EP3405032A1 - Extrait de plante agissant comme agent antifongique, et procede de preparation - Google Patents

Extrait de plante agissant comme agent antifongique, et procede de preparation

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Publication number
EP3405032A1
EP3405032A1 EP17705162.0A EP17705162A EP3405032A1 EP 3405032 A1 EP3405032 A1 EP 3405032A1 EP 17705162 A EP17705162 A EP 17705162A EP 3405032 A1 EP3405032 A1 EP 3405032A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
extract
plant extract
dittrichia
esi
diene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17705162.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Lucius TAMM
Hans-Jakob SCHAERER
Annabel LEVERT
Vanessa ANDREU
Cédric BERTRAND
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Greentech SA
Original Assignee
Greentech SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Greentech SA filed Critical Greentech SA
Publication of EP3405032A1 publication Critical patent/EP3405032A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/12—Asteraceae or Compositae [Aster or Sunflower family], e.g. daisy, pyrethrum, artichoke, lettuce, sunflower, wormwood or tarragon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/06—Unsaturated carboxylic acids or thio analogues thereof; Derivatives thereof

Definitions

  • the invention relates to a plant extract acting as antifungal agent against any type of phytopathogens.
  • the invention also relates to the process for producing such an extract, and a fungicidal composition for use in phytoprotection.
  • the present invention relates to the technical field of antifungals for use in protecting crops.
  • Fungicides are known from synthetic molecules such as mancozeb or tebuconazole, active against apple scab and mildew of the vine.
  • fungicidal products of natural origin for example of mineral origin. These include copper derivatives (copper hydroxide, copper sulphate), sulfur derivatives (micronized sulfur) and potassium bicarbonate. But these products have a significant toxicity and also have a high remanence in the environment. This is particularly the case of copper that is not degraded.
  • the invention thus provides a fungicide of natural origin with sufficient efficacy on crops to be either a substitute for fungicides currently used, or have sufficient efficacy against diseases currently lacking effective treatment.
  • the invention relates essentially to a plant extract of the family Asteraceae, for example of the genus Dittrichia, which is essentially characterized in that it comprises at least the 12-carboxyeudesma-3 compound, 1 1 (13) -diene and / or one of its dehydrogenated derivatives acting as antifungal agent, and in that it is obtained according to a process comprising at least the steps of drying fresh plants, maceration of the dried plants in a solvent chosen from water, alcohols, ketones, esters, ethers, chlorinated solvents, hydrocarbon alkanes and any mixture of two or more of the solvents mentioned or by supercritical fluid extraction combined or not with a co-solvent and drying the mixture, for which steps the operating temperature is lower.
  • a solvent chosen from water, alcohols, ketones, esters, ethers, chlorinated solvents, hydrocarbon alkanes and any mixture of two or more of the solvents mentioned or by supercritical fluid extraction combined or not with a co-solvent and drying
  • the extract of the invention may also include the following optional characteristics considered in isolation or according to all possible technical combinations: the maceration step is carried out at a temperature below 40 ° C. and at a pH of between 5 and 8; the solvent used during the maceration step is ethanol,
  • the extract furthermore comprises a terpene compound of mass 498 and of empirical formula C30H42O6 wherein the terpene compound of mass 498 and of empirical formula C30H42O6 has an ESI + mass spectrum according to FIG. 5, an ESI-mass spectrum according to FIG. 6, a spectrum of ms2 at ESI + according to FIG. 7 and a spectrum of ms2 at ESI- according to FIG. 8, the plant of the genus Dittrichia is Dittrichia viscosa.
  • the invention also relates to the use of the plant extract previously defined as antifungal agent against phytopathogenic plant organisms.
  • phytopathogenic organisms are those among Basidiomycetes, Oomycetes, Ascomycetes and Deuteromycetes.
  • the plant extract is used as antifungal agent in pre or post-harvest treatment on agricultural areas, for example as a preventive treatment, anti-germinative or curative on seeds, in viticulture, arboriculture or market gardening, or in treatment on non-agricultural areas.
  • the invention finally relates to a biofungicidal composition which is essentially characterized in that it comprises the plant extract as defined above.
  • the biofungicidal composition is in the form of dispersible granules, liquids, aqueous emulsions or emulsifiable concentrates.
  • FIG. 1 represents the ESI + mass spectrum of the major compound of a first active subfraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of 12-carboxyeudesma-3,11 (13) -diene,
  • FIG. 2 represents the ESI mass spectrum of the major compound of the first active subfraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene;
  • FIG. 3 represents the spectrum of ms2 corresponding to the ESI + mass spectrum of FIG. 1 of the major compound of the first active subfraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of 12-carboxyeudesma-3,11 (13) diene,
  • FIG. 4 represents the spectrum of ms2 corresponding to the ESI mass spectrum of FIG. 2 of the major compound of the first active subfraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of 12-carboxy-3-methoxy-3-carbons. (13) -diene,
  • FIG. 5 represents the ESI + mass spectrum of the major component of a second active fraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of a terpene compound of mass 498 and of empirical formula C30H42O6,
  • FIG. 6 represents the ESI mass spectrum of the major component of the second active fraction of an extract of Dittrichia viscosa, showing the majority presence of terpene compound of mass 498 and of crude formula
  • FIG. 7 represents the spectrum of ms2 corresponding to the mass spectrum ESI + of FIG. 5 of the major compound of the second active subfraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of the terpene compound of mass 498 and of formula gross C30H42O6,
  • FIG. 8 represents the spectrum of ms2 corresponding to the ESI mass spectrum of FIG. 6 of the major compound of the second active subfraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of the terpene compound of mass 498 and of crude formula C3oH4206,
  • FIG. 8a the ESI + mass spectrum of the major compound of a third active fraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of a dehydrogenated derivative of 12-carboxyeudesma-3,11 (13) -diene
  • FIG. 8b represents the spectrum of ms2 corresponding to the ESI mass spectrum of FIG. 8a of the major compound of the third active subfraction of a Dittrichia viscosa extract showing the predominant presence of the dehydrogenated derivative 12-carboxyeudesma- 3,11 (13) -diene,
  • FIG. 9 shows the effectiveness of a Dittrichia viscosa extract and a particularly active first and second fraction of this extract for concentrations of 25 and 50 ppm on the inhibition of mycelial growth
  • FIG. 10 shows the distribution of the incidence of monilysis for control nectarines treated with Dittrichia viscosa extract enriched in 12-carboxyeudesma-3,11 (13) -diene, in the form of a didehydrogen derivative and in a terpene mass compound. 498 and of empirical formula C30H42O6,
  • FIG. 11 shows the incidence and mean severity observed on untreated grape mildew (Plasmopara viticola), treated with copper, and treated with Dittrichia viscosa extract enriched in 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene, as a dihydrogen derivative and terpene compound of mass 498 and of empirical formula C30H42O6,
  • FIG. 12 shows the incidence and mean severity observed on powdery mildew (Erysiphe necator) without treatment, treated with copper, and treated with Dittrichia viscosa extract enriched in 12-carboxyeudesma-3,11 (13) -diene, the dihydrogenated derivative and terpene compound having a mass of 498 and a crude formula
  • FIG. 13 shows the average incidence observed on apple scab without treatment and treated with Dittrichia viscosa extract enriched in 12-carboxyeudesma-3,11 (13) -diene, in didehydrogenated derivative and in terpene mass compound. 498 and of empirical formula C30H42O6,
  • FIG. 14 shows the areas of the peaks corresponding respectively to 12-carboxyeudesma-3,11 (13) -diene and to the costic acid present in a Dittrichia viscosa extract obtained according to different operating conditions of temperature and pH, and
  • FIG. 15 shows the antifungal index against Monilinia fructigena of an extract of Dittrichia viscosa obtained according to different operating conditions of temperature and pH.
