EP3158316A1 - Particules liquides biomimétiques, procédé et dispositif de mesure en cytométrie en flux - Google Patents

Particules liquides biomimétiques, procédé et dispositif de mesure en cytométrie en flux

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EP3158316A1
EP3158316A1 EP15728576.8A EP15728576A EP3158316A1 EP 3158316 A1 EP3158316 A1 EP 3158316A1 EP 15728576 A EP15728576 A EP 15728576A EP 3158316 A1 EP3158316 A1 EP 3158316A1
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EP
European Patent Office
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liquid particles
measurements
liquid
solution
phase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP15728576.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Marc NERIN
Nicolas Bremond
Jérôme Bibette
Jean Baudry
Rory GILES
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Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
Original Assignee
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
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Filing date
Publication date
Application filed by Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris filed Critical Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
Publication of EP3158316A1 publication Critical patent/EP3158316A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N15/1012—Calibrating particle analysers; References therefor
    • G01N2015/1014—Constitution of reference particles

Definitions

  • the present invention relates to a solution of biomimetic liquid particles in suspension in the form of an emulsion for the control, the calibration of a biological analysis device such as a flow cytometer intended for the analysis of biological cells, and / or performing optical measurements in such a device.
  • It also relates to a method for performing a control, a calibration and / or a measurement in a flow cytometry device, as well as a flow cytometry device.
  • the field of the invention is more particularly, but in a non-limiting manner, that of devices and methods for biological analysis and in particular for blood analysis.
  • Samples of blood or other biological fluids undergo a preparation phase in which they are diluted, mixed with reagents, lysed, ...
  • an analysis chamber in the form of a sufficiently stretched sample flow (for example by hydraulic confinement techniques, or hydrofocusing) so that the cells it contains pass through this analysis chamber separately.
  • the flow of cells passes through one or a plurality of optical beams (for example beams from lasers).
  • fluorescence measurements for example to identify particular cells or compounds (proteins) which have been previously labeled with a dye or a fluorescent reagent;
  • FSC Forward Scatter Channel
  • SSC lateral scattering measurements
  • FSC and SSC small angle scattering measurements are particularly interesting because they provide a pair of coordinates that identify certain types of cells based on their position in an FSC-SSC diagram.
  • FSC-SSC diagram one can for example identify several families of leukocytes and proceed to a differential count of these biological cells using a "gating" or a specific classification, well known to those skilled in the art.
  • FSC and lateral SSC in order to be able to relate measured values to physical dimensions or other cell characteristics.
  • solid-state particles of known size of the polymer or PMMA (polymethyl methacrylate) type.
  • the PMMA beads have a refractive index of the order of 1 .59.
  • this material is used in place of biological cells whose average refractive index is around 1 .41.
  • biomimetic materials that are artificial bloods made using natural products: animal blood, human blood, fungi. These products are designed to to best mimic the physicochemical functions of human blood in clinical routine analyzers, which must be checked twice a day.
  • biomimetic materials also have disadvantages. They are difficult to stabilize over long periods, they are sensitive to temperature, and they can present health risks according to the origin of the blood used (contamination by viruses of hepatitis B, C, HIV, ...) .
  • the present invention aims to provide biomimetic materials suitable for calibration, control and measurement in flow cytometers that avoid the disadvantages of known materials for calibration or control of such systems.
  • Another object of the present invention is to propose biomimetic materials which make it possible to calibrate flow cytometers in a more precise manner.
  • the present invention also aims to provide biomimetic materials that can be easily adapted to different types of calibration.
  • the object of the present invention is also to propose biomimetic materials that can enable the calibration or the physical, chemical or biochemical control of a device for analyzing a biological sample.
  • the present invention also aims to provide biomimetic materials that can be used to perform specific biological measurements, including the assay of proteins or antibodies.
  • Another object of the present invention is to propose a process for calibrating flow cytometers which makes it possible to achieve improved measurement accuracies, in particular for the identification of cells.
  • the object of the present invention is to propose a flow cytometer which integrates calibration means that are easy to implement and based on products that are easy to store.
  • said solution being characterized in that it comprises liquid particles of a first liquid phase dispersed in a second liquid phase, which liquid particles having physical and / or biochemical properties making it possible to produce in said analysis device physical measurements similar to measurements as obtained (or as they would be obtained) with said analysis device on biological cells .
  • the first liquid phase and the second liquid phase comprise liquids that are immiscible with each other. Their mixture therefore produces a compound in the form of a solution of liquid particles in suspension, or an emulsion.
  • the biological analysis device may in particular be a flow cytometry device for the analysis of biological cells.
  • control and calibration can be in particular of a physical or biochemical nature.
  • the liquid particles may in particular have physical and / or biochemical properties making it possible to produce in the analysis device optical measurements similar to optical measurements as obtained with said analysis device on biological cells.
  • the solution of liquid particles in suspension can comprise liquid particles with:
  • refractive index can be determined for a working wavelength between 0.25 ⁇ and 2 ⁇ .
  • the suspended particles may comprise liquid particles:
  • the solution of liquid particles in suspension according to the invention can comprise liquid particles with a diameter whose coefficient of variation within the solution of liquid particles in suspension, defined as the ratio between the standard deviation the diameter distribution and the average diameter is less than 20%, or preferably less than 10% or 5%.
  • liquid particle diameters mentioned can be defined as equivalent diameters of a sphere of the same volume, or a sphere constituting the better approximation of shape, or hydrodynamic diameters, it being understood that in any case the liquid particles in suspension have a substantially spherical shape.
  • the compound according to the invention has the form of a solution of particles in suspension which comprises liquid particles called "monodisperse” in the sense that they are very similar and very homogeneous within the solution of particles in suspension in terms of dimensions and physical characteristics.
  • these liquid particles are designed so as to have physical, chemical or biochemical properties for mimicking, with selected degrees of improvement, the response of real cells within an analysis device, in particular a cytometer of flux.
  • the liquid particles of the invention may have physical and / or biochemical properties such as a refractive index and / or a diameter close to those of biological cells (of the leucocyte type for example), so as to produce when they are analyzed in a flow cytometer diffraction or diffusion measurements similar to diffraction or diffusion measurements that would be obtained with the same device by analyzing these biological cells;
  • the liquid particles of the invention may have physical and / or biochemical properties such as a fluorescence intensity at a given wavelength and close to those of biological cells possibly previously treated with reagents, so as to produce when analyzed in a flow cytometer fluorescence measurements similar to fluorescence measurements that would be obtained with the same device by analyzing these biological cells;
  • the liquid particles of the invention may have physical and / or biochemical properties such as an electrical impedance at at least one electrical frequency close to that of biological cells, so that they can be produced when they are analyzed in a cytometer of flow according to Coulter's method of electrical measurements similar to electrical measurements that would be obtained with the same device by analyzing these biological cells.
  • the first liquid phase may comprise at least one of the following compounds:
  • the second liquid phase of the solution of liquid particles in suspension according to the invention may comprise water and:
  • amphiphilic molecules in particular anionic (sodium dodecyl sulphate (SDS), sodium oleate, etc.), cationic (cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), etc.), nonionic poly (oxyethylene) sorbitan monolaurate, distearate polyethylene glycol, block copolymer of Poly (ethylene glycol) -poly (propylene glycol), ...); and or
  • solid nanoparticles of sub-micrometric size, capable of being adsorbed at the interface between the two liquid phases.
  • amphiphilic molecules or surfactants, or surfactants, or surfactants
  • the nanoparticles make it possible in particular to stabilize the liquid particles which are drops in suspension, against the fusion or the aggregation or the ripening of the drops between them, and thus make it possible to guarantee the stability over time of the solution of particles in suspension.
  • the liquid particles may include at least one of the following:
  • microparticles solid or liquid
  • a ligand functionalized with a molecule having a high affinity for the first phase and having amphiphilic properties a ligand functionalized with a molecule having a high affinity for the first phase and having amphiphilic properties.
  • the organic solvents of the family of alkanes such as hexane or pentane make it possible in particular to solubilize fluorescent compounds such as fluorophores produced by Hoeschi® (Hoechst 33258, Hoechst 33342, and Hoechst 34580).
  • Microparticles are particles of smaller size than those of liquid particles.
  • Microparticles with gold particles coupled to lipophilic molecules can significantly increase the wide-angle scattering signal (SSC) without noticeably modifying the small-angle scattering intensity (FSC scattering) when measured in a flow cytometer.
  • SSC wide-angle scattering signal
  • FSC scattering small-angle scattering intensity
  • ligands themselves attached to a molecule having a high affinity for the fractionated phase, ie the liquid particle, so that the ligand-molecule complex has a shared affinity between the phase constituting the liquid particle and the phase in which the particle is located.
  • functionalized amphiphilic molecules it is possible to incorporate functionalized amphiphilic molecules.
  • the ligands are here trapped on the surface of the liquid particles, in particular via an amphiphilic molecule. . In addition, they have mobility on the periphery of the liquid particle which makes it possible to efficiently capture at its interface receivers of interest.
  • the ligands are in permanent motion at the very periphery of the particle by the effect of Brownian motion.
