EP3338091A1 - Méthode prédictive et d'évaluation de l'excès de dose dû aux produits de contraste iodés injectés pendant les examens de radiodiagnostic - Google Patents

Méthode prédictive et d'évaluation de l'excès de dose dû aux produits de contraste iodés injectés pendant les examens de radiodiagnostic

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Publication number
EP3338091A1
EP3338091A1 EP16763916.0A EP16763916A EP3338091A1 EP 3338091 A1 EP3338091 A1 EP 3338091A1 EP 16763916 A EP16763916 A EP 16763916A EP 3338091 A1 EP3338091 A1 EP 3338091A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ph2ax
irradiation
iodinated contrast
foci
minutes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16763916.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas FORAY
Adeline GRANZOTTO
Clément DEVIC
Mélanie FERLAZZO
Larry BODGI
Sandrine PEREIRA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Centre Léon Bérard
Université Claude Bernard Lyon 1
Neolys Diagnostics SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Centre Léon Bérard
Université Claude Bernard Lyon 1
Neolys Diagnostics SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Centre Léon Bérard, Université Claude Bernard Lyon 1, Neolys Diagnostics SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique
Publication of EP3338091A1 publication Critical patent/EP3338091A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the invention relates to the field of medical radiobiology, and more particularly to the field of radiobiological laboratory methods.
  • the present invention relates to a novel predictive method of cellular and clinical radiosensitivity in the field of radiodiagnostics involving iodinated contrast agents and which is based on the determination and cross-checking of several cellular and enzymatic parameters and criteria.
  • the invention also relates to a novel method for evaluating the combined effect of injecting iodinated contrast material and X-radiation administered in a radiodiagnostic examination.
  • Radiodiagnosis represents the greatest single cause of exposure to ionizing radiation and is one of the greatest sources of radiation-induced cancer risk (according to a report "Biological Effects of Low Radiation Doses", Vol I Annex G published in 2000 by the United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation (UNSCEAR).
  • UNSCEAR Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation
  • radiodiagnostic examinations sometimes require an increase in contrast to to better visualize the organ to be studied (Perez, Devic et al., 2015).
  • iodine administered in the form of iodine compounds
  • iodine compounds remains the best compromise to increase the low-energy X-ray contrast between sufficiently heavy elements and easy-to-produce, non-toxic, easily removable chemicals.
  • iodinated contrast agents can be divided into four classes: 1) ionic monomers (the oldest, developed in the 1950s); 2) nonionic monomers, 3) ionic dimers; 4) non-ionic dimers (the most recent ones).
  • the basic structure of these iodinated contrast agents is a benzene ring, on which three iodine atoms are attached. Contrast agents are injected before and during treatment and accumulate mainly in tumors, more vascularized. Iodine diffuses easily into the intercellular space and there is a significant natural gradient of concentration between the pathological zone and the healthy zone. The concentration of iodine in healthy tissues remains low (see the aforementioned article by Bae).
  • double-strand breaks in DNA that are induced by irradiation will have limited or faulty repair due to the presence of iodides in the DNA by inhibition of DNA-PK and ATM kinases that regulate repair. and the signaling of DNA damage. It is also known that the question of tissue sensitivity to ionizing radiation is inseparable from that of DNA damage repair mechanisms. Indeed, at the cellular level, ionizing radiation can break certain types of chemical bonds by generating free radicals (in particular by peroxidation) and other reactive species that cause DNA damage.
  • Damage to DNA by endogenous or exogenous aggressions can lead to different types of DNA damage depending in particular on the deposited energy: base damage, single-strand breaks and double-strand breaks (DSBs).
  • Unrepaired CBD is associated with cell death, toxicity and more specifically radiosensitivity.
  • Badly repaired CBD is associated with genomic instability, mutagenicity, and susceptibility to cancer.
  • the body has specific repair systems for each type of DNA damage.
  • mammals have two main modes of repair: repair by suture (ligation of strands) and repair by recombination (insertion of a homologous or non-homologous strand).
  • Bodgi et al. have proposed a formula that can model the kinetics of recognition and repair of CDB in DNA (Bodgi et al, "A single formula to describe radiation-induced protein relocalization: towards a mathematical definition of individual radiosensitivity", J Theor Biol , vol.333, p135-145 (2013)):
  • Dthérap ' ⁇ the irradiation dose b rec: inverse time at which 50% of CBD are recognized min "1 boundary representation: inverse time at which 50% of recognized CBD are repaired min" 1 t 0: average gap between CBD recognition and repair.
  • radiosensitivity generally results from a genetic predisposition: it is therefore specific to an individual.
  • any excess dose increases both the risk of radiosensitivity tissue reaction and the risk of radiation-induced cancer.
  • radiation-induced tissue reactions burns
  • the present invention aims at providing a novel predictive method of individual tissue and clinical radiosensitivity following radiodiagnostic examination involving iodinated contrast agents.
  • the inventors have furthermore found, and this is the second starting point of the present invention, that the double-strand breaks (DSBs) of the DNA are the most radioinduced radiation-induced damage of radiosensitivity when they are unrepaired. on the one hand, and genomic instability when they are poorly repaired on the other.
  • the inventors have discovered that the CBDs are supported by the majority mode of suture repair, and / or by the minority mode of faulty repair, referred to as MRE1 1-dependent recombination. The balance between these two modes of repair is controlled by the ATM protein.
  • the pH2AX marker indicates a CBD site recognized by the suture repair mode.
  • the marker MRE1 1 indicates a CBD site that was supported by the MRE1 1 -dependent fault repair.
  • the pATM marker provides information on activation of the histone H2AX phosphorylation suture pathway and inhibition of the 1 - dependent MRE1 pathway.
  • the inventors have also observed a transfer of the cytoplasmic forms of the ATM protein into the cell nucleus following an oxidative-type stress, and in particular following a stress linked to an ionizing radiation inducing CBD.
  • iodinated contrast media especially sodium iodide.
  • radiolysis products of the iodinated contrast media or an iodide of an alkaline element preferably sodium iodide
  • step (4) forms a first object of the present invention.
  • the two embodiments of step (4) are equivalent but are not used for the same predictive purpose.
  • radiolysis products of iodinated contrast media is adapted to the equipment available to the radiotherapist, ie a high energy gamma irradiator for radiotherapy.
  • the radiotherapist is made to perform imaging by scanning to better situate the tumor before, during and after radiotherapy.
  • An X-ray dose D scan equivalent to a CT medical imaging session is used. This dose D scan is advantageously between 5 mGy and 50 mGy, and preferably between 10 mGy and 40 mGy depending on the organs to be imaged.
  • the embodiment called "radiation therapist" of the method according to the invention consists in measuring the number of unrepaired CDB after a dose D th mmo equivalent to a radiation therapy session, in the presence of sodium iodide, the final product of radiolysis iodinated contrast media.
  • the dose D th mmo is typically between 0.5 Gy and 4 Gy, preferably between 1 Gy and 3 Gy, and more preferably between 1, 7 Gy and 2.3 Gy.
  • the use of an iodide of an alkaline element is adapted to the equipment available to the radiologist, that is to say a low energy X-ray scanner.
  • the so-called "radiologist" embodiment of the method according to the invention consists in measuring the number of unrepaired CBDs after 20 mGy (dose equivalent to a scanner imaging session) in the presence or absence of iodinated contrast medium. .
  • Another object of the invention is a method of evaluating the additional DNA-breaking effect of an iodinated contrast agent injected into an individual as part of a medical imaging examination using X-rays, on a tissue taken from said individual, in which process:
  • test medium comprising said iodinated contrast agent and / or iodide ions
  • D scan represents the X-ray dose used for a medical imaging examination
  • Dthera represents the dose of ionizing radiation administered during a radiation therapy session that follows a medical imaging examination using X-rays;
  • the number of double-strand breaks of the DNA, and / or a biomarker representing this number, and / or the number of micronuclei are determined on the cell sample at the end of step (d).
  • These X-rays are typically generated with a tungsten anode.
  • step (d) The said cell sample is subjected after step (d) to contact with a medium to be tested (which advantageously comprises iodide ions, but no agent of iodinated contrast) at a given dose of gamma rays mmo D th (D héra t being preferably between 0.5 Gy and 4 Gy, more preferably between 1 Gy and 3 Gy, still more preferably between 1, 2 and 7 Gy , 3 Gy, and typically 2 Gy); and then ( ⁇ ) The number of double-strand breaks of the DNA is detected on the cell sample, and / or a biomarker representing this number, and / or the number of micronuclei.
  • a medium to be tested which advantageously comprises iodide ions, but no agent of iodinated contrast
  • the determinations in step (a) and / or step ( ⁇ ) can be made at additional observation times t1 and / or t2 and / or t3, given that
  • t4 is advantageously chosen between 6 times t3 and 8 times t3, but must be at least 12 hours, and preferably between 12h and 48h, and still more preferably about 24 hours;
  • t3 is a fixed value which represents the time after which about 25% of the double-strand breaks (DSBs) are repaired in control cells from radiation-resistant patients, and which is advantageously chosen between 3 times t2 and 5 times t2, but must in this case be at least 2.5 hours and at most 6 hours, and is preferably between 3 hours and 5 hours, and is even more preferably about 4 hours;
  • t2 is a fixed value which represents the time after which approximately 50% of the CBDs are repaired in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 5 times t1 and 7 times t1, but which must in this case be less than 35 minutes and not more than 90 minutes, and is preferably between 45 minutes and 75 minutes, and is even more preferably about 60 minutes;
  • t1 is a fixed value which represents the time after which the number of recognized CBDs reaches its maximum in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 5 minutes and
  • 15 minutes after stopping the irradiation preferably between 7.5 minutes and 12.5 minutes, and even more preferably at about 10 minutes.
