EP3338089A1 - Méthode prédictive pour caractériser la sensibilité d'une tumeur en réponse à un traitement cassant l'adn - Google Patents

Méthode prédictive pour caractériser la sensibilité d'une tumeur en réponse à un traitement cassant l'adn

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Publication number
EP3338089A1
EP3338089A1 EP16763914.5A EP16763914A EP3338089A1 EP 3338089 A1 EP3338089 A1 EP 3338089A1 EP 16763914 A EP16763914 A EP 16763914A EP 3338089 A1 EP3338089 A1 EP 3338089A1
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EP
European Patent Office
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dose
dna
tumor
cells
treatment
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16763914.5A
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German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas FORAY
Larry BODGI
Sandrine PEREIRA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Leon Berard
Universite Claude Bernard Lyon 1
Neolys Diagnostics SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Centre Leon Berard
Universite Claude Bernard Lyon 1
Neolys Diagnostics SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Centre Leon Berard, Universite Claude Bernard Lyon 1, Neolys Diagnostics SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the invention relates to the field of medical radiotherapy, and more particularly to the field of radiotherapeutic laboratory methods.
  • the present invention relates to a novel predictive method of cellular, tissue and clinical radiosensitivity, which is based on the determination and cross-checking of several cellular and enzymatic parameters and criteria applied to the tumor response. More particularly, the invention relates to a predictive method for characterizing the sensitivity of a tumor in response to radiotherapeutic DNA-breaking therapy.
  • Non-surgical cancer treatments generally aim to cause cell death in cancer cells: most of these treatments cause breaks in the DNA, which then causes apoptosis of these cells. This is true especially for the treatment of a tumor by ionizing radiation (radiotherapy).
  • ionizing radiation radiotherapy
  • There are, however, few methods for predicting a tumor's response to such antitumor treatment, and their reliability is not sufficient to guide the strategy of antitumor therapy in clinical practice for radiotherapy see "Radiation Biology, A Handbook for Teachers and Students," IAEA, 2010, pp. 107/108). It is known that the question of tissue sensitivity to ionizing radiation is inseparable from those of DNA damage repair mechanisms.
  • ionizing radiation can break certain types of chemical bonds by generating free radicals (in particular by peroxidation) and other reactive species that cause DNA damage. Damage to DNA by endogenous or exogenous aggressions (such as ionizing radiation and free radicals) can lead to different types of DNA damage depending in particular on the deposited energy: base damage, single-strand breaks and double-strand breaks (DSBs).
  • Unrepaired CBD is associated with cell death, toxicity and more specifically radiosensitivity.
  • Badly repaired CBD is associated with genomic instability, mutagenicity, and susceptibility to cancer. The body has specific repair systems for each type of DNA damage.
  • lymphomas are generally more radiosensitive than sarcomas, and this generally regardless of the genetic status of the individual: for tumors, the "individual factor” can be erased behind the factor "tissue".
  • a predictive test method to determine the cumulative minimum dose that a tumor must receive to be sterilized. This question arises first of all in radiotherapy in a context of high ionizing doses. However, this question is also likely to arise for any other exposure to high ionizing doses, equivalent to those used in radiotherapy.
  • TCD50 and TCD95 Tuour Control Dose represent the doses for which one has respectively 50% and 95% of tumor control. Used frequently in the 1980s, when standard treatments allowed for some standardization in dose delivery for a given type of tumor, it is no longer valid today for cancerous diseases that are treated differently according to the centers with a wide variety in the spread of the dose.
  • TCP Tumor Control Probability
  • TCP e p-Woex (yT-DD - /? D 2 )
  • a and ⁇ are the parameters of the quadratic linear model
  • ⁇ the proliferation constant of the cells
  • T the duration of the treatment in days.
  • the RECIST criterion (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) is one of the most commonly used criteria for describing the evolution of solid tumors after radiotherapy treatment. It was published in February 2000 by an international collaboration and revised in 2009 (Eisenhauer et al., "New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1)", European J Cancer 45 (1009), p.228 -247). This criterion is based on the decrease in the sum of the largest diameters of tumors:
  • Partial Response at least 30% decrease in the sum of the largest diameters of tumors
  • PD Progressive Disease
  • two imaging criteria are used by clinicians, in particular the criteria for the variation of signal intensity after radiotherapy treatment.
  • This intensity is usually measured by PetScan or MRI infusion.
  • This intensity can be correlated to a number of surviving cells since only the part of the tumor containing living cells will emit a signal because this part will always be vascularized.
  • the Choi criterion correlates the volume of the tumor with the intensity of the signal (Choi et al 2007, "Correlation of Computed Tomography and Positron Emission Tomography in Patients with Metastatic Gastrointestinal Stromal Tumor Treated at a Single Institution with Imatinib").
  • Mesylate Proposed New Computed Tomography Response Critera J Clin Oncol 25: 1753-1759.
  • Those skilled in the art also know cellular parameters for describing tumors.
  • This dose will be repeated n times, to reach the total dose D of the treatment.
  • irradiation in a single dose causes greater cellular damage than fractional irradiation for the same total dose of the treatment.
  • This kind of splitting although it decreases the effectiveness of treatment at the level of the tumor, reduces the side effects of radiation therapy.
  • More advanced treatment techniques such as cyberknife and tomotherapy, deliver a higher dose per tumor fraction while sparing healthy tissue, making treatment more effective.
  • TCD95 142.8 X SF2 + 8.57
  • the number of surviving cells after irradiation is a quantifiable parameter for defining tumor control and volume reduction. It will be directly correlated to cell survival and the number of initial cells in tumor N 0 :
  • N 0 SF (d, D)
  • the patent application WO2014 / 154854 (University Hospital Center of Jardin) describes a method for predicting the radiosensitivity of a subject via the use of at least one radiosensitivity biomarker. This method does not detect markers directly related to DNA damage or repair; it is also based on proteomic data. In addition, this patent application does not describe a quantitative relationship between the radiobiological data and the severity of the tissue reactions.
  • the patent application WO 2013/187973 (University of California) describes systems and methods for determining the radiosensitivity of cells and / or a subject with respect to a control population. More particularly, this method includes the irradiation of a biological sample, the detection and quantification of radioinduced foci in erythrocyte, lymphocyte or primary cell cells, resulting from a blood sample via the use of one or more markers. detection among a set of markers including anti-pH2AX, anti-MRE1 1 and anti-ATM. Quantification of radioinduced foci at different post-irradiation observation times of less than 2 h allows determination of their repair kinetics, which is empirically correlated with radiosensitivity of the subject. However, foci analysis in lymphocyte-like cells is very difficult because of their small nucleus. In addition, this method does not allow the practitioner to make decisions about the treatment of the patient.
  • Patent application WO 2010/88650 (University of Texas) describes methods and compositions for identifying cancer cells that are either sensitive or resistant to a particular radiotherapy treatment; it is therefore not applicable to any radiotherapeutic treatment.
  • Patent application WO 2010/109357 describes a method and apparatus for adaptive radiotherapy protocol planning based on optimizing the probability of complication of normal tissues and the probability of tumor control according to markers specific to each patient.
  • the normal tissue marker values include in vitro test values, protein spectrometric signatures, history data, and patient history.
  • the in vitro test values can be of cellular, proteomic and genetic origin such as, but not limited to, various cell counts, HB, CRP, PSA, TNF-alpha, ferritin, transferrin, LDH, IL-1. 6, hepcidin, creatinine, glucose, HbAlc, and the length of the telomeres.
  • Anamnesis and patient history markers include anterior abdominal surgery, hormonal medications or anticoagulants, diabetes, age, and measures related to tumor growth. Biomarkers unrelated to radiotoxicity are also contemplated, such as biomarkers associated with various forms of ablation. However, individual radiosensitivity is not taken into account.
  • the present invention aims to propose a new predictive method of tumor sensitivity to a DNA-breaking treatment.
  • the inventors have found a correlation between cell survival at a dose D and a dose fractionation d and the number of foci of pH2AX is:
  • NH2AX represents the number of pH2AX focal in tumor cells surviving at 24 hours post-irradiation
  • ⁇ represents the tolerance of the cell (unit: number of double-strand breaks),
  • D is the dose in Gy
  • d is the dose in Gy per fraction
  • n is the number of fractions
  • ⁇ parameter in Gy "2 of the quadratic linear model relating to the type of tumor tissue, knowing that ⁇ and ⁇ are parameters of decimal or integer adjustments, preferably decimal adjustment parameters corresponding to the arithmetic rounding of the value obtained by calculation, preferably to two significant digits after the decimal point, more preferably to three significant digits after the decimal point, and even more preferentially to four significant digits after the decimal point.
  • A is an integer constant or decimal between 130 Gy and 160 Gy,
  • B is an integer or decimal constant between 5 Gy and 15 Gy.
  • the TCD95 parameter is determined according to the following formula:
  • A is an integer or decimal constant between 130 Gy and 160 Gy
  • B is an integer or decimal constant between 5 Gy and 15 Gy.
  • the TCD95 parameter is determined according to the following formula:
  • TCD 142.8 X e c ⁇ + 8.57 knowing that ⁇ and ⁇ are adjustment parameters as explained above.
  • TCP (D) e ⁇ N ° xe knowing that ⁇ and ⁇ are adjustment parameters as explained above.
