EP3465317A1 - Optische anordnung zur gepulsten beleuchtung, verfahren zur gepulsten beleuchtung und mikroskop - Google Patents

Optische anordnung zur gepulsten beleuchtung, verfahren zur gepulsten beleuchtung und mikroskop

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Publication number
EP3465317A1
EP3465317A1 EP17728139.1A EP17728139A EP3465317A1 EP 3465317 A1 EP3465317 A1 EP 3465317A1 EP 17728139 A EP17728139 A EP 17728139A EP 3465317 A1 EP3465317 A1 EP 3465317A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
frequency
laser light
optical arrangement
sequence
pulse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP17728139.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Widzgowski
Vishnu Vardhan Krishnamachari
Lars Friedrich
Manuel KREMER
Arnold Giske
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP3465317A1 publication Critical patent/EP3465317A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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    • G02B21/0064—Optical details of the image generation multi-spectral or wavelength-selective arrangements, e.g. wavelength fan-out, chromatic profiling
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    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02F—OPTICAL DEVICES OR ARRANGEMENTS FOR THE CONTROL OF LIGHT BY MODIFICATION OF THE OPTICAL PROPERTIES OF THE MEDIA OF THE ELEMENTS INVOLVED THEREIN; NON-LINEAR OPTICS; FREQUENCY-CHANGING OF LIGHT; OPTICAL LOGIC ELEMENTS; OPTICAL ANALOGUE/DIGITAL CONVERTERS
    • G02F1/00—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics
    • G02F1/01—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics for the control of the intensity, phase, polarisation or colour 
    • G02F1/11—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics for the control of the intensity, phase, polarisation or colour  based on acousto-optical elements, e.g. using variable diffraction by sound or like mechanical waves
    • G02F1/116—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics for the control of the intensity, phase, polarisation or colour  based on acousto-optical elements, e.g. using variable diffraction by sound or like mechanical waves using an optically anisotropic medium, wherein the incident and the diffracted light waves have different polarizations, e.g. acousto-optic tunable filter [AOTF]

Definitions

  • the invention relates to an optical arrangement for illuminating a sample space with a sequence of laser light pulses generated in a laser cycle, a microscope and a method for illuminating a sample space with a sequence of laser light pulses.
  • Pulse repetition frequency which corresponds to the laser clock to reduce the pulses generated, however, are costly, can reduce the stability of the laser light source and can not be adapted to any lighting situation.
  • An optical arrangement with which this can be achieved is described, for example, in EP 2 081 074 B1.
  • a so-called Pulsepicker German: pulse selector
  • the provision of the Pulse Picker at this point - in the Supercontinuumlaser - can be disadvantageous and cause additional costs.
  • the object of the present invention is thus to provide an optical arrangement, a microscope and a method which are inexpensive, allow versatile lighting applications and also do not affect the stability of a laser system.
  • Optical arrangements for illumination can be used, for example, in fluorescence microscopy, in particular using confocal or light-sheet microscopes.
  • pulsed lasers are used to excite dyes (luminophores or fluorophores) which have an afterglow following the excitation.
  • the afterglow usually required the excitation in a certain
  • Spectral range i. at a certain wavelength. If several luminophores are used simultaneously, it is desirable to be able to distinguish the luminescence of different luminophores, in particular if they have a different temporal behavior of the luminescence.
  • the above-mentioned optical arrangement for illuminating a sample space with a sequence of laser light pulses generated in a laser cycle solves the above objects in that the optical arrangement comprises an optical beam path, at least one laser light source for generating the sequence of laser light pulses along the optical beam path and having a wavelength selective pulse spreader located in the optical path.
  • the Pulspicker points in one predetermined, synchronizable with the laser light pulses lighting clock on an open state in which the pulse picker is transparent for at least one laser light pulse to the sample space, the open state has at least two different transmission states that differ with respect to their respective transmission spectrum, and wherein the two
  • Transmission states are independently switched on and / or off.
  • the microscope according to the invention in particular a PIE microscope, achieves the above objects with an optical arrangement according to the invention.
  • the method according to the invention mentioned at the outset solves the above objects by sending the laser light pulses through a wavelength-selective pulse picker, which is switched between at least two different transmission spectrums in synchronism with the laser clock.
  • the present invention differs from the previously known solutions that do not allow wavelength-selective, with the laser light pulses synchronized reduction of the pulse repetition frequency.
  • the laser light source used may emit light of multiple colors, and may preferably be a supercontinuum laser or a Raman comb laser.
  • the supercontinuum laser may include a pump light source and a non-linear fiber.
  • a non-linear fiber is meant a fiber in which nonlinear optical effects, such as self-phase modulation, of the coupled laser pulses of the pumping light source occur.
  • the laser light source emits pulsed light with at least one laser light pulse or laser pulse.
  • optical beam path is to be understood as an optical path along which the
  • the optical path is rectilinear and can be changed by optical elements such as mirrors, prisms, gratings or the like.
  • the optical beam path is essentially determined by the laser light source.
  • a transmission state is to be understood as an adjustment or a mode of the optical arrangement. Each transmission state is due to a respective transmission spectrum
  • transmission spectra preferably at least one transmission maximum exhibit.
  • Different transmission states differ by their
  • Transmission conditions may be partially identical and only in defined
  • Laser light source can be covered.
  • a supercontinuum laser for example, all wavelengths of the visible spectrum or an entire octave can be covered.
  • Distributed laser source across transmission maxima may have, wavelength ranges without a transmission maximum of a transmission state, however, may also be present.
  • the open state can be synchronized with the laser clock, it is thus ensured that a laser pulse in the pulse picker encounters a combination of transmission states which remain unchanged at least until the next lighting cycle, which can correspond to the next laser cycle.
  • the lighting clock of the pulse picker can have a lower frequency than the laser clock, so that illumination of the sample space is prevented between two cycles of the lighting clock, in other words no laser light pulse is transmitted to the sample space.
  • the lighting clock can also correspond to the laser clock, so that at each cycle of the laser clock, a laser light pulse can illuminate the sample space.
  • the pulse picker has at least three different transmission states, which can be switched independently of one another. This has the advantage that three luminophores can be used in the sample, the
  • the three luminophores can be excited at arbitrary times in the lighting cycle, any combination of the transmission states being possible.
  • the wavelength-selective pulse sputterer has an electro-optical element. This has the advantage that it allows very short switching times in the range of a few nanoseconds up to a few hundred picoseconds.
  • An electro-optical element is based on the Kerr effect in a crystal and results in a wavelength-dependent rotation of the polarization of the light passing through the electro-optical element, the wavelength dependence being variable by means of the voltage applied to the electro-optical element.
  • wavelength-selective Pulspicker an acousto-optical element.
  • An acousto-optical element also has short switching times. In contrast to the use of an electro-optical, the switching time of an acousto-optical element is dependent on the experimental conditions.
  • an acousto-optic element is based on a sound wave which is generated in a medium and propagates, among other things, the speed of sound in the medium used, as well as the diameter of the light beam to be modulated in the medium determine the switching time.
  • the sound wave precedes with the first frequency of the sound waves at the second frequency, wherein the Phase front, which is located in the transition region between the first and the second frequency, must propagate over the entire beam diameter, until there is talk of a successful switching.
  • An acousto-optical element is further based on the diffraction of electromagnetic waves on the acoustic wave, which forms a density grating. Only the wavelengths which satisfy the Bragg condition are diffracted at the density grating.
  • the remaining wavelengths which are not diffracted at the density grid and thus do not reach the sample space can nevertheless emerge from the pulse spreader and be used for other applications.
  • Conceivable applications are, for example, the illumination and generation of a stroboscopic effect, wherein the appearance of the originally broadband, preferably white appearing light changes depending on the composition of the transmission states by bending individual wavelengths or wavelength ranges on the density grating.
  • the non-diffracted light enters a beam trap and is completely absorbed in it.
  • the acousto-optical element has a crystal, wherein at least one connected to the crystal
  • Sound transducer is provided.
  • the sound transducer which can be mounted on the crystal to transmit motion, a sound wave is coupled into the crystal in a simple manner and transmitted in the crystal.
  • acoustic longitudinal waves are preferably generated, whose
  • Oscillation takes place in the propagation direction.
  • the crystal can be located between an input path, into which the laser light pulses can be coupled, and an output path, through which the at least one laser light pulse can be coupled out to the sample space
  • crystals also has the advantage that by suitable cuts of the crystals a direction of propagation through the crystal can be established, whose optical properties, such as the speed of sound, are known.
  • at least one electro-optical element and / or at least one acousto-optical element preferably an acousto-optic tunable filter (AOTF)
  • AOTF acousto-optic tunable filter
  • Supercontinuum laser white light laser, WLL
  • WLL amankammlaser
  • non-linear optical fiber or a correspondingly pulsed laser light source is arranged downstream.
  • WO 2011/154501 A1 The entire disclosure content of WO 2011/154501 A1 is hereby incorporated by reference, and all embodiments described herein also extend in the context of optical components such as e.g. AOTF, AOM, AOD, EOM, EOD, AOBM and AOBS, which are described in WO 2011/154501 AI on page 2, second paragraph to page 3, first paragraph.
  • optical components such as e.g. AOTF, AOM, AOD, EOM, EOD, AOBM and AOBS, which are described in WO 2011/154501 AI on page 2, second paragraph to page 3, first paragraph.
  • pulsed laser light sources emitting multi-wavelength light e.g., supercontinuum laser or Raman ridge laser
  • typically only one pulse picker for selecting the individual light pulses for all colors at a time can be realized by e.g. between the pumping light source and a nonlinear fiber of a
  • Supercontinuumlasers an electro- or acousto-optical element is placed. Although the functionality of the repetition rate reduction occurs, it simultaneously affects all colors. That In particular, the following configuration is provided with a supercontinuum laser with commercially available pulse picker, e.g. from EP 2 081 074 B1, not possible: illumination with a first excitation light having a wavelength of 629 nm with a
  • Repetition rate of 40 MHz a second excitation light having a wavelength of 485 nm with a repetition rate of 20 MHz and a third excitation light with a wavelength of 557 nm with a repetition rate of 40 MHz, wherein e.g. the sequence of light pulses of the second and third excitation light is time-shifted by a predeterminable period of time (e.g., 12.5 ns or 25 ns) relative to the pulse position of the first excitation light of wavelength 629 nm.