  • the extract of the invention and the biofungicidal composition of the invention comprise at least one sesquiterpene acid of the 12-carboxyeudesma-3,11 (13) -diene type, otherwise called eudesma-3,11 acid (13). -diene-12-oic acid or one of its dehydrogenated derivatives.
  • the 12-carboxyeudesma 3.1 1 (13) -diene acting as antifungal agent in the extract and the composition of the invention may have a three-dimensional structure having a separate CAS number.
  • the use of the term 12-carboxyeudesma 3,11 (13) -diene also includes this three-dimensional structure.
  • the use of the term "isocostic acid” widely used in the literature does not refer exclusively to 12-carboxyeudesma 3,11 (13) -diene. Indeed, isocostic acid groups several molecules including 12-carboxyeudesma 3.1 1 (13) -diene.
  • the 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene is identified in some Lauraceae of the genus Nectandra sp. and in a number of genera of the family Asteraceae. It has in fact been isolated from organic extracts of plants of the genera Cheirolophus sp. , Cratystylis sp. , Ophryosporus sp. , Artemisia sp. or Dittrichia sp. More recent publications report the phytotoxic, antileishmanial, anthelmintic and ichthyotoxic activity of 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13) -diene, isolated from extracts of Dittrichia viscosa or D. graveolens.
  • the plant extract of the invention also advantageously comprises a second active compound which is a terpene compound of formula C3oH 206 and mass 498 which has not been known to the inventors, until now. identified or associated with any antimicrobial or antifungal activity in plant extracts.
  • the present invention therefore relates in a first aspect, a plant extract, for example Dittrichia viscosa comprising these two molecules, 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene and / or one of its dehydrogenated derivatives, and preferably also a terpene compound of formula C30H42O6 which may be pure or in mixtures, which act as antifungal agent, that is to say active against pathogenic fungi, used for crop protection.
  • a plant extract for example Dittrichia viscosa comprising these two molecules, 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene and / or one of its dehydrogenated derivatives, and preferably also a terpene compound of formula C30H42O6 which may be pure or in mixtures, which act as antifungal agent, that is to say active against pathogenic fungi, used for crop protection.
  • an extract of the plant of the genus Dittrichia may be used for this purpose.
  • the extract of the invention will be obtained according to a second aspect of the invention according to a maceration extraction process which will be described later, but which must necessarily be free of any operation carrying the plant at a higher temperature. at 60 ° C.
  • pH conditions of the maceration step must be respected. Without following these operating conditions, the extract may contain 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene and / or dehydrogenated derivatives, without having sufficient fungicidal character.
  • the extract comprises 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene and / or one of its dehydrogenated derivatives, but also that the process of extraction respects the operating conditions and in particular that all operations are performed at temperatures below 60 ° C.
  • the plants used to make the extract may be whole or consist of parts of plants such as roots, stems, leaves, fruits, flowers or any mixture of at least two of these parts, .
  • the parts of the extracted plants may be in fresh or dry form, whole or ground.
  • the extracts used can in particular be obtained by extraction with a solvent chosen from water, alcohols, ketones, esters, ethers, polyols, chlorinated solvents or any mixture of two or more of these solvents.
  • the parts of the selected plant are harvested and then crushed in fresh or dry form. They are left to macerate at a temperature below 60 ° C and at a pH strictly greater than 1 and strictly less than 10, preferably with stirring or ultrasound for 15 minutes to 1 month, preferably for a few hours.
  • a mass ratio ground mill on solvent of between 1/1 and 1/10.
  • At this extraction step may be added purification, fractionation, filtration, concentration and / or drying steps.
  • the desired antifungal activity may be of a fungistatic or fungicidal nature.
  • the preparation can be applied as an anti-germinative, preventive or curative treatment on all types of plant pathogenic fungi including in particular those of the family Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes and Oomycetes.
  • rust agents Albugo sp., Puccinia sp., Melapsora sp., Melampsorella sp., Gymnosporangium sp., Cronartium sp.
  • mildew Powdery mildews (Podosphaera sp., Erysiphe sp., Blumeria sp), cankers (Neonectria sp., Cryphonectria sp.), galls (Synchytrium) sp.) and scab (Venturia sp., Fusicladium sp.).
  • the extracts comprising 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene and / or one of its dehydrogenated derivatives, and the terpenic compound of formula C30H42O6, may be incorporated into a biofungicidal composition that may occur in the form of more or less concentrated liquids, dispersible granules, emulsion or any other type of preparation known to those skilled in the art.
  • this composition may be added various adjuvants or formulants allowing for example better penetration and stabilization of the extract.
  • paraffins and derivatives thereof hydrocarbon polymers, vegetable oils such as rapeseed oil, mineral oils, resins, triglyceride derivatives and oligomers may be mentioned as examples.
  • the 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene, one of its dehydrogenated derivatives, and the terpenic compound of formula C30H42O6 are derived from a plant extract of Dittrichia viscosa also referred to as viscous Inula. These two molecules may also be derived from a plant extract of another plant species of the genus Dittrichia. In the following example, these two active molecules have been identified in the Dittrichia viscosa extract by means of a bio-guided fractionation.
  • Dittrichia viscosa The aerial parts of Dittrichia viscosa were harvested in June 2012 in various fallow and fallow areas of Perpignan, France, in the eastern Pyrenees. These aerial parts were dried at room temperature.
  • the extraction is carried out by maceration of 100g of previously dried plants of Dittrichia viscosa in 3 x 1 L of ethanol (in a ratio of 1 g of plant per 10 ml of ethanol), optionally assisted with ultrasound to reduce the extraction time and thus increase the yield. After 3 hours of maceration, the mixture of plant and ethanol is filtered, and the filter permeate is dried by evaporation at a temperature between 35 and 40 ° C.
  • the filtered residue is then lyophilized, frozen and then subjected to an evaporation operation in order to remove traces of water.
  • An extract (dry residue of 13g) of Dittrichia viscosa is obtained which is in the form of a viscous green wax at room temperature.
  • the HPLC analyzes are performed on an Agilent Technologies ® equipment equipped with a diode array detector and connected to a MAT LCQ mass spectrometer connected to an ion trap.
  • a kinetex ® C18 grafted column is used. 10 ⁇ l of sample are injected into the column with UV detection between 200 and 600 nm, targeting particularly the wavelengths 210, 254 and 280 nm.
  • the eluting solvent is a gradient of methanol in water containing 0.1% formic acid.
  • the families of major compounds found in the extract are flavonoids aglycones and terpenes, including sesquiterpenes. An identification of the majority compounds is carried out.
  • the extract is fractionated on chromatographic flash chromatography systems and reversed-phase semi-preparative chromatography using stationary phase of the grafted silica C18.
