EP3600296A1 - Nouveaux composes, compositions et methodes pour le traitement de la resistance a l'insuline - Google Patents

Nouveaux composes, compositions et methodes pour le traitement de la resistance a l'insuline

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EP3600296A1
EP3600296A1 EP18710891.5A EP18710891A EP3600296A1 EP 3600296 A1 EP3600296 A1 EP 3600296A1 EP 18710891 A EP18710891 A EP 18710891A EP 3600296 A1 EP3600296 A1 EP 3600296A1
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EP
European Patent Office
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formula
group
compound
insulin
hydrogen atom
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18710891.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Maria MITEVA
Bruno Villoutreix
David J. Aitken
Anne-Françoise BURNOL
Anais GONDOIN
Tarik Issad
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Descartes
Universite Paris Diderot Paris 7
Universite Paris Sud
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Descartes
Universite Paris Diderot Paris 7
Universite Paris Sud
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Definitions

  • the present invention relates to inhibitors of the interaction between the Grb14 protein and the insulin receptor for use for therapeutic purposes, in particular for the treatment of insulin resistance and for the prevention and treatment of pathologies. associated with insulin resistance.
  • the invention also relates to a method for synthesizing these inhibitors and pharmaceutical compositions comprising said inhibitors.
  • Type 2 diabetes represents 90% of the diabetes encountered in the world. It is largely the result of overweight and sedentary lifestyle. The annual cost of health care in the United States for diabetes was estimated at $ 245 billion in 2012. The prevention and treatment of metabolic diseases such as type 2 diabetes have become a major health care priority . In addition, abnormal glucose homeostasis is associated directly and indirectly with hypertension and alterations in lipid metabolism, and patients with type 2 diabetes have a significantly increased risk of macrovascular and microvascular complications, such as arterial hypertension, diabetic microangiopathy, or diabetic macroangiopathy.
  • Metformin is generally recommended as a first-line treatment.
  • Other drugs include: other biguanides, sulfonylureas, thiazolidinediones, dipeptidyl peptidase-4 inhibitors, alpha-glucosidase inhibitors, glinides, fibrates, SGLT2 inhibitors and glucagon-like peptide-1 (GLP1) analogues. Most people do not initially need insulin, but insulin therapy may be associated with an oral drug.
  • insulin resistance results in impaired insulin signaling and reduced effectiveness of conventional therapeutic approaches.
  • insulin resistance develops before the onset of hyperglycemia and is associated with an increase in insulin production. After several years, the increase in insulin secretion is no longer sufficient to compensate for insulin-dependent insulin-dependent tissue resistance and the subject becomes hyperglycemic.
  • Pancreatic beta cells can no longer produce enough insulin to compensate for decreased insulin sensitivity, they begin to lose their function and apoptosis is triggered. Thus, in parallel with the development of insulin resistance, there is a progressive loss of the functional mass of pancreatic cells. Ultimately, this loss of functional mass of cells is such that the pancreas is no longer able to compensate for loss of insulin sensitivity, leading to the onset of type 2 diabetes.
  • none of the drugs usually used for the treatment of diabetes is recognized to permanently block the natural evolution of the pathology. Thus, more than half of the "pre-diabetic" population will develop type 2 diabetes after 4 to 5 years of treatment. For example, metformin would reduce the risk of diabetes by only 4%.
  • Grb14 is a highly expressed molecular adapter in insulin-sensitive tissues (liver, adipose tissue, muscle), which binds to the activated insulin receptor and inhibits its catalytic activity.
  • the expression of Grb14 is increased in adipose tissue of type 2 diabetic patients as well as in different animal models of insulin resistance, suggesting that this protein may be involved in the reduction of insulin signaling.
  • the peptide domains of the Grb7 family of proteins involved in the inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity have been identified in WO200055634, yet this patent application does not propose molecules that can effectively treat insulin resistance.
  • WO200055634 yet this patent application does not propose molecules that can effectively treat insulin resistance.
  • the invention therefore aims to overcome the disadvantages of the prior art.
  • the invention aims to provide novel inhibitors of the interaction between Grb14 and the insulin receptor for use for therapeutic purposes. These molecules may especially be used in pharmaceutical compositions for therapeutic purposes.
  • the present invention provides novel compositions based on these inhibitors for use in the treatment of insulin resistance.
  • the compositions and methods provided by the inventors may be used to treat a subject suffering from insulin resistance.
  • the compositions and methods provided by the inventors can be used to treat a subject suffering, at risk of suffering or likely to suffer from a pathology associated with insulin resistance.
  • Another object of the present invention is to provide a process for the preparation of these compounds.
  • the invention relates to a compound that inhibits the interaction between a Grb14 protein and an insulin receptor selected from the group consisting of compounds belonging to the family of sulfonamide isoxazoles of formula (I) , their salts, solvates and / or diastereoisomers,
  • the group R 1 represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms
  • the groups R2, R3, R4 and R5 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms; or in the group consisting of compounds belonging to the family of dioxothioxotetrahydro-pyrimidinylidene of formula (II), their salts, solvates, and / or diastereoisomers,
  • the group Re represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms or a - (C 1 -C 5 alkyl) aryl group, said aryl being substituted by one or more groups chosen from groups following: -CO2R11, COR12, -OC (O) R13, -S (O) R14, -
  • the group Re represents a hydrogen atom or an aryl group
  • the group Rg represents a hydrogen atom or an alkoxyl group
  • the groups R to R20 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms,
  • the compound inhibiting the interaction between a Grb14 protein and an insulin receptor is a small molecule.
  • small molecule it is to be understood, within the meaning of the invention, a natural or synthetic compound having a molecular weight of less than 1200 Da, for example between 200 and 1100 Da, and preferably between 300 and 900 Da.
  • the compounds of general formula (I) and (II) are non-toxic, penetrate the membranes and in particular stimulate the PI3K pathway. There is also a specificity of inhibition of the Grb14 / IR interaction with respect to the Grb10 / IR interaction.
  • compositions of the invention are used to increase lipogenesis and reduce gluconeogenesis and in particular increase the action of insulin on the expression of genes involved in lipogenesis and gluconeogenesis.
  • the inhibitors according to the invention are non-toxic compounds that penetrate the membranes and particularly stimulate the PI3K pathway.
  • these molecules specifically block the interaction between Grb14 and the insulin receptors and do not interfere with the interaction between Grb10 and the insulin receptors. These compounds are useful for therapeutic interventions for the treatment of insulin resistance and the prevention or treatment of conditions associated with insulin resistance.
  • the group R 1 represents a linear or branched chain alkyl group containing up to 5 carbon atoms
  • the groups R2 and R3 represent a hydrogen atom
  • the groups FU and R5 represent a methyl group.
  • the inhibiting compound of formula (I) is chosen from the group consisting of compounds of formula (Ia) or (Ib),
  • the inhibiting compound of formula (II) is selected from the group consisting of compounds of formula (IIc), (IId), (IIc), or (IIf)
  • the inhibitor compound according to the invention is intended for use as an insulin sensitizer.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition comprising at least one inhibiting compound of formula (I) or formula (II) according to the invention.
  • the pharmaceutical composition according to the invention further comprises at least one other active ingredient chosen from: sulfonylureas, biguanides such as metformin, thiazolidinediones, GLP1 analogs such as exenatide or liraglutide, dipeptidyl inhibitors peptidase-4 such as gliptin, sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, linagliptin, gemigliptin or alogliptin, alpha-glucosidase inhibitors, glinides, fibrates or SGLT2 inhibitors such as canaglifozin .
  • active ingredient chosen from: sulfonylureas, biguanides such as metformin, thiazolidinediones, GLP1 analogs such as exenatide or liraglutide, dipeptidyl inhibitors peptidase-4 such as gliptin, sitagliptin, vil
  • the pharmaceutical composition according to the invention is intended for use for therapeutic purposes in a subject subjected to insulin therapy, said insulin therapy comprising insulin or an insulin analogue.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is a combination product for simultaneous, joint or separate, or sequential use for therapeutic purposes.
  • the invention also relates to the inhibiting compound according to the invention or to the pharmaceutical composition according to the invention for their use in the treatment of insulin resistance as well as for the prevention or treatment of a pathology associated with insulin resistance.
  • the pathology associated with insulin resistance is selected from: metabolic syndrome, polycystic ovary syndrome, obesity, pre-gestational diabetes, type 2 diabetes, hyperglycemia, lipodystrophy, diabetic nephropathy, or cardiovascular complications such as arterial hypertension, diabetic microangiopathy, or diabetic macroangiopathy,
  • the inhibitory compound according to the invention is administered at a dose of between 50 mg and 250 mg per day, preferably between 100 mg and 200 mg per day.
  • the invention also relates to a process for the synthesis of an inhibiting compound according to formula (I), or its diastereoisomers, comprising a step of condensation of a sulphonamide of formula (V)
  • R 4 and R 5 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms; with an acrylic acid derivative of formula (IV)
  • the group R 1 represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms
  • the groups R2 and R3 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms.
  • said condensation step is carried out in the presence of DIPEA (N-ethyl-N- (propan-2-yl) propan-2-amine) and a peptide coupling reagent selected from HATU (1 - [bis (dimethylamino) methylene] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate) and Ghosen's reagent (1 -chloro-N, N, 2-trimethylpropenylamine).
  • DIPEA N-ethyl-N- (propan-2-yl) propan-2-amine
  • a peptide coupling reagent selected from HATU (1 - [bis (dimethylamino) methylene] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate
  • Ghosen's reagent (1 -chloro-N, N, 2-trimethylprop
  • Figure 1 the inhibitory effect of the compound of formula (Ia) (Comp la) according to the invention (black bars) on the IR / Grb14 interaction measured by the BRET IR-Luc / Grb14-YFP technique in acellular system , compared to control (white bars), in the presence or absence of 100 nM insulin pre-stimulation (Ins).
  • the results expressed as a percentage of the DMSO (dimethylsulfoxide) control, are the average calculated on the basis of 2 to 8 independent experiments ( ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001, by Bonferroni Multiple comparison test).
  • FIG. 2 the inhibitory effect of the compound of formula (Ia) according to the invention (black bars) on the IR / Grb14 interaction as measured by co-immunoprecipitation in acellular system, compared to control (white bars), with western blot analysis of the amount of IR-Luc co-precipitated with Grb14-YFP and densitometric quantification of the revealed signals.
  • the results expressed as a percentage of the DMSO (Dimethylsulfoxide) control, are the average of 2 to 8 independent experiments ( *** p ⁇ 0.001, by Bonferroni Multiple comparison test).
  • FIG. 3A and FIG. 3B the inhibitory effect of the compound of formula (Ia) according to the invention (black bars) on the interaction between Grb14 and the IR tyrosine kinase domain (IRTK-Grb14 interaction) as measured by co-immunoprecipitation with Western blot analysis of the amount of IRTK48-Rluc co-precipitated with Grb14 ( Figure 3A) or Grb10 ( Figure 3B) fused to YFP and densitometric quantification of the revealed signals.
  • the results expressed as a percentage of the DMSO (dimethylsulfoxide) control, are the average of 3 independent experiments ( ** p ⁇ 0.01, by t-test).
  • Figure 4 the effect of the compound of formula (la) (black bars) on the growth and survival of HEK293T cells measured after 72 h of culture compared to DMSO control (Dimethylsulfoxide, white bars).
  • the histograms represent the growth rate of the cells determined by the ratio: Fluorescence at D3 / Fluorescence at OJ.
  • the results are the average of 3 independent experiments made in triplicates.
  • FIGS. 5A and 5B show the effect of the compound of formula (Ia) according to the invention (black bars) on the activation of the PI3K / Akt pathway measured by the BRET Luc-Akt-PH / YFP-membrane technique by relative to the control DMSO (dimethylsulfoxide, white bars) as measured on (FIG. 5A) of the HEK293T cells pre-incubated or not for 1 h with the tyrosine kinase inhibitor AG1024 at a concentration of 25 ⁇ final or on (FIG. 5B) a MCF7 line doubled stably transfected with the vectors encoding Luc-Akt-PH and YFP-membrane.
  • the results, expressed as BRET delta, are the average of 3 to 8 independent experiments ( ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001, by Newman-Keuls multiple comparison test).
  • FIG. 6 the effect of the compound of formula (Ia) according to the invention (black bars) on the expression of the target genes of insulin, PEPCK (FIG. 6A) and G6Pase (FIG. 6B), involved in the pathway of gluconeogenesis
  • the hepatocytes in primary culture are cultured for 8 h in the presence of compound of formula (Ia) (50 ⁇ l), insulin (1 nM) and glucagon (preincubation for 1 h at 10 nM).
  • the relative quantification of the mRNAs is carried out by RT-qPCR.
  • the values are related to the quantification of 18S gene from the same sample to normalize the results.
  • the results are the average of 3 to 5 independent experiments ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, by Anova followed by a Newman-Keuls test).
  • FIG. 7 the effect of the compound of formula (Ia) according to the invention (black bars) on the expression of insulin target genes, SREBP-1c, ACC, FAS and SCD1 (FIGS. 7AA respectively) involved in the way of lipogenesis.
  • the hepatocytes in primary culture are cultured in the presence of 5 mM glucose (G5) or 25 mM glucose (G25) and 10 nM insulin for 24 h.
  • the relative quantification of the mRNAs is carried out by RT-qPCR.
  • the values are related to the quantification of the 18S gene of the same sample in order to normalize the results.
  • the results are the average of 3 to 5 independent experiments ( * p ⁇ 0.05 by Anova followed by a Newman-Keuls test).
  • the present invention provides a novel therapeutic approach for the treatment of insulin resistance.
  • the invention relates to novel small molecule compounds which inhibit the interaction between the Grb14 protein and the insulin receptor, as well as pharmaceutical compositions comprising such compounds for use in therapeutic purposes.
  • the invention also relates to therapeutic methods using such compounds.
  • the compounds, compositions and methods allow more particularly the treatment of insulin resistance and the prevention and treatment of pathologies associated with insulin resistance.
  • the "Grb14 protein” corresponds, within the meaning of the invention, to a protein belonging to the Grb7 family of molecular adapters.
  • the Grb7 family of molecular adapters consists of three members: Grb7, Grb10 and Grb14. All three bind to the activated, phosphorylated insulin receptor. However, only Grb10 and Grb14 appear to play an important role in regulating the action of insulin (Holt & Siddle 2005, Desbuquois et al., 2013).
  • the Grb14 protein (NP_001290351, NP 004481, UniProtKB-Q14449), encoded by the grb14 gene (Gene ID: 2888), has different isoforms defined by their parent species: hGrbl 4 for humans, rGrbl 4 for rats, and mGrb14 for the mouse.
  • Grb14 is known to be strongly expressed in the skeletal muscle, white adipose tissue, heart, brain, pancreas and kidneys as well as in the liver and retina.
  • the insulin receptor is encoded by a single gene comprising 22 exons and 21 introns (Gene ID: 3643).
  • the insulin receptor is localized to the plasma membrane of most cells, but is most strongly found in insulin-sensitive tissues such as liver, muscle, and adipose tissue. It is also well expressed in ⁇ cells of the pancreas, in the vascular endothelium as well as in certain specific areas of the brain.
  • the inhibitor of the interaction between a protein Grb14 and an insulin receptor corresponds to a compound capable of inhibiting the interaction between a protein Grb14 and a receptor of the invention. 'insulin.
  • said inhibitor is preferably specific for the Grb14 protein and / or the insulin receptor, that is to say that it does not inhibit the interaction of the adapters of the same family with the insulin receptor, especially Grb10.
  • the "insulin-sensitive tissues” correspond to the liver, pancreas, muscles, adipose tissue (white and brown) and the brain.
  • insulin resistance also called “insulin resistance” corresponds to the insensitization of membrane cell receptors to insulin.
  • insulin does not do as much effect on these receptors.
  • glucose does not penetrate the cells so much, and as a result, it accumulates in the blood and lymphatic circulation, leading to an increase in blood glucose. This increase in turn stimulates hypersecretion of insulin by the pancreas and after a number of years pancreatic cells are depleted.
  • the clinical profile of persons susceptible or at risk of developing insulin resistance frequently includes at least one, preferably several, more preferably at least three, of the following characteristics: excess weight (BMI greater than 25), abdominal distribution abnormal fat (waist circumference greater than 80 cm in the female, at 94 cm in humans), a sedentary lifestyle, a family history of type 2 diabetes, high blood pressure.
  • Insulin resistance can be diagnosed by many methods known to those skilled in the art, including measuring glucose tolerance, measuring fasting insulin levels, measuring insulin sensitivity by intravenous administration of glucose and insulin (hyperinsulinemic euglycemic clamp). The preferred method for measuring insulin resistance is the euglycemic hyperinsulinemic clamp.
  • pathology associated with insulin resistance is meant, within the meaning of the invention, any pathology or condition that is the consequence of said insulin resistance or one of its comorbidities.
