EP2834628A1 - Methode de determination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur d'un fragment d'organe solide humain ou animal - Google Patents

Methode de determination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur d'un fragment d'organe solide humain ou animal

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Publication number
EP2834628A1
EP2834628A1 EP13719904.8A EP13719904A EP2834628A1 EP 2834628 A1 EP2834628 A1 EP 2834628A1 EP 13719904 A EP13719904 A EP 13719904A EP 2834628 A1 EP2834628 A1 EP 2834628A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tumor
cancer
fragment
spectrum
peaks
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13719904.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fabienne BREGEON
Didier Raoult
Jean-Marc Rolain
Xavier Benoît D'JOURNO
Christophe FLAUDROPS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Original Assignee
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM filed Critical Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Publication of EP2834628A1 publication Critical patent/EP2834628A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the tumor or non-tumor nature or tumor type of a human (adult or child) or animal solid organ fragment of a given individual.
  • tumor is understood here to mean a pathology involving a cellular proliferation of new cells of abnormal appearance, resulting in a local physical modification of the texture in the case of a solid organ. It may be a tumor whose cells are cancerous, that is to say a tumor having the capacity to invade neighboring structures as explained below or a non-cancerous tumor called "benign" or a tumor of infectious origin or other. This tumor phenomenon can lead to an increase in organ volume. When the tumor has a rounded or spheroidal shape, it is called a nodule. When the rounded formation has an inflammatory reaction at its periphery, it is called granuloma.
  • a common cause of benign tumor is inflammation (inflammatory tumor), which can occur in response to the introduction of a foreign body or organism into the tissue (foreign body tumor, tumor in response to an infection, etc.) .
  • Some infectious agents have the particularity of inducing the formation of tumors of nodular and granulomatous appearance in the organ they infect, this is the case, for example, of tuberculosis.
  • Some cases are at the limit of these definitions, so-called pseudo-tumors or lesion (corneal lesion for example). It therefore appears that knowledge of the nature of a tumor is crucial to answer the following questions: - Is it necessary to remove it surgically (exeresis)? - what medicines to give: does antibiotic, anti-tuberculosis, anti-inflammatory, anti-cancer treatment need to be given?
  • the organs can be the lung (lung parenchyma or bronchi), but also the colo-digestive system (hollow organs and accessory glands, liver, vesicle, pancreas salivary glands), as well as any organ of the body (urogenital and reproductive system, muscles, skin, brain, endocrine glands, exocrine glands, bones, or the lymphatic tissue (spleen and ganglia), including ganglia of the thoracic chain .
  • the present invention is useful for performing a rapid diagnosis of the quality of tumor removal, especially in cancer surgery. More particularly, the present invention relates to the use of matrix-assisted laser desorption ionisation mass spectrometry ("matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry") called MALDI type.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionisation mass spectrometry
  • MALDI type matrix-assisted laser desorption ionisation mass spectrometry
  • MALDI type matrix-assisted laser desorption ionisation mass spectrometry
  • -TOF for the extemporaneous diagnosis of total surgical excision (that is to say the removal of all or part of an organ) especially in case of cancer, from shreds for which no protein purification and no morphological localization cancer cells is not performed.
  • Cancer is characterized by the proliferation of abnormal cells in appearance and function within normal tissue. When this occurs within a solid tissue, a formation develops, more or less well limited but identifiable by its difference in appearance and consistency with the neighboring tissue. We speak of "tumor". Thus cancer cells will develop first locally most often, then regionally by invading neighboring tissues and organs, especially the ganglia. But the limits of this training are more or less sharp relative to the neighboring tissue.
  • a tumor contains cancer cells whose origin is the same as that of the tissue in which they proliferate, it is called “primary cancer”. The cancerous cells can also spread and develop at a distance to form a so-called secondary tumor in another organ than the primary organ: these are metastases.
  • a tumor contains cancer cells whose origin is distinct from that of the tissue in which they proliferate, we speak of "metastasis”.
  • lymphoid organ lymph nodes and / or other lymphoid organ such as the spleen
  • the cancer is called lymphoma.
  • the organs that will be the target of metastases are mainly the lung, the brain, the bone tissue and the ganglia.
  • the ganglia may be of a malignant tumor nature either because of a primary lymphoid cancer (lymphoma) or because of a lymph node metastasis of a cancer whose swarming point is another tissue.
  • the surgical procedure of the resection aims at the total suppression of any abnormal cell and generally passes by the exeresis of the whole of the tumor with a sufficient margin of safety of the whole vascular and cellulo-lymphatic neighborhood may contain regional metastases.
  • One of the problems at the time of cancer surgery is therefore to know where tumor invasion stops.
  • non-vital organs eg the thyroid
  • determining the limits of excision is a crucial issue. They are first guided by visualization with the naked eye of the "tumoral" aspect different from the "non-tumoral" aspect as well as by a logic based on the anatomical organization of the organ.
  • the extent of the ablation is of major importance: too large, resection unnecessarily deprives the patient of some of its functions, too restricted, it incurs a high risk of Incomplete resection with a high percentage of recurrence, swarming and eventually death. Indeed, recurrences are more aggressive, infiltrating and are less accessible to a cure than the initial tumors. Because cancer cells invisible to the eye can migrate from the visible tumor to neighboring areas, the contours of the resection should be wider than those of the visible tumor.
  • Anatomopathological or histological examination that is to say the microscopic examination of the removed organ fragment (called “resected"), is the main means currently used to assert the nature of the tumor, to determine the quality of the tumor. Tumor ablation and determine the existence of ganglion invasion or surrounding tissue. Often an intraoperative extemporaneous examination is required for tumors of questionable origin, in particular to confirm the diagnosis of cancer on the one hand, and then to determine and guide the limits of the excision, that is, to analyze the surrounding areas called “resection banks", but also the lymph nodes. An immediate recovery may then be required to complete the excision.
  • Malignant lung tumors are referred to as thoracic surgery in a large number of cases, which involves the total removal of the cancer area and invaded lymph nodes. Due to the characteristics of the pulmonary parenchyma, there is no clear boundary that clearly partitions the organ visibly to the eye. If a tumor is cancerous, its location will cause the surgeon to extend the excision on the basis of lobe and segment lung organization. If a tumor is noncancerous, it can be the object of a very circumscribed excision or of an absence of excision with sampling for diagnostic purpose.
  • the management of a pulmonary tumor can range from non-anatomical resection (according to the contours of the tumor or "wedge resection") for diagnostic purposes, or, in ascending order: segmentectomy, lobectomy, pneumonectomy.
  • segmentectomy lobectomy
  • pneumonectomy a technique providing information at the cellular level.
  • proteomics studies the large set of proteins expressed at a given moment by a cell. Proteomics makes it possible, for example, to demonstrate protein regulations occurring during cell differentiation, such as during cancers, in particular by mass spectrometry.
  • SELDI-TOF type mass spectrometry comprising a surface-enhanced surface separation (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight) or magnetic beads.
  • SELDI-TOF type mass spectrometry comprising a surface-enhanced surface separation (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight) or magnetic beads.
  • the origin of a liver metastasis could be diagnosed with an insufficient sensitivity of 81 to 91% and a specificity of 85 to 87% according to the chosen algorithm, the diagnosis of the type "hepatocellular carcinoma" of a tumor of the liver could be worn with a sensitivity of 73 to 74% and a specificity of 96 to 97% according to the algorithm.
  • these previous uses of MALDI-TOF mass spectrometry utilize long and complex techniques of protein extraction or organ fragment processing.
  • a sample of organ fragments comprising a pluricellular and pluritissular mixture of whole cells obtained by dilution, preferably in distilled water, and grinding is used.
  • Mass spectrometry is a physical analysis technique for detecting and identifying molecules of interest by measuring their mass. Its principle lies in the gas phase separation of charged molecules (ions) according to their mass / charge ratio (m / Z). It uses a beam L.A.S.E.R. pulsed in the UV (337 nm) to desorb and ionize a matrix / sample mixture co-crystallized on a metal surface. A matrix avoids excessive degradation of the sample, it absorbs energy and this energy supply causes expansion in the gas phase.
  • Mass spectrometry under its MALDI-TOF variant has recently entered the microbiology laboratories. It allows to identify and classify different bacterial types using intact bacteria. Indeed, among the various components identified in a MALDI / TOF mass spectrometry spectrum of the Biotyper® type, some appear to be specific to a specific bacterial species [9, 10]. It has thus been possible to identify a large number of bacterial species isolated from clinical samples using data banks developed from each of these species.
  • MALDI-TOF analysis has been successfully applied for the identification of eukaryotic cell types preserved by freezing. It has made it possible to study the presence of different lymphocyte populations in a complex tissue such as human blood and to build a database [10].
  • a solid tissue has a complex multicellular nature that can comprise, according to the organ concerned, elastic or collagenous or other fibers, blood, vessels, muscles, lymph or other biological fluid and a large number of non-specific protein components so that no model spectrum can be defined.
  • the present invention provides a method for determining the tumor or non-tumor nature or the type of tumor and / or the type of cancer of a human or animal solid organ fragment of a given individual, by analysis.
  • MALDI-TOF type mass spectral spectrum (s) said tumor type belonging to at least one of the following classes and subclasses of tumors: a) the class of cancerous tumors, b) the subclass of cancerous tumors of the primitive cancer type, c) the subclass of metastatic cancerous fragments, and d) the class of non-cancerous tumors, characterized in that the following successive steps are carried out in which:
  • At least one spectrum of at least one said first sample is made and said spectrum is analyzed by comparison with at least a reference profile, said reference profile being constituted by at least one list of peak (s) of spectrum reference (s) established (s) on respectively at least one ground reference sample of respectively at least one reference fragment same tissue of at least one individual, said reference sample (s) being prepared identically to said first sample, said reference fragment (s) being known (s) to be of a tumor or non-tumoral nature, or, in the case of tumoral nature, being known to belong to one of said tumor or cancer classes or subclasses (a) to (d) mentioned above, and
  • tissue fragment of said first sample is a tissue fragment of tumor or non-tumor nature or belongs to one of said tumor classes or subclasses of tumor (a) to (d) above , according to the presence or absence of said reference peaks and / or the value of the area of said reference peak (s) in the spectrum of said first sample.
  • step 1) the implementation of a said pluricellular and pluritissular mixture of non-lysed whole cells means that no extraction treatment and / or separation of particular proteins, cells or tissues is carried out, and no specific desalting or prior purification of the proteins or of a particular cell or tissue type is carried out.
  • the inventors first sought to analyze samples of groundnut having undergone cell, chemical or enzymatic lysis steps, as well as samples processed to extract and purify certain components, in particular proteins. But these samples failed to obtain a relevant classification based on MALDI-TOF mass spectrum.
  • the inventors have discovered that, surprisingly, raw sample fragments and, even, not freed of large tissue debris or blood residues, made it possible to obtain exploitable spectra, that is, say reproducible and of acceptable quality according to the quality score criteria discussed below, working - originally, by mistake, on a raw sample simply diluted with distilled water.
  • the samples diluted with solvents other than distilled water did not make it possible to obtain spectra of sufficient quality, probably because they contained ionic species coming from the reagents and solvents used which saturated the detection by spectrometry of MALDI-TOF type, given that the latter detects ions as recalled above.
  • step 1) a dilution is carried out in distilled water to obtain an aqueous suspension of a concentration of 0.05 to 5 mg / ml, preferably 0.5 to 1 mg / ml. .
  • concentration is required to obtain exploitable spectra as defined above with currently available MALDI-TOF mass spectrometry equipment.
  • the inventors formulate the explanation that below the lower limit of this range, it may lack the characteristic components of the organ and above, the amount of non-characteristic components could be too important and creates background noise covering the signal of the characteristic components. This concentration can be obtained from fragments of
  • 0.05 to 2 g preferably 0.1 to 0.5 g (about 1 to 5 mm), diluted in distilled water to 1/100 to l / 200th, particularly l / 160th.
  • step 1) the grinding of an organ fragment by grinding is carried out, providing particles smaller than 100 microns in size by means of a rotor-type dispersion / homogenization device. stator, inducing shearing forces and tensile and high turbulence in the fluid including a trade mark ULTRA TURRAX ® brand.
  • said suspension of said ground material is freed of tissue debris larger than 100 ⁇ , of preferably greater than 50 .mu.m, preferably by centrifugation and recovery of the supernatant and without desalting said suspension.
  • said pulp suspension comprises a protein solubilizing solvent, preferably formic acid and / or acetonitrile.
  • tissue debris larger than 100 ⁇ m, preferably greater than 50 ⁇ m the following steps are carried out:
  • the solubilization of the proteins is intended to prevent the possible coagulation of the proteins, possibly released by certain cells during grinding and / or dilution described above.
  • step 2) said reference profile can be chosen from:
  • reference peak (s) having a number less than the number of peaks of said spectrum, preferably from 1 to 20 peaks, the series of (s) said (s) peak (s) constituting a reference profile.
  • step 3 determining whether said organ fragment of said first sample is a tumor-like or non-tumor fragment or belongs to one of said tumor or cancer classes or subclasses (a) to (d) above tumor, according to one of two ways respectively:
  • the spectrum of said first sample makes it possible to classify the fragment as being of tumoral nature or conversely of non-tumoral nature or belonging to at least one of said classes or subclasses of tumor or cancer (a) to (d) above, according to the presence or absence of said reference peaks of a said reference list and / or the value of the area of said reference peak (s) in the spectrum of said first sample.
  • the complete spectrum is an average spectrum resulting from an average between several spectra made from several deposits analyzed on the same spectrometer plate, from the same fragment of the same individual. , in particular at least 4 spectra, preferably at least 10 spectra.
  • said reference differential profile is established from a reference sample set of reference fragments of said one of a plurality of individuals, said reference fragments being known to be of a tumor or non-tumor nature, or, in the case of a tumor, being known to belong to one of the said classes or sub-classes of tumor or cancer (a) to (d) mentioned above.
  • Several differential reference profiles for different kinds of fragments known for a particular organ and / or for different organs can be recorded in a database.
  • tumor-like fragment means any tumor, namely: a cancerous tumor as well as a non-cancerous tumor.
  • tumor fragment class of cancerous nature a primary cancer or a secondary type of cancer, that is to say, metastases (cancer cells from another tissue or organ).
  • subclass cancerous fragments of the type of primary cancer cancer proliferation cells of origin of said tissue, and for any cell type of said organ such as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, undifferentiated carcinoma, melanoma, sarcoma , lymphoma and any other type of cancer.
  • subclass cancerous fragments of metastasis type a cancer resulting from proliferation of cells from a type of organ other than that in which it is identified.
  • organ when said organ is a ganglion, it is the preferred site for metastases from a nearby organ (near or distant) as indicated above.
  • tumor fragment class of non-cancerous nature means an inflammatory tumor (infectious or non-infectious), a non-inflammatory tumor (infectious or non-infectious).
  • the organs analyzed are selected from the pulmonary parenchyma and the regional thoracic ganglia. In another preferred embodiment, the analyzed samples are selected from the bronchi and the ganglia.
  • bronchi or esophagus thoracic, mediastinal hilar, para-esophageal, abdomino-celiac and cervical ganglia;
  • - for the breasts the axillary, thoracic and cervical ganglia;
  • the cervical and thoracic ganglia for the organs of the head and neck: the cervical and thoracic ganglia;
  • the term "the value of the area of said peaks” is understood to mean a normalized value of the area under the curve of the peak, namely the integral corresponding to the integration of all the intensities corresponding to the region of the peak situated between the curve of the peak and a straight line passing through the first and the last point of inflection (the baseline of the spectrum being the line of relative intensity of zero peak), said integral being divided by the mean peak intensity of the same m / z in the set of spectra of the class N considered.
  • This mode of calculation is described in the ClinProtools® 2.1 software manual.
  • steps 2.2) and 3.2) depending on the diversity of the reference samples from a plurality of individuals constituting the sample bank for determining said differential profiles, it will be possible to differentiate further subclasses, especially the subclasses. additional costs:
  • the subclasses of metastases from respectively different other organs, in particular for the lung the respective subclasses of the metastases originating, for example, from any cancer localized in another organ, for example cancers of the breast, of the colon, of prostate, pancreas, kidney, thyroid, stomach, melanoma, ovary, sarcomas.
  • subclasses of the following non-cancerous tumors infectious inflammatory tumor, non-infectious inflammatory tumor), infectious non-inflammatory tumor and non-infectious non-inflammatory tumor.
  • Non-cancerous tumors such as tubercular nodules, sarcoidosis, histiocytosis X, mycosis, pneumoconiosis, parasitosis, Wegener's granulomatosis or any other non-cancerous abnormality may be mentioned.
  • step 2) a plurality of spectra of a plurality of samples of said suspension, at least 4 spectra, preferably at least 10 spectra, are produced to determine a mean spectrum of said sample.
  • step 2) in a known way, the following spectra are not taken into account: i- the only peaks whose relative intensity, expressed as a percentage of the intensity of the peak of greater intensity, is greater than at least 3 times that of the background noise, and ii- said spectra having a quality score greater than 2, said quality score consisting of the addition of the two notes ni and n2 each having a value of 0 to 6 with:
  • ni is the score given according to the number of characteristic peaks of said spectrum n, as specified more specifically in example 2 below, and
  • - n2 is the score given according to the value of the signal-to-noise ratio (Rmax) of the peak of greater intensity of said spectrum, as specified more specifically in Example 2 below; and at least 50, preferably at least 70 peaks of greater intensities, are retained in the spectrum.
  • the peaks of said spectra being defined by a pair of coordinates composed of an abscissa consisting of the mass / charge ratio (m / z) of 2,000 to 15,000 Da, more particularly of 3,000 to 9,000 Da, the ordinate coordinate being relative intensity or in arbitrary unity.
  • relative intensity is meant here an intensity expressed as a percentage of the intensity of the peak of greater intensity or otherwise expressed by the ratio of (intensity of the peak / intensity of the background noise).
  • step 3 it is considered that a peak is common between the spectrum analyzed and a profile or reference spectrum, if the peak has the validation and recalibration criteria defined for each model and known to the human being. art, and whose setting can be modified by the operator according to the instructions explained in the user manuals specific Bruker Daltonics® software and as listed below in the methods.
  • step 3 when comparing a new spectrum to another spectrum, as in step 3.1), or to a reference profile present in the database, as in step 3.2) above.
  • BIOTYPER ® software can thus identify unknown spectra by comparison with reference spectra stored in a database.
  • step 2.2 in a known manner, the CLINPROTOOLS ® software of BRUCKER DALTONICS® allows, where possible, from a bank of spectra established on samples classified into several groups corresponding to categories. different fragments, to identify a said differential profile consisting of a (or) peak (s) discriminant (s), able (s) to differentiate the spectra of different categories of fragments.
  • the differentiation between the different groups by comparison with a said differential profile can result from:
  • the software was able to identify a discriminating peak of a said fragment group and / or a peak area value, and / or
  • the software has been able to identify several so-called reference peaks whose presence or absence of the different peaks and / or whose values of the area of some of said reference peaks allow to differentiate different so-called groups.