  • the alcoholic macerate of the aerial parts of Dittrichia viscosa is fractionated by flash chromatography in reverse phase with an elution solvent consisting of a gradient of methanol in water. This sharing makes it possible to recover two fractions.
  • the first fraction 1 and the second fraction 2 are tested in vitro on strains of Monilinia laxa for two concentrations of 25 and 50 ppm respectively and compared to extract 3. It can be seen that Inhibition of the strongest mycelial growth is obtained with the second fraction 2. Similar tests are also conducted in vivo on Plasmopara viticola and Venturia inaequalis and the results also show a greater activity of the second fraction 2.
  • This second most active fraction 2 is subfractionated on flash chromatography with an elution solvent consisting of a gradient of methanol in water. This sharing allows to recover 8 sub fractions. A first sub-fraction more active F2.1 is then sub-fractionated on flash chromatography in 6 subfractions.
  • FIGS. 1 and 3 respectively show the ESI + mass spectra and the corresponding ms2 spectrum of the active subfraction F.2.1.4.
  • FIGS. 2 and 4 respectively show the ESI- mass spectra and the corresponding ms2 spectrum of this active fraction F.2.1.4.
  • FIGS. 5 and 7 respectively show the ESI + mass spectra and the corresponding ms2 spectrum of the active fraction F.2.1.5.
  • FIGS. 6 and 8 respectively show the ESI- mass spectra and the corresponding ms2 spectrum of this active fraction F.2.1 .5.
  • FIGS. 8a and 8b respectively show the ESI (+) mass spectra and the corresponding ms2 spectrum of the active fraction F 2.1 .3.
  • the major component of this fraction has a mass of 232 uma with a molecular ion in ESI (+) of 233 m / z.
  • Its fractionation in ESI (+) causes the formation of two ions, at 215 and 187 m / z, explainable by the loss of an OH group and a COOH group. These two losses are characteristic of the carboxylic groups.
  • the majority compound of the subfraction F 2.1.3.
  • 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene has been identified as a sesquiterpene acid of the di-dehydrocostic type (which may be otherwise referred to as the dehydrogenated derivative of 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene) such as, for example, eudesma-2,4-acid (15) , 11 (13) -triene-12-oic. It has thus been identified that 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene and its dehydrogenated derivatives, as well as the compound of formula C30H42O6 and mass 498, are active antifungal compounds of an extract. of Dittrichia viscosa.
  • An extract of Dittrichia viscosa is prepared by maceration extraction as previously described.
  • Botrytis cinerea Botrytis allii
  • Monilinia taxa Monilinia fructigena
  • the tests are carried out in 12-well microplates, with 3 repetitions per modality.
  • a 6 mm diameter mycelial disc from a 10-day malt agar medium culture was deposited on 2 ml of agar medium containing 1% ethanolic extract. After incubation for 1 to 3 days at 23 ° C., the reading of the size of the mycelial halo makes it possible to determine the growth inhibition rate with respect to the control.
  • Table 2 shows the median inhibitory concentrations (IC50) obtained on the different strains in the in vitro tests of Dittrichia viscosa extract on mycelial growth.
  • the extract is active on all the strains tested, and more particularly on the strains of Botrytis sp. and Monilinia sp.
  • Tests were conducted in vivo on mini-vine plants (Plasmopara viticola) and apple (Venturia inaequalis) according to standardized protocols. All experiments were conducted with six replicates per treatment using random assignment of treatments in each block. The plants were treated with Dittrichia viscosa extract on all leaves using an air compressor equipped with an automatic air assisted spray booster (approximately 20 ml per plant; the nozzle). The plants were then allowed to dry at room temperature before being inoculated with the spore suspensions.
  • the inoculum was prepared from spores of P. viticola and V. inaequalis recovered from previously infected plants.
  • the inoculated plants were then kept for 24 hours in the dark at 20-21 ° C and in the presence of a relative humidity of 80-99%, then 6 days at 18-25 ° C in the presence of a relative humidity of 60-80% and a photoperiod 16 hours day / 8 hours night.
  • the plants were then incubated overnight in the dark at 20 ° C and 80-99% relative humidity to promote sporulation.
  • Table 3 below includes the efficiencies of Dittrichia viscosa extract on the two strains tested.
  • the extract has a very good activity in vivo on the two targets tested, with an inhibition comparable to that of the positive control for doses of 1000 and 2500 ppm.
  • FIG. 13 shows the average incidence observed on apple scab treated with Dittrichia viscosa extract 12 in comparison with an untreated control. There is also a substantial reduction in the incidence when the treatment is carried out. is carried out with the substance of the invention 12.
  • Antifungal activity tests were also conducted according to different operating conditions for obtaining the Dittrichia viscosa extract.
  • the extraction is carried out as previously described by varying the temperature between 20 ° C (room temperature TA) and 80 ° C, and the extraction pH between 1 and 10.
  • the various extracts are analyzed in LC -DAD-MS on a Thermo Scientific® system equipped with a diode array detector and connected to a Fleet LCQ mass spectrometer.
  • the ionization mode used is electrospray (ESI) in positive and negative mode and the analyzer is of the ion trap type.
  • FIG. 15 shows the antifungal index against Monilinia fructigena extracts obtained according to the different extraction operating conditions presented with reference to FIG. 14, except for the extract obtained by a 80 ° extraction. vs. While the extracts obtained at pH 10 have a content of 12-carboxyeudesma-3.1 1 (13) -diene only substantially lower than that obtained at pH 5 (FIG. 14), the antifungal activity of the extract obtained by extraction at room temperature and pH 5 is substantially superior to the antifungal activity of all other extracts. If it has been demonstrated that 12-carboxyeudesma-3,11 (13) -diene and its dehydrogenated derivatives have a strong antifungal activity (see Table 1 in particular), the results presented in FIGS.
  • the maceration extraction temperature for obtaining the Dittrichia viscosa extract must be less than 60 ° C. and the pH is at 1 ⁇ pH ⁇ 10.
  • the temperature is below 40 ° C. and the pH is between 5 and 8.
  • the temperature conditions below 60 ° C. extend to all the operations of the process for preparing the extract, including the preliminary drying of fresh plants and the drying of the macerated mixture.

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Abstract

L'invention porte principalement sur un extrait de plante de la famille des Astéracées, par exemple du genre Dittrichia, qui est essentiellement caractérisé en ce qu'il comporte au moins le composé 12-carboxyeudesma-3,11 (13)-diène et/ou l'un de ses dérivés déshydrogénés agissant comme agent antifongique, et en ce qu'il est obtenu selon un procédé comportant au moins les étapes de séchage des plantes fraîches, macération des plantes séchées dans un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les solvants chlorés, les alcanes hydrocarbonés et tout mélange de deux ou plus des solvants cités ou par extraction sous fluide supercritique combinée ou non avec un co-solvant, et séchage du mélange, pour lesquelles étapes la température opératoire est inférieure à 60°C et pour laquelle étape de macération le pH est selon 1 < pH < 10.

Description

EXTRAIT DE PLANTE AGISSANT COMME AGENT ANTIFONGIQUE, ET PROCEDE DE PREPARATION "
[0001] L'invention concerne un extrait de plante agissant comme agent antifongique à rencontre de tout type de phytopathogènes.
