EP3652297A1 - Procede de preparation d'un milieu de culture bi-phasique de bacterie - Google Patents

Procede de preparation d'un milieu de culture bi-phasique de bacterie

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EP3652297A1
EP3652297A1 EP18749462.0A EP18749462A EP3652297A1 EP 3652297 A1 EP3652297 A1 EP 3652297A1 EP 18749462 A EP18749462 A EP 18749462A EP 3652297 A1 EP3652297 A1 EP 3652297A1
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EP
European Patent Office
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medium
layer
container
culture medium
agar
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18749462.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Raoult
Saber KHELAIFIA
Marion Bonnet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Fondation Mediterranee Infection
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Fondation Mediterranee Infection
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Filing date
Publication date
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Publication of EP3652297A1 publication Critical patent/EP3652297A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/24—Apparatus for enzymology or microbiology tube or bottle type
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M99/00—Subject matter not otherwise provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing an agar culture medium - hereinafter abbreviated as "agar” - for culturing bacteria under aerobic conditions.
  • the present invention relates to a process for preparing a biphasic solid culture medium packaged in a bacterial culture tube for culturing bacteria under aerobic conditions, and a biphasic solid culture medium conditioned in a said tube and a method of culturing aerobic or anaerobic bacteria with a said biphasic solid culture medium packaged in a said tube.
  • the inventors observed dehydration of the agar plates after 72 hours of incubation. However, some bacteria have a longer growth time, greater than 72 hours, and can be up to 28 days. This dehydration considerably reduces the possibility of a long incubation of these agar plates thus preventing microbiologists to carry out cultures of slow-growing bacteria because the dehydration of the agars results in a systematic inhibition of bacterial growth. Indeed, during the dehydration of the agar, there is a loss of water from the solid culture medium, which tends to concentrate the components of the culture medium such as salt for example.
  • the salt such as NaCl becomes an inhibitor because few bacteria are halotolerant.
  • the halophilic bacteria can tolerate a salt concentration (NaCl) up to 200 g / L while the non-halophilic bacteria can only tolerate a concentration of 5 g / L.
  • bacteria whose growth is sensitive to oxygen tension and in particular bacteria that are poorly tolerant of high oxygen tensions and for which optimal growth of said bacterium requires an incubation atmosphere with a relatively low oxygen content compared with the oxygen content of the air, said bacteria being chosen from the following bacteria:
  • anaerobic bacteria including strict anaerobic bacteria, and microaerophilic bacteria of the type mentioned above.
  • Slow growing bacteria include, for example, Mycobacterium genavensae (several weeks), Mycobacterium tuberculosis (2-3 weeks), Bartonella quintana (around 21 days), Bartonella henselae (around 21 days), Methanobrevibacter smithii (9-15 days). days), as well as all the strict anaerobic bacteria that can be grown aerobically (about 5 days minimum).
  • the inventors have developed a method that allows the agar to be permanently rehydrated.
  • the inventors have developed a bi-phasic culture medium comprising an inclined agar superimposed on a moisturizing medium and a method of manufacturing this bi-phasic inclined agar.
  • Biphasic culture media are known but which are used to improve the growth of mycobacteria, and thus reduce the time required for detection and increase its percentage of detection.
  • a biphasic medium has been described for the culture of the Mycobacterium tuberculosis complex [1].
  • Another biphasic medium makes it possible to detect the Mycobacterium avium complex, in particular in the blood of HIV patients [2].
  • the solid phase of the medium consists of 7H11 medium supplemented with acid oleic albumin agar and the liquid phase consists of a broth of BHI (Brain Heart Infusion).
  • both cases they comprise a nutrient liquid medium superimposed over a solid culture medium, which makes it impossible to carry out a culture by solid bacteria seeding to identify the growth of colonies on solid culture medium.
  • the inventors thus imprisoned the moisturizing liquid phase of the first medium under the solid phase of the second medium because, when the liquid phase is disposed above the solid phase, the free surface of the aerobic bacteria seeding over the sloping agar of the lower layer decreases or disappears completely in case of spreading of the liquid culture medium over the entire surface of the agar during the inclination of the culture tube. This prevents the growth of colonies of the bacterium seeded on the surface of the solid culture medium.
  • the first or second medium in step a1) or b1), if the first or second medium is capable of being gelled and in the castable state, it means that it then contains at least one gelling agent and that it is at this stage at a temperature at which - after being heated to make it flowable - it has not yet cooled sufficiently to bulk or become too viscous to be cast, and
  • step a.2) or b.2) the first or second medium capable of being gelled, cooled and compacted in a sufficiently viscous manner to adhere to the surface of the container so that the upper surface of the first layer keeps a determined inclination (oc2) relative to the axis (XX ') of said container regardless of the inclination of the container; and - if in step a1), said first aqueous medium is a liquid not containing a gelling agent, in step a.2) it is frozen and after step b.2) it becomes liquid again after defrosting after a while at a temperature above the freezing temperature.
  • an agar culture medium or a gelled aqueous medium contains from 5 to 20% of gelling agents.
  • said container containing the first medium containing a gelling agent is subjected to autoclaving by heating it at a temperature of 121 ° C. for 15 min, which makes it possible to sterilize it and gives it this gelling property during cooling after casting at 56 ° C.
  • the first layer of first aqueous liquid medium has the effect of progressive rehydration over time of the second layer of solid culture medium according to the purpose of the present invention.
  • the inclination of the container further allows:
  • the longitudinal axis of said container means an axis of symmetry of the side walls of the container in elevation relative to the bottom, preferably said container being a flat bottom container and the side walls of the container are in elevation perpendicularly to the flat bottom of said container as the axis of said container.
  • a container of a shape such that the contact surface of the second layer with the walls of the container is greater, preferably at least twice that of: (a) the contact surface of the second layer with the first layer, and / or
  • steps a1) and b1) an amount of second medium greater than the amount of first medium, preferably the respective volumes of said first liquid relative to said second medium being such that the free surface of the second layer extends from the bottom of said container to near the top edge of the container.
  • said container is a tube and in steps a 1 and b 1), the ratio of the volumes of the first medium / second medium is 1/10 to 4/10 and the longitudinal axis (XX 7 ) of the tube is inclined. at an angle of 45 to 80 ° with respect to the vertical to obtain an inclination of the upper surface of the second solid layer after step b.2) by an angle ⁇ 2 of 10 to 45 ° with respect to the longitudinal axis of the tube.