  • t1 is between 8 minutes and 12 minutes
  • t2 is between 50 minutes and 70 minutes
  • t3 is between 3.5 hours and 4.5 hours
  • t4 is between 22 hours and 26 hours
  • t1 is 10 minutes
  • t2 is 60 minutes
  • t3 is 4 hours
  • t4 is 24 hours; preferably, D t hera is 2 Gy.
  • said test medium comprises iodine ions.
  • iodine ions in this case: - SI N
  • the risk is considered to be moderate: the cell sample is called "Group II",
  • P H2AX is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • NipATM is the number of pATM foci obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • NIMN is the average number of micronuclei observed per 100 cells with irradiation in the presence of iodine ions.
  • said test medium comprises an iodinated contrast agent. In that case :
  • P H2AX is the number of pH2AX foci obtained with irradiation in the presence of an iodinated contrast agent
  • N P H2AX is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation without iodinated contrast agent.
  • the additional effect of breaking the DNA of iodide ions is determined, said method being characterized in that:
  • test medium comprises iodine ions (preferably a solution containing 10 ⁇ of sodium iodide) but no iodinated contrast agent,
  • the additional dose is determined solely on the basis of the number of pH2AX foci at time t4, and preferably using the following formula:
  • N i P H2Ax is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • N P H2Ax is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation without iodine ions.
  • test medium comprises iodine ions (preferably a solution containing 10 ⁇ of sodium iodide) but no iodinated contrast agent,
  • the additional dose is determined on the basis of the number of pH2AX foci obtained in a condition without irradiation (0 Gy) and also at times t1, t2, t3 and t4, and preferably according to the following method:
  • the numbers of pH2AX foci obtained in a condition without irradiation (0 Gy) and also at times t- ⁇ , t 2, t 3 and t 4 for the sample of irradiated cells without iodinated contrast medium are determined.
  • the number of foci pH2AX can be used only at time t4, and preferably using the following formula:
  • Ni P H2Ax is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of an iodinated contrast agent
  • N P H2AX is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation without iodinated contrast agent.
  • iodine per ml of contrast medium iodine, and preferably between 10 and 20 mg, but these values are not limiting.
  • a first embodiment of the invention is a method for predicting cellular radiosensitivity of a cell sample to ionizing radiation associated with the presence of contrast media containing iodine atoms, said cell sample having been obtained from cells taken from a patient in a non-irradiated or poorly irradiated zone, in which process:
  • the iodide can be added in the form of an iodide of an alkaline element, preferably Nal;
  • t4 is a fixed value which represents the time for which the rate of DNA breaks reaches its residual value, and which is advantageously chosen between 6 times t3 and 8 times t3, but in this case must be at least 12 hours, and preferably between 12h and 48h, and which is even more preferably about 24 hours;
  • t3 is a fixed value which represents the time after which approximately 25% of the CBDs are repaired in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 3 times t2 and 5 times t2, but in this case must be at least 2.5 hours and not more than 6 hours, and is preferably between 3 hours and 5 hours, and still more preferably about 4 hours;
  • t2 is a fixed value which represents the time after which approximately 50% of the CBDs are repaired in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 5 times t1 and 7 times t1, but which must in this case be less than 35 minutes and not more than 90 minutes, and is preferably between 45 minutes and 75 minutes, and even more preferably about 60 minutes;
  • t1 is a fixed value which represents the time after which the number of recognized CBDs reaches its maximum in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 5 minutes and
  • 15 minutes after stopping the irradiation preferably between 7.5 minutes and 12.5 minutes, and even more preferably at about 10 minutes.
  • P H2AX is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • NipATM is the number of pATM foci obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • N iMN is the average number of micronuclei observed per 100 cells with irradiation in the presence of iodine ions.
  • the mathematical determination of the "excess dose" associated with irradiation with a dose D in the presence of iodine can be done according to two methods, depending on the number of available information: if it is available only time t4 then method 1 will be applied, if all the times are available (t1, t2, t3, t4) it is method 2 that will be applied.
  • an iodide solution of an alkali metal preferably a solution containing 10 ⁇ l of sodium iodide, is used.
  • P H 2 AX is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • N PH2A x is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation without iodine ions.
  • Method 2 using the number of pH2AX foci in a condition without irradiation (0 Gy) and also at times t1, t2, t3 and t4
  • the second method to deduce the excess dose caused by the presence of iodinated contrast media will be in two steps:
  • Step 1
  • a second embodiment of the invention is a method for predicting cellular radiosensitivity of a cell sample to ionizing radiation associated with the presence of contrast media containing iodine atoms, said cell sample having been obtained from cells taken from a patient in a non-irradiated or poorly irradiated zone, in which process: (i) said collected cells are isolated and / or amplified, these isolated and / or amplified cells constituting the "cell sample"; (ii) determining on said cell sample the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker at observation times t and at a radiation dose D (this average number being called N H2Ax (t, D)), obtained in a condition without irradiation (0 Gy) and also at observation times t4 after irradiation,
  • P H2AX is the number of pH2AX foci obtained with irradiation in the presence of an iodinated contrast agent
  • N P H2Ax is the number of pH2AX foci obtained with irradiation without iodinated contrast agent.
  • the mathematical determination of the "excess dose" associated with irradiation with a dose D in the presence of iodine can be determined according to the following method:
  • P H 2 AX is the number of pH2AX foci obtained with irradiation in the presence of an iodinated contrast agent
  • N PH2A x is the number of pH2AX foci obtained with irradiation without iodinated contrast agent.
  • radioinduced damage all refer to ionizing radiation, particularly to particle-type radiation, such as alpha-type particles.
  • particle-type radiation such as alpha-type particles.
  • ⁇ beta
  • high energy electromagnetic radiation especially gamma ( ⁇ ) or X.
  • ATM cyto-nuclear transit describes the translocation of the ATM protein from the cytoplasm to the nucleus, especially after irradiation.
  • the "DNA effect" of a contrast agent injected into an individual as part of a medical imaging examination using X-rays on a cell sample from a tissue sample is called an "iodine effect". on said individual. This iodine effect is in addition to the DNA-breaking effect of the ionizing radiation administered during said medical imaging examination.
  • the operator takes the patient a cell sample.
  • a cell sample Preferably he biopsy samples a skin sample; this sampling can be advantageously done according to a method known as the "dermatological punch".
  • the cell sample is placed in DMEM medium + 20% sterile fetal calf serum.
  • the sample is transferred without delay to a specialized laboratory, knowing that the sample should not remain more than 38 hours at room temperature.
  • control cells from radioresistant patients were selected as cells exhibiting an in vitro clonogenic survival rate of greater than 55% after irradiation with an absorbed dose of 2 Gy.
  • control cells from radio-resistant patients were selected as cells taken from patients who did not show significant tissue reactions during or following a CT scan or radiotherapeutic treatment.
  • the method according to the invention uses at least one sample of healthy tissue, preferably fibroblasts. These are preferably taken from the connective tissue of the patient. This sampling can be done by biopsy.
  • said cells are fibroblastic cells derived from a skin biopsy of a patient (typically taken by a method known as "dermatological punch").
  • the tissue sample is grown in a suitable culture medium.
  • the next step is the isolation and / or amplification of the sampled tissue.
  • the cell sample typically the biopsy
  • the cell sample is established as an amplifiable cell line without a viral or chemical transformation agent following an ancillary procedure and well known to culture laboratories, such as the underlines the publication of EIkin M. et al. "The radiobiology of cultured mammalian cells", Gordon and Breach (1967).
  • the first experiments are carried out using the method according to the invention.
  • the cells are seeded on glass slides in petri dishes.
  • the cells are placed in the presence of iodine ions, preferably in the proportion of 5 to 25 mg of iodine per ml of contrast media (and preferably in the proportion of 10 to 20 mg, and even more preferably of approximately 15 mg).
  • contrast media being, for example: lomeron TM, Xenetix TM or Ultravist TM), or preferably 2 to 20 ⁇ iodide (preferably at a rate of 5 to 15 ⁇ , and even more preferably about 10 ⁇ ), this embodiment being called the "radiotherapist" embodiment), knowing that the iodide can be added in the form of an iodide of an alkaline element, preferably Nal.
  • Said ionizing radiation is defined by its absorbed dose (parameter called D therapy and Ds can expressed in Gray).
  • the absorbed D scan dose is between 0.01 Gy and 1 Gy, preferably between 0.01 Gy and 0.05 Gy, and is even more preferably 0.02 Gy.
  • absorbed dose D th mmo is between 0.5 Gy and 4 Gy, preferably between 1, 7 Gy and 2.3 Gy, and still more preferably 2 Gy.
  • characteristics corresponding to the radio-induced state are acquired after several repair times (post-irradiation repair time).
  • at least two and even more preferably at least three points are preferably acquired, namely: t1, t2, t3 and t4. Said characteristics are represented by the foci corresponding to the pH2AX and pATM marker.
  • a point at t4 is acquired for the pH2AX marker.
  • the cells on glass slides are then fixed, lysed and hybridized.
  • the results are acquired from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model, for example).
  • the reading can be direct (typically by counting the foci on at least 50 cells in G 0 / Gi for each point) or by dedicated image analysis software, or on an automated microscope; preferably the software or automated microscope methods are calibrated with manual determinations.
  • the invention is based inter alia on the use of data acquired for at least two pH2AX, pATM markers on non-irradiated cells (spontaneous state) and irradiated (radioinduced state).
  • the method is based on the kinetic study of the labeling by this marker as a function of the duration of the repair: the samples are marked after a determined lapse of time from the end of the irradiation, and their immunofluorescence is studied. It is possible to measure the complete kinetic curves, for example represented by 4 points advantageously located at t1 (preferably 10 minutes), t2 (preferably 1 h), t3 (preferably 4h) and t4 (preferably 24h), and before irradiation (spontaneous state).