  • the ligands can potentially have all possible orientations, and capture at the interface, ie at the boundary of the first phase and the second phase, the molecule of interest optimally, since theoretically all orientations of the ligand are possible.
  • a cumulative effect is obtained with the invention which makes it possible to concentrate the ligand-receptor complex on the surface of the liquid particle. Indeed, potentially, all the ligands present in a liquid particle can capture a molecule of interest. It is thus possible to obtain a higher concentration of molecules of interest on the liquid particles than in the continuous phase. This characteristic is very advantageous, particularly for the identification and the determination of "receptor" molecules that are slightly abundant in the continuous phase.
  • a method for performing control, calibration and / or measurement in a flow cytometry device for biological cell analysis which comprises steps:
  • the method according to the invention may further comprise steps:
  • the method according to the invention may also comprise steps:
  • This information may in particular be a fluorescence intensity proportional to the concentration of the ligand-receptor-fluorophore complex, in a technique for assaying the molecule of interest: antigen, ion, enzyme, etc.
  • the method according to the invention may further comprise steps:
  • the method according to the invention may further comprise steps:
  • fluorophores with a known concentration, it is possible to simulate biological cells with fluorescent markers and thus to calibrate fluorescence measurement channels of a cytometer.
  • a flow cytometry device for the analysis of biological cells, which device comprises means of implementation, for the control, calibration and / or the realization of physical measurements, in particular optical system, a solution of liquid particles in suspension comprising liquid particles of a first liquid phase dispersed in a second liquid phase, which liquid particles having physical, chemical and / or biochemical properties for producing in said cytometry device flow of physical measurements similar to measurements obtained with biological cells.
  • the flow cytometry device of the invention may further comprise means for producing the solution of liquid particles in suspension from fluids respectively of the first phase and the second phase.
  • It may in particular comprise dispersion means based on a microfluidic technology for producing the solution of liquid particles in suspension, which microfluidic technology implementing at least one of the following configurations:
  • the flow cytometry device of the invention may further comprise means for separately storing at least one fluid of the first phase and at least one fluid of the second phase.
  • Products included in the composition of the first liquid phase and the second liquid phase can be supplied and stored separately in the flow cytometry apparatus or in the vicinity, as conventional reagents. This avoids possible problems related to the stability over time of the liquid particles in suspension. This also makes it easy to produce, on demand, liquid particles with different characteristics (inclusion of specific fluorophores, etc.).
  • the synthesis of liquid particles can be easily performed with a production process that relies on microfluidic technologies. It is thus possible to produce a device for producing a solution of suspended particles which is compatible with integration into a laboratory flow cytometer and which is capable of producing the volumes of solution of liquid particles in suspension necessary for the calibration. and / or control of the flow cytometer.
  • FIG. 1 shows an embodiment of a flow cytometer according to the invention which allows measurements of small angle scattering (FSC) and lateral diffusion (SSC) on cells
  • FIG. 2 presents a histogram of measurements of a measurement signal SSC obtained with polymer spheres of diameter 5 ⁇ on a flow cytometer implementing a laser at a wavelength of 488 nm
  • FSC small angle scattering
  • SSC lateral diffusion
  • FIG. 3 shows the intensity of a measurement signal SSC obtained at a wavelength of 488 nm on polymer spheres, as a function of the diameter of these spheres,
  • FIG. 4 shows a block diagram of a device for producing liquid particles according to the invention
  • FIG. 5 shows a sectional view of a device for producing liquid particles according to the invention
  • FIG. 6 presents results obtained with a flow cytometer by implementing the calibration method of the invention, with FIG. 6a a histogram of small angle scattering (FSC) measurements, FIG. 6b a histogram of lateral scattering measurements (SSC), and FIG. 6c the corresponding SSC-FSC diagram,
  • FSC small angle scattering
  • SSC histogram of lateral scattering measurements
  • FIG. 7 shows an example of fluorescence measurements obtained with a flow cytometer on fluorescent liquid particles according to the invention
  • FIG. 9 shows the SSC-FSC diagram obtained with the comparative solution of FIG. 8 and the flow cytometer used in the context of FIG. 7.
  • the invention relates to a method for calibrating flow cytometers for carrying out measurements on biological cells in particular.
  • Such instruments are for example commonly used to perform blood tests, enumerations of cells such as leukocytes ...
  • a flow cytometer comprises an analysis chamber 10 at which the measurements are made.
  • Samples of blood or other biological fluids 17 undergo a preparation phase in which they are diluted, mixed with reagents, lysed, ...
  • sample flow 19 which is sufficiently fine and stretched so that the cells it contains pass through a measuring zone 11 so that they can be distinguished.
  • the conditioning of the sample flow 19 is carried out by implementing a hydraulic confinement technique, or "hydrofocusing".
  • the sample flow 19 is injected into the analysis chamber 10 through an injection nozzle 12.
  • a cladding fluid 24 is also injected into the analysis chamber 10 around the injection nozzle 12. This fluid cladding 24 is used to stretch and center the sample flow 19.
  • the sample flow 19 thus conditioned passes through a measurement zone 1 1.
  • This measurement zone 1 1 comprises in particular optical measurement means.
  • other known measuring means such as impedance measuring means, can also be implemented.
  • the optical measurement means generally make it possible to perform optical measurements of the fluorescence measurement type and / or scattering measurements at different angles.
  • At least one light source 13 (generally a laser diode) which generates an optical measurement beam directed towards the sample flow 19 in the measurement zone 11.
  • Photodetectors are arranged in different angular orientations to capture light from the sample flow and due to scattering or fluorescence phenomena.
  • FIG. 1 illustrates a measurement configuration with:
  • a photodetector 15 positioned along an optical axis close to the optical axis of the measurement beam, which makes it possible to carry out small angle scattering measurements (FSC); a photodetector 14 positioned along an optical axis substantially at right angles to the optical axis of the measurement beam and to the sample flow 19, which makes it possible to carry out lateral scattering measurements (SSC).
  • FSC small angle scattering measurements
  • SSC lateral scattering measurements
  • Fluorescence measurements are used, for example, to identify particular cells or compounds (proteins) that have been previously labeled with a dye or a fluorescent reagent.
  • the FSC and SSC small angle scattering measurements are of particular interest because they provide a pair of coordinates that make it possible to identify certain types of cells according to their position in an FSC-SSC intensity diagram.
  • leukocytes can be identified in this way.
  • FSC and lateral SSC in order to be able to relate measured values to physical dimensions or other cell characteristics.
  • sample stream 19 is passed in place of a calibration stream which contains particles or microbeads 21 of known dimensions.
  • particles in the solid state for example of the polymer or PMMA (polymethyl methacrylate) type, are used.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • FIG. 2 shows a histogram of SSC lateral scattering measurements carried out at a wavelength of 488 nm on PMMA microbeads of diameter 5 ⁇ and whose coefficient of variation in the volume of the sample is 1 5%.
  • a dispersion of the measurements is observed which is much greater than the dispersion of the particles in terms of size. This dispersion of the measurements of course has a direct impact on the quality of the calibration and the measurements made subsequently with the apparatus.
  • the curve of FIG. 3 represents an intensity, calculated at a wavelength of 488 nm, of the SSC side scattering signal as a function of the diameter of a polymer particle between 0 and 6 ⁇ .
  • the polymer taken into account is PMMA with a refractive index of the order of 1 .59.
  • This compound is intended in particular to allow a much more precise calibration of these flow cytometers.
  • this compound is a solution of liquid particles in suspension.
  • the particles are made in the form of liquid particles or drops of a first liquid phase suspended in a second liquid phase.
  • the liquids of the first and second phases are of course immiscible. This compound can therefore be considered as an emulsion.
  • the nominal size of the liquid particles must be 5 and 6 ⁇ with a refractive index equal to 1 .4.
  • the coefficient of variation of the size of the liquid particles within the solution of particles in suspension must be as small as possible (for example of the order of 10% in diameter, preferably of the order of 5%) .
  • the first phase is obtained with an optical index oil.
  • Optical index oils are oils that are specifically formulated to exhibit a known and controlled optical refractive index. Such oils are commonly used in optics for producing refractive index matching layers in particular. There may be mentioned oils produced by Cargille®.
  • the second phase is composed of water and sodium dodecyl sulphate (SDS), which makes it possible to ensure the stability of the solution of particles in suspension over time.
  • SDS sodium dodecyl sulphate
  • This production device 20 implements a microfluidic process that allows a mass production of liquid particles 21, that is to say of the order of 10 ml / day for liquid particles 21 whose diameter is included between 1 and 10 ⁇ .
  • a body 40 for example made of glass
  • a plurality of microchannels of rectangular section 41 passing through its wall.
  • Fig. 5 shows a sectional view of this body 40.
  • the liquid of the first phase 42 is brought into contact with the external face of the body 40 with a pressure P1.
  • the liquid of the second phase 43 is brought into contact with the internal face of the body 40 with a pressure P2.
  • the liquid of the first phase 42 flows into the liquid of the second phase 43 through the microchannels 41, breaking up in the form of drops or particles liquids 21.
