EP3319728B1 - Procédé de récupération de gouttes et système de récupération de gouttes associé - Google Patents

Procédé de récupération de gouttes et système de récupération de gouttes associé Download PDF

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EP3319728B1
EP3319728B1 EP16741562.9A EP16741562A EP3319728B1 EP 3319728 B1 EP3319728 B1 EP 3319728B1 EP 16741562 A EP16741562 A EP 16741562A EP 3319728 B1 EP3319728 B1 EP 3319728B1
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EP
European Patent Office
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fluid
pocket
zone
droplet
support
Prior art date
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EP16741562.9A
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German (de)
English (en)
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EP3319728A1 (fr
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Laurent Boitard
Nicolas Bremond
Jaïro GARNICA RODRIGUEZ
Jérôme Bibette
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville de Paris ESPCI
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Publication date
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    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Definitions

  • the method according to the invention makes it possible, for example, to form an emulsion drop by drop with a determined content or to reinject an emulsion, then to space the drops of the emulsion before isolating them one by one on a solid support.
  • the solid support is for example a 96, 386 or 1536 well plate, or a Petri dish or a MALDI plate.
  • An emulsion is a heterogeneous mixture of two immiscible liquids, in the form of drops from the first liquid to the second.
  • Gout microfluidics is used in a large number of laboratories to miniaturize biological and biochemical reactions in bioreactors from a few picoliters to a few nanoliters.
  • the sampling speeds, beyond 1000 drops analyzed per second and the reduction in the volume of the samples make this technology very attractive for the screening of molecules and cells.
  • a large number of modules have been developed to handle these micrometric drops: mixing and adding of compounds, fusion of drops, detection of fluorescent markers, incubation and selection of drops of interest.
  • FADS Fluorescence-activated droplets sorting
  • An emulsion of drops is injected into a sorting device, the drops of the emulsion are spaced apart with an injection of fluorinated oil without surfactant.
  • the drops are then sent to a sorting interface.
  • a measurement is carried out, all the drops having a signal above a detection threshold are collected in a same tube.
  • the method described above With the method described above, approximately one thousand mixed drops are collected together at the exit of the system, it is therefore necessary to carry out numerous subsequent steps to isolate the cells having the best arrangements for synthesizing the compound of interest.
  • the method described above can be used to recover only one drop, but this is difficult to implement due to the small volume of the drop to be handled and, moreover, in this case, the rest of the drops are lost or eliminated. .
  • the patent application WO2012042060 describes a system for producing and recovering drops.
  • the drops are generated at a compatible frequency synchronized with the speed of movement of the drop recovery element.
  • this system does not allow reinjection of an emulsion.
  • the separation of the drops requires a large amount of oil which makes them difficult to handling.
  • this system does not make it possible to add a reagent (lysis liquid for example) once the drop has formed.
  • An object of the invention is to provide a more reliable and more precise drop recovery process than existing processes, allowing individual monitoring of each drop and efficient recovery of its content.
  • the invention relates to a method according to claim 1.
  • the invention also relates to a droplet recovery system according to claim 12.
  • the droplet recovery system according to the invention may comprise one or more of the features of claims 13 to 15, taken alone or in any technically possible combination.
  • upstream and downstream and the terms “inlet” and “outlet” are used with reference to the normal direction of circulation of the fluids of the system.
  • longitudinal is defined with respect to the direction of the circulation conduit in the chip.
  • the planes which are perpendicular to the longitudinal direction are called “transverse plane”.
  • diameter designates the maximum extent of the element considered in a transverse plane.
  • the frequency of drops is called the number of drops per second passing in front of a fixed point in the circulation duct.
  • a first droplet recovery system 1 is shown on the figure 1 .
  • the first droplet recovery system 1 is provided for isolating and separately recovering the drops 4 from an emulsion 6.
  • An emulsion 6 of drops 4 is represented on the figure 2 .
  • the emulsion 6 consists of a plurality of drops 4 of an internal fluid 8 dispersed in an external fluid 10.
  • Emulsion 6 is substantially stable, this means that for a fixed volume of emulsion 6, the number and volume of drops 4 vary by less than 5% when the fixed volume of emulsion 6 is kept between -80 ° C and 80 ° C, at 1 bar for 48 h.
  • Emulsion 6 is concentrated. This means that the volume fraction of drops 4 in the emulsion 6 is between 30% and 40%. Each drop 4 constitutes a closed compartment filled with internal fluid 8.
  • the drops 4 of the emulsion 6 are preferably substantially monodisperse.
  • the drops 4 have, for example, a volume of between 2 pL and 2 ⁇ L.
  • At least some drops 4 of the emulsion 6 are different from other drops 4 of the emulsion 6.
  • Each drop 4 comprises an internal fluid 8 potentially different from one drop 4 to another.
  • the internal fluid 8 of all the drops 4 comprises at least one and the same common base 12.
  • the common base 12 is a buffer solution suitable for the survival of cells such as a phosphate buffered saline solution or a culture medium.
  • the internal fluid 8 of each drop 4 consists of own elements 14 to the drop 4 and of the common base 12.
  • the proportions of the clean elements 14 and of the common base 12 and / or the natures of the clean elements 14 vary from one drop 4 to another.
  • the proper elements 14 of a drop 4 are a cell and elements secreted by the cell, such as proteins.
  • more than 10% of the volume of the drop 4 consists of the common base 12.
  • each drop 4 is immiscible with the external fluid 10. It is understood by immiscible that the partition coefficient between the two fluids is less than 10 -3 .
  • the drops 4 are well defined in the emulsion 6 and the exchanges between two neighboring drops 4 in the emulsion 6 are limited to the compounds which are soluble or slightly soluble in the external fluid 10, that is to say with a partition coefficient greater than or equal to 10 -3 and in cases where the compositions are different between neighboring 4 drops.
  • the common base 12 is immiscible with the external fluid 8.
  • the internal fluid 8 is an aqueous phase and the external fluid 10 is an organic phase, in particular an oily phase.
  • the external fluid 10 comprises for example hydrofluoroethers such as FC-40 or HFE-7500, forming a fluorinated oil.
  • the external fluid 10 also advantageously comprises a surfactant.
  • the surfactant is able to stabilize the emulsion 6.
  • the surfactant is, for example, a block copolymer of polyethylene glycol and perfluoropolyether (PEG-PFPE).
  • PEG-PFPE perfluoropolyether
  • the concentration of surfactant in the external fluid 10 is between 2% and 5%.
  • the emulsion 6 is, for example, prepared by means of a preparation device and stored before being used in the first recovery system 1.
  • the first recovery system 1 is intended to recover the drops 4 of the emulsion 6 separately.
  • the first droplet recovery system 1 shown in the figure 1 , comprises a separation chip 20, a control unit 21 and a device 22 for injecting the emulsion 6 into the chip 20.
  • the first recovery system 1 comprises a device 24 for injecting carrier fluid 26 in the chip 20 to form a working fluid 28, a device 32 for injecting a separating fluid 33 into the chip 20 and a recovery support 34.
  • control unit 21 is capable of controlling the injection into the chip 20 of the separating fluid 33 by the device 32 of injecting the separating fluid 33 to separate the working fluid 28 into a plurality of successive pockets 35, capable of containing a drop 4, as illustrated in the figure 1 .
  • the first droplet recovery system 1 comprises a sensor 36 capable of detecting the passage of successive drops 4 of the emulsion 6 into the working fluid 28.
  • the first droplet recovery system 1 also comprises, an evacuation tube 38, an exit detector 40 and a device 42 for relative displacement of the support 34 relative to the chip 20.
  • the chip 20 comprises a fluid circulation conduit 46 successively defining in the direction of circulation of the fluids, an inlet zone 48, a zone 50 for spacing the drops advantageously having a measurement region 52, an injection zone 54 of separating fluid 33 and a separation zone 56.
  • the circulation duct 46 extends along a longitudinal axis X.
  • the chip 20 is, in the example, a rectangular block extended along the longitudinal axis X and a transverse axis Y perpendicular to the longitudinal axis X.
  • the chip has a thickness along an elevation axis Z perpendicular to the longitudinal axis X and the transverse axis Y.
  • the terms “lower” and “upper” are understood with respect to the elevation axis Z, perpendicular to the longitudinal axis X.
  • the direction of the elevation axis Z is for example substantially vertical .
  • the cross section, that is to say along a plane comprising the transverse axis Y and the elevation axis Z, of the circulation duct 46 is rectangular.
  • the circulation duct 46 is delimited by four side walls.
  • the cross section has other shapes.
  • the maximum area of the cross section of the duct 46 is less than 1 mm 2 .
  • the chip 20 is transparent at least in the measurement region 52.
  • the chip 20 is made of transparent material, for example polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the material of the chip 20 is impermeable to the carrier fluid 26.
  • the material of the chip 20 is, moreover, impermeable to the separating fluid 33, for example when the separating fluid 33 is a liquid.
  • the chip 20 has a first entry 60 opening into the entry zone 48 of the circulation duct 46, at least a second entry 62 opening into the spacing zone 50 of the circulation duct 46 and at least a third entry 64 opening into the injection zone 54 of the circulation conduit 46.
  • the chip 20 has an outlet 66 through which the circulation conduit 46 opens into the evacuation tube 38.
  • the first inlet 60 is in fluid communication upstream with the emulsion injection device 22, as illustrated in the figure 1 .
  • the entry zone 48 of the circulation duct 46 extends from the first entry 60 to the spacing zone 50.
  • the shape of the circulation duct 46 in the entry area 48 is adapted to allow the injection of the emulsion 6 into the entry area 48 and the passage of one drop 4 at a time to the spacing area 48.
  • the circulation duct 46 in the inlet zone 48 has a first portion 68 and a second portion forming a converging point 70.
  • the first portion 68 has a constant diameter along the longitudinal axis X.
  • the second portion 70 opens into the spacing zone of the circulation duct. It allows the passage of one drop 4 at a time towards the spacing zone 48.
  • the second portion 70 has a point shape converging in the direction of circulation of the fluids along a plane comprising the longitudinal axis X and the transverse axis Y.
  • the angle of the converging tip 70 is adapted to prevent the drops 4 from coalescing.
  • the opposite side walls of the circulation duct 46 at the level of the converging point 70 form an angle between them between 45 ° and 70 °.
  • the diameter of the first portion 68 is the maximum diameter of the converging tip 70.
  • the minimum diameter of the converging tip 70 is substantially equal to the average diameter of the drops 4.
  • the second inlet 62 is in fluid communication upstream with the carrier fluid injection device 26 as illustrated in the figure 1 .
  • the shape of the circulation duct 46 in the spacing zone 50 is adapted to allow the injection of the carrier fluid 26 between the drops 4 of the emulsion 6.
  • the circulation duct 46 comprises in the spacing zone 50, a junction 72 with the second inlet 62.
  • the junction 72 comprises at least one secondary channel 74 with an angle between 45 ° and 90 ° relative to the longitudinal axis X and opening into the circulation duct 46.
  • the junction 72 comprises two secondary channels 74 opening on either side of the circulation duct 46.
  • the circulation duct 46 has in the spacing zone 50 away from the junction 72, a cross section of diameter less than that of the first portion in the vicinity of the inlet 60, for example, substantially equal to 400% the diameter of means of the drops 4.
  • this diameter is equal to the minimum diameter of the converging tip 70.
  • the spacing zone 50 extends from the entry zone 48 to the injection zone 54.
  • the spacing zone 50 also has a measurement region 52 in which the drops 4 are detected by the sensor 36, as will be described below.
  • the dimension of this measurement region 52 is for example equal to the diameter of a drop 4.
  • the measurement region 52 extends along a transverse plane over a surface equal to the section of the circulation duct 46.
  • the length of the spacing zone 50 is preferably greater than 3 times the diameter of the circulation duct 46.
  • the third inlet 64 is in fluid communication upstream with the injection device 32 of separating fluid 33 as illustrated in the figure 1 .
  • the shape of the circulation duct 46 in the injection zone 54 is adapted to allow the injection of the separating fluid 33 between the drops 4 of the working fluid 28.
  • the circulation duct 46 comprises in the injection zone 54, a junction 76 with the third inlet 64.
  • the circulation conduit 46 in the separation zone 56 has a flared shape so that the dimension of the circulation conduit reaches the internal diameter of the evacuation tube 38.
  • the diameter of the circulation duct 46 is greater at the outlet from the separation zone 56 than in the spacing zone 50.
  • the circulation duct 46 has a maximum diameter in the separation zone of between 10 ⁇ m and 2 mm, advantageously greater than the diameter of the drop 4.
  • the control unit 21 is able to control the flow rates of the various fluids 6, 26, 28, 33, to receive the signals from the sensor 36 and from the output detector 40 and to record the characteristics of the drops 4.
  • the control unit 21 is capable of controlling the injection device 22 for an emulsion, the injection device 24 for the carrier fluid, the injection device 32 for the separating fluid.
  • the device 22 for injecting an emulsion is capable of injecting an emulsion 6 of drops 4 of an internal fluid 8 dispersed in an external fluid 10 in the inlet zone 48 by the first inlet 60.