  • pH2AX denotes the phosphorylated forms in serine 439 of the histone H2AX X variant which marks, according to the findings of the applicant, the number of double-strand breaks in the DNA (CDB) which are recognized by the method of Majority and faithful repair, the suture.
  • the pH2AX marker is essentially nuclear in the form of only nuclear foci and only the number and size of the foci will be analyzed.
  • pATM refers to the phosphorylated forms in 1981 serine of the ATM protein kinase. According to the findings of the applicant, ATM passes cytoplasm to the nucleus after irradiation under normal conditions (radio-resistant status). The pATM forms are mainly concentrated in the cytoplasm and then mark CBD sites.
  • the pATM marker is distinguished by a location that can be homogeneous cytoplasmic (no cytoplasmic foci) without nuclear foci, only nuclear in the form of nuclear foci (no homogeneous nuclear localization), or cytoplasmic and nuclear foci. Counterpoloration with DAPI (a DNA marker known to those skilled in the art) makes it possible to locate the nucleus to locate the cytoplasmic or nuclear localization (this distribution being modified pATM under the influence of ionizing radiation)
  • N P H2Ax (t), NpATM (t) the average numbers of nuclear foci obtained with the markers pH2AX, pATM, obtained in a condition without irradiation (0 Gy) and also at the observation times t1, t2, t3, t4 after irradiation (absorbed dose: 2 Gy or 20 mGy), knowing that the determination of the parameter N pH 2Ax (t) is obligatory within the framework of the method according to the invention, whereas that of the other parameters N pA TM (t) is optional but advantageous;
  • GROUP The classification of the patient in a group I, II or III (criterion called GROUP):
  • P H2AX is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • NipATM is the number of pATM foci obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • NIMN is the average number of micronuclei observed per 100 cells with irradiation in the presence of iodine ions.
  • Ni P H2Ax is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of an iodinated contrast agent
  • N P H2AX is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation without iodinated contrast agent.
  • P H 2 AX is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of iodine ions
  • N PH2A x is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation without iodine ions.
  • Method 2 using the number of pH2AX foci obtained in a condition without irradiation (0 Gy) and also at times t1, t2, t3 and t4
  • the second method to deduce the excess dose caused by the presence of iodinated contrast media will be in two steps:
  • Step 1
  • the numbers of pH2AX foci obtained in a condition without irradiation (0 Gy) and also at times t 1, t 2, t 3 and t 4 for the sample of irradiated cells without the iodinated contrast media will be adjusted by the Bodgi formula. (Bodgi et al., JTB 2013) and thanks to this adjustment, the parameters b rec , b rep and to will be determined.
  • the parameters b rec , b rep and t 0 are numbers or decimal or integer numbers.
  • the parameters b rec , b rep are preferably decimal numbers or numbers rounded to two significant digits after the decimal point, preferably three significant digits after the decimal point. This rounding corresponds to the arithmetic rounding of the value obtained by calculation.
  • the parameters b rec and b rep are preferably between 0.001 and 5 min -1
  • the parameter t 0 is preferably between 0 minutes and 120 minutes.
  • This formula will make it possible to determine the parameter D- ⁇ , which is the equivalent dose of the irradiation with the iodinated contrast product.
  • D- ⁇ is the equivalent dose of the irradiation with the iodinated contrast product.
  • the use of this formula according to the invention for the determination of D- ⁇ leads to obtaining a digit or a decimal or integer number.
  • P H 2 AX is the number of pH2AX foci obtained with irradiation in the presence of an iodinated contrast agent
  • N PH2A x is the number of pH2AX foci obtained with irradiation without iodinated contrast agent.
  • the use of this formula according to the invention for determining the additional dose equivalent leads to obtaining a digit or a decimal or integer number.
  • the value of D sup obtained is a digit or a decimal number corresponding to the arithmetic rounding to two significant digits after the decimal point of the value obtained by calculation.
  • HMEC control vascular endothelial cells were amplified according to the supplier's recommendations (Thermo Fisher Scientific) until the desired number of cells was obtained. After obtaining a sufficient number of cells (generally after one to three weeks), the first experiments were carried out using the method according to the invention. The cells were seeded on glass slides in Petri dishes. Part of these lamellae was then brought into contact with the test medium comprising an iodinated contrast agent and / or iodide ions at a given concentration as shown in Table 2 below. Another part of these lamellae has not been brought into contact with this test medium comprising an iodinated contrast agent and / or iodide ions.
  • the concentrations of the test media comprising an iodinated contrast agent and / or iodide ions are expressed as mg of iodinated compound per ml.
  • a solution of Ultravist TM 10 mg / ml contains 10 mg of Iopromide (CAS #: 73334- 07-3) per milliliter.
  • the irradiation was carried out with a medical accelerator which delivers 6 MV photons with an absorbed dose rate of 3 Gy min -1
  • a medical accelerator which delivers 6 MV photons with an absorbed dose rate of 3 Gy min -1
  • the cells were stored in the culture incubator at 37 ° C.
  • the irradiated samples were labeled 24 hours after stopping irradiation (t4), and the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker was acquired at this post-irradiation repair time (24h).
  • the irradiated cells were then fixed, lysed and hybridized on glass coverslips.
  • HEPES buffer solution 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid
  • the coverslips were then washed in phosphate buffered saline (known as PBS) prior to immunostaining. Incubation was carried out for 40 min at 37 ° C in PBS supplemented with 2% bovine serum albumin (known as BSA or fraction V, supplied by Sigma Aldrich) and was followed by PBS washing. .
  • BSA or fraction V bovine serum albumin
  • the primary anti-pH2AX antibodies were used at a concentration of 1: 800, the other primary antibodies at 1: 100.
  • Incubations with FITC anti-mouse or anti-rabbit TRITC secondary antibodies (1: 100, provided by Sigma Aldrich) were performed at 37 ° C in 2% BSA for 20 minutes.
  • Ni P H2Ax is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation in the presence of an iodinated contrast agent and / or iodide ions
  • N P H2Ax is the number of foci of pH2AX obtained with irradiation without iodinated contrast agent or without iodide ions
  • D corresponds to a determined absorbed dose of ionizing radiation D sca n or D th era expressed in Gray.

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Abstract

Procédé d'évaluation de l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste iodé injecté à un individu dans le cadre d'un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X, sur un tissu prélevé sur ledit individu, dans lequel procédé : on approvisionne des cellules d'un tissu à évaluer qui a été prélevé (de préférence par biopsie) sur un individu; on disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire; on met en contact ledit échantillon cellulaire avec un milieu à tester, ledit milieu à tester comprenant ledit agent de contraste iodé et/ou des ions d'iodure; on soumet ledit échantillon cellulaire en contact avec ledit milieu à tester à une dose absorbée Dtherap ou Dscan déterminée de rayonnement ionisant, sachant que : Dscan représente la dose de rayons X utilisée pour un examen d'imagerie médicale, Dtherap représente la dose de rayonnement ionisant administrée lors d'une séance de radiothérapie qui suit un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X; on détermine sur l'échantillon cellulaire le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux.

Description

Méthode prédictive et d'évaluation de l'excès de dose dû aux produits de contraste iodés injectés pendant les examens de radiodiagnostic
Domaine technique de l'invention
L'invention concerne le domaine de la radiobiologie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiobiologiques. L'invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire et clinique dans le cadre du radiodiagnostic impliquant des produits de contraste iodés et qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques. L'invention concerne également une nouvelle méthode d'évaluation de l'effet combiné de l'injection d'un produit de contraste iodé et du rayonnement X administrés lors d'un examen de radiodiagnostic.
Etat de la technique
Le radiodiagnostic représente pour l'homme la plus grande cause d'exposition aux radiations ionisantes et constitue l'une des plus grand source de risques de cancer radio- induit (selon un rapport "Biological Effects of low radiation doses", Vol. I, Annex G publié en 2000 par l'UNSCEAR (United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation)). Généralement consistant en une exposition à une dose faible de rayons X allant de 2 à 40 mSv pour les mammographies, les scanners ou l'angiographie et de l'ordre du μ5ν pour la radiologie, les examens de radiodiagnostic nécessitent parfois une augmentation du contraste afin de mieux visualiser l'organe à étudier (Perez, Devic et al. 2015). Depuis les années 20, l'iode (administré sous la forme de composés iodés) reste le meilleur compromis pour augmenter le contraste à faibles énergies de rayons X entre les éléments suffisamment lourds et les produits chimiques aisés à produire, non toxiques et faciles à éliminer (voir Bae, « Intraveneous contrasts médium administration and scan timing at CT : considérations and approaches », Radiology 256(1 ), p.32-61 (2010)).
Les agents de contraste iodés actuellement disponibles peuvent être divisés en quatre classes : 1 ) les monomères ioniques (les plus anciens, développés dans les années 1950) ; 2) les monomères non-ioniques, 3) les dimères ioniques ; 4) les dimères non-ioniques (les plus récents). La structure de base de ces agents de contraste iodés est un cycle benzénique, sur lequel sont fixés trois atomes d'iode. Les agents de contraste sont injectés avant et pendant le traitement et s'accumulent principalement dans les tumeurs, plus vascularisées. L'iode diffuse facilement dans l'espace intercellulaire et on observe un gradient naturel important de concentration entre la zone pathologique et la zone saine. La concentration d'iode dans les tissus sains reste faible (voir l'article précité de Bae). Ce gradient de concentration se traduit par un gradient dans les sections efficaces d'absorption. Le fait d'irradier avec des rayons X de radiodiagnostic (120-140 kV) d'énergie moyenne de l'ordre de 65 keV, implique un renforcement du dépôt de dose de radiation ionisante par effet photoélectrique à proximité des atomes d'iode de l'agent de contraste.
