EP3568401A1 - Complexes de lanthanides à base de dendrimères - Google Patents

Complexes de lanthanides à base de dendrimères

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Publication number
EP3568401A1
EP3568401A1 EP18700278.7A EP18700278A EP3568401A1 EP 3568401 A1 EP3568401 A1 EP 3568401A1 EP 18700278 A EP18700278 A EP 18700278A EP 3568401 A1 EP3568401 A1 EP 3568401A1
Authority
EP
European Patent Office
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formula
group
brs
groups
solution
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18700278.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Stéphane PETOUD
Svetlana ELISEEVA
Ivana MARTINIC
Virginie PLACIDE
Franck Suzenet
Régis DELATOUCHE
Joan LECLERC
Alexandra FOUCAULT-COLLET
Guillaume COLLET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dOrleans
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dOrleans
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite dOrleans filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the present invention relates to lanthanide complexes based on dendrimers.
  • the subject of the present invention is dendrimeric compounds, grafted to an antenna, capable of complexing with lanthanides.
  • the methods related to fluorescence have the advantages of being very sensitive, to allow real-time measurements, which are not very dangerous for biological media (because of the small quantity of imaging agents required for condition to use suitable excitation wavelengths) and very accessible (in terms of manufacturing and use costs), experimental time, mobility and level of specialization of users.
  • Fluorescent reporters based on semiconductor nanocrystals are another range of optical imaging agent choices. Another limiting factor is the high toxicity of the metals that make up these nanoparticles (cadmium, tellurium and selenium) in the case where the latter dissociate.
  • the family of lanthanides includes 14 elements with extremely interesting and unique optical properties, characterized by narrow and precise emission bands, ranging from visible to near infrared (> 1,200 nm). Each lanthanide has distinct and identifiable spectral properties. It is thus possible to decline, on the basis of the same technology, a whole range of different wavelengths by simply choosing the nature of the lanthanide to be incorporated in the molecule. These emission bands are much narrower than organic fluorophores and fluorescent nanoparticles (quantum dots), which allows for better spectral discrimination and multiplexed assays.
  • the position (in nm) of these emission bands does not vary according to the environment (cell, pH, temperatures, hydrophilic / hydrophobic sites, etc.) which facilitates their detections and minimizes the adaptation of the equipment (single filter for a given lanthanide).
  • the environment cell, pH, temperatures, hydrophilic / hydrophobic sites, etc.
  • fluorescent probes compatible with biological applications and operating in lower energy conversion based on lanthanides which are ideally excitable and emitters above 600 nm, corresponding to the biological window.
  • the current infrared near-infrared probes are of an organic nature, the commercial ones are few and suffer from limitations such as the tendency towards photobleaching and restricted Stokes displacements.
  • the object of the present invention is therefore to provide a polymetallic lanthanide dendrimeric complex emitting in the near infrared and capable of being excited in the near infrared.
  • Another object of the invention is to provide an absorbing and emitting light emitting system in the near infrared and to observe various biological systems without destroying them or interfere with their operation.
  • Another object of the invention is to provide a luminescent system for limiting spurious fluorescence / luminescence signals generated by biological materials (autofluorescence).
  • the present invention relates to a complex comprising at least one dendrimer (D) and at least one lanthanide (Ln), in which the dendrimer (D) comprises a unit of formula (I) below:
  • Ci is a valence group 4 of formula> N-CH 2 -CH 2 -N ⁇ ;
  • a 2 and A 3 are groups of formula - (CH 2 ) 2 -C (O) -NH- (CH 2 ) 2-;
  • Luminescent compounds containing lanthanides have, among other advantages, a spectral specificity in the visible and near-infrared spectral discrimination by their narrow emission bands specific to the nature of each lanthanide. In order to obtain a good luminescence intensity, it is important to introduce functional groups on the molecule that make it capable of absorbing a large amount of light radiation and to transfer the resulting energy onto the luminescent lanthanide to obtain the light. emission of luminescence radiation by return of the lanthanide to the ground state.
  • Near infrared offers a lot of unique advantages. It makes it possible to dispense with the auto-fluorescence of the tissues, and thus makes it possible to improve the signal-to-noise ratio and thus the detection sensitivity. Moreover, the biological tissues do not absorb or slightly between 640 nm and 1100 nm (window of biological transparency), which allows an excitation of the probes in depth and a non-invasive biological observation (diagnosis and research).
  • the lanthanide complexes are photostable. This photostability property is crucial in allowing the imaging agent to be excited i) over long experimental times and / or ii) during successive experiments and / or iii) by powerful excitation sources (lasers for confocal microscopy for example). A larger amount of photons can thus be collected without disturbing or damaging the functioning of the biological system to be studied (it is important to remember here that the excitation wavelength (> 650 nm) interacts extremely weakly with fluids and tissues. and increase the intensity and quality of the signal collected.
  • the structure of the dendrimers makes it possible to group on the same molecule a large density of lanthanides and antennas making it possible to increase the quantity of photons emitted per unit volume, which increases the intensity of the signal per molecule and therefore the sensitivity of the detection.
  • the present invention thus relates to an entity obtained by complexation between a dendrimer (D) as defined above and at least one lanthanide.
  • the complexes thus obtained are luminescent molecules.
  • the lanthanides are encapsulated within the dendrimer due to the presence of oxygen and nitrogen atoms.
  • the arrangement of the branches of the dendrimer around lanthanides partially protects them from direct interactions with solvent and water molecules in particular.
  • the complexes according to the invention are obtained by placing a dendrimer (D) in contact with a solution of lanthanides.
  • the dendrimer (D) is dissolved for example in a solution of DMSO and a solution of lanthanide salt is added to the solution containing the compound (D) in particular in an eight to one ratio.
  • the reaction mixture was mixed and the resulting dendrimer-lanthanide conjugate was isolated by dialysis.
  • the unit of formula (I) is connected via at least one arm to at least one antenna as defined above.
  • At least one is covalently connected to at least one antenna, via an arm.
  • the term "antenna” designates an entity capable of absorbing a large amount of excitation light to transfer the energy corresponding to the lanthanides and / or to emit directly by fluorescence.
  • the antenna is selected from the group consisting of anthraquinones, cyanines, especially cyanines 5, cyanines 5.5 and cyanines 7, aza-BODIPY, perylenediimides, porphyrins, phenothiazine salts and their salts. derivatives.
  • antennas it is also possible to use compounds of the "IR dyes" type well known to those skilled in the art.
  • these antennas there may be mentioned for example the following compounds:
  • These antennas are fixed on the dendrimers via chlorine by substitution and thus in the final form there is no chlorine but is a C, N, S and O.
  • arm refers to an entity for covalently connecting the pattern of formula (I) and the antenna.
  • the antenna is connected to the unit of formula (I) in a covalent manner via at least one arm corresponding to the following formula (II):
  • a 4 is a group of formula - (CH 2 ) 2 -X '- (CH 2 ) 2-, X' representing a group - C (O) -NH- or a group -NH-C (O) -, and preferably being a group of formula - (CH 2 ) 2 -C (O) -NH- (CH 2 ) 2 -;
  • X is a group of formula -NH-C (O) -; - i is an integer between 1 and 3;
  • k 0 or 1
  • a 5 and A 6 are selected, independently of each other, from the radicals (cyclo) alkylene, linear or branched, comprising from 1 to 12 carbon atoms;
  • Z is selected from -O-, -NH-, -S-, amide, ester, triazole, amine, ether, thioether, urea, thiourea, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate, disulfide groups; and sulfonyl; and
  • Y is selected from -O-, -NH-, -S-, alkylene, amide, ester, triazole, amine, ether, thioether, urea, thiourea, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate , disulfide and sulfonyl.
  • the dendrimer has the following formula:
  • Ci is a valence group 4 of formula> N-CH 2 -CH 2 -N ⁇ ;
  • a 2 - A 2 , A 3 and A 4 are groups of formula - (CH 2 ) 2 -C (O) -NH- (CH 2 ) 2 -;
  • radicals R ' are chosen, independently of one another, from the group consisting of:
  • L representing an antenna selected from the group consisting of anthraquinones, cyanines, aza-BODIPY, perylenediimides, porphyrins, phenothiazine salts and their derivatives; . groups of formula (2) below:
  • L representing a function that can be involved in a bioconjugation reaction, and preferably being an alkyne group, at least one of R 'groups having the formula (1).
  • water-solubilising group designates a chemical entity making it possible to increase the solubility of the probe in aqueous media.
  • water-solubilising groups there may be mentioned, for example, phosphates, sulphonates, sugars and PEG chains.
  • targeting group refers to a molecule, biological or not, capable of recognizing and / or binding a specific biological site.
  • Targeting groups include, for example, antibodies, proteins, peptides, carbohydrates, lipids, polysaccharides, fatty acids, amino acids, deoxyribonucleic acids, ribonucleic acids, oligonucleotides, medicaments and the like. ligands.
  • Formula (II) above contains 32 peripheral groups R ', of which at least one comprises an antenna connected to the dendrimer via an arm.
  • the dendrimers according to the invention may comprise at least one arm through which at least one antenna is linked.
  • at least one of the groups R ' has the formula (1) above.
  • the dendrimer is a generation 4 dendrimer of the following formula ( ⁇ ):
  • R ' being as defined above.
  • k 0.
  • At least one of the groups R ' corresponds to the following formula (1'):
  • a 5 and Z are as defined in formula (II), and
  • a 5 is chosen from alkylene radicals, linear or branched, comprising from 1 to 4 carbon atoms.
  • a 5 and L are as defined above.
  • a 5 is chosen from alkylene radicals, linear or branched, comprising from 1 to 4 carbon atoms.
  • a 5 and L are as defined above.
  • a 5 is chosen from alkylene radicals, linear or branched, comprising from 1 to 4 carbon atoms.
  • the antenna responds to one of the following formulas:
  • this may contain a metal, chosen in particular from Ag, Al, As, Au, Cd, Co, Cu, Fe, Ir, Mg, Mn, Ni, Os, Pd, Pt, Rh, Ru, Sb, Sn, V , Zn, La, Ce, Pr, Nd, Sm,
  • a metal chosen in particular from Ag, Al, As, Au, Cd, Co, Cu, Fe, Ir, Mg, Mn, Ni, Os, Pd, Pt, Rh, Ru, Sb, Sn, V , Zn, La, Ce, Pr, Nd, Sm,
  • the dendrimer (D) according to the invention has the following formula:
  • the dendrimer (D) according to the invention has the following formula:
  • L 2 is one of the following antennas:
  • the dendrimer (D) according to the invention corresponds to the formula
  • R2 responds to one of the following formulas:
  • the lanthanide is chosen from the group consisting of Yb, Nd, Ho, Tm, Sm, Dy, Eu, Pr and Er.
  • the present invention also relates to a conjugate comprising a biological molecule and a complex as defined above, wherein said complex is linked to the biological molecule via a linker, said biological molecule being chosen from the group consisting of antibodies, proteins, peptides, carbohydrates, lipids, polysaccharides, fatty acids, amino acids, deoxyribonucleic acids, ribonucleic acids, oligonucleotides, drugs and ligands.
  • the present invention also relates to the use of a complex as defined above as a fluorescent chromophore.
  • fluorescent chromophore refers to a molecule that can re-emit light after excitation with a quantum yield greater than 10 -6 (10 -4 %).
  • the complexes according to the invention may especially be used in the field of cell imaging, veterinary imaging, blood tests, biopsies, histological sectional analyzes, high throughput screening assays, bioanalytical assays. plates 96, 396 and 1536 wells or assisted surgery (guided) by imaging.
  • the present invention also relates to the use of a complex as defined above as a photodynamic therapy agent (PDT).
  • PDT photodynamic therapy agent
  • Figure 1 shows the 1 H NMR spectrum (DMSO, TFA, 40 ° C) of the G3P- (TPP) 32 dendrimer.
  • Figure 2 shows the 1 H NMR spectrum (DMSO, room temperature, suspension in water) of the G3P- (TPP) 32 dendrimer.
  • the absorption spectrum of the compound 9 is multiplied by a factor corresponding to the number of chromophores attached to the branches of the dendrimer, for example, by 16 for (Ln 8 -) G3P- (Bodipy1) 16 and by 32 for (Ln 8 -) G3P- (Bodipy1) 32 .
  • the experiments were carried out for a 10 ⁇ solution in DMSO and under uninterrupted illumination at 670 nm, the emission being collected at 735 nm.
  • Figure 7 shows the confocal microscopy imaging results.
  • the emission of aza-BODIPY (A ex : 633 nm; A em : 650-800 nm) was observed under excitation at 633 nm (6% laser power).
  • Figure 8 represents the results of the study of cellular internalisation by flow cytometry.
  • the HeLa cells were treated with NaN 3 (active internalization inhibitor) or preincubated at 4 ° C for 30 minutes (inhibition of active and passive pathways) before incubation. with the dendrimers.
  • the signal emitted by the aza-Bodipy chromophore was collected ( eg 655 nm ⁇ 40 nm, A em : long pass filter 785 nm, 8 s exposure).
  • Figure 12 shows the results of epifluorescence microscopy imaging on HeLa cells.
  • B luminescence image (A eg 655 bandwidth of 40nm; A em: 750 bandwidth 50 nm; exposure time of (seconds).
  • C Image resulting from the merger of A and B.
  • Figure 13 shows the absorption spectrum of Yb 8 -G3P- (TPP) 32 (1.0 ⁇ ) in DMSO and in the DMSO / (Opti-MEM: FCS) mixture (2.2 ⁇ ) at 298 K .
  • Figure 14 shows the visible emission spectrum of Yb 8 -G3- (TPP) 32 (37 ⁇ ) in DMSO under excitation at 520 nm, 298K.
  • Figure 15 shows the near-infrared emission spectra of Yb 8 -G3- (TPP) 32 (37 ⁇ ) and G3- (TPP) 32 (37 ⁇ ) in DMSO under excitation at 520 nm, 298K .
  • Figure 17 shows the images obtained by epifluorescence microscopy of HeLa cells.
  • A After 1 hr and 30 min of incubation with a 1 ⁇ l solution of Yb-G3P-TPP dendrimer complex.
  • B The same cells after 2 min of selected light exposure with a bandpass filter centered at 417 nm: vesicle formation.
  • C cells not incubated with Yb 8 -G3- (TPP) 32 .
  • This antenna (10) is obtained according to the reaction scheme below
  • nitrobutanone 2 (1.16 mmol, 1 eq.) And 5 eq are dissolved in a flask. of KOH in 100 mL of MeOH / THF (1: 2). The solution is stirred at room temperature for one hour and then added dropwise to a solution of concentrated H 2 SO 4 (2 mL / mmol) dissolved in 100 mL of MeOH at 0 ° C. After the addition is complete, the ice bath is removed and the solution stirred at room temperature for 1 hour. The mixture is then poured into an Erlenmeyer flask containing water and ice and the solution is neutralized by adding a 4M sodium hydroxide solution.
  • the mixture is extracted with dichloromethane and the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and the solvent evaporated under reduced pressure.
  • the residue is dissolved in 100 mL glacial acetic acid and 5 eq. ammonium acetate are added.
  • the solution is heated at reflux for one hour during which the color of the solution changes from yellow to deep blue.
  • the solution is cooled to room temperature and the acetic acid evaporated under reduced pressure.
  • the black solid is then dissolved in dichloromethane and the solution is washed several times with a saturated solution of sodium bicarbonate and brine.
  • the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure.
  • the organic phase is dried, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • the residue is dissolved in a minimum volume of ethanol and excess aqueous solution of sodium acetate and ice are added and the mixture is stirred for one hour.
  • the solution is then extracted with dichloromethane and washed with brine.
  • the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo.
  • the residue is then dissolved in a minimum volume of dichloromethane and the product is precipitated by addition. slow of petroleum ether.
  • the solid is filtered on Buchner and washed with petroleum ether. 0.503 g of nitrosopyrrole 6 (1.81 mmol, 76%) are obtained in the form of a green powder.
  • aqueous phase is then reextracted three times with dichloromethane and the combined organic phases are dried over MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo.
  • the residue is purified by chromatography on silica with a gradient of PE / DCM. Azabodipy 8 is obtained as an iridescent dark blue powder (0.196 g, 0.318 mmol, 99%).
  • azabodipy 8 (0.5 mmol, 1 eq) in a THF / water / H 3 PO 4 mixture (50 mL: 25 mL: 10 mL) is dissolved in a flask. The solution is stirred under reflux for 20 hours until no trace of the ester is visible by TLC. After cooling, the solution is extracted with dichloromethane. The organic phase is washed with brine and then the aqueous phases are re-extracted with dichloromethane until no blue color is observed in the aqueous phase. The organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure. The residue can optionally be purified by chromatography with DCM / MeOH if the ester is still present in the crude. Azabodipy 9 is obtained as a dark blue solid (0.294 g, 0.49 mmol, 98%).
  • This antenna (19) is obtained according to the reaction scheme below:
  • IR (cm 1 ): u 3394, 2948, 2875, 2080, 1496, 1246, 831, 752, 692.
  • This compound (ocher-golden powder) is synthesized by applying the procedure described for the preparation of compound 6.
  • IR (cm 1 ): u 3280, 2918, 2850, 2092, 1603, 1360, 1258, 1,164, 1038, 828, 768, 695, 668.
