EP3548887A1 - Procédé de détection des maladies articulaires - Google Patents

Procédé de détection des maladies articulaires

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Publication number
EP3548887A1
EP3548887A1 EP17811481.5A EP17811481A EP3548887A1 EP 3548887 A1 EP3548887 A1 EP 3548887A1 EP 17811481 A EP17811481 A EP 17811481A EP 3548887 A1 EP3548887 A1 EP 3548887A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
drop
synovial fluid
value
mammal
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP17811481.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Catherine BOSSER
Thierry Hoc
Caroline BOULOCHER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Centrale de Lyon
Ecole Nationale dIngenieurs de Saint Etienne ENISE
Institut Enseignement Superieur et Recherche en Alimentation Sante Animale Sciences Agronomiques et Environnement
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Centrale de Lyon
Ecole Nationale dIngenieurs de Saint Etienne ENISE
Institut Enseignement Superieur et Recherche en Alimentation Sante Animale Sciences Agronomiques et Environnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Centrale de Lyon, Ecole Nationale dIngenieurs de Saint Etienne ENISE, Institut Enseignement Superieur et Recherche en Alimentation Sante Animale Sciences Agronomiques et Environnement filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3548887A1 publication Critical patent/EP3548887A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic method.
  • the present invention relates to a method for diagnosing, determining the type or assessing the severity of a mammalian joint disease, including osteoarthritis.
  • Joint diseases affect the joints and include osteoarthritis, arthritis, rheumatoid arthritis, ankylo spondylitis and arthralgia.
  • osteoarthritis also known as osteoarthritis is the most widespread.
  • the prevalence of osteoarthritis is steadily increasing worldwide as it is linked to aging and overweight populations. It manifests itself most often by mechanical pain and / or discomfort, during the movements of a joint.
  • Osteoarthritis has long been described as cartilage "wear and tear” when it is a destructive and inflammatory syndrome associated with various risk factors.
  • scientists no longer talk about osteoarthritis in general but “arthrosis” according to the patient's profile: age-related osteoarthritis, osteoarthritis related to obesity, osteoarthritis related to a disease of the joint, etc.
  • the objective at present is to individualize the care and treatments according to these different profiles.
  • Cartilage lesions do not regress over time and their evolution is not linear. It can be very fast and make it necessary to put a prosthesis in less than 5 years. Osteoarthritis can also evolve slowly, over several years, without inducing a major handicap.
  • the diagnosis of the disease is usually made by (i) the patient's own observation of pain or discomfort in a joint, and (ii) a radiograph of the joint in question see firsthand the state of degradation of the cartilage.
  • Clinical diagnostic criteria have been developed by the American College of Rheumatology (ACR), based on the description of pain and / or discomfort (Litwic et al., 2013).
  • the severity of the disease is most commonly measured according to the
  • the present invention relates to the realization of this second objective.
  • diagnosis is made on the basis of clinical examination and radiological images.
  • researchers are working to identify molecules whose presence or concentration in serum or urine could serve as a bio-label, although currently no candidate molecule can categorize patients (Lotz et al. , 2013).
  • a link between the presence of certain circulating microRNAs in the serum and the severity of osteoarthritis of the knee or hip has been demonstrated (Beyer et al., 2015).
  • synovial fluid During a thrust with an intra-articular fluid effusion also called synovial fluid, the analysis of this fluid collected during a puncture of the joint can help confirm and / or refine the diagnosis. In vitro methods for assessing the severity of joint disease in a mammal from synovial fluid samples are actively sought.
  • the article (Esmonde-White et al., 2009a) describes in particular a method for discriminating different stages of the disease, comprising measuring, on a dried drop of synovial fluid, the following parameters: presence of crystals at the center of the droplet , and presence of radial erosion marks on the edges of the drop.
  • Dr. Esmonde-White's team identified a link between the Raman spectrum of synovial fluid and the severity, according to the K / L score, of osteoarthritis. knee.
  • Raman band intensity ratios were significantly correlated with the radiographic severity of the disease (Esmonde-White et al, 2009b).
  • hyaluronic acid HA
  • This compound lubricating joints is a bio marker of joint diseases: indeed in these pathologies, it is either degraded or present in lesser concentration following the infiltration of fluids and proteins into the joint; in addition, the hyaluronic acid present is in a different molecular form, of lower molecular weight, this form does not have the same viscoelastic properties as hyaluronic acid present in healthy joints.
  • This biomarker is indicative of the stage of the disease, but remains difficult to implement, equipment for performing Raman spectroscopy is necessary.
  • the inventors have demonstrated a link between the morphological characteristics of a drop of synovial fluid and the presence, the type or the stage of an articular disease affecting the mammal from which the synovial fluid is derived.
  • the inventors have also demonstrated a correlation between the morphological characteristics of a drop of synovial fluid and the content of hyaluronic acid and proteins of said synovial fluid.
  • the method as presented below makes it possible to diagnose a joint disease and / or to obtain information on its type or its stage and / or to predict its evolution, simply, quickly and at low cost.
  • the present invention relates to an in vitro method for diagnosing joint disease in a mammal and / or determining the type of joint disease and / or determining the stage of said disease and / or predicting the course of said disease, comprising the steps of:
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid
  • said parameter is selected from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the droplet .
  • the method may furthermore comprise the following steps:
  • step e determining the Raman spectrum of the dried drop in step b), and f) comparing the Raman spectrum determined in step e) with a Raman spectrum representative of a reference synovial fluid.
  • the present invention also relates to an in vitro method for monitoring a mammal with joint disease, comprising the steps of: a) depositing a drop of a sample of synovial fluid of said mammal, obtained at a time Ii, on a flat support consisting of an inorganic material, such as glass;
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a value obtained by applying steps (a) to (c) of the method to a sample of synovial fluid of said mammal obtained at an instant I 0 prior to the instant Ii ,
  • the present invention also relates to an in vitro method for determining the efficacy of a treatment of a joint disease in a mammal afflicted with said disease and to which said treatment is administered, comprising the following steps:
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid
  • the present invention also relates to a method for in vivo screening in a non-human mammal of candidate compounds for treating at least one joint disease, comprising the steps of:
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid
  • said parameter is selected from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the droplet .
  • the present invention also relates to a method for molecular characterization of a mammalian synovial fluid, comprising the following steps:
  • the value (H) is compared with a range of values correlated with the concentration of proteins present in a synovial fluid.
  • FIG. 1 Schematic representation of the drop deposit protocol (DDRS).
  • Figure 4 A) Box plot boxes (representing medians, quartiles, and minimum and maximum values) of the droplet surfaces (left-hand side of Figure 4A) and bead height between drops (right-hand side of Figure 4A).
  • Figure 4A healthy LS and osteoarthritis: the stars show significant differences * (p ⁇ 0.05) and **
  • the vertical lines in Figure 5C correspond to the wavelengths specified on the x-axis of the lower part of the figure, respectively from left to right: 945 cm 1 , 960 cm 1 , 970 cm 1 , 1031 cm 1 , 1046 cm 1 , 1062 cm 1 , 1081 cm 1 , 1102 cm 1 , 1127 cm -1 , 1242 cm -1 and 1275 cm -1 .
  • Each point (star for healthy samples, circle for OA sick samples) represents the 210 ratios of the Raman spectrum of a sample. Groups of healthy points and OA are clearly located in separate areas.
  • FIG. 7 This figure shows a good correlation between three ratios of Raman spectrum peaks with the amount of interleukin 6 (IL6) in human LS samples.
  • IL6 interleukin 6
  • Figure 9 The four ratios of Raman peaks in relation to hyaluronic acid: 1317/896 cm -1 (A) 1339/896 cm -1 (B); 1062/1046 cm -1 (C) and 1317/945 cm -1 (D) are correlated with the surface value (S) of the synovial fluid drop in LS samples from dogs.
  • FIG. 10 (A) Boxplots (ie "box plot”) (representing medians, quartiles and minimum and maximum values) of the droplet surfaces between SL drops (inflammatory stage) and SNI (non-inflammatory stage): stars show significant differences * (p ⁇ 0.05) and ** (p ⁇ 0.01).
  • the upper curve illustrates the results obtained on drops of subjects in the SI.
  • the lower curve illustrates the results obtained on drops of subjects at the SNI.
  • biomarkers for diagnosing or determining the type or severity of joint disease, these biomarkers being parameters indicative of the morphological characteristics of a dried drop of synovial fluid from a mammal.
  • articular disease within the meaning of the invention means a disease affecting the joints and in particular the cartilage present in these joints.
  • This articular disease may be inflammatory or non-inflammatory, degenerative or otherwise, and is chosen in particular from osteoarthritis, arthritis, rheumatoid arthritis, ankylo spondylitis and arthralgia.
  • mammal within the meaning of the invention is meant in particular domestic mammalian animals such as cats, dogs, hamsters, rabbits, guinea pigs and ferrets; also covered by the present invention are farm animals such as sheep, cattle, goats, equines, camelids and deer.
  • domestic mammalian animals such as cats, dogs, hamsters, rabbits, guinea pigs and ferrets
  • farm animals such as sheep, cattle, goats, equines, camelids and deer.
  • the present invention relates to joint diseases affecting humans.
  • the term "patient” refers to a human being, child or adult, affected by joint disease.
  • the present invention relates to an in vitro method for diagnosing joint disease in a mammal, comprising the steps of:
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid
  • said parameter is selected from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the droplet .
  • the term "diagnosing" is intended to establish the presence of a joint disease in a patient, including at a very early stage of the disease where the clinical symptoms are difficult to detect or to interpret.
  • the present invention relates to an in vitro method for determining the type of joint disease affecting a mammal, comprising the steps of:
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid
  • said parameter is selected from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the droplet .
  • determining the type of joint disease is meant, within the meaning of the invention, to determine the origin or origins of the articular disease, and in particular to determine whether it is an inflammatory disease or not, or whether it is a disease related to the profile of the patient (age, overweight) or the presence of a pathogen (bacteria, virus), or if it is a degenerative disease.
  • the present invention relates to an in vitro method for assessing the stage of a mammalian joint disease, comprising the steps of:
  • step c) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained, and d) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid,
  • said parameter is selected from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the droplet .
  • assessing the stage of a joint disease also referred to in this application as “assessing the severity of an articular disease” is meant in the sense of the present invention to determine the stage of the disease according to the scores previously established clinical and biological tests, such as the K / L radio logical severity score.
  • this method makes it possible to distinguish the inflammatory stage and the non-inflammatory stage of an articular disease.
  • the method for determining the stage of a mammalian joint disease also makes it possible to give a prognosis of the course of the disease.
  • the present invention relates to an in vitro method for predicting the course of joint disease, comprising the steps of:
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid
  • said parameter is selected from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the droplet .
  • the present invention relates to an in vitro method for diagnosing joint disease in a mammal and severity of joint disease, comprising the steps a) to d) listed above.
  • the present invention relates to an in vitro method for diagnosing joint disease in a mammal and determining the type of said joint disease, comprising the steps a) to d) listed above.
  • the present invention relates to an in vitro method for assessing the severity and determining the type of a mammalian joint disease comprising the steps a) to d) listed above.
  • the present invention relates to an in vitro method for diagnosing joint disease in a mammal, for evaluating the severity and determining the type of said disease, comprising the steps a) to d) listed above.
  • the methods according to the invention all comprise four successive steps a) to d), the implementation of which is detailed below.
  • the first step consists in depositing a drop of a sample of synovial fluid of said mammal on a planar support consisting of an inorganic material, such as glass.
  • Synovial fluid is a biological fluid produced by the synovial membrane. This liquid is viscous, transparent or pale yellow. It is composed of a serum dialysate comprising electrolytes, glucose, proteins, glucoproteins and hyaluronic acid, and interstitial liquid filtered from the blood plasma.
  • this fluid in the joints is to reduce friction by its lubricating power, to absorb shocks, to supply oxygen and nutrients to the chondrocytes of articular cartilage, and to eliminate carbon dioxide and the metabolic waste of these cells.
  • synovial fluid samples tested according to the process of the invention are derived from mammalian joints affected or likely to be affected by joint disease.
  • the samples are sterilized by surgery.
  • the samples are then frozen for preservation.
  • these samples Prior to deposition of the drop, these samples are centrifuged to remove the cells present in the synovial fluid.
  • These LS samples can be diluted with standard or undiluted buffers. They can also be treated with proteases and R Ases in order to better preserve the biological constituents.
  • the deposited drop comes from an undiluted LS sample.
  • the LS sample is untreated with proteases and / or RNAses.
  • Biofluids can be prepared using a single drop of liquid, and the same dried drop can be examined using multiple techniques such as light microscopy, white light interferometry, atomic force microscopy (AFM), the desorption / ionization matrix assisted laser (MALDI), mass spectrometry, acoustic-mechanical impedance or optical spectroscopy, in particular Raman spectroscopy.
  • AFM atomic force microscopy
  • MALDI desorption / ionization matrix assisted laser
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • acoustic-mechanical impedance or optical spectroscopy in particular Raman spectroscopy.
  • the multiple data obtained from a few microliters of biofluid are representative of the physical and chemical properties of the biological fluid analyzed.
