EP2726878A1 - Procédé in vitro utilisant de la peau humaine pour évaluer l'influence des transporteurs abc - Google Patents

Procédé in vitro utilisant de la peau humaine pour évaluer l'influence des transporteurs abc

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EP2726878A1
EP2726878A1 EP12738535.9A EP12738535A EP2726878A1 EP 2726878 A1 EP2726878 A1 EP 2726878A1 EP 12738535 A EP12738535 A EP 12738535A EP 2726878 A1 EP2726878 A1 EP 2726878A1
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EP
European Patent Office
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skin
samples
inhibitor
absorption
human
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12738535.9A
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German (de)
English (en)
Inventor
Hanan OSMAN-PONCHET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
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Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP2726878A1 publication Critical patent/EP2726878A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
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Definitions

  • the invention describes an in vitro method using human skin of total thickness to evaluate the influence of ABC transporters (such as MDR1, MRP1, MRP2 or BCRP) on the uptake and distribution of topically applied drug substances. .
  • ABC transporters such as MDR1, MRP1, MRP2 or BCRP
  • ABC transporters are a family of complete membrane proteins found in all cells of all species of archaea, eubacteria and eukaryotes. Methods for evaluating the influence of ABC transporters (such as MDR1, MRP1, MRP2 and / or BCRP) on the uptake and delivery of topically applied drug substances have been described, but are not optimal. summary
  • Exemplary embodiments provide an in vitro method using human skin to evaluate the influence of cutaneous ABC transporters on the uptake and delivery of topically applied drug substances.
  • the method generally comprises the following steps:
  • ABC transporter proteins control the transport of molecules, ranging from small ions to drug substances, lipids and proteins, through cell membranes.
  • the human genome codes for 48 genes of ABC transporters.
  • ABC transporters Most of the 48 human ABC transporters play a role in the export of physiological substrates (amino acids, peptides, lipids, inorganic ions, etc.) and of these, nine are associated with a multiple resistance phenotype (MDR). due to their ability to extrude from the cells a wide variety of xenobiotic substances. These are P-glycoprotein (ABCB1, P-gp or MDR1), multiple resistance proteins or MRP (MRP1-MRP7, also referred to as ABCC1 -6 and ABCC10) and cancer resistance protein. breast cancer or BCRP (ABCG2).
  • ABSB1 P-gp or MDR1
  • MRP1-MRP7 multiple resistance proteins
  • cancer resistance protein breast cancer or BCRP
  • MDR1 or P-gp are widely distributed in the body [Thiebaut F, Tsuruo T, Hamada H, et al. Cellular localization of the multidrug resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987; 84: 7735-8.], They also play an important role in modulating uptake, tissue distribution and removal of their substrates. As a result, ABC MDR transporters are considered to be major players in the pharmacokinetics of several drug substances, which may in turn modulate their pharmacological activity or toxicity.
  • the ABC transporter extracellularly transfers the drug substances by coupling with them and regulates the disposition profile of the drug substances (effective drug concentration in the drug). absorption, distribution, metabolism, excretion, location on target), which in turn determines the total pharmacological effect of drug substances.
  • an ABC transporter which is expressed in intestinal epithelial cells and in cerebral vascular endothelial cells, has a great influence on the bioavailability of orally administered drug substances and on the migration of drug substances. to the central nervous system.
  • MRP1 Multi-resistance or MRP-associated proteins have been reported to be expressed in normal human epidermal keratinocytes (NHEKs), the function of which is unclear [Baron J M, Holler D, Schiffer R et al. J Invest Dermatol, 2001; 116; 541-548.], And MRP1 was the most highly expressed among the drug transient genes analyzed by real-time PCR in human skin [Smith G, Dawe R
  • MDR1 mRNA More recently, using the same real-time PCR analysis, the expression of MDR1 mRNA demonstrated that it was up to 360-fold higher in complete human skin specimens compared to expression in NHEKs. Strong expression of MDR1 mRNA was particularly detected in the human dermis (300 times higher than that in NHEK), whereas epidermal mRNA expression was only slightly greater (12-fold) in the expression in NHEKs [Shazik C, Wenzel J
  • ABC transporters would function in a viable skin layer (viable dermis and epidermis) but not in the stratum corneum, which is composed of dead cells.
  • an exemplary embodiment provides an in vitro method using full thickness human skin to evaluate the influence of cutaneous ABC transporters, such as MDR1, MRP1, MRP2 and / or BCRP, on absorption. and the distribution of drug substances applied topically.
  • cutaneous ABC transporters such as MDR1, MRP1, MRP2 and / or BCRP
  • the method generally comprises the following steps: (1) Prepare ex vivo human skin samples of total thickness, without subcutaneous fat, and maintain skin samples under organ culture conditions, preferably at 37 ° C for a duration of 1 minute at 72 hours;
  • step (3) contacting a second skin sample (control) with the vehicle under organ culture conditions, preferably for the same duration as that of step (2);
  • Skin samples come from both men and women. They can be obtained from abdominal or mammary tissues, but also from other anatomical sites of the body.
  • Fresh or frozen skin samples may be used. Preferably, fresh skin samples are used since the activity of ABC transporters and other enzymes is better preserved.
  • fresh skin samples we mean skin samples obtained just after excision of the skin, up to about 24 hours after excision, preferably about 4 hours after excision.
  • the skin samples can be maintained under organ culture conditions for up to about 72 hours after excision and before the method of evaluating ABC transporter involvement begins. Samples of healthy skin as well as skin with lesions are used. The subcutaneous fat of the skin is gently removed by dissection before using it in the process.
  • Skin samples of total thickness can be used without any treatment of the stratum corneum, the outermost layer of the skin which acts as a barrier impermeable to hydrophilic or high molecular weight drug substances.
  • skin samples can be used after reducing or interrupting the stratum corneum, in order to control the barrier properties of this layer and to increase the penetration of the drug substance.
  • the first step (1) of the method after excision of the human skin sample and removal of the subcutaneous fat, pieces of skin (2 X 2 cm or less) are cut and placed, dermal face down in a Transwell® insert housed inside the well of a multi-well culture plate.
  • the support on which the human skin samples are placed is a permeable support with microporous membranes.
  • the membrane used is made of a polycarbonate material but other membrane materials can be used.
  • Such carriers are marketed by Corning as Transwell® but other similar devices available on the market can be used in this step.
  • the Transwell® insert used can be adapted to a 6-well, 12-well or 24-well plate.
  • the wells are pre-filled with an appropriate volume of long-lasting skin culture medium.
  • the volume of medium varies from 2.0 mL to 0.2 mL.
  • a cylinder preferably made of glass but which may also be made of another suitable material, is placed at the top of the skin sample for the purpose of delimiting the surface to be treated of the skin sample.
  • the surface to be treated depends on the size of the cylinder used, which is in turn adapted to the size of the insert used.
  • the skin surface to be treated varies from about 0.125 cm 2 to about 3 cm 2 .
  • the Transwell® plate is placed on an orbital shaker and maintained under organ culture conditions.
  • organ culture conditions we understand a culture temperature of from about 32 ° C to about 38 ° C, preferably about 37 ° C, with a CO 2 concentration ranging from about 4% to about about 10% of preferably about 5%, and with saturated hygrometry in an incubator for cell culture.
  • diffusion cells such as Franz scattering cells
  • diffusion cells such as Franz scattering cells
  • Skin sections were mounted on glass diffusion cells, with nominal areas of about 1 or 2 cm 2 and recipient compartments having capacities of 3 ml.
  • the epidermal surface of the skin is exposed to atmospheric conditions while the dermal surface is immersed in a long-lasting skin culture medium.
  • the culture medium is maintained at about 30 ° C to about 38 ° C, preferably at about 32 ° C, by a water jacket controlled by a water bath.
  • Constant agitation of the receiving fluid is maintained by magnetic stirring at about 500 rpm. Care is taken to remove any air bubbles between the lower surface of the skin (dermis) and the culture medium in the recipient compartment.
  • the pieces of skin are placed on a filter paper and supported by cork plates.
  • the skin samples are stretched to their original size and fixed with pins.
  • the Dermaroller® for example a CIT8 model with 500 ⁇ needle lengths, is rolled in four directions on the surface of the skin, exerting pressure with the hand on it.
  • a specific inhibitor of an ABC transporter solubilized in a vehicle, is applied to the surface of the first skin sample.
  • Several inhibitors may be used depending on the ABC transporters studied. Examples of ABC transporter inhibitors are shown in Table 1 but are not restricted to this list.
  • Verapamil an ABCB1-specific inhibitor (P-gp or MDR1)
  • P-gp or MDR1 an ABCB1-specific inhibitor
  • a vehicle consisting of, for example, ethanol / 0 NaCl, 9% (25/75, v / v) approx.
  • Skin samples are treated with 10 ⁇ -Jcrm 2 about a solution of Verapamil to about 10 mM for about 30 minutes.
  • the incubations are preferably conducted at about 37 ° C with 5% CO 2 on an orbital shaker in a humidified incubator for about 30 minutes.
  • various skin samples (same skin surface treatment, intact, pickled or Dermaroller® passed) are treated with the vehicle at approximately 10 ⁇ - ⁇ m 2 , for example consisting of 0.9% ethanol / NaCl (25/75, v / v) for about 30 minutes. These samples are used as control samples without inhibitor.
  • a drug substance is applied to both the first skin sample (with inhibitor) and the second skin samples (controls) (without inhibitor).
  • the drug substance that is used to evaluate the involvement of ABC transporters in its skin absorption and distribution may be a fluorescent compound, a radiolabelled compound or an unlabeled compound.
  • This drug is used at an appropriate concentration, generally ranging from about 0.01 mM to about 100 mM, in a suitable vehicle depending on the characteristics of the drug substance being tested.