  • a predeterminable period of time e.g., 12.5 ns or 25 ns
  • Such a time sequence of the first to third excitation light would be e.g. in a picture of a sample provided with fluorescent dyes using a microscope and in particular with a scanning microscope and very particularly preferably with a confocal scanning microscope, in particular for PIE, whereby the fluorescent dyes of the sample can be excited with the first to third excitation light and the sample with the microscope or microscope the
  • the frequency sequence can be generated with a digital frequency synthesizer (frequency sequence generator).
  • a digital frequency synthesizer frequency sequence generator
  • the electro-optical element and / or the acousto-optical element is / are in this case driven by a frequency sequence suitable for this purpose, which stands for the epetitionsrate of the laser light pulses of the laser light source in a predeterminable temporal relationship and in particular is synchronous thereto.
  • Such a suitable frequency sequence can be generated by means of digital synthesizing, as e.g. in WO 2011/154501 AI is described.
  • the frequency is set alternately between at least two values corresponding to the desired colors or wavelengths, and, due to the synchronization per light pulse of the laser, those respectively applied to the current one on the AOTF
  • Vibration frequency corresponding color selected Vibration frequency corresponding color selected.
  • a drive unit is provided for generating a frequency sequence for the pulse picker, the transmission state of the pulse picker being dependent on the frequency of the frequency sequence.
  • the frequency sequence can be applied to the transducer of the Pulspicker, wherein the
  • a density grating with a spatial frequency forms, which is directly proportional to the frequency of the frequency sequence.
  • the frequency sequence can have a superposition of at least two partial signals of different frequencies.
  • each frequency of the sub-signals leads to a density grating of different spatial frequency.
  • Two different wavelengths or wavelength ranges of a pulse which impinges on the pulse picker along the optical beam path can thus be switched on independently of one another.
  • the switch-on corresponds physically to the fulfillment of the Bragg condition, in which case light of the respective wavelength is diffracted in a predetermined direction and preferably in this direction is an output of the pulse spicker, through which the diffracted light can pass.
  • the drive unit may comprise an overlay unit with which at least two frequencies in the frequency sequence can be superimposed.
  • the drive unit comprises a digital data processing device for generating a digital frequency sequence composed of a plurality of frequencies and at least one digital-to-analog converter for converting the digital frequency sequence into an analog frequency sequence.
  • Data processing device may include a digital frequency calculation device for calculating and generating at least two digital frequency sequence components of different frequency. Furthermore, a digital superposition device for superimposing the at least two digital frequency sequence components and calculating the resulting digital frequency sequence can be provided in the drive unit. The analog frequency sequence generated by the digital-to-analog converter can be fed into an amplifier and be transmitted from this amplified to the sound transducer.
  • the drive unit can be designed as a digital frequency synthesizer and can have a plurality of channels, with each of which simultaneously different vibration frequencies can be generated and with which simultaneously an electro-optical element and / or an acousto-optical element can be acted upon.
  • the frequency sequence can be pulsed.
  • changeable stored in the optical arrangement can be pulsed.
  • Lighting parameters exist on which depend the frequency of the frequency sequence and / or the control clock.
  • the illumination parameters can thus contain a sequence for each transmission state, which controls the switching on or off of the respective transmission state.
  • the switching on or off can be done periodically or aperiodically to predetermined, done with at least one clock of the laser clock matching times.
  • Transmission state can have a different sequence of switching on or off.
  • At least one at least two-colored transmission state is present, in which the transmission spectrum is at least two separate from each other
  • Excitation wavelengths may be larger and a second of the excitation wavelengths may be smaller than an excitation wavelength of a third luminophore.
  • Wavelength maxima are advantageous when it is desired that the third luminophore not be excited together with the first or second luminophore.
  • the number of transmission states is dependent in a further embodiment of the number of different frequencies in the frequency sequence. Consequently, everyone can
  • Transmission state to be assigned a different wavelength maximum in particular, each transmission state is associated with exactly one different wavelength maximum.
  • each of the sound waves has a different frequency, which correlates with the spatial frequency of the formed density grating. Further, at each density grating of a spatial frequency becomes exactly one
  • Wavelength or a wavelength range diffracted namely the one that meets the Bragg condition.
  • the number of possible wavelength maxima can correspond at most to the number of different frequencies in the frequency sequence.
  • the optical arrangement for illuminating a sample with laser pulses can be a pulsed one
  • Laser system which emits pulses in at least two different wavelength ranges in a pulse sequence and which has a Pulstriggermodul for generating a synchronized with the pulses of the laser system trigger signal. Furthermore, a drive unit with stored, changeable illumination parameters and with a trigger input, to which the Pulstriggermodul the pulsed laser system is connected to be provided, the
  • the optical arrangement can be an acousto-optical component having an input path into which the light generated by the pulsed laser system can be coupled, an output path through which the light transmitted through the acousto-optic component can be coupled out in accordance with the illumination parameters, and a crystal which with at least one
  • Sound transducer is connected include, wherein the frequency converter can be applied to the sound transducer, and wherein the sound transducer, the frequency sequence representing density grating can be generated in the crystal.
  • At least one sounder can be attached to a crystal, wherein light of the
  • Laser system can be coupled into the crystal and at least partially transmitted through the crystal and emerges from the crystal.
  • the drive unit can transmit the frequency sequence to the at least one sound generator and the sound generator generates acoustic waves in the crystal as a function of the frequency sequence.
  • the acousto-optic component of the optical arrangement may have a direction of propagation of an acoustic wave generated by the acousto-optic component and forming the density grating that does not run collinear with the input path.
  • the acoustic wave and the pulses are at an angle to each other.
  • the optical arrangement can have at least two sound transducers attached to the crystal, wherein the density grating produced thereby can preferably be a stationary density grating.
  • the standing wave is created by the superposition of two acoustic waves that pass through the crystal.
  • each transducer faces an absorber to minimize reflections of the acoustic waves, thereby minimizing switching cycle time.
  • the density grating of the optical arrangement can have at least two spatial frequencies, whereby pulses with at least two different wavelengths can be decoupled from the acousto-optical component via the output path by diffraction at the respective spatial frequencies.
  • the spatial frequencies can correspond to the two frequencies of the drive unit.
  • the density grating formed in the crystal may be stationary with respect to an envelope of the density grating upon passage of a pulse through the crystal. Since the density grating is moved in the crystal, the frequency sequence composed by interference is not stationary with respect to the crystal, however stationary to the envelope. Thus, the synchronization is between the incoming
  • the frequency sequence generated by the drive unit can be divided into isochronous signal sections of a constant frequency composition in each case, wherein a time duration of the signal sections can correspond to a period duration of the pulse train emitted by the laser system.
  • Signal sections can be the same length (in time), wherein the time window of a signal section can be as long as the time between two consecutive pulses.
  • the input path and the density grating may intersect at an interaction area, and each laser pulse passing through the interaction area may pass through only one density grating section at a time.
  • the laser pulse may substantially center the density grating section with respect to the
  • the method of operating an optical device may include the steps of generating a sequence of equidistant pulses of at least two different ones
  • the method may include generating a further density grating and superposing the density grating with the further density grating to produce a standing density grating.
  • the temporal equalization of signal sections each having the same frequency composition to a period duration of the sequence of pulses, as well as the generation of a density grating section from the signal section can be provided as a respective further method step.
  • the passage of a pulse can be synchronized by exactly one respective density grating section.
  • the concept is scalable. So it is e.g. it is possible for light pulses of four different colors (which originate from the same laser light source) to either couple a pulse sequence alternating between four corresponding oscillation frequencies into the excitation beam path of a microscope, or a frequency sequence with two frequencies at the same pulse alternating with two other frequencies for the next following pulse depending on how the specific application requires it.
  • the lattice changes in the acousto-optic crystal should be able to be changed correspondingly fast (in particular as a function of the pulse repetition frequency of the light whose pulse repetition frequency is to be reduced) in order to allow short switching times.
  • Helpful measures include a suitable selection of materials with high acoustic speed.
  • a reduction of the optical beam diameter can take place until it is focused into the AOTF crystal. This reduces the interaction area or the
  • the pulse repetition frequency of the light (of at least one wavelength), whose pulse repetition frequency is to be reduced, is preferably reduced in such a way that only a part of the original pulses in an application can be used per time interval.
  • this can be used to generate an almost arbitrary sequence of pulses of different wavelengths and their temporally predeterminable sequence.
  • Arrangement and the method can also be used for applications in spectroscopy.
  • optical arrangement or method according to the invention can be used for applications involving the light of a supercontinuum laser and / or Raman ridge laser and / or a light source with a non-linear
  • Fig. 1 shows a schematic structure of the optical arrangement according to the invention in one
  • 1 shows an exemplary embodiment of the optical arrangement 11 according to the invention, which comprises a laser light source 1 which generates pulsed laser light 2.
  • the laser light 2 is shown schematically on the basis of a sequence 36 of four light pulses 3 which propagate along an optical beam path 15.
  • the light pulses 3, also called laser pulses 3 or laser light pulses 3 have in the embodiment shown a pulse repetition frequency 13 of 80 MHz, wherein the Pulse repetition frequency 13 corresponds to the reciprocal value of a period 17 and a laser clock 35 marks.
  • the individual laser light pulses 3 are generated and emitted by the laser light source 1.
  • the period 17 has a value of 12.5 ns.
  • the optical beam path 15 is drawn with a dashed line and in this is a wavelength-selective Pulspicker 19.
  • the Pulspicker shown in the embodiment shown 19 includes an acousto-optical element 21, which is configured as acousto-optic adjustable filter 5, short AOTF 5 ,
  • the acousto-optic element 21 has a crystal 21a to which a sound transducer 21b is attached.
