EP3204743A1 - Fluorometrische temperatursensorik mit fret-basierten molecular beacons in molekularbiologischen und diagnostischen assays - Google Patents

Fluorometrische temperatursensorik mit fret-basierten molecular beacons in molekularbiologischen und diagnostischen assays

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Publication number
EP3204743A1
EP3204743A1 EP15771163.1A EP15771163A EP3204743A1 EP 3204743 A1 EP3204743 A1 EP 3204743A1 EP 15771163 A EP15771163 A EP 15771163A EP 3204743 A1 EP3204743 A1 EP 3204743A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
emissive
temperature
quencher
acceptor
molecular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15771163.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andy Wende
Ute Resch-Genger
Zerrin Fidan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung
Original Assignee
Qiagen GmbH
Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH, Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP3204743A1 publication Critical patent/EP3204743A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/01—Measuring temperature of body parts ; Diagnostic temperature sensing, e.g. for malignant or inflamed tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01K—MEASURING TEMPERATURE; MEASURING QUANTITY OF HEAT; THERMALLY-SENSITIVE ELEMENTS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • G01K11/00—Measuring temperature based upon physical or chemical changes not covered by groups G01K3/00, G01K5/00, G01K7/00 or G01K9/00
    • G01K11/20—Measuring temperature based upon physical or chemical changes not covered by groups G01K3/00, G01K5/00, G01K7/00 or G01K9/00 using thermoluminescent materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/48—Other medical applications
    • A61B5/4848—Monitoring or testing the effects of treatment, e.g. of medication

Definitions

  • the present invention is in the field of biochemical sensing and is concerned with the use of molecular beacons as temperature sensors.
  • Thermocouples non-contact or non-invasive temperature measurements with optical methods are widespread.
  • Processes are of great importance because they affect the biochemical reactions in the cells.
  • Temperatur measurements in moving e.g.
  • Rotary systems such as certain readout devices for microfluidic assays and reactions, in cells or in conditions where generally no electrical sensors can be used, are particularly suitable optical T-probes
  • the non-contact temperature measurement e.g. allow luminescence in the NIR or visible vis spectral range, sometimes even intracellularly.
  • lanthanide-based molecular thermometers eg, rare-earth-doped nanoparticles
  • up-converting luminescent nanoparticles e.g., up-converting luminescent nanoparticles, polymer-based nanogels, fluorescent gold nanoparticles, or luminescent metal-ligand complexes or organic dyes with temperature-dependent optical
  • the use of at least one Molecular Beacon (MB) as a temperature sensor in biological assays or diagnostic methods comprising a fluorescent donor and a non-emissive quencher, or a fluorescent donor and an emissive acceptor, or a fluorescent A donor and a non-emissive acceptor wherein the fluorescent donor, non-emissive quencher, emissive acceptor and non-emissive acceptor are temperature stable.
  • MB Molecular Beacon
  • a temperature stability of the fluorescent donor, the non-emissive quencher, the emissive acceptor and the non-emissive acceptor is preferably given by molecular rigid structures in which all potential quenching channels are bridged and corresponding parts of the molecule can not rotate freely or thermally labile
  • Bindings are avoided or bridged.
  • a temperature resistance in particular for a fluorescent donor and / or a emissive acceptor according to the proposed use consists in a constant fluorescence without significant change in the intensity of the fluorescence and / or without a significant shift of the emitted wavelength (s).
  • a temperature resistance is for a fluorescent donor and / or an emissive
  • a temperature stability for a fluorescent donor and / or an emissive acceptor is that the fluorescence intensities of the initial value 20 ° C and end value 95 ° C differ by ⁇ 30%, preferably ⁇ 20% and most preferably ⁇ 10%.
  • a temperature stability for a fluorescent donor and / or an emissive acceptor is that the
  • Temperature range of 50 ° C, preferably 60 ° C, more preferably 70 ° C, in particular in the temperature range of 20 ° C to 95 ° C differ by ⁇ 30%, preferably ⁇ 20% and most preferably ⁇ 10%.
  • the integral emission is here defined as the quotient of the respective integrals of the emission signals of a dye as a function of the temperature and the integral of the emission signal of a dye at a specific temperature (here minimum temperature T min in ° C) over a specific wavelength range ( ⁇ ). It is calculated according to the following formula and formula:
  • a temperature resistance of an extinguisher is that the wavelength of the absorbed light does not change significantly with a temperature change up to 100 ° C.
  • a temperature resistance of an extinguisher is that the wavelength of the absorbed light at a temperature change of 50 ° C, preferably 60 ° C, more preferably 70 ° C, and even more preferably 100 ° C by ⁇ 100 nm, preferably ⁇ 80 nm , even more preferably ⁇ 70 nm and most preferably ⁇ 50 nm.
  • a shift in the wavelength of the absorbed light of ⁇ 100 nm, preferably ⁇ 80 nm, even more preferably ⁇ 70 nm and most preferably ⁇ 50 nm in a temperature range from 20 to 95 ° C.
  • the temperature resistance of an extinguisher can be that the intensity of the absorption over a certain temperature range is stable by the intensity hardly changes, and thus is not temperature-dependent.
  • the temperature resistance is considered to be when, in a temperature range such as 20 to 95 ° C, the intensity of the absorption increases by only 30% from an initial value such as 20 ° C when heated to a final value such as 95 ° C. preferably 20% more preferably 10%> and most preferably 5% changes.
  • Molecular beacons have been described as being useful in non-invasive temperature measurements. However, these molecules have hitherto only found use in improving melting point analyzes, for temperature calibration in microfluidic chips, in microchip-based biosensors, as L-DNA based in vivo nano-thermometers, and as pH-dependent fluorescent probes.
  • molecular biology assays allows a non-invasive and highly sensitive
  • molecular beacons as temperature sensors as proposed herein, temperature measurements are also possible in very small volumes as in microfluidic systems as well as for rotating systems, especially in rotating microfluidic readout devices. Furthermore, temperature measurements are possible on membranes, on biochips, in pores and in microchannels as well as in microtiter plates.
  • the above-specified molecular beacons are used for biological DNA-based assays, in particular for a PCR
  • thermohilic helicase-dependent amplification tHDA
  • immuno-PCR immuno-PCR
  • aptamer-based assay e.g., a thermohilic helicase-dependent amplification (tHDA)
  • tHDA thermohilic helicase-dependent amplification
  • immuno-PCR immuno-PCR
  • aptamer-based assay e.g., an immuno-PCR or an immuno-PCR.
  • the Molecular Beacons specified above find application for temperature monitoring in quantitative real-time PCR, in the ligase chain reaction (LCR), in one
  • SDA Strand displacement amplification
  • MDA multiple displacement amplification
  • RCA rolling circle amplification
  • SPIA single primer isothermal amplification
  • TMA transcription mediated amplification
  • NEAR nicking enzyme amplification reaction
  • EXPAR exponential amplification reaction
  • LAMP loop mediated isothermal amplification
  • RPA recombinase polymerase amplification
  • NASBA nucleic acid sequence-based amplification
  • SMAP smart-amplification process
  • rtPCR nucleic acid real-time PCR
  • Preferred temperature ranges that can be monitored and determined by molecular beacons as proposed herein are preferably in the range of 50-75 ° C for fluorescence measurements, for isothermal methods, in particular isothermal amplifications in the range of 35-65 ° C and for Melting curves of probes, amplicons or genomic DNA in the range of 45-90 ° C. It is advantageous to the present proposal that the use of the molecular thermometers proposed herein for high-sensitivity temperature measurement in bio-analytically relevant buffers (e.g., PBS or HDA buffer) occurs in the T-range of about 35-98 ° C.
  • bio-analytically relevant buffers e.g., PBS or HDA buffer
  • the molecular beacons were constructed and synthesized by conventional methods in order to provide them for the temperature ranges in question with a corresponding melting point.
  • the calculation of the structure, in particular the structure and sequence of the stem region, and the resulting melting points is well known to the skilled person and will not be reproduced here.
  • the calculation of the structure can be carried out according to the methods of the following references:
  • Particularly suitable molecular beacons are:
  • MB molecular beacon
  • NIR near or near infrared
  • the use of at least one molecular beacon is proposed wherein the at least one molecular beacon comprises a fluorescent donor and a non-emissive quencher.
  • fluorescent donors are in principle molecular compounds such as small organic dyes, metal-ligand compounds such as lanthanide chelates and complexes, or nanoscale reporters such as fluorescent particles such as
  • fluorophore-doped or labeled polymer or silica particles, or Mosaic viruses semiconductor nanomaterials such as quantum dots, upconversion nanoparticles in question.
  • the compounds selected from these classes of dyes have the temperature stability described herein as well as their suitability to be bound to molecular beacons. Particular preference is given to dyes having a rigid chromophore skeleton with sterically fixed functional groups whose rotation could lead to fluorescence quenching.
  • fluorescent dyes proposed as fluorescent donors are selected from the group consisting of and / or comprising rhodamine 101, rhodamine 6G, 2,3,6,7-tetrahydro-9- (trifluoromethyl) -1H, 5H, HH- [1] benzopyrano (6,7,8-ij) quinolizine-1-one (coumarin 153), 6-carboxy-X-rhodamines (ROX) and Atto 647 N.
  • the corresponding structural formulas are shown in FIG.
  • molecular systems such as non-fluorescent organic dyes or non-emissive nanoscale particles, such as metal nanoparticles of, for example, gold or silver or carbon nanotubes (CNTs) come into question as non-emissive quenchers.
  • non-fluorescent organic dyes or non-emissive nanoscale particles such as metal nanoparticles of, for example, gold or silver or carbon nanotubes (CNTs) come into question as non-emissive quenchers.
  • CNTs carbon nanotubes
  • azo compounds are proposed as extinguishers, selected from the group consisting of and / or comprising Black Hole Quencher 1 TM, Black Hole Quencher 2 TM, Black Hole Quencher 3 TM and 4 - ((4- (dimethylamino) phenyl) azo) benzoic acid (Dabcyl), Deep Dark Quencher (DDQ) and BlackBerry Quencher, as well as Iowa Black FQ and RQ, QXL Quencher, and DYC Quencher.