  • the inventors have found that these parameters of the TCD95 and the TCP as determined according to the invention certainly give a more accurate predictive description than the methods according to the state of the art, but that the predictive description based on the cellular parameters and / or molecular can be significantly improved by characterizing tumor sensitivity in response to DNA-breating treatment by evaluation of the surviving cell fraction at a D dose and d-dose fractionation, or by the volume of the tumor.
  • This embodiment also has the advantage that:
  • SF (d, D) can be easily determined from the number of foci of pH2AX the volume being a geometric factor, it can be correlated with all the other clinical criteria used by practitioners according to the state of the art to describe the state and evolution of a tumor, such as the RECIST criterion, mentioned above.
  • the inventors have also found a correlation between the number of pH2AX foci and cell survival.
  • cell survival is:
  • NH2AX represents the number of pH2AX foci in surviving tumor cells at 24 hours post-irradiation
  • ⁇ represents the tolerance of the cell (unit: number of double-strand breaks)
  • D is the dose in Gy
  • d is the dose in Gy per fraction
  • n is the number of fractions
  • ⁇ is the parameter in Gy "2 of the quadratic linear model relative to the type of tumor tissue, knowing that ⁇ and ⁇ are parameters adjustment as explained above.
  • V ⁇ D) ⁇ + e- aW 0 (SF (D) -SF (D 50 )) knowing that V (D) expresses the volume of the tumor that survives a D dose.
  • ⁇ represents the tolerance of the cell (unit: number of double-strand breaks),
  • D 50 is the dose for which the volume of the tumor is found to be 50%
  • n 50 is the number of fractions for which the volume of the tumor is found to be 50%
  • a is a constant of volume variation by number of breaks
  • ⁇ is a parameter (in Gy "2 ) of the quadratic linear model relating to the type of tumor tissue, knowing that ⁇ and ⁇ are adjustment parameters as explained above, in addition this fraction surviving at a dose D (divided into n doses d) is proportional to the ratio of intensities of the signals collected by imaging before and after treatment by radiotherapy according to the formula:
  • I f is the intensity of the signal in the treated volume at the end of the treatment
  • I is the intensity of the signal in the treated volume before the treatment
  • C is a proportionality constant
  • the dose d is the dose per fraction of the radiotherapeutic treatment (typically 2 Gy) and D is the total dose of the radiotherapy treatment administered.
  • the object of the present invention is a method of evaluating the response of a tumor to a DNA-breaking treatment from a sample of cells of said tumor (preferably by biopsy), wherein: (a) preparing a cell sample from cells taken from said tumor;
  • T4 is a fixed value which represents the time for which the rate of DNA breaks reaches its residual value, and which is advantageously chosen between 6 times t3 and 8 times t3, but in this case must be at least 12 hours, and preferably between 12h and 48h, and which is even more preferably about 24 hours;
  • T3 is a fixed value which represents the time after which approximately 25% of the double-strand breaks (DSBs) are repaired in control cells from radiation-resistant patients, and which is advantageously chosen between 3 times t2 and 5 times t2, but in this case must be at least 2.5 hours and at most 6 hours, and is preferably between 3 hours and 5 hours, and is even more preferably about 4 hours;
  • T2 is a fixed value which represents the time after which about 50% of the CBDs are repaired in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 5 times t1 and 7 times t1, but which must in this case be at least 35 minutes and at most 90 minutes, and is preferably between 45 minutes and 75 minutes, and even more preferably about 60 minutes;
  • T1 is a fixed value which represents the time after which the number of recognized CBDs reaches its maximum in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 5 minutes and 15 minutes after stopping irradiation, preferably between 7.5 minutes and 12.5 minutes, and even more preferably at about 10 minutes.
  • Said DNA-breaking treatment is irradiation with ionizing radiation.
  • Said tumor may be a solid or liquid tumor.
  • the parameter or score of the tumor response to a DNA-breaking treatment is determined by at least one parameter selected from the group consisting of: the surviving cell fraction after a D dose divided into n doses of SF (d, D)), the parameter TCD50, the parameter TCD95, the parameter TCP, the volume of the tumor.
  • the TCD95 parameter is advantageously established from the number of cells surviving the DNA-breaking treatment with a dose D, preferably by the relationship
  • N 0 represents the number of initial tumor cells
  • N (2 Gy) represents the number of surviving cells at t4 after irradiation with ionizing radiation of a dose of 2 Gy of DNA-breating treatment, said dose preferably being a dose of ionizing radiation of between 0.5 Gt and 5 Gy, preferably between 1 Gy and 3 Gy, and even more preferably 2 Gy,
  • A is an integer or decimal constant between 130 Gy and 160 Gy
  • B is an integer or decimal constant between 5 Gy and 15 Gy.
  • the TCD95 parameter is advantageously established from the number of cells surviving the DNA-breaking treatment with a dose D, preferably by the relationship
  • N 0 is the initial number of tumor cells
  • N (2 Gy) represents the number of surviving cells to t4 after irradiation with ionizing radiation at a dose of 2 Gy treatment breaking the DNA, said dose being preferably a dose of ionizing radiation between 0.5 Gt and 5 Gy, preferably between 1 Gy and 3 Gy, and even more preferably 2 Gy.
  • the TCD95 parameter is established from the number of pH2AX foci of cells surviving the DNA-breaking treatment with a dose D, preferably by the relationship
  • TCD9S A xe ⁇ ⁇ + ⁇ + B
  • N H 2Ax (2Gy, 24h) represents the number of focal pH2AX at time t4 after a dose D of DNA-breating treatment, said dose preferably being a dose of ionizing radiation of 2 Gy
  • ⁇ represents the tolerance of the cell (expressed in number of double-strand breaks)
  • ⁇ represents the parameter in Gy "2 of the quadratic linear model relating to the type of tumor tissue
  • A is a constant in Gy or decimal between 130 Gy and 160 Gy
  • B is an integer Gy or decimal constant between 5 Gy and 15 Gy.
  • N H 2Ax (2Gy, 24h) represents the number of focal pH2AX at time t4 after a dose D of DNA-breating treatment, said dose preferably being a radiation dose 2Gy ionizing
  • ⁇ represents the cell tolerance (expressed as the number of double-strand breaks)
  • ⁇ the Gy- 2 parameter of the quadratic linear model relative to the type of tumor tissue, knowing that ⁇ and ⁇ are adjustment as explained above.
  • the TCP parameter can be established from the number of surviving cells after treatment breaking the DNA with a dose D, preferably by the relation
  • TCP ⁇ D e ⁇ N ⁇
  • N represents the number of surviving cells after a dose D of DNA-breating treatment, said dose preferably being a dose of ionizing radiation of 2 Gy.
  • the TCP parameter can be established from the number of pH2AX foci of cells surviving the DNA-breating treatment with a dose D of DNA-breaking treatment, preferably by the relationship
  • N H 2Ax (d, 24h) represents the number of pH2AX foci in the surviving cells at time t4 after a d dose of DNA-breating treatment, said dose preferably being a dose of ionizing radiation of 2 Gy.
  • ⁇ and ⁇ are adjustment parameters as explained above.
  • the survival of the tumor cells is established after a DNA-breating treatment with a D dose divided into n doses preferably by the relation:
  • N H 2AX represents the number of pH2AX foci in tumor cells surviving at 24 hours post-irradiation
  • ⁇ represents the tolerance of the cell (unit: number of breaks double-stranded)
  • D is the dose in Gy
  • d is the dose in Gy per fraction
  • n is the number of fractions
  • ⁇ is the Gy- 2 parameter of the quadratic linear model relative to the type of tumor tissue
  • the proportionality of said surviving cell fraction can be established after a D dose divided into n doses d with the ratio of intensities of the signals collected by imaging before and after radiotherapy treatment according to the formula:
  • I f is the intensity of the signal in the treated volume at the end of the treatment
  • I is the signal intensity in the volume treated before the treatment
  • the volume of the tumor is determined after a DNA-breaking treatment with a dose D (this volume being expressed by the parameter V (D)) from the survival of the tumor cells, preferably by the relation V ( D ⁇ 1 + e- ⁇ V 0 (SF (D) -SF (D 50 )) or
  • N is the number of surviving cells after irradiation with a dose D
  • - SF (D) is the fraction of surviving cells at a dose D
  • - a is the constant of variation of the volume by number of breaks of the DNA
  • - D50 is the dose in Gy for which a 50% reduction of the volume of the tumor is observed.
  • the volume of the tumor is determined after a DNA-breaking treatment with a dose D (this volume being expressed by the parameter V (D)) from the number of surviving cells, preferably by the relation () _ 1 + e -a (N (D) -N (D 50 )) where:
  • N is the number of surviving cells after irradiation with a dose D
  • - N (D) is the number of surviving cells at a dose D
  • - a is the constant of variation of the volume by number of breaks of the DNA
  • - D50 is the dose in Gy for which a 50% reduction of the volume of the tumor is observed.
  • the tumor volume is determined after a DNA-breaking treatment at a fractionated D dose in n doses from the number of pH2AX foci of cells surviving the DNA-breaking treatment, preferably by the relation
  • N 0 represents the number of initial tumor cells
  • ⁇ represents the tolerance of the cell (unit: number of double-strand breaks)
  • D 50 is the dose for which a 50% reduction in tumor volume is found
  • n 50 is the number of fractions for which a 50% reduction in tumor volume is found.