  • IR (cm 1 ): u 2094, 1759, 1600, 1496, 1241, 1166, 903, 806, 764, 694, 675.
  • the mixture 1,7- and 1,6-dibromoperylene-3,4,9,10-tetracarboxylic dianhydride (1.03 g, 1.8 mmol, 1.0 eq) is solubilized under argon in 20 ml of NMP.
  • hexylamine 0.546 g, 5.4 mmol, 700 ⁇ , 7.3 eq
  • acetic acid 0.32 g, 7.2 mmol, 412 ⁇ , 4.0 eq
  • the reaction mixture is stirred at 85 ° C. under an inert atmosphere for 2 hours. After returning to ambient temperature, the reaction mixture is poured into ethanol. The red precipitate is filtered under vacuum and washed several times with ethanol.
  • the desired mixture P1a and P1b is obtained in the form of a red powder which is used directly in the next reaction.
  • the mixture obtained above (20a, 20b) is solubilized in pyrrolidine.
  • the solution is stirred under an inert atmosphere at 85 ° C. for 16 hours.
  • the aqueous phase is extracted three times with dichloromethane.
  • the organic phases are combined, dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under reduced pressure.
  • the crude reaction product is purified on a chromatographic column on silica gel (eluent: Hexane / ethyl acetate (7/3)) to give the isomer 1, 7 (P2) as a green powder.
  • the organic crude is then dried over Na 2 S0 4 , filtered and evaporated under reduced pressure
  • the crude product is purified on a chromatographic column (eluent: hexane / ethyl acetate (6/4)) to give the compound P3 in the form of a green powder.
  • the compound 23 (135 mg, 1, 9.10 4 mol, 1, 0eq) is solubilized in dry dichloromethane (20 mL). To this solution are added triethylamine (256 ⁇ l, 1.9 mmol, 10.0 eq) and 4-toluenesulfonyl chloride (366 mg, 1.9 mmol, 10.0 eq). The reaction mixture is stirred at ambient temperature under an inert atmosphere for 16 hours. At the end of the reaction, water is added and the organic phase is washed three times with water. The organic phase is then dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under reduced pressure. The crude reaction product is purified on a chromatographic column (Eluent: Hexane / ethyl acetate (8/2)) to give the compound P5 in the form of a green powder.
  • a chromatographic column Eluent: Hexane / ethyl acetate (8/2)
  • Triethylene glycol mono methyl ether (2.0 g, 1.22 ⁇ 10 2 mol, 1.0 eq) is solubilized in 120 ml of dry CH 2 Cl 2 .
  • To this solution are added under argon 4-toluenesulfonyl chloride (4.64 g, 2.43 ⁇ 10 -2 mol, 2.0 eq) and triethylamine (2.68 g, 2.43 ⁇ 10 -2 mol, 2.0 g). eq).
  • the reaction mixture is stirred under an inert atmosphere at ambient temperature for 16 hours.
  • water is added to the reaction mixture and the organic phase is washed three times with water, dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under vacuum.
  • the crude reaction product is purified by chromatography column on silica gel (eluent: CH 2 Cl 2 / MeOH (0.5%)) to give the desired product in the form of a colorless oil.
  • Tetraphenylporphyrin (TPPH, compound 28) was synthesized following the Alder-Rothemund method from a mixture of benzaldehyde and pyrrole in propionic acid, heated at 130 ° C for two hours. The crystalline product was isolated by filtration in 6% yield. The low yield is in agreement with the literature and the synthetic route used.
  • the next step is an electrophilic aromatic substitution, also called aromatic nitration.
  • aromatic nitration is controllable regioselectively in the para position of the phenyl, by varying the amount of sodium nitrite and the reaction time in the TFA. Indeed, after concentrating TPPH in TFA, the latter was treated with 1 .8 equivalents of sodium nitrite for exactly 3 minutes.
  • the reaction mixture was re-engaged without intermediate purification in order to reduce the nitro group to an amino group in the presence of excess of tin chloride and hydrochloric acid.
  • the mono-amino unsymmetric porphyrin (compound 29) was isolated by column chromatography (silica, DCM / Hexane, 9: 1).
  • TPPH TPPH (906 mg, 1.5 mmol, 1.0 equiv) was dissolved in 70 mL of TFA, then sodium nitrite (181 mg, 2.6 mmol, 1.8 equiv) was added. . The solution was stirred at room temperature for exactly 3 minutes. The reaction mixture was then quenched with 200 mL of water. The aqueous solution was extracted with DCM. The organic layer was washed with saturated aqueous NaHCO 3 solution , dried over anhydrous Na 2 SO 4 , filtered and evaporated in vacuo to give a purple solid. The latter was dissolved without purification in 50 ml of concentrated HCl.
  • n equivalents of 9 (4 eq./NH 2 for a total functionalization is 128 eq or 0.5 eq./NH 2 for a hemifunctionalization or 16 eq.), N eq. HBTU and n eq. of DIPEA in 10 mL of dry, degassed DMF.
  • the solution is stirred at room temperature for 15 minutes.
  • 1 eq. of G3P- (NH 2 ) 32 (typically, 0.100 mL of a 12.44% solution of G3P- (NH 2 ) 32 in MeOH, ie 1 .8 ⁇ of dendrimer) are dissolved in 10 mL of anhydrous DMF.
  • argon was bubbled in the dendrimer solution for 5 minutes before adding it to the activated azabodipy solution.
  • the reaction is allowed to stir overnight at room temperature in the dark.
  • the solution is concentrated under reduced pressure to evaporate the maximum of DMF and DIPEA.
  • the pasty blue residue is then dissolved in quality DMSO for analysis, and placed in a bag of dialysis membrane (10 kDa) sealed with tongs.
  • the dialysis rod is immersed in DMSO 3a in a 500 mL Erlenmeyer flask and gently stirred in the dark.
  • the dialysis DMSO is changed every hour on the first day, then every half day on the following days.
  • the functionalized dendrimer solution is recovered inside the flange and the maximum of DMSO evaporated by evaporation under vacuum.
  • Hexynoic acid (428 mg, 3.8 ⁇ 10 -4 mol, 40.0 eq), N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloric acid (592 mg, 3.8 ⁇ 10 -4 mol, 40.0 eq), HOBT (516 mg, 3.8 10 -4 mol, 40.0 eq) and DIPEA are dissolved in 40 mL distilled DMF. The solution is stirred under an inert atmosphere for 30 min. To this solution is added a solution of G3P- (NH 2) 3 2 (660 mg, 9.5 10 -5 mol, 1 .0 eq). The reaction mixture is stirred under an inert atmosphere at 25 ° C.
  • G3P- (Alkyne) 32 (20 mg, 2.0 ⁇ 10 -6 mol, 1.0 eq) and the chromophore bearing an azide function (compound Perylene) (8.0 ⁇ 10 -5 mol, 40 eq) are solubilized in 1 ml of distilled DMF.
  • the solution is degassed under argon for 20min.
  • To this solution is then added a solution of CuSO 4 5H 2 O and sodium ascorbate in H 2 O / DMF (1 ml, 1/1, v / v).
  • the reaction mixture is stirred under an inert atmosphere at room temperature for 24 hours. At the end of the reaction, the solvents are evaporated under reduced pressure and an EDTA solution is added to the reaction crude.
  • G3P- (Alkyne) 32 (20 mg, 2.0 10 -6 mol, 1 0 eq) and the chromophore azide (1, 6.10 "5 mol, 8.0 eq) are solubilized in 1 mL DMF.
  • the solution is degassed under argon for 20 min
  • a solution of CuSO 4 .5H 2 O ( 7 ⁇ 10 -6 mol, 3.5 eq) and sodium ascorbate (7 ⁇ 10 6 mol, 3.5 eq) (1 mL, DMF / H 2 O (1 / 1, v / v)) is then added.
  • the reaction mixture is stirred under argon at 25 ° C for 12 h.
  • the solvents are evaporated under reduced pressure.
  • the reaction crude is triturated in an aqueous solution of EDTA for 5 h and then dialyzed in water (MW 2 kDa).
  • the compound 27 the nitrogenous hydrosolubilizing group (4.0 ⁇ 10 -5 mol, 20.0 eq)
  • the solution is degassed under argon for 20 minutes
  • a solution of CuSO 4 .5H 2 O (2.0.10 "5 mol, 10.0 eq) and sodium ascorbate (2.0 ⁇ 10 -5 mol, 10.0 eq) (1 mL, DMF / H 2 O (1/1, v / v)) is then added
  • the reaction mixture is stirred under argon at 25 ° C.
  • a dendrimer solution in DMSO was treated with 8 eq. of lanthanide nitrate for 7 days at room temperature.
  • the forms of the excitation spectra measured under observation of the emission at 760 nm correspond to those of the absorption spectra ( Figure 4 vs. 3).
  • the characteristic luminescence in the form of narrow bands of Yb 3+ or Nd 3+ ions could not be observed in the near infrared under excitation of the chromophore. This result can be explained by an insufficient capacity of the Bodipy chromophore to sensitize the lanthanides tested or an unbalanced ratio between the number of chromophoric groups and the number of Ln 3+ which could induce the masking of the characteristic signals of the Nd 3+ or Yb 3 + under a broad emission band from organic groups.
  • the fully functionalized dendrimers and their complexes formed with Yb 3+ and Nd 3+ have a very similar photostability with a decrease of only 28-34% of the initial luminescence intensity after 3h of illumination.
  • the partially functionalized dendrimer, the G3P- (Bodipy1) i 6 completely loses its emission signal ( Figure 5, right).
  • the photostability of G3P- (Bodipy1) 16 could be improved by the incorporation of Ln 3+ .
  • the intensity of Nd 8 -G3P- (Bodipy1) 16 is decreased by 40% after 3h of illumination while the emission signal of Yb 8 -G3P- (Bodipy1) 16 after a slight increase of the signal of emission returns to its initial intensity value after 200 min of treatment.
  • compound 9 (FIG. 5) loses 75% of its luminescence intensity after 3 hours of illumination. Therefore, in general, the attachment of the chromophore moieties to the dendrimer structure and the presence of Ln 3+ can be used to advantage to ensure and improve the photostability of the probe. Cytotoxicity of aza-Bodipy-based molecules
  • HeLa cells incubated with aza-BODIPY-COOH show a signal of lower intensity than that observed for Yb 8 -G3P- (aza-BODIPY) 16 (FIG. 7, top: (A) vs. (D)), despite a quantum yield of aza-BODIPY-COOH 3.4 times higher than that of Yb 8 -G3P- (aza-BODIPY) 16 (Table 2).
  • Flow cytometry has been used to quantify cell internalization of dendrimers and to better understand signal intensity differences observed in confocal microscopy.
  • the mechanisms of passive (non-dependent energy) and active (energy dependent) internalisation of cells have been studied. Active transport was inhibited with sodium azide (NaN 3 ), while incubation at 4 ° C inhibited active and passive transport pathways by increasing the plasma membrane stiffness of HeLa cells (S. Vranic, N. Boggetto, V. Contremoulins, S. Mornet, N. Reinhardt, Marano F., A. Baeza-Squiban, S. Boland, Deciphering the mechanisms of cellular uptake of nanoparticles by accurate evaluation of internalization imaging flow cytometry, Particle and Fiber Toxicology, 10 (2013) 1-16).
  • Endocytosis is the main active mechanism allowing entry into the cell (BD Grant, JG Donaldson, Pathways and Mechanisms of Endocytic Recycling, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 1 (2009) 597-608, L. Kou, J. Sun, Y. Zhai, Z. He, The endocytosis and intracellular fate of nanomedicines: implications for rational design, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 8 (201 3) 1-10, D. Vercauteren, RE Vandenbroucke, AT Jones, J Rejman, J. Demeester, SC De Smedt, NN Sanders, K.
  • the excitation on the bands centered on the ligand results in an intense broadband emission centered at 725 nm. No narrow emission bands characteristic of Nd or Yb could be observed in the near infrared.
  • Yb 8 -G3P- (TPP) 32 shows a typical porphyrin emission: two bands in the visible region: centered at 664 nm and 717 nm, Figure 14. A narrow band corresponding to transition 2 F 5/2 ⁇ 2 F 7/2 of the Yb 3+ in the near infrared has been observed, Figure 15. However, the signal seems to be superimposed on the residual emission of the tetraphenylporphyrin chromophore. This result can be explained by a low capacity of the chromophore to sensitize Yb 3+ or an unbalanced ratio between the number of chromophore groups and that of lanthanide cations.
  • the excitation spectrum of Yb 8 -G3- (TPP) 32 shows bands comparable to those observed on the absorption spectrum, thus indicating that the sensitization of Yb 3+ occurs by the transfer of energy from the tetraphenylporphyrin chromophore to the lanthanide cation, Figure 16.

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Abstract

La présente invention concerne un complexe comprenant au moins un dendrimère et au moins un lanthanide, dans lequel le dendrimère comprend un motif de formule (I) suivante : dans laquelle : - C1 est un groupe de valence 4 de formule >N-CH2-CH2-N<; - A1, A2 et A3 sont des groupes de formule -(CH2)2-C(O)-NH-(CH2)2-; ledit motif de formule (I) étant relié de façon covalente à au moins une antenne qui absorbe à une longueur d'onde allant de 500 nm à 900 nm.

Description

COMPLEXES DE LANTHANIDES À BASE DE DENDRIMÈRES
La présente invention a pour objet des complexes de lanthanides à base de dendrimères. En particulier, la présente invention a pour objet des composés dendrimériques, greffés à une antenne, pouvant se complexer aux lanthanides.
Les méthodes liées à la fluorescence (microscopie et macroscopie) présentent les avantages d'être très sensibles, de permettre des mesures en temps réel, peu dangereuses pour les milieux biologiques (en raison de la faible quantité d'agents d'imagerie nécessaires à la condition d'utiliser des longueurs d'onde d'excitation adaptées) et très accessibles (en terme de coûts de fabrication et d'utilisation), de temps expérimentaux, de mobilité et de niveau de spécialisation des utilisateurs.
La grande majorité des fluorophores organiques commerciaux sont fortement photosensibles et se dégradent en présence de lumière d'excitation.
Les rapporteurs fluorescents basés sur des nanocristaux semi-conducteurs constituent une autre gamme de choix d'agents d'imagerie optique. Un autre facteur limitant est la forte toxicité des métaux qui constituent ces nanoparticules (cadmium, tellure et sélénium) dans le cas où ces dernières se dissocient.
La famille des lanthanides inclut 14 éléments aux propriétés optiques extrêmement intéressantes et uniques, caractérisées par des bandes d'émissions précises et étroites, allant du visible au proche infrarouge (> 1 200 nm). Chaque lanthanide possède des propriétés spectrales distinctes et identifiables. Il est ainsi possible de décliner, sur la base d'une même technologie, toute une gamme de longueurs d'ondes différentes par le simple choix de la nature du lanthanide à incorporer dans la molécule. Ces bandes d'émission sont beaucoup plus étroites que celles des fluorophores organiques et des nanoparticules fluorescentes (quantum dots), ce qui autorise une meilleure discrimination spectrale et des essais multiplexes. De plus, la position (en nm) de ces bandes d'émission ne varie pas en fonction de l'environnement (cellulaire, pH, températures, sites hydrophiles/hydrophobes...) ce qui facilite leurs détections et minimise l'adaptation de l'équipement (filtre unique pour un lanthanide donné). En dépit de la forte demande des chercheurs en biologie et des médecins, il n'existe cependant à ce jour aucune sonde fluorescente compatible avec des applications biologiques et fonctionnant en conversion inférieure en énergie à base de lanthanides qui soient idéalement excitables et émetteurs au-dessus de 600 nm, correspondant ainsi à la fenêtre biologique. Globalement, les sondes proches infrarouges actuelles sont de nature organique, les commerciales sont peu nombreuses et souffrent de limitations comme la tendance au photoblanchiment et des déplacements de Stokes restreints.
La présente invention a donc pour but de fournir un complexe dendrimérique polymétallique de lanthanide, émettant dans le proche infrarouge et pouvant être excité dans le proche infrarouge.
Un autre but de l'invention consiste à fournir un système luminescent absorbant et émettant dans le proche infrarouge et permettant d'observer divers systèmes biologiques sans les détruire ou interférer avec leurs fonctionnements.
Un autre but de l'invention consiste à fournir un système luminescent permettant de limiter les signaux parasites de fluorescence/luminescence générés par les matières biologiques (autofluorescence).
Ainsi, la présente invention concerne un complexe comprenant au moins un dendrimère (D) et au moins un lanthanide (Ln), dans lequel le dendrimère (D) comprend un motif de formule (I) suivante :
dans laquelle :
- Ci est un groupe de valence 4 de formule >N-CH2-CH2-N< ;
- A1 ; A2 et A3 sont des groupes de formule -(CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2- ;
ledit motif de formule (I) étant relié de façon covalente à au moins une antenne qui absorbe à une longueur d'onde allant de 500 nm à 900 nm. Les composés luminescents contenant des lanthanides possèdent, parmi d'autres avantages, une spécificité spectrale dans le visible et le proche-infrarouge permettant une discrimination spectrale de par leurs bandes d'émission étroites spécifiques à la nature de chaque lanthanide. Afin d'obtenir une bonne intensité de luminescence, il est important d'introduire des groupes fonctionnels sur la molécule qui la rendent capable d'absorber une grande quantité rayonnement lumineux et de transférer l'énergie résultante sur le lanthanide luminescent permettant d'obtenir l'émission d'un rayonnement de luminescence par retour du lanthanide à l'état fondamental.