  • the Pulspicker 19 may be configured as an electro-optical element 22.
  • the laser light 2 may preferably be broadband and the visible spectral range 23, i.
  • An exemplary spectrum 27 of the laser light 2 is shown in FIG. This contributes an intensity 29 of the laser light 2 over the wavelength 25.
  • In the spectrum 27 of the laser light 2 are four different transmission spectra 31, which are each associated with a transmission state 33. Each of the transmission spectra 31 has a different wavelength maximum 32.
  • FIG. 1 further shows a symbolic first partial representation 101 of four transmission states 33, which repeat along a time axis 37 and are symbolized by the associated transmission spectra 31.
  • the transmission spectra 31 are plotted along a wavelength axis 39 which extends obliquely upwards into the plane of the drawing (see the spectrum 27).
  • the transmission states 33 occur in a lighting cycle 41, which in the example shown corresponds to the laser clock 35 and can also be referred to as a control clock 41a.
  • the AOTF 5 is in an open position 42.
  • switched off transmission states 33 shown in time dependence.
  • these sixteen transmission states 33 are available for lighting within a period of four lighting cycles 41, ie four open positions 42 and can be switched on and off independently in each of the open positions 42.
  • the transmission states 33 are thus temporarily discrete and bound to the lighting clock 41.
  • the laser light source 1 has a trigger output 43, via which a generated trigger signal 4 is transmitted by means of a trigger line 45.
  • the trigger signal 4 is in a second
  • Partial representation 103 shown and depends on the pulse repetition frequency 13 of the laser light source 1 from.
  • the frequency of the trigger signal 4 corresponds to the pulse repetition frequency 13.
  • the AOTF 5 is arranged downstream of the laser light source 1 in the optical beam path 15, with reference to the propagation direction 16 of the light 2.
  • the AOTF 5 is actuated by a component 6 designed as a drive unit 51, which acts on the AOTF 5 with a frequency sequence 47 output by the drive unit 51.
  • the signal 7 shown in a third partial representation 105 is a frequency sequence 47 and is transmitted via a control line 49 from the drive unit 51 to the AOTF 5.
  • a corresponding oscillation wave 53 propagates or passes through the AOTF 5 in the AOTF 5, whereby a Bragg grating 55 forms, with which the laser light 2 interacts and on which the laser light 2 is diffracted when the Bragg grating 55 forms a suitable effective lattice spacing 57 and a suitable propagation direction.
  • the Bragg grating 55 is to be understood as a density grating 59.
  • the optical beam path 15 is coupled into the AOTF 5 at an angle to the oscillation wave 53, the zeroth order 65 is not deflected by the AOTF 5, and only the first order 67 is diffracted.
  • the reciprocal value of the grating pitch 57 corresponds to a spatial frequency 61. After passing through the laser light 2 by the AOTF 5, therefore, at least the zeroth 65 and the first diffraction order 67 of the changed light 69 result, which is indicated schematically in FIG. 1 to the right of the AOTF 5.
  • the zeroth 65 and / or the first diffraction order 67 of the modified light 69 could be used for an application (general type).
  • the first diffraction order 67 of the modified light 69 is used, namely this changed light 69 is fed to a sample space 71 of a microscope 73, with which a sample provided with fluorescent dyes (both not shown) can be imaged.
  • the drive unit 51 has a trigger input 75 into which the trigger signal 4 of the trigger output 43 of the laser light source 1 is input.
  • the drive unit 51 is a device in the form of at least one digital
  • Frequency synthesizer 77 (frequency sequence generator) provided with which a digital synthesis is such that a suitable time sequence of at least one oscillation frequency 7a or frequency sequence is generated, in response to the trigger signal 4.
  • a suitable time sequence of at least one oscillation frequency 7a or frequency sequence is generated, in response to the trigger signal 4.
  • two oscillation frequencies 7a in the frequency sequence 47 consecutively combined.
  • oscillation frequencies 7a can be sequenced in time (as in FIG. 1). In this case, several oscillation frequencies 7a can occur simultaneously, i. be superimposed.
  • the frequency sequence 7 generated in this way is amplified by an amplifier 79 provided in the drive unit 51 (in the form of an analogue amplifier in this example) and fed to the AOTF 5 via a suitable line, the control line 49 (see dashed line).
  • the drive unit 51 can read out illumination parameter 81 from a lighting parameter memory and make it available to the digital frequency synthesizer 77.
  • the frequency sequence 47 is composed of two partial signals 47a and 47b, but may also be composed of more than two partial signals 47a, 47b.
  • Frequency sequence 7 that in each case a first light pulse 87 of a pulse train with a blue color, ie a first wavelength 89, is diffracted into the first diffraction order 67 and thus the microscope 73 can be fed.
  • the other light pulse portions 97 of the modified light 69 at other wavelengths of this pulse train undergo the AOTF 5 unbent and may be fed to a beam trap (not shown) should they not be needed for an application.
  • a second light pulse 93 with a red color, i. a second wavelength 95 diffracted into the first diffraction order 67 and supplied to the microscope 73.
  • every second light pulse 3 of the pulse repetition frequency 13 of the laser light 2 is diffracted with a blue or red wavelength 25 into the first diffraction order 67, with the blue out (the first light pulse 87) and the red light pulse deflected out (the second light pulse 93).
  • each of the pulse repetition frequency 13 originate from a different laser pulse 3 of the laser light source 1 and are therefore offset in time with respect to one another at a time interval 99.
  • the diffracted into the first diffraction order 67 light pulses 87 and 93 of the same wavelength 25 each have a pulse interval 99 of 25 ns, wherein a blue light pulse (the first light pulse 87) after 12.5 ns a red light pulse (the second light pulse 93 ) follows.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung (11), ein Mikroskop und ein Verfahren zur Beleuchtung eines Probenraums (71) mit einer Folge (36) von Laserlichtpulsen (3). Bekannte optische Anordnungen (11) erlauben es, eine Pulswiederholfrequenz (13) erzeugter Pulse zu verringern, sind allerdings kostenintensiv, können die Stabilität der Laserlichtquelle (1) verringern und nicht an jede Beleuchtungssituation angepasst werden. Die erfindungsgemäße optische Anordnung (11) räumt diese Nachteile aus, indem mindestens eine Laserlichtquelle (1) zur Erzeugung der Folge (36) von Laserlichtpulsen (3) entlang des optischen Strahlengangs (15) und ein sichim optischen Strahlengang (15) befindlicher, wellenlängenselektiver Pulspicker (19) vorgesehen sind, wobei der Pulspicker (19) in einem vorgegebenen, mit den Laserlichtpulsen (3) synchronisierbaren Beleuchtungstakt (41) einen Offenzustand (42) aufweist, in dem er für wenigstens einen Laserlichtpuls (3) zum Probenraum (71) hin lichtdurchlässig ist. Dabei weist der Offenzustand (42) wenigstens zwei unterschiedliche Transmissionszustände (33) auf, die sich bezüglich ihres jeweiligen Transmissionsspektrums (31) unterscheiden, wobei die beiden Transmissionszustände (33) unabhängig voneinander ein-und/oder ausschaltbar sind.

Description

Optische Anordnung zur gepulsten Beleuchtung, Verfahren zur gepulsten Beleuchtung und
Mikroskop
Die Erfindung betrifft eine optische Anordnung zur Beleuchtung eines Probenraums mit einer Folge von Laserlichtpulsen, die in einem Lasertakt erzeugt werden, ein Mikroskop und ein Verfahren zur Beleuchtung eines Probenraums mit einer Folge von Laserlichtpulsen.
Aus dem Stand der Technik bekannte optische Anordnungen erlauben es zwar, die
Pulswiederholfrequenz, diese entspricht dem Lasertakt, der erzeugten Pulse zu verringern, sind allerdings kostenintensiv, können die Stabilität der Laserlichtquelle verringern und können nicht an jede Beleuchtungssituation angepasst werden. Eine optische Anordnung, mit welcher dies erzielt werden kann, ist beispielsweise in der EP 2 081 074 Bl beschrieben. Dort ist ein sogenannter Pulsepicker (deutsch: Pulsselektor) zwischen einem modengekoppelten Faseroszillator und einem optischen Faserverstärker eines Superkontinuumlasers angeordnet. Das Vorsehen des Pulse Pickers an dieser Stelle - also im Superkontinuumlaser - kann nachteilig sein und zusätzliche Kosten verursachen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit eine optische Anordnung, ein Mikroskop und ein Verfahren zu schaffen, die kostengünstig sind, vielseitige Beleuchtungsanwendungen erlauben und zudem die Stabilität eines Lasersystems nicht beeinflussen.
Optische Anordnungen zur Beleuchtung können zum Beispiel in der Fluoreszenz-Mikroskopie, insbesondere unter Verwendung von Konfokal- oder Lichtblattmikroskopen, eingesetzt werden. In diesen Anwendungsfällen werden mit gepulsten Lasern Farbstoffe (Luminophore bzw. Fluorophore) angeregt, welche ein der Anregung nachfolgendes Nachleuchten aufweisen. Das Nachleuchten (Lumineszenz bzw. Fluoreszenz) erforderte meist die Anregung in einem bestimmten
Spektralbereich, d.h. bei einer bestimmten Wellenlänge. Werden mehrere Luminophore simultan verwendet, so ist es wünschenswert, die Lumineszenz unterschiedlicher Luminophore unterscheiden zu können, insbesondere wenn diese ein unterschiedliches zeitliches Verhalten der Lumineszenz aufweisen. Diese Schwierigkeiten sind bekannt und werden im Stand der Technik beispielsweise durch einzelne Laser gelöst, welche jeweils ein Luminophor anregen und separat angesteuert werden
Die eingangs erwähnte optische Anordnung zur Beleuchtung eines Probenraums mit einer Folge von Laserlichtpulsen, die in einem Lasertakt erzeugt werden, löst die obigen Aufgaben dadurch, dass die optische Anordnung einen optischen Strahlengang, mindestens eine Laserlichtquelle zur Erzeugung der Folge von Laserlichtpulsen entlang des optischen Strahlenganges und einen sich im optischen Strahlengang befindlichen, Wellenlänge selektiven Pulspicker aufweist. Der Pulspicker weist in einem vorgegebenen, mit den Laserlichtpulsen synchronisierbaren Beleuchtungstakt einen Offenzustand auf, in dem der Pulspicker für wenigstens einen Laserlichtpuls zum Probenraum hin durchlässig ist, wobei der Offenzustand wenigstens zwei unterschiedliche Transmissionszustände aufweist, die sich bezüglich ihres jeweiligen Transmissionsspektrums unterscheiden, und wobei die beiden
Transmissionszustände unabhängig voneinander ein- und/oder ausschaltbar sind.