  • first middle and second middle and tilt angle allow in practice to spread the surface of the second layer from the bottom of the tube to near the top edge of the tube for a standard flat-bottomed culture tube. at 50 ml_ and from 14 to 20 cm in height and 1.5 to 2.5 cm in diameter.
  • said first medium is water or a bacterial liquid culture medium containing no gelling agent.
  • this first medium containing no gelling agent is frozen with liquid nitrogen at -196 ° C or -80 ° C, the freezing is so important, so that the time that the second medium is poured and solidifies, the first frozen layer does not have time to melt.
  • said first medium is an agar culture medium of said bacterium.
  • said first medium is a culture medium of said bacterium containing the same nutrients and / or same growth factors as said agar culture medium of bacteria of said second medium.
  • said second medium provides the nutrients and / or growth factors that could be consumed by the bacteria on the agar.
  • said first medium is a medium containing a (or) first agent (s) gelling (s) whose nature and / or quantity gives it a lower viscosity and water retention capacity to those of (or) second (s) agent (s) gelling (s) of said agar culture medium of bacteria of said second medium.
  • the said second gelling agent (s) confers (s) on said second solid medium a melting point higher than the temperature at which the first (s) ) agent (s) gelling (s) allow to obtain a first medium in the pourable state without it takes up mass.
  • said first medium is an aqueous medium containing, as first gelling agents, the kappa-carrageenan compound, preferably with starch, K 2 HPO 4 and CaCl 2 , and said agar culture medium of bacteria of said second medium.
  • solid contains agar as the second gelling agent.
  • said first medium is a gelled medium containing one (or more) gelling agent (s) identical (s) to the second (s) agent (s) gelling (s) said agar culture medium of bacteria of said second solid medium, but in an amount less than that of (or) second (s) agent (s) gelling (s), preferably agar.
  • the present invention also relates to a biphasic culture medium containing an inclined solid culture medium, packaged in a bacterial culture vessel having a longitudinal axis, preferably a bacterial culture tube, for culturing bacteria under conditions.
  • aerobiosis obtained by a preparation process according to the invention characterized in that it comprises:
  • a first layer of a said first aqueous medium situated at the bottom of the said container the upper surface of the said first layer being inclined at an angle ⁇ with respect to the longitudinal axis XX 'of the said container, the said first medium being a medium in the frozen or gelled state, or preferably in the liquid state, and
  • a second layer of a said second aqueous medium in the solid state the said second layer being superimposed over the said first layer so that the upper surface of the said second layer is inclined at the same angle by relative to the longitudinal axis (XX ') of said container parallel to the upper surface of the first layer, said second solid medium being a said agar culture medium of said bacterium under aerobic conditions.
  • the subject of the present invention is also a method for culturing bacteria under aerobic conditions using a biphasic culture medium packaged in a said container according to the invention in which the free surface of said second layer is seeded. , preferably arranged horizontally, with a said bacterium under aerobic conditions, then allows to incubate said container in an oven at 37 ° C preferably with its axis (XX 7 ) arranged vertically.
  • FIG. 1 schematically represents a culture tube filled with a diphasic culture medium according to the invention.
  • the inventors used standard sterile glass tube (test tube) with flat bottom 20 mL and 14.5 cm height (L) and 1.6 cm diameter (d) from Bio-rad (France) or Bolium (France) as a support for their culture medium. If the tubes are purchased sterile, the inventors can pour their medium directly into these tubes. On the other hand, if the tubes are not sterile, the inventors will have to autoclave them in a vacuum at a temperature of 134 ° C. for 18 minutes in porous packages.
  • the freezing at -80 ° C. of the first liquid culture medium makes it possible to obtain a fairly large freezing of the liquid so that it does not liquefy immediately when casting the hot agar of the second culture centre.
  • these first and second middle volumes and this angle of inclination allows in practice to spread the surface of the second layer from the bottom 2a of the tube to near the upper edge 2b of the tube for a standard culture tube flat bottom of 20 ml_ and 14.5 cm in height and 1.6 cm in diameter.
  • Obtaining the bi-phasic agar makes it possible to have a permanent hydration of the culture medium and thus an optimal growth of the bacteria sown on this culture medium.
  • the first liquid culture medium instead of freezing for 10 minutes at a temperature of minus 80 ° C, it can be solidified in liquid nitrogen at -196 ° C. This process takes less time since freezing takes place in about 1 minute. For this, the sterile glass tube is introduced in an inclined position in the liquid nitrogen, and was removed about 1 min later.
  • the second step which consists of casting the second solid culture medium on this first base remains the same as that explained above.
  • Solid media Columbia and Schaedler comprising the following components in one liter of distilled water are commonly used for bacterial culture. Slow bacteria, mentioned below, were sown on these media taken separately but during aerobic incubation, the agar plates dehydrate. During prolonged agar incubation (> 72h) dehydration of the culture medium is observed, which results in agar cracking and drying, until a completely dry "slab" is formed.
  • a colony of the bacterium selected from the following slow bacteria is subcultured onto the said medium and the agar is incubated at 37 ° C: Mycobacterium genavensae (several weeks), Mycobacterium tuberculosis (2-3 weeks), Bartonella quintana (21 days surroundings), Bartonella henselae (around 21 days), Methanobrevibacter smithii (9-15 days).
  • the freezing phase of the first liquid culture medium in the sterile glass tubes is not readily achievable by a industrial, for the purpose of marketing.
  • the inventors have tested the implementation of a first medium comprising other gelling agents than the second culture medium, with a water retention capacity lower than that of the agar so as to allow hydrate the agar, while having a slight gelation imparting a sufficiently viscous build-up of the first medium to support the casting of the second medium, thereby avoiding the freezing phase of the first medium.
  • the composition of the first gelling agents is as follows, preferably in the following amounts and weight proportions for IL:
  • a first or gelled sub-layer is obtained but of relatively lower viscosity than that of the second solid medium below.
  • the second solid culture medium consisting of agar as gelling agent, was autoclaved and then cast, at a temperature of about 56 ° C, into the tubes containing the underlayer of first compound culture medium of the mixture of the first gelling agents, in inclined form also.
  • a second solidified layer of viscosity or hardness higher than that of the first layer is obtained thanks to the second gelling agent which is agar.
  • the inventors obtained a bi-phasic agar containing an underlayer consisting of first gelling agents with a lower power of water retention than the agar. This allows an improved continuous hydration of the agar of the second solid culture medium by release of water by the first gelling agents of the first culture medium.