  • the control unit 21 is capable of controlling the injection device 22 of the emulsion 6 so that it injects the emulsion 6 into the inlet zone 48 at a flow rate of between 1 ⁇ L / h and 500 ⁇ L / h and advantageously at a flow rate of 80 ⁇ L / h.
  • the device 22 for injecting an emulsion comprises for example a container in which is placed a volume of the emulsion 6 of between 1 nL and 2 mL.
  • the device 22 for injecting an emulsion further comprises a connection pipe making it possible to put the container and the first inlet 60 in fluid communication and a means for circulating the emulsion, as illustrated in FIG. figure 1 .
  • the emulsion injection device 22 includes a syringe driver, a syringe filled with emulsion 6 and a connection pipe.
  • the carrier fluid injection device 24 is capable of injecting the carrier fluid 26 into the spacing zone 50 through the second inlet 62 to form a working fluid 28 in the circulation duct 46.
  • the control unit 21 is capable of controlling the injection device 24 of the carrier fluid 26 so that it injects carrier fluid 26 into the spacing zone 50 through the second inlet 62 at a flow rate of between 5 ⁇ L / h and 5 mL / h and advantageously at a flow rate of 1 ml / h.
  • the injection rate of the carrier fluid 26 is for example adjusted so that the frequency of the drops 4 in the spacing zone 50 is for example between 0.5 drops per second and 500 drops per second and advantageously 30 drops per seconds.
  • the device 24 for injecting the carrier fluid 26 comprises for example a container in which is placed a volume of the carrier fluid 26 of between 10 ⁇ L and 10 mL.
  • the injection device 24 further comprises a connection pipe making it possible to put the container and the second inlet 62 in fluid communication and a means for circulating the carrier fluid 26.
  • the injection device 24 comprises for example a syringe pump, a syringe filled with carrier fluid 26 and a connection pipe.
  • the carrier fluid 26 is miscible with the external fluid 10.
  • the carrier fluid 26 used is the same as the external fluid 10, that is to say fluorinated oil HFE with the same surfactant with a concentration of between 0% and 0.5%.
  • the working fluid 28 comprises carrier fluid 26, external fluid 10 and drops 4 of the emulsion 6 spaced apart from one another along the circulation duct 48.
  • the control unit 21 is able to circulate the working fluid 28 in the circulation duct 46 downstream of the spacing zone 50.
  • the control unit 21 imposes a fixed flow rate for the working fluid 28 by controlling the flow rates of the injection device 22 of the emulsion 6 and of the injection device 24 of the carrier fluid 26.
  • the control unit 21 also controls the flow rate of the injection device 32 of the separating fluid 33.
  • the control unit 21 is capable of varying the flow rate of the delivery device injection 32 of the separating fluid 33 according to the presence or absence of a drop 6 detected by the sensor 36 in the spacing zone.
  • the sensor 36 is capable of detecting the passage of successive drops 4 of the emulsion 6 into the spacing zone 50.
  • the sensor 36 is capable of making a measurement within the drop 4.
  • the measurement is an optical measurement, like a fluorescence measurement.
  • the control unit 21 is able to store the information measured by the drop 4 by drop 4 sensor.
  • the measurement depends on the internal fluid 8 present in the drop 4.
  • the measurement makes it possible to determine the nature or the concentration of the clean element 14 with each drop 4.
  • the control unit 21 is capable of triggering the injection of separating fluid as a function of the measurement of the sensor 36.
  • the device 32 for injecting the separating fluid 33 is suitable for injecting the separating fluid 33 immiscible with the carrier fluid 26 in the injection zone 54 in order to separate the working fluid 28 into a plurality of successive pockets 35 comprising carrier fluid 26.
  • Each pocket 35 is isolated from the next pocket 35 by a separator 80 made up of separating fluid 33.
  • the separating fluid 33 is immiscible with the carrier fluid 26.
  • the separating fluid 33 is preferably a gas.
  • the separating fluid 33 is air.
  • the separator 80 is an air bubble.
  • each pocket 35 is greater than or equal to that of the circulation duct 46.
  • each separator 80 is greater than twice the volume of a drop 4.
  • the diameter of each separator 80 is greater than or equal to that of the circulation duct 46.
  • the diameter of each separator 80 is for example equal to the internal diameter of the evacuation tube 38.
  • the control unit 21 is able to circulate the pockets 35 and the separators 80, in the separation zone, towards the outlet 66 of the chip 20.
  • the support 34 comprises at least one compartment 82 suitable for receiving a pocket 35.
  • the support 34 is a Petri dish.
  • the support 34 comprises several compartments 82 separated from each other.
  • the support 34 is a 96-well plate, each well being a separate recovery compartment 82.
  • the support 34 is a 24-well or 384-well plate or the like.
  • the evacuation tube 38 has an inlet 84 and an outlet 86 and an internal lumen 87 opening through the inlet 84 and the outlet 86.
  • the internal lumen 87 extends in the extension of the circulation duct 46.
  • the inlet 84 of the evacuation tube 38 is tightly connected to the outlet 66 of the chip 20.
  • the outlet 86 of the evacuation tube 38 is suitable for being placed opposite the compartment 82, for the recovery of at least one pocket 35 comprising a drop 4 in the compartment 82.
  • the evacuation tube 38 is for example a Teflon capillary having an internal diameter advantageously greater than 0.1 mm.
  • the dimension of the evacuation tube 38 is adapted to the dimension of the pockets 35 desired.
  • the volume of the pockets 35 is greater than the volume of a drop of diameter equal to the inside diameter of the evacuation tube 38, so as to facilitate their visualization by the exit detector 40 and their deposit in the support 34.
  • the exit detector 40 is located downstream of the separation zone 56.
  • the exit detector 40 is capable of successively detecting each pocket 35 in the evacuation tube 38.
  • the outlet detector 40 is also advantageously capable of detecting the drops 4 in the evacuation tube 38.
  • the control unit 21 is able to control the movement of the support 34.
  • the displacement device 42 is a robotic stage.
  • the displacement device 42 is able to move the support 34 relative to the evacuation tube 38 and to the chip 20.
  • the plate is able to move the support 34 horizontally at a speed of between 0.5 mm.s -1 and 45 mm.s -1 .
  • control unit 21 is capable of controlling the displacement device 42 as a function of each detection of drops 4 by the sensor 36, so that a single pocket 35 comprising a drop 4 detected in the detection step is recovered in each compartment 82 of the support 34.
  • control unit 21 controls the displacement device 42 as a function of the signals detected by the output detector 40.
  • the detection of the drops 4 or pockets 35 by the exit detector 40 makes it possible to trigger the movement of the displacement device 42 in order to put a drop 4 per compartments 82.
  • the displacement device 42 is suitable for placing the outlet 86 of the evacuation tube 38 facing a different compartment 82 after each movement of the support 34 relative to the chip 20.
  • the first droplet recovery system 1 is provided.
  • the injection device 22 of the emulsion 6 is supplied with an emulsion 6 as previously described.
  • the emulsion 6 of drops 4 is injected into the entry area 48 of the chip 20 by means of the injection device 22 of the emulsion 6.
  • the emulsion 6 is circulated for example at a flow rate of 80 ⁇ L / h.
  • the drops 4 of the emulsion 6 arrive one by one in the spacing zone 50 due to the converging tip 70 of the entry zone 48.
  • the carrier fluid 26 is injected into the spacing zone 50 by means of the carrier fluid injection device 24 26 to form a working fluid in the circulation duct.
  • the carrier fluid 26 is circulated for example at a flow rate of 1 ml / h.
  • Each drop 4 is spaced from the other drops 4 by carrier fluid 26.
  • the distance between each drop 4 is, for example, greater than the inside diameter of the evacuation tube 38.
  • the distance between each drop 4 in the spacing zone 50 is sufficient to be able to inject separating fluid 33 between the drops 4 without disturbing the working fluid 28.
  • the working fluid 28 is conveyed into the circulation duct 46.
  • the drops 6 in the working fluid 28 are spaced and ordered along the circulation duct 46.
  • the drops 6 of the working fluid 28 pass one by one through the measurement region 52.
  • a step of detecting the passage of successive drops 6 in the measurement region 52 is implemented by the sensor 36.
  • the sensor 36 measures information relating to the drop 6.
  • the measurement is a fluorescence measurement representative of the clean element 14 of the drop 6.
  • the information collected is for example an enzymatic activity, a number of cells, a biomass or amount of protein produced in the drop.
  • the control unit 21 stores the number of the drop 6 and the information measured in order.
  • the drops 6 of the working fluid 28 pass one by one through the injection zone 54.
  • the control unit 21 triggers the injection of separating fluid 33 according to the measurement of the sensor 36, so that there is a separator 80 between each drop 4.
  • the separating fluid 33 is injected into the injection zone 54 by means of the separator fluid injection device 32.
  • the separating fluid 33 separates the working fluid 28 into a plurality of successive pockets 35.
  • the separating fluid 33 is injected between two successive drops 4 6 of the working fluid 28.
  • the injection of separating fluid 33 allows the formation of pockets 35 and separators 80.
  • Each separator 80 separates two successive pockets 35 of working fluid 28. It is immiscible with the pocket 35.
  • the pockets 35 are working fluid cavities 28 separated by the separator 80.
  • the pockets 35 mainly comprise carrier fluid 26.
  • At least one pocket 35 preferably, more than 100% of the pockets 35 additionally contain a drop 4 of 1 emulsion 6.
  • the volume of the pockets 35 is greater than the volume of a drop of diameter equal to the inside diameter of the evacuation tube 38.
  • the rate of injection of the separating fluid 33 by the device 32 for injecting the separating fluid 33 is adjusted by the control unit 21 so that each pocket 35 contains strictly less than two drops 4.
  • the adjustment is passive , the injection flow rate of the separating fluid 33 is constant.
  • Some pockets 35 are empty of drops 4 other pockets 35 include a drop 4 only.
  • the rate of injection of the separating fluid 33 by the device 32 for injecting the separating fluid 33 is adjusted in real time by the control unit 21 so that each pocket 35 contains exactly one drop 4 of the emulsion 6.
  • the detection of a drop 4 by the sensor 36 causes the control unit 21 to control the injection of a determined volume of separating fluid 33 allowing the formation of a pocket 35.
  • This active mechanism ensures that each pocket formed is not empty and contains only one drop 4.
  • the frequency of formation of the pockets 35 depends on the size of the drops 4. The larger the volume of the drops 4, the slower the frequency of formation of the pockets 35.
  • the formation of the pockets 35 is, for example, carried out at a frequency of between 0.5 pockets per second and 500 pockets per second.
  • the bags 35 are then conveyed into the evacuation tube 38.
  • the pockets 35 and the separators 80 are conveyed in the separation zone 56, towards the outlet 66 of the chip by the control unit 21, the circulation duct 46 having an increasingly large diameter.
  • the flow rate of the fluids is preserved during this change of scale but the frequency of the drops 4 is modified.
  • the frequency of circulation of the bags 35 in the evacuation tube 38 is less than the frequency of circulation of the drops 4 at the outlet 66 from the spacing zone 50. This reduction in frequency is proportional to the square of the ratio of the inside diameter of the evacuation tube 38 on the diameter of the circulation duct 46.
  • the pockets 35 and the separators 80 successively enter the evacuation tube 38.
  • the change of scale makes it possible to modify the frequency of circulation of the drops 4. For example, when there is a drop 4 per bag 35, the drops 4 in the evacuation tube 38 circulate at the frequency of circulation of the bags 35 .
  • the dimensions are adapted so that if the drops 4 circulate at 100 drops per second in front of a point in the measurement region 52, they circulate at 6 drops per second in the evacuation tube 38.
  • the speed of circulation of the bags 35 in the evacuation tube 38 is less than the maximum speed of movement of the movement device 42.
  • each pocket 35 is detected by the exit detector 40.
  • the drops 4 in the pockets are detected by the exit detector 40.
  • At least one pocket 35 comprising a drop 4 is recovered in a compartment 82 of the support 34.
  • the pocket 35 is recovered in the compartment 82 placed under the outlet 86 of the evacuation tube 38.
  • the control unit 21 triggers the movement of the displacement device 42 according to the measurement of the exit detector 40 so that each pocket 35 or drop 4 is recovered in a compartment 82 different from the support 34.
  • Each drop 4 is traced by the control unit 21.
  • the drops 4 are detected at the sensor 36 and are numbered.
  • Each drop 4 of the emulsion 6 is thus associated both with a measurement and with the compartment 82 in which it was recovered.
  • the method comprises, after each recovery step, a step of relative displacement of the support 34 relative to the chip 20, the outlet 86 of the evacuation tube 38 being placed opposite a different compartment 82 after each displacement of support 34.
  • the movement of the support 34 is controlled by the control unit 21 as a function of each detection of drops 4, so that a single pocket 35 comprising a drop 4 detected in the detection step is recovered in each compartment 82 of the support 34 .
  • a second recovery system 100 will be presented next to the figure 3 .
  • the second recovery system differs from the first recovery system 1 in that it comprises a device 102 for injecting a complementary solution 104 into at least one pocket 35.
  • the complementary solution 104 is immiscible with the separating fluid 33.
  • the complementary solution 104 is advantageously miscible with the internal fluid 18 and immiscible with the carrier fluid 26.
