesis solvent (2), optionally supplied by a self-priming pump. According to a preferred embodiment, a reactor (5) for preactivating the amino acids and / or dissolving the powders and connected to the assembly reactor (9) via an inlet pipe (6), a dedicated inlet pipe at the introduction of the deprotecting agent of the amino acid (3) fed by a self-priming pump and an inlet pipe dedicated to the introduction of the solvent (4) are connected to the assembly reactor (9). ), an additional inlet pipe dedicated to the introduction of the reagents (8) and an inlet pipe dedicated to the introduction of the solvent are connected to the preactivation reactor (5). The recirculation loop (10) of the reactor liquid comprising at least one detector (1 1), preferably a near-infrared spectrophotometric measuring cell, a control module (13) controlled by a software allowing the automation of the control system. reactor through advanced online control in the recirculation loop. A 3-way valve (12) at the output of the sensors on the recirculation loop of the assembly reactor (9) makes it possible, according to the needs, to switch to emptying mode or not.
La figure 2 représente une courbe de calibration de la pipéridine par UV (390nm) pour la quantification par infrarouge.  Figure 2 shows a calibration curve of piperidine by UV (390nm) for infrared quantization.
La figure 3 représente la courbe de calibration de la pipéridine entre 0.01 % et 35%v.  Figure 3 shows the calibration curve of the piperidine between 0.01% and 35% v.
La Figure 4 représente la courbe de calibration de la pipéridine entre 0.01 % et 1 %v.  Figure 4 shows the calibration curve of piperidine between 0.01% and 1% v.
La figure 5 représente le suivi dans la phase liquide et dans le temps du couplage de l’histidine sur un peptide-résine. Observation de la disparition des réactifs et la formation d’un produit (DICU).  Figure 5 shows the follow-up in the liquid phase and in time of the coupling of histidine on a peptide-resin. Observation of the disappearance of reagents and the formation of a product (DICU).
La figure 6 représente Suivi d’une étape de déprotection de l’histidine. Figure 6 shows a follow-up of a deprotection step of histidine.
La figure 7 représente les lavages de la pipéridine après déprotection de l’Histidine. La figure 8 représente la disparition de l’agent de déprotection au cours du temps pour un débit fixe de percolation. Figure 7 shows washes of piperidine after deprotection of Histidine. Figure 8 shows the disappearance of the deprotecting agent over time for a fixed rate of percolation.
DESCRIPTION DETAILLEE DETAILED DESCRIPTION
On décrit dans ce qui suit des modes de réalisation et des modes de mise en œuvre préféré du système et du procédé selon l’invention. Cette description est faite également en référence aux figures annexées.  Embodiments and preferred embodiments of the system and method according to the invention will be described in the following. This description is also made with reference to the appended figures.
Le réacteur de synthèse est un réacteur en acier inoxydable d’une capacité de 25 litres. Un dispositif de filtration est placé au fond du réacteur afin de retenir la résine et d’évacuer les solvants. Ce dispositif de filtration est formé d’un matériau inox fritté mais, pourrait consister en une toile filtrante ou tout autre système de filtration connu de l’homme du métier.  The synthesis reactor is a stainless steel reactor with a capacity of 25 liters. A filtration device is placed at the bottom of the reactor to retain the resin and evacuate the solvents. This filtration device is formed of a sintered stainless steel material but could consist of a filter cloth or any other filtration system known to those skilled in the art.
Le réacteur possède une pâle d’agitation afin de mélanger au mieux la résine et le liquide. Cette pâle d’agitation peut tourner dans les deux sens de rotation. Sur le haut du réacteur sont présentes plusieurs entrées dont une entrée dédiée à l’introduction de la résine et une entrée dédiée à l’introduction du solvant de synthèse (DMF), solvant de synthèse, amené par une pompe auto-amorçante. Le débit d’introduction ainsi que le volume introduit sont mesurés et quantifiés par un débitmètre massique. Les débits peuvent aller de 35 l/h à 600 l/h. Le solvant peut être chauffé ou refroidit au besoin avant entrée dans le réacteur via un échangeur de chaleur. Afin de bien nettoyer le réacteur entre chaque étape de la synthèse, un dispositif de dispersion du solvant se situe en fin de ligne, au niveau du réacteur. Ce dispositif fonctionne correctement entre 20 et 1000 l/h. Une conduite d’entrée dédiée à l’introduction de l’agent de déprotection de l’acide aminé peut être également placée sur le haut du réacteur d’assemblage. Elle est réalisée grâce à une pompe auto-amorçante dont le débit est de 20 à 1000 l/h. Le débit d’introduction ainsi que le volume introduit sont mesurés et quantifiés par un débitmètre massique. L’agent de déprotection peut être pré-mélangé ou non avec le solvant de synthèse avant l’introduction dans le réacteur. Une conduite d’entrée de solvant supplémentaire dont le volume et le débit sont contrôlés par un débitmètre massique peut également être placé en haut du réacteur d’assemblage. The reactor has a stirring blade in order to mix the resin and the liquid as well as possible. This pale agitation can rotate in both directions of rotation. On the top of the reactor are several inputs including an entry dedicated to the introduction of the resin and an entry dedicated to the introduction of synthetic solvent (DMF), synthetic solvent, supplied by a self-priming pump. The feed rate and the volume introduced are measured and quantified by a mass flow meter. Flow rates can range from 35 l / h to 600 l / h. The solvent may be heated or cooled if necessary before entering the reactor via a heat exchanger. In order to thoroughly clean the reactor between each step of the synthesis, a solvent dispersion device is located at the end of the line, at the reactor. This device works properly between 20 and 1000 l / h. An inlet line dedicated to the introduction of the deprotecting agent of the amino acid can also be placed on the top of the assembly reactor. It is carried out thanks to a self-priming pump with a flow rate of 20 to 1000 l / h. The feed rate and the volume introduced are measured and quantified by a mass flow meter. The deprotection agent may be premixed or not with the synthesis solvent before introduction into the reactor. An additional solvent inlet pipe whose volume and flow rate are controlled by a mass flow meter may also be placed at the top of the assembly reactor.