  • pathologies are of preference selected from: metabolic syndrome, polycystic ovary syndrome, obesity, gestational diabetes, type 2 diabetes, hyperglycemia, lipodystrophy, diabetic nephropathy or cardiovascular complications such as as arterial hypertension, diabetic microangiopathy (including diabetic neuropathy and diabetic retinopathy), and diabetic macroangiopathy.
  • metabolic syndrome is meant, within the meaning of the invention, a pathology characterized by a plurality of physiological and biochemical abnormalities, asymptomatic, which can coexist with genetic and acquired factors.
  • diagnosis of the metabolic syndrome can be made using the following methods: that of the World Health Organization (WHO) (WHO consultation 1999), that of the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP ATP) III of 2001) and that of the International Diabetes Federation (IDF 2005) (Zimmet et al., 2005).
  • the diagnosis is made by the IDF method 2005.
  • the designation of a compound is intended to designate the compound per se, as well as any salt, hydrate, or pharmaceutically acceptable stereoisomer thereof. In a more preferred embodiment, the designation of a compound is intended to mean the compound as specifically designated per se, as well as any pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • salt and / or solvate means, in the context of the present invention, a salt or solvate of a compound according to the invention, preferably pharmaceutically acceptable and having the pharmacological activity of the corresponding compound.
  • salt refers to a pharmaceutically acceptable, inorganic or organic acid or base addition salt of a compound of the present invention. Salt formation typically involves associating an acidic, basic or zwitterionic molecule with a counter ion to create a saline version of the compound.
  • solvates corresponds to conventional solvates such as those produced during the last stage of the preparation of the compounds of the invention because of the presence of solvents.
  • solvates due to the presence of water (these solvates are also called hydrates) or of ethanol.
  • the "stereoisomers” are compounds of the same semi-developed formula, but which differ in the arrangement of the atoms in space.
  • the "enantiomers” are stereoisomers which are symmetrical to one another in a mirror and not superimposable.
  • the "diastereoisomers” are stereoisomers which are not enantiomers. That is to say that diastereoisomers have the same sequence of atoms, but which are neither superimposable nor image of one another in a mirror.
  • the double bond stereochemistry is described either in cis or in trans, with reference to the relative position of the substituents on either side of a double bond.
  • subject is meant to describe here any member of the animal kingdom, preferably mammals and more preferably the man.
  • prevention it should be understood in the context of the present invention to prevent or delay the occurrence of clinical or biochemical manifestations associated with the pathology.
  • prevention refers to the fact of preventing or delaying the onset or reducing the intensity of pathologies associated with insulin resistance.
  • insulin resistance for example to prevent or delay the onset or decrease the intensity of type 2 diabetes.
  • Prevention can preferably be implemented in subjects considered at risk or predisposed to develop the pathology.
  • treatment refers to the treatment of a declared condition or pathology or to reduce the symptoms and / or progression.
  • treatment includes a clinical or biochemical improvement in the condition or pathology of the subject. Therefore, such treatment can be used in a subject suffering from insulin resistance to delay its progression, reduce or eliminate its effects and thus cure this condition.
  • Such treatment may also be used in a subject suffering from a pathology associated with insulin resistance such as metabolic syndrome, polycystic ovary syndrome, obesity, pre-gestational diabetes, type 2 diabetes, hyperglycemia, lipodystrophy, diabetic nephropathy, or cardiovascular complications such as high blood pressure, diabetic microangiopathy, or diabetic macroangiopathy.
  • administering means in the context of the present invention that a compound of interest is delivered or dispensed to a subject by any appropriate mode of administration, which can be easily determined. by the skilled person according to the nature of said compound.
  • said compound may be delivered or dispensed to said subject as appropriate orally, transdermally, or parenterally such as by subcutaneous, intravenous, intramuscular, or intraperitoneal injection.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means a quantity or a prophylactic or therapeutic concentration of a compound of interest, that is to say a quantity or concentration of said compound sufficient to to treat insulin resistance and / or to prevent or treat conditions associated with insulin resistance, or to treat insulin resistance or said pathology once reported, or to reduce its symptoms and / or progression. Those skilled in the art are able to determine this so-called pharmaceutically effective amount.
  • alkyl group linear, cyclic or branched, containing up to 5 carbon atoms
  • C5 alkyl Cr corresponds to a saturated hydrocarbon chain, linear cyclic or branched, containing 1 to 5 carbon atoms or a linear or branched unsaturated hydrocarbon chain containing 2 to 5 carbon atoms.
  • a saturated hydrocarbon chain, linear, cyclic or branched, containing from 1 to 5 carbon atoms includes, but is not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, n- pentyl, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and the like.
  • a linear or branched unsaturated hydrocarbon chain containing from 2 to 5 carbon atoms comprises at least one double or triple bond and includes, but is not limited to, ethene, propene, butene, pentene, ethenyl, propenyl, butenyl, pentenyl and the like.
  • aryl group denotes an aromatic hydrocarbon group preferably comprising 6 to 10 carbon atoms and comprising one or more, in particular 1 or 2, condensed rings, such as, for example a phenyl group or a naphthyl group.
  • this designates a phenyl group.
  • - (C 1 -C 5 alkyl) -aryl refers to an aryl group as defined above bonded to the molecule via a C 1 -C 5 alkyl group such as as defined above.
  • the - (C 1 -C 5 alkyl) aryl group according to the invention is a benzyl group.
  • the attachment is indicated by "-”.
  • “- (C 1 -C 5) alkyl-aryl” refers to an alkyl radical bonded to an aryl radical in which the alkyl is bonded to the rest of the molecule.
  • the aryl group according to the present invention may be substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of alkyl, alkoxyl (alkoxyl), hydroxyl, carboxyl or ester.
  • substituted phenyl groups are methoxyphenyl, dimethoxyphenyl and carboxyphenyl.
  • substituted means that any one of the hydrogen atoms may be replaced by a substituent, such as a carboxyl group.
  • the compound inhibiting the interaction between a Grb14 protein and an insulin receptor is a small molecule.
  • small molecule it is to be understood within the meaning of the invention, a natural or synthetic compound having a molecular weight between 200 and 1100 Da, preferably between 300 and 900 Da.
  • These small molecules are generally more malleable by synthetic chemistry techniques than other classes of protein-protein interaction modulators such as peptide compounds.
  • they generally have a great structural complexity which gives them a high selectivity with respect to their target and good binding affinity.
  • they may have a high bioavailability and ability to cross membranes.
  • the subject of the invention is an inhibitory compound for the interaction between a Grb14 protein and an insulin receptor chosen from the group consisting of compounds belonging to the family of sulphonamide isoxazoles of formula (I), their salts, solvates and / or diastereoisomers
  • the group R 1 represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms
  • the groups R 2, R 3, R 4 and R 5 are identical or different and represent a hydrogen atom or an alkyl group; linear, cyclic or branched chain containing up to 5 carbon atoms; or in the group consisting of compounds belonging to the family of dioxothioxotetrahydro-pyrimidinylidenes of formula (II), their salts, solvates, and / or diastereoisomers,
  • the group Re represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms or a - (C 1 -C 5 alkyl) aryl group, said aryl being substituted by one or more groups chosen from groups following: -CO2R11, COR12, -OC (0) Ri3, -S (0) Ri4, - OR15, -SR16, -SO2Ri7, -CONRi8Ri9, -OCO 2 R 20,
  • the group R 7 represents a hydrogen atom or a carboxyl group
  • the group Re represents a hydrogen atom or an aryl group
  • the group Rg represents a hydrogen atom or an alkoxyl group
  • the groups R to R20 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms, for its use for therapeutic purposes.
  • the compound inhibiting the interaction between a Grb14 protein and an insulin receptor for its use for therapeutic purposes, is chosen from the group consisting of compounds belonging to the family of sulphonamide isoxazoles of formula (I), their salts, solvates and / or diastereoisomers
  • the group R 1 represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms
  • R2, R3, R4 and R5 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms;
  • the compound of general formula (I) is in trans configuration.
  • the groups R2 and R3 represent a hydrogen atom.
  • the groups R4 and R5 represent a methyl group.
  • the group R 1 represents a linear or branched chain saturated alkyl group containing up to 5 carbon atoms, preferably a linear or branched chain saturated alkyl group. containing up to 3 carbon atoms.
  • the group R 1 represents a linear-chain saturated alkyl group containing up to 5 carbon atoms, and even more preferably up to 3 carbon atoms. carbon.
  • the inhibiting compound is selected from the group consisting of compounds of formula (Ia) or of formula (Ib):
  • the compound inhibiting the interaction between a Grb14 protein and an insulin receptor for its use for therapeutic purposes, is selected from the group consisting of compounds belonging to the dioxothioxotetrahydro-pyrimidinylidene family of formula (II), their salts, solvates, and / or diastereoisomers
  • the group Re represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms or a - (C 1 -C 5 alkyl) aryl group, said aryl being substituted by one or more groups chosen from groups following: -C0 2 Rn, COR12, -OC (0) R 3, -S (0) R 4, -OR 15, -SRie, -SO2R17, -CONRi 8 R 9,
  • the group R 7 represents a hydrogen atom or a carboxyl group
  • the group Re represents a hydrogen atom or an aryl group
  • the group Rg represents a hydrogen atom or an alkoxyl group
  • the groups R to R20 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms.
  • the compound of general formula (II) is in the cis configuration.
  • Re represents a linear or branched, preferably saturated, chain alkyl group containing up to 5 carbon atoms. More preferably, in this inhibiting compound of formula (II), Re represents a saturated linear chain alkyl group containing up to 5 carbon atoms. Even more preferably, in this inhibiting compound of formula (II), Re represents a saturated linear chain alkyl group containing up to 3 carbon atoms.
  • Re represents a - (C 1 -C 5) alkylaryl group, said aryl being substituted with one or more groups, preferably a group, chosen from groups following: -CO2R11, COR12, -OC (O) R13, -S (O) R14, -OR15, -SR18, -SO2R17, -CONR18R19, -OCO2R20.
  • Re represents a benzyl group, substituted with a group chosen from the following groups: -CO2R11, -COR12, -OC (O) R13, -S (O) R14 , - SO2R17.
  • the groups R to R20 being as defined above.
  • Re represents a benzyl group, substituted with a carboxyl group.
  • the inhibiting compound according to the invention is chosen from the group consisting of the compounds of formula (IIa), their salts and / or their solvates,
  • the Rio group represents a carboxylic group.
  • the alkoxyl group of the Rg group is selected from methoxyl or ethoxyl.
  • the group R 7 represents a hydrogen atom when the group Re represents an aryl group.
  • the group Re represents a hydrogen atom or a phenyl group.
  • the group Re represents a phenyl group.
  • the inhibiting compound according to the invention is chosen from the group consisting of compounds of formula (Mb), their salts and / or their solvates,
  • the group Re represents a linear or branched chain alkyl group containing up to 5 carbon atoms, or a - (C 1 -C 5) alkyl - aryl group, substituted by a carboxyl group, and
  • the group R 7 represents a hydrogen atom or a carboxyl group.
  • the inhibiting compound is selected from the group consisting of compounds of formula (II), (IId), (Ile) or (IIf) .
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising at least one inhibiting compound of formula (I) or formula (II) as defined above for its use for therapeutic purposes.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising at least one inhibiting compound of formula (I) or of formula (II) as defined above and at least one pharmaceutically acceptable excipient for its use for therapeutic purposes.
  • compositions according to the invention may be formulated especially for an oral or parenteral administration, comprising the subcutaneous route, the intravenous route and the intramuscular route, preferably for oral administration, said compositions for mammals, including humans.
  • the pharmaceutical composition may, for example, be administered orally by means of tablets and capsules.
  • the inhibitor compound according to the invention is mixed with a pharmaceutical vehicle such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic and the like.
  • a pharmaceutical vehicle such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic and the like.
  • the tablets may be coated with sucrose or other suitable materials, or they may be treated to have prolonged or delayed activity and continuously release a predetermined amount of active ingredient.
  • the preparation in capsules is obtained by mixing the inhibiting compound according to the invention with a diluent and pouring the resulting mixture into soft or hard gelatin capsules.
  • the present invention relates to the inhibiting compound of general formula (I) or (II) as defined above, or a pharmaceutical composition according to the present invention, for use in the treatment of insulin resistance.
  • this inhibitor compound according to the invention is particularly suitable for its use as an insulin sensitizer.
  • the present invention also relates to the inhibiting compound of general formula (I) or (II) as defined above, or a pharmaceutical composition according to the present invention, for use in the prevention or treatment of a pathology. associated with insulin resistance.
  • the present invention relates to a method of treating insulin resistance comprising the administration to a subject of a pharmaceutically effective amount of an inhibiting compound of general formula (I) or (II) as defined above or a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating a pathology associated with insulin resistance comprising the administration to a subject of a pharmaceutically effective amount of an inhibiting compound of general formula (I) or ( II) as defined above or a pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the present invention also relates to the use of an inhibitory compound of general formula (I) or (II) as defined above, for the manufacture of a medicament for the treatment of insulin resistance.
  • the present invention also relates to the use of an inhibiting compound of general formula (I) or (II) as defined above, for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a pathology associated with insulin resistance.
  • the pathology associated with insulin resistance may preferably be selected from: the metabolic syndrome, polycystic ovary syndrome, obesity, pre-gestational diabetes, type 2 diabetes mellitus, hyperglycemia, lipodystrophy, diabetic nephropathy or cardiovascular complications such as arterial hypertension, diabetic microangiopathy (including diabetic neuropathy and diabetic retinopathy), or diabetic macroangiopathy. More preferably, the pathology associated with insulin resistance may be preferably selected from: obesity, type 2 diabetes, metabolic syndrome and hyperglycemia. Even more preferably, the pathology associated with insulin resistance may be preferably selected from: obesity, type 2 diabetes and hyperglycemia.
  • the inhibiting compound according to the invention can be administered in unit dosage forms of administration, in admixture with conventional pharmaceutical carriers, to animals or to mammals, preferentially humans.
  • the inhibiting compound of the invention as an active ingredient can be formulated at doses of between 1 and 500 mg, preferably between 25 mg and 250 mg, more preferably 50 mg and 150 mg in galenic forms. allowing a single dose, twice a day in equal doses, or even a desired dose of divided doses throughout the day (eg, but not only, in relation to meals).
  • the dose administered per day is advantageously between 50 mg and 500 mg, preferably between 100 mg and 200 mg.
  • the dose administered may also be indicated per unit of body weight of the patient to be treated, which is particularly relevant in the treatment of a person whose body mass is out of the norm.
  • the inhibiting compound of the invention as an active ingredient can be administered at daily doses of between 1 and 40 mg / kg, preferably between 1 and 20 mg / kg, or even between 1 and 10 mg / kg. It may be necessary to use doses outside these ranges as defined above as determined by those skilled in the art.
  • the administration of the inhibitor compound according to the invention may be carried out at least one dose per day.
  • the administration of the active ingredient may be performed at least once a week, for example twice a week.
  • the treatment of insulin resistance or the prevention and treatment of a pathology associated with insulin resistance by the administration of the inhibitory compound according to the invention may be carried out for a period of between 1 month and 96 months, preferably for a period of one month. duration between 6 months and 72 months, preferably for a period of between 1 2 months and 48 months.
  • the treatment of insulin resistance or the prevention and treatment of a pathology associated with insulin resistance by the administration of the active ingredient can also be prolonged over longer periods.
  • compositions according to the invention may further comprise at least one other active ingredient, such as an active compound for the treatment of diabetes and more particularly acting as an activator of secretion.
  • active ingredient such as an active compound for the treatment of diabetes and more particularly acting as an activator of secretion.
  • insulin insulin sensitizer, potentiator of the effects of insulin and / or inhibitor of digestive absorption of carbohydrates.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising:
  • At least one other active ingredient such as an antidiabetic agent, preferably as a combination product for simultaneous, joint or separate, or sequential use.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may thus further comprise at least one other active ingredient chosen from: sulfonylureas, biguanides such as metformin, thiazolidinediones, GLP1 analogs such as exenatide or liraglutide, dipeptidyl peptidase-4 inhibitors such as gliptin, sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, linagliptin, gemigliptin or alogliptin, alpha-glucosidase inhibitors, glinides, fibrates, or inhibitors of SGLT2 such as canaglifozine.
  • active ingredient chosen from: sulfonylureas, biguanides such as metformin, thiazolidinediones, GLP1 analogs such as exenatide or liraglutide, dipeptidyl peptidase-4 inhibitors such as gliptin, sitaglip
  • Sulfonylureas are active ingredients used in the treatment of type 2 diabetes. They act by increasing the release of insulin by the beta cells of the pancreas.
  • the sulphonylureas which may be used in combination with the inhibiting compound according to the invention may be more particularly selected from the following compounds: acetohexamide (968-81-0), carbutamide (339-43-5), chlorpropamide (94-20-2) ), glibenclamide (10238-21 -8), glibornuride (26944-48-9), glipizide (29094-61 -9), glimepiride (93479-97-1), gliclazide (21 187-98-4), gliquidone ( 33342-05-1), glisentide (32797-92-5), glyclopyramide (631-27-6), tolbutamide (64-77-7) and tolazamide (1,156-19-0).