[0002] L'invention concerne également le procédé de réalisation d'un tel extrait, ainsi qu'une composition fongicide destinée à être utilisée en phytoprotection.
[0003] La présente invention concerne le domaine technique des antifongiques destinés à être utilisés pour protéger les cultures. [0004] On connaît des fongicides issus de molécules de synthèse tels que le mancozèbe ou le tébuconazole, actifs à rencontre de la tavelure du pommier et du mildiou de la vigne.
[0005] Il existe également des produits fongicides d'origine naturelle, par exemple d'origine minérale. Il s'agit notamment de dérivés de cuivre (hydroxyde de cuivre, sulfate de cuivre), de dérivés de soufre (soufre micronisé) et de bicarbonate de potassium. Mais ces produits présentent une toxicité non négligeable et présentent également une forte rémanence dans l'environnement. C'est notamment le cas du cuivre qui n'est pas dégradé.
[0006] Tous ces produits, de synthèse ou d'origine naturelle, peuvent engendrer par ailleurs des phénomènes de résistance des nuisibles.
[0007] Avec la prise de conscience de l'impact environnemental et sanitaire des pesticides et l'apparition de phénomènes de résistance face à ces produits, les exigences réglementaires européennes pour l'utilisation des pesticides sont de plus en plus drastiques. Certains produits de synthèse ou fongicides d'origine minérale sont ou devront être dans un futur proche, retirés du marché. [0008] Pour répondre à ces contraintes réglementaires, il est donc nécessaire de développer de nouveaux types de produits de protection des cultures tels que des bio-pesticides, des produits d'origines naturelles à base de microorganismes et de molécules naturelles, d'origines végétale, animale ou microbienne, moins rémanents et ayant à priori un impact réduit sur l'environnement. Ces besoins existent notamment pour les compositions antifongiques utilisables en protection des cultures. [0009] En outre, pour certaines maladies, par exemple certaines monilioses, les produits de synthèse existants ne sont pas suffisamment efficaces et il n'existe pas de produit d'origine naturelle homologué.
[0010] L'invention vise ainsi un fongicide d'origine naturelle présentant une efficacité suffisante sur les cultures pour pouvoir soit se substituer aux fongicides actuellement utilisés, soit présenter une efficacité suffisante à rencontre des maladies actuellement dépourvues de traitement efficace.
[001 1] À cet effet, l'invention porte essentiellement sur un extrait de plante de la famille des Astéracées, par exemple du genre Dittrichia, qui est essentiellement caractérisé en ce qu'il comporte au moins le composé 12-carboxyeudesma- 3,1 1 (13)-diène et/ou l'un de ses dérivés déshydrogénés agissant comme agent antifongique, et en ce qu'il est obtenu selon un procédé comportant au moins les étapes de séchage des plantes fraîches, macération des plantes séchées dans un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les solvants chlorés, les alcanes hydrocarbonés et tout mélange de deux ou plus des solvants cités ou par extraction sous fluide supercritique combinée ou non avec un co-solvant, et séchage du mélange, pour lesquelles étapes la température opératoire est inférieure. [0012] L'extrait de l'invention peut également comporter les caractéristiques optionnelles suivantes considérées isolément ou selon toutes les combinaisons techniques possibles : - l'étape de macération est réalisée à une température inférieure à 40°C et à un pH compris entre 5 et 8, - le solvant utilisé lors de l'étape de macération est l'éthanol,
- l'extrait comporte en outre un composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6 o le composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6 présente un spectre de masse en ESI+ selon la figure 5, un spectre de masse en ESI- selon la figure 6, un spectre de ms2 en ESI+ selon la figure 7 et un spectre de ms2 en ESI- selon la figure 8, - la plante du genre Dittrichia est Dittrichia viscosa.
[0013] L'invention porte également sur l'uttilisation de l'extrait de plante précédemment défini comme agent antifongique à rencontre d'organismes phytopathogènes de plantes.
[0014] Avantageusement, les organismes phytopathogènes sont ceux parmi Basidiomycètes, Oomycètes, Ascomycètes et Deutéromycètes.
[0015] De préférence, l'extrait de plante est utilisé comme agent antifongique en traitement pré ou post-récolte sur zones agricoles, par exemple en traitement préventif, antigerminatif ou curatif sur semences, en viticulture, arboriculture ou maraîchage, ou en traitement sur zones non agricoles.
[0016] L'invention porte enfin sur une composition biofongicide qui est essentiellement caractérisée en ce qu'elle comprend l'extrait de plante tel que précédemment défini. [0017] De préférence, la composition biofongicide se présente sous forme de granulés dispersibles, de liquides, d'émulsions aqueuses ou de concentrés émulsifiables. [0018] D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront clairement de la description qui en est donnée ci-dessous, à titre indicatif et nullement limitatif, en référence aux figures annexées parmi lesquelles :
- la figure 1 représente le spectre de masse ESI+ du composé majoritaire d'une première sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire de 12-carboxyeudesma-3,11 (13)-diène,
- la figure 2 représente le spectre de masse ESI- du composé majoritaire de la première sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire de 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène, - la figure 3 représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse ESI+ de la figure 1 du composé majoritaire de la première sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire de 12- carboxyeudesma-3,11 (13)-diène,
- la figure 4 représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse ESI- de la figure 2 du composé majoritaire de la première sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire de 12- carboxyeudesma-3,11 (13)-diène,
- la figure 5 représente le spectre de masse ESI+ du composé majoritaire d'une seconde sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire d'un composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6,
- la figure 6 représente le spectre de masse ESI- du composé majoritaire de la seconde sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire du composé terpénique de masse 498 et de formule brute
- la figure 7 représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse ESI+ de la figure 5 du composé majoritaire de la seconde sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire du composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6,
- la figure 8 représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse ESI- de la figure 6 du composé majoritaire de la seconde sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire du composé terpénique de masse 498 et de formule brute C3oH4206,
- la figure 8a le spectre de masse ESI+ du composé majoritaire d'une troisième sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire d'un dérivé déshydrogéné du 12-carboxyeudesma-3,11 (13)- diène, - la figure 8b représente le spectre de ms2 correspondant au spectre de masse ESI- de la figure 8a du composé majoritaire de la troisième sous fraction active d'un extrait de Dittrichia viscosa mettant en évidence la présence majoritaire du dérivé déshydrogéné 12-carboxyeudesma-3,11 (13)-diène,
- la figure 9 présente l'efficacité d'un extrait de Dittrichia viscosa et d'une première et seconde fraction particulièrement active de cet extrait pour des concentrations de 25 et 50 ppm sur l'inhibition de la croissance mycélienne,
- la figure 10 présente la répartition de l'incidence de la moniliose pour des nectarines témoins et traitées avec l'extrait de Dittrichia viscosa enrichi en 12- carboxyeudesma-3,11(13)-diène, en dérivé didéhydrogénéet en composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6,
- la figure 11 présente l'incidence et la sévérité moyenne observées sur le mildiou de la vigne (Plasmopara viticola) sans traitement, traité avec du cuivre, et traité avec l'extrait de Dittrichia viscosa enrichi en 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène, en dérivé didéhydrogénéet en composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6,
- la figure 12 présente l'incidence et la sévérité moyenne observées sur l'oïdium de la vigne {Erysiphe necator) sans traitement, traité avec du cuivre, et traité avec l'extrait de Dittrichia viscosa enrichi en 12-carboxyeudesma-3,11(13)-diène, en dérivé didéhydrogéné et en composé terpénique de masse 498 et de formule brute
- la figure 13 présente l'incidence moyenne observée sur la tavelure du pommier sans traitement et traité avec l'extrait de Dittrichia viscosa enrichi en 12- carboxyeudesma-3,11 (13)-diène, en dérivé didéhydrogéné et en composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6,
- la figure 14 présente les aires des pics correspondant respectivement au 12- carboxyeudesma-3,11 (13)-diène et à l'acide costique présent dans un extrait de Dittrichia viscosa obtenu selon différentes conditions opératoires de température et de pH, et
- la figure 15 présente l'indice antifongique à rencontre de Monilinia fructigena d'un extrait de Dittrichia viscosa obtenu selon différentes conditions opératoires de température et de pH.