Selon un mode de réalisation de l’invention, une conduite d’entrée d’azote dans le but de rendre inerte le réacteur ou de balayer à l’azote le réacteur est placée sur le haut du réacteur d’assemblage.  According to one embodiment of the invention, a nitrogen inlet pipe for the purpose of rendering the reactor inert or flushing with nitrogen the reactor is placed on the top of the assembly reactor.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le réacteur d’assemblage peut être muni de différents capteurs :  According to another embodiment of the invention, the assembly reactor may be provided with different sensors:
• Un capteur de spectroscopie proche-infrarouge,  • Near infrared spectroscopy sensor,
• Un capteur de niveau (de type radar), pour mesurer le niveau de résine ou de liquide dans le réacteur,  • A level sensor (radar type), to measure the level of resin or liquid in the reactor,
• Un capteur de pression.  • A pressure sensor.
• Une cellule de conductivité au fond du réacteur pour mesurer la conductivité à tout moment de la synthèse dans la phase solide-liquide.  • A conductivity cell at the bottom of the reactor to measure the conductivity at any time of the synthesis in the solid-liquid phase.
• Un pH-mètre au fond du réacteur pour mesurer le pH à tout moment de la synthèse dans la phase solide-liquide.  • A pH meter at the bottom of the reactor to measure the pH at any time of the synthesis in the solid-liquid phase.
Une boucle de recirculation du liquide du réacteur d’assemblage permet de mesurer en temps réel l’évolution des espèces chimiques dans le réacteur via des cellules de mesures qui sont, une cellule de conductivité, une cellule de proche- infrarouge (de 1 mm à 30mm de chemin optique) et une cellule UV (de 0.5 mm à 10mm de chemin optique). Pour une étape donnée, le passage du liquide dans la boucle a lieu à de nombreuses reprises et le débit de la recirculation peut être ajusté en fonction des étapes, si les réactions sont lentes ou rapides.  A recirculation loop of the liquid of the assembly reactor makes it possible to measure in real time the evolution of the chemical species in the reactor via measurement cells which are, a conductivity cell, a near-infrared cell (from 1 mm to 30mm optical path) and a UV cell (from 0.5mm to 10mm optical path). For a given step, the passage of the liquid in the loop takes place many times and the rate of recirculation can be adjusted according to the steps, if the reactions are slow or fast.
Lorsqu’une étape est finie, le liquide du réacteur est vidangé via le matériau fritté, en passant par les cellules de mesure de la boucle de recirculation, qui peuvent alors donner des informations sur la phase liquide en sortie du réacteur.  When a step is finished, the liquid of the reactor is drained via the sintered material, through the measurement cells of the recirculation loop, which can then give information on the liquid phase at the outlet of the reactor.
Selon un mode de réalisation de l’invention, le réacteur d’assemblage est relié à un autre réacteur pouvant servir de dissolution des poudres ou de préactivation des acides aminés avant introduction dans le réacteur. Ce réacteur est un réacteur double-enveloppe en verre d’une capacité de 101. Il est muni d’un agitateur permettant la dissolution des poudres. Il possède optionnellement une sonde de conductivité et un capteur de pression. Une entrée existe sur le couvercle afin d’introduire les poudres. Une conduite d’entrée de solvant permet comme le cas du réacteur d’assemblage d’introduire le solvant grâce à une pompe auto-amorçante, allant entre 20 et 1000 l/h. Le débit et le volume d’introduction sont mesurés par à un débitmètre massique. Une dernière conduite d’entrée est présente pour introduire un solvant ou un agent de couplage. According to one embodiment of the invention, the assembly reactor is connected to another reactor that can be used to dissolve the powders or preactivate the amino acids before introduction into the reactor. This reactor is a double-jacketed glass reactor with a capacity of 101. It is equipped with an agitator allowing the dissolution of the powders. It has an optional conductivity sensor and a pressure sensor. An inlet exists on the lid to introduce the powders. As in the case of the assembly reactor, a solvent inlet pipe makes it possible to introduce the solvent by means of a self-priming pump, ranging between 20 and 1000 l / h. The flow rate and the volume of introduction are measured by a mass flow meter. A last inlet line is present to introduce a solvent or a coupling agent.
L’ensemble est piloté par un logiciel permettant l’automatisation de l’installation grâce au contrôle avancé en ligne. Exemple 1. Fonctionnement de l’installation  The whole is controlled by a software allowing the automation of the installation thanks to the advanced control in line. Example 1. How the installation works
Lors d’une synthèse en phase solide, on commence par introduire la résine dans le réacteur via l’entrée dédiée. On ajoute un volume prédéfini de solvant de synthèse à un débit prédéfini via l’entrée dédiée. On agite le mélange résine- solvant puis une fois la résine gonflée, on vidange le solvant via la sortie en fond de réacteur. On recommence l’opération plusieurs fois. En parallèle, on dissout/ou on préactive dans le réacteur de dissolution l’acide aminé ou le linker dans du DMF. On agite. Soit on ajoute l’agent de couplage soit non. Si oui, on suit l’étape de préactivation, de manière préférée grâce à une cellule de conductivité.  During a solid phase synthesis, the resin is first introduced into the reactor via the dedicated inlet. A predefined volume of synthesis solvent is added at a predefined rate via the dedicated input. The resin-solvent mixture is stirred and once the resin is swollen, the solvent is drained via the outlet at the bottom of the reactor. We repeat the operation several times. In parallel, the amino acid or the linker in DMF is dissolved or pre-activated in the dissolution reactor. It is stirred. Either add the coupling agent or not. If so, the preactivation step is followed, preferably by means of a conductivity cell.