  • the presence or absence of a peak of said reference profile is characterized by the presence of a signal or not at a particular value of m / z given.
  • a peak may be discriminating between two or more groups of organ fragments because of its presence or because of its absence in the spectrum analyzed, because of the value of its area, or because of its presence or absence in combination with the presence or absence of other so-called reference peaks or the value of its area relative to that of other said reference peaks of said differential profile.
  • Said reference profile is here established from a bank of spectra established on at least known tumor-like samples and non-tumor samples and, where appropriate, tumor fragment samples from the various known classes and subclasses, said samples from the same organ and a plurality of individuals.
  • said reference profiles consisting of all or part of a specific spectrum of a fragment of a tumor nature, or conversely specific to a fragment of a non-tumor nature, or still specific of a said tumor or cancer class or subclass of said fragments of the same organ at least, as defined above reliable, from a spectral library established from samples of a tumor nature and non-tumor samples and, where appropriate, samples of tumor fragments of the different said classes and subclasses from the same organ and a plurality of individuals, including at least 40 samples from at least 20 individuals, at the provided that all such samples are prepared according to step 1) above and according to the same grinding and dilution protocol, with or without removal of tissue debris gr ossicles and solubilization of the protein content.
  • sample prepared in an identical manner means a sample prepared in particular under the same grinding conditions, at the same dilution with or without removal of cellular debris and solubilization of the total protein content.
  • the tumor or non-tumoral nature, or even the known tumor or cancer type, of said second fragment may be established by simple visual examination with the naked or microscopic eye or may have been determined independently by another analysis by MALDI-TOF spectrometry of protein extract or other like that of step 3.2) or by histology and pathology or other analysis.
  • step 3.1 a comparison with a database of spectra or series of specific reference specific peaks of the given type (s) of tumor tissue (s) is not used. respectively non-tumoral (aux).
  • said reference profile consists of a complete spectrum of a ground reference sample of a said reference fragment of the same organ of the same individual, said reference sample being prepared in identical manner to said reference sample; first sample, said reference fragment being known to be of tumor or non-tumoral nature, or, in the case of tumor nature, being known to belong to one of said classes or subclasses of tumor or cancer (a) to d) mentioned above (corresponding to step 2.1) above, and
  • step 3 it is determined that said tissue fragment of said first sample is a tissue fragment of tumor or non-tumor nature or belongs to one of said classes or subclasses of tumor or cancer (a) to (d) ) above tumor, when the spectrum of said first sample is identical to said full spectrum of reference of said reference sample (corresponding to step 3.1) above).
  • step 3 said analyzed spectrum, hereinafter referred to as "first spectrum”, is compared with a reference spectrum produced as said first spectrum in step 2) on a sample a second fragment of the same organ of the same individual whose non-tumoral or cancerous nature is hereinafter referred to as "reference sample", said first sample being prepared in the same manner as said reference sample, and determining the tumor or respectively cancerous nature of said first fragment if said first spectrum is identical to said second spectrum, and conversely the tumor or respectively non-cancerous nature of said subclass is determined if the two spectra are different.
  • said reference profile is therefore a complete spectrum of the same individual comprising a number of peaks defined by the user (or set at 70 by default), namely the complete spectrum of the second sample or reference sample.
  • said specific peaks are characterized by the presence of each of the peaks of said complete reference spectrum, the number of common peaks being determined as a function of an identification score, and finally the intensities and normalized area values being quantified then compared with those of the complete reference spectrum according to an algorithm described in detail in the Biotyper ® 3.0 software user manual.
  • said type of known tumor fragment is known as to the type of tissue and possibly further to the type of tumor.
  • said reference profile is constituted by a list of reference peaks, the number of reference peaks being less than the number of peaks of said spectrum, preferably from 1 to 20 peaks; , the list of said reference peak constituting a reference profile referred to hereinafter as "differential profile" making it possible to classify said spectrum of said first sample as coming specifically from a fragment of tumor or non-tumor nature or belonging to specifically to at least one of said tumor or cancer classes or subclasses (a) to (d) above according to the presence or absence of said reference peaks and / or the value of the area of said reference peaks in the spectrum of said first sample (corresponding to step 2.2) above), and in step 3), it is determined that said organ fragment of said first sample is an organ fragment of a nature tumor or non-tumor or belongs to one of said tumor classes or subclasses of cancer (a) to (d) above, depending on the presence or absence of said reference peaks and / or the value of the area of (s) said reference peaks in the spectrum
  • a method according to the present invention will be particularly useful in the case of a surgical operation to help the surgeon to quickly determine the extent of solid organ ablation to be performed.
  • method 3.2) can be implemented to check the nature of the tumor of the resection part, including its nature of primary cancer in comparison with the database.
  • Method 3.1) will be used more particularly to define later the limit of the exteresis to be achieved by testing peripheral fragments suspected of the more obvious tumor focus already resected and / or determined as tumor.
  • step 3.2 the comparison of the spectra with regard to the common presence of a given number of peaks in common can be achieved in particular with the CLINPROTOOLS® brand software developed by mass spectrometer manufacturer Bruker Daltonik® GmbH , Leipzig, Germany, Microflex® LT reference.
  • a human lung fragment is analyzed.
  • said reference profile is a said differential profile constituted by a number of 5 to 20 said reference peaks whose presence and the values of area under the curve make it possible to differentiate the two groups comprising the group ( 2) of the tumor tumor tissue class and the group (1) of the non-tumor tissue fragment category, based on the area values of the different peaks.
  • the CLINPROTOOLS ® software will indicate if the fragment belongs to one of these two groups and if so to which of the two groups. On the other hand, if the fragment does not belong to any of these software groups will indicate that the fragment is of indeterminate nature that is to say here that said fragment is a fragment of the same organ but of non-cancerous tumor nature or a fragment of another organ.
  • said reference profile makes it possible to differentiate the two groups comprising the group (2) of the cancerous tumor lung fragment class and the group (1) of the non-tumor lung fragment category, said reference profile comprising at least the reference peaks at the following values of m / z and normalized area values S1 and S2, S2 representing the mean value of normalized area of the peak when the peak belongs to the group (2) of the cancer fragments and SI the average value of the normalized area of the peak when the peak belongs to the group (1) of the non-tumor fragments for samples of suspensions of crude bromates diluted at a concentration of 0.5 to 1 mg / ml, said suspension being cleared of debris tissue of size greater than 100 ⁇ and comprising a protein solubilization solvent: TABLE A
  • said reference profile is a said differential profile constituted by a number of 5 to 20 said reference peaks whose presence and the values of area under the curve make it possible to differentiate the two groups comprising the group ( 2) the subclass of primary tumor cancer tumor tissue fragments and the non-tumor tissue fragment group (1) as a function of the area values under the curve of the different peaks.
  • the CLINPROTOOLS® software will indicate whether the fragment belongs to one of these two groups and if so to which of the two groups.
  • the fragment does not belong to any of these software groups will indicate that the fragment is of indeterminate nature (that is to say here that said fragment is a fragment of the same organ but of non-cancerous tumoral nature or of cancer but not primitive, or a fragment of another organ).
  • said reference profile makes it possible to differentiate the two groups comprising the group (2) of the class of primary cancer cancer tumor lung fragments and the group (1) of the category of non-tumor lung fragments, said profile reference point comprising at least the 5 peaks specific to following values of m / z and normalized area values S1 and S2, S2 representing the mean value of normalized area of the peak when the peak belongs to group (2) of primary cancer fragments and SI the mean value of area normalized peak when the peak belongs to the group (1) of the non-tumor fragments, for samples of suspensions of crude bromates diluted to a concentration of 0.5 to 1 mg / ml, said suspension being cleared of tissue debris larger than 100 ⁇ and comprising a solvent for solubilizing proteins: TABLE B
  • This criterion provides a primitive lung cancer determination of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma classes, with varying degrees of differentiation with a specificity of 97.8% and a 96% sensitivity for the presence of cancer, for samples from fragments of individuals used to determine said reference profile.
  • said reference profile makes it possible to differentiate the two groups comprising the group (2) of the class of lung fragments with primary cancer cancer and the group (1) of the category of non-lung fragments. tumor, said reference profile comprising at least the 11 peaks specific to the following values of m / z and normalized area values S1 and S2, where SI represents the average value of normalized area of the peak when the peak belongs to group (1) non-tumor fragments) and S2 the mean value of normalized area of the peak when the peak belongs to the group (2) of primitive cancerous fragments, for samples of suspensions of crude bromates diluted to a concentration of 0.5 to 1 mg / ml, said suspension being freed of tissue debris larger than 100 ⁇ and comprising a solvent for solubilizing the proteins: TABLE C
  • This criterion provides a determination of primary lung cancer of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma classes at varying degrees of differentiation with a specificity of 100% and a sensitivity of more than 99% for the presence of cancer, for samples from fragments of individuals used to determine said reference profile.
  • said reference profile is a said differential profile constituted by a number of 5 to 20 said reference peaks whose presence and the values of area under the curve make it possible to differentiate the two groups comprising the group ( 1) of the category of tumor-like organ fragments and the group (2) of the non-tumor tissue fragment category, as a function of the area values under the curve of the different peaks.
  • the CLINPROTOOLS ® software will indicate whether the fragment belongs to one of these two groups and, if so, to which of the two groups. On the other hand, if the fragment does not belong to any of these software groups will indicate that the fragment is of indeterminate nature (i.e. here that said fragment is a fragment of the same organ but of particular pathological nature such that non-tumor tissue lesion, or a fragment of another organ).
  • the molecular weight values m / z may vary up to ⁇ 1 Da of the average value mentioned and the area values may vary up to ⁇ 1%, or even ⁇ 5% , the average value of normalized area mentioned.
  • the reported values were obtained by melt suspension analysis mixed in a known manner with a solution of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix. Specifically, aqueous suspensions of tissue mill were mixed, volume-to-volume, with a solution of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix, in said mass spectrometric analysis and not before.
  • the CLINPROTOOLS® software is able, if necessary, to define a differential profile capable of differentiating between 2 and 20 groups of spectra.
  • said reference profile is a said differential profile constituted by a number of 5 to 20 said reference peaks whose presence and the values of area under the curve make it possible to differentiate the four groups comprising the group ( 1) of the subclass of non-cancer tumor-like organ fragments, the group (2) of the primary tumor cancer tumor lung class, the group (3) of the tumor lung fragment class cancerous metastasis and the group (4) from the non-tumor tissue fragment category, based on the area values under the curve of the different peaks.
  • FIG. 1 represents spectra obtained by MALDI-TOF type mass spectrometry after the extraction / separation protocol (profiles 1 to 6: A2 and B2) or on raw ground material (profiles 7 to 10: Al and B1) of healthy lungs (FIGS. braces A1 and A2) or infected (braces B1 and B2) with bacteria (species: rat);
  • FIG. 2 represents spectra obtained by MALDI-TOF type mass spectrometry from crude broyates of healthy rat lungs diluted in pure water (top 1-5 spectra) or a PBS-buffered electrolytic medium (spectra). frame C);
  • FIG. 3 represents spectra obtained from the same fragment of infected lung tissue diluted 10-fold (D1), 20-fold (D2) and 40-fold (D3);
  • FIG. 4 represents spectra obtained on samples of 40-fold, healthy rat lung homogenates (spectra 1-3 from above), the spectra with samples of said crushed with Acinetobacter baumannii pneumonia confirmed in culture. (spectra 5-8 from the top) in comparison with the spectrum obtained from a pure colony of the same bacterium (spectrum 9 of the bottom) or with the spectrum obtained after addition of 3 colonies of the same bacterium in a homogenate. healthy lung (spectrum 4 from the top).
  • FIG. 5 is a dendrogram representation of the differences between the spectra obtained from a healthy rat lung (bottom group: A) and inflammatory following a mechanical stress (top group: B);
  • FIG. 6 represents a dendrogram representing the analysis of the spectra obtained with samples of human lungs (A), rat (B), sheep (C), D mouse;
  • FIG. 7 represents a dendrogram representing the differences in spectral profile obtained in the MALDI-TOF type mass spectrometry analysis on diluted crushed fragments of human lung fragments (2 fragments per patient);
  • FIG. 8 represents a dendrogram obtained with the spectra corresponding to healthy lungs (box A) and cancerous cells (box B) after elimination of badly classified and non-cancerous tumors.
  • Tissue sampling Pulmonary resections were performed according to the standard surgical technique.
  • the resection piece also called a fragment of tissue, was the site of 4 biopsies at the heart of the visible tumor and four other fragments taken as far as possible from the tumor in supposedly healthy territory.
  • One copy of each territory was sent for the extemporaneous histological examination, another copy was intended for definitive histological examination, another was sent for preservation to the tumoro-partner, the last was intended for the treatments according to the invention and mass spectrometry studies in its MALDI-TOF variant.
  • Preparation of samples for MALDI-TOF analysis were sent for the extemporaneous histological examination, another copy was intended for definitive histological examination, another was sent for preservation to the tumoro- partner, the last was intended for the treatments according to the invention and mass spectrometry studies in its MALDI-TOF variant.
  • the material collection was performed after grinding the parenchyma diluted in distilled water using the variable-speed T25 digital variable-speed T25 reference disperser / homogenizer mill at a speed of 3,400 to 24,000 rpm ( hereinafter "rpm" and 500 to 300 W electrical power (high-performance disperse), according to the technique described in the protocol summarized below.
  • the ground material was then used as it is and deposited on the MALDI TOF spectrometer plate or, for comparative purposes, underwent a purification phase according to various modalities, in particular as described below, by repeating the simple purification / solubilization protocol already used for the first time. identification of bacteria in urine in the Clinical Microbiology Laboratory of the Timone Hospital.
  • the sample is co-crystallized with an hcca (4-hydroxy-alpha-cyano cinnamic acid) matrix and then the spectra will be obtained on the LT® microflex apparatus (Bruker Daltonics) according to the following methodology:
  • the deposit protocol comprises the following steps:
  • the spectra are obtained via an automatic method controlled by the software FLEXCONTROL® of the manufacturer BRUKER DALTONICS® the parameters are the following for each spot:
  • ni 0 for n ⁇ 8
  • ni 1 for 8 ⁇ n ⁇ 27
  • ni 2 for 27 ⁇ n ⁇ 43
  • ni 6 for 110 ⁇ n
  • n2 is the score given according to the value of the signal-to-noise ratio (Rmax) of the peak of greater intensity of the spectrum, with
  • n2 3 for 52.6 ⁇ Rmax ⁇ 208.6
  • n2 4 for 208.2 ⁇ Rmax ⁇ 398.6
  • BIOTYPER® software establishes a mean spectrum from at least 4, preferably at least 10, spectra made on 10 plate deposits of the same sample.
  • the intensity of the peak is considered when the signal / background noise ratio is greater than 3.
  • the inventors compared two average spectra between themselves or a new spectrum with the average spectra contained in the database of spectra of known samples described hereinafter with the BIOTYPER-RTC® software developed by the mass spectrometer manufacturer.
  • MALDI-TOF BRUKER DALTONICS®
  • the algorithms for calculating these scores are described in the manual provided by BRUKER DALTONICS®, which gives a brief example of the method used in its manual "Software for microorganism identification and classification”.
  • an identical peak between two spectra or with a spectrum of the database and the analyzed spectrum gets a positive score while the absence of a peak results in a negative score.
  • the set of scores obtained is expressed in logarithmic scale.
  • the scores obtained for identifying and classifying microorganisms are the ones that the inventors used to identify and classify cancerous and non-cancerous solid tissue types.
  • an identification score between 0 and 1.699 makes it possible to exclude the identity of the spectrum analyzed with that of a given type present in the database or the spectrum with which it is compared.
  • An identification score of between 1,700 and 1,999 suggests that the spectrum analyzed is identical to that in the database and an identification score greater than 2.0 allows for some identification.
  • the spectra of two samples considered identical are aligned.
  • An acceptable error is assigned for the peak mass of each spectrum ( ⁇ 1 Da) and the software repositions the two spectra (in other words, if the difference between the peaks of the same spectrum and the peaks of the other spectrum is too much different, the software will not be able to align the spectra).
  • a second step the comparison of an unknown spectrum with the reference spectrum (ie here, the average spectrum present in the database or a spectrum of another sample with which it is compared) is evaluated using dedicated identification scores.
  • the algorithms for calculating these scores are described in the manual provided by Bruker Daltonics, which provides a succinct example of method used in his manual "Software for microorganism identification and classification".
  • each peak of the spectrum to be analyzed is compared to the same peak of the reference spectra.
  • two windows of adjustable masses (“adjustable mass Windows”) are created.
  • the “inner mass window” corresponds to perfectly adjusted peaks, which gives them a full score and the “outer mass window” corresponds to peaks that are not perfectly aligned: the value of the assigned score is proportional to the distance with the peak "corresponding" of the reference spectrum (if Figure 4 was in color, we could see in green perfectly adjusted peaks between reference peaks and peaks of the sample tested, in yellow partially adjusted peaks and in red peaks unadjusted). This results in a cumulative score for the sample to be compared to the reference spectrum.
  • the distances (d) between two categories are all the smaller as they are close, that is, they have all the more common characteristic peaks shared in their spectra (and vice versa).
  • the vertical lines indicate that the categories or spectra connected have a certain percentage of peaks in common, this percentage being all the greater as the horizontal lines, below the vertical line of connection which links these categories or spectra, are small.
  • the remoteness of a vertical line that is to say the height of the horizontal lines delimiting the vertical line connecting them, accounts for the "distance" between the categories of spectra concerned, being inversely proportional to the number of peaks in common.
  • the representation in dendrogram which is freed from the representation in hierarchical classification is directly resulting from the data of the hierarchical classification.
  • Hierarchical "clustering” consists of an ascending hierarchical classification for which each "cluster” is gradually "absorbed” by the closest "cluster” for build an anchor cluster to be compared with other cell types. Thus, an A spectrum and a D spectrum are compared with the anchor cluster of the B + C spectra.
  • the set B + C is connected by a horizontal bar to a vertical bar connecting A to B + C.
  • the distance separating the vertical bar connecting A to the set B + C is greater than that of the vertical bar connecting B and C.
  • the resulting set A + B + C is compared with D and it can be seen that the horizontal bar which links D to the set A + B + C has a greater distance than the others, which means that the spectrum D is the least "close” to the spectra A, B and C.
  • the area under the curve of a peak being dependent on the width and the height of the peak, it is dependent on its intensity. It is therefore necessary to standardize the calculation of the area under the curve of a peak.
  • Example 4 Tests Achieved 1 In a first series of tests for the detection of pulmonary bacterial infections in the rat, an attempt was made to develop a protocol for applying bacterial detection by spectrometry to the lung tissue.
  • MALDI-TOF mass already used in the laboratory on blood and urine. The inventors have encountered a lack of detection of spectra possibly due to saturation of the signal related to the cell richness. At this stage, these were raw samples of crushed and diluted 1 / 40th fabric .