  • A is a constant of volume change by number of breaks
  • ⁇ represents the parameter in Gy "2 of the quadratic linear model relating to the type of tumor tissue, knowing that ⁇ and ⁇ are adjustment parameters as explained above.
  • FIG. 1 represents the evolution of cell survival for irradiation with a single dose (see FIG. 1A) and the evolution of cell survival for irradiation with a total dose D divided into n fractions of one dose.
  • dose d see FIG. 1B: FIG. 1 shows that irradiation in a single dose is much more lethal at the cellular level than fractional irradiation for the same total dose of the treatment. This kind of fractionation, although it decreases the effectiveness of treatment at the level of the tumor, reduces the side effects related to radiotherapy
  • FIG. 2 represents the evolution of the cell survival fraction at a single dose of 2 Gy (SF2 (%)) as a function of the number of acquired pH2AX foci per cell, after 24h of repair time after irradiation with an absorbed dose of 2 Gy. Each point corresponds to the evolution of cell survival at 2 Gy as a function of the number of pH2AX foci acquired per cell, after 24 hours of repair time after irradiation with an absorbed dose of 2 Gy for a cell line.
  • a simulation according to the invention connecting the SF2 (%) to the number of pH2AX foci acquired per cell, after 24 hours of repair time after irradiation with an absorbed dose of 2 Gy is shown in dotted line in FIG.
  • the treatment breaking the DNA is quantified by its dose D.
  • said dose D corresponds to the absorbed dose of said ionizing radiation (commonly expressed in Gy).
  • the respective operators (belonging for example to a cytological analysis laboratory) are informed (typically by the doctor) of the possible infection status of the patient by HIV or hepatitis C for operators can take appropriate measures of increased biosecurity when collecting, handling and managing cell culture. Then, the operator takes the patient a tumor sample. The cell sample is placed in DMEM medium + 20% sterile fetal calf serum. The sample is transferred without delay to a specialized laboratory, knowing that the sample should not remain more than 38 hours at room temperature.
  • the next step is the isolation and / or amplification of the sampled tissue.
  • the cell sample (typically the biopsy) is established as an amplifiable cell line, most preferably via selective flow cytometry culture or via the use of selective culture and this, without viral or chemical transformation agent according to an ancillary procedure and well known variable depending on the type of tumor (Krônig et al, "Cell type specifies gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity" Oncotarget 2015 Jan. 20; 6 (2): 1302-14; Hristozova et al., "A single multicolor for cytometry protocol for detection and molecular characterization of circulating tumor cells in epithelial cancers.” Cytometry A.
  • the irradiation can be carried out for example with a medical accelerator which delivers 6 MV photons with an absorbed dose rate of 3 Gy min -1
  • a medical accelerator which delivers 6 MV photons with an absorbed dose rate of 3 Gy min -1
  • the cells remain in the culture incubator at 37 ° C.
  • characteristics corresponding to the radio-induced state are acquired after several repair times (post-irradiation repair time). At least two and even more preferably at least three points are preferably acquired, namely: t1, t2, t3 and t4. Said characteristics are represented by the foci corresponding to the pH2AX marker.
  • the cells on glass slides are then fixed, lysed and hybridized.
  • the following procedure, known per se (see the cited publication by Bodgi et al.), Can be used: the cells were fixed in 3% paraformaldehyde and 2% sucrose for 15 minutes at room temperature and permeabilized in 20 mM solution HEPES buffer (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid) at pH 7.4, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl 2 , 300 mM sucrose, 0.5% Triton X-100 (a non-surfactant ionic formula I-Oct- 6 H4- (OCH 2 CH 2 ) xOH with x 9-10, CAS No.
  • the results are acquired from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model, for example).
  • the reading can be direct (typically by counting the foci on at least 50 cells in G 0 / Gi for each point) or by dedicated image analysis software, or on an automated microscope; preferably the software or automated microscope methods are calibrated with manual determinations.
  • the invention is based among others on the use of data acquired for the pH2AX marker on non-irradiated cells (spontaneous state) and irradiated (radioinduced state).
  • the method is based on the kinetic study of the labeling by this marker as a function of the duration of the repair: the samples are marked after a determined lapse of time from the end of the irradiation, and their immunofluorescence is studied.
  • the complete kinetic curves can be measured, for example represented by 5 points advantageously located at t0, t1 (preferably 10 minutes), t2 (preferably 1 h), t3 (preferably 4h) and t4 (preferably 24h), knowing that t0 corresponds to the state before irradiation (spontaneous state). But the plaintiff realized that some points (corresponding to certain times of repair) are more important than others, and that some points are not predictive. Thanks to the judicious selection of the parameters determined at given times, it is thus possible to reduce the number of measurements and thus reduce the overall cost of the diagnosis, without reducing the predictive power of the method.
  • pH2AX denotes the phosphorylated forms in serine 439 of the histone H2AX X variant which marks, according to the findings of the applicant, the number of double-strand breaks in the DNA (CDB) which are recognized by the method of Majority and faithful repair, the suture.
  • the pH2AX marker is essentially nuclear in the form of only nuclear foci and only the number and size of the foci will be analyzed.
  • DAPI a DNA marker known to those skilled in the art
  • N P H2Ax (t) the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker, at the observation times tO (non-irradiated) or t1, t2, t3, t4 after irradiation (absorbed dose: 2 Gy), knowing that the determination of the parameter N pH 2Ax (t) is mandatory in the context of the method according to the invention;
  • NH2AX represents the number of pH2AX foci in surviving tumor cells at 24 hours post-irradiation
  • ⁇ represents the tolerance of the cell (unit: number of double-strand breaks)
  • D is the dose in Gy
  • d is the dose in Gy per fraction
  • n is the number of fractions
  • ⁇ is the parameter in Gy "2 of the quadratic linear model relative to the type of tumor tissue, knowing that ⁇ and ⁇ are parameters adjustment as explained above.
  • this fraction surviving at a dose D (divided into n doses d) is
  • I f is the intensity of the signal in the volume treated at the end of the treatment
  • li is the intensity of the signal in the volume treated before the treatment
  • C is a constant of proportionality.
  • N 0 represents the number of initial tumor cells
  • ⁇ represents the tolerance of the cell (unit: number of double-strand breaks)
  • D 50 is the dose for which the volume of the tumor is found to be 50%
  • n 50 is the number of fractions for which we find reduction of the tumor volume of 50%
  • a is a constant of volume variation by number of breaks
  • ⁇ represents the parameter in Gy "2 of the quadratic linear model relative to the type of tumor tissue, knowing that ⁇ and ⁇ are parameters of adjustment as explained above.
  • N P H2Ax (t) determined in an algorithm leading to a parameter or score making it possible to characterize the response of the sample to said dose D of said DNA-breaking treatment is used.
  • the observation is made that certain values are not predictive for any score: this is the case, for example, of the points N pH 2Ax (t3). This is why a restricted analysis can be envisaged where only the points t0, t1, t2 and t4 are used among the determined values N pH 2Ax (t).
  • the cell lines presented in Table 1 were amplified according to the supplier's recommendations (SIGMA-ALDRICH) until the desired number of cells was obtained. After obtaining a sufficient number of cells (generally after one to three weeks), the first experiments were carried out using the method according to the invention.
  • the cells were seeded on glass slides in Petri dishes. These strips were irradiated on a medical dosimetry irradiator according to a validated with an absorbed dose of 2 Gy D. The irradiation was performed with a medical accelerator that delivers photon 6 MV with an absorbed dose rate of 3 Gy min " 1. After irradiation with an absorbed dose of 2 Gy, the cells were stored in the culture incubator at 37 ° C.
  • the samples were then labeled after 24h of post-irradiation repair, namely: 24h (t4) to from the cessation of irradiation, and the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker was acquired after 24 hours of post-irradiation repair (see Table 1).
  • the irradiated cells were then fixed, lysed and hybridized on glass coverslips.
  • the coverslips were then washed in phosphate buffered saline (known as PBS) prior to immunostaining. Incubation was carried out for 40 min at 37 ° C in PBS supplemented with 2% bovine serum albumin (known as BSA or fraction V, supplied by Sigma Aldrich) and was followed by PBS washing. .
  • BSA or fraction V bovine serum albumin
  • the primary anti-pH2AX antibodies were used at a concentration of 1: 800, the other primary antibodies at 1: 100.
  • Incubations with FITC anti-mouse or anti-rabbit TRITC secondary antibodies (1: 100, provided by Sigma Aldrich) were performed at 37 ° C in 2% BSA for 20 minutes.
  • the acquisition of the results was performed from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model).
  • the reading was carried out directly by counting the foci obtained with the pH2AX marker on at least 50 cells in G 0 / Gi for each point and by dedicated image analysis software (imageJ).

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Abstract

Procédé d'évaluation de la réponse d'une tumeur à un traitement cassant l'ADN à partir d'un prélèvement de cellules de ladite tumeur dans lequel : (a) on prépare un échantillon cellulaire à partir des cellules prélevées sur ladite tumeur; (b) on soumet ledit échantillon cellulaire à un traitement cassant l'ADN caractérisé par une dose D, (c) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec un marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t)), lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état avant administration de la dose D) et au moins un temps d'observation sélectionné parmi t = t1, t2, t3 et t4 après administration de la dose D; (d) on détermine au moins un paramètre ou score permettant de caractériser la réponse de l'échantillon audit traitement cassant l'ADN, en utilisant au moins les nombres moyens NpH2Ax(t), et dans lequel procédé • t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, · t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, • t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, · t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants.