Une fois la préactivation finie, on introduit le mélange dans le réacteur d’assemblage. On lance l’agitation dans le réacteur d’assemblage et on lance la boucle de recirculation. La mesure d’infrarouge dans la boucle de recirculation permet de quantifier les espèces chimiques du mélange. La concentration des réactifs diminuent et celles des sous-produits de la réaction augmentent dans la phase liquide jusqu’à une stabilisation. Une fois la stabilisation atteinte, l’étape est finie, on vidange alors le réacteur d’assemblage via la boucle de recirculation qui, grâce à une vanne 3 voies en sortie des capteurs permet de passer en mode vidange.  Once the preactivation is complete, the mixture is introduced into the assembly reactor. Agitation is started in the assembly reactor and the recirculation loop is started. The infrared measurement in the recirculation loop makes it possible to quantify the chemical species of the mixture. The concentration of the reagents decreases and those of the byproducts of the reaction increase in the liquid phase until stabilization. Once the stabilization is reached, the step is finished, then the assembly reactor is emptied via the recirculation loop which, thanks to a 3-way valve at the output of the sensors, makes it possible to switch to the emptying mode.
L’étape de couplage étant finie, du solvant de synthèse est introduit dans le réacteur à un volume et un débit prédéfini. Le mélange solvant-résine est agité et la boucle de recirculation est lancée. Quand les signaux de conductivités sont stables dans le réacteur, et/ou les signaux dans la boucle de recirculation, la vidange du réacteur est lancée. Cette étape est réalisée plusieurs fois, de manière préférée au moins 3 fois jusqu’à atteindre les concentrations résiduelles voulues dans le réacteur. The coupling step being finished, synthesis solvent is introduced into the reactor at a volume and a predefined flow rate. The solvent-resin mixture is stirred and the recirculation loop is started. When the conductivity signals are in the reactor, and / or the signals in the recirculation loop, the emptying of the reactor is started. This step is carried out several times, preferably at least 3 times until the desired residual concentrations in the reactor are reached.
Une fois cette étape de lavage de la résine finie, l’étape de déprotection commence. Le solvant de synthèse et l’agent de déprotection sont introduits dans le réacteur via les conduites d’entrée dédiées. L’agitation dans le réacteur est ensuite lancée ainsi que la boucle de recirculation. On suit en temps réel l’étape de déprotection dans le réacteur grâce aux cellules de mesure en ligne.  Once this step of washing the finished resin, the deprotection step begins. The synthesis solvent and the deprotection agent are introduced into the reactor via the dedicated inlet lines. The stirring in the reactor is then started as well as the recirculation loop. The deprotection step in the reactor is monitored in real time by means of the on-line measurement cells.
La conductivité augmente dans le réacteur jusqu’à une stabilisation indiquant la fin de la réaction. La quantification des espèces dans le réacteur peut se faire, de manière préférée, grâce à une cellule infrarouge. Dans ce cas, le suivi de la formation du dibenzofulvène et de la consommation de 1‘agent de déprotection, ici la pipéridine, est possible.  The conductivity increases in the reactor until a stabilization indicating the end of the reaction. Quantification of the species in the reactor can be done, preferably, by means of an infrared cell. In this case, the monitoring of the formation of dibenzofulvene and the consumption of the deprotection agent, here piperidine, is possible.
L’augmentation de l’absorbance UV révèle la formation du dibenzofulvène et sa stabilisation indique la fin de l’étape de déprotection. La quantification de cette espèce par UV peut être réalisée si une stabilisation de l’UV n’est pas suffisante pour l’interprétation des signaux.  The increase in UV absorbance reveals the formation of dibenzofulvene and its stabilization indicates the end of the deprotection step. The quantification of this species by UV can be carried out if a stabilization of the UV is not sufficient for the interpretation of the signals.
Une fois l’étape finie, une vidange du réacteur a lieu. S’ensuit une étape de lavage de l’agent de déprotection. Cette étape de lavage, peut se faire de deux façons.  Once the stage is over, the reactor is emptied. A washing step of the deprotection agent follows. This washing step can be done in two ways.
Selon un mode de réalisation de l’invention, l’étape de lavage est réalisée par batchs successifs d’introduction du solvant de lavage, ici la DMF, agitation et boucle de recirculation, puis vidange. A chaque batch, une cellule infrarouge mesure la concentration en pipéridine dans le réacteur. Lorsque la mesure infrarouge donne le seuil de pipéridine atteint, on effectue une dernière vidange.  According to one embodiment of the invention, the washing step is carried out in successive batches of introduction of the washing solvent, here the DMF, stirring and recirculation loop, and then emptying. At each batch, an infrared cell measures the piperidine concentration in the reactor. When the infrared measurement gives the piperidine threshold reached, a last emptying is carried out.