  • Biguanides are active ingredients with oral antihyperglycemic properties used in the treatment of type 2 diabetes.
  • the biguanides that can be used in combination with the inhibiting compound according to the invention may be more particularly selected from the following compounds: buformin (1,190-53-0), metformin (657-24-9 or 11-15-70-4) and phenformin (834-28-6).
  • Thiazolidinediones or glitazones are active ingredients for reducing the level of sugar in the blood and are used in the treatment of type 2 diabetes.
  • the thiazolidinediones may be used in combination with the inhibitor compound according to the invention may be more particularly selected from the following compounds: rosiglitazone (122320-73-4 or 302543-62-0 or 155141 -29-0 or 397263-60-4) and pioglitazone (1 1 1025-46-8 or 1 12529-15- 4).
  • Glucagon-like peptide-1 (GLP1) analogues promote the proliferation of ⁇ -cells, inhibit apoptosis of ⁇ -cells and are used in the treatment of type 2 diabetes.
  • GLP1 analogues can be used in combination with the compound inhibitor according to the invention may be more particularly selected from the following compounds: exenatide (141758-74-9) and liraglutide (204656-20-2).
  • Inhibitors of dipeptidyl peptidase-4 allow an increase in the secretion of insulin, a decrease in the secretion of glucagon, and are thus used in the treatment of type 2 diabetes.
  • the inhibitors of dipeptidyl peptidase-4 which may be used in combination with the inhibiting compound according to the invention may be more particularly selected from the following compounds: alogliptin (850649-62-6), sitagliptin (654671 -78-0), vildagliptin (274901 -16-5), saxagliptin (361442-04-8), linagliptin (668270-12-0), gemigliptin (91 1637-19-9), berberine (2086-83-1 or 633-65-8 or 633-66-9) and dutogliptin (852329-66-9).
  • the alpha-glucosidase inhibitors reduce postprandial hyperglycemia and are thus used in the treatment of type 2 diabetes.
  • the alpha-glucosidase inhibitors can be used in combination with the inhibitory compound according to the invention.
  • the invention may be more particularly selected from the following compounds: acarbose (56180-94-0), miglitol (72432-03-2), and voglibose (83480-29-9).
  • the inhibitors of SGLT2 improve insulin sensitivity and ⁇ -cell function.
  • the SGLT2 inhibitors that can be used in combination with the inhibiting compound according to the invention may be more particularly selected from the following compounds: canaglifozine (842133-18-0). dapagliflozin (461432-26-8), ipragliflozin (761423-87-4), tofogliflozin (1201913-82-7 or 903565-83-3) and empagliflozin (864070-44-0).
  • Glinides improve the secretion of insulin and are used in the treatment of type 2 diabetes.
  • the glinides that can be used in combination with the inhibitor compound according to the invention may be more particularly selected from the following compounds: 145375-43-5), nateglinide (105816-04-4), and repaglinide (135062-02-1).
  • Fibrates are lipid-lowering compounds.
  • the fibrates that can be used in combination with the inhibitor compound according to the invention may be more particularly selected from the following compounds: bezafibrate (41859-67-0), ciprofibrate (52214-84-3), clof ibrate (637-07- 0 or 882-09-7 or 39087-48-4 or 14613-30-0), fenofibrate (49562-28-9 or 42017-89-0 or 856676-23-8) and gemfibrozil (25812-30-0) .
  • the pharmaceutical composition according to the invention further comprises at least one other active ingredient chosen from: metformin, gliptin, and canaglifozine.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention, for its use for therapeutic purposes in a subject subjected to insulin therapy said insulin therapy comprising the administration of insulin or an insulin analogue.
  • the insulin analogue may for example be a modified insulin so as to change the speed of its absorption by the subject.
  • the commercial products are for example Lispro, Aspart, Glulisine, Detemir, Degludec and Glargine.
  • the present invention also relates to a method for treating insulin resistance, and more particularly to preventing or treating a pathology associated with insulin resistance, comprising administering to a subject in need of a pharmaceutically effective amount. effective of the pharmaceutical composition as defined above.
  • the present invention also relates to the use of the pharmaceutical composition as defined above, for the manufacture of a medicament for the treatment of insulin resistance.
  • the present invention also relates to the use of the pharmaceutical composition as defined above, for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a pathology associated with insulin resistance.
  • the invention relates to a process for the synthesis of a compound of formula (I) as defined above and including the preferred embodiments. Said method comprising a step of condensation of a sulphonamide of formula (V)
  • the groups FU and R5 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched chain alkyl group containing up to 5 carbon atoms; with an acrylic acid derivative of formula (IV)
  • the group R 1 represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms
  • the groups R2 and R3 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms.
  • the acrylic acid derivative of formula (IV) can be easily purchased commercially or be synthesized from the general knowledge of those skilled in the art or from the teachings of Pontiki et al. (201 1).
  • the method of synthesis according to the invention may comprise a preliminary step of condensation of an aldehyde of formula (III)
  • the group R 1 represents a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms
  • the groups R2 and R3 are identical or different and represent a hydrogen atom or a linear, cyclic or branched alkyl group containing up to 5 carbon atoms; with a malonic acid in the presence of pyridine and piperidine.
  • the peptide coupling reagent is selected from HATU (1 - [bis (dimethylamino) methylene] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate) and Ghosez's reagent (1-chloro-N, N, 2-trimethylpropenylamine).
  • the coupling reagent may further be used in combination with DIPEA (A / -ethyl- / V- (propan-2-yl) propan-2-amine).
  • the sulphonamide condensation step of formula (V) with the acrylic acid derivative of formula (IV) is carried out in the presence of DMF (dimethylformamide) or DCM (dichloromethane), more preferably in the presence of DMF.
  • DMF dimethylformamide
  • DCM diichloromethane
  • the sulphonamide condensation step of formula (V) with the acrylic acid derivative of formula (IV) comprises a microwave heating and irradiation step, for example at 70 ° C. C and 40 W.
  • DCM Dichloromethane DIPEA: ⁇ /, / V-Diisopropylethylamine
  • HATU 1 Bis (dimethylamino) methylene] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium-3-oxide hexafluorophosphate
  • the first optional step consists in converting an aldehyde of formula (III) such as 5-methyl-2-furfuraldehyde into an acrylic acid derivative of formula (IV) such as (E) -acid.
  • an aldehyde of formula (III) such as 5-methyl-2-furfuraldehyde
  • an acrylic acid derivative of formula (IV) such as (E) -acid.
  • 3- 5-methylfuran-2-yl) acrylic acid.
  • This transformation has already been described in the literature (Pontiki et al., 201 1). Briefly, (E) -3- (5-methylfuran-2-yl) acrylic acid was obtained by condensation of 5-methyl-2-furfuraldehyde with malonic acid in the presence of pyridine and piperidine.
  • the second step consists in the condensation of a sulphonamide of formula (V) such as 4-amino-N- (3,4-dimethyl-1,2-oxazol-5-yl) benzenesulfonamide (sulfisoxazole) with an acrylic acid derivative of formula (IV) such as (E) -3- (5-methylfuran-2-yl) acrylic acid, in the presence of a peptide coupling reagent.
  • a sulphonamide of formula (V) such as 4-amino-N- (3,4-dimethyl-1,2-oxazol-5-yl) benzenesulfonamide (sulfisoxazole)
  • an acrylic acid derivative of formula (IV) such as (E) -3- (5-methylfuran-2-yl) acrylic acid
  • the aqueous extract is acidified with 6M HCl (6 mL) to acidic pH.
  • the precipitate thus formed was filtered through Buchner, rinsed with distilled water (2 x 5 mL) and dried at 40 ° C for 6 h to give the compound of formula (la) (89 mg, 44%) as a a light yellow solid.
  • HEK293T cells were transfected with a vector coding for the insulin receptor fused to luciferase (IR-Luc). Before lysis, cells transfected with IR-Luc were stimulated or not with 100 nM insulin for 10 minutes. The IR-Luc lysates were recovered and then purified on Sepharose beads coupled to wheat germ lectin (WGL for Wheat Germ Lectin). The IR-Luc receptors were then eluted and frozen in liquid nitrogen before being stored at -80 ° C.
  • HEK293T cells were transfected with either a vector encoding Grb14 protein fused to YFP (Grb14-YFP) or the empty pcDNA3 plasmid. Cells transfected with Grb14-YFP or with the empty pcDNA3 plasmid were lysed 48 h after transfection. After centrifugation, the lysates are recovered and frozen at -80 ° C.
  • the insulin receptors (IR-Luc) partially purified from cells stimulated or not with insulin were incubated for 20 minutes with the inhibitor compounds according to the invention suspended in DMSO.
  • the cell extracts from cells transfected with Grb14-YFP (or the empty pcDNA3 plasmid) were then added and after 40 minutes of incubation, coelenterazine was added and the BRET reading was initiated.
  • the results are expressed as a percentage of the BRET signal obtained in the presence of the tested molecules with respect to the BRET signal of the DMSO control.
  • the compounds according to the invention induce a decrease of the BRET signal between the insulin receptor and the Grb14 protein.
  • the compound of formula Ile decreases by 25% the BRET signal between the insulin receptor and the Grb14 protein.
  • the compound of formula (Ia) induces a significant decrease of 60% in BRET IR-Grb14 at 50 ⁇ M.
  • the inhibitory effect of the compounds according to the invention on the IR-Grb14 interaction was confirmed in co-immunoprecipitation experiments in acellular system.
  • the IR-Luc extracts stimulated or not by insulin were preincubated for 20 minutes in the absence or in the presence of 50 ⁇ l of the compound according to the invention before being incubated with the cell extract containing the fusion protein.
  • Grb14-YFP for 40 minutes. YFP-directed immunoprecipitation allows the Western blot to analyze the amount of receptor that has remained associated with the Grb14 protein.
  • HEK 293T cells co-transfected with a construct bearing only the tyrosine kinase domain of the luciferase-fused receptor (IRTK48-RLuc) and the Grb14 protein fused to the YFP were incubated for 4 hours in the presence of compounds according to the invention.
  • the insulin receptor tyrosine kinase domain spontaneously autophosphorylates, so it is not necessary to add insulin to stimulate the IRTK-Grb14 interaction.
  • the Western blot analysis of the amount of IRTK48-Rluc co-precipitated with the Grb14 proteins shows that the amount of tyrosine kinase domain of the insulin receptor coimmunized with the Grb14 protein is decreased by 75% by the compound of formula (Ia), 50 ⁇ l.
  • This result indicates that the compound of formula (Ia) enters the cells and decreases the interaction between the insulin receptor kinase domain and the Grb14 protein.
  • the compound of formula (Ia) therefore acts well at the insulin receptor tyrosine kinase domain, the only part of the receptor present in the construct used for this experiment. This confirms that the compounds according to the invention inhibit the IR-Grb14 interaction by acting specifically on the kinase domain of the insulin receptor.
  • FIG. 3B having densitometric quantification of the signals revealed, shows that the compound of formula (Ia) does not modify the amounts of tyrosine kinase domain of the insulin receptor coimmunized with the Grb10 protein.
  • the compound of formula (Ia) seems specific for the IRTK-Grb14 interaction, since it does not inhibit the IRTK-Grb10 interaction.
  • HEK293T cells were cultured for 72 h at different concentrations of serum (0.1%, 1%, 10%). ), in the absence or in the presence of compound of formula (la) (50 or 100 ⁇ ).
  • the fluorescence of the cells was measured before and after treatment with a reagent containing resazurin. Knowing that the intensity of the fluorescence is correlated with the number of living cells, the growth of the cells is estimated by relating the fluorescence measured at 72 h of treatment to that measured at tO. The presence of serum promotes cell growth. Thus, after 72 hours, the cell population is increased from 7 times to 0.1% serum and 10 times to 1 or 10% serum.
  • the compound of formula (la) at 50 ⁇ and 100 ⁇ does not modify the cell growth rate.
  • mice were treated daily either by gavage with 30 mg / kg / day of compound of formula (Ia) diluted in 0.5% carboxymethylcellulose; either by intraperitoneal injection with 30 mg / kg / day of compound of formula (Ia) diluted in DMSO, or with DMSO alone, for a period of 15 days.
  • mice Before the start of the treatments, the mice had a similar body weight. After 12 days of treatment, no difference in weight gain was observed between the different groups, regardless of the treatment. Moreover, regardless of the method of administration of the compound according to the invention, it is possible to observe a decrease in the glycemia measured in the post-absorptive state. Finally, no difference in the appearance of the liver was observed in these mice.
  • the compound of formula (Ia) according to the invention therefore has no detectable toxic effect.
  • HEK293T cells are transfected with plasmids allowing, on the one hand, the expression of the PH domain. (Pleckstrin Homology) of the Akt protein that has been fused to luciferase and on the other hand a membrane targeting sequence that has been fused to the YFP protein.
  • Akt PH domain is recruited to the membrane by PIP3
  • energy transfer between the luciferase that is coupled to the Akt PH domain and the membrane YFP protein takes place.
  • the measured BRET signal is a control of PIP3 production at the membrane and is a reflection of the activation of the PI-3 kinase / Akt pathway in real time on cells.
  • insulin induces a rapid increase in the BRET signal (BRET delta of about 100).
  • the compound of formula (la) (50 ⁇ l) increases the recruitment of the Akt protein to the membrane in the absence (BRET delta of approximately 86) and in the presence (BRET delta of approximately 121) of 5 nM insulin. .
  • the effect of the compound of formula (Ia), in the absence of insulin is detectable as early as 5 ⁇ l, with a significant increase of the BRET signal at 10 ⁇ l (results not shown). This effect is also observed for the other inhibiting compounds according to the invention as shown in Table 3.
  • the effect of the comparative compounds of formula (IVa) and of formula (Va) used in the synthesis of the compound of formula (Ia) on the PI3K / Akt pathway was tested in the presence of 5 nM insulin.
  • the compounds of formula (IVa) and formula (Va) (added separately or simultaneously) have no effect on the recruitment of Akt kinase to the membrane in the absence of the hormone.
  • the compound of formula (Va) also has no effect on the production of PIP3 at the membrane.
  • the effect of the compound of formula (Ia) on the increase in the production of PIP3 at the membrane was not found in all cellular systems. Indeed, in MCF7 cells (mammary tumor cells) which overexpress the IGF-1 receptor relative to the insulin receptor (Zhang et al., 2007), the compound of formula (la) (50 ⁇ l) has no effect on membrane production of PIP3 (in the absence and presence of 100 nM insulin). This suggests that the compound of formula (Ia) does not stimulate the PI3K / Akt pathway in cancer cells that overexpress the IGF-1 receptor. Finally, the compounds according to the invention increase the Ras / Raf interaction whether the cells are stimulated or not by insulin (results not shown).
  • the compounds according to the invention thus induce activation of PI3K / Akt pathways. These compounds potentiate the effect of insulin, but also have an activating effect in the absence of the hormone. In addition, the effect of the compound of formula (Ia) on the activation of the PI3K / Akt pathway is significant from 10 ⁇ . Finally, the effect of the compound of formula (Ia) on the activation of the PI3K / Akt pathway depends on the TK activity of the insulin receptor, proving a specificity of action. 6.2: Expression of the genes for gluconeogenesis
  • mouse hepatocytes in primary culture were pre-incubated with 10 nM glucagon.
  • glucagon strongly induces the expression of the key gluconeogenesis genes PEPCK and G6Pase, and the addition of insulin at 1 nM inhibits by approximately 60 to 70%. expression of these genes.
  • the compound of formula (Ia) induces a significant decrease of about 20% in the expression of PEPCK and glucagon-induced G6Pase.
  • the compounds according to the invention also reduce, even in the absence of insulin, the expression of glucagon-induced gluconeogenesis genes in hepatocytes in primary culture.
  • mouse hepatocytes in primary culture are cultured in the presence of 5 mM glucose (G5) or 25 mM glucose (G25) and 10 nM insulin for 24 h.
  • the relative quantification of the mRNAs is carried out by RT-qPCR and the values are related to the quantification of the 18S gene of the same sample in order to normalize the results.
  • G251 G25, with 10 nM insulin
  • a 60% increase in the expression of the messenger RNA of SREBP-1 c is observed, as well as an increase in the expression of its target genes ACC (of 650%), FAS (of 150%) and SCD1 (of 160%).
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Abstract

L'invention porte sur un composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline de formule (I) ou de formule (II), leurs sels, solvates et/ou diastéréoisomères, pour une utilisation à des fins thérapeutiques, en particulier pour le traitement de l'insulinorésistance, et des compositions pharmaceutiques contenant de tels composés.