  • the additional solution 104 added makes it possible to dilute the drop 4 of the emulsion 6.
  • the additional solution 104 added comprises a marker facilitating the detection of the drop 4 within the pocket 35 by the exit detector 40
  • the additional solution 104 added is a cell lysis reagent or a reagent intended to facilitate the cryopreservation of the internal fluid, drop 4.
  • the control unit 21 is capable of controlling the injection device 102 of the complementary solution 104.
  • the method for recovering the drops with the second recovery system 100 differs from the method previously described in that the method comprises a step of adding an additional solution 104 into at least one bag 35.
  • the same volume of solution complementary 104 is added to each pocket 35 by the injection device 102 of a complementary solution 104.
  • the bag 35 in which the additional solution is added comprises a drop of emulsion 6 and the method additionally comprises a step of melting said drop of emulsion 6 with the additional solution 104 added.
  • the merger is said to be passive.
  • the low concentration of surfactant present in the carrier fluid 26 no longer makes it possible to stabilize the drops 6 of the coalescence.
  • the drop of emulsion and the drop of complementary fluid being confined in the pocket 35 between two separators 80, have a high probability of contact.
  • the invention which has just been described provides a process for recovering drops 4 which is more reliable and more precise than the existing methods, allowing individual monitoring of each drop 4. In fact, each drop 4 is collected individually in a compartment 82 of the support 34.
  • drops 4 Once the drops 4 have been collected in the macroscopic support, it is possible to carry out analysis steps, chemical reactions or reactions. conventional biologicals on the content of drops 4. For example, if drops 4 contain cells, the recovery system 1, 100 makes it possible to recover drops 4 individually before culturing the cells separately.
  • the recovery system 1, 100 makes it possible to recover individual drops 4 from a small quantity of drops 4 of an emulsion 6. For example, starting from 0.1 ⁇ L of emulsion 6 containing 10,000 drops per ⁇ L , the recovery system 1, 100 allows individual recovery of 1000 drops.
  • each drop 4 is associated with a measurement signal.
  • the recovery system 1, 100 makes it possible to have a link between the individual information of the drop 4 and the isolated drop 4. Each drop 4 analyzed is recoverable.
  • the measurement carried out in the measurement region 52 is precise because the surface of the measurement region 52 is adapted to the volume of the drop 4. Passage through a macroscopic scale makes it easier to recover the content of the drop 4 in a support 34 manipulable. Finally, the system 1, 100 can be automated. Indeed, the size of the pockets 35 facilitates the handling of the drops 4 and allows the use of various instruments for recovery and after recovery.
  • each pocket 35 makes it possible in particular to handle a macroscopic object of significantly larger volume than that of an individual drop 4, which facilitates handling and guarantees the integrity of the drop 4.
  • the outlet 66 of the chip opens directly opposite a compartment 82 of the support 34 and the displacement device 42 is suitable for placing the outlet 66 of the chip 20 opposite a different compartment 82 after each displacement of the support 34 relative to the chip 20.
  • the droplet recovery system comprises a device for preparing the emulsion 6 disposed upstream of the entry area 48 of the chip 20.
  • the flow rates are advantageously adjusted by the control unit 21 as a function of the maximum speed of movement of the movement device 42.
  • the recovery system 1, 100 further includes an incubation zone.
  • the emulsion 6 comprises drops 4 comprising a cell or no cell.
  • the method includes culturing each recovered cell.
  • the analysis of the drops 4 before the selection makes it possible, for example, to cultivate only the cells capable of generating an interesting clone.
  • the system makes it possible to associate the signal measured for each drop 4 containing a bacterium or a colony originating from a single cell with compartment 84 in which the drop 4 has been recovered.
  • the bacterium is cultivated in a culture medium adapted according to the information measured.
  • a third recovery system 110 will be presented next to the figure 4 .
  • the third recovery system 110 differs from the recovery systems 1, 100 previously described in that the injection of the emulsion 6 into the chip 20 is provided by a lower part of the chip 20.
  • the chip 20 comprises an upper block 112 and a lower block 114 defining between them the circulation duct 46.
  • the chip 20 further comprises, in the input area 48, an input connection block 116.
  • the lower block 114 is sandwiched between the upper block 112 and the input connection block 116 in the elevation direction Z.
  • the upper block 112 and the connection block 116 are in PDMS and the lower block 114 is made of glass.
  • the inlet connection block 116 defines an inlet duct 118 extending in the direction of elevation Z.
  • the lower block 114 is pierced with an entry orifice 120.
  • the entry orifice 120 crosses the entire thickness of the lower block 114 and opens out through the upper face of the lower block 114 in the circulation duct 46 and through the lower face of the lower block 114 in the inlet duct 118.
  • the inlet conduit 118 is aligned with the inlet orifice 120.
  • the inlet conduit 118 is centered relative to the inlet orifice 120.
  • the diameter of the inlet port 120 is greater than the diameter of the inlet duct 118.
  • the diameter of the inlet duct 118 measures 750 micrometers ( ⁇ m) and the diameter of the inlet port 120 measures 1.4 mm.
  • the inlet conduit 118 opens downstream into the inlet orifice 120 and upstream via the first inlet 60 into an injection tube 122 connected to the device 22 for injecting the emulsion.
  • the method for recovering the drops 4 with the third recovery system 110 differs from the recovery methods previously described in that the injection of the emulsion 6 is facilitated.
  • the flow of drops 4 passes directly from the injection tube 122 to the inlet duct 118, then through the inlet orifice 120 before arriving in the circulation duct 46 without encountering any obstacle.
  • the apparent light is continuous and of increasing diameter in the direction of circulation of the emulsion 6, from the injection tube 122 to the inlet duct 118 and from the inlet duct 118 to the inlet port 120. This prevents blockage of drops 4 in connection blind spots.
  • the injection provided in the third recovery system 110 is particularly advantageous for emulsions 6 comprising an internal fluid 8 less dense than the external fluid 10. In fact if the direction of elevation Z is vertical, Archimedes' push promotes the rise of the drops 4 in the direction of elevation Z in the inlet duct 118.
  • a fourth recovery system 130 will be presented next to the figure 5 .
  • the fourth recovery system 130 differs from the recovery systems 1, 100, 110 previously described in that the outlet of the pockets 35 and the separators 80 of the chip 20 is provided on an upper part of the chip 20.
  • the chip 20 comprises an upper block 132 and a lower block 134 defining between them the circulation duct 46.
  • the chip 20 also comprises, at the output 66 of the chip, an output connection block 136.
  • the upper block 132 is sandwiched between the lower block 134 and the input connection block 136 in the direction of elevation Z.
  • the upper block 132 defines an outlet duct 138.
  • the outlet duct 138 extends in the direction of elevation Z, perpendicular to the circulation duct 46.
  • the outlet duct 138 opens out through the outlet 66 into the internal lumen 87 of the evacuation tube 38.
  • the diameter of the outlet conduit 138 is less than the internal diameter of the evacuation tube 38.
  • connection block 136 defines an orifice 140 of diameter greater than the diameter of the outlet duct 138.
  • the diameter of the orifice 140 is substantially equal to the external diameter of the evacuation tube 38.
  • the evacuation tube 38 has an internal diameter of 750 micrometers and an external diameter of 1.6 mm
  • the outlet conduit 138 has a diameter of 500 micrometers
  • the orifice 140 has a diameter of 1.6 mm.
  • the evacuation tube 38 is introduced into the opening 140 of the connection block 136 so that the lumen of the outlet conduit 138 and the internal lumen 87 of the tube 38 are continuous.
  • the upstream end 142 of the evacuation tube 38 is in contact with the upper face of the upper block 132.
  • the process for recovering the drops 4 with the fourth recovery system 130 differs from the methods previously described in that the transfer of the pockets 35 and separators 80 from the chip 20 to the evacuation tube 38 is facilitated.
  • the flow of pockets 35 and separator 80 passes directly from the circulation duct 46 to the outlet duct 138, then into the lumen 87 of the evacuation tube 38 without encountering any obstacle.
  • the bags 35 in circulation circulate in conduits 138, 87 whose diameter increases from the chip 20 towards the evacuation tube 38 in the direction of circulation of the drops 4 contained in the bags 35 and separator 80.
  • the drops 4 are not stuck in a blind spot when the scale is changed. This helps prevent drop or separator blockages in connection blind spots.
  • the output of the chip 20 provided in this fourth recovery system 130 is particularly advantageous when the carrier fluid 26 is less dense than the separating fluid 33. In fact if the direction of elevation Z is vertical, Archimedes' push promotes the rise of the drops 4 in the direction of elevation Z in the outlet conduit 138 then in the internal lumen 87.
  • a fifth recovery system 150 will be presented next to the figures 6 to 9 .
  • the fifth recovery system 150 differs from the recovery systems 1, 100, 110, 130, previously described in that the system 150 comprises a device 152 for dispensing bags 35.
  • the bag distribution device 152 comprises the evacuation tube 38, a device 154 for circulating a plurality of successive bags 35, each bag 35 being isolated from the next bag 35 by a separator 80 made of separating fluid 33 , in the internal lumen 87 of the evacuation tube 38.
  • the bag dispenser 152 152 further comprises a nozzle 156 suitable for receiving the discharge tube 38 and a blowing unit 158.
  • the circulation device 154 is capable of controlling the flow rate of the bags 35 in the internal lumen 87 of the evacuation tube 38.
  • the circulation device 154 is controlled by the control unit 121.
  • the device circulation 154 controls the injection device 22 of the emulsion 6, the carrier fluid injection device 24 26 and / or the device 32 for injecting the separating fluid 33 into the chip 20 so that the bags 35 circulate in internal lumen 87 at a flow rate between 100 ⁇ L / h and 5 ml / h and advantageously at a flow rate of 2 ml / h.
  • the evacuation tube 38 has a main portion 160 and an outlet portion 162 connected by a narrowing zone 164.
  • the internal lumen 87 of the evacuation tube 38 opens onto an open mouth 166 in the outlet portion 162.
  • the main portion 160 extends from the upstream end 142 of the evacuation tube 38, for example disposed at the outlet of the chip 66 to the narrowing region 164.
  • the outlet portion 162 extends from the narrowing region 64 at the open mouth 166 located at the downstream end of the evacuation tube 38.
  • the external diameter of the outlet portion 162 of the discharge tube 38 is less than the external diameter of the main portion 160 of the discharge tube 38.
  • the external diameter of the outlet portion 162 is substantially equal to the internal diameter of the main portion 160.
  • the main portion 160 has an external diameter of 1.6 mm and an internal diameter of 0.75 mm
  • the outlet portion 162 has an external diameter of 0.75 mm and an internal diameter of 0.3 mm .
  • the recovery device 152 advantageously comprises an injection device 168 of additional separating fluid 33.
  • the device 168 for injecting additional separating fluid is capable of adding separating fluid 33 into at least one separator 80 circulating in the main portion 160 of the evacuation tube 38.
  • the device 168 for injecting additional separating fluid is suitable for add more than 2 cm of separating fluid between the pockets 35.
  • the tip 156 is for example a glass tube.
  • the endpiece 156 is extended in the direction of elevation Z.
  • the endpiece 156 has a through passage 170 in which the outlet portion 162 of the evacuation tube 38 is disposed.
  • the tip 156 comprises a cylindrical upper portion 172 and a hollow lower portion 174 having a frustoconical or curved section.
  • the through passage 170 is extended in the direction of elevation Z and opens into the lower portion 174 through an orifice delimited by a neck 176.
  • the diameter of the orifice defined by the neck 176 of the nozzle 156 is slightly greater than the external diameter of the outlet portion 162 of the tube 38.
  • the internal diameter of the upper portion 172 is greater than the external diameter of the outlet portion 162 of the drain tube 38.
  • the lower portion 174 of the endpiece 156 advantageously has a 45 ° bevelled shape.
  • the evacuation tube 38 is placed in the through passage 170 of the end piece 156 so that the evacuation tube 38 protrudes from the end piece 156.
  • the mouth 166 is outside the end piece 156.
  • the mouth 166 of the evacuation tube 38 is at a distance from the neck 176 of the end piece 156 between 1 mm and 10 mm.
  • the external wall 164 of the evacuation tube 38 is in abutment on the neck 176 of the endpiece 156 at the outlet of the through passage 170.
  • the blowing unit 158 is capable of injecting an air flow into the through passage 170 so that part of the air runs along the external wall 164 of the evacuation tube 38, up to the mouth 166 of the evacuation tube 38.
  • the blowing unit 158 comprises an injection tube 3 m long and with an internal diameter of 150 ⁇ m and the injection pressure at the inlet of the injection tube is between 500 mBar and 1600 mBar.
  • the bag distribution device 152 includes a control unit 180 capable of controlling the blowing unit 158 so that it injects air into the through passage 170 at a flow rate of between 1 ⁇ L / h and 2 mL / h and advantageously at a flow rate of 500 ⁇ L / h.
  • control unit 180 controls the bag circulation device 154.
  • a distribution device 152 as previously described is provided. Pockets 35 and separators 80 are circulated in the internal lumen 87 by the circulation device 154.
  • additional separating fluid is injected into the separators 80 by the injection device 168.
  • Air is injected into the through passage 170 of the nozzle 156 by the blowing unit 158.