[0019] L'extrait de l'invention et la composition biofongicide de l'invention comprennent au moins un acide sesquiterpénique de type 12-carboxyeudesma- 3,11 (13)-diène, autrement dénommé acide eudesma-3,11 (13)-diène-12-oïque ou l'un de ses dérivés déshydrogénés.
[0020] Il est à noter que le 12-carboxyeudesma 3,1 1 (13)-diène agissant comme agent antifongique dans l'extrait et la composition de l'invention peut présenter une structure en trois dimensions présentant un numéro CAS distinct. Dans la présente demande, l'utilisation du terme 12-carboxyeudesma 3,11 (13)- diène inclut également cette structure en trois dimensions. [0021 ] Il est également à noter que l'emploi du terme « acide isocostique » largement utilisé dans la littérature ne se réfère pas exclusivement au 12- carboxyeudesma 3,11 (13)-diène. En effet, l'acide isocostique regroupe plusieurs molécules dont le 12-carboxyeudesma 3,1 1 (13)-diène. Il s'ensuit que si le 12- carboxyeudesma 3,1 1 (13)-diène est bien un acide isocostique, la seule référence à un acide isocostique n'emporte pas automatiquement référence au 12- carboxyeudesma 3,1 1 (13)-diène.
[0022] Le 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène est identifié chez certaines Lauracées du genre Nectandra sp. et chez un certain nombre de genres de la famille des Asteracées. Il a en effet été isolé d'extraits organiques de plantes des genres Cheirolophus sp. , Cratystylis sp. , Ophryosporus sp. , Artemisia sp. ou encore Dittrichia sp. Des publications plus récentes font état de l'activité phytotoxique, antileishmanienne, anthelminthique et ichthyotoxique du 12- carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène, isolé d'extraits de Dittrichia viscosa ou D. graveolens.
[0023] L'activité antibactérienne de l'huile essentielle de Dittrichia viscosa a en outre été observée, sans que cette activité ne soit attribuée à la présence de 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène. Par ailleurs, ces essais ont été menés essentiellement sur des souches fongiques et bactériennes humaines ou du sol. Une publication précise l'activité antimicrobienne du 12-carboxyeudesma-3,11 (13)- diène isolé de Dittrichia viscosa (Shtacher et al., 1970). Cependant, l'activité revendiquée concerne exclusivement les dermatophytes pathogènes de l'homme.
[0024] Ainsi, l'activité antifongique du 12-carboxyeudesma-3,11 (13)-diène vis- à-vis des phytopathogènes n'a, à la connaissance des inventeurs, jamais été caractérisée ni publiée. [0025] L'extrait de plante de l'invention comporte en outre avantageusement un second composé actif qui est un composé terpénique de formule C3oH 206 et de masse 498 qui n'a jusqu'à présent, à la connaissance des inventeurs, jamais été identifié ni associé à une quelconque activité antimicrobienne ou antifongique dans des extraits de végétaux. [0026] La présente invention concerne donc selon un premier aspect, un extrait de plante, par exemple de Dittrichia viscosa comprenant ces deux molécules, le 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène et/ou l'un de ses dérivés déshydrogénés, et de préférence également un composé terpénique de formule C30H42O6 qui peuvent être purs ou en mélanges, qui agissent comme agent antifongique, c'est-à-dire actif à encontre des champignons pathogènes, utilisable en protection des cultures. À titre d'exemple, un extrait de la plante du genre Dittrichia pourra être utilisé à cette fin.
[0027] L'extrait de l'invention sera obtenu selon un second aspect de l'invention selon un procédé d'extraction par macération qui sera décrit plus loin, mais qui doit nécessairement être exempt de toute opération portant la plante à une température supérieure à 60°C. Par ailleurs, des conditions de pH de l'étape de macération doivent être respectées. Sans suivre ces conditions opératoires, l'extrait pourra comporter du 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène et/ou en dérivés déshydrogénés, sans présenter de caractère fongicide suffisant. Il s'en suit qu'il est à la fois nécessaire que l'extrait comporte du 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène et/ou l'un de ses dérivés déshydrogénés, mais également que le procédé d'extraction respecte les conditions opératoires et notamment que toutes les opérations soient réalisées à des températures inférieures à 60°C.
[0028] Les plantes utilisées pour réaliser l'extrait peuvent être entières ou être constituées de parties de plantes telles que les racines, les tiges, les feuilles, les fruits, les fleurs ou de tout mélange d'au moins deux de ces parties, . Les parties des plantes extraites peuvent se présenter sous forme fraîche ou sèche, entière ou broyée. Les extraits utilisés peuvent notamment être obtenus par extraction avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés ou n'importe quel mélange de deux ou plusieurs de ces solvants.
[0029] Lors de l'extraction par solvant, par exemple l'éthanol, on pourra par exemple procéder comme suit : les parties de la plante sélectionnée sont récoltées puis broyées sous forme fraîche ou sèche. Elles sont laissées à macérer à une température inférieure à 60°C et à un pH strictement supérieur à 1 et strictement inférieure à 10, de préférence sous agitation ou ultrasons pendant 15 minutes à 1 mois, de préférence pendant quelques heures. De façon avantageuse, on utilisera un rapport massique partie broyât sur solvant compris entre 1/1 et 1/10. À cette étape d'extraction peuvent s'ajouter des étapes de purification, fractionnement, filtration, concentration et/ou séchage.
[0030] L'activité antifongique recherchée peut être de nature fongistatique ou fongicide. La préparation peut être appliquée en traitement antigerminatif, préventif ou curatif sur tout type de champignons pathogènes des plantes comprenant notamment ceux de la famille des Ascomycètes, des Basidiomycètes, des Deuteromycètes et Oomycètes. A titre d'exemple concernant les cibles potentielles de telles préparations, on peut citer sans aucun caractère limitatif, les agents de rouilles (Albugo sp., Puccinia sp., Melapsora sp., Melampsorella sp., Gymnosporangium sp., Cronartium sp...), de septoriose (Septoria sp., Mycosphaerella sp...), fusariose (Fusarium sp., Gibberella sp...), phoma (Phoma sp.) de pourriture grise (Botrytis cinerea), de monilioses (Monilinia sp.), des mildious (Plasmopara sp. , Phytophtora sp., Bremia sp., Peronospora sp.) des oïdiums (Podosphaera sp., Erysiphe sp., Blumeria sp), chancres (Neonectria sp., Cryphonectria sp.), galles (Synchytrium sp.) et tavelures (Venturia sp., Fusicladium sp.).