Description

NOUVEAUX COMPOSES, COMPOSITIONS ET METHODES POUR LE TRAITEMENT
DE LA RESISTANCE A L'INSULINE
[0001 ] La présente invention concerne des inhibiteurs de l'interaction entre la protéine Grb14 et le récepteur de l'insuline pour une utilisation à des fins thérapeutiques, notamment pour le traitement de l'insulinorésistance ainsi que pour la prévention et le traitement de pathologies associées à l'insulinorésistance. L'invention concerne également un procédé de synthèse de ces inhibiteurs et des compositions pharmaceutiques comprenant lesdits inhibiteurs.
ÎArt antérieur! [0002] Depuis de nombreuses années, il y a une forte augmentation des maladies métaboliques telles que le diabète, notamment le diabète de type 2, l'obésité, le syndrome métabolique et le diabète pré-gestationnel. Ainsi, l'Organisation Mondiale de la Santé estime en 2016 à plus de 400 millions le nombre de diabétiques dans le monde et indique que la prévalence mondiale du diabète chez les adultes de plus de 18 ans est passée de 4,7% en 1980 à 8,5% en 2014.
[0003] Le diabète de type 2 représente 90% des diabètes rencontrés dans le monde. Il est en grande partie le résultat d'une surcharge pondérale et de la sédentarité. Le coût annuel des soins de santé aux États-Unis pour le diabète était estimé à 245 milliards de dollars en 2012. La prévention et le traitement des maladies métaboliques telles que le diabète de type 2 sont devenus une priorité majeure en matière de soins de santé. En outre, l'homéostasie anormale du glucose est associée directement et indirectement à l'hypertension et aux altérations du métabolisme des lipides, et les patients atteints de diabète de type 2 ont un risque significativement accru de complications macrovasculaires et microvasculaires, telles que l'hypertension artérielle, la microangiopathie diabétique, ou la macroangiopathie diabétique.
[0004] Les stratégies thérapeutiques actuelles utilisées pour lutter contre la majorité de ces maladies métaboliques et leurs conséquences visent à améliorer la sécrétion de l'insuline ou ses actions au niveau des différents tissus cibles. La metformine est généralement recommandée comme traitement de première intention. D'autres médicaments incluent : les autres biguanides, les sulfonylurées, les thiazolidinediones, les inhibiteurs de dipeptidyl peptidase-4, les inhibiteurs de l'alpha-glucosidase, les glinides, les fibrates, les inhibiteurs de SGLT2 et les analogues du glucagon-like peptide-1 (GLP1 ). La plupart des sujets n'ont pas initialement besoin d'insuline, mais une insulinothérapie peut éventuellement être associée à un médicament administré par voie orale.
[0005] Néanmoins, la majorité de ces maladies métaboliques est associée à une insulinorésistance et cette dernière est initiée bien en amont de l'état diabétique. Ainsi, dans une étude récente, il est estimé qu'aux États-Unis, plus de 37 % des adultes sont prédiabétiques (Menke A et al., 2015), conditions comportant la plupart du temps le développement d'une insulinorésistance. L'insulinorésistance entraîne une altération de la signalisation insulinique et une réduction de l'efficacité des approches thérapeutiques conventionnelles. Pour les conditions pré-diabétiques, la résistance à l'insuline se développe avant le début de l'hyperglycémie et est associée à une augmentation de la production d'insuline. Après plusieurs années, l'augmentation de la sécrétion d'insuline ne suffit plus à compenser la résistance des tissus insulino-dépendants à l'insuline et le sujet devient hyperglycémique. Les cellules bêta du pancréas ne peuvent plus produire suffisamment d'insuline pour compenser la diminution de la sensibilité à l'insuline, elles commencent à perdre leur fonction et l'apoptose est déclenchée. Ainsi, parallèlement au développement de l'insulinorésistance, se produit une perte progressive de la masse fonctionnelle des cellules du pancréas. A terme, cette perte de masse fonctionnelle de cellules est telle que le pancréas n'est plus capable de compenser la perte de sensibilité à l'insuline, conduisant ainsi à l'apparition du diabète de type 2. Pourtant, aucun des médicaments habituellement utilisés pour le traitement du diabète n'est reconnu pour bloquer durablement l'évolution naturelle de la pathologie. Ainsi, plus de la moitié de la population « pré-diabétique » va développer un diabète de type 2 après 4 à 5 ans de traitement. Par exemple, la metformine ne réduirait le risque de diabète que de 4%. [0006] En outre, tous les antidiabétiques oraux actuels présentent des effets secondaires importants qui réduisent très fortement leur rapport bénéfice/risque lors d'un traitement chronique de prévention chez des sujets asymptomatiques. Ainsi, des risques accrus d'insuffisance cardiaque ou de cancer de la vessie associés aux traitements contenant les insulinosensibilisateurs tels que la rosiglitazone ou la pioglitazone (appartenant à la famille des thiazolidinediones) ont entraîné leur retrait du marché par diverses autorités de santé.
[0007] Grb14 est un adaptateur moléculaire fortement exprimé dans les tissus insulinosensibles (foie, tissu adipeux, muscle), qui se lie au récepteur de l'insuline activé et inhibe son activité catalytique. L'expression de Grb14 est augmentée dans le tissu adipeux de patients diabétiques de type 2 ainsi que dans différents modèles animaux d'insulinorésistance, suggérant que cette protéine pourrait être impliquée dans la diminution de la signalisation de l'insuline. Les domaines peptidiques des protéines de la famille Grb7 impliqués dans l'inhibition de l'activité tyrosine kinase des récepteurs de l'insuline ont été identifiés dans WO200055634, néanmoins cette demande de brevet ne propose pas de molécules pouvant efficacement traiter l'insulinorésistance. Ainsi, il existe un besoin pour de nouveaux composés capables de répondre aux problèmes engendrés par les traitements existants, permettant un traitement de l'insulinorésistance et permettant ainsi une prévention ou un traitement des pathologies associées à l'insulinorésistance. rProblème technique!
[0008] L'invention a donc pour but de remédier aux inconvénients de l'art antérieur. En particulier, l'invention a pour but de proposer de nouveaux inhibiteurs de l'interaction entre Grb14 et le récepteur de l'insuline pour une utilisation à des fins thérapeutiques. Ces molécules pouvant notamment être utilisées dans des compositions pharmaceutiques à des fins thérapeutiques.
[0009] Plus particulièrement, la présente invention propose de nouvelles compositions à base de ces inhibiteurs pour une utilisation dans le traitement de l'insulinorésistance. Typiquement, les compositions et les procédés fournis par les inventeurs peuvent être utilisés pour traiter un sujet souffrant d'une insulinorésistance. Ainsi, les compositions et les procédés fournis par les inventeurs peuvent être utilisés pour traiter un sujet souffrant, à risque de souffrir ou susceptible de souffrir d'une pathologie associée à l'insulinorésistance.
[0010] Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé de préparation de ces composés.
Γ Brève description de l'invention]
[001 1 ] A cet effet, l'invention porte sur un composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline choisi dans le groupe constitué des composés appartenant à la famille des isoxazoles sulfamides de formule (I), leurs sels, solvates et/ou diastéréoisomères,
(i)
dans laquelle :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et
- les groupements R2, R3, R4 et R5 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ; ou dans le groupe constitué des composés appartenant à la famille des dioxo- thioxotetrahydro-pyrimidinylidène de formule (II), leurs sels, solvates, et/ou diastéréoisomères,
dans laquelle :
- le groupement Re représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ou un groupe -(alkyle en d-C5)-aryle, ledit aryle étant substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements suivants : -CO2R11 , COR12, -OC(0)Ri3, -S(0)Ri4, -
OR15, -SR16, -SO2R17, -CONR18R19, -OCO2R20, - le groupement R7 représente un atome d'hydrogène ou un groupe carboxyle,
- le groupement Re représente un atome d'hydrogène ou un groupe aryle, et
- le groupement Rg représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkoxyle,
- les groupements R à R20, sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone,
pour son utilisation à des fins thérapeutiques.
[0012] Contrairement aux inhibiteurs d'interaction protéine-protéine tels que les anticorps monoclonaux ou les peptides, le composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline selon l'invention est une petite molécule. Par petite molécule, il faut comprendre, au sens de l'invention, un composé naturel ou de synthèse possédant un poids moléculaire inférieur à 1200 Da, par exemple compris entre 200 et 1 100 Da, et de préférence entre 300 et 900 Da. Comme cela sera détaillé ci-après, les composés de formule générale (I) et (II) sont non toxiques, pénètrent les membranes et stimulent notamment la voie PI3K. Il existe en outre une spécificité d'inhibition de l'interaction Grb14/IR par rapport à l'interaction Grb10/IR.
[0013] Avantageusement, les compositions de l'invention sont utilisées pour augmenter la lipogenèse et réduire la néoglucogenèse et notamment augmenter l'action de l'insuline sur l'expression des gènes impliqués dans la lipogenèse et la néoglucogenèse.
[0014] Avantageusement, les inhibiteurs selon l'invention sont des composés non toxiques qui pénètrent les membranes et stimulent notamment la voie PI3K. De plus, ces molécules bloquent spécifiquement l'interaction entre Grb14 et les récepteurs de l'insuline et n'interfèrent pas sur l'interaction entre Grb10 et les récepteurs de l'insuline. Ces composés sont utiles pour des interventions thérapeutiques pour le traitement de l'insulinorésistance et la prévention ou le traitement des pathologies associées à l'insulinorésistance.
[0015] Selon d'autres caractéristiques optionnelles du composé inhibiteur :
- le composé inhibiteur de formule (I) est tel que :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone,
- les groupements R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène, et - les groupements FU et R5 représentent un groupe méthyle.
le composé inhibiteur de formule (I) est choisi dans le groupe constitué des composés de formule (la) ou (Ib),
le composé inhibiteur de formule (I I) est choisi dans le groupe constitué des composés de formule (Ile), (l ld), (I le), ou (llf)
leurs sels, solvates et/ou diastéréoisomères. le composé inhibiteur selon l'invention est destiné à une utilisation en tant qu'insulinosensibilisateur.
[0016] L'invention porte en outre sur une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé inhibiteur de formule (I) ou de formule (II) selon l'invention.
[0017] Selon d'autres caractéristiques optionnelles de la composition :
la composition pharmaceutique selon l'invention comprend en outre au moins un autre ingrédient actif choisi parmi : les sulfonylurées, les biguanides tels que la metformine, les thiazolidinediones, les analogues de GLP1 tels que l'exenatide ou le liraglutide, les inhibiteurs de la dipeptidyl peptidase-4 tels que la gliptine, la sitagliptine, la vildagliptine, la saxagliptine, la linagliptine, la gemigliptine ou l'alogliptine, les inhibiteurs de l'alpha-glucosidase, les glinides, les fibrates ou les inhibiteurs de SGLT2 tels que la canaglifozine.
- la composition pharmaceutique selon l'invention est destinée à une utilisation à des fins thérapeutiques chez un sujet soumis à l'insulinothérapie ladite insulinothérapie comprenant de l'insuline ou un analogue de l'insuline. la composition pharmaceutique selon l'invention est un produit de combinaison pour une utilisation simultanée, conjointe ou séparée, ou séquentielle à des fins thérapeutiques.
[0018] L'invention porte en outre sur le composé inhibiteur selon l'invention ou sur la composition pharmaceutique selon l'invention pour leur utilisation dans le traitement de l'insulinorésistance ainsi que pour la prévention ou le traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance.
[0019] Selon d'autres caractéristiques optionnelles de cette utilisation :
- la pathologie associée à l'insulinorésistance est sélectionnée parmi : le syndrome métabolique, le syndrome des ovaires polykystiques, l'obésité, le diabète pré- gestationnel, le diabète de type 2, l'hyperglycémie, la lipodystrophie, la néphropathie diabétique ou les complications cardiovasculaires telles que l'hypertension artérielle, la microangiopathie diabétique, ou la macroangiopathie diabétique,
le composé inhibiteur selon l'invention est administré à une dose comprise entre 50 mg et 250 mg par jour, de préférence entre 100 mg et 200 mg par jour.
[0020] L'invention porte en outre sur un procédé de synthèse d'un composé inhibiteur selon la formule (I), ou ses diastéroisomères, comprenant une étape de condensation d'un sulfamidé de formule (V)
dans laquelle :
- les groupements R4 et R5 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ; avec un dérivé d'acide acrylique de formule (IV)
dans laquelle :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et
- les groupements R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone.
[0021 ] En outre, selon une caractéristique optionnelle de ce procédé de synthèse, ladite étape de condensation est réalisée en présence de DIPEA (N-Ethyl-N-(propan-2-yl)propan- 2-amine) et d'un réactif de couplage peptidique sélectionné parmi l'HATU (1 - [Bis(dimethylamino)methylene]-1 H-1 ,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate) et le réactif de Ghosez (1 -Chloro-N,N,2-trimethylpropenylamine).
[0022] D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante donnée à titre d'exemple illustratif et non limitatif, en référence aux Figures annexées qui représentent :
Figure 1 , l'effet inhibiteur du composé de formule (la) (Comp. la) selon l'invention (barres noires) sur l'interaction IR/Grb14 mesurée par la technique de BRET IR-Luc/ Grb14-YFP en système acellulaire, comparé au contrôle (barres blanches), en présence ou en absence d'une stimulation préalable à l'insuline (Ins.) à 100 nM. Les résultats, exprimés en pourcentage du contrôle DMSO (Diméthylsulfoxide), sont la moyenne calculée sur la base de 2 à 8 expériences indépendantes (** p<0.01 , *** p<0.001 , par Bonferroni Multiple comparison test).
• Figure 2, l'effet inhibiteur du composé de formule (la) selon l'invention (barres noires) sur l'interaction IR/Grb14 telle que mesurée par co-immunoprécipitation en système acellulaire, comparé au contrôle (barres blanches), avec analyse par western blot de la quantité d'IR-Luc co-précipitée avec Grb14-YFP et quantification par densitométrie des signaux révélés. Les résultats, exprimés en pourcentage du contrôle DMSO (Diméthylsulfoxide), sont la moyenne de 2 à 8 expériences indépendantes (*** p<0.001 , par Bonferroni Multiple comparison test).
Figure 3A et figure 3B, l'effet inhibiteur du composé de formule (la) selon l'invention (barres noires) sur l'interaction entre Grb14 et le domaine tyrosine kinase de l'IR (interaction IRTK-Grb14) telle que mesurée par co-immunoprécipitation avec analyse par western blot de la quantité d'IRTK48-Rluc co-précipitée avec les protéines Grb14 (figure 3A) ou Grb10 (figure 3B) fusionnées à la YFP et quantification par densitométrie des signaux révélés. Les résultats, exprimés en pourcentage du contrôle DMSO (Diméthylsulfoxide), sont la moyenne de 3 expériences indépendantes (** p<0.01 , par t-test).
Figure 4, l'effet du composé de formule (la) (barres noires) sur la croissance et la survie de cellules HEK293T mesurées après 72 h de culture comparé au contrôle DMSO (Diméthylsulfoxide, barres blanches). Les histogrammes représentent le taux de croissance des cellules déterminé par le rapport : Fluorescence à J3/Fluorescence à JO. Les résultats sont la moyenne de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicats.
Figure 5A et Figure 5B, l'effet du composé de formule (la) selon l'invention (barres noires) sur l'activation de la voie PI3K/Akt mesurée par la technique de BRET Luc- Akt-PH/YFP-membrane par rapport au contrôle DMSO (Diméthylsulfoxide, barres blanches) telle que mesurée sur (figure 5A) des cellules HEK293T pré-incubées ou non pendant 1 h avec l'inhibiteur de tyrosine kinase AG1024 à une concentration de 25 μΜ final ou sur (figure 5B) une lignée MCF7 doublement transfectée de façon stable avec les vecteurs codant pour Luc-Akt-PH et YFP-membrane. Les résultats, exprimés en delta de BRET, sont la moyenne de 3 à 8 expériences indépendantes (** p<0.01 , *** p<0.001 , par Newman-Keuls multiple comparison test).
Figure 6, l'effet du composé de formule (la) selon l'invention (barres noires) sur l'expression des gènes cibles de l'insuline, PEPCK (figure 6A) et G6Pase (figure 6B), impliqués dans la voie de la néoglucogenèse. Les hépatocytes en culture primaire sont cultivés pendant 8 h en présence de composé de formule (la) (50 μΜ), d'insuline (1 nM) et de glucagon (pré-incubation 1 h à 10 nM). La quantification relative des ARNm est réalisée par RT-qPCR. Les valeurs sont rapportées à la quantification du gène 18S du même échantillon afin de normaliser les résultats. Les résultats sont la moyenne de 3 à 5 expériences indépendantes (* p<0.05, ** p<0.01 , par Anova suivie d'un test de Newman-Keuls).
Figure 7, l'effet du composé de formule (la) selon l'invention (barres noires) sur l'expression de gènes cibles de l'insuline, SREBP-1 c, ACC, FAS et SCD1 (figures 7 A-D respectivement) impliqués dans la voie de la lipogenèse. Les hépatocytes en culture primaire sont cultivés en présence de 5 mM de glucose (G5) ou 25 mM de glucose (G25) et 10 nM d'insuline pendant 24 h. La quantification relative des ARNm est réalisée par RT-qPCR. Les valeurs sont rapportées à la quantification du gène 18S du même échantillon afin de normaliser les résultats. Les résultats sont la moyenne de 3 à 5 expériences indépendantes (* p<0.05 par Anova suivie d'un test de Newman-Keuls).