  • the skin samples are treated with a defined volume / amount of drug for a period of time, preferably about 1 hour to about 72 hours. hours and, preferably, approximately 16 hours.
  • the receiving fluid is collected, analyzed immediately or stored at an appropriate temperature (between + 4 ° C and -80 ° C) before being analyzed.
  • the amount of drug that has reached the receiving fluid is then determined with the appropriate analyzer.
  • HPLC with UV, fluorescence, radioactive, or mass spectrometry detection can be used to measure the amount of drug in the receptor fluid.
  • the radioactivity in the receiving fluid is analyzed by liquid scintillation counting.
  • the fluorescence intensity in the receiving fluid is measured directly with a microplate spectrofluorometer.
  • the receiving fluid can be analyzed directly without any extraction procedure.
  • an extraction step may be performed prior to the analysis of the receiving fluid.
  • the amount of drug dispensed into the skin is determined. The excess drug is removed by wiping the skin with 5 cotton swabs impregnated with a suitable solvent.
  • stripping of skin samples may be performed using 6 adhesive strips. Skin samples are frozen at -80 ° C before analysis.
  • frozen skin samples are cut into small pieces, fixed on a pre-cooled microtome sample holder.
  • the skin is cut perpendicular to the surface into sections about 5 to 10 m thick using a cryomicrotome. In some cases, cuts may be made parallel to the surface of the skin.
  • Skin sections, cut perpendicularly to the skin surface, are analyzed by autoradiography or micro-autoradiography, in the case of a radio-labeled drug substance, or by confocal or epifluorescence microscopy in the case of a substance. fluorescent drug.
  • Skin sections cut parallel to the surface of the skin are analyzed by liquid scintillation count, in the case of a radiolabelled drug substance, or by HPLC with a suitable detection mode after extraction of the drug substance from the drug sections. skin.
  • a comparison is made of the level of absorption of the drug substance in the first skin sample (with inhibitor) with that of the control skin sample (without inhibitor).
  • the amount of drug that has reached the receptor fluid (absorption) in the skin samples treated with both the ABC transporter inhibitor and the drug is compared to that in skin samples treated with the drug alone. If the lowest amount of drug is seen in skin samples treated with the ABC transporter inhibitor, this indicates that the ABC transporter is involved in dermal absorption of the drug substance. If no difference is observed between the two conditions (with and without inhibitors), this indicates that dermal absorption is not related to ABC transporters.
  • Topically applied medicinal substances are generally used in the treatment of cutaneous diseases.
  • topically applied drugs may also be used in the treatment of other unrelated skin disorders in which a systemic route could not be used.
  • systemic treatments are used in the treatment of skin diseases.
  • Topical ointments are usually prescribed to decrease the
  • Topical and prescription remedies are available for viral skin diseases.
  • mice Microscopic fungi are the cause of fungal infections.
  • Candida, athlete's foot and ringworm are all viral infections.
  • Treatments may include oral medications, topical ointments, powders and oral antiseptics.
  • Treatment may involve antibiotics for drainage of the area or, in extreme cases, removal of the infected area.
  • Basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma and melanoma are types of cancerous skin diseases. Skin lesions or spots that change shape or color are signs of skin cancer.
  • topically applied drug substances used for the treatment of skin diseases are listed below:
  • Cortisone retinoids derived from vitamin A, vitamin D analogues, salicylic and lactic acids.
  • Impetigo Erythromycin and mupirocin.
  • a reverse transcription reaction was then performed in a total volume of 20 ⁇ l, using a high capacity Master Mix RNA to cDNA mixture provided by Applied Biosystem.
  • the expression of the ABCB1, ABCC2, ABCC1 and ABCG2 genes was analyzed in duplicate by real-time PCR, using specific sense and antisense primers and a TaqMan probe provided by Applied Biosystem.
  • the GAPDH gene has been used as a housekeeping gene to normalize the expression of each gene.
  • Figure 1 shows the amplification curve of ABCB1, ABCC1, ABCC2 and ABCG2 in ex vivo human skin maintained in organ culture for 72 hours shows the amplification curve of each amplified gene in human skin.
  • Figure 2 expression of ABC transporters in ex vivo human skin maintained in organ culture for 72 hours shows the relative expression of each gene compared to the ABCC1 gene encoding MRP1 in human skin organoculture.
  • Figure 3 expression of ABC transporters in human hepatocytes maintained in primary culture for 96 hours shows the relative expression of each gene compared to the ABCC1 gene encoding MRP1 in human hepatocytes in primary culture.
  • Figure 4 shows the relative expression of the gene encoding MRP1 in human skin as compared to human hepatocytes.
  • the expression of the ABCC1 gene coding for the MRP1 transporter is very high compared to the genes coding for MDR1, MRP2 and BCRP, for which the expression is relatively weak.
  • the expression of the gene coding for MRP2 is the highest compared to other genes whereas in human skin it is the expression of the gene coding for MRP1 which is the highest.
  • the comparison of the expression of the gene coding for MRP1 in the skin and in the hepatocytes reveals that the expression of the gene coding for MRP1 is 15 times higher in human skin than in hepatocytes.
  • the insensitive water loss (TEWL) was measured using a Tewameter TM 300® (Courage & Khazaka electronic GmbH, Germany) with an open measuring chamber.
  • the skin samples were mounted on a glass diffusion cell (nominal area of 1 or 2 cm 2 and recipient compartment with capacities of 3 mL).
  • the epidermal surface of the skin was exposed to atmospheric conditions while the dermal surface was in contact with the receiving fluid (long-lived skin culture medium (Biopredic, France) maintained at 32 ° C).
  • the initial TEWL was measured in triplicate (three skin samples).
  • skin samples were removed from the diffusion cells, fixed onto cork plates and stripped or pierced as described above. above. After stripping or puncturing, the skin samples were again placed on the diffusion cells and the TEWL was measured at appropriate time intervals, over 19 hours and 25 hours for dermaroller and stripping respectively.
  • Figure 5 (effect of stripping on TEWL in ex vivo human skin samples) shows the effect of stripping on TEWL and Figure 5 (effect of dermaroller on TEWL in samples of human skin ex vivo) presents the effect of the dermaroller on TEWL.
  • Vinblastine model substrate molecule was used throughout this experiment. Vinblastine is known to be a specific substrate for MDR1.
  • Verapamil The inhibitory model Verapamil molecule was used throughout this experiment. Verapamil is known to be a specific inhibitor of MDR1. Tritium-labeled vinblastine was used. An isotopic solution of [ 3 H] -vinblastine was prepared with a final concentration of 10 mM in methanol (1 mCi / mL).
  • Verapamil was prepared with a final concentration of 10 mM in the vehicle consisting of ethanol / 0.9% NaCl (25/75, v / v).
  • the vehicle used to treat the control skin samples was ethanol / 0.9% NaCl (25/75, v / v).
  • the skin samples were first treated with the verapamil inhibitor solution. To do this, 20 ⁇ l of verapamil solution were applied to the surface of skin samples using a micropipette, corresponding to 10 Ucm 2 of cutaneous surface. The duration of the treatment with the inhibitor was 30 minutes.
  • control samples were treated with the vehicle of the inhibitor used, consisting of ethanol / 0.9% NaCl (25/75, v / v).
  • vehicle of the inhibitor used consisting of ethanol / 0.9% NaCl (25/75, v / v).
  • 20 ⁇ of the vehicle were applied to the surface of skin samples, using a micropipette.
  • the duration of the treatment with the inhibitor was 30 minutes.
  • both control and inhibitor-treated skin samples were treated with [ 3 H] -vinblastine solution.
  • the isotopic solution of [ 3 H] -vinblastine at 10 mM was diluted 4 times in 0.9% NaCl, reaching a final concentration of 2.5 mM. Twenty microliters of this diluted solution were applied to the surface of each skin sample, corresponding to 10 ⁇ _ / ⁇ - ⁇ 2 .
  • the duration of treatment with vinblastine was 16 hours.
  • the receptor fluid was analyzed by liquid scintillation counting to measure the amount of Vinblastine that reached the receiving fluid (absorption).
  • the distribution of Vinblastine in the skin was analyzed by autoradiography. Skin samples were placed on a tissue holder and cryo-mounted in embedding medium for cryo-montages. The frozen blocks were sliced in sections 8 to 10 ⁇ thick, perpendicular to the surface of the epidermis, in a cryomicrotome (Thermo Electron). The sections were collected on glass slides and dried. The cryo-sections were placed on a Low-III Fuji imaging plate (20 x 40 cm) in a Fujix Bas 2040 cassette for 24 hours up to 5 days. The exposed plate was scanned with a Bio-lmaging analyzer (Fujix BAS 2000). The scanned images were analyzed using TINA software.
  • in vitro dermal absorption of vinblastine was performed on intact skin samples without any adhesive stripping or dermaroller perforation. In other experiments, in vitro dermal absorption of vinblastine was performed on skin samples striped with adhesive strips (30 strips) or skin that had been dermarolled (32 roller passes).
  • pieces of skin of a suitable surface were placed on a filter paper and supported by cork plates.
  • the skin samples were stretched to their original size and fixed with pins.
  • the surface of the skin was pickled with 30 pieces of tape.
  • the adhesive tape was of sufficient size to cover the entire surface of the skin to be in contact with the test compound.
  • pieces of skin of a suitable surface are placed on a filter paper and supported by cork boards. In order to avoid a shrinkage of the total thickness of the skin, the skin samples are stretched to their original size and fixed with pins.
  • the Dermaroller® model CIT8 was rolled in cycles of eight times, exerting pressure with the hand on it, in four directions on the skin surface (32 passes).