[0031 ] Les extraits comportant du 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène et/ou l'un de ses dérivés déshydrogénés, et le composé terpénique de formule C30H42O6, pourront être intégrés dans une composition biofongicide qui peut se présenter sous forme de liquides plus ou moins concentrés, de granulés dispersibles, d'émulsion ou tout autre type de préparation connue par l'homme du métier. Pourront être ajoutés dans cette composition différents adjuvants ou formulants permettant par exemple une meilleure pénétration et stabilisation de l'extrait.
[0032] On citera à titre d'exemple comme adjuvants la paraffine et ses dérivés, les polymères d'hydrocarbures, les huiles végétales telles que l'huile de colza, les huiles minérales, les résines, les dérivés de triglycérides, les oligomères terpéniques, le diméthyl polysiloxane, les alcools terpéniques, l'alcool polyvinylique, les polymères d'amines gras, ou tout autre adjuvant ou formulant homologué pour leurs utilisations dans des bouillies fongicides. [0033] Selon un mode de réalisation non limitatif, le 12-carboxyeudesma- 3,1 1 (13)-diène, l'un de ses dérivés déshydrogénés, et le composé terpénique de formule C30H42O6 sont issus d'un extrait végétal de Dittrichia viscosa également dénommé Inule visqueuse. Ces deux molécules pourront également être issues d'un extrait végétal d'une autre espèce de plante du genre Dittrichia. Dans l'exemple qui suit, ces deux molécules actives ont été identifiées dans l'extrait de Dittrichia viscosa au moyen d'un fractionnement bio-guidé.
Préparation de l'extrait de Dittrichia viscosa [0034] Les parties aériennes de Dittrichia viscosa ont été récoltées en juin 2012 dans différentes zones en friche et jachère de Perpignan, en France, dans les Pyrénées orientales. Ces parties aériennes ont été séchées à température ambiante. [0035] L'extraction est réalisée par macération de 100g de plantes préalablement séchées de Dittrichia viscosa dans 3 x 1 L d'éthanol (sous un rapport de 1 g de plante pour 10 ml d'éthanol), optionnellement assistée aux ultrasons pour réduire le temps d'extraction et augmenter ainsi le rendement. [0036] Après 3 heures de macération, le mélange de plante et d'éthanol est filtré, puis le perméat de filtration est séché par èvaporation à une température comprise entre 35 et 40°C. Le résidu filtré est alors lyophilisé, congelé puis soumis à une opération d'évaporation afin de retirer les traces d'eau. [0037] On obtient un extrait (résidu sec de 13g) de Dittrichia viscosa qui se présente sous la forme d'une cire verte visqueuse à température ambiante.
Identification des métabolites marqueurs d'activité [0038] Les analyses HPLC sont réalisées sur un appareillage Agilent Technologies ® équipé d'un détecteur à barrette de diode et connecté à un spectromètre de masse MAT LCQ connecté à une trappe d'ions. Une colonne kinetex ® greffée en C18 est utilisée. 10 μΙ d'échantillon sont injectés dans la colonne avec une détection UV entre 200 et 600 nm, en ciblant particulièrement les longueurs d'onde 210, 254 et 280 nm. Le solvant d'élution est un gradient de méthanol dans l'eau contenant 0,1 % d'acide formique.
[0039] Les familles de composés majoritaires retrouvées dans l'extrait sont des flavonoides aglycones et des terpènes, notamment des sesquiterpènes. Il est procédé à une identification des composés majoritaires.
[0040] L'extrait est fractionné sur des systèmes de flash chromatpgraphie et chromatographie semi-préparative en phase inverse en utilisant comme phase stationnaire de la silice greffée en C18. Le macérât alcoolique des parties aériennes de Dittrichia viscosa est fractionné sur flash chromatographie en phase inverse avec un solvant d'élution constitué d'un gradient de méthanol dans l'eau. Ce partage permet de récupérer deux fractions. [0041] En référence à la figure 9, la première fraction 1 et la seconde fraction 2 sont testées in vitro sur des souches de Monilinia laxa pour deux concentrations respectivement de 25 et 50 ppm et comparées à l'extrait 3. On constate que l'inhibition de la croissance mycélienne la plus forte est obtenue avec la seconde fraction 2. Des tests similaires sont également menés in vivo sur Plasmopara viticola i Venturia inaequalis et les résultats montrent également une activité plus importante de la seconde fraction 2.
[0042] Cette seconde fraction 2 la plus active est sous-fractionnée sur flash chromatographie avec un solvant d'élution constitué d'un gradient de méthanol dans l'eau. Ce partage permet de récupérer 8 sous fractions. Une première sous fraction plus active F2.1 est ensuite sous-fractionnée sur flash chromatographie en 6 sous-fractions.
[0043] En référence au Tableau 1 ci-dessous, parmi les six sous fractions obtenues, trois sous fractions F 2.1 .3, F2.1 .4 et F2.1.5 sont les plus actives sur Plasmopara viticola et Venturia inaequalis avec des CMI (Concentrations Minimales Inhibitrices) en comparaison avec l'extrait. Les CMI obtenues pour ces trois extraits à rencontre du mildiou de la vigne sont comprises entre 16 et 63 ppm alors que la CMI de l'extrait est dans ce cas de 250 ppm. En ce qui concerne la tavelure du pommier, les CMI des fractions F.2.1.3 et F 2.1.4. sont de 63 ppm pour une CMI de l'extrait de 158 ppm.
Tableau 1 : Concentrations Minimales Inhibitrices exprimées en pg/ml in vitro de trois sous fractions d'un extrait de Dittrichia viscosa
[0044] Ces résultats montrent deux choses. En premier lieu, les CMI obtenues pour l'extrait de Dittrichia viscosa sont suffisamment basses pour mettre en évidence l'efficacité fongicide de cet extrait. En outre, les trois fractions F 2.1.3, F 2.1.4 et F 2.1.5 présentent une activité particulièrement importante à encontre du mildiou de la vigne et de la tavelure du pommier. Il convient alors d'identifier les substances actives présentes dans ces trois fractions.
[0045] L'élucidation structurale des composés majoritaires des trois sous fractions actives F 2.1.3, F.2.1.4 et F.2.1.5 a été établie par l'interprétation des données de spectrométrie de masse et de RMN 1 D et 2D et par spectrométrie de masse à haute résolution pour la fraction F 2.1.5. L'appareillage de RMN utilisé est un Bruker BioSpin. Les spectres RMN 1H, 13C, DEPT 135, HMBC et HSQC ont été traités avec le logiciel Mestrenova.
[0046] Les figures 1 et 3 présentent respectivement les spectres de masse en ESI+ et le spectre de ms2 correspondant de la sous fraction active F.2.1.4. et les figures 2 et 4 présentent respectivement les spectres de masse en ESI- et le spectre de ms2 correspondant de cette sous fraction active F.2.1.4.