  • the use of at least one molecular beacon is proposed, wherein the at least one molecular beacon comprises a fluorescent donor and an emissive acceptor.
  • Suitable fluorescent donors are the compounds already mentioned above.
  • an emissive acceptor come molecular compounds such as small organic dyes, metal-ligand compounds such as lanthanide chelates and
  • the aforementioned compounds have the temperature stability described herein as well as their suitability to be bound to molecular beacons. Preference is given in particular Compounds of compound classes which are also suitable as fluorescent donors, such as xanthene or coumarin dyes with sterically fixed groups.
  • the use of at least one molecular beacon is proposed, wherein the at least one molecular beacon comprises a fluorescent donor and a non-emissive acceptor.
  • Suitable fluorescent donors are the compounds already mentioned above.
  • Suitable non-emissive acceptors are molecular compounds such as small organic dyes or metal-ligand compounds which absorb strongly but do not shine, or nonfluorescent nanoscale systems such as, for example, dye-doped or labeled polymer or silica particles or mosaic viruses and metal particles, for example, gold or silver particles, carbon nanotubes or graphene.
  • nonfluorescent nanoscale systems such as, for example, dye-doped or labeled polymer or silica particles or mosaic viruses and metal particles, for example, gold or silver particles, carbon nanotubes or graphene.
  • the aforementioned compounds have those described herein
  • chromophores with substituents which quench the fluorescence, e.g. Bromide, iodide and nitro compounds.
  • the non-emissive acceptor extinguishes the fluorescence of the fluorescent donor as much as possible, for example by contact-based processes, electron transfer, energy transfer, a heavy atom effect or
  • Paramagnetism Depending on the quenching process, it may happen that the non-emissive acceptor absorbs the emission of the fluorescent donor.
  • an effective FRET is formed in each of the combinations of a fluorescent donor and a non-emissive quencher, a fluorescent donor and an emissive acceptor, and a fluorescent donor and a non-emissive acceptor.
  • an effective FRET it is particularly preferred if in the closed state of the MB below the melting temperature T m efficient FRET takes place, so that either upon excitation of the donor only the fluorescence of the acceptor is detected or when using a non-fluorescent acceptor no or only minimal fluorescence occurs.
  • fluorescent dyes it is preferred that in addition to a temperature resistance in the form of the lowest possible temperature dependence their absorption and fluorescence, an efficient FRET of donor and acceptor fluorophore, so a very good spectral superposition of the absorption and
  • Emission spectra is given.
  • the maximum of the emission of the one fluorescent donor is less than 100 nm from the maximum of the
  • the maximum of the emission of the one fluorescent donor and the maximum of the absorption of the quencher are in the range of 400 to 800 nm, more preferably from 500 to 700 nm.
  • At least one molecular beacon is immobilized as a temperature sensor in biological assays or diagnostic methods.
  • Immobilization involves localization of the molecular beacons by covalent attachment, e.g. on channel inner walls of micro fluidic chips, on membranes, on glass- or polymer-based biochips, on porous carrier materials such as cellulose, silica nanoparticles, etc., and on other materials used for performing DNA-based assays, or on optical materials Fibers for the production of
  • Temperature sensors to support materials such as glass slides, polymers, Au surfaces, optical fibers or nanomaterials such. Quantum Dots (QD), metal nanoparticles or magnetic nanoparticles (MNP).
  • QD Quantum Dots
  • MNP magnetic nanoparticles
  • Another area of immobilization is the attachment to particles which can function either as support materials, for use in temperature sensing in DNA-based assays or on particles such as e.g. Iron oxide particles or metal particles for use in temperature sensors
  • Such immobilization preferably takes place by appropriate functionalization of the nucleotides in the loop or stem sequence ("loop and stone region engineering") .
  • modified, non-natural nucleotides can be incorporated into the loop sequence to form different linkers such as linking PEG, peptide or hydrocarbon linkers to the corresponding nucleotides to immobilize the MBs on the desired support materials.
  • linkers such as linking PEG, peptide or hydrocarbon linkers to the corresponding nucleotides to immobilize the MBs on the desired support materials.
  • biotin-streptavidin the biotinylated to the stem sequence Molecular Beacon by the binding of the biotin to a streptavidin-coated surface of the
  • Bound carrier material in another embodiment, immobilization of a molecular beacon can also be accomplished by attachment via stimuli-responsive "cleavable" linkers
  • Immobilization can be selectively reversed, for example, by reductive, enzymatic, photochemical and / or thermal cleavage.
  • Sensor arrays can be constructed by the Molecular Beacons in all
  • Temperature measurement in the body to control and monitor hyperthermia treatment.
  • the positioning of the temperature sensors based on molecular beacons allows local temperature measurements at different locations in a microfluidic chip such as a "lab-on-a-chip” reactor module, or in a biotechnological reactor or in different sized cavities ,
  • At least two molecular beacons are used which carry different temperature-stable and substantially inert fluorescent dyes with emission in the vis and NIR range, the molecular beacons emitting in different color channels.
  • Advantage of such an embodiment is an improved measurement data quality and an increased sensitivity of the temperature measurement.
  • the accuracy of the determined temperature and the temperature resolution can be increased when using different molecular beacons with possibly different spectral properties.
  • a combination of at least two molecular beacons comprising a fluorescent donor and a non-emissive quencher, or a fluorescent donor and an emissive acceptor, or a fluorescent donor and a non-emissive acceptor, wherein the fluorescent donor, the non-emissive quencher, the emissive acceptor and the non-emissive acceptor are temperature stable.
  • a temperature resistance for a fluorescent donor and / or an emissive acceptor and / or a non-emissive extinguisher according to the proposed combination has the same requirements as described in [0009] to [0014].
  • the temperature resolution can be significantly increased by the presence of a larger and more extensive data set.
  • the temperature resolution can be increased so far that a T resolution ⁇ 1 ° C (preferably 0.9 ° C to 0.05 ° C, more preferably 0.5 ° C to 0.1 ° C) is made possible by mathematical evaluation.
  • the use of more than one molecular beacon is of particular interest for lower temperature ranges below 45 ° C, as in this range the inherent temperature resolution of Molecular Beacons is less accurate.
  • a molecular beacon A control to reach or undercut a certain minimum temperature by means of "yes / no” - decisions with a high precision is particularly suitable for process control and can thus support automation. Such automation could find particular application to a high throughput method.
  • a combination of at least two molecular beacons is furthermore proposed, wherein the temperature resolution can be regulated to less than 1 ° C. by the length of the nucleotide strand and / or the guanine cytosine content.
  • a combination of at least two molecular beacons is proposed, wherein the at least two molecular beacons are immobilized on a support.
  • the at least two molecular beacons to be immobilized carry a chemical functionalization via which the attachment to a carrier for immobilization occurs.
  • fluorescent donors are selected from the group consisting of or consisting of Rhodamine 101, Pvhodamine 6G, Coumarin 153, 6-carboxy-X-Rhodamine, and Atto 647N.
  • the non-emissive quencher is selected from the group consisting of or consisting of Black Hole Quencher 2 (BHQ 2), Black Hole Quencher 3 (BHQ 3), and Dabcyl.
  • a sensor array comprising a solid support, and a combination of at least two molecular beacons as suggested herein.
  • a sensor array is proposed, wherein the support is selected from the group consisting of or consisting of 2D and 3D supports such as membranes, films, glass supports, polymer support, mesoporous particles and gels, optical fibers, microchannels and microtiter plate wells.
  • 2D and 3D supports such as membranes, films, glass supports, polymer support, mesoporous particles and gels, optical fibers, microchannels and microtiter plate wells.
  • a sensor array is proposed, wherein the 2D and 3D supports can consist of membranes, films and / or microscope slides made of glass, polymers or mesoporous particles.
  • a sensor array comprising a solid support, and a combination of at least two molecular beacons, wherein the at least two molecular beacons carry different temperature-stable and substantially inert fluorescent dyes, in particular with emission in the vis and NIR range ,
  • Sensor arrays proposed as a temperature sensor in biological assays or diagnostic procedures.
  • FIG. 1 shows schematically a fluorescent nucleotide
  • donor fluorophore
  • the distance between donor and acceptor is temperature-dependent, which causes a temperature-dependent fluorescence of the MB.
  • FIG. 2 shows a selection of suitable ones
  • Fluorescent dyes are fluorescent dyes.
  • FIG. 3 shows a selection of suitable extinguishing molecules.
  • Figure 4 shows the temperature dependence of the absorption of ROX, (A) before and after heating at 25 ° C and (B) at 25 ° C, 60 ° C and 80 ° C.
  • FIG. 5 shows in (A) a comparison of the absorption
  • Figure 6 shows the temperature dependence of the absorption of Atto 647 N, (A) before and after heating at 25 ° C and (B) at 25 ° C, 60 ° C and 80 ° C.
  • FIG. 7 shows in (A) a comparison of the absorption
  • Figure 8 shows in (A) the absorption behavior of BHQ2 and BHQ3 at 25 ° C and in (B) the absorption behavior of BHQ3 at 25 ° C before and after heating and at 90 ° C.
  • Figure 9 shows the temperature resistance of the emission of Atto647 N and ROX by comparing the normalized Emission in (A) at 20 ° C, 60 ° C and 80 ° C for Atto 647 N and in (B) at 20 ° C, 60 ° C and 95 ° C for ROX.
  • FIG. 10 shows, in comparison to FIG. 9, the drop in the emission intensity in the temperature-resistant one
  • Fluorescent dye TAMRA in the range of 20 ° C to 95 ° C.
  • FIG. 11 shows in (A) the normalized absorption of BHQ3 together with the normalized emission of Atto 647 N and in (B) the normalized absorption of BHQ2 together with the normalized emission of ROX.