Le proche infrarouge offre un grand nombre d'avantages uniques. Il permet de s'affranchir de l'auto-fluorescence des tissus, et de ce fait, permet d'améliorer le rapport signal/bruit et ainsi la sensibilité de détection. Par ailleurs, les tissus biologiques n'absorbent pas ou peu entre 640 nm et 1 100 nm (fenêtre de transparence biologique), ce qui permet une excitation des sondes en profondeur et une observation biologique non invasive (diagnostic et recherche).
En outre, les complexes de lanthanide sont photostables. Cette propriété de photostabilité est cruciale en permettant à l'agent d'imagerie d'être excité i) sur des temps expérimentaux longs et/ou ii) lors d'expériences successives et/ou iii) par des sources d'excitation puissantes (lasers pour microscopie confocale par exemple). Une quantité de photons plus importante peut ainsi être collectée sans perturber ou endommager le fonctionnement du système biologique à étudier (il est important de rappeler ici que la longueur d'onde d'excitation (> 650 nm) interagit extrêmement faiblement avec les fluides et tissus biologiques) et ainsi accroître l'intensité et la qualité du signal collecté.
La structure des dendrimères permet de grouper sur une même molécule une grande densité de lanthanides et d'antennes permettant d'accroître la quantité de photons émis par unité de volume, ce qui augmente l'intensité du signal par molécule et donc la sensibilité de la détection.
La présente invention concerne donc une entité obtenue par complexation entre un dendrimère (D) tel que défini ci-dessus et au moins un lanthanide. Les complexes ainsi obtenus sont des molécules luminescentes.
Les lanthanides sont encapsulés à l'intérieur du dendrimère en raison de la présence d'atomes d'oxygène et d'azote. L'agencement des branches du dendrimère autour des lanthanides les protège partiellement des interactions directes avec les molécules de solvant et d'eau en particulier.
De préférence, les complexes selon l'invention sont obtenus par mise en présence d'un dendrimère (D) avec une solution de lanthanides. Le dendrimère (D) est dissous par exemple dans une solution de DMSO et une solution de sel de lanthanide est ajoutée à la solution contenant le composé (D) notamment dans un rapport huit pour un. Selon un mode de réalisation, le mélange réactionnel a été mélangé et le conjugué dendrimère-lanthanide obtenu a été isolé par dialyse.
Selon un mode de réalisation, dans le composé (D), le motif de formule (I) est relié par l'intermédiaire d'au moins un bras à au moins une antenne telle que définie ci-dessus.
De préférence, parmi les 16 atomes d'azote en périphérie dans la formule (I), l'un au moins est relié de façon covalente à un moins une antenne, par l'intermédiaire d'un bras.
Selon l'invention, le terme "antenne" désigne une entité capable d'absorber une grande quantité de lumière d'excitation de transférer l'énergie correspondante aux lanthanides et /ou d'émettre directement par fluorescence.
De préférence, l'antenne est choisie dans le groupe constitué des anthraquinones, des cyanines, notamment des cyanines 5, cyanines 5,5 et des cyanines 7, des aza-BODIPY, des pérylènediimides, des porphyrines, des sels de phénothiazine et de leurs dérivés.
Parmi les antennes, on peut également utiliser des composés de type « IR dyes » bien connus de l'homme du métier. Parmi ces antennes, on peut par exemple citer les composés suivants :
Ces antennes sont fixées sur les dendrimères via le chlore par substitution et donc dans la forme finale il n'y a pas de chlore mais soit un C, N, S et O.
Selon l'invention, le terme "bras" désigne une entité permettant de relier de façon covalente le motif de formule (I) et l'antenne.
Selon un mode de réalisation, l'antenne est reliée au motif de formule (I) de façon covalente par l'intermédiaire d'au moins un bras répondant à la formule (II) suivante :
-A4-X-[A5-Z]r((A6)rY)k- (II) dans laquelle :
- A4 est un groupe de formule -(CH2)2-X'-(CH2)2-, X' représentant un groupe - C(0)-NH- ou un groupe -NH-C(O)-, et étant de préférence un groupe de formule - (CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2- ;
- X est un groupe de formule -NH-C(O)- ; - i est un nombre entier compris entre 1 et 3 ;
- j est 0 ou 1 ;
- k est 0 ou 1 ;
- A5 et A6 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les radicaux (cyclo)alkylènes, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi les groupes -O-, -NH-, -S-, amide, ester, triazole, aminé, éther, thioéther, urée, thiourée, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate, disulfure et sulfonyle ; et
- Y est choisi parmi les groupes -O-, -NH-, -S-, alkylène, amide, ester, triazole, aminé, éther, thioéther, urée, thiourée, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate, disulfure et sulfonyle.
Dans la formule (II) telle que définie ci-dessus, c'est par l'intermédiaire du radical A4 que le bras se lie au dendrimère (en particulier au motif de formule (I) susmentionnée) et c'est par l'intermédiaire de Y, ou de Z lorsque k=0, que le bras se lie à l'antenne.
Selon un mode de réalisation préféré, le dendrimère répond à la formule suivante :
Ci-{A1-N[A2-N(A3-N(A4-R')2)2]2}4 (III) dans laquelle :
- Ci est un groupe de valence 4 de formule >N-CH2-CH2-N< ;
- A2, A3 et A4 sont des groupes de formule -(CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2- ;
- les radicaux R' sont choisis, indépendamment les uns des autres, dans le groupe constitué :
. des groupes de formule (1 ) suivante :
-NH-C(0)-[A5-Z]r((A6)rY)k-L
i, j, k, A5, A6, Z et Y étant tels que définis dans la formule (II),
L représentant une antenne choisie dans le groupe constitué des anthraquinones, des cyanines, des aza-BODIPY, des pérylènediimides, des porphyrines, des sels de phénothiazine et de leurs dérivés ; . des groupes de formule (2) suivante :
-NH-C(0)-[A5-Z]r((A6)rY)k-L'
i, j, k, A5, A6, Z et Y étant tels que définis dans la formule (II),
L' représentant un groupe hydrosolubilisant ou un groupe ciblant ; et . des groupes de formule (3)
-NH-C(0)-A5-L"
A5 étant tel que défini dans la formule (II), et
L" représentant une fonction pouvant être impliquée dans une réaction de bioconjugaison, et étant de préférence un groupe alcyne ; l'un au moins des groupes R' répondant à la formule (1 ).
Selon l'invention, le terme "groupe hydrosolubilisant" désigne une entité chimique permettant d'accroître la solubilité de la sonde dans les milieux aqueux.
Parmi les groupes hydrosolubilisants, on peut citer par exemple les phosphates, les sulfonates, les sucres et les chaînes PEG.
Selon l'invention, le terme "groupe ciblant" désigne une molécule, biologique ou non, capable de reconnaître et/ou de se lier un site biologique spécifique.
Parmi les groupes ciblants, on peut citer par exemple des anticorps, des protéines, des peptides, des glucides, des lipides, des polysaccharides, des acides gras, des acides aminés, des acides désoxyribonucléiques, des acides ribonucléiques, des oligonucléotides, des médicaments et des ligands.
Parmi les groupes hydrosolubilisants et les groupes ciblants, on peut notamment citer les groupes suivants :
La formule (II) ci-dessus contient 32 groupes R' en périphérie parmi lesquels l'un au moins comprend une antenne reliée au dendrimère par l'intermédiaire d'un bras. Ainsi, les dendrimères selon l'invention peuvent comprendre au moins un bras par l'intermédiaire duquel est liée au moins une antenne. Ainsi, comme indiqué ci-dessus, l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1 ) susmentionnée.
Selon un mode de réalisation, le dendrimère est un dendrimère de génération 4 de formule (ΙΙΓ) suivante :
Ci-{A1-N[A2-N(A3-N(A4-N[(CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2-R']2)2)2]2}4
R' étant tel que défini ci-dessus.
De préférence, dans la formule (1 ), k=0.
De préférence, dans la formule (1 ), k=0 et i=1 .
Selon un mode de réalisation, dans la formule (II), l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1 ') suivante :
-NH-C(0)-A5-Z-L
A5 et Z étant tels que définis dans la formule (II), et
L étant tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, dans la formule (II), tous les groupes R' identiques répondent à la formule (1 ').
De préférence, dans la formule (1 ') ci-dessus, A5 est choisi parmi les radicaux alkylènes, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone.
De préférence, dans la formule (1 ') ci-dessus, Z est choisi dans le groupe constitué des groupes -O-, -NH-, -S-, -C(=0)-0-, -0-C(=0)-, -NH-C(=0)-, -N(Alk)- C(=0)-, -C(=0)-NH- et -C(=0)-N(Alk)-, Alk représentant un groupe alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
Selon un mode de réalisation, dans la formule (II), l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1 ") suivante :
A5 et L étant tels que définis ci-dessus.
De préférence, dans la formule (1 ") ci-dessus, A5 est choisi parmi les radicaux alkylènes, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone.
Selon un mode de réalisation, dans la formule (II), tous les groupes R' identiques répondent à la formule (1 "). Selon un mode de réalisation, dans la formule (II), l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1 "') suivante :
-NH-C(0)-A5-0-L
A5 et L étant tels que définis ci-dessus.
De préférence, dans la formule (1 "') ci-dessus, A5 est choisi parmi les radicaux alkylènes, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone.
Selon un mode de réalisation, dans la formule (II), tous les groupes R' identiques répondent à la formule (1 "').
Selon un mode de réalisation, l'antenne répond à l'une des formules suivantes :
Lorsque l'antenne répond à la formule
celle-ci peut contenir un métal, notamment choisi parmi Ag, Al, As, Au, Cd, Co, Cu, Fe, Ir, Mg, Mn, Ni, Os, Pd, Pt, Rh, Ru, Sb, Sn, V, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Sm,
Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb et Lu.
De préférence, le dendrimère (D) selon l'invention répond à la formule suivante :
De préférence, le dendrimère (D) selon l'invention répond à la formule suivante :
dans laquelle L2 est l'une des antennes suivantes : De préférence, le dendrimère (D) selon l'invention répond à la formule
dans laquelle :
- L2 répond à l'une des formules suivantes :
- R2 répond à l'une des formules suivantes :
Selon un mode de réalisation, dans les complexes selon l'invention, le lanthanide est choisi dans le groupe constitué de Yb, Nd, Ho, Tm, Sm, Dy, Eu, Pr et Er.
La présente invention concerne également un conjugué comprenant une molécule biologique et un complexe tel que défini ci-dessus, dans lequel ledit complexe est lié à la molécule biologique par l'intermédiaire d'un linker, ladite molécule biologique étant choisie dans le groupe constitué des anticorps, des protéines, des peptides, des glucides, des lipides, des polysaccharides, des acides gras, des acides aminés, des acides désoxyribonucléiques, des acides ribonucléiques, des oligonucléotides, des médicaments et des ligands.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe tel que défini ci-dessus, comme chromophore fluorescent.
Selon l'invention, le terme "chromophore fluorescent" désigne une molécule pouvant réémettre de la lumière après excitation avec un rendement quantique supérieur à 10"6 (10"4%).
Les complexes selon l'invention peuvent notamment être utilisés dans le domaine de l'imagerie cellulaire, de l'imagerie vétérinaire, des analyses sanguines, des biopsies, des analyses de coupes histologiques, des analyses de criblage à haut débit, des essais bioanalytiques sur plaques 96, 396 et 1536 puits ou encore de la chirurgie assistée (guidée) par imagerie.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe tel que défini ci-dessus, comme agent de thérapie photodynamique (PDT).
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente le spectre 1 H NMR (DMSO, TFA, 40°C) du dendrimère G3P-(TPP)32.
La Figure 2 représente le spectre 1 H RMN (DMSO, température ambiante, suspension dans l'eau) du dendrimère G3P-(TPP)32.
La Figure 3 représente les spectres d'absorption d'une solution du composé 9 à une concentration de 10μΜ et de (Ln8-) G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3+) mesurés à température ambiante dans le DMSO. Dans un souci de comparaison, le spectre d'absorption du composé 9 est multiplié par un facteur correspondant au nombre de chromophores attachés au branches du dendrimère, exemple, par 16 pour (Ln8-) G3P-(Bodipy1 )16 et par 32 pour (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )32.
La Figure 4 représente les spectres d'excitation (Aem = 750 nm, graphique gauche) et d'émission (Aex = 650 nm, graphique droit) normalisés d'une solution de concentration 10μΜ de composé 9 et de (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3+) mesurés dans le DMSO à température ambiante.
La Figure 5 représente les résultats d'une expérience de photoblanchiment pour le composé 9 et (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3+). Les expériences ont été réalisées pour une solution à 10μΜ dans le DMSO et sous une illumination ininterrompue à 670 nm, l'émission étant collectée à 735 nm.
La Figure 6 représente les résultats des tests de cytotoxicité à l'Alamar Blue réalisés pour différentes concentration de chromophores (composé 9) et de dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3+) après 24h d'incubation sur des cellules HeLa.
La Figure 7 représente les résultats d'imagerie par microscopie confocale. Cellules HeLa après 30 minutes d'incubation avec une solution de 1 .5 μΜ de composé 9 et de dendrimère (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3+). L'émission de l'aza-BODIPY (Aex : 633nm ; Aem : 650-800 nm) a été observée sous excitation à 633 nm (puissance laser à 6%). (Haut) Yb8-G3P-(Bodipy1 )i6 (A), Nd8- G3P-(Bodipy1 )16 (B), G3P-(Bodipy1 )16 (C), composé 9 (D) et (bas) Yb8-G3P- (Bodipy1 )32 (A), Nd8-G3P-(Bodipy1 )32 (B), G3P-(Bodipy1 )32 (C), cellules non traitées (D). Les images sont prises dans le plan du noyau cellulaire. Les flèches blanches indiquent la localisation spécifique des dendrimères dans les lysosomes et les flèches jaunes indiquent les filopodes. Objectif de grossissement 63x.
La Figure 8 représente les résultats de l'étude de l'internalisation cellulaire par cytométrie en flux. Des cellules HeLa ont été incubées pendant 30 minutes avec une solution de concentration 1 ,5 μΜ de chromophores et de dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3+) comme contrôle. Afin de bloquer les voies de transport actives et passives, les cellules HeLa ont été traitées avec du NaN3 (inhibiteur de l'internalisation active) ou pré-incubées à 4°C pour 30 minutes (inhibition des voies actives et passives) avant incubation avec les dendrimères.
La Figure 9 représente des résultats d'imagerie en microscopie par épifluorescence sur des cellules HeLa après 30 minutes d'incubation avec une solution 1 .5 μΜ de composé 9 et de dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3+). Le signal émis par le chromophore aza-Bodipy a été collecté (Aex: 655 nm ± 40 nm; Aem: filtre passe long 785 nm, 8 s d'exposition). (Haut) Yb8-G3P- (Bodipy1 )16 (A), Nd8-G3P-(Bodipy1 )16 (B), G3P-(Bodipy1 )16 (C), Composé 9 (D) et (bas) Yb8-G3P-(Bodipy1 )32 (A), Nd8-G3P-(Bodipy1 )32 (B), G3P-(Bodipy1 )32 (C), cellules non traitées (D).
La Figure 10 représente des spectres d'absorption et d'émission du G3P- (Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) dans DMSO à température ambiante.
La Figure 1 1 représente les résultats des tests de photostabilité des complexes (Ln8-)G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10, Ln = Yb, Nd) sous excitation à 665 nm (DMSO, température ambiante, Aem = 725 nm).
La Figure 12 représente les résultats d'imagerie de microscopie d'épifluorescence sur des cellules HeLa. (Haut) Après 3h d'incubation avec une solution 2,5 μΜ de (Nd8-)G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) et (bas) cellules non traitées. A: image obtenue dans la lumière blanche. B: image de luminescence (Aex: 655 de bande passante de 40nm; Aem: 750 de bande passante de 50 nm; durée d'exposition de (secondes). C: Image résultant de la fusion de A et B.
La Figure 13 représente le spectre d'absorption du Yb8-G3P-(TPP)32 (1 ,0 μΜ) dans le DMSO et dans le mélange DMSO / (Opti-MEM: FCS) (2,2 μΜ) à 298 K.
La Figure 14 représente le spectre d'émission dans le visible de Yb8-G3- (TPP)32 (37 μΜ) dans le DMSO sous excitation à 520 nm, 298K.
La Figure 15 représente les spectres d'émission dans le proche-infrarouge de Yb8-G3-(TPP)32 (37 μΜ) et de G3-(TPP)32 (37 μΜ) dans du DMSO sous excitation à 520 nm, 298K.
La Figure 16 représente les spectres d'absorption et d'excitation (Aem = 977 nm) du complexe Yb8-G3-(TPP)32 dans le DMSO normalisés sur l'intensité de la bande à 650 nm.
La Figure 17 représente les images obtenues par microscopie d'épifluorescence de cellules HeLa. (A) Après 1 h et 30 min d'incubation avec une solution 1 μΜ de complexe de dendrimère Yb-G3P-TPP. (B) Les mêmes cellules après 2 min d'exposition à la lumière sélectionnée avec un filtre à bande passante centrée à 417 nm : formation des vésicules. (C) cellules non incubées avec Yb8-G3- (TPP)32.