  • the Dermaroller was supplied by DISTRIMED SARL, Germany.
  • the CIT8 model was used.
  • the CIT8 model has 24 circular arrangements of 8 needles each, 500 ⁇ long (192 needles in total) in a cylindrical assembly, the cylinder being 2 cm in diameter and 2 cm in length.
  • the in vitro dermal absorption experiments of vinblastine with intact skin and strip-etched skin samples were performed on glass diffusion cells, with a nominal area of 2 cm 2 and receptor fluid capacities of 3 mL.
  • the treatment volume of the cutaneous surface was 20 ⁇ l, corresponding to 10 Ucm 2 .
  • Figure 7 (cutaneous absorption of vinblastine in intact skin as well as in skin that has been stripped and dermaroller-treated) shows the effect of a cutaneous treatment on the cutaneous absorption of Vinblastine by human skin.
  • Figure 8 (cutaneous distribution of vinblastine in untreated and pickled human skin samples, analyzed by skin section autoradiography) shows the distribution of Vinblastine in untreated and pickled human skin, analyzed by autoradiography.
  • Figure 9 (effect of verapamil on cutaneous absorption of Vinblastine in intact human skin samples) shows the effect of verapamil on the uptake of Vinblastine by human skin in intact human skin samples.
  • Figure 10 shows the effect of verapamil on the uptake of Vinblastine by human skin in human skin samples taken with dermaroller.
  • the dermal absorption of vinblastine is very low and represents only 0.001% of the applied dose (corresponding to 0.003 nmol).
  • the stripping and perforation of the skin with a dermaroller significantly increase the skin absorption of vinblastine.
  • dermal absorption of vinblastine represented 0.07 nmol and 0.6 nmol in the skin that had been stripped and dermarolled, respectively. This implies that strip stripping increased the dermal absorption of vinblastine by about 20-fold and that skin perforation by the dermaroller increased the dermal absorption of vinblastine by about 200-fold.
  • Rhodamine 123 was used throughout this experiment. Rhodamine 123 is known to be a substrate of MDR1.
  • Rhodamine is a fluorescent molecule.
  • a solution of Rhodamine 123 was prepared with a final concentration of 2.5 mM in 25% DMSO.
  • Verapamil was prepared with a final concentration of 10 mM in the vehicle consisting of ethanol / 0.9% NaCl (25/75, v / v).
  • the vehicle used to treat the control samples was ethanol / 0.9% NaCl (25/75, v / v).
  • the skin samples were first treated with the verapamil inhibitor solution. To do this, 20 ⁇ l of verapamil solution were applied to the surface of skin samples, using a micropipette, corresponding to 10 Ucm 2 of cutaneous surface. The duration of the treatment with the inhibitor was 30 minutes.
  • control samples were treated with the vehicle of the inhibitor used, consisting of ethanol / 0.9% NaCl (25/75, v / v).
  • vehicle of the inhibitor used consisting of ethanol / 0.9% NaCl (25/75, v / v).
  • 20 ⁇ of the vehicle was applied to the surface of skin samples using a micropipette.
  • the duration of treatment with the vehicle was 30 minutes.
  • both control and inhibitor-treated skin samples were treated with Rhodamine 123 solution.
  • 20 ⁇ l of Rhodamine 123 2.5 mM were applied to the surface of each skin sample, corresponding to 10 Ucm 2 .
  • the duration of treatment with Rhodamine 123 was 16 hours.
  • SYNERGY 2 Biotech
  • the excitation and emission wavelengths were 485 and 590 respectively.
  • the analysis was performed with Gen5 software.
  • the distribution of Rhodamine 123 in the skin was analyzed by epifluorescence microscopy. Skin samples were placed on a tissue holder and cryo-mounted in embedding medium for cryo-montages. The frozen blocks were sliced in sections of 4 to 10 ⁇ thick, perpendicular to the surface of the epidermis, in a cryicrotome (Thermo Electron). The sections were collected on glass slides and dried. Cryo-sections were studied under an epifluorescence microscope with a TRITC filter (eclipse, 80i L, Nikon). The microscope, equipped with a digital camera (DS-5M-LI, Nikon), was used for image capture.
  • Figure 11 shows the effect of verapamil on cutaneous absorption of Rhodamine 123 in human skin samples.
  • Rhodamine 123 in vitro dermal absorption of Rhodamine 123 was very low and accounted for about 0.4% of the applied dose. However, compared with skin absorption of Vinblastine in intact skin samples, in which dermal absorption accounted for only 0.001% of the applied dose, Rhodamine 123 could be considered well absorbed.
  • Figure 12A Cutaneous section of a control skin sample without any treatment (without Rhodamine) showing the basic level of autofluorescence.
  • Figure 12B Skin section of a skin sample treated with Rhodamine 123 showing an increase in red fluorescence due to Rhodamine 123.
  • Rhodamine 123 is distributed mainly in the upper layers of the skin section, corresponding to the epidermis and the stratum corneum. Compared with the control skin section, an increase in dermal fluorescence can also be observed, indicating that Rhodamine 123 is also distributed in the dermis, but to a lesser extent. These results are consistent with the results shown in Figure 9, indicating that Rhodamine 123 has been absorbed into the receiving fluid.
  • Example 4 and Example 5 show that the cutaneous absorption of Vinblastine and Rhodamine 123, two substrates of the ABC transporters, was inhibited by Verapamil, an inhibitor of the ABC transporter. This indicates that ABC transporters of the skin, mainly MDR1, are involved in the human skin absorption and distribution of Vinblastine and Rhodamine 123.
  • Leukotriene-C4 model substrate molecule (LTC4) was used throughout this experiment.
  • Leukotriene-C4 is known to be a physiological substrate of the MRP1 transporter.
  • the inhibitory molecule model MK571 was used throughout this experiment.
  • MK571 is known to be a specific inhibitor of MRP1.
  • Tritium labeled LTC4 was used.
  • the concentration of the LTC4 solution used was 68.5 nM (0.01 m Ci / m L).
  • MK571 was prepared with a final concentration of 2 mM in water.
  • the vehicle used to treat the control skin samples consisted of 100% water.
  • the skin samples were first treated with MK571 inhibitor solution. To do this, 10 ⁇ of MK571 solution were applied to the surface of skin samples, using a micropipette, corresponding to 10 ⁇ / ⁇ 2 of cutaneous surface. The duration of the treatment with the inhibitor was 30 minutes.
  • control samples were treated with the vehicle of the inhibitor used, constituted.
  • 10 ⁇ of water was applied to the surface of skin samples using a micropipette.
  • the duration of treatment with the vehicle was 30 minutes.
  • both the control and the inhibitor-treated skin samples were treated with the LTC4 solution.
  • 10 ⁇ l of the 68.5 nM LTC4 solution were applied to the surface of each skin sample, corresponding to 10 Ucm 2 .
  • the duration of treatment with LTC4 was 6 hours.
  • the receiving fluid was analyzed by liquid scintillation counting to measure the amount of LTC4 that reached the receiving fluid (absorption).
  • LTC4 The distribution of LTC4 in the skin was analyzed by autoradiography.
  • the experimental conditions are identical to those described previously for Vinblastine.
  • Figure 14 (cutaneous distribution of LTC4 in skin samples analyzed by skin section autoradiography) shows the distribution of LTC4 in human skin with and without treatment with MRP1 inhibitor MK571, analyzed by autoradiography.
  • the result shows that, in human skin samples, cutaneous absorption of LTC4 was significantly reduced by MK571 treatment (t-test, p ⁇ 0.05). In fact, the absorption of LTC4 was reduced by about 17% by MK571 applied topically. Since MK571 is a specific inhibitor of the MRP1 transporter, this result suggests that the MRP1 transporter is involved in the cutaneous absorption of LTC4.
  • the results of the distribution of LTC4 analyzed by autoradiography show that, in skin sections without treatment with the inhibitor, a radioactive signal related to LTC4 is observed in the highest part of the skin section corresponding to the epidermis. No signal was observed in the deeper layers.
  • a human skin sample (woman, 75 years old) from a facelift was used to study the location of the MRP1 transporter by immunohistochemistry.
  • Skin biopsies were included in cryomatrix (Shandon Thermo) and serial sections of 4 ⁇ thickness were made by cryomicrotome. Cryocuts were collected on glass slides (superfrost plus Thermo, 1.0mm 25x75) and stored at -20 ° C.
  • the primary MRPm6 (Tebu-bio) antibody against MRP1 was used. It is a monoclonal antibody produced in mice with a concentration of 500 ⁇ g ml. The primary antibody was used at a 1/100 dilution (5 ⁇ g / mL).
  • MRP1 transporter is well detected in the skin, and is mainly located in the appendages of the dermis (sweat glands, hair follicles, smooth muscles). Similar results with MDR1 have been reported recently (Skazik C. et al., 201 1) showing preferential localization at the level of the dermis. The location of MRP1 at the level of the appendages, in particular at the level of the hair follicles is in favor of a role of this transporter MRP1 in the cutaneous absorption.

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Abstract

L'invention décrit un procédé in vitro utilisant de la peau humaine d'épaisseur totale pour évaluer l'influence des transporteurs ABC (tel que MDR1, MRP1, MRP2 ou BCRP) sur l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique.

Description

Procédé in vitro utilisant de la peau humaine pour évaluer l'influence des transporteurs ABC
L'invention décrit un procédé in vitro utilisant de la peau humaine d'épaisseur totale pour évaluer l'influence des transporteurs ABC (tel que MDR1 , MRP1 , MRP2 ou BCRP) sur l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique.