  • the deposition of a drop of a sample of synovial fluid is performed on a flat support consisting of an inorganic material, in particular of a water-repellent nature.
  • water-repellent material means an impermeable material that repels water, which can not interfere with the pores of the material because of the nature itself or the coating of the material.
  • the flat support is pretreated to remove any trace of fat on its surface.
  • the flat support has a contact angle with water of between 50 ° and 90 °.
  • the planar support is transparent.
  • the flat support is made of glass.
  • the term "glass” refers to amorphous solids obtained by heating a mixture, in appropriate proportions, of silica and metal oxides. They are therefore mixed silicates, solid, noncrystalline, transparent and fragile, formed by the disordered juxtaposition of SiO 4 silica tetrahedra and by the presence of alkaline, alkaline earth oxides, lead, aluminum, etc.
  • the glass is hard, brittle and transparent to visible light.
  • the glass considered in the present invention is a mineral glass, and not an organic glass.
  • It may be in particular soda-lime glass, or borosilicate glass, quality adapted to microscopy.
  • the flat support is in particular a microscope slide, of optical quality glass, thin (about 1 mm) and uncoated. This support is particularly advantageous because of its very low cost and its high availability.
  • the drying of the drop of synovial fluid is carried out at ambient temperature for at least 8 hours, or even at least 12 hours, or even at least 24 hours. According to another embodiment of the invention, the drying of the drop will be carried out for 30 minutes or one hour, at 37 ° C.
  • the drying time can be shortened to less than 30 minutes.
  • the diagnostic method according to the invention will preferably be implemented quickly, to obtain a diagnosis in the shortest time.
  • the third step of the method is a step of measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained.
  • indicator parameter of the morphological characteristics of the drop is meant all the parameters relating to the size and shape of the drop, and relating to the size and shape of the bead which is created at the periphery of the drop (see FIG. 3, OA).
  • the parameters representative of the morphological characteristics of the drop are in particular the surface of the drop, the surface profile (Z) of the drop, the height (H) of the bead and the width of the bead.
  • the parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop is chosen from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the drop.
  • the skilled person may choose to measure a single parameter chosen from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the drop, or to measure the values of two parameters or to measure the values of the three parameters mentioned above. All these parameters are measurable from 2D images and / or 3D images of the dried drop on a plane support, in particular a glass slide.
  • the measurement step c) is carried out by a white light interferometry method, making it possible to obtain the 3D images of the dried drops.
  • Interferometry is a measurement method that exploits interferences occurring between several waves coherent with each other.
  • White-light interferometers use special optical configurations and short-coherence light sources, which optimize the interaction between the light reflected by the measured object and the reference beam.
  • the measurement itself is based on the Michelson interferometer principle.
  • the light is collimated from the light source and then divided into two beams: an object beam and a reference beam.
  • the object beam is reflected by the measured object, and the reference beam is reflected on a reference mirror.
  • Light reflected from each beam is picked up and recombined at the beam splitter.
  • the superimposed beams are then imaged by a camera.
  • Each parameter value measured in step c) must be put into perspective with a corresponding reference value, in order to be able to draw a diagnostic conclusion on the presence of a mammalian joint disease and / or on the type of joint disease. present and / or to evaluate the severity of said joint disease.
  • Reference value
  • reference value means a value of a parameter indicative of the morphological characteristics of one or more drops of LS, representative of one or more reference synovial liquids.
  • reference synovial fluid is intended to mean a sample of LS derived from a mammal whose status with respect to a given joint disease is known.
  • This may include samples of LS from mammals that do not have joint diseases, or on the contrary with a specific articular disease and whose stage is known.
  • the reference value is chosen from a representative value of a synovial fluid of a mammal not suffering from an articular disease, and a representative value of a synovial fluid of a mammal affected by joint disease at a given stage, especially at a non-inflammatory stage.
  • the reference samples are generally samples from mammals whose stage of the disease is known and characterized, for example, whose stage of the disease is characterized as being "non-inflammatory".
  • a reference synovial fluid will be derived from a mammal of the same species as the mammal whose status with respect to a given joint disease is tested.
  • the reference LS will be from a human being.
  • a reference synovial fluid will be derived from a mammal whose status or type or stage of severity with respect to a specific joint disease is known, to diagnose or determine the type or to evaluate the severity of said joint disease.
  • the reference LS will be from a mammal whose status vis-à-vis osteoarthritis is known.
  • the value of an indicative parameter could be compared to a first representative reference value of an LS from a mammal with severe osteoarthritis, and a second representative reference value of an LS from a mammal with moderate osteoarthritis.
  • said reference value is an average value measured from several samples of LS from a plurality of mammals whose status with respect to a given joint disease is known, in particularly from mammals without articular disease, and in particular dogs or healthy humans, that is, unaffected by joint disease.
  • the reference value is a so-called “threshold” or “cut-off” value, which is determined from values determined from (i) LS samples from mammals with joint disease, and (ii) values determined from samples of LS from healthy mammals, that is to say which are not affected by this same joint disease (control LS).
  • An average reference value can be defined, this "threshold" value unambiguously separating the values obtained from control LS samples not showing articular disease, and those from mammals with articular disease.
  • a mammal tested according to the method of the invention will be considered to have articular disease when the parameter value measured from the dried LS drop of said mammal is significantly different from the threshold value of reference.
  • Examples 1 and 2 presented in this application were made from synovial fluid samples from healthy dogs and dogs showing evidence of cartilage damage and varying degrees of inflammation.
  • Example 3 relates to synovial fluid samples from individuals with osteoarthritis.
  • Example 4 relates to synovial fluid samples from rabbits developing surgically induced osteoarthritis by surgical transection of the anterior cruciate ligament.
  • the droplet area is significantly larger in the group of sick dogs (OA) than in the group of healthy dogs ( Figure 4A);
  • the value of the Z (Z / X) surface profile of the drop is much higher, in the group of diseased dogs, than the reference value of this surface profile measured in the group of healthy dogs (FIG. 4B).
  • the droplet area is significantly greater in the group of rabbits with inflammatory stage OA than in the group of rabbits with noninflammatory OA (FIG) (FIG. 10A);
  • the value of the Z (Z / X) surface profile of the drop is much greater for the synovial fluid originating from joints at an inflammatory stage (FIG. 10C).
  • a drop area value greater than a drop surface reference value, representative of one or more reference synovial fluids from mammals without joint disease, is indicative of the presence of joint disease
  • a bead height value (H) greater than a bead height reference value (HR), representative of one or more reference synovial fluids from mammals without articular disease, is indicative of the presence joint disease
  • a droplet surface profile value (Z) greater than a drop surface profile reference value (ZR), representative of one or more reference synovial fluids from mammals without articular disease, is indicative of the presence of joint disease;
  • Raman spectroscopy is a non-destructive method of observing and characterizing the molecular composition and external structure of a material, which exploits the physical phenomenon in which a medium slightly modifies the frequency of light. flowing. This frequency shift called “Raman effect" corresponds to an exchange of energy between the light beam and the medium, and gives information on the composition of the medium itself.
  • Raman spectroscopy is carried out by sending a monochromatic light onto a sample and analyzing the scattered light. The information obtained by the measurement and the analysis of this shift make it possible to define certain properties of the medium.
  • Raman spectroscopy of the dried drop of LS provides information on the chemical composition and in particular on the presence of the proteins contained in said drop.
  • the in vitro method for diagnosing joint disease in a mammal and / or determining the type of joint disease and / or evaluating the severity of said disease and / or predicting the evolution of said disease disease furthermore includes the following steps:
  • step e determining the Raman spectrum of the dried drop in step b), and f) comparing the Raman spectrum determined in step e) with a reference Raman spectrum representative of a synovial reference liquid.
  • a reference Raman spectrum can in particular be an average of several representative Raman spectra of several samples of synovial fluid, from healthy dogs.
  • Example 2 it was found that the shape of the protein structural bands and their intensities vary significantly between the Raman spectra of LS samples from healthy dogs and those of dogs with joint disease. .
  • the region 910-990 cm “1 was found to be drastically different between healthy and diseased spectra: whereas only the band of 945 cm hyaluronic acid" is one predominant on healthy spectra, bands at 960 cm " 1 and 970 cm -1 appear on the spectra of osteoarthritic subjects.
  • the region 1020-1145 cm -1 is rich in information because it contains the bands corresponding to phenylalanine (1031 cm -1 ), hyaluronic acid (1046, 1102 and 1127 cm -1 ), chondroitin 6-sulfate. (C6S) (1062 cm -1 ) and protein backbone (1081 cm 1 ).
  • the height value (H) of the beads beads may be correlated with the presence of some Raman strips of drops of LS, such as 1448/1102 bands; 1654/1102; and 1448/1317 cm “1 " on both dog and human LS samples (see Table 4 and Figure 8).
  • the method according to the invention for diagnosing and / or determining the type and / or assessing the severity of a joint disease is particularly suitable for the following joint diseases: osteoarthritis, arthritis, rheumatoid arthritis, ankylo spondylitis health and arthralgia.
  • this method is adapted to diagnose and / or determine the type and / or evaluate the severity of osteoarthritis.
  • the severity of the articular disease can be determined in particular according to pre-defined clinical or biological scores, notably related to important clinical symptoms and / or low cartilaginous capital and / or to synovitis and / or bone remodeling. .
  • the severity / stage of the articular disease corresponds to important clinical symptoms and / or low cartilaginous capital and / or to synovitis and / or bone remodeling.
  • the present invention also relates to an in vitro method of monitoring a mammal with joint disease, comprising the steps of:
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a value obtained by applying steps (a) to (c) of the method to a sample of synovial fluid of said mammal obtained at a time Io prior to time Ii,
  • said parameter is selected from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the droplet ..
  • no reference value is used since the two values compared are those obtained from LS samples from the same mammal, but at two different times.
  • a reference value representative of a synovial reference liquid is used in comparison with the values obtained from the samples of LS obtained at times Io and L.
  • the instant Io corresponds to a moment when the mammal presenting a joint disease is not yet treated for said disease, and corresponds in particular to a "before treatment" state.
  • the instant Io corresponds to a moment when the mammal presenting a joint disease starts a treatment against said disease.
  • the instant Ii corresponds to a moment when the mammal presenting a joint disease has been following a treatment against said disease, for at least one day, two days, three days, one week, two weeks, three days. weeks, one month, two months, or at least three months.
  • the instant Ii corresponds to a moment when the mammal presenting a joint disease has finished its treatment against said disease, and corresponds in particular to a "after treatment" state.
  • This method makes it possible to follow the evolution of a disease, and thus to classify the pathology into several categories such as: disease with slow or rapid evolution, degenerative disease, etc.
  • This method also makes it possible to evaluate the effectiveness of a given treatment.
  • said treatment will be judged to be effective if the value of (i) the height of the bead formed on the surface of the drop, and / or (ii) the surface of the drop and / or (iii) the surface profile (Z) of the drop as determined in step a) is less than the corresponding reference value Vo determined before the start of the treatment at 10 .
  • this method may be completed by the implementation of the following additional steps:
  • step e determining the Raman spectrum of the dried drop in step b), and f) comparing the Raman spectrum determined in step e) with a reference Raman spectrum representative of a synovial reference liquid.
  • the present invention also relates to an in vitro method for determining the efficacy of a treatment of a joint disease in a mammal afflicted with said disease, and to which said treatment is administered, comprising the following steps:
  • step b) drying the drop deposited in step a); c) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained, and
  • step c) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid
  • said parameter is selected from (i) the maximum height (H) of the bead formed on the surface of the drop, (ii) the surface of the drop and (iii) the surface profile (Z) of the droplet .
  • Such a method for monitoring the evolution and / or the effectiveness of a treatment corresponds to what can be called a 'companion test' which makes it possible to adapt or change a treatment, depending on the response. specific to an individual given this treatment.
  • the reference value may in particular be representative of the synovial fluid of said mammal obtained at an instant I 0 prior to the start of treatment.
  • said treatment will be judged to be effective if the value of (i) the height of the bead formed on the surface of the drop, and / or (ii) the surface of the drop and / or (iii) the surface profile (Z) of the drop as determined in step a) is less than the corresponding reference value Vo determined before the start of the treatment at 10 .
  • the reference value may also be representative of a reference synovial fluid obtained from a mammal that does not have articular disease.
  • said treatment will be judged to be effective if the value of (i) the height of the bead formed on the surface of the drop, and / or (ii) the surface of the drop and / or (iii) the surface profile (Z) of the drop, as determined in step a) is substantially equal to the reference value.
  • a representative reference value of a reference synovial fluid obtained from a mammal that does not have articular disease said treatment will be judged to be effective if the value of (i) the height of the bead formed on the surface of the drop, and / or (ii) the surface of the drop and / or (iii) of the surface profile (Z) of the drop, as determined in step a), approaches the reference value representative of a synovial reference liquid while moving away from the value Vo determined before the start of treatment at I 0 .
  • this method may be completed by the implementation of the following additional steps:
  • step e determining the Raman spectrum of the dried drop in step b), and f) comparing the Raman spectrum determined in step e) with a reference Raman spectrum representative of a synovial reference liquid.