Description

Méthode prédictive pour caractériser la sensibilité d'une tumeur en réponse à un traitement cassant l'ADN
Domaine technique de l'invention
L'invention concerne le domaine de la radiothérapie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiothérapeutiques. L'invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique, qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques appliqués à la réponse tumorale. Plus particulièrement l'invention concerne une méthode prédictive pour caractériser la sensibilité d'une tumeur en réponse à un traitement radiothérapique cassant l'ADN.
Etat de la technique
Les traitements anti-cancéreux non-chirurgicaux visent en règle générale à provoquer la mort cellulaire des cellules cancéreuses : la plupart de ces traitements provoquent des cassures de l'ADN qui provoque ensuite l'apoptose de ces cellules. Cela est vrai notamment pour les traitements d'une tumeur par rayonnement ionisant (radiothérapie). Il existe cependant peu de méthodes pour prédire la réponse d'une tumeur à un tel traitement anti-tumoral, et leur fiabilité n'est pas suffisante pour orienter la stratégie d'un traitement anti-tumoral dans la pratique clinique (pour la radiothérapie voir : « Radiation Biology, A Handbook for Teachers and Students », IAEA, 2010, p. 107/108). On sait que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non-homologue). Cette dernière affirmation est valable quelle que soit la nature du tissu, qu'il soit normal ou tumoral. On sait également que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise (« Inhérent cellular radiosensibility as a basic concept for human tumor radiotherapy », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 7, p.621 - 629 (1981 ) ; « Intrincsic radiosensitivity of human cell Unes is correlated with radioresponsiveness of human tumors : Analysis of 101 published survival curves », Int.J. Radiation Oncology Biol. Phys. 1 1 , p.1699-1707 (1985)). Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. De même, les tumeurs montrent un large spectre de radiosensibilité qui dépend à la fois de l'individu mais aussi de la nature du tissu. Par exemple, les lymphomes sont généralement plus radiosensibles que les sarcomes, et ce généralement quel que soit le statut génétique de l'individu : pour les tumeurs, le « facteur individu » peut s'effacer derrière le facteur « tissu ». Afin d'évaluer le rapport bénéfice/risque d'un traitement anti- cancer, il serait donc désirable de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer la dose minimale cumulée qu'une tumeur doit recevoir pour être stérilisée. Cette question se pose en premier lieu en radiothérapie dans un contexte de fortes doses ionisantes. Toutefois, cette question est également susceptible de se poser pour toute autre exposition à de fortes doses ionisantes, équivalentes à celles utilisées en radiothérapie.
Plusieurs critères cliniques sont utilisés par les praticiens pour quantifier la réponse tumorale à la suite d'un traitement anti-cancéreux. La plupart de ces critères sont relatifs à la diminution du volume tumoral (ou contrôle local) après le traitement ou à la dose de radiations pour diminuer ce volume. Pourtant aucun de ces critères n'est consensuel :
Les critères TCD50 et TCD95 (Tumour Control Dose) représentent les doses pour lesquelles on a respectivement 50% et 95% de contrôle tumoral. Utilisé fréquemment dans les années 80 où les traitements standards permettaient une certaine uniformisation dans la délivrance de dose pour un type de tumeur donné, il n'est plus valable aujourd'hui pour les affections cancéreuses qui sont traitées de façon différente suivant les centres avec une grande variété dans l'étalement de la dose.
Le critère TCP (Tumour Control Probability) permet de prédire théoriquement la probabilité de contrôler une tumeur. Ce critère est basé sur des études radiobiologiques qui ont pris en compte la survie clonogénique des cellules tumorales irradiées in vitro. Mathématiquement, la TCP est basée sur le modèle Linéaire-Quadratique :
TCP = e p-Woex (yT-œD-/?D2) où a et β sont les paramètres du modèle linéaire quadratique, γ la constante de prolifération des cellules et T la durée du traitement en jours.
Le critère RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) est l'un des critères les plus utilisés actuellement pour décrire l'évolution de la tumeur solides après un traitement par radiothérapie. Il a été publié en février 2000 par une collaboration internationale et révisé en 2009 (Eisenhauer et al., « New response évaluation criteria in solid tumours : Revised RECIST guideline (version 1.1) », European J Cancer 45 (1009), p.228-247). Ce critère est basé sur la diminution de la somme des plus grands diamètres des tumeurs :
Complète Response (CR) : disparition totale des tumeurs
Partial Response (PR) : au moins 30% de diminution de la somme des plus grands diamètres des tumeurs
- Stable disease (SD) : pas de changement notable
Progressive Disease (PD) : au moins 20% d'augmentation de la somme des plus grands diamètres des tumeurs.
De plus, deux critères d'imagerie sont utilisés par les cliniciens, en particulier les critères relatifs à la variation de l'intensité du signal après le traitement par radiothérapie. Cette intensité est généralement mesurée par PetScan ou IRM de perfusion. Cette intensité peut être corrélée à un nombre de cellules survivantes puisque seule la partie de la tumeur contenant des cellules vivantes va émettre un signal car cette partie sera toujours vascularisée. Par ailleurs, le critère de Choi permet de corréler le volume de la tumeur à l'intensité du signal (Choi et al 2007, «Corrélation of Computed Tomography and Positron Emission Tomography in Patients With Metastatic Gastrointestinal Stromal Tumor Treated at a Single Institution With Imatinib Mesylate: Proposai of New Computed Tomography Response Critera » J Clin Oncol 25:1753-1759.). L'homme du métier connaît également des paramètres cellulaires permettant de décrire les tumeurs.
Un de ce paramètres est la survie cellulaire : En 1956, Puck et Marcus proposèrent d'utiliser le test in vitro des colonies pour quantifier la radiosensibilité : après ensemencement d'un nombre connu de cellules irradiées, la mesure du nombre de colonies (amas macroscopique de cellules survivantes prolifératives après 5-6 générations) formées par les cellules que l'irradiation n'avait pas stérilisées devint la méthode de référence pour évaluer la fraction survivante des cellules irradiées in vitro. Les courbes de survie sont établies en représentant dans un graphe semi-logarithmique la relation dose (abscisse) - survie (ordonnée logarithmique) par une série de tests à différentes doses, chacune délivrée en générale en une seule fraction. Ces courbes sont décrites par le modèle Linéaire-Quadratique :
SF(D) = exp(-aZ) - βϋ2) où a et β sont des paramètres d'ajustements.
Cette formule est valable pour une irradiation par une dose unique. Toutefois, si on considère une irradiation fractionnée, c'est-à-dire une dose totale D divisée en n fractions d'une dose d, nous avons :
D=n x d
SF(d)=exp(-ad - β d2)
Cette dose sera répétée n fois, pour atteindre la dose totale D du traitement.
SF(D, d) =SF(d)n= exp(-ad - β d2)"
= exp(-nad - ηβ d2)
= exp(-aD - β dD)
Dans le cas d'un fractionnement de dose, la survie sera décrite par la formule suivante :
SF(d, D) = exp(- D - βάΌ ) où d est la dose en Gy par fraction
La courbe de survie pour une irradiation par une dose unique, respectivement pour une irradiation par une dose totale D divisée en n fractions d'une dose d est représentée sur la figure 1A, respectivement sur la figure 1 B:
Ainsi, comme on peut le voir sur la figure 1 , une irradiation en une seule dose engendre un endommagement cellulaire plus important qu'une irradiation fractionnée pour une même dose totale du traitement. Ce genre de fractionnement, bien qu'il diminue l'efficacité du traitement au niveau de la tumeur, permet de réduire les effets secondaires de la radiothérapie.
Des techniques de traitement plus développées, tel que le cyberknife et la tomothérapie, permettent de délivrer une dose par fraction plus importante au niveau de la tumeur tout en épargnant les tissus sains, ce qui rend le traitement plus efficace.
La fraction survivante à 2 Gy (SF2) est souvent utilisée pour prédire la radiosensibilité d'une tumeur. Une relation linéaire a été trouvée entre la TCD95 et la SF2 par Fertil et Malaise en 1981 (voir la publication citée ci-dessus):
TCD95 = 142.8 X SF2 + 8.57 Plusieurs groupes de recherche ont tenté de relier la SF2 aux différents critères cliniques de réponse tumorale précitée, mais cela n'a pas abouti à un modèle général et assez simple pour développer des tests prédictifs.