  • the air flow and the flow of the bags 35 are adjusted by the control unit 180 so that each bag 35 is successively detaches from the mouth 166 of the evacuation tube 38.
  • This device improves the distribution of the drops.
  • the figure 7 represents the ejection of a pocket 35.
  • Part of the carrier fluid 26 of the pocket 26 adheres to the outer wall 164 of the evacuation tube 138 by capillarity.
  • the air flow along the external wall 164 of the evacuation tube 38 makes it possible to unhook the pocket 35.
  • the Figures 8 and 9 present distribution results obtained for different experimental conditions.
  • the recovery medium 34 is a sheet of paper.
  • the pockets 35 were recovered on the support 34 under conditions of fragmentation.
  • the pockets 35 are recovered one by one on the support 34. Each pocket is ejected from the outlet before the arrival of the next pocket 35.
  • Each task 182 formed on the support 34 comes only from a pocket 35.
  • the same pocket 35 which is fragmented during ejection forms a group 186 of small visible spots on the support 34. Some pockets 35 do not fragment and form a larger spot 184.
  • the flow rates are adjusted so that the pockets 35 retain their integral volume during ejection.
  • the individual bags are distributed without fragmentation.
  • the spots 184 obtained on the support 34 have substantially the same diameter.
  • the setting of the parameters makes it easier to extract and locate the pockets 35 on the support 34.

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Description

  • La présente invention concerne un procédé de récupération de gouttes comprenant les étapes suivantes :
    • fourniture d'une puce comportant un conduit de circulation de fluide définissant successivement dans un sens de circulation des fluides, une zone d'entrée, une zone d'espacement, une zone d'injection et une zone de séparation,
    • injection d'une émulsion de gouttes d'un fluide interne dispersées dans un fluide externe, dans la zone d'entrée,
    • injection d'au moins un fluide porteur miscible avec le fluide externe dans la zone d'espacement, pour former dans le conduit de circulation un fluide de travail comprenant du fluide porteur et des gouttes de l'émulsion espacées les unes des autres le long du conduit,
    • convoyage du fluide de travail dans le conduit de circulation.
  • Le procédé selon l'invention permet, par exemple, de former une émulsion goutte à goutte avec un contenu déterminé ou de réinjecter une émulsion, puis d'espacer les gouttes de l'émulsion avant de les isoler une à une sur un support solide. Le support solide est par exemple une plaque à 96, 386 ou 1536 puits, ou une boite de Pétri ou une plaque MALDI.
  • Une émulsion est un mélange hétérogène de deux liquides non miscibles, sous forme de gouttes du premier liquide dans le second.
  • La microfluidique de goutte est utilisée dans un grand nombre de laboratoires pour miniaturiser les réactions biologiques et biochimiques dans des bioréacteurs de quelques picolitres à quelques nanolitres. Les vitesses d'échantillonnages, au delà de 1000 gouttes analysées par seconde et la réduction du volume des échantillons rendent cette technologie très attractive pour le criblage de molécules et de cellules. Au cours des 10 dernières années, un grand nombre de modules ont été développés pour manipuler ces gouttes micrométriques : mélange et ajout de composés, fusion de gouttes, détection de marqueurs fluorescents, incubation et sélections de gouttes d'intérêt.
  • La publication "Fluorescence-activated droplets sorting (FADS): Efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity", de Baret et al. publiée en ligne le 23 avril 2009 dans la revue Lab on a Chip illustre ce principe.
  • Une émulsion de gouttes est injectée dans un dispositif de tri, les gouttes de l'émulsion sont espacées avec une injection d'huile fluorée sans tensio-actif. Les gouttes sont ensuite envoyées vers une interface de tri. Une mesure est effectuée, toutes les gouttes présentant un signal supérieur à un seuil de détection sont collectées dans un même tube. Un tel système permet la séparation de l'émulsion en deux populations de gouttes et la récupération de chaque population.
  • Cependant, cette méthode ne permet pas de récupérer les gouttes individuellement.
  • Or, il est important dans certaines applications de pouvoir récupérer des gouttes isolées dans un support macroscopique.
  • Par exemple, dans le domaine du criblage haut débit de cellules, on souhaite tester de nombreuses cellules isolées à la fois, puis sélectionner et récupérer les cellules les plus intéressantes. L'isolement des cellules dans des gouttes distinctes facilite les tests, puis la remise en culture des cellules sélectionnées permet d'obtenir des clones générant des anticorps monoclonaux ou des enzymes industrielles.
  • Avec la méthode précédemment décrite, environ mille gouttes mélangées sont récupérées ensemble à la sortie du système, il faut donc réaliser de nombreuses étapes ultérieures pour isoler les cellules présentant les meilleures dispositions pour synthétiser le composé d'intérêt. En variante, la méthode précédemment décrite peut être utilisée pour récupérer seulement une goutte mais ceci est difficile à mettre en oeuvre du fait du faible volume de la goutte à manipuler et, en outre, dans ce cas, le reste des gouttes est perdu ou éliminé.
  • La publication « Interfacing picoliter droplet microfluidics with addressable microliter compartments using fluorescence activated cell sorting » de Bai et al., publiée en ligne le 28 décembre 2013 dans la revue Sensors and Actuators B : Chemical, propose une méthode qui permet d'isoler les gouttes une à une. Cette méthode consiste à gélifier les gouttes contenant les molécules ou cellules d'intérêt avant de les placer dans un cytomètre de flux à tri cellulaire activé par fluorescence (appelé FACS pour Fluorescence Activated Cell Sorter) qui va ensuite les distribuer dans une plaque.
  • Cependant, de nombreuses gouttes sont perdues. De plus, un inconvénient majeur de cette méthode est l'étape de gélification de la goutte qui impose des conditions de températures qui ne sont pas forcément compatibles avec toutes les réactions biochimiques ou biologiques. En effet, les auteurs placent leurs échantillons dans un bain de glace, ce qui va arrêter toute réaction.
  • La demande de brevet WO2012042060 décrit un système de production et de récupération de gouttes. Les gouttes sont générées à une fréquence compatible synchronisée avec la vitesse de déplacement de l'élément de récupération des gouttes.
  • Cependant, ce système ne permet pas de réinjecter une émulsion. En outre, la séparation des gouttes nécessite une quantité importante d'huile qui rend difficile leur manipulation. Enfin, ce système ne permet pas d'ajouter un réactif (liquide de lyse par exemple) une fois la goutte formée.
  • Le document US 2011/053798 A1 décrit un procédé d'analyse d'un échantillon par formation et coalescence d'émulsions multiples.
  • Un but de l'invention est de fournir un procédé de récupération de gouttes plus fiable et plus précis que les procédés existants, permettant un suivi individuel de chaque goutte et une récupération efficace de son contenu.
  • A cet effet, l'invention a pour objet un procédé selon la revendication 1.
  • Le procédé selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des caractéristiques des revendications 2 à 11 ou des caractéristiques suivantes, prise(s) isolément ou suivant toute combinaison techniquement possible :
    • la formation des poches est effectuée à une fréquence comprise entre 1 poche par secondes et 1000 poches par secondes ;
    • le diamètre de chaque goutte est inférieur ou égal à celui du conduit de circulation 46 ;
    • le diamètre de chaque poche est supérieur ou égal à celui du conduit de circulation 46 ;
    • le diamètre de chaque séparateur est supérieur ou égal à celui du conduit de circulation 46, le fluide séparateur étant de préférence un gaz.
  • L'invention a également pour objet un système de récupération de gouttes selon la revendication 12.
  • Le système de récupération de gouttes selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des caractéristiques des revendications 13 à 15, prise(s) isolément ou suivant toute combinaison techniquement possible.
  • L'invention a également pour objet un dispositif de distribution de poches comprenant :
    • un tube d'évacuation, définissant une lumière interne débouchant sur une embouchure ouverte, le tube d'évacuation comprenant une paroi externe ;
    • un dispositif de mise en circulation dans la lumière interne du tube d'évacuation d'une pluralité de poches successives comprenant un fluide porteur, chaque poche étant isolée de la poche suivante par un séparateur constitué d'un fluide séparateur, le fluide séparateur étant non miscible avec le fluide porteur;
    • un embout présentant un passage traversant, le tube d'évacuation étant placé dans le passage traversant de l'embout ;
    • une unité de soufflage propre à injecter un flux d'air dans le passage traversant de sorte à ce qu'une partie de l'air longe la paroi externe du tube d'évacuation, jusqu'à l'embouchure du tube d'évacuation.
  • L'invention a également pour objet un procédé de distribution de poches comprenant les étapes suivantes :
    • fourniture d'un dispositif de distribution tel que précédemment décrit ;
    • mise en circulation des poches successives dans la lumière interne,
    • injection d'air dans le passage traversant de l'embout, le débit d'air et le débit des poches étant ajustés pour que chaque poche se détache successivement de l'embouchure du tube d'évacuation.
  • L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple, et faite en se référant aux dessins annexés, sur lesquels :
    • la figure 1 est une représentation schématique d'un premier système de récupération de gouttes selon l'invention,
    • la figure 2 est une représentation schématique d'une émulsion avant l'injection dans le système de récupération des gouttes,
    • la figure 3 est une représentation détaillée d'une partie d'un deuxième système de récupération de gouttes selon l'invention,
    • la figure 4 est une représentation détaillée d'une partie d'un troisième système de récupération de gouttes ;
    • la figure 5 est une représentation détaillée d'une partie d'un quatrième système de récupération ;
    • la figure 6 est une représentation détaillée d'un dispositif de distribution de poche d'un cinquième système de récupération ;
    • la figure 7 est une représentation détaillée du dispositif de distribution de poche de la figure 6, lors d'une étape suivante d'un procédé de distribution de poches ;
    • la figure 8 est un résultat de distribution de poche obtenu après une distribution de poches par le dispositif de distribution de poche de la figure 6 ;
    • la figure 9 est un autre résultat de distribution de poche obtenu après une distribution de poches par le dispositif de distribution de poche de la figure 6.
  • Dans la description qui va suivre, les termes « amont » et « aval » et les termes « entrée » et « sortie » sont utilisées en référence au sens normaux de circulation des fluides du système.
  • Le terme « longitudinal » est défini par rapport à la direction du conduit de circulation dans la puce. On appelle « plan transversal » les plans qui sont perpendiculaires à la direction longitudinale.
  • Le terme « diamètre » d'un élément désigne l'étendue maximale de l'élément considérée dans un plan transversal.
  • On appelle « fréquence des gouttes », le nombre de gouttes par seconde passant devant un point fixe du conduit de circulation.
  • Un premier système de récupération 1 de gouttes est représenté sur la figure 1.
  • Le premier système de récupération 1 de gouttes est prévu pour isoler et récupérer séparément les gouttes 4 d'une émulsion 6.
  • Une émulsion 6 de gouttes 4 est représentée sur la figure 2.
  • L'émulsion 6 est constituée d'une pluralité de gouttes 4 d'un fluide interne 8 dispersées dans un fluide externe 10.
  • L'émulsion 6 est sensiblement stable, cela signifie que pour un volume fixe de l'émulsion 6, le nombre et le volume des gouttes 4 varient de moins de 5 % lorsque le volume fixe de l'émulsion 6 est conservé entre -80 °C et 80 °C, à 1 bar pendant 48 h.
  • L'émulsion 6 est concentrée. Ceci signifie que la fraction volumique de gouttes 4 dans l'émulsion 6 est comprise entre 30 % et 40 %. Chaque goutte 4 constitue un compartiment fermé rempli de fluide interne 8.
  • Les gouttes 4 de l'émulsion 6 sont, de préférence, sensiblement monodisperses. Les gouttes 4 présentent, par exemple, un volume compris entre 2 pL et 2 µL.
  • Au moins certaines gouttes 4 de l'émulsion 6 sont différentes d'autres gouttes 4 de l'émulsion 6.
  • Chaque goutte 4 comprend un fluide interne 8 potentiellement différent d'une goutte 4 à l'autre.
  • Avantageusement, le fluide interne 8 de toutes les gouttes 4 comprend au moins une même base commune 12. Par exemple, la base commune 12 est une solution tampon adaptée à la survie de cellules comme une solution de tampon phosphate salin ou un milieu de culture.
  • Le fluide interne 8 de chaque goutte 4 est constitué d'éléments propres 14 à la goutte 4 et de la base commune 12. Les proportions des éléments propres 14 et de la base commune 12 et/ou les natures des éléments propres 14 varient d'une goutte 4 à l'autre.
  • Par exemple, les éléments propres 14 d'une goutte 4 sont une cellule et des éléments secrétés par la cellule, comme des protéines.
  • Avantageusement, plus de 10 % du volume de la goutte 4 est constitué de la base commune 12.
  • Le fluide interne 8 de chaque goutte 4 est non miscible avec le fluide externe 10. On entend par non miscible que le coefficient de partage entre les deux fluides est inférieur à 10-3. Les gouttes 4 sont bien définies dans l'émulsion 6 et les échanges entre deux gouttes 4 voisines dans l'émulsion 6 sont limités aux composés solubles ou légèrement solubles dans le fluide externe 10, c'est-à-dire avec un coefficient de partage supérieur ou égal à 10-3 et dans les cas où les compositions sont différentes entre gouttes 4 voisines.