  • the diameter D of the liquid particles thus formed and their formation frequency f depends in particular on the thickness H of the micro-channel and the flow rate Q of the liquid of the first phase in this micro-channel:
  • the formation frequency f depends little on the pressure P2 on the side of the second phase but increases with the pressure P1 on the side of the first phase.
  • the solution of suspended particles flows as it is formed to an outlet of the body 40.
  • Fig. 6 presents calibration results of a flow cytometer obtained with a solution of particles in suspension of calibration according to the invention.
  • Figs. 6a and Figs. 6b respectively show histograms of small angle scattering (FSC) and lateral scattering (SSC) measurements obtained for a population of liquid particles according to the invention. It can be seen that the high dispersion of lateral scattering measurements (SSC) observed in FIG. 2 for PMMA microspheres disappeared in lateral diffusion measurements performed with the liquid particles of the invention ( Figure 6b). Accordingly, as illustrated in FIG. 6c, the calibration liquid particle population produces a well-localized "spot" in the SSC-FSC diagram that effectively calibrates the relationship between FSC-SSC measurements and sizes or other characteristics of biological cells.
  • FSC small angle scattering
  • SSC lateral scattering
  • Fig. 7 shows an example of fluorescence measurements obtained with a flow cytometer on fluorescent liquid particles according to the invention.
  • the dispersed phase in the form of drops or droplets (the first phase) comprises a mineral oil and a fluorophore of the "Nile red” type with a concentration of the order of 2 ⁇ 10 -5 mol / l.
  • the second phase is composed of water and sodium dodecyl sulphate (SDS).
  • the suspended particulate solution formed as explained above is sufficiently stable over time to be mass-produced, packaged in vials and routed to end-users for routine use on laboratory flow cytometers.
  • the liquid particle solution of FIG. 8 was obtained by mixing the first-phase liquid and the second-phase liquid mentioned above with the mortar.
  • the chemical composition of this solution of liquid particles is therefore identical to that of the solution of liquid particles prepared according to FIG. 5.
  • the SSC-FSC diagram of FIG. 9 shows that the comparative solution of polydisperse liquid particles produces a "stain" very spread, which does not allow to calibrate the device effectively.
  • the invention also makes it possible to perform cytometers with integrated calibration means.
  • Fig. 1 thus illustrates a flow cytometer according to the invention which comprises a device for producing solution of liquid particles in suspension, for example as described in FIGS. 4 and FIG. 5.
  • This flow cytometer also comprises means 22 for storing a liquid or liquids of the first phase 42 and means 23 for storing a liquid or liquids of the second phase 43.
  • these storage means 22, 23 may comprise flasks and interfaces for inserting these flasks into the cytometer, as is conventionally done for the reagents.
  • the suspended particulate solution is produced as needed in the integrated production device 20.
  • the cytometer may also optionally include temporary storage of the suspended particulate solution produced.
  • the flow cytometer comprises a valve 18 which makes it possible to bring the solution of liquid particles in suspension to the measurement chamber 24, or biological samples prepared in the usual manner.
  • This embodiment therefore makes it possible to bring and store at the level of the cytometer only the products necessary for the manufacture of the solution of liquid particles in suspension. In addition, they can be managed like other conventional reagents.
  • solution of liquid particles in suspension according to the invention can also be used to "capture” and concentrate molecules of interest on the surface of liquid particles 21.
  • the solution of liquid particles in suspension according to the invention is used as a calibration or dosing element of a molecule of interest.
  • a measurement method is then implemented which comprises steps of: implementing or manufacturing a solution of particles in suitable suspension, with ligands included in the liquid particles 21; - Dilute the solution of liquid particles in suspension in a solution containing the molecules of interest, so that the molecules of interest are captured and concentrate on the surface of the liquid particles 21;
  • This type of measurement can of course advantageously be carried out with a cytometer according to the invention with an integrated production device 20 of solution of liquid particles in suspension. In this case, it is simply necessary to provide additional dilution means for the solution of particles in suspension with a solution containing molecules of interest.
  • the molecules of interest are, for example, the antibodies included in the flow cytometer reagents for labeling biological cells such as anti-CD4 and / or CD8 antibodies, but theoretically the fluid particle may contain at least one ligand making it possible to recognize a anti-CDn antibody (where n is a natural number to identify the molecule of interest according to a classification well known to those skilled in the art).
  • the calibration method according to the invention can be implemented with any type of flow cytometer.
  • flow cytometers that implement any type of confinement method to generate a sample flow 19. It can thus be implemented for example with flow cytometers that use fluidic microchannels to confine sample flow 19 without cladding fluid.
  • flow cytometers intended to perform measurements on elements other than biological cells, or on non-biological elements.
  • a flow cytometer according to the invention which comprises calibration means as described above can: - be of any type;
  • a device 20 for producing a solution of liquid particles in suspension can also be shared between several flow cytometers.
  • the liquid particles can be mixed with biological particles (erythrocytes, spores) to allow, in a single phase, to calibrate and / or control functions that the only biomimetic particles can not satisfy, such as the activity of a reagent lytic commonly used in flow cytometers.
  • biological particles erythrocytes, spores

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une solution de particules liquides en suspension pour le contrôle, la calibration et/ou la réalisation de mesures physiques, notamment optiques, dans un dispositif de cytométrie en flux destiné à l'analyse de cellules biologiques, ladite solution comprenant des particules liquides (21) d'une première phase liquide dispersées dans une seconde phase liquide, lesdites particules liquides (21) présentant des propriétés physiques, chimiques et/ou biochimiques permettant de produire dans ledit dispositif de cytométrie en flux des mesures physiques similaires à des mesures obtenues avec des cellules biologiques, et lesdites particules liquides (21) ayant un diamètre dont le coefficient de variation au sein de la solution de particules liquides en suspension est inférieur à 10 %. L'invention concerne aussi un procédé de mesure et un dispositif de cytométrie en flux mettant en œuvre la solution de particules liquides en suspension.

Description

Particules liquides biomimétiques, procédé et dispositif de mesure en cytométrie en flux
La présente invention concerne une solution de particules liquides biomimétiques en suspension sous la forme d'une émulsion pour le contrôle, la calibration d'un dispositif d'analyse biologique tel qu'un cytomètre en flux destiné à l'analyse de cellules biologiques, et/ou la réalisation de mesures optiques dans un tel dispositif.
Elle concerne aussi un procédé pour effectuer un contrôle, une calibration et/ou une mesure dans un dispositif de cytométrie en flux, ainsi qu'un dispositif de cytométrie en flux.
Le domaine de l'invention est plus particulièrement, mais de manière non limitative, celui des dispositifs et des procédés d'analyse biologique et notamment d'analyse sanguine.
Les techniques d'analyse de sang ou d'autres milieux biologiques par cytométrie en flux sont bien connues.
On connaît notamment des techniques qui permettent d'effectuer des énumérations et/ou des identifications de cellules biologiques, telles que par exemple des globules blancs. De manière générale, leur fonctionnement est le suivant.
Les échantillons de sang ou d'autres fluides biologiques subissent une phase de préparation dans laquelle ils sont dilués, mélangés à des réactifs, lysés, ...
Ils sont ensuite transférés dans une chambre d'analyse sous la forme d'un flux échantillon suffisamment étiré (par exemple par des techniques de confinement hydraulique, ou hydrofocusing) pour que les cellules qu'il contient traversent cette chambre d'analyse séparément.
Dans les systèmes qui mettent en œuvre des mesures optiques, le flux de cellules traverse un ou une pluralité de faisceaux optiques (par exemple des faisceaux issus de lasers).
Afin d'identifier, caractériser et/ou dénombrer des cellules, différents types de mesures physiques peuvent être effectuées. On peut citer notamment :
- des mesures de fluorescence, pour identifier par exemple des cellules ou des composés particuliers (protéines) qui ont été préalablement marqués avec un colorant ou un réactif fluorescent ;
- des mesures de volume par la technique de Wallace H. Coulter
- des mesures de diffusion ou de diffraction de la lumière.
Parmi les mesures de diffusion, on trouve : - des mesures de diffusion aux petits angles (en Anglais « Forward Scatter Channel », FSC) qui sont effectuées avec un détecteur proche de l'axe du faisceau émergeant du flux échantillon ;
- des mesures de diffusion latérale (en Anglais « Side Scatter Channel », SSC) qui sont effectuées avec un détecteur positionné à angle droit par rapport au faisceau de mesure et au flux échantillon ;
Les mesures de diffusion aux petits angles FSC et latérales SSC sont particulièrement intéressantes car elles fournissent un couple de coordonnées qui permettent d'identifier certains types de cellules en fonction de leur position dans un diagramme FSC-SSC. Dans le diagramme FSC-SSC, on peut par exemple identifier plusieurs familles de leucocytes et procéder à un comptage différentiel de ces cellules biologiques en utilisant un « gating » ou une classification spécifique, bien connu de l'homme de l'art.