  • the present invention also relates to a method of screening in a non-human mammal candidate compounds for treating at least one joint disease, comprising the steps of:
  • step b) measuring at least one parameter indicative of the morphological characteristics of the dried drop in step b), whereby a value for said parameter is obtained
  • step c) comparing each value measured in step c) with a reference value representative of a reference synovial fluid
  • said parameter is selected from (i) the maximum height
  • the reference value may in particular be representative of synovial fluid from said non-human mammal obtained at an instant I 0 prior to the administration of a candidate compound.
  • said candidate compound will be judged to be effective if the value of (i) the height of the bead formed on the surface of the drop, and / or (ii) the surface of the drop and / or (iii) ) of the surface profile (Z) of the drop, as determined in step a) is less than the corresponding reference value Vo determined before the start of administration to I 0 .
  • the reference value may also be representative of a reference synovial fluid obtained from a mammal that does not have articular disease.
  • said candidate compound will be judged to be effective if the value of (i) the height of the bead formed on the surface of the drop, and / or (ii) the surface of the drop and / or (iii) ) of the surface profile (Z) of the drop, as determined in step a) is substantially equal to the reference value.
  • said candidate compound will be judged to be effective if the value of (i) the height of the bead formed on the surface of the drop, and / or (ii) the surface of the drop and / or (iii) ) of the surface profile (Z) of the drop, as determined in step a), approaches the reference value representative of a synovial reference liquid while moving away from the determined value Vo before the start of administration at I 0 .
  • this method may be completed by the implementation of the following additional steps:
  • step e determining the Raman spectrum of the dried drop in step b), and f) comparing the Raman spectrum determined in step e) with a reference Raman spectrum representative of a synovial reference liquid.
  • the present invention also relates to a method for the molecular characterization of a mammalian synovial fluid, comprising the following steps:
  • the value (S) is compared with a range of values correlated with the concentration of hyaluronic acid present in a synovial fluid
  • the value (H) is compared with a range of values correlated with the concentration of proteins present in a synovial fluid.
  • S i + i corresponds to a concentration of hyaluronic acid Ci + i
  • Si + 2 corresponds to a concentration of hyaluronic acid G + 2 ;
  • S n corresponds to a concentration of hyaluronic acid C n .
  • This correlation makes it possible to perform a molecular characterization of a synovial fluid, in particular to determine its concentration of hyaluronic acid, from the value of the surface of the dried drop of said synovial fluid, without further manipulation.
  • Hi corresponds to a protein concentration Cpi
  • H i + i corresponds to a protein concentration Cpi + i
  • Hi + 2 corresponds to a protein concentration Cpi + 2 ;
  • H n corresponds to a concentration of proteins Cp n .
  • This correlation makes it possible to perform a molecular characterization of a synovial fluid, in particular to determine its protein concentration, from the value of the height of the bead formed on the surface of the dried drop of said synovial fluid, without proceeding further. extensive manipulation.
  • the two droplet surface parameters (S) and bead height (H) can advantageously be measured together on the same sample of synovial fluid, which will make it possible to determine the concentration of hyaluronic acid and proteins of this synovial fluid.
  • LS samples are taken in vivo from healthy and osteoarthritic dogs.
  • the sampling protocol in accordance with the legislation of the European Community, has been validated by the Ethics Committee (VetAgro Sup, ref. 1187 for healthy LS, 1408 for pathological LS).
  • LS samples were placed in sealed eppendorfs without additives and stored at -80 ° C until use.
  • Healthy LS samples were obtained by arthrocentesis (20G needle, 5ml syringe) on six Beagle adult dogs, 2-3 years old, clinically and radio logically healthy after intramuscular sedation and surgical joint preparation. All samples were free of normal blood contamination and appearance (transparency, turbidity, viscosity, color). Pathological LS samples were sterilely collected in the operating room on dogs from clients of the CHEV Clinic at the VetAgro Sup Veterinary Campus and requiring surgery under general anesthesia. The various joints operated showed signs of cartilage damage and various degrees of inflammation evaluated by the surgeons and noted on each operative report.
  • a standard microscope equipped with a 2048 x 2048 pixel camera was used to photograph the dried drops, with a 2.5X objective. Depending on the size of the drops, several photos may have been needed.
  • the 'Image J' software was used to reconstruct 2D photos using the 'MosaicJ' plugin and to measure the surface of each drop. 3D topographies were made by white light interferometry (smartWLI-microscope, GBS mbH, Germany) at the periphery of each drop (right side) in vertical scanning interferometry (VSI) mode with a Michelson lens.
  • VSI vertical scanning interferometry
  • the MountainsMap ® analysis software (DigitalSurf, France) enabled the reconstruction of topographic maps of size 1.4 x 1.07 mm and the recording of associated data (X, Y, Z).
  • Matlab ® routines (The Mathworks, MA, USA, R2013a version) have been developed specifically to calculate Z profiles along each topographic map.
  • the system Prior to any acquisition, the system was calibrated using the 520.7 cm- 1 line of a reference silicon sample.
  • the spectral acquisitions were performed with a 50X objective, a 0.75 numerical aperture and a wavelength of laser at 632.8 nm (HeNe, power at the sample of 12 mW) giving a spot size of 1 ⁇ Raman scattering was measured by a CCD detector (1024 ⁇ 256 pixels cooled by Peltier effect at -70 ° C.).
  • Spectral resolution is less than 1 cm -1 thanks to the use of a network 1800 lines / mm.
  • the size of the confocal hole is adjusted to 200 ⁇ for an axial resolution of 2 ⁇ m.
  • the average spectrum of each drop of LS was defined as the mean of the average spectra of each ROI.
  • the 1002 cm- 1 band of phenylalanine (so-called ring breathing band) was used to normalize the intensities (Esmonde-White et al., 2009), this band not being sensitive to conformational change. proteins.
  • PCA Principal Component Analysis
  • the drops of LS were deposited on standard glass slides and 2D images of the dried drops were captured (Figure 3).
  • the structural bands of proteins such as Amide III between 1242 and 1275 cm -1 and Amide I between 1654 and 1670 cm -1 are particularly recognizable, as well as amino acid bands such as phenylalanine (breathing mode of the aromatic cycle). at 1002 cm -1 ) and tyrosine (doublet at 828 and 850 cm -1 ).
  • the protein content can also be identified by the different modes of CH2CH3 at 1448 crrf 1 ("bending" mode), 1317 cm “1 (" twisting "mode) and 1339 cm “ 1 (“wagging” mode).
  • the presence of hyaluronic acid (HA) is identifiable by the band at 945 cm -1 and its contribution in the region 1020-1140 cm -1 (Esmonde-White et al, 2008).
  • Table 3 List of the four ratios related to hyaluronic acid, showing a high degree of correlation with the surface of the drops: mean and standard deviation of the ratios, p-value of the Mann-Whitney tests, trend of evolution, coefficients of correlation with the surface of the drops.
  • FIG. 9 graphically shows this very clear correlation (R 2 > 70%) between the surface value of the drops and the concentration of hyaluronic acid in the synovial fluid; the more the surface of the drops increases, the lower the concentration of hyaluronic acid in the synovial fluid.
  • a range of droplet surface values can be indexed over a hyaluronic acid concentration range.
  • Table 4 List of eight ratios showing a high degree of correlation with the height of the beads: mean and standard deviation of the ratios, p-value of the Mann-Whitney tests, trend of evolution, correlation coefficients with the height of the beads.
  • Figure 8 presents graphically this very clear correlation (R 2 > 85% in the dog) between the height value of the beads, and the concentration of proteins in the synovial fluid; the higher the bead height, the higher the protein concentration in this synovial fluid.
  • a range of bead height values can be indexed over a range of protein concentration.
  • This correlation makes it possible to perform a molecular characterization of a synovial fluid, in particular to determine its protein concentration, from the value of the height of the bead formed on the surface of the dried drop of said synovial fluid, without proceeding further. extensive manipulation.
  • SI inflammatory stage
  • non-inflammatory stage SNI
  • the volume of synovial fluid collected is greater in the SI group than in the SNI group, this being due to post-surgical inflammation.
  • the joint tissue samples of the SI group do not yet show visible macroscopic changes typical of osteoarthritis.
  • tissue samples from the SNI group show tissue damage characteristic of osteoarthritis.
  • the viscoelastic properties of the joint are already affected.
  • Synovial fluid from SI rabbits has significantly higher drip and bead surface area than synovial fluid from SNI rabbits, from joints with tissue damage typical of osteoarthritis but with reduced inflammation .
  • the parameters "surface of the drops” and “height of the beads” make it possible to determine whether the disease is at an inflammatory or non-inflammatory stage.
  • Raman Spectroscopy Provides a Powerful Diagnostic Tool for Accurate Determination of Albumin Glycation. PLoS ONE 7, e32406.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou déterminer le stade de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de ladite maladie, comprenant les étapes suivantes : • a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre; • b) séchage de la goutte déposée à l'étape a); • c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et • d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence. Ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface (S) de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte. La valeur de la surface (S) est représentatif de la concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide synovial et la valeur de l'hauteur maximale (H) est représentatif de la concentration de protéines présente dans un liquide synovial.

Description

PROCEDE DE DETECTION DES MALADIES ARTICULAIRES
La présente invention concerne un procédé de diagnostic.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour diagnostiquer, déterminer le type ou évaluer la sévérité d'une maladie articulaire affectant un mammifère, notamment l'arthrose.
Les maladies articulaires, ou arthropathies, touchent les articulations et comprennent notamment l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylo santé et les arthralgies.
Parmi ces maladies articulaires, l'arthrose aussi dénommée ostéo-arthrite est la plus répandue. La prévalence de l'arthrose est en constante augmentation dans le monde, car elle est liée au vieillissement et au surpoids de la population. Elle se manifeste le plus souvent par des douleurs mécaniques et/ou une gêne, lors des mouvements d'une articulation.
De nombreuses articulations peuvent être touchées par l'arthrose. Les principales sont les cervicales et les lombaires (entre 70 et 75 %), le genou (40 %), le pouce (30 %), la hanche et la cheville (10 %) et les épaules (2 %).
L'arthrose a longtemps été présentée comme une « usure » du cartilage alors qu'il s'agit bien d'un syndrome destructeur et inflammatoire, associé à différents facteurs de risque. Les scientifiques ne parlent plus d'arthrose en général mais « des arthroses » en fonction du profil du patient : arthrose liée à l'âge, arthrose liée à une obésité, arthrose liée à une maladie de l'articulation, etc. L'objectif à l'heure actuelle est d'individualiser la prise en charge et les traitements en fonction de ces différents profils.
Les lésions du cartilage ne régressent pas au cours du temps et leur évolution n'est pas linéaire. Elle peut être très rapide et rendre nécessaire la pose d'une prothèse en moins de 5 ans. L'arthrose peut également évoluer lentement, sur plusieurs années, sans induire de handicap majeur.
Le diagnostic de la maladie s'établit généralement par (i) l'observation par le patient lui-même d'une douleur ou d'une gêne dans une articulation, et (ii) une radiographie de l'articulation en question qui permet de constater de visu l'état de dégradation du cartilage. Toutefois, il n'y a pas de relation entre l'importance des lésions radio logiques et l'importance de la douleur arthrosique. Des critères de diagnostic clinique ont été développés par l'ACR (American Collège of Rheumatology), basés sur la description des douleurs et/ou gênes (Litwic et al., 2013).
Les radiographies peuvent montrer des signes très caractéristiques de l'arthrose telles que :
• le pincement articulaire,
• l'ostéophyte, c'est-à-dire un surplus d'os autour de l'articulation,
• la condensation de l'os sous le cartilage.
• les géodes dans l'os qui correspondent à des « trous ».
La sévérité de la maladie est le plus généralement mesurée selon l'échelle de
Kellgren & Lawrence, qui ont établi une échelle de scores de sévérité radiologique K/L allant de 0 à 4, cette échelle ayant été maintenant adoptée par l'OMS.
Il n'existe à ce jour que des traitements symptomatiques pour soulager la douleur. Aucune thérapeutique anti-arthrosique capable de protéger le cartilage n'est actuellement disponible.
La recherche sur les maladies articulaires se focalise actuellement sur deux objectifs principaux, d'une part trouver des cibles thérapeutiques, et d'autre part identifier des bio marqueurs (i) permettant de diagnostiquer la maladie avant l'apparition des symptômes invalidants, (ii) permettant de déterminer le type de maladie afin de personnaliser le traitement, (iii) permettant de déterminer le stade de la maladie, et (iv) permettant de prédire l'évolution de la maladie.
La présente invention concerne la réalisation de ce deuxième objectif. Actuellement, et comme indiqué précédemment, le diagnostic s'effectue sur la base de l'examen clinique et des images radiologiques. Les chercheurs s'emploient à identifier des molécules dont la présence ou la concentration dans le sérum ou l'urine pourrait servir de bio marqueur, sans que toutefois à l'heure actuelle aucune molécule candidate ne permette de catégoriser les patients (Lotz et al., 2013). Il a cependant été mis en évidence un lien entre la présence de certains micro-ARN circulants dans le sérum, et la sévérité de l'arthrose du genou ou de la hanche (Beyer et al., 2015)
Lors d'une poussée avec un épanchement de liquide intra-articulaire aussi appelé liquide synovial, l'analyse de ce liquide recueilli lors d'une ponction de l'articulation peut aider à confirmer et/ou affiner le diagnostic. Des procédé in vitro permettant d'évaluer la sévérité d'une maladie articulaire chez un mammifère, à partir d'échantillons de liquide synovial, sont activement recherchés.