Contexte
Les transporteurs de cassettes de liaison à ΓΑΤΡ (ABC) sont une famille de protéines membranaires complètes présentes dans toutes les cellules de toutes les espèces d'archées, d'eubactéries et d'eucaryotes. Des procédés destinés à évaluer l'influence des transporteurs ABC (tel que MDR1 , MRP1 , MRP2 et/ou BCRP) sur l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique ont été décrits, mais ne sont pas optimaux. Résumé
Des modes de réalisation exemplaires proposent un procédé in vitro utilisant de la peau humaine pour évaluer l'influence de transporteurs ABC cutanés sur l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique.
Le procédé comprend en général les étapes suivantes :
(1 ) Préparer ex vivo des échantillons de peau humaine et maintenir les échantillons de peau dans des conditions de culture d'organes ;
(2) Mettre en contact un premier échantillon de peau avec un inhibiteur spécifique d'un transporteur ABC solubilisé dans un véhicule, dans des conditions de culture d'organes ;
(3) Mettre en contact un deuxième échantillon de peau (témoin) avec le véhicule, dans des conditions de culture d'organes ;
(4) Mettre en contact à la fois les échantillons de peau témoins et ceux traités avec l'inhibiteur du transporteur ABC avec une substance médicamenteuse, dans des conditions de culture d'organes ;
(5) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse recueillie dans le liquide récepteur (absorption) après pénétration à travers la peau ;
(6) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse située dans les échantillons de peau (distribution) ; et (7) Comparer le niveau d'absorption de la substance médicamenteuse dans le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) avec celui de l'échantillon de peau témoin (sans inhibiteur).
La grande majorité des protéines transporteurs ABC contrôlent le transport de molécules, allant de petits ions à des substances médicamenteuses, lipides et protéines, à travers les membranes cellulaires. Le génome humain code pour 48 gènes de transporteurs ABC.
La plupart des 48 transporteurs ABC humains jouent un rôle dans l'exportation de substrats physiologiques (acides aminés, peptides, lipides, ions inorganiques, etc.) et, parmi ceux-là, neuf sont associés à un phénotype de résistance multiple (MDR), dû à leur faculté à extruder hors des cellules une grande variété de substances xénobiotiques. Celles-ci sont la glycoprotéine P (ABCB1 , P-gp ou MDR1 ), les protéines associées à une résistance multiple ou MRP (MRP1 -MRP7, auxquelles on se réfère aussi comme ABCC1 -6 et ABCC10) et la protéine de résistance au cancer du sein ou BCRP (ABCG2).
Comme les transporteurs ABC en particulier, MDR1 ou P-gp sont largement distribués dans l'organisme [Thiebaut F, Tsuruo T, Hamada H, & al. Cellular localization of the multidrug- resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987; 84: 7735-8.], ils jouent également un rôle important dans la modulation de l'absorption, la distribution tissulaire et l'élimination de leurs substrats. Par conséquent, les transporteurs ABC MDR sont considérés comme étant des intervenants majeurs dans la pharmacocinétique de plusieurs substances médicamenteuses, qui peuvent moduler à leur tour leur activité pharmacologique ou leur toxicité.
Sur la base de ces propriétés et d'un point de vue cellulaire, le transporteur ABC transfère, de manière extracellulaire, les substances médicamenteuses en se couplant avec elles et régule le profil de disposition des substances médicamenteuses (concentration efficace en substance médicamenteuse dans l'absorption, la distribution, le métabolisme, l'excrétion, emplacement sur la cible), ce qui détermine à son tour l'effet pharmacologique total des substances médicamenteuses.
Par exemple, un transporteur ABC, qui est exprimé dans des cellules épithéliales de l'intestin et dans des cellules de l'endothélium vasculaire cérébral, a une grande influence sur la biodisponibilité de substances médicamenteuses administrées par voie orale et sur la migration de substances médicamenteuses vers le système nerveux central.
Comme autre exemple, il est bien connu dans le domaine de la thérapie chimique du cancer que, quand la glycoprotéine P et la MRP1 sont surexprimées, les cellules cancéreuses deviennent tolérantes en excrétant de nombreuses substances médicamenteuses anti- cancéreuses hors des cellules. Ce rôle fonctionnel des transporteurs ABC peut s'appliquer quand les substances médicamenteuses sont administrées par voie orale ou entérale. Mais dans le cas de produits dermatologiques, dans lequel les substances médicamenteuses sont appliquées par voie topique, on en sait peu sur le rôle fonctionnel des protéines de transport qui sont exprimées constitutivement dans la peau et spécifiquement dans la peau humaine.
On a rapporté que les protéines associées à une résistance multiple ou MRP sont exprimées dans des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK), dont la fonction n'est pas claire [Baron J M, Holler D, Schiffer R & al. J Invest Dermatol, 2001; 116; 541-548.], et le MRP1 a été le plus fortement exprimé parmi les gènes transporteurs de substances médicamenteuses analysés par PCR en temps réel dans la peau humaine [Smith G, Dawe R
5 &al. J Invest Dermatol, 2003; 121; 390-398].
Plus récemment, en utilisant la même analyse par PCR en temps réel, l'expression d'un ARNm de MDR1 a démontré qu'elle était jusqu'à 360 fois supérieure dans des spécimens de peau humaine complète par comparaison avec l'expression dans des NHEK. Une forte expression d'ARNm de MDR1 a été particulièrement détectée dans le derme humain (| 300 fois supérieure à celle dans des NHEK), tandis que l'expression d'ARNm épidermique n'a été que légèrement supérieure (12 fois) à l'expression dans des NHEK [Shazik C, Wenzel J
6 al, Expérimental Dermatology, 2011; 1-3]. En fait, les transporteurs ABC fonctionneraient dans une couche cutanée viable (derme et épiderme viables) mais pas dans la couche cornée, qui est composée de cellules mortes.
D'un autre côté, on a révélé, en utilisant l'immunohistochimie, une forte expression de protéine P-gp dans différents compartiments de la peau humaine, tels que les canaux sudoripares, les vaisseaux, les gaines des nerfs et les muscles de la peau humaine. Seule une expression modérée de la protéine P-gp a été observée dans la couche basale de l'épiderme [Shazik C, Wenzel J & al, Expérimental Dermatology, 2011; 1-3].
Une autre étude a montré l'implication du transporteur MDR1 ou P-gp dans l'absorption cutanée des substances médicamenteusesj/io K, & alL J Control Release. 2008 198-204]. Dans cette étude, les auteurs ont utilisée de la peau de souris qui n'exprime pas le gène codant pour MDR1 et un procédé in vitro qui est adaptée à la mesure de l'absorption intestinale (chambre d'Ussing) et non à l'absorption cutanée. Dans ce procédé, le prélèvement de peau est mis de part et d'autre en contact avec un milieu liquide dans lequel est dissoute la substance à tester. C'est donc un modèle qui est très loin de l'application topique où seule la partie dermale est en contact avec le liquide alors que l'épiderme est laissé à l'air libre. Dans cette étude les auteurs ont comparé l'absorption de la Rhodamine 123 (substrat de MDR1 ) dans la peau de souris sauvage et dans la peau de souris qui n'exprime pas le gène MDR1. L'absorption de la Rhodamine dans le sens épiderme-derme (absorption) était plus importante dans la peau de souris sauvage que dans la peau de souris n'exprimant pas le transporteur MDR1 ce qui a conduit les auteur à conclure que le transporteur MDR1 joue un rôle dans l'absorption cutanée des substances médicamenteuses.
Bien que le procédé utilisé par les auteurs (chambre d'Ussing) peut être contestable car il n'est pas adapté à l'application topique, l'utilisation de la peau de souris génétiquement modifié a permis de mettre en évidence le rôle de la P-gp dans l'absorption cutanée chez la souris. Toutefois, l'implication de la P-gp dans l'absorption cutané sur la peau humaine ne peut pas être démontréé, de plus le modèle utilisé ne peut pas être utilisé pour étudier le rôle d'autres transporteurs ABC comme MRP1 dans l'absorption cutanée des substances médicamenteuses utilisée par application topique à moins de modifier génétiquement d'autre animaux.
Ainsi, à la lumière de ce que l'on sait sur le fait que certains transporteurs ABC, tels que le MDR1 ou la protéine P-gp, aient une vaste spécificité de substrat, leur expression dans différents compartiments de la peau humaine peut être une considération importante pour le développement de substances médicamenteuses, en particulier de substances médicamenteuses dermatologiques topiques.
En effet, on a besoin d'obtenir un procédé d'évaluation, directement sur la peau humaine, de l'influence de transporteurs ABC sur la pénétration de substances médicamenteuses appliquées par voie topique.
Un tel procédé appliqué à la peau humaine est requis pour mieux comprendre le rôle de transporteurs dans la disposition des substances médicamenteuses topiques disponibles actuellement, ainsi que pour développer l'aptitude à prédire la contribution des transporteurs ABC dans la disposition de nouvelles entités moléculaires en cours de développement.
Le besoin de développer un procédé applicable directement sur la peau humaine semble être plus essentiel, tout en sachant qu'il existe des différences dans la reconnaissance d'un substrat et l'activité de transport entre les transporteurs orthologues animaux (tels que la souris) et humains (tels que le MRP1 , par exemple), ce qui indique qu'il existe des différences significatives inter-espèces [Stride BD & al in Mol. Pharmacol. 1997 Sep;52(3):344-53].
Description détaillée
Dans un aspect, un mode de réalisation exemplaire propose un procédé in vitro utilisant de la peau humaine d'épaisseur totale pour évaluer l'influence de transporteurs ABC cutanés, tels que les MDR1 , MRP1 , MRP2 et/ou BCRP, sur l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique.