  • Avantageusement, la base commune 12 est non miscible avec le fluide externe 8.
  • Dans l'exemple, le fluide interne 8 est une phase aqueuse et le fluide externe 10 est une phase organique notamment une phase huileuse.
  • Le fluide externe 10 comprend par exemple des hydrofluoroéthers comme FC-40 ou HFE-7500, formant une huile fluorée.
  • Le fluide externe 10 comprend, en outre, avantageusement un tensio-actif. Le tensio-actif est propre à stabiliser l'émulsion 6. Le tensio-actif est, par exemple, un copolymère à bloc de polyéthylène glycol et de perfluoropolyéther (PEG-PFPE). Par exemple, la concentration de tensio-actif dans le fluide externe 10 est comprise entre 2 % et 5 %.
  • L'émulsion 6 est, par exemple, préparée au moyen d'un dispositif de préparation et conservée avant d'être utilisée dans le premier système de récupération 1.
  • Le premier système de récupération 1 est destiné à récupérer séparément les gouttes 4 de l'émulsion 6.
  • Le premier système de récupération de gouttes 1, représenté sur la figure 1, comprend une puce 20 de séparation, une unité de commande 21 et un dispositif 22 d'injection de l'émulsion 6 dans la puce 20. En outre, le premier système de récupération 1 comprend un dispositif 24 d'injection de fluide porteur 26 dans la puce 20 pour former un fluide de travail 28, un dispositif 32 d'injection d'un fluide séparateur 33 dans la puce 20 et un support de récupération 34.
  • Comme cela sera décrit par la suite, l'unité de commande 21 est propre à contrôler l'injection dans la puce 20 du fluide séparateur 33 par le dispositif 32 d'injection du fluide séparateur 33 pour séparer le fluide de travail 28 en une pluralité de poches 35 successives, susceptibles de contenir une goutte 4, comme illustré sur la figure 1.
  • En complément, le premier système de récupération 1 de gouttes comprend un capteur 36 propre à détecter le passage de gouttes 4 successives de l'émulsion 6 dans le fluide de travail 28. Le premier système de récupération 1 de gouttes comprend, en outre, un tube d'évacuation 38, un détecteur de sortie 40 et un dispositif de déplacement 42 relatif du support 34 par rapport à la puce 20.
  • La puce 20 comporte un conduit de circulation 46 de fluide définissant successivement dans le sens de circulation des fluides, une zone d'entrée 48, une zone d'espacement 50 des gouttes présentant avantageusement une région de mesure 52, une zone d'injection 54 de fluide séparateur 33 et une zone de séparation 56.
  • Le conduit de circulation 46 s'étend selon un axe longitudinal X.
  • La puce 20 est, dans l'exemple, un bloc rectangulaire étendu selon l'axe longitudinal X et un axe transversal Y perpendiculaire à l'axe longitudinal X. En outre, la puce présente une épaisseur selon un axe d'élévation Z perpendiculaire à l'axe longitudinal X et à l'axe transversal Y.
  • Dans la suite, les termes « inférieurs » et « supérieurs » s'entendent par rapport à l'axe d'élévation Z, perpendiculaire à l'axe longitudinal X. La direction de l'axe d'élévation Z est par exemple sensiblement verticale.
  • Par exemple, la section transversale, c'est-à-dire selon un plan comprenant l'axe transversal Y et l'axe d'élévation Z, du conduit de circulation 46 est rectangulaire. Le conduit de circulation 46 est délimité par quatre parois latérales.
  • En variante, la section transversale présente d'autres formes.
  • L'aire maximale de la section transversale du conduit 46 est inférieure à 1 mm2.
  • La puce 20 est transparente au moins dans la région de mesure 52. Avantageusement la puce 20 est réalisée en matériau transparent, par exemple en polydiméthylsiloxane (PDMS).
  • Le matériau de la puce 20 est imperméable au fluide porteur 26. Dans une variante, le matériau de la puce 20 est, de plus, imperméable au fluide séparateur 33, par exemple lorsque le fluide séparateur 33 est un liquide.
  • La puce 20 comporte une première entrée 60 débouchant dans la zone d'entrée 48 du conduit de circulation 46, au moins une deuxième entrée 62 débouchant dans la zone d'espacement 50 du conduit de circulation 46 et au moins une troisième entrée 64 débouchant dans la zone d'injection 54 du conduit de circulation 46. La puce 20 comporte une sortie 66 par laquelle le conduit de circulation 46 débouche dans le tube d'évacuation 38.
  • La première entrée 60 est en communication fluidique en amont avec le dispositif d'injection 22 de l'émulsion, comme illustré sur la figure 1.
  • La zone d'entrée 48 du conduit de circulation 46 s'étend de la première entrée 60 à la zone d'espacement 50.
  • La forme du conduit de circulation 46 dans la zone d'entrée 48 est adaptée pour permettre l'injection de l'émulsion 6 dans la zone d'entrée 48 et le passage d'une goutte 4 à la fois vers la zone d'espacement 48.
  • Dans l'exemple représenté sur la figure 1, le conduit de circulation 46 dans la zone d'entrée 48 présente une première portion 68 et une deuxième portion formant une pointe convergente 70.
  • La première portion 68 présente un diamètre constant le long de l'axe longitudinal X.
  • La deuxième portion 70 débouche dans la zone d'espacement du conduit de circulation. Elle permet le passage d'une goutte 4 à la fois vers la zone d'espacement 48.
  • La deuxième portion 70 présente une forme de pointe convergente dans le sens de circulation des fluides selon un plan comprenant l'axe longitudinal X et l'axe transversal Y.
  • L'angle de la pointe convergente 70 est adapté pour éviter que les gouttes 4 coalescent. Par exemple, les parois latérales opposées du conduit de circulation 46 au niveau de la pointe convergente 70 forment entre elles un angle compris entre 45 ° et 70 °.
  • Le diamètre de la première portion 68 est le diamètre maximal de la pointe convergente 70.
  • Par exemple, le diamètre minimal de la pointe convergente 70 est sensiblement égal au diamètre moyen des gouttes 4.
  • La deuxième entrée 62 est en communication fluidique en amont avec le dispositif d'injection du fluide porteur 26 comme illustré sur la figure 1.
  • La forme du conduit de circulation 46 dans la zone d'espacement 50 est adaptée pour permettre l'injection du fluide porteur 26 entre les gouttes 4 de l'émulsion 6.
  • Ainsi, le conduit de circulation 46 comporte dans la zone d'espacement 50, une jonction 72 avec la deuxième entrée 62.
  • Avantageusement, la jonction 72 comporte au moins un canal secondaire 74 avec un angle compris entre 45° et 90° par rapport à l'axe longitudinal X et débouchant dans le conduit de circulation 46.
  • Dans l'exemple représenté sur la figure 1, la jonction 72 comporte deux canaux secondaires 74 débouchant de part et d'autre du conduit de circulation 46.
  • Le conduit de circulation 46 présente dans la zone d'espacement 50 à l'écart de la jonction 72, une section transversale de diamètre inférieur à celle de la première portion du voisinage de l'entrée 60, par exemple, sensiblement égal à 400 % du diamètre de moyen des gouttes 4. Avantageusement, ce diamètre est égal au diamètre minimal de la pointe convergente 70.
  • La zone d'espacement 50 s'étend de la zone d'entrée 48 à la zone d'injection 54.
  • La zone d'espacement 50 présente, en outre, une région de mesure 52 dans laquelle les gouttes 4 sont détectées par le capteur 36, comme cela sera décrit par la suite. La dimension de cette région de mesure 52 est par exemple égale au diamètre d'une goutte 4. En variante, la région de mesure 52 s'étend selon un plan transversal sur une surface égale à la section du conduit de circulation 46.
  • La longueur de la zone d'espacement 50 est de préférence supérieure à 3 fois le diamètre du conduit de circulation 46.
  • La troisième entrée 64 est en communication fluidique en amont avec le dispositif d'injection 32 de fluide séparateur 33 comme illustré sur la figure 1.
  • La forme du conduit de circulation 46 dans la zone d'injection 54 est adaptée pour permettre l'injection du fluide séparateur 33 entre les gouttes 4 du fluide de travail 28.
  • Ainsi, le conduit de circulation 46 comporte dans la zone d'injection 54, une jonction 76 avec la troisième entrée 64.
  • Le conduit de circulation 46 dans la zone de séparation 56 présente une forme évasée de sorte que la dimension du conduit de circulation atteigne le diamètre interne du tube d'évacuation 38.
  • Le diamètre du conduit de circulation 46 est plus important en sortie de la zone de séparation 56 que dans la zone d'espacement 50.
  • Le conduit de circulation 46 présente un diamètre maximal dans la zone de séparation compris entre 10 µm et 2 mm avantageusement supérieur au diamètre de la goutte 4.
  • L'unité de commande 21 est propre à piloter les débits des différents fluides 6, 26, 28, 33, à recevoir les signaux du capteur 36 et du détecteur de sortie 40 et à enregistrer les caractéristiques des gouttes 4.
  • L'unité de commande 21 est propre à contrôler le dispositif d'injection 22 d'une émulsion, le dispositif d'injection 24 du fluide porteur, le dispositif d'injection 32 du fluide séparateur.
  • Le dispositif d'injection 22 d'une émulsion est propre à injecter une émulsion 6 de gouttes 4 d'un fluide interne 8 dispersées dans un fluide externe 10 dans la zone d'entrée 48 par la première entrée 60.
  • L'unité de commande 21 est propre à contrôler le dispositif d'injection 22 de l'émulsion 6 pour qu'il injecte l'émulsion 6 dans la zone d'entrée 48 à un débit compris entre 1 µL/h et 500 µL/h et avantageusement à un débit de 80 µL/h.
  • Le dispositif d'injection 22 d'une émulsion comporte par exemple un récipient dans lequel est placé un volume de l'émulsion 6 compris entre 1 nL et 2 mL. Le dispositif d'injection 22 d'une émulsion comporte, en outre, un tuyau de connexion permettant de mettre en communication fluidique le récipient et la première entrée 60 et un moyen de mise en circulation de l'émulsion, comme illustré sur la figure 1.
  • Par exemple le dispositif d'injection 22 de l'émulsion comporte un pousse-seringue, une seringue remplie d'émulsion 6 et un tuyau de connexion.
  • Le dispositif d'injection 24 du fluide porteur est propre à injecter le fluide porteur 26 dans la zone d'espacement 50 par la deuxième entrée 62 pour former dans le conduit de circulation 46 un fluide de travail 28.
  • L'unité de commande 21 est propre à contrôler le dispositif d'injection 24 du fluide porteur 26 pour qu'il injecte du fluide porteur 26 dans la zone d'espacement 50 par la deuxième entrée 62 à un débit compris entre 5 µL/h et 5 mL/h et avantageusement à un débit de 1mL/h.
  • Le débit d'injection du fluide porteur 26 est par exemple ajusté de sorte que la fréquence des gouttes 4 dans la zone d'espacement 50 soit comprise par exemple entre 0,5 gouttes par secondes et 500 gouttes par secondes et avantageusement de 30 gouttes par secondes.
  • Le dispositif d'injection 24 du fluide porteur 26 comporte par exemple un récipient dans lequel est placé un volume du fluide porteur 26 compris entre 10 µL et 10 mL. Le dispositif d'injection 24 comporte en outre un tuyau de connexion permettant de mettre en communication fluidique le récipient et la deuxième entrée 62 et un moyen de mise en circulation du fluide porteur 26.
  • De même, le dispositif d'injection 24 comporte par exemple un pousse-seringue, une seringue rempli de fluide porteur 26 et un tuyau de connexion.
  • Le fluide porteur 26 est miscible avec le fluide externe 10.
  • Par exemple, le fluide porteur 26 utilisé est le même que le fluide externe 10 c'est-à-dire de l'huile fluorée HFE avec le même tensio-actif avec une concentration comprise entre 0 % et 0,5 %.
  • Le fluide de travail 28 comprend du fluide porteur 26, du fluide externe 10 et des gouttes 4 de l'émulsion 6 espacées les unes des autres le long du conduit de circulation 48.
  • L'unité de commande 21 est propre à faire circuler le fluide de travail 28 dans le conduit de circulation 46 en aval de la zone d'espacement 50.
  • L'unité de commande 21 impose un débit fixe pour le fluide de travail 28 en contrôlant les débits du dispositif d'injection 22 de l'émulsion 6 et du dispositif d'injection 24 du fluide porteur 26. L'unité de commande 21 contrôle, de plus, le débit du dispositif d'injection 32 du fluide séparateur 33. Par exemple, l'unité de commande 21 est propre à faire varier le débit du dispositif d'injection 32 du fluide séparateur 33 selon la présence ou non d'une goutte 6 détectée par le capteur 36 dans la zone d'espacement.
  • Le capteur 36 est propre à détecter le passage de gouttes 4 successives de l'émulsion 6 dans la zone d'espacement 50. En outre, le capteur 36 est propre à effectuer une mesure au sein de la goutte 4. Par exemple, la mesure est une mesure optique, comme une mesure de fluorescence.
  • L'unité de commande 21 est propre à mémoriser les informations mesurées par le capteur goutte 4 par goutte 4.