Das erfindungsgemäße Mikroskop, insbesondere ein PIE- Mikroskop, löst die obigen Aufgaben mit einer optischen Anordnung gemäß der Erfindung.
Das eingangs erwähnte erfindungsgemäße Verfahren löst die obigen Aufgaben, indem bei diesem die Laserlichtpulse durch einen wellenlängenselektiven Pulspicker geschickt werden, der synchron zum Lasertakt zwischen wenigstens zwei unterschiedlichen Transmissionsspektren umgeschaltet wird.
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich damit von den bisher bekannten Lösungen, die keine wellenlängenselektive, mit den Laserlichtpulsen synchronisierte Reduktion der Pulsfolgefrequenz erlauben.
Im Folgenden werden weitere Ausgestaltungen der Erfindung beschrieben, deren zusätzliche oder alternative technische Merkmale jeweils für sich vorteilhaft sind und beliebig miteinander kombiniert werden können.
Die verwendete Laserlichtquelle kann Licht mehrerer Farben bzw. Wellenlängen emittieren und kann bevorzugt ein Superkontinuumlaser oder ein Ramankammlaser sein. Der Superkontinuumlaser kann eine Pumplichtquelle und eine nichtlineare Faser aufweisen. Unter einer nichtlinearen Faser ist eine Faser zu verstehen, in der nichtlineare optische Effekte, wie zum Beispiel Selbstphasenmodulation, der eingekoppelten Laserpulse der Pumplichtquelle auftreten. Die Laserlichtquelle emittiert gepulstes Licht mit mindestens einem Laserlichtimpuls bzw. Laserpuls.
Der optische Strahlengang ist als optischer Pfad zu verstehen, entlang dem sich die
elektromagnetischen Wellen des Lichts, bzw. bei Pulsen des elektromagnetischen Wellenpakets fortpflanzen. Der optische Strahlengang ist geradlinig und kann durch optische Elemente wie Spiegel, Prismen, Gitter oder ähnliche verändert werden. Der optische Strahlengang wird im Wesentlichen durch die Laserlichtquelle bestimmt.
Ein Transmissionszustand ist als eine Einstellung oder ein Modus der optischen Anordnung zu verstehen. Jeder Transmissionszustand ist durch ein jeweiliges Transmissionsspektrum
gekennzeichnet, wobei die Transmissionsspektren bevorzugt mindestens ein Transmissionsmaximum aufweisen. Verschiedene Transmissionszustände unterscheiden sich durch ihre
Transmissionsspektren, wobei die Transmissionsspektren zweier unterschiedlicher
Transmissionszustände partiell identisch sein können und sich lediglich in definierten
Wellenlängenbereichen unterscheiden können. Bevorzugt ist mit der Vielzahl möglicher Transmissionszustände das Emissionsspektrum der
Laserlichtquelle abdeckbar. Im Falle eines Superkontinuumlasers können somit beispielsweise alle Wellenlängen des sichtbaren Spektrums oder eine ganze Oktave abgedeckt sein. Hierunter ist zu verstehen, dass verschiedene Transmissionszustände über das Emissionsspektrum der
Laserlichtquelle hinweg verteilt Transmissionsmaxima aufweisen können, Wellenlängenbereiche ohne ein Transmissionsmaximum eines Transmissionszustandes allerdings auch vorhanden sein können.
Das Umschalten zwischen den wenigstens zwei unterschiedlichen Transmissionsspektren umfasst in einer Ausgestaltung des Verfahrens das Erzeugen eines mindestens eine Frequenz umfassende Frequenzfolge und das Anlegen der Frequenzfolge an einen Schallwandler und Um- oder
Hinzuschalten der Frequenz der Frequenzfolge.
Da der Offenzustand mit dem Lasertakt synchronisierbar ist, ist somit sichergestellt, dass ein Laserpuls im Pulspicker auf eine Kombination von Transmissionszuständen trifft, die zumindest bis zum nächsten Beleuchtungstakt, welcher dem nächsten Lasertakt entsprechen kann, unverändert bleibt. Der Beleuchtungstakt des Pulspickers kann eine niedrigere Frequenz aufweisen als der Lasertakt, so dass zwischen zwei Takten des Beleuchtungstakts eine Beleuchtung des Probenraumes verhindert wird, mit anderen Worten kein Laserlichtpuls zum Probenraum hin durchgelassen wird. Der Beleuchtungstakt kann allerdings auch dem Lasertakt entsprechen, sodass bei jedem Takt des Lasertakts ein Laserlichtpuls den Probenraum beleuchten kann. Unter dem eingangs erwähnten PIE-Mikroskop ist ein Mikroskop zu verstehen, welches eine Probe mit verschachtelten (Englisch: interleaved), mit anderen Worten zeitversetzten und zeitlich ineinandergreifenden, Pulsfolgen anregt (Englisch: excite). Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop kann in besonders vorteilhafter Weise diese sogenannte„Pulsed Interleaved Excitation (PIE)"- Funktionalität, sprich die Anregung mit verschachtelten Pulsen, in Verbindung mit einem gepulsten Mehrfarbenlaser oder mehreren zueinander synchronisierten gepulsten Mehrfarbenlasern bzw. einem Superkontinuumlaser realisiert werden, die bei einer optischen Untersuchung einer Probe mit einem Mikroskop, insbesondere mit einem Rastermikroskop und ganz besonders bevorzugt mit einem konfokalen Rastermikroskop zum Einsatz kommt.
In einer weiteren Ausgestaltung der optischen Anordnung weist der Pulspicker wenigstens drei unterschiedliche Transmissionszustände auf, die unabhängig voneinander schaltbar sind. Dies hat den Vorteil, dass drei Luminophore in der Probe verwendet werden können, wobei die
unterschiedlichen Transmissionsspektren der drei unabhängig voneinander schaltbaren
Transmissionszustände mit den Anregungsspektren der Luminophore im Wesentlichen
übereinstimmen können.
Somit können die drei Luminophore zu beliebigen Zeitpunkten im Beleuchtungstakt angeregt werden, wobei jede beliebige Kombination der Transmissionszustände möglich ist. Bei drei
Transmissionszuständen, die jeweils ein- oder ausgeschaltet sein können, ergeben sich somit acht mögliche Kombinationen.
In weiteren Ausgestaltungen können vier, fünf, sechs oder mehr ganzzahlige Transmissionszustände möglich sein. In einer weiteren Ausgestaltung der optischen Anordnung weist der wellenlängenselektive Pulspicker ein elektro-optisches Element auf. Dieses hat den Vorteil, dass es sehr kurze Schaltzeiten im Bereich weniger Nanosekunden bis hin zu wenigen hundert Pikosekunden ermöglicht. Ein elektro-optisches Element basiert auf dem Kerr-Effekt in einem Kristall und resultiert in einer wellenlängenabhängigen Rotation der Polarisation des durch das elektro-optische Element hindurchtretenden Lichtes, wobei die Wellenlängenabhängigkeit mittels der am elektro-optischen Element angelegten Spannung veränderbar ist.
In einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen optischen Anordnung weist der
wellenlängenselektive Pulspicker ein akusto-optisches Element auf. Auch ein akusto-optisches Element weist kurze Schaltzeiten auf. Im Gegensatz zur Verwendung eines elektro-optischen ist die Schaltzeit eines akusto-optischen Elements abhängig von den Versuchsbedingungen.
Da ein akusto-optisches Element auf einer Schallwelle basiert, die in einem Medium erzeugt wird und sich fortpflanzt, bestimmen unter anderem die Schallgeschwindigkeit im verwendeten Medium, als auch der Durchmesser des zu modulierenden Lichtstrahls im Medium die Umschaltzeit.
Wird beispielsweise von einer ersten Frequenz auf eine zweite Frequenz umgeschaltet, so eilt die Schallwelle mit der ersten Frequenz der Schallwellen mit der zweiten Frequenz voraus, wobei die Phasenfront, die sich im Übergangsbereich zwischen der ersten und der zweiten Frequenz befindet, über den gesamten Strahldurchmesser propagieren muss, bis von einem erfolgten Umschalten die Rede sein kann.
Ein akusto-optisches Element basiert ferner auf der Beugung elektromagnetischer Wellen an der akustischen Welle, welche ein Dichtegitter ausbildet. Am Dichtegitter werden jeweils lediglich die Wellenlängen gebeugt, welche die Bragg-Bedingung erfüllen.
In einer Ausgestaltung der Erfindung können die verbleibenden Wellenlängen, die am Dichtegitter nicht gebeugt werden und somit nicht zum Probenraum gelangen dennoch aus dem Pulspicker austreten und für andere Anwendungen genutzt werden. Denkbare Anwendungsfälle sind zum Beispiel das Beleuchten und Erzeugen eines Stroboskopeffektes, wobei sich durch das Beugen einzelner Wellenlängen bzw. Wellenlängenbereiche am Dichtegitter das Erscheinungsbild des ursprünglich breitbandigen, bevorzugt weiß erscheinenden Lichtes je nach Zusammensetzung der Transmissionszustände ändert.
Im einfachsten Fall tritt das nicht gebeugte Licht in eine Strahlfalle ein und wird in dieser vollständig absorbiert.
In einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen optischen Anordnung weist das akusto- optische Element einen Kristall auf, wobei mindestens ein mit dem Kristall verbundener
Schallwandler vorgesehen ist. Mit dem Schallwandler, der bewegungsübertragend am Kristall befestigt sein kann, wird auf einfache Weise eine Schallwelle in den Kristall eingekoppelt und im Kristall übertragen. Dabei werden bevorzugt akustische Longitudinalwellen erzeugt, deren
Schwingung in Ausbreitungsrichtung erfolgt.
Akustische Transversalwellen sind ebenso denkbar, allerdings weisen diese im Allgemeinen eine geringere Schallgeschwindigkeit als Longitudinalwellen auf.
Der Kristall kann sich zwischen einem Eingangspfad, in den die Laserlichtpulse einkoppelbar sind, und einem Ausgangspfad, durch den der wenigstens eine Laserlichtpuls zum Probenraum hin auskoppelbar ist, befinden
Die Verwendung von Kristallen hat weiterhin den Vorteil, dass durch geeignete Schnitte der Kristalle eine Propagationsrichtung durch den Kristall hindurch festgelegt werden kann, deren optische Eigenschaften, wie zum Beispiel die Schallgeschwindigkeit, bekannt sind. Erfindungsgemäß kann somit mindestens ein elektro-optisches Element und/oder mindestens ein akusto-optisches Element, bevorzugt ein akusto-optisches, steuerbares Filter (acousto-optical tunable filter: AOTF), an einer Stelle im optischen Strahlengang angeordnet sein, die - bezogen auf die Ausbreitungsrichtung des Lichts - der Laserlichtquelle, d.h. beispielsweise dem
Superkontinuumlaser (Weißlichtlaser, WLL) oder dem amankammlaser oder einer nicht-linearen (photokristallinen) optischen Faser bzw. einer entsprechend gepulsten Laserlichtquelle nachgeordnet ist.
Der gesamten Offenbarungsgehalt der WO 2011/154501 AI wird hier mit einbezogen und sämtliche hier beschriebenen Ausführungsformen erstrecken sich auch im Kontext auf optischen Bauteile wie z.B. AOTF, AOM, AOD, EOM, EOD, AOBM und AOBS, welche in der WO 2011/154501 AI auf Seite 2, zweiter Absatz bis Seite 3, erster Absatz beschrieben sind.
Problematisch mit gepulsten Laserlichtquellen, welche Licht mit mehreren Farben bzw. Wellenlängen emittieren (z.B. Superkontinuumlaser oder Ramankammlaser), ist, dass üblicherweise nur ein Pulsepicker zum Selektieren der einzelnen Lichtpulse nur für alle Farben gleichzeitig realisiert werden kann, indem z.B. zwischen der Pumplichtquelle und einer nichtlinearen Faser eines
Superkontinuumlasers ein elektro- oder akusto-optisches Element platziert wird. Die Funktionalität der Repetitionsratenreduktion tritt zwar ein, wirkt aber auf alle Farben simultan. D.h. insbesondere ist folgende Konfiguration mit einem Superkontiuumlaser mit handelsüblichem Pulsepicker, wie z.B. aus der EP 2 081 074 Bl bekannt, nicht möglich: Beleuchtung mit einem ersten Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 629 nm mit einer
Repetitionsrate von 40 MHz, einem zweiten Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 485 nm mit einer Repetitionsrate von 20 MHz und einem dritten Anregungslicht mit einer Wellenlänge von 557 nm mit einer Repetitonsrate von 40 MHz, wobei z.B. die Abfolge der Lichtpulse des zweiten und dritten Anregungslichts um eine vorgebbare Zeitdauer (z.B. 12,5 ns oder 25 ns) relativ zur Pulslage des ersten Anregungslichts mit der Wellenlänge 629 nm zeitlich verschoben ist.
Eine solche zeitliche Abfolge des ersten bis dritten Anregungslichts wäre z.B. bei einer Abbildung einer mit Fluoreszenzfarbstoffen versehenen Probe mithilfe eines Mikroskops und insbesondere mit einem Rastermikroskop und ganz besonders bevorzugt mit einem konfokalen Rastermikroskop insbesondere für PIE hilfreich, wobei die Fluoreszenzfarbstoffe der Probe mit dem ersten bis dritten Anregungslicht angeregt werden können und die Probe mit dem Mikroskop bzw. dem
Rastermikroskop bzw. dem konfokalen Rastermikroskop abgebildet bzw. untersucht wird. Das Problem kann dadurch gelöst werden, dass ein AOTF, bei welchem die Farbselektion über das Setzen einer Schwingungsfrequenz geschieht, mit Hilfe eines digital gemischten Steuersignals, d.h. einer digital gemischten Frequenzfolge, synchron zur Laserrepetitionsrate angesteuert wird.
Bevorzugt kann die Frequenzfolge mit einem digitalen Frequenzsynthesizer (Frequenzfolgegenerator) erzeugt werden.
Das elektro-optische Element und/oder das akusto-optische Element wird/werden hierbei mit einer hierzu geeigneten Frequenzfolge angesteuert, die zur epetitionsrate der Laserlichtpulse der Laserlichtquelle in einer vorgebbaren zeitlichen Beziehung steht und insbesondere synchron dazu ist.
Eine solche geeignete Frequenzfolge kann mittels einer digitalen Synthetisierung erzeugt werden, wie dies z.B. in der WO 2011/154501 AI beschrieben ist.
Dabei wird in bestimmter Abfolge die Frequenz zwischen mindestens zwei zu den gewünschten Farben bzw. Wellenlängen entsprechenden Werten alternierend eingestellt, und aufgrund der Synchronisierung pro Lichtpuls des Lasers jeweils die zu der gerade am AOTF anliegenden
Schwingungsfrequenz entsprechende Farbe ausgewählt. In einer Ausgestaltung der optischen Anordnung ist eine Ansteuereinheit zur Erzeugung einer Frequenzfolge für den Pulspicker vorgesehen, wobei der Transmissionszustand des Pulspickers abhängig von der Frequenz der Frequenzfolge ist.
Die Frequenzfolge kann an den Schallwandler des Pulspicker angelegt werden, wobei der
Schallwandler mit der Frequenz der Frequenzfolge schwingt. Im Kristall breitet sich folglich eine mit dieser Frequenz schwingende Schallwelle aus, die entsprechend der Schallgeschwindigkeit im
Material, insbesondere im Kristall, ein Dichtegitter mit einer Raumfrequenz ausbildet, welche direkt proportional zur Frequenz der Frequenzfolge ist.
Ferner kann in einer weiteren Ausgestaltung der optischen Anordnung die Frequenzfolge eine Überlagerung wenigstens zweier Teilsignale unterschiedlicher Frequenz aufweisen. Dies hat den Vorteil, dass jede Frequenz der Teilsignale zu einem Dichtegitter unterschiedlicher Raumfrequenz führt. Zwei unterschiedliche Wellenlängen bzw. Wellenlängenbereiche eines Pulses, der entlang des optischen Strahlengangs auf den Pulspicker trifft, können somit unabhängig voneinander eingeschaltet werden. Das Einschalten entspricht physikalisch dem Erfüllen der Bragg-Bedingung, wobei in diesem Fall Licht der betreffenden Wellenlänge in eine vorbestimmte Richtung gebeugt wird und bevorzugt in diese Richtung ein Ausgang des Pulspicker liegt, durch den das gebeugte Licht hindurchtreten kann.
Da das in den Pulspicker eintretende Licht gepulst ist, ist auch ein gemäß einem
Transmissionszustand selektierter spektraler Anteil gepulst. Auf die Erhöhung der Pulsdauer aufgrund einer verringerten Bandbreite wird an dieser Stelle nicht eingegangen, da die Lumineszenz im Allgemeinen eine Anstiegszeit im Bereich von Pikosekunden bis Mikrosekunden aufweist und sich somit die Anregung eines Luminophors mit einer Pulsdauer von 10 fs nicht von der Anregung mit einer Pulsdauer von beispielsweise 300 fs unterscheidet. Die Ansteuereinheit kann eine Überlagerungseinheit umfassen, mit der mindestens zwei Frequenzen in der Frequenzfolge überlagerbar sind. Insbesondere umfasst die Ansteuereinheit eine digitale Datenverarbeitungsvorrichtung zur Erzeugung einer digitalen, aus mehreren Frequenzen zusammengesetzten Frequenzfolge und mindestens einen Digital-Analogwandler zur Umwandlung der digitalen Frequenzfolge in eine analoge Frequenzfolge. Die digitale
Datenverarbeitungsvorrichtung kann dabei eine digitale Frequenzberechnungsvorrichtung zur Berechnung und Erzeugung mindestens zweier digitaler Frequenzfolgeanteile unterschiedlicher Frequenz umfassen. Ferner kann in der Ansteuereinheit eine digitale Überlagerungsvorrichtung zur Überlagerung der mindestens zwei digitalen Frequenzfolgeanteile und Berechnung der daraus resultierenden digitalen Frequenzfolge vorgesehen sein. Die durch den Digital-Analogwandler erzeugte analoge Frequenzfolge kann in einen Verstärker einspeisbar sein und von diesem verstärkt an den Schallwandler weitergegeben werden.
Die Ansteuereinheit kann als digitaler Frequenzsynthesizer ausgestaltet sein und kann mehrere Kanäle aufweisen, mit welchen jeweils simultan unterschiedliche Schwingungsfrequenzen erzeugt werden können und mit welchen simultan ein elektro-optisches Element und/oder ein akusto- optisches Element beaufschlagt werden kann.
In einer weiteren Ausgestaltung der erfindungsgemäßen optischen Anordnung weist die
Frequenzfolge einen mit dem Lasertakt synchronisierten Steuertakt auf. Dies hat den Vorteil, dass die Frequenzfolge zum Zeitpunkt eines Im Pulspicker eintreffenden Laserpulses nicht geändert wird und somit jeder Laserpuls eine eindeutige Zusammensetzung von Transmissionszuständen im
Offenzustand des Pulspickers erfährt.
