EP3465211A1 - Method for determining the number of sites of infection of a cell culture - Google Patents
Method for determining the number of sites of infection of a cell cultureInfo
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Abstract
The invention relates to a method for determining the number of sites of infection of a cell culture, comprising the steps of: infecting a cell culture arranged in a sample carrier with viruses, counting any infected areas of the cell culture by means of a transmitted light method, marking infected cells with fluorescence markers, counting infected areas of the cell culture by means of a fluorescence analysis method, and evaluating area by area the areas determined in both methods for determining the number of sites of infection.
Description
Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden einer Method for determining the number of foci of infection
Zellkultur cell culture
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden einer Zellkultur. The invention relates to a method for determining the number of foci of infection of a cell culture.
Zur Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden einer Zellkultur ist es bekannt, dass zunächst eine Zellkultur auf einem Probenträger gezüchtet wird. Als Probenträger sind insbesondere Titerplatten und Mitkotiterplatten geeignet, wobei in den einzelnen Wells Zellkulturen gezüchtet werden, sodass die Zellen am Wellboden anwachsen. Anschließend erfolgt ein Infizieren der Zellen mit einer viralen Flüssigkeit. Diese ist üblicherweise verdünnt, wobei unterschiedlichen Wells inbesonders virale Flüssigkeiten in unterschiedlicher Verdünnung zugegeben wird. Nach einer vorgegebenen, insbesondere von der Art der Viren abhängigen Zeitspanne, erfolgt ein Entnehmen, insbesondere ein Abpumpen der viralen Flüssigkeit. Die virale Flüssigkeit wirkt üblicherweise mehrere Minuten bis mehrere Stunden auf die Zellkultur ein. Nach Entfernen der viralen Flüssigkeit erfolgt üblicherweise ein Zuführen eines Mediums, das eine Diffusion später freigesetzter Viruspartikel verhindern soll. Mit einem derartigen, insbesondere als Gelschicht eingebrachten Mediums, erfolgt ein Abdecken der Zellkultur. Anschließend erfolgt ein Warten über einen längeren Zeitraum von üblicherweise mehreren Tagen. In diesem Zeitraum sterben die infizierten Zellen ab, platzen und die aus ihnen austretenden Viren breiten sich in die Nachbarzellen aus. Hierdurch wird erzielt, dass verhältnismäßig große Bereiche entstehen, in denen abgestorbene Zellen nicht mehr sichtbar und umgeben von Zonen mit noch lebenden aber bereits infizierten Zellen sind . Als Infekti-
onsherde sind dabei Region auf dem Probenträger zu verstehen, in dem eine anfängliche Infizierung der Zellen durch den Virus erfolgt ist, wobei sich ausgehend von dem jeweiligen Infektionsherd infizierte Bereiche bilden, in denen die Zellen bereits infiziert sind und/oder bereits zerstört wurden. To determine the number of infection sites of a cell culture, it is known that first a cell culture is grown on a sample carrier. Titer plates and Mitkotiterplatten are particularly suitable as a sample carrier, cell cultures are grown in the individual wells, so that the cells grow on the well bottom. Subsequently, the cells are infected with a viral fluid. This is usually diluted, with different wells in particular viral liquids added in different dilutions. After a predetermined, in particular dependent on the type of virus period, there is a removal, in particular a pumping out of the viral fluid. The viral fluid usually affects the cell culture for several minutes to several hours. After removal of the viral fluid is usually carried out a supply of a medium which is intended to prevent diffusion of virus particles released later. With such, especially introduced as a gel layer medium, covering the cell culture. This is followed by a wait over a longer period of usually several days. During this period, the infected cells die, burst, and the viruses emanating from them spread into the neighboring cells. This achieves that relatively large areas arise in which dead cells are no longer visible and surrounded by zones of living but already infected cells. As infectious Onsherde are to understand region on the sample carrier, in which an initial infection of the cells has been carried out by the virus, which form infected areas starting from the respective infection, in which the cells are already infected and / or have already been destroyed.
Mit Hilfe eines Durchlichtverfahrens können die zerstörten Bereiche bzw. Bereiche, in denen sich keine lebenden Zellen befinden, gezählt werden . Ein derartiges Zählen erfolgt üblicherweise nach Aufnahme eines entsprechenden Bildes durch Personen, Fotografieren oder Mikroskopieren. Gegebenenfalls kann zur Kontrasterhöhung die Probe mit einem Farbstoff eingefärbt werden. Ein geeigneter insbesondere unspezifischer Farbstoff wie beispielsweise Methylenblau markiert die lebenden Zellen, sodass die Bereiche, in denen keine lebenden Zellen vorhanden sind, für den Betrachter deutlicher als Löcher zu sehen sind. With the aid of a transmitted-light method, the destroyed areas or areas in which there are no living cells can be counted. Such counting is usually done after taking a corresponding image by persons, photographing or microscopy. Optionally, to increase the contrast, the sample can be dyed with a dye. A suitable, in particular, non-specific dye, such as, for example, methylene blue, marks the living cells so that the areas in which no living cells are present are more clearly visible to the observer than holes.