  • Example 3 The inventors have tested the implementation of a first medium comprising the same gelling agent as the second culture medium, but at a lower concentration so as to allow hydration of the agar of the second medium, while having a slight gelation conferring in mass sufficiently viscous of the first medium to ensure the support of the casting of the second medium, thus avoiding the freezing phase of the first medium.
  • the inventors have tested agar concentrations of the first medium ranging from 2.5 to 5 g / l of agar. They obtained gelling but much less hard than when they put a higher concentration of agar of the second medium of 15 g / L of agar. Then, the tubes containing the first heat-cast medium at 56 ° C, inclined slope, to gel in the refrigerator at 4 ° C for 10 minutes. A first or gelled sub-layer is obtained but of relatively lower viscosity than that of the second solid medium below.
  • the second solid culture medium consisting of agar as gelling agent, was autoclaved and then cast, at a temperature of about 56 ° C, into the tubes containing the underlayer of first compound culture medium of the mixture of the first gelling agents, in inclined form also.
  • a second solidified layer of viscosity or hardness higher than that of the first layer is obtained thanks to the gelling agent which is agar.
  • the inventors obtained a bi-phasic agar containing an underlayer consisting of first gelling agents with a lower power of water retention than the agar. This allows a continuous hydration of the agar of the second solid culture medium by release of water by the gelling agents of the first culture medium.
  • These different methods of manufacturing a bi-phasic inclined agar thus made it possible to have an improved continuous hydration of the agar, allowing the same numerous bacteria to be cultured with the same components of culture media as those described in Example 1. .
  • Example 4 Solid media, Columbia and Schaedler comprising the following components in one liter of distilled water are routinely used for culturing bacteria.
  • the anaerobic bacteria cultivated aerobically, cited below were seeded on these media taken separately but during the aerobic incubation, the agar plates are dehydrated.
  • dehydration of the culture medium is observed, which results in agar cracking and drying, until a completely dry "slab" is formed.
  • a colony of the bacterium selected from the following anaerobically grown aerobic bacteria is subcultured onto said agar medium and the tube is incubated at 37 ° C under air atmosphere: Clostridium massilioamazoniense, Finegoldia magna, Clostridium irregulare, Clostridium butyricum or still Propion ibacteriu m acnes. The growth of bacterial colonies on the surface of the agar is observed.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique (1) conditionné dans un tube (2) destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose comprenant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a.1) on verse au fond du tube, un premier milieu aqueux apte à être congelé ou gélifié, et on incline le dit tube selon une inclinaison déterminée par rapport à la verticale, et a.2) on congèle ou gélifie ledit premier milieu jusqu'à former une première couche à l'état solide tel que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (α2) par rapport à l'axe (XX') du dit tube, et b.1) on coule dans le tube, un deuxième milieu aqueux qui est un milieu de culture apte à former un milieu de culture solide, et on incline le dit tube selon une inclinaison déterminée (α1) de son axe longitudinal (XX') par rapport à la verticale pour former une deuxième couche de dit deuxième milieu par-dessus ladite première couche, et b.2) on gélifie ledit deuxième milieu jusqu'à former une deuxième couche de dit milieu de culture solide gélosé.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'UN MILIEU DE CULTURE BI-PHASIQUE DE BACTERIE
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture gélosé - ci-après abrégé par « gélose » - pour cultiver les bactéries en conditions d'aérobiose.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un tube de culture de bactéries destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose, ainsi qu'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un dit tube et un procédé de culture de bactéries aérobie ou anaérobie avec un dit milieu de culture solide biphasique conditionné dans un dit tube.
Lors de l'incubation des géloses ensemencées par des cultures bactériennes en aérobiose, les inventeurs ont observé une déshydratation des géloses au bout de 72 heures d'incubation. Or, certaines bactéries ont un temps de croissance plus long, supérieur à 72 heures, et qui peut aller jusqu'à 28 jours. Cette déshydratation réduit considérablement la possibilité d'une incubation longue de ces géloses empêchant ainsi les microbiologistes de réaliser des cultures de bactéries à croissance lente car la déshydratation des géloses entraine une inhibition systématique de la croissance bactérienne. En effet, lors de la déshydratation de la gélose, il y a une perte d'eau du milieu de culture solide, ce qui a tendance à concentrer les éléments composants le milieu de culture tel que le sel par exemple. A une concentration trop importante, le sel tel que NaCI devient un inhibiteur car peu de bactéries sont halotolérantes. Par exemple, les bactéries halophiles peuvent tolérer une concentration de sel (NaCI) jusqu'à 200 g/L alors que les bactéries non halophiles ne peuvent tolérer qu'une concentration de 5 g/L.
Cette conséquence peut ainsi entraîner une inhibition de la croissance bactérienne. Ce problème de déshydratation n'intervient qu'en aérobiose car les cultures anaérobies sont cultivées dans des boites fermées hermétiquement, empêchant ainsi l'évaporation et la déshydratation des milieux. Au contraire, les cultures aérobies sont cultivées à l'air libre, favorisant une perte d'eau des milieux, lors de leur incubation dans des enceintes à 37°C. On entend ici par « aérobiose », une atmosphère d'incubation qui est de l'air ou qui contient de l'oxygène à teneur réduite par rapport à l'air. Dans WO2014/064359. et WO2015/162377, on a décrit des milieux de culture enrichis en agents antioxydants à savoir l'acide urique, l'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrosulfure de sodium qui permettent d'améliorer et faciliter les conditions de croissance en culture acellulaire des bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène et notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries suivantes :
- les bactéries anaérobies, y compris les bactéries anaérobies strictes, et - les bactéries microaérophiles du type citées ci-dessus.
Parmi les bactéries à croissance lente, on peut citer par exemple Mycobacterium genavensae (plusieurs semaines), Mycobacterium tuberculosis (2-3 semaines), Bartonella quintana (21 jours environs), Bartonella henselae (21 jours environs), Methanobrevibacter smithii (9-15 jours), ainsi que toutes les bactéries anaérobies strictes que l'on peut cultiver en aérobie (environ 5 jours minimum).