Die Frequenzfolge kann gepulst sein. In einer weiteren Ausgestaltung sind in der optischen Anordnung gespeicherte, änderbare
Beleuchtungsparameter vorhanden, von denen die Frequenz der Frequenzfolge und/oder der Steuertakt abhängen. Die Beleuchtungsparameter können somit für jeden Transmissionszustand eine Abfolge enthalten, welche das Ein- oder Ausschalten des jeweiligen Transmissionszustandes steuert. Das Ein- oder Ausschalten kann periodisch erfolgen oder aber aperiodisch zu vorgegebenen, mit mindestens einem Takt des Lasertaktes übereinstimmenden Zeitpunkten erfolgen. Jeder
Transmissionszustand kann hierbei eine unterschiedliche Abfolge des Ein- oder Ausschaltens aufweisen.
In einer weiteren Ausgestaltung ist mindestens ein wenigstens zweifarbiger Transmissionszustand vorhanden, in dem das Transmissionsspektrum wenigstens zwei voneinander getrennte
Wellenlängenmaxima aufweist. Dies hat den Vorteil, dass Luminophore, deren Lumineszenz sich nicht gegenseitig beeinflusst (kein Cross-talk) zeitgleich angeregt werden können. Eine der
Anregungswellenlängen kann größer und eine zweite der Anregungswellenlängen kleiner als eine Anregungswellenlänge eines dritten Luminophors sein. Zwei voneinander getrennte
Wellenlängenmaxima sind vorteilhaft, wenn es erwünscht ist, dass das dritte Luminophor nicht zusammen mit dem ersten oder zweiten Luminophor angeregt wird.
Die Zahl der Transmissionszustände ist dabei in einer weiteren Ausgestaltung von der Anzahl unterschiedlicher Frequenzen in der Frequenzfolge abhängig. Folglich kann jedem
Transmissionszustand ein unterschiedliches Wellenlängenmaximum zugeordnet sein, insbesondere ist jedem Transmissionszustand genau ein unterschiedliches Wellenlängenmaximum zugeordnet.
Mit anderen Worten ist im Pulspicker eine Überlagerung mehrerer Schallwellen vorhanden. Jede der Schallwellen weist eine unterschiedliche Frequenz auf, die mit der Raumfrequenz des ausgebildeten Dichtegitters korreliert. Ferner wird an jedem Dichtegitter einer Raumfrequenz genau eine
Wellenlänge bzw. ein Wellenlängenbereich gebeugt, und zwar diejenige, welche die Bragg- Bedingung erfüllt. Die Anzahl der möglichen Wellenlängenmaxima kann dabei maximal der Anzahl unterschiedlicher Frequenzen in der Frequenzfolgeentsprechen.
Die optische Anordnung zur Beleuchtung einer Probe mit Laserpulsen, kann ein gepulstes
Lasersystem umfassen, welches in einer Pulsfolge Pulse in mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängen bereichen emittiert und welches ein Pulstriggermodul zur Erzeugung eines mit den Pulsen des Lasersystems synchronisierten Triggersignals aufweist. Ferner kann eine Ansteuereinheit mit gespeicherten, änderbaren Beleuchtungsparametern und mit einem Triggereingang, an den das Pulstriggermodul des gepulsten Lasersystems anschließbar ist vorgesehen sein, wobei die
Ansteuereinheit in Abhängigkeit der gespeicherten Beleuchtungsparameter und des Triggersignals eine sich zeitlich periodisch ändernde Frequenzfolge generiert, welches sich aus mindestens zwei Frequenzen zusammensetzt. Ferner kann die optische Anordnung ein akusto-optisches Bauteil mit einem Eingangspfad, in den das vom gepulsten Lasersystem erzeugte Licht einkoppelbar ist, einen Ausgangspfad, durch den das durch das akusto-optische Bauteil transmittierte Licht gemäß den Beleuchtungsparametern auskoppelbar ist, und einem Kristall, der mit mindestens einem
Schallwandler verbunden ist umfassen, wobei an den Schallwandler die Frequenzfolge anlegbar ist, und wobei mit dem Schallwandler ein, die Frequenzfolge repräsentierendes Dichtegitter im Kristall generierbar ist.
Hierbei kann wenigstens ein Schallgeber an einem Kristall befestigt sein, wobei Licht des
Lasersystems in den Kristall einkoppelbar ist und zumindest partiell durch den Kristall transmittiert wird und aus dem Kristall austritt. Die Ansteuereinheit kann die Frequenzfolge an den mindestens einen Schallgeber übertragen und der Schallgeber in Abhängigkeit von der Frequenzfolge akustische Wellen im Kristall generieren.
Das akusto-optische Bauteil der optischen Anordnung kann eine Ausbreitungsrichtung einer durch das akusto-optische Bauteil erzeugten und das Dichtegitter ausbildenden akustischen Welle aufweisen, die nichtkollinear zum Eingangspfad verläuft. Mit anderen Worten verlaufen die akustische Welle und die Pulse unter einem Winkel zueinander. Die optische Anordnung kann mindestens zwei am Kristall angebrachte Schallwandler aufweisen, wobei das hierdurch erzeugte Dichtegitter bevorzugt ein stehendes Dichtegitter sein kann. Die stehende Welle entsteht dabei bei Überlagerung von zwei akustischen Wellen, die durch den Kristall laufen. Typischerweise liegt jedem Schallwandler ein Absorber gegenüber, um Reflexionen der akustischen Wellen zu minimieren, wodurch die Schaltlaufzeit minimiert wird. Das Dichtegitter der optischen Anordnung kann mindestens zwei Raumfrequenzen aufweisen, wobei durch Beugung an den jeweiligen Raumfrequenzen Pulse mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängen über den Ausgangspfad aus dem akusto-optischen Bauteil auskoppelbar sind. Die Raumfrequenzen können den zwei Frequenzen der Ansteuereinheit entsprechen.
Das im Kristall ausgebildete Dichtegitter kann beim Durchgang eines Pulses durch den Kristall stationär bezüglich einer Hüllkurve des Dichtegitters sein. Da das Dichtegitter im Kristall bewegt ist, ist die durch Interferenz zusammensetzende Frequenzfolge nicht stationär bezüglich des Kristalls, jedoch stationär zur Hüllkurve. Somit ist die Synchronisierung zwischen den eintreffenden
Laserpulsen und den Dichtegitter-Abschnitten möglich. Ferner ist sichergestellt, dass zum Zeitpunkt des Eintreffens eines Pulses der Wechsel der Frequenzzusammensetzung der akustischen Welle bereits abgeschlossen ist und unbestimmte Frequenzzustände (Oberwellen oder Ähnliches) nicht auftreten.
Die von der Ansteuereinheit generierte Frequenzfolge kann in isochrone Signalabschnitte jeweils konstanter Frequenzzusammensetzung aufteilbar sein, wobei eine Zeitdauer der Signalabschnitte einer Periodendauer der vom Lasersystem emittierten Pulsfolge entsprechen kann. Die
Signalabschnitte können gleich lang (zeitlich) sein, wobei das Zeitfenster eines Signalabschnittes genauso lang sein kann wie die Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Pulsen.
Durch den Schallwandler können aus den Signalabschnitten jeweils konstanter
Frequenzzusammensetzung Dichtegitterabschnitte jeweils konstanter
Raumfrequenzzusammensetzung generierbar sein.
Ferner kann sich der Eingangspfad und das Dichtegitter in einem Interaktionsbereich kreuzen, und jeder, den Interaktionsbereich durchlaufende Laserpuls kann jeweils nur einen Dichtegitterabschnitt passieren.
Der Laserpuls kann den Dichtegitterabschnitt im Wesentlichen zentral bezüglich der
Ausbreitungsrichtung der akustischen Welle passieren.
Das Verfahren zum Betreiben einer optischen Anordnung kann die folgenden Schritte umfassen: das Erzeugen einer Abfolge äquidistanter Pulse mindestens zweier unterschiedlicher
Wellenlängenbereiche und das Ausgeben eines mit der Pulsfolge synchronen Lasertakts; das Auslesen von Beleuchtungsparametern und Generieren einer Frequenzfolge durch das
Überlagern mindestens zweier Frequenzen in Abhängigkeit der Beleuchtungsparameter und des Lasertakts; das Übertragen der Frequenzfolge an einen Schallwandler und das Erzeugen eines, die Frequenzfolge repräsentierenden Dichtegitters in einem Kristall; das Einkoppeln der äquidistanten Pulse in den Kristall; und das wellenlängenselektive Auskoppeln von Pulsen aus dem Kristall. Ferner kann das Verfahren das Erzeugen eines weiteren Dichtegitters und das Überlagern des Dichtegitters mit dem weiteren Dichtegitter zur Erzeugung eines stehenden Dichtegitters umfassen.
Das zeitliche Angleichen von Signalabschnitten jeweils gleicher Frequenzzusammensetzung an eine Periodendauer der Abfolge der Pulse, als auch das Erzeugen eines Dichtegitterabschnittes aus dem Signalabschnitt kann als jeweils weiterer Verfahrensschritt vorgesehen sein.
Im Verfahren kann das Passieren eines Pulses durch jeweils genau einen Dichtegitterabschnitt synchronisiert sein.
Ganz besonders vorteilhaft ist das Konzept skalierbar. So ist es z.B. möglich, dass Lichtpulse von vier unterschiedlichen Farben (die von derselben Laserlichtquelle stammen) entweder eine zwischen vier entsprechenden Schwingungsfrequenzen alternierende Pulsabfolge in den Anregungsstrahlengang eines Mikroskops einzukoppeln, oder eine Frequenzabfolge mit je zwei Frequenzen zum gleichen Puls, alternierend zu zwei anderen Frequenzen zum nächsten folgenden Puls anzulegen, je nachdem, wie die konkrete Applikation dies erfordert.
Durch die Freiheiten einer digitalen Synthetisierung der im Prinzip beliebiger Frequenzmischungen und Frequenzabfolgen sind auch Sonderkonfigurationen des Pulspickers möglich, wie z.B. zwei Farben mit jedem Takt des Lasertakts herauszubeugen, bei der dritten und vierten Farbe z.B. nur jeden zweiten Puls mit entsprechender für das„PIE" Verfahren üblichen zeitlichen Verschiebung, und bei der fünften Farbe nur jeden vierten Puls. Unter dem Begriff Farbe ist eine Wellenlänge bzw. ein Wellenlängenbereich zu verstehen, die/der aufgrund eines Transmissionsmaximums vom Pulspicker zum Probenraum gelangt. Dies geschieht durch das Beugen bzw. Herausbeugen aus dem akusto- optischen Element.