Pour qu'un cytomètre puisse fournir des informations fiables, il est nécessaire de le calibrer et de le contrôler. En pratique, ces opérations sont effectuées périodiquement lors de l'exploitation de l'appareil.
Il est notamment nécessaire de calibrer les mesures de diffusion aux petits angles
FSC et latérales SSC, afin de pouvoir relier des valeurs mesurées à des dimensions physiques ou d'autres caractéristiques de cellules.
Pour cela, on utilise de manière habituelle des particules à l'état solide de taille connue, de type polymère ou PMMA (Polyméthacrylate de méthyle).
Ces particules solides présentent toutefois des inconvénients. Elles ont des propriétés optiques qui ne miment pas correctement le comportement des objets pour lequel le cytomètre est utilisé, c'est-à-dire les cellules biologiques.
Par exemple, les billes de PMMA ont un indice de réfraction de l'ordre de 1 .59. Or ce matériau est utilisé en lieu et place de cellules biologiques dont l'indice de réfraction moyen est situé aux alentours de 1 .41 . Ainsi, il n'est pas rare de devoir modifier ou de commuter les gains ensuite des systèmes de détection pour adapter la dynamique des signaux aux objets étudiés.
En outre, on observe en pratique que l'utilisation de billes de PMMA produit des signaux de diffusion latérale SSC bruités, ce qui limite fortement l'efficacité de la calibration.
Pour calibrer et contrôler des cytomètres en hématologie, on utilise également des matériaux biomimétiques qui sont des sangs artificiels fabriqués à l'aide de produits naturels : sangs d'animaux, sangs humains, champignons. Ces produits sont conçus pour mimer au mieux les fonctions physico-chimiques de sangs humains dans des appareils d'analyse en routine clinique, qui doivent être contrôlés deux fois par jour.
Ces matériaux biomimétiques présentent également des inconvénients. Ils sont difficiles à stabiliser sur des durées longues, ils sont sensibles à la température, et ils peuvent présenter des risques sanitaires suivant l'origine du sang utilisé (contamination par des virus de l'hépatite B, C, HIV, ...).
La présente invention a pour objet de proposer des matériaux biomimétiques adaptés à la calibration, le contrôle et la réalisation de mesures dans des cytomètres en flux qui évitent les inconvénients des matériaux connus pour la calibration ou le contrôle de tels systèmes.
La présente invention a également pour objet de proposer des matériaux biomimétiques qui produisent des mesures proches de celles de cellules biologiques dans des cytomètres en flux.
La présente invention a également pour objet de proposer des matériaux biomimétiques qui permettent d'effectuer des calibrations de cytomètres en flux de manière plus précis.
La présente invention a également pour objet de proposer des matériaux biomimétiques qui puissent être adaptés aisément à différents types de calibration.
La présente invention a également pour objet de proposer des matériaux biomimétiques qui puissent permettre la calibration ou le contrôle physique, chimique ou biochimique d'un dispositif d'analyse d'un échantillon biologique.
La présente invention a également pour objet de proposer des matériaux biomimétiques qui puissent être utilisés pour effectuer des mesures biologiques spécifiques, dont notamment le dosage de protéines ou d'anticorps.
La présente invention a également pour objet de proposer un procédé de calibration de cytomètres en flux qui permettent d'atteindre des précisions de mesures améliorées, notamment pour l'identification de cellules.
La présente invention a enfin pour objet de proposer un cytomètre en flux qui intègre des moyens de calibration faciles à mettre en œuvre et basés sur des produits faciles à stocker.
Ces objectifs sont atteints en utilisant une solution de particules liquides en suspension pour le contrôle, la calibration et/ou la réalisation de mesures physiques dans un dispositif d'analyse biologique,
ladite solution étant caractérisée en ce qu'elle comprend des particules liquides d'une première phase liquide dispersées dans une seconde phase liquide, lesquelles particules liquides présentant des propriétés physiques et/ou biochimiques permettant de produire dans ledit dispositif d'analyse des mesures physiques similaires à des mesures telles qu'obtenues (ou telles qu'elles seraient obtenues) avec ledit dispositif d'analyse sur des cellules biologiques.
La première phase liquide et la seconde phase liquide comprennent des liquides qui ne sont pas miscibles entre eux. Leur mélange produit donc un composé sous la forme d'une solution de particules liquides en suspension, ou d'une émulsion.
Le dispositif d'analyse biologique peut notamment être un dispositif de cytométrie en flux destiné à l'analyse de cellules biologiques.
Le contrôle et la calibration peuvent être notamment de nature physique on biochimique.
Les particules liquides peuvent notamment présenter des propriétés physiques et/ou biochimiques permettant de produire dans le dispositif d'analyse des mesures optiques similaires à des mesures optiques telles qu'obtenues avec ledit dispositif d'analyse sur des cellules biologiques.
Suivant des modes de réalisation, la solution de particules liquides en suspension peut comprendre des particules liquides avec :
- un indice de réfraction inférieur à 1 .5 ;
- un indice de réfraction inférieur à 1 .45 ;
- un indice de réfraction compris entre 1 .35 et 1 .45 ;
- un indice de réfraction égal à 1 .4.
Ces valeurs d'indice de réfraction peuvent être déterminées pour une longueur d'onde de travail comprise entre 0.25 μηι et 2 μηι.
Suivant des modes de réalisation, les particules en suspension peuvent comprendre des particules liquides:
- avec un diamètre inférieur à 20 μηι ;
- avec un diamètre compris entre 0.5 et 20 μηι ;
- avec un diamètre compris entre 1 et 10 μηι, préférentiellement compris entre 4 et
6 μηι ;
Suivant des modes de réalisation, la solution de particules liquides en suspension selon l'invention peut comprendre des particules liquides avec un diamètre dont le coefficient de variation au sein de la solution de particules liquides en suspension, défini comme le rapport entre l'écart type de la distribution des diamètres et le diamètre moyen, est inférieur à 20 %, ou de manière préférentielle inférieur à 10 % ou 5%.
Les diamètres de particules liquides mentionnées peuvent être définis comme des diamètres équivalents d'une sphère de même volume, ou d'une sphère constituant la meilleure approximation de forme, ou des diamètres hydrodynamiques, étant entendu que de toute façon les particules liquides en suspension ont une forme sensiblement sphérique.
Ainsi, le composé selon l'invention a la forme d'une solution de particules en suspension qui comprend des particules liquides dites « monodisperses » dans le sens où elles sont très semblables et très homogènes au sein de la solution de particules en suspension en termes de dimensions et de caractéristiques physiques. En outre, ces particules liquides sont conçues de telle sorte à présenter des propriétés physiques, chimiques ou biochimiques permettant de mimer, avec des degrés de perfectionnement choisis, la réponse de cellules réelles au sein d'un dispositif d'analyse, notamment un cytomètre de flux.
En particulier, à titre d'exemples non limitatifs en relation avec des mesures mises en œuvre de manière habituelle dans un cytomètre de flux :
- les particules liquides de l'invention peuvent présenter des propriétés physiques et/ou biochimiques telles qu'un indice de réfraction et/ou un diamètre proches de celles de cellules biologiques (de type leucocytes par exemple), de telle sorte à produire lorsqu'elles sont analysées dans un cytomètre de flux des mesures de diffraction ou de diffusion similaires à des mesures de diffraction ou de diffusion qui seraient obtenues avec le même dispositif en analysant ces cellules biologiques ;
- les particules liquides de l'invention peuvent présenter des propriétés physiques et/ou biochimiques telles qu' une intensité de fluorescence à une longueur d'onde donnée et proches de celles de cellules biologiques éventuellement préalablement traitées avec des réactifs, de telle sorte à produire lorsqu'elles sont analysées dans un cytomètre de flux des mesures de fluorescence similaires à des mesures de fluorescence qui seraient obtenues avec le même dispositif en analysant ces cellules biologiques ;
- les particules liquides de l'invention peuvent présenter des propriétés physiques et/ou biochimiques telles qu'une impédance électrique à au moins une fréquence électrique proche de celle de cellules biologiques, de telle sorte à produire lorsqu'elles sont analysées dans un cytomètre de flux selon la méthode de Coulter des mesures électriques similaires à des mesures électriques qui seraient obtenues avec le même dispositif en analysant ces cellules biologiques.
Le terme de « mesures similaires » désigne des mesures produisant les mêmes valeurs, ou des valeurs comparables, ou encore des valeurs se trouvant dans un même intervalle prédéterminé, ou encore des mesures représentatives d'un même type et/ou d'un même état de cellules biologiques. Suivant des modes de réalisation de la solution de particules liquides en suspension selon l'invention, la première phase liquide peut comprendre au moins l'un des composés suivants :
- une huile minérale ou végétale,
- une huile silicone, ou polysiloxane
- une solution de sulfure de carbone CS2,
- un solvant organique de la famille des alcanes,
- de l'hexane,
- du pentane,
- une huile fluorocarbure.