  • FIG. 12 shows in (A) the change of
  • FIG. 13 shows in (A) the change of
  • FIG. 14 shows in (A) the temperature dependence of the normalized fluorescence in a temperature range of 20-95 ° C. for the molecular beacon 5'-ROX-MB64-BHQ2-3 'and in (B) the temperature dependence of the normalized fluorescence in a temperature range of 20-95 ° C for the Molecular Beacon 5 '-FAM-MB59-TAMRA-3' with the sequence
  • FIG. 15 shows the temperature dependence of
  • FIG. 16 shows the melting point determination of the molecular beacon used in a tHDA 5'-ROX-MB70-BHQ2-
  • Figure 1 illustrates that below the melting temperature T m efficient FRET occurs, so that either ideally when the donor is excited only the fluorescence of the acceptor is detected or when using a non-fluorescent acceptor no or minimal fluorescence.
  • T m melting temperature
  • FIG. 4A illustrates that the absorption of ROX does not change despite intermediate heating to 95 ° C. This will be the
  • Figure 5B illustrates that also the emission of ROX at different temperatures 25 ° C, 60 ° C and 95 ° C does not differ significantly and that the emission remains stable even after heating to 95 ° C at 25 ° C.
  • Figure 6A illustrates that the absorption of Atto 647 N despite interim heating to 80 ° C does not change and is constant. This shows the temperature resistance of Atto 647 N. The same is illustrated in Fig. 6B, which shows that the absorption of Atto 647 N at 25 ° C, 60 ° C and 80 ° C is approximately equal.
  • Figure 7B illustrates that the fluorescence of Atto 647 N at different temperatures 25 ° C, 60 ° C and 80 ° C does not differ significantly and that the fluorescence even after heating to 80 ° C at 25 ° C stable remains.
  • Figure 8B illustrates that also the absorption of BHQ3 at different temperatures 25 ° C and 90 ° C does not differ significantly and only a small bathochromic shift of the absorption band takes place. Further, Fig. 8B shows that the absorption remains stable even after heating to 90 ° C at 25 ° C.
  • Figures 9A and B illustrate that with respect to the relative integral emission, a temperature increase for the fluorescent dyes ROX and Atto 647 N no significant change occurs at a temperature increase from 20 ° C to 90 ° C (Atto 647 N) or 95 ° C (ROX).
  • Fig. 10 illustrates that, compared to ROX and Atto 647N, the fluorescent dye TAMRA suffers a significant drop in emission intensity in the range of 20 ° C to 95 ° C.
  • TAMRA unlike ROX and Atto 647 N, is an example of a temperature-unstable fluorescent dye.
  • Figures 11A and 11B illustrate that Atto 647 N and BHQ3, as well as 6-ROX and BHQ2 form good FRET pairs.
  • Figs. 12A and 12B illustrate the suitability of the Molecular Beacons 56 and 64 for the respective temperature ranges around 56 ° C and 64 ° C.
  • Figure 13B illustrates that the molecular beacons ROX-MB56-BHQ2 and ROX-MB64-BHQ2 emit temperature resistant in a temperature range of 35 ° C to 80 ° C without significant shift of the emitted wavelength.
  • MB56 + 64 ROX-BHQ2 a calibration level of 56-68 ° C was obtained for which the uncertainty is +/- 0.7 ° C.
  • Figure 14A illustrates the suitability of the Molecular Beacon ROX-MB64-BHQ2 as a temperature sensor in a temperature range of 55 ° C to 95 ° C.
  • Fig. 14 B illustrates that a non-temperature resistant
  • Fluorescent dye such as TAMRA (fluorescence range around 580 nm) does not allow the use of molecular beacons as a temperature sensor in biomolecular systems, since the fluorescence intensity in the temperature range between 25 ° C and 95 ° C does not remain constant and decreases significantly.
  • Figures 15 and 16 illustrate that the molecular beacons used in a tHDA have not taken damage during the reaction and continue to have a stable melting point and exhibit a clean increase in fluorescence upon temperature elevation.
  • the fluorescence measurements as a function of the temperature were carried out with the fluorescence spectrometer FSP920 Edinburgh Instruments.
  • the absorption measurements were carried out with the CARY 5000 Varian absorption spectrometer.
  • the temperature behavior of the molecular beacons was measured in 10 ⁇ 2 mm cuvettes from Hellma Analytics in PBS buffer (pH 7.4) (concentrations around the ⁇ ). The temperature tests were carried out in the respective spectrometers by means of temperature-controlled
  • the dye-bound molecular beacons 5 '-ROX-MB56-BHQ2-3', 5 '-ROX-MB64-BHQ2-3' and 5 '-ROX-MB70-BHQ2-3' were obtained from the company metabion international AG ( Planegg, Germany) and acquired from there.
  • the molecular beacons used here have the following structures:
  • MB-56 5'-ROX-TC ATGC TTTTTTTTT GC ATGT-BHQ2-3 ';
  • MB-70 5 '-ROX-TCGC ATGG TTTTTTTTT CCATGCGT -BHQ2-3'
  • a tHDA was performed in the presence of 5 '-ROX-MB70-BHQ2-3'.
  • three primer solutions were prepared comprising a forward primer, a Reverse primer, a double-labeled probe molecule in RNA-free water with different amounts of 5'-ROX-MB70-BHQ2-3 ':
  • RNA-free water 1.4 The various primer sets were then reacted with common buffer solution, an enzyme mix containing helicase and a common helicase buffer of TRIS, NaCl, DTT, EDTA and glycerol, a 5 mM MgSO 4 solution and water according to the following
  • the incubation was carried out in a RotorGene Q (QIAGEN, Hilden, Germany) PCR cycler at 65 ° C. 15 ⁇ of the reaction mixture was transferred to the prepared RGQ cycler and the measurement started. Forty cycles of one minute each were performed, including 1 minute fluorescence readout time.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der biochemischen Sensorik und befasst sich mit der Verwendung von Molecular Beacons als Temperatursensoren.

Description

Fluorometrische Temperatursensorik mit FRET-basierten Molecular Beacons in molekularbiologischen und diagnostischen Assays
[0001] Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der biochemischen Sensorik und befasst sich mit der Verwendung von Molecular Beacons als Temperatursensoren.
[0002] Die Temperatur ist eine der am häufigsten gemessenen physikalischen Größen, deren präzise Bestimmung sowohl in der Forschung als auch bei vielen analytischen
Verfahren, medizinisch-diagnostischen Assays, und in vielen Industrieprozessen erforderlich ist. Neben taktilen Verfahren, welche eine elektrische Kontaktierung erfordern (z.B.
Thermoelemente), sind kontaktlose bzw. nicht-invasive Temperaturmessungen mit optischen Methoden verbreitet.
[0003] Ferner ist die Bestimmung der Temperatur (T) vor allem in biologischen
Prozessen (z.B. zelluläre Prozesse) von großer Bedeutung, da diese die biochemischen Reaktionen in den Zellen beeinflusst. Für Temperaturmessungen in sich bewegenden, z.B. rotierenden Systemen wie bestimmten Auslesegeräten für mikrofluidische Assays und Reaktionen, in Zellen oder unter Bedingungen, wo generell keine elektrischen Sensoren eingesetzt werden können, eignen sich besonders optische T-Sonden, die eine berührungslose Temperaturmessung z.B. über die Lumineszenz im NIR- oder sichtbaren vis-Spektralbereich erlauben, bisweilen sogar intrazellulär.
[0004] In diesem Zusammenhang ist die Verwendung von fluoreszierenden
Temperatursonden geeignet, da diese aufgrund ihrer temperaturabhängigen
Emissionseigenschaften als sogenannte„molekulare Thermometer" eingesetzt werden können. Hierzu gehören beispielsweise Lanthanoid-basierte molekulare Thermometer (z.B. seltenen Erden dotierte Nanopartikel), aufkonvertierende lumineszierende Nanopartikel, Polymer-basierte Nanogele, fluoreszierende Gold-Nanopartikel oder lumineszierende Metall- Ligand-Komplexe oder organische Farbstoffe mit temperaturabhängigen optischen
Eigenschaften.
[0005] Diese Systeme leiden allerdings unter einer geringen Flexibilität bezogen auf die Steuerung des zu detektierenden Temperaturbereichs, der für molekularbiologischen
Anwendungen in Frage kommt. [0006] Auch sind die Anforderungen für einen Einsatz von nicht-invasiven Temperatursonden in molekularbiologischen Systemen oder diagnostischen Verfahren hoch anzusiedeln, da die jeweiligen Sensoren nicht mit den Reaktanden in Interaktion treten dürfen und darüber hinaus bei den gegebenen Bedingungen chemisch stabil sein müssen, unter der Voraussetzung, dass eine konstante und ausreichende Signalsendung gewährleistet ist. Es besteht daher ein Bedarf an geeigneten nicht-invasiven Temperatursensoren, die in biomolekularen Reaktionen verwendet werden können, und wenn möglich eine kontrollierte Positionierung zulassen.
[0007] Vor diesem Hintergrund wird eine Verwendung von Molecular Beacons nach Anspruch 1, sowie eine Kombination von Molecular Beacons nach Anspruch 10 und ein Sensorarray nach Anspruch 16 vorgeschlagen.
[0008] In einer ersten Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon (MB) als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren vorgeschlagen umfassend einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher, oder einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor, oder einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor, wobei der fluoreszierende Donor, der nicht-emissive Löscher, der emissive Akzeptor und der nicht-emissive Akzeptor temperaturbeständig sind.
[0009] Eine Temperaturbeständigkeit von dem fluoreszierenden Donor, dem nicht- emissiven Löscher, dem emissiven Akzeptor und dem nicht-emissiven Akzeptor ist bevorzugt gegeben durch molekular rigide Strukturen, in denen alle potenziellen Löschkanäle verbrückt sind und entsprechende Molekülteile nicht frei rotieren können bzw. thermisch labile
Bindungen vermieden oder verbrückt werden.