Selon un autre mode de réalisation préférée, l’étape de lavage peut se faire également, et de manière surprenante, par percolation grâce à un système comprenant  According to another preferred embodiment, the washing step can also be done, and surprisingly, by percolation through a system comprising
- Une distribution de solvant de lavage homogène sur le lit de résine, - Une mesure de niveau de liquide et une régulation de débit basée sur la mesure de niveau liquide par un capteur approprié, A distribution of homogeneous washing solvent on the resin bed, - A liquid level measurement and flow control based on the liquid level measurement by an appropriate sensor,
L’optimisation des volumes de lavage au DMF est réalisé. Le débit d’introduction du DMF est égal, de manière préférée, au débit de vidange du réacteur gardant ainsi le niveau constant de liquide au sein du réacteur et au plus proche du niveau du lit de résine. La mesure de concentration de l’agent de déprotection, par exemple la pipéridine, est mesurée en temps réel en sortie du réacteur. Une fois le seuil de l’agent de déprotection atteint, on stoppe l’introduction du solvant de lavage et on finit la vidange.  The optimization of the DMF washing volumes is achieved. The feed rate of the DMF is preferably equal to the discharge rate of the reactor thus keeping the constant level of liquid within the reactor and as close to the level of the resin bed. The measurement of the concentration of the deprotection agent, for example piperidine, is measured in real time at the outlet of the reactor. Once the threshold of the deprotection agent has been reached, the introduction of the washing solvent is stopped and the emptying is finished.
Une fois la résine lavée, on recommence les mêmes étapes jusqu’à la fin de l’assemblage du peptide à savoir, préactivation ou dissolution des acides aminés, couplage de l’acide aminé sur la résine, lavage de la résine, déprotection de l’acide aminé, lavage de la résine.  Once the resin has been washed, the same steps are repeated until the end of the peptide assembly, namely, preactivation or dissolution of the amino acids, coupling of the amino acid to the resin, washing of the resin, deprotection of the amino acid, washing the resin.
L’utilisation d’une boucle de recirculation sur le réacteur d’assemblage comprenant une cellule de mesure, notamment de proche infrarouge, à de nombreux avantages par rapport aux solutions de l’art antérieur. On peut notamment quantifier de manière directe et non indirecte, les espèces chimiques suivantes selon l’étape dans laquelle se trouve l’assemblage du peptide.  The use of a recirculation loop on the assembly reactor comprising a measuring cell, particularly near-infrared, has many advantages over the solutions of the prior art. In particular, the following chemical species can be quantified in a direct and non-indirect manner depending on the stage in which the peptide assembly is located.
Lors du couplage et lavage après couplage, le système permet de quantifier les acides aminés protégés par un groupement de type Fmoc (Fmoc- aa) quel que soit leur état d’activation, Fmoc-aa-OFI, Fmoc-aa-OBt, Fmoc-aa- Oxyma ou Fmoc-aa-DIC et valable quel que soit l’acide aminé, en présence ou non d’FIOBt, oxyma, DIC, DICU, ou d’eau, le diisopropylurée (DICU) en présence des agents de couplages, par exemple FIOBt, Oxyma, DIC, Fmoc-aa. la somme de FIOBt (1 -hydroxybenzotriazole) +Fmoc-aa-OBt en présence de DIC, DICU et Fmoc-aa ; la somme de Oxyma + Fmoc-aa-oxyma en présence de DIC, DICU et Fmoc-aa ; la somme de DIC (N,A/-diisopropylcarbodiimide) + Fmoc-aa-DIC.  During coupling and washing after coupling, the system makes it possible to quantify amino acids protected by an Fmoc-type group (Fmoc-aa) whatever their activation state, Fmoc-aa-OFI, Fmoc-aa-OBt, Fmoc aa-Oxyma or Fmoc-aa-DIC and valid regardless of the amino acid, in the presence or absence of FIOBt, oxyma, DIC, DICU, or water, diisopropylurea (DICU) in the presence of coupling agents eg FIOBt, Oxyma, DIC, Fmoc-aa. the sum of FIOBt (1-hydroxybenzotriazole) + Fmoc-aa-OBt in the presence of DIC, DICU and Fmoc-aa; the sum of Oxyma + Fmoc-aa-oxyma in the presence of DIC, DICU and Fmoc-aa; the sum of DIC (N, N-diisopropylcarbodiimide) + Fmoc-aa-DIC.
On peut aussi suivre l’évolution, sans quantification au besoin, de toutes les espèces présentes ou non (création, disparition ou stabilisation de la concentration des espèces) en présence des autres agents de couplage dans le milieu: DIC (N,N'-Diisopropylcarbodiimide), Fmoc-aa-OH, Fmoc-aa-OBt, Fmoc- aa-Oxyma, Fmoc-aa-DIC. We can also follow the evolution, without quantification if necessary, of all the species present or not (creation, disappearance or stabilization of the concentration of the species) in the presence of the other coupling agents in the medium: DIC (N, N'-Diisopropylcarbodiimide), Fmoc-aa-OH, Fmoc-aa-OBt, Fmoc-aa-Oxyma, Fmoc-aa-DIC.
Calibration de la pipéridine pour la quantification par infrarouge Calibration of piperidine for infrared quantification
Une courbe de calibration doit être réalisée avant de pouvoir créer une méthode de quantification par infrarouge.  A calibration curve must be performed before an infrared quantification method can be created.
Les inventeurs ont choisi de manière arbitraire d’utiliser une méthode de quantification déjà existante et bien connu de l’homme du métier pour la pipéridine, à savoir une méthode de quantification par spectromètre UV.  The inventors have arbitrarily chosen to use an already existing quantification method well known to those skilled in the art for piperidine, namely a method of quantification by UV spectrometer.