Das Bestimmen der Anzahl von Infektionsherden einer Zellkultur mit Hilfe des Durchlichtverfahrens weist insbesondere den Nachteil auf, dass beispielsweise später infizierte Zellen oder Zellen, die auf den Virus anders reagieren, noch nicht abgestorben sind und insofern im Durchlichtverfahren kein entsprechendes Loch gesehen werden kann. Dies gilt beispielsweise auch für Zellen die langsamer reagieren, sodass die entsprechenden Löcher noch sehr klein und insofern nicht oder nur schwer sichtbar sind. Ein weiterer Nachteil des Durchlichtverfahrens besteht darin, dass auch andere Fehlstellen, die nicht von den Viren hervorgerufen wurden, als derartige Fehlstellen erkannt und fälschlicherweise mitgezählt werden. Bei derartigen Fehlstellen kann es sich bei- spielswese um Bereiche handeln, in denen die Zellen weggeschwemmt wurden oder Verunreinigungen vorhanden sind. Das Wegschwemmen kann beispielsweise bei der Zugabe der viralen Flüssigkeiten oder auch bei der Zugabe des Gels auftreten. Auch die Länge des Zeitraums, die vor einer entsprechenden Durchführung des Durchlichtverfahrens abgewartet werden muss, ist schwer bestimmbar und hängt insbesondere von der Art der Viren ab. Ist der Zeitraum zu kurz gewählt weisen die entsprechenden infizierten Bereiche nur eine
geringe Anzahl an abgestorbenen Zellen auf, sodass die entsprechenden Löcher bzw. Fehlstellen schwer zu erkennen sind. Ist der Zeitraum zu lang gewählt wachsen einzelne Bereiche zusammen, sodass schwer bestimmbar ist, ob es sich ursprünglich um einen Infektionsherd oder um mehrere Infektionsherde mit einem gemeinsamen infizierten Bereich der Zellkultur handelt. The determination of the number of foci of infection of a cell culture with the aid of the transmitted light method has the particular disadvantage that, for example, later infected cells or cells which react differently to the virus have not yet died and insofar as a corresponding hole can not be seen in the transmitted light method. This also applies, for example, to cells that react more slowly, so that the corresponding holes are still very small and therefore not or hardly visible. Another disadvantage of the transmitted light method is that other defects that were not caused by the viruses are recognized as such defects and incorrectly counted. Such imperfections may, for example, be areas in which the cells have been washed away or impurities are present. The Wegschwemmen can occur, for example, in the addition of the viral fluids or even with the addition of the gel. The length of the period of time that must be waited before a corresponding implementation of the transmitted light method is difficult to determine and depends in particular on the type of virus. If the period is too short, the corresponding infected areas have only one small number of dead cells, so that the corresponding holes or defects are difficult to detect. If the period chosen is too long, individual areas grow together, making it difficult to determine whether it is originally a source of infection or multiple sites of infection with a common infected area of cell culture.
Ferner ist es zur Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden einer Zellkultur bekannt die Zellkultur mit insbesondere virus-spezifischen Fluoreszenzmarkern zu behandeln, die die infizierten Zellen markieren. Es ist sodann möglich die infizierten Bereiche zu zählen, da die entsprechenden Bereiche fluoreszieren. Dieses Verfahren hat allerdings den Nachteil, dass nebeneinander liegende infizierte Bereiche nicht voneinander unterschieden werden können und insofern fälschlicherweise nur als ein ursprünglicher Infektionsherd erkannt werden können. Furthermore, to determine the number of infection sites of a cell culture, it is known to treat the cell culture with, in particular, virus-specific fluorescent markers which mark the infected cells. It is then possible to count the infected areas as the corresponding areas fluoresce. However, this method has the disadvantage that juxtaposed infected areas can not be distinguished from each other and insofar can be falsely recognized only as an original source of infection.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden einer Zellkultur zu schaffen mit dem die Anzahl der Infektionsherde genauer und zuverlässiger bestimmt werden kann. The object of the invention is to provide a method for determining the number of foci of infection of a cell culture with which the number of foci of infection can be determined more accurately and reliably.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1. The object is achieved according to the invention by a method according to claim 1.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden in einer Zellkultur erfolgt zunächst ein Infizieren einer in einem Probenträger angeordneten Zellkultur mit Viren. Dies erfolgt insbesondere durch Zugabe einer viralen Flüssigkeit, die gegebenenfalls verdünnt sein kann. Als Infektionsherde sind dabei Region auf dem Probenträger zu verstehen, in dem eine anfängliche Infizierung der Zellen durch den Virus erfolgt ist, wobei sich ausgehend von dem jeweiligen Infektionsherd infizierte Bereiche bilden, in denen die Zellen bereits infiziert sind und/oder bereits zerstört wurden. Als Probenträger werden vorzugsweise Titerplatten, insbesondere Mikrotiterplatten
verwendet, wobei die Zellkulturen vorzugsweise am Wellboden angewachsen sind. In the method according to the invention for determining the number of foci of infection in a cell culture, infecting a cell culture arranged in a sample carrier with viruses first takes place. This is done in particular by adding a viral fluid, which may optionally be diluted. As infection foci are to be understood region on the sample carrier, in which an initial infection of the cells is carried out by the virus, forming infected areas starting from the respective infection, in which the cells are already infected and / or have already been destroyed. As sample carriers are preferably titer plates, in particular microtiter plates used, wherein the cell cultures are preferably grown on the well bottom.