L'article (Esmonde-White et al., 2009a) décrit notamment un procédé permettant de discriminer différents stades de la maladie, comprenant la mesure, sur une goutte séchée de liquide synovial, des paramètres suivants : présence de cristaux au centre de la goutte, et présence de marques d'érosion radiales sur les bords de la goutte.
De plus, en analysant la composition du liquide synovial pathologique par spectroscopie Raman, l'équipe du Dr Esmonde-White a identifié un lien entre ledit spectre Raman du liquide synovial et la sévérité, selon le score K/L, de l'arthrose du genou. En particulier, des ratios d'intensité de bandes Raman ont été corrélés de manière significative avec la sévérité radiographique de la maladie (Esmonde-White et al, 2009b).
Dans la demande US 2007/0082409, l'analyse du spectre Raman du liquide synovial a permis de déterminer la présence de certaines molécules, tel que l'acide hyaluronique (HA). Ce composé lubrifiant des articulations est un bio marqueur des maladies articulaires : en effet dans ces pathologies, il est soit dégradé, soit présent en concentration moindre suite à l'infiltration de fluides et protéines dans l'articulation ; de plus, l'acide hyaluronique présent est sous une forme moléculaire différente, de plus faible poids moléculaire, cette forme ne présentant pas les mêmes propriétés viscoélastiques que l'acide hyaluronique présent dans des articulations saines.
La détection de ce biomarqueur est indicative du stade de la maladie, mais reste toutefois difficile à mettre en œuvre, un équipement permettant d'effectuer une spectroscopie Raman étant nécessaire.
En cas de maladies articulaires, d'autres modifications moléculaires du liquide synovial sont observées telles qu'une augmentation de la concentration en protéines, et une modification du taux de glycosaminoglycances (GAG) : augmentation de leur concentration aux stades précoces, diminution aux stades avancés.
Les inventeurs ont mis en évidence un lien entre les caractéristiques morphologiques d'une goutte de liquide synovial et la présence, le type ou le stade d'une maladie articulaire touchant le mammifère dont est issu le liquide synovial. Les inventeurs ont également mis en évidence une corrélation entre les caractéristiques morphologiques d'une goutte de liquide synovial et la teneur en acide hyaluronique et en protéines dudit liquide synovial.
Le procédé tel que présenté ci-dessous permet de diagnostiquer une maladie articulaire et/ou d'obtenir des informations sur son type ou son stade et/ou de prédire son évolution, de manière simple, rapide et à faible coût.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou déterminer le stade de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de ladite maladie, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Par ailleurs, selon un mode de mise en œuvre particulier, le procédé peut comprendre de plus les étapes suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention concerne également un procédé in vitro de suivi d'un mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes : a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Ii, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu à un instant I0 antérieur à l'instant Ii,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte. La présente invention concerne également un procédé in vitro pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère atteint de ladite maladie et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte. La présente invention concerne également un procédé de criblage in vivo chez un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats audit mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a);
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
La présente invention concerne également un procédé de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a. dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b. séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c. mesure de :
• la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (S) pour cette surface est obtenue, et/ou
• la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (H) pour ladite hauteur est obtenue, et
d. comparaison de ces valeurs (S) et/ou (H) avec les gammes de valeurs suivantes: la valeur (S) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide synovial ; et
la valeur (H) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration de protéines présente dans un liquide synovial.
FIGURES
Figure 1. Représentation schématique du protocole de dépôt de gouttes (DDRS).
Figure 2. Images obtenues par la technique DDRS :
(a) Images prises au microscope à lumière blanche d'une goutte sèche de liquide synovial (LS) montrant des structures typiques dans deux régions distinctes : une zone périphérique translucide présentant des cracks radiaux et une zone centrale avec des dépôts cristallins de forme dendritiques. Les acquisitions Raman ont été réalisées dans les zones cardinales périphériques et sont représentées par des rectangles.
(b) L'image supérieure mesurée avec un interféromètre montre que les quatre ROI (Région of Interest) sont positionnées dans des zones où les solutés sont concentrés.
Figure 3. Exemples d'images 2D et 3D pour un LS sain (partie supérieure de la figure) et un LS arthrosique (LS OA - partie inférieure de la figure) : la goutte de LS sain est de taille inférieure à celle de LS OA ; sur la goutte de LS sain, un cercle noir est visible entre la périphérie extérieure et le centre, et la hauteur maximale du bourrelet est de l'ordre de 12 μιη (la hauteur est représentée par les variations de couleur noir/blanc) ; sur la goutte de LS OA, on voit clairement un bourrelet en périphérie, dont la hauteur maximale est de l'ordre de 25 μιη et est plus large que sur la goutte de LS sain.
Figure 4. A) Boîtes à moustache (i.e. « box plot ») (représentant médianes, quartiles et valeurs minimales et maximales) des surfaces des gouttes (partie gauche de la Figure 4A) et des hauteurs de bourrelet entre gouttes (partie droite de la Figure 4A) de LS sains et arthrosiques : les étoiles témoignent des différences significatives* (p<0.05) et **
(p<0.01).
B) Profils Z le long de la périphérie des gouttes sur LS sains et arthrosiques : les lignes en gras et les zones ombrées représentent respectivement la moyenne et les écart-types. La courbe supérieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets OA. La courbe inférieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets sains. Figure 5. (A) Spectres Raman moyen normalisés de LS sains chez le chien (n=6) ; macroscopiquement tous les échantillons présentaient un aspect normal (viscosité, turbidité, transparence, couleur). En ordonnées : valeur d'intensité du signal, exprimée en Unités Arbitraires (a.u.). En abscisse : nombres d'onde, exprimées en cm"1.
(B) Spectre Raman normalisé de LS arthrosique chez le chien (n=6) ; les échantillons étaient plus ou moins inflammatoires avec une couleur allant de jaune paille à orange. Le spectre en gras représente l'empreinte spectrale Raman de LS sain, la zone grisée correspond à l'écart-type. En ordonnées : valeur d'intensité du signal, exprimée en Unités Arbitraires (a.u.). En abscisse : nombres d'onde, exprimées en cm"1.
(C) Zones spectrales d'intérêt.
Partie supérieure de la Figure 5C : spectres obtenus à partir de gouttes de sujets sains ; De gauche à droite : (i) spectres dans la gamme spectrale 910 à 990 cm"1 ; (ii) spectres dans la gamme spectrale 1020 à 1145 cm"1 ; (iii) spectre dans la gamme spectrale 1220 à 1280 cm"1 ;
Partie inférieure de la Figure 5C : spectres obtenus à partir de gouttes de sujets OA ; De gauche à droite : (i) spectres dans la gamme spectrale 910 à 990 cm"1 ; (ii) spectres dans la gamme spectrale 1020 à 1145 cm"1 ; (iii) spectres dans la gamme spectrale 1220 à 1280 cm"1 ;
Les lignes verticales de la Figure 5C correspondent aux longueurs d'ondes spécifiées sur la ligne des abscisses de la partie inférieure de la figure, respectivement de gauche à droite : 945 cm 1, 960 cm 1, 970 cm 1, 1031 cm 1, 1046 cm 1, 1062 cm 1, 1081 cm 1, 1102 cm 1, 1127 cm"1, 1242 cm"1 et 1275 cm"1.
Figure 6. Résultats d'une Analyse des Composantes Principales (ACP ou PCA en anglais) basée sur 210 ratios de spectre Raman.
Chaque point (étoile pour les échantillons sains, cercle pour les échantillons malades OA) représente les 210 ratios du spectre Raman d'un échantillon. Les groupes de points sains et OA sont clairement situés dans des zones distinctes.
Figure 7. Cette figure montre une bonne corrélation entre trois ratios de pics de spectre Raman avec la quantité d'interleukine 6 (IL6) dans des échantillons de LS humain.
(A) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1062 cm"1 par rapport au pic à 945 cm"1. En abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration. (B) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1081 cm"1 par rapport au pic à 1062 cm 1. En abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration.
(C) En ordonnées : le ratio de signal du pic à 1102 cm"1 par rapport au pic à 1062 cm"1. En abscisse : la quantité d'IL6, exprimée en Logio de la concentration.
Figure 8. Les trois ratios des pics Raman 1448/1102 cm"1 (A) ; 1654/1102 cm"1 (B) ; et 1448/1317 cm"1 (C) ; sont corrélés avec la valeur (H) de hauteur des bourrelets, aussi bien dans les échantillons de LS issus d'humain que de chien. Le ratio 1031/1102 cm"1
(D) également lié aux protéines est fortement corrélé (R2>85%) avec la valeur (H) de hauteur de bourrelet chez le chien.
Figure 9. Les quatre ratios des pics Raman en relation avec l'acide hyaluronique : 1317/896 cm"1 (A) ; 1339/896 cm"1 (B) ; 1062/1046 cm"1 (C) et 1317/945 cm"1 (D), sont corrélés avec la valeur (S) de surface de la goutte de liquide synovial, dans des échantillons de LS issus de chiens.
Figure 10. (A) Boîtes à moustache (ie. « box plot ») (représentant médianes, quartiles et valeurs minimales et maximales) des surfaces des gouttes entre gouttes de LS SI (stade inflammatoire) et SNI (stade non inflammatoire) : les étoiles témoignent des différences significatives* (p<0.05) et ** (p<0.01).
(b) Boîtes à moustache (ie. « box plot ») (représentant médianes, quartiles et valeurs minimales et maximales) des hauteurs de bourrelet entre gouttes de LS SI (stade inflammatoire) et SNI (stade non inflammatoire) : les étoiles témoignent des différences significatives* (p<0.05) et ** (p<0.01).
(C) Profils Z le long de la périphérie des gouttes sur LS SI et SNI : les lignes en gras et les zones ombrées représentent respectivement la moyenne et les écart-types. La courbe supérieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets au SI. La courbe inférieure illustre les résultats obtenus sur des gouttes de sujets au SNI.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis en évidence de nouveaux biomarqueurs permettant de diagnostiquer ou de déterminer le type ou la sévérité d'une maladie articulaire, ces biomarqueurs étant des paramètres indicatifs des caractéristiques morphologiques d'une goutte séchée de liquide synovial issu d'un mammifère. Par maladie articulaire, au sens de l'invention, on entend une maladie touchant les articulations et notamment le cartilage présent au niveau de ces articulations. Cette maladie articulaire peut être de type inflammatoire ou non, dégénérative ou non, et est notamment choisie parmi l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylo santé et les arthralgies.
Par mammifère, au sens de l'invention, on entend notamment les animaux mammifères domestiques tels que les chats, les chiens, les hamsters, les lapins, les cochons d'inde et les furets ; sont également visés par la présente invention les animaux d'élevage tels que les ovins, bovins, caprins, équidés, camélidés et cervidés.
Plus particulièrement, la présente invention concerne les maladies articulaires affectant l'être humain. Dans la présente demande, le terme « patient » désigne un être humain, enfant ou adulte, affecté par une maladie articulaire.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Par « diagnostiquer » on entend, au sens de l'invention, établir la présence d'une maladie articulaire chez un patient, y compris à un stade très précoce de la maladie où les symptômes cliniques sont difficiles à déceler ou à interpréter. Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour déterminer le type de maladie articulaire affectant un mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Par « déterminer le type de maladie articulaire » on entend, au sens de l'invention, déterminer la ou les origines de la maladie articulaire, et en particulier déterminer s'il s'agit d'une maladie inflammatoire ou pas, ou s'il s'agit d'une maladie liée au profil du patient (âge, surpoids) ou à la présence d'un pathogène (bactéries, virus), ou encore s'il s'agit d'une maladie dégénérative.
En particulier, il sera possible de déterminer quelle est la maladie touchant le patient, parmi les maladies articulaires suivantes : l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et les arthralgies.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour évaluer le stade d'une maladie articulaire affectant un mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Par « évaluer le stade d'une maladie articulaire », également désigné dans la présente demande par l'expression « évaluer la sévérité d'une maladie articulaire », on entend au sens de la présente invention déterminer le stade de la maladie selon les scores cliniques et biologiques préalablement établis, comme par exemple le score de sévérité radio logique K/L.
Ce procédé permet notamment de distinguer le stade inflammatoire et le stade non inflammatoire d'une maladie articulaire.
Selon une mise en œuvre de l'invention, le procédé pour déterminer le stade d'une maladie articulaire affectant un mammifère permet également de donner un pronostic sur l'évolution de la maladie.
Selon un quatrième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour prédire l'évolution d'une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Selon un cinquième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et sévérité de la maladie articulaire, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus. Selon un sixième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et déterminer le type de ladite maladie articulaire, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
Selon un septième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour évaluer la sévérité et déterminer le type d'une maladie articulaire affectant un mammifère, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
Selon un huitième aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère, pour évaluer la sévérité et déterminer le type de ladite maladie, comprenant les étapes a) à d) listées ci-dessus.