C’est une méthode indirecte où la pipéridine dans le DMF est dérivatisée avec du DNFB puis analysée par spectrométrie UV à 390 nm après 30 min de dérivatisation. A titre d’exemple non limitatif, un spectrophotomètre utilisable selon l’invention est celui de la société Thermo Scientific de référence Genesys 10S UV-Vis.  This is an indirect method where the piperidine in DMF is derivatized with DNFB and then analyzed by UV spectrometry at 390 nm after 30 min of derivatization. By way of nonlimiting example, a spectrophotometer usable according to the invention is that of the company Thermo Scientific reference Genesys 10S UV-Vis.
Après 30 min de dérivatisation, la concentration de pipéridine est mesurée à 390 nm.  After 30 minutes of derivatization, the piperidine concentration is measured at 390 nm.
La courbe de calibration de la pipéridine est représentée sur la figure 2. The calibration curve of the piperidine is shown in FIG.
Une fois la courbe de calibration sur UV réalisée, des échantillons de pipéridine sont préparés à différentes concentrations connues entre 0.01 % et 35% volumique de pipéridine dans le DMF. Pour avoir une précision accrue pour les faibles valeurs de pipéridine, de nombreux échantillons ont été préparés entre 0.01 % et 1 % de pipéridine. Once the UV calibration curve has been carried out, piperidine samples are prepared at various known concentrations between 0.01% and 35% by volume of piperidine in DMF. To have increased accuracy for low piperidine values, many samples were prepared between 0.01% and 1% piperidine.
Ces échantillons ont ensuite été passés dans la cellule de mesure du spectromètre infrarouge (Fabricant Bruker sous la référence commerciale Matrix- F) identique ou non, à celle du système selon l’invention.  These samples were then passed into the measuring cell of the infrared spectrometer (Bruker manufacturer under the trade name Matrix-F), identical or different, to that of the system according to the invention.
Afin d’avoir une méthode de quantification correcte de la pipéridine par infrarouge, il faut aussi passer sur la cellule des échantillons réels, c’est-à-dire des échantillons issus des étapes de déprotection et de lavage après déprotections. Ceux-ci contiennent notamment des dibenzofulvènes, des traces de réactifs (Fmoc-aa, DIC, DICU, FIOBt, Oxyma) en plus de la pipéridine dans le DMF. La quantification par infrarouge étant une quantification basée sur des bandes spectrales et non une longueur d’onde bien précise, il est important lors de la calibration, d’avoir des échantillons proches des solutions de synthèses réelles. In order to have a method for the correct quantification of piperidine by infrared, it is also necessary to pass on the cell of the real samples, that is to say samples resulting from the deprotection and washing steps after deprotection. These contain especially dibenzofulvenes, traces of reagents (Fmoc-aa, DIC, DICU, FIOBt, Oxyma) in addition to piperidine in DMF. The quantization by infrared being a quantification based on spectral bands and not a very precise wavelength, it is important during the calibration, to have samples close to real synthesis solutions.
La quantification en proche infrarouge est une calibration multi-variables faisant emploi d’une résolution matricielle et de méthodes statistiques. Ces méthodes sont directement intégrées au logiciel de pilotage du spectromètre infrarouge.  Quantification in the near infrared is a multi-variable calibration using matrix resolution and statistical methods. These methods are directly integrated into the control software of the infrared spectrometer.
Des échantillons réels de déprotection et de lavage après déprotections ont été passés sur la cellule infrarouge et ont été analysés en parallèle par spectrométrie UV afin de déterminer la concentration réelle de pipéridine dans les échantillons.  Actual deprotection and washout samples were run on the infrared cell and analyzed in parallel by UV spectrometry to determine the actual piperidine concentration in the samples.
Une fois les échantillons passés sur la cellule NIR (NEAR INFRARED) à des concentrations de pipéridine connues, on peut commencer l’analyse multi- variables et déterminer la meilleure méthode de quantification proposée par le logiciel. Cette méthode doit ensuite être testée et éprouvée en passant d’autres échantillons à concentrations connues et voir si la courbe de calibration proposée permet effectivement de quantifier la pipéridine dans la marge d’erreur souhaitée.  Once the samples are passed to the NIR (NEAR INFRARED) cell at known piperidine concentrations, the multi-variable analysis can be started and the best quantification method proposed by the software can be determined. This method must then be tested and tested by passing other samples at known concentrations and see if the proposed calibration curve effectively quantifies the piperidine in the desired margin of error.
Dans le cas de la pipéridine, deux courbes de calibrations ont été réalisées car la gamme de mesure est très large (0.01 % à 35% de pipéridine) et que la précision à faible teneur en pipéridine doit être importante.  In the case of piperidine, two calibration curves have been realized because the measuring range is very wide (0.01% to 35% piperidine) and the accuracy with low piperidine content must be important.
Les échantillons à concentrations connues de pipéridine ont été analysés par la méthode de quantification infrarouge.  Samples with known concentrations of piperidine were analyzed by the infrared quantification method.
La figure 3 représente la courbe de calibration où des échantillons à concentrations connues de pipéridine ont été analysés par la méthode de quantification infrarouge entre 0.01 % et 35% de pipéridine.  FIG. 3 represents the calibration curve where samples with known concentrations of piperidine were analyzed by the infrared quantification method between 0.01% and 35% of piperidine.
La figure 4 représente la courbe de calibration de pipéridine entre 0.01 % et 1 % de pipéridine.  Figure 4 shows the piperidine calibration curve between 0.01% and 1% piperidine.