Im nächsten Schritt erfolgt mit Hilfe des bekannten Durchlichtverfahrens ein Bestimmen von gegebenenfalls infizierten Bereichen, bei denen bereits ein Loch in der Zellkultur entstanden ist durch eine Zerstörung der Zellen auf Grund der Virusinfektion. Mit Hilfe des Durchlichtverfahrens werden somit sämtliche Bereiche bestimmt, in denen keine lebenden Zellen vorhanden sind. Es erfolgt somit ein Bestimmen entsprechender Fehlstellen bzw. Löcher. Hier werden insbesondere nicht nur diejenigen Bereiche bestimmt, in denen Aufgrund des Virus Zellen abgestorben sind, sondern auch diejenigen Bereiche, die beispielsweise durch Verunreinigen oder durch Wegschwemmen keine lebenden Zellen aufweisen. In the next step, with the aid of the known transmitted-light method, it is possible to determine areas which may have been infected in which a hole has already been formed in the cell culture by destroying the cells due to the virus infection. With the help of the transmitted light method, all areas are thus determined in which no living cells are present. There is thus a determination of corresponding defects or holes. Here, in particular, not only those areas are determined in which due to the virus cells have died, but also those areas that have no living cells, for example, by contaminating or by wegschwemmen.
Weiterhin erfolgt erfindungsgemäß ein Markieren infizierter Zellen mit einem insbesondere spezifischen Fiuoreszenzmarker. Dabei erfolgt das Markieren der infizierten Zellen unmittelbar anhand des Virus und/oder anhand eines unmittelbar durch den Virus verursachten Effekts. Die infizierten Bereiche lassen sich hierdurch von den nicht infizierten Bereichen der Zellkultur unterscheiden. Die infizierten Bereiche der Zellkultur werden sodann mittels Fluoreszenzanalyseverfahren bestimmt. Hierbei werden zumindest zunächst auch große fluoreszierende Bereiche nur als ein Bereich gezählt. Furthermore, according to the invention, an identification of infected cells is carried out using a particular specific fluorescent marker. In this case, the marking of the infected cells takes place directly on the basis of the virus and / or on the basis of an effect caused directly by the virus. The infected areas can thereby be distinguished from the uninfected areas of the cell culture. The infected areas of the cell culture are then determined by fluorescence analysis method. Here, at least initially, even large fluorescent areas are counted as only one area.
Anschließend erfolgt die erfindungsgemäße Kombination der beiden Verfahren derart, dass ein bereichsweises Auswerten der in den beiden Verfahren bestimmten Bereiche erfolgt, um die Anzahl der Infektionsherde zu bestimmen. Es werden insbesondere nacheinander alle zuvor entweder mittels Durchlichtverfahren oder mittels Floureszenzanalyseverfahren bestimmten Bereiche konsekutiv durchgegangen und aus der Kombination der beiden Verfahren zuverlässig die jeweilige Anzahl der Infektionsherde des jeweilig in Betracht gezogenen Bereichs ermittelt. Möglich wäre es beispielsweise, die in den beiden Verfahren bestimmten Bereiche aufzusummieren. Da hierbei einzelne
Bereiche doppelt gezählt werden, kann auch insofern ein Abgleich insbesondere durch Übereinanderlegen der ermittelten Ergebnisse des Durchlicht- verfahrens und des Fluoreszenzanalyseverfahrens der ermittelten Bereiche erfolgen, dass die in beiden Verfahren ermittelten Bereiche nur einfach gezählt werden. Somit können beispielsweise nur solche Bereiche als Infektionsherde gezählt werden, die in beiden Methoden als infizierte Bereiche identifiziert wurden. Insbesondere können auch in der Fluoreszenzmethode erkannte Bereiche, die in der Durchlichtanalyse mehrere Infektionsherde aufweisen, zuverlässig als multiple Infektionen charakterisiert werden. Hierdurch ist bereits eine erhebliche Verbesserung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden einer Zellkultur erzielt. Subsequently, the combination of the two methods according to the invention is carried out in such a way that an area-wise evaluation of the areas determined in the two methods takes place in order to determine the number of foci of infection. In particular, all the areas previously determined beforehand either by means of transmitted light method or by means of fluorescence analysis methods are consecutively passed through in succession, and the combination of the two methods reliably determines the respective number of sources of infection of the respective area considered. It would be possible, for example, to sum up the areas determined in the two methods. Since this individual Areas can be counted twice, so far as a balance can be made in particular by superimposing the determined results of the transmitted light method and the fluorescence analysis method of the determined areas that the areas determined in both methods are only counted easily. Thus, for example, only those areas can be counted as infection, which were identified as infected areas in both methods. In particular, regions recognized in the fluorescence method, which have multiple sources of infection in the transmitted light analysis, can be reliably characterized as multiple infections. As a result, a considerable improvement in the accuracy in determining the number of infection foci of a cell culture has already been achieved.