[0047] Il est identifié à partir des spectres de masse des figures 1 à 4 et des spectres de RMN la présence majoritaire de 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène dans la sous fraction active F.2.1 .4.
[0048] Les figures 5 et 7 présentent respectivement les spectres de masse en ESI+ et le spectre de ms2 correspondant de la sous fraction active F.2.1.5. et les figures 6 et 8 présentent respectivement les spectres de masse en ESI- et le spectre de ms2 correspondant de cette sous fraction active F.2.1 .5.
[0049] Ces spectres de masse des figures 5 à 8 correspondent à un composé de formule brute C30H42O6 et de masse 498 (m/z 497,2903 en ESI-) présent majoritairement dans la sous fraction active F.2.1.5 .
[0050] Enfin, les figures 8a et 8b présentent respectivement les spectres de masse en ESI(+) et le spectre de ms2 correspondant de la sous fraction active F 2.1 .3. Le composé majoritaire de cette fraction présente une masse de 232 u.m.a avec un ion moléculaire en ESI(+) de 233 m/z. Son fractionnement en ESI(+) entraîne la formation de deux ions, à 215 et 187 m/z, explicables par la perte d'un groupement OH et d'un groupement COOH. Ces deux pertes sont caractéristiques des groupements carboxyliques. [0051 ] Ainsi, le composé majoritaire de la sous fraction F 2.1.3. a été identifié comme étant un acide sesquiterpénique de type di-déhydrocostique (pouvant être autrement dénommé dérivé déshydrogéné du 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène) tel que par exemple l'acide eudesma-2,4(15),1 1 (13)-triène-12-oïque. [0052] Il a ainsi été identifié que le 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène et ses dérivés déshydrogénés, ainsi que le composé de formule brute C30H42O6 et de masse 498, sont des composés actifs antifongiques d'un extrait de Dittrichia viscosa. C'est particulièrement le cas pour le 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène qui présente une efficacité homogène à rencontre du mildiou de la vigne et de la tavelure du pommier. Caractérisation de l'activité antifongique d'extraits de Dittrichia viscosa comportant du 12-carboxyeudesma-3, 1 1 (13)-diène et/ou l'un de ses dérivés, et le composé terpénigue de formule C30H42O6
[0053] Un extrait de Dittrichia viscosa est préparé par extraction par macération tel que précédemment décrit.
[0054] Les tests antifongiques in vitro sont réalisés par contact de l'extrait sur les souches suivantes :
- Pénicillium expansum
- Botrytis cinerea, Botrytis allii
- Monilinia taxa, Monilinia fructigena [0055] Les tests sont effectués dans des microplaques 12 puits, avec 3 répétitions par modalité. Un disque mycélien de 6 mm de diamètre issu d'une culture sur milieu malt agar âgée de 10 jours a été déposé sur 2 ml de milieu gélosé contenant 1 % d'extrait éthanolique. Après incubation 1 à 3 jours à 23°C la lecture de la taille du halo mycélien permet de déterminer le taux d'inhibition de la croissance par rapport au contrôle.
[0056] Le Tableau 2 ci-dessous présente les concentrations inhibitrices médianes (CI50) obtenues sur les différentes souches lors des essais in vitro de l'extrait de Dittrichia viscosa sur la croissance mycélienne. L'extrait est actif sur toutes les souches testées, et plus particulièrement sur les souches de Botrytis sp. et Monilinia sp.
Botrytis Botrytis Pénicillium Monilini Monilinia cinerea allii expansum a laxa fructigena
Temps d'incubation 24h 24h 48h 72h 72h
400 > CI50 400 > CI50 2000 > CI50
Extrait 25 ppm 25 ppm >
> 100 > 100 > 1500
de Dittrichia viscosa > Cl50 CI50
ppm ppm ppm Tableau 2 : Concentration inhibitrice médiane de l'extrait de Dittrichia viscosa sur différentes souches lors d'essais in vitro sur la croissance mycélienne
[0057] Des essais ont été menés in vivo sur des mini-plants de vigne (Plasmopara viticola) et de pommier (Venturia inaequalis) selon des protocoles standardisés. Toutes les expérimentations ont été menées avec six répétitions par traitement en utilisant une répartition aléatoire des traitements dans chaque bloc. Les plants ont été traités avec l'extrait de Dittrichia viscosa sur l'ensemble des feuilles à l'aide d'un compresseur d'air équipé d'une cabine de pulvérisation assistée par air automatique (environ 20 ml par plante ; 120 kPa à la buse). Les plantes ont ensuite été mises à sécher à température ambiante avant d'être inoculées par les suspensions de spores.
[0058] L'inoculum a été préparé à partir de spores de P. viticola et V. inaequalis récupérées sur plantes préalablement infectées. La suspension, préparée immédiatement avant l'inoculation des plantes, a été pulvérisée sur la surface de chaque feuille. Les plants inoculés ont ensuite été maintenus pendant 24 heures dans l'obscurité à 20-21 ° C et en présence d'un taux d'humidité relative de 80-99 %, puis 6 jours à 18-25 ° C en présence d'un taux d'humidité relative de 60-80 % et d'une photopériode 16 heures jour/8 heures nuit. Les plantes ont ensuite été incubées pendant une nuit à l'obscurité à 20 ° C et en présence d'un taux d'humidité relative de 80-99 % afin de promouvoir la sporulation. L'incidence de la maladie (nombre, exprimé en pourcentage, de feuilles présentant des symptômes de tache d'huile et/ou de sporulation visible) et la sévérité de la maladie (pourcentage de la surface des feuilles couvert par des spores) ont été évalués. Toutes les évaluations de la maladie ont été faites en se basant sur l'échelle standard OEPP (OEPP , 2004).
[0059] Le Tableau 3 ci-dessous regroupe les efficacités de l'extrait de Dittrichia viscosa sur les deux souches testées. L'extrait présente une très bonne activité in vivo sur les deux cibles testées, avec une inhibition comparable à celle du contrôle positif pour des doses de 1000 et 2500 ppm.
Tableau 3 : Efficacité in vivo de l'extrait de Dittrichia viscosa sur Plasmopara viticola et Venturia inaequalis
[0060] Des essais ont également été menés en champs sur moniliose de nectarine de variété Nectacrisp {Monilinia fructigena). Toutes les expérimentations ont été menées avec six répétitions par traitement en utilisant une répartition aléatoire des traitements. L'extrait de Dittrichia viscosa à 2500 ppm a été appliqué 5 fois durant la saison d'essais, de début Juillet à début Août 2014. L'adjuvant utilisé est un adjuvant commercialisé sous l'appellation Helioterpen® film comportant 910 g/l d'oligomères terpéniques. Cet adjuvant a été introduit dans l'extrait de Dittrichia viscosa à hauteur d'une concentration volumique de 0,2%. En référence à la figure 10, le traitement des nectarines avec l'extrait de Dittrichia viscosa a permis de diminuer l'incidence de la moniliose au champ de plus de 60% par rapport à un témoin non traité.
[0061] Des tests d'activité antifongique avec l'extrait de Dittrichia viscosa ont été réalisés en plein champs sur deux maladies cryptogamiques de la vigne : oïdium (Erysiphe necator) et mildiou {Plasmopara viticola).