Un autre paramètre est le nombre de cellules survivantes : Le nombre de cellules survivantes après une irradiation est un paramètre quantifiable permettant de définir le contrôle tumoral et la réduction du volume. Il va être directement corrélé à la survie cellulaire et le nombre de cellules initiales dans la tumeur N0:
N = 0SF(d, D)
Au niveau moléculaire, l'état de la technique fait état d'analyses utilisant le marqueur H2AX ou pH2AX pour prédire l'efficacité de la radiothérapie. Ainsi Mahrhofer et al. ("Radiation induced DNA damage and damage repair in human tumour and fibroblast œil Unes assessed by histone HAX phosphorylation", Int J Oncol Biol Phys, 2006. 64(2): p. 573-80) ont montré sur cinq lignées cancéreuses qu'il n'existait pas de corrélation entre le marqueur pH2AX et une radiosensibilité de la tumeur déterminée par la survie clonogénique à 2 Gy (SF2). Cependant, leur étude ne prend pas en compte le nombre de foci de pH2AX réel (normalisation des résultats) et elle se base uniquement sur la SF2. De la même façon, Koch et al. (« Residual yH2AX foci predict local tumour control after radiotherapy", Radiotherapy and Oncology, 2013, 108. p. 434-9) ont proposé un modèle basé sur la corrélation entre le nombre de foci de pH2AX normalisés et la TCD50. Cependant cette étude a été menée sur des xénogreffes ce qui ne reflète pas la réalité physiologique de la tumeur. La demande de brevet EP 2 466 310 A1 (Helmholtz Zentrum Munchen) décrit la réparation de ruptures de l'ADN de type double brin en présence de la forme phosphorylée de l'histone H2AX (appelée gamma-H2AX ou g-H2AX). Les demandes de brevet US 2008/234946 et US 2012/041908 (University of South Florida et al.) décrivent une méthode pour la prédiction de la radiosensibilité de cellules cancéreuses, et non pas de cellules saines ; elle est en plus basée sur des données génomiques et non des tests fonctionnels.
La demande de brevet WO2014/154854 (Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier) décrit une méthode pour la prédiction de la radiosensibilité d'un sujet via l'utilisation d'au moins un biomarqueur de radiosensibilité. Cette méthode ne détecte pas des marqueurs directement reliés à l'endommagement ou à la réparation de l'ADN ; elle est en plus basée sur des données protéomiques. De plus, cette demande de brevet ne décrit pas de relation quantitative entre les données radiobiologiques et la sévérité des réactions tissulaires.
La demande de brevet WO 2013/187973 (University of California) décrit des systèmes et des méthodes de détermination de la radiosensibilité de cellules et/ou d'un sujet au regard d'une population contrôle. Plus particulièrement cette méthode inclut l'irradiation d'un échantillon biologique, la détection et la quantification de foci radioinduits au sein de cellules erythrocytes, lymphocytes ou de cellules primaires, résultant d'un prélèvement sanguin via l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs de détection parmi un ensemble de marqueurs dont l'anti-pH2AX, l'anti-MRE1 1 et l'anti-ATM. La quantification des foci radioinduits à différents temps d'observation post-irradiation inférieurs à 2 h permet de déterminer leur cinétique de réparation qui est corrélée de manière empirique à la radiosensibilité du sujet. Toutefois, l'analyse des foci dans des cellules de type lymphocyte est très difficile du fait de leur petit noyau. De plus, cette méthode ne permet cependant pas au praticien de prendre des décisions quant au traitement du patient.
La demande de brevet WO 2010/88650 (University of Texas) décrit des méthodes et compositions pour identifier les cellules cancéreuses qui sont soit sensibles soit résistantes à un traitement de radiothérapie particulier ; elle n'est donc pas applicable à tout traitement radiothérapeutique.
La demande de brevet WO 2010/109357 décrit un procédé et un appareil pour la planification de protocole de radiothérapie adaptative basée sur l'optimisation de la probabilité de complication des tissus normaux et la probabilité de contrôle tumoral selon des marqueurs spécifiques à chaque patient. Les valeurs des marqueurs associées à des tissus normaux comprennent des valeurs de tests in vitro, les signatures par spectrométrie de masse des protéines, des données de l'anamnèse et les antécédents du patient. Les valeurs d'essai in vitro peuvent être d'origine cellulaire, protéomique et génétique tel que, mais sans s'y limiter, divers comptages de cellules, HB, CRP, PSA, TNF-alpha, ferritine, transferrine, LDH, IL-6, l'hepcidine, créatinine, glucose, HbAlc, et la longueur des télomères. Les marqueurs de l'anamnèse et des antécédents du patient incluent la chirurgie abdominale antérieure, les médicaments hormonaux ou de anticoagulants, le diabète, l'âge, et les mesures liées à la croissance tumorale. Les biomarqueurs non liés à la radiotoxicité sont également envisagés, tels que les biomarqueurs associés à diverses formes d'ablation. Toutefois, la radiosensibilité individuelle n'y est pas prise en compte.
Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate que les brevets décrits ci-dessus ne décrivent pas une méthode de quantification de la sensibilité tumorale à un traitement cassant l'ADN permettant d'évaluer quantitativement l'efficacité d'un traitement anti-cancer, qui puisse être employé pour tout patient et tout type de traitement susceptible d'induire des CDB, et notamment pour tout type de rayonnement ionisant. Le problème de fournir une méthode prédictive de la sensibilité des tumeurs et de prévoir le contrôle tumoral quel que soit les paramètres cliniques utilisés reste donc sans solution opérationnelle. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive de la sensibilité tumorale à un traitement cassant l'ADN.
Objet de l'invention
Les inventeurs ont trouvé une corrélation entre la survie cellulaire à une dose D et un fractionnement de dose d et le nombre de foci de pH2AX soit :
n xNH2AX(d,24h)
+βάϋ)
SF(d, D) = e Θ OÙ :
NH2AX représente le nombre de foc\ de pH2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation,
Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin),
D est la dose en Gy, d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions, β : paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral, sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustements décimaux ou entiers, de préférence des paramètres d'ajustements décimaux correspondant à l'arrondi arithmétique de la valeur obtenue par calcul, de préférence, à deux chiffres significatifs après la virgule, plus préférentiellement à trois chiffres significatifs après la virgule, encore plus préférentiellement à quatre chiffres significatifs après la virgule.
Sur la base de ce constat, les inventeurs ont trouvé des corrélations entre des paramètres cliniques et certains paramètres moléculaires et/ou cellulaires
Pour le paramètre TCD95 :
1 ) En fonction du nombre de cellules survivantes :
N(2Gy)
TCD95 = A x + B
N0
ou
A est une constante entière ou décimale comprise entre 130 Gy et 160 Gy,
B est une constante entière ou décimale comprise entre 5 Gy et 15 Gy.
De préférence, le paramètre TCD95 est déterminé selon la formule suivante :
NCZGy)
TCD95 = 142.8 X— -—— + 8.57
N0
2) En fonction du nombre de foci pH2AX (ce nombre étant appelé NH2AX) ou
A est une constante entière ou décimale comprise entre 130 Gy et 160 Gy, B est une constante entière ou décimale comprise entre 5 Gy et 15 Gy. De préférence, le paramètre TCD95 est déterminé selon la formule suivante :
(NH2AX{2Gy,24h)
TCD = 142.8 X e c θ + 8.57 sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus.
Pour le paramètre TCP :
1 ) En fonction du nombre de cellules survivantes après traitement avec une dose D :
7TP( ) = e~N^ sachant que cette corrélation est déduite de la corrélation connue suivante (Zaider and Minerbo, « Tumour control probability: a formulation applicable to any temporal protocol of dose delivery », Phys Med Biol. 2000 Feb;45(2):279-93j:
TCP(D) = e -*oSF(D)
2) En fonction du nombre de foci pH2AX (ce nombre étant appelé NH2AX)
fn xNH2AX{d,2Ah)
( '+βάθ)
TCP(D) = e~N°xe sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus. Les inventeurs ont constaté que ces paramètres de la TCD95 et de la TCP tels que déterminés selon l'invention donnent certes une description prédictive plus précise que les méthodes selon l'état de la technique, mais que la description prédictive sur la base des paramètres cellulaires et/ou moléculaires peut être améliorée de manière significative si l'on caractérise la sensibilité de la tumeur en réponse à un traitement cassant l'ADN par l'évaluation de la fraction cellulaire survivante à une dose D et un fractionnement de dose d, ou par le volume de la tumeur. Ce mode de réalisation présente aussi l'avantage que :
La SF(d,D) peut être aisément déterminée à partir du nombre de foci de pH2AX le volume étant un facteur géométrique, il peut être corrélé à tous les autres critères cliniques utilisés par les praticiens selon l'état de la technique pour décrire l'état et l'évolution d'une tumeur, tel que le critère RECIST, mentionné ci-dessus. Pour la fraction cellulaire survivante à une dose D
Les inventeurs ont également trouvé une corrélation entre le nombre de foci pH2AX et la survie cellulaire. Pour une dose de 2Gy, la survie cellulaire est :
fNH2AX(2Gy,24h)
ou pour une dose D et un fractionnement de dose d:
SF(d, D) = e"( θ +^dZ ) où :
NH2AX représente le nombre de foci de pH2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation, Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin),
D est la dose en Gy, d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions, β représente le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus.
Pour le volume de la tumeur :
1 ) En fonction de la survie :
V0
V{D) = \ + e -a.W0 (SF(D)-SF(D50)) sachant que V(D) exprime le volume de la tumeur qui survit à une dose D.
En fonction du nombre de cellules survivantes :
V0
17(D) + e -a(N(D)-N(D50))
3) En fonction du nombre de foci pH2AX
Dans ces formules reliées au volume de la tumeur: No représente le nombre de cellules tumorales initiales,
Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin),
D50 est la dose pour laquelle on trouve éduction du volume de la tumeur de 50%, n50 est le nombre de fractions pour lequel on trouve réduction du volume de la tumeur de 50%, a est une constante de variation du volume par nombre de cassures, β est un paramètre (en Gy"2) du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus. De plus cette fraction survivante à une dose D (fractionnée en n doses d) est proportionnelle au rapport d'intensités des signaux recueillis par imagerie avant et après le traitement par radiothérapie selon la formule :
où
If est l'intensité du signal dans le volume traité à la fin du traitement, I, est l'intensité du signal dans le volume traité avant le traitement, C est une constante de proportionnalité.