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse de dendrimères (D) selon l'invention 1. Préparation d'antennes de type aza-BODIPY
1.1. Préparation du tert-butyl N-[2-[[2-[4-[(2Z)-2-[1-difluoroboranyl-3-(4- méthoxyphényl)-5-phényl-pyrrol-2-yl]imino-5-phényl-pyrrol-3-yl]phénoxy] acétyl]amino]éthyl]carbamate ( 10)
Cette antenne (10) est obtenue selon le schéma réactionnel ci-dessous
67% 1
Synthèse de (£)-3-(4-méthoxyphényl)-1-phénylprop-2-èn-1-one (1 )
Dans un ballon sont dissous 8,94 mL de para-anisaldéhyde (10 g, 73,45 mmol, 1 eq.) et 8,58 mL d'acétophénone (8,825 g, 73,45 mmol, 1 eq.) dans 150 mL d'éthanol. Le ballon est plongé dans un bain de glace et 5,876 g de soude (149,9 mmol, 2 eq.) dissouts dans 50 mL d'eau sont ajoutés goutte à goutte. On laisse la solution remonter à température ambiante et être agitée toute la nuit. Le lendemain, le ballon est mis dans un bain de glace et de l'eau froide est ajoutée au mélange. Un précipité jaune se forme et le mélange est filtré sur fritté et lavé à l'eau. Le précipité est ensuite recristallisé dans l'éthanol fournissant 1 1 ,698 g de la chalcone 1 (49.1 mmol, 67%) sous forme de cristaux blancs.
1 H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) δ 8,06 - 7,97 (m, 2H), 7,79 (d, J = 15,0 Hz, 1 H), 7,64 - 7,59 (m, 2H), 7,58-7,45 (m, 3H), 7,42 (d, J = 15,6 Hz, 1 H), 6,98-6,91 (m, 2H), 3,86 (s, 3H). Synthèse de 3-(4-méthoxyphényl)-4-nitro-1-phénylbutan-1 -one (2)
Dans un ballon sont dissous 0,546 g (2,29 mmol, 1 eq.) de 1 , 0,621 mL de nitrométhane (1 1 ,46 mmol, 5 eq.) et 1 ,185 mL de diéthylamine (1 1 ,46 mmol, 5 eq.) dans 150 mL de méthanol. La solution est chauffée à reflux toute la nuit. Une fois la réaction terminée, le solvant est évaporé sous vide et le résidu dissous dans le dichlorométhane. La solution est lavée avec une solution de KHS04 1 M puis NaCI saturée. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS04, filtrée et concentrées sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur silice avec éther de pétrole/acétate d'éthyle fournissant la nitrobutanone 2 (0,654 g, 2,18 mmol, 95%) sous forme d'un huile visqueuse jaune pâle.
1 H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) δ 7,96 - 7,88 (m, 2H), 7,63 - 7,53 (m, 1 H), 7,51 - 7,41 (m, 2H), 7,25 - 7,16 (m, 2H), 6,91 - 6,81 (m, 2H), 4,80 (ddd, J = 12,3, 6,7, 0,5 Hz, 1 H), 4,65 (ddd, J = 12,3, 7,9, 0,4 Hz, 1 H), 4,18 (p, J = 7,0 Hz, 1 H), 3,78 (s, 3H), 3,42 (dd, J = 7,0, 2,1 Hz, 2H).
Synthèse de 4-(4-méthoxyphényl)-2-phényl-1 H-pyrrole (3)
Dans un ballon sont dissous 3,5 g de nitrobutanone 2 (1 1 .69 mmol, 1 eq.) et 5 eq. de KOH dans 100 mL d'un mélange MeOH/THF (1 :2). La solution est agitée à température ambiante durant une heure et est ensuite ajoutée goutte à goutte à une solution de H2S04 concentré (2 mL/mmol) dissoute dans 100 mL de MeOH à 0°C. Une fois l'addition terminée, le bain de glace est enlevé et la solution agitée à température ambiante pendant 1 h. Le mélange est ensuite versé dans un erlenmeyer contenant de l'eau et de la glace et la solution est neutralisée en ajoutant une solution de soude 4M. Une fois neutralisée, le mélange est extrait avec du dichlorométhane et la phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et le solvant évaporé sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 100 mL d'acide acétique glacial et 5 eq. d'acétate d'ammonium sont ajoutés. La solution est chauffée à reflux durant une heure pendant laquelle la couleur de la solution évolue du jaune au bleu profond. La solution est ramenée à température ambiante et l'acide acétique évaporé sous pression réduite. Le solide noir est alors dissous dans le dichlorométhane et la solution est lavée plusieurs fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium et de saumure. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu est ensuite dissous dans un minimum de dichlorométhane et de l'éther de pétrole est ajouté lentement jusqu'à ce que se forme un précipité. Le précipité est filtré sur Buchner et lavé plusieurs fois à l'éther de pétrole. Le pyrrole 3 est obtenu avec un rendement de 60% (1 .742 g, 6.99 mmol) sous forme d'une poudre légèrement colorée.
1 H RMN (250 MHz, DMSO-cfe) δ 1 1 ,32 (s, 1 H), 7,66 (dt, J = 7,7, 1 ,1 Hz, 2H), 7,57 - 7,48 (m, 2H), 7,36 (dd, J = 8,4, 7,0 Hz, 2H), 7,21 (dd, J = 2,8, 1 ,7 Hz, 1 H), 7,20 - 7,12 (m, 1 H), 6,94 - 6,84 (m, 3H), 3,75 (s, 3H).
Synthèse de 4-(5-phényl-1 H-pyrrol-3-yl)phénol (4)
Dans un ballon sous argon sont dissous 0,546 g de pyrrole 3 (2,19 mmol, 1 eq.) dans 100 mL de dichlorométhane anhydre. La solution est refroidie à -78°C et 5,48 mL d'une solution de BBr3 1 M dans le dichlorométhane (5,48 mmol, 2,5 eq.) sont ajoutés lentement. La réaction est agitée 3 h à -78°C puis toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, la solution est refroidie à -78°C et du MeOH est ajouté au mélange. La solution est agitée pendant une heure puis elle est diluée dans du dichlorométhane et lavée avec du NaCI saturé. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu est dissout dans un minimum de dichlorométhane et le produit est précipité par ajout lent d'éther de pétrole. Le précipité est filtré sur Buchner et lavé à l'éther de pétrole fournissant 0,495 g (2,10 mmol, 96%) du pyrrole 4 sous forme d'une poudre blanche légèrement violacée.
1 H RMN (250 MHz, DMSO-d6) δ 1 1 .25 (s, 1 H), 9.15 (s, 1 H), 7.69 - 7.61 (m, 2H), 7.43 - 7.31 (m, 4H), 7.20 - 7.1 1 (m, 2H), 6.81 (dd, J = 2.7, 1 .7 Hz, 1 H), 6.77 - 6.69 (m, 2H).
1 H RMN (250 MHz, acétone-cfe) δ 10,48 (s, 1 H), 8,09 (s, 1 H), 7,71 - 7,65 (m, 2H), 7,49 - 7,41 (m, 2H), 7,41 - 7,31 (m, 2H), 7,21 - 7,14 (m, 2H), 6,85 (dd, J = 2,8, 1 ,7 Hz, 1 H), 6,84 - 6,80 (m, 2H).
13C RMN (63 MHz, Acétone) δ 156,27, 134,16, 133,40, 129,58, 128,76, 126,92, 126,80, 126,55, 124,38, 1 16,24, 1 15,94, 104,14.
LRMS : calculé : 235,0997, mesuré [M+H]+ : 236,1
IR (cm 1) : 3443, 3300, 1600, 1581 , 1494, 1244, 1 132, 921 , 834, 804, 778, 751 , 717, 690, 609.
Mp : 209°C Synthèse de méthyl 2-(4-(5-phényl-1 H-pyrrol-3-yl)phénoxy)acétate (5)
Dans un ballon sont dissous 0,725 g de 4 (3,08 mmol, 1 eq.) dans 60 ml_ de DMF. 1 ,278 g de K2C03 (9,24 mmol, 3 eq.), 1 ,08 ml_ de chloroacétate de méthyle (12,33 mmol, 4 eq.) et une quantité catalytique de bromure de potassium sont ajoutés à la solution qui est agitée à température ambiante toute la nuit. La solution est ensuite extraite à l'éther diéthylique et lavée trois fois avec de la saumure. La phase aqueuse est ensuite extraite trois fois avec de l'éther diéthylique. Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur MgS04, filtrées et le solvant évaporé sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de dichlorométhane et de l'éther de pétrole est ajouté jusqu'à formation d'un précipité. Le précipité est filtré sur Buchner et lavé à l'éther de pétrole pour obtenir 0,553 g de 5 sous forme d'une poudre blanc cassé.
1 H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) δ 8,43 (s, 1 H), 7,55 - 7,46 (m, 4H), 7,44 - 7,35 (m, 2H), 7,25 - 7,19 (m, 1 H), 7,07 (dd, J = 2,7, 1 ,7 Hz, 1 H), 6,97 - 6,88 (m, 2H), 6,76 (dd, J= 2,8, 1 ,7 Hz, 1 H), 4,66 (s, 2H), 3,82 (s, 3H).
13C RMN (63 MHz, CDCI3) δ 169,57, 156,10, 133,02, 132,51 , 129,56, 128,93, 126,45, 126,38, 126,1 1 , 123,83, 1 14,98, 1 14,94, 103,86, 65,58, 52,25.
LRMS : calculé : 307,1208, mesuré [M+H]+ : 308,4
IR (cm 1) : 3430, 2941 , 1759, 1600, 1581 , 1496, 1438, 1212, 1 178, 1 131 , 1075, 834, 801 , 774, 758, 719, 693.
Mp : 165°C.
Synthèse de 3-(4-méthoxyphényl)-2-nitroso-5-phényl-1 H-pyrrole (6)
Dans un ballon à température ambiante sont dissous 0,593 g de pyrrole 3 (2,38 mmol, 1 eq.) dans 50 mL d'éthanol et 0,48 mL d'HCI concentré (0,2 mL/mmol). 0,189 g de nitrite de sodium (2,74 mmol, 1 ,15 eq.) dissous dans de l'eau (concentration 0,6 mol/L) sont ajoutés goutte à goutte. La solution est agitée 30 minutes et est ensuite refroidie à 0°C. Une deuxième portion d'HCI concentré (2,38 mL, 1 mL/mmol) est ajoutée. La solution est agitée une heure puis, elle est dissoute dans du dichlorométhane et lavée avec de la saumure. La phase organique est séchée, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu est dissous dans un volume minimal d'éthanol et un excès de solution aqueuse d'acétate de sodium et de glace sont ajoutés et le mélange est agité une heure. La solution est ensuite extraite au dichlorométhane et lavée avec de la saumure. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu est ensuite dissous dans un volume minimal de dichlorométhane est le produit est précipité par addition lente d'éther de pétrole. Le solide est filtré sur Buchner et lavé avec de l'éther de pétrole. 0,503 g de nitrosopyrrole 6 (1 ,81 mmol, 76%) sont obtenus sous forme d'une poudre verte.
1 H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) δ 8,20 - 8,13 (m, 2H), 7,79 (dd, J = 6,9, 3,0 Hz, 2H), 7,51 (dd, J = 5,1 , 1 ,8 Hz, 3H), 7,07 (s, 1 H), 7,02 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 3,89 (s, 3H).
Synthèse de (Z)-méthyl 2-(4-(2-((3-(4-méthoxyphényl)-5-phényl-1 H-pyrrol- 2-yl)imino)-5-phényl-2H-pyrrol-3-yl)phénoxy)acétate (7)
Dans un ballon sont dissous dans 20 mL d'acide acétique glacial 0,1 12 g de nitrosopyrrole 6 (0,40 mmol, 1 eq.), 0,124 g de pyrrole 5 (0,40 mmol, 1 eq. et 0,40 mL d'anhydride acétique. La solution est agitée et chauffée à reflux pendant une heure durant laquelle la coloration passe au bleu foncé. La solution est ensuite refroidie et le solvant évaporé sous pression réduite. Le résidu est ensuite dissous dans du dichlorométhane et la solution est lavée avec NaHC03 saturé et NaCI saturé. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu est ensuite dissous dans un minimum de dichlorométhane et de l'éther de pétrole est ajouté jusqu'à formation d'un précipité qui est filtré sur Buchner et lavé à l'éther de pétrole. L'azadipyrrométhène 7 est obtenu sous forme d'une poudre bleu foncé (0,197 g, 0,35 mmol, 87%).
1 H RMN (250 MHz, Chloroform-d) δ 8,05 - 7,98 (m, 4H), 7,93 (ddd, J = 7,8, 6,4, 1 ,5 Hz, 4H), 7,58 - 7,44 (m, 7H), 7,1 1 (s, 1 H), 7,09 (s, 1 H), 6,96 (dd, J = 8,9, 1 ,8 Hz, 4H), 4,71 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,85 (s, 3H).
IR (cm 1) : 3426, 2948, 1758, 1597, 1495, 121 1 , 1 175, 1075, 1002, 902, 833, 801 , 772, 759, 745, 718, 692, 637, 605.
Mp : 230°C.
HRMS (ESI) : m/z calculé pour [C36H30N3O4] : 568,223083, mesuré 568,222834 (-0,4 ppm)
Synthèse de (Z)-méthyl 2-(4-(2-((1-(difluoroboryl)-3-(4-méthoxyphényl)-5- phényl-1 H-pyrrol-2-yl)imino)-5-phényl-2H-pyrrol-3-yl)phénoxy)acétate (8)
Dans un ballon sous argon sont dissous 0,183 g d'azadipyrrométhène 7 (0,32 mmol, 1 eq.) et 0,548 mL de DIPEA (3,22 mmol, 10 eq.) dans du dichlorométhane fraîchement distillé. Après quelques minutes d'agitation à température ambiante, 0,613 mL de BF3.Et20 distillé (4,84 mmol, 15 eq.) sont ajoutés et la solution est portée à reflux durant deux heures. La solution est ensuite refroidie à température ambiante et la phase organique est lavée avec de la saumure trois fois. La phase aqueuse est ensuite réextraite trois fois avec du dichlorométhane et les phases organiques combinées sont séchées sur MgS04, filtrées et concentrées sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur silice avec un gradient de PE/DCM. L'azabodipy 8 est obtenu sous forme d'une poudre bleu foncé iridescente (0,196 g, 0,318 mmol, 99%).
1 H RMN (400 MHz, Acétone-cfe) δ 8,23 (dd, J = 8,8, 6,2 Hz, 4H), 8,18 - 8,09 (m, 4H), 7,58 - 7,46 (m, 6H), 7,33 (d, J = 1 ,4 Hz, 2H), 7,14 (dd, J = 9,0, 7,2 Hz, 4H), 4,88 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,79 (s, 3H).
13C RMN (101 MHz, Acétone) δ 169,66, 162,39, 160,53, 132,72, 131 ,94, 131 ,87, 131 ,70, 131 ,62, 130,55, 130,51 , 129,36, 125,87, 1 18,92, 1 15,83, 1 15,26, 65,70, 55,88, 52,29.
19F RMN (235 MHz, Acétone-d6) δ -130,38 (dd, J= 62,8 - 31 ,4 Hz).
HRMS (ESI) : m/z calculé pour [C36H29BF2N3O4] : 616,221996, mesuré 616,221217 (-1 ,3 ppm)
Mp : 179°C
IR (cm 1) : 3288, 2918, 2584, 1758, 1728, 1601 , 1504, 1487, 1454, 1388, 1277, 1252, 1228, 1 175, 1 129, 1 100, 1068, 1024, 999, 970, 929, 904, 868, 836, 818, 767, 742, 690, 641 , 615.
Synthèse de l'acide (Z)-2-(4-(2-((1-(difluoroboryl)-3-(4-méthoxyphényl)-5- phényl-1 H-pyrrol-2-yl)imino)-5-phényl-2H-pyrrol-3-yl)phénoxy)acétique (9)
Dans un ballon est dissous 0,308 g d'azabodipy 8 (0,5 mmol, 1 eq.) dans un mélange THF/eau/H3P04 (50 mL : 25 mL : 10 mL). La solution est agitée sous reflux 20h jusqu'à ce qu'aucune trace de l'ester ne soit visible par CCM. Après refroidissement, la solution est extraite au dichlorométhane. La phase organique est lavée avec de la saumure puis, les phases aqueuses sont réextraites au dichlorométhane jusqu'à ce qu'aucune coloration bleue ne soit observée dans la phase aqueuse. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous pression réduite. On peut éventuellement purifier le résidu par chromatographie avec DCM/MeOH si de l'ester est encore présent dans le brut. L'azabodipy 9 est obtenu sous forme d'un solide bleu foncé (0,294 g, 0,49 mmol, 98%).