  • the 4 bottom profiles A1 and B1 correspond to raw tissue mill samples diluted in distilled water of healthy lungs (A1) or infected (B1) with bacteria (species: rat), and the 6 profiles of the top A2 and B2 correspond to different protocols for extraction / separation of healthy (Al) or infected (B1) lungs with bacteria (species: rat)
  • both methods allow to obtain peaks. Reproducibility of the healthy lung spectra could be verified for each method by the Biotyper software.
  • the spectra obtained by MALDI-TOF type mass spectrometry from raw homogenates of a single lung homogenous of a single healthy rat, diluted in pure water, are the spectra 1 Top and bottom spectrum) and those with a PBS buffered electrolytic medium are the C-frame spectra.
  • the spectra obtained on solid rat lung broth are the spectra 1-3 from above, the spectra with samples of said mash with Acinetobacter Baumannii pneumonia confirmed in culture (spectra 4-8) (dilution 1/160 and without elimination of coarse tissue debris or protein solubilization) in comparison with the spectrum obtained from a pure colony of the same bacterium (spectrum 9 bottom).
  • Figure 5 is a dendrogram representation of the differences between the spectra obtained from a healthy rat lung (bottom group: A) and inflammatory following mechanical stress (top group: B).
  • FIG. 6 represents a dendrogram representing the analysis of the spectra obtained with samples of human lungs (A), rat B, sheep C, and mouse D.
  • a list of 64 samples was constituted as follows: 1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3-1,3-2, 32-1, 32-2. The whole was kept frozen as it was at -80 ° C.
  • a small fragment (weight between 0.010 and 0.3 grams) of each sample was initially diluted in a quantity of water equal to 10 times its weight (dilution 1/10), from which half dilutions were made. (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160).
  • Some analyzes were done with a groundnut diluted 1/80 or 1/160 without removal of coarse tissue debris or protein solubilization. Other analyzes were made by applying the technique of separation / rapid solubilization to the ground material diluted to 1/160.
  • the supposed tumor fragment was labeled C
  • the supposed non-tumor fragment was labeled N.
  • Two additional fragments were added to the list of 32 pairs, labeled ISM and 2 SM or 33 and 34 and corresponding to healthy zone fragments. (non-tumorous) lungs from subjects with healthy lungs. When we conducted several tests with the same technique, the test number indicated in brackets from the 2nd test.
  • the spectra generated during the 2 nd test from the non-tumor supposed fragment of patient 5, made dilution 1/160 with simple separation according to the method used in microbiology for the urine is identified according to the following designation: HL_5 N_1160 _U (2).
  • FIG. 7 it is noted that the spectra of fragments of numbers 9C, 24C, 10C, 5C, 3C are grouped within a majority of N. Also, the numbers 12N and 9N are found within a majority of C.
  • the origin of this poor distribution may be due to an error in the labeling of the fragment at the time of its packaging, to an error in the diagnosis a priori (the surgeon mistakenly believed that the fragment was healthy by ex) or a lack of spectral signature characteristic of each class.
  • a priori the surgeon mistakenly believed that the fragment was healthy by ex
  • Table 1 List of subjects from which tumor and non-tumor samples were taken. The diagnosis of the tumor fragment carried out according to the definitive histological analysis is carried in column 2. The primary, metastatic or non-cancerous pulmonary cancer origin of the tumor is indicated in column 3 and results from definitive clinical and histological data. patient type cancerous cell tumor origin
  • the model revealed a clear separation into two groups.
  • the dendrogram obtained shows the spectra corresponding to healthy lungs in frame A and the spectra of cancer samples after removal of misclassified and non-cancerous tumors in frame B.
  • each input data is an average spectrum (SM) of 70 peaks (default setting), generated by the software.
  • SM average spectrum
  • MS 53 average reference spectra
  • the RTC ClinProTools ® software developed by the company Bruker Daltonics ® identifies a group of peaks selected from several, here preferably 2, groups of samples, within a spectral profile. This group of peaks is hereinafter called "differential profile”.
  • the software implements a genetic algorithm according to a validated method (JH Holland, Adaptation in Natural and Artificial Systems, University of Michigan Press, Ann Arbor, 1975).
  • this algorithm will select a differential profile by comparing randomly generated mass lists (m / z) from the spectra of the two categories or classes. Additional criteria of selection of peaks (other than those established to define the validity of a peak, as described above) to create the list, may be, for some, modified by the operator and appear in the form of a report edited with the list at the end of the generation of the list.
  • the mass lists correspond to a set of peaks and are recorded by their numerical mass value (m / z).
  • the software queries each original spectrum and establishes the percentage of detection of the differential profile. After a first query, the composition of the list is changed randomly by the software and the new list is tested again. So on until you get the most efficient differential profile possible.
  • Several differential profiles have been generated by this software. The choice of the number of peaks given as reference to the software was chosen by the operator.
  • the first is based on a search from 5 peaks, the second on a search from 11 peaks.
  • the first differential profile comprises specific peaks Nos. 6, 17, 30, 87 and 103 at the respective m / z values:
  • This criterion makes it possible to obtain a primitive lung cancer determination of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma classes with varying degrees of differentiation with an internal specificity of 97.8% and an internal sensitivity of 96% as regards the presence of cancer.
  • the value of the normalized area of each peak is compared between the primary cancer class S2 and non-tumor SI by a non-parametric statistical test of Kruskal-Wallis or Wilcoxon type whose value ⁇ 0.05 means that the difference is discriminating between classes.
  • the distribution of the value in the whole class is given by the standard deviation and the 95% confidence interval according to the usual uses in statistical methodology evaluating more or less heterogeneous populations. The selection of the peaks by the software does not imply that the peak was always present in one or the other class.
  • the peaks of the differential list are searched.
  • one of the peaks in the list is present, its area under the curve and its intensity are measured.
  • the spectrum is thus analyzed on the criteria of each of the peaks of the list and the peak is classified as belonging to one class to another according to or is not classifiable.
  • the classification is performed by the software that introduces the spectrum into the selected algorithm and establishes the classification according to the rules of the art described for this algorithm.
  • the spectrum is assigned to the non-tumor class or the tumor class.
  • the list of differential peaks of model 2 is shown in Table C.
  • the value of the normalized area of each peak is compared between the primary cancer class (area value S2) and non-tumor (area value SI) by a nonparametric statistical test of Kruskal-Wallis type (KW test) or Wilcoxon usually used in statistics and whose value ⁇ 0.05 means that the difference is discriminating between classes.
  • the distribution of the value in the whole class is given by the standard deviation and the 95% confidence interval and can be edited by a report from the ClinProtools ® software. The selection of the peaks by the software does not imply that the peak was always present in one or the other class.
  • model 2 allowed, from the spectra stored in this series, assigning 99.33% of the spectra from the lung cancer tissue fragments to the cancer class and all tissue fragments corresponding to a healthy zone were ranked well. Note that the 3 mass peaks 3488.16 / 3329.54 / 3711.08 did not have a significantly different area under the curve between the 2 classes. These peaks were removed from the model and the diagnostic performance was maintained.
  • This differential profile makes it possible to obtain a determination of the category of primary lung cancers of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma classes with varying degrees of differentiation with a specificity of 100% and a sensitivity of more than 99.3%.
  • EXTERNAL VALIDATION 12 additional healthy lung fragments from patients different from those used to determine the above reference profiles were tested (numbered 35 to 45). 4 deposits for each were made from the ground materials (4 spectra per sample). All healthy fragment spectra were correctly classified as healthy by the 3 differential profiles of 5, 11 and 15 peaks, respectively, except for a healthy fragment that was correctly classified by the 15-peak model. Rapid analysis by MALDI-TOF mass spectrometry, not preceded by an extraction or purification technique allows, for a given pathology, to determine whether a tissue fragment carries the pathology or not.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de détermination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur et/ou du type de cancer d'un fragment d'organe solide humain ou animal d'un individu donné, par analyse de spectre(s) de spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles : • 1) on prépare un premier échantillon d'une suspension homogène de broyât de dit fragment comprenant un mélange de différents types de cellules entières non lysées, et • 2) on réalise au moins un spectre d'au moins un dit premier échantillon et on analyse ledit spectre par comparaison avec au moins un profil de référence, ledit profil de référence étant constitué par au moins une liste de pic(s) de référence de spectre(s) établi(s) sur des fragments de référence étant connus pour être de nature tumorale ou non tumorale, ou, en cas de nature tumorale, étant connus pour appartenir à une dite classe ou sous classe de tumeur ou de cancer, et • 3) on détermine si ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment de tissu de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une dite classe ou sous-classe de tumeur ou de cancer, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon.

Description

METHODE DE DETERMINATION DE LA NATURE TUMORALE OU NON TUMORALE OU DU TYPE DE TUMEUR D'UN FRAGMENT D'ORGANE SOLIDE
HUMAIN OU ANIMAL
La présente invention concerne une méthode de détermination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur d'un fragment d'organe solide humain (adulte ou enfant) ou animal d'un individu donné.
On entend ici par « tumeur », une pathologie impliquant une prolifération cellulaire de cellules nouvelles d'aspect anormal, entraînant une modification physique locale de la texture dans le cas d'organe solide. Il peut s'agir de tumeur dont les cellules sont cancéreuse c'est- à-dire une tumeur ayant le pouvoir d'envahir les structures voisines comme explicité ci-après ou d'une tumeur non cancéreuse dite « bénigne » ou encore une tumeur d'origine infectieuse ou autre. Ce phénomène tumoral peut conduire à une augmentation de volume d'organe. Lorsque la tumeur à une forme arrondie ou sphéroïdale, on parle de nodule. Lorsque la formation arrondie comporte une réaction inflammatoire en sa périphérie on parle de granulome. Une cause fréquente de tumeur bénigne est l'inflammation (tumeur inflammatoire), laquelle peut se produire en réaction à l'introduction d'un corps ou organisme étranger dans le tissu (tumeur à corps étranger, tumeur en réponse à une infection, etc). Certains agents infectieux ont la particularité d'induire volontiers la formation de tumeurs d'allure nodulaire et granulomateuse dans l'organe qu'ils infectent, c'est le cas par exemple de la tuberculose. Certains cas sont à la limite de ces définitions, on parle alors de pseudo-tumeurs ou de lésion (lésion cornéenne par exemple). Il apparaît donc que la connaissance de la nature d'une tumeur est cruciale pour répondre aux questions suivantes: - faut-il l'enlever chirurgicalement (éxérèse) ? - quels médicaments donner : faut-il un traitement antibiotique, antituberculeux, anti-inflammatoire, anticancéreux ?
- faut-il compléter la chirurgie du cancer d'une chimiothérapie ou d'une radiothérapie Les organes peuvent être le poumon (parenchyme pulmonaire ou bronches), mais aussi le système colo-digestif (organes creux et glandes annexes, foie, vésicule, pancréas glandes salivaires), ainsi que tout organe de l'organisme (appareil urogénital et reproducteur, muscles, peau, cerveau, glandes endocrines, glandes exocrines, os, ou encore le tissu lymphatique (rate et ganglions), notamment des ganglions de la chaîne thoracique.
Plus particulièrement, la présente invention est utile pour réaliser un diagnostic rapide de la qualité d'une ablation de tumeur, notamment dans la chirurgie du cancer. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation de la spectrométrie de masse par désorption-ionisation laser assistée par matrice et temps de vol (en anglais « matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry ») dite type MALDI-TOF pour le diagnostic extemporané d'exérèse chirurgicale totale (c'est-à-dire l'ablation de tout ou partie d'un organe) notamment en cas de cancer, à partir de broyats pour lesquels aucune purification protéique et aucune localisation morphologique des cellules cancéreuses n'est effectuée.
Le cancer est caractérisé par la prolifération de cellules anormales en aspect et en fonctionnement au sein d'un tissu normal. Lorsque ceci se produit au sein d'un tissu solide, une formation se développe, plus ou moins bien limitée mais identifiable par sa différence d'aspect et de consistance avec le tissu voisin. On parle de « tumeur ». Ainsi les cellules cancéreuses vont se développer d'abord localement le plus souvent, puis de manière régionale en envahissant les tissus et organes voisins en particulier les ganglions. Mais les limites de cette formation sont plus ou moins nettes par rapport au tissu voisin. Lorsqu'une tumeur comporte des cellules cancéreuses dont l'origine est la même que celle du tissu dans lequel elles prolifèrent, on parle de «cancer primitif». Les cellules cancéreuses peuvent aussi essaimer et se développer à distance pour former une tumeur dite secondaire au sein d'un autre organe que l'organe primitif : ce sont les métastases. Lorsqu'une tumeur comporte des cellules cancéreuses dont l'origine est distincte de celles du tissu dans lequel elles prolifèrent, on parle en effet de «métastase».
La quasi-totalité des organes de l'organisme peuvent être le siège de tumeurs cancéreuses appelées aussi « tumeurs malignes ». Lorsque l'organe malade est un organe lymphoïde (ganglions et /ou organe lymphoïdes autres tels que la rate), le cancer porte le nom de lymphome. Les organes qui seront la cible de métastases sont principalement le poumon, le cerveau, le tissu osseux et les ganglions. Ainsi les ganglions peuvent être de nature tumorale maligne soit en raison d'un cancer lymphoïde primitif (lymphome) soit en raison d'une métastase ganglionnaire d'un cancer dont le point d'essaimage est un autre tissu.
Dans le cas de cancers de tissus solides, l'acte chirurgical de l'exérèse vise la suppression totale de toute cellule anormale et passe en général par l'exérèse de l'ensemble de la tumeur avec une marge de sécurité suffisante de l'ensemble vasculaire et cellulo-lymphatique de voisinage susceptible de contenir des métastases régionales. Un des problèmes au moment de la chirurgie du cancer est donc de savoir où s'arrête l'envahissement tumoral. Pour les organes non-vitaux (par exemple la thyroïde), une ablation totale de l'organe est possible. Pour les organes vitaux, la détermination des limites de l'exérèse est une question cruciale. Elles sont d'abord guidées par la visualisation à l'œil nu de l'aspect « tumoral » différent de l'aspect « non tumoral » ainsi que par une logique basée sur l'organisation anatomique de l'organe. En cas de doute, un examen microscopique d'un fragment tissulaire prélevé sur les limites de l'exérèse permettra de dire si la résection est passée en zone saine ou pas (cf infra). Dans les deux cas, il est également nécessaire de déterminer avec certitude l'existence d'un envahissement ganglionnaire car la voie lymphatique est souvent le principal mode de diffusion dans la circulation générale favorable aux métastases. Le pronostic étant plus sévère en cas d'envahissement ganglionnaire, la prise en charge thérapeutique sera souvent renforcée par une radiothérapie et /ou chimiothérapie.
Au-delà de l'objectif curatif, l'étendue de l'ablation est d'une importance majeure : trop large, la résection prive inutilement le patient d'une partie de ses fonctions, trop restreinte, elle fait encourir un risque élevé de résection incomplète avec pour corollaire un pourcentage élevé de récidives, d'essaimage et finalement de décès. En effet, les récidives sont plus agressives, infiltrantes et sont moins accessibles à un traitement curatif que les tumeurs initiales. Parce que des cellules cancéreuses invisibles pour l'œil peuvent migrer depuis la tumeur visible vers des zones voisines, les contours de la résection doivent être plus larges que ceux de la tumeur visible.
L'examen anatomopathologique ou histologique, c'est-à-dire l'examen au microscope du fragment d'organe enlevé (dit « réséqué »), est le moyen principal actuellement utilisé pour affirmer la nature de la tumeur, déterminer la qualité de l'ablation tumorale et déterminer l'existence d'un envahissement ganglionnaire ou d'un tissu de voisinage. Souvent un examen extemporané per-opératoire est requis pour les tumeurs d'origine douteuse, en particulier pour confirmer le diagnostic de cancer d'une part, puis pour déterminer et guider les limites de l'exérèse, c'est-à-dire pour analyser les zones avoisinantes appelées « berges de résection », mais aussi les des ganglions lymphatiques. Une reprise immédiate pourra alors être requise pour compléter l'exérèse. Il est d'un appui majeur dans la chirurgie vidéo-assistée pour déterminer l'existence d'un envahissement ganglionnaire lequel, au cas où il est présent, conduira à convertir l'opération chirurgicale en ouverture conventionnelle. Cette observation microscopique doit se faire rapidement ce qui implique de ne pas conditionner le prélèvement selon les techniques habituelles ni d'utiliser des colorations capables de bien discriminer les éléments architecturaux des tissus. Cette observation microscopique peut se faire sur les lieux de l'intervention chirurgicale donc dans le bloc opératoire avant fermeture de la paroi (analyse histologique extemporanée). Cet examen requiert toutefois l'ablation d'un fragment relativement gros, à savoir au moins 5 g (environ 2 cm2) et une durée d'au moins 30 minutes voire 1 heure par un spécialiste anatomopathologiste expert sur l'organe concerné, éventuellement présent dans le bloc opératoire. Enfin, cette analyse demeure délicate dans son interprétation et le risque de faux négatifs et/ou de réponses douteuses est relativement élevé. C'est pourquoi une étude plus précise éventuellement complétée d'un marquage cellulaire est ensuite réalisée sur la pièce de résection et permet, a posteriori, la caractérisation précise du type de tumeur et de son degré de différentiation en cas de cancer, mais aussi de porter un diagnostic définitif de la présence ou pas de cellules cancéreuses visibles en microscopie sur les berges de la résection. Les résultats de cette analyse a posteriori sont disponibles en général dans les 10 jours post-opératoires. Confronté à ces données définitives, il n'est pas exceptionnel que l'analyse extemporanée ait rendu un résultat faussement négatif (données non disponibles, estimées par expérience à 1-2%). Dans ce cas, un traitement adjuvant par exemple par chimiothérapie sera mis en place. Il est plus fréquent d'obtenir des faux positifs. La présente invention concerne plus particulièrement l'analyse de fragments de poumon dans le cas de cancer pulmonaire.