Die Gitteränderungen im akusto-optischen Kristall sollten entsprechend schnell (insbesondere in Abhängigkeit der Pulswiederholfrequenz des Lichts, dessen Pulswiederholfrequenz zu verringern ist) geändert werden können, um geringe Umschaltzeiten zu erlauben. Hilfreiche Maßnahmen sind unter anderem eine geeignete Auswahl der Materialien mit hoher akustischer Geschwindigkeit. Alternativ oder zusätzlich kann eine Verkleinerung des optischen Strahldurchmessers, bis zum Fokussieren in den AOTF Kristall erfolgen. Dies verkleinert die Wechselwirkungsfläche bzw. das
Wechselwirkungsvolumen des zu veränderten Lichts mit dem Dichtegitter im akusto-optischen Kristall bzw. ermöglicht es, dieses möglichst gering zu halten. Bevorzugt wird die Pulswiederholfrequenz des Lichts (von mindestens einer Wellenlänge), dessen Pulswiederholfrequenz zu verringern ist, derart verringert, dass pro Zeitintervall nur noch ein Teil der ursprünglichen Pulse in einer Anwendung genutzt werden können.
Beispielsweise können in einer Ausgestaltung von ursprünglichen 100 Pulsen in einem Zeitintervall nur noch 95 bis 5 Pulse pro Zeitintervall für eine Anwendung genutzt werden.
Soweit mit der synthetisierten Frequenzfolge darstellbar kann diese zur Erzeugung einer nahezu beliebigen Folge von Pulsen unterschiedlicher Wellenlängen und deren zeitlichen vorgebbaren Abfolge genutzt werden.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit kann die vorliegende Erfindung für eine Vielzahl von
Anwendungen eingesetzt werden. Insbesondere neben der bereits erwähnten Anwendung für die Mikroskopie, Rastermikroskopie und/oder konfokalen Rastermikroskopie kann die optische
Anordnung bzw. das Verfahren auch für Anwendungen in der Spektroskopie verwendet werden.
Im Allgemeinen kann die erfindungsgemäße optische Anordnung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren für Anwendungen genutzt werden, welche das Licht eines Superkontinuumlasers und/oder eines Ramankammlasers und/oder einer Lichtquelle mit einer nicht-linearen
(photokristallinen) optischen Faser und/oder einer entsprechend gepulsten Laserlichtquelle nutzen und eine vorgegebene Abfolge und/oder Kombination von Laserpulsen vorgegebener Wellenlängen fordern.
Im Folgenden wird eine Ausgestaltung der Erfindung anhand der beigefügten Zeichnung näher beschrieben. Gleiche technische Merkmale und technische Merkmale mit gleicher technischer Wirkung werden dabei der Übersichtlichkeit halber mit den gleichen Bezugszeichen versehen.
Es zeigt:
Fig. 1 einen schematischen Aufbau der erfindungsgemäßen optischen Anordnung in einer
möglichen Ausgestaltung. Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen optischen Anordnung 11, welche eine Laserlichtquelle 1 umfasst, die gepulstes Laserlicht 2 erzeugt. Das Laserlicht 2 ist schematisch anhand einer Folge 36 von vier Lichtpulsen 3 gezeigt, die entlang eines optischen Strahlengangs 15 propagieren. Die Lichtpulse 3, auch Laserpulse 3 oder Laserlichtpulse 3 genannt, weisen in der gezeigten Ausführungsform eine Pulswiederholfrequenz 13 von 80 MHz auf, wobei die Pulswiederholfrequenz 13 dem reziproken Wert einer Periodendauer 17 entspricht und einen Lasertakt 35 kennzeichnet. In diesem Lasertakt 35 werden die einzelnen Laserlichtpulse 3 von der Laserlichtquelle 1 erzeugt und emittiert. Im gezeigten Ausführungsbeispiel hat die Periodendauer 17 einen Wert von 12,5 ns. Der optische Strahlengang 15 ist mit einer gestrichelten Linie gezeichnet und in diesem befindet sich ein wellenlängenselektiver Pulspicker 19. Der im gezeigten Ausführungsbeispiel gezeigte Pulspicker 19 enthält ein akusto-optisches Element 21, welches als akusto-optisches einstellbares Filter 5, kurz AOTF 5, ausgestaltet ist. Das akusto-optische Element 21 weist einen Kristall 21a auf, an dem ein Schallwandler 21b befestigt ist. In anderen nicht gezeigten Ausgestaltungen kann der Pulspicker 19 als elektro-optisches Element 22 ausgestaltet sein.
Das Laserlicht 2 kann bevorzugt breitbandig sein und den sichtbaren Spektralbereich 23, d.h.
Wellenlängen 25 von ca. 400 nm bis 700 nm einschließen. Ein exemplarisches Spektrum 27 des Laserlichts 2 ist in Fig. 1 gezeigt. Dieses trägt eine Intensität 29 des Laserlichts 2 über die Wellenlänge 25 auf. Im Spektrum 27 des Laserlichts 2 liegen vier unterschiedliche Transmissionsspektren 31, die jeweils einem Transmissionszustand 33 zugeordnet sind. Jedes der Transmissionsspektren 31 weist ein unterschiedliches Wellenlängenmaximum 32 auf.
Die Fig. 1 zeigt ferner eine symbolische erste Teildarstellung 101 von vier Transmissionszuständen 33, die sich entlang einer Zeitachse 37 wiederholen und durch die zugehörigen Transmissionsspektren 31 symbolisiert sind. Die Transmissionsspektren 31 sind entlang einer Wellenlängenachse 39 aufgetragen, die sich nach schräg oben in die Zeichenebene hinein erstreckt (vgl. das Spektrum 27).
Mit Bezugszeichen sind jeweils nur vier der sich im Beleuchtungstakt 41 wiederholenden und insgesamt sechzehn gezeigten Transmissionszustände 33 bzw. Transmissionsspektren 31 versehen.
Die Transmissionszustände 33 treten in einem Beleuchtungstakt 41 auf, welcher im gezeigten Beispiel dem Lasertakt 35 entspricht und auch als Steuertakt 41a bezeichnet werden kann. Im Beleuchtungstakt 41 ist das AOTF 5 jeweils in einer Offenstellung 42.
In der ersten Teildarstellung 101 der in Fig. 1 gezeigten Ausgestaltung der optischen Anordnung 11 mit vier möglichen Transmissionszuständen 33 ist eine Gesamtheit der möglichen ein- bzw.
ausschaltbaren Transmissionszustände 33 in zeitlicher Abhängigkeit gezeigt. Mit anderen Worten stehen diese sechzehn Transmissionszustände 33 innerhalb eines Zeitraums von vier Beleuchtungstakten 41, d.h. vier Offenstellungen 42 für die Beleuchtung zur Verfügung und können unabhängig voneinander in jeder der Offenstellungen 42 ein- bzw. ausgeschaltet werden.
Die Transmissionszustände 33 sind somit temporär diskret und an den Beleuchtungstakt 41 gebunden.
Die Laserlichtquelle 1 weist einen Triggerausgang 43 auf, über welchen ein erzeugtes Triggersignal 4 mittels einer Triggerleitung 45 übertragen wird. Das Triggersignal 4 ist in einer zweiten
Teildarstellung 103 gezeigt und hängt von der Pulswiederholfrequenz 13 der Laserlichtquelle 1 ab. Insbesondere entspricht die Frequenz des Triggersignals 4 der Pulswiederholfrequenz 13. Das AOTF 5 ist im optischen Strahlengang 15 - bezogen auf die Ausbreitungsrichtung 16 des Lichts 2 - der Laserlichtquelle 1 nachgeordnet. Das AOTF 5 wird von einem als Ansteuereinheit 51 ausgestalteten Bauelement 6 angesteuert, welche das AOTF 5 mit einer von der Ansteuereinheit 51 ausgegebenen Frequenzfolge 47 beaufschlagt. Das in einer dritten Teildarstellung 105 gezeigte Signal 7 ist eine Frequenzfolge 47 und wird über eine Steuerleitung 49 von der Ansteuereinheit 51 an das AOTF 5 übertragen.
Dadurch breitet sich in dem AOTF 5 eine entsprechende Schwingungswelle 53 aus bzw. durchläuft den AOTF 5, wodurch sich ein Bragg-Gitter 55 ausbildet, mit welchem das Laserlicht 2 wechselwirkt und an welchem das Laserlicht 2 gebeugt wird, wenn das Bragg-Gitter 55 einen geeigneten wirksamen Gitterabstand 57 und eine geeignete Ausbreitungsrichtung hat. Das Bragg-Gitter 55 ist als Dichtegitter 59 zu verstehen.
Es ist zu beachten, dass die in Fig. 1 gezeigten Orientierungen des optischen Strahlengangs vor bzw. nach dem AOTF 5 bezüglich der Schwingungswelle 53, als auch ein Winkel 63 zwischen einer nullten Ordnung 65 und einer ersten Ordnung 67 rein schematisch dargestellt sind.
Im Allgemeinen ist der optische Strahlengang 15 unter einem Winkel zur Schwingungswelle 53 in das AOTF 5 eingekoppelt, die nullte Ordnung 65 wird durch das AOTF 5 nicht abgelenkt und lediglich die erste Ordnung 67 wird gebeugt.
Der reziproke Wert des Gitterabstands 57 entspricht einer Raumfrequenz 61. Nach dem Durchlaufen des Laserlichts 2 durch das AOTF 5 ergeben sich daher zumindest die nullte 65 und die erste Beugungsordnung 67 des veränderten Lichts 69, was schematisch in der Fig. 1 rechts neben dem AOTF 5 angedeutet ist.