Les procédés selon l'invention comprennent tous quatre étapes successives a) à d) dont la mise en œuvre est détaillée ci-dessous.
Etape a)
La première étape consiste en un dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre.
Echantillon de liquide synovial
Le liquide synovial (LS), ou synovie, est un liquide biologique produit par la membrane synoviale. Ce liquide est visqueux, transparent ou jaune pâle. Il est composé d'un dialysât du sérum comprenant des électrolytes, du glucose, des protéines, des glucoprotéines et de l'acide hyaluronique, et de liquide interstitiel filtré du plasma sanguin.
La présence de ce liquide dans les articulations a pour fonction de réduire la friction par son pouvoir lubrifiant, d'absorber les chocs, de fournir de l'oxygène et des nutriments aux chondrocytes du cartilage articulaire, et d'éliminer le dioxyde de carbone et les déchets métaboliques de ces cellules.
Les échantillons de liquide synovial testés selon le procédé de l'invention sont issus d'articulations de mammifères atteints ou susceptibles d'être atteints par une maladie articulaire. Les prélèvements sont effectués stérilement par intervention chirurgicale. Les échantillons sont ensuite congelés pour leur conservation.
Avant le dépôt de la goutte, ces échantillons sont centrifugés pour éliminer les cellules présentes dans le liquide synovial. Ces échantillons de LS peuvent être dilués avec des tampons classiques, ou non dilués. Ils peuvent également être traités avec des protéases et des R Ases afin de conserver au mieux les constituants biologiques.
Selon un aspect préféré de l'invention, la goutte déposée provient d'un échantillon de LS non dilué. Selon un autre aspect, l'échantillon de LS est non traité par des protéases et/ou RNAses.
Technique de « Drop Déposition »
La technique de « DD » (Drop Déposition) est bien adaptée pour l'examen des bio fluides de faible abondance, comme les larmes, le liquide synovial ou le liquide céphalo-rachidien, car il n'y a souvent pas assez de liquide pour effectuer des analyses en chromatographie ou en électrophorèse classique. Les biofluides peuvent être préparés en utilisant une seule goutte de liquide, et la même goutte séchée peut être examinée à l'aide de multiples techniques telles que la microscopie optique, l'interférométrie à lumière blanche, la microscopie à force atomique (AFM), le laser assisté par matrice désorption / ionisation (MALDI), la spectrométrie de masse, l'impédance acoustique-mécanique ou la spectroscopie optique, notamment la spectroscopie Raman.
Les multiples données obtenues à partir de quelques microlitres de biofluide sont représentatives des propriétés physiques et chimiques du fluide biologique analysé.
Nature du matériau constituant la surface plane
Dans le procédé selon l'invention, le dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial est effectué sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, en particulier de nature hydrofuge.
Le terme « matériau de nature hydrofuge » désigne un matériau imperméable, qui repousse l'eau, celle-ci ne pouvant s'immiscer dans les pores du matériau grâce à la nature même ou au revêtement du matériau.
Selon une mise en mise en œuvre particulière de l'invention, le support plan est préalablement traité pour éliminer toute trace de graisse à sa surface.
Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, le support plan présente un angle de contact avec l'eau compris entre 50° et 90°. Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, le support plan est transparent. Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, le support plan est constitué de verre.
Au sens de l'invention, le terme « verre » désigne des solides amorphes obtenus par chauffage d'un mélange, en proportions appropriées, de silice et d'oxydes métalliques. Ce sont donc des silicates mixtes, solides, non cristallins, transparents et fragiles, formés par la juxtaposition désordonnée de tétraèdres de silice Si04 et par la présence d'oxydes alcalins, alcalinoterreux, de plomb, d'aluminium, etc. Le verre est dur, cassant et transparent à la lumière visible. Le verre considéré dans la présente invention est un verre minéral, et non un verre organique.
Il peut s'agir notamment de verre sodo-calcique, ou de verre borosilicaté, de qualité adaptée à la microscopie.
Le support plan est en particulier une lame porte-objet pour microscope, en verre de qualité optique, de faible épaisseur (environ 1 mm) et sans revêtement. Ce support est particulièrement avantageux du fait de son coût très faible et de sa grande disponibilité.
L'article de Esmonde-White et al., 2014, présente une étude sur la technique DD, basée sur deux biofluides : le plasma et le liquide synovial, où plusieurs matériaux légèrement hydrophiles ont été testés comme support pour le dépôt des gouttes. Il s'agit en particulier de verre recouvert d'or ou de fluorure de calcium (CaF2). Ces matériaux sont utilisés car ils permettent d'optimiser la lecture du spectre Raman, le bruit de fond étant bien plus faible que celui généré par le verre sans revêtement. Toutefois, sur un support plan constitué de ces matériaux, les auteurs de l'article n'ont pas observé de différences au niveau des caractéristiques morphologiques des gouttes de LS issus de patient atteints d'arthrose, à différents stades de la maladie.
Etape b) : séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
Le séchage sera effectué de la manière la plus adéquate, comme cela est facilement déterminable par l'homme du métier.
Selon une mise en œuvre de l'invention, le séchage de la goutte de liquide synovial est effectué à température ambiante, pendant au moins 8 heures, voire au moins 12 heures, voire au moins 24 heures. Selon une autre mise en œuvre de l'invention, le séchage de la goutte sera effectué pendant 30 minutes ou une heure, à 37°C.
Selon d'autres mises en œuvre de l'invention, le temps de séchage pourra être raccourci jusqu'à moins de 30 minutes. En effet, le procédé de diagnostic selon l'invention sera de préférence mis en œuvre de manière rapide, pour obtenir un diagnostic dans les plus courts délais.
Une fois la goutte séchée, des images en 2 et 3 dimensions pourront être obtenues afin de réaliser les mesures détaillées ci-dessous. De telles images de gouttes séchées sont présentées en figure 3.
Etape c).
La troisième étape du procédé est une étape de mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue.
Par « paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte » on entend tous les paramètres relatifs à la taille et à la forme de la goutte, et relatifs à la taille et à la forme du bourrelet qui se crée en périphérie de la goutte (voir figure 3, OA). Les paramètres représentatifs des caractéristiques morphologiques de la goutte sont notamment la surface de la goutte, le profil de surface (Z) de la goutte, la hauteur (H) du bourrelet et la largeur du bourrelet.
Selon l'invention, le paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Il est entendu que, dans le procédé selon l'invention, l'Homme du métier pourra choisir de mesurer un seul paramètre choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte, ou de mesurer les valeurs de deux paramètres ou encore de mesurer les valeurs des trois paramètres cités ci-dessus. Tous ces paramètres sont mesurables à partir d'images 2D et/ou images 3D de la goutte séchée sur un support plan, notamment une lame de verre.
Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, l'étape c) de mesure est réalisée par une méthode d'interférométrie à lumière blanche, permettant d'obtenir les images 3D des gouttes séchées. L'interférométrie est une méthode de mesure qui exploite les interférences intervenant entre plusieurs ondes cohérentes entre elles.
Les interféromètres à lumière blanche utilisent des configurations optiques spéciales et des sources lumineuses de courte longueur de cohérence, qui optimisent l'interaction entre la lumière réfléchie par l'objet mesuré et le faisceau de référence.
La mesure elle-même est basée sur le principe de l'interféromètre de Michelson. La lumière est collimatée à partir de la source lumineuse et ensuite divisée en deux faisceaux : un faisceau objet et un faisceau de référence. Le faisceau objet est réfléchi par l'objet mesuré, et le faisceau de référence se reflète sur un miroir de référence. La lumière réfléchie à partir de chaque faisceau est captée et recombinée au niveau du diviseur de faisceau. Les faisceaux superposés sont ensuite mis en image par une caméra.
Etape d) : comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence.
Chaque valeur de paramètre mesurée à l'étape c) doit être mise en perspective avec une valeur de référence correspondante, afin de pouvoir tirer une conclusion diagnostique sur la présence d'une maladie articulaire chez un mammifère et/ou sur le type de maladie articulaire présent et/ou pour évaluer la sévérité de ladite maladie articulaire. Valeur de référence
Au sens de l'invention, on entend par « valeur de référence », une valeur d'un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques d'une ou plusieurs gouttes de LS, représentatives d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence.
Par « liquide synovial de référence » on entend, au sens de l'invention, un échantillon de LS issu d'un mammifère dont le statut vis-à-vis d'une maladie articulaire donnée est connu.
Il pourra s'agir notamment d'échantillons de LS issus de mammifères ne présentant pas de maladies articulaires, ou au contraire présentant une maladie articulaire spécifique et dont le stade est connu.
Selon une mise en œuvre de l'invention, la valeur de référence est choisie parmi une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère non atteint par une maladie articulaire, et une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère atteint par une maladie articulaire à un stade donné, notamment à un stade non inflammatoire.
Il est en effet difficile de se procurer des échantillons de liquide synovial issus d'individus sains. Ainsi, les échantillons de référence sont généralement des échantillons issus de mammifères dont le stade de la maladie est connu et caractérisé, par exemple dont le stade de la maladie est caractérisé comme étant « non inflammatoire ».
Il est entendu qu'un liquide synovial de référence sera issu d'un mammifère de la même espèce que le mammifère dont le statut vis-à-vis d'une maladie articulaire donnée est testé. En particulier, pour diagnostiquer chez un être humain une maladie articulaire, le LS de référence sera issu d'un être humain.
Il est également entendu qu'un liquide synovial de référence sera issu d'un mammifère dont le statut ou le type ou le stade de sévérité vis-à-vis d'une maladie articulaire spécifique est connu, pour diagnostiquer ou déterminer le type ou évaluer la sévérité de ladite maladie articulaire. En particulier, pour diagnostiquer ou évaluer la sévérité de l'arthrose, le LS de référence sera issu d'un mammifère dont le statut vis-à-vis de l'arthrose est connu.
Il pourra être fait usage, dans certains cas, de plusieurs valeurs de référence. Par exemple, pour évaluer la sévérité d'une arthrose chez un mammifère, la valeur d'un paramètre indicatif pourra être comparée à une première valeur de référence représentative d'un LS issu d'un mammifère atteint d'arthrose sévère, et à une seconde valeur de référence représentative d'un LS issu d'un mammifère atteint d'arthrose modérée.
Il est également entendu que pour chaque paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée, il sera affecté une valeur de référence dudit paramètre mesuré à partir d'un ou de plusieurs liquides synoviaux de référence.
Selon une mise en œuvre préférée du procédé, ladite valeur de référence est une valeur moyenne mesurée à partir de plusieurs échantillons de LS issus d'une pluralité de mammifères dont le statut vis-à-vis d'une maladie articulaire donnée est connu, en particulier issus de mammifères ne présentant pas de maladie articulaire, et en particulier de chiens ou d'êtres humains sains, c'est-à-dire non affectés par une maladie articulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation, la valeur de référence est une valeur dite « seuil » ou de « cut-off », qui est déterminée à partir de valeurs déterminées à partir (i) d'échantillons de LS issus de mammifères atteints d'une maladie articulaire, et (ii) de valeurs déterminées à partir d'échantillons de LS issus de mammifères sains, c'est-à-dire qui ne sont pas atteints par cette même maladie articulaire (LS témoins).
Une valeur moyenne de référence peut être définie, cette valeur « seuil » séparant sans ambiguïté les valeurs obtenues à partir d'échantillons de LS témoins ne présentant pas de maladie articulaire, et ceux de mammifères présentant une maladie articulaire.
Dans ce mode de réalisation, un mammifère testé selon le procédé de l'invention sera considéré comme étant atteint d'une maladie articulaire lorsque la valeur du paramètre mesurée à partir de la goutte séchée de LS dudit mammifère est signifïcativement différente de la valeur seuil de référence.
Différences significatives avec les valeurs de référence
Les exemples 1 et 2 présentés dans la présente demande ont été réalisés à partir d'échantillons de liquide synovial issus de chiens sains et de chiens présentant des signes de lésion du cartilage et divers degrés d'inflammation. L'exemple 3 est relatif à des échantillons de liquide synovial issus d'individus atteints d'arthrose. L'exemple 4 est relatif à des échantillons de liquide synovial issus de lapins développant une arthrose induite chirurgicalement par transection chirurgicale du ligament croisé antérieur.
Comme cela est connu par l'Homme du métier, les résultats mis en évidence sur ces échantillons s'appliquent également à des échantillons de LS issus d'autres espèces de mammifères, et sont donc applicables à d'autres espèces de mammifères.