Actuellement, pour éviter cette déshydratation, les laboratoires incubent les géloses en chambre humide. Pour cela, des jarres en plastiques sont utilisées et un papier imbibé d'eau est ajouté dans la jarre dans laquelle les géloses ont été mises à incuber. La jarre est fermée hermétiquement et l'humidité reste ainsi prisonnière dans la jarre. Le problème de cette technique est le cout engendré par l'achat de ces jarres ainsi que place qui leur est consacré dans les étuves, ce qui peut être pénalisant lorsqu'il y a beaucoup de géloses à incuber.
Pour pallier à cette déshydratation des milieux lors de leur incubation en aérobie, les inventeurs ont mis au point un procédé qui permet de réhydrater en permanence la gélose. Pour cela, les inventeurs ont élaboré un milieu de culture bi-phasique comprenant une gélose inclinée superposée à un milieu hydratant et un procédé de fabrication de cette gélose inclinée bi-phasique.
On connaît des milieux de culture bi-phasique mais qui sont utilisés pour améliorer la croissance des mycobactéries, et ainsi diminuer le temps nécessaire pour la détection et augmenter son pourcentage de détection. Un milieu biphasique a été décrit pour la culture du complexe Mycobacterium tuberculosis [1]. Un autre milieu biphasqiue permet de détecter le complexe Mycobacterium avium notamment dans le sang des patients atteints du VIH [2]. La phase solide du milieu est constituée du milieu 7H11 supplémenté en acide oléique albumine agar et la phase liquide est constituée d'un bouillon de BHI (Brain Heart Infusion). Dans les deux cas, ils comprennent un milieu liquide nutritif superposé par-dessus un milieu de culture solide ce qui empêche de réaliser une culture par ensemencement de bactérie sur milieu solide pour identifier la croissance de colonies sur milieu de culture solide. Les inventeurs ont ainsi emprisonné la phase liquide hydratante du premier milieu sous la phase solide du deuxième milieu car lorsque la phase liquide est disposée dessus la phase solide, la surface libre d'ensemencement des bactéries aérobies par-dessus la gélose inclinée de la couche inférieure diminue voire disparait totalement en cas d'étalement du milieu de culture liquide sur toute la surface de la gélose lors de l'inclinaison du tube de culture. Ceci empêche d'observer la croissance de colonies de la bactérie ensemencée en surface du milieu de culture solide. Par ailleurs, pour les bactéries anaérobies incubées en aérobie, la présence de liquide à la surface de la gélose et plus précisément au fond du tube, favorise une croissance de ces bactéries anaérobies dans le liquide, plutôt qu'à la surface de la gélose de la deuxième couche. En effet, une certaine condition d'anaérobiose s'installe au fond du tube dans le liquide où l'oxygène est moins présent.
Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un récipient de culture de bactéries présentant un axe longitudinal (XX7), de préférence un tube de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes dans lesquelles : a.l) on verse au fond du récipient, un premier milieu aqueux qui est liquide ou coulable mais apte à être congelé ou gélifié, et simultanément ou après ce versement, on incline le dit récipient selon une inclinaison de son axe longitudinal (XX') par rapport à la verticale d'un angle déterminé al, et a.2) on congèle ou respectivement gélifie ledit premier milieu jusqu'à former une première couche du premier milieu à l'état congelé ou respectivement formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison par rapport à l'axe longitudinal (XX') du dit récipient d'un angle complémentaire al tel que al + a2=90°, et b.l) on coule dans le récipient, un deuxième milieu aqueux qui est un milieu de culture gélosé d'une dite bactérie en conditions d'aérobiose, à l'état coulable mais apte à être gélifié et ainsi former un milieu de culture solide, et simultanément ou après ce coulage, on incline le dit récipient selon une inclinaison de son axe longitudinal (XX') par rapport à la verticale d'un même angle al pour former une deuxième couche de dit deuxième milieu à l'état coulable par-dessus ladite première couche du premier milieu solide à l'état congelé ou respectivement formant un gel, la surface supérieure de la dite deuxième couche étant inclinée par rapport à l'axe longitudinal (XX7) du dit récipient parallèlement à la surface supérieure de la première couche, et b.2) on gélifie ledit deuxième milieu jusqu'à former une deuxième couche de dit milieu de culture solide gélosé d'une dite bactérie solide formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison par rapport à l'axe longitudinal (XX') du dit récipient d'un même angle al . On comprend que :
- à l'étape a.l) ou b.l), si le premier ou deuxième milieu est apte à être gélifié et à l'état coulable, cela signifie qu'il contient alors au moins un agent gélifiant et qu'il se trouve à cette étape à une température à laquelle - après avoir été chauffé pour être rendu coulable - il n' a pas encore suffisamment refroidi pour prendre en masse ou devenir trop visqueux pour être coulé, et
- à l'étape a.2) ou b.2), le premier ou deuxième milieu apte à être gélifié, a refroidi et pris en masse de façon suffisamment visqueuse pour adhérer à la surface du récipient de sorte la surface supérieure de la première couche garde une inclinaison déterminée (oc2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient quelle que soit l'inclinaison du récipient; et - si à l'étape a.l), le dit premier milieu aqueux est un liquide ne contenant pas d'agent gélifiant, à l'étape a.2) il est congelé et après l'étape b.2) il redevient liquide après décongélation au bout d'un certain temps à température supérieure à la température de congélation.
De façon connue, un milieu de culture gélosé ou un milieu aqueux gélifié contient de 5 à 20% d'agents gélifiants.
En pratique, le dit récipient contenant le premier milieu contenant un agent gélifiant le cas échéant est soumis à un autoclavage en le chauffant à une température 121°C pendant 15 min qui permet de le stériliser et lui confère cette propriété de gélification lors du refroidissement après coulage à 56°C. Selon la présente invention, on a découvert que la première couche de premier milieu aqueux liquide a pour effet une réhydratation progressive au cours du temps de la deuxième couche de milieu de culture solide selon le but de la présente invention. Le fait que les surfaces supérieures des deux couches de milieux ont le même angle d'inclinaison respectivement par rapport à la verticale et à l'horizontale, il permet de :
- garantir une épaisseur uniforme de la deuxième couche et donc une réhydratation homogène de celle-ci, et - obtenir une épaisseur constante de la deuxième couche et ainsi éviter que la gélose supérieure ne s'affaisse du fait d'un poids localement excessif vis-à-vis de la quantité relativement réduite de liquide de la couche inférieure le cas échéant.
Aux étapes a.l) et b.l), l'inclinaison du récipient permet en outre de:
- augmenter la surface de contact de la deuxième couche avec la première couche et donc améliorer sa réhydratation par celle-ci, et
- offrir une plus grande surface de travail apte à être ensemencée par des bactéries à cultiver sur la surface libre inclinée de la deuxième couche.