Le procédé comprend généralement les étapes suivantes : (1 ) Préparer ex vivo des échantillons de peau humaine d'épaisseur totale, sans graisse sous-cutanée, et maintenir les échantillons de peau dans des conditions de culture d'organes, de préférence à 37°C pendant une durée allant de 1 minute à 72 heures ;
(2) Mettre en contact un premier échantillon de peau avec un inhibiteur spécifique d'un transporteur ABC solubilisé dans un véhicule, dans des conditions de culture d'organes, de préférence pendant une durée allant de 1 minute à 1 heure ;
(3) Mettre en contact un deuxième échantillon de peau (témoin) avec le véhicule, dans des conditions de culture d'organes, de préférence pendant la même durée que celle de l'étape (2) ;
(4) Mettre en contact à la fois l'échantillon de peau témoin et celui traité avec un inhibiteur du transporteur ABC avec une substance médicamenteuse, dans des conditions de culture d'organes, de préférence pendant une durée allant de 1 heure à 72 heures et, plus préférablement, autour de 16 heures ;
(5) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse recueillie dans le récepteur liquide (absorption) après pénétration à travers la peau ;
(6) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse située dans les échantillons de peau (distribution) ; et
(7) Comparer le niveau d'absorption de la substance médicamenteuse dans le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) avec celui de l'échantillon de peau témoin (sans inhibiteur).
Pour la préparation ex vivo d'échantillons de peau humaine d'épaisseur totale, on obtient la peau à partir d'une chirurgie plastique. Les échantillons de peau proviennent aussi bien d'hommes que de femmes. Ils peuvent être obtenus à partir de tissus abdominaux ou mammaires, mais également à partir d'autres sites anatomiques du corps.
Des échantillons de peau frais ou congelés peuvent être utilisés. De préférence, on utilise des échantillons de peau fraîche puisque l'activité des transporteurs ABC et d'autres enzymes est mieux conservée. Par "échantillons de peau fraîche" nous entendons des échantillons de peau obtenus juste après l'excision de la peau, jusqu'à 24 heures environ après l'excision, de préférence environ 4 heures après l'excision.
En variante, les échantillons de peau peuvent être maintenus dans des conditions de culture d'organes jusqu'à 72 heures environ après l'excision et avant que le procédé d'évaluation de l'implication du transporteur ABC ne débute. Des échantillons de peau saine ainsi que de peau avec lésions sont utilisés. La graisse sous-cutanée de la peau est retirée délicatement par dissection avant de l'utiliser dans le procédé.
Des échantillons de peau d'épaisseur totale peuvent être utilisés sans traitement quelconque de la couche cornée, la couche la plus externe de la peau qui agit comme barrière imperméable aux substances médicamenteuses hydrophiles ou de poids moléculaires élevés.
En variante, des échantillons de peau peuvent être utilisés après avoir réduit ou interrompu la couche cornée, dans le but de maîtriser les propriétés barrières de cette couche et d'augmenter la pénétration de la substance médicamenteuse.
Deux approches différentes sont utilisées pour réduire ou interrompre la fonction de barrière de la couche cornée : le décapage ou le Dermaroller®.
Pour la première étape (1 ) du procédé, après excision de l'échantillon de peau humaine et retrait de la graisse sous-cutanée, des morceaux de peau (2 X 2 cm ou moins) sont découpés et placés, face dermique vers le bas, dans un insert Transwell® logé à l'intérieur du puits d'une plaque de culture multi-puits. Le support sur lequel sont placés les échantillons de peau humaine est un support perméable avec des membranes microporeuses. De préférence, la membrane utilisée est faite d'un matériau en polycarbonate mais d'autres matériaux pour membranes peuvent être utilisés. De tels supports sont commercialisés par Corning sous le nom de Transwell® mais d'autres dispositifs semblables disponibles sur le marché peuvent être utilisés dans cette étape. L'insert Transwell® utilisé peut être adapté à une plaque de 6 puits, 12 puits ou 24 puits. Les puits sont pré-remplis avec un volume approprié de milieu de culture de peau de longue durée.
En fonction de la plaque de culture utilisée, le volume de milieu varie de 2,0 mL à 0,2 mL. Un cylindre, de préférence fabriqué en verre mais qui peut être aussi fabriqué dans un autre matériau approprié, est placé au sommet de l'échantillon de peau dans le but de délimiter la surface à traiter de l'échantillon de peau. Ainsi, la surface à traiter dépend de la taille du cylindre utilisé, lequel est adapté à son tour à la taille de l'insert utilisé. La surface de peau à traiter varie de 0,125 cm2 environ jusqu'à 3 cm2 environ.
A ce stade, la plaque Transwell® est placée sur un agitateur orbital et est maintenue dans des conditions de culture d'organes. Par "conditions de culture d'organes" nous comprenons une température de culture allant de 32°C environ jusqu'à 38°C environ, de préférence de 37°C environ, avec une concentration en C02 allant de 4% environ jusqu'à 10% environ, de préférence 5% environ, et avec une hygrométrie saturée dans un incubateur pour culture cellulaire.
En variante, des cellules de diffusion, comme des cellules de diffusion de Franz, peuvent être utilisées également à la place du modèle décrit ci-dessus. Dans ce cas, les conditions préférées utilisées sont comme suit :
Des coupes de peau sont montées sur des cellules de diffusion en verre, avec des superficies nominales d'environ 1 ou 2 cm2 environ et des compartiments receveurs ayant des capacités de 3 ml_. La face épidermique de la peau est exposée aux conditions atmosphériques alors que la face dermique est immergée dans du milieu de culture de peau de longue durée. Le milieu de culture est maintenu entre 30°C environ et 38°C environ, de préférence à 32 °C environ, par une chemise d'eau contrôlée par un bain d'eau. Une agitation constante du fluide récepteur est maintenue par agitation magnétique à environ 500 tr/min. On prend soin de retirer toutes les bulles d'air comprises entre la surface inférieure de la peau (derme) et le milieu de culture dans le compartiment receveur.
En variante, quand on a besoin de maîtriser la couche cornée, on utilise deux approches différentes : le décapage ou une perforation par Dermaroller®.
Dans le cas d'un décapage, on place des morceaux de peau, préparés tel que décrit ci- dessus, sur un papier filtrant et supportés par des plaques de liège. Dans le but d'éviter un rétrécissement de l'épaisseur totale de la peau, les échantillons de peau sont étirés jusqu'à leur taille d'origine environ et fixés avec des épingles. La surface de la peau est décapée à l'aide de 5 à 50 morceaux de bande adhésive successives, de préférence 30 morceaux de bande adhésive. La bande adhésive est d'une taille suffisante pour couvrir la totalité de la surface de la peau qui sera en contact avec le composé à tester.
En cas de perforation avec le Dermaroller®, les morceaux de peau sont placés sur un papier filtrant et supportés par des plaques de liège. Dans le but d'éviter un rétrécissement de l'épaisseur totale de la peau, les échantillons de peau sont étirés jusqu'à leur taille d'origine environ et fixés avec des épingles. Le Dermaroller®, par exemple un modèle CIT8 avec des longueurs d'aiguille de 500 μηι, est roulé dans quatre directions sur la surface de la peau, en exerçant une pression avec la main sur celui-ci.
Dans la deuxième étape (2) du procédé, un inhibiteur spécifique d'un transporteur ABC, solubilisé dans un véhicule, est appliqué sur la surface du premier échantillon de peau. Plusieurs inhibiteurs peuvent être utilisés en fonction des transporteurs ABC étudiés. Des exemples d'inhibiteurs de transporteurs ABC sont présentés dans le Tableau 1 mais ils ne sont pas restreints à cette liste.
Tableau 1 : Exemple d'inhibiteurs de transporteurs ABC Gène Appellation Inhibiteur
ABCB1 P-gp, MDR1 Ritonavir,
Cyclosporine,
Vérapamil,
Érythromycine,
Kétoconazole,
Itraconazole,
Quinidine,
Elacridar (GF120918)
LY335979
Valspodar (PSC833)
ABCC1 MRP1 Probénécid
Cyclosporine
MK571
ABCC2 MRP2, cMOAT Cyclosporine
Probénécid
ABCG2 BCRP, MXR Estrone,
173-œstradiol,
Fumitrémorgine C
Elacridar (GF120918),
Géfitinib
Par exemple, une solution de Vérapamil, un inhibiteur spécifique d'un ABCB1 (P-gp ou MDR1 ), est préparé avec une concentration finale de 10 mM dans un véhicule constitué, par exemple, par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v) environ.
Des échantillons de peau sont traités avec 10 μ-Jcrm2 environ d'une solution de Vérapamil à environ 10 mM pendant à peu près 30 minutes. Dans le cas où des inserts Transwell sont utilisés, les incubations sont conduites, de préférence, à 37°C environ avec 5% de C02 sur un agitateur orbital dans un incubateur humidifié, pendant 30 minutes environ. Dans la troisième étape (3) du procédé, seul le véhicule est appliqué à la surface du deuxième échantillon de peau (témoin). En parallèle au traitement avec l'inhibiteur, différents échantillons de peau (même traitement de surface de la peau, intacte, décapée ou passée au Dermaroller®) sont traités avec le véhicule à 10 μ-Jcrm2 environ, par exemple constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v) environ, pendant 30 minutes environ. Ces échantillons sont utilisés comme échantillons témoins sans inhibiteur.
Dans la quatrième étape (4) du procédé, une substance médicamenteuse est appliquée à la fois sur le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) et sur les deuxièmes échantillons de peau (témoins) (sans inhibiteur).
La substance médicamenteuse qui est utilisée pour évaluer l'implication des transporteurs ABC dans son absorption et sa distribution cutanées peuvent être un composé fluorescent, un composé radio-marqué ou un composé non marqué. Cette substance médicamenteuse est utilisée à une concentration appropriée, allant généralement de 0,01 mM environ à 100 mM environ, dans un véhicule approprié en fonction des caractéristiques de la substance médicamenteuse testée.