  • La mesure dépend du fluide interne 8 présent dans la goutte 4. Avantageusement la mesure permet de déterminer la nature ou la concentration de l'élément propre 14 à chaque goutte 4.
  • L'unité de commande 21 est propre à déclencher l'injection de fluide séparateur en fonction de la mesure du capteur 36.
  • Le dispositif d'injection 32 du fluide séparateur 33 est propre à injecter le fluide séparateur 33 non miscible avec le fluide porteur 26 dans la zone d'injection 54 pour séparer le fluide de travail 28 en une pluralité de poches 35 successives comprenant du fluide porteur 26.
  • Chaque poche 35 est isolée de la poche 35 suivante par un séparateur 80 constitué de fluide séparateur 33.
  • Le fluide séparateur 33 est non miscible avec le fluide porteur 26.
  • Le fluide séparateur 33 est de préférence un gaz.
  • Dans l'exemple, le fluide séparateur 33 est de l'air. Le séparateur 80 est une bulle d'air.
  • Le diamètre de chaque poche 35 est supérieur ou égal à celui du conduit de circulation 46.
  • Le volume de chaque séparateur 80 est supérieur à deux fois le volume d'une goutte 4. Le diamètre de chaque séparateur 80 est supérieur ou égal à celui du conduit de circulation 46. Le diamètre de chaque séparateur 80 est par exemple égal au diamètre intérieur du tube d'évacuation 38.
  • L'unité de commande 21 est propre à faire circuler les poches 35 et les séparateurs 80, dans la zone de séparation, vers la sortie 66 de la puce 20.
  • Le support 34 comporte au moins un compartiment 82 propre à recevoir une poche 35. Par exemple, le support 34 est une boîte de Pétri.
  • Avantageusement, le support 34 comporte plusieurs compartiments 82 séparés les uns des autres.
  • Par exemple, le support 34 est une plaque à 96 puits, chaque puits étant un compartiment 82 séparé de récupération. En variante, le support 34 est une plaque à 24 puits ou à 384 puits ou autres.
  • Le tube d'évacuation 38 présente une entrée 84 et une sortie 86 et une lumière interne 87 débouchant par l'entrée 84 et la sortie 86. La lumière interne 87 s'étend dans le prolongement du conduit de circulation 46.
  • L'entrée 84 du tube d'évacuation 38 est connectée de manière étanche à la sortie 66 de la puce 20.
  • La sortie 86 du tube d'évacuation 38 est propre à être placée en regard du compartiment 82, pour la récupération d'au moins une poche 35 comprenant une goutte 4 dans le compartiment 82.
  • Le tube d'évacuation 38 est par exemple un capillaire en téflon présentant un diamètre interne avantageusement supérieur à 0,1 mm.
  • La dimension du tube d'évacuation 38 est adaptée à la dimension des poches 35 souhaitée.
  • Le volume des poches 35 est supérieur au volume d'une goutte de diamètre égal au diamètre intérieur du tube d'évacuation 38, de façon à faciliter leur visualisation par le détecteur de sortie 40 et leur dépôt dans le support 34.
  • Le détecteur de sortie 40 est situé en aval de la zone de séparation 56. Avantageusement, le détecteur de sortie 40 est propre à détecter successivement chaque poche 35 dans le tube d'évacuation 38.
  • Selon la taille des gouttes, le détecteur de sortie 40 est en outre avantageusement propre à détecter les gouttes 4 dans le tube d'évacuation 38. L'unité de commande 21 est apte à commander le déplacement du support 34.
  • Dans l'exemple, le dispositif de déplacement 42 est une platine robotisée. Le dispositif de déplacement 42 est apte à déplacer le support 34 par rapport au tube d'évacuation 38 et à la puce 20. Par exemple, la platine est apte à déplacer le support 34 horizontalement à une vitesse comprise entre 0,5 mm.s-1 et 45 mm.s-1.
  • Avantageusement, l'unité de commande 21 est propre à commander le dispositif de déplacement 42 en fonction de chaque détection de gouttes 4 par le capteur 36, pour qu'une seule poche 35 comprenant une goutte 4 détectée à l'étape de détection soit récupérée dans chaque compartiment 82 du support 34. En variante ou en complément, l'unité de commande 21 commande le dispositif de déplacement 42 en fonction des signaux détectées par le détecteur de sortie 40.
  • Par exemple, la détection des gouttes 4 ou poches 35 par le détecteur de sortie 40 permet de déclencher le mouvement du dispositif de déplacement 42 afin de mettre une goutte 4 par compartiments 82. Après chaque récupération, le dispositif de déplacement 42 est propre à placer la sortie 86 du tube d'évacuation 38 en regard d'un compartiment 82 différent après chaque déplacement du support 34 par rapport à la puce 20.
  • Un procédé de récupération des gouttes 4, selon l'invention, va maintenant être décrit.
  • Le premier système de récupération 1 de gouttes est fourni. Le dispositif d'injection 22 de l'émulsion 6 est fourni avec une émulsion 6 telle que précédemment décrite.
  • L'émulsion 6 de gouttes 4 est injectée dans la zone d'entrée 48 de la puce 20 au moyen du dispositif d'injection 22 de l'émulsion 6. L'émulsion 6 est mise en circulation par exemple à un débit de 80 µL/h.
  • Les gouttes 4 de l'émulsion 6 arrivent une à une dans la zone d'espacement 50 en raison de la pointe convergente 70 de la zone d'entrée 48.
  • Le fluide porteur 26 est injecté dans la zone d'espacement 50 au moyen du dispositif d'injection 24 du fluide porteur 26 pour former dans le conduit de circulation un fluide de travail. Le fluide porteur 26 est mis en circulation par exemple à un débit de 1mL/h.
  • Chaque goutte 4 est espacée des autres gouttes 4 par du fluide porteur 26.
  • La distance entre chaque goutte 4 est, par exemple, supérieure au diamètre intérieur du tube d'évacuation 38. La distance entre chaque goutte 4 dans la zone d'espacement 50 est suffisante pour pouvoir injecter du fluide séparateur 33 entre les gouttes 4 sans perturber le fluide de travail 28.
  • Le fluide de travail 28 est convoyé dans le conduit de circulation 46.
  • Les gouttes 6 dans le fluide de travail 28 sont espacées et ordonnées le long du conduit de circulation 46.
  • Les gouttes 6 du fluide de travail 28 passent une à une dans la région de mesure 52.
  • Une étape de détection du passage de gouttes 6 successives dans la région de mesure 52 est mise en oeuvre par le capteur 36.
  • Le capteur 36 mesure une information relative à la goutte 6. Par exemple, la mesure est une mesure de fluorescence représentative de l'élément propre 14 de de la goutte 6. Les informations recueillies sont par exemple une activité enzymatique, un nombre de cellules, une biomasse ou une quantité de protéine produites dans la goutte.
  • L'unité de commande 21 mémorise le numéro de la goutte 6 et les informations mesurées dans l'ordre.
  • Les gouttes 6 du fluide de travail 28 passent une à une dans la zone d'injection 54.
  • L'unité de commande 21 déclenche l'injection de fluide séparateur 33 en fonction de la mesure du capteur 36, de sorte qu'il y ait un séparateur 80 entre chaque goutte 4. Le fluide séparateur 33 est injecté dans la zone d'injection 54 au moyen du dispositif d'injection 32 de fluide séparateur. Le fluide séparateur 33 sépare le fluide de travail 28 en une pluralité de poches 35 successives. Le fluide séparateur 33 est injecté entre deux gouttes 4 successives 6 du fluide de travail 28. L'injection de fluide séparateur 33 permet la formation de poches 35 et des séparateurs 80.
  • Chaque séparateur 80 sépare deux poches 35 successives de fluide de travail 28. Il est immiscible avec la poche 35.
  • Les poches 35 sont des cavités de fluide de travail 28 séparées par le séparateur 80. Les poches 35 comprennent principalement du fluide porteur 26. Au moins une poche 35 de préférence, plus de 100 % des poches 35 contiennent de plus une goutte 4 de l'émulsion 6.
  • Le volume des poches 35 est supérieur au volume d'une goutte de diamètre égal au diamètre intérieur du tube d'évacuation 38.
  • Le débit d'injection du fluide séparateur 33 par le dispositif d'injection 32 de fluide séparateur 33 est ajusté par l'unité de commande 21 pour que chaque poche 35 contienne strictement moins de deux gouttes 4. Par exemple, l'ajustement est passif, le débit d'injection du fluide séparateur 33 est constant. Certaine poches 35 sont vides de gouttes 4 d'autre poches 35 comprennent une goutte 4 seulement.
  • Avantageusement, le débit d'injection du fluide séparateur 33 par le dispositif d'injection 32 de fluide séparateur 33 est ajusté en temps réel par l'unité de commande 21 pour que chaque poche 35 contienne exactement une goutte 4 de l'émulsion 6. Par exemple, la détection d'une goutte 4 par le capteur 36, entraine la commande par l'unité de commande 21 de l'injection d'un volume déterminé de fluide séparateur 33 permettant la formation d'une poche 35. Ce mécanisme actif permet de s'assurer que chaque poche formée ne soit pas vide et contienne une goutte 4 seulement.
  • La fréquence de formation des poches 35 dépend de la taille des gouttes 4. Plus le volume des gouttes 4 est important, plus la fréquence de formation des poches 35 est lente. La formation des poches 35 est, par exemple, effectuée à une fréquence comprise entre 0,5 poches par secondes et 500 poches par secondes.
  • Les poches 35 sont ensuite convoyées dans le tube d'évacuation 38.
  • Les poches 35 et les séparateurs 80 sont convoyés dans la zone de séparation 56, vers la sortie 66 de la puce par l'unité de commande 21, le conduit de circulation 46 présentant un diamètre de plus en plus grand. Le débit des fluides est conservé lors de ce changement d'échelle mais la fréquence des gouttes 4 est modifiée. Ainsi la fréquence de circulation des poches 35 dans le tube d'évacuation 38 est inférieure à la fréquence de circulation des gouttes 4 en sortie 66 de la zone d'espacement 50. Cette diminution de fréquence est proportionnelle au carré du ratio du diamètre intérieur du tube d'évacuation 38 sur le diamètre du conduit de circulation 46.
  • Les poches 35 et les séparateurs 80 entrent successivement dans le tube d'évacuation 38.
  • Le changement d'échelle permet de modifier la fréquence de circulation des gouttes 4. Par exemple, lorsqu'il y a une goutte 4 par poche 35, les gouttes 4 dans le tube d'évacuation 38 circulent à la fréquence de circulation des poches 35.
  • Par exemple, les dimensions sont adaptées pour que si les gouttes 4 circulent à 100 gouttes par secondes devant un point de la région de mesure 52, elles circulent à 6 gouttes par secondes dans le tube d'évacuation 38.
  • Avantageusement, la vitesse de circulation des poches 35 dans le tube d'évacuation 38 est inférieure à la vitesse maximale de déplacement du dispositif de déplacement 42.
  • Avantageusement, chaque poche 35 est détectée par le détecteur de sortie 40. En variante, les gouttes 4 dans les poches sont détectées par le détecteur de sortie 40.
  • Ensuite au moins une poche 35 comprenant une goutte 4 est récupérée dans un compartiment 82 du support 34. La poche 35 est récupérée dans le compartiment 82 placé sous la sortie 86 du tube d'évacuation 38.
  • L'unité de commande 21 déclenche le mouvement du dispositif de déplacement 42 en fonction de la mesure du détecteur de sortie 40 de sorte que chaque poche 35 ou goutte 4 soit récupérée dans un compartiment 82 différent du support 34.
  • Chaque goutte 4 est tracée par l'unité de commande 21. Par exemple les gouttes 4 sont détectées au niveau du capteur 36 et sont numérotées. Chaque goutte 4 de l'émulsion 6 est ainsi associée à la fois à une mesure et au compartiment 82 dans lequel elle a été récupérée.
  • En complément, le procédé comporte, après chaque étape de récupération, une étape de déplacement relatif du support 34 par rapport à la puce 20, la sortie 86 du tube d'évacuation 38 étant placée en regard d'un compartiment 82 différent après chaque déplacement du support 34.
  • Le déplacement du support 34 est commandé par l'unité de commande 21 en fonction de chaque détection de gouttes 4, pour qu'une seule poche 35 comprenant une goutte 4 détectée à l'étape de détection soit récupérée dans chaque compartiment 82 du support 34.
  • Un deuxième système de récupération 100 va être présenté en regard de la figure 3. Le deuxième système de récupération diffère du premier système de récupération 1 en ce qu'il comprend un dispositif d'injection 102 d'une solution complémentaire 104 dans au moins une poche 35.
  • La solution complémentaire 104 est immiscible avec le fluide séparateur 33. De plus, la solution complémentaire 104 est avantageusement miscible avec le fluide interne 18 et immiscible avec le fluide porteur 26.
  • Par exemple, la solution complémentaire 104 ajoutée permet de diluer la goutte 4 de l'émulsion 6. En variante, la solution complémentaire 104 ajoutée comprend un marqueur facilitant la détection de la goutte 4 au sein de la poche 35 par le détecteur de sortie 40. En variante, la solution complémentaire 104 ajoutée est un réactif de lyse cellulaire ou un réactif destiné à faciliter la cryoconservation du fluide interne la goutte 4.