Les tumeurs malignes du poumon relèvent de la chirurgie dite thoracique dans un grand nombre de cas, laquelle vise l'ablation totale de la zone cancéreuse et des ganglions envahis. En raison des caractéristiques du parenchyme pulmonaire, il n'existe pas de limite nette cloisonnant bien l'organe de manière visible pour l'œil. Si une tumeur est cancéreuse, sa localisation fera décider le chirurgien d'étendre l'exérèse sur la base de l'organisation du poumon en lobes et segments. Si une tumeur est non cancéreuse, elle peut être l'objet d'une exérèse très circonscrite voire d'une absence d'exérèse avec prélèvement à but diagnostic. Ainsi, la prise en charge d'une tumeur pulmonaire peut aller de l'exérèse non-anatomique (selon les contours de la tumeur ou « wedge resection ») à but diagnostic, ou bien, par ordre croissant : segmentectomie, lobectomie, pneumonectomie. Afin d'améliorer la sensibilité et la spécificité des techniques asservies à la microscopie optique, des techniques fournissant des informations à l'échelle cellulaire ont été mises à disposition des cliniciens. Parmi elles, la protéomique étudie le grand ensemble des protéines exprimées à un moment donné par une cellule. La protéomique permet par exemple de mettre en évidence des régulations protéiques survenant lors de la différenciation cellulaire, telles qu'au cours des cancers, notamment par spectrométrie de masse. Depuis ses débuts à la fin des années 1990 [1], cette science a dû s'accompagner du développement d'outils bioinformatiques ultra performants et sophistiqués capables de décrypter la myriade d'informations résultant du catalogue protéique qu'elle permet d'établir. En effet, plus que l'identification d'un marqueur protéique spécifique, c'est la recherche de réseaux de régulations qui sont mis en lumière. Toutefois, si l'information qui découle de ce type d'analyse est particulièrement riche, elle n'a été jusqu'alors évaluée qu'après purification/extraction du contenu protéique total de l'échantillon cellulaire analysé, et l'information est d'autant plus spécifique que la lignée cellulaire est pure. C'est pourquoi en règle générale, avant l'analyse par spectrométrie de masse, les protéines sont séparées par électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide par exemple (2-D PAGE) [2]. Il existe également d'autres techniques permettant de sélectionner un groupe de protéines d'intérêt sur un critère physico-chimique (hydrophobicité, valence...). Ces techniques sont exploitées sous deux systèmes d'analyse et de traitement bio-informatique dénommés spectrométrie de masse de type SELDI-TOF comprenant une séparation sur une surface (de l'anglais « Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time Of Flight ») ou sur des billes magnétiques. Ces deux derniers types de séparation sont fréquemment appliqués à l'analyse des liquides biologiques complexes tels le sérum, les urines, le lavage broncho-alvéolaire ou les suspensions cellulaires, mais ne peuvent pas valablement être appliqué de manière rapide et simple sur un tissu complet. Ainsi, le préalable des analyses protéomiques proposées jusqu'alors en cancérologie est-il principalement basé sur des manipulations longues, complexes et coûteuses de purification- extraction, écartant toute possibilité d'application à l'analyse extemporanée pour aide au geste chirurgical au bloc opératoire.
La première application de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF au cancer date des années 2000 [3]. Par souci de trouver un marqueur plus sensible et plus spécifique que le marqueur biologique habituel (l'alphafoeto-protéine circulante dans ce travail) pour l'aide au diagnostic ainsi que le suivi thérapeutique du carcinome hépatocellulaire, ces auteurs ont mis en évidence un ensemble de 20 protéines candidates associés au carcinome hépatocellulaire et détectables à partir du sérum sanguin prétraité par électrophorèse bidimensionnelle. Depuis, l'application du MALDI-TOF précédé d'une électrophorèse s'est répandu en cancérologie des cancers du sein, prostate, colon, foie, poumon [4, 5, 6] à des fins de localisation de cellules tumorales au sein d'un tissu, de recherche de facteurs pronostiques ou de suivi thérapeutique. Il est aussi utilisé pour prédire le risque de métastases [5]. Récemment, il a été proposé de déterminer l'origine tumorale d'une tumeur d'origine incertaine, à partir de coupes d'organes, en visualisant les cellules tumorales par imagerie de type imagerie MALDI [8]. Il s'agit donc dans ces travaux de l'analyse d'extraits protéiques de sérums sanguins basée sur l'analyse des spectres de protéines circulantes non issues de cellules tumorales, c'est-à-dire des marqueurs non spécifiques de cellules cancéreuses ou sur l'analyse d'un groupe protéique issu d'une lignée cellulaire purifiée ou encore d'un groupe de protéines sélectionnées à partir d'un tissu isolé du reste de l'organe (épithélium, par exemple). Sur des tissus solides, on recherche et étudie une protéine particulière, ou un spectre spécifique émis par un type cellulaire tumoral donné co-localisant le spectre et les cellules anormales sur des coupes fines de tissu pré-traité pour fixation.
Dans une revue générale, Ardekani et al. [4] fait un état de l'art sur la question de la recherche de profils protéiques détectables dans le sérum humain par SELDI-TOF pour différencier les patients porteurs des non porteurs de cancer de l'ovaire. Dans un but de dépistage précoce, Ward DG et al. ont également recherché par SELDI-TOF une liste de protéines candidates (non spécifiques du cancer en question) qui différencient des patients porteurs de cancer colo-rectal de sujets sains. De même pour la détection sérique de profils protéiques associés au cancer du poumon tel qu'effectué par exemple par Yang SY et al. [6]. Ces recherches sur le plasma auraient donc pour but une application à large échelle sur l'ensemble d'une population à risque à laquelle la technique serait appliquée. Ce type d'application se heurte alors aux questions de rapport coût/bénéfice attendu ainsi qu'à l'absence de confirmation sur de larges effectifs. De façon plus ciblée, l'équipe de Oshita et al [7] a utilisé la spectrométrie de masse sur les protéines extraites de tumeurs cancéreuses décongelées dans le cadre du cancer pulmonaire d'un seul type (adénocarcinome) et bien différencié de 16 patients opérés 5 ans plus tôt. Le but était de rechercher un profil protéique associé à la récidive cancéreuse après ablation sur la base d'une comparaison entre des tumeurs de patients n'ayant pas récidivé à 5 ans et d'autres étant décédés du fait d'une récidive. Une liste de 11 protéines a été établie comme associée aux tumeurs des patients ayant récidivé à 5 ans. L'intérêt de ce type de recherche serait donc de savoir dès l'opération, à partir de l'analyse de la tumeur, quels sont les sujets à risque de récidive. Dans le travail récent de Meding et al [8], le profil spectral spécifique des cellules cancéreuses de 6 types d'adénocarcinomes de localisation différentes (sein, colon, foie, estomac, œsophage, thyroïde) a été établi pour chacune, à partir d'une cohorte de 171 échantillons pour lesquels une technique d'imagerie sur des coupes de zones identifiées au préalable par microscopie comme étant tumorales, a été effectuée pour déterminer le type de tumeur. A partir de ces données, l'origine d'une métastase hépatique a pu être diagnostiquée avec une sensibilité insuffisante de 81 à 91% et une spécificité de 85 à 87% selon l'algorithme choisi, le diagnostic du type « carcinome hépatocellulaire» d'une tumeur du foie a pu être porté avec une sensibilité de 73 à 74% et une spécificité de 96 à 97% selon l'algorithme. Sur sérum ou sur tissu, ces précédentes utilisations de la spectrométrie de masse-MALDI-TOF utilisent des techniques longues et complexes d'extraction protéique ou de traitement du fragment d'organe. A ce jour, aucun travail n'a suggéré qu'une détection simple et directe, sans passer par un gel de séparation ni par une technique d'extraction et purification des seules protéines et/ou désalinisation de l'échantillon, et sans chercher à identifier les protéines détectées ni à localiser les cellules anormales pour en recueillir le spectre spécifique, pouvait apporter une information suffisante pour l'analyse de fragment d'organe comportant plusieurs types de tissus par spectrométrie de masse.
Compte tenu de la difficulté à isoler des marqueurs spécifiques du cancer primitif ou du risque de récidive ou de métastases, on a cherché selon la présente invention à fournir une nouvelle méthode d'analyse de fragments d'organes tumoraux, notamment pour déterminer la qualité et les limites d'une ablation chirurgicale, qui soit plus rapide, plus simple et moins coûteuse à réaliser.
Selon la présente invention, on a découvert de façon accidentelle et surprenante qu'il était possible d'utiliser une spectrométrie de masse de type MALDI-TOF pour définir des profils spectraux suffisamment sensibles et spécifiques permettant d'affecter un fragment d'organe à une classe tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur, notamment cancéreuse ou au contraire non cancéreuse, à partir de l'analyse directe d'échantillon de fragments d'organe, sans séparation des cellules ou tissus qui le composent et sans présélection et étude d'un groupe protéique particulier. Selon la présente invention, on met en œuvre un échantillon de fragments d'organe comprenant un mélange pluricellulaire et pluritissulaire de cellules entières obtenues par dilution, de préférence dans de l'eau distillée, et broyage.
La spectrométrie de masse est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur masse. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/Z). Elle utilise un faisceau L.A.S.E.R. puisé dans l'UV (337 nm) afin de désorber et d'ioniser un mélange de matrice/échantillon co-cristallisé sur une surface métallique. Une matrice évite une trop importante dégradation de l'échantillon, elle absorbe l'énergie et cet apport d'énergie provoque l'expansion en phase gazeuse.
La spectrométrie de masse sous sa variante MALDI-TOF est récemment entrée dans les laboratoires de microbiologie. Elle permet d'identifier et de classifier différents types bactériens en utilisant des bactéries intactes. En effet, parmi les divers composants identifiés dans un spectre de spectrométrie de masse MALDI/TOF de type Biotyper®, certains semblent spécifiques d'une espèce bactérienne précise [9, 10]. II a ainsi été possible d'identifier un grand nombre d'espèces bactériennes isolées à partir des prélèvements cliniques en utilisant des banques de données élaborées à partir de chacune de ces espèces.
Enfin, l'analyse MALDI-TOF a été appliquée avec succès pour l'identification de types cellulaires eucaryotes conservés par congélation. Elle a permis d'étudier la présence de différentes populations lymphocytaires au sein d'un tissu complexe tel que le sang humain et de constituer une banque de données [10]. Cependant, Il n'a encore jamais été proposé d'analyser directement un échantillon de fragment d'organe soumis à une préparation rapide et simple pour la détection de tumeurs, notamment de cancers, par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF par étude d'un spectre global d'un organe pluritissulaire et pluricellulaire. La raison principale découle de ce qu'un tissu solide présente une nature complexe pluricellulaire pouvant comprendre selon l'organe concerné des fibres élastiques ou collagènes ou autres, du sang, des vaisseaux, des muscles, de la lymphe ou autre liquide biologique et un grand nombre de composants protéiques non spécifiques de sorte qu' aucun spectre modèle ne peut être défini.
Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de détermination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur et/ou du type de cancer d'un fragment d'organe solide humain ou animal d'un individu donné, par analyse de spectre(s) de spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, ledit type de tumeur appartenant à au moins l'une des classes et sous-classes de tumeurs suivantes : a) la classe des tumeurs cancéreuses, b) la sous classe des tumeurs cancéreuses de type cancer primitif, c) la sous-classe des fragments cancéreux de type métastase, d) la classe des tumeurs non cancéreuses, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles :
1) on prépare un premier échantillon d'une suspension homogène de broyât de dit fragment d'organe comprenant un mélange pluricellulaire et/ou pluritissulaire de différents types de cellules entières non lysées, dilué de préférence dans de l'eau distillé, et
2) on réalise au moins un spectre d'au moins un dit premier échantillon et on analyse ledit spectre par comparaison avec au moins un profil de référence, ledit profil de référence étant constitué par au moins une liste de pic(s) de référence de spectre(s) établi(s) sur respectivement au moins un échantillon de référence de broyât de respectivement au moins un fragment de référence brut de même tissu d'au moins un individu, le(s) dit échantillon(s) de référence étant préparé(s) de manière identique audit premier échantillon, le(s) dit(s) fragment(s) de référence étant connu(s) pour être de nature tumorale ou non tumorale , ou, en cas de nature tumorale, étant connu(s) pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus, et
3) on détermine si ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment de tissu de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon.
A l'étape 1), la mise en œuvre d'un dit mélange pluricellulaire et pluritissulaire de cellules entières non lysées signifie que l'on ne réalise pas de traitement d'extraction et/ou séparation de protéines, cellules ou tissus particuliers, et on ne réalise pas de traitement désalinisation ou purification préalable spécifique des protéines ou d'un type cellulaire ou tissulaire particulier.
En particulier, les inventeurs avaient tout d'abord cherché à analyser des échantillons de broyât ayant subi des étapes de lyse cellulaire, chimique ou enzymatique, ainsi que des échantillons traités pour extraire et purifier certains composants, notamment des protéines. Mais ces échantillons n'ont pas permis d'obtenir une classification pertinente sur la base de spectre de masse de type MALDI-TOF. En revanche, les inventeurs ont découvert que, de façon surprenante, des fragments d'échantillon bruts et, même, non débarrassés des débris tissulaires de grosse taille ni des résidus sanguins, permettaient d'obtenir des spectres exploitables, c'est-à-dire reproductibles et de qualité acceptable selon les critères de score de qualité discuté ci- après, en travaillant- à l'origine, par erreur, sur un échantillon brut simplement dilué à l'eau distillée. De même, les échantillons dilués par des solvants autres que de l'eau distillée ne permettaient pas d'obtenir des spectres de qualité suffisante, probablement car ils contenaient des espèces ioniques provenant des réactifs et solvants mis en œuvre qui saturaient la détection par spectrométrie de type MALDI-TOF, compte tenu que cette dernière détecte des ions comme rappelé ci-dessus.
Plus particulièrement, à l'étape 1), on réalise une dilution dans de l'eau distillée pour obtenir une suspension aqueuse d'une concentration de 0,05 à 5 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml. Une telle concentration est requise pour obtenir des spectres exploitables tel que défini ci-dessus avec les matériels de spectrométrie de masse MALDI- TOF disponibles actuellement dans le commerce. Sans être lié par cette théorie, les inventeurs formulent l'explication selon laquelle en dessous de la limite inférieure de cette fourchette, il pourrait manquer des composants caractéristiques de l'organe et au-dessus, la quantité de composants non caractéristiques pourrait être trop importante et crée un bruit de fond couvrant le signal des composants caractéristiques. Cette concentration peut être obtenue à partir de fragments de
0,05 à 2 g, de préférence de 0,1 à 0,5 g (environ 1 à 5 mm), dilués dans de l'eau distillée au 1/100 à l/200ème, notamment l/160ème.
De façon connue, à l'étape 1), on réalise le broyage d'un fragment d'organe par dilacération fournissant des particules de taille inférieure à 100 microns à l'aide d'un dispositif de dispersion/homogénéisation du type à rotor et stator, induisant des forces de cisaillement et de traction et de hautes turbulences dans le fluide notamment un dispositif du commerce de marques ULTRA TURRAX®.
Toutefois, avantageusement, ladite suspension de dit broyât est débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι, de préférence supérieure à 50 μ m, de préférence par centrifugation et récupération du surnageant et sans désalinisation de ladite suspension.
De préférence encore, ladite suspension de broyât comprend un solvant de solubilisation de protéines, de préférence de l'acide formique et/ou de l'acétonitrile.
Plus particulièrement encore, pour éliminer les débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι, de préférence de taille supérieure à 50 μιτι, on réalise les étapes suivantes :
- une première centrifugation lente, avec une accélération inférieure à 100 g de ladite suspension de broyât diluée, et
- une deuxième centrifugation plus rapide du surnageant de première centrifugation, à une accélération de plus de 10 000 g, plus particulièrement de 10000 à 20000 g, puis
- de préférence, une troisième centrifugation rapide de plus de 10 000 g, de préférence de 10 000 g, du culot de deuxième centrifugation dilué dans de l'eau distillée, et
- récupération dudit culot de deuxième ou, de préférence, troisième centrifugation, que l'on dilue dans des dissolvants de solubilisation de protéines. Ces échantillons, débarrassés des débris tissulaires grossiers et dilués dans des solvants favorisant la solubilisation des protéines, sont avantageux dans certains modes de réalisation décrits ci-après.
La solubilisation des protéines vise à éviter la coagulation éventuelle des protéines, éventuellement libérées par certaines cellules lors du broyage et/ou dilution décrits ci-dessus.
Le procédé selon la présente invention est simple et rapide à réaliser, n'ayant pas d'étape d'extraction protéique préalable à l'analyse ou autre traitement à réaliser. A l'étape 2), ledit profil de référence peut être choisi parmi:
2.1) un spectre complet ) d'un échantillon de référence de broyât d'un fragment de référence brut de même organe du même individu, ledit échantillon de référence étant préparé de manière identique audit premier échantillon, ledit fragment de référence étant connu pour être de nature tumorale ou non tumorale, ou, en cas de nature tumorale, étant connu pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus, et
2.2) une liste de pic(s) de référence comportant un nombre inférieur au nombre de pics dudit spectre, de préférence de 1 à 20 pics, la série de(s) dit(s) pic(s) de référence constituant un profil de référence dénommé ci-après « profil différentiel » permettant de classer ledit spectre dudit premier échantillon comme provenant spécifiquement d'un fragment de nature tumorale ou non tumorale ou appartenant spécifiquement à au moins l'une desdites classes ou sous classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire desdits pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon.
Et, à l'étape 3) on détermine si ledit fragment d'organe dudit premier échantillon est un fragment de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon l'une des deux manières suivantes respectivement :
3.1) si le spectre dudit premier échantillon est identique-à un dit spectre complet de référence d'un dit échantillon de référence du même organe du même individu, on détermine que ledit fragment dudit premier échantillon est de même nature tumorale ou respectivement non tumorale connue, ou le cas échéant appartient à la même classe ou sous-classe de tumeur ou cancer connue provenant du même individu que ledit fragment de référence, et 3.2) le spectre dudit premier échantillon permet de classer le fragment comme étant de nature tumorale ou inversement de nature non tumorale ou encore appartenant à au moins l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence d'une dite liste de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon.
De préférence, à l'étape 2.1), le spectre complet est un spectre moyen résultant d'une moyenne entre plusieurs spectres effectués à partir de plusieurs dépôts analysés sur la même plaque de spectromètre, issus d'un même fragment d'un même individu, notamment au moins 4 spectres, de préférence au moins 10 spectres.
A l'étape 2.2), ledit profil différentiel de référence est établi à partir d'un ensemble d'échantillons de référence de fragments de référence d'un dit organe d'une pluralité d'individus, lesdits fragments de référence étant connus pour être de nature tumorale ou non tumorale, ou, en cas de nature tumorale, étant connu pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus. Plusieurs profils différentiels de références pour différentes natures de fragments connues pour un organe particulier et/ou pour différents organes peuvent être enregistrés dans une base de donnée.
Pour la méthode des étapes 2.2) et 3.2) ci-dessus, on utilise de préférence des échantillons de broyats dilués et débarrassés des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι, tels que décrits ci-dessus, et de préférence avec des solvants de solubilisation de protéines.
Les inventeurs ont mis en évidence la possibilité de définition de signatures spécifiques de différents types d'organes solides tumoraux par analyse des spectres complets obtenus par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Selon la présente invention, la démonstration de la spécificité a été réalisée sur des analyses comparatives de 32 fragments de tissus pulmonaires tumoraux de toutes classes et 32 fragments pulmonaires non cancéreux comme explicité ci-après. On entend par « fragment de nature tumorale », une tumeur quelconque à savoir: une tumeur cancéreuse aussi bien que non cancéreuse.
On entend par « classe des fragments de tumeur de nature cancéreuse », un cancer primitif ou un cancer de type secondaire, c'est- à-dire de métastases (cellules cancéreuses provenant d'un autre tissu ou organe).