1 H RMN (250 MHz, Acétone-d6) δ 8,27-8,18 (m, 4H), 8,18-8,09 (m, 4H), 7,57- 7,48 (m, 6H), 7,32 (d, J= 1 ,8 Hz, 2H), 7,19-7,08 (m, 4H), 4,86 (s, 2H), 3,91 (s, 3H). HRMS (ESI) : m/z calculé pour [C35H27BF2N3O4] : 602,206329, mesuré 602,205753 (1 ,0 ppm)
Synthèse de tert-butyl N-[2-[[2-[4-[(2Z)-2-[1 -difluoroboranyl-3-(4- méthoxyphényl)-5-phényl-pyrrol-2-yl]imino-5-phényl-pyrrol-3-yl]phénoxy] acétyl]amino]éthyl]carbamate (10)
Dans un ballon sous argon sont dissous 0,080 g de 9 (0,13 mmol, 1 eq.), 0,070 mL de DIPEA (0,40 mmol, 3 eq.) et 0,076 g de HBTU (0,20 mmol, 1 ,5 eq.) dans 5 mL de dichlorométhane et 1 mL d'acétonitrile distillés. La réaction est agitée 15 minutes puis on ajoute 0,032 g de Boc-éthylène diamine (0.20 mmol, 1 .5 eq.) dissouts dans 2 mL de dichlorométhane anhydre. La réaction est agitée 1 h30. Ensuite, la solution est extraite au dichlorométhane et lavée successivement avec KHSO4 1 M, NaHC03 sat. et NaCI sat. Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur MgS04, filtrées et concentrées sous vide. Le résidu est ensuite purifié par chromatographie sur silice avec un mélange PE/EA fournissant 0,069 g d'un solide bleu profond aux reflets métalliques (0,093 mmol, 71 %).
1 H RMN (250 MHz, Chloroforme-d) δ 8,10 - 7,98 (m, 8H), 7,51 - 7,44 (m, 6H), 7,02 (dd, J = 9,0, 8,1 Hz, 4H), 6,94 (d, J = 1 ,1 Hz, 2H), 4,88 (s, 1 H), 4,58 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,50 (q, J = 5,6 Hz, 2H), 3,35 (dd, J = 12,1 , 6,0 Hz, 2H), 2,80 (s, 3H), 1 ,43 (s, 9H).
13C RMN (101 MHz, CDCI3) δ 131 ,13, 131 ,08, 130,96, 130,79, 129,66, 128,69, 125,36, 1 17,98, 1 17,94, 1 15,03, 1 14,42, 67,41 , 55,65, 38,76, 28,49.
HRMS : [M+H]+ C24H41 BF2N5O5 m/z calculé 744,317054, mesuré 744316900 (0.2 ppm).
1.2. Préparation du 2-[4-[(2Z)-2-[5-[4-[4-(tert-butoxycarbonylamino) butoxy]phényl]-1-difluoroboranyl-3-phényl-pyrrol-2-yl]imino-5-ph
yl]phénoxy]acétate de méthyle (19)
Cette antenne (19) est obtenue selon le schéma réactionnel ci-dessous :
85%
Synthèse de (E)-1-(4-méthoxyphényl)-3-phényl-prop-2-èn-1 -one (10')
Dans un ballon sont dissous 15 g de paraméthoxyacétophénone (0,1 mol, 1 eq.), 10,1 ml_ de benzaldéhyde (0,1 mol, 1 eq.) et 400 mg de NaOH (10 mmol, 0,1 eq.) dans du méthanol. La solution est agitée à reflux toute la nuit. De l'eau froide est ensuite ajoutée au mélange et le précipité formé est filtré et lavé à l'eau. La chalcone 10' est recristallisée dans le méthanol sous forme de cristaux blancs avec un rendement de 85% (20,254 g, 85 mmol).
RMN 1 H (CDCI3, 250 MHz): 8,08-8,01 (tt, 2H), 7,80 (d, J = 15,7 Hz, 1 H), 7,67- 7,61 (m, 2H), 7,54 (d, J = 15,7 Hz, 1 H), 7,44-7,37 (m, 3H), 7,01 -6,94 (tt, 2H), 3,87 (s, 3H).
Synthèse de 1 ((4-méthoxyphényl)-4-nitro-3-phényl-butan-1-one (11 )
Ce composé est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 2.
Masse obtenue : 3,205 g ; 10,71 mmol
Rendement 85%.
RMN 1 H (CDCI3, 400 MHz) : 7,88-7,86 (d, 2H), 7,31 -7,21 (m, 5H), 6,90-6,88 (d, 2H), 4,80 (ddd, J = 12,6 Hz, 6,4 Hz, 1 ,3 Hz, 1 H), 4,65 (ddd, J = 12,6 Hz, 8,3 Hz 1 ,3 Hz), 4,18 (p, J= 7,1 Hz, 1 H), 3,82 (s, 3H), 3,42-3,29 (m, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 101 MHz) : 195,39, 163,88, 139,39, 130,39, 129,52, 129,06, 127,83, 127,51 , 1 13,93, 79,68, 55,56, 41 ,22, 39,49.
Synthèse de 2-(4-méthoxyphényl)-4-phényl-1 H-pyrrole (12)
Ce composé est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 3.
Masse obtenue : 1 ,917 g ; 7,69 mmol
Rendement : 62%
RMN 1 H (CDCI3, 250 MHz): 8,37 (s, 1 H), 7,57 (dd, J = 8,4 Hz, 1 ,3 Hz, 2H), 7,48-7,42 (m, 2H), 7,36 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 7,23-7,16 (m, 1 H), 7,1 1 (dd, J = 2,6 Hz, 1 ,7 Hz, 1 H), 6,98-6,91 (m, 2H), 6,71 (dd, J= 2,7 Hz, 1 ,7 Hz, 1 H), 3,84 (s, 3H).
RMN 13C (CDCI3, 63 MHz) : 158,63, 135,79, 133,27, 128,77, 126,64, 125,79, 125,73, 125,46, 125,31 , 1 15,00, 1 14,55, 103,14, 55,51 . Synthèse de 4-(4-phényl -1 H-pyrrol-2-yl)phénol (13)
Ce composé est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 4.
Masse obtenue : 180 mg, 0,77 mmol
Rendement : 89%
Mp: > 300°C
HRMS : [M+H]+: 236,1070.
IR(cm1) : u = 3215, 1495, 1249, 1171, 1101,832, 763, 696
RMN 1H (Acétone-d6, 250 MHz) : 10,41 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 7,62-7,58 (m, 2H), 7,55-7,51 (m, 2H), 7,33-7,27 (m, 2H), 7,22 (dd, J= 2,8 Hz, 1,7 Hz, 1H), 7,15- 7,08 (m, 1 H), 6,89-6,85 (m, 2H), 6,77 (dd, J = 2,8 Hz, 1 ,8 Hz, 1 H).
Synthèse de 2-[4-(4-bromobutoxy)phényl]-4-phényl-1 H-pyrrole (14)
Dans un ballon à température ambiante sont dissous 0,450 g de 13 (1,91 mmol, 1 eq.), 0,794 g de K2C03 (5,74 mmol, 3 eq.) et 0,69 ml_ de 1,4- dibromobutane (5,74 mmol, 3 eq.) dans du DMF. La réaction est agitée vigoureusement à température ambiante une nuit. Le lendemain, de l'eau est ajoutée à la réaction et le mélange est extrait à l'éther diéthylique, la phase organique est lavée 3 fois avec NaCI sat puis les phases aqueuses sont réextraites avec de l'éther diéthylique. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS04, filtrées et concentrées sous vide. Le résidu est dissous dans un minimum de dichlorométhane, et le produit est précipité par ajout d'éther de pétrole, filtré sur Buchner et lavé avec de l'éther de pétrole fournissant 0,466 g de 14 (1,26 mmol, 66%) sous forme d'une poudre blanche.
Mp : 160-162°C
HRMS : [M(79Br)+H]+: 371 ,1813, [M(81Br)+H]+ : 373,0814, [M+H]+ : 372,0781. IR(cm1) : u = 3395, 1497, 1247, 830, 802, 751,692.
RMN 1H (DMSO-d6, 250 MHz) : 11,28 (s, 1H,), 7,61-7,57 (m, 4H), 7,34-7,31 (d, 2H), 7,28-7,25 (dd, 1H), 7,14-7,07 (tt, 1H), 6,95 (d, J= 2,8 Hz, 2H), 6,80 (dd, J = 2,7 Hz, 1,7 Hz, 1H), 4,02 (t, J= 6,1 Hz, 2H), 3,62 (t, J= 6,5 Hz, 2H), 2,01-1,94 (m, 2H), 1,88-1,81 (m, 2H).
RMN 13C (DMSO-d6, 63 MHz): 156,82, 135,86, 132,27, 128,48, 125,59, 124,88, 124,76, 124,49, 124,33, 115,71, 114,71, 101,94, 66,59, 34,86, 29,11, 27,42. Synthèse de 2-[4-(4-azidobutoxy)phényl]-4-phényl-1 H-pyrrole (15)
Dans un ballon sont dissous 0,450 g de 14 (1 ,22 mmol, 1 eq.) et 0,395 g d'azoture de sodium (6,08 mmol, 5 eq.) dans du DMF. La réaction est agitée à température ambiante une nuit. Le mélange est dissous dans du dichlorométhane est lavé plusieurs fois avec NaCI sat. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous vide. Après dilution dans un minimum de dichlorométhane, le produit 15 est précipité par addition d'éther de pétrole. Le solide est filtré sur Buchner et on obtient 243 mg de 15 (0,73 mmol, 60%) sous forme d'une poudre blanche.
Mp : 177-180°C
HRMS : [M+H]+: 333,1707.
IR (cm 1) : u = 3394, 2948, 2875, 2080, 1496, 1246, 831 , 752, 692.
RMN 1 H (CDCI3, 250 MHz) : 8.38 (s, 1 H), 7,59-7,55 (m, 2H), 7,45-7,39 (m, 2H), 7,37-7,33 (m, 2H), 7,23-7,17 (m, 1 H), 7,10-7,08 (m, 1 H), 6,94-6,88 (m, 2H), 6,72 (dd, J = 2,6 Hz, 1 ,5 Hz, 1 H), 4,01 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,38 (t, , J = 6,3 Hz, 2H), 1 ,89-1 ,80 (m, 4H)
RMN 13C (CDCI3, 63 MHz) : 157,86, 135,76, 133,21 , 128,77, 126,57, 125,89 , 125,77, 125,41 , 125,27, 1 16,09, 1 15,09 , 103,09, 67,41 , 51 ,34, 26,66, 25,90.
Synthèse de 5-[4-(4-azidobutoxy)phényl]-2-nitroso-3-phényl-1 H-pyrrole
(16)
Ce composé (poudre ocre-dorée) est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 6.
Masse obtenue : 67 mg, 0,186 mmol
Rendement : 62%
Point de fusion : 125-126°C
HRMS : [M+H]+ : 362,1612.
IR (cm 1) : u = 3280, 2918, 2850, 2092, 1603, 1360, 1258, 1 164, 1038, 828, 768, 695, 668.
RMN 1 H (CDCI3, 250 MHz) : 8,14-8,1 1 (m, 2H), 7,84 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,46 (dd, J = 5,2 Hz, 1 ,9 Hz, 3H), 7,15 (s, 1 H), 6,99 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 4,06 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,39 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 1 ,93-1 ,78 (m, 4H).
RMN 13C (CDCI3, 63 MHz): 163,72, 162,05, 142,84, 131 ,91 , 129,71 , 129,57, 129,29, 128,93, 122,19, 1 15,47, 1 15,03, 67,67, 51 ,27, 26,53, 25,82. Synthèse de méthyl 2-[4-[(2Z)-2-[[5-[4-(4-azidobutoxy)phényl]-3-phényl- 1H-pyrrol-2-yl]imino]-5-phényl-pyrrol-3-yl]phénoxy]acétate (17)
Ce composé (poudre bleue intense) est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 7.
Masse obtenue : 0,080 g, 0,123 mmol
Rendement : 89%.
Mp : 150-152°C
HRMS : [M+H]+ : 651,2717.
IR(cm1) : u = 2094, 1759, 1600, 1496, 1241, 1166, 903, 806, 764, 694, 675.
RMN 1H (CDCI3, 400 MHz) : 8,00 (d, J= 7,8 Hz, 4H), 7,92 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,80 (d, J= 7,6 Hz, 2H), 7,48 (t, J= 7,5 Hz, 2H), 7,39 (dd, J= 12,8 Hz, 6,9 Hz, 4H), 7,17 (s, 1H), 6,99 (d, 3H), 6,93 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 4,69 (s, 2H), 4,06 (t, J= 6,1 Hz, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,40 (t, J=6,6Hz, 2H), 1,91 (dt, J= 11 ,4 Hz, 6,1 Hz, 2H), 1,82 (p, J=6,8 Hz, 2H).
RMN 13C (CDCI3, 101 MHz) : 169,49 , 161,27 , 160,76 , 157,61, 153,83, 148,27, 145,30, 145,27, 138,66, 133,76, 131,94, 130,36, 129,28, 129,22, 129,00, 128,32, 128,22, 128,15, 125,91, 125,50, 117,43, 115,16, 114,52, 111,16, 67,56, 65,53, 52,45, 51,32, 26,61, 25,87.
Synthèse de 2-[4-[(2Z)-2-[5-[4-(4-azidobutoxy)phényl]-1 -dif luoroboranyl- 3-phényl-pyrrol-2-yl]imino-5-phényl-pyrrol-3-yl]phénoxy]acétate de méthyle (18)
Ce composé (solide vert intense d'aspect métallique) est synthétisé en appliquant la procédure décrite pour la préparation du composé 8.
Masse obtenue : 0,065 g, 0,093 mmol
Rendement : 85%
1H RMN (400 MHz, Acétone-d6) : δ 8,27-8,19 (m, 6H), 8,16-8,11 (m, 2H), 7,60 - 7,46 (m, 7H), 7,29 (s, 1 H), 7,14 - 7,08 (m, 4H), 4,87 (s, 2H), 4,24 - 4,17 (m, 2H), 3,78 (d, J= 2,1 Hz, 3H), 3,47 (t, J= 6,5 Hz, 2H), 1,98- 1,89 (m, 2H), 1,83 (q, J = 7,4 Hz, 2H).
13C RMN (101 MHz, Acétone) : δ 133,16, 131,74, 131,33, 130,48, 130,43, 130,29, 129,60, 129,34, 118,67, 115,76, 115,65, 68,49, 65,69, 52,28, 51,76, 27,13, 26,32.
HRMS : [M+H]+ Ca^BF^^ m/z calculé 699,270390 ; mesuré 699,270354 (0,1 ppm) Synthèse de 2-[4-[(2Z)-2-[5-[4-[4-(tert-butoxycarbonylamino)butoxy] phényl]-1-difluoroboranyl-3-phényl-pyrrol-2-yl]imino-5-phényl-pyrrol-3- yl]phénoxy]acétate de méthyle (19)
Dans un ballon sous argon à température sont dissous 0,061 g de 18 (0,087 mmol, 1 eq.) et 0,024 g de Boc-ON (0,096 g, 1 ,1 eq.) dans du THF anhydre. A cette solution sont ajoutés 0,096 ml_ d'une solution 1 M de triméthylphosphine dans le toluène (0,096 mmol, 1 ,1 eq.). La solution est agitée une nuit à température ambiante. Le lendemain, la solution est contrôlée par CCM et si du produit de départ est encore visible, on ajoute 1 eq. supplémentaire de PMe3 et de Boc-ON afin de terminer la réaction en une heure. La solution est ensuite lavée avec NaCI sat. et extraite au dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur silice (PE/EA) et 0,061 g de 19 (0.079 mmol, 91 %) sont obtenus sous forme d'un solide vert foncé iridescent.
1 H RMN (400 MHz, Acetone-d6) δ 8,26 - 8,17 (m, 6H), 8,15 - 8,09 (m, 2H), 7,52 (td, J = 9,6, 8,9, 4,8 Hz, 7H), 7,25 (s, 1 H), 7,1 1 - 7,05 (m, 4H), 6,00 (s, 1 H), 4,85 (s, 2H), 4,16 (dt, J = 6,6, 3,4 Hz, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,17 (td, J = 7,6, 3,8 Hz, 2H), 1 ,84 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 1 ,69 (p, J = 7,4 Hz, 2H), 1 ,41 (s, 9H).
13C RMN (101 MHz, Acétone) δ 169,64, 163,1 1 , 160,51 , 160,29, 158,35, 156,72, 146,61 , 145,53, 144,69, 143,18, 133,12, 133,07, 133,04, 131 ,70, 131 ,27, 130,44, 130,41 , 130,37, 130,26, 129,55, 129,31 , 126,86, 124,28, 120,79, 1 18,57, 1 15,71 , 1 15,62, 78,39, 68,77, 65,66, 52,28, 41 ,83, 40,75, 28,68, 27,43, 27,21 , 24,44.
HRMS : [M+H]+ C42H41 BF2N5O5 calculé 744,317054, mesuré 744,316900 (0,2 ppm).
2. Préparation d'antennes de type pérylènediimide
Synthèse du dérivé pérylènebisimide clickable :
Composés 20a-20b
Le mélange 1 ,7- et 1 ,6-dibromopérylène-3,4,9,10-tétracarboxylique dianhydride (1 ,03 g ; 1 ,8 mmol ; 1 ,0 éq) est solubilisé sous argon dans 20 mL de NMP. A cette solution sont ajoutés l'hexylamine (0,546 g ; 5,4 mmol ; 700μί ; 7,3 éq) et l'acide acétique (0,432 g ; 7,2 mmol ; 412 μί ; 4,0 éq). Le mélange réactionnel est agité à 85°C sous atmosphère inerte pendant 2h. Après retour à température ambiante, le mélange réactionnel est versé dans l'éthanol. Le précipité rouge est filtré sous vide et lavé plusieurs fois à l'éthanol. Le mélange P1 a et P1 b désiré est obtenu sous la forme d'une poudre rouge que l'on utilise directement dans la réaction suivante.