Insbesondere ist die Abfolge der Schritte des Verfahrens Anwendung des Durchlichtverfahrens wie oben beschrieben, Markieren der infizierten Zellen durch einen spezifischen Marker wie oben beschrieben und Anwendung des Fluoreszenzanalyseverfahrens wie oben beschrieben, frei wählbar, wobei selbstverständlich ein Markieren der infizierten Zellen stets vor dem Fluoreszenzanalyseverfahren durchgeführt werden muss. So ist es beispielsweise möglich, mittels einem spezifischen Marker die infizierten Zellen der Probe zu markieren und nachfolgend das Durchlichtverfahren sowie das Fluoreszenzanalyseverfahren durchzuführen. Besonders bevorzugt ist es hierbei, das Durchlichtverfahren und das Fluoreszenzanalyseverfahren gleichzeitig an der Probe durchzuführen. In particular, the sequence of the steps of the method of using the transmitted light method as described above, labeling the infected cells by a specific marker as described above and applying the fluorescence analysis method as described above are arbitrary, of course, labeling the infected cells always before the fluorescence analysis method got to. Thus, it is possible, for example, to mark the infected cells of the sample by means of a specific marker and subsequently to carry out the transmitted light method and the fluorescence analysis method. It is particularly preferred in this case to carry out the transmitted light method and the fluorescence analysis method simultaneously on the sample.
Bei einer bevorzugten Weiterführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Auswertung der mit den beiden Verfahren bestimmten Bereiche derart, dass im Durchlichtverfahren erkannte Bereiche, die jedoch im Fluoreszenzanalyseverfahren nicht erkannt wurden, nicht als Infektionsherd gezählt werden. Durch den Vergleich der mit den beiden Verfahren ermittelten Bereiche ist es möglich Fehlstellen bzw. Löcher zu bestimmten, die nicht durch die virale Infektion hervorgerufen wurden, da derartige Fehlstellen nicht von fluoreszierenden, dass heißt viral infizierten Zellen umgeben sind . Es ist somit mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich Fehlstellen, die beispielsweise durch Wegschwemmen oder Verunreinigung erzeugt wurden, gesondert zu bestimmen, sodass diese das Ergebnis der Anzahl der Infektionsherde nicht verfälschen. Insbesondere ist es auch möglich diese Bereiche gesondert zu zählen oder auszuwerten. Hierdurch ist eine Qualitätskontrolle der Probe möglich. Beispielsweise kann bei einer vorgegebenen Anzahl an derartigen Störstellen, an denen die Verunreinigungen, Ausschwemmungen oder dergleichen entstanden sind, die entsprechende Probe bei der Auswertung nicht berücksichtigt werden. Dies kann auf Grund der Anzahl oder der Größe der entsprechenden Fehlstellen insbesondere automatisch erfolgen. Die Kontrolle der Häufigkeit und Größe dieser Störstellen ist auch für die Qualitätskontrolle der Probenpräparation von Bedeutung. In a preferred continuation of the method according to the invention, the evaluation of the areas determined by the two methods takes place in such a way that areas recognized in the transmitted-light method, which, however, were not recognized in the fluorescence analysis method, are not counted as a source of infection. By comparing the areas determined by the two methods, it is possible to determine defects or holes which were not caused by the viral infection, since such defects are not surrounded by fluorescent, that is, virally infected cells. It is thus with Help of the method according to the invention possible to determine defects that were generated for example by Wegschwemmen or contamination separately, so that they do not distort the result of the number of foci of infection. In particular, it is also possible to count or evaluate these areas separately. As a result, a quality control of the sample is possible. For example, in the case of a predetermined number of such impurities, at which the impurities, effluents or the like have arisen, the corresponding sample can not be taken into account in the evaluation. This can be done automatically due to the number or size of the corresponding defects in particular. The control of the frequency and size of these defects is also important for the quality control of the sample preparation.