Les résultats permettent de valider les courbes de calibrations de la pipéridine par infrarouge. Monitoring de différentes espèces présentes dans le système The results validate the calibration curves of piperidine by infrared. Monitoring of different species present in the system
L’invention propose un exemple non limitatif de suivi et des quantifications par infrarouge des différentes espèces lors des différentes étapes de la synthèse peptidique.  The invention provides a nonlimiting example of monitoring and infrared quantification of the different species during the different stages of peptide synthesis.
Suivi d’une étape de couplage d’une Histidine sur un peptide-résine donné Follow-up of a coupling step of a Histidine on a given peptide-resin
L’acide aminé et IΉOBT sont dissouts dans le réacteur de dissolution. Ils sont ensuite introduits dans le réacteur d’assemblage ainsi que le DIC. L’agitation est lancée et la boucle de recirculation est mise en route.  The amino acid and IΉOBT are dissolved in the dissolution reactor. They are then introduced into the assembly reactor as well as the DIC. The agitation is started and the recirculation loop is started.
L’analyse infrarouge au cours du temps est visible sur la figure 7.  The infrared analysis over time is visible in FIG. 7.
La stabilisation des signaux a lieu après environs 2h. La concentration finale des espèces et notamment du Fmoc-aa-* (correspondant à l’histidine), est proche de la concentration attendue. Le couplage est fini. La vidange du réacteur peut avoir lieu. The stabilization of the signals takes place after about 2 hours. The final concentration of species, especially Fmoc-aa- * (corresponding to histidine), is close to the expected concentration. The coupling is finished. The emptying of the reactor can take place.
Du DMF est introduit dans le réacteur d’assemblage. L’agitation est alors lancée et la boucle de recirculation est mise en route. On ajoute alors la quantité de pipéridine nécessaire à la déprotection. La mesure des signaux par infrarouge dans la boucle de recirculation est visible sur la figure 8.  DMF is introduced into the assembly reactor. The agitation is then started and the recirculation loop is started. The amount of piperidine necessary for deprotection is then added. The measurement of the infrared signals in the recirculation loop is visible in FIG. 8.
Celle-ci montre une consommation de pipéridine et une libération des dibenzofulvènes dans le réacteur d’assemblage. La déprotection a bien lieu. Une fois la stabilisation des signaux observée, la réaction n’évolue plus. Le réacteur est alors vidangé.  This shows a consumption of piperidine and a release of dibenzofulvenes in the assembly reactor. Deprotection takes place. Once the stabilization of the signals observed, the reaction no longer evolves. The reactor is then emptied.
Une fois les déprotections finies, on peut suivre l’évolution de la concentration de pipéridine durant les lavages par batchs.  Once the deprotections are over, the evolution of the piperidine concentration during the batch washings can be followed.
Les résultats sont présentés en figure 9.  The results are shown in Figure 9.
Pour cela, une quantité de DMF prédéfinie est introduite dans le réacteur d’assemblage. L’agitation est lancée ainsi que la boucle de recirculation. On quantifie par mesure infrarouge la quantité de pipéridine présente dans le réacteur. A chaque stabilisation de la concentration en pipéridine, le réacteur est vidangé. Tant que la valeur de pipéridine obtenue n’est pas suffisamment faible, on recommence un lavage jusqu’à l’obtention de la concentration souhaitée. Optimisation du temps de lavage du système par percolation. For this, a predefined amount of DMF is introduced into the assembly reactor. Stirring is started as well as the recirculation loop. The amount of piperidine present in the reactor is quantified by infrared measurement. At each stabilization of the piperidine concentration, the reactor is drained. As long as the value of piperidine obtained is not sufficiently low, washing is repeated until the desired concentration is obtained. Optimization of the washing time of the system by percolation.
Selon un mode préféré de l’invention, le système de réacteur de synthèse chimique selon l’invention est relié à un système de percolation afin d’optimiser encore les temps de lavage et les quantités de solvant de lavage utilisés.  According to a preferred embodiment of the invention, the chemical synthesis reactor system according to the invention is connected to a percolation system in order to further optimize the washing times and the amounts of washing solvent used.
Au sens de la présente invention, la percolation signifie que le solvant, notamment de lavage, est passé au travers un lit fixe, comme une résine pour effectuer une extraction.  For the purposes of the present invention, percolation means that the solvent, in particular the washing solvent, is passed through a fixed bed, such as a resin, to carry out an extraction.
La percolation est réalisée sur une résine, par exemple une résine 4- Methylbenzhydrylamine hydrochloride ou tout autre résine connue par l’homme du métier (à confirmer ou donner un autre exemple), simplement déposée en lit fixe sur le système de filtration et répartie de façon homogène et à l’horizontal à sa surface afin d’éviter tout chemin préférentiel du solvant de lavage à travers le lit de résine.  The percolation is carried out on a resin, for example a 4-methylbenzhydrylamine hydrochloride resin or any other resin known to those skilled in the art (to be confirmed or give another example), simply deposited in fixed bed on the filtration system and distributed homogeneously and horizontally on its surface to avoid any preferential route of the washing solvent through the resin bed.
Le solvant de lavage, comme le DMF, est amené grâce à un système de distribution qui permet d’éviter de perturber le lit de résine afin qu’il reste bien à l’horizontal à sa surface.  The washing solvent, such as DMF, is fed through a distribution system that avoids disturbing the resin bed so that it remains horizontal on its surface.