Dès les années 1970, Norman et coll. (« Cytogenetic effects of contrast média and triiodobenzoic derivatives in human lymphocytes », Radiology 129(1 ), p.19-203 (1978)) observèrent des cassures et des aberrations chromosomiques dans des lymphocytes circulants de patients soumis à des scanners après injection de produits de contraste iodés. De telles observations se multiplièrent sans véritable explication mécanistique.
En 2005, Joubert et al. ont montré que l'irradiation par scanner émet un maximum d'énergie entrez 50 et 60 keV qui correspond au maximum d'absorption d'énergie de l'iode dans l'eau (« Irradiation in présence of iodinated contrast agent results in radiozensitization of endothelial cells : Conséquences for coputed tomography therapy », Int J Radiation Oncology Biol Phys 62(5), p.1486-1496 (2005)). Cette publication montre qu'une telle énergie provoque la radiolyse des produits de contraste iodés qui aboutit à la production d'ions qui se transforment en iodure de sodium ou de potassium. De telles molécules, au contraire des molécules de produits de contraste iodés, peuvent rentrer dans les cellules et se fixer à l'ADN. A ce stade, les cassures double-brin de l'ADN qui sont induites par l'irradiation auront une réparation limitée ou fautive du fait de la présence de iodures dans l'ADN par inhibition des kinases DNA-PK et ATM qui régulent la réparation et la signalisation des dommages de l'ADN. On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue).
En 2013, Bodgi et al. ont proposé une formule qui permet de modéliser la cinétique de reconnaissance et de réparation des CDB de l'ADN (Bodgi et al, « A single formula to describe radiation-induced protein relocalization: towards a mathematical définition of individual radiosensitivity », J Theor Biol, vol.333, p135-145 (2013)) :
1 1
NpH2Axtt, D) - IDthérap(l - 1 + x + h^{t _ ¾))
Avec :
I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X
Dthérap '■ la dose d'irradiation brec : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues en min"1 brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées en min"1 t0 : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB.
On sait que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise (« Inhérent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621 - 629 (1981 ) ; « Intrincsic radiosensitivity of human cell Unes is correlated with radioresponsiveness of human tumors : Analysis of 101 published survival curves », Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 1 1 , p.1699-1707 (1985)). Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. Ce qui est vrai pour la radiosensibilité l'est également pour la prédisposition au cancer, et plus particulièrement au cancer radioinduit. Ainsi, tout excès de dose augmente à la fois le risque de réaction tissulaire de radiosensibilité et le risque de cancer radioinduit. Toutefois, aux faibles doses utilisées en radiodiagnostic, les réactions tissulaires (brûlures) radioinduites ne sont pas observées : seul l'excès de risque de cancer du au surdosage est à envisager. Il serait donc désirable de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer le risque et l'excès de dose dû à la radiolyse du produit de contraste iodé provoquée par l'exposition radiodiagnostique.
Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate que les brevets décrits ci-dessus ne décrivent pas une méthode de quantification de l'excès de dose et de risque lié à l'utilisation de produits de contraste iodés en examen radiodiagnostique. Le problème de fournir une méthode prédictive de la radiosensibilité individuelle reste donc sans solution opérationnelle. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité tissulaire et clinique individuelle à la suite d'un examen radiodiagnostique impliquant des produits de contraste iodés.
Objets de l'invention
Les inventeurs ont constaté, et c'est le premier point de départ de la présente invention, que les raies d'émission du spectre des rayons X produit par un tube standard des appareils de radiodiagnostic, qui correspondent aux raies K du tungstène (raie KQ à 59,3 keV, raie Kp à 67,23 keV) composant l'anode des tubes, et qui se superposent au spectre polychromatique continu (s'étalant, selon la tension d'accélération, d'environ 20 keV jusqu'à typiquement environ 80, 100 ou 120 keV), sont très proches du maximum d'absorption de l'énergie des atomes d'iode dans l'eau (rapport maximal entre les coefficients relatifs d'absorption d'énergie massiques d'iode et de l'eau) se situant entre 40 et 60 keV, sachant que le seuil d'absorption K des atomes d'iode se situe à environ 33,2 keV : à cette énergie l'effet photoélectrique est prédominant. Ces constatations sont rassemblées dans le tableau 1 ci-dessous.
On doit donc s'attendre à ce qu'avec une anode en tungstène l'effet radiolytique du rayonnement X sur un agent de contraste iodé est maximal. Les inventeurs ont constaté que la radiolyse d'un agent de contraste iodé au cours d'un examen radiodiagnostique conduit à la libération d'iode, ce iode libre ayant un effet cassant l'ADN qui s'ajoute à l'effet cassant l'ADN de la dose de rayonnement X de l'examen radiodiagnostique qui provoque ladite radiolyse. Cet effet supplémentaire cassant l'ADN lié à la radiolyse de l'agent de contraste iodé est appelé ici « l'excès de dose biologique » ou « surplus de dose biologique ».
Les doses à ne pas dépasser pour le grand public, soumis à des examens radiographiques et radioscopiques, sont identiques à ceux des travailleurs exposés : l'exposition est limitée à 50 mSv chez l'enfant et 100 mSv chez l'adulte. Or, on suspecte que le cumul des doses lié à la répétition de tels examens serait susceptible d'induire un véritable excès de cancers, même si des données épidémiologiques précises ne semblent pas exister. La mesure d'un éventuel excès de dose lié à l'iode est donc d'intérêt car elle permettrait de mieux connaître, pour chaque individu et pour des conditions d'irradiation données, la dose et les seuils cumulatifs à ne pas dépasser.
Les inventeurs ont par ailleurs constaté, et c'est le deuxième point de départ de la présente invention, que les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont les dommages radioinduits les plus prédictifs de la radiosensibilité quand ils sont non-réparés d'une part, et de l'instabilité génomique quand ils sont mal réparés d'autre part. Les inventeurs ont découvert que les CDB sont prises en charge par le mode majoritaire de réparation dit de suture, et/ou par le mode minoritaire de réparation fautive dit recombinaison MRE1 1 - dépendante. L'équilibre entre ces deux modes de réparation est contrôlé par la protéine ATM. Le marqueur pH2AX indique un site CDB reconnu par le mode de réparation par suture. Le marqueur MRE1 1 indique un site de CDB qui a été pris en charge par la réparation fautive MRE1 1 -dépendante. Le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de l'histone H2AX et l'inhibition de la voie MRE1 1 - dépendante.
Les inventeurs ont par ailleurs observé un transfert des formes cytoplasmiques de la protéine ATM dans le noyau cellulaire à la suite d'un stress de type oxydatif, et notamment à la suite d'un stress lié à un rayonnement ionisant induisant des CDB.
Enfin, les inventeurs ont montré que ce sont les produits de radiolyse spécifiques du produit de contraste iodé qui sont responsables de l'excès de CDB non réparés après une examen radiodiagnostique : c'est notamment le cas des iodures de sodium.
Pour constater l'endommagement d'un ADN par une agression exogène dus aux produits de radiolyse spécifiques du produit de contraste iodé, il faut tenir compte :
d'une part, de l'état spontané de l'ADN,
d'autre part, de son état radioinduit,
- enfin de son état radioinduit après l'action des produits de radiolyse des
produits de contraste iodés notamment de l'iodure de sodium.
Par ailleurs, après irradiation, il faut tenir compte de la réparation de l'ADN, dont la cinétique dépend du mécanisme de réparation et donc du type d'endommagement radioinduit. On sait par ailleurs que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une radiosensibilité exceptionnelle. L'effet des produits de radiolyse des produits de contraste iodés s'ajoute aux effets radioinduits.
Selon l'invention le problème est résolu par une méthode dans laquelle
(1 ) on procède à une amplification de cellules non transformées issues d'un échantillon cellulaire, notamment de cellules issues de biopsies de peau ;
(2) on établit un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines quiescentes;
(3) on procède à des tests fonctionnels de la reconnaissance, de la réparation et de la signalisation des CDB ;
(4) on applique soit des produits de radiolyse des produits de contraste iodés, soit un iodure d'un élément alcalin (de préférence iodure de sodium).
Cette méthode forme un premier objet de la présente invention. Les deux modes de réalisation de l'étape (4) sont équivalents mais ne sont pas utilisés dans le même but prédictif.
L'utilisation des produits de radiolyse des produits de contraste iodés est adaptée au matériel dont dispose le radiothérapeute, c'est-à-dire un irradiateur gamma à hautes énergies pour la radiothérapie. Le radiothérapeute est amené à réaliser des imageries par scanners pour mieux situer la tumeur avant, pendant et après la radiothérapie. On utilise une dose Dscan de rayonnement X équivalente à une session d'imagerie médicale sur scanner. Cette dose Dscan est avantageusement comprise entre 5 mGy et 50 mGy, et de préférence entre 10 mGy et 40 mGy suivant les organes à imager.
Le mode de réalisation dit « du radiothérapeute » de la méthode selon l'invention consiste à mesurer le nombre de CDB non réparées après une dose Dthéra équivalente à une session de radiothérapie, en présence d'iodure de sodium, produit final de radiolyse des produits de contraste iodés. La dose Dthéra est typiquement comprise entre 0,5 Gy et 4 Gy, de préférence entre 1 Gy et 3 Gy, et plus préférentiellement entre 1 ,7 Gy et 2,3 Gy.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, on standardise les paramètres Dscan et selon le mode de réalisation dit du radiologue (Dscan) ou du radiothérapeute (Dthérap) (et de préférence les deux à la fois) à une valeur fixe afin de générer des données comparables pour différents tissus et patients ; ces valeurs standardisées sont : Dthérap = 2 Gy et/ou Dscan = 20 mGy. L'utilisation d'un iodure d'un élément alcalin est adaptée au matériel dont dispose le radiologue, c'est-à-dire un scanner X de faibles énergies.