On comprend que l'axe longitudinal dudit récipient s'entend d'un axe de symétrie des parois latérales du récipient en élévation par rapport au fond, de préférence le dit récipient étant un récipient à fond plat et les parois latérales du récipient sont en élévation perpendiculairement au fond plat du dit récipient comme l'axe du dit récipient.
On peut citer en particulier comme récipient de culture, un récipient de forme telle que la surface de contact de la deuxième couche avec les parois du récipient est supérieure, de préférence au moins le double par rapport à : (a) d'une part, la surface de contact de la deuxième couche avec la première couche, et/ou
(b) d'autre part, la surface de contact de la première couche avec les parois du récipient.
Sur des boites de Pétri, cette condition n'est pas vérifiée. On peut citer en particulier comme récipient de culture qui permette d'obtenir une gélose inclinée, tout récipient de préférence cylindrique et à fond plat, plus long que large, c'est à dire dont les parois latérales sont plus hautes que la largeur de la paroi de fond au- dessus de laquelle elles s'étendent.
Plus particulièrement, aux étapes a.l) et b.l), on verse une quantité de deuxième milieu supérieure à la quantité de premier milieu, de préférence les volumes respectifs de dit premier liquide par rapport au dit deuxième milieu étant tels que la surface libre de la deuxième couche s'étend depuis le fond dudit récipient jusqu'à proximité du bord supérieur du récipient.
Ceci permet que la surface de contact du deuxième milieu avec le récipient soit supérieure à celle du premier milieu et qu'ainsi l'adhérence de la deuxième couche solide sur les parois du récipient soit suffisante pour garantir que le premier milieu liquide ne déborde par-dessus la deuxième couche du dit milieu de culture en cours d'utilisation.
Plus particulièrement encore, ledit récipient est un tube et aux étapes a.l) et b.l), le rapport des volumes des premier milieu /deuxième milieu est de 1/10 à 4/10 et on incline l'axe longitudinal (XX7) du tube d'un angle al de 45 à 80° par rapport à la verticale pour obtenir une inclinaison de la surface supérieure de la deuxième couche solide après l'étape b.2) d'un angle oc2 de 10 à 45° par rapport à l'axe longitudinal du tube.
Ces quantités des premier milieu et deuxième milieu et angle d'inclinaison permettent en pratique d'étaler la surface de la deuxième couche depuis le fond du tube jusqu'à proximité du bord supérieur du tube pour un tube de culture standard à fond plat de 20 à 50 ml_ et de 14 à 20 cm de hauteur et 1.5 à 2.5 cm de diamètre.
Dans un mode de réalisation, le dit premier milieu est de l'eau ou un milieu de culture liquide de bactérie ne contenant pas d'agent gélifiant. A l'étape a.2), ce premier milieu ne contenant pas de gélifiant est congelé à l'azote liquide à -196°C ou à -80°C, la congélation est tellement importante, de sorte que le temps que le deuxième milieu soit coulé et se solidifie, la première couche congelée n'a pas le temps de fondre.
Selon un autre mode de réalisation, le dit premier milieu est un milieu de culture gélosé de dite bactérie.
Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu de culture de dite bactérie contenant les mêmes éléments nutritifs et/ou mêmes facteurs de croissance que le dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. Ainsi, en plus d'hydrater le deuxième milieu, cela permet de lui apporter les nutriments et/ou facteurs de croissance qui ont pu être consommés par les bactéries sur la gélose.
Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu contenant un (ou des) premier (s) agent(s) gélifiants(s) dont la nature et/ou la quantité lui confère une viscosité et un pouvoir de rétention d'eau inférieurs à ceux du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. Plus particulièrement encore, le(s) dit(s) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) confère(nt) au dit deuxième milieu solide une température de fusion supérieure à la température à laquelle le(s) premier (s) agent(s) gélifiants(s) permettent d'obtenir un premier milieu à l'état coulable sans qu'il ne prenne en masse. Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu aqueux contenant comme premiers agents gélifiants le composé kappa-carraghénane, de préférence avec l'amidon, K2HP04 et CaCI2, et le dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide contient de l'agar comme deuxième agent gélifiant.
Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu gélifié contenant un (ou des) premier(s) agent(s) gélifiants(s) identique(s) au(x) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide, mais en quantité inférieure à celle du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s), de préférence de l'agar.
La présente invention a également pour objet un milieu de culture biphasique contenant un milieu de culture solide incliné, conditionné dans un récipient de culture de bactérie présentant un axe longitudinal, de préférence un tube de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose obtenu par un procédé de préparation selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend :
- une première couche d'un dit premier milieu aqueux situé au fond dudit récipient, la surface supérieure de la dite première couche étant inclinée d'un angle al par rapport à l'axe longitudinal (XX') du dit récipient, le dit premier milieu étant un milieu à l'état congelé ou gélifié, ou de préférence à l'état liquide, et
- une deuxième couche d'un dit deuxième milieu aqueux à l'état solide, la dite deuxième couche étant superposée par-dessus la dite première couche de sorte que la surface supérieure de la dite deuxième couche est inclinée d'un même angle al par rapport à l'axe longitudinal (XX') du dit récipient parallèlement à la surface supérieure de la première couche, ledit deuxième milieu solide étant un dit milieu de culture gélosé de dite bactérie en conditions d'aérobiose.
La présente invention a également pour objet un procédé de culture de bactéries en conditions d'aérobiose à l'aide d'un milieu de culture biphasique conditionné dans un dit récipient selon l'invention dans lequel on ensemence la surface libre de la dite deuxième couche, de préférence disposée horizontalement, avec une dite bactérie en conditions d'aérobiose, puis laisse à incuber ledit récipient, dans une étuve à 37°C de préférence avec son axe (XX7) disposé verticalement. D'autre caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée des exemples de réalisations suivants.
La figure 1 représente schématiquement un tube de culture rempli d'un milieu de culture diphasique selon l'invention. Les inventeurs ont utilisé des tubes en verre stérile (tube à essai) standard à fond plat 20 mL et de 14.5 cm de hauteur (L) et 1.6 cm de diamètre (d) de chez Bio-rad (France) ou Bolium (France) comme support de leur milieu de culture. Si les tubes sont achetés stériles, les inventeurs peuvent couler leur milieu directement dans ces tubes. En revanche, si les tubes ne sont pas stériles, les inventeurs devront les autoclaver à vide à une chaleur de 134°C pendant 18 minutes dans des emballages poreux.