[0010] Als besonders geeignete fluoreszierende Donoren und/oder emissive Akzeptoren wurden organische Fluoreszenzfarbstoffe gefunden, in denen alle Gruppen, deren Rotation zu einer strahlungslosen Desaktivierung des angeregten Zustand führen könnte, verbrückt sind. Eine Temperaturbeständigkeit insbesondere für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor gemäß der vorgeschlagenen Verwendung besteht in einer konstanten Fluoreszenz ohne signifikante Veränderung der Intensität der Fluoreszenz und/oder ohne eine signifikante Verschiebung der ausgestrahlten Wellenlänge(n). Insbesondere besteht eine Temperaturbeständigkeit für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven
Akzeptor darin, dass sich die Fluoreszenzintensitäten des Anfangs- und Endwertes in einer Temperaturspanne von 50 °C, bevorzugt 60 °C, weiter bevorzugt 70 °C, und noch weiter bevorzugt 100 °C um <30%, bevorzugt <20% und am meisten bevorzugt <10%
unterscheiden. Insbesondere besteht eine Temperaturbeständigkeit für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor darin, dass sich die Fluoreszenzintensitäten des Anfangswertes 20 °C und Endwertes 95 °C um <30%, bevorzugt <20% und am meisten bevorzugt <10% unterscheiden. Insbesondere besteht eine Temperaturbeständigkeit für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor darin, dass sich die
Fluoreszenzintensitäten des Maximalwertes und des Minimalwertes in einer
Temperaturspanne von 50 °C, bevorzugt 60 °C, weiter bevorzugt 70 °C, insbesondere im Temperaturbereich von 20 °C bis 95 °C um <30%, bevorzugt <20% und am meisten bevorzugt <10% unterscheiden. Diese Zusammenhänge können analog für die Absorption aufgestellt werden, da die gemessene Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Absorption ist.
[001 1] Die integrale Emission ist hier definiert als der Quotient aus den jeweiligen Integralen der Emissionssignale eines Farbstoffes in Abhängigkeit der Temperatur und des Integrals des Emissionssignals eines Farbstoffes bei einer bestimmten Temperatur (hier Minimaltemperatur Tmin in °C) über einen bestimmten Wellenlängenbereich (λ). Sie errechnet sich nach der folgenden Weise und Formel:
ί Ä1I(Ä,Tmin)dÄ i:intensität Ι[λ,Τ1), Ι(λ, T2),. ..
[0012] Ferner besteht eine Temperaturbeständigkeit eines Löschers gemäß der vorgeschlagenen Verwendung darin, dass sich die Wellenlänge des absorbierten Lichts nicht signifikant bei einer Temperaturveränderung bis zu 100 °C ändert. Insbesondere besteht eine Temperaturbeständigkeit eines Löschers darin, dass sich die Wellenlänge des absorbierten Lichts bei einer Temperaturveränderung von 50 °C, bevorzugt 60 °C, weiter bevorzugt 70 °C, und noch weiter bevorzugt 100 °C um <100 nm, bevorzugt <80 nm, noch weiter bevorzugt <70 nm und am meisten bevorzugt <50 nm verschiebt. Bevorzugt ist bei einem Löscher gemäß einem hierin beschriebenen Vorschlag eine Verschiebung der Wellenlänge des absorbierten Lichts von <100 nm, bevorzugt <80 nm, noch weiter bevorzugt <70 nm und am meisten bevorzugt <50 nm in einem Temperaturbereich von 20 bis 95 °C.
[0013] Des Weiteren kann die Temperaturbeständigkeit eines Löschers gemäß der vorgeschlagenen Verwendung darin bestehen, dass die Intensität der Absorption über einen bestimmten Temperaturbereich stabil ist, indem sich die Intensität kaum ändert, und somit nicht temperaturabhängig ist. In einer Ausführungsform wird die Temperaturbeständigkeit darin gesehen, wenn sich in einem Temperaturbereich wie beispielsweise von 20 bis 95 °C die Intensität der Absorption von einem Anfangswert wie beispielsweise von 20 °C bei Erwärmung zu einem Endwert wie beispielsweise 95 °C um lediglich 30%, bevorzugt 20% weiter bevorzugt 10%> und am meisten bevorzugt 5% ändert.
[0014] Die oben beschriebene Temperaturbeständigkeit von fluoreszierendem Donor, nicht-emissivem Löscher, emissivem Akzeptor und nicht-emissivem Akzeptor steht im Gegensatz zu den meisten Fluoreszenzfarbstoffen, deren optische Eigenschaften, also die spektrale Lage ihrer Absorptions- und Fluoreszenzbanden, die Absorptionsintensitäten, die Fluoreszenzquantenausbeuten sowie die Fluoreszenzlebensdauern temperatursensitiv sind, und damit nicht für eine Verwendung in Kombination mit Molecular Beacons für den Einsatz in biomolekularen oder diagnostischen Verfahren geeignet sind.
[0015] Zu Molecular Beacons ist beschrieben worden, dass sie in nicht-invasiven Temperaturmessungen eingesetzt werden können. Diese Moleküle haben allerdings bisher lediglich Einsatz gefunden bei der Verbesserung von Schmelzpunktanalysen, zur Temperaturkalibrierung in mikrofluidischen Chips, in Mikrochip-basierten Biosensoren, als L-DNA basierte in vivo Nano-Thermometer sowie als pH-abhängige fluoreszierende Sonden. Eine Eignung als Temperatursensor in biomolekularen Reaktionen, die insbesondere DNA-basiert sind, ist weder beschrieben noch vorgeschlagen worden, und war überdies bis jetzt fraglich, da eine benötigte Temperaturbeständigkeit und der Ausschluss einer Interaktion der DNA- Stränge der Molecular Beacons mit DNA-Molekülen einer biomolekularen Reaktion nicht zu erwarten war.
[0016] Die Verwendung von temperaturbeständigen Molecular Beacons in
molekularbiologischen Assays ermöglicht eine nicht-invasive und hochsensitive
Temperaturmessung. Es wird ferner die Verwendung eines Molecular Beacons als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren vorgeschlagen, wobei das mindestens eine Molecular Beacon inert gegenüber den Reaktanden im
biologischen Assay ist, insbesondere durch die auf den Assay angepasste Wahl der loop- und stem-Sequenz.
[0017] Eine solche Verwendung ist möglich, da gefunden werden konnte, dass selbst bei erhöhten Temperaturen keine Interaktion der oben beschriebenen Molecular Beacons mit DNA-basierten Reaktanden stattfindet und somit die molekularbiogische Reaktionen durch den Temperatursensor nicht verfälscht, verhindert oder verschlechtert werden. Insbesondere wurde gefunden, dass keine Wechselwirkung mit Assay-Komponenten beim direkten Einsatz als Temperatursensor stattfindet. In gleicher Weise wurde auch gefunden, dass die Assay- Komponenten wiederum auch nicht mit den Molecular Beacons in Verbindung treten und somit die Funktionsfähigkeit der Molecular Beacons beeinträchtigen oder verhindern. Dies hat ferner den Vorteil, dass eine Verwendung in biologisch relevanten Puffern, im Serum, in Zellkulturen möglich ist. Somit wird ferner die Verwendung eines Molecular Beacons als Temperatursensor in in vivo und in vitro Systemen vorgeschlagen.
[0018] Durch die Verwendung von Molecular Beacons als Temperatursensoren wie hierin vorgeschlagen sind Temperaturmessungen auch in sehr kleinen Volumina wie in mikrofluidischen Systemen möglich wie auch für rotierende Systeme, insbesondere auch bei rotierenden mikrofluidischen Auslesegräten. Ferner sind Temperaturmessungen ermöglicht an Membranen, auf Biochips, in Poren und in Mikrokanälen sowie in Mikrotiterplatten.
Außerdem ist eine kontrollierte Positionierung des Molecular Beacons möglich.
[0019] In einer weiteren Ausführungsform werden die oben spezifizierten Molecular Beacons für biologische DNA-basierte Assays verwendet, insbesondere für eine PCR
(Polymerasekettenreaktion), eine tHDA (thermophilic helicase-dependent amplification), eine Immuno-PCR oder ein Aptamer-basiertes Assay. Ferner finden die oben spezifizierten Molecular Beacons Anwendung zur Temperaturüberwachung in quantitativer Echtzeit PCR, in der Ligase Kettenreaktion (ligase chain reaction, LCR), in einer
Strangverdrängungsamplifikation (strand displacement amplification, SDA), in einer multiplen Verdrängungsamplifikation (multiple displacement amplification, MDA), oder auch in sog. rolling-circle-Amplification (RCA), restriction aided RCA, Einzelprimer Isothermal- amplifikation (single primer isothermal amplification, SPIA), transcription mediated- Amplifikation (TMA), Amplifikationsreaktion mit einschneidendem Enzym (nicking enzyme amplification reaction, NEAR), exponentielle Amplifikationsreaktion (exponential amplification reaction, EXPAR), loop mediated Isothermalamplifikation (loop mediated isothermal amplification, LAMP), Rekombinase Polymerase Amplifikation (recombinase Polymerase amplification, RPA), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (nucleic acid sequence based amplification, NASBA), smart- Amplifikationsprozess (smart-amplification process, SMAP) und quantifizierende Nukleinsäure Echtzeit PCR (quantifying nucleic acids real-time PCR, rtPCR).
[0020] Bevorzugte Temperaturbereiche, die durch Molecular Beacons wie hierin vorgeschlagen, überwacht und bestimmt werden können, liegen für Fluoreszenzmessungen bevorzugt im Bereich von 50-75 °C, für isothermale Methoden, insbesondere isothermale Amplifikationen im Bereich von 35-65 °C und für Schmelzkurven von Sonden, Amplifikaten oder genomischer DNA im Bereich von 45-90 °C. Es ist vorteilhaft für den vorliegenden Vorschlag, dass der Einsatz der hierin vorgeschlagenen molekularen Thermometer zur hochsensitiven Temperaturmessung in bioanalytisch relevanten Puffern (z.B. PBS oder HDA- Puffer) im T-Bereich von ca. 35-98 °C erfolgt.