À la fin de la période de traitement avec l'inhibiteur ou avec le véhicule, les échantillons de peau sont traités avec un volume/une quantité défini(e) de substance médicamenteuse pendant une durée allant, de préférence, de 1 heure environ à 72 heures environ et, plus préférablement, de 16 heures environ.
Dans la cinquième étape (5) du procédé, après une incubation pendant la durée prédéterminée à l'étape (4), le fluide récepteur est recueilli, analysé immédiatement ou stocké à une température appropriée (comprise entre +4°C et -80°C) avant d'être analysé. La quantité de substance médicamenteuse qui a atteint le fluide récepteur (absorption) est déterminée alors avec l'appareil d'analyse approprié. Par exemple, une HPLC avec une détection UV,, fluorescence, radioactive ou spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour mesurer la quantité de substance médicamenteuse dans le fluide récepteur.
Dans le cas d'une substance médicamenteuse radio-marquée, la radioactivité dans le fluide récepteur est analysée par comptage de scintillation liquide.
Dans le cas d'une substance médicamenteuse fluorescente, l'intensité de fluorescence dans le fluide récepteur est mesurée directement avec un spectrofluorimètre pour microplaques. Dans certains cas, le fluide récepteur peut être analysé directement sans une quelconque procédure d'extraction.
Dans d'autres cas, une étape d'extraction peut être effectuée avant l'analyse du fluide récepteur. Dans la sixième étape (6) du procédé, après une incubation pendant la durée prédéterminée à l'étape (4), la quantité de substance médicamenteuse distribuée dans la peau (distribution) est déterminée. L'excès de substance médicamenteuse est retiré en essuyant la peau avec 5 coton-tiges imprégnés avec un solvant approprié. Dans certains cas, un décapage des échantillons de peau peut être effectué en utilisant 6 bandes adhésives. Les échantillons de peau sont congelés à -80°C environ avant analyse.
Afin de déterminer la quantité de substance médicamenteuse dans les différentes couches de peau (distribution), des échantillons de peau congelés sont découpés en petits morceaux, fixés sur un porte-échantillon de microtome refroidi préalablement. La peau est découpée perpendiculairement à la surface en coupes d'environ 5 à 10 m environ d'épaisseur en utilisant un cryomicrotome. Dans certains cas, on peut effectuer des coupes parallèles à la surface de la peau.
Les coupes de peau, découpées perpendiculairement à la surface de la peau, sont analysées par autoradiographie ou micro-autoradiographie, dans le cas d'une substance médicamenteuse radio-marquée, ou bien par microscopie confocale ou à épifluorescence dans le cas d'une substance médicamenteuse fluorescente.
Les coupes de peau découpées parallèlement à la surface de la peau sont analysées par comptage de scintillation liquide, dans le cas d'une substance médicamenteuse radio- marquée, ou par HPLC avec un mode de détection approprié après extraction de la substance médicamenteuse des coupes de peau.
Dans la septième étape (7) du procédé, on effectue une comparaison du niveau d'absorption de la substance médicamenteuse dans le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) avec celui de l'échantillon de peau témoin (sans inhibiteur).
La quantité de substance médicamenteuse qui a atteint le fluide récepteur (absorption) dans les échantillons de peau traités à la fois avec l'inhibiteur des transporteurs ABC et la substance médicamenteuse est comparée à celle dans les échantillons de peau traités seulement avec la substance médicamenteuse. Si la plus faible quantité de substance médicamenteuse est observée dans les échantillons de peau traités avec l'inhibiteur des transporteurs ABC, ceci indique que le transporteur ABC est impliqué dans l'absorption cutanée de la substance médicamenteuse. Si aucune différence n'est observée entre les deux conditions (avec et sans inhibiteurs), ceci indique que l'absorption cutanée n'est pas liée aux transporteurs ABC.
Ce procédé permet d'améliorer la sélection de substances médicamenteuses appliquées par voie topique en fonction à la fois de l'affinité pour le transporteur ABC et de l'emplacement du site d'action ciblé, qui dépend de la pathologie à traiter. Des substances médicamenteuses appliquées par voie topique sont utilisées généralement dans le traitement de maladies cutanées. Cependant, des substances médicamenteuses appliquées par voie topique peuvent être utilisées également dans le traitement d'autres troubles cutanés non apparentés, dans lesquels une voie systémique ne pourrait pas être utilisée. Dans certains cas, des traitements systémiques sont utilisés dans le traitement de maladies de la peau.
Il existe 5 types courants de maladies de la peau :
• Maladies inflammatoires
Celles-ci comprennent l'eczéma, une dermatite, le psoriasis, l'érythème fessier et l'acné. Certaines de ces maladies peuvent durer pendant des périodes prolongées.
Des pommades topiques sont prescrites habituellement pour diminuer la
démangeaison et le gonflement.
• Maladies virales
Celles-ci comprennent la varicelle, la rougeole, l'herpès 1 , l'herpès 2 et le zona. Des remèdes topiques et sur ordonnance sont disponibles pour les maladies cutanées virales.
• Maladies fongiques
Des champignons microscopiques sont la cause d'infections fongiques. Les Candida, le pied d'athlète et la teigne sont toutes des infections virales. Les traitements peuvent comprendre des médicaments oraux, des pommades topiques, des poudres et des antiseptiques oraux.
• Maladies bactériennes
Celles-ci comprennent l'impétigo, la cellulite, le MRSA, une folliculite, la gale et une fasciite nécrosante et sont toutes des maladies de peau bactériennes. Le traitement peut faire intervenir des antibiotiques pour un drainage de la zone ou, dans des cas extrêmes, le retrait de la zone infectée.
• Maladies cancéreuses de la peau
Le cancer baso-cellulaire, le carcinome à cellules squameuses et les mélanomes sont des types de maladies cancéreuses de la peau. Des lésions cutanées ou des taches qui changent de forme ou de couleur sont des signes d'un cancer de la peau.
Des exemples de substances médicamenteuses appliquées par voie topique utilisées pour le traitement de maladies de la peau sont énumérés ci-dessous :
• Acné Trétinoïne, peroxyde de benzoyle, clindamycine, doxycycline, isotrétinoïne, tétracycline, minocycline, acide salicylique, acide azélaïque, érythromycine topique, drospirénone-éthinyl estradiol, tazarotène, peroxyde de benzoyle-clindamycine, éthinyl estradiol-norgestimate, sulfacétamide sodique ou clindamycine-trétinoïne. · Psoriasis :
Cortisone, rétinoïdes dérivés de la vitamine A, analogues de la vitamine D, acides salicylique et lactique.
• Acné rosacée : Métronidazole et acide azélaïque. · Vitiligo :
Hydroquinone
• Impétigo : Érythromycine et mupirocine.
Les exemples suivants sont proposés simplement comme illustrations de divers aspects de l'invention et ne devront être interprétés d'aucune manière comme limitant l'invention :
EXEMPLE 1 :
Expression de transporteurs ABC dans des
échantillons de peau humaine
Des échantillons de peau humaine obtenus à partir d'une chirurgie plastique abdominale ont été maintenus en culture d'organes pendant 72 heures. Deux biopsies de peau de 6 mm de diamètre ont été cultivées dans 500 μΙ_ de milieu de culture de peau de longue durée, dans les puits d'une plaque de 24 puits à 37°C, avec 5% C02 et hygrométrie saturée. Le milieu de culture a été changé chaque 24 heures. Après 72 heures de culture, les 2 biopsies de peau ont été broyées en utilisant un instrument Presselys 24 (Ozyme) dans 350 μΙ_ de tampon pour lyse (Promega). L'ARN total a été extrait ensuite en utilisant une trousse SV Total RNA Isolation System, selon les instructions fournies par le constructeur (Promega). Une réaction par transcription inverse a été effectuée ensuite dans un volume total de 20 μΙ_, en utilisant un mélange Master Mix ARN vers ADNc de capacité élevée fourni par Applied Biosystem. L'expression des gènes ABCB1 , ABCC2, ABCC1 et ABCG2 a été analysée en double par une PCR en temps réel, utilisant des amorces sens et antisens et une sonde TaqMan spécifiques fournies par Applied Biosystem. Le gène GAPDH a été utilisé comme gène domestique pour normaliser l'expression de chaque gène.
En parallèle, l'expression des 4 gènes ABCB1 , ABCC1 , ABCC2 et ABCG2 a été analysé selon le même procède décrit plus haut dans des hépatocytes humains frais maintenus en culture primaire pendant 96 heures.
La Figure 1 (courbe d'amplification des ABCB1 , ABCC1 , ABCC2 et ABCG2 dans de la peau humaine ex vivo maintenue en culture d'organes pendant 72 heures) présente la courbe d'amplification de chaque gène amplifié dans la peau humaine. La Figure 2 (expression des transporteurs ABC dans la peau humaine ex vivo maintenue en culture d'organes pendant 72 heures) présente l'expression relative de chaque gène par comparaison avec le gène ABCC1 codant pour MRP1 dans la peau humaine en organoculture. La Figure 3 (expression des transporteurs ABC dans les hépatocytes humains maintenus en culture primaire pendant 96 heures) présente l'expression relative de chaque gène par comparaison avec le gène ABCC1 codant pour MRP1 dans les hépatocytes humains en culture primaire. La Figure 4 (expression du transporteur ABCC1 codant pour MRP1 dans la peau humaine en organoculture et dans les hépatocytes humains en culture primaire) présente l'expression relative du gène codant pour MRP1 dans la peau humaine par comparaison aux hépatocytes humains.