Exemple 1
Pour fabriquer une gélose bi-phasique, les inventeurs ont réalisé les étapes suivantes:
1) 2 mL d'un premier milieu de culture liquide 1-1 sont versés au fond 2a de tubes en verre stériles 2. Ce milieu de culture liquide est mis à congeler à -80°C durant 10 min, l'axe XX' du tube étant incliné de 60°par rapport la verticale YY' avec la surface libre du milieu de culture horizontale, de façon à obtenir une solidification sous forme inclinée du milieu de culture liquide (figure 1).
2) 10 mL d'un deuxième milieu de culture gélosé 1-2, comprenant les mêmes composants que le premier milieu mais étant supplémenté en agar, sous forme solide a été autoclavé à 121°C pendant 15 minutes, puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant une première couche 1-1 du premier milieu de culture congelé, le tube étant incliné également de 60°par rapport la verticale YY' comme à l'étape 1). Les tubes ne sont pas refermés avec un bouchon 2c immédiatement après le coulage de la gélose. En effet, on attend que la gélose du deuxième milieu ait pris en masse et que la condensation, due à la chaleur dégagée par le deuxième milieu de culture lors de son coulage, ait disparu. On obtient ainsi une deuxième couche 1-2 gélose bi-phasique dont la surface supérieure libre la de la deuxième couche 1-2 du dit deuxième milieu de culture solide est de al = 30° par rapport à l'axe XX' du tube, comme montré figure 1. En effet, la congélation à -80°C du premier milieu de culture liquide permet d'obtenir une congélation assez importante du liquide pour que celui-ci ne se liquéfie pas immédiatement lors du coulage de la gélose chaude du deuxième milieu de culture.
D'autre part, ces volumes de premier et deuxième milieu et cet angle d'inclinaison permet en pratique d'étaler la surface de la deuxième couche depuis le fond 2a du tube jusqu'à proximité du bord supérieur 2b du tube pour un tube de culture standard à fond plat de 20 ml_ et de 14,5 cm de hauteur et 1.6 cm de diamètre.
L'obtention de la gélose bi-phasique permet d'avoir une hydratation permanente du milieu de culture et ainsi une croissance optimale des bactéries ensemencées sur ce milieu de culture.
Pour la congélation du premier milieu de culture liquide, au lieu de le congeler pendant 10 minutes à une température de moins 80°C, on peut le solidifier dans de l'azote liquide à -196°C. Ce processus prend moins de temps puisque la congélation a lieu en environ 1 minute. Pour cela, le tube en verre stérile est introduit en position inclinée dans l'azote liquide, et est ressorti environ 1 min plus tard. La deuxième étape, qui consiste à couler le deuxième milieu de culture solide sur cette première base reste la même que celle explicitée précédemment.
Les milieux solides, Columbia et Schaedler comprenant les composants suivants dans un litre d'eau distillée sont utilisés de façon courante pour la culture des bactéries. Les bactéries lentes, citées ci-après ont été ensemencées sur ces milieux pris séparément mais lors de l'incubation en aérobie, les géloses se déshydratent. Lors de l'incubation prolongée de la gélose (>72h) il est observé une déshydratation du milieu de culture qui se traduit par une fissuration de la gélose et un dessèchement, jusqu'à obtenir une « galette » complètement sèche.
En revanche, les résultats de culture étaient favorables sur des milieux biphasiques selon l'invention comprenant les composants de ces deux milieux sans agar pour le premier milieu et avec agar pour le deuxième milieu. a) Milieu Columbia
Caséine hydrolysate (Tryptone) 10 g (1 %)
Extrait de levure 5 g (0,5 %)
Proteose peptone 5 g (0,5 %)
Tryptic Digest of Beef Heart 3 g (0,3 %)
L-cystéine 0,1 g (0,01%)
Glucose 2,5 g (0,25 %)
NaCI 5 g (0,5 %)
Sulfate de magnésium (MgS04) 0,1 g (0,01 %) Sulfate de fer (FeS04) 0,02 g (0,002 %) Carbonate de sodium (Na2C03) 0,6 g (0,06 %) Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane 0,83 g (0,083 %) Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane HCI 2,86 g (0,286 %) (Agar 15 g (1,5 %)) b) Milieu Schaedler:
Peptone trypticase-soja 10,0 g (1%) Peptone 5,0 g (0,5 %)
Extrait de levure 5,0 g (0,5 %)
Chlorhydrate de cystéine 0,4 g (0,04 %)
Hémine 0,01 g (0,001 %)
Glucose 5,0 g (0,5 %)
Tampon TRIS 0,75 g (0,075 %)
(Agar 13,5 g (1,35 %))
Une colonie de la bactérie choisie parmi les bactéries lentes suivantes est repiquée sur le dit milieu et la gélose est mise à incuber à 37°C : Mycobacterium genavensae (plusieurs semaines), Mycobacterium tuberculosis (2-3 semaines), Bartonella quintana (21 jours environs), Bartonella henselae (21 jours environs), Methanobrevibacter smithii (9-15 jours).
Exemple 2
La phase de congélation du premier milieu de culture liquide dans les tubes en verre stérile, que ce soit par le procédé de congélation à -80°C ou par le procédé de congélation à l'azote liquide, n'est pas facilement réalisable par un industriel, dans un but de commercialisation. Pour pallier cet inconvénient, les inventeurs ont testé la mise en œuvre d'un premier milieu comprenant d'autres gélifiants que le deuxième milieu de culture, avec un pouvoir de rétention d'eau moindre que celui de l'agar afin de permettre ainsi d'hydrater la gélose, tout en ayant une légère gélification conférant une prise en masse suffisamment visqueuse du premier milieu pour assurer le support du coulage du deuxième milieu, permettant ainsi d'éviter la phase de congélation du premier milieu.