On entend par « sous classe des fragments cancéreux de type de cancer primitif », un cancer de prolifération des cellules d'origine dudit tissu, et ce pour tout type cellulaire du dit organe tel que adénocarcinome, carcinome épidermoïde, carcinome indifférencié, mélanome, sarcome, lymphome et tout autre type de cancer.
On entend par «sous-classe des fragments cancéreux de type de métastase», un cancer provenant de prolifération de cellules provenant d'un autre type d'organe que celui au sein duquel elle est identifiée. En particulier, lorsque ledit organe est un ganglion, celui-ci est le siège privilégié de métastases provenant d'un organe voisin (proche ou distant) comme indiqué ci-dessus.
On entend par « classe de fragment tumoral de nature non cancéreuse », une tumeur inflammatoire (infectieuse ou non infectieuse), une tumeur non inflammatoire (infectieuse ou non infectieuse).
Dans un mode préféré de réalisation, les organes analysés sont choisis parmi le parenchyme pulmonaire et les ganglions thoraciques régionaux. Dans un autre mode de réalisation préféré, les échantillons analysés sont choisis parmi les bronches et les ganglions.
Pour les raisons exposées précédemment on analysera attentivement les ganglions à proximité de l'organe principal analysé. En particulier les ganglions régionaux suivants pour les organes voisins suivants :
- pour les poumons, les bronches ou l'œsophage : les ganglions thoraciques, médiastinaux hilaires, para-œsophagiens, abdomino- coeliaques et cervicaux ; - pour les seins : les ganglions axillaires, thoraciques et cervicaux ;
- pour les viscères intra-abdominaux : les ganglions abdomino- pelviens et sus-claviculaires ;
- pour les organes de la tête et du cou : les ganglions cervicaux et thoraciques ;
- pour la prostate, les testicules et la vessie et autres organes de l'appareil uro-génital et reproducteur féminin ou masculin : les ganglions abdomino-perlviens;
-Pour les tissus cutanés et musculaires y compris des membres inférieurs : les ganglions inguinaux, axillaires et/ou du territoire concerné.
A l'étape 3), de façon connue, on entend par « la valeur de l'aire desdits pics », une valeur normalisée de l'aire sous la courbe du pic, à savoir l'intégrale correspondant à l'intégration de toutes les intensités correspondant à la région du pic située entre la courbe du pic et une ligne droite passant par le premier et le dernier point d'inflexion (la ligne de base du spectre étant la ligne d'intensité relative de pic nulle), ladite intégrale étant divisée par l'intensité moyenne du pic de même m/z dans l'ensemble des spectres de la classe N considérée. Ce mode de calcul est décrit dans le manuel d'utilisation du logiciel ClinProtools® 2.1.
Aux étapes 2.2) et 3.2), en fonction de la diversité des échantillons de référence provenant d'une pluralité d'individus constituant la banque d'échantillons pour déterminer lesdits profils différentiels, on pourra différentier davantage de sous-classes, notamment les sous classes additionnelles suivantes :
- les sous-classes des cancers primitifs dudit organe de respectivement différents types cellulaires de cancer, en particulier pour le poumon les cancers primitifs des différents types listés dans la classification OMS 2004 et 2011 cités ci-après , notamment les types cellulaires de cancers tels que adénocarcinome, carcinome épidermoïde, carcinome indifférencié, mélanome, sarcome, lymphome ; et
- les sous-classes de métastases provenant respectivement de différents autres organes, en particulier pour le poumon, les sous- classes respectives des métastases provenant par exemple de tout cancer localisé dans un autre organe comme par exemple des cancers du sein, du côlon, de la prostate, du pancréas, du rein, de la thyroïde, de l'estomac, des mélanomes, de l'ovaire, des sarcomes. - les sous-classes de tumeurs non cancéreuses suivantes : tumeur inflammatoire infectieuse, tumeur inflammatoire non infectieuse), tumeur non inflammatoire infectieuse et tumeur non inflammatoire non infectieuse. On peut citer les tumeurs non cancéreuses telles que nodule tuberculeux, sarcoïdose, Histiocytose X, mycose, pneumoconiose, parasitose, granulomatose de Wegener ou toute autre anomalie non cancéreuse.
A l'étape 2), comme mentionné précédemment, de façon connue, on réalise une pluralité de spectres d'une pluralité d'échantillons de ladite suspension, au moins 4 spectres, de préférence au moins 10 spectres, pour déterminer un spectre moyen dudit échantillon. A l'étape 2), de façon connue encore, on ne prend en compte dans lesdits spectres : i- les seuls pics dont l'intensité relative, exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité, est supérieure à au moins 3 fois celle du bruit de fond, et ii- lesdits spectres présentant un score de qualité supérieure à 2, ledit score de qualité étant constitué de l'addition des deux notes ni et n2 ayant chacune une valeur de 0 à 6 avec :
- ni est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques dudit spectre n, tel que spécifié plus précisément dans l'exemple 2 ci-après, et
- n2 est la note attribuée en fonction de la valeur du rapport signal/bruit (Rmax) du pic de plus grande intensité dudit spectre, tel que spécifié plus précisément dans l'exemple 2 ci-après ; et iii- on retient dans le spectre au moins les 50, de préférence au moins les 70 pics de plus grandes intensités.
Les critères i à iii ci-dessus sont pris en compte à l'aide notamment du logiciel de marque BIOTYPER® RTC et CLINPROTOOLS® développés par le fabricant de spectromètre de masse Bruker Daltonik® GmbH, Leipzig, Germany de référence Microflex LT.
Les pics desdits spectres étant définis par une paire de coordonnées composées d'une abscisse constituée du rapport masse/charge (m/z) de 2 000 à 15 000 Da, plus particulièrement de 3 000 à 9 000 Da, la coordonnée en ordonnée étant une intensité relative ou en unité arbitraire.
On entend ici par "intensité relative", une intensité exprimée en pourcentage de l'intensité du pic de plus grande intensité ou autrement exprimée par le rapport de (intensité du pic/ intensité du bruit de fond). A l'étape 3), on considère qu'un pic est commun entre le spectre analysé et un profil ou spectre de référence, si le pic présente les critères de validation et de recalibration définis pour chaque modèle et connus de l'homme de l'art, et dont le paramétrage peut être modifié par l'opérateur selon les consignes explicitées dans les manuels d'utilisateur spécifiques des logiciels Bruker Daltonics® et tels que listés plus loin dans les méthodes.
A l'étape 3), lorsque l'on compare un nouveau spectre à un autre spectre, comme à l'étape 3.1), ou à un profil de référence présent dans la base de données, comme à l'étape 3.2) ci-dessus, on prend en compte un autre score, appelé score d'identification décrit plus loin, qui est calculé par le logiciel BIOTYPER®. Le logiciel BIOTYPER® peut identifier ainsi des spectres inconnus par comparaison avec des spectres de référence stockés dans une base de données. A l'étape 2.2), de façon connue, le logiciel CLINPROTOOLS® de la société BRUCKER DALTONICS® permet, lorsque cela est possible, à partir d'une banque de spectres établis sur des d'échantillons classés en plusieurs groupes correspondant à des catégories différentes de fragments, d'identifier un dit profil différentiel consistant en un (ou des) pic(s) discriminant(s), apte(s) à différentier les spectres des catégories différentes de fragments.
La différentiation entre les différents groupes par comparaison avec un dit profil différentiel peut résulter de ce que :
- à partir de ladite banque de spectres, le logiciel a été capable d'identifier un pic discriminant d'un dit groupe de fragment et/ou une valeur d'aire du pic, et/ou
- à partir de ladite banque de spectres, le logiciel a été capable d'identifier plusieurs dits pics de référence dont la présence ou l'absence des différents pics et/ou dont les valeurs de l'aire de certains desdits pics de référence, permet de différentier différents dits groupes. La présence ou absence d'un pic dudit profil de référence se caractérise par la présence d'un signal ou non à une valeur de m/z particulière donnée.
Un pic peut être discriminant entre deux ou plusieurs groupes de fragments d'organe du fait de sa présence ou du fait de son absence dans le spectre analysé, du fait de la valeur de son aire, ou encore du fait de sa présence ou absence en combinaison avec la présence ou absence d'autres dits pics de référence ou de la valeur de son aire par rapport à celle d'autres dits pics de référence dudit profil différentiel. Ledit profil de référence est ici établi à partir d'une banque de spectres établis sur au moins des échantillons de nature tumorale connue et des échantillons non tumoraux et le cas échéant des échantillons de fragments tumoraux des différentes dites classes et sous classes connues, lesdits échantillons provenant du même organe et d'une pluralité d'individus.
Selon la présente invention on a donc découvert qu'il était possible de déterminer desdits profils de référence consistant en tout ou partie d'un spectre spécifique d'un fragment de nature tumorale, ou inversement spécifique d'un fragment de nature non tumorale, ou encore spécifique d'une dite classe ou sous-classe de tumeur ou de cancer de dits fragments du même organe au moins, tels que définis ci- dessus fiables, à partir d'une banque de spectres établis à partir d'échantillons de nature tumorale et des échantillons non tumoraux et le cas échéant des échantillons de fragments tumoraux des différentes dites classes et sous classes, provenant du même organe et d'une pluralité d'individus, notamment au moins 40 échantillons provenant d'au moins 20 individus, à la condition que tous lesdits échantillons soient préparés conformément à l'étape 1) ci-dessus et selon le même protocole de broyage et dilution, avec ou sans élimination des débris tissulaires grossiers et solubilisation du contenu protéique. On entend donc par « échantillon préparé de manière identique », un échantillon préparé notamment dans les mêmes conditions de broyage, à la même dilution avec ou sans élimination des débris cellulaires et solubilisation du contenu protéique total. A l'étape 3.1), la nature tumorale ou respectivement non tumorale voire le type de tumeur ou de cancer connu dudit deuxième fragment peut être établie par simple examen visuel à l'œil nu ou microscopique ou avoir été déterminée indépendamment par une autre analyse par spectrométrie de type MALDI-TOF d'extrait protéique ou autre comme celle de l'étape 3.2) ou par histologie et anatomopathologique ou autre analyse encore.
A l'étape 3.1), on n'a pas recours à une comparaison avec une banque de données de spectres ou séries de pics spécifiques de référence spécifiques de type(s) donné(s) de tissu(s) tumoral(aux) ou respectivement non tumoral(aux).
Dans un premier mode de réalisation :
- à l'étape 2), ledit profil de référence est constitué par un spectre complet d'un échantillon de référence de broyât d'un dit fragment de référence de même organe du même individu, ledit échantillon de référence étant préparé de manière identique audit premier échantillon, ledit fragment de référence étant connu pour être de nature tumorale ou non tumorale , ou, en cas de nature tumorale, étant connu pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus (correspondant à l'étape 2.1) ci-dessus), et
- à l'étape 3), on détermine que ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment de tissu de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, lorsque le spectre dudit premier échantillon est identique audit spectre complet de référence dudit échantillon de référence (correspondant à l'étape 3.1) ci-dessus).
Ainsi, dans ce premier mode de réalisation, à l'étape 3), on compare ledit spectre analysé, ci-après dénommé « premier spectre », avec un spectre de référence réalisé comme ledit premier spectre à l'étape 2) sur un échantillon d'un deuxième fragment du même organe du même individu dont la nature non tumorale ou sous classe cancéreuse est connue ci-après dénommé «échantillon de référence » , ledit premier échantillon étant préparé de la même manière que ledit échantillon de référence, et on détermine la nature tumorale ou respectivement cancéreuse dudit premier fragment si ledit premier spectre est identique au dit deuxième spectre, et inversement on détermine la nature tumorale ou respectivement non cancéreuse de ladite sous classe si les deux spectres sont différents . Dans ce mode de réalisation, ledit profil de référence est donc un dit spectre complet du même individu comprenant un nombre de pics défini par l'utilisateur (ou fixé par défaut à 70), à savoir le spectre complet du deuxième échantillon ou échantillon de référence, et lesdits pics spécifiques se caractérisent par la présence de chacun des pics dudit spectre complet de référence, le nombre de pics communs étant déterminé en fonction d'un score d'identification, et enfin les intensités et valeurs normalisées d'aire étant quantifiées puis comparées avec celles du spectre complet de référence selon un algorithme décrit en détail dans le manuel d'utilisation du logiciel Biotyper® 3.0. A l'étape 3.1), de préférence, ledit type de fragment tumoral connu est connu quant au type de tissu et éventuellement en outre quant au type de tumeur.
Dans un deuxième mode de réalisation :
- à l'étape 2), ledit profil de référence est constitué par une liste de pic(s) de référence, le nombre de pic(s) de référence étant inférieur au nombre de pics dudit spectre, de préférence de 1 à 20 pics, la liste de(s) dit(s) pic()s de référence constituant un profil de référence dénommé ci-après « profil différentiel » permettant de classer ledit spectre dudit premier échantillon comme provenant spécifiquement d'un fragment de nature tumorale ou non tumorale ou appartenant spécifiquement à au moins l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire desdits pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon (correspondant à l'étape 2.2) ci-dessus), et - à l'étape 3), on détermine que ledit fragment d'organe dudit premier échantillon est un fragment d'organe de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon (correspondant à l'étape 3.2) ci-dessus).
Une méthode selon la présente invention sera particulièrement utile en cas d'opération chirurgicale pour aider le chirurgien à déterminer rapidement l'étendue d'une ablation d'organe solide à réaliser. Pour ce faire, la méthode 3.2) pourra être mise en œuvre pour vérifier la nature de la tumeur de la pièce de résection, notamment sa nature de cancer primitif par comparaison avec la banque de données. La méthode 3.1) sera plus particulièrement mise en œuvre pour définir ultérieurement la limite de l'éxérèse à réaliser en faisant tester des fragments périphériques suspects du foyer tumoral plus manifeste déjà réséqué et/ou déterminé comme tumoral.
A l'étape 3.2), la comparaison des spectres au regard de la présence en commun d'un nombre donné de pics en commun peut être réalisée notamment avec le logiciel de marque CLINPROTOOLS® développé par le fabricant de spectromètre de masse Bruker Daltonik® GmbH, Leipzig, Germany, de référence Microflex® LT. Dans un mode de réalisation plus particulier, on analyse un fragment de poumon humain.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la classe des fragments de tissus à tumeur cancéreuse et le groupe (1) de la catégorie des fragments de tissus non tumoraux, en fonction des valeurs d'aire des différents pics . Dans ce cas, le logiciel CLINPROTOOLS® indiquera si le fragment appartient à l'un de ces deux groupes et le cas échéant auquel des deux groupes. En revanche, si le fragment n'appartient à aucun de ces groupes logiciel indiquera que le fragment est de nature indéterminée c'est-à-dire ici que ledit fragment est un fragment du même organe mais de nature tumorale non cancéreuse ou un fragment d'un autre organe.
Plus particulièrement, ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse et le groupe (1) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux , ledit profil de référence comprenant au moins les 15 pics de référence aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées SI et S2 suivantes, S2 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments de cancers et SI la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments non tumoraux pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι et comprenant un solvant de solubilisation de protéines : TABLEAU A
Dans un autre mode de réalisation, ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la sous classe des fragments de tissus à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (1) de la catégorie des fragments de tissus non tumoraux en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics. Dans ce cas, le logiciel CLINPROTOOLS® indiquera si le fragment appartient à l'un de ces deux groupes et le cas échéant auquel des deux groupes. En revanche, si le fragment n'appartient à aucun de ces groupes logiciel indiquera que le fragment est de nature indéterminée (c'est-à-dire ici que ledit fragment est un fragment du même organe mais de nature tumorale non cancéreuse ou de cancer mais non primitif, ou un fragment d'un autre organe).
Plus particulièrement, ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (1) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 5 pics spécifiques aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées suivantes SI et S2 suivantes, S2 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments de cancers primitifs et SI la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments non tumoraux, pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι et comprenant un solvant de solubilisation des protéines : TABLEAU B
Ce critère permet d'obtenir une détermination de cancer pulmonaire primitifs de classes adénocarcinome et carcinome épidermoïde, à des degrés de différentiation variables avec une spécificité de 97,8% et une sensibilité de 96% quant à la présence de cancer, pour des échantillons provenant de fragments d'individus ayant servi à déterminer ledit profil de référence.
Dans une variante préférée de réalisation, ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (1) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 11 pics spécifiques aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées SI et S2 suivantes, SI représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments non tumoraux ) et S2 la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments à cancers primitifs, pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι et comprenant un solvant de solubilisation des protéines : TABLEAU C
Ce critère permet d'obtenir une détermination de cancer pulmonaire primitif de classes adénocracinome et carcinome épidermoïde à des degrés de différentiation variables avec une spécificité de 100% et une sensibilité de plus de 99% quant à la présence de cancer, pour des échantillons provenant de fragments d'individus ayant servi à déterminer ledit profil de référence.
Dans une autre variante de réalisation, ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la catégorie des fragments d'organe de nature tumorale et le groupe (2) de la catégorie des fragments de tissus de nature non tumorale, en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics.
Dans ce cas, le logiciel CLINPROTOOLS® indiquera si le fragment appartient à l'un de ces deux groupes et le cas échéant auquel des deux groupes. En revanche, si le fragment n'appartient à aucun de ces groupes logiciel indiquera que le fragment est de nature indéterminée (c'est-à-dire ici que ledit fragment est un fragment du même organe mais de nature pathologique particulière tel qu'une lésion tissulaire non tumorale, ou un fragment d'un autre organe).
Dans les tableaux A à C ci-dessus, les valeurs des masses moléculaires m/z peuvent varier jusqu'à ± 1 Da de la valeur moyenne mentionnée et les valeurs d'aire peuvent varier jusqu'à ±1%, voire ±5%, de la valeur moyenne d'aire normalisée mentionnée. On fait état de la valeur m/z, z représentant la charge électrique de l'espèce ionisée. Mais, en pratique, m/z peut être assimilé à la masse moléculaire m, avec z=l, car la quantité de protéines qui s'ionisent 2 fois (z= + 2), voire 3 fois (z=+3), est négligeable, compte-tenu de la limite de sensibilité des techniques de mesures. Les valeurs rapportées ont été obtenus par une analyse de suspension de broyât mélangée de façon connue à une solution de matrice d'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique. Plus précisément, les suspensions aqueuses de broyât tissulaire ont été mélangées, volume à volume, avec une solution de matrice d'acide a-cyano-4- hydroxycinnamique, lors de ladite analyse par spectrométrie de masse et pas avant.
Le logiciel CLINPROTOOLS® est capable, le cas échéant, de définir un profil différentiel apte à différentier de 2 à 20 groupes de spectres.