Nun könnte die nullte 65 und/oder die erste Beugungsordnung 67 des veränderten Lichts 69 für eine Anwendung (allgemeiner Art) verwendet werden. Im konkreten Ausführungsbeispiel wird jedoch nur die erste Beugungsordnung 67 des veränderten Lichts 69 verwendet, und zwar wird dieses veränderte Licht 69 einem Probenraum 71 eines Mikroskops 73 zugeleitet, mit welchem eine mit Fluoreszenzfarbstoffen versehene Probe (beides nicht gezeigt) abgebildet werden kann.
Die Ansteuereinheit 51 weist einen Triggereingang 75 auf, in welchen das Triggersignal 4 des Triggerausgangs 43 der Laserlichtquelle 1 eingegeben wird.
In der Ansteuereinheit 51 ist eine Einrichtung in Form mindestens eines digitalen
Frequenzsynthesizers 77 (Frequenzfolgegenerators) vorgesehen, mit welcher eine digitale Synthese derart erfolgt, dass eine geeignete zeitliche Abfolge mindestens einer Schwingungsfrequenz 7a bzw. Frequenzfolge erzeugt wird, und zwar in Abhängigkeit vom Triggersignal 4. In der Fig. 1 sind zwei Schwingungsfrequenzen 7a in der Frequenzfolge 47 aufeinanderfolgend kombiniert.
In einer Frequenzfolge 7 können verschiedene Schwingungsfrequenzen 7a zeitlich aneinander gereiht werden (wie in Fig. 1). Dabei können auch mehrere Schwingungsfrequenzen 7a gleichzeitig auftreten, d.h. überlagert sein.
Die so erzeugte Frequenzfolge 7 wird mit einem in der Ansteuereinheit 51 vorgesehenen Verstärker 79 (in diesem Beispiel in Form eines Analogverstärkers ausgebildet) verstärkt und über eine geeignete Leitung, der Steuerleitung 49 (siehe gestrichelte Linie), dem AOTF 5 zugeleitet. Zur Erzeugung der Frequenzfolge 47 kann die Ansteuereinheit 51 Beleuchtungsparameter 81 aus einem Beleuchtungsparameterspeicher auslesen und dem digitalen Frequenzsynthesizer 77 zur Verfügung stellen. Die Frequenzfolge 47 setzt sich aus zwei Teilsignalen 47a und 47b zusammen, kann sich aber auch aus mehr als zwei Teilsignalen 47a, 47b zusammensetzen.
Hierbei bewirkt der - lediglich schematisch angedeutete - höherfrequente Anteil 85 der
Frequenzfolge 7, dass jeweils ein erster Lichtpuls 87 eines Pulszugs mit einer blauen Farbe, d.h. einer ersten Wellenlänge 89, in die erste Beugungsordnung 67 gebeugt wird und somit dem Mikroskop 73 zugeleitet werden kann. Die anderen Lichtpulsanteile 97 des veränderten Lichts 69 mit anderen Wellenlängen dieses Pulszugs durchlaufen das AOTF 5 ungebeugt und können einer Strahlfalle (nicht gezeigt) zugeführt werden, sollten sie für eine Anwendung nicht benötigt werden.
Mit dem niederfrequenten Anteil 91 der Frequenzfolge 7 wird jeweils ein zweiter Lichtpuls 93 mit einer roten Farbe, d.h. einer zweiten Wellenlänge 95, in die erste Beugungsordnung 67 gebeugt und dem Mikroskop 73 zugeleitet.
In diesem Ausführungsbeispiel wird jeder zweite Lichtpuls 3 der Pulsfolgefrequenz 13 des Laserlichts 2 mit einer blauen bzw. roten Wellenlänge 25 in die erste Beugungsordnung 67 gebeugt, wobei der herausgebeugte blaue (der erste Lichtpuls 87) und der herausgebeugte rote Lichtpuls (der zweite Lichtpuls 93) der Pulsfolgefrequenz 13 jeweils aus einem anderen Laserpuls 3 der Laserlichtquelle 1 stammen und daher in einem zeitlichen Abstand 99 zeitlich versetzt zueinander sind. Insoweit weisen die in die erste Beugungsordnung 67 gebeugten Lichtpulse 87 bzw. 93 gleicher Wellenlänge 25 jeweils einen Pulsabstand 99 von 25 ns auf, wobei auf einen blauen Lichtpuls (der erste Lichtpuls 87) nach 12,5 ns ein roter Lichtpuls (der zweite Lichtpuls 93) folgt.
Bezugszeichen
1 Laserlichtquelle
2 Laserlicht
3 Lichtpuls
4 Triggersignal
5 akusto-optisches einstellbares Filter
6 Bauelement
7 Signal
7a Schwingungsfrequenz
11 optische Anordnung
13 Pulswiederholfrequenz
15 optischer Strahlengang
17 Periodendauer
19 wellenlängenselektiver Pulspicker
21 akusto-optisches Element
21a Kristall
21b Schallwandler
22 elektro-optisches Element
23 sichtbarer Spektralbereich
25 Wellenlänge
27 Spektrum
29 Intensität
31 Transmissionspektrum
33 Transmissionszustand
35 Lasertakt
36 Folge
37 Zeitachse
39 Wellenlängenachse
41 Beleuchtungstakt
41a Steuertakt
42 Offenstellung
43 Triggerausgang
45 Triggerleitung Frequenzfolge
Steuerleitung
Ansteuereinheit
Schwingungswelle
Bragg-Gitter
Gitterabstand
Dichtegitter
Raumfrequenz
Winkel
nullte Ordnung
erste Ordnung
verändertes Licht
Probenraum
Mikroskop
Triggereingang
digitaler Frequenzsynthesizer
Verstärker
Beleuchtungsparameter höherfrequenter Anteil erster Lichtpuls
erste Wellenlänge niederfrequenter Anteil zweiter Lichtpuls zweite Wellenlänge anderer Lichtpulsanteil zeitlicher Abstand erste Teildarstellung zweite Teildarstellung dritte Teildarstellung

Claims

Ansprüche
Optische Anordnung (11) mit einem optischen Strahlengang (15) zur Beleuchtung eines Probenraumes (71) mit einer Folge (36) von Laserlichtpulsen (13), die in einem Lasertakt (35) erzeugt werden, mit mindestens einer Laserlichtquelle (1) zur Erzeugung der Folge (36) von Laserlichtpulsen (3) entlang des optischen Strahlengangs (15), und mit einem sich im optischen Strahlengang (15) befindlichen, wellenlängenselektiven Pulspicker (19), der in einem vorgegebenen, mit den Laserlichtpulsen (3) synchronisierbaren
Beleuchtungstakt (41) einen Offenzustand (42) aufweist, in dem der Pulspicker (19) für wenigstens einen Laserlichtpuls (3) zum Probenraum (71) hin lichtdurchlässig ist, wobei der Offenzustand (42) wenigstens zwei unterschiedliche Transmissionszustände (33) aufweist, die sich bezüglich ihres jeweiligen Transmissionsspektrums (31) unterscheiden, und wobei die beiden Transmissionszustände (33) unabhängig voneinander ein- und/oder ausschaltbar sind.
Optische Anordnung (11) nach Anspruch 1, wobei der Pulspicker (19) wenigstens drei unterschiedliche Transmissionszustände (33) aufweist, die unabhängig voneinander schaltbar sind.
Optische Anordnung (11) nach Anspruch 1 oder 2, wobei der wellenlängenselektive Pulspicker (19) ein elektro-optisches Element (22) aufweist.
Optische Anordnung (11) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der wellenlängenselektive Pulspicker (19) ein akusto-optisches Element (21) aufweist.
Optische Anordnung (11) nach Anspruch 4, wobei das akusto-optische Element (21) einen Kristall (21a) aufweist, wobei mindestens ein mit dem Kristall (21a) verbundener Schallwandler (21b) vorgesehen ist.
Optische Anordnung (11) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei eine Ansteuereinheit (51) zur Erzeugung einer Frequenzfolge (47) für den Pulspicker (19) vorgesehen und der
Transmissionszustand (33) des Pulspickers (19) abhängig von der Frequenz (7a) der
Frequenzfolge (47) ist.
7. Optische Anordnung (11) nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Frequenzfolge (47) eine
Überlagerung wenigstens zweier Teilsignale (47a, 47b) unterschiedlicher Frequenz (7a) aufweist.
8. Optische Anordnung (11) nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Frequenzfolge (47) einen mit dem Lasertakt (35) synchronisierten Steuertakt (41a) aufweist.
9. Optische Anordnung (11) nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei gespeicherte, änderbare Beleuchtungsparameter (81) vorhanden sind, von denen die Frequenz (7a) der Frequenzfolge (47) und/oder der Steuertakt (41a) abhängen.
10. Optische Anordnung (11) nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei mindestens ein wenigstens zweifarbiger Transmissionszustand (33) vorhanden ist, in dem das Transmissionsspektrum (31) wenigstens zwei voneinander getrennte Wellenlängenmaxima (32) aufweist.
11. Optische Anordnung (11) nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei die Zahl der
Transmissionszustände (33) von der Anzahl unterschiedlicher Frequenzen (7a) in der
Frequenzfolge (47) abhängig ist.
12. Mikroskop (73), insbesondere PIE-Mikroskop mit einer optischen Anordnung (11) nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Verfahren zur Beleuchtung eines Probenraums (71) mit einer Folge (36) von Laserlichtpulsen (3), die in einem Lasertakt (35) erzeugt werden, wobei die Laserlichtpulse (3) durch einen wellenlängenselektiven Pulspicker (19) geschickt werden, der synchron zum Lasertakt (35) zwischen wenigstens zwei unterschiedlichen Transmissionsspektren (31) umgeschaltet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Umschalten zwischen den wenigstens zwei
unterschiedlichen Transmissionsspektren (31) ferner umfasst: das Erzeugen einer mindestens eine Frequenz (7a) umfassenden Frequenzfolge (47) und das Anlegen der Frequenzfolge (47) an einen Schallwandler (21b) und Um- oder Hinzuschalten der Frequenz (7a) der Frequenzfolge (47).
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