Dans ce but, les inventeurs ont testé comme autre gélifiant du premier milieu : la gomme kappa-carraghénane. La composition des premiers gélifiants (gélifiant du premier milieu) est la suivante, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour IL:
- Kappa-carraghénane : 4 g (0,4%)
- K2HP04 : 0,83 g (0,083%)
- CaCI2 : 0,1 g (0,01%)
- Amidon : 5 g (0,5%). K2HP04, CaCI2 et l'amidon permettent une meilleure prise en masse de la gomme kappa-carraghénane. Ce mélange est autoclavé avant d'être coulé à une température d'environ 56°C. Le coulage des premier et deuxième milieux à 56°C est avantageux car les milieux ne gélifient qu'à 40°C pour le kappa-carraghénane et respectivement 35°C pour l'agar on reste en deçà de la température de fusion du premier milieu contenant kappa-carraghénane qui est supérieure à 65°C, la température de fusion du deuxième milieu contenant l'agar étant de 90°C . En terme quantitatif, on met 15 g/L d'agar dans un milieu solide dont alors que pour avoir une gélification comparable, il faut 8 g/L de gomme kappa-carraghénane.
Ensuite, on place les tubes contenant le premier milieu coulé à chaud, en pente inclinée, à gélifier au réfrigérateur à 4°C durant 10 minutes. On obtient une première couche ou sous-couche gélifiée mais de viscosité relativement inférieure à celle du deuxième milieu solide ci-après.
Une fois ce délai passé, le deuxième milieu de culture solide, constitué d'agar comme gélifiant, a été autoclavé puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant la sous-couche de premier milieu de culture composé du mélange des premiers gélifiants, sous forme incliné également. On obtient une deuxième couche solidifiée de viscosité ou dureté supérieure à celle de la première couche grâce au deuxième gélifiant qu'est l'agar.
Les autres conditions et paramètres de mise en œuvre du procédé sont pour le reste, identiques à celles de l'exemple 1.
Les inventeurs ont obtenu une gélose bi-phasique contenant une sous couche constituée de premiers gélifiants avec un pouvoir moindre de rétention d'eau que l'agar. Cela permet une hydratation continue améliorée de la gélose du deuxième milieu de culture solide par relargage d'eau par les premiers gélifiants du premier milieu de culture.
Ces différents procédés de fabrication d'une gélose inclinée bi-phasique ont ainsi permis d'avoir une hydratation continue de la gélose, permettant la culture des mêmes nombreuses bactéries avec les mêmes composants de milieux de culture que ceux décrits à l'exemple 1.
Exemple 3 Les inventeurs ont testé la mise en œuvre d'un premier milieu comprenant le même gélifiant que le deuxième milieu de culture, mais à une concentration moindre pour permettre ainsi d'hydrater la gélose du deuxième milieu, tout en ayant une légère gélification conférant une prise en masse suffisamment visqueuse du premier milieu pour assurer le support du coulage du deuxième milieu, permettant ainsi d'éviter la phase de congélation du premier milieu.
Dans ce but, les inventeurs ont testé des concentrations d'agar du premier milieu allant de 2.5 à 5 g/L d'agar. Ils ont obtenu une gélification mais beaucoup moins dure que lorsqu'ils ont mis une concentration plus élevée d'agar du deuxième milieu de 15 g/L d'agar. Ensuite, on place les tubes contenant le premier milieu coulé à chaud à 56°C, en pente inclinée, à gélifier au réfrigérateur à 4°C durant 10 minutes. On obtient une première couche ou sous-couche gélifiée mais de viscosité relativement inférieure à celle du deuxième milieu solide ci-après.
Une fois ce délai passé, le deuxième milieu de culture solide, constitué d'agar comme gélifiant, a été autoclavé puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant la sous-couche de premier milieu de culture composé du mélange des premiers gélifiants, sous forme incliné également. On obtient une deuxième couche solidifiée de viscosité ou dureté supérieure à celle de la première couche grâce au gélifiant qu'est l'agar.
Les autres conditions et paramètres de mise en œuvre du procédé sont pour le reste, identiques à celles de l'exemple 1.
Les inventeurs ont obtenu une gélose bi-phasique contenant une sous couche constituée de premiers gélifiants avec un pouvoir moindre de rétention d'eau que l'agar. Cela permet une hydratation continue de la gélose du deuxième milieu de culture solide par relargage d'eau par les gélifiants du premier milieu de culture. Ces différents procédés de fabrication d'une gélose inclinée bi-phasique ont ainsi permis d'avoir une hydratation continue améliorée de la gélose, permettant la culture des mêmes nombreuses bactéries avec les mêmes composants de milieux de culture que ceux décrits à l'exemple 1.
Exemple 4 Les milieux solides, Columbia et Schaedler comprenant les composants suivants dans un litre d'eau distillée sont utilisés de façon courante pour la culture des bactéries. Lors de l'ajout d'antioxydants à la recette de base de ces milieux, permet la culture de certaines bactéries anaérobie strictes en aérobiose. Les bactéries anaérobies cultivées en aérobie, citées ci-après ont été ensemencées sur ces milieux pris séparément mais lors de l'incubation en aérobie, les géloses se déshydratent. Lors de l'incubation prolongée de la gélose (>72h) il est observé une déshydratation du milieu de culture qui se traduit par une fissuration de la gélose et un dessèchement, jusqu'à obtenir une « galette » complètement sèche.