La seconde phase liquide de la solution de particules liquides en suspension selon l'invention peut comprendre de l'eau et :
- des molécules amphiphiles, notamment anioniques (dodécylsulfate de sodium (SDS), oléate de sodium,...), cationiques (bromure de cétyltriméthyl ammonium (CTAB), ...), non ioniques (Poly(oxyethylène) sorbitan monolaurate, distéarate de polyethylène glycol, copolymère bloc de Poly(éthylène glycol)-poly(propylène glycol), ...) ; et/ou
- des nano-particules solides, de taille sub-micrométrique, aptes à s'adsorber à l'interface entre les deux phases liquides.
Les molécules amphiphiles (ou tensioactifs, ou agents de surface, ou surfactants), ou les nano-particules permettent notamment de stabiliser les particules liquides qui sont des gouttes en suspension, contre la fusion ou l'agrégation ou le mûrissement des gouttes entre elles, et permettent ainsi de garantir la stabilité dans le temps de la solution de particules en suspension.
Suivant des modes de réalisation de la présente invention, les particules liquides peuvent inclure au moins l'un des éléments suivants :
- un fluorophore,
- des micro-particules, solides ou liquides,
- des particules d'or couplées à des molécules lipophiles,
- des molécules amphiphiles,
- un ligand fonctionnalisé à une molécule ayant une grande affinité pour la première phase et possédant des propriétés amphiphiles.
Les solvants organiques de la famille des alcanes tels que l'hexane ou le pentane permettent notamment de solubiliser des composés fluorescents tels que des fluorophores produits par la société Hoeschi® (Hoechst 33258, Hoechst 33342, and Hoechst 34580). Les micro-particules sont des particules de taille plus petite que celles des particules liquides.
Des microparticules avec des particules d'or couplées à des molécules lipophiles peuvent permettre d'augmenter significativement le signal de diffusion aux grands angles (diffusion latérale SSC) sans notoirement modifier l'intensité diffusée aux petits angles (diffusion FSC) lors de mesures effectuées dans un cytomètre en flux.
Comme expliqué précédemment, il est possible d'incorporer dans les particules liquides de l'invention des ligands eux-mêmes attachés à une molécule ayant une grande affinité pour la phase fractionnée, c'est-à-dire la particule liquide, de sorte que le complexe ligand-molécule ait une affinité partagée entre la phase constituant la particule liquide et la phase dans laquelle se trouve la particule. En d'autres termes, il est possible d'incorporer des molécules amphiphile fonctionnalisées.
Contrairement aux particules solides de l'art antérieur, pour lesquelles les ligands sont « attachés » à la surface des particules par une liaison covalente, les ligands sont ici piégés à la surface des particules liquides, notamment par l'intermédiaire d'une molécule amphiphile. En outre, ils possèdent une mobilité en périphérie de la particule liquide qui permet de capturer efficacement à son interface des récepteurs d'intérêt.
Dans le cas des particules solides de l'art antérieur, pour lesquelles le ligand est figé à la surface de la particule, un grand nombre de ligands possèdent une orientation aléatoire qui ne leur permet pas de capturer la molécule réceptrice d'intérêt : c'est le cas des anticorps pour lesquels les techniques de greffage conventionnelles ne permettent pas une sélection de leur orientation, et ceux qui ne sont pas correctement orientés ne peuvent pas capturer l'antigène.
Dans le cas de la particule liquide de l'invention, les ligands sont en mouvement permanent en périphérie même de la particule par l'effet du mouvement brownien. Les ligands peuvent avoir potentiellement toutes les orientations possibles, et capturer à l'interface, c'est à dire à la frontière de la première phase et la seconde phase, la molécule d'intérêt de manière optimale, puisque théoriquement toutes les orientations du ligand sont possibles.
En outre, on obtient avec l'invention un effet cumulatif qui permet de concentrer le complexe ligand-récepteur à la surface de la particule liquide. En effet, potentiellement, tous les ligands présents dans une particule liquide peuvent capturer une molécule d'intérêt. On peut ainsi obtenir une concentration plus élevée de molécules d'intérêt sur les particules liquides que dans la phase continue. Cette caractéristique est très avantageuse notamment pour l'identification et le dosage de molécules « récepteur » faiblement abondantes dans la phase continue. Suivant un autre aspect, il est proposé un procédé pour effectuer un contrôle, une calibration et/ou une mesure dans un dispositif de cytométrie en flux destiné à l'analyse de cellules biologiques, qui comprend des étapes :
- de transfert dans ledit dispositif de cytométrie en flux d'une solution de particules liquides en suspension comprenant des particules liquides d'une première phase liquide dispersée dans une seconde phase liquide, lesquelles particules liquides présentent des propriétés physiques, chimiques et/ou biochimiques permettant de produire dans ledit dispositif de cytométrie en flux des mesures physiques similaires à des mesures obtenues avec des cellules biologiques,
- de réalisation de mesures d'au moins l'un des types suivants sur lesdites particules liquides : mesures optiques, mesures électriques, mesures magnétiques, mesures électromagnétiques.
Suivant des modes de mise en œuvre, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre des étapes :
- de mélange d'une solution de particules liquides en suspension comprenant des particules liquides avec des ligands aptes à se lier à des molécules d'intérêt avec une solution contenant des molécules d'intérêt, de sorte à permettre la capture à la surface des particules liquides par les ligands de molécules d'intérêt,
- de déduction d'une information sur lesdites molécules d'intérêt à partir de mesures optiques sur lesdites particules liquides.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre des étapes :
- de mesures de fluorescence,
- de déduction d'une information de densité de molécules d'intérêt présentes à la surface des particules liquides. Cette information peut être notamment une intensité de fluorescence proportionnelle à la concentration du complexe ligand-récepteur-fluorophore, dans une technique de dosage de la molécule d'intérêt : antigène, ion, enzyme, ...
Suivant des modes de mise en œuvre, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre des étapes :
- de mesures de diffusion aux petits angles (FSC) et de diffusion latérale (SSC) sur des particules liquides de dimension connue,
- de déduction d'une information de calibration du cytomètre pour la différentiation ou la mesure de dimensions de cellules.
En effet, comme les caractéristiques des particules liquides de l'invention sont connues et maîtrisées, et en outre proches de celles des cellules biologiques à caractériser, on peut ainsi calibrer la réponse d'un cytomètre en flux pour les mesures de diffusion FSC - SSC - Volume de manière qu'elles produisent ensuite des informations précises et fiables sur les cellules biologiques.
Suivant des modes de mise en œuvre, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre des étapes :
- de mesures de fluorescence sur des particules liquides comprenant au moins un fluorophore,
- de déduction d'une information de calibration du cytomètre pour des mesures de fluorescence.
Ainsi, en incluant dans les particules liquides de l'invention des fluorophores avec une concentration connue, on peut simuler des cellules biologiques avec des marqueurs fluorescents et donc calibrer des canaux de mesure de fluorescence d'un cytomètre.
Suivant encore un autre aspect, il est proposé un dispositif de cytométrie en flux destiné à l'analyse de cellules biologiques, lequel dispositif comprend des moyens de mise en œuvre, pour le contrôle, la calibration et/ou la réalisation de mesures physiques, notamment optiques, d'une solution de particules liquides en suspension comprenant des particules liquides d'une première phase liquide dispersées dans une seconde phase liquide, lesquelles particules liquides présentant des propriétés physiques, chimiques et/ou biochimiques permettant de produire dans ledit dispositif de cytométrie en flux des mesures physiques similaires à des mesures obtenues avec des cellules biologiques.
Suivant des modes de réalisation, le dispositif de cytométrie en flux de l'invention peut comprendre en outre des moyens pour produire la solution de particules liquides en suspension à partir de fluides respectivement de la première phase et de la seconde phase.
Il peut notamment comprendre des moyens de dispersion basés sur une technologie microfluidique pour produire la solution de particules liquides en suspension, laquelle technologie microfluidique mettant en œuvre au moins l'une des configurations suivantes :
- un co-écoulement des fluides de la première phase et de la seconde phase,
- des écoulements transverses des fluides de la première phase et de la seconde phase,
- un écoulement d'un des deux fluides de l'une des phases à travers un trou débouchant dans un réservoir contenant l'autre fluide de l'autre phase,
- des canaux dans lesquels s'écoulent les deux fluides simultanément présentant une variation de leurs dimensions, telle que la hauteur ou la largeur. Suivant des modes de réalisation, le dispositif de cytométrie en flux de l'invention peut comprendre en outre des moyens pour stocker séparément au moins un fluide de la première phase et au moins un fluide de la seconde phase.
Ainsi, avantageusement, il n'est pas nécessaire de stocker et de transporter une solution de particules liquides en suspension selon l'invention.
Les produits entrant dans la composition de la première phase liquide et de la seconde phase liquide peuvent être amenés et stockés séparément dans l'appareil de cytométrie en flux ou à proximité, comme des réactifs classiques. Cela permet d'éviter d'éventuels problèmes liés à la stabilité dans le temps des particules liquides en suspension. Cela permet aussi de réaliser facilement, et à la demande, des particules liquides avec des caractéristiques différentes (inclusion de fluorophores spécifiques,...).
Ces avantages en termes d'utilisation sont bien entendu dus à la nature du produit de calibration, c'est-à-dire de la solution de particules liquides en suspension selon l'invention.