Toutes ces corrélations selon l'invention peuvent être utilisées pour une dose de rayonnement ionisant. Dans un mode de réalisation la dose d est la dose par fraction du traitement radiothérapeutique (typiquement 2 Gy) et D est la dose totale du traitement radiothérapique administré.
Ainsi, l'objet de la présente invention est un procédé d'évaluation de la réponse d'une tumeur à un traitement cassant l'ADN à partir d'un prélèvement de cellules de ladite tumeur (de préférence par biopsie), dans lequel : (a) on prépare un échantillon cellulaire à partir des cellules prélevées sur ladite tumeur ;
(b) on soumet ledit échantillon cellulaire à un traitement cassant l'ADN caractérisé par une dose D ; (c) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec un marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t)), lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état avant administration de ladite dose D) et au moins un temps d'observation sélectionné parmi t = t1 , t2, t3 et t4 après administration de ladite dose absorbée D;
(d) on détermine au moins un paramètre ou score permettant de caractériser la réponse de l'échantillon audit traitement cassant l'ADN, en utilisant au moins les nombres moyens NpH2Ax(t), et dans lequel procédé
• t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être dans ce cas être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ;
• t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ;
• t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1 , mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ;
• t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes. Ledit traitement cassant l'ADN est une irradiation avec un rayonnement ionisant. Ladite tumeur peut être une tumeur solide ou liquide. Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention on détermine les nombres moyens NpH2Ax(t) à t= tO, t1 , t2, t3 et t4.
Dans un autre mode de réalisation on détermine comme paramètre ou score de la réponse de la tumeur à un traitement cassant l'ADN au moins un paramètre sélectionné dans le groupe formé par : la fraction cellulaire survivante après une dose D fractionnée en n doses d (SF(d,D)), le paramètre TCD50, le paramètre TCD95, le paramètre TCP, le volume de la tumeur.
Dans le cas où ledit traitement cassant l'ADN est un rayonnement ionisant, on établit avantageusement le paramètre TCD95 à partir du nombre de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
NCZGy)
TCD95 = A x——— + B
N0 où
N0 représente le nombre de cellules tumorales initiales,
N(2 Gy) représente le nombre de cellules survivantes à t4 après irradiation avec un rayonnement ionisant d'une dose de 2 Gy de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant comprise entre 0,5 Gt et 5 Gy, de préférence entre 1 Gy et 3 Gy, et encore plus préférentiellement de 2 Gy,
A est une constante entière ou décimale comprise entre 130 Gy et 160 Gy, B est une constante entière ou décimale comprise entre 5 Gy et 15 Gy.
Dans le cas où ledit traitement cassant l'ADN est un rayonnement ionisant, on établit avantageusement le paramètre TCD95 à partir du nombre de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
N ZGy)
TCD95 = 142.8 X— -—— + 8.57
N0 où N0 représente le nombre de cellules tumorales initiales, N(2 Gy) représente le nombre de cellules survivantes à t4 après irradiation avec un rayonnement ionisant d'une dose de 2 Gy de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant comprise entre 0,5 Gt et 5 Gy, de préférence entre 1 Gy et 3 Gy, et encore plus préférentiellement de 2 Gy. Dans le cas où ledit traitement cassant l'ADN est un rayonnement ionisant, on établit le paramètre TCD95 à partir du nombre de foci pH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
fNH2AX(2Gy,24h)
TCD9S = A x e { θ + μ + B où NH2Ax(2Gy,24h) représente le nombre de foc\ pH2AX au temps t4 après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy, Θ représente la tolérance de la cellule (exprimée en nombre de cassures double-brin), β représente le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral, A est une constante en Gy entière ou décimale comprise entre 130 Gy et 160 Gy, et B est une constante en Gy entière ou décimale comprise entre 5 Gy et 15 Gy.
Dans ce même cas, on peut établir le paramètre TCD95 à partir du nombre de foci pH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
fNH2AX(2Gy,24h)
TCD9S = 142.8 X e c θ + μ + 8.57 où NH2Ax(2Gy,24h) représente le nombre de foc\ pH2AX au temps t4 après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy, Θ représente la tolérance de la cellule (exprimée en nombre de cassures double-brin) et β le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus.
Dans ce même cas, on peut établir le paramètre TCP à partir du nombre de cellules survivantes après traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
TCP{D) = e ~N^ où N représente le nombre de cellules survivantes après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy.
Dans ce même cas on peut établir le paramètre TCP à partir du nombre de nombre de foci pH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D de traitement cassant l'ADN, de préférence par la relation
où NH2Ax(d, 24h) représente le nombre de foci de pH2AX dans les cellules survivantes au temps t4 après une dose d de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy. sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus. Dans un mode de réalisation on établit la survie des cellules de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D fractionnée en n doses d de préférence par la relation :
SF(d, D) = e"( θ +^dZ ) où : NH2AX représente le nombre de foci de pH2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation, Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin),
D est la dose en Gy, d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions,
β est le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. On peut établir la proportionnalité de ladite fraction cellulaire survivante après une dose D fractionnée en n doses d avec le rapport d'intensités des signaux recueillis par imagerie avant et après le traitement par radiothérapie selon la formule :
— - = c x SF{d, D) = c x e y θ J
' i
où :
If est l'intensité du signal dans le volume traité à la fin du traitement, I, est l'intensité du signal dans le volume traité avant le traitement,
C est une constante de proportionnalité.
Dans un mode de réalisation avantageux on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D (ce volume étant exprimé par le paramètre V(D)) à partir de la survie des cellules de la tumeur, de préférence par la relation V(D^ ~ 1 + e -a. V0(SF(D)-SF(D50)) ou :
- N est de nombre de cellules survivantes après une irradiation avec une dose D,
- V0 est le volume initial de la tumeur,
- SF(D) est la fraction de cellules survivantes à une dose D, - a est la constante de variation du volume par nombre de cassures de l'ADN,
- D50 est la dose en Gy pour laquelle il est observé une réduction de 50% du volume de la tumeur.
Dans un autre mode de réalisation avantageux on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D (ce volume étant exprimé par le paramètre V(D)) à partir du nombre de cellules survivantes, de préférence par la relation ( ) _ 1 + e -a(N(D)-N(D50)) où :
- N est de nombre de cellules survivantes après une irradiation avec une dose D,
- V0 est le volume initial de la tumeur,
- N(D) est le nombre de cellules survivantes à une dose D, - a est la constante de variation du volume par nombre de cassures de l'ADN,
- D50 est la dose en Gy pour laquelle il est observé une réduction de 50% du volume de la tumeur.
Dans un autre mode de réalisation on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN à une dose D fractionnée en n doses d et ce à partir du nombre de foci pH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN, de préférence par la relation
où :
N0 représente le nombre de cellules tumorales initiales,
Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D50 est la dose pour laquelle on trouve une réduction du volume de la tumeur de 50%, n50 est le nombre de fractions pour lequel on trouve une réduction du volume de la tumeur de 50% a est une constante de variation du volume par nombre de cassures, β représente le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral, sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus.
Description des figures La figure 1 représente l'évolution de la survie cellulaire pour une irradiation par une dose unique (cf. figure 1A) et l'évolution de la survie cellulaire pour une irradiation par une dose totale D divisée en n fractions d'une dose d (cf. figure 1 B): La figure 1 montre qu'une irradiation en une seule dose est bien plus létale au niveau cellulaire qu'une irradiation fractionnée pour une même dose totale du traitement. Ce genre de fractionnement, bien qu'il diminue l'efficacité du traitement au niveau de la tumeur, permet de réduire les effets secondaires liés à la radiothérapie
La figure 2 représente l'évolution de la fraction de survie cellulaire à une dose unique de 2 Gy (SF2 (%)) en fonction du nombre de foci pH2AX acquis par cellule, après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy. Chaque point correspond à l'évolution de la survie cellulaire à 2 Gy en fonction du nombre de foci pH2AX acquis par cellule, après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy pour une lignée cellulaire. Une simulation selon l'invention reliant la SF2(%) au nombre de foci pH2AX acquis par cellule, après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy est représentée en pointillée sur la figure 2.
Description détaillée
Dans le cadre de la présente invention, le traitement cassant l'ADN est quantifié par sa dose D. Dans le cas où ledit traitement cassant l'ADN est un rayonnement ionisant (radiothérapie), ladite dose D correspond à la dose absorbée dudit rayonnement ionisant (couramment exprimée en Gy). Nous décrivons ici un mode de réalisation avec plusieurs variantes qui convient pour un patient humain.
1 . Préparation de l'essai
Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prélevées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que les opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire. Puis, l'opérateur prélève au patient un échantillon de tumeur. L'échantillon cellulaire est placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau foetal stérile. L'échantillon est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante.
L'étape suivante représente l'isolation et /ou l'amplification du tissu prélevé.