Le mode de réalisation dit « du radiologue » de la méthode selon l'invention consiste à mesurer le nombre de CDB non réparées après 20 mGy (dose équivalente à une séance d'imagerie par scanner) en présence ou en absence de produit de contraste iodé.
Pour l'imagerie par scanner aux rayons X on utilise en règle générale des tubes générant des rayons X avec une anode en tungstène. Un autre objet de l'invention est un procédé d'évaluation de l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste iodé injecté à un individu dans le cadre d'un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X, sur un tissu prélevé sur ledit individu, dans lequel procédé :
(a) On approvisionne des cellules d'un tissu à évaluer qui a été prélevé (de préférence par biopsie) sur un individu ;
(b) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ;
(c) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec un milieu à tester, ledit milieu à tester comprenant ledit agent de contraste iodé et/ou des ions d'iodure ;
(d) On soumet ledit échantillon cellulaire en contact avec ledit milieu à tester à une dose absorbée Dthera OU Dscan déterminée de rayonnement ionisant, sachant que :
Dscan représente la dose de rayons X utilisée pour un examen d'imagerie médicale,
Dthera représente la dose de rayonnement ionisant administrée lors d'une séance de radiothérapie qui suit un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X ; (e) On détermine sur l'échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux.
Lesdits rayons X sont typiquement générés avec une anode en tungstène.
Dans un mode de réalisation de ce procédé : (a) On soumet ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) en contact avec un milieu à tester (qui comprend avantageusement des ions d'iodure, mais pas d'agent de contraste iodé) à une dose déterminée de rayons gamma Dthéra (Dthéra étant comprise de préférence entre 0,5 Gy et 4 Gy, plus préférentiellement entre 1 Gy et 3 Gy, encore plus préférentiellement entre 1 ,7 Gy et 2,3 Gy, et typiquement de 2 Gy) ; et puis (β) On détecte sur l'échantillon cellulaire le nombre de cassures double brin de l'ADN, et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux.
Dans un mode de réalisation de ce procédé : on détermine sur ledit échantillon cellulaire n'ayant pas encore été mis en contact avec le milieu à tester le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t) et NpATM(t)), obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi au temps t= t4 (où t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures) ; et puis
on détermine sur ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et pour la dose Dscan) (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t, Dscan)) et NpATM(t, DSCan)), ledit temps d'observation étant t = t4.
Avantageusement, on détermine sur ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (a) le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et pour la dose Dthéra (Gy) (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t, Dthérap)) et NpATM(t, Dthérap)), ledit temps d'observation étant t = t4. On peut effectuer les déterminations à l'étape (a) et/ou à l'étape (β) à des temps additionnels d'observations t1 et/ou t2 et/ou t3, sachant que
t4 est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ;
t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ;
t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1 , mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ;
t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et
15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes.
Par exemple, t1 est compris entre 8 minutes et 12 minutes, t2 est compris entre 50 minutes et 70 minutes, t3 est compris entre 3,5 heures et 4,5 heures, et t4 est compris entre 22 heures et 26 heures, ou encore t1 est 10 minutes, t2 est 60 minutes, t3 est 4 heures, t4 est 24 heures ; de préférence, Dthera est 2 Gy.
Dans un mode de réalisation, à l'étape (c) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode. Dans ce cas : - SI N|pH2Ax(t4, Dthérap) < 2 et N |pATM(t1 , Dthérap) > N |pATM(t2, Dthérap) et N|pATM(t1 , Dthérap) > 30, alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ;
- si (N|PH2Ax(t4, > 24), alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ;
- pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon cellulaire est dit « de Groupe II »,
où :
N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode,
- NipATM est le nombre de foci de pATM obtenu avec irradiation en présence d'ions iode,
NIMN est le nombre moyen de micronoyaux observés pour 100 cellules avec irradiation en présence d'ions iode.. Dans un autre mode de réalisation, à l'étape (c) ledit milieu à tester comprend un agent de contraste iodé. Dans ce cas :
- si N |PH2Ax(t4, Dscan) - NpH2Ax(t4, Dscan)) < 2 , alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ;
- si N|PH2Ax(t4, Dscan)) - NpH2Ax(t4, Dscan)) > 8 , alors on considère que l'échantillon
cellulaire est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; Pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon cellulaire est dit « de Groupe II »,
N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé,
NPH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé.
Dans un autre mode de réalisation (appelé ici « méthode du radiothérapeute ») du procédé selon l'invention on détermine l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'ions iodure, ledit procédé étant caractérisé en ce que :
(i) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode (de préférence une solution contenant 10 μΜ d'iodure de sodium) mais pas d'agent de contraste iodé,
(ii) on détermine la dose supplémentaire uniquement sur la base du nombre de foci pH2AX au temps t4, et de préférence en utilisant la formule suivante :
_ NipH2AX (t4, Dfftérap ) ~~ NpH2AX (t4, Dthérap )
'-'sup Z r . \ X ^thérap
^pH2Ax(,t4, L't/lérap ) ou :
N iPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode, NPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans ions iode.
Par ailleurs l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'ions iodure (dans la « méthode du radiothérapeute ») peut être déterminé aussi de la manière suivante :
(i) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode (de préférence une solution contenant 10 μΜ d'iodure de sodium) mais pas d'agent de contraste iodé,
(ii) on détermine la dose supplémentaire sur la base du nombre de foci pH2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1 , t2, t3 et t4, et de préférence selon la méthode suivante :
dans une première étape, on détermine les nombres de foci pH2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t-ι , t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées sans produit de contraste iodés,
dans une deuxième étape on calcule les paramètres brec, brep et t0 dans la formule ( \ -
NVH2AX t> Dthérap)— IDthérap (l— ^ ^ ^ t^l + Z? (t~~ ou
I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X, brec : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues [min"1], brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées [min"1], t0 : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB ; dans une troisième étape on détermine les nombres de foci pH2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps ti , t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées avec le produit de contraste iodé, dans une quatrième étape on calcule la dose équivalente D-ι de l'irradiation avec le produit de contraste iodé en utilisant les paramètres brec, brep et t0 déterminés à la deuxième étape, en utilisant la formule : v 1 + brect 1 + brep(t — ÎQ) dans une cinquième étape on détermine le surplus de dose dû au produit de contraste iodé Dsup selon la formule :
Dans un autre mode de réalisation (dans la méthode « du radiologue ») on peut utiliser le nombre de foci pH2AX uniquement au temps t4, et de préférence en utilisant la formule suivante :
_ NiPH2Ax(t4, Dscan )— NpH2Ax(t4, Dscan )
SUP ~ (t n ^ x scan
1 ρΗ2ΑΧ ^ uscan )
où :
NiPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé,
NPH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé. Dans le cadre de la présente invention on utilise typiquement entre 5 et 25 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé, et de préférence entre 10 et 20 mg, mais ces valeurs ne sont pas limitatives.
Nous donnons ici des précisions sur les deux principaux modes d'utilisation du procédé selon l'invention.
1 ) Le mode de réalisation dit « du radiothérapeute »
Un premier mode de réalisation de l'invention est un procédé pour prédire la radiosensibilité cellulaire d'un échantillon cellulaire envers un rayonnement ionisant associé à la présence de produits de contraste contenant des atomes d'iode, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient dans une zone non irradiée ou peu irradiée, dans lequel procédé :
(i) on isole et / ou amplifie lesdites cellules prélevées, ces cellules isolées et /ou amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ; (ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et à une dose de radiation D (ce nombre moyen étant appelé N H2Ax(t, D)) et NpATM(t, D)), obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi au temps d'observation t4 (et de préférence en plus les temps t1 , t2 et t3) après irradiation,
(iii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM à tous les temps d'observation t et à une dose de radiation D en présence (pendant l'irradiation) d'ions de iode,
de préférence à raison de 2 à 20 μΜ de iodure (de préférence à raison de 5 à 15 μΜ, et encore plus préférentiellement d'environ 10 μΜ), ce mode de réalisation étant appelé le mode de réalisation « du radiothérapeute »), sachant que le iodure peut être ajouté sous la forme d'un iodure d'un élément alcalin, de préférence Nal ;
lesdits nombres moyens de foci nucléaires étant appelé respectivement N| H2Ax(t,D),
où - t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être dans ce cas être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ;
t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et 10 est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ;
t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1 , mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ;
t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et
15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes.
Pour l'utilisation de la méthode avec des iodures d'un métal alcalin, on utilise avantageusement une solution contenant 10 μΜ d'iodure de sodium, et si :
(l) N|pH2Ax(t4, Dthérap ) < 2 et N|pATM(t1 , Dthérap ) > N|pATM(t2, Dthérap ) et N,pAT (t1 , Dthérap ) > 30, alors on considère que l'échantillon est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ; si
(ii) (N|PH2Ax(t4, ) > 8 ou N|MN(t4, Dthérap ) > 24), alors on considère que l'échantillon est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; et
(iii) pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon est dit « de Groupe II »,
où :
- N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode,
NipATM est le nombre de foci de pATM obtenu avec irradiation en présence d'ions iode, N iMN est le nombre moyen de micronoyaux observés pour 100 cellules avec irradiation en présence d'ions iode.
Dans ce mode de réalisation, la détermination mathématique du « surplus de dose » associé à une irradiation avec une dose D en présence d'iode peut se faire selon deux méthodes, selon le nombre d'informations disponibles : si l'on ne dispose que du temps t4 alors la méthode 1 sera appliquée, si l'on dispose de tous les temps (t1 ,t2,t3,t4) c'est la méthode 2 qui sera appliquée.