[Description de l'invention! [0023] La présente invention propose une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l'insulinorésistance. L'invention concerne de nouveaux composés, de type petite molécule, inhibiteurs de l'interaction entre la protéine Grb14 et le récepteur de l'insuline, ainsi que des compositions pharmaceutiques comportant de tels composés pour une utilisation à des fins thérapeutiques. L'invention concerne également des méthodes thérapeutiques utilisant de tels composés. Les composés, compositions et méthodes permettent plus particulièrement le traitement de l'insulinorésistance ainsi que la prévention et le traitement des pathologies associées à l'insulinorésistance.
[0024] Dans la suite de la description, la « protéine Grb14 » correspond, au sens de l'invention, à une protéine appartenant à la famille Grb7 d'adaptateurs moléculaires. La famille Grb7 d'adaptateurs moléculaires se compose de trois membres : Grb7, Grb10 et Grb14. Tous trois se lient au récepteur de l'insuline activé, phosphorylé. Toutefois seules Grb10 et Grb14 semblent jouer un rôle important dans la régulation de l'action de l'insuline (Holt & Siddle 2005 ; Desbuquois et al. 2013). La protéine Grb14 (NP_001290351 ; NP 004481 . UniProtKB - Q14449), codée par le gène grb14 (Gene ID: 2888), présente différentes isoformes définies par leur espèce d'origine : hGrbl 4 pour l'homme, rGrbl 4 pour le rat et mGrb14 pour la souris. Grb14 est connue pour être fortement exprimée dans le muscle squelettique, le tissu adipeux blanc, le cœur, le cerveau, le pancréas et les reins ainsi que dans le foie et la rétine.
[0025] Le « récepteur de l'insuline », au sens de l'invention, appartient à la famille des récepteurs à activité tyrosine kinase (TK). Chez l'homme, le récepteur de l'insuline est codé par un gène unique comprenant 22 exons et 21 introns (Gene ID: 3643). La synthèse du récepteur de l'insuline est sujette à un épissage alternatif. Les événements post- traductionnels en aval de l'une ou l'autre isoforme ont pour résultat la formation d'une sous- unité a et d'une sous-unité β clivées protéolytiquement, qui, lors de la combinaison, sont finalement capables d'homo ou d'hétérodimérisation pour produire le récepteur transmembranaire de l'insuline =320 kDa (UniProtKB - P06213). Le récepteur de l'insuline est localisé à la membrane plasmique de la plupart des cellules, mais il l'est plus fortement dans les tissus insulinosensibles que sont le foie, le muscle et le tissu adipeux. Il est également bien exprimé dans les cellules β du pancréas, dans l'endothélium vasculaire ainsi que dans certaines zones particulières du cerveau. [0026] Au sens de l'invention, « l'inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline » correspond à un composé capable d'inhiber l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline. Dans le contexte de la présente invention, ledit inhibiteur est de préférence spécifique à la protéine Grb14 et/ou au récepteur de l'insuline, c'est-à-dire qu'il n'inhibe pas l'interaction des adaptateurs de la même famille avec le récepteur de l'insuline, en particulier de Grb10.
[0027] Au sens de l'invention, les « tissus insulinosensibles » correspondent au foie, au pancréas, aux muscles, aux tissus adipeux (blanc et brun) et au cerveau.
[0028] Au sens de l'invention, le terme « insulinorésistance », aussi appelé « résistance à l'insuline », correspond à l'insensibilisation des récepteurs cellulaires membranaires à l'insuline. Ainsi, l'insuline ne fait plus autant d'effet sur ces récepteurs. De ce fait, malgré l'insuline, le glucose ne pénètre plus autant dans les cellules, et de ce fait, il s'accumule dans la circulation sanguine et lymphatique, d'où une augmentation de la glycémie. Cette augmentation stimule à son tour une hypersécrétion d'insuline par le pancréas et au bout d'un certain nombre d'années, les cellules pancréatiques s'épuisent. Classiquement, le profil clinique des personnes susceptibles ou à risque de développer une insulinorésistance comprend fréquemment au moins une, de préférence plusieurs, de façon plus préférée au moins trois, des caractéristiques suivantes : une surchage pondérale (IMC supérieur à 25), une répartition abdominale des graisses anormale (tour de taille supérieur à 80 cm chez la femme, à 94 cm chez l'homme), une sédentarité, des antécédents familiaux de diabète de type 2, une hypertension artérielle. L'insulinorésistance peut être diagnostiquée par de nombreuses méthodes connues par l'homme du métier, comprenant la mesure de la tolérance au glucose, la mesure du taux d'insuline à jeun, la mesure de la sensibilité à l'insuline par administration intraveineuse de glucose et d'insuline (clamp euglycémique hyperinsulinémique). La méthode préférée pour la mesure de la résistance à l'insuline est le clamp euglycémique hyperinsulinémique.
[0029] Par « pathologie associée à l'insulinorésistance », il faut comprendre, au sens de l'invention, toute pathologie ou condition qui est la conséquence de ladite insulinorésistance ou une de ses comorbidités. De telles pathologies sont de préférences sélectionnées parmi : le syndrome métabolique, le syndrome des ovaires polykystiques, l'obésité, le diabète pré- gestationnel, le diabète de type 2, l'hyperglycémie, la lipodystrophie, la néphropathie diabétique ou les complications cardiovasculaires telles que l'hypertension artérielle, la microangiopathie diabétique (couvrant notamment la neuropathie diabétique et la rétinopathie diabétique), et la macroangiopathie diabétique.
[0030] Par « syndrome métabolique », il faut comprendre, au sens de l'invention, une pathologie se caractérisant par une pluralité d'anomalies physiologiques et biochimiques, asymptomatiques, qui peuvent coexister avec des facteurs génétiques et acquis. Parmi les nombreuses définitions proposées, le diagnostic du syndrome métabolique pourra être réalisé grâce aux méthodes suivantes : celle de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) (WHO consultation 1999), celle du National Cholestérol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP ATP III de 2001 ) et celle de la Fédération Internationale du Diabète (IDF 2005) (Zimmet et al., 2005). De façon préférée, le diagnostic est réalisé par la méthode IDF 2005. [0031 ] Dans le cadre d'un mode de réalisation préféré de l'invention, la désignation d'un composé est destinée à désigner le composé en soi, ainsi que tout sel, hydrate, ou stéréoisomère pharmaceutiquement acceptable de celui-ci. Dans un mode de réalisation plus préféré, la désignation d'un composé est destinée à désigner le composé comme spécifiquement désigné en soi, ainsi que tout sel pharmaceutiquement acceptable de celui- ci.
[0032] Aux fins de l'invention, on entend par « pharmaceutiquement acceptable » ce qui est utile pour la préparation d'une composition pharmaceutique et ce qui est généralement sûr et non toxique pour une utilisation pharmaceutique. [0033] L'expression « sel et/ou solvate » entend désigner, dans le cadre de la présente invention, un sel ou solvate d'un composé selon l'invention, de préférence pharmaceutiquement acceptable et possédant l'activité pharmacologique du composé correspondant. Ainsi, au sens de l'invention, le terme « sel » désigne un sel d'addition d'acide ou de base pharmaceutiquement acceptable, inorganique ou organique d'un composé de la présente invention. La formation d'un sel consiste typiquement à associer une molécule acide, basique ou zwitterionique avec un contre-ion pour créer une version saline du composé. On peut utiliser une grande variété d'espèces chimiques dans la réaction de neutralisation. Bien que la plupart des sels d'un principe actif donné soient des bioéquivalents, certains peuvent avoir, entre autres, des propriétés de solubilité ou de biodisponibilité accrues. La sélection du sel est maintenant une opération courante dans le processus de développement de médicament comme enseigné par H. Stahl et C.G Wermuth (Stahl et al, 201 1 ). Au sens de l'invention, le terme « solvates » correspond aux solvates classiques tels que ceux produits lors de la dernière étape de la préparation des composés de l'invention en raison de la présence de solvants. A titre d'exemple, on peut citer les solvates dus à la présence d'eau (ces solvates sont également appelés hydrates) ou d'éthanol.
[0034] Au sens de la présente invention, les « stéréoisomères » sont des composés de même formule semi-développée, mais qui diffèrent par la disposition des atomes dans l'espace. Au sens de la présente invention, les « énantiomères » sont des stéréoisomères qui sont symétriques l'un de l'autre dans un miroir et non superposables. Au sens de la présente invention, les « diastéréoisomères » sont des stéréoisomères qui ne sont pas des énantiomères. C'est-à-dire que des diastéréoisomères ont le même enchaînement d'atomes, mais qui ne sont ni superposables, ni image l'une de l'autre dans un miroir. Traditionnellement, la stéréochimie en double liaison est décrite soit en cis soit en trans, en référence à la position relative des substituants de part et d'autre d'une double liaison.
[0035] Par « sujet », on entend décrire ici n'importe quel membre du règne animal, de manière préférée les mammifères et de manière encore préférée l'homme.
[0036] Par le terme « prévention », il faut comprendre dans le cadre de la présente invention le fait d'empêcher ou de retarder la survenue des manifestations cliniques ou biochimiques associées à la pathologie. Dans le cadre de la prévention des pathologies associées à l'insulinorésistance, le terme « prévention » se réfère donc au fait d'empêcher ou de retarder la survenue ou de diminuer l'intensité des pathologies associées à l'insulinorésistance, par exemple d'empêcher ou de retarder la survenue ou de diminuer l'intensité du diabète de type 2. La prévention peut de préférence être mise en œuvre chez des sujets considérés comme à risque ou prédisposés à développer la pathologie.
[0037] Dans le cadre de l'invention, le terme « traitement » désigne le fait de soigner une affection ou pathologie déclarée ou d'en atténuer les symptômes et/ou la progression. Ainsi, le terme « traitement », comprend une amélioration constatée au niveau clinique ou biochimique de l'affection ou de la pathologie du sujet. Par conséquent, un tel traitement peut être utilisé chez un sujet souffrant d'insulinorésistance pour retarder sa progression, diminuer ou supprimer ses effets et ainsi soigner cette affection. Un tel traitement peut également être utilisé chez un sujet souffrant d'une pathologie associée à l'insulinorésistance telle que le syndrome métabolique, le syndrome des ovaires polykystiques, l'obésité, le diabète pré-gestationnel, le diabète de type 2, l'hyperglycémie, la lipodystrophie, la néphropathie diabétique, ou de complications cardiovasculaires telles que l'hypertension artérielle, la microangiopathie diabétique, ou la macroangiopathie diabétique.
[0038] Le terme « administration » ou « administrer » signifie dans le cadre de la présente invention qu'un composé d'intérêt est délivré ou dispensé à un sujet par n'importe quel mode d'administration approprié, qui pourra être aisément déterminé par l'homme du métier selon la nature dudit composé. Par exemple, ledit composé pourra être délivré ou dispensé audit sujet selon le cas par voie orale, transdermale, ou parentérale telle que par injection sous- cutanée, intraveineuse, intramusculaire, ou intrapéritonéale.
[0039] Dans le contexte de la présente invention, par « quantité pharmaceutiquement efficace », on entend une quantité ou concentration prophylactique ou thérapeutique d'un composé d'intérêt, c'est-à-dire une quantité ou concentration dudit composé suffisante pour traiter l'insulinorésistance et/ou pour prévenir ou traiter les pathologies associées à l'insulinorésistance, ou pour soigner l'insulinorésistance ou ladite pathologie une fois déclarée ou d'en atténuer les symptômes et/ou la progression. L'homme de l'art est à même de déterminer cette quantité dite pharmaceutiquement efficace.
[0040] L'expression « groupe alkyle, linéaire, cyclique ou ramifiée, contenant jusqu'à 5 atomes de carbone » tel qu'utilisée dans la présente invention (aussi appelée alkyle en Cr C5) , correspond à une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire, cyclique ou ramifiée, contenant de 1 à 5 atomes de carbone ou à une chaîne hydrocarbonée insaturée, linéaire ou ramifiée, contenant de 2 à 5 atomes de carbone. Une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire, cyclique ou ramifiée, contenant de 1 à 5 atomes de carbone comprend, sans s'y limiter, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, sec-butyle, t- butyle, n-pentyle, cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle et similaires. Une chaîne hydrocarbonée insaturée, linéaire ou ramifiée, contenant de 2 à 5 atomes de carbone comprend au moins une double ou une triple liaison, et inclut, sans s'y limiter, les groupes éthène, propène, butène, pentène, éthényle, propényle, butényle, pentényle et similaires.
[0041 ] Le terme « groupe aryle », tel qu'utilisé dans la présente invention, désigne un groupe hydrocarboné aromatique comprenant de préférence 6 à 10 atomes de carbone et comprenant un ou plusieurs, notamment 1 ou 2, cycles condensés, comme par exemple un groupe phényle ou un groupe naphtyle. Avantageusement, cela désigne un groupe phényle.
[0042] Le terme « -(alkyle en d-C5)-aryle », tel qu'utilisé dans la présente invention, désigne un groupe aryle tel que défini ci-dessus lié à la molécule via un groupe alkyle en C1 à C5 tel que défini ci-dessus. En particulier, le groupe -(alkyle en d-C5)-aryle selon l'invention est un groupe benzyle. Pour les groupes comprenant deux sous-groupes ou plus, l'attachement est indiqué par « - ». Par exemple, « -(alkyle en d-C5)-aryle » désigne un radical alkyle lié à un radical aryle dans lequel l'alkyle est lié au reste de la molécule.
[0043] Le groupe aryle selon la présente invention peut être substitué avec un ou plusieurs groupes choisis indépendamment dans le groupe consistant en alkyle, alkoxyle (alcoxyle), hydroxyle, carboxyle ou ester. Des exemples de groupes phényle substitués sont le méthoxyphényle, le diméthoxyphényle et le carboxyphényle.
[0044] Le terme « substitué » tel qu'utilisé ici signifie que l'un quelconque des atomes d'hydrogène peut être remplacé par un substituant, tel qu'un groupement carboxyle.
Composé inhibiteur selon l'invention
[0045] Contrairement aux inhibiteurs d'interaction protéine-protéine tels que les anticorps monoclonaux ou les peptides, le composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline selon l'invention est une petite molécule. Par petite molécule, il faut comprendre au sens de l'invention, un composé naturel ou de synthèse possédant un poids moléculaire compris entre 200 et 1 100 Da, de préférence entre 300 et 900 Da. Ces petites molécules sont généralement plus malléables par les techniques de chimie de synthèse que les autres classes de modulateurs d'interaction protéine-protéine tels que les composés peptidiques. En outre, elles présentent généralement une grande complexité structurale qui leur procure une forte sélectivité vis-à-vis de leur cible et une bonne affinité de liaison. Enfin, elles peuvent disposer d'une forte biodisponibilité et d'une capacité à traverser les membranes.
[0046] L'invention a pour objet un composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline choisi dans le groupe constitué des composés appartenant à la famille des isoxazoles sulfamides de formule (I), leurs sels, solvates et/ou diastéréoisomères
(I)
dans laquelle :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et - les groupements R2, R3, R4 et R5 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ; ou dans le groupe constitué des composés appartenant à la famille des dioxo- thioxotetrahydro-pyrimidinylidènes de formule (II), leurs sels, solvates, et/ou diastéréoisomères,
dans laquelle :
- le groupement Re représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ou un groupe -(alkyle en d-C5)-aryle, ledit aryle étant substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements suivants : -CO2R11 , COR12, -OC(0)Ri3, -S(0)Ri4, - OR15, -SR16, -SO2Ri7, -CONRi8Ri9, -OCO2R20,
- le groupement R7 représente un atome d'hydrogène ou un groupe carboxyle,
- le groupement Re représente un atome d'hydrogène ou un groupe aryle,
- le groupement Rg représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkoxyle, et
- les groupements R à R20, sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, pour son utilisation à des fins thérapeutiques.
Famille des isoxazoles sulfamides
[0047] Selon un mode de réalisation du premier aspect de la présente invention, le composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline, pour son utilisation à des fins thérapeutiques, est choisi dans le groupe constitué des composés appartenant à la famille des isoxazoles sulfamides de formule (I), leurs sels, solvates et/ou diastéréoisomères
(I) dans laquelle :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et
- les groupements R2, R3, R4 et R5 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ;
[0048] De façon préférée, le composé de formule générale (I) est en configuration trans.
[0049] En particulier, dans ce composé inhibiteur de formule (I), les groupements R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène.
[0050] De même, dans ce composé inhibiteur de formule (I), les groupements R4 et R5 représentent un groupe méthyle.
[0051 ] De façon préférée, dans le composé inhibiteur de formule (I), le groupement Ri représente un groupe alkyle saturé à chaîne linéaire ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, de préférence un groupe alkyle saturé à chaîne linéaire ou ramifiée contenant jusqu'à 3 atomes de carbone.