Le niveau de liquide au-dessus de la résine est contrôlé au plus proche du lit de résine sans la perturber, afin de diminuer la quantité de solvant de lavage utilisé en limitant les phénomènes de remélange.  The liquid level above the resin is controlled closer to the resin bed without disturbing it, in order to reduce the amount of washing solvent used by limiting the remixing phenomena.
Le débit de solvant de lavage est optimisé grâce à la détermination des cinétiques de transfert des espèces à éliminer entre la phase solide (résine) et la phase liquide (solvant de lavage).  The flow of washing solvent is optimized by determining the kinetics of transfer of the species to be removed between the solid phase (resin) and the liquid phase (washing solvent).
Ainsi un débit trop important, ne permettrait pas aux espèces de diffuser et impliquerait une surconsommation du solvant de lavages et un débit trop faible permettrait bien aux espèces de diffuser mais impliquerait un temps de lavage trop long.  Thus too much flow, would not allow the species to diffuse and imply an overconsumption of washing solvent and too low flow would allow the species to diffuse but involve a wash time too long.
L’exemple suivant montre qu’en fonction du débit de lavage, l’efficacité des lavages n’est pas la même.  The following example shows that depending on the washing rate, the washing efficiency is not the same.
L’expérience est réalisée dans un réacteur en verre de 10 cm de diamètre muni d’un matériau fritté contenant un lit de résine de 10 cm de hauteur sur lequel est couplé un peptide. On cherche à réduire la concentration de l’agent de déprotection en effectuant une percolation avec le solvant de lavage. Le lit de résine est homogène et à l’horizontal, il n’y a pas de chemin préférentiel et le solvant de lavage est distribuée de telle sorte que le lit de résine reste bien à l’horizontal en surface. The experiment is carried out in a glass reactor 10 cm in diameter provided with a sintered material containing a bed of resin 10 cm in height on which is coupled a peptide. We try to reduce the concentration of the agent of deprotection by percolating with the washing solvent. The resin bed is homogeneous and horizontally there is no preferred path and the washing solvent is distributed so that the resin bed remains horizontal on the surface.
Dans le tableau suivant, on peut voir l’impact du débit de solvant de lavage sur l’efficacité du lavage par percolation.  In the following table, one can see the impact of the wash solvent flow on the efficiency of the percolation wash.
A 50 ml/min de débit de percolation, pour atteindre un lavage optimum, il faut 930 ml de solvant de lavage soit 20 min de lavage maximum. At 50 ml / min of percolation rate, to achieve optimum washing, 930 ml of washing solvent is required, ie 20 minutes of maximum washing.
A 300 ml/min de débit de percolation, pour atteindre le même lavage optimum, il faut 1200 ml de solvant de lavage (+20% de solvant supplémentaire par rapport à un débit de 50 ml/min) soit 4 min de lavage (-79% du temps par rapport à un débit de 50 l/h).  At 300 ml / min of percolation flow, to reach the same optimum washing, 1200 ml of washing solvent (+ 20% of additional solvent with respect to a flow rate of 50 ml / min) is required, ie 4 minutes of washing (- 79% of the time compared to a flow of 50 l / h).
On voit bien qu’à un débit trop élevé, il faut plus de solvant de lavage pour atteindre le même seuil de lavage mais un temps de lavage plus court.  It can be seen that at a rate that is too high, more washing solvent is required to reach the same washing threshold, but a shorter wash time.
Résultats de la percolation sur le système selon l’invention. Results of percolation on the system according to the invention.
L’exemple suivant montre un lavage par percolation sur le réacteur de l’invention avec une hauteur de lit de résine de 5,6 cm.  The following example shows a percolation wash on the reactor of the invention with a resin bed height of 5.6 cm.
Une analyse en ligne sur la boucle de recirculation permet de quantifier précisément l’élimination de l’agent de déprotection, ici la pipéridine.  An online analysis of the recirculation loop makes it possible to precisely quantify the elimination of the deprotection agent, here piperidine.
La figure 8 montre la disparition de l’agent de déprotection au cours du temps pour un débit fixe de percolation. La présente invention étant ainsi décrite, il est évident que la même chose peut être modifiée de nombreuses façons. De telles variations ne doivent pas être considérées comme un départ de l'esprit et la portée de l'invention, et toutes les modifications qui seraient évidentes pour l'homme du métier sont destinées à être incluses dans le cadre des revendications suivantes. Figure 8 shows the disappearance of the deprotection agent over time for a fixed rate of percolation. The present invention being thus described, it is obvious that the same thing can be modified in many ways. Such variations should not be considered a departure from the spirit and scope of the invention, and any modifications that would be apparent to those skilled in the art are intended to be included within the scope of the following claims.

Claims

Revendications claims
1 . Système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide, le système de réacteur comportant : 1. A reactor system for performing solid phase peptide synthesis, the reactor system comprising:
une conduite d’entrée (1 ) dédiée à l’introduction de résine,  an inlet pipe (1) dedicated to the introduction of resin,
une conduite d’entrée (2) dédiée à l’introduction du solvant de synthèse et de lavage,  an inlet pipe (2) dedicated to the introduction of the synthesis and washing solvent,
une conduite d’entrée (3) dédiée à l’introduction de l’agent de déprotection de l’acide aminé amenée,  an inlet pipe (3) dedicated to the introduction of the deprotecting agent of the supplied amino acid,
une conduite d’entrée (4) dédiée à l’introduction des réactifs,  an inlet pipe (4) dedicated to the introduction of the reagents,
un réacteur d’assemblage (9),  an assembly reactor (9),
une boucle de recirculation (10) du liquide du réacteur comprenant au moins une cellule de mesure (1 1 ) de quantification indirecte de l’avancée de la réaction sur la phase solide.  a recirculation loop (10) of the reactor liquid comprising at least one measuring cell (1 1) indirectly quantifying the progress of the reaction on the solid phase.