[0062] Les essais ont été menés sur vigne de cépage Chasselas avec la substance de l'invention (à 2,5g/L). Toutes les expérimentations ont été menées avec 4 réplicas de 6 individus par cultivar en utilisant un dispositif randomisé selon les directives de l'Organisation Européenne et méditerranéenne pour la Protection des Plantes (OEPP). 16 traitements ont été réalisés entre le début du mois de Mai et la fin du mois d'Août. [0063] Les figures 1 1 et 12 présentent l'incidence A1 .A2 et la sévérité moyenne B1 ,B2 sur mildiou (figure 1 1 ) et oïdium (figure 12) pour un témoin non traité 6,7, la référence cuivre 8,9 et l'extrait de Dittrichia viscosa 10,1 1 . [0064] Le traitement des vignes avec l'extrait de Dittrichia viscosa a eu un effet notable sur mildiou et oïdium de la vigne. Il a en effet permis de réduire la sévérité du mildiou de la vigne d'environ 60% (sévérité de 18% contre 50% pour le témoin non traité) et a eu un effet comparable à celui de l'hydroxyde de cuivre sur l'incidence de l'oïdium de la vigne, avec une efficacité de plus de 90%.
[0065] Enfin, la figure 13 présente l'incidence moyenne observée sur la tavelure du pommier traitée avec l'extrait de Dittrichia viscosa 12 en comparaison avec un témoin non traité 13. On constate également une réduction substantielle de l'incidence lorsque le traitement est effectué avec la substance de l'invention 12.
[0066] Des essais d'activité antifongique ont également été menés selon différentes conditions opératoires d'obtention de l'extrait de Dittrichia viscosa. Pour ce faire, l'extraction est réalisée telle que précédemment décrit en faisant varier la température entre 20°C (Température ambiante TA) et 80°C, et le pH d'extraction entre 1 et 10. Les différents extraits sont analysés en LC-DAD-MS sur un système Thermo Scientific® équipé d'un détecteur à barrettes de diodes et connecté à un spectromètre de masse LCQ Fleet. Le mode d'ionisation utilisé est l'electrospray (ESI) en mode positif et négatif et l'analyseur est de type trappe d'ion. [0067] La figure 14 présente les aires des pics (proportionnelles aux teneurs des composants) correspondant à deux composés présents dans les extraits : l'acide costique (référence 20) et le 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène (référence 21 ), précédemment identifié comme présentant une activité antifongique. Les conditions opératoires sont définies en abscisse, TA signifiant Température ambiante ce qui correspond approximativement à une température de 20°C. [0068] On constate qu'à un pH 1 d'extraction, le 12-carboxyeudesma- 3,1 1 (13)-diène est absent de l'extrait. Il est en revanche fortement présent à pH 5 pour des températures allant jusqu'à 60°C et sensiblement décroissant lorsque le pH est de 10. On constate par ailleurs que la teneur en acide costique est bien plus faible que la teneur en 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène et ce, particulièrement pour un pH de 5.
[0069] La figure 15 présente l'indice antifongique à rencontre de Monilinia fructigena des extraits obtenus selon les différentes conditions opératoires d'extraction présentées en référence à la figure 14, à l'exception de l'extrait obtenu par une extraction à 80°C. Alors que les extraits obtenus à pH 10 présentent une teneur en 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène seulement sensiblement inférieure à celle obtenue à pH 5 (figure 14), l'activité antifongique de l'extrait obtenu par extraction à température ambiante et à pH 5 est substantiellement supérieure à l'activité antifongique de tous les autres extraits. [0070] S'il a été démontré que 12-carboxyeudesma-3,11 (13)-diène et ses dérivés déshydrogénés présentent une forte activité antifongique (voir Tableau 1 notamment), les résultats présentés sur les figures 14 et 15 montrent que s'ajoute à la présence de ces deux composants, la nécessité de réaliser l'extrait comportant ces composants selon des conditions opératoires spécifiques. Il s'agit notamment de réaliser l'extraction à un pH supérieur à 1 , inférieur à 10 et à une température inférieure à 60°C. On définit donc que selon l'invention, la température d'extraction par macération pour l'obtention de l'extrait de Dittrichia viscosa doit être inférieure à 60°C et le pH est selon 1 < pH < 10. De préférence et selon les résultats présentés sur la figure 15, la température est inférieure à 40°C et le pH est compris entre 5 et 8. Les conditions de températures inférieures à 60°C s'étendent à toutes les opérations du procédé de préparation de l'extrait, y compris le séchage préalable des plantes fraîches et le séchage du mélange macéré.
[0071] Ces conditions opératoires sont ainsi essentielles pour obtenir d'une part un extrait riche en 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène et/ou ses dérivés déshydrogénés, et d'autre part un extrait présentant une activité antifongique conséquente. [0072] Les résultats présentés sur les figures 14 et 15 montrent également que l'acide costique n'est pas un composant actif de l'extrait de Dittrichia viscosa de l'invention puisqu'il présente une teneur substantiellement inférieure à celle du 12-carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène dans l'extrait obtenu à pH 5 et à température ambiante.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Extrait de plante de la famille des Astéracées, par exemple du genre Dittrichia, caractérisé en ce qu'il comporte au moins le composé 12- carboxyeudesma-3,1 1 (13)-diène et/ou l'un de ses dérivés déshydrogénés agissant comme agent antifongique, et en ce qu'il est obtenu selon un procédé comportant au moins les étapes de séchage des plantes fraîches, macération des plantes séchées dans un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les cétones, les esters, les éthers, les solvants chlorés, les alcanes hydrocarbonés et tout mélange de deux ou plus des solvants cités ou par extraction sous fluide supercritique combinée ou non avec un co-solvant, et séchage du mélange, pour lesquelles étapes la température opératoire est inférieure à 60°C et pour laquelle étape de macération le pH est selon 1 < pH < 10.
2. Extrait de plante selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'étape de macération est réalisée à une température inférieure à 40°C et à un pH compris entre 5 et 8.
3. Extrait de plante selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le solvant utilisé lors de l'étape de macération est l'éthanol.
4. Extrait de plante selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6
5. Extrait de plante selon la revendication 3, caractérisé en ce que le composé terpénique de masse 498 et de formule brute C30H42O6 présente un spectre de masse en ESI+ selon la figure 5, un spectre de masse en ESI- selon la figure 6, un spectre de ms2 en ESI+ selon la figure 7 et un spectre de ms2 en ESI- selon la figure 8.
6. Extrait de plante selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la plante du genre Dittrichia est Dittrichia viscosa.
7. Utilisation de l'extrait de plante selon les revendications 1 à 6 comme agent antifongique à rencontre d'organismes phytopathogènes de plantes.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les organismes phytopathogènes sont ceux parmi Basidiomycètes, Oomycètes, Ascomycètes et Deutéromycètes.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisée en ce que l'extrait de plante est utilisé comme agent antifongique en traitement pré ou post-récolte sur zones agricoles, par exemple en traitement préventif, antigerminatif ou curatif sur semences, en viticulture, arboriculture ou maraîchage, ou en traitement sur zones non agricoles.
10. Composition biofongicide, caractérisée en ce qu'elle comprend l'extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
11. Composition biofongicide selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de granulés dispersibles, de liquides, d'émulsions aqueuses ou de concentrés émulsifiables.
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