[0021] Die Molecular Beacons wurden nach gängigen Methoden so aufgebaut und synthetisiert, um diese für die fraglichen Temperaturbereiche mit einem entsprechenden Schmelzpunkt zu versehen. Die Berechnung der Struktur, insbesondere der Struktur und Sequenz des Stammbereichs, und der daraus resultierenden Schmelzpunkte ist dem Fachmann wohl bekannt und wird hier nicht weiter wiedergegeben. Beispielsweise kann die Berechnung der Struktur nach den Methoden der nachfolgenden Referenzen durchgeführt werden:
Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web Server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; Owczarzy,R. et al, Biochemistry, 43, 3537; Owczarzy, R. et al, Biochemistry, 47, 5336. Durch die Verwendung entsprechender DNA- Sequenzen innerhalb des Stamms des Molecular Beacons kann der Schmelzpunkt vorher bestimmt werden.
[0022] Besonders geeignete Molecular Beacons sind:
Name Sequenz Berechneter Schmelzpunkt
MB-47 TACTCTTTTTTTTTTGAGTT 47,1°C MB-56 TCATGCTTTTTTTTTTGCATGT 56,6°C
MB-59 TTGCACTTTTTTTTTTGTGCAT 56,9 / 59,3°C
MB-64 TGCGTGTTTTTTTTTTCACGCT 64,2°C
MB70 TCGCATGGTTTTTTTTTTCCATGCGT 70,6°C
(Die Schmelzpunkte wurden über die Internetseite
„http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/01igoAnalyzer/Default.aspx" berechnet mit den voreingestellten Parametern: Temp. 25°C, Na+ conc. 50mM, Mg2+ conc. 5mM, suboptimality
50%.)
[0023] Insbesondere wird eine Verwendung für Nukleinsäureamplifikationsreaktionen in demselben Reaktionsgefäß zusammen mit den Analyten und Amplifikationsreagenzien vorgeschlagen. Durch die Verwendung von Molecular Beacons gemäß einem hierin beschriebenen Vorschlag wird Temperatursensorik auch in miniaturisierten Assays möglich. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die temperaturbeständigen
Molecular Beacons für biologische DNA-basierte Assays in einem„Lab-on-a-Chip"- Reaktormodul verwendet.
[0024] Es wird ferner eine Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon (MB) mit einem fluoreszierenden Donor und/oder einem emissiven Akzeptor vorgeschlagen, wobei der fluoreszierende Donor und/oder der emissive Akzeptor im vis- oder nahen infrarot (NIR-) Bereich emittiert/emittieren.
[0025] In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon vorgeschlagen, wobei der mindestens eine Molecular Beacon einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher umfasst.
[0026] Als fluoreszierende Donatoren kommen prinzipiell molekulare Verbindungen wie kleine organische Farbstoffe, Metall-Ligand- Verbindungen wie beispielsweise Lanthanid- Chelate und -Komplexe, oder nanoskalige Reporter wie fluoreszente Partikel wie
beispielsweise Fluorophor-dotierte oder markierte Polymer- oder Silika-Partikel, oder Mosaik- Viren, Halbleiter-Nanomaterialien wie beispielsweise Quantenpunkte, Upconversion Nanopartikel in Frage. Als gemeinsames Merkmal haben die aus diesen Farbstoffklassen ausgewählten Verbindungen die hierin beschriebene Temperaturbeständigkeit sowie deren Eignung an Molecular Beacons gebunden zu werden. Besonders bevorzugt sind Farbstoffe mit einem rigiden Chromophorgerüst mit sterisch fixierten funktionellen Gruppen, deren Rotation zur Fluoreszenzlöschung führen könnte. Insbesondere werden als fluoreszierende Donoren fluoreszierende Farbstoffe vorgeschlagen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus und/oder umfassend Rhodamine 101, Rhodamine 6G, 2,3,6,7-Tetrahydro-9-(trifiuoromethyl)- lH,5H,HH-[l]benzopyrano(6,7,8-ij)quinolizin-l l-one (Coumarin 153), 6-Carboxy-X- Rhodamine (ROX) und Atto 647 N. Die entsprechenden Strukturformeln sind in Figur 2 widergegeben.
[0027] Als nicht-emissive Löscher kommen prinzipiell molekulare Systeme wie nicht- fluoreszente organische Farbstoffe oder nicht-emissive nanoskalige Partikel, wie Metall- Nanopartikel beispielsweise aus Gold oder Silber oder Kohlenstoffnanoröhrchen (CNTs) in Frage. Insbesondere werden als Löscher Azo-Verbindungen vorgeschlagen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus und/oder umfassend Black Hole Quencher 1™, Black Hole Quencher 2™, Black Hole Quencher 3™ und 4-((4-(dimethylamino)phenyl)azo)benzoic acid (Dabcyl), Deep Dark Quencher (DDQ) und BlackBerry Quencher, sowie auch Iowa Black FQ und RQ, QXL Quencher, und DYC-Quencher. Einige der entsprechenden Strukturformeln sind in Figur 3 wiedergegeben.
[0028] In einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon vorgeschlagen, wobei der mindestens eine Molecular Beacon einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor umfasst.
[0029] Als fluoreszierende Donatoren kommen die bereits oben erwähnten Verbindungen in Frage. Als emissiver Akzeptor kommen molekulare Verbindungen wie kleine organische Farbstoffe, Metall-Ligand- Verbindungen wie beispielsweise Lanthanid-Chelate und
-Komplexe, oder nanoskalige Reporter wie fluoreszente Partikel wie beispielsweise
Fluorophor-dotierte oder markierte Polymer- oder Silika-Partikel oder Mosaik- Viren und Halbleiter-Nanomaterialien wie Quantenpunkte in Frage. Als gemeinsames Merkmal haben die zuvor genannten Verbindungen die hierin beschriebene Temperaturbeständigkeit sowie deren Eignung an Molecular Beacons gebunden zu werden. Bevorzugt sind insbesondere Verbindungen der Verbindungsklassen, die auch als fluoreszente Donatoren in Frage kommen, wie z.B. Xanthen- oder Coumarin-Farbstoffe mit sterisch fixierten Gruppen.
[0030] In einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon vorgeschlagen, wobei der mindestens eine Molecular Beacon einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor umfasst.
[0031] Als fluoreszierende Donatoren kommen die bereits oben erwähnten Verbindungen in Frage. Als nicht-emissiver Akzeptor kommen molekulare Verbindungen wie kleine organische Farbstoffe oder Metall-Ligand- Verbindungen in Frage, die stark absorbieren, aber nicht leuchten, oder nichtfluoreszente nanoskalige Systeme wie beispielsweise Farbstoff- dotierte oder markierte Polymer- oder Silika-Partikel oder Mosaik- Viren und Metallpartikel beispielsweise Gold- oder Silber-Partikel, Carbonnanotubes oder Graphene. Als gemeinsames Merkmal haben die zuvor genannten Verbindungen die hierin beschriebene
Temperaturbeständigkeit sowie deren Eignung an Molecular Beacons gebunden zu werden. Bevorzugt sind insbesondere Chromophore mit Substituenten, welche die Fluoreszenz löschen, wie z.B. Bromid-, Iodid- und Nitroverbindungen.
[0032] Es ist besonders bevorzugt, wenn der nicht-emissive Akzeptor die Fluoreszenz des fluoreszierenden Donors möglichst stark löscht beispielsweise durch kontaktbasierte Prozesse, Elektronentransfer, Energietransfer, einen Schweratomeffekt oder
Paramagnetismus. Dabei kann es je nach Löschprozess vorkommen, dass der nicht-emissive Akzeptor die Emission des fluoreszierenden Donors absorbiert.
[0033] Es ist bevorzugt, dass bei allen Kombinationen von einem fluoreszierenden Donor und einem nicht-emissiven Löscher, einem fluoreszierenden Donor und einem emissiven Akzeptor und einem fluoreszierenden Donor und einem nicht-emissiven Akzeptor jeweils ein effektiver FRET gebildet wird. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn im geschlossenen Zustand des MBs unterhalb der Schmelztemperatur Tm effizienter FRET erfolgt, so dass entweder bei Anregung des Donors nur die Fluoreszenz des Akzeptors detektiert wird oder bei Verwendung eines nicht- fluoreszenten Akzeptors keine oder nur minimale Fluoreszenz auftritt.
[0034] Für die Auswahl geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe ist es bevorzugt, dass neben einer Temperaturbeständigkeit in Form einer möglichst geringen Temperaturabhängigkeit ihrer Absorption und Fluoreszenz, ein effizienter FRET von Donor- und Akzeptor- Fluorophor, also eine möglichst gute spektrale Überlagerung der Absorptions- und
Emissionsspektren, gegeben ist. Insbesondere ist es bevorzugt, dass das Maximum der Emission des einen fluoreszierenden Donors weniger als 100 nm vom Maximum der
Absorption des Löschers abweicht, weiter bevorzugt weniger als 80 nm und noch weiter bevorzugt weniger als 50 nm. Ferner ist es bevorzugt, dass das Maximum der Emission des einen fluoreszierenden Donors und das Maximum der Absorption des Löschers im Bereich von 400 bis 800 nm liegen, weiter bevorzugt von 500 bis 700 nm.
[0035] Neben FRET können auch andere abstandsabhängige Löschprozesse wie
Elektronentransfer, plasmonische Wechselwirkungen (abstandsabhängige
Fluoreszenzlöschung durch Metall-Fluorophor- Wechselwirkungen z.B. für Gold oder Silber), Schweratomeffekt oder Paramagnetismus ausgenutzt werden. Für solche Prozesse ist es nicht erforderlich, dass sich die Absorption des Akzeptors und des Donors im besten Falle überlagern.
[0036] Gemäß einem Aspekt des vorliegenden Vorschlages für die Verwendung von Molecular Beacons liegt mindestens ein Molecular Beacon als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren immobilisiert vor.