Selon une autre variante de réalisation, ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les quatre groupes comprenant le groupe (1) de la sous classe des fragments d'organe de nature tumorale non cancéreuse, le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif, le groupe (3) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de métastase et le groupe (4) de la catégorie des fragments de tissus de nature non tumorale, en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée des exemples de réalisation suivants, présentés de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur lesquels :
- la figure 1 représente des spectres obtenus en spectrométrie de masse type MALDI-TOF après protocole d'extraction/séparation (profils 1 à 6 : A2 et B2) ou sur broyât brut (profils 7 à 10 : Al etBl) de poumons sains (accolades Al et A2) ou infectés (accolades Bl et B2) avec des bactéries (espèce : rat) ;
- la figure 2 représente des spectres obtenus en spectrométrie de masse type MALDI-TOF à partir de broyats bruts de poumons de rat sains dilué dans de l'eau pure (spectres 1-5 du haut ) ou un milieu électrolytique tamponné type PBS (spectres du cadre C) ;
- la figure 3 représente des spectres obtenus à partir d'un même fragment de tissu pulmonaire infecté dilué 10 fois (Dl), 20 fois (D2) et 40 fois (D3) ;
- la figure 4 représente des spectres obtenus sur des échantillons de broyats de poumon de rat dilués 40 fois, sains (spectres 1-3 à partir du haut), les spectres avec des échantillons de dit broyât avec une pneumonie à Acinetobacter baumannii confirmée en culture (spectres 5- 8 à partir du haut) en comparaison avec le spectre obtenu d'après une colonie pure de la même bactérie (spectre 9 du bas) ou avec le spectre obtenu après adjonction de 3 colonies de la même bactérie dans un broyât de poumon sain (spectre 4 à partir du haut).
- la figure 5 est une représentation par dendrogramme des différences entre les spectres obtenus à partir d'un poumon de rat sain (groupe du bas : A) et inflammatoire suite à un stress mécanique (groupe du haut : B) ; - La figure 6 représente un dendrogramme représentant les analyse des spectres obtenus avec des échantillons de poumons humains (A), de rat (B), de mouton (C), de souris D;
- La figure 7 représente un dendrogramme représentant les différences de profil spectral obtenu à l'analyse en spectrométrie de masse type MALDI-TOF sur broyats dilués de fragments de poumons humains (2 fragments par patients) ;
- La figure 8 représente un dendrogramme obtenu avec les spectres correspondant à des poumons sains (cadre A) et cancéreux (cadre B) après élimination des mal classés et des tumeurs non cancéreuses.
Exemple 1 : Protocole de préparation des fragments tissulaires de poumon
1) Prélèvement du tissu Les résections pulmonaires ont été effectuées selon la technique chirurgicale standard. La pièce de résection encore appelée fragment de tissu, a été le siège de 4 biopsies au cœur de la tumeur visible et quatre autres fragments prélevés le plus à distance possible de la tumeur en territoire supposé sain. Un exemplaire de chaque territoire a été adressé pour l'examen histologique extemporané, un autre exemplaire était destiné à l'examen histologique définitif, un autre était adressé pour conservation à la tumoro-thèque, le dernier était destiné aux traitements selon l'invention et études par spectrométrie de masse dans sa variante MALDI-TOF. 2) Préparation des échantillons en vue de l'analyse MALDI-TOF
Le recueil de matériel a été effectué après broyage du parenchyme dilué dans de l'eau distillée à l'aide du broyeur du type disperseur/homogénéiseur Ultra-turrax® de référence T25 digital de vitesse variable de 3 400 à 24 000 tours par minute (ci-après "tr/min" et de puissance électrique de 500 à 300 W (high-performance disperser), selon la technique décrite dans le protocole résumé ci-dessous. Le broyât a ensuite été utilisé tel quel et déposé sur la plaque du spectromètre MALDI TOF ou à titre comparatif a subi une phase de purification selon différents modalités notamment tel que décrit ci-après en reprenant le protocole de purification/solubilisation simple déjà utilisée pour l'identification des bactéries dans des urines au sein du laboratoire de microbiologie clinique de l'hôpital de la Timone.
2.1) Traitement préalable du fragment pulmonaire (fragmentation et broyage)
On a réalisé le protocole suivant comprenant les étapes suivantes de :
1- Division du fragment initial de poumon en 10 portions sensiblement égales,
2- Echantillonnage d'un fragment avec sa pesée pour un travail sur un fragment de 0.08 à 0.3 g sur cette série,
3- Nettoyage du broyeur : par mise en marche de la rotation et plongée de l'outil de dispersion dans un tube d'eau stérile le couvrant jusqu'en haut puis répétition de cette manœuvre dans de l'alcool et répétition encore dans de l'eau distillée,
4- Pesée du fragment et mise en place dans un tube stérile sec,
5- Adjonction d'un volume d'eau distillée égal à 10 fois le poids du fragment de poumon réalisant ainsi la première dilution à l/10eme. Maintien du tube contenant le fragment et l'eau dans de la glace pilée pour éviter tout échauffement lors du broyage,
6- Broyage par mise en marche progressive de la rotation jusqu'à 2400 tr/min pendant 1 minute correspondant au temps habituellement nécessaire pour obtenir une suspension homogène, 7- Prélèvement d'une partie de la suspension pour mise en réserve. Ajout d'un volume d'eau distillée à la suspension restante, ajusté au fur et à mesure des résultats (de l/10eme à l/160eme) jusqu'à ce que l'on se fixe le facteur optimal qui s'est avéré être 1/160 pour obtenir une suspension aqueuse de broyât homogène trouble de concentration de 0,5 à 1 mg/ml à l'issue de l'étape de broyage,
8- Pour certains échantillons : conservation du broyât en plusieurs aliquots entreposés à -80°C,
9- Au moment de l'analyse, dépôt de suspension de de broyât , le cas échéant décongelé sur la plaque du MALDI-TOF (10 dépôts de 1 microlitre par échantillon pour la mise au point du protocole).
2.2) Méthode de séparation des débris cellulaires grossiers de taille supérieure à 100 μιτι et solubilisation de protéine
On a réalisé le protocole suivant comprenant les étapes suivantes consistant à :
1- Centrifuger la suspension de broyât diluée dans de l'eau, obtenue à l'étape 7- de la méthode 2.1) ci-dessus, pendant 5 minutes à 20 g (soit 500 tr/min avec la centrifugeuse de la société THERMOSCIENTIFIC® de référence HERAUS PICO 17), 2- Prélever le surnageant, le centrifuger pendant 5 minutes à 16
500 g (soit 14000 tr/min avec la centrifugeuse ci-dessus),
3- Rejeter le surnageant, ajouter 1 ml d'eau distillée et remettre le culot en suspension,
4- Agiter (Vortexer) puis centrifuger 5 min à 16500 g,
5- Rejeter le surnageant et récupérer le culot,
6- Ajouter au culot lavé 5 μΙ d'acide formique 100%. Bien mélanger avec la pipette et attendre 5 min, 7- Ajouter 5 μΙ d'acétonitrile à 100%. Bien mélanger,
8- Centrifuger 2 minutes à 16 500 g,
9- Récupérer le surnageant et déposer le surnageant sur la plaque du spectromètre de masse MALDI-TOF (10 spots par échantillons). Exemple 2 : Réalisation des spectres par spectrométrie de type
MALDI-TOF
L'échantillon est co-cristallisé avec une matrice de type hcca (acide 4-hydroxy alpha-cyano cinnamique) puis les spectres seront obtenus sur l'appareil microflex LT® (Bruker Daltonics) selon la méthodologie suivante :
Le protocole de dépôt comprend les étapes suivantes consistant à:
1- déposer 1 pL d'extraction pulmonaire sur une position prédéfinie (cercles appelés « spots ») de la cible MICROFLEX (plaque en acier inoxidable BRUKER DALTONICS, 2- déposer 1 pL de matrice (HCCA à saturation dans 50% d'acétonitrile 2,5% d'acide trifluoroacetique, qsp eau distillée),
3- laisser sécher pendant 5 minutes à température ambiante,
4- introduire la plaque (cible Microflex modèle de référence 224989 dénommé MSP 96) contenant les dépôts dans le spectromètre de masse Microflex LT,
5- Démarrer l'ordinateur associé au spectromètre pour lancer les analyses, et
6- Lancer l'acquisition des spectres de masse MALDI-TOF.
Les paramètres appliqués au spectromètre de masse sont les suivants :
- Mode linéaire positif - Electrode IS1 : 20,00 kV
- Electrode IS2 : 16,65 kV
- Electrode de focalisation : 7,20 kV
- Post-ion-extraction (PIE) : 120 ns - Fréquence du laser : 60Hz
- Gain du détecteur : 8,4 X
- Gamme de masse : de 2 000 à 20 000 Da
Les spectres sont obtenus via une méthode automatique contrôlée par le logiciel FLEXCONTROL® du fabricant BRUKER DALTONICS® les paramètres sont les suivants pour chaque spot :
- Somme de 240 tirs par série de 40 tirs
- Afin que les tirs aient balayé l'ensemble de l'échantillon de façon homogène l'acquisition se fait sur 6 positions différentes selon une géométrie hexagonale. - Pré-tirs : 10 tirs à 40% de la puissance maximum laser servent à dessaler l'échantillon (contamination par les sels minéraux)
- Puissance laser : 30 % à 45 % régulée via le logiciel FLEXCONTROL®
- Sélection du spectre : sur une gamme de masse de 4 000 à 10 000 Da.
- L'acquisition des spectres est au final réalisée via le logiciel Biotyper-RTC® du fabricant BRUKER DALTONICS® qui permet d'appliquer la méthode automatique décrite ci-dessus à une série d'échantillons en prenant en compte les critères mentionnés précédemment et un score de qualité ou score de validation qui représentent l'addition de 2 notes ni + n2 (ni étant fonction du nombre de pics et n2 fonction du rapport signal/bruit de fond).
- ni est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques du spectre n, avec . ni = 0 pour n < 8
. ni = 1 pour 8 < n < 27
. ni = 2 pour 27 < n < 43
. ni = 3 pour 43 < n < 78
. ni = 4 pour 78 < n < 86 . ni = 5 pour 86 < n < 110
. ni = 6 pour 110 < n, et
- n2 est la note attribuée en fonction de la valeur du rapport signal/bruit (Rmax) du pic de plus grande intensité du spectre, avec
. n2 = 0 pour Rmax < 6,8 . n2 = 1 pour 6,8 < Rmax < 26,8
. n2 = 2 pour 26,8 < Rmax < 52,6
. n2 = 3 pour 52,6 < Rmax < 208,6
. n2 = 4 pour 208,2 < Rmax < 398,6
. n2 = 5 pour 398,6 < Rmax < 1092,2 . n2 = 6 pour 1092,2 < Rmax.
Un spectre est pris en compte si son score de validation (nl + n2) est supérieur à 2. D'autre part, le logiciel BIOTYPER® établit un spectre moyen à partir d'au moins 4, de préférence au moins 10, spectres réalisés sur 10 dépôts sur plaque d'un même échantillon.
Ledit spectre moyen issu de plusieurs spectres est établi par le logiciel BIOTYPER® à partir des spectres individuels dans lesquels sont recherchés des pics dits « valides » selon une méthode se résumant ainsi :
- l'étendue du pic sur l'axe des abscisses ne doit pas excéder 25
Da, - la variation de la ligne de base du pic doit être contenue dans l'intervalle moyen de variation des lignes de base de l'ensemble des pics du spectre, et
- l'intensité du pic est considérée lorsque le rapport signal/bruit de fond est supérieur à 3. Une fois les pics d'intérêt ainsi sélectionnés, le logiciel réalise une moyenne des intensités pour chaque valeur de m/z présents dans au moins 25% des spectres individuels.
Exemple 3 : analyse des spectres.
Les inventeurs ont comparé entre eux deux spectres moyens entre eux ou un nouveau spectre avec les spectres moyens contenus dans la base de données de spectres d'échantillons connus décrits ci-après grâce au logiciel BIOTYPER-RTC® développé par le fabricant du spectromètre de masse MALDI-TOF (BRUKER DALTONICS®). Il en résulte des scores de qualité Les algorithmes, qui permettent de calculer ces scores, sont décrits dans le manuel fourni par BRUKER DALTONICS® qui donne un exemple succinct de la méthode employée dans son manuel "Software for microorganism identification and classification". Ainsi, un pic identique entre deux spectres ou avec un spectre de la base de données et le spectre analysé, obtient un score positif alors que l'absence d'un pic se traduit par un score négatif. L'ensemble des scores obtenus est exprimé en échelle logarithmique. Les scores obtenus pour identifier et classifier les microorganismes (Fournier PE, Couderc C, Buffet S, Flaudrops C, Raoult D. Rapid and cost-effective identification of Bartonella species using mass spectrometry. J Med M icrobiol . 2009, 58:1154-1159) sont ceux que les inventeurs ont utilisés pour identifier et classifier les types de tissus solides cancéreux et non cancéreux. Ainsi, un score d'identification compris entre 0 et 1,699 permet d'exclure l'identité du spectre analysé avec celui d'un type donné présent dans la base de données ou le spectre avec lequel il est comparé. Un score d'identification compris entre 1,700 et 1,999 suggère que le spectre analysé est identique à celui présent dans la base de données et un score d'identification supérieur à 2,0 permet une identification certaine.
Dans un premier temps, les spectres de deux échantillons considérés comme identiques sont alignés. On assigne une erreur acceptable pour la masse des pics de chaque spectre (±1 Da) et le logiciel repositionne les deux spectres (autrement dit, si l'écart entre les pics du même spectre et entre les pics de l'autre spectre est trop différent, le logiciel ne pourra pas aligner les spectres).
Dans un second temps, la comparaison d'un spectre inconnu avec le spectre de référence (à savoir ici, le spectre moyen présent dans la base de données ou un spectre d'un autre échantillon avec lequel il est comparé) est évaluée en utilisant des scores d'identification dédiés. Les algorithmes, qui permettent de calculer ces scores, sont décrits dans le manuel fourni par Bruker Daltonics qui donne un exemple succinct de la méthode employée dans son manuel "Software for microorganism identification and classification". Pour cela, les informations issues de l'analyse du spectre de référence sont converties en une valeur appelée score maximum accessible ("maximum score ou Max. Se") calculée de la façon suivante : chaque pic présent avec une fréquence de 100% obtient 100 points; les pics présents avec une moindre fréquence obtiennent un nombre de points équivalent à leur fréquence (par exemple, un petit pic présent dans seulement 8 spectres présents dans la base de données qui en contient 20 obtient un score de 8/20 = 40). L'addition de tous les points donne le score maximum accessible. Ainsi, par exemple, un spectre de référence qui contient 10 pics avec 100% de fréquence, 5 pics avec une fréquence de 50% et 3 pics avec une fréquence de 10% atteint un score maximum accessible de (10xl00)+(5x50)+(3xl0)=l 280. Une fois établi ce score concernant les spectres de référence, chaque pic du spectre à analyser est comparé au même pic des spectres de référence. Pour cela, deux fenêtres de masses ajustables ("adjustable mass Windows") sont créées. La fenêtre "inner mass window" correspond à des pics parfaitement ajustés, ce qui leur donne un score plein et la fenêtre "outer mass window" correspond à des pics non parfaitement alignés : la valeur du score attribué est proportionnelle à la distance avec le pic "correspondant" du spectre de référence (si la figure 4 était en couleur, on pourrait voir en vert les pics parfaitement ajustés entre les pics de référence et les pics de l'échantillon testé, en jaune les pics partiellement ajustés et en rouge les pics non ajustés). Il en résulte un score cumulatif pour l'échantillon à comparer au spectre de référence. La comparaison de ce score cumulé ("actual score ou Act. Se") avec le score maximum accessible ("Max. Se") conduit à un score relatif ("Rel. Se") ou Rel. Sc.=Act. Se/Max. Se (avec un maximum de 1 pour une parfaite identité). Sont pris également en compte dans le score final ("overall score") le nombre de pics parfaitement ajustés (PN k), le nombre de pics partiellement ajustés (PN b) et le nombre total de pics (PN m) présents dans le spectre sous la forme d'un nombre de pics relatif ("Rel. P-Num.") qui est calculé de la façon suivante : Rel. P-Num. = (PN k) + (0,5xPN b)/(PN m). Enfin, un calcul de corrélation ("Effective I-correlation value" ou I-Corr.) est effectué. Le score final est calculé comme suit : Rel. Se. x Rel. P-Num. x I-Corr. x 1000 (avec un maximum de 1000) puis exprimé en Log (l'échelle va donc de 1 = aucune homologie à 3 = identité parfaite). C'est ainsi que l'on obtient des scores < ou > à 2,0. Les figures 5 et 6 ci-après sont des représentations en dendrogramme de la proximité de différents spectres de différentes catégories d'échantillons résultant d'une analyse par classification hiérarchique, les valeurs d de 0 à 1 000 sur l'axe horizontal sont les niveaux de "distance" entre les deux catégories d'échantillons concernés. Les distances (d) entre deux catégories sont d'autant plus petites qu'ils sont proches, c'est-à-dire qu'ils ont d'autant plus de pics caractéristiques communs partagés dans leurs spectres (et vice et versa). Dans un dendrogramme, les traits verticaux indiquent que les catégories ou spectres reliés présentent un certain pourcentage de pics en commun, ce pourcentage étant d'autant plus grand que les traits horizontaux, dessous le trait vertical de liaison qui relie ces catégories ou spectres, sont petits. L'éloignement d'un trait vertical, c'est-à-dire la hauteur des traits horizontaux délimitant le trait vertical les reliant, rend compte de la "distance" entre les catégories de spectres concernés, étant inversement proportionnelle au nombre de pics en commun. La représentation en dendrogramme qui s'affranchit de la représentation en classification hiérarchique est directement issue des données de la classification hiérarchique.
La méthode, classique, de détermination d'un "clustering" hiérarchique est explicitée sur le site Internet http://asi.insa- rouen.fr/enseignement/siteUV/dm/Cours/clustering. pdf et dans l'ouvrage de Husson F., Lê S, Pagès J. Pratique de la statistique, 2009, pages 169-202, chapitre 4 : Classification, aux éditions des Presses Universitaires de Rennes. Le "clustering" hiérarchique consiste en une classification hiérarchique ascendante pour laquelle chaque "cluster" est progressivement "absorbé" par le "cluster" le plus proche pour constituer un cluster d'ancrage destiné à être comparé avec les autres types cellulaires. Ainsi, un spectre A et un spectre D sont comparés avec le cluster d'ancrage des spectres B + C. Si on observe que le spectre A est plus "proche" de l'ensemble B + C que le spectre D, l'ensemble B + C est donc relié par une barre horizontale à une barre verticale reliant A à B+C. La distance séparant la barre verticale reliant A à l'ensemble B + C est plus importante que celle de la barre verticale reliant B et C. L'ensemble A + B + C qui en résulte est comparé à D et l'on voit que la barre horizontale qui lie D à l'ensemble A + B + C a une distance plus importante que les autres, ce qui signifie que le spectre D est le moins "proche" des spectres A, B et C. Cette représentation par fusions successives constitue un dendrogramme. Deux "clusters" réputés "proches" dans le dendrogramme montrent qu'ils partagent le maximum de pics en commun lorsqu'on les compare aux autres "clusters". Leur éloignement progressif signifie qu'ils partagent de moins en moins de pics en commun avec les autres clusters. Deux spectres B et C sont donc considérés comme les plus "proches" s'ils partagent le plus de pics en commun et si leurs barres horizontales sont les plus.