2. Système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide selon la revendication 1 , caractérisé en ce la cellule de mesure (1 1 ) est une cellule de mesure spectrophotométrique.  2. A reactor system for performing solid phase peptide synthesis according to claim 1, characterized in that the measuring cell (1 1) is a spectrophotometric measuring cell.
3. Système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide selon la revendication 2, caractérisé en ce la cellule de mesure (1 1 ) est une cellule de mesure de proche-infrarouge.  A reactor system for performing solid phase peptide synthesis according to claim 2, characterized in that the measuring cell (1 1) is a near-infrared measuring cell.
4. Système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide selon la revendication 2, caractérisé en ce la cellule de mesure (1 1 ) est une cellule de mesure par spectroscopie Raman.  4. Reactor system for carrying out solid phase peptide synthesis according to claim 2, characterized in that the measuring cell (1 1) is a Raman spectroscopic measuring cell.
5. Système de réacteur pour réaliser une synthèse peptidique en phase solide selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu’il comprend en outre dans le réacteur d’assemblage (9) un système de filtration.  5. reactor system for carrying out a solid phase peptide synthesis according to one of claims 1 to 4, characterized in that it further comprises in the assembly reactor (9) a filtration system.
6. Système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu’il comprend en outre un réacteur (5) de préactivation des acides aminés et/ou de dissolution des poudres et une entrée (6) reliant le réacteur (5) au réacteur d’assemblage (9). A reactor system for performing solid phase peptide synthesis according to claim 5, characterized in that it further comprises a reactor (5) for preactivating amino acids and / or dissolving the powders and an inlet (6). ) connecting the reactor (5) to the assembly reactor (9).
7. Système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend en outre dans la boucle de recirculation (10) une cellule de mesure de la conductivité. 7. A reactor system for performing solid phase peptide synthesis according to claim 6, characterized in that it further comprises in the recirculation loop (10) a conductivity measuring cell.
8. Système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend en outre dans la boucle de recirculation (10) une cellule de mesure de l’absorbance en ultraviolet.  8. A reactor system for performing a solid phase peptide synthesis according to claim 6, characterized in that it further comprises in the recirculation loop (10) an ultraviolet absorbance measuring cell.
9. Système de réacteur pour réaliser une synthèse de peptide en phase solide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend en outre dans la boucle de recirculation (10) une cellule de mesure par spectroscopie Raman.  9. Reactor system for performing a solid phase peptide synthesis according to claim 6, characterized in that it further comprises in the recirculation loop (10) a Raman spectroscopic measuring cell.
10. Procédé de synthèse peptidique en phase solide comprenant les étapes suivantes :  10. Solid phase peptide synthesis process comprising the following steps:
a) Couplage par agitation dans un réacteur d’assemblage et lancement de la boucle de recirculation,  a) coupling by stirring in an assembly reactor and launching of the recirculation loop,
b) Suivi en temps réel de l’étape de couplage par mesure d’un détecteur dans une boucle de recirculation pour quantifier les espèces chimiques du mélange,  b) Real-time monitoring of the coupling step by measuring a detector in a recirculation loop to quantify the chemical species in the mixture,
c) Lavage du réacteur d’assemblage,  c) Washing of the assembly reactor,
d) Déprotection par introduction d’un solvant de synthèse et d’un agent de déprotection dans le réacteur et lancement de l’agitation dans le réacteur et dans la boucle de recirculation,  d) Deprotection by introducing a synthesis solvent and a deprotecting agent into the reactor and starting agitation in the reactor and in the recirculation loop,
e) Suivi en temps réel de l’étape de déprotection dans le réacteur par mesure d’un détecteur,  e) Real-time monitoring of the deprotection step in the reactor by measuring a detector,
f) Lavage de l’agent de déprotection,  f) Washing the deprotection agent,
g) Suivi en temps réel de l’étape de lavage (f) de la concentration de l’agent de déprotection dans le réacteur par mesure d’un détecteur. g) Real-time monitoring of the washing step (f) of the concentration of the deprotecting agent in the reactor by measuring a detector.
1 1 . Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : 1 1. Method according to claim 10, characterized in that it comprises the following steps:
a) Une étape préliminaire de préactivation de l’acide aminé dans un réacteur de dissolution,  a) A preliminary step of preactivating the amino acid in a dissolution reactor,
b) Suivi en temps réel de l’étape de préactivation dans le réacteur par mesure d’un détecteur, c) Introduction du mélange préactivé dans le réacteur d’assemblage.b) Real-time monitoring of the preactivation step in the reactor by measuring a detector, c) Introduction of the preactivated mixture into the assembly reactor.
12. Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que le suivi en temps réel de l’étape de préactivation se fait par un conductimètre. 12. The method of claim 1 1, characterized in that the real-time monitoring of the preactivation step is by a conductivity meter.
13. Procédé selon la revendication l’une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que le lavage à l’étape (f) se fait par percolation.  13. The method of claim any one of claims 10 to 12, characterized in that the washing in step (f) is by percolation.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la concentration de l’agent de déprotection est mesurée en temps réel en sortie du réacteur.  14. The method of claim 13, characterized in that the concentration of the deprotection agent is measured in real time at the outlet of the reactor.
15. Utilisation d’un système de percolation dans un procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 14 pour la filtration d’un solvant.  15. Use of a percolation system in a process according to any one of claims 10 to 14 for the filtration of a solvent.
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