  • L'unité de commande 21 est propre à contrôler le dispositif d'injection 102 de la solution complémentaire 104.
  • Le procédé de récupération des gouttes avec le deuxième système de récupération 100 diffère du procédé précédemment décrit en ce que le procédé comprend une étape d'ajout d'une solution complémentaire 104 dans au moins une poche 35. Par exemple, un même volume de solution complémentaire 104 est ajouté dans chaque poche 35 par le dispositif d'injection 102 d'une solution complémentaire 104.
  • Avantageusement, la poche 35 dans laquelle la solution complémentaire est ajoutée comprend une goutte d'émulsion 6 et le procédé comporte en complément une étape de fusion de ladite goutte d'émulsion 6 avec la solution complémentaire 104 ajoutée. La fusion est dite passive. La faible concentration de tensio-actif présent dans le fluide porteur 26 ne permet plus de stabiliser les gouttes 6 de la coalescence. La goutte d'émulsion et la goutte de fluide complémentaire étant confinées dans la poche 35 entre deux séparateurs 80, ont une forte probabilité de contact.
  • L'invention qui vient d'être décrite fournit un procédé de récupération de gouttes 4 plus fiable et plus précis que les procédés existants, permettant un suivi individuel de chaque goutte 4. En effet, chaque goutte 4 est récupérée individuellement dans un compartiment 82 du support 34.
  • Une fois les gouttes 4 récupérées dans le support 34 macroscopique, il est possible d'effectuer des étapes d'analyse, des réactions chimiques ou des réactions biologiques classiques sur le contenu des gouttes 4. Par exemple, si les gouttes 4 contiennent des cellules, le système de récupération 1, 100 permet de récupérer les gouttes 4 individuellement avant de cultiver séparément les cellules.
  • Le système de récupération 1, 100 permet de récupérer des gouttes 4 individuelles à partir d'une quantité faible de gouttes 4 d'une émulsion 6. Par exemple, en partant de 0,1 µL d'émulsion 6 contenant 10 000 gouttes par µL, le système de récupération 1, 100 permet de récupérer individuellement 1000 gouttes.
  • En outre, chaque goutte 4 est associée à un signal de mesure. Le système de récupération 1, 100 permet d'avoir un lien entre l'information individuelle de la goutte 4 et la goutte 4 isolée. Chaque goutte 4 analysée est récupérable.
  • La mesure effectuée dans la région de mesure 52 est précise car la surface de la région de mesure 52 est adaptée au volume de la goutte 4. Le passage dans une échelle macroscopique permet la récupération du contenu de la goutte 4 dans un support 34 plus facilement manipulable. Enfin le système 1, 100 est automatisable. En effet, la taille des poches 35 facilite la manipulation des gouttes 4 et permet l'emploi d'instruments variés pour la récupération et après la récupération.
  • Le placement d'une goutte 4 dans chaque poche 35 permet en particulier de manipuler un objet macroscopique de volume significativement plus important que celui d'une goutte 4 individuelle, ce qui facilite la manipulation et garantit l'intégrité de la goutte 4.
  • Dans une variante, la sortie 66 de la puce débouche directement en regard d'un compartiment 82 du support 34 et le dispositif de déplacement 42 est propre à placer la sortie 66 de la puce 20 en regard d'un compartiment 82 différent après chaque déplacement du support 34 par rapport à la puce 20.
  • En variante, le système de récupération de gouttes comporte un dispositif de préparation de l'émulsion 6 disposé en amont de la zone d'entrée 48 de la puce 20.
  • Les débits sont avantageusement réglés par l'unité de commande 21 en fonction de la vitesse maximale de déplacement du dispositif de déplacement 42.
  • Dans un exemple, le système de récupération 1, 100 comporte en outre une zone d'incubation. L'émulsion 6 comporte des gouttes 4 comprenant une cellule ou aucune cellule.
  • Le procédé comprend la mise en culture de chaque cellule récupérée. L'analyse des gouttes 4 avant la sélection permet par exemple de ne cultiver que les cellules susceptibles de générer un clone intéressant. En outre, il n'est pas nécessaire d'effectuer plusieurs repiquages de clones avant d'obtenir une culture monoclonale puisque la cellule est déjà isolée avant la mise en culture. Ceci évite de devoir effectuer des dilutions limites multiple.
  • Par exemple, dans le cas du criblage de bactéries synthétisant un composé d'intérêt, le système permet d'associer le signal mesuré pour chaque goutte 4 contenant une bactérie ou une colonie issue d'une cellule unique au compartiment 84 dans lequel la goutte 4 a été récupérée. Ainsi, la bactérie est cultivée dans un milieu de culture adapté en fonction des informations mesurées.
  • Un troisième système de récupération 110 va être présenté en regard de la figure 4. Le troisième système de récupération 110 diffère des systèmes de récupération 1, 100 précédemment décrits en ce que l'injection de l'émulsion 6 dans la puce 20 est prévue par une partie inférieure de la puce 20.
  • Telle que représentée sur la figure 4, la puce 20 comprend un bloc supérieur 112 et un bloc inférieur 114 définissant entre eux le conduit de circulation 46. La puce 20 comprend en outre, dans la zone d'entrée 48, un bloc de connexion d'entrée 116. Dans la zone d'entrée 48, le bloc inférieur 114 est pris en sandwich entre le bloc supérieur 112 et le bloc de connexion d'entrée 116 selon la direction d'élévation Z. Par exemple, le bloc supérieur 112 et le bloc de connexion 116 sont en PDMS et le bloc inférieur 114 est en verre.
  • Le bloc de connexion d'entrée 116 définit un conduit d'entrée 118 s'étendant selon la direction d'élévation Z.
  • Dans la zone d'entrée 48, le bloc inférieur 114 est percé d'un orifice d'entrée 120. L'orifice d'entrée 120 traverse toute l'épaisseur du bloc inférieur 114 et débouche par la face supérieure du bloc inférieur 114 dans le conduit de circulation 46 et par la face inférieure du bloc inférieur 114 dans le conduit d'entrée 118.
  • Le conduit d'entrée 118 est aligné avec l'orifice d'entrée 120. Par exemple, le conduit d'entrée 118 est centré par rapport à l'orifice d'entrée 120.
  • Le diamètre de l'orifice d'entrée 120 est supérieur au diamètre du conduit d'entrée 118. Par exemple, le diamètre du conduit d'entrée 118 mesure 750 micromètres (µm) et le diamètre de l'orifice d'entrée 120 mesure 1,4 mm.
  • Le conduit d'entrée 118 débouche en aval dans l'orifice d'entrée 120 et en amont par la première entrée 60 dans un tube d'injection 122 relié au dispositif d'injection 22 de l'émulsion.
  • Le procédé de récupération des gouttes 4 avec le troisième système de récupération 110 diffère des procédés de récupération précédemment décrit en ce que l'injection de l'émulsion 6 est facilitée.
  • En effet, le flux de gouttes 4 passe directement du tube de d'injection 122 au conduit d'entrée 118, puis par l'orifice d'entrée 120 avant d'arriver dans le conduit de circulation 46 sans rencontrer d'obstacle. La lumière apparente est continue et de diamètre croissant dans le sens de circulation de l'émulsion 6, du tube de d'injection 122 au conduit d'entrée 118 et du conduit d'entrée 118 à l'orifice d'entrée 120. Ceci prévient les blocages de gouttes 4 dans des angles morts de connexion.
  • Dans ce troisième système de récupération 110, lors du transfert de l'émulsion 6 dans la puce 20, les pertes de gouttes 4 sont limitées.
  • L'injection prévue dans le troisième système de récupération 110 est particulièrement avantageuse pour les émulsions 6 comprenant un fluide interne 8 moins dense que le fluide externe 10. En effet si la direction d'élévation Z est verticale, la poussée d'Archimède favorise la montée des gouttes 4 selon la direction d'élévation Z dans le conduit d'entrée 118.
  • Un quatrième système de récupération 130 va être présenté en regard de la figure 5. Le quatrième système de récupération 130 diffère des systèmes de récupération 1, 100, 110 précédemment décrits en ce que la sortie des poches 35 et des séparateurs 80 de la puce 20 est prévue sur une partie supérieure de la puce 20.
  • Telle que représentée sur la figure 5, la puce 20 comprend un bloc supérieur 132 et un bloc inférieur 134 définissant entre eux le conduit de circulation 46. La puce 20 comprend en outre, au niveau de la sortie 66 de la puce, un bloc de connexion de sortie 136. Au niveau de la sortie 66, le bloc supérieur 132 est pris en sandwich entre le bloc inférieur 134 et le bloc de connexion d'entrée 136 selon la direction d'élévation Z.
  • Le bloc supérieur 132 définit un conduit de sortie 138. Le conduit de sortie 138 s'étend selon la direction d'élévation Z, perpendiculairement au conduit de circulation 46. Le conduit de sortie 138 débouche par la sortie 66 dans la lumière interne 87 du tube d'évacuation 38. Le diamètre du conduit de sortie 138 est inférieur au diamètre interne du tube d'évacuation 38.
  • Le bloc de connexion 136 définit un orifice 140 de diamètre supérieur au diamètre du conduit de sortie 138. Le diamètre de l'orifice 140 est sensiblement égal au diamètre externe du tube d'évacuation 38.
  • Dans un exemple, le tube d'évacuation 38 présente un diamètre interne de 750 micromètres et un diamètre externe de 1,6 mm, le conduit de sortie 138 présente un diamètre de 500 micromètres et l'orifice 140 présente un diamètre de 1,6 mm.
  • Le tube d'évacuation 38 est introduit dans l'orifice 140 du bloc de connexion 136 de sorte que la lumière du conduit de sortie 138 et la lumière interne 87 du tube d'évacuation 38 soient continues. L'extrémité amont 142 du tube d'évacuation 38 est en contact avec la face supérieure du bloc supérieur 132.
  • Le procédé de récupération des gouttes 4 avec le quatrième système de récupération 130 diffère des procédés précédemment décrit en ce que le transfert des poches 35 et séparateurs 80 de la puce 20 vers le tube d'évacuation 38 est facilitée.
  • En effet, le flux de poches 35 et de séparateur 80 passe directement du conduit de circulation 46 au conduit de sortie 138, puis dans la lumière 87 du tube d'évacuation 38 sans rencontrer d'obstacle. Les poches 35 en circulation circulent dans des conduits 138, 87 dont le diamètre augmente de la puce 20 vers le tube d'évacuation 38 dans le sens de circulation des gouttes 4 contenues dans les poches 35 et séparateur 80. En outre, du fait de la direction du conduit de sortie 138, les gouttes 4 ne sont pas coincées dans un angle mort au moment du changement d'échelle. Ceci permet de prévenir les blocages de gouttes ou séparateur dans des angles morts de connexion.
  • La sortie de la puce 20 prévue dans ce quatrième système de récupération 130 est particulièrement avantageuse lorsque le fluide porteur 26 est moins dense que le fluide séparateur 33. En effet si la direction d'élévation Z est verticale, la poussée d'Archimède favorise la montée des gouttes 4 selon la direction d'élévation Z dans le conduit de sortie 138 puis dans la lumière interne 87.
  • Un cinquième système de récupération 150 va être présenté en regard des figures 6 à 9. Le cinquième système de récupération 150 diffère des systèmes de récupération 1, 100, 110, 130, précédemment décrits en ce que le système 150 comprend un dispositif de distribution 152 de poches 35.
  • Le dispositif de distribution de poches 152 comprend le tube d'évacuation 38, un dispositif de mise en circulation 154 d'une pluralité de poches 35 successives, chaque poche 35 étant isolée de la poche 35 suivante par un séparateur 80 constitué de fluide séparateur 33, dans la lumière interne 87 du tube d'évacuation 38.
  • Le dispositif de distribution 152 de poches 35 comprend en outre un embout 156 propre à recevoir le tube d'évacuation 38 et une unité de soufflage 158.
  • Le dispositif de mise en circulation 154 est propre à contrôler le débit des poches 35 dans la lumière interne 87 du tube d'évacuation 38. Par exemple le dispositif de mise en circulation 154 est piloté par l'unité de commande 121. Le dispositif de mise en circulation 154 contrôle le dispositif d'injection 22 de l'émulsion 6, le dispositif 24 d'injection de fluide porteur 26 et/ou le dispositif 32 d'injection du fluide séparateur 33 dans la puce 20 pour que les poches 35 circulent dans la lumière interne 87 à un débit compris entre 100 µL/h et 5 mL/h et avantageusement à un débit de 2 mL/h.
  • Le tube d'évacuation 38 présente une portion principale 160 et une portion de sortie 162 reliée par un zone de rétrécissement 164.
  • La lumière interne 87 du tube d'évacuation 38 débouche sur une embouchure ouverte 166 dans la portion de sortie 162.
  • La portion principale 160 s'étend de l'extrémité amont 142 du tube d'évacuation 38, par exemple disposé à la sortie de la puce 66 à la zone de rétrécissement 164. La portion de sortie 162 s'étend de la zone de rétrécissement 64 à l'embouchure ouverte 166 située à l'extrémité aval du tube d'évacuation 38.