Compte tenu que toutes les conditions de réalisation d'un spectre ne sont pas totalement constantes, une variation d'intensité peut être obtenue sur l'ensemble d'un spectre. L'aire sous la courbe d'un pic étant dépendante de la largeur et de la hauteur du pic, elle est dépendante de son intensité. Il est donc nécessaire de normaliser le calcul de l'aire sous la courbe d'un pic. On entend par la « valeur normalisée de l'aire desdits pics », la valeur de l'aire sous la courbe du pic telle que calculée par intégration de toutes les intensités correspondantes à la région du pic, laquelle région est située entre la courbe du pic et une ligne droite passant par le premier et le dernier point d'inflexion (ligne de base du spectre = intensité relative de pic nulle), divisée par l'intensité moyenne du pic de même m/z dans l'ensemble des spectres de la classe N considérée. La description du mode de calcul se retrouve dans le manuel d'utilisation du logicile ClinProtool® 2.1 .Cette valeur normalisée y est appelée AveN dans le rapport de statistiques du logiciel ClinProtools® (Ave pour « average peak area/peak intensity ») qui est produit en fin d'analyse sous la forme d'un fichier compatible Excel : « ClinProstatistic.xml ».
Exemple 4 : Essais réalisés 1) Dans une première série d'expérimentations de test de détection d'infections bactériennes pulmonaires chez le rat, il avait été tenté de mettre au point un protocole permettant d'appliquer au tissu pulmonaire, la détection bactérienne par spectrométrie de masse MALDI-TOF déjà utilisée dans le laboratoire sur le sang et les urines. Les inventeurs se sont heurtés à un défaut de détection de spectres possiblement dû à une saturation du signal liée à la richesse cellulaire. A ce stade, il s'agissait d'échantillons brut de tissus broyés et dilués au l/40eme. L'application des protocoles de séparation des débris cellulaires de taille supérieure à 100 μιτι, selon la méthode décrite au paragraphe 2.2) ci-dessus, n'a pas permis d'améliorer la performance. Il a alors été testé plusieurs types de broyage tissulaire, avec plusieurs solvants (eau pure, chlorure de sodium, tampon type PBS), selon plusieurs protocoles de séparation rapide (augmentation des temps de centrifugation, protocole habituellement utilisé pour le sang, protocole habituellement utilisé pour les urines), sans succès. Finalement, contre toute attente, c'est en travaillant accidentellement sur un échantillon brut broyé et dilué dans l'eau 160 fois, mais sans séparation des débris tissulaires grossiers, que des spectres reproductibles et de qualité correcte ont pu être obtenus (figure 1) Sur la figure 1, les 4 profils du bas Al et Bl correspondant à des échantillons de broyât de tissus brut dilués dans l'eau distillée de poumons sains (Al) ou infectés (Bl) avec des bactéries (espèce : rat), et les 6 profils du haut A2 et B2 correspondent à différents protocoles d'extraction/sépration de broyats de poumons sains (Al) ou infectés (Bl) avec des bactéries (espèce : rat) Sur le poumon sain (Bl et Al) les deux méthodes permettent d'obtenir des pics. La reproductibilité des spectres sur poumon sain a pu être vérifiée pour chaque méthode par le logiciel Biotyper. En B2, la quasi absence de pics conduit à exclure ce spectre de toute possibilité d'analyse et le logiciel Biotyper ne peut identifier la bactérie dont la présence est connue du fait du dessin de l'expérience alors qu'en Bl, le même échantillon, traité sans méthode de séparation des débris tissulaires grossiers, permet d'obtenir des pics et donc d'interroger la base de donnée sur les bactéries. 2) Dans une 2eme série d'expériences les inventeurs ont testé différents milieux de dilution. Les meilleurs signaux ont été obtenus avec un broyât dans l'eau pure (figure 2). Il est possible que l'ajout de solvants au produit testé forme des adduits c'est-à-dire des ajouts d'ions sodium et potassium sur les protéines supposées être détectées ce qui tendrait à diminuer la sensibilité de la détection de la protéine.
Sur la figure 2, les spectres obtenus en spectrométrie de masse type MALDI-TOF à partir de broyats bruts d'un seul et même broyât de poumon d'un seul rat sain, dilué dans de l'eau pure, sont les spectres 1- 5 du haut et le dernier spectre en bas) et ceux avec un milieu électrolytique tamponné type PBS sont les spectres du cadre C.
On voit clairement à l'œil nu que le nombre de pics et donc la richesse de l'information sont plus importants avec l'eau pure et que chaque spectre est un calque de chacun des autres (1-4 et dernier spectres). En plus de représenter moins de pics, les spectres générés avec un broyât dans le PBS (cadre C) ne se ressemblent pas. Par exemple, on ne trouve aucun pic significatif sur le premier spectre du cadre. Ces similitudes ou différences entre les spectres visibles à l'œil sont confirmées par le logiciel Biotyper et ont été constatées sur plusieurs séries de contrôles. 3) Des dilutions supplémentaires dans de l'eau distillée ont montré l'amélioration de l'information (figure 3) La figure 3 représente des spectres obtenus à partir d'un même fragment de 200 mg de tissu pulmonaire infecté dilué 10 fois (concentrations de 20 mg/ml, Dl), 20 fois (concentrations de 10 mg/ml, D2) et 40 fois (concentrations de 5 mg/ml, D3). On voit clairement par l'observation des spectres, que le nombre, l'intensité et la gamme de masse où apparaissent des pics augmentent avec le facteur de dilution.
4) Dans une 3eme série d'expériences, les inventeurs ont tenté d'identifier les bactéries qu'elles soient déjà présentes dans le poumon du rat (pneumonies) ou qu'elles soient ajoutées à du poumon de rat sain a posteriori, soit au moment du broyage. On a échoué dans la détection de bactéries au sein d'un poumon de rat infecté au préalable (figure 4).
Sur la figure 4, les spectres obtenus sur broyât de poumon sain de rat (de dilution 1/160 et sans élimination des débris ni solubilisation protéique) sont les spectres 1-3 à partir du haut, les spectres avec d'échantillons de dit broyât avec une pneumonie à Acinetobacter Baumannii confirmée en culture (spectres 4-8) (dilution 1/160 et sans élimination des débris tissulaires grossiers ni solubilisation protéique) en comparaison avec le spectre obtenu d'après une colonie pure de la même bactérie (spectre 9 du bas).
On note une intensité importante des pics, leur nombre important, la séparation nette et leur faible empiétement, surtout dans la zone des m/z < 10 000 KD. Surtout, les spectres issus d'une même catégorie ont de nombreux pics en commun.
Il était ainsi possible de distinguer les spectres réalisés sur des broyats de poumon de rat, entre ceux provenant d'organe sain et ceux d'organe pathologique, tel que confirmé sur un dendrogramme (non représenté). Cette capacité de différentiation des spectres réalisés sur des broyats de poumon de rat, entre ceux provenant d'organe sain et ceux d'organe pathologique a été confirmée sur un modèle de poumon inflammatoire de rat non infecté mais exposé à une agression mécanique par la ventilation artificielle, comme illustré par le dendrogramme de la figure 5.
La figure 5 est une représentation par dendrogramme des différences entre les spectres obtenus à partir d'un poumon de rat sain (groupe du bas : A) et inflammatoire suite à un stress mécanique (groupe du haut : B).
Il a également été testé si le signal était différent selon que l'on travaillait sur un poumon entier ou un fragment. Pour cela, on a comparé les spectres obtenus en analysant le poumon droit et gauche, un poumon entier ou un fragment d'une même espèce. Sur poumon sain la taille de l'échantillon et sa localisation n'a pas modifié le résultat (non illustré ici).
5) Dans une 4eme série d'expérimentations, il a aussi été observé que la signature spectrale obtenue en spectrométrie de masse type MALDI-TOF sur un broyât de poumon dilué était spécifique d'espèce pour le rat, la souris et le mouton qui étaient les 3 espèces testées avec des pics discriminants dans la zone spectrale correspondant aux masses situées entre 7 000 et 8 500 D. p<0,001 (spectres non représentés). Il a été testé les poumons de plusieurs espèces de mammifères (rat, souris, mouton) y compris l'humain. Les échantillons pulmonaires ont été obtenus par biopsie pour l'homme. Ceux de mouton sont issus du commerce. Ceci a confirmé la spécificité d'espèce. Cette spécificité peut être représentée par un dendrogramme qui représente une arborescence dont les branches sont d'autant plus éloignées que l'analyse des données montre une différence (figure 6). A ce stade, on a noté une différence sur des échantillons humains issus d'un même patient. La recherche a posteriori de renseignements cliniques et des résultats histologiques a révélé qu'il s'agissait d'un fragment pulmonaire porteur d'une tumeur cancéreuse. L'idée est alors apparue que l'analyse rapide par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF non précédé d'une désalinisation ni d'extraction et purification des protéines pouvait permettre de détecter la présence de cellules cancéreuse dans un fragment de poumon et différencier ainsi un fragment sain d'un fragment tumoral.
La figure 6 représente un dendrogramme représentant les analyse des spectres obtenus avec des échantillons de poumons humains (A), de rat B, de mouton C, de souris D.
5) Dans une 5eme série d'expérimentations, on a analysé 32 paires de broyats d'échantillons de poumon dilués à environ 0,625 mg/ml dans l'eau distillée issus de fragments de poumons humains prélevés au cours d'une chirurgie thoracique pour tumeur cancéreuses du poumon. Les fragments étaient codés sans révéler lesquels (au nombre de 32) étaient prélevés au sein de la tumeur ni ceux (32) en zones saines. Les résultats bruts ont permis d'observer une séparation des profils spectraux en deux principaux groupes alors que 2 échantillons se rangeaient ailleurs. Plus précisément, un numéro de 1 à 32 était attribué à chaque fragment suivi du numéro 1 ou 2 selon qu'il était à priori prélevé en zone non tumorale (1) ou tumorale (2). Ainsi, une liste de 64 échantillons a été constituée comme suit : 1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3-1,3- 2....32-1, 32-2. L'ensemble a été conservé congelé tel quel à - 80°c. Un petit fragment (poids compris entre 0,010 et 0,3 grammes) de chaque échantillon a été initialement dilué dans une quantité d'eau égale à 10 fois son poids (dilutionl/10), à partir de quoi des dilutions par moitié ont été effectuées (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160). Certaines analyses ont été faites avec un broyât dilué à 1/80 ou à 1/160 sans élimination des débris tissulaires grossiers ni solubilisation des protéines. D'autres analyses ont été faites en appliquant la technique de séparation/solubilisation rapide au broyât dilué à 1/160. Les indications de numéro de patient (1 à 32), d'origine présumée du fragment (N pour zone saine/ non tumorale, C pour zone tumorale), de dilution (1/80, 1/160) et de technique (sans séparation, avec séparation selon la méthode standardisées pour les urines), ont été reportées manuellement sur les labels des spectres au moment de la création des images spectrales. Le fragment supposé tumoral a été labellisé C, le fragment supposé non-tumoral a été labélisé N. Deux fragments supplémentaires ont été ajoutés à la liste des 32 paires, labélisés ISM et 2 SM ou 33 et 34 et correspondant à des fragments de zone saines (non tumorales) de poumons de sujets aux poumons sains. Lorsque l'on a réalisé plusieurs essais avec une même technique, le numéro de l'essai a été indiqué entre parenthèse à partir du 2eme essai. Ainsi par exemple, les spectres générés lors du 2eme essai à partir du fragment supposé non tumoral du patient 5, réalisés à la dilution 1/160 avec séparation simple selon la méthode utilisée en microbiologie pour les urines est repéré selon l'appellation suivante : HL_5 N_1160 _U(2).
Lorsqu'on compare l'ensemble des spectres issus de ces 64 + 2 = 66 échantillons préparés et analysés selon la même méthode, on observe une séparation des profils spectraux en deux principaux groupes.
Le décodage a posteriori a révélé que les spectres correspondant aux fragments « cancéreux » (indexés C sur la figure 7) étaient regroupés sur le dendrogramme, de même ceux correspondant aux fragments non cancéreux (indexés N) sur la figure 7. Surtout, ces deux groupes étaient séparés par une distance témoignant d'une différence significative (figure 7). Sur la figure 7, le cadre A représente les spectres du Groupe avec prédominance de poumons non cancéreux.
La figure 7 représente un dendrogramme représentant les différences de profil spectral obtenu à l'analyse en spectrométrie de masse type MALDI-TOF sur broyât de poumons humains (2 fragments par patients). La levée de l'inconnue diagnostique a été réalisée a posteriori révélant un fragment cancéreux et un fragment sain pour la plupart des sujets et l'absence de cancer pour 3 sujets (diagnostic définitif = lpseudo-tumeur inflammatoire et 2 pneumopathies infectieuses). Sur la figure 7, on remarque que les 5 spectres de fragments de numéros 9C, 24C, 10C, 5C, 3C sont groupés au sein d'une majorité de N. Egalement, les numéros 12N et 9 N se trouvent au sein d'une majorité de C. L'origine de cette mauvaise répartition peut être due à une erreur de l'étiquetage du fragment au moment de son conditionnement, à une erreur sur le diagnostic à priori (le chirurgien a cru a tort que le fragment était sain par ex) ou à une absence de signature spectrale caractéristique de chaque classe. Toutefois, sur la base d'une majorité de regroupement des fragments tumoraux et non tumoraux entre eux, nous avons supposé que certains éléments du spectre pourraient probablement être dégagés comme signant une appartenance à chaque groupe.
Les défauts d'étiquetages ne pourront pas être corrigés. En revanche, il existe un diagnostic définitif de la nature de la tumeur qui a été révélé a posteriori tableau 1. Celui-ci a permis de dire que les fragments 24C et 3C étaient des tumeurs cancéreuses différentes des autre tumeurs car étant une métastase d'un cancer de langue et une métastase d'un cancer colique, pouvant expliquer leur répartition à distance du groupe des autres tumeurs de type cancer primitif sur le dendrogramme. Aucune explication par le diagnostic définitif n'a été possible pour les autres mal regroupés.
Tableau 1: liste des sujets à partir desquels les échantillons tumoraux et non tumoraux ont été prélevés. Le diagnostic du fragment tumoral porté d'après l'analyse histologique définitive est porté en colonne 2. L'origine cancéreuse pulmonaire primitive, métastatique ou non cancéreuse de la tumeur est indiquée en colonne 3 et résulte des données cliniques et histologiques définitives. patient type cellulaire cancéreux origine tumorale
1 carcinome épidermoïde Cancer Primitif pulmonaire
2 adénocarcinome Métastase cancer coligue
3 adénocarcinome Métastase cancer coligue
4 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
5 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
6 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
7 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
8 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
9 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
10 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
11 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
12 adénocarcinome Cancer Primitif pulmonaire
13 0 actinomycose
14 carcinome épidermoïde Métastase cancer œsophagien
15 carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire
16 léiomyosarcome Métastase léiomvosarcome
17 adénocarcinome Primitif pulmonaire
18 adénocarcinome Primitif pulmonaire
19 0 inflammatoire
20 adénocarcinome Primitif pulmonaire
21 adénocarcinome Métastase cancer coligue
22 carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire
23 adénocarcinome Primitif pulmonaire
24 carcinome épidermoïde Métastase cancer de langue
25 adénocarcinome Primitif pulmonaire
26 0 inflammatoire
27 carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire
28 adénocarcinome Primitif pulmonaire
29 adénocarcinome Primitif pulmonaire
30 carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire 31 Carcinome indifférencié Primitif pulmonaire
32 carcinome épidermoïde Primitif pulmonaire
En retirant de l'analyse les échantillons mal classés et les tumeurs non cancéreuses, le modèle a révélé une séparation nette en deux groupes .Sur la figure 8, le dendrogramme obtenu montre les spectres correspondant poumons sains dans le cadre A et les spectres d'échantillons cancéreux après élimination des mal classés et des tumeurs non cancéreuses dans le cadre B.
Sur le constat d'une majorité de regroupement des spectres issus des fragments pulmonaires tumoraux ensembles et non tumoraux ailleurs, il peut être escompté qu'il soit possible de diagnostiquer la nature tumorale d'une lésion d'un organe à partir du spectre obtenu à partir d'un fragment infime non soumis à une extraction protéique ou a un conditionnement complexe et sans imagerie. Pour vérifier cette hypothèse, il a été tenté de construire un modèle statistique performant permettant de faire le diagnostic de tumeur ainsi que du type de tumeur, sous réserve d'avoir établi au préalable une base de donnée représentative des spectres de chaque type de tissu sain ou tumoral pour au moins 3 grandes classes de lots de tumeurs : cancéreuse primitive, cancéreuse métastatique, tumeur non cancéreuse. Dans l'hypothèse où cela est vérifié pour le poumon, on peut en déduire que cela se vérifiera pour les autres tissus solides et pour davantage de sous-classes selon une précision diagnostique de plus en plus fine. L'application en serait la possibilité d'un diagnostic précis avec une sensibilité et une spécificité compatible avec une application clinique en tant qu'outil diagnostique ultra-rapide pour aide à la décision thérapeutique lors des exérèses chirurgicales.
Dans tous les cas on a observé que les deux spectres N et C pour chaque patient étaient distincts.
Ces résultats nous ont fait rechercher un système performant permettant de classer un fragment tissulaire en tant que tissu cancéreux ou non cancéreux avec une sensibilité et une spécificité compatible avec une application clinique en tant qu'outil diagnostique ultra-rapide pour aide à la décision lors des exérèses chirurgicales.
6) Méthode d'identification par homologie : utilisation du logiciel BioTyper® version 3.0
Le profil spectral est parfaitement superposable pour des analyses différentes réalisées à partir d'un même échantillon préparé dans les mêmes conditions. Ceci a permis de réaliser une banque de données selon le logiciel BIOTYPER® développé par le fabricant du spectromètre de masse MALDI-TOF : BRUKER DALTONICS®. Globalement, les spectres issus des analyses successives effectuées à partir des 32 paires d'échantillons cancer/non-cancer appariés à partir d'un même patient (n = 32 patients) ont été examinés. Une partie d'un sous-ensemble de spectres correspondant au diagnostic « non-cancéreux » a été archivée. De même pour créer la base de données « cancéreux ». La partie des spectres n'ayant pas servi à créer la base de données a été réservée pour les tests de confrontation future (interrogation de la base de donnée).