Composé 21
Le mélange obtenu précédemment (20a, 20b) est solubilisé dans la pyrrolidine. La solution est agitée sous atmosphère inerte à 85°C pendant 16h. A la fin de la réaction, la solution est refroidie et une solution d'HCI 1 M est ajoutée jusqu'à pH=2. La phase aqueuse est extraite trois fois avec du dichlorométhane. Les phases organiques sont regroupées, séchées sur Na2S04, filtrées et évaporées sous pression réduite. Le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique sur gel de silice (Eluant : Hexane / Acétate d'éthyle (7/3)) pour donner l'isomère 1 ,7 (P2) sous la forme d'une poudre verte.
1 H RMN (600MHz, CDCI3) :8,37 (s, 2H), 8,31 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,53 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 4,21 (dd, J= 8,6, 6,6 Hz, 2H), 3,68 (brs, 4H), 2,75 (brs, 4H), 2,04 (brs, 4H), 1 ,94 (brs, 4H), 1 ,75 (m, 4H), 1 ,46 (m, 4H), 1 ,37-1 ,34 (m, 8H), 0,90 (t, J= 7,0 Hz, 6H).
13C RMN (151 MHz, CDCI3) : 164,05, 146,39, 134,10, 129,82, 126,55, 123,71 , 122,03, 121 ,66, 120,66, 1 19,00, 1 17,98, 52,14, 40,54, 31 ,65, 28,16, 26,87, 25,80, 22,61 , 14,1 1 .
Composé 22
Le composé 21 (180 mg, 2,58.10"4 mol, 1 ,0eq) est solubilisé dans tBuOH (25 mL). A cette solution est ajouté le KOH broyé (73 mg, 1 .29.10 3, 5.0 eq). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à 95°C pendant 3h. L'avancement de la réaction est suivi par CCM. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est refroidi et 10 mL d'acide acétique sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h supplémentaire, puis une solution d'HCI 1 M (10mL) est ajoutée. Le mélange réactionnel est agité pendant une heure supplémentaire. Du dichlorométhane est ensuite ajouté et la phase organique est lavée trois fois à l'eau. La phase organique est ensuite séchée sur Na2S04, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique (Eluant : Hexane / Acétate d'éthyle (6/4)) pour donner le composé P3 sous la forme d'une poudre verte.
1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,49 (s, 1 H), 8,43 (s, 1 H), 8,42 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 8,40 (d, J= 8,06 Hz, 2H), 7,69 (d, J=8,01 Hz, 2H), 7,55 (d, J= 8,03 Hz, 2H), 4,22 (m, 2H), 3,74 (brs, 4H), 2,83 (brs, 4H), 2,1 1 (brs, 4H), 2,00 (brs, 4H), 1 ,76 (m, 2H), 1 ,45 (m, 2H), 1 ,36-1 ,30 (m, 8H), 0,90 (t, J= 6,98 Hz, 3H)
Composé 23
Le composé 22 (180 mg, 2,58.10"4mol, 1 ,0eq) est solubilisé dans 10mL de NMP et le 6-amino-1 -hexanol (87mg, 1 ,4.10"4 mol, 1 ,0eq) est ajouté. Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à 85°C pendant 16h. A la fin de la réaction, le mélange réactionnel est refroidi et du dichlorométhane est ensuite ajouté. La phase organique est lavée trois fois à l'eau. La phase organique est ensuite séchée sur Na2S04, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique (Eluant : Hexane / Acétate d'éthyle (7/3)) pour donner le composé P4 sous la forme d'une poudre verte.
1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,51 (s, 1 H), 8,50 (s, 1 H), 8,45 (dd, J=8,1 , 1 ,8 Hz, 2H), 7,74 (dd, J=8,0, 6,9 Hz, 2H), 4,23 (m, 4H) 3,77 (brs, 4H), 2,85 (brs, 4H), 2,38 (t, J= 8,1 Hz, 2H), 2,10 (brs, 4H), 2,00 (brs, 4H), 1 ,79-17,6 (m, 4H),1 ,57 (m, 4H), 1 ,49- 1 ,44 (m, 4H), 1 ,38-1 ,35 (m, 4H), 0,9 (t, J= 7,0 Hz, 3H).
Composé 24
Le composé 23 (135 mg, 1 ,9.10 4 mol, 1 ,0eq) est solubilisé dans du dichlorométhane sec (20mL). A cette solution sont ajoutés de la triéthylamine (256 μί, 1 ,9 mmol, 10,0eq) et le chlorure de 4-toluènesulfonyle (366 mg, 1 ,9 mmol, 10,0 eq). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante sous atmosphère inerte pendant 16h. A la fin de la réaction, de l'eau est ajoutée et la phase organique est lavée trois fois à l'eau. La phase organique est ensuite séchée sur Na2S04, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le brut réactionnel est purifié sur colonne chromatographique (Eluant : Hexane / Acétate d'éthyle (8/2)) pour donner le composé P5 sous la forme d'une poudre verte.
1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,50 (d, J= 6,5 Hz, 2H), 8,44 (dd, J= 8,09, 6,9 Hz, 2H), 7,79 (m, 2H), 7,73 (t, J= 7,8 Hz, 2H), 7,35 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 4,22 (dt, J= 22,9, 7,6 Hz, 4H), 4,03 (t, J= 6,5 Hz, 2H), 3,77 (br s, 4H), 2,85 (br s, 4H), 2,44 (s, 3H), 2,10 (br s, 4H), 1 ,99 (br s, 4H), 1 ,77-1 ,66 (m, 6H), 1 ,45 (t, J= 7,6 Hz, 2H), 1 ,40-1 ,33 (m, 8H), 0,90 (t, J= 7,0Hz, 3H).
13C RMN (151 MHz, CDCI3) : 164,18, 146,58, 144,76, 134,23, 133,34, 129,99, 129,95, 128,01 , 126,73, 126,69, 123,91 , 123,84, 122,19, 121 ,86, 120,82, 1 19,20, 1 19,01 , 1 18,21 , 1 18,05, 70,71 , 52,30, 40,67, 40,30, 31 ,77, 28,89, 28,29, 28,05, 26,99, 26,61 , 25,93, 25,29, 22,74, 21 ,77, 14,24.
Composé 25
Le composé 24 (68 mg, 78.10"3 mol, 1 ,0 eq) est solubilisé dans 20mL de DMF. A cette solution est ajouté l'azoture de sodium (51 mg, 7,8.10"3 mol, 10,0 eq). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à 50°C pendant 12h. A la fin de la réaction le mélange réactionnel est refroidi et de l'eau est ajoutée. La phase aqueuse est extraite trois fois avec du dichlorométhane. Les phases organiques sont regroupées, séchées sur Na2S04, filtrées et évaporées sous pression réduite pour mener au produit P6 désiré sans autre purification. 1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,38 (d, J= 2,3 Hz, 2H), 8,33 (dd, J=8,0, 6,4 Hz, 2H), 7,55 (dd, J= 12,3, 8,0Hz, 2H), 4,22 (q, J= 7,4 Hz, 4H), 3,69 (brs, 4H), 3,28 (t, J= 7,0 Hz, 2H), 2,76 (br s, 4H), 2,05 (br s, 4H), 1 ,95 (br s, 4H), 1 ,84-1 ,72 (m, 6H), 1 ,65 (t, J= 7,0Hz, 3H), 1 ,48 (m, 7H), 1 ,36 (m, 5H), 0,90 (t, J= 7,0 Hz, 3H).
13C RMN (151 MHz, CDCI3) : 164,20, 146,56, 134,31 , 134,20, 129,96, 126,73, 123,89, 122,18, 122,16, 121 ,85, 121 ,29, 120,80, 1 19,19, 1 19,02, 1 18,19, 1 18,05, 52,29, 51 ,54, 40,68, 40,39, 31 ,77, 29,83, 29,65, 28,88, 28,29, 28,13, 27,00, 26,81 , 26,63, 25,93, 22,74, 14,24.
3. Préparation de groupes hvdrosolubilisants
Composé 26
Le triéthylène glycol mono méthyl éther (2,0 g, 1 ,22.10 2 mol, 1 ,0 eq) est solubilisé dans 120 mL de CH2CI2 sec. A cette solution sont ajoutés sous argon le chlorure de 4-toluènesulfonyle (4,64 g, 2,43.10"2 mol, 2,0 eq) et la triéthylamine (2,68 g, 2,43.10"2 mol, 2,0 eq). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à température ambiante pendant 16h. A la fin de la réaction, de l'eau est ajouté au mélange réactionnel et la phase organique est lavée trois fois à l'eau, séchée sur Na2S04, filtrée et évaporée sous vide. Le brut réactionnel est purifié par colonne chromatographie sur gel de silice (Eluant : CH2CI2/MeOH (0.5%)) pour donner le produit désiré sous la forme d'une huile incolore.
1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 7,79 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,33 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 4,20-4,10 (m, 2H), 3,72-3,64 (m, 2H), 3,63-3,56 (m, 6H), 3,55-3,49 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 2,44 (s, 3H).
13C RMN (151 MHz, CDCI3) : 144,90, 133,14, 129,93, 121 ,10, 72,03, 70,87, 70,69, 70,67, 69,35, 68,80, 59,15, 21 ,76.
Composé 27
Le composé 26 (2,87 g, 9,02 mmol, 1 ,0 eq) est solubilisé dans 90mL de DMF sec. A cette solution est ajouté sous atmosphère inerte, le NaN3 (4,70 g, 72,0 mmol, 8eq). Le mélange réactionnel est agité à 50°C pendant 16h. Après retour à température ambiante, de l'eau est ajoutée au mélange réactionnel et la phase aqueuse est extraite au CH2CI2. La phase organique est lavée à l'eau, séchée sur Na2S04, filtrée et évaporée sous pression réduite. Le produit désiré est obtenu sous la forme d'une huile sans autre purification.
1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 3,69-3,65 (m, 8H), 3,57-3,55 (m, 2H), 3,40-3,39 (m, 5H).
13C RMN (151 MHz, CDCI3) : 72,09, 70,86, 70,82, 70,77, 70,19, 59,19, 50,84. 4. Préparation d'antennes de type porphyrine
La tétraphénylporphyrine (TPPH, composé 28) a été synthétisée en suivant la méthode de Alder-Rothemund à partir d'un mélange de benzaldéhyde et de pyrrole dans l'acide propionique, chauffé à 130°C pendant deux heures. Le produit cristallin a été isolé par filtration avec un rendement de 6%. Le faible rendement est en accord avec la littérature et la voie de synthèse employée.
L'étape suivante est une substitution électrophile aromatique, appelée aussi nitration aromatique. Ce dernier est contrôlable de façon régiosélective en position para du phényle, en faisant varier la quantité de nitrite de sodium et le temps de réaction dans le TFA. En effet, après avoir concentré la TPPH dans du TFA, cette dernière a été traitée par 1 .8 équivalent de nitrite de sodium pendant exactement 3 minutes. Le mélange réactionnel a été ré-engagé sans purification intermédiaire afin de réduire le groupement nitro en groupement amino en présence d'excès de chlorure d'étain et d'acide chlorhydrique. La porphyrine dissymétrique mono-amino (composé 29) a été isolée par chromatographie sur colonne (silice, DCM/Hexane, 9:1 ).
Composé 28 Composé 29
5, 10, 15,20-Tetraphenylporphyrine (TPPH, composé 28)
On a ajouté du benzaldéhyde (5,0 ml, 49,1 mmoles, 1 ,2 équiv.) et du pyrrole (4,0 ml, 57,6 mmoles, 1 ,0 équiv.) dans 250 mL d'acide propionique. La solution a été agitée à 130°C pendant 2 h. Le mélange réactionnel a ensuite été refroidi à température ambiante puis filtré. Le solide pourpre a été lavé avec du MeOH et de l'eau chaude pour donner le produit désiré sous la forme d'une poudre pourpre (1 .70 g, 2.76 mmol, rendement = 5%).
1 H RMN (600 MHz, CDCI3) δ ppm = -2.76 (s, 2H, H1 ); 7.76 (m, 12H, H4 and H5); 8.22 (d, J = 7 Hz, 8H, H3); 8.85 (s, 8H, H2)
13C RMN (150 MHz, CDCI3) δ ppm = 120.28 (Cq); 126.83 (C4); 127.85 (C5); 134.70 (C3); 142.32 (Cq)
ESI-MS m/z cale, for [C44H30N4] = 614.3; trouvé: [M+H+]+ = 615.3, [M+2H+]2+ = 308.1
4'-Amino-5, 10, 15,20-tetraphenylporphyrin (composé 29)
On a dissous de la TPPH (906 mg, 1 ,5 mmol, 1 ,0 équiv.) dans 70 mL de TFA, puis on a ajouté du nitrite de sodium (181 mg, 2,6 mmoles, 1 ,8 équiv.). La solution a été agitée à température ambiante pendant exactement 3 minutes. Le mélange réactionnel a ensuite été désactivé par 200 mL d'eau. La solution aqueuse a été extraite avec du DCM. La couche organique a été lavée avec une solution aqueuse saturée de NaHC03, séchée sur du Na2S04 anhydre, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide pourpre. Ce dernier a été dissous sans purification dans 50 mL de HCI concentré. Du chlorure d'étain(ll) dihydraté (3,88 g, 17,0 mmol, 1 1 ,5 équiv.) a été ajouté à cette solution. Le mélange a été agité à 65°C pendant 2 h. Le mélange réactionnel a été désactivé avec 100 mL d'eau froide. La solution aqueuse a été basifiée à pH 14 par addition d'une solution d'hydroxyde d'ammonium, puis extraite avec du DCM jusqu'à ce qu'elle soit incolore. La couche organique combinée a été déshydratée sur Na2S04 anhydre, filtrée et évaporée sous vide pour donner un solide pourpre, qui a été purifié par chromatographie sur colonne (silice, DCM) a donné le composé souhaité TPP-NH2 sous la forme d'une poudre pourpre (443 mg, 7,05.10"4 moles, rendement = 51 %).
1 H RMN (600 MHz, CDCI3) δ ppm = -2.75 (s, 2H, H1 ); 7.08 (d, J = 8.9 Hz, 2H, H7 or H8); 7.78- 7.73 (m, 9H, H4 and H5); 8.01 (d, J = 8.3 Hz, 2H, H7 or H8); 8.22 (d, J = 6 Hz, 6H, H3); 8.83 (s, 6H, H2); 8.94 (d, J = 4.45 Hz, 2H, H6)
13C RMN (150 MHz, CDCI3) δ ppm = 1 13.61 (C8 or C7); 126.80 (C4); 127.50 (C5); 134.71 (C3); 135.85 (C7 or C8)
ESI-MS m/z cale, for [C44H31 N5] = 629.3; trouvé: [M+H+]+ = 630.3; [M+2H]2+ = 315.6 5. Procédure générale de fonctionnalisation des dendrimères PAMAM- G3-NH, (G3P-(NH9),9)
Dans un ballon sous argon sont dissouts n équivalents de 9 (4 eq./NH2 pour une fonctionnalisation totale soit 128 eq. ou 0.5 eq./NH2 pour une hémifonctionnalisation soit 16 eq.), n éq. de HBTU et n eq. de DIPEA dans 10 mL de DMF sec et dégazé. La solution est agitée à température ambiante durant 15 minutes. Pendant ce temps, 1 eq. de G3P-(NH2)32 (typiquement, 0.100 mL d'une solution de G3P-(NH2)32 à 12.44% dans le MeOH soit 1 .8 μηιοΙ de dendrimère) sont dissous dans 10 mL de DMF anhydre. Ensuite, on fait buller de l'argon dans la solution de dendrimère durant 5 minutes avant de l'ajouter à la solution d'azabodipy activée. On laisse la réaction agiter pendant une nuit à température ambiante à l'abri de la lumière. Le lendemain, la solution est concentrée sous pression réduite de façon à évaporer le maximum de DMF et de DIPEA. Le résidu bleu pâteux est ensuite dissous dans du DMSO de qualité pour analyse, et placé dans un sachet de membrane pour dialyse (10 kDa) fermé hermétiquement par des pinces. Le boudin de dialyse est plongé dans du DMSO p.a. dans un erlenmeyer de 500 mL et agité doucement dans l'obscurité. Durant la dialyse, on change le DMSO de dialyse toutes les heures le premier jour, puis toutes les demi-journées les jours suivants. Après une semaine de dialyse, plus aucune coloration bleue n'est observée dans le solvant de dialyse, on récupère la solution de dendrimère fonctionnalisé à l'intérieur du boudin et on évapore le maximum de DMSO par évaporation sous vide. Le dendrimère fonctionnalisé G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32) est récupéré sous forme d'une poudre bleu intense avec un rendement quantitatif.