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Bereiche ermittelt die im Fluoreszenzverfahren, aber nicht im Durchlichtverfahren erkannt werden. Diese Bereiche werden als Infektionsherde der Zellkultur mitgezählt. Hierbei handelt es sich um Bereiche, die virusinfizierte Zellen aufweisen, bei denen jedoch noch keine so große Schädigung der Zellen aufgetreten ist, dass eine entsprechende Anzahl abgestorbener Zellen, die dann auch zerfallen und als leerer Bereich mit der Durchlichtmethode sichtbar wäre, vorhanden ist. Insbesondere ist es auch möglich diese Bereiche gesondert zu zählen oder auch zu wichten. Zweckmäßig kann diese Analyse z. B. sein, um Hinweise auf stark variierende Infektionsgeschwindigkeit der Viren zu erhalten. Auch eine Qualitätskontrolle bestimmter Aspekte der Probenpräparation ist hiermit möglich. In a further preferred embodiment of the invention, regions are determined which are detected in the fluorescence method but not in the transmitted-light method. These areas are counted as sources of infection of the cell culture. These are areas that have virus-infected cells, but in which no such great damage to the cells has occurred, that a corresponding number of dead cells, which then also decay and would be visible as an empty area with the transmitted light method, is present. In particular, it is also possible to count these areas separately or to weight them. Suitably, this analysis z. B. be to get clues to greatly varying infection rate of the virus. It is also possible to control the quality of certain aspects of sample preparation.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt ein Analysieren der insbesondere in beiden Verfahren erkannten Bereiche bezogen auf deren Größe und/oder Form. Insbesondere bei Überschreiten einer vorgegebenen Grenzgröße, dass heißt bei Überschreiten einer vorgegebenen Ausdehnung oder einer vorgegebenen Fläche des infizierten Bereiches, kann der entsprechende Bereich mehrfach gezählt werden. Hier liegt die Annahme zu-
gründe, dass es sich um mehrere zusammengewachsene ursprüngliche Infektionsherde handelt. In a further preferred embodiment of the invention, the areas detected in particular in both methods are analyzed based on their size and / or shape. In particular, when a predetermined limit value is exceeded, that is, when a predetermined extent or a predetermined area of the infected area is exceeded, the corresponding area can be counted several times. Here, the assumption is reasons that these are several coalesced original foci of infection.
Vorzugsweise erfolgt ein genaueres Analysieren derartiger Bereiche. So werden für Bereiche, die im Fluoreszenzanalyseverfahren erkannt werden und eine vorgegebene Grenzgröße überschreiten, in Abhängigkeit der Größe, der Form und/oder der Fluoreszenzstärke eine Anzahl an Infektionsherden festgelegt. Desweiteren ist es möglich, diese Bereiche insofern näher zu analysieren, dass die Anzahl der Fehlstellen betrachtet wird . Die Anzahl der Fehlstellen, die auf Grund der Fluoreszenz auf abgestorbene Zellen zurückzuführen sind, stellt vorzugsweise die Mindestanzahl der in diesem Bereich ursprünglich infizierten Infektionsherde dar. Gegebenenfalls wird diese Zahl noch auf Grund der starken Fluoreszenz erhöht, da davon auszugehen ist, dass in diesem Bereich beispielsweise auch ursprünglich infizierte Zellen vorhanden sind, die bisher noch nicht abgestorben sind, sodass keine Fehlstelle entstanden ist. Preferably, a more accurate analysis of such areas takes place. Thus, for areas that are detected in the fluorescence analysis method and exceed a predetermined limit size, depending on the size, the shape and / or the fluorescence intensity, a number of foci of infection are determined. Furthermore, it is possible to further analyze these areas in that the number of defects is considered. The number of defects due to fluorescence on dead cells preferably represents the minimum number of sites of infection originally infected in this area. If necessary, this number is increased due to the strong fluorescence, since it is assumed that in this area For example, originally infected cells are present, which have not yet died, so that no defect has arisen.
Vorzugsweise erfolgt ein Festlegen der Grenzgröße in Abhängigkeit der Proben und/oder der Messungen. So ist es beispielsweise möglich die Grenzgröße auf Basis einer Größenverteilung der entsprechenden aufgefundenen Bereiche zu bestimmen. Möglich wäre beispielsweise auch ein Vergleich mit dem Median- Wert derartiger aufgefundener Bereiche. Insbesondere kann eine Bestimmung des Grenzwerts auf Basis einer Größenstatistik der unterschiedlichen Bereiche erfolgen. Preferably, the limit size is determined as a function of the samples and / or the measurements. For example, it is possible to determine the limit size based on a size distribution of the corresponding found areas. For example, a comparison with the median value of such found areas would also be possible. In particular, a determination of the limit value can be made on the basis of a size statistic of the different regions.
Besonders bevorzugt ist es, das Durchlichtverfahren und/oder das Fluoreszenzanalyseverfahren als automatisierte Verfahren durchzuführen. Insbesondere erfolgt dies auf Basis bildgebender Verfahren. Geeignet sind hierfür insbesondere automatisierte Mikroskope oder Plattenlesegeräte mit Bildverarbeitungsverfahren. Geeignet ist hierfür beispielsweise der Plattenreader EnSight des Herstellers PerkinElmer.