Les caractéristiques morphologiques des gouttes de LS séchées ont été observées sur des images en deux dimensions (2D), ainsi que sur des images en 3D prises par interférométrie à lumière blanche. Les résultats suivants ont été observés :
- la surface des gouttes est signifïcativement plus grande dans le groupe des chiens malades (OA) que dans le groupe des chiens sains (figure 4A) ;
- la hauteur du bourrelet formé en périphérie de la goutte est signifïcativement plus grande dans le groupe des chiens malades (H moyenne = 30.09 μιη) que dans le groupe des chiens sains (H moyenne = 11.81 μιη) (figure 4 A) ;
- la valeur du profil Z (Z/X) de surface de la goutte est bien supérieure, dans le groupe des chiens malades, à la valeur de référence de ce profil de surface mesuré dans le groupe des chiens sains (figure 4B). - dans le modèle « lapin », la surface des gouttes est signifïcativement plus grande dans le groupe des lapins présentant une OA à un stade inflammatoire (SI) que dans le groupe des lapins présentant une OA à un stade non inflammatoire (SNI) (figure 10A) ;
- de même, la hauteur des bourrelets est signifïcativement plus grande lorsque le liquide synovial provient d'articulations à un stade inflammatoire (figure 10B) ;
- la valeur du profil Z (Z/X) de surface de la goutte est bien supérieure pour le liquide synovial provenant d'articulations à un stade inflammatoire (figure 10C).
Ainsi, les déductions suivantes peuvent donc être formulées :
· une valeur de surface de goutte supérieure à une valeur de référence de surface de goutte, représentative d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence issus de mammifères non atteints d'une maladie articulaire, est indicative de la présence d'une maladie articulaire ;
• une valeur de hauteur de bourrelet (H) supérieure à une valeur de référence de hauteur de bourrelet (HR), représentative d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence issus de mammifères non atteints d'une maladie articulaire, est indicative de la présence d'une maladie articulaire ;
• une valeur de profil (Z) de surface de goutte supérieure à une valeur de référence de profil (ZR) de surface de goutte, représentative d'un ou plusieurs liquides synoviaux de référence issus de mammifères non atteints d'une maladie articulaire, est indicative de la présence d'une maladie articulaire ;
• la valeur de surface de goutte, de hauteur de bourrelet et de profil de surface sont indicatives d'un stade inflammatoire de la maladie articulaire.
Etapes supplémentaires
La spectroscopie Raman, ou spectrométrie Raman, est une méthode non destructive d'observation et de caractérisation de la composition moléculaire et de la structure externe d'un matériau, qui exploite le phénomène physique selon lequel un milieu modifie légèrement la fréquence de la lumière y circulant. Ce décalage en fréquence dit « effet Raman » correspond à un échange d'énergie entre le rayon lumineux et le milieu, et donne des informations sur la composition du milieu lui-même. La spectroscopie Raman est mise en œuvre en envoyant une lumière monochromatique sur un échantillon et en analysant la lumière diffusée. Les informations obtenues par la mesure et l'analyse de ce décalage permettent de définir certaines propriétés du milieu.
Ainsi, la spectroscopie Raman de la goutte séchée de LS fournit des informations sur la composition chimique et notamment sur la présence des protéines contenues dans ladite goutte.
Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, le procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou évaluer la sévérité de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de ladite maladie, comprend de plus les étapes suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
Comme indiqué dans les exemples, tous les spectres Raman des LS issus de chiens sains ne présentent que d'infimes différences, comme l'atteste le faible écart type. Ainsi, un spectre Raman de référence peut notamment être une moyenne de plusieurs spectres Raman représentatifs de plusieurs échantillons de liquide synovial, issus de chiens sains.
Comme cela est présenté dans l'exemple 2, il a été constaté que la forme des bandes structurelles des protéines, ainsi que leurs intensités, varient signifîcativement entre les spectres Raman d'échantillons LS de chiens sains, et ceux de chiens présentant une maladie articulaire.
En particulier, dans les spectres Raman d'échantillons de LS issus de chiens atteints d'une maladie articulaire :
- de nouvelles bandes apparaissent aux emplacements 970, 1248, 1575 cm"1 et à 1542 cm"1, attribuées respectivement à la fibrine et l'hémoglobine, résultant de l'inflammation de l'articulation (Virkler and Lednev, 2010) (Figure 5B).
- La région 910-990 cm"1 s'est révélée être drastiquement différente entre spectres sains et malades : alors que seule la bande de l'acide hyaluronique à 945 cm"1 est prédominante sur les spectres sains, des bandes à 960 cm"1 et 970 cm"1 apparaissent sur les spectres des sujets arthrosiques. - La région 1020-1145 cm"1 est riche en information car contient les bandes correspondant à la phénylalanine (1031 cm"1), à l'acide hyaluronique (1046, 1102 et 1127 cm"1), à la chondroïtine 6-sulfate (C6S) (1062 cm"1) et au squelette des protéines (1081 cm 1).
- Finalement, la région 1220-1280 cm"1 des Amide III est la troisième à être notablement différente. (Figure 5C).
En conclusion, il s'avère que toutes les bandes liées au HA, au C6S et au squelette des protéines diminuent dans les échantillons de LS de chiens malades, tandis que l'on constate une augmentation des bandes de CH2/CH3 et des acides aminés, ainsi que du phosphate minéral osseux.
D'une manière générale, le spectre Raman des échantillons de LS de chiens malades est signifïcativement différent de celui des échantillons de référence (figure 6).
Par ailleurs, et comme présenté dans l'exemple 3, la valeur de hauteur (H) des bourrelets des gouttes peut être corrélée à la présence de certaines bandes Raman des gouttes de LS, telles que les bandes 1448/1102 ; 1654/1102 ; et 1448/1317 cm"1' à la fois sur les échantillons de LS de chiens et d'êtres humains (voir tableau 4 et figure 8).
Applications du procédé selon l'invention
Le procédé selon l'invention pour diagnostiquer et/ou déterminer le type et/ou évaluer la sévérité d'une maladie articulaire est notamment adapté pour les maladies articulaires suivantes : l'arthrose, l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylo santé et les arthralgies.
Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, ce procédé est adapté pour diagnostiquer et/ou déterminer le type et/ou évaluer la sévérité de l'arthrose.
La sévérité de la maladie articulaire pourra notamment être déterminée en fonction de 'scores' cliniques ou biologiques préalablement définis, notamment liés à des symptômes cliniques importants et/ou à un capital cartilagineux faible et/ou à une synovite et/ou à un remodelage osseux.
Selon une mise en œuvre de l'invention, la sévérité / le stade de la maladie articulaire correspond à des symptômes cliniques importants et/ou à un capital cartilagineux faible et/ou à une synovite et/ou à un remodelage osseux. La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro de suivi d'un mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Ii, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu à un instant Io antérieur à l'instant Ii,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte..
Selon une mise en œuvre de ce procédé, aucune valeur de référence n'est utilisée puisque les deux valeurs comparées sont celles obtenues à partir d'échantillons de LS issus d'un même mammifère, mais à deux instants différents.
Selon une mise en œuvre particulière du procédé selon l'invention, une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence est utilisée en comparaison des valeurs obtenues à partir des échantillons de LS obtenus aux instants Io et L.
Naturellement, dans ce procédé, il est également possible de comparer un grand nombre de valeurs d'un seul paramètre, obtenues à partir d'échantillons de LS obtenus à des instants Io, Ii, I2, L etc., et ainsi de suivre l'évolution de la maladie articulaire.
Selon une mise en œuvre de ce procédé, l'instant Io correspond à un instant où le mammifère présentant une maladie articulaire n'est pas encore traité pour ladite maladie, et correspond en particulier à un état « avant traitement ».
Selon une autre mise en œuvre de ce procédé, l'instant Io correspond à un instant où le mammifère présentant une maladie articulaire débute un traitement contre ladite maladie. Selon une mise en œuvre de ce procédé, l'instant Ii correspond à un instant où le mammifère présentant une maladie articulaire suit un traitement contre ladite maladie, depuis au moins un jour, deux jours, trois jours, une semaine, deux semaines, trois semaines, un mois, deux mois, ou au moins trois mois.
Selon une autre mise en œuvre de ce procédé, l'instant Ii correspond à un instant où le mammifère présentant une maladie articulaire a fini son traitement contre ladite maladie, et correspond en particulier à un état « après traitement ».
Ce procédé permet de suivre l'évolution d'une maladie, et ainsi de classifïer la pathologie en plusieurs catégories telles que : maladie à évolution lente ou rapide, maladie dégénérative, etc.
Ce procédé permet également d'évaluer l'efficacité d'un traitement donné. Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à l'étape a) est inférieure à la valeur de référence Vo correspondante déterminée avant le début du traitement à I0.
Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, ce procédé pourra être complété par la mise en œuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère atteint de ladite maladie, et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ; c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Un tel procédé permettant de suivre l'évolution et/ou l'efficacité d'un traitement, correspond à ce que l'on peut appeler un 'test compagnon' qui permet d'adapter ou de changer un traitement, en fonction de la réponse spécifique d'un individu donné à ce traitement.
Dans ce procédé, la valeur de référence pourra en particulier être représentative du liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant I0 avant le début du traitement.
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à l'étape a) est inférieure à la valeur de référence Vo correspondante déterminée avant le début du traitement à I0.
La valeur de référence pourra également être représentative d'un liquide synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à l'étape a) est sensiblement égale à la valeur de référence.
Il pourra également être utilisé deux valeurs de référence :
- une valeur de référence représentative du liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant I0 avant le début du traitement ; et
- une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire. Dans ce cas de figure, ledit traitement sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à l'étape a), se rapproche de la valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence tout en s 'éloignant de la valeur Vo déterminée avant le début du traitement à I0.
Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, ce procédé pourra être complété par la mise en œuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
La présente invention se rapporte également à un procédé de criblage chez un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats audit mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a);
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
Dans ce procédé de criblage, la valeur de référence pourra en particulier être représentative du liquide synovial dudit mammifère non humain, obtenu à un instant I0 avant le début de l'administration d'un composé candidat. Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à l'étape a) est inférieure à la valeur de référence Vo correspondante déterminée avant le début de l'administration à I0.
La valeur de référence pourra également être représentative d'un liquide synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à l'étape a) est sensiblement égale à la valeur de référence.
Il pourra également être utilisé deux valeurs de référence :
- une valeur de référence représentative du liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant I0 avant le début de l'administration du composé candidat ; et
- une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence, obtenu à partir d'un mammifère ne présentant pas de maladie articulaire.
Dans ce cas de figure, ledit composé candidat sera jugé comme étant efficace si la valeur de (i) la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte, et/ou (ii) de la surface de la goutte et/ou (iii) du profil de surface (Z) de la goutte, tels que déterminée(s) à l'étape a), se rapproche de la valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence tout en s'éloignant de la valeur Vo déterminée avant le début de l'administration à I0.
Selon une mise en œuvre préférée de l'invention, ce procédé pourra être complété par la mise en œuvre des étapes supplémentaires suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
En particulier, grâce à ce procédé de criblage in vivo, on pourra tester les composés à activité anti-arthrosique suivants : la chondroïtine sulfate, la glucosamine, la diacéréine, les insaponifïables d'avocat et de soja, et l'acide hyaluronique. Naturellement, ce procédé est essentiellement destiné à tester de nouveaux composés dont l'activité anti-arthrosique n'a pas encore été démontrée.
Procédés de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère La présente invention concerne également un procédé de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a. dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b. séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c. mesure de :
• la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (S) pour cette surface est obtenue, et/ou
• la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (H) pour ladite hauteur est obtenue, et
d. comparaison de ces valeurs (S) et/ou (H) avec les gammes de valeurs suivantes:
• la valeur (S) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide synovial ; et
• la valeur (H) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration de protéines présente dans un liquide synovial.
Comme cela est présenté dans l'exemple 2, sur les bases des résultats présentés dans le tableau 3 et la figure 9, une corrélation très nette (R2>70%) est observée entre la valeur (S) de surface des gouttes, et la concentration d'acide hyaluronique dans le liquide synovial ; plus la surface des gouttes augmente, plus la concentration d'acide hyaluronique dans le liquide synovial est faible.
Ainsi, une gamme de valeurs de surfaces de gouttes, comprenant des valeurs Si avec i = 1 à n, n étant au moins égal à 5, préférentiellement égal ou supérieur à 10, peut être indexée sur une gamme de concentration en acide hyaluronique, de la façon suivante :
Si correspond à une concentration en acide hyaluronique Ci ;
S i+i correspond à une concentration en acide hyaluronique Ci+i ; Si+2 correspond à une concentration en acide hyaluronique G+2 ;
Sn correspond à une concentration en acide hyaluronique Cn.
Une telle gamme de valeurs sera aisément obtenue par un Homme du métier, en appliquant des techniques classiques de mesure de la concentration d'acide hyaluronique.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en acide hyaluronique, à partir de la valeur de la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Ainsi, par une simple mesure de la surface (S) d'une goutte séchée, il est possible de déterminer quel est le taux d'acide hyaluronique dans un échantillon de liquide synovial, sans recourir à des techniques d'analyses plus sophistiquées et coûteuses.
De même, comme cela est illustré dans le tableau 4 et la figure 8, une corrélation très nette (R2>85%) est observée entre la valeur (H) de hauteur des bourrelets, et la concentration en protéines dans le liquide synovial ; plus la hauteur du bourrelet augmente, plus la concentration en protéines dans ce liquide synovial est élevée.