En outre, comme évoqué précédemment, la synthèse des particules liquides peut être aisément réalisée avec un procédé de production qui s'appuit sur des technologies microfluidiques. On peut ainsi réaliser un dispositif de production d'une solution de particules en suspension qui est compatible avec une intégration dans un cytomètre en flux de laboratoire, et qui est en mesure de produire les volumes de solution de particules liquides en suspension nécessaires à la calibration et/ou contrôle du cytomètre en flux.
Les procédés de production utilisables dans le cadre de l'invention comprennent notamment ceux qui impliquent :
- un co-écoulement de deux fluides immiscibles avec ou sans la focalisation des fluides immiscibles, avec ou sans variation de la géométrie des canaux dans lesquels s'écoulent simultanément les deux fluides,
- des écoulements transverses des deux fluides immiscibles avec ou sans variation de la géométrie des canaux dans lesquels s'écoulent les deux fluides,
- un écoulement d'un des deux fluides immiscibles à travers un trou de section rectangulaire et débouchant dans un réservoir contenant le second fluide au repos ou bien en écoulement.
D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée de mises en œuvre et de modes de réalisation nullement limitatifs, et des dessins annexés suivants :
- la Fig. 1 présente un mode de réalisation d'un cytomètre en flux selon l'invention qui permet des mesures de diffusion à petits angles (FSC) et de diffusion latérale (SSC) sur des cellules, - la Fig. 2 présente un histogramme de mesures d'un signal de mesure SSC obtenu avec des sphères en polymère de diamètre 5 μηι sur un cytomètre en flux mettant en œuvre un laser à une longueur d'onde de 488 nm,
- la Fig. 3 présente l'intensité d'un signal de mesure SSC obtenu à une longueur d'onde de 488nm sur des sphères en polymères, en fonction du diamètre de ces sphères,
- la Fig. 4 présente un schéma de principe d'un dispositif de production de particules liquides selon l'invention,
- la Fig. 5 présente une vue en coupe d'un dispositif de production de particules liquides selon l'invention,
- la Fig. 6 présente des résultats obtenus avec un cytomètre en flux en mettant en œuvre la méthode de calibration de l'invention, avec Fig. 6a un histogramme de mesures de la diffusion à petits angles (FSC), Fig. 6b un histogramme de mesures de la diffusion latérale (SSC), et Fig. 6c le diagramme SSC-FSC correspondant,
- la Fig. 7 présente un exemple de mesures de fluorescence obtenues avec un cytomètre en flux sur des particules liquides fluorescentes selon l'invention,
- la Fig. 8 présente un cliché pris sous microscope (barre d'échelle = 20 μηι) d'une solution de particules liquides, préalablement préparée au mortier et ayant un coefficient de variation supérieur à 10%, et
- la Fig. 9 présente le diagramme SSC-FSC obtenu avec la solution comparative de la Fig. 8 et le cytomètre en flux utilisé dans le cadre de la Fig. 7.
Il est bien entendu que les modes de réalisation qui seront décrits dans la suite ne sont nullement limitatifs. On pourra notamment imaginer des variantes de l'invention ne comprenant qu'une sélection de caractéristiques décrites par la suite isolées des autres caractéristiques décrites, si cette sélection de caractéristiques est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieur. Cette sélection comprend au moins une caractéristique de préférence fonctionnelle sans détails structurels, ou avec seulement une partie des détails structurels si cette partie uniquement est suffisante pour conférer un avantage technique ou pour différencier l'invention par rapport à l'état de la technique antérieur.
En particulier toutes les variantes et tous les modes de réalisation décrits sont combinables entre eux si rien ne s'oppose à cette combinaison sur le plan technique.
Sur les figures, les éléments communs à plusieurs figures conservent la même référence. En référence à la Fig. 1 , l'invention concerne un procédé pour calibrer des cytomètres en flux destinés à effectuer des mesures sur des cellules biologiques notamment.
De tels instruments sont par exemple utilisés couramment pour effectuer des analyses sanguines, des énumérations de cellules telles que des leukocytes ...
De manière générale, un cytomètre en flux comprend une chambre d'analyse 10 au niveau de laquelle les mesures sont effectuées.
Les échantillons de sang ou d'autres fluides biologiques 17 subissent une phase de préparation dans laquelle ils sont dilués, mélangés à des réactifs, lysés, ...
Ils sont ensuite transférés dans la chambre d'analyse 10 et conditionnés la forme d'un flux échantillon 19 suffisamment fin et étiré pour que les cellules qu'il contient traversent une zone de mesure 1 1 de manière à pouvoir être distinguées.
Dans le mode de réalisation présenté à la Fig. 1 , le conditionnement du flux échantillon 19 est réalisé en mettant en œuvre une technique de confinement hydraulique, ou « hydrofocusing ». Le flux échantillon 19 est injecté dans la chambre d'analyse 10 au travers d'une buse d'injection 12. Un fluide de gainage 24 est également injecté dans la chambre d'analyse 10 autour de la buse d'injection 12. Ce fluide de gainage 24 est utilisé pour étirer et centrer le flux échantillon 19.
Le flux échantillon 19 ainsi conditionné traverse une zone de mesure 1 1 . Cette zone de mesure 1 1 comprend notamment des moyens de mesure optique. Bien entendu, d'autres moyens de mesure connus, tels que des moyens de mesure d'impédance, peuvent également être mis en œuvre.
Les moyens de mesure optique permettent de manière générale d'effectuer des mesures optiques de type mesures de fluorescence et/ou des mesures de diffusion à différents angles.
Ils comprennent donc au moins une source de lumière 13 (en général une diode laser) qui génère un faisceau de mesure optique dirigé vers le flux échantillon 19 dans la zone de mesure 1 1 . Des photodétecteurs sont disposés selon différentes orientations angulaires pour capter la lumière issue du flux échantillon et due à des phénomènes de diffusion ou de fluorescence.
Le mode de réalisation présenté à la Fig. 1 illustre une configuration de mesure avec :
- un photodétecteur 15 positionné selon un axe optique proche de l'axe optique du faisceau de mesure, qui permet d'effectuer des mesures de diffusion à petits angles (FSC) ; - un photodétecteur 14 positionné selon un axe optique sensiblement à angle droit par rapport à l'axe optique du faisceau de mesure et au flux échantillon 19, qui permet d'effectuer des mesures de diffusion latérale (SSC).
Les mesures de fluorescence sont utilisées par exemple pour identifier des cellules ou des composés particuliers (protéines) qui ont été préalablement marquées avec un colorant ou un réactif fluorescent.
Comme expliqué précédemment, les mesures de diffusion à petits angles FSC et latérales SSC sont particulièrement intéressantes car elles fournissent un couple de coordonnées qui permettent d'identifier certains types de cellules en fonction de leur position dans un diagramme d'intensité FSC-SSC. On peut notamment identifier des leucocytes de cette manière.
Pour qu'un cytomètre puisse fournir des informations fiables, il est nécessaire de le calibrer et de le contrôler. En pratique, ces opérations sont effectuées périodiquement lors de l'exploitation de l'appareil.
II est notamment nécessaire de calibrer les mesures de diffusion à petits angles
FSC et latérales SSC, afin de pouvoir relier des valeurs mesurées à des dimensions physiques ou d'autres caractéristiques de cellules.
Pour cela, on fait passer à la place du flux échantillon 19 un flux de calibration qui contient des particules ou des microbilles 21 de dimensions connues.
Dans les méthodes de l'art antérieur, on utilise des particules à l'état solide, par exemple de type polymère ou PMMA (Polyméthacrylate de méthyle). Les résultats ne sont toutefois pas satisfaisants.
En effet, même en utilisant des microbilles de dimensions très homogènes, on observe une forte dispersion des intensités mesurées de diffusion latérale SSC.
Cet effet est illustré à la Fig. 2 qui montre un histogramme de mesures de diffusion latérale SSC effectuées à une longueur d'onde de 488 nm sur des microbilles de PMMA de diamètre 5 μηι et dont le coefficient de variation volumique au sein de l'échantillon est de 1 .5 %.
On observe une dispersion des mesures qui est très supérieure à la dispersion des particules en termes de taille. Cette dispersion des mesures impacte bien entendu directement la qualité de la calibration et des mesures effectuées ensuite avec l'appareil.
En référence à la Fig. 3, il a été déterminé dans le cadre de l'invention que cette dispersion des mesures de diffusion latérale SSC peut être expliquée par la théorie de Mie et provient notamment du fait que l'indice de réfraction des particules en matériau polymère utilisées est trop élevé. La courbe de la Fig. 3 représente une intensité, calculée à une longueur d'onde de 488 nm, du signal de diffusion latérale SSC en fonction du diamètre d'une particule de polymère compris entre 0 et 6 μηι. Le polymère pris en compte est du PMMA avec un indice de réfraction de l'ordre de 1 .59.