[0052] De façon plus préférée, dans le composé inhibiteur de formule (I), le groupement Ri représente un groupe alkyle saturé à chaîne linéaire contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et de façon encore plus préférée jusqu'à 3 atomes de carbone.
[0053] De façon encore plus préférée, notamment dans le cadre d'une utilisation selon la présente invention, le composé inhibiteur est sélectionné dans le groupe constitué des composés de formule (la) ou de formule (Ib) :
Composé Inhibiteur de formule (II)
[0054] Selon un mode de réalisation du premier aspect de la présente invention, le composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline, pour son utilisation à des fins thérapeutiques, est choisi dans le groupe constitué des composés appartenant à la famille des dioxo-thioxotetrahydro-pyrimidinylidène de formule (II), leurs sels, solvates, et/ou diastéréoisomères
dans laquelle : - le groupement Re représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ou un groupe -(alkyle en d-C5)-aryle, ledit aryle étant substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements suivants : -C02Rn , COR12, -OC(0)Ri3, -S(0)Ri4, -OR15, -SRie, -SO2R17, -CONRi8Ri9,
- le groupement R7 représente un atome d'hydrogène ou un groupe carboxyle,
- le groupement Re représente un atome d'hydrogène ou un groupe aryle,
- le groupement Rg représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkoxyle, et
- les groupements R à R20, sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone.
[0055] De façon préférée, le composé de formule générale (II) est en configuration cis.
[0056] En particulier, dans ce composé inhibiteur de formule (II), Re représente un groupe alkyle à chaîne de préférence saturée, linéaire ou ramifiée, contenant jusqu'à 5 atomes de carbone. De façon plus préférée, dans ce composé inhibiteur de formule (II), Re représente un groupe alkyle à chaîne linéaire saturée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone. De façon encore plus préférée, dans ce composé inhibiteur de formule (II), Re représente un groupe alkyle à chaîne linéaire saturée contenant jusqu'à 3 atomes de carbone. [0057] En particulier, dans ce composé inhibiteur de formule (II), Re représente un groupe -(alkyle en d-C5)-aryle, ledit aryle étant substitué par un ou plusieurs groupes, de préférence un groupe, choisi parmi les groupements suivants : -CO2R11 , COR12, -OC(0) Ri3, -S(0)Ri4, -OR15, -SRie, -SO2R17, -CONR18R19, -OCO2R20. De façon plus préférée, dans ce composé inhibiteur de formule (II), Re représente un groupe benzyle, substitué par un groupe choisi parmi les groupements suivants : -CO2R11 , -COR12, -OC(0)Ri3, -S(0) Ri4, - SO2R17. Les groupements R à R20 étant tels que définis ci-dessus. De façon encore plus préférée, dans ce composé inhibiteur de formule (II), Re représente un groupe benzyle, substitué par un groupe carboxyle.
[0058] Ainsi, de façon particulière, le composé inhibiteur selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des composés de formule (lia), leurs sels et/ou leurs solvates,
et
- le groupement Rio représente un groupe carboxylique.
[0059] De préférence, dans le composé inhibiteur de formule (II), le groupe alkoxyle du groupement Rg est sélectionné parmi un méthoxyle ou un éthoxyle.
[0060] De préférence, dans ce composé inhibiteur de formule (II), le groupement R7 représente un atome d'hydrogène lorsque le groupement Re représente un groupe aryle.
[0061 ] De préférence, dans ce composé inhibiteur de formule (II), le groupement Re représente un atome d'hydrogène ou un groupe phényle.
[0062] De façon particulière, le groupement Re représente un groupe phényle. Ainsi, le composé inhibiteur selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des composés de formule (Mb), leurs sels et/ou leurs solvates,
(Mb)
dans laquelle :
- le groupement Re représente un groupe alkyle à chaîne linéaire ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, ou un groupe -(alkyle en C1 -C5)- aryle, substitué par un groupement carboxyle, et
- le groupement R7 représente un atome d'hydrogène ou un groupement carboxyle.
[0063] De façon encore plus préférée, notamment dans le cadre d'une utilisation selon la présente invention, le composé inhibiteur est sélectionné dans le groupe constitué des composés de formule (Ile), (lld), (Ile) ou (llf).
Composition pharmaceutique
[0064] L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé inhibiteur de formule (I) ou de formule (II) tel que défini ci-dessus pour son utilisation à des fins thérapeutiques. En particulier, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé inhibiteur de formule (I) ou de formule (II) tel que défini ci-dessus et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable pour son utilisation à des fins thérapeutiques.
[0065] Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées notamment pour une administration par voie orale ou par voie parentérale, comprenant la voie sous-cutanée, la voie intraveineuse et la voie intramusculaire, de préférence pour une administration par voie orale, lesdites compositions étant destinées à des mammifères, y compris des humains. Ainsi, la composition pharmaceutique peut, par exemple, être administrée par voie orale au moyen de comprimés et de gélules.
[0066] Lorsqu'une composition solide est préparée sous forme de comprimés, le composé inhibiteur selon l'invention est mélangé à un véhicule pharmaceutique tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique et similaires. Les comprimés peuvent être revêtus de saccharose ou d'autres matériaux appropriés, ou ils peuvent être traités de manière à avoir une activité prolongée ou retardée et ils libèrent en continu une quantité prédéterminée de principe actif. La préparation dans des gélules est obtenue en mélangeant le composé inhibiteur selon l'invention avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.
[0067] Pour l'administration par injection, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents dispersants et / ou des agents mouillants pharmacologiquement compatibles. [0068] Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne le composé inhibiteur de formule générale (I) ou (II) tel que défini ci-dessus, ou une composition pharmaceutique selon la présente invention, pour une utilisation dans le traitement de l'insulinorésistance. Ainsi, ce composé inhibiteur selon l'invention est particulièrement adapté pour son utilisation en tant qu'insulinosensibilisateur. [0069] La présente invention concerne également le composé inhibiteur de formule générale (I) ou (II) tel que défini ci-dessus, ou une composition pharmaceutique selon la présente invention, pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance.
[0070] Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de traitement de l'insulinorésistance comprenant l'administration à un sujet d'une quantité pharmaceutiquement efficace d'un composé inhibiteur de formule générale (I) ou (II) tel que défini ci-dessus ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention.
[0071 ] La présente invention concerne également un procédé de prévention ou de traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance comprenant l'administration à un sujet d'une quantité pharmaceutiquement efficace d'un composé inhibiteur de formule générale (I) ou (II) tel que défini ci-dessus ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention.
[0072] La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé inhibiteur de formule générale (I) ou (II) tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de l'insulinorésistance. En particulier, la présente invention concerne également l'utilisation d'un composé inhibiteur de formule générale (I) ou (II) tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament pour la prévention ou le traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance.
[0073] Selon l'invention, la pathologie associée à l'insulinorésistance peut être de préférence sélectionnée parmi : le syndrome métabolique, le syndrome des ovaires polykystiques, l'obésité, le diabète pré-gestationnel, le diabète de type 2, l'hyperglycémie, la lipodystrophie, la néphropathie diabétique ou les complications cardiovasculaires telles que l'hypertension artérielle, la microangiopathie diabétique (comprenant notamment la neuropathie diabétique et la rétinopathie diabétique), ou la macroangiopathie diabétique. [0074] De façon plus préférée, la pathologie associée à l'insulinorésistance peut être de préférence sélectionnée parmi : l'obésité, le diabète de type 2, le syndrome métabolique et l'hyperglycémie. De façon encore plus préférée, la pathologie associée à l'insulinorésistance peut être de préférence sélectionnée parmi : l'obésité, le diabète de type 2 et l'hyperglycémie.
[0075] Dans le cadre de la présente invention, le composé inhibiteur selon l'invention peut être administré sous des formes posologiques unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, à des animaux ou à des mammifères, préférentiellement des humains. Le composé inhibiteur de l'invention en tant qu'ingrédient actif peut être formulé à des doses comprises entre 1 et 500 mg, de préférence entre 25 mg et 250 mg de manière encore préférée 50 mg et 150 mg sous des formes galéniques autorisant une administration en une seule dose, deux fois par jour à des doses égales, ou encore une administration de la dose souhaitée de façon fractionnée tout au long de la journée (e.g., mais pas uniquement, en rapport avec les repas). La dose administrée par jour est avantageusement comprise entre 50 mg et 500 mg, de préférence entre 1 00 mg et 200 mg. La dose administrée peut également être indiquée par unité de poids corporel du patient à traiter, ce qui est particulièrement pertinent dans le cadre du traitement d'une personne dont la masse corporelle sort de la norme. Ainsi, le composé inhibiteur de l'invention en tant qu'ingrédient actif peut être administré à des doses journalières comprises entre 1 et 40 mg/kg, de préférence entre 1 et 20 mg/kg, voire entre 1 et 10 mg/kg. Il peut être nécessaire d'utiliser des doses en dehors de ces plages telle que définies ci-dessus comme déterminé par l'homme du métier.
[0076] L'administration du composé inhibiteur selon l'invention peut être réalisée à raison d'au moins une administration par jour. Dans certains modes de réalisation, l'administration de l'ingrédient actif peut être réalisée à raison d'au moins une fois par semaine, par exemple deux fois par semaine. Le traitement de l'insulinorésistance ou la prévention et le traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance par l'administration du composé inhibiteur selon l'invention peut être conduit pendant une durée comprise entre 1 mois et 96 mois, de préférence pendant une durée comprise entre 6 mois et 72 mois, préférentiellement pendant une durée comprise entre 1 2 mois et 48 mois. Le traitement de l'insulinorésistance ou la prévention et le traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance par l'administration de l'ingrédient actif peut également être prolongée sur des durées plus importantes.
[0077] Bien qu'efficaces en tant que telles, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient actif, tel qu'un composé actif pour le traitement du diabète et plus particulièrement agissant comme activateur de la sécrétion d'insuline, insulinosensibilisateur, potentialisateur des effets de l'insuline et/ou inhibiteur de l'absorption digestive des glucides.
[0078] Ainsi, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant :
(I) au moins un composé inhibiteur de formule (I) ou de formule (II) tel que défini ci- dessus, et
(II) au moins un autre ingrédient actif, tel qu'un agent antidiabétique, de façon préférée, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, conjointe ou séparée, ou séquentielle.
[0079] La composition pharmaceutique selon la présente invention peut ainsi comprendre en outre au moins un autre ingrédient actif choisi parmi : les sulfonylurées, les biguanides tels que la metformine, les thiazolidinediones, les analogues de GLP1 tels que l'exenatide ou le liraglutide, les inhibiteurs de la dipeptidyl peptidase-4 tels que la gliptine, la sitagliptine, la vildagliptine, la saxagliptine, la linagliptine, la gemigliptine ou l'alogliptine, les inhibiteurs de l'alpha-glucosidase, les glinides, les fibrates ou les inhibiteurs de SGLT2 tels que la canaglifozine.
[0080] Les sulfonylurées sont des ingrédients actifs utilisés dans le traitement du diabète de type 2. Ils agissent par accroissement de la libération d'insuline par les cellules bêta du pancréas. Les sulfonylurées pouvant être utilisées en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnées parmi les composés suivants : acetohexamide (968-81 -0), carbutamide (339-43-5), chlorpropamide (94-20-2), glibenclamide (10238-21 -8), glibornuride (26944-48-9), glipizide (29094-61 -9), glimepiride (93479-97-1 ), gliclazide (21 187-98-4), gliquidone (33342-05-1 ), glisentide (32797-92-5), glyclopyramide (631 -27-6), tolbutamide (64-77-7) et tolazamide (1 156-19-0).
[0081 ] Les biguanides sont des ingrédients actifs aux propriétés antihyperglycémiques à prise orale utilisés dans le traitement du diabète de type 2. Les biguanides pouvant être utilisés en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnés parmi les composés suivants : buformine (1 190-53-0), metformine (657-24-9 ou 1 1 15-70-4) et phenformine (834-28-6).
[0082] Les thiazolidinediones ou glitazones sont des ingrédients actifs permettant de réduire le niveau de sucre dans le sang et sont utilisés dans le traitement du diabète de type 2. Les thiazolidinediones pouvant être utilisées en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnées parmi les composés suivants : rosiglitazone (122320-73-4 ou 302543-62-0 ou 155141 -29-0 ou 397263-60-4) et pioglitazone (1 1 1025-46-8 ou 1 12529-15-4). [0083] Les analogues du glucagon-like peptide-1 (GLP1 ) favorisent la prolifération des cellules β, inhibent l'apoptose des cellules β et sont utilisés dans le traitement du diabète de type 2. Les analogues du GLP1 pouvant être utilisés en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnés parmi les composés suivants : exenatide (141758-74-9) et liraglutide (204656-20-2).
[0084] Les inhibiteurs de la dipeptidyl peptidase-4 permettent une augmentation de la sécrétion d'insuline, une diminution de la sécrétion de glucagon, et sont ainsi utilisés dans le traitement du diabète de type 2. Les inhibiteurs de la dipeptidyl peptidase-4 pouvant être utilisés en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnés parmi les composés suivants : alogliptine (850649-62-6), sitagliptine (654671 -78-0), vildagliptine (274901 -16-5), saxagliptine (361442-04-8), linagliptine (668270-12-0), gemigliptine (91 1637-19-9), berbérine (2086-83-1 ou 633-65-8 ou 633-66-9) et dutogliptine (852329-66-9).
[0085] Les inhibiteurs de l'alpha-glucosidase permettent de réduire l'hyperglycémie postprandiale et sont ainsi utilisés dans le traitement du diabète de type 2. Les inhibiteurs de l'alpha-glucosidase pouvant être utilisés en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnés parmi les composés suivants : acarbose (56180-94-0), miglitol (72432-03-2), et voglibose (83480-29-9).
[0086] Les inhibiteurs de SGLT2 (cotransporteur sodium-glucose de type 2) permettent d'améliorer la sensibilité à l'insuline et la fonction β-cellulaire. Les inhibiteurs de la SGLT2 pouvant être utilisés en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnés parmi les composés suivants : canaglifozine (842133-18-0). dapagliflozine (461432-26-8), ipragliflozine (761423-87-4), tofogliflozine (1201913-82-7 ou 903565-83-3) et empagliflozine (864070-44-0).
[0087] Les glinides améliorent la sécrétion d'insuline et sont utilisés dans le traitement de diabète de type 2. Les glinides pouvant être utilisés en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnés parmi les composés suivants : mitiglinide (145375-43-5), natéglinide (105816-04-4), et répaglinide (135062-02-1 ).
[0088] Les fibrates sont des composés hypolipémiants. Les fibrates pouvant être utilisés en combinaison avec le composé inhibiteur selon l'invention peuvent être plus particulièrement sélectionnés parmi les composés suivants : bezafibrate (41859-67-0), ciprofibrate (52214-84-3), clof ibrate (637-07-0 ou 882-09-7 ou 39087-48-4 ou 14613-30-0), fénofibrate (49562-28-9 ou 42017-89-0 ou 856676-23-8) et gemfibrozil (25812-30-0). [0089] De façon préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend en outre au moins un autre ingrédient actif choisi parmi : metformine, gliptine, et canaglifozine.
[0090] L'invention porte également sur une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation à des fins thérapeutiques chez un sujet soumis à une insulinothérapie ladite insulinothérapie comprenant l'administration d'insuline ou d'un analogue de l'insuline.
[0091 ] L'analogue de l'insuline peut par exemple être une insuline modifiée de façon à modifier la rapidité de son absorption par le sujet. Les produits commerciaux sont par exemple Lispro, Aspart, Glulisine, Detemir, Degludec et Glargine.
[0092] La présente invention concerne également un procédé de traitement de l'insulinorésistance, et plus particulièrement de prévention ou de traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance, comprenant l'administration à un sujet en ayant besoin d'une quantité pharmaceutiquement efficace de la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus.
[0093] La présente invention concerne également l'utilisation de la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de l'insulinorésistance. En particulier, la présente invention concerne également l'utilisation de la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament pour la prévention ou le traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance.
Synthèse du composé inhibiteur selon la formule (I)
[0094] Selon un autre aspect, l'invention porte sur un procédé de synthèse d'un composé de formule (I) tel que défini ci-dessus et incluant les modes de réalisation préférés. Ledit procédé comprenant une étape de condensation d'un sulfamidé de formule (V)
dans laquelle :
- les groupements FU et R5 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ; avec un dérivé d'acide acrylique de formule (IV)
dans laquelle :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et
- les groupements R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone.
[0095] Le dérivé d'acide acrylique de formule (IV) peut être aisément acheté dans le commerce ou bien être synthétisé à partir des connaissances générales de l'homme du métier ou à partir des enseignements de Pontiki et al. (201 1 ). En particulier, le procédé de synthèse selon l'invention peut comprendre une étape préalable de condensation d'un aldéhyde de formule (III)
dans laquelle :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et
- les groupements R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ; avec un acide malonique en présence de pyridine et de pipéridine.