Les résultats montrent clairement que, dans la peau humaine ex vivo maintenue en culture d'organes pendant 72 heures, l'ensemble des quatre gènes est exprimé dans la peau humaine. L'expression du gène ABCC1 codant pour le transporteur MRP1 est très élevée par comparaison avec les gènes codant pour MDR1 , MRP2 et BCRP, pour lesquels l'expression est relativement faible. Ces résultats montrent que, dans la peau humaine en culture d'organes, les transporteurs ABC sont exprimés et que donc la peau humaine en culture d'organes peut être utilisée pour étudier l'implication des transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution de substances médicamenteuses appliquées par voie topique. D'autre part, les résultats montrent que l'expression des gènes codant pour les 4 transporteurs est différente dans la peau et dans les hépatocytes. Dans les hépatocytes, l'expression des 3 gènes codant pour MDR1 , MRP2 et BCRP est très élevée par comparaison à la peau humaine. De plus, dans les hépatocytes humains, l'expression du gène codant pour MRP2 est la plus élevée comparée aux autres gènes alors que dans la peau humaine c'est l'expression du gène codant pour MRP1 qui est la plus élevée. La comparaison de l'expression du gène codant pour MRP1 dans la peau et dans les hépatocytes révèle que l'expression du gène codant pour MRP1 est 15 fois plus élevée dans la peau humaine que dans les hépatocytes. Ces résultats seraient en faveur d'un rôle important du transporteur MRP1 dans l'absorption cutanée des substances médicamenteuses appliquées par voie topique.
EXEMPLE 2 :
Mesure de la perte insensible d'eau dans des
échantillons de peau humaine
La perte insensible d'eau (TEWL) a été mesurée en utilisant un Tewameter TM 300® (Courage & Khazaka electronic GmbH, Allemagne) avec une chambre de mesure ouverte. Les échantillons de peau ont été montés sur une cellule de diffusion en verre (superficie nominale de 1 ou 2 cm2 et compartiment receveur ayant des capacités de 3 mL). La face épidermique de la peau a été exposée aux conditions atmosphériques alors que la face dermique a été en contact avec le fluide récepteur (milieu de culture de peau de longue durée (Biopredic, France) maintenu à 32 °C). La TEWL initiale a été mesurée en triple (trois échantillons de peau). Pour la perforation de la peau avec le Dermaroller ou pour le décapage de la peau, on a retiré les échantillons de peau des cellules de diffusion, on les a fixés sur des plaques en liège et on les a décapés ou percés tel que décrit ci-dessus. Après le décapage ou la perforation, les échantillons de peau ont été placés à nouveau sur les cellules de diffusion et la TEWL a été mesurée à des intervalles de temps appropriés, sur 19 heures et 25 heures pour le dermaroller et le décapage respectivement.
La Figure 5 (effet d'un décapage sur la TEWL dans des échantillons de peau humaine ex vivo) présente l'effet d'un décapage sur la TEWL et la Figure 5 (effet du dermaroller sur la TEWL dans des échantillons de peau humaine ex vivo) présente l'effet du dermaroller sur la TEWL.
Les résultats montrent que la valeur de la TEWL augmente proportionnellement au nombre de bandes adhésives utilisées, jusqu'à 20 bandes, puis elle a atteint un plateau. Plus aucune augmentation de la TEWL n'a été observée, même en utilisant 50 bandes. Une augmentation de la valeur de la TEWL de six fois a été observée quand on a utilisé 20 bandes adhésives pour ôter la couche cornée. La valeur de 30 bandes a été utilisée comme valeur standard dans les expériences ultérieures.
Les résultats montrent également que la valeur de la TEWL a augmenté après 20 passages de dermaroller et elle a atteint un plateau, sans qu'aucune autre augmentation n'ait été observée après 30 ou 50 passages de dermaroller. Une augmentation de la valeur de la TEWL de quatre fois a été observée quand on a utilisé 20 passages de dermaroller pour interrompre la couche cornée. La valeur de 32 passages de rouleau a été utilisée comme valeur standard dans les expériences ultérieures. EXEMPLE 3 :
Implication de transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution de Vinblastine dans des échantillons de peau humaine
La molécule substrat modèle Vinblastine a été utilisée tout au long de cette expérience. La Vinblastine est connue pour être un substrat spécifique des MDR1.
La molécule inhibitrice modèle Vérapamil a été utilisée tout au long de cette expérience. Le Vérapamil est connu pour être un inhibiteur spécifique des MDR1. De la Vinblastine marquée au tritium a été utilisée. Une solution isotopique de [3H]- vinblastine a été préparée avec une concentration finale de 10 mM dans du méthanol (1 mCi/mL).
Le Vérapamil a été préparé avec une concentration finale de 10 mM dans le véhicule constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v).
Le véhicule utilisé pour traiter les échantillons de peau témoins était constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v).
Les échantillons de peau ont été traités d'abord avec la solution d'inhibiteur vérapamil. Pour ce faire, 20 μί de solution de vérapamil ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau en utilisant une micropipette, correspondant à 10 Ucm2 de surface cutanée. La durée du traitement avec l'inhibiteur a été de 30 minutes.
En parallèle, d'autres échantillons de peau (échantillons témoins) ont été traités avec le véhicule de l'inhibiteur utilisé, constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v). Pour ce faire, 20 μί du véhicule ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau, en utilisant une micropipette. La durée du traitement avec l'inhibiteur a été de 30 minutes.
À la fin de la période de traitement, les échantillons de peau à la fois témoins et ceux traités par l'inhibiteur ont été traités avec une solution de [3H]-vinblastine. Pour ce faire, la solution isotopique de [3H]-vinblastine à 10 mM a été diluée 4 fois dans du NaCI à 0,9%, atteignant une concentration finale de 2,5 mM. Vingt microlitres de cette solution diluée ont été appliqués à la surface de chaque échantillon de peau, correspondant à 10 μΙ_/οη-ι2. La durée du traitement avec la vinblastine a été de 16 heures.
À la fin de la période de traitement avec la Vinblastine, le fluide récepteur a été analysé par comptage de scintillation liquide dans le but de mesurer la quantité de Vinblastine ayant atteint le fluide récepteur (absorption).
La distribution de la Vinblastine dans la peau a été analysée par autoradiographie. Des échantillons de peau ont été placés sur un porte-tissus et cryo-montés dans un milieu d'enrobage pour cryo-montages. Les blocs congelés ont été tranchés en coupes de 8 à 10 μηη d'épaisseur, perpendiculaires à la surface de l'épiderme, dans un cryomicrotome (Thermo Electron). Les coupes ont été recueillies sur des lames de verre et séchées. Les cryo-coupes ont été placées sur une plaque pour imagerie Fuji de type Bas-lll (20 x 40 cm) dans une cassette Fujix Bas 2040, pendant 24 heures jusqu'à 5 jours. La plaque exposée a été scannée avec un analyseur Bio-lmaging (Fujix BAS 2000). Les images scannées ont été analysées en utilisant un logiciel TINA.
Dans certaines expériences, l'absorption cutanée in vitro de vinblastine a été réalisée sur des échantillons de peau intacte sans un quelconque décapage adhésif ni perforation par dermaroller. Dans d'autres expériences, l'absorption cutanée in vitro de vinblastine a été réalisée sur des échantillons de peau décapée par bandes adhésives (30 bandes) ou de peau ayant été passée au dermaroller (32 passages de rouleau).
Pour la peau décapée par bandes adhésives, des morceaux de peau d'une surface appropriée (environ 2 x 2 cm) ont été placés sur un papier filtrant et supportés par des plaques de liège. Dans le but d'éviter un rétrécissement de l'épaisseur totale de la peau, les échantillons de peau ont été étirés jusqu'à leur taille d'origine environ et fixés avec des épingles. La surface de la peau a été décapée avec 30 morceaux de bande adhésive. La bande adhésive était d'une taille suffisante pour couvrir la totalité de la surface de la peau devant être en contact avec le composé à tester. Pour la perforation avec le dermaroller, les morceaux de peau d'une surface appropriée (environ 2 x 2 cm ou moins) sont placés sur un papier filtrant et supportés par des plaques de liège. Dans le but d'éviter un rétrécissement de l'épaisseur totale de la peau, les échantillons de peau sont étirés jusqu'à leur taille d'origine environ et fixés avec des épingles. Le Dermaroller® modèle CIT8 a été roulé par cycles de huit fois, en exerçant une pression avec la main sur celui-ci, dans quatre directions sur la surface de la peau (32 passages). Le Dermaroller a été fourni par DISTRIMED SARL, Luxembourg. Le modèle CIT8 a été utilisé. Le modèle CIT8 possède 24 arrangements circulaires de 8 aiguilles chacun, d'une longueur de 500 μηη (192 aiguilles au total) dans un assemblage cylindrique, le cylindre ayant 2 cm de diamètre et 2 cm de longueur. Les expériences d'absorption cutanée in vitro de vinblastine avec les échantillons de peau intacte et de peau décapée par bandes adhésives ont été effectuées sur des cellules de diffusion en verre, avec une superficie nominale de 2 cm2 et des capacités de fluide récepteur de 3 mL. Le volume de traitement de la surface cutanée était de 20 μί, correspondant à 10 Ucm2. Les expériences avec des échantillons de peau intacte ont été réalisées en triple sur 5 donneurs différents (N = 15), tandis que les expériences avec la peau décapée par bandes adhésives ont été effectuées en triple sur 6 donneurs différents (N = 18).
Des expériences d'absorption cutanée in vitro de vinblastine avec des échantillons de peau percée par dermaroller ont été effectuées sur une plaque Transwell à 6 puits, avec une surface de peau traitée de 1 cm2 et des capacités de fluide récepteur de 1 ,5 mL. Le volume de traitement de la surface cutanée était de 10 μί, correspondant à 10 Ucm2. Les expériences avec des échantillons de peau ayant été passée au dermaroller ont été réalisées en triple sur 4 donneurs différents (N = 1 1 ).