Avantageusement on utilise une solution d'iodure d'un métal alcalin, de préférence une solution contenant 10 μΜ d'iodure de sodium.
Méthode 1 : en utilisant uniquement le nombre de foci pH2AX au temps t4
On utilise la formule suivante :
_ NipH2AX (t4, Dfftérap ) ~~ NpH2AX (t4, Dthérap )
'-'sup Z r . \ X ^thérap
^pH2Ax(,t4, L't/lérap ) où :
N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode,
NPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans ions iode.
Méthode 2 : en utilisant le nombre de foci pH2AX dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1 , t2, t3 et t4
La deuxième méthode pour déduire le surplus de dose causé par la présence de produits de contraste iodés se fera en 2 étapes :
Etape 1 :
Les nombres de foci pH2AX obtenus (NpH2AX) dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t-ι, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées sans les produits de contraste iodés seront ajustés par la formule de Bodgi (Bodgi et al. (2013) cité ci- dessus) et grâce à cet ajustement, les paramètres brec, brep etto seront déterminés : ( λ _ _ί 1
N t> Dthérap) ~ IDthérap (l— -)( ~ ~ )
1 -|- -|- rep\ l
Avec :
I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X Dthérap '■ la dose d'irradiation brec : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues en min"1 brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées en min"1 t0 : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB. Etape 2 :
Les nombres de foci pH2AX obtenus (NPH2AX) dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps ti , t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées avec les produits de contraste iodés seront ajustés par la formule de Bodgi ((Bodgi et al. (2013) cité ci- dessus) en fixant les paramètres brec, brep et to déterminés à l'étape 1 : v 1 + brect 1 + brep(t —
Cette formule permet de déterminer le paramètre D-ι, qui est la dose équivalente de l'irradiation avec le produit de contraste iodé.
Le surplus de dose dû au produit de contraste iodé Dsu sera donc donné par la formule :
2) Le mode de réalisation dit « du radiologue »
Un deuxième mode de réalisation de l'invention est un procédé pour prédire la radiosensibilité cellulaire d'un échantillon cellulaire envers un rayonnement ionisant associé à la présence de produits de contraste contenant des atomes d'iode, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient dans une zone non irradiée ou peu irradiée, dans lequel procédé : (i) on isole et / ou amplifie lesdites cellules prélevées, ces cellules isolées et /ou amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ; (ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t et à une dose de radiation D (ce nombre moyen étant appelé N H2Ax(t, D)), obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps d'observation t4 après irradiation,
(iii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX à tous les temps d'observation t et à une dose de radiation D en présence (pendant l'irradiation) d'ions de iode ; de préférence à raison de 5 à 25 mg d'iode par ml de produits de contraste (et de préférence à raison de 10 à 20 mg, et encore plus préférentiellement d'environ 15 mg), ce mode de réalisation étant appelé le mode de réalisation « du radiologue », ces produits de contraste étant par exemple : Noméron™ comprenant comme principe actif Noméprol (n° CAS : 78649-41 -9), le Xenetix™ comprenant comme principe actif Nobitridol (n° CAS : 136949-58-1 ) ou l'Ultravist™ comprenant comme principe actif Nopromide (n° CAS : 73334-07-3)).
Pour l'utilisation de la méthode avec des produits de radiolyse des produits de contraste contenant des atomes d'iode on utilise avantageusement 15 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé, et si : (a) N|PH2Ax(t4, Dscan) - NpH2Ax(t4, Dscan) < 2 , alors on considère que l'échantillon est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ;
(b) N|PH2Ax(t4, Dscan) - NpH2Ax(t4, Dscan) > 8 , alors on considère que l'échantillon est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ;
(c) Pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon est dit « de Groupe II »,
où :
N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé,
NPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé.
Dans ce mode de réalisation de l'invention on détermine la détermination mathématique du « surplus de dose » associé à une irradiation avec une dose D en présence d'iode peut se faire selon la méthode suivante :
On utilise avantageusement, dans le mode de réalisation dit « du radiologue », 15 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé. On détermine l'équivalent de dose supplémentaire en utilisant uniquement le nombre de foci pH2AX au temps t4 à partir de la formule suivante :
N IpH2AX (t4, A scan ) - N pH2AX (t4, A scan )
D s, up X D,
N (t4, A scan
pH2AX scan
où :
N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé,
NPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé.
Description détaillée
Les termes « endommagement radioinduit », « radioinduit », « radiosensibilité, « radiorésistance », « radiotoxicité », « radiothérapie » se réfèrent tous à un rayonnement ionisant, notamment à un rayonnement de type particules, tel que constitué par des particules de type alpha (a) ou béta (β), ou encore à un rayonnement électromagnétique à haute énergie, notamment de type gamma (γ) ou X.
Le terme « transit cyto-nucléaire d'ATM » décrit la translocation qu'effectue la protéine ATM en passant du cytoplasme au noyau, notamment après irradiation. On appelle « effet iode » l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste injecté à un individu dans le cadre d'un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X, sur un échantillon cellulaire issu d'un tissu prélevé sur ledit individu. Cet effet iode s'ajoute à l'effet cassant l'ADN du rayonnement ionisant administré au cours dudit examen d'imagerie médicale. Les inventeurs se sont rendus compte que les raies d'émission du spectre des rayons X produit par un tube de rayons X avec une anode en tungstène, de type habituellement utilisé dans les dispositifs d'imagerie tridimensionnelle (scanner tomographiques aux rayons X), et qui se superposent au spectre continu (dont la distribution spectrale dépend de la tension d'accélération, qui est typiquement comprise entre 80 et 120 kV), sont proches du maximum d'absorption de l'énergie des atomes d'iode dans l'eau. Ces données sont rassemblées dans le tableau 1 . Tableau 1
Propriétés relatives aux rayons X générés avec une anode de tungstène de l'eau et de l'atome d'iode
1 . Préparation de l'essai
Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prélevées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que les opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire.
Puis, l'opérateur prélève au patient un échantillon cellulaire. De préférence il lui prélève par biopsie un échantillon de peau ; ce prélèvement peut se faire avantageusement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique ». L'échantillon cellulaire est placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fœtal stérile. L'échantillon est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante.
Dans un mode de réalisation avantageux lesdites cellules témoins issues de patients radiorésistants ont été sélectionnées en tant que cellules montrant un taux de survie clonogénique in vitro supérieur à 55% après une irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy.
Dans un autre mode de réalisation lesdites cellules témoins issues de patients radiorésistants ont été sélectionnées en tant que cellules prélevées sur des patients n'ayant pas montré de réactions tissulaires significatives pendant ou à la suite d'un scanner ou d'un traitement radiothérapeutique.
Le procédé selon l'invention utilise au moins un échantillon de tissu sain, de préférence des fibroblastes. Ces derniers sont de préférence prélevés sur le tissu conjonctif du patient. Ce prélèvement peut être effectué par biopsie. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux lesdites cellules prélevées sont des cellules fibroblastiques issues d'une biopsie de peau d'un patient (prélevées typiquement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique »). L'échantillon de tissu est cultivé dans un milieu de culture approprié.
L'étape suivante représente l'isolation et /ou l'amplification du tissu prélevé. Dans un mode de réalisation, dès réception, l'échantillon cellulaire (typiquement la biopsie) est établi sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable sans agent de transformation virale ou chimique suivant une procédure ancillaire et bien connue des laboratoires de culture, comme le souligne la publication d'EIkin M. et al. « The radiobiology of cultured mammalian cells », Gordon and Breach (1967). Dès que le nombre de cellules est suffisant (1 - 3 semaines), les premières expériences sont réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Les cellules sont mises en présence d'ions iode de préférence à raison de 5 à 25 mg d'iode par ml de produits de contraste (et de préférence à raison de 10 à 20 mg, et encore plus préférentiellement d'environ 15 mg), ce mode de réalisation étant appelé le mode de réalisation « du radiologue »), ces produits de contraste étant par exemple : loméron™, Xenetix™ ou Ultravist™), ou de préférence à raison de 2 à 20 μΜ de iodure (de préférence à raison de 5 à 15 μΜ, et encore plus préférentiellement d'environ 10 μΜ), ce mode de réalisation étant appelé le mode de réalisation « du radiothérapeute »), sachant que le iodure peut être ajouté sous la forme d'un iodure d'un élément alcalin, de préférence Nal. Une partie de ces lamelles sont irradiées sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D (par exemple 2 Gy). Une autre partie n'est pas irradiée ; elle représente l'état spontané (dose absorbée 0 Gy).
Ledit rayonnement ionisant est défini par sa dose absorbée (paramètre appelé Dthérap et Dscan exprimés en Gray). Dans le cadre de la présente invention la dose absorbée Dscan est comprise entre 0,01 Gy et 1 Gy, de préférence comprise entre 0,01 Gy et 0,05 Gy, et est encore plus préférentiellement de 0,02 Gy. Dans le cadre de la présente invention la dose absorbée Dthéra est comprise entre 0,5 Gy et 4 Gy, de préférence comprise entre 1 ,7 Gy et 2,3 Gy, et est encore plus préférentiellement de 2 Gy.
Ces zones correspondent typiquement à une séance individuelle de scanner ou de traitement radiothérapeutique pour lesquels le nombre de séances dépendent de la localisation, du type et du stade d'avancement de la tumeur. Après l'irradiation et pour subir les temps de réparation mentionnés ci-dessous, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C.