[0037] Einer Immobilisierung liegt eine Lokalisierung der Molecular Beacons durch kovalente Anbindung z.B. an Kanalinnenwände von mikro fluidischen Chips, an Membranen, an Glas- oder Polymer-basierten Biochips, an porösen Trägermaterialien wie Cellulose, Silika-Nanopartikel etc. und an anderen Materialien, die für die Durchführung von DNA- basierten Assays eingesetzt werden, oder an optischen Fasern für die Herstellung von
Temperatursensoren, an Trägermaterialien wie Glasslides, Polymere, Au-Oberflächen, optische Fasern oder Nanomaterialien wie z.B. Quantum Dots (QD), Metall-Nanopartikel oder magnetische Nanopartikel (MNP) zu Grunde. Ein weiteres Gebiet für Immobilisierungen bietet die Anbindung an Partikel, die dabei entweder als Trägermaterialien fungieren können, für den Einsatz zur Temperatursensorik in DNA-basierten Assays oder an Partikel wie z.B. Eisenoxid-Partikel oder Metall-Partikel für den Einsatz zur Temperatursensorik in
therapeutischen Verfahren wie die therapeutische Hyperthermie und zur Temperaturmessung in vitro und in vivo Systemen sowie zum Monitoring. [0038] Eine solche Immobilisierung geschieht vorzugsweise durch entsprechende Funktionalisierungen der Nukleotide in der Loop- bzw. Stamm-Sequenz („ loop and stein region engineering"). So können modifizierte, nicht natürliche Nukleotide in die Loop- Sequenz eingebunden werden, um unterschiedliche Linker, wie beispielsweise PEG-, Peptid- oder Kohlenwasserstoff-Linker an die entsprechenden Nukleotide zu koppeln und somit die MBs auf die gewünschten Trägermaterialien zu immobilisieren. Eine gut untersuchte und universelle Methode, um MBs auf Oberflächen zu immobilisieren, ist der Einsatz des Biotin- Streptavidin-Systems. Hierbei wird der an der Stammsequenz biotinylierte Molecular Beacon durch die Bindung des Biotins an eine Streptavidin-beschichtete Oberfläche an das
Trägermaterial gebunden. In einer weiteren Ausführungsform kann eine Immobilisierung eines Molecular Beacon auch durch die Anbindung über stimuli-responsive„spaltbare" Linker vollzogen werden. Vorteilhaft ist an dieser Ausführungsform, dass die
Immobilisierung gezielt wieder rückgängig gemacht werden kann, zum Beispiel durch reduktive, enzymatische, photochemische und/oder thermische Spaltung.
[0039] Eine Funktionalisierung zur Immobilisierung hat ferner den Vorteil, dass
Sensorarrays aufgebaut werden können, durch die Molecular Beacons in alle
Assayplattformen integriert werden können, die feste Supports oder Mikroanalyte verwenden. Dadurch ist eine örtliche Kontrolle der Positionierung ebenfalls gegeben. Ferner ist die Integration in Therapeutika für die therapeutische Hyperthermie und die lokale
Temperaturmessung im Körper zur Kontrolle und zur Überwachung der Hyperthermie- behandlung gegeben. Ebenfalls erlaubt die Positionierung der Temperatursensoren auf Basis von Molecular Beacons gemäß einem hierin beschriebenen Vorschlag lokale Temperaturmessungen an verschiedenen Orten in einem mikrofluidischen Chip wie beispielsweise einem „Lab-on-a-Chip"-Reaktormodul, oder in einem biotechnologischen Reaktor oder in unterschiedlich großen Kavitäten.
[0040] Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine hierin vorgeschlagene
Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren vorgeschlagen, wobei mindestens zwei
unterschiedliche Molecular Beacons verwendet werden.
[0041] Insbesondere wird vorgeschlagen, dass mindestens zwei Molecular Beacons verwendet werden, die verschiedene temperaturstabile und im Wesentlichen inerte
Fluoreszenzfarbstoffe mit Emission im vis- und NIR-Bereich tragen, insbesondere mit spektral unterscheidbaren Emissionen im UV- und vis-Bereich. Weiter bevorzugt ist, dass mindestens zwei Molecular Beacons verwendet werden, die verschiedene temperaturstabile und im Wesentlichen inerte Fluoreszenzfarbstoffe mit Emission im vis- und NIR-Bereich tragen, wobei die Molecular Beacons in unterschiedlichen Farbkanälen emittieren.
[0042] Vorteil einer solchen Ausführungsform ist eine verbesserte Messdatenqualität und eine erhöhte Sensitivität der Temperaturmessung. Dadurch können ferner auch spektral unterscheidbare Molecular Beacons mit unterschiedlichen Stamm-Sequenzen verwendet werden, die unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen. Mit Hilfe einer mathematischen Auswertung kann bei Verwendung unterschiedlicher Molecular Beacons mit gegebenenfalls unterschiedlichen spektralen Eigenschaften die Genauigkeit der ermittelten Temperatur und die Temperaturauflösung erhöht werden.
[0043] Gemäß einem weiteren Aspekt wird eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons vorgeschlagen, die jeweils umfassen einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher, oder einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor, oder einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor, wobei der fluoreszierende Donor, der nicht-emissive Löscher, der emissive Akzeptor und der nicht-emissive Akzeptor temperaturbeständig sind.
[0044] Eine Temperaturbeständigkeit für einen fluoreszierenden Donor und/oder einen emissiven Akzeptor und/oder einen nicht-emissiven Löscher gemäß der vorgeschlagenen Kombination hat die gleichen Anforderungen wie unter [0009] bis [0014] beschrieben.
[0045] Durch die Verwendung von mindestens zwei Molecular Beacons als Kombination kann die Temperaturauflösung deutlich gesteigert werden durch das Vorliegen eines größeren und umfangreicheren Datensatz. Die Temperaturauflösung kann dadurch soweit erhöht werden, dass durch mathematische Auswertung eine T- Auflösung < 1 °C (bevorzugt 0,9 °C bis 0,05 °C, weiter bevorzugt 0.5 °C bis 0.1 °C) ermöglicht wird. Die Verwendung von mehr als einem Molecular Beacon ist insbesondere für niedrigere Temperaturbereiche unter 45 °C interessant, da in diesem Bereich von Natur aus die Temperaturauflösung von Molecular Beacons weniger präzise ist. Ferner ist es möglich, durch die Kombination von mindestens zwei Molecular Beacons eine präzise Steuerung einzurichten zur Erreichung oder
Unterschreitung einer bestimmten Mindest-Temperatur mittels„Ja/Nein" -Entscheidungen. Eine solche Steuerung ist auch mit einem Molecular Beacon möglich. Eine Steuerung zur Erreichung oder Unterschreitung einer bestimmten Mindest-Temperatur mittels„Ja/Nein"- Entscheidungen mit einer hohen Präzision ist besonders gut geeignet für die Prozesskontrolle und kann dadurch eine Automatisierung unterstützen. Eine solche Automatisierung könnte insbesondere einem high-throughput Verfahren Anwendung finden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ferner eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons vorgeschlagen, wobei die Temperaturauflösung durch die Länge des Nukleotidstranges und/oder den Guanin-Cytosin-Gehalts auf unter 1 °C geregelt werden kann.
[0046] In einer Ausführungsform wird eine Kombination von mindestens zwei Molecular Beacons vorgeschlagen, wobei die mindestens zwei Molecular Beacons auf einem Träger immobilisiert sind. In einer solchen Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, wenn die mindestens zwei zu immobilisierenden Molecular Beacons eine chemische Funktionalisierung tragen, über die die Anbindung an einen Träger zur Immobilisierung geschieht.
[0047] Für eine hierin beschriebene Kombination kommen dieselben Verbindungen in Frage, die auch für die Verwendung von wie hierin beschriebenen Molecular Beacons eingesetzt werden. Insbesondere werden für eine hierin vorgeschlagene Kombination fluoreszierende Donoren ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Rhodamin 101, Pvhodamin 6G, Coumarin 153, 6-Carboxy-X-Rhodamin und Atto 647 N.
[0048] Insbesondere werden für eine hierin vorgeschlagene Kombination der nicht- emissive Löscher ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Black Hole Quencher 2 (BHQ 2), Black Hole Quencher 3 (BHQ 3) und Dabcyl.
[0049] Insbesondere wird auch die Verwendung einer hierin vorgeschlagenen
Kombination vorgeschlagen als Temperatursensor in biologischen Assays oder
diagnostischen Verfahren.
[0050] Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein Sensorarray vorgeschlagen umfassend einen festen Träger, und eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons wie hierin vorgeschlagen.
[0051] In einer weiteren Ausführungsform wird ein Sensorarray vorgeschlagen, wobei der Träger ausgesucht ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus 2D- und 3D-Supports wie beispielsweise Membrane, Filme, Glasträger, Polymerträger, mesoporöse Partikel und Gele, optischen Fasern, Mikrokanälen und Mikrotiterplatten-Kavitäten.
[0052] In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Sensorarray vorgeschlagen, wobei die 2D und 3D-Supports aus Membranen, Filmen und / oder Mikroskopieslides aus Glas, Polymeren oder aus mesoporösen Partikeln bestehen können.
[0053] In einer weiteren Ausführungsform wird ein Sensorarray vorgeschlagen umfassend einen festen Träger, und eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons, wobei die mindestens zwei Molecular Beacons verschiedene temperaturstabile und im Wesentlichen inerte Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere mit Emission im vis- und NIR-Bereich tragen.
Ein solcher Aufbau ermöglicht das Design von verschieden farbig emittierenden
Sensorarrays.
[0054] Insbesondere wird auch die Verwendung eines hierin vorgeschlagenen
Sensorarrays vorgeschlagen als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren.
[0055] Die beiliegenden Zeichnungen veranschaulichen eine beispielhafte
Ausführungsform und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Prinzipien der Erfindung. Die Elemente der Zeichnungen sind relativ zueinander und nicht
notwendigerweise maßstabsgetreu.