[0096] La réaction de condensation du sulfamidé de formule (V) avec le dérivé d'acide acrylique de formule (IV) est difficile à réaliser à cause de la faible réactivité du sulfamidé de formule (V) et de la présence de deux sites potentiellement nucléophiles sur cette molécule.
[0097] Dans l'art antérieur, il est proposé de faire réagir un sulfamide (n'étant pas de formule (V)) avec un dérivé de chlorure d'acyle (Marwaha et al, 2014). Néanmoins, une reproduction de ce protocole avec un sulfamidé de formule (V) et un dérivé de chlorure d'acyle correspondant à un dérivé d'acide acrylique de formule (IV) ne permet pas d'obtenir un composé de formule (I). En effet, comme cela est évoqué dans les exemples, ce protocole entraine la génération d'un milieu réactionnel hétérogène incapable de permettre la synthèse d'un composé de formule (I).
[0098] En outre, une amélioration de ce protocole selon les enseignements du document US3,427,318 permet d'atteindre un brut complexe à partir duquel, comme cela est présenté dans les exemples, il n'est possible de purifier un composé de formule (I) qu'avec 1 1 % de rendement. Ainsi, les protocoles de l'art antérieur, notamment basés sur Marwaha et al., 2014, même modifiés, ne permettent pas de produire un composé de formule (I) avec un rendement satisfaisant. [0099] Les inventeurs de la présente invention ont donc défini des conditions réactionnelles permettant d'obtenir des rendements de condensation satisfaisants sur le site nucléophile souhaité. Cela passe notamment par l'utilisation d'un dérivé d'acide acrylique de formule (IV) en lieu et place d'un dérivé de chlorure d'acyle. [00100] En outre, de préférence, la réaction de condensation d'un sulfamidé de formule (V) avec un dérivé d'acide acrylique de formule (IV) est réalisée en présence d'un réactif de couplage peptidique.
[00101 ] De façon préférée, le réactif de couplage peptidique est sélectionné parmi l'HATU (1 -[Bis(dimethylamino)methylene]-1 H-1 ,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate) et le réactif de Ghosez (1 -Chloro-N,N,2-trimethylpropenylamine). Le réactif de couplage peut en outre être utilisé en combinaison avec de la DIPEA (A/-Ethyl-/V- (propan-2-yl)propan-2-amine).
[00102] De préférence, l'étape de condensation du sulfamidé de formule (V) avec le dérivé d'acide acrylique de formule (IV) est réalisée en présence de DMF (Diméthylformamide) ou de DCM (Dichlorométhane), de façon plus préférée en présence de DMF.
[00103] De façon préférée, l'étape de condensation du sulfamidé de formule (V) avec le dérivé d'acide acrylique de formule (IV) comprend une étape de chauffage et d'irradiation par micro-onde, par exemple à 70 °C et 40 W.
[00104] Les composés selon la formule (II) peuvent quant à eux être aisément achetés dans le commerce ou synthétisés par des méthodes connues de l'art antérieur telle que celle décrite dans Uciechowska et al. (2008).
[00105] La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-après servant à illustrer l'invention.
EXEMPLES
[00106] Les abréviations suivantes ont été utilisées dans les exemples suivants.
BRET : Bioluminescence résonance energy transfer
DCM : Dichlorométhane DIPEA : Λ/,/V-Diisopropyléthylamine
DMF : Diméthylformamide
DMSO : Diméthylsulfoxide
EDCI : 1 -Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
HATU 1 Bis(dimethylamino)methylene]-1 H-1 ,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3- oxide hexafluorophosphate
HOBt Hydroxybenzotriazole
HPLC Chromatographie Liquide à Haute performance
IBCF Isobutylechloroformate
IR Récepteur de l'insuline
Luc Luciférase
μ ν Microonde
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
THF Tetrahydrofurane
ta Température ambiante
YFP Yellow Fluorescent Protein
Exemple I : Synthèse des isoxazoles sulfamides de formule (I)
1 .1 Etape préalable de formation du composé de formule (IV)
[00107] La première étape optionnelle consiste en la transformation d'un aldéhyde de formule (III) tel que le 5-methyl-2-furfuraldéhyde en dérivé d'acide acrylique de formule (IV) tel que l'acide (E)-3-(5-methylfuran-2-yl)acrylique. Cette transformation a déjà été décrite dans la littérature (Pontiki et al., 201 1 ). Brièvement, l'acide (E)-3-(5-methylfuran-2- yl)acrylique a été obtenu par condensation du 5-methyl-2-furfuraldéhyde avec l'acide malonique en présence de pyridine et de pipéridine.
1 .2 Etape de formation du composé de formule (I)
[00108] La deuxième étape consiste en la condensation d'un sulfamidé de formule (V) tel que le 4-amino-N-(3,4-dimethyl-1 ,2-oxazol-5-yl)benzenesulfonamide (sulfisoxazole) avec un dérivé d'acide acrylique de formule (IV) tel que l'acide (E)-3-(5-methylfuran-2- yl)acrylique, en présence d'un réactif de couplage peptidique. Synthèse du composé de formule (la) :
[00109] Dans un réacteur micro-onde (volume 10 ml_) une solution de l'acide (E)-3-(5- methylfuran-2-yl)acrylique (76 mg ; 0,5 mmol) dans du DMF anhydre (0,625 ml_), sous argon, à 0 °C, est traitée par de l'HATU (190 mg ; 0,5 mmol) puis de la DIPEA (87 μΙ_ ; 0,5 mmol). Le mélange est agité pendant 5 minutes à 0 °C. Du sulfisoxazole (134 mg ; 0.5 mmol) est ensuite ajouté et le mélange est agité à température ambiante pendant 15 minutes, puis irradié par des micro-ondes (70 °C ; 40 W) pendant 25 minutes. Le mélange est traité avec de l'AcOEt (100 mL) et extrait avec une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (50 mL).
[001 10] L'extrait aqueux est acidifié avec HCI 6 M (6 mL) jusqu'à pH acide. Le précipité ainsi formé est filtré sur Buchner, rincé avec de l'eau distillée (2 x 5 mL) et séché à 40 °C pendant 6 h pour donner le composé de formule (la) (89 mg ; 44%) sous forme d'un solide jaune clair.
Analyse du composé de formule (la) : [001 1 1 ] Pureté > 95% par inspection du spectre RMN 1 H ; Rf = 0,33 (AcOEt) ; F = 150-151 °C ; IR (ATR) : v 3315, 31 12, 3060, 2839, 2774, 1673, 1625, 1589, 1540, 1526, 1497, 1419, 1368, 1334, 1348, 1253, 1 189, 1 162 cm"1 ; RMN 1 H (250 MHz, DMSO-cfe) : δ 10,95 (1 H, bs, H6), 10,60 (1 H, s, H12), 7,88 (2H, d, J = 9,0 Hz, H9), 7,72 (2H, d, J = 9,0 Hz, H10), 7,37 (1 H, d, J= 15,5 Hz, H14), 6,80 (1 H, d, J = 3,3 Hz, H17), 6,37 (1 H, d, J = 15,5 Hz, H15), 6,28 (1 H, d, J =3,3 Hz, H18), 2,35 (3H, s, H23), 2,10 (3H, s, H21 ), 1 ,63 (3H, s, H22) ; RMN 13C (75 MHz, DMSO-cfe) : 5 164,2 (C13), 161 ,4 (C5), 155,6 (C3), 154,9 (C19), 149,4 (C16), 143,7 (C1 1 ), 133,5 (C8), 128,2 (C14), 128,0 (C9), 1 18,8 (C10), 1 17,1 (C15), 1 16,9 (C17), 109,2 (C18), 105,1 (C4), 13,5 (C23), 10,3 (C21 ), 5,8 (C22) ; SMHR: m/z trouvé : 424,0925 [M+Na]+ ; calculé pour CigHigN3Na05S : 424,0938.
1 .2 : Optimisation des conditions de synthèse
[001 12] La réaction de condensation d'un sulfamidé de formule (V) avec un dérivé d'acide acrylique de formule (IV) est difficile à réaliser à cause de la faible réactivité du sulfamidé de formule (V) couplée à la présence de deux sites potentiellement nucléophiles. Différentes méthodes de synthèse du composé de formule (I) ont été évaluées de façon à comparer les rendements de synthèse du composé de formule (I) à partir de l'acide (E)-3-(5-methylfuran- 2-yl)acrylique et du sulfisoxazole selon les conditions de couplage. [001 13] Comme cela est présenté dans le tableau 1 , selon les conditions réactionnelles et le réactif de couplage utilisé, le rendement de synthèse du composé de formule (la) varie de 17 à 44%. Tableau 1
(a) Le chlorure de (E)-3-(5-methylfuran-2-yl)acryloyle a été utilisé à la place de l'acide (E)- 3-(5-methylfuran-2-yl)acrylique.
(b) Suivant le protocole décrit par S. Marwaha et al. 2014. Le milieu réactionnel était hétérogène.
(c) Suivant le protocole décrit par M. S. Barber et al., US Patent 3,427,318 (1969).
[001 14] Ainsi, il apparaît de ces expérimentations que les inventeurs ont identifié des conditions permettant d'atteindre de hauts rendements en composés inhibiteurs de formule (I) et plus particulièrement en composés inhibiteurs de formule (la ou Ib). [001 15] Par exemple, associés à la DIPEA, l'HATU et le Réactif de Ghosez semblent être les réactifs de couplage peptidique permettant d'obtenir les meilleurs rendements dans ces expérimentations de synthèse. De même, les solvants DMF et le DCM permettent d'atteindre les rendements les plus élevés notamment lors de l'utilisation d'une irradiation par microonde. [001 16] Au contraire, les résultats obtenus en utilisant un dérivé de chlorure d'acyle comme suggéré dans l'art antérieur permettent au mieux d'obtenir un brut réactionnel comprenant de très nombreux composés très largement dégradés où le composé de formule (I) représente moins de 15%. Ainsi, si le chlorure d'acyle est le choix le plus évident qui semble le plus rapide et le plus simple pour l'homme du métier, il s'avère que pour la synthèse de composés de formule (I), celui-ci est trop réactif et pas assez sélectif.
Exemple 2 : Evaluation de l'effet inhibiteur des composés selon l'invention par une méthode de BRET acellulaire
[001 17] Des composés selon l'invention ont été évalués expérimentalement pour leur effet inhibiteur sur l'interaction IR-Grb14 par une technique de BRET en système acellulaire décrite brièvement ci-après.
[001 18] D'une part, des cellules HEK293T ont été transfectées avec un vecteur codant pour le récepteur de l'insuline fusionné à la luciférase (IR-Luc). Avant leur lyse, les cellules transfectées avec IR-Luc ont été stimulées ou non avec 100 nM d'insuline pendant 10 minutes. Les lysats IR-Luc ont été récupérés puis purifiés sur des billes de sépharose couplées à de la lectine de germe de blé (WGL pour Wheat Germ Lectin). Les récepteurs IR-Luc ont alors été élués puis congelés dans l'azote liquide avant d'être stockés à -80 °C. D'autre part, des cellules HEK293T ont été transfectées soit avec un vecteur codant pour la protéine Grb14 fusionnée à la YFP (Grb14-YFP), soit avec le plasmide vide pcDNA3. Les cellules transfectées avec Grb14-YFP ou avec le plasmide vide pcDNA3 ont été lysées 48 h après transfection. Après centrifugation, les lysats sont récupérés et congelés à—80 °C.
[001 19] Les récepteurs de l'insuline (IR-Luc) partiellement purifiés à partir de cellules stimulées ou non avec l'insuline ont été incubés 20 minutes avec les composés inhibiteurs selon l'invention suspendus dans du DMSO. Les extraits cellulaires provenant de cellules transfectées avec Grb14-YFP (ou le plasmide vide pcDNA3) ont ensuite été ajoutés puis après 40 minutes d'incubation, la coelenterazine a été ajoutée et la lecture du BRET a été initiée. Les résultats sont exprimés en pourcentage du signal de BRET obtenu en présence des molécules testées par rapport au signal de BRET du contrôle DMSO.
[00120] Les résultats de cette évaluation sont illustrés dans le cas du composé de formule (la) selon l'invention à la figure 1 et reportés dans le tableau 2 ci-dessous dans le cas des autres composés selon l'invention en présence d'une stimulation à l'insuline (100 nM). Tableau 2.
[00121 ] Les composés selon l'invention induisent une diminution du signal de BRET entre le récepteur de l'insuline et la protéine Grb14. Par exemple, à une concentration de 50 μΜ, le composé de formule Ile diminue de 25 % le signal de BRET entre le récepteur de l'insuline et la protéine Grb14. Le composé de formule (la) induit quant à lui une diminution significative de 60 % du BRET IR-Grb14 à 50 μΜ.
[00122] De plus, comme cela est présenté dans la figure 1 , une diminution significative du signal de BRET de 50 % par le composé de formule (la) est également observée en absence de stimulation avec l'insuline. En outre, des études complémentaires ont confirmé, pour les composés selon l'invention, la présence d'un effet dose-réponse sur la diminution du signal de BRET.
[00123] Au contraire, certains composés partageant des similarités de structure avec les composés selon l'invention ne parviennent pas à induire une diminution significative du signal de BRET entre le récepteur de l'insuline et la protéine Grb14. [00124] Par exemple, l'activité des composés (IVa) et (Va) entrant dans la synthèse du composé de formule (la) a été testé via la technique de BRET en système acellulaire détaillée précédemment. Les composés de formule (IVa) et (Va) pris individuellement, ajoutés séparément ou simultanément, ne permettent pas de réduire l'interaction IR-Grb14. Ainsi, l'activité inhibitrice du composé de formule (la) ne dépend donc pas d'une structure partielle de ce composé et la molécule est nécessaire dans son intégralité.
[00125] De plus, comme cela est détaillé dans le tableau 2, les composés A et B proches structurellement des composés de formule (la) ou (Ib), ne permettent pas une diminution significative du signal de BRET. En outre, ces essais comparatifs montrent l'importance pour les composés de formule générale (I) du cycle furane (cf. comparatif composé B) ainsi que du substituant en position Ri (cf. comparatif composé A).
[00126] De même, comme cela est détaillé dans le tableau 2, les composés C, D, E et F proches structurellement des composés de formule générale (II), ne permettent pas une diminution significative du signal de BRET. Ces résultats confirment la nécessité d'un substituant sur l'aryle en R6 (cf. comparatif composé C), en outre ce substituant est nucléophile (cf. comparatif composé D) sans être un halogène (cf. comparatif composé E). Ces résultats montrent également l'importance de la présence d'un atome de carbone lié à un atome de soufre en position 2 du cycle pyrimidine (cf. comparatif composé F).
Composé IVa Composé Va
Composé Comparatif A Composé Comparatif B
Composé Comparatif E Composé Comparatif F
Exemple 3 : Validation de l'effet inhibiteur par une méthode de coimmunoprécipitation
[00127] L'effet inhibiteur des composés selon l'invention sur l'interaction IR-Grb14 a été confirmé dans des expériences de co-immunoprécipitation en système acellulaire. Les extraits de IR-Luc stimulés ou non par l'insuline ont été pré-incubés pendant 20 minutes en absence ou en présence de 50 μΜ de composé selon l'invention avant d'être incubés avec l'extrait cellulaire contenant la protéine de fusion Grb14-YFP pendant 40 minutes. Une immunoprécipitation dirigée contre la YFP permet d'analyser par Western blot la quantité de récepteur qui est restée associée avec la protéine Grb14.
[00128] Comme attendu, l'association entre les protéines IR et Grb14 est beaucoup plus importante avec les récepteurs provenant de cellules stimulées à l'insuline qu'avec les récepteurs provenant de cellules non stimulées par l'hormone (figure 2). On observe que le composé de formule (la) selon l'invention diminue de 60 % la quantité de récepteurs de l'insuline associés à la protéine Grb14 en présence d'insuline. Enfin, des expériences de coimmunoprécipitation en système acellulaire montrent également une inhibition dose dépendante par le composé de formule (la), de la quantité de IR immunoprécipitée avec Grb14. En effet, dans cette série d'expériences, la quantité d'IR-Luc co-précipitée est diminuée de 20 % à une concentration de 25 μΜ et de 50 % à une concentration de 50 μΜ (résultats non montrés).
Exemple 4 : Spécificité de l'action des composés selon l'invention
4.1 : Action spécifique sur le domaine TK (tyrosine kinase) du récepteur de l'insuline
[00129] Des cellules HEK 293T co-transfectées avec une construction ne portant que le domaine tyrosine kinase du récepteur fusionné à la luciférase (IRTK48-RLuc) et la protéine Grb14 fusionnée à la YFP ont été incubées pendant 4 heures en présence de composés selon l'invention. En absence de sous-unités a, le domaine tyrosine kinase du récepteur de l'insuline s'autophosphoryle de manière spontanée, il n'est donc pas nécessaire d'ajouter de l'insuline pour stimuler l'interaction IRTK-Grb14.