Dans le but de conjuguer le dérivé porphyrine (29) au dendrimère PAMAM- G3 par des liaisons amide, les trente-deux acides succiniques monoamide en surface du dendrimère sont activés par un mélange de HATU et DIPEA dans le DMF. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 30 minutes, puis la porphyrine monoamino (29) est ajoutée. Le mélange réactionnel est agité pendant 3 jours. Le produit final est purifié par dialyse dans le DMSO, grâce à une membrane de type cut-off MWCO 10kDa. Le produit (G3-(TPP)32) est caractérisé par 1 H RMN dans le DMSO-d6 et permet de démontrer la substitution complète du dendrimère par trente-deux porphyrines (Figures 1 , 2). 6. Préparation de dendrimères selon l'invention 6.1. Composé G3P-(Alcyne)32
L'acide hexynoique (428 mg, 3.8 10~4 mol, 40.0 eq), N-(3- dimethylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide chlorhydrique (592 mg, 3,8 10~4 mol, 40,0 eq), HOBT (516 mg, 3,8 10~4 mol, 40,0 eq) et le DIPEA sont solubilisés dans 40 mL de DMF distillé. La solution est agitée sous atmosphère inerte pendant 30min. A cette solution est ajoutée une solution de G3P-(NH2)32 (660 mg, 9.5 10~5 mol, 1 .0 eq). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à 25°C pendant 48h. A la fin de la réaction, le DMF est évaporé sous pression réduite. Le produit brut réactionnel est purifié par dialyse dans le DMSO pendant 24h. Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite. Le composé G3P-(Alcyne)32 est obtenu sous la forme d'une huile orange.
1 H RMN (600MHz, DMSO-c 6) : 7,97 (brs), 7,87 (brs), 312-3,07 (m), 2,72-2,69 (m), 2,47 (brs), 2,22-2,20 (brs), 2,16-2,12 (m), 1 ,64 (q).
13C RMN (MHz, DMSO-c 6) : 172,20, 171 ,89, 171 ,64, 84,31 , 71 ,56, 52,18, 49,62, 40,43, 39,24, 36,86, 34,41 , 33,06, 24,37, 17,58. 6.2. Procédure générale pour la synthèse de G3P-(L2)32 :
G3P-(Alcyne)32 (20 mg, 2,0.10~6 mol, 1 .0 eq) et le chromophore porteur d'une fonction azoture (composé 25 (Perylène))(8,0.10~5 mol, 40 eq) sont solubilisés dans 1 ml de DMF distillé. La solution est dégazée sous argon pendant 20min. A cette solution est ensuite ajoutée une solution de CuS045H20 et d'ascorbate de sodium dans un mélange H20/DMF (1 ml ; 1 /1 , v/v). Le mélange réactionnel est agité sous atmosphère inerte à température ambiante pendant 24h. A la fin de la réaction, les solvants sont évaporés sous pression réduite et une solution d'EDTA est ajoutée au brut réactionnel. La solution est agitée pendant 12h puis dialysée dans l'eau pendant 24h. Le solvant est ensuite évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu est dialysé dans le DMSO pendant 24h. A la fin de la purification, le DMSO est évaporé sous pression réduite et le produit désiré (G3P-(Perylène)32) est obtenu sous la forme d'une poudre.
Avec composé 25 à titre de chromophore azoturé :
G3P-(Perylène)32 1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,47 (s), 8,42 (d), 8,06-7,99 (brs), 7,725 (t), 7,54 (brs), 7,17-7,09 (brs), 4,85 (brs), 4,57 (brs), 4,30 (brs), 4,19- 4,14 (br m), 3,47 (brs), 3,29 (brs), 2,34 (brs), 2,24 (brs), 1 ,89 (brs), 1 ,69 (brs), 1 ,40 (brs), 1 ,31 (brs), 0,85-0,81 (m). 6.3. Procédure générale pour la synthèse d'un dendrlmère G3P- (Alcyne)x-(L2)y :
G3P-(Alcyne)32 (20 mg, 2,0 10~6 mol, 1 ,0 eq) et le chromophore azoturé (1 , 6.10"5 mol, 8,0 eq) sont solubilisés dans 1 mL DMF. La solution est dégazée sous argon pendant 20 min. Une solution de CuS04.5H20 (7.10"6 mol, 3.5 eq) et d'ascorbate de sodium (7.10 6 mol, 3,5 eq) (1 mL, DMF/H20 (1 /1 , v/v)) est ensuite ajoutée. Le mélange réactionnel est agité sous argon à 25°C pendant 12 h. A la fin de la réaction, les solvants sont évaporés sous pression réduite. Le brut réactionnel est trituré dans une solution aqueuse d'EDTA pendant 5h puis dialysé dans l'eau (MW 2 kDa). A la fin de la dialyse, les solvants sont évaporés sous vide et le composé G3P-(Alcyne)x-(L2)y (x = 22-24, y = 8-10).
Avec composé 25 à titre de chromophore azoturé,
G3P-(Alcyne)x-(Perylène)y (x = 22-24, y = 8-10)
1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,16-8,09 (br m), 7,48 (brs), 7,19 (brs), 4,32 (brs), 4,18-4,13 (brsm), 3,53 (brs), 3,33 (brs), 2,70 (brs), 2,58 (brs), 2,26 (brs), 1 ,94 (brs), 1 ,84 (brs), 1 ,74 (brs), 1 ,44 (br m), 1 ,34 (brs m), 0,89 (brs)
Avec une cyanine à titre de chromophore azoturé, G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10)
1 H RMN (600MHz, DSMO-c 6) : 7,95 (brs), 7,88 (brs), 7,74 (brs), 7,42 (brm), 7,27 (brm), 7,17 (brm), 7,04 (brm), 5,64 (m), 4,51 (brs), 3,93 (brs), 3,77 (brs), 2,75 (brm), 2,68 (brs), 2,20 (brs), 2,14 (brs), 1 ,76 (brs), 1 ,65 (brs), 1 ,57 (brs).
Avec le composé 18 à titre de chromophore azoturé
G3P-(Alcyne)x-(Bodipy2)y (x = 22-24, y = 8-10)
1 H RMN (600MHz, DSMO-ctë) : 7,95 (brs), 7,89 (brs), 7,55-7,41 (m), 7,12 (brm), 6,92 (brm), 4,93-4,73 (m), 4,37 (brs), 3,51 (brs), 3,39 (brs), 3,08 (brs), 2,75 (brs), 2,67 (brs), 2,21 (brs), 2,15 (brs), 1 ,76 (brs), 1 ,65 (t).
6.4. Procédure générale pour la synthèse d'un dendrimère G3P-(R2)X-
Le dendrimère G3P-(Alcyne)x-(L2)y (x = 22-24, y = 8-10) est solubilisé dans 1 ml_ de DMF. A cette solution est ajouté le composé 27, le groupe hydrosolubilisant azoturé (4,0.10"5 mol, 20,0 eq). La solution est dégazée sous argon pendant 20 min. Une solution de CuS04.5H20 (2.0.10"5 mol, 10.0 eq) et d'ascorbate de sodium (2.0.10"5 mol, 10.0 eq) (1 mL, DMF/H20 (1/1 , v/v)) est ensuite ajoutée. Le mélange réactionnel est agité sous argon à 25°C pendant 12 h. A la fin de la réaction, les solvants sont évaporés sous pression réduite. Le brut réactionnel est trituré dans une solution aqueuse d'EDTA pendant 5h puis dialysé dans l'eau (MW 2 kDa). A la fin de la dialyse, les solvants sont évaporés sous pression réduite et le résidu est solubilisé dans le DMSO puis dialysé dans le DMSO (MW 10 kDa). A la fin de la dialyse le DMSO est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré G3P-(R2)x-(L2)y (x = 22-24, y = 8-10) est obtenu sous la forme d'une poudre. Avec le composé 25 à titre de chromophore azoture et le composé 27 à titre de groupe hydrosolubilisant azoturé, G3P-(PEG)x-(Perylène)y ( = 22-24, y = 8-10)
1 H RMN (600MHz, CDCI3) : 8,16-80,9 (brm), 7,45 (brs), 7,56 (s), 7,49 (brs), 7,13 (brs), 4,49 (s), 4,33 (brs), 4,19-4,14 (brm), 3,84(s), 3,61 (s), 3,61 (s), 3,36 (s), 3,32 (brs), 2,71 (s), 2,35 (brs), 2,25(brs), 1 ,95 (brs), 1 ,85 (brs), 1 ,74 (brs), 1 ,44 (brs), 1 ,34 (brs).
Avec le composé 18 à titre de chromophore azoture et le composé 27 à titre de groupe hydrosolubilisant azoturé, G3P-(PEG)x-(Bodipy2)y ( = 22-24, y = 8-10)
1 H RMN (600MHz, DSMO-ctë) : 7,96 (brs), 7,86 (brs), 7,81 (s), 7,47-7,36 (brsm), 7,00 (brm), 6,70-6,65 (brm), 5,16 (brs), 4,89 (brs), 4,45 (s), 3,78 (s), 3,78 (s), 3,50 (s), 3,46 (brs), 3,39 (brs), 3,34 (brs), 3,31 (brs), 3,08 (brs), 2,78 (brs), 2,65 (brs), 2,59-2,56 (brm), 2,42 (brs), 2,19 (brs), 2,1 1 (t), 1 ,79 (t).
Exemple 2 : Synthèse de complexes selon l'invention
Pour préparer des complexes de dendrimères contenant les cations lanthanide, une solution de dendrimère dans le DMSO a été traitée avec 8 éq. de nitrate de lanthanide pendant 7 jours à température ambiante.
Exemple 3 : Propriétés des complexes selon l'invention
Propriétés photophysiques des molécules à bases d'aza-Bodipy
Le spectre d'absorption du chromophore Bodipy (composé 9) mesuré dans une solution de DMSO présente une bande large allant jusqu'à 770 nm avec une bande principale à basse énergie située à 672 nm (ε = 2.1■ 105 M"1 cm"1 , Figure 3). Le fait d'attacher ce chromophore à la surface du dendrimère G3 PAMAM (G3P- (Bodipy1 )n, n = 16, 32) ainsi que l'encapsulation des ions Ln3+ à l'intérieur de ses branches n'affectent pas la position et la forme des bandes d'absorption à basse énergie. D'autre part, le coefficient molaire d'absorption augmente avec le nombre d'unités chromophore Bodipy attachées. Sous excitation centrée à 650 nm, correspondant au maximum d'absorption du chromophore, le composé 9 ainsi que les dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32 ; Ln = Yb3+, Nd3+) montrent de larges bandes d'émission très similaires avec un maximum à -735 nm provenant des niveaux d'énergie centrés sur le chromophore aza-Bodipy (Figure 4). (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )32 (Ln = Yb3+, Nd3+) montre un léger élargissement des bandes d'émission ainsi qu'un décalage vers des longueurs d'ondes à plus basses énergies. Les formes des spectres d'excitation mesurés sous observation de l'émission à 760 nm correspondent à celles des spectres d'absorption (Figure 4 vs. 3). La luminescence caractéristique sous formes de bandes étroites des ions Yb3+ ou Nd3+ n'a pu être observée dans le proche infrarouge sous excitation du chromophore. Ce résultat peut s'expliquer par une capacité insuffisante du chromophore Bodipy à sensibiliser les lanthanides testés ou un rapport déséquilibré entre le nombre de groupes chromophores et le nombre de Ln3+ qui pourrait induire le masquage des signaux caractéristiques du Nd3+ or Yb3+ sous une large bande d'émission provenant des groupements organiques.
Les rendements quantiques absolus d'émission du chromophore (composé 9) et des dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3+) sont résumés dans le Tableau 1 . On a observé des diminutions significatives (6 et 3,4 fois) des rendements quantiques d'émission provenant des fragments chromophores aza- BODIPY-COOH pour les dendrimères fonctionnalisés, G3P-(aza-BODIPY)32 et G3P-(aza-BODIPY)16, respectivement. Un tel effet est probablement causé par l'auto-extinction des chromophores localisés sur le dendrimère G3P PAMAM. La présence des Ln3+ à l'intérieur des branches des G3P-(aza-BODIPY)16 n'affecte pas les valeurs de rendements quantiques qui restent les mêmes en tenant compte de l'erreur expérimentale. D'autre part, les valeurs Q sont augmentées de 1 ,7 et 1 ,4 fois pour G3P-(Bodipy1 )32 lors de l'encapsulation des cations lanthanide Yb3+ et Nd3+, respectivement. Ce résultat peut être expliqué par la formation des différentes conformations de dendrimères dans Ln8-G3P-(Bodipy)32 avec des interactions réduites entre unités chromophores modulant ainsi l'auto-extinction. Tableau 1. Rendements quantiques (Q) d'une solution de concentration 10μΜ de composé 9 et de (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3+) mesurés dans le DMSO à température ambiante. a
Composé Q (%)
Composé 9 8.04(8)
G3P-(Bodipy1)32 1 .33(3)
Yb8-G3P-(Bodipy1)32 2.25(3)
Nd8-G3P-(Bodipy1)32 1 .85(1 )
G3P-(Bodipy1)ie 2.40(3)
Yb8-G3P-(Bodipy1)i6 2.53(7)
Nd8-G3P-(Bodipy1)i6 2.27(3)
a Les valeurs 2σ sont indiquées entre parenthèses. Erreurs expérimentales: Q, ±10%. Rendements quantiques (Q) mesurés sous excitation à 650 nm en collectant l'émission dans la plage de 660 à 850 nm.
Pour tester la photostabilité du système, le chromophore (composé 9) et les dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3+) ont été illuminés en continu avec de la lumière à 670 nm et le signal d'émission a été suivi à 735 nm. Les résultats (Figure 5) ont révélé des comportements significativement différents pour (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )32 et pour (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )i6. Les dendrimères entièrement fonctionnalisés et leurs complexes formés avec Yb3+ et Nd3+ présentent une photostabilité très similaire avec une diminution de seulement 28-34% de l'intensité de luminescence initiale après 3h d'illumination. Dans les mêmes conditions, le dendrimère partiellement fonctionnalisé, le G3P-(Bodipy1 )i6 perd complètement son signal d'émission (Figure 5, à droite). Cependant, la photostabilité de G3P-(Bodipy1 )16 pourrait être améliorée par l'incorporation des Ln3+. De plus, il s'est avéré être dépendant de la nature des lanthanides. Ainsi, l'intensité de Nd8-G3P-(Bodipy1 )16 est diminuée de 40% après 3h d'illumination alors que le signal d'émission de Yb8-G3P-(Bodipy1 )16 après une légère augmentation du signal d'émission retourne à sa valeur d'intensité initiale après 200 min de traitement. Comme pour le chromophore initial, le composé 9 (Figure 5) perd 75% de son intensité de luminescence après 3h d'illumination. Par conséquent, en général, la fixation des fragments chromophores sur la structure des dendrimères et la présence des Ln3+ peuvent être utilisée avantageusement pour assurer et améliorer la photostabilité de la sonde. Cytotoxicité des molécules à base d'aza-Bodipy
Afin de déterminer la potentielle toxicité des dendrimères décrits, un test à l'Alamar Blue a été réalisé sur la lignée de cellules humaines de carcinome ovarien HeLa (Figure 6). Différentes concentrations de chromophores (composé 9) et de dendrimères (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3+) ont été testées. Le chromophore n'induit pas de toxicité jusqu'à la concentration de 2 μΜ avec -100% de viabilité cellulaire observée.
Microscopie confocale de fluorescence des composés à base de Bodlpy
Des expériences de microscopie confocale ont été réalisées afin de confirmer la localisation intracellulaire des dendrimères (Figure 7). Dans ce but, des cellules HeLa ont été incubées durant 30 minutes avec une solution de concentration de 1 ,5 μΜ, ce qui correspond à -89-100% de viabilité cellulaire. La fluorescence des dendrimères a été observée en utilisant un laser à 633 nm comme source d'excitation et l'émission de l'aza-BODIPY a été collectée entre 650 et 800 nm avec une coupe optique d'1 μηι dans l'axe-z. Une même puissance de laser a été utilisée pour les différentes expériences afin de comparer les variations d'intensité de signal entre les différents dendrimères. Le signal le plus intense a été observé pour Yb8- G3P-(aza-BODIPY)16 alors que les images acquises pour les cellules HeLa incubées avec Nd8-G3P-(aza-BODIPY)16 présentent une intensité relativement moins intenses (Figure 1 1 , haut : (A) et (B)). Dans le cas des dendrimères G3P- (aza-BODIPY)16 et (Ln8-)G3P-(aza-BODIPY)32 le signal observé était relativement faible avec les mêmes réglages du laser (puissance réglée à 6%) (Figure 7, haut : (C) et bas : (A) et (B)). Les cellules HeLa incubées avec l'aza-BODIPY-COOH montrent un signal de plus faible intensité que celui observé pour Yb8-G3P-(aza- BODIPY)16 (Figure 7, top : (A) vs. (D)), malgré un rendement quantique de l'aza- BODIPY-COOH 3,4 fois plus élévé que celui de Yb8-G3P-(aza-BODIPY)16 (Tableau 2).
Les différences d'intensité de signaux émis dans le cas des cellules incubées avec un dendrimère entièrement ou partiellement fonctionnalisés, avec ou sans Ln3+ encapsulés, peuvent être attribuées à l'importance de l'internalisation cellulaire qui varie en fonction des différences de solubilité dans l'eau ou des conformations des macromolécules. Cependant, dans tous les cas, la distribution du signal intracellulaire a été observé dans le cytoplasme et plus spécifiquement dans les lysosomes, avec un signal particulièrement intense pour le dendrimère Yb8-G3P- (aza-BODIPY)16. De plus, une formation de plusieurs filipodes longs et fins, des structures dérivées des membranes plasmiques riche en actine F ont été observés pour les différents dendrimères étudiés et les molécules d'aza-BODIPY-COOH (Figures 7, flèches jaunes). Des expériences seront nécessaires pour confirmer ce marquage spécifique, en particulier des expériences de colocalisation avec des sondes commercialement disponibles, de types AlexaFluor conjuguées à une phalloidine (peptide spécifique pour le marquage de l'actine).