Pour les cellules irradiées, on acquiert des caractéristiques correspondant à l'état radio- induit après plusieurs temps de réparation (temps de réparation post-irradiation). Dans la méthode dite du radiothérapeute on acquiert de préférence au moins deux et encore plus préférentiellement au moins trois points, à savoir : t1 , t2, t3 et t4. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX et pATM. Dans la méthode dite du radiologue on acquiert un point à t4 pour le marqueur pH2AX.
Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (voir la publication citée de Bodgi et al. (2013)), peut être utilisée : les cellules ont été fixés dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCI2, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule t- Oct-C6H4-(OCH2CI-l2)xOH avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1 , fourni par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma Aldrich) et a été suivi par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800, les autres anticorps au 1 :100. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souri ou TRITC anti-lapin (1 :100, fournis par Sigma Aldrich) ont été effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du Vectashield™ contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. La coloration avec du DAPI permet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase Gi (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase G2 (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles).
L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en G0/Gi pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles.
Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, au moins 3 séries d'expériences (irradiation) indépendantes sont effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est calculée.
2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques
2.1 Généralités et marqueurs utilisés
L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour au moins deux marqueurs pH2AX, pATM sur des cellules non-irradiées (état spontané) et irradiées (état radioinduit). La méthode est basée sur l'étude cinétique du marquage par ce marqueur en fonction de la durée de réparation : on marque les échantillons après un laps de temps déterminé à compter de l'arrêt de l'irradiation, et on étudie leur immunofluorescence. On peut mesurer les courbes cinétiques complètes, par exemple représentées par 4 points se situant avantageusement à t1 (de préférence 10 minutes), t2 (de préférence 1 h), t3 (de préférence 4h) et t4 (de préférence 24h), et avant irradiation (état spontané). Mais la demanderesse s'est rendue compte que certains points (correspondant à certains temps de réparation) sont plus importants que d'autres, et que certains points ne sont pas prédictifs. Grâce à la sélection judicieuse des paramètres déterminés à des temps donnés, on peut ainsi diminuer le nombre de mesures et donc diminuer le coût global du diagnostic, sans diminuer le pouvoir prédictif de la méthode. C'est cette méthode simplifiée qui constitue la base de la méthode prédictive selon l'invention. Les moyennes de chaque point et chaque dose avec chaque marqueurs sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (appelé « SEM ») vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type « standard error SE »).
(i) pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures double-brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaire et seuls le nombre et la taille des foci seront analysés.
(ii) pATM désigne les formes phosphorylées en sérine 1981 de la protéine kinase ATM. Selon les constatations de la demanderesse, ATM passe du cytoplasme au noyau après irradiation en conditions normales (statut radiorésistant). Les formes pATM se concentrent principalement dans le cytoplasme puis marquent des sites de CDB. Le marqueur pATM se distingue par une localisation qui peut être cytoplasmique homogène (pas de foci cytoplasmique) sans foci nucléaire, uniquement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaires (pas de localisation nucléaire homogène), soit cytoplasmique et foci nucléaire. La contrecoloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation cytoplasmique ou nucléaire (cette répartition étant modifiée pATM sous l'influence de la radiation ionisante)
2.2 Paramètres biologiques
On définit et détermine comme indiqué :
- NPH2Ax(t), NpATM(t) les nombres moyens de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX, pATM, obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps d'observations t1 , t2, t3, t4 après irradiation (dose absorbée: 2 Gy ou 20 mGy), sachant que la détermination du paramètre NpH2Ax(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention, alors que celle des autres paramètres NpATM(t) est facultative mais avantageuse ;
2.3 Evaluation prédictive Elle vise la prédiction de paramètres cliniques ou radiothérapeutiques à partir des données biologiques mesurées. Deux niveaux de diagnostic sont proposés : A) un diagnostic quantitatif directement issu de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques reliant les scores ; celui-ci concerne les deux critères suivants :
2.3.1 La classification du patient dans un groupe I, Il ou III (critère appelé GROUPE) :
Pour l'utilisation de la méthode dite du radiothérapeute avec des iodures d'un métal alcalin, on utilise avantageusement une solution contenant 10 μΜ d'iodure de sodium, et si :
(a) N|pH2Ax(t4, Dthérap ) < 2 et N|pATM(t1 , Dthérap ) > N|pATM(t2, Dthérap ) et N|pAT (t1 , Dthérap ) >
30, alors on considère que l'échantillon est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ;
(b) (N|PH2Ax(t4, ) > 8 ou N,MN(t4, Dthérap ) > 24), alors on considère que
l'échantillon est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ; (c) pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré :
l'échantillon est dit « de groupe II », où :
N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode,
NipATM est le nombre de foci de pATM obtenu avec irradiation en présence d'ions iode,
NIMN est le nombre moyen de micronoyaux observés pour 100 cellules avec irradiation en présence d'ions iode.
Pour l'utilisation de la méthode dite du radiologue avec des produits de radiolyse des produits de contraste contenant des atomes d'iode on utilise avantageusement 15 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé, et si :
- N|PH2Ax(t4, Dscan) - NpH2Ax(t4, Dscan) < 2 , alors on considère que l'échantillon est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ;
- Si N|PH2Ax(t4, Dscan) - NpH2Ax(t4, Dscan) > 8 , alors on considère que l'échantillon est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » ;
Pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon est dit « de Groupe II », NiPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé,
NPH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé.
2.3.2 La détermination de la dose supplémentaire
Pour l'utilisation de la méthode dite du radiothérapeute avec des iodures d'un métal alcalin, on utilise avantageusement une solution contenant 10 μΜ d'iodure de sodium.
Deux méthodes sont proposées selon le nombre d'informations disponibles :
Méthode 1 : en utilisant uniquement le nombre de foci pH2AX au temps t4 On utilise la formule suivante :
_ NipH2AX (t4, Dfftérap ) ~~ NpH2AX (t4, Dthérap )
'-'sup Z r . \ X ^thérap
^pH2Ax(,t4, L't/lérap )
où :
N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode,
NPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans ions iode.
Méthode 2 : en utilisant le nombre de foci pH2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1 , t2, t3 et t4
La deuxième méthode pour déduire le surplus de dose causé par la présence de produits de contraste iodés se fera en 2 étapes :
Etape 1 :
Les nombres de foci pH2AX obtenus obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps ti , t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées sans les produits de contraste iodés seront ajustés par la formule de Bodgi (Bodgi et al. JTB 2013) et grâce à cet ajustement, les paramètres brec, brep et to seront déterminés. Les paramètres brec, brep et t0 sont des chiffres ou des nombres décimaux ou entiers. Les paramètres brec, brep sont, de préférence, des chiffres ou des nombres décimaux arrondis à deux chiffres significatifs après la virgule, de préférence trois chiffres significatifs après la virgule. Cet arrondi correspond à l'arrondi arithmétique de la valeur obtenue par calcul. Les paramètres brec et brep sont, de préférence, compris entre 0,001 et 5 min"1. Le paramètre t0 est, de préférence, compris entre 0 minute et 120 minutes.
Les paramètres brec, brep et to sont spécifiques du patient considéré.
_ί 1
NVH2AX t> Dthérap) ~ IDthérap (l -)( 77 —r)
1 T DREC L 1 -|- Drep \ l LQJ
Avec :
I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X Dthérap '■ la dose d'irradiation pour la méthode du radiothérapeute en Gy brec : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues en min"1 brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées en min"1 t0 : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB. Etape 2 :
Les nombres de foci pH2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps ti , t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées avec les produits de contraste iodés seront ajustés par la formule de Bodgi (Bodgi et al. JTB 2013) en fixant les paramètres brec, b^ etto déterminés à l'étape 1 : v 1 + brect 1 + brep (t — ÎQ )
Cette formule permettra de déterminer le paramètre D-ι, qui est la dose équivalente de l'irradiation avec le produit de contraste iodé. L'utilisation de cette formule selon l'invention permettant la détermination de D-ι conduit à l'obtention d'un chiffre ou d'un nombre décimal ou entier.
Le surplus de dose dû au produit de contraste iodé Dsup sera donc donné par la formule
Dsup- D-|-Dtherap Pour l'utilisation de la méthode dite du radiologue avec des produits de radiolyse des produits de contraste contenant des atomes d'iode on utilise avantageusement 15 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé en utilisant uniquement le nombre de foci pH2AX au temps t4.
On obtient l'équivalent de dose supplémentaire en utilisant uniquement le nombre de foci pH2AX au temps t4 à partir de la formule suivante :
N IpH2AX (t4, A scan ) - N pH2AX (t4, A scan )
D s, up X D,
N (t4, A scan
pH2AX scan où :
N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé,
NPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé.
L'utilisation de cette formule selon l'invention permettant la détermination de l'équivalent de dose supplémentaire conduit à l'obtention d'un chiffre ou d'un nombre décimal ou entier. De préférence, la valeur de Dsup obtenue est un chiffre ou un nombre décimal correspondant à l'arrondi arithmétique à deux chiffres significatifs après la virgule de la valeur obtenue par calcul.
B) Dans le cadre de la présente invention on propose également un diagnostic plus qualitatif, influencé par le diagnostic quantitatif mais qui tient compte d'éventuels éléments cliniques portés à la connaissance du praticien.
EXEMPLE :
Des cellules endothéliales vasculaires témoins HMEC commerciales ont été amplifiées suivant les préconisations du fournisseur (Thermo Fisher Scientific) jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles a ensuite été mise en contact avec le milieu à tester comprenant un agent de contraste iodé et/ou des ions iodures à une concentration donnée comme présenté dans le tableau 2 ci-après. Une autre partie de ces lamelles n'a pas été mise en contact avec ce milieu à tester comprenant un agent de contraste iodé et/ou des ions iodures.