[00130] L'analyse par Western blot de la quantité d'IRTK48-Rluc co-précipitée avec les protéines Grb14 (figure 3A) montre que la quantité de domaine tyrosine kinase du récepteur de l'insuline coimmunoprécipitée avec la protéine Grb14 est diminuée de 75 % par le composé de formule (la), 50 μΜ. Ce résultat indique que le composé de formule (la) entre dans les cellules et diminue l'interaction entre le domaine kinase du récepteur de l'insuline et la protéine Grb14. Le composé de formule (la) agit donc bien au niveau du domaine tyrosine kinase du récepteur de l'insuline, seule partie du récepteur présente dans la construction utilisée pour cette expérience. Cela confirme que les composés selon l'invention inhibent l'interaction IR-Grb14 en agissant spécifiquement sur le domaine kinase du récepteur de l'insuline.
4.2 : Action spécifique sur Grb14 [00131 ] Afin de tester la spécificité du composé de formule (la) sur cette interaction IRTK- Grb14, la même expérience a été réalisée avec des cellules HEK 293T co-transfectées avec une construction ne portant que le domaine tyrosine kinase du récepteur fusionné à la luciférase et la protéine Grb10 fusionnée à la YFP. En effet, la protéine Grb10 se lie également au récepteur de l'insuline phosphorylé et inhibe son activité catalytique.
[00132] La figure 3B, présentant la quantification par densitométrie des signaux révélés, montre que le composé de formule (la) ne modifie pas les quantités de domaine tyrosine kinase du récepteur de l'insuline co-immunoprécipitées avec la protéine Grb10. Ainsi, le composé de formule (la) semble spécifique de l'interaction IRTK-Grb14, puisqu'il n'inhibe pas l'interaction IRTK-Grb10.
Exemple 5 : Absence de toxicité des composés selon l'invention 5.1 : Toxicité sur cellules HEK293T
[00133] Afin d'étudier l'effet du composé de formule (la) sur la croissance et la survie cellulaire, des cellules HEK293T ont été cultivées pendant 72 h à différentes concentrations de sérum (0,1 %, 1 %, 10 %), en absence ou en présence de composé de formule (la) (50 ou 100 μΜ). La fluorescence des cellules a été mesurée avant et après traitement à l'aide d'un réactif comportant de la résazurine. Sachant que l'intensité de la fluorescence est corrélée au nombre de cellules vivantes, la croissance des cellules est estimée en rapportant la fluorescence mesurée à 72 h de traitement à celle mesurée à tO. La présence de sérum favorise la croissance cellulaire. On observe ainsi, au bout de 72 h, une augmentation de la population cellulaire de 7 fois à 0,1 % de sérum et de 10 fois à 1 ou 10 % de sérum.
[00134] Comme cela est présenté dans la figure 4, que ce soit à une faible concentration de sérum 0,1 % (afin de mesurer la survie cellulaire) ou à une forte concentration de sérum 10 % (afin de mesurer la prolifération cellulaire), le composé de formule (la) à 50 μΜ et 100 μΜ ne modifie pas le taux de croissance cellulaire.
5.1 : Toxicité in vivo
[00135] Une étude de toxicité à doses répétées a également été réalisée chez des souris C57BI/6J (12 mâles, âgés de 8 semaines). Les souris ont été traitées quotidiennement soit par gavage avec 30 mg/kg/jour de composé de formule (la) dilué dans de la carboxymethylcellulose 0,5 % ; soit par injection intrapéritonéale avec 30 mg/kg/jour de composé de formule (la) dilué dans du DMSO, soit avec du DMSO seul, pendant une durée de 15 jours.
[00136] Avant le début des traitements, les souris avaient un poids corporel similaire. Après 12 jours de traitements, aucune différence de prise de poids n'a été observée entre les différents groupes, quel que soit le traitement. De plus, quel que soit le mode d'administration du composé selon l'invention, il est possible d'observer une diminution de la glycémie mesurée à l'état post-absorptif. Enfin, aucune différence sur l'aspect du foie n'a par ailleurs été observée chez ces souris.
[00137] Le composé de formule (la) selon l'invention n'a donc pas d'effet toxique détectable.
Exemple 6 : Activation de la voie PI3-Kinase par les composés selon l'invention
6.1 : Recrutement de la protéine Akt à la membrane [00138] Pour mesurer l'activité de la voie PI-3 kinase par la technique de BRET, des cellules HEK293T sont transfectées avec des plasmides permettant d'une part l'expression du domaine PH (Pleckstrin Homology) de la protéine Akt qui a été fusionné à la luciférase et et d'autre part une séquence d'adressage à la membrane qui a été fusionnée à la protéine YFP. Lorsque le domaine PH d'Akt est recruté à la membrane par les PIP3, un transfert d'énergie entre la luciférase qui est couplée au domaine PH d'Akt et la protéine YFP membranaire a lieu. Le signal de BRET mesuré est un témoin de la production de PIP3 à la membrane et est un reflet de l'activation de la voie PI-3 kinase/Akt en temps réel sur des cellules.
[00139] Les résultats de cette évaluation sont illustrés dans le cas du composé de formule (la) selon l'invention dans la figure 5 et reportés dans le tableau 3 ci-dessous dans le cas des autres composés selon l'invention. Tableau 3.
* en présence d'insuline ;† sans insuline
[00140] Comme cela est présenté dans la figure 5A, l'insuline (5 nM) induit une augmentation rapide du signal de BRET (delta de BRET d'environ 100). Le composé de formule (la) (50 μΜ) augmente le recrutement de la protéine Akt à la membrane en absence (delta de BRET d'environ 86) et en présence (delta de BRET d'environ 121 ) de 5 nM d'insuline. Plus le composé de formule (la) est concentré plus la production de PIP3 à la membrane est augmentée. En outre, l'effet du composé de formule (la), en absence d'insuline, est détectable dès 5 μΜ, avec une augmentation significative du signal de BRET à 10 μΜ (résultats non montrés). Cet effet est également observé pour les autres composés inhibiteurs selon l'invention comme cela est présenté dans le tableau 3.
[00141 ] L'inhibition de l'activité tyrosine kinase du récepteur de l'insuline dans ce système, en pré-incubant les cellules pendant 1 h avec 25 μΜ de l'inhibiteur de tyrosine kinase AG1024 entraine une chute très importante du signal de BRET. L'insuline (5 nM) et le composé de formule (la) (50 μΜ) n'ont plus d'effet sur le recrutement de la protéine Akt à la membrane (Figure 5A).
[00142] De la même façon que précédemment, l'effet des composés comparatifs de formule (IVa) et de formule (Va) entrant dans la synthèse du composé de formule (la) sur la voie PI3K/Akt a été testé en présence de 5 nM d'insuline. A la différence du composé de formule (la), les composés de formule (IVa) et de formule (Va) (ajoutés séparément ou simultanément) n'ont pas d'effet sur le recrutement de la kinase Akt à la membrane en absence de l'hormone. De plus, en présence d'insuline, le composé de formule (Va) n'a pas non plus d'effet sur la production de PIP3 à la membrane. Le composé de formule (IVa) quant à lui, diminue seul le recrutement de la protéine Akt à la membrane d'environ 50 % et d'au moins 60 % lorsqu'il est combiné au composé de formule (Va).
[00143] Par ailleurs, comme cela est présenté dans la figure 5B, l'effet du composé de formule (la) sur l'augmentation de la production de PIP3 à la membrane n'a pas été retrouvé dans tous les systèmes cellulaires. En effet, dans des cellules MCF7 (cellules tumorales mammaires) qui surexpriment le récepteur de l'IGF-1 par rapport au récepteur de l'insuline (Zhang et al., 2007), le composé de formule (la) (50 μΜ) n'a pas d'effet sur la production de PIP3 à la membrane (en absence et en présence de 100 nM d'insuline). Ceci suggère que le composé de formule (la) ne stimule pas la voie PI3K/Akt dans des cellules cancéreuses qui surexpriment le récepteur de l'IGF-1 . Enfin, les composés selon l'invention augmentent l'interaction Ras/Raf que les cellules soient stimulées ou non par l'insuline (résultats non montrés).
[00144] Les composés selon l'invention induisent donc une activation des voies PI3K/Akt. Ces composés potentialisent l'effet de l'insuline, mais présentent également un effet activateur en absence de l'hormone. De plus, l'effet du composé de formule (la) sur l'activation de la voie PI3K/Akt est significatif dès 10 μΜ. Enfin, l'effet du composé de formule (la) sur l'activation de la voie PI3K/Akt dépend de l'activité TK du récepteur de l'insuline, prouvant une spécificité d'action. 6.2 : Expression des gènes de la néoglucogenèse
[00145] Pour étudier l'effet inhibiteur de l'insuline sur l'expression de gènes de la néoglucogenèse, des hépatocytes de souris en culture primaire ont été pré-incubés avec 10 nM de glucagon.
[00146] Comme présenté dans la figure 6, le glucagon induit fortement l'expression des gènes clés de la néoglucogenèse que sont la PEPCK et la G6Pase, et l'ajout d'insuline à 1 nM inhibe d'environ 60 à 70 % l'expression de ces gènes. Le composé de formule (la) induit une diminution significative d'environ 20 % de l'expression de la PEPCK et de la G6Pase induite par le glucagon. Ainsi, les composés selon l'invention diminuent également, même en l'absence d'insuline, l'expression des gènes de la néoglucogenèse induite par le glucagon dans des hépatocytes en culture primaire.
6.3 : Expression des gènes de la lipogenèse [00147] La stimulation de la lipogenèse en réponse à l'insuline se fait au niveau transcriptionnel notamment grâce à l'activation du facteur de transcription SREBP-1 c (Sterol Regulatory Elément Binding Protein 1 c). Ce facteur de transcription une fois activé et clivé migre dans le noyau et régule l'expression des enzymes clés de la lipogenèse (ACC, FAS et SCDI ).
[00148] Brièvement, les hépatocytes de souris en culture primaire sont cultivés en présence de 5 mM de glucose (G5) ou 25 mM de glucose (G25) et 10 nM d'insuline pendant 24 h. La quantification relative des ARNm est réalisée par RT-qPCR et les valeurs sont rapportées à la quantification du gène 18S du même échantillon afin de normaliser les résultats. [00149] Comme présenté dans la figure 7, en condition G25i (G25, avec insuline 10 nM) on observe une augmentation de 60 % de l'expression de l'ARN messager de SREBP-1 c ainsi qu'une augmentation de l'expression de ses gènes cibles ACC (de 650 %), FAS (de 150 %) et SCD1 (de 160 %). De façon intéressante, l'ajout du composé de formule (la) en condition G25i accentue l'effet de l'insuline sur l'expression de ces gènes. L'effet de l'hormone sur l'expression de SREBP-1 c et de ses gènes cibles ACC, FAS et SCD1 est ainsi augmenté d'environ 60 %. Ainsi, il y a potentialisation de l'effet de l'insuline sur la lipogenèse par les composés selon l'invention.
[00150] Ces exemples, sans limiter l'invention, confirment que les composés selon l'invention diminuent significativement l'interaction IR-Grb14 de façon reproductible. Non toxiques, ces composés pénètrent les membranes et stimulent les voies PI3K/Akt et MAP kinases. Ils entraînent également une augmentation de la production de PIP3 et activent la voie Ras/Raf à l'état basai. Enfin, ils améliorent l'effet de l'insuline dans des hépatocytes de souris en culture primaire, potentialisant notamment l'effet de l'insuline sur l'expression des gènes de la lipogenèse et de la néoglucogénèse. Ainsi, en diminuant l'interaction IR-Grb14, les composés selon l'invention augmentent la signalisation de l'insuline et s'avèrent être des composés prometteurs pour un usage thérapeutique, notamment pour le traitement de l'insulinorésistance. REFERENCES
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Claims

Revendications
1 . Composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline choisi dans le groupe constitué des composés appartenant à la famille des isoxazoles sulfamides de formule (I), leurs sels, solvates et/ou diastéréoisomères
(I)
dans laquelle :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et
- les groupements R2, R3, R4 et R5 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ; ou dans le groupe constitué des composés appartenant à la famille des dioxo- thioxotetrahydro-pyrimidinylidène de formule (II), leurs sels, solvates et/ou diastéréoisomères,
(II) dans laquelle :
- le groupement R6 représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ou un groupe -(alkyle en Ci-C5)-aryle, ledit aryle étant substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements suivants : -C02Rn , COR12, -OC(0) Ri3, -S(0)Ri4, -
OR15, -SR16, -SO2Ri7, -CONRi8Ri9, -OCO2R20,
- le groupement R7 représente un atome d'hydrogène ou un groupe carboxyle,
- le groupement R8 représente un atome d'hydrogène ou un groupe aryle,
- le groupement R9 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkoxy, et - les groupements R à R20, sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone,
pour son utilisation à des fins thérapeutiques.
2. Composé inhibiteur de formule (I) pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est en configuration trans.
3. Composé inhibiteur de formule (I) pour son utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les groupements R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène.
4. Composé inhibiteur de formule (I) pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les groupements R4 et R5 représentent un groupe méthyle.
5. Composé inhibiteur de formule (I) pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le groupement Ri représente un groupe alkyle saturé à chaîne linéaire ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone.
6. Composé inhibiteur de formule (I) pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone,
- les groupements R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène, et - les groupements R4 et R5 représentent un groupe méthyle.
7. Composé inhibiteur pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué des composés de formule (la) ou (Ib),
leurs sels, solvates, et/ou diastéréoisomères.
8. Composé inhibiteur de formule (II) pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le groupe alkoxyle du groupement R9 est sélectionné parmi un méthoxyle ou un éthoxyle.
9. Composé inhibiteur de formule (II) pour son utilisation selon l'une des revendications 1 ou 8, caractérisé en ce que le groupement R8 représente un atome d'hydrogène ou un groupe phényle.
10. Composé inhibiteur de formule (II) pour son utilisation selon l'une des revendications 1 , 8 ou 9, caractérisé en ce que le groupement R7 représente un atome d'hydrogène lorsque le groupement R8 représente un groupe aryle.
1 1 . Composé inhibiteur de formule (II) pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué des composés de formule (Ile), (lld), (Ile), ou (llf)
leurs sels, solvates et/ou diastéréoisomères.
12. Composé inhibiteur pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , pour le traitement de l'insulinorésistance.
13. Composé inhibiteur pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 pour son utilisation en tant qu'insulinosensibilisateur.
14. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé inhibiteur selon l'une des revendications 1 à 1 1 pour son utilisation à des fins thérapeutiques.
15. Composition pharmaceutique selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un autre ingrédient actif choisi parmi : les sulfonylurées, les biguanides tels que la metformine, les thiazolidinediones, les analogues de GLP1 tels que l'exenatide ou le liraglutide, les inhibiteurs de la dipeptidyl peptidase-4 tels que la gliptine, la sitagliptine, la vildagliptine, la saxagliptine, la linagliptine, la gemigliptine ou l'alogliptine, les inhibiteurs de l'alpha-glucosidase, les glinides, les fibrates ou les inhibiteurs de SGLT2 tels que la canaglifozine.
16. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, pour le traitement de l'insulinorésistance.
17. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, pour la prévention ou le traitement d'une pathologie associée à l'insulinorésistance.
18. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 17, caractérisé en ce que la pathologie associée à l'insulinorésistance est sélectionnée parmi : le syndrome métabolique, l'obésité, le syndrome des ovaires polykystiques, le diabète pré-gestationnel, le diabète de type 2, l'hyperglycémie, la lipodystrophie, la néphropathie diabétique ou les complications cardiovasculaires telles que l'hypertension artérielle, la microangiopathie diabétique, ou la macroangiopathie diabétique.
19. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que le composé inhibiteur de l'interaction entre une protéine Grb14 et un récepteur de l'insuline, est administré à une dose comprise entre 50 mg et 250 mg par jour, de préférence entre 100 mg et 200 mg par jour.
20. Procédé de synthèse d'un composé selon la formule (I), ou ses diastéréoisomères, tel que défini à la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de condensation d'un sulfamidé de formule (V)
dans laquelle :
- les groupements R4 et R5 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone ; avec un dérivé d'acide acrylique de formule (IV)
dans laquelle :
- le groupement Ri représente un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone, et
- les groupements R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle à chaîne linéaire, cyclique ou ramifiée contenant jusqu'à 5 atomes de carbone.
21 . Procédé de synthèse selon la revendication 20 caractérisé en ce que ladite étape de condensation est réalisée en présence d'un réactif de couplage peptidique.
22. Procédé de synthèse selon l'une des revendications 20 ou 21 caractérisé en ce que ladite étape de condensation est réalisée en présence de DIPEA (A/-Ethyl-/V- (propan-2-yl)propan-2-amine) et d'un réactif de couplage peptidique sélectionné parmi l'HATU (1 -[Bis(dimethylamino)methylene]-1 H-1 ,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate) et le réactif de Ghosez (1 -Chloro-N,N,2- trimethylpropenylamine).
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