Zur Erhöhung des Kontrasts im Durchlichtverfahren kann die Zellkultur eingefärbt werden. Dies kann mit an sich bekannten Verfahren und Farbstoffen, insbesondere Methylenblau erfolgen. Insbesondere erfolgt das Einfärben der Zellkultur mit einem unspezifischen Farbstoff, der alle Zellen der Zellkultur gleichermaßen einfärbt, um somit Fehlstellen innerhalb der Zellkultur deutlich hervortreten zu lassen. Dabei müssen gegebenenfalls die spektralen Eigenschaften des für das Fluoreszenz verfahren genutzten Farbstoffes berücksichtigt werden. Desweiteren kann wie bei Verfahren zur Bestimmung von Infektionsherden einer Zellkultur nach dem Stand der Technik das Anwachsen der Zellen, das Infizieren der Zellen mit viraler Flüssigkeit, das Abdecken mit einem Gel, wie bekannt erfolgen. Insbesondere können die Zellkulturen mittels einer gegebenenfalls verdünnten viralen Flüssigkeit infiziert werden. Bevorzugt ist es hierbei, dass der Verdünnungsfaktor bei der Bestimmung der Anzahl der Infektionsherde berücksichtigt wird . Bei Verwendung von Titerplatten, insbesondere Mikrotiterplatten, ist es desweiteren bevorzugt, dass auf jedem Well dieselbe Zellkultur vorhanden ist und oder dieselben virale Flüssigkeit gegebenenfalls in unterschiedlichen Verdünnungen zugeführt werden. Insbesondere durch die Verwendung von Mikrotiterplatten mit einer großen Anzahl von Wells ist es auch möglich, unterschiedliche Bereiche mit unterschiedlichen Zellkulturen, unterschiedlichen viralen Flüssigkeiten oder mit unterschiedlichen pharmazeutischen Wirkstoffen behandelte Zellkulturen zu nutzen. It is particularly preferred to carry out the transmitted light method and / or the fluorescence analysis method as automated methods. In particular, this is done on the basis of imaging techniques. Particularly suitable for this purpose are automated microscopes or plate readers with image processing methods. Suitable for this example, the disk reader EnSight manufacturer PerkinElmer. To increase the contrast in the transmitted light method, the cell culture can be colored. This can be done with known methods and dyes, especially methylene blue. In particular, the staining of the cell culture is carried out with a nonspecific dye which dyes all cells of the cell culture equally, so as to clearly highlight defects within the cell culture. If necessary, the spectral properties of the dye used for the fluorescence method must be taken into account. Furthermore, as in methods for determining sites of infection of a cell culture according to the prior art, the growth of the cells, the infecting of the cells with viral fluid, the covering with a gel, as known. In particular, the cell cultures can be infected by means of an optionally diluted viral fluid. It is preferred here that the dilution factor is taken into account in the determination of the number of foci of infection. When using titer plates, in particular microtiter plates, it is further preferred that the same cell culture is present on each well and or the same viral liquid is optionally supplied in different dilutions. In particular, by using microtiter plates with a large number of wells, it is also possible to use different regions with different cell cultures, different viral fluids or cell cultures treated with different pharmaceutically active substances.
Bei einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung werden Kontrollwerte zur Qualitätskontrolle insbesondere automatisch ermittelt. Hierbei kann es sich um eine nähere Betrachtung oder auch nur ein Zählen der Fehlstellen handeln, bei denen es sich um Fehlstellen handelt, die beispielsweise durch Wegschwimmen oder Verunreinigungen entstanden sind und nicht durch abgestorbene Zellen. Wichtige Kontrollwerte sind ferner die Qualität der Objekterkennung, die Textur der insbesondere nicht durch eine Virusinfektion gestörten Zellschichten oder auch die über eine Probe gemittelte Stärke des spezifischen Infektionsmarkers. Desweiteren können auch Details über die Größe oder
Morphologie der erkannten Infektionsbereiche für die Interpretation der Messung herangezogen werden. In a preferred embodiment of the invention, control values for quality control are determined automatically in particular. This may be a closer look or even just a counting of the imperfections that are flaws, caused for example by swimming away or impurities and not by dead cells. Important control values are also the quality of the object recognition, the texture of the cell layers, which in particular are not disturbed by a virus infection, or also the strength of the specific infection marker averaged over a sample. In addition, details about the size or Morphology of the detected infection areas are used for the interpretation of the measurement.
Anstelle eines Durchlichtverfahrens können auch andere unspezifische Erkennungsverfahren eingesetzt werden . Geeignet sind hierfür auch Fluoreszenzverfahren, die Zellen oder Bereiche von Zellen unabhängig von einer Infektion markieren und die dann mikroskopisch ausgelesen werden. Um eine einfache Unterscheidung von der infektionsspezifischen Markierung zu erlauben wird hierfür ein Fluoreszenzfarbstoff mit unterschiedlichen Eigenschaften (wie z.b. der Emissionswellenlänge) bevorzugt. Instead of a transmitted light method, other nonspecific detection methods can also be used. Also suitable for this purpose are fluorescence methods which mark cells or areas of cells independently of an infection and which are then read microscopically. In order to allow a simple distinction from the infection-specific label, a fluorescent dye with different properties (such as the emission wavelength) is preferred for this purpose.