Dans un mode de réalisation, dès réception, l'échantillon cellulaire (typiquement la biopsie) est établie sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable, de manière très préférée via une culture sélective par cytométrie de flux ou via l'utilisation de milieux de culture sélectifs et ce, sans agent de transformation virale ou chimique suivant une procédure ancillaire et bien connue modulable en fonction du type de tumeur (Krônig et al, « Cell type spécifie gene expression analysis of prostate needle biopsies résolves tumor tissue heterogeneity » Oncotarget. 2015 Jan 20;6(2):1302-14; Hristozova et al, « A simple multicolor flow cytometry protocol for détection and molecular characterization of circulating tumor cells in epithelial cancers » Cytometry A. 2012 Jun;81 (6):489-95. doi: 10.1002/cyto.a.22041. Epub 2012 Mar 21 .; Wang et al, « Identification and characterization of cells with cancer stem cell properties in human primary lung cancer cell Unes » PLoS One. 2013;8(3):2013 Mar 4.). Dès que le nombre de cellules est suffisant (1 - 3 semaines), Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Une partie de ces lamelles sont irradiées sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D (par exemple 2 Gy). Une autre partie n'est pas irradiée ; elle représente l'état spontané (dose absorbée 0 Gy).
L'irradiation peut être effectuée par exemple avec un accélérateur médical qui délivre des photons de 6 MV avec un débit de dose absorbée de 3 Gy min"1. Après l'irradiation et pour subir les temps de réparation mentionnés ci-dessous, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C. Pour les cellules irradiées, on acquiert des caractéristiques correspondant à l'état radio- induit après plusieurs temps de réparation (temps de réparation post-irradiation). On acquiert de préférence au moins deux et encore plus préférentiellement au moins trois points, à savoir : t1 , t2, t3 et t4. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX.
Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (voir la publication citée de Bodgi et al.), peut être utilisée : les cellules ont été fixés dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCI2, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule i-Oct- C6H4-(OCH2CH2)xOH avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1 , fourni par Sigma AIdrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma AIdrich) et a été suivi par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souris ou TRITC anti-lapin (1 :100, fournis par Sigma AIdrich) ont été effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du Vectashield™ contenant du DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole) pour marquer le noyau. La coloration avec du DAPI permet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase Gi (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase G2 (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles).
L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en G0/Gi pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles.
Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, au plus 3 séries d'expériences (irradiation) indépendantes sont effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est calculée. 2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques
2.1 Généralités et marqueurs utilisés L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour le marqueur pH2AX sur des cellules non-irradiées (état spontané) et irradiées (état radioinduit). La méthode est basée sur l'étude cinétique du marquage par ce marqueur en fonction de la durée de réparation : on marque les échantillons après un laps de temps déterminé à compter de l'arrêt de l'irradiation, et on étudie leur immunofluorescence. On peut mesurer les courbes cinétiques complètes, par exemple représentées par 5 points se situant avantageusement à tO, t1 (de préférence 10 minutes), t2 (de préférence 1 h), t3 (de préférence 4h) et t4 (de préférence 24h), sachant que tO correspond à l'état avant irradiation (état spontané). Mais la demanderesse s'est rendue compte que certains points (correspondant à certains temps de réparation) sont plus importants que d'autres, et que certains points ne sont pas prédictifs. Grâce à la sélection judicieuse des paramètres déterminés à des temps donnés, on peut ainsi diminuer le nombre de mesures et donc diminuer le coût global du diagnostic, sans diminuer le pouvoir prédictif de la méthode.
Les moyennes de chaque point et chaque dose avec chaque marqueurs sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (appelé « SEM ») vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type « standard error SE »). (i) pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures double-brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaire et seuls le nombre et la taille des foci seront analysés.
La contre-coloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation nucléaire.
2.2 Paramètres biologiques
On définit et détermine comme indiqué : - NPH2Ax(t), le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX, aux temps d'observations tO (non irradié) ou t1 , t2, t3, t4 après irradiation (dose absorbée: 2 Gy), sachant que la détermination du paramètre NpH2Ax(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention;
2.3 Evaluation prédictive
Elle vise la prédiction de paramètres cliniques ou radiothérapiques à partir des données biologiques mesurées. Plusieurs niveaux de diagnostic sont proposés :
A) Un diagnostic quantitatif directement issu de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques
Elle vise la prédiction de paramètres cliniques ou radiothérapiques à partir des données biologiques mesurées. Plusieurs niveaux de diagnostic sont proposés :
Le paramètre TCD95
■NH2AX(2Gy,24h)
■+4β)
TCD9S = 142.8 X e Θ + 8.57
Pour le paramètre TCP :
Pour la fraction cellulaire survivante à une dose D et à un fractionnement de dose d:
n xNH2AX(d,24h)
SF(d, D) = e"( ë +^ ou :
NH2AX représente le nombre de foci de pH2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation, Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin),
D est la dose en Gy, d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions, β représente le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral. sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus. De plus cette fraction survivante à une dose D (fractionnée en n doses d) est
proportionnelle au rapport d'intensités des signaux recueillis par imagerie avant et après le traitement par radiothérapie selon la formule :
où :
If est l'intensité du signal dans le volume traité à la fin du traitement, li est l'intensité du signal dans le volume traité avant le traitement, C est une constante de proportionnalité. sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus.
- Pour le volume de la tumeur :
Dans ces formules reliées au volume de la tumeur:
N0 représente le nombre de cellules tumorales initiales,
Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D50 est la dose pour laquelle on trouve éduction du volume de la tumeur de 50%, n50 est le nombre de fractions pour lequel on trouve réduction du volume de la tumeur de 50%, a est une constante de variation du volume par nombre de cassures, β représente le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral, sachant que Θ et β sont des paramètres d'ajustement comme expliqué ci-dessus.
B) un diagnostic plus qualitatif, influencé par le diagnostic quantitatif mais qui tient compte d'éventuels éléments cliniques portés à la connaissance du praticien. 2.5 Les niveaux et méthodes d'analyse
Dans un premier mode de réalisation, on utilise tout ou partie des valeurs NPH2Ax(t) déterminées dans un algorithme conduisant à un paramètre ou score permettant de caractériser la réponse de l'échantillon à ladite dose D dudit traitement cassant l'ADN. Dans un deuxième mode de réalisation, on tient compte du constat que certaines valeurs ne sont pas prédictifs pour aucun score : tel est le cas par exemple des points NpH2Ax(t3). C'est pourquoi on peut envisager une analyse restreinte où seulement les points tO, t1 , t2 et t4 sont utilisés parmi les valeurs NpH2Ax(t) déterminées.
Exemple : Validation de l'équation selon l'invention permettant de déterminer la fraction de survie à 2 Gy en fonction du nombre de foci pH2AX
Les lignées cellulaires présentées dans le tableau 1 ont été amplifiés suivant les préconisations du fournisseur (SIGMA-ALDRICH) jusqu'à obtention du nombre de cellules souhaité. Après obtention d'un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d'une à 3 semaines), les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules ont été ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Ces lamelles ont été irradiées sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D de 2 Gy. L'irradiation a été effectuée avec un accélérateur médical qui délivre des photons de 6 MV avec un débit de dose absorbée de 3 Gy min"1. Après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy, les cellules ont été conservées dans l'incubateur de culture à 37°C. Les échantillons ont ensuite été marqués après 24h de réparation post-irradiation, à savoir : 24h (t4) à compter de l'arrêt de l'irradiation, et on a acquis le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX après 24h de réparation post-irradiation (cf. tableau 1 ).
Les cellules ayant subi l'irradiation ont ensuite été fixées, lysées et hybridées sur des lamelles de verre. Les cellules ont été fixées dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgCI2, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1 , fourni par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additionné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma Aldrich) et a été suivie par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800, les autres anticorps primaires à 1 :100. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souri ou TRITC anti-lapin (1 :100, fournis par Sigma Aldrich) ont été effectuées à 37°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes.
L'acquisition des résultats (nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX) a été effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus). La lecture a été réalisée de manière directe par comptage des foci obtenus avec le marqueur pH2AX sur au moins 50 cellules en G0/Gi pour chaque point et par logiciel d'analyse d'image dédié (imageJ).
Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, 3 séries d'expériences indépendantes ont été effectuées. La moyenne et les erreurs écart-types de la moyenne (« SEM » ou o) de chacun des nombres de foci acquis après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy a été calculé et présenté dans le tableau 1 .
La SF2(%) a été déterminée expérimentalement en réalisant une expérience de survie clonogénique à une dose de 2 Gy utilisant des lignées de cellules adhérentes. Ces expérimentations se sont déroulées selon une procédure en quatre phases bien connue de l'homme du métier:
1 ) le traitement de la monocouche de cellules dans des flacons de culture tissulaire,
2) la préparation des suspensions cellulaires simples et ensemencement d'un nombre approprié de cellules dans des boîtes de Pétri,
3) l'irradiation à une dose D=2 Gy de ces cellules, et 4) la fixation et la coloration des colonies après une période d'incubation appropriée, qui peut varier de 1 -3 semaines, en fonction de la lignée cellulaire. Le nombre de cellules survivantes a été exprimé en % de survie.
Le nombre de foci pH2AX après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy et de la fraction de survie à 2 Gy obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci-après, pour plusieurs lignées cellulaires tumorales.
Tableau 1 Détection du nombre de foci pH2AX (NH2AX) après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy et de la fraction de survie à 2 Gy pour plusieurs lignées cellulaires tumorales
Lignée cellulaire Nature de la tumeur SF2(%) NH2AX(24 h)
HT29 colorectal carcinoma 74 ±2 7 ±2
Be11 melanoma 73 ± 1 3± 1
SaOS2 osteosarcoma 73 ±2 3± 1
MCF7 breast carcinoma 68 ±2 6 ±2
M059K glioblastoma 65 ±2 10 ±2
U20S osteosarcoma 63 ±3 9±3
Hela cervix carcinoma 60 ±3 12 ±2
RT112 bladder carcinoma 60 ±4 12 ±2
HRT18 colorectal carcinoma 54 ±5 10 ±2
Ma11 melanoma 52 ±2 6 ±2
IGROV ovarian carcinoma 52 ±4 11 ±3
Na11 melanoma 51 ±4 5±4
2180 nephroblastoma 33 ±4 15±4
SW48 colorectal carcinoma 22 ±6 27 ±3
HCC1937 ductal carcinoma 22 ±3 11 ±2
Hx142 bladder carcinoma 18 ±4 14 ±3
CAPAN-1 ovarian carcinoma 10 ± 3 22 ±5
M059J glioblastoma 6±5 29 ±5
L'ensemble des données présentées dans le tableau 1 a permis de déterminer les paramètres β et 1/Θ de l'équation
(NH2AX(2Gy,24h)
SF{2Gy) = e"( θ +4« L'évolution de la fraction de survie cellulaire à 2 Gy (SF2 (%)) en fonction du nombre de foci pH2AX acquis par cellule (données du tableau 1 ), après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy a été représentée en figure 2. Chaque point correspond à l'évolution de la survie cellulaire à 2 Gy en fonction du nombre de foci pH2AX acquis par cellule, après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy pour une lignée cellulaire. Une simulation reliant la SF2(%) au nombre de foci pH2AX acquis par cellule, après 24h de temps de réparation après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy a été réalisée et est représentée en pointillée sur la figure 2. La fraction de survie pour ces lignées cellulaires tumorales a été simulée et exprimée en fonction de β et de 1/Θ.
SF2 = exp(-0.0619*NH2AX(24h)-0.1 1 1 ) avec R = 0.82 où β= 0.1 1 1/4 = 0.0277 et 1/Θ = 0.0619
Le calcul des valeurs de de β et de 1/Θ via la formule de la SF2 permet d'obtenir des résultats cohérents (ces deux valeurs numériques correspondent bien aux valeurs moyennes de β et de 1/Θ attendues pour des tumeurs qui sont en majorité des groupes II) qui illustrent les différentes radiosensibilités des tumeurs.

Claims

REVENDICATIONS
Procédé d'évaluation de la réponse d'une tumeur à un traitement cassant l'ADN à partir d'un prélèvement de cellules de ladite tumeur (de préférence par biopsie), dans lequel :
(a) On prépare un échantillon cellulaire à partir des cellules prélevées sur ladite tumeur ;
(b) On soumet ledit échantillon cellulaire à un traitement cassant l'ADN caractérisé par une dose D,
(c) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec un marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelé respectivement NpH2Ax(t)), lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état avant administration de ladite dose D) et au moins un temps d'observation sélectionné parmi t = t1 , t2, t3 et t4 après administration de ladite dose D;
(d) on détermine au moins un paramètre ou score permettant de caractériser la réponse de l'échantillon audit traitement cassant l'ADN, en utilisant au moins les nombres moyens NpH2Ax(t), et dans lequel procédé
• t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être dans ce cas être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ;
• t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ;
• t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1 , mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ;
• t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préférentiellement à environ 10 minutes.
Procédé selon la revendication 1 , dans lequel ledit traitement cassant l'ADN est une irradiation avec un rayonnement ionisant.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel ladite tumeur est une tumeur solide ou liquide.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel on détermine les nombres moyens NpH2Ax(t) à t= tO, t1 , t2, t3 et t4.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel on détermine comme paramètre ou score de la réponse de la tumeur à un traitement cassant l'ADN au moins un paramètre sélectionné dans le groupe formé par : la fraction cellulaire survivante après une dose D fractionnée en n doses d (SF(d,D)), le paramètre TCD50, le paramètre TCD95, le paramètre TCP, le volume de la tumeur.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel on établit le paramètre TCD95 à partir du nombre de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
NCZGy)
TCD95 = A x——— + B
N0 où
N0 représente le nombre de cellules tumorales initiales,
N(2 Gy) représente le nombre de cellules survivantes à t4 après irradiation avec un rayonnement ionisant d'une dose de 2 Gy de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant comprise entre 0,5 Gt et 5 Gy, de préférence entre 1 Gy et 3 Gy, et encore plus préférentiellement de 2 Gy, A est une constante entière ou décimale comprise entre 130 Gy et 160 Gy, B est une constante entière ou décimale comprise entre 5 Gy et 15 Gy.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, dans lequel on établit le paramètre TCD95 à partir du nombre de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
NCZGy)
TCD95 = 142.8 X— -—— + 8.57
N0 où N0 représente le nombre de cellules tumorales initiales,
N(2 Gy) représente le nombre de cellules survivantes à t4 après irradiation avec un rayonnement ionisant d'une dose de 2 Gy de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant comprise entre 0,5 Gt et 5 Gy, de préférence entre 1 Gy et 3 Gy, et encore plus préférentiellement de 2 Gy.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, dans lequel on établit le paramètre TCD95 à partir du nombre de foci pH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
(NH2AX(2Gy,24h
TCD = A X e c θ + μ + B où NH2Ax(2Gy,24h) représente le nombre de foci pH2AX au temps t4 après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy, Θ représente la tolérance de la cellule (exprimée en nombre de cassures double-brin), β représente le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral, A est une constante en Gy entière ou décimale comprise entre 130 Gy et 160 Gy, et B est une constante en Gy entière ou décimale comprise entre 5 Gy et 15 Gy.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 ou 8, dans lequel on établit le paramètre TCD95 à partir du nombre de foci pH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
fNH2AX(2Gy,24h)
TCD9S = 142.8 X e c θ + μ + 8.57 où NH2Ax(2Gy,24h) représente le nombre de foc\ pH2AX au temps t4 après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy, Θ représente la tolérance de la cellule (exprimée en nombre de cassures double-brin) et β le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, dans lequel on établit le paramètre TCP à partir du nombre de cellules survivantes après traitement cassant l'ADN avec une dose D, de préférence par la relation
TCP{D) = e~N^ où N représente le nombre de cellules survivantes après une dose D de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy. 1 1 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 10 dans lequel on établit le paramètre TCP à partir du nombre de nombre de foci pH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN avec une dose D de traitement cassant l'ADN, de préférence par la relation
n xNH2 AX(d,24V
TCP(D) = e~N°xe θ où NH2Ax(d, 24h) représente le nombre de foci de pH2AX dans les cellules survivantes au temps t4 après une dose d de traitement cassant l'ADN, ladite dose étant de préférence une dose de rayonnement ionisant de 2 Gy.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , dans lequel on établit la survie des cellules de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D fractionnée en n doses d de préférence par la relation :
SF(d, D) = e"( θ +^dZ ) où : NH2AX représente le nombre de foci de pH2AX dans cellules tumorales survivantes à 24h post-irradiation,
Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin), D est la dose en Gy d est la dose en Gy par fraction, n est le nombre de fractions, β est le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 12, dans lequel on établit la proportionnalité de ladite fraction cellulaire survivante après une dose D fractionnée en n doses d avec le rapport d'intensités des signaux recueillis par imagerie avant et après le traitement par radiothérapie, de préférence selon la formule :
— L = c x SF{d, D) = c x e y θ J où :
If est l'intensité du signal dans le volume traité à la fin du traitement li est l'intensité du signal dans le volume traité avant le traitement, C est une constante de proportionnalité.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 13, dans lequel on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D (ce volume étant exprimé par le paramètre V(D)) à partir de la survie des cellules de la tumeur, de préférence par la relation
V0
V(D) = 1 _|_ e -a V0(SF(D)-SF(D50)) ou : - N est de nombre de cellules survivantes après une irradiation avec une dose D,
- V0 est le volume initial de la tumeur,
- SF(D) est la fraction de cellules survivantes à une dose D,
- a est la constante de variation du volume par nombre de cassures de l'ADN,
- D50 est la dose en Gy pour laquelle il est observé une réduction de 50% du volume de la tumeur.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 14, dans lequel on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN avec une dose D (ce volume étant exprimé par le paramètre V(D)) à partir du nombre de cellules survivantes, de préférence par la relation ( ) _ 1 + e -a(N(D)-N(D50)) où :
- N est de nombre de cellules survivantes après une irradiation avec une dose D, - V0 est le volume initial de la tumeur,
- N(D) est le nombre de cellules survivantes à une dose D,
- a est la constante de variation du volume par nombre de cassures de l'ADN,
- D50 est la dose en Gy pour laquelle il est observé une réduction de 50% du volume de la tumeur.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 15, dans lequel on établit le volume de la tumeur après un traitement cassant l'ADN à une dose D fractionnée en n doses d et ce à partir du nombre de foci pH2AX de cellules survivantes au traitement cassant l'ADN, de préférence par la relation
OÙ :
N0 représente le nombre de cellules tumorales initiales,
Θ représente la tolérance de la cellule (unité : nombre de cassures double-brin),
D50 est la dose pour laquelle on trouve une réduction du volume de la tumeur de 50%, n50 est le nombre de fractions pour lequel on trouve une réduction du volume de la tumeur de 50% a est une constante de variation du volume par nombre de cassures,
β représente le paramètre en Gy"2 du modèle linéaire quadratique relatif au type de tissu tumoral.
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