Ainsi, une gamme de valeurs de hauteur des bourrelets, comprenant des valeurs Hi avec i = 1 à n, n étant au moins égal à 5, préférentiellement égal ou supérieur à 10, peut être indexée sur une gamme de concentration en protéines, de la façon suivante :
Hi correspond à une concentration en protéines Cpi ;
H i+i correspond à une concentration en protéines Cpi+i ;
Hi+2 correspond à une concentration en protéines Cpi+2 ;
Hn correspond à une concentration en protéines Cpn.
Une telle gamme de valeurs sera aisément obtenue par un Homme du métier, en appliquant des techniques classiques de détermination de la teneur en protéines.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en protéines, à partir de la valeur de la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Ainsi, par une simple mesure de la hauteur (H) du bourrelet présent à la surface d'une goutte séchée, il est possible de déterminer quel est le taux de protéines dans un échantillon de liquide synovial, sans recourir à des techniques d'analyses plus sophistiquées et coûteuses.
Les deux paramètres surface de goutte (S) et hauteur de bourrelet (H) pourront avantageusement être mesurés conjointement sur le même échantillon de liquide synovial, ce qui permettra de déterminer la concentration en acide hyaluronique et en protéines de ce liquide synovial.
L'Homme du métier pourra ainsi obtenir des informations sur le type de maladie articulaire, ou le stade de la maladie articulaire, en fonction des concentrations en acide hyaluronique et en protéines telles que déterminées selon le procédé de l'invention.
En particulier, si ces mesures sont réalisées sur des échantillons de liquide synovial prélevés à des différents moments dans le temps, il sera possible pour l'Homme du métier de déterminer l'évolution de la maladie chez un patient, en fonction de l'évolution dans le temps de la concentration en acide hyaluronique et en protéines dans le liquide synovial.
EXEMPLES
Les exemples présentés ci-dessous sont à but illustratifs et ne limitent en rien l'invention décrite dans la présente demande.
MATERIEL ET METHODES
Echantillons de Liquide Synovial (LS)
Les échantillons de LS sont prélevés in vivo sur des chiens sains et arthrosiques. Le protocole de prélèvement, en accord avec la législation de la Communauté Européenne, a été validé par le Comité d'éthique (VetAgro Sup, saisine n°1187 pour les LS sains, n°1408 pour les LS pathologiques).
Les échantillons de LS ont été placés dans des eppendorfs hermétiques, sans additifs, puis stockés à -80°C jusqu'à leur utilisation.
Les échantillons de LS sains ont été obtenus par arthrocentèse (aiguille 20G, seringue 5ml) sur six chiens adultes de race Beagle, âgés de 2 à 3 ans, cliniquement et radio logiquement sains après sédation intramusculaire et préparation chirurgicale des articulations. Tous les échantillons étaient exempts de contamination sanguine et d'apparence (transparence, turbidité, viscosité, couleur) normale. Les échantillons de LS pathologiques ont été prélevés stérilement en bloc opératoire sur des chiens de clients de la clinique du CHEV du campus vétérinaire de VetAgro Sup et nécessitant une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Les différentes articulations opérées présentaient des signes de lésions du cartilage et divers degrés d'inflammation évalués par les chirurgiens et notés sur chaque compte-rendu opératoire.
Le tableau 1 ci- dessous résume les caractéristiques des différents échantillons :
Tableau 1
LS Age Poids Deg Diagnostic clinique
(mois) (kg)
Hl 34 10.6 (Sain)
H2 35 8.8 (Sain)
H2 34 9.8 (Sain)
H4 35 11.5 (Sain)
H5 34 11.0 (Sain)
H6 11 12.8 (Sain)
OA1 91 56.2 J Rupture des ligaments croisés
OA2 56 52.7 J Rupture des ligaments croisés
OA3 29 40.5 J Rupture des ligaments croisés
OA4 60 28 J Rupture des ligaments croisés
OA5 45 30 J Rupture des ligaments croisés
OA6 29 58.5 + Post TPLO sévère
Dépôt de gouttes
Après décongélation à température ambiante, 150 μΐ d'échantillon sont centrifugés à 3000 tr/min (soit 1000g) pendant 10 min, à 4°C. Le culot est séparé du surnageant. Des lames de verre sont préalablement dégraissées à l'alcool 70°. Des gouttes de 8 μΐ de surnageant sont ensuite déposées sur les lames puis laissées sécher à température ambiante semi-couvertes pendant une journée (Figure 1).
Observation des photos en 2D et 3D des gouttes séchées
Un microscope standard équipé d'une caméra 2048 x 2048 pixels a été utilisé pour photographier les gouttes séchées, avec un objectif 2,5X. Selon la taille des gouttes, plusieurs photos ont pu être nécessaires. Le logiciel 'Image J' a été utilisé pour reconstruire des photos 2D grâce au module d'extension (plugin) 'MosaicJ' et pour mesurer la surface de chaque goutte. Des topographies 3D ont été réalisées par interférométrie à lumière blanche (smartWLI-microscope, GBS mbH, Germany) en périphérie de chaque goutte (côté droit) en mode « vertical scanning interferometry » (VSI) avec un objectif de Michelson.
Le logiciel d'analyse MountainsMap® (DigitalSurf, France) a permis la reconstruction des cartes topographiques de taille 1.4 x 1.07 mm et l'enregistrement des données associées (X, Y, Z).
Des routines Matlab® (The Mathworks, MA, USA, version R2013a) ont été développées spécifiquement pour calculer les profils Z le long de chaque carte topographique.
DDRS (Drop Déposition RS)
Les acquisitions spectrales ont été réalisées sur un microscope confocal Raman (LabRAM HR800®, Horiba Jobin Yvon, Villeneuve d'Ascq, France). Quatre ROI (Région of Interest) ont été sélectionnées avec un objectif 10X aux quatre points cardinaux de chaque goutte, de taille 20 x 60 μιη2, dans la zone périphérique où la pré-concentration des solutés est maximum, comme cela a pu être vérifié par interférométrie (Figure 2).
Avant toute acquisition, le système a été calibré en utilisant la raie à 520.7 cm"1 d'un échantillon de silicium de référence. Les acquisitions spectrales ont été réalisées avec un objectif 50X, d'ouverture numérique 0.75 et une longueur d'onde du laser à 632.8 nm (HeNe, puissance à l'échantillon de 12 mW) donnant une taille de spot de 1 μιη. La diffusion Raman était mesurée par un détecteur CCD (1024x 256 pixels refroidi par effet Peltier à -70°C). La résolution spectrale est inférieure à 1 cm"1 grâce à l'utilisation d'un réseau 1800 traits/mm. La taille du trou confocal est ajustée à 200 μιη pour une résolution axiale de 2 um.
Dans chacune des ROI, six points ont été cartographiés, espacés chacun de
20 μιη, dans la gamme spectrale de 800 à 1780 cm"1, avec un temps d'acquisition de 30 s et 3 accumulations. Les spectres ont été enregistrés avec le logiciel LabSpec6 (Horiba Jobin Yvon, Villeneuve d'Ascq, France). Prétraitement des résultats Raman
Tous les spectres présentaient un haut rapport signal sur bruit. Tous ont été prétraités dans Matlab® (The Mathworks, MA, USA, version R2013a) par le développement de routines utilisateurs pour éliminer la fluorescence et supprimer la ligne de base.
Pour la comparaison des signatures spectrales et l'identification des bandes Raman, le spectre moyen de chaque goutte de LS a été défini comme la moyenne des spectres moyens de chaque ROI.
La bande à 1002 cm"1 de la phénylalanine (dite respiration du cycle, ou ring breathing band) a été utilisée pour normaliser les intensités (Esmonde-White et al., 2009), cette bande n'étant pas sensible au changement de conformation des protéines.
Les fonctions Gauss et Lorentz ont servi à « fitter » les pics dans des bandes spécifiques. Classiquement en spectroscopie Raman, les ratios d'intensités de pics sont utilisés plutôt que les intensités elle-même pour détecter les différences entre échantillons (Nyman et al, 2011), les ratios associés aux pics « fïttés » ont donc été calculés.
Analyses statistiques
Tous les tests statistiques ont été réalisés dans Matlab avec les outils
« Statistics and Machine Learning Toolbox ». Des tests de Mann Whitney ont été effectués sur tous les ratios calculés pour vérifier les différences statistiques entre les LS sains et arthrosiques. Le niveau de signifïcativité a été un risque -a de 5% (p<0.05). Des tests de corrélation de Pearson ont été réalisés sur ces mêmes ratios pour trouver s'il existe des corrélations entre les ratios et les caractérisations morphologiques des gouttes.
Des Analyses en Composantes Principales (ACP) ont également été réalisées sur ces ratios. L'ACP est une méthode statistique multivariée classiquement utilisée sur les données hyper spectrales pour réduire le grand nombre de variables contenu dans les spectres. Les Composantes Principales (PCs) sont calculées comme étant un nouvel ensemble de variables décorrélées, combinaisons linéaires des variables initiales corrélées, et expliquant le maximum de variance possible entre les données. Les diagrammes dits « scatter plots », permettent une visualisation aisée des résultats de l'ACP, chaque spectre étant représenté par un point dans le système d'axe des PCs. Exemple 1. Résultats obtenus par interférométrie à lumière blanche
Les gouttes de LS ont été déposées sur des lames en verre standard et des images 2D des gouttes séchées ont été capturées (Figure 3). La surface des gouttes était signifïcativement plus grande (p=0.026) dans le groupe OA malade (n=6) avec une surface moyenne {écart-typé) de 38.37 mm2 (4.80 mm2) que dans le groupe sain (n=6) avec une moyenne (écart-typé) de 31.30 mm2 (2.85 mm2) (Figure 4).
Ces images prises au microscope ont révélé la présence d'un anneau noir entre la périphérique extérieur et le centre cristallin seulement visible sur les gouttes du groupe sain tandis qu'un bourrelet se voit distinctement sur les gouttes du groupe OA.
Les images 3D prises par interférométrie (Figure 3) ont confirmé que la hauteur du bourrelet en périphérie est signifïcativement plus importante (p=0.002) dans le groupe OA (n=6) avec une hauteur moyenne (écart-typé) de 30.09 μιη (5.80 μm), soit presque trois fois supérieure à celle du groupe sain (n=6) avec une hauteur moyenne (écart-type) de 11.81 μιη (7.7i//m) (Figure 4).
Exemple 2. Résultats obtenus par analyse du spectre Raman
Aucune différence significative n'a été observée entre les différents spectres des LS sains comme en atteste le faible écart-type. La moyenne des 6 spectres des LS sains a ainsi été utilisée par la suite pour modéliser la signature spectrale des LS sains (Figure 5A).
Les bandes Raman ont été identifiées et assignées à partir d'une étude bibliographique sur le liquide synovial, les protéines, les acides aminés, le sang et le sérum (Tableau 2).
Pour comparer les spectres sains et OA, les principales bandes ont été identifiées, déconvoluées et les ratios afférents calculés. Ainsi, vingt et un pics ont été sélectionnés, identifiés dans le Tableau 2, résultant dans le calcul de deux cent dix ratios (seulement la moitié de la matrice des ratios a été utilisée, considérant qu'il n'était pas nécessaire de calculer un ratio et son inverse). Tableau 2. Bandes Raman des gouttes séchées de LS
Bande Molécule assignée Pics
Raman Raman
~ (cm 1) utilisés
. (n=2D
828 Tyrosine doublet
852 Tyrosine doublet
880 6(C-C) Tryplophan
896 Hyaluronic acid ^
945 Hyaluroîiic acid
960 v(P04 3~) of phosphate bone ^
970 Fibrin of blood
1002 C-C aromatic ring of phenylalanine (breathing mode) ^
1031 ô(C-H) of phenylalanine ^
1046 Hyaluronic acid ^
1062 v(OS03 ofchondroitin 6-sulfate ^
1081 v(C-C) or v(C-O) or v(C-N) protein and lipids ^
1102 Hyaluronic acid
1127 Hyaluronic acid ^
1 172 Tyrosine ^
1207 Tyrosine, phenylalanine ^
1242 v(C-N), δ(Ν-Η) of Amide III (β-sheet conformation) ^
1248 Fibrin of Blood
1275 v(C-N), δ(Ν-Η) of Amide III (α-helix conformation) ^
1317 CH2 CH3 twist of proteins ^
1339 Tryptophan, C¾ C¾ wag of proteins ^
1363 Heme of blood
1448 ÔCH;, (SCH, in collagen ^
1542 Heme of blood
1554 Tryptophan
1575 Fibrin of blood
1586 Phenylalanine
1605 Phenylalanine
1615 Tyrosine
1654 v(C=0) stretching of Amide I (α-helix conformation) ^
1670 v(C=0) stretching of Amide I (β-sheet conformation) ^
Les assignements ont été réalisés à partir de la bibliographie sur le LS, les protéines, les acides aminés, l'acide hyaluronique, le sang et le sérum (Alkrad et al, 2003; Bansil et al, 1978; Dingari et al, 2012; Ellis et al, 2009; Esmonde-White et al, 2008; Mandair et al, 2006; Rygula et al, 2013; Tuma, 2005; Virkler and Lednev, 2010; Wei et al, 2008)
Les bandes structurelles des protéines, comme les Amide III entre 1242 et 1275 cm"1 et les Amide I entre 1654 et 1670 cm-1 sont particulièrement reconnaissables, ainsi que les bandes des acides aminés comme la phénylalanine (mode « breathing » du cycle aromatique à 1002 cm-1) et la tyrosine (doublet à 828 et 850 cm"1). La teneur en protéine peut également être identifiée par les différents modes de CH2CH3 à 1448 crrf 1 (mode « bending »), 1317 cm"1 (mode « twisting ») et 1339 cm"1 (mode « wagging »). La présence de l'acide hyaluronique (HA) est identifiable par la bande à 945 cm"1 et sa contribution dans la région 1020-1140 cm"1 (Esmonde-White et al, 2008).