Il convient de noter que dans ces conditions expérimentales utilisées, aucun signal d'autofluorescence n'a été détecté, ce qui démontre une nouvelle fois les avantages d'utiliser des sondes possédant des longueurs d'ondes d'excitation et d'émission dans la fenêtre d'imagerie biologique.
Expériences de cytométrie en flux avec les molécules à base de Bodlpy
La cytométrie en flux a été utilisée afin de quantifier l'internalisation cellulaire des dendrimères et de mieux comprendre les différences d'intensités de signal observées en microscopie confocale. Les mécanismes d'internalisation cellulaire passifs (énergie non dépendant) et actif (énergie dépendant) ont été étudiés. Le transport actif a été inhibé avec de l'azoture de sodium (NaN3), tandis qu'une incubation à 4°C a permis d'inhiber les voies de transport actives et passives en augmentant la rigidité de la membrane plasmique des cellules HeLa (S. Vranic, N. Boggetto, V. Contremoulins, S. Mornet, N. Reinhardt, F. Marano, A. Baeza-Squiban, S. Boland, Deciphering the mechanisms of cellular uptake of engineered nanoparticles by accurate évaluation of internalization using imaging flow cytometry, Particle and Fibre Toxicology, 10 (2013) 1 -16).
Les résultats obtenus permettent de conclure sans ambiguïté que les dendrimères partiellement fonctionnalisés (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )16 (Ln = Yb3+, Nd3+) sont significativement plus internalisés par les cellules par comparaison avec les dendrimères entièrement fonctionnalisés (Ln8-)G3P-(Bodipy1 )32 (Ln = Yb3+, Nd3+) (Figure 8). Cependant, pour les deux types de dendrimères, l'internalisation est systématiquement plus importante pour ceux contenant de l'Yb3+ que pour ceux contenant du Nd3+. En effet, l'incubation avec le dendrimère Yb8G3P-(Bodipy1 )16 montre une internalisation cellulaire plus importante que le dendrimère Nd8G3P- (Bodipy1 )16. Ces résultats peuvent s'expliquer par la meilleure solubilité et par conséquent une agrégation moindre dans le milieu cellulaire des dendrimères partiellement fonctionnalisés ainsi qu'une conformation plus favorable à l'internalisation des dendrimères ayant encapsulé des Ln3+ (particulièrement pour Ln = Yb3+). Pour le chromophore composé 9, un signal d'émission relativement fort a été observé et correspondant à 65% d'internalisation de Yb8G3P-(Bodipy1 )i 6. Par ailleurs, l'internalisation du dendrimère Nd8-G3P-(Bodipy1 )i 6 plus faible que celle du dendrimère Yb8-G3P-(Bodipy1 )i 6 est compensée par un rendement quantique plus élevé (Tableau 2) permettant d'observer des intensités d'émission comparables en microscopie confocale (Figure 7, haut (A), (B) vs (D)). Les dendrimères pénètrent dans les cellules par des voies de transport actives et passives (Figure 8). Les résultats correspondants à l'inhibition de l'internalisation cellulaire sont présentés dans le Tableau 2. Les pourcentages relatifs d'internalisation active ou passive varient en fonction du nombre de chromophore Bodipy et de la présence de Ln3+. Le chromophore composé 9 montre 19% d'internalisation par transport actif. Cependant, des études plus poussées sont nécessaires pour clarifier les mécanismes exacts de transport actif. L'endocytose est le mécanisme principal actif permettant l'entrée dans la cellule (B.D. Grant, J.G. Donaldson, Pathways and mechanisms of endocytic recycling, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 1 0 (2009) 597-608 ; L. Kou, J. Sun, Y. Zhai, Z. He, The endocytosis and intracellular fate of nanomedicines: implication for rational design, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 8 (201 3) 1 -10 ; D. Vercauteren, R.E. Vandenbroucke, AT. Jones, J. Rejman, J. Demeester, S.C. De Smedt, N.N. Sanders, K. Braeckmans, The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls, Molecular Therapy, 18 (2010) 561 -569 ; D.A. Kuhn, D. Vanhecke, B. Michen, F. Blank, P. Gehr, A. Petri-Fink, B. Rothen-Rutishauser, Différent endocytotic uptake mechanisms for nanoparticles in epithelial cells and macrophages, Beilstein Journal of Nanotechnology, 5 (2014) 1 625-1 636), des mesures de cytométrie en flux pourront être réalisées après inhibition des différentes voies d'endocytoses avec des molécules appropriées telles que : (D. Dutta, J.G. Donaldson, Search for inhibitors of endocytosis: intended specificity and unintended conséquences, Cell Logist, 2 (201 2) 203-208) monodansylcadaverine (HT. McMahon, E. Boucrot, Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 1 2 (201 1 ) 517-533), Filipin I I I (J.E. Schnitzer, P. Oh, E. Pinney, J. Allard, Filipin-sensitive caveolae-mediated transport in endothelium-reduced transcytosis, scavenger endocytosis, and capillary-permeability of selected macromolecules, Journal of Cell Biology, 127 (1994) 1217-1232) ou Amiloride (S. Gold, P. Monaghan, P. Mertens, T. Jackson, A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells, PLoS One, 5 (2010) e1 1360), inhibiteurs respectifs de l'endocytose clathrine- et caveoline- dépendante ou la micropinocytose.
Tableau 2. Pourcentage d'inhibition cellulaire de l'internalisation par mécanisme de transport actif et passif des composé 9 et dendrimères (Ln8-)G3P- (Bodipy1 )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3+) (cellules HeLa). Les valeurs ont été obtenues par cytométrie en flux.
Internalisation cellulaire
Composés
Active Passive
Yb8-G3P-(Bodipy1 )16 42±8 53±4
Nd8-G3P-(Bodipy1)16 68±20 29±3
G3P-(Bodipy1 )16 35±19 57±2
Yb8-G3P-(Bodipy1 )32 72±8 22±7
Nd8-G3P-(Bodipy1)32 57±17 38±6
G3P-(Bodipy1 )32 40±5 51 ±7
Composé 9 18±4 81 ±1 a Les pourcentages d'inhibition des mécanismes passifs sont présentés comme la différence de pourcentage entre l'internalisation inhibée à 4°C et celle inhibée à l'azoture de sodium
Microscopie d'épifluorescence avec les molécules à base de Bodipy
La capacité de détection du signal émis dans le proche infrarouge par les composé 9 et les dendrimères (Ln8-) G3P-(Bodipy1 )n (n = 16, 32; Ln = Yb3+, Nd3+) a été confirmé en microscopie d'épifluorescence après 30 minutes d'incubation de cellules HeLa avec une solution de 1 ,5 μΜ de complexe de dendrimère correspondant. En raison de la largeur de bande d'émission en proche infrarouge du chromophore aza-Bodipy, le signal a été collecté par épifluorescence avec un filtre passe long de 785 nm à l'émission et un filtre 655 ± 40 nm à l'excitation (Figure 9). Les résultats obtenus concordent avec ceux obtenus par microscopie confocale (Figure 7). Les cellules HeLa incubées avec le dendrimère. Ln8-G3P-(Bodipy1 )i6 (Figure 9, haut: (A) et (B)) présentent le signal émis le plus intense après 8 secondes d'exposition. Les images obtenues pour les autres dendrimères montrent un signal plus faible voir non détectable dans le cas du G3P-(Bodipy1 )32. Les résultats peuvent à nouveau s'expliquer par les différences d'internalisation cellulaire (Tableau 2) et les intensités d'émission (Tableau 1 ) pour les différents dendrimères étudiés.
Propriétés photophysiques des molécules à base de Cyanine
Le dendrimère G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) et ses complexes formés avec Nd et Yb montrent une large bande d'absorption centrée à 665 nm (Figure 10). L'excitation sur les bandes centrées sur le ligand se traduit par une intense émission à large bande centrée à 725 nm. Aucune bande d'émission étroite caractéristique du Nd ou du Yb n'a pu être observée dans le proche- infrarouge.
L'illumination continue de G3P-(Alcyne)x-(Cyanine)y (x = 22-24, y = 8-10) avec une lumière centrée à 665 nm permet d'estimer la photostabilité des dendrimères qui apparaît comme étant assez faible (Figure 1 1 ).
Microscopie par épifluorescence des molécules à bases de cyanine
Afin d'établir la preuve de principe que l'émission de ce dendrimère peut être détecté par microscopie d'épifluorescence après incubation avec des cellules HeLa. Un signal de fluorescence a été observé en utilisant un filtre d'excitation 655 ±40 nm ainsi qu'un filtre d'émission 750 ± 50 nm (Figure 12).
Propriétés photophysiques des molécules à base de porphyrine
Les spectres d'absorption du complexe Yb8-G3P-(TPP)32 ont été enregistrés dans le DMSO et dans le mélange DMSO/(Opti-MEM/ FCS, 6:94%) (Figure 13).
Le spectre d'absorption du Yb8-G3P-(TPP)32 mesuré dans une solution de DMSO présente les bandes d'absorbance de porphyrine typiques : la bande de Soret centrée à 420 nm (ε~5.9- 106 M"1 -cm"1), la bande Q IV centrée à 517 nm (ε~29.1 - 104 M-1 -crrr1), la bande Q III centrée à 553 nm (ε~16.6- 104 M^ -cm"1), la bande Q II centrée à 592 nm (ε~8.5- 104 M"1 -cm"1), et la bande Q I centrée à 648 nm (ε~9.1 - 104 M-1 -crrr1).
Les bandes présentes sur le spectre d'absorption du Yb8-G3P-(TPP)32 dans le mélange DMSO / (Opti-MEM: FCS) sont légèrement décalées vers le rouge, par 3- 1 1 nm. Il faut noter ici que dans notre cas, nous avons été limité par la faible solubilité de Yb8-G3P-(TPP)32 dans le milieu de culture cellulaire et, par conséquent, la diffusion de la lumière est importante.
Avec une excitation centrée à 520 nm, Yb8-G3P-(TPP)32 montre une émission de porphyrine typique : deux bandes dans la région visible : centrées à 664 nm et 717 nm, Figure 14. Une bande étroite correspondant à la transition 2F5/2→ 2F7/2 de l'Yb3+ dans le proche-infrarouge a été observée, Figure 15. Cependant, le signal semble être superposé à l'émission résiduelle du chromophore tétraphénylporphyrine. Ce résultat peut s'expliquer par une faible capacité du chromophore à sensibiliser l'Yb3+ ou un rapport déséquilibré entre le nombre de groupes chromophores et celui des cations lanthanide.
Le spectre d'excitation de Yb8-G3-(TPP)32 montre des bandes comparables à celles observées sur le spectre d'absorption, indiquant ainsi que la sensibilisation de Yb3+ se produit par le transfert d'énergie du chromophore tétraphénylporphyrine vers le cation lanthanide, Figure 16.
Le rendement quantique de l'émission de Yb3+ dans le complexe Yb8-G3- (TPP)32, 37 μΜ dans une solution de DMSO n'a pas pu être déterminé en raison de la trop faible intensité du signal d'émission. Néanmoins, les courbes de décroissance de la luminescence ont été mesurées et peuvent être déconvoluées par des fonctions bi-exponentielles avec des valeurs de temps de vie individuels de 68 (1 ) MS (48 (5)%) et 17,4 (1 ) με (52 (5)%).
Microscopie d'épifluorescence des molécules à base de porphyrine et activité potentielle en thérapie photodynamique
La capacité du complexe Yb8-G3-(TPP)32 à être utilisé comme agent d'imagerie dans la région proche-infrarouge a été confirmée par des expériences de microscopie d'épifluorescence. Des signaux intenses ont été détectés dans le proche-infrarouge sous une excitation à 417 nm (filtre de bande passante 60 nm) dans des cellules HeLa incubées avec le complexe Yb8-G3-(TPP)32 (Figure 17A). Après 2 minutes d'irradiation avec une lumière sélectionnée avec un filtre à bande passante centrée à 417 nm, nous avons observé la formation de vésicules. Ce résultat est une indication typique d'un processus de stress oxydatif résultant de la production d'espèces réactives d'oxygène par Yb8-G3-(TPP)32 sous irradiation lumineuse (Figure 17B). Dans le cas des cellules non incubées avec Yb8-G3-(TPP)32, nous n'avons pas observé d'autofluorescence dans la région proche-infrarouge (Figure 17C). Les images de microscopie d'épifluorescence montrent un certain niveau d'agrégation des dendrimères Yb8-G3-(TPP)32 dans les conditions biologiques utilisées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Complexe comprenant au moins un dendrimère et au moins lanthanide, dans lequel le dendrimère comprend un motif de formule (I) suivante
dans laquelle :
- Ci est un groupe de valence 4 de formule >N-CH2-CH2-N< ;
- A1 ; A2 et A3 sont des groupes de formule -(CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2- ;
ledit motif de formule (I) étant relié de façon covalente à au moins une antenne qui absorbe à une longueur d'onde allant de 500 nm à 900 nm, ladite antenne étant choisie dans le groupe constitué des anthraquinones, des cyanines, notamment des cyanines 5 et des cyanines 7, des aza-BODIPY, des pérylènediimides, des porphyrines, des sels de phénothiazine et de leurs dérivés.
2. Complexe selon la revendication 1 , dans lequel l'antenne est reliée au motif de formule (I) de façon covalente par l'intermédiaire d'au moins un bras répondant à la formule suivante :
-A4-X-[A5-Z]r((A6)rY)k- dans laquelle :
- A4 est un groupe de formule -(CH2)2-X'-(CH2)2-, X' représentant un groupe - C(0)-NH- ou un groupe -NH-C(O)-, et étant de préférence un groupe de formule - (CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2- ;
- X est un groupe de formule -NH-C(O)- ;
- i est un nombre entier compris entre 1 et 3 ;
- j est 0 ou 1 ;
- k est 0 ou 1 ; - A5 et A6 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les radicaux (cyclo)alkylènes, linéaires ou ramifiés, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone ;
- Z est choisi parmi les groupes -O-, -NH-, -S-, amide, ester, triazole, aminé, éther, thioéther, urée, thiourée, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate, disulfure et sulfonyle ; et
- Y est choisi parmi les groupes -O-, -NH-, -S-, alkylène, amide, ester, triazole, aminé, éther, thioéther, urée, thiourée, imine, oxyme, hydrazone, sulfonamide, carbamate, amidine, phosphoramidate, disulfure et sulfonyle.
3. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le dendrimère répond à la formule suivante :
C1-{A1-N[A2-N(A3-N(A4-R')2)2]2}4 dans laquelle :
- Ci est un groupe de valence 4 de formule >N-CH2-CH2-N< ;
- Ai , A2, A3 et A4 sont des groupes de formule -(CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2- ;
- les radicaux R' sont choisis, indépendamment les uns des autres, dans le groupe constitué :
. des groupes de formule (1 ) suivante :
-NH-C(0)-[A5-Z]r((A6)rY)k-L
i, j, k, A5, A6, Z et Y étant tels que définis dans la revendication 2,
L représentant une antenne choisie dans le groupe constitué des anthraquinones, des cyanines, notamment des cyanines 5 et des cyanines 7, des aza-BODIPY, des pérylènediimides, des sels de phénothiazine et de leurs dérivés ; et
. des groupes de formule (2) suivante :
-NH-C(0)-[A5-Z]r((A6)rY)k-L'
i, j, k, A5, A6, Z et Y étant tels que définis dans la revendication 2,
L' représentant un groupe hydrosolubilisant ou un groupe ciblant, le groupe hydrosolubilisant étant de préférence choisi parmi les phosphates, les sulfonates, les sucres et les chaînes PEG, et le groupe ciblant étant de préférence choisi parmi les peptides, les anticorps, les oligonucléotides, la biotine, les sucres et les polysaccharides ; et
. des groupes de formule (3)
-NH-C(0)-A5-L"
A5 étant tel que défini dans la revendication 2, et
L" représentant un groupe alcyne ; l'un au moins des groupes R' répondant à la formule (1 ).
4. Complexe selon la revendication 3, dans lequel l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1 ') suivante :
-NH-C(0)-A5-Z-L
A5 et Z étant tels que définis dans la revendication 2, et
L étant tel que défini dans la revendication 3.
5. Complexe selon la revendication 4, dans lequel l'un au moins des groupes R' répond à la formule 1 ") suivante :
A5 étant tel que défini dans la revendication 2, et
L étant tel que défini dans la revendication 3.
6. Complexe selon la revendication 4, dans lequel l'un au moins des groupes R' répond à la formule (1 "') suivante :
-NH-C(0)-A5-0-L
A5 étant tel que défini dans la revendication 2, et
L étant tel que défini dans la revendication 3.
7. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l'antenne répond 'une des formules suivantes :
8. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le lanthanide est choisi dans le groupe constitué de Yb, Nd, Ho, Tm, Sm, Dy, Eu, Pr et Er.
9. Utilisation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comme chromophore fluorescent.
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