[0056] Figur 1 zeigt schematisch eine fluoreszente Nukleotid-
Sonde in Form eines Molecular Beacon (MB), die aus einer DNA-Sequenz, einem Donor-Fluorophor und einem nicht- emissiven oder emissiven Akzeptor-Farbstoff besteht, die ein FRET-System bilden (Donor: Fluorophor, Akzeptor: nicht- fluoreszenter Akzeptor = Löscher). Der Abstand von Donor und Akzeptor wird temperaturabhängig variiert, was eine temperaturabhängige Fluoreszenz des MB bedingt.
[0057] Figur 2 zeigt eine Auswahl geeigneter
Fluoreszenzfarbstoffe.
[0058] Figur 3 zeigt eine Auswahl geeigneter Löschermoleküle.
[0059] Figur 4 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Absorption von ROX, (A) vor und nach dem Erwärmen bei 25 °C und (B) bei 25 °C, 60 °C und 80 °C.
[0060] Figur 5 zeigt in (A) einen Vergleich der Absorption und
Emission von ROX und in (B) die Temperaturabhängigkeit der Emission von ROX bei 25 °C, 60 °C und 80 °C.
[0061] Figur 6 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Absorption von Atto 647 N, (A) vor und nach dem Erwärmen bei 25 °C und (B) bei 25 °C, 60 °C und 80 °C.
[0062] Figur 7 zeigt in (A) einen Vergleich der Absorption und
Emission von Atto 647 N und in (B) die
Temperaturabhängigkeit der Emission von Atto 647 N bei 25 °C, 60 °C und 80 °C.
[0063] Figur 8 zeigt in (A) das Absorptionsverhalten von BHQ2 und BHQ3 bei 25 °C und in (B) das Absorptionsverhalten von BHQ3 bei 25 °C vor und nach Erwärmen und bei 90 °C.
[0064] Figur 9 zeigt die Temperaturbeständigkeit der Emission von Atto647 N und ROX durch Vergleich der normierten Emission in (A) bei 20 °C, 60 °C und 80 °C für Atto 647 N und in (B) bei 20 °C, 60 °C und 95 °C für ROX.
Figur 10 zeigt im Vergleich zu Fig. 9 den Abfall der Emissionsintensität bei dem temperaturunbeständigen
Fluoreszenzfarbstoff TAMRA im Bereich von 20 °C bis 95 °C.
Figur 11 zeigt in (A) die normierte Absorption von BHQ3 zusammen mit der normierten Emission von Atto 647 N und in (B) die normierte Absorption von BHQ2 zusammen mit der normierten Emission von ROX.
Figur 12 zeigt in (A) die Änderung der
Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Temperatur im Bereich von 35 °C bis 80 °C für den Molecular Beacon ROX- MB56-BHQ2 und in (B) die Entwicklung der
Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Temperatur im Bereich von 35 °C bis 80 °C für den Molecular Beacon ROX- MB64-BHQ2.
Figur 13 zeigt in (A) die Änderung der
Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Temperatur im Bereich von 35 °C bis 80 °C für die Kombination der Molecular Beacons aus ROX-MB56-BHQ2 und ROX-MB64-BHQ2 im Verhältnis 1 : 1 und in (B) Änderung der Fluoreszenzintensität bei den Temperaturen 35 °C, 50 °C, 65 °C und 80 °C für dieselbe Kombination.
Figur 14 zeigt in (A) die Temperaturabhängigkeit der normierten Fluoreszenz in einem Temperaturbereich von 20-95 °C für den Molecular Beacon 5'-ROX-MB64-BHQ2-3' und in (B) die Temperaturabhängigkeit der normierten Fluoreszenz in einem Temperaturbereich von 20-95 °C für den Molecular Beacon 5 '-FAM-MB59-TAMRA-3 ' mit der Sequenz
5 ' -F AMTTGC ACTTTTTTTTTTGTGC AT-T AMRA-3 ' . [0070] Figur 15 zeigt die Temperaturabhängigkeit der
Fluoreszenz des in einer tHDA eingesetzten Molecular Beacons 5'-ROX-MB70-BHQ2-3' bei den unterschiedlichen
Konzentrationen 60 nM und 100 nM im orangenen Kanal.
[0071] Figur 16 zeigt die Schmelzpunktbestimmung des in einer tHDA eingesetzten Molecular Beacons 5'-ROX-MB70-BHQ2-
3' bei den unterschiedlichen Konzentrationen 60 nM und 100 erster Ableitung der Fluoreszenz im Temperaturbereich von 55 °C bis 95 °C.
[0072] Die Figuren wurden in der obigen Figurenbeschreibung bereits näher dargelegt, weitere Details werden zusätzlich dazu weiter unten verdeutlicht.
[0073] Insbesondere verdeutlicht Figur 1, dass unterhalb der Schmelztemperatur Tm effizienter FRET erfolgt, so dass entweder idealerweise bei Anregung des Donors nur die Fluoreszenz des Akzeptors detektiert wird oder bei Verwendung eines nicht-fluoreszenten Akzeptors keine bzw. minimale Fluoreszenz. Beim Erreichen einer bestimmten Temperatur im Bereich des Schmelzpunktes, der über die Stamm-Sequenz gezielt eingestellt und variiert werden kann, erfolgt die Dehybridisierung des Nukleotidstranges (Stamm), wobei sich der Abstand von Fluorophor und Löscher bzw. der Donor- und Akzeptor-Fluorophore zunehmend ändert. Im Falle von Fluorophor-Löscher-MB bedingt dies einen starken Anstieg der
Fluoreszenz des zuvor gelöschten Donor-Fluorophors.
[0074] Insbesondere verdeutlicht Figur 4A, dass die Absorption von ROX trotz zwischenzeitlichen Erwärmens auf 95 °C sich nicht ändert. Damit wird die
Temperaturbeständigkeit von ROX gezeigt. Selbiges wird in Fig. 4B verdeutlicht, der zu entnehmen ist, dass die Absorption von ROX bei 25 °C, 60 °C und 80 °C annähernd gleich ist.
[0075] Insbesondere verdeutlicht Figur 5B, dass sich auch die Emission von ROX bei verschiedenen Temperaturen 25 °C, 60 °C und 95 °C nicht signifikant unterscheidet und dass die Emission auch nach Erwärmung auf 95 °C bei 25 °C stabil bleibt. [0076] Insbesondere verdeutlicht Figur 6A, dass die Absorption von Atto 647 N trotz zwischenzeitlichen Erwärmens auf 80 °C sich nicht ändert und konstant ist. Damit wird die Temperaturbeständigkeit von Atto 647 N gezeigt. Selbiges wird in Fig. 6B verdeutlicht, der zu entnehmen ist, dass die Absorption von Atto 647 N bei 25 °C, 60 °C und 80 °C annähernd gleich ist.
[0077] Insbesondere verdeutlicht Figur 7B, dass sich auch die Fluoreszenz von Atto 647 N bei verschiedenen Temperaturen 25 °C, 60 °C und 80 °C nicht signifikant unterscheidet und dass die Fluoreszenz auch nach Erwärmung auf 80 °C bei 25 °C stabil bleibt.
[0078] Insbesondere verdeutlicht Figur 8B, dass sich auch die Absorption von BHQ3 bei verschiedenen Temperaturen 25 °C und 90 °C nicht signifikant unterscheidet und nur eine geringe bathochrome Verschiebung der Absorptionsbande stattfindet. Ferner zeigt Fig. 8B, dass die Absorption auch nach Erwärmung auf 90 °C bei 25 °C stabil bleibt.
[0079] Insbesondere verdeutlichen Figuren 9A und B, dass hinsichtlich der relativen integralen Emission eine Temperaturerhöhung für die Fluoreszenzfarbstoffe ROX und Atto 647 N keine nennenswerte Veränderung auftritt bei einer Temperaturerhöhung von 20 °C auf 90 °C (Atto 647 N) bzw. 95 °C (ROX).
[0080] Insbesondere verdeutlicht Fig. 10, dass im Vergleich zu ROX und Atto 647 N der Fluoreszenzfarbstoff TAMRA einen erheblichen Abfall der Emissionsintensität im Bereich von 20 °C bis 95 °C erleidet. TAMRA ist im Gegensatz zu ROX und Atto 647 N ein Beispiel für einen temperaturunbeständigen Fluoreszenzfarbstoff.
[0081] Insbesondere verdeutlichen Figuren 11A und 11B, dass Atto 647 N und BHQ3, sowie 6-ROX und BHQ2 gute FRET-Paare bilden. [0082] Insbesondere verdeutlichen Fig. 12A und 12B die Eignung der Molecular Beacons 56 und 64 für die jeweiligen Temperaturbereich um 56 °C und 64 °C.
[0083] Insbesondere verdeutlicht Figur 13B, dass die Molecular Beacons ROX-MB56- BHQ2 und ROX-MB64-BHQ2 temperaturbeständig in einem Temperaturbereich von 35 °C bis 80 °C emittieren ohne nennenswerte Verschiebung der emittierten Wellenlänge. Es wurde für die Kombination MB56+64 ROX-BHQ2 eine Kalibrierebene von 56-68°C erhalten, für die die Unsicherheit +/- 0.7 °C beträgt.
[0084] Insbesondere verdeutlicht Figur 14A die Eignung des Molecular Beacon ROX- MB64-BHQ2 als Temperatursensor in einem Temperaturbereich von 55°C bis 95 °C. Im Vergleich dazu verdeutlicht Fig. 14 B, dass ein nicht temperaturbeständiger
Fluoreszenzfarbstoff wie TAMRA (Fluoreszenzbereich um 580 nm) die Verwendung von Molecular Beacons als Temperatursensor in biomolekularen Systemen nicht zulässt, da die Fluoreszenzintensität im Temperaturbereich zwischen 25 °C und 95 °C nicht konstant bleibt und signifikant abnimmt.