La Figure 7 (absorption cutanée de vinblastine dans de la peau intacte ainsi que dans des peaux décapées et passées au dermaroller) présente l'effet d'un traitement cutané sur l'absorption cutanée de Vinblastine par la peau humaine.
La Figure 8 (distribution cutanée de la vinblastine dans des échantillons de peau humaine non traitée et décapée, analysés par autoradiographie de coupes de peau) présente la distribution de la Vinblastine dans de la peau humaine non traitée et décapée, analysée par autoradiographie.
La Figure 9 (effet du Vérapamil sur l'absorption cutanée de Vinblastine dans des échantillons de peau humaine intacte) présente l'effet du Vérapamil sur l'absorption de Vinblastine par la peau humaine dans des échantillons de peau humaine intacte.
La Figure 10 (effet du vérapamil sur l'absorption cutanée de vinblastine dans des échantillons de peau humaine passée au dermaroller) présente l'effet du Vérapamil sur l'absorption de Vinblastine par la peau humaine dans des échantillons de peau humaine passée au dermaroller.
Les résultats montrent que, dans des échantillons de peau intacte, l'absorption cutanée de vinblastine est très faible et représente seulement 0,001 % de la dose appliquée (correspondant à 0,003 nmol). Le décapage ainsi que la perforation de la peau avec un dermaroller augmentent considérablement l'absorption cutanée de la vinblastine. En effet, l'absorption cutanée de vinblastine représentait 0,07 nmol et 0,6 nmol dans les peaux décapées et passées au dermaroller respectivement. Ceci implique que le décapage par bandes adhésives a augmenté l'absorption cutanée de vinblastine de 20 fois environ et que la perforation de la peau par le dermaroller a augmenté l'absorption cutanée de vinblastine de 200 fois environ. Ces résultats indiquent aussi que, dans les conditions utilisées, la perforation de la peau avec le dermaroller est un meilleur outil que le décapage par bandes adhésives pour le renforcement de l'absorption cutanée de vinblastine. Les résultats montrent que, dans la peau non traitée, un signal très faible apparenté à la vinblastine est observé dans la partie la plus supérieure de la coupe de peau correspondant à la couche cornée. Aucun signal n'a été observé dans les couches plus profondes. Dans la peau décapée par bandes adhésives (30 bandes), où la couche cornée a été ôtée, on a observé une augmentation notoire de l'intensité du signal apparenté à la vinblastine. Ceci indique que le décapage par bandes adhésives fait augmenter la pénétration de la vinblastine dans les couches plus profondes d'un échantillon de peau. Ce résultat est conforme au résultat obtenu à la Figure 5, montrant que le décapage par bandes adhésives fait augmenter, de manière notoire, la quantité de vinblastine absorbée dans le fluide récepteur.
Les résultats montrent que, dans les échantillons de peau non traitée, l'absorption cutanée de vinblastine a été réduite par un traitement au vérapamil. En effet, l'absorption de vinblastine a été réduite de 18% par du vérapamil appliqué par voie topique. Comme le vérapamil est un inhibiteur connu du transporteur MDR1 , ce résultat suggère que le transporteur MDR1 est impliqué dans l'absorption cutanée de la vinblastine.
Le résultat montre que, dans les échantillons de peau humaine perforés au dermaroller, l'absorption cutanée de vinblastine a été réduite par du vérapamil appliqué par voie topique. En effet, l'absorption cutanée de vinblastine a été réduite de 14% par du vérapamil appliqué par voie topique. Comme le vérapamil est un inhibiteur connu du transporteur MDR1 , ce résultat suggère que le transporteur MDR1 est impliqué dans l'absorption cutanée de la vinblastine.
EXEMPLE 4 Implication des transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution de la
Rhodamine123 dans des échantillons de peau humaine
La molécule substrat modèle Rhodamine 123 a été utilisée tout au long de cette expérience. La Rhodamine 123 est connue pour être un substrat des MDR1.
La molécule inhibitrice modèle Vérapamil a été utilisée tout au long de cette expérience. Le Vérapamil est connu pour être un inhibiteur spécifique des MDR1. La Rhodamine est une molécule fluorescente. Une solution de Rhodamine 123 a été préparée avec une concentration finale de 2,5 mM dans du DMSO à 25%.
Le Vérapamil a été préparé avec une concentration finale de 10 mM dans le véhicule constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v).
Le véhicule utilisé pour traiter les échantillons témoins était constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v).
Les échantillons de peau ont été traités d'abord avec la solution d'inhibiteur vérapamil. Pour ce faire, 20 μί de solution de vérapamil ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau, en utilisant une micropipette, correspondant à 10 Ucm2 de surface cutanée. La durée du traitement avec l'inhibiteur a été de 30 minutes.
En parallèle, d'autres échantillons de peau (échantillons témoins) ont été traités avec le véhicule de l'inhibiteur utilisé, constitué par de l'éthanol/NaCI à 0,9% (25/75, v/v). Pour ce faire, 20 μί du véhicule ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau en utilisant une micropipette. La durée du traitement avec le véhicule a été de 30 minutes.
À la fin de la période de traitement, les échantillons de peau à la fois témoins et ceux traités par l'inhibiteur ont été traités avec une solution de Rhodamine 123. Pour ce faire, 20 μί de la solution de Rhodamine 123 à 2,5 mM ont été appliqués à la surface de chaque échantillon de peau, correspondant à 10 Ucm2. La durée du traitement avec la Rhodamine 123 a été de 16 heures.
Les expériences d'absorption cutanée in vitro de la Rhodamine 123 ont été réalisées avec des échantillons de peau intacte. Des échantillons de peau congelés ont été utilisés dans ces expériences. Après les avoir dégelés, les échantillons de peau ont été montés sur des cellules de diffusion en verre, avec une superficie nominale de 2 cm2 et des capacités de fluide récepteur de 3 ml_. Le volume de traitement de la surface cutanée était de 20 μΙ_, correspondant à 10 μ-Jcrm2. Un total de 4 expériences différentes a été réalisé sur un donneur et chaque expérience a été effectuée en double (N = 8). À la fin de la période de traitement avec la Rhodamine 123, le fluide récepteur a été analysé directement en triple, via un spectrofluorimètre pour microplaques SYNERGY 2 (Biotech) dans le but de mesurer la quantité de Rhodamine 123 qui avait atteint le fluide récepteur (absorption). Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission étaient de 485 et 590 respectivement. L'analyse a été exécutée avec un logiciel Gen5. La distribution de la Rhodamine 123 dans la peau a été analysée par microscopie à épifluorescence. Des échantillons de peau ont été placés sur un porte-tissus et cryo-montés dans un milieu d'enrobage pour cryo-montages. Les blocs congelés ont été tranchés en coupes de 4 à 10 μηη d'épaisseur, perpendiculaires à la surface de l'épiderme, dans un cryo- microtome (Thermo Electron). Les coupes ont été recueillies sur des lames de verre et séchées. Les cryo-coupes ont été étudiées sous un microscope à épifluorescence avec un filtre TRITC (éclipse, 80i L ; Nikon). Le microscope, équipé d'un appareil photo numérique (DS-5M-LI, Nikon), a été utilisé pour la capture des images.
La Figure 1 1 (effet du vérapamil sur l'absorption cutanée de Rhodamine 123 dans des échantillons de peau humaine) présente l'effet du Vérapamil sur l'absorption cutanée de la Rhodamine 123 dans des échantillons de peau humaine.
Ce résultat montre que, dans des échantillons de peau humaine intacte, l'absorption cutanée in vitro de Rhodamine 123 était très faible et représentait environ 0,4% de la dose appliquée. Cependant, par comparaison avec l'absorption cutanée de Vinblastine dans des échantillons de peau intacte, dans lesquels l'absorption cutanée représentait seulement 0,001 % de la dose appliquée, la Rhodamine 123 pouvait être considérée comme étant bien absorbée.
De plus, le résultat montre que, dans les échantillons de peau humaine intacte, l'absorption cutanée de Rhodamine 123 a été significativement réduite par un traitement au Vérapamil (test t, p < 0,05). En effet, l'absorption de la Rhodamine 123 a été réduite de 36% par du vérapamil appliqué par voie topique. Comme le Vérapamil est un inhibiteur connu du transporteur MDR1 , ce résultat suggère que le transporteur MDR1 est impliqué dans l'absorption cutanée de la Rhodamine 123. La Figure 12 (distribution cutanée de la Rhodamine 123 dans des échantillons de peau humaine) présente la distribution de la Rhodamine 123 dans des échantillons de peau humaine.
Figure 12 A : coupe cutanée d'un échantillon de peau témoin sans un quelconque traitement (sans Rhodamine) montrant le niveau basique d'autofluorescence.
Figure 12 B : coupe cutanée d'un échantillon de peau traité avec de la Rhodamine 123 montrant une augmentation de la fluorescence rouge due à la Rhodamine 123.
Ces résultats montrent que la Rhodamine 123 est distribuée principalement dans les couches supérieures de la coupe de peau, correspondant à l'épiderme et à la couche cornée. Par comparaison avec la coupe de peau témoin, une augmentation de la fluorescence dans le derme peut être également observée, ce qui indique que la Rhodamine 123 est distribuée aussi dans le derme, mais dans une moindre mesure. Ces résultats sont conformes aux résultats présentés à la Figure 9, indiquant que la Rhodamine 123 a été absorbée dans le fluide récepteur.
Aucune différence d'intensité de fluorescence n'a été observée dans les coupes d'échantillons de peau traités avec