Comme le montre cette courbe, il existe des oscillations importantes. Ces oscillations résultent de la superposition d'ondes multiples (issues de réflexions et/ou de transmissions multiples au sein de la sphère) dont la somme fait intervenir les amplitudes avec un facteur de phase qui dépend de l'indice de réfraction et du diamètre de la particule. L'amplitude des oscillations avoisine les 50% pour des particules de 5 μηι, ce qui explique la dispersion de mesures observée en pratique et illustrée à la Fig. 2.
Il a également été déterminé dans le cadre de l'invention que ces oscillations de la courbe de la Fig. 3 ne se retrouvent pas ou du moins sont très fortement atténuées en effectuant les mêmes calculs avec des particules qui ont un indice de réfraction proche de celui des cellules biologiques, c'est-à-dire de l'ordre de 1 .41 .
Ainsi, il a été développé dans le cadre de l'invention un composé qui permet de simuler au mieux le comportement des cellules biologiques en termes de résultats de mesure optiques dans un cytomètre en flux.
Ce composé est notamment destiné à permettre une calibration beaucoup plus précise de ces cytomètres en flux.
Comme expliqué précédemment, ce composé est une solution de particules liquides en suspension. Les particules sont réalisées sous la forme de particules liquides ou de gouttes d'une première phase liquide en suspension dans une seconde phase liquide. Les liquides de la première et de la seconde phase sont bien entendu non miscibles. Ce composé peut donc être considéré comme une émulsion.
Afin d'obtenir des performances de calibration optimales, il a été établi que la taille nominale des particules liquides doit se situer 5 et 6 μηι avec un indice de réfraction égal à 1 .4. Bien entendu, le coefficient de variation de la taille des particules liquides au sein de la solution de particules en suspension doit être aussi réduit que possible (par exemple de l'ordre de 10% en diamètre, préférentiellement de l'ordre de 5 %).
Suivant un mode de réalisation, la première phase est obtenue avec une huile optique d'indice. Les huiles optiques d'indice sont des huiles qui sont spécifiquement formulées de telle sorte à présenter un indice de réfraction optique connu et maîtrisé. De telles huiles sont couramment utilisées en optique pour réaliser des couches d'adaptation d'indice de réfraction notamment. On peut notamment citer les huiles produites par la société Cargille®. Dans le mode de réalisation présenté, la seconde phase est composée d'eau et de dodécylsulfate de sodium (SDS), qui permet d'assurer la stabilité de la solution de particules en suspension dans le temps.
Comme expliqué précédemment, il est également possible d'inclure dans la première phase des éléments additionnels tels que des fluorophores, des micro-particules ou des ligands.
Cette inclusion doit être effectuée bien entendu avant de mélanger les deux phases sous la forme d'une solution de particules en suspension. En référence aux Fig. 4 et Fig. 5, nous allons maintenant décrire un dispositif de production 20 qui permet de produire une solution de particules en suspension selon l'invention.
Ce dispositif de production 20 met en œuvre un procédé micro-fluidique qui permet une fabrication en masse des particules liquides 21 , c'est-à-dire de l'ordre de 10 mL/jour pour des particules liquides 21 dont le diamètre est compris entre 1 et 10 μηι.
Il comprend un corps 40 (par exemple en verre) avec une pluralité de microcanaux de section rectangulaire 41 traversant sa paroi. La Fig. 5 présente une vue en coupe de ce corps 40.
Le liquide de la première phase 42 est amené en contact avec la face externe du corps 40 avec une pression P1 .
Le liquide de la seconde phase 43 est amené au contact de la face interne du corps 40 avec une pression P2.
Comme illustré à la Fig. 4, sous l'effet d'une différence de pression, le liquide de la première phase 42 d'écoule dans le liquide de la seconde phase 43 au travers des micro- canaux 41 , en se fragmentant sous la forme de gouttes ou de particules liquides 21 .
Pour un micro-canal, le diamètre D des particules liquides ainsi formé et leur fréquence f de formation dépend notamment de l'épaisseur H du micro-canal et du débit Q du liquide de la première phase dans ce micro-canal :
Q=nD3f/6.
Par ailleurs, la fréquence f de formation dépend peu de la pression P2 du côté de la deuxième phase mais augmente avec la pression P1 du côté de la première phase.
On obtient ainsi du côté de la seconde phase 43 à l'intérieur du corps 40 une solution de particules en suspension mono-disperse de particules liquides de la première phase 42 de dimensions très homogènes (taille des gouttes = 8 μηι et coefficient de variation = 4%) réparties dans la seconde phase 43. La solution de particules en suspension s'écoule au fur et à mesure de sa formation vers une sortie du corps 40. La Fig. 6 présente des résultats de calibration d'un cytomètre en flux obtenus avec une solution de particules en suspension de calibration selon l'invention.
Les Fig. 6a et Fig. 6b montrent respectivement des histogrammes de mesures de la diffusion à petits angles (FSC) et de la diffusion latérale (SSC), obtenus pour une population de particules liquides selon l'invention. On constate que la forte dispersion des mesures de diffusion latérale (SSC) observée à la Fig. 2 pour des microsphères de PMMA a disparu dans les mesures de diffusion latérale effectuées avec les particules liquides de l'invention (Fig. 6b). En conséquence, comme illustré à la Fig. 6c, la population de particules liquides de calibration produit une « tache » bien localisée dans le diagramme SSC-FSC qui permet de calibrer efficacement la relation entre les mesures FSC-SSC et les tailles ou d'autres caractéristiques de cellules biologiques.
La Fig. 7 présente un exemple de mesures de fluorescence obtenues avec un cytomètre en flux sur des particules liquides fluorescentes selon l'invention.
La phase dispersée sous formes de gouttes ou de gouttelettes (la première phase) comprend une huile minérale et un fluorophore de type « Nile red » avec une concentration de l'ordre de 2 10-5 mol/l. La seconde phase est composée d'eau et de dodécylsulfate de sodium (SDS).
La solution de particules en suspension formée comme expliqué précédemment est suffisamment stable dans le temps pour pouvoir être produite en masse, conditionnée en flacons et acheminée vers les utilisateurs finaux pour une utilisation en routine sur des cytomètres en flux de laboratoire.
On peut ainsi utiliser la solution de particules en suspension et le procédé de calibration de l'invention pour améliorer la calibration de tout type de cytomètre en flux existant, solution en remplacement d'autres produits de calibration.
La solution de particules liquides de la Fig. 8 a été obtenue en mélangeant au mortier le liquide de première phase et le liquide de seconde phase précités. La composition chimique de cette solution de particules liquides est donc identique à celle de la solution de particules liquides préparée selon la Fig. 5.
Au contraire de la solution de particules liquides préparée selon la Fig. 5, la solution de particules liquides de la Fig.8 est polydisperse (coefficient de variation = 75%) et essentiellement constituée de gouttes de l'ordre du micromètre (diamètre moyen des gouttes = 2,3 μηι).
Au contraire du diagramme SSC-FSC de la Fig. 6c obtenu avec une solution de particules liquides selon l'invention (Fig.5), le diagramme SSC-FSC de la Fig. 9 montre que la solution comparative de particules liquides polydisperses produit une « tache » très étalée, qui ne permet pas de calibrer efficacement l'appareil. Suivant un autre aspect avantageux, l'invention permet également de réaliser des cytomètres avec des moyens de calibration intégrés.
La Fig. 1 illustre ainsi un cytomètre en flux selon l'invention qui comprend un dispositif de production 20 de solution de particules liquides en suspension, par exemple tel que décrit aux Fig. 4 et Fig. 5.
Ce cytomètre en flux selon l'invention comprend également des moyens 22 pour stocker un ou des liquides de la première phase 42 et des moyens 23 pour stocker un ou des liquides de la deuxième phase 43.
En pratique, ces moyens de stockage 22, 23 peuvent comprendre des flacons et des interfaces pour insérer ces flacons dans le cytomètre, comme cela est fait de manière classique pour les réactifs.
Des produits supplémentaires (fluorophores, ...) peuvent également être stockés au niveau de l'appareil pour produire des solutions de particules en suspension avec des propriétés particulières.
La solution de particules en suspension est produite en fonction des besoins dans le dispositif de production intégré 20.
Le cytomètre peut comprendre également, de manière optionnelle, un stockage temporaire de la solution de particules en suspension produite.
Dans le mode de réalisation présenté, le cytomètre en flux selon l'invention comprend une vanne 18 qui permet d'amener vers la chambre de mesure 24, soit la solution de particules liquides en suspension, soit des échantillons biologiques préparés de manière habituelle.
Ce mode de réalisation permet donc d'amener et de stocker au niveau du cytomètre seulement les produits nécessaires à la fabrication de la solution de particules liquides en suspension. En outre, ils peuvent être gérés comme d'autres réactifs classiques.
Comme expliqué précédemment, la solution de particules liquides en suspension selon l'invention peut également être utilisée pour « capturer » et concentrer des molécules d'intérêt à la surface des particules liquides 21 .
Dans ce cas, la solution de particules liquides en suspension selon l'invention est utilisée comme élément de calibration ou de dosage d'une molécule d'intérêt.