En revanche, les résultats de culture étaient favorables sur des milieux biphasiques selon l'invention comprenant les composants de ces deux milieux sans agar pour le premier milieu et avec agar pour le deuxième milieu. a) Milieu Columbia
Caséine hydrolysate (Tryptone) 10 g (1 %)
Extrait de levure 5 g (0,5 %)
Proteose peptone 5 g (0,5 %)
Tryptic Digest of Beef Hear 3 g (0,3 %)
L-cystéine 0,1 g (0,01%)
Glucose 2,5 g (0,25 %)
NaCI 5 g (0,5 %)
Sulfate de magnésium (MgS04) 0,1 g (0,01%) Sulfate de fer (FeS04) 0,02 g (0,002 %) Carbonate de sodium (Na2C03) 0,6 g (0,06 %) Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane 0,83 g (0,083 %) Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane HCI 2,86 g (0,286 %) (Agar 15 g (1,5 %)) b) Milieu Schaedler:
Peptone trypticase-soja 10,0 g (1 %) Peptone 5,0 g (0,5 %)
Extrait de levure 5,0 g (0,5 %)
Chlorhydrate de cystéine 0,4 g (0,04 %)
Hémine 0,01 g (0,001%)
Glucose 5,0 g (0,05%)
Tampon TRIS 0,75 g (0,075%)
(Agar 13,5 g (1,35 %))
Antioxydants ajoutés à chacun de ces milieux :
• Acide ascorbique 1 g (0,1 %)
• Acide urique 0,4 g (0,04 %)
• Glutathion 0,1 g (0,01%)
• Na2S 0,5 g (0,05%) Une colonie de la bactérie choisie parmi les bactéries anaérobies cultivées en aérobie suivantes est repiquée sur le dit milieu gélosé et le tube est mis à incuber à 37°C sous atmosphère d'air : Clostridium massilioamazoniense, Finegoldia magna, Clostridium irregulare, Clostridium butyricum ou encore Propion ibacteriu m acnés. On observe la croissance de colonies bactériennes en surface de la gélose.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Evaluation of a Novel Biphasic Culture Médium for Recovery of Mycobacteria: A Multi-Center Study. Zhenling Cui et al. Plos one. April 27, 2012 2. New biphasic culture System for isolation of mycobacteria from blood of patients with acquired immune deficiency syndrome. 0 G Berlin et al. Journal of clinical microbiology. 1984 September

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique (1) conditionné dans un récipient de culture de bactéries présentant un axe longitudinal (XX'), de préférence un tube de culture de bactéries (2), destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes dans lesquelles : a. l) on verse au fond du récipient, un premier milieu aqueux qui est liquide ou coulable mais apte à être congelé ou gélifié, et simultanément ou après ce versement, on incline le dit récipient selon une inclinaison de son axe longitudinal (XX') par rapport à la verticale d'un angle al déterminé, et a.2) on congèle ou respectivement gélifie ledit premier milieu jusqu'à former une première couche (1-1) du premier milieu à l'état congelé ou respectivement formant un gel qui a pris en masse, telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison par rapport à l'axe longitudinal (XX7) du dit récipient d'un angle complémentaire al tel que al + a2=90°, et b. l) on coule dans ledit récipient, un deuxième milieu aqueux qui est un milieu de culture gélosé d'une dite bactérie en conditions d'aérobiose, à l'état coulable mais apte à être gélifié et ainsi former un milieu de culture solide, et simultanément ou après ce coulage, on incline le dit récipient selon une inclinaison déterminée (al) de son axe longitudinal (XX') par rapport à la verticale d'un même angle al pour former une deuxième couche (1-2) de dit deuxième milieu à l'état coulable par-dessus ladite première couche du premier milieu solide à l'état congelé ou respectivement formant un gel, la surface supérieure (la) de la dite deuxième couche étant inclinée (a2) par rapport à l'axe longitudinal (XX') du dit récipient, parallèlement à la surface supérieure de la première couche, et b.2) on gélifie ledit deuxième milieu jusqu'à former une deuxième couche de dit milieu de culture solide gélosé d'une dite bactérie formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison par rapport à l'axe longitudinal (XX') du dit récipient d'un même angle a2.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'aux étapes a. l) et b. l), on verse une quantité de deuxième milieu supérieure à la quantité de premier milieu, de préférence les volumes respectifs de dit premier liquide par rapport au dit deuxième milieu étant tels que la surface libre (la) de la deuxième couche s'étend depuis le fond (2a) du récipient jusqu'à proximité du bord supérieur (2b) du récipient.
3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'aux étapes a.l) et b.l), le dit récipient est un tube (2), le rapport des volumes des premier milieu /deuxième milieu de 1/10 à 4/10 et on incline l'axe longitudinal (XX7) du tube d'un angle al de 45 à 80° par rapport à la verticale pour obtenir une inclinaison de la surface supérieure (la) de la deuxième couche solide (1-2) après l'étape b.2) d'un angle oc2 de 10 à 45° par rapport à l'axe longitudinal (XX') dudit tube.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le dit premier milieu est de l'eau ou un milieu de culture liquide de bactérie ne contenant pas d'agent gélifiant.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu de culture gélosé de dite bactérie.
6. Procédé selon l'une des revendications 4 ou 5 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu de culture de dite bactérie contenant les mêmes éléments nutritifs et/ou mêmes facteurs de croissance que le dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 et 5 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu contenant un (ou des) premier (s) agent(s) gélifiants(s) dont la nature et/ou la quantité lui confère une viscosité et un pouvoir de rétention d'eau inférieurs à ceux du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que et le(s) dit(s) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) confère(nt) au dit deuxième milieu solide une température de fusion supérieure à la température à laquelle le(s) premier (s) agent(s) gélifiants(s) permettent d'obtenir un premier milieu à l'état coulable sans qu'il ne prenne en masse.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu aqueux contenant comme premiers agents gélifiants le composé kappa- carraghénane, de préférence avec l'amidon, K2HP et CaCI2, et le dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide contient de l'agar comme deuxième agent gélifiant.
10. Procédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que le dit premier milieu est un milieu gélifié contenant un (ou des) premier(s) agent(s) gélifiants(s) identique(s) au(x) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide, mais en quantité inférieure à celle du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s), de préférence de l'agar.
11. Milieu de culture biphasique (1-1 - 1-2) contenant un milieu de culture solide incliné, conditionné dans un récipient de culture de bactéries présentant un axe longitudinal (XX7), de préférence un tube (2) de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend :
- une première couche (1-1) d'un dit premier milieu aqueux situé au fond dudit récipient, la surface supérieure de la dite première couche étant inclinée par rapport à l'axe longitudinal (XX') du dit récipient d'un angle oc2, le dit premier milieu étant un milieu à l'état congelé ou gélifié, ou de préférence à l'état liquide, et
- une deuxième couche (1-2) d'un dit deuxième milieu aqueux à l'état solide, la dite deuxième couche étant superposée par-dessus la dite première couche de sorte que la surface supérieure de la dite deuxième couche est inclinée par rapport à l'axe longitudinal (XX7) du dit récipient d'un même angle al parallèlement à la surface supérieure de la première couche, ledit deuxième milieu solide étant un dit milieu de culture gélosé de dite bactérie en conditions d'aérobiose.
12. Milieu de culture biphasique selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il est conditionné dans un dit récipient qui est un tube (2) de culture de bactéries et l'angle al de 10 à 45°.
13. Procédé de culture de bactéries en conditions d'aérobiose à l'aide d'un milieu de culture conditionné dans un dit récipient selon la revendication 11 dans lequel on ensemence la surface libre de la dite deuxième couche, de préférence disposée horizontalement, en conditions d'aérobiose, avec une dite bactérie, puis laisse à incuber ledit récipient, dans une étuve à 37°C de préférence avec son axe (XX7) disposé verticalement.
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