Ebenso ist es möglich, anstelle eines Fluoreszenzanalyseverfahrens andere infektionsspezifische Erkennungsverfahren einzusetzen. In diesen werden nicht-fluoreszente infektionsspezifische Marker verwendet. Hierbei kann es sich beispielsweise um Farbstoffe für kolorimetrische Verfahren handeln . It is likewise possible to use other infection-specific detection methods instead of a fluorescence analysis method. These use non-fluorescent infection-specific markers. These may, for example, be dyes for colorimetric processes.
Bei geeigneten Zelltypen kann es auch möglich sein, Bereiche infizierter Zellen ohne speziellen Marker anhand der Textureigenschaften von nicht infizierten Zellbereichen zu unterscheiden With suitable cell types, it may also be possible to distinguish areas of infected cells without specific markers based on the texture characteristics of uninfected cell areas
Ferner ist es möglich, dieses Verfahren nicht nur für die Untersuchung der Infektion von Zellenkulturen durch Viren zu nutzen. Denkbar sind beispielsweise auch Bakterien, die Zellkulturen infizieren oder Zellen bzw. (einzellige) Lebewesen wie etwa Amöben, die Bakterienkulturen fressen. Furthermore, it is possible to use this method not only for the investigation of the infection of cell cultures by viruses. Also conceivable, for example, are bacteria that infect cell cultures or cells or (unicellular) living beings, such as amoebae, that eat bacterial cultures.
In der anliegenden Skizze ist als schematisches Beispiel ein Well einer Titerplatte dargestellt. In dem Bereich innerhalb des Wellrandes ist eine Zellkultur angeordnet, die wie vorstehend beschrieben mit Viren infiziert wurde. Hierbei bilden sich unterschiedliche Bereiche aus. Der weiß dargestellte Bereich ist ein Bereich in dem Zellen beispielsweise bei der Zugabe des viralen Fluids oder dergleichen weggespült wurden und insofern ein Bereich ohne Zellen entsteht. Die dunkel schattierten Bereiche sind fluoreszierende Bereiche,
dass heißt Bereiche in denen infizierte Zellen vorhanden sind. Hierbei können sich unterschiedliche Bereiche ausbilden. Im dargestellten Beispiel ist es ein Bereich ohne freies Zentrum. Hierbei handelt es sich um einen Bereich in dem zwar Zellen infiziert sind, jedoch noch kein freies Zentrum abgestorbener Zellen entstanden ist. In the attached sketch, a well of a titer plate is shown as a schematic example. In the area within the corrugated edge, a cell culture is arranged, which was infected with viruses as described above. Here, different areas are formed. The area shown in white is an area in which cells have been washed away, for example, in the addition of the viral fluid or the like, and thus an area without cells is formed. The dark shaded areas are fluorescent areas, that is, areas where infected cells are present. Here, different areas can form. In the example shown, it is an area without a free center. This is an area in which cells are infected, but still no free center of dead cells has emerged.
Im oberen Bereich der Skizze ist ein infizierter Bereich dargestellt, der ein freies oder leeres Zentrum hat. Das leere Zentrum ist der Bereich in dem abgestorbene Zellen vorhanden sind. Diese sind von infizierten und daher fluoreszierenden Zellen umgeben. Der im linken Bereich des Wells dargestellte große Bereich stellt einen zusammengewachsenen Infektionsherd dar. Dieser weist vier leere Zentren auf, die von fluoreszierenden und somit infizierten Zellen umgeben sind.
In the upper part of the sketch an infected area is shown, which has a free or empty center. The empty center is the area where dead cells are present. These are surrounded by infected and therefore fluorescent cells. The large area shown in the left part of the well represents a coalesced focus of infection. It has four empty centers surrounded by fluorescent and therefore infected cells.
Claims
Ansprüche claims
Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden einer Zellkultur mit den Schritten Method for determining the number of infection sites of a cell culture with the steps
Infizieren einer in einem Probenträger angeordneten Zellkultur mit Viren, Infecting a cell culture arranged in a sample carrier with viruses,
Bestimmen von ggf. infizierten Bereichen der Zellkultur mittels Durchlichtverfahren, Determining possibly infected areas of the cell culture by means of transmitted light method,
Markieren infizierter Zellen mit Fluoreszenzmarkern, Marking infected cells with fluorescent markers,
Bestimmen von infizierten Bereichen der Zellkultur mittels Fluoreszenzanalyseverfahren und wobei für jeden der in beiden Verfahren bestimmten Bereiche eine Auswertung erfolgt zur Bestimmung der Anzahl von Infektionsherden. Determining infected areas of the cell culture by means of fluorescence analysis method and wherein for each of the areas determined in both methods, an evaluation is carried out to determine the number of foci of infection.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anzahl der Infektionsherde bestimmt wird durch Kombination der durch das Durchlichtverfahren bestimmten Bereiche und der durch das Floureszenzanalyseverfahren bestimmten Bereiche. The method of claim 1, wherein the number of foci of infection is determined by combining the areas determined by the transmitted light method and the areas determined by the fluorescence analysis method.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Bereiche, die im Durchlichtverfahren, aber nicht im Fluoreszenzanalyseverfahren erkannt werden, nicht gezählt werden. The method of claim 1 or 2, wherein areas which are detected by the transmitted light method, but not in the fluorescence analysis method, are not counted.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Bereiche, die im Fluoreszenzanalyseverfahren aber nicht im Durchlichtverfahren erkannt werden, gezählt werden.