On met alors en œuvre un procédé de mesure qui comprend des étapes: - de mise en œuvre ou de fabrication d'une solution de particules en suspension adaptée, avec des ligands inclus dans les particules liquides 21 ; - de dilution de la solution de particules liquides en suspension dans une solution contenant les molécules d'intérêt, de sorte que les molécules d'intérêt soient captées et se concentrent à la surface des particules liquides 21 ;
- de transfert de la solution de particules liquides en suspension dans la chambre de mesure 10 du cytomètre pour effectuer des mesures, notamment de fluorescence, sur les particules liquides 21 ;
- de déduction d'une information sur les molécules d'intérêt telle qu'une présence (détection) ou une concentration sur la base du traitement des mesures, notamment de fluorescence.
Ce type de mesures peut bien entendu avantageusement être réalisé avec un cytomètre selon l'invention avec un dispositif de production intégré 20 de solution de particules liquides en suspension. Dans ce cas il faut simplement prévoir des moyens de dilution supplémentaires de la solution de particules en suspension avec une solution contenant des molécules d'intérêt.
Bien entendu, une solution de particules liquides en suspension selon l'invention
(selon une même formulation ou selon des formulations différentes) peut être utilisée dans un même cytomètre en flux pour effectuer :
- des mesures de calibration,
- des mesures sur des molécules d'intérêt.
Les molécules d'intérêt sont par exemple les anticorps compris dans les réactifs des cytomètres de flux permettant le marquage des cellules biologiques tels que les anticorps anti CD4 et/ou CD8, mais théoriquement la particule fluide peut contenir au moins un ligand permettant de reconnaître un anticorps anti-CDn (où n est un entier naturel permettant d'identifier la molécule d'intérêt selon une classification bien connue de l'homme de l'art).
Suivant des modes de réalisations, le procédé de calibration selon l'invention peut être mis en œuvre avec tout type de cytomètres en flux.
Il peut notamment être mis en œuvre avec des cytomètres en flux qui mettent en œuvre tout type de méthode de confinement pour générer un flux échantillon 19. Il peut ainsi être mis en œuvre par exemple avec des cytomètres en flux qui utilisent des microcanaux fluidiques pour confiner le flux échantillon 19 sans fluide de gainage.
Il peut également être mis en œuvre avec des cytomètres en flux destinés à effectuer des mesures sur des éléments autres que des cellules biologiques, ou sur des éléments non biologiques.
De même, un cytomètre en flux selon l'invention qui comprend des moyens de calibration tels que décrit précédemment peut : - être de tout type ;
- mettre en œuvre tout type de méthode de confinement ;
- être destinés à effectuer des mesures sur des éléments autres que des cellules biologiques, ou sur des éléments non biologiques.
Suivant des modes de mise en œuvre, un dispositif de production 20 d'une solution de particules liquides en suspension peut également être partagé entre plusieurs cytomètres en flux.
Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention. Par exemple, les particules liquides peuvent être mélangées à des particules biologiques (érythrocytes, spores) pour permettre, en une seule phase, de calibrer et/ou contrôler des fonctions que les seules particules biomimétiques ne peuvent satisfaire comme l'activité d'un réactif lytique couramment utilisé dans les cytomètres en flux.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Utilisation d'une solution de particules liquides en suspension pour le contrôle, la calibration et/ou la réalisation de mesures physiques dans un dispositif d'analyse biologique,
ladite solution comprenant des particules liquides (21 ) d'une première phase liquide (42) dispersées dans une seconde phase liquide (43),
lesdites particules liquides (21 ) présentant des propriétés physiques, et/ou biochimiques permettant de produire dans ledit dispositif d'analyse des mesures physiques similaires à des mesures telles qu'obtenues avec ledit dispositif d'analyse sur des cellules biologiques, et
lesdites particules liquides (21 ) ayant un diamètre dont le coefficient de variation au sein de la solution de particules liquides en suspension est inférieur à 10 %.
2. Utilisation selon la revendication 1 , dans laquelle ladite solution comprend des particules liquides (21 ) avec un indice de réfraction inférieur à 1 .5.
3. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle ladite solution comprend des particules liquides (21 ) avec un diamètre compris entre 0.5 et 20 μηι.
4. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les particules liquides (21 ) ont un diamètre dont le coefficient de variation au sein de la solution de particules liquides en suspension est inférieur à 5 %.
5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la première phase liquide (42) comprend au moins l'un des composés suivants :
- une huile minérale ou végétale,
- une huile silicone, ou polysiloxane,
- une solution de sulfure de carbone CS2,
- un solvant organique de la famille des alcanes,
- de l'hexane,
- du pentane,
- une huile fluorocarbure.
6. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la seconde phase liquide (43) comprend de l'eau et :
- des molécules amphiphiles ; et/ou
- des nano-particules solides, de taille sub-micrométrique, aptes à s'adsorber à l'interface entre les deux phases liquides.
7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les particules liquides (21 ) incluent au moins l'un des éléments suivants :
- un fluorophore,
- des micro-particules, solides ou liquides,
- des particules d'or couplées à des molécules lipophiles,
- des molécules amphiphiles,
- un ligand fonctionnalisé à une molécule ayant une grande affinité pour la première phase et possédant des propriétés amphiphiles.
8. Procédé pour effectuer un contrôle, une calibration et/ou une mesure dans un dispositif de cytométrie en flux destiné à l'analyse de cellules biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend des étapes :
- de transfert dans ledit dispositif de cytométrie en flux d'une solution de particules liquides en suspension comprenant des particules liquides (21 ) d'une première phase liquide (42) dispersées dans une seconde phase liquide (43), lesdites particules liquides (21 ) présentant des propriétés physiques, chimiques et/ou biochimiques permettant de produire dans ledit dispositif de cytométrie en flux des mesures physiques similaires à des mesures obtenues avec des cellules biologiques, et lesdites particules liquides (21 ) ayant un diamètre dont le coefficient de variation au sein de la solution de particules liquides en suspension est inférieur à 10 %,
- de réalisation de mesures d'au moins l'un des types suivants sur lesdites particules liquides (21 ) : mesures optiques, mesures électriques, mesures magnétiques, mesures électromagnétiques.
9. Procédé selon la revendication 8, comprenant en outre des étapes :
- de mélange d'une solution de particules liquides en suspension comprenant des particules liquides (21 ) avec des molécules de ligands aptes à se lier à des molécules d'intérêt avec une solution contenant des molécules d'intérêt, de sorte à permettre la capture à la surface des particules liquides par les ligands de molécules d'intérêt, - de déduction d'une information sur lesdites molécules d'intérêt à partir de mesures optiques sur lesdites particules liquides (21 ).
10. Procédé selon la revendication 9, comprenant des étapes :
- de mesures de fluorescence,
- de déduction d'une information de densité de molécules d'intérêt présentes à la surface des particules liquides (21 ).
1 1 . Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, comprenant des étapes :
- de mesures de diffusion aux petits angles (FSC) et de diffusion latérale (SSC) sur des particules liquides (21 ) de dimension connue,
- de déduction d'une information de calibration du cytomètre pour la différentiation de cellules.
12. Procédé selon l'une des revendications 8 à 1 1 , comprenant des étapes :
- de mesures de fluorescence sur des particules liquides (21 ) comprenant au moins un fluorophore,
- de déduction d'une information de calibration du cytomètre pour des mesures de fluorescence.
13. Dispositif de cytométrie en flux destiné à l'analyse de cellules biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de mise en œuvre, pour le contrôle, la calibration et/ou la réalisation de mesures physiques, d'une solution de particules liquides en suspension comprenant des particules liquides (21 ) d'une première phase liquide (42) dispersées dans une seconde phase liquide (43), lesdites particules liquides (21 ) présentant des propriétés physiques, chimiques et/ou biochimiques permettant de produire dans ledit dispositif de cytométrie en flux des mesures physiques similaires à des mesures obtenues avec des cellules biologiques, et lesdites particules liquides (21 ) ayant un diamètre dont le coefficient de variation au sein de la solution de particules liquides en suspension est inférieur à 10 %.
14. Dispositif selon la revendication 13, comprenant en outre des moyens (18, 20, 22, 23) pour produire la solution de particules liquides en suspension à partir de fluides respectivement de la première phase (42) et de la seconde phase (43).
15. Dispositif selon la revendication 14, comprenant des moyens de dispersion (20) basés sur une technologie microfluidique pour produire la solution de particules liquides en suspension, laquelle technologie microfluidique mettant en œuvre au moins l'une des configurations suivantes :
- un co-écoulement des fluides de la première phase (42) et de la seconde phase
(43),
- des écoulements transverses des fluides de la première phase (42) et de la seconde phase (43),
- un écoulement d'un des deux fluides de l'une des phases à travers un trou débouchant dans un réservoir contenant l'autre phase,
- des canaux dans lesquels s'écoulent les deux fluides simultanément présentant une variation de leurs dimensions, telle que la hauteur ou la largeur.
16. Dispositif selon l'une des revendications 13 à 15, comprenant en outre des moyens (22, 23) pour stocker séparément au moins un fluide de la première phase (42) et au moins un fluide de la seconde phase (43).
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