La forme des bandes et leurs intensités varient significativement entre les spectres sains et OA, dans lesquels apparaissent de nouvelles bandes comme 970, 1248 et 1575 cm"1 et à 1542 cm"1 attribuées respectivement à la fibrine et l'hémoglobine, résultant de l'inflammation de l'articulation (Virkler and Lednev, 2010) (Figure 5B).
Plusieurs zones spectrales d'intérêt ont focalisé l'attention (Figure 5C). La région 910-990 cm"1 s'est révélée être drastiquement différente entre spectres sains et OA : alors que seule la bande HA à 945 cm-1 est prédominante sur les spectres sains, des bandes à 960 cm"1 et 970 cm"1 apparaissent sur les spectres OA. La région 1020-1145 cm"1 est riche en information car contient des bandes de la phénylalanine (1031 cm"1), HA (1046, 1102 et 1127 cm"1), chondroïtine 6-sulfate (C6S) (1062 cm"1) et le squelette des protéines (1081 cm"1). Finalement, la région 1220-1280 cm"1 des Amide III est la troisième à être notablement différente.
Analyses statistiques univariées
Des tests univariés de Mann Whitney ont été réalisés sur les deux cent dix ratios calculés pour comparer le groupe sain (n=6) et le groupe OA (n=6). Cent soixante- quatre d'entre eux se sont révélés être significativement différents. L'analyse de ces ratios significativement différents permet de conclure que toutes les bandes liées au HA, au C6S et au squelette des protéines diminuent tandis que l'on peut constater une augmentation des bandes de CH2/CH3 et des acides aminés, ainsi que du phosphate minéral osseux.
Régressions linéaires
Des tests de corrélation de Pearson ont été menés sur les deux cent dix ratios pour trouver les corrélations pouvant exister entre les ratios et les caractérisations morphologiques des gouttes (hauteur des bourrelets et surfaces des gouttes).
Les tests ont montré que quatre ratios avaient une corrélation supérieure à 70%
(p<10 3) avec la surface des gouttes et dix- huit ratios avaient une corrélation supérieure 80% (p<10 4), dont 8 avec une corrélation supérieure à 85%>, avec la hauteur des bourrelets. Tous ces ratios faisaient partie des cent soixante-quatre ratios signifîcativement différents entre groupes sain et OA (Tableaux 3 et 4).
Tableau 3. Liste des quatre ratios liés à l'acide hyaluronique, montrant un haut degré de corrélation avec la surface des gouttes : moyenne et écart-types des ratios, valeur p des tests de Mann-Whitney, tendance d'évolution, coefficients de corrélation avec la surface des gouttes.
La figure 9 présente de manière graphique cette corrélation très nette (R2>70%) entre la valeur de surface des gouttes et la concentration d'acide hyaluronique dans le liquide synovial ; plus la surface des gouttes augmente, plus la concentration d'acide hyaluronique dans le liquide synovial est faible.
Ainsi, une gamme de valeurs de surfaces de gouttes peut être indexée sur une gamme de concentration en acide hyaluronique.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en acide hyaluronique, à partir de la valeur de la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans procéder à de plus amples manipulations. Une autre corrélation d'importance a été mise en évidence entre la hauteur (H) du bourrelet présent à la surface des gouttes, et le taux de protéines présent dans le LS testé, comme cela est présenté dans le tableau 4 ci-dessous et la figure 8.
Tableau 4. Liste des huit ratios montrant un haut degré de corrélation avec la hauteur des bourrelets : moyenne et écart-types des ratios, valeur p des tests de Mann- Whitney, tendance d'évolution, coefficients de corrélation avec la hauteur des bourrelets.
La figure 8 présente de manière graphique cette corrélation très nette (R2>85% chez le chien) entre la valeur de hauteur des bourrelets, et la concentration en protéines dans le liquide synovial ; plus la hauteur du bourrelet augmente, plus la concentration en protéines dans ce liquide synovial est élevée.
Ainsi, une gamme de valeurs de hauteur de bourrelet peut être indexée sur une gamme de concentration en protéines.
Cette corrélation permet d'effectuer une caractérisation moléculaire d'un liquide synovial, notamment de déterminer sa concentration en protéines, à partir de la valeur de la hauteur du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée dudit liquide synovial, sans procéder à de plus amples manipulations.
Analyse statistique multivariée
Afin d'évaluer les différences statistiques entre les spectres de LS sains et OA, une ACP a été effectuée en utilisant les deux cent dix ratios comme variables d'entrée. Les « scatter plot » des quatre premiers scores de PCA représentant 92,2% de la variance expliquée totale, ont montré que les groupes OA et sains sont distinctement séparés (Figure 6).
Exemple 3. Analyse de gouttes de liquide synovial humain
Dans cette étude, les échantillons de LS humains ont été fournis « prêts à l'emploi » par l'Hôpital Universitaire de Genève (HUG). Il s'agissait de LS prélevés in vivo sur des patients de grades radiographiques 2 et 4. Ces échantillons ont été fournis avec un certain nombre de données patients (âge, IMC) et de biomarqueurs comme les dosages de la leptine, de l'interleukine-6 (IL6) ainsi que les scores WOMAC douleur et fonction. Ces échantillons de LS ont été exploités comme présenté ci-dessus pour les échantillons de LS de chiens, à savoir dépôt de gouttes, images 2D et 3D des gouttes séchées et spectres Raman. Analyses statistiques
Tous les tests statistiques ont été réalisés dans Matlab® avec les outils « Statistics and Machine Learning Toolbox ». Des tests de corrélation de Pearson ont été réalisés sur tous les ratios pour rechercher l'existence de corrélations entre les deux cent dix ratios et (i) les biomarqueurs et (ii) les caractéristiques morphologiques des gouttes (hauteur des bourrelets et surfaces des gouttes).
Corrélation LS HUG / dosage IL6
Les tests de corrélation ont mis en évidence une corrélation linéaire supérieure à 50% entre trois ratios, tous liés à la chondroïtine 6-sulfate et le dosage en Interleukine-6 (Figure 7), pris sous forme de logio. Ces corrélations semblent très pertinentes puisqu'il est connu qu'il existe une relation entre chondroïtine 6-sulfate (un des glycosaminoglycanes de la matrice du cartilage) et l'Interleukine-6.
Corrélation LS HUG + CN / Hauteur
Comme pour le chien, des tests de corrélation de Pearson ont été réalisés sur les deux cent dix ratios pour trouver les corrélations significatives entre les ratios et les caractéristiques morphologiques des gouttes (hauteur des bourrelets et surfaces des gouttes). Les tests ont notamment montré que les ratios fortement corrélés à la hauteur des bourrelets chez l'humain, sont aussi très fortement corrélés chez le chien (Tableau 5) et qu'en outre les ratios sont très proches (Figure 8), rendant ces ratios très pertinents.
Tableau 5. Trois ratios montrent une corrélation supérieure à 70% (p<10~4) avec la hauteur des bourrelets des gouttes de LS humains. Ils sont aussi signifïcativement corrélés avec les hauteurs des bourrelets des gouttes de LS de chiens. Ratios Corrélation Hauteur
R2 HUG(%) R2 Chiens(%)
1448/1102 cm-1 72,1 86,6
1654/1102 cm- 1 73,9 86,3
1448/1317 cm-1 85,6 88,6
Exemple 4. Analyse de gouttes de liquide synovial de lapin
Un modèle animal de l'arthrose induite chirurgicalement a été développé chez le lapin : ce modèle est désigné « modèle de transection chirurgicale du ligament croisé antérieur (ACLT) ». Ce modèle est particulièrement approprié pour étudier les stades précoces de l'arthrose (Madry et al., 2016).
Deux groupes de lapins ont été étudiés :
- Un groupe « 2 semaines après induction ACLT » qui correspond au stade inflammatoire de la maladie, ci-après désigné « Stade inflammatoire (SI) » ;
- Un groupe « 6 semaines après induction ACLT » qui correspond à un stade non inflammatoire de l'arthrose, ci-après désigné « Stade non inflammatoire (SNI) ».
Dans chaque groupe, la moitié des individus a été traitée par injection d'acide hyaluronique dans l'articulation ; toutefois, aucune différence notable n'a été observée entre les lapins traités et non traités au regard des paramètres étudiés, ces différences ne sont donc pas présentées ici.
Le volume de liquide synovial prélevé est plus important dans le groupe SI que dans le groupe SNI, ceci étant dû à l'inflammation post-chirurgicale.
Les échantillons de tissus articulaires du groupe SI ne présentent pas encore de modifications macroscopiques visibles, typiques de l'arthrose. Au contraire les échantillons tissulaires du groupe SNI présentent des dégradations tissulaires caractéristiques de l'arthrose. Toutefois, dans le groupe SI, les propriétés viscoélastiques de l'articulation sont déjà affectées.
Le liquide synovial prélevé sur ces lapins a été étudié comme cela est présenté dans le chapitre « Matériel et Méthodes » ci-dessus.
Le tableau 6 ci-dessous, ainsi que la figure 10, présentent les valeurs de surface des gouttes et de hauteur des bourrelets des liquides synoviaux identifiés. Tableau 6. Valeurs moyennes et écart type de la surface et de la hauteur du bourrelet des gouttes de LS.
Le liquide synovial issu de lapins SI présente des valeurs de surface de goutte et de hauteur de bourrelets nettement supérieures que le liquide synovial issu de lapins SNI, provenant d'articulations présentant des dégradations tissulaires typiques de l'arthrose mais où l'inflammation est atténuée.
Ainsi, les paramètres « surface des gouttes » et « hauteur des bourrelets » permettent de déterminer si la maladie est à un stade inflammatoire ou non inflammatoire.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro pour diagnostiquer une maladie articulaire chez un mammifère et/ou déterminer le type de maladie articulaire et/ou déterminer le stade de ladite maladie et/ou prédire l'évolution de la maladie, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur de référence est choisie parmi une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère non atteint par une maladie articulaire, et une valeur représentative d'un liquide synovial d'un mammifère atteint par une maladie articulaire à un stade donné, notamment à un stade non inflammatoire.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le procédé comprend de plus les étapes suivantes :
e) déterminer le spectre Raman de la goutte séchée à l'étape b), et f) comparer le spectre Raman déterminé à l'étape e) avec un spectre Raman de référence représentatif d'un liquide synovial de référence.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape c) de mesure est réalisée par une méthode d'interférométrie à lumière blanche.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la maladie articulaire est l'arthrose.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le stade de la maladie articulaire correspond à des symptômes cliniques importants et/ou à un capital cartilagineux faible et/ou à une synovite et/ou à un remodelage osseux.
7. Procédé in vitro de suivi d'un mammifère présentant une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu à un instant Ii, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur obtenue en appliquant les étapes (a) à (c) du procédé à un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu à un instant I0 antérieur à l'instant Ii,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale
(H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
8. Procédé in vitro pour déterminer l'efficacité d'un traitement d'une maladie articulaire chez un mammifère atteint de ladite maladie et auquel est administré ledit traitement, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère, obtenu après le début dudit traitement, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a) ; c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
9. Procédé de criblage chez un mammifère non humain de composés candidats destinés à traiter au moins une maladie articulaire, comprenant les étapes suivantes :
a) dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère obtenu après le début de l'administration de l'un desdits composés candidats audit mammifère non humain, sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b) séchage de la goutte déposée à l'étape a);
c) mesure d'au moins un paramètre indicatif des caractéristiques morphologiques de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur pour ledit paramètre est obtenue, et
d) comparaison de chaque valeur mesurée à l'étape c) avec une valeur de référence représentative d'un liquide synovial de référence,
caractérisé en ce que ledit paramètre est choisi parmi (i) la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte, (ii) la surface de la goutte et (iii) le profil de surface (Z) de la goutte.
10. Procédé de caractérisation moléculaire d'un liquide synovial de mammifère, comprenant les étapes suivantes :
a. dépôt d'une goutte d'un échantillon de liquide synovial dudit mammifère sur un support plan constitué d'un matériau inorganique, tel que du verre ;
b. séchage de la goutte déposée à l'étape a) ;
c. mesure de : • la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (S) pour cette surface est obtenue, et/ou
• la hauteur maximale (H) du bourrelet formé à la surface de la goutte séchée à l'étape b), par quoi une valeur (H) pour ladite hauteur est obtenue, et
comparaison de ces valeurs (S) et/ou (H) avec les gammes de valeurs
• la valeur (S) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration d'acide hyaluronique présente dans un liquide synovial ; et
• la valeur (H) est comparée à une gamme de valeurs corrélée à la concentration de protéines présente dans un liquide synovial.
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