Method according to one of claims 1 to 3, wherein areas which are detected in the fluorescence analysis method but not in the transmitted light method are counted.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, wobei Bereiche, die im Fluoreszenzanalyseverfahren aber nicht im Durchlichtverfahren erkannt werden, zusätzlich gesondert gezählt werden . 5. The method according to any one of claims 1-4, wherein areas which are detected in the fluorescence analysis method but not in the transmitted light method, additionally counted separately.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, wobei erkannte Bereiche, die eine vorgegebene Grenzgröße überschreiten, mehrfach gezählt werden. 6. The method according to any one of claims 1-5, wherein recognized areas that exceed a predetermined limit size are counted multiple times.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, wobei für Bereiche, die in dem Fluoreszenzanalyseverfahren erkannt werden und eine vorgegebene Grenzgröße überschreiten, in Abhängigkeit der Größe, Form und/oder der Fluoreszenzstärke eine Anzahl festgelegt wird . 7. The method according to any one of claims 1-6, wherein for areas which are detected in the fluorescence analysis method and exceed a predetermined limit size, a number is determined depending on the size, shape and / or the fluorescence intensity.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei Bereiche, die im Fluoreszenzanalyseverfahren erkannt werden und eine vorgegebene Grenzgröße überschreiten, mit dem entsprechenden Bereich des im Durchlichtverfahren ermittelten Bereich verglichen werden und zumindest die Anzahl der in diesem Bereich erkannten Fehlstellen gezählt wird . 8. The method according to any one of claims 1-7, wherein areas which are detected in the fluorescence analysis method and exceed a predetermined limit size are compared with the corresponding area of the area determined by the transmitted light method and at least the number of defects detected in this area is counted.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 - 8, wobei die Grenzgröße in Abhängigkeit der Proben und/oder der Messungen insbesondere automatisch angepasst wird. 9. The method according to any one of claims 6-8, wherein the limit size is adjusted automatically in particular depending on the samples and / or the measurements.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 9, wobei es sich beim Durchlichtverfahren und/oder beim Fluoreszenzanalyseverfahren um automatisch durchgeführte Verfahren, insbesondere auf Basis von bildgebenden Verfahren, handelt. 10. The method according to any one of claims 1-9, wherein the transmitted light method and / or the fluorescence analysis method to automatically performed method, in particular based on imaging methods is.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, wobei die Zellkulturen vor dem Durchführen des Durchlichtverfahrens eingefärbt werden.
11. The method according to any one of claims 1-10, wherein the cell cultures are colored before performing the transmitted light method.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11, wobei Kontrollwerte zur Qualitätskontrolle insbesondere automatisch ermittelt werden. 12. The method according to any one of claims 1-11, wherein control values for quality control are determined in particular automatically.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 12, wobei die Zellkultur mittels einer viralen Flüssigkeit, ggf. verdünnt, infiziert wird. 13. The method according to any one of claims 1-12, wherein the cell culture by means of a viral liquid, optionally diluted, is infected.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Verdünnungsfaktur bei der Bestimmung der Anzahl der Infektionsherde berücksichtigt wird. 14. The method of claim 13, wherein the dilution factor is taken into account in the determination of the number of foci of infection.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, wobei als Probenträger eine Titerplatte, insbesondere eine Mikro-Titerplatte, verwendet wird . 15. The method according to any one of claims 1-14, wherein a titer plate, in particular a micro-titer plate is used as a sample carrier.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei je well der Titerplatte und insbesondere der Mikrotiterplatte dieselbe Zellkultur vorhanden ist. 16. The method according to claim 15, wherein each well of the titer plate and in particular of the microtiter plate the same cell culture is present.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 - 16, wobei die virale Flüssigkeit nach einer Einwirkzeit entfernt und durch eine die Diffusion später freigesetzter Viruspartikel behindernde Abdeckung, etwa eine Gelschicht ersetzt wird. 17. The method according to any one of claims 14-16, wherein the viral liquid is removed after a contact time and replaced by a diffusion of later released virus particles hindering coverage, such as a gel layer.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 17, wobei die Durchführung der Verfahren nach einer Inkubationszeit von vorzugsweise einigen Minuten und insbesondere mehreren Tagen erfolgt.
18. The method according to any one of claims 1-17, wherein the implementation of the method takes place after an incubation period of preferably a few minutes and in particular several days.
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