[0085] Insbesondere verdeutlichen Figur 15 und 16, dass die Molecular Beacons die in einer tHDA eingesetzt wurden, keinen Schaden während der Reaktion genommen haben und weiterhin einen stabilen Schmelzpunkt aufweisen und bei Temperaturerhöhung einen sauberen Anstieg der Fluoreszenz aufweisen.
[0086] Wenngleich hierin spezifische Ausführungsformen dargestellt und beschrieben worden sind, liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die gezeigten
Ausführungsformen geeignet zu modifizieren, ohne vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die weiter unten nachfolgenden Ansprüche stellen einen ersten, nicht bindenden Versuch dar, die Erfindung allgemein zu definieren. Beispiele
[0087] Die Fluoreszenzmessungen in Abhängigkeit der Temperatur wurden mit dem Fluoreszenzspektrometer FSP920 Edinburgh Instruments durchgeführt. Die Absorptionsmessungen wurden mit dem Absorptionsspektrometer CARY 5000 Varian durchgeführt.
[0088] Das Temperaturverhalten der Molecular Beacons wurde in 10 x 2 mm Küvetten von Hellma Analytics in PBS-Puffer (pH 7.4) gemessen (Konzentrationen um die ΙμΜ). Die Temperaturversuche wurden in den jeweiligen Spektrometern mittels temperierbarem
Probenhalter durchgeführt.
[0089] Die farbstoffgebundenen Molecular Beacons 5 '-ROX-MB56-BHQ2-3 ',5 '-ROX- MB64-BHQ2-3' und 5 '-ROX-MB70-BHQ2-3 'wurden von der Firma metabion international AG (Planegg, Deutschland) synthetisiert und von dort erworben.
[0090] Die hier verwendeten Molecular Beacons haben die folgenden Strukturen:
MB-56: 5 ' -ROX-TC ATGC TTTTTTTTTT GC ATGT-BHQ2-3 ' ;
Tm = 56.4°C; AG = -4.55 kcal/mol; ΔΗ = -47.7 kcal/mol; AS = -144.73 cal/(K*mol).
MB-64: 5 ' -ROX-TGCGTG TTTTTTTTTT CACGCT -BHQ2-3 '
Tm = 64°C; AG = -6.19 kcal/mol; AH = -53.5 kcal/mol, AS = -158.66 cal/(K*mol)
MB-70: 5 ' -ROX-TCGC ATGG TTTTTTTTTT CCATGCGT -BHQ2-3 '
Tm = 70.44°C; AG = -8.87 kcal/mol; AH = -67.1 kcal/mol, AS = -195.31 cal/(K*mol)
[0091] tHDA mit Molecular Beacons als Temperatursensor
Um die Eignung von Molecular Beacons als Temperatursensor in biomolekularen Systemen zu zeigen, wurde eine tHDA in Gegenwart von 5 '-ROX-MB70-BHQ2-3 'durchgeführt. Dazu wurden drei Primerlösungen angefertigt umfassend einen Vorwärtsprimer, einen Rückwärtsprimer, ein doppelt gelabeltes Sondenmolekül in RNA-freiem Wasser mit unterschiedlicher Menge an 5'-ROX-MB70-BHQ2-3':
Primerset 1 :
Komponente Stock Endkonzentration Volumen/Reaktion
Vorwärtsprimer 10 μΜ 80 nM 0,12
Rückwärtsprimer 10 μΜ 240 nM 0,36
Sondenmolekül 10 μΜ 80 nM 0,12
Molecular Beacon 10 μΜ 60 nM 0,09
RNA-freies Wasser 1 ,31
Primerset 2:
Komponente Stock Endkonzentration Volumen/Reaktion
Vorwärtsprimer 10 μΜ 80 nM 0,12
Rückwärtsprimer 10 μΜ 240 nM 0,36
Sondenmolekül 10 μΜ 80 nM 0,12
Molecular Beacon 10 μΜ 100 nM 0,15
RNA-freies Wasser 1,25
Primerset 3 :
Komponente Stock Endkonzentration Volumen/Reaktion
Vorwärtsprimer 10 μΜ 80 nM 0,12
Rückwärtsprimer 10 μΜ 240 nM 0,36
Sondenmolekül 10 μΜ 80 nM 0,12 Molecular Beacon
RNA-freies Wasser 1,4 Die verschiedenen Primersets wurden im Anschluss mit gängiger Pufferlösung, einem Enzymmix enthaltend Helicase und einem gängigen Helicasepuffer aus TRIS, NaCl, DTT, EDTA und Glycerol, einer 5 mM MgS04-Lösung und Wasser umgesetzt nach den folgenden
Mengenangaben:
Komponente Volumen für 1 Reaktion Volumen für 4 Reaktionen
2,5 x Puffer 6 24
Primerset 2 8
Enzymmix 1 4 lOx MgS04 1,5 6
Wasser 3,5 14
Summe 14
Die Inkubation erfolgte in einem RotorGene Q (QIAGEN, Hilden, Deutschland) PCR-Cycler bei 65 °C. 15 μΐ der Reaktionsmischung wurden in den vorbereiteten RGQ-Cycler überführt und die Messung gestartet. 40 Zyklen mit je einer Minute Länge wurden vorgenommen, wobei in dieser 1 Minute auch die Fluoreszenzauslesezeit inbegriffen ist.
Aus den tHDA-Reaktionsansätzen wurden für alle drei Primersets die Zeiten bis zum
Auftreten messbarer Nukleinsäureamplifikation bestimmt, jeweils in dreifacher Redundanz:
Molecular Beacon Ct [min] Durchschnitt Ct Δ Ct [min]
[min]
60 nM 22,07
60 nM 20,83 21,25 -0,17
60 nM 20,84
100 nM 19,83
100 nM 19,82 19,62 -1,79
100 nM 19,21 20,9
21,57 21,41
21,77
Aus den obigen Daten geht hervor, dass die tHDA nicht durch die Anwesenheit des
Molecular Beacons beeinflusst wird. Der Zeitpunkt des Eintritts der messbaren Amplifikation liegt bei allen drei Messlösungen jeweils in allen drei Versuchen im selben Bereich.
[0092] Ferner wurde zur Überprüfung des Einflusses der tHDA auf die Molecular Beacons eine Schmelzpunktanalyse im Anschluss an die tHDA mit den eingesetzten
Molecular Beacons durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 und 16 dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass auch die Molecular Beacons, die in der tHDA als Temperatursensoren eingesetzt wurden, keinen Schaden in diesem biomolekularen System genommen haben und auch nach dieser Anwendung funktionieren und verlässliche Schmelzpunkte aufweisen, und weiterhin als Temperatursonden in biomolekularen Systemen eingesetzt werden können.
[0093] Es konnte somit gezeigt werden, dass nicht nur die tHDA durch die Anwesenheit der Molecular Beacons (mit entsprechend Assay-adaptiert ausgewählter Sequenz) nicht beeinträchtigt wird, sondern auch, dass die Molecular Beacons durch deren Anwendung in der tHDA nicht in irgendeiner Weise reagieren und somit keinen Schaden nehmen.
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Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von mindestens einem Molecular Beacon (MB) umfassend einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher, oder einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor, oder einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor, wobei der fluoreszierende Donor, der nicht-emissive Löscher, der emissive Akzeptor und der nicht-emissive Akzeptor temperaturbeständig sind, als Temperatursensor in biologischen Assays oder diagnostischen Verfahren.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine Molecular Beacon inert gegenüber den Reaktanden im biologischen Assay ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 in in vivo oder in vitro Systemen.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biologische Assay DNA-basiert ist.
5. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das biologische Assay eine PCR (Polymerasekettenreaktion), eine tHDA (thermophilic Helicase-dependent Amplification), eine Immuno-PCR oder ein Aptamer-basiertes Assay ist.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der fluoreszierende Donor und/oder der emissive Akzeptor im vis- oder nahen infrarot (NIR-) Bereich emittiert/ emittieren.
7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Molecular Beacon einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher umfasst.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Molecular Beacon immobilisiert ist.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens zwei unterschiedliche Molecular Beacons verwendet werden.
10. Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons, die jeweils umfassen einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Löscher, oder einen fluoreszierenden Donor und einen emissiven Akzeptor, oder einen fluoreszierenden Donor und einen nicht-emissiven Akzeptor, wobei der fluoreszierende Donor, der nicht-emissive Löscher, der emissive Akzeptor und der nicht-emissive Akzeptor temperaturbeständig sind.
11. Kombination nach Anspruch 10, wobei die Temperaturauflösung durch die Länge des Nukleotidstranges und/oder den Guanin-Cytosin-Gehalts auf unter 1 °C geregelt ist.
12. Kombination nach Anspruch 11 oder 12, wobei die mindestens zwei Molecular Beacons auf einem Träger immobilisiert sind.
13. Kombination nach Anspruch 13, wobei die mindestens zwei zu immobilisierenden Molecular Beacons eine chemische Funktionalisierung tragen, über die eine Anbindung an einen Träger zur Immobilisierung geschieht.
14. Kombination nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der fluoreszierende Donor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Rhodamine 101, Rhodamine 6G, Coumarin 153, 6-Carboxy-X-Rhodamine und Atto 647 N.
15. Kombination nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die Kombination mindestens einen Molecular Beacon umfasst mit einem nicht-emissiven Löscher, und der nicht- emissive Löscher ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus Black Hole Quencher 2 (BHQ 2), Black Hole Quencher 3 (BHQ 3) und Dabcyl.
16. Sensorarray umfassend einen festen Träger, und eine Kombination aus mindestens zwei Molecular Beacons gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15.
Sensorarray nach Anspruch 16, wobei der Träger ausgesucht ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus 2D- und 3D-Support, optische Fasern, Mikrokanälen und Mikrotiterplatten-Kavitäten.
Sensorarray nach Anspruch 17, wobei der 2D-Support aus Membranen, Filmen und/oder Mikroskopieslides aus Glas oder einem Polymer oder an mesoporösen Partikeln bestehen kann.
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