Plus précisément, on a constitué 2 bibliothèques de spectres ou banques de données, l'une tumeur l'autre non-tumeur. Le principe est d'introduire dans ces bases des spectres « valides » d'une série d'échantillons ayant un point commun. De nouveaux spectres pourront être ultérieurement confrontés à chaque base. Dans le cas présent, les nouveaux spectres seront ceux qui ont été générés à partir des mêmes échantillons que ceux de la base, mais qui n'auront pas servis à créer la base (spectres en réserve). Les exigences qualitatives des spectres et le besoin d'en avoir suffisamment pour la base et pour le test expliquent que l'on n'ait pu travailler que sur les spectres de 23 des 32 échantillons tumoraux et de 30 des 34 (32+ 2 issus de malades à poumons sains) échantillons non tumoraux, ce qui correspond à environ 200 spectres dans chaque base de données (200 pour la base poumon tumoral et 200 pour la base poumon non tumoral). En regardant a posteriori leur label, il s'est avéré qu'il pouvait s'agir de spectres d'échantillons traités avec toute technique (séparation ou pas) et pour 2 dilutions (1/80 et 1/160). Pour créer les deux banques, chaque donnée introduite est un spectre moyen (SM) de 70 pics (paramétrage par défaut), généré par le logiciel. Ainsi, à partir des 53 (23 + 30) échantillons, 53 spectres moyens de référence (SM) ont été créés. On a ici arbitrairement décidé de créer chaque spectre moyen à partir d'au moins 4 spectres choisis au sein de l'ensemble des spectres obtenus au cours des différentes expériences pour un même échantillon.
Le résultat de la confrontation informatique à ces banques de données, des spectres mis en réserve, a été rendu sous la forme d'un diagnostic tumeur/ non tumeur dont la pertinence est appréciée par un test statistique exprimé par un score de 0 à 3. Cette valeur statistique est définie par le fabricant via un algorithme spécifique à Brucker Daltonics®. Pour une valeur comprise entre 0 et 1,699, le spectre, donc l'échantillon dont il est issu, est exclu de toute similitude avec ceux de la base de données et rendu comme étant « inclassable ». Un score compris entre 1,700 et 1,999 suggère une similitude de degré moyen, un score supérieur à 2,0 permet une classification certaine comme appartenant au groupe trouvé dans la base de données. Sur ces critères, les spectres testés en aveugle ont été classées correctement pour 13/23 échantillons tumoraux et 18/30 échantillons non tumoraux. Les échantillons incorrectement classés sont repérés par un astérisque sur le tableau 2 ci-après. Une majorité d'erreurs de classement a pu être rapportée à l'introduction de spectres issus de la dilution 1/80 dans la base de données.
De façon intéressante, on observe que pour 4 des 10 erreurs de classement des échantillons tumeur, une origine particulière, métastase ou actinomycose était présente. Tableau 2 : résultats obtenus avec une classification par homologie en utilisant le logiciel Biotyper® selon le paramétrage par défaut (70 pics) et des bases de données tumeur et non-tumeur incluant des spectres issus de préparations différentes
ANALYSE DES ECHANTILLONS NON-TUMORAUX code patient Nombre de nombre de nombres de
de spectres spectres rendus spectres rendus
l'échantillon confrontés NON-CANCER CANCER inclassables
1 SM* 10 8 2
IN 12 10 2
2 SM* 14 6 8
2N 3 3 0
3N 4 4 0
5N 4 4 0
9N* 4 0 4
ION* 4 1 3
UN* 4 1 3
12N 4 4 0
13N 4 4 0
14N 4 4 0
15N 4 4 0
16N 5 5 0
17N 4 4 0
18N 4 4 0
19N* 7 4 2 1
20N 4 4 0
21N* 4 3 1
22N* 8 4 1 3
23N 4 4 0
24N* 7 5 2
25N 4 4 0
26N* 8 4 4
27N 4 4 0
28N 4 4 0
29N* 8 7 1
30N 4 4 0
31N* 7 6 1
32N 8 8 0 TABLEAU D'ANALYSE DES ECHANTILLONS TUMORAUX (Tumeur/NON tumeur)
En ne tenant en compte que d'une seule technique de préparation et une seule dilution et avec le paramétrage à 200 pics, il n'a pas été possible d'améliorer la classification par le modèle Biotyper®.
Une autre approche méthodologique a alors été décidée tel que rapporté ci-après.
7) Méthode d'identification par recherche des différences.
L'existence de tumeurs d'origine et de type cellulaire différentes au sein du panel testé a laissé supposer que la diversité des types tumoraux était à l'origine d'une inefficacité du système d'analyse (nombreux sous types de cancers). Il a alors été décidé de simplifier l'approche en réduisant le panel aux seules paires de tissus cancéreux/non-cancéreux correspondant à un cancer primitif pulmonaire (à l'exclusion des paires comportant des métastases et les tumeurs non cancéreuses). Une approche méthodologique complètement différente de la précédente a ainsi été mise en place, basée sur la recherche de différences entre les spectres.
Pour mettre en place un tel test de discrimination selon les deux critères primitif cancéreux/non cancéreux, le logiciel CLINPROTOOLS® RTC développé par la société BRUKER DALTONICS® permet d'identifier un groupe de pics sélectionnés à partir de plusieurs, ici de préférence 2, groupes d'échantillons, au sein d'un profil spectral. Ce groupe de pics est appelé ci-après « profil différentiel ».
Pour définir le « profil différentiel », le logiciel met en œuvre un algorithme génétique selon une méthode validée (J.H. Holland, adaptation in natural and artificial Systems, University of Michigan Press, Ann. Arbor. 1975). Par une méthode analytique complexe, cet algorithme va sélectionner un profil différentiel en comparant entre elles des listes de masses (m/z) générées de façon aléatoires à partir des spectres des deux catégories ou classes. Les critères supplémentaires de sélection des pics (autres que ceux établis pour définir la validité d'un pic, tels que décrits ci-dessus) pour créer la liste, peuvent être, pour certains, modifiés par l'opérateur et apparaissent sous la forme d'un rapport édité avec la liste en fin de génération de la liste. Les listes des masses correspondent à un ensemble de pics et sont enregistrées par leur valeur numérique de masse (m/z). Le logiciel interroge ensuite chaque spectre d'origine et établit le pourcentage de détection du profil différentiel. Après une première interrogation, la composition de la liste est modifiée de façon aléatoire par le logiciel et la nouvelle liste est testée à nouveau. Ainsi de suite jusqu'à obtenir le profil différentiel le plus performant possible. Plusieurs profils différentiels ont été générés grâce à ce logiciel. Le choix du nombre de pics donné en consigne au logiciel a été choisi par l'opérateur. Nous avons évalué pas à pas l'efficacité du modèle en testant n = 3, puis n'=n + l jusqu'à n'=20 vis-à-vis de 4 classes de tumeurs : métastases, tumeur non cancéreuse, cancer primitif et tissus sain en introduisant uniquement les spectres générés à partir d'échantillons traités selon la même méthode (dilution au 1/1606, élimination des débris tissulaires grossiers par centrifugation et solubilisation de protéines). Le premier est basé sur une recherche à partir de 5 pics, le second sur une recherche à partir de 11 pics.
Le premier profil différentiel comprend les 5 pics spécifiques N° 6, 17, 30, 87 et 103 aux valeurs de m/z respectives suivantes :
Tableau B
Moyenne de
l'aire du pic Moyenne de Déviation Déviation SI dans la l'aire du pic standard standard classe S2 dans la de SI dans de S2 dans
Test KW ou
M/z classe la classe la classe
Wilkoxon
NON CANCER NON CANCER TUMEUR PRIMITIF TUMEUR PRIMITIF
6853,33 < 0.000001 2,58 7,72 1,24 4,25
3488,16 0,103 43,54 46 25,23 43,32 8298,71 < 0.000001 0,35 0,81 0,25 0,71
3329,54 0,977 5,85 6,24 3,34 4,66
3711,08 0,102 4,45 4,8 2,22 4,48
Ce critère permet d'obtenir une détermination de cancer pulmonaire primitifs de classes adénocarcinome et carcinome épidermoïde à des degrés de différentiation variables avec une spécificité interne de 97,8% et une sensibilité interne de 96% quant à la présence de cancer.
La valeur de l'aire normalisée de chaque pic (tenant compte de son intensité) est comparée entre la classe cancer primitif S2 et non tumeur SI par un test statistique non paramétrique de type Kruskal- Wallis ou Wilcoxon dont une valeur <0,05 signifie que la différence est discriminante entre les classes. La répartition de la valeur dans l'ensemble de la classe est donnée par la déviation standard et l'intervalle de confiance à 95% selon les usages habituels en méthodologie statistique évaluant des populations plus ou moins hétérogènes. La sélection des pics par le logiciel ne sous-entend pas que le pic était toujours présent dans une ou l'autre classe.
Ainsi, lorsqu'un nouveau spectre unique complet issu d'un échantillon donné est analysé, les pics de la liste différentielle sont recherchés. Lorsqu'un des pics de la liste est présent, son aire sous la courbe et son intensité sont mesurées. Le spectre est ainsi analysé sur les critères de chacun des pics de la liste et le pic est classé comme appartenant à une classe à une autre selon ou est non classable. La classification est réalisée par le logiciel qui introduit le spectre dans l'algorithme sélectionné et établit la classification selon les règles de l'art décrit pour cet algorithme. Ainsi, en fonction du résultat, le spectre est affecté à la classe non tumeur ou à la classe tumeur.
La liste des pics différentiels du modèle 2 est présentée dans le tableau C. Pour information, la valeur de l'aire normalisée de chaque pic (tenant compte de son intensité) est comparée entre la classe cancer primitif (valeur d'aire S2) et non tumeur (valeur d'aire SI) par un test statistique non paramétrique de type Kruskal-Wallis ( test KW) ou Wilcoxon habituellement utilisés en statistiques et dont une valeur < 0,05 signifie que la différence est discriminante entre les classes. La répartition de la valeur dans l'ensemble de la classe est donnée par la déviation standard et l'intervalle de confiance à 95% et peut être éditée par un rapport à partir du logiciel ClinProtools®. La sélection des pics par le logiciel ne sous-entend pas que le pic était toujours présent dans une ou l'autre classe.
Tableau C
Compte tenu qu'un échantillon fait toujours l'objet de plusieurs spectres (4 à 10 dépôts pour un broyât par exemple), le diagnostic final à retenir devra tenir compte de l'ensemble des analyses de chaque spectre.
Ici, sur un ensemble d'analyses statistiques et d'analyses d'échantillons relatifs à des cancers pulmonaires primitifs toutes classes confondues (adénocarcinomes et carcinomes épidermoïdes et degrés de différenciations variables), le modèle 2 a permis, à partir des spectres mis en réserve sur cette série, d'affecter 99,33% des spectres issus des fragments tissulaires pulmonaires de type cancéreux à la classe cancéreux et tous les fragments tissulaires correspondant à une zone saine ont été bien classés. On remarque que les 3 pics de masse 3488,16/ 3329,54/3711,08 n'avaient pas une aire sous la courbe significativement différente entre les 2 classes. On a retiré ces pics du modèle et constaté que la performance diagnostique était maintenue.
Ce profil différentiel permet d'obtenir une détermination de la catégorie des cancers pulmonaires primitifs de classes adénocarcinome et carcinome épidermoïde à des degrés de différentiation variables avec une spécificité de 100% et une sensibilité de plus de 99,3%.
En conclusion, sur un ensemble d'analyses statistiques et d'analyses d'échantillons relatifs à des cancers pulmonaires primitifs toutes classes confondues (adénocarcinomes et carcinomes épidermoïdes et degrés de différenciations variables), le profil différentiel de 11 pics ci-dessus a permis d'affecter 100% des spectres en réserve issus de fragments pulmonaires de type cancéreux à la classe cancéreux et seul spectre issu des fragments correspondant à une zone saine a été affecté à la classe cancéreux, c'est-à-dire 99,3% de classification correcte pour le fragment non cancéreux).
La même approche a été réalisée sur les classes tout-cancer et tissu non tumoral/sain. Une liste de 15 pics, tous distincts de ceux de la liste précédente a été générée (Tableau A). Trois parmi ces pics ont une aire sous la courbe statistiquement non différente (p> 0,5) entre les 2 classes. Cependant, lorsqu'on les retire du modèle, la performance diagnostique s'effondre : leur maintien est nécessaire à la bonne classification. Ce modèle à 15 pics pour les classes tout-cancer et tissu sain à permis de classer correctement les tumeurs dans 100% des cas et le tissu sain dans 100% des cas également. Tableau A : liste des 15 pics différentiels permettant de classer un fragment pulmonaire dans la classe tumeur cancéreuse toute origine confondue (primitifs et métastase) ou dans la classe tissu non tumoral/sain
VALIDATION EXTERNE : 12 fragments sains de poumons additionnels provenant de patients différents de ceux ayant servis à déterminer les profils de référence ci-dessus, ont été testés (numérotés de 35 à 45). 4 dépôts pour chacun ont été réalisés à partir des broyats (4 spectres par échantillon). Tous les spectres de fragments sains ont été correctement classés sains par les 3 profils différentiels de 5, 11 et 15 pics, respectivement, sauf un fragment sain qui n'a été classé correctement par le modèle à 15 pics. L'analyse rapide par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, non précédée d'une technique d'extraction ni de purification permet, pour une pathologie donnée, de déterminer si un fragment tissulaire est porteur de la pathologie ou non.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détermination de la nature tumorale ou non tumorale ou du type de tumeur et/ou du type de cancer d'un fragment d'organe solide humain ou animal d'un individu donné, par analyse de spectre(s) de spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, ledit type de tumeur appartenant à au moins l'une des classes et sous-classes de tumeurs suivantes : a) la classe des tumeurs cancéreuses, b) la sous classe des tumeurs cancéreuses de type cancer primitif, c) la sous-classe des fragments cancéreux de type métastase, d) la classe des tumeurs non cancéreuses, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles :
1) on prépare un premier échantillon d'une suspension homogène de broyât de dit fragment d'organe comprenant un mélange pluricellulaire et/ou pluritissulaire de différents types de cellules entières non lysées, dilué de préférence dans de l'eau distillée, et
2) on réalise au moins un spectre d'au moins un dit premier échantillon et on analyse ledit spectre par comparaison avec au moins un profil de référence, ledit profil de référence étant constitué par au moins une liste de pic(s) de référence de spectre(s) établi(s) sur respectivement au moins un échantillon de référence de broyât de respectivement au moins un fragment de référence brut de même tissu d'au moins un individu, le(s) dit échantillon(s) de référence étant préparé(s) de manière identique audit premier échantillon, le(s) dit(s) fragment(s) de référence étant connu(s) pour être de nature tumorale ou non tumorale, ou, en cas de nature tumorale, étant connu(s) pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus, et
3) on détermine si ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment de tissu de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape 1), on réalise une dilution dans de l'eau distillée pour obtenir une suspension aqueuse d'une concentration de 0,05 à 5 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite suspension de dit broyât est débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι, de préférence supérieure à 50 μιτι, de préférence par centrifugation et récupération du surnageant et sans désalinisation de ladite suspension.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite suspension de broyât comprend un solvant de solubilisation de protéines, de préférence de l'acide formique et/ou de l'acétonitrile.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que :
- à l'étape 2), ledit profil de référence est constitué par un spectre complet d'un échantillon de référence de broyât d'un dit fragment de référence brut de même organe du même individu, ledit échantillon de référence étant préparé de manière identique au dit premier échantillon, ledit fragment de référence étant connu pour être de nature tumorale ou non tumorale, ou, en cas de nature tumorale, étant connu pour appartenir à l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) mentionnées ci-dessus, et
- à l'étape 3), on détermine que ledit fragment de tissu dudit premier échantillon est un fragment d'organe de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, lorsque le spectre dudit premier échantillon est identique audit spectre complet de référence dudit échantillon de référence .
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que :
- à l'étape 2), ledit profil de référence est constitué par une liste de pic(s) de référence, le nombre de pic(s) de référence étant inférieur au nombre de pics dudit spectre, de préférence de 1 à 20 pics, la liste de(s) dit(s) pic()s de référence constituant un profil de référence dénommé ci-après « profil différentiel » permettant de classer ledit spectre dudit premier échantillon comme provenant spécifiquement d'un fragment de nature tumorale ou non tumorale ou appartenant spécifiquement à au moins l'une desdites classes ou sous classes de de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire desdits pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon, et
- à l'étape 3), on détermine que ledit fragment d'organe dudit premier échantillon est un fragment d'organe de nature tumorale ou non tumorale ou appartient à une desdites classes ou sous-classes de tumeur ou de cancer (a) à (d) ci-dessus de tumeur, selon la présence ou l'absence desdits pics de référence et/ou selon la valeur de l'aire de(s) dit(s) pics de référence dans le spectre dudit premier échantillon.
7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (1) de la classe des fragments de tissus à tumeur cancéreuse et le groupe (2) de la catégorie des fragments de tissus non tumoraux, en fonction des valeurs d'aire des différents pics .
8. Méthode selon les revendications 6 et 7, caractérisée en ce que ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse et le groupe (1) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 15 pics de référence aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées SI et S2 suivantes , S2 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments de cancers et SI la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments non tumoraux pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι et comprenant un solvant de solubilisation de protéines :
Tableau A :
9. Méthode selon l'une des revendications 6 à 7, caractérisée en ce que ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la sous classe des fragments de tissus à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (1) de la catégorie des fragments de tissus non tumoraux en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics.
10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (1) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 5 pics spécifiques aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées SI et S2 suivantes, S2 représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments de cancers primitifs et SI la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments non tumoraux, pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι et comprenant un solvant de solubilisation de protéines:
TABLEAU B
11. Méthode selon la revendications 9, caractérisée en ce que ledit profil de référence permet de différentier les deux groupes comprenant le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif et le groupe (1) de la catégorie des fragments de poumons non tumoraux, ledit profil de référence comprenant au moins les 11 pics spécifiques aux valeurs de m/z et valeurs d'aire normalisées SI et S2 suivantes, SI représentant la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (1) des fragments non tumoraux et S2 la valeur moyenne d'aire normalisée du pic lorsque le pic appartient au groupe (2) des fragments à cancers primitifs, pour des échantillons de suspensions de broyats brut dilués à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, ladite suspension étant débarrassée des débris tissulaires de taille supérieure à 100 μιτι et comprenant un solvant de solubilisation de protéines:
Tableau C
12. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit profil de référence est un dit profil différentiel constitué par un nombre de 5 à 20 dits pics de référence dont la présence et les valeurs d'aire sous la courbe permettent de différentier les quatre groupes comprenant le groupe (1) de la sous classe des fragments d'organes de nature tumorale non cancéreuse, le groupe (2) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de cancer primitif le groupe, (3) de la classe des fragments de poumon à tumeur cancéreuse de métastase et le groupe (4) de la catégorie des fragments d'organes de nature non tumorale, en fonction des valeurs d'aire sous la courbe des différents pics.
13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit organe est un ganglion.
14. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit organe est une bronche.
15. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, 12, 13 et 14 caractérisée en ce que ledit profil différentiel est apte à différentier les sous classes additionnelles choisies parmi: - les sous-classes des cancers primitifs dudit organe de respectivement différents types cellulaire de cancer,
- les sous-classes de métastases provenant respectivement de différents organes voisins,
- les sous-classes de tumeurs non cancéreuses suivantes : tumeur inflammatoire infectieuse, tumeur inflammatoire non infectieuse, tumeur non inflammatoire infectieuse et tumeur non inflammatoire non infectieuse telle qu'un nodule.
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