Tableau 2 Evaluation de l'excès de dose Dsu dû aux produits de contraste iodés injectés pendant les examens de radiodiagnostic
Dans le tableau 2, les concentrations des milieux à tester comprenant un agent de contraste iodé et/ou des ions iodures sont exprimées en mg de composé iodé par ml. Ainsi, une solution d'Ultravist™ à 10 mg/ml contient 10 mg d'Iopromide (n° CAS : 73334- 07-3) par millilitre.
L'ensemble de ces lamelles a ensuite été immédiatement irradié sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D comme présenté dans le tableau 2. Une dose de 2 Gy a été utilisée dans le cadre d'un traitement thérapeutique. Une dose de 0,1 Gy a été utilisée dans le cadre d'un traitement radiologique.
L'irradiation a été effectuée avec un accélérateur médical qui délivre des photons de 6 MV avec un débit de dose absorbée de 3 Gy min"1. Après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy ou de 0.1 Gy, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. Les échantillons irradiés ont été marqués 24h à compter de l'arrêt de l'irradiation (t4), et on a acquis le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX, à ce temps de réparation post-irradiation (24h). Les cellules ayant subi l'irradiation ont ensuite été fixées, lysées et hybridées sur des lamelles de verre. Les cellules ont été fixées dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCI2, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1 , fourni par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma Aldrich) et a été suivie par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800, les autres anticorps primaires à 1 :100. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souris ou TRITC anti-lapin (1 :100, fournis par Sigma Aldrich) ont été effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes.
L'acquisition des résultats a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en G0/G1 pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).
Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'irradiations indépendantes ont été effectuées. La moyenne de chacun des nombres de foci après 24h (t4)) de réparation post-irradiation a été calculée et présentée dans le tableau 2, et ce, pour différentes lignées cellulaires HMEC.
L'équivalent de dose supplémentaire Dsup a ensuite été calculé en utilisant uniquement le nombre de foci pH2AX au temps t4, à-savoir à 24h de réparation post-irradiation à partir de la formule suivante :
N IpH2AX (t4, D ) - N pH2AX (t4, D )
D s, up X D
N pH2AX (t4, D ) ou :
NiPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé et / ou d'ions iodures, NPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé ou sans ions iodures. et D correspond à une dose absorbée déterminée de rayonnement ionisant Dscan ou Dthera exprimée en Gray.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé d'évaluation de l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste iodé injecté à un individu dans le cadre d'un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X, sur un tissu prélevé sur ledit individu, dans lequel procédé : (a) On approvisionne des cellules d'un tissu à évaluer qui a été prélevé (de préférence par biopsie) sur un individu ;
(b) On disperse et/ou amplifie lesdites cellules pour obtenir un échantillon cellulaire ;
(c) On met en contact ledit échantillon cellulaire avec un milieu à tester, ledit milieu à tester comprenant ledit agent de contraste iodé et/ou des ions d'iodure ; (d) On soumet ledit échantillon cellulaire en contact avec ledit milieu à tester à une dose absorbée Dthera OU Dscan déterminée de rayonnement ionisant, sachant que :
Dscan représente la dose de rayons X utilisée pour un examen d'imagerie médicale,
Dthera représente la dose de rayonnement ionisant administrée lors d'une séance de radiothérapie qui suit un examen d'imagerie médicale utilisant des rayons X ;
(e) On détermine sur l'échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) le nombre de cassures double brin de l'ADN , et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux. 2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel lesdits rayons X sont générés avec une anode en tungstène.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel (a) On soumet ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) en contact avec un milieu à tester (qui comprend avantageusement des ions d'iodure, mais pas d'agent de contraste iodé) à une dose déterminée de rayons gamma Dthéra (Dthéra étant comprise de préférence entre 0,5 Gy et 4 Gy, plus préférentiellement entre 1 Gy et 3 Gy, encore plus préférentiellement entre 1 ,7 Gy et 2,3 Gy, et typiquement de 2 Gy) ; et puis
(β) On détecte sur l'échantillon cellulaire le nombre de cassures double brin de l'ADN , et/ou un biomarqueur représentant ce nombre, et/ou le nombre de micronoyaux. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel :
On détermine sur ledit échantillon cellulaire n'ayant pas encore été mis en contact avec le milieu à tester le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t) et ΝΡΑΤΜ(Ϊ)), obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi au temps t= t4,
où t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ; et puis
On détermine sur ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (d) le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et pour la dose Dscan) (ces nombres moyens étant appelés respectivement NpH2Ax(t, Dscan)) et NpATM(t, Dscan)), ledit temps d'observation étant t = t4.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, dans lequel on détermine sur ledit échantillon cellulaire à l'issue de l'étape (a) le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX et pATM aux temps d'observation t et pour la dose Dthéra (Gy) (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t, Dthéra )) et NpATM(t, Dthéra )), ledit temps d'observation étant t = t4.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel on effectue les déterminations à l'étape (a) et/ou à l'étape (β) à des temps additionnels d'observations t1 et/ou t2 et/ou t3, sachant que
t4 est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ;
t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ;
t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1 , mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ;
t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel t1 est compris entre 8 minutes et 12 minutes, t2 est compris entre 50 minutes et 70 minutes, t3 est compris entre 3,5 heures et 4,5 heures, et t4 est compris entre 22 heures et 26 heures.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel t1 est 10 minutes, t2 est 60 minutes, t3 est 4 heures, t4 est 24 heures, et dans laquelle, de préférence, Dthera est 2 Gy.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel à l'étape (c) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel :
- SI N|pH2Ax(t4, Dthérap) < 2 et N|pATM(t1 , Dthérap) > NlpATM(t2, Dthérap) et N |pATM(t1 , > 30, alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ;
- si (N|PH2Ax(t4, > 24), alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe III » - pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré : l'échantillon cellulaire est dit « de Groupe II »,
où :
NiPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode, NipATM est le nombre de foci de pATM obtenu avec irradiation en présence d'ions iode et N |MN est le nombre moyen de micronoyaux observés pour 100 cellules avec irradiation en présence d'ions iode.
1 1 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel à l'étape (c) ledit milieu à tester comprend un agent de contraste iodé.
12. Procédé selon la revendication 1 1 , dans lequel
- si N|PH2Ax(t4, Dscan) - NpH2Ax(t4, Dscan)) < 2 , alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiorésistant à l'effet iode : il est dit « de Groupe I » ;
- si N|PH2Ax(t4, Dscan)) - NpH2Ax(t4, Dscan)) > 8 , alors on considère que l'échantillon cellulaire est radiosensible à l'effet iode : il est dit « de Groupe II I » ;
Pour toutes les autres conditions on considère que le risque est modéré :
l'échantillon cellulaire est dit « de Groupe I I », où :
NiPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé et NpH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel on détermine l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste iodé, ledit procédé étant caractérisé en ce que :
(i) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode (de préférence une solution contenant 10 μΜ d'iodure de sodium) mais pas d'agent de contraste,
(ii) on détermine la dose supplémentaire uniquement sur la base du nombre de foci pH2AX au temps t4, et de préférence en utilisant la formule suivante :
où :
NiPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'ions iode et NPH2Ax est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans ions iode.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel on détermine l'effet supplémentaire cassant l'ADN d'un agent de contraste iodé, ledit procédé étant caractérisé en ce que :
(i) ledit milieu à tester comprend des ions d'iode (de préférence une solution contenant 10 μΜ d'iodure de sodium) mais pas d'agent de contraste iodé,
(ii) on détermine la dose supplémentaire sur la base du nombre de foci pH2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t1 , t2, t3 et t4, et de préférence selon la méthode suivante : dans une première étape, on détermine les nombres de foci pH2AX obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps ti, t2, t3 et t4 pour l'échantillon de cellules irradiées sans produit de contraste iodés,
dans une deuxième étape on calcule les paramètres brec, brep et t0 dans la formule
_i 1
NVH2AX t> Dthérap) ~ IDthérap (l -)( 77 —r)
1 T DREC L 1 -|- Drep \ l LQJ où :
I : nombre de CDB induite de l'ADN équivalent à 40 CDB par Gy pour les rayons X, brec : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB sont reconnues [min"1], brep : inverse du temps au bout duquel 50% des CDB reconnues sont réparées [min"1], t0 : décalage moyen entre la reconnaissance et la réparation des CDB ; dans une troisième étape on détermine les nombres de foci pH2AX obtenus aux obtenus dans une condition sans irradiation (0 Gy) et aussi aux temps t-i, t2, t3 et pour l'échantillon de cellules irradiées avec le produit de contraste iodé, dans une quatrième étape on calcule la dose équivalente D-ι de l'irradiation avec le produit de contraste iodé en utilisant les paramètres brec, brep et t0 déterminés à la deuxième étape, en utilisant la formule :
1 1
dans une cinquième étape on détermine le surplus de dose dû au produit de contraste iodé Dsup selon la formule :
DsuP — D-|-DtheraP
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel on utilise entre 5 et 25 mg d'iode par ml de produit de contraste iodé, et de préférence entre 10 et 20 mg.
16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on utilise le nombre de foci pH2AX uniquement au temps t4, et de préférence en utilisant la formule suivante :
_ NiPH2Ax(t4, Dscan )— NpH2Ax(t4, Dscan )
SUP ~ 1 pH2AX (t^, u nscan ) x scan
où : N|PH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation en présence d'un agent de contraste iodé et NpH2AX est le nombre de foci de pH2AX obtenu avec irradiation sans agent de contraste iodé.
17. Procédé selon les revendications 1 , 2, 4, 6, 7, 9, 1 1 , 12 et 15 à 16, dans lequel Dscan est compris entre 5 mGy et 50 mGy, de préférence entre 10 mGy et 40 mGy, plus préférentiellement est de 20 mGy.
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