  • Le diamètre externe de la portion de sortie 162 du tube d'évacuation 38 est inférieur au diamètre extérieur de la portion principale 160 du tube d'évacuation 38. Par exemple, le diamètre externe de la portion de sortie 162 est sensiblement égal au diamètre interne de la portion principale 160.
  • Par exemple, la portion principale 160 présente un diamètre externe de 1,6 mm et un diamètre interne de 0,75 mm, et la portion de sortie 162 présente un diamètre externe de 0,75 mm et un diamètre interne de 0,3 mm.
  • En outre, le dispositif de récupération 152 comprend avantageusement un dispositif d'injection 168 de fluide séparateur 33 additionnel. Le dispositif d'injection 168 de fluide séparateur additionnel est propre à ajouter du fluide séparateur 33 dans au moins un séparateur 80 circulant dans la portion principale 160 du tube d'évacuation 38. Le dispositif d'injection 168 de fluide séparateur additionnel est propre à ajouter plus de 2 cm de fluide séparateur entre les poches 35.
  • L'embout 156 est par exemple un tube en verre. L'embout 156 est étendu selon la direction d'élévation Z. L'embout 156 présente un passage traversant 170 dans laquelle est disposée la portion de sortie 162 du tube d'évacuation 38.
  • L'embout 156 comprend une portion supérieure cylindrique 172 et une portion inférieure 174 creuse présentant une section tronconique ou incurvée. Le passage traversant 170 est étendu selon la direction d'élévation Z et débouche dans la portion inférieure 174 par un orifice délimité par un col 176.
  • Le diamètre de l'orifice délimité par le col 176 de l'embout 156 est légèrement supérieur au diamètre externe de la portion de sortie 162 du tube 38. Le diamètre interne de la portion supérieure 172 est supérieur au diamètre externe de la portion de sortie 162 du tube d'évacuation 38.
  • La portion inférieure 174 de l'embout 156 présente avantageusement une forme biseautée à 45°.
  • Le tube d'évacuation 38 est placé dans le passage traversant 170 de l'embout 156 de telle sorte que le tube d'évacuation 38 fasse saillie hors de l'embout 156. L'embouchure 166 est hors de l'embout 156. Par exemple l'embouchure 166 du tube d'évacuation 38 est à une distance du col 176 de l'embout 156 comprise entre 1 mm et 10 mm.
  • La paroi externe 164 du tube d'évacuation 38 est en appui sur le col 176 de l'embout 156 à la sortie du passage traversant 170.
  • L'unité de soufflage 158 est propre à injecter un flux d'air dans le passage traversant 170 de sorte à ce qu'une partie de l'air longe la paroi externe 164 du tube d'évacuation 38, jusqu'à l'embouchure 166 du tube d'évacuation 38. Par exemple, l'unité de soufflage 158 comporte un tube d'injection de 3 m de long et de diamètre interne 150 µm et la pression d'injection en entrée du tube d'injection est comprise entre 500 mBar et 1600 mBar.
  • Le dispositif de distribution de poches 152 comprend une unité de contrôle 180 propre à contrôler l'unité de soufflage 158 de sorte à ce qu'elle injecte de l'air dans le passage traversant 170 à un débit compris entre 1 µL/h et 2 mL/h et avantageusement à un débit de 500 µL/h.
  • En outre, l'unité de contrôle 180 commande le dispositif de mise en circulation des poches 154.
  • Un procédé de distribution de poches va maintenant être décrit.
  • Un dispositif de distribution 152 tel que précédemment décrit est fourni. Des poches 35 et des séparateurs 80 sont mis en circulation dans la lumière interne 87 par le dispositif de mise en circulation 154.
  • Dans un exemple, du fluide séparateur additionnel est injectée dans les séparateurs 80 par le dispositif d'injection 168.
  • De l'air est injecté dans le passage traversant 170 de l'embout 156 par l'unité de soufflage 158. Le débit d'air et le débit des poches 35 sont ajustés par l'unité de contrôle 180 pour que chaque poche 35 se détache successivement de l'embouchure 166 du tube d'évacuation 38.
  • Ce dispositif améliore la distribution des gouttes.
  • La figure 7 représente l'éjection d'une poche 35. Une partie du fluide porteur 26 de la poche 26 adhère à la paroi externe 164 du tube d'évacuation 138 par capillarité. Le flux d'air longeant la paroi externe 164 du tube d'évacuation 38 permet de décrocher la poche 35.
  • L'injection d'air par l'unité de soufflage 158 à travers l'embout 156 permet d'éjecter la poche 35 du tube d'évacuation 38 avant l'arrivée de la poche 35 suivante en évitant que la poche 35 reste fixée à l'embouchure 166
  • Les figures 8 et 9 présentent des résultats de distribution obtenus pour différentes conditions expérimentales. Le support de récupération 34 est une feuille de papier.
  • Ces résultats ont été obtenus avec un débit de poches dans le tube d'évacuation 38 maintenus à trois poches par seconde par l'unité de contrôle 180.
  • Dans l'exemple de la figure 8, les poches 35 ont été récupérées sur le support 34 dans des conditions de fragmentation.
  • Les poches 35 sont récupérées une à une sur le support 34. Chaque poche est éjectée de la sortie avant l'arrivée de la poche 35 suivante.
  • Cependant, certaines poches 35 se fragmentent lors de l'éjection. Un débit d'air supérieur à 1,6 bar aboutit à une fragmentation des poches 35 individuelles récupérées.
  • Chaque tâche 182 formée sur le support 34 provient seulement d'une poche 35. Une même poche 35 qui s'est fragmenté lors de l'éjection forme un groupe 186 de petites taches visibles sur le support 34. Certaines poches 35 ne se fragmentent pas et forment une tache 184 plus large.
  • Dans un deuxième exemple de distribution présenté sur la figure 9, les débits sont ajustés pour que les poches 35 conservent leur volume intègre lors de l'éjection. Les poches 35 individuelles sont distribuées sans fragmentation. Les taches 184 obtenues sur le support 34 présentent sensiblement le même diamètre.
  • Le réglage des paramètres permet de faciliter l'extraction et la localisation des poches 35 sur le support 34.

Claims (15)

  1. Procédé de récupération de gouttes (4), comprenant les étapes suivantes :
    - fourniture d'une puce (20) comportant un conduit de circulation (46) de fluide définissant successivement dans un sens de circulation des fluides, une zone d'entrée (48), une zone d'espacement (50), une zone d'injection (54) et une zone de séparation (56),
    - injection d'une émulsion (6) de gouttes (4) d'un fluide interne (8) dispersées dans un fluide externe (10), dans la zone d'entrée (48),
    - injection d'au moins un fluide porteur (26) miscible avec le fluide externe (10) dans la zone d'espacement (50), pour former dans le conduit de circulation (46) un fluide de travail (28) comprenant du fluide porteur (26) et des gouttes (4) de l'émulsion (6) espacées les unes des autres le long du conduit (46),
    - convoyage du fluide de travail (28) dans le conduit de circulation (46), caractérisé en ce que le procédé comprend les étapes suivantes :
    - injection d'un fluide séparateur (33) non miscible avec le fluide porteur (26) dans la zone d'injection, pour séparer le fluide de travail (28) en une pluralité de poches (35) successives comprenant du fluide porteur (26), chaque poche (35) étant isolée de la poche (35) suivante par un séparateur (80) constitué de fluide séparateur (33),
    - convoyage des poches (35) et des séparateurs (80), dans la zone de séparation (56), vers une sortie (66) de la puce (20),
    - récupération dans un compartiment (82) d'un support de récupération (34) d'au moins une poche (35) comprenant une goutte (4) récupérée après le convoyage, le procédé comportant une étape de détection du passage de gouttes (4) successives, la détection d'une goutte (4) commandant l'injection d'un volume de fluide séparateur (33) et la formation d'une poche (35).
  2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le conduit de circulation (46) est plus large dans la zone de séparation (56) que dans la zone d'espacement (50).
  3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel chaque poche (35) comprend du fluide porteur (26) et strictement moins de deux gouttes (4).
  4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la sortie (66) de la puce (20) débouche dans un tube d'évacuation (38) présentant une sortie (86).
  5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le support (34) comporte plusieurs compartiments (82) séparés les uns des autres, et le procédé comporte, après chaque étape de récupération, une étape de déplacement relatif du support (34) par rapport à la puce (20), la sortie (86) du tube d'évacuation (38) étant placée en regard d'un compartiment (82) différent après chaque déplacement du support (34).
  6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une détection du passage des poches (35) successives.
  7. Procédé selon la revendication 5 dans lequel, le déplacement du support (34) est commandé en fonction de chaque détection de gouttes (4), pour qu'une seule poche (35) comprenant une goutte (4) détectée à l'étape de détection soit récupérée dans chaque compartiment (82) du support (34).
  8. Procédé selon les revendications 5 et 6, prises ensembles, dans lequel le déplacement du support (34) est commandé en fonction de chaque détection de poche (35), pour qu'une seule poche (35) comprenant une goutte (4) détectée à l'étape de détection soit récupérée dans chaque compartiment (82) du support (34).
  9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape de détection de poches (35) dans une zone de détection en aval de la zone de séparation (56).
  10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape d'ajout d'une solution complémentaire (104) dans au moins une poche (35).
  11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel la poche (35) dans laquelle la solution complémentaire (104) est ajoutée comprend une goutte (4) d'émulsion (6) et le procédé comporte une étape de fusion de ladite goutte (4) d'émulsion (6) avec la solution complémentaire (104) ajoutée.
  12. Système de récupération de gouttes (1, 100, 110, 130, 150), comprenant :
    - une puce (20) comportant un conduit de circulation (46) de fluide définissant successivement dans le sens de circulation des fluides, une zone d'entrée (48), une zone d'espacement (50), une zone d'injection (54) et une zone de séparation (56),
    - un dispositif (22) d'injection d'une émulsion (6) de gouttes (4) d'un fluide interne (8) dispersées dans un fluide externe (10), dans la zone d'entrée (48),
    - un dispositif (24) d'injection d'au moins un fluide porteur (26) miscible avec le fluide externe (10) dans la zone d'espacement (50), pour former dans le conduit de circulation (46) un fluide de travail (28) comprenant du fluide porteur (26) et des gouttes de l'émulsion (6) espacées les unes des autres le long du conduit (46),
    - un dispositif (32) d'injection d'un fluide séparateur (33) non miscible avec le fluide porteur (26) dans la zone d'injection (54), pour séparer le fluide de travail (28) en une pluralité de poches (35) successives comprenant du fluide porteur (26), chaque poche (35) étant isolée de la poche (35) suivante par un séparateur (80) constitué de fluide séparateur (33), et
    - une unité de commande (21) propre à faire circuler le fluide de travail (28) dans le conduit de circulation (46), et à convoyer les poches (35) et les séparateurs (80), dans la zone de séparation (56), vers une sortie (66) de la puce (20),
    - un support de récupération (34), le support (34) comportant au moins un compartiment (82), pour la récupération d'au moins une poche (35) comprenant une goutte (4) dans le compartiment (82),
    - un capteur (36) propre à détecter le passage de gouttes (4) successives de l'émulsion (6) dans le fluide de travail (28), la détection d'une goutte (4) par le capteur (36) entrainant la commande par l'unité de commande (21) de l'injection d'un volume déterminé de fluide séparateur (33) permettant la formation d'une poche (35).
  13. Système de récupération de gouttes (1, 100, 110, 130, 150) selon la revendication 12, dans lequel la sortie (66) de la puce (20) débouche dans un tube d'évacuation (38) présentant une sortie (86), le support (34) comportant plusieurs compartiments (82) séparés les uns des autres, et le système comprend un dispositif de déplacement (42) relatif du support (34) par rapport à la puce (20), après chaque récupération, le dispositif de déplacement (42) étant propre à placer la sortie (86) du tube d'évacuation (38) en regard d'un compartiment (82) différent après chaque déplacement du support (34) par rapport à la puce (20).
  14. Système de récupération de gouttes (1, 100, 110, 130, 150) selon la revendication 13, dans lequel le capteur (36) est propre à détecter le passage de gouttes (4) successives dans la zone d'espacement (50), le dispositif de déplacement (42) étant commandé en fonction de chaque détection de gouttes (4), pour qu'une seule poche (35) comprenant une goutte (4) détectée à l'étape de détection soit récupérée dans chaque compartiment (82) du support (34).
  15. Système de récupération de gouttes (1, 100, 110, 130, 150) selon la revendication 12 à 14, dans lequel la sortie (66) de la puce (20) débouche dans un tube d'évacuation (38), le tube d'évacuation (38) définit une lumière interne (87) débouchant sur une embouchure ouverte (166), le tube d'évacuation (38) comprenant une paroi externe (164) et le système (1, 100, 110, 130, 150) comprend un embout (156) présentant un passage traversant (170), le tube d'évacuation (38) étant placé dans le passage traversant (170) et le système (1, 100, 110, 130, 150) comprend une unité de soufflage (158) propre à injecter un flux d'air dans le passage traversant (170) de sorte à ce qu'une partie de l'air longe la paroi externe (164) du tube d'évacuation (38), jusqu'à l'embouchure (166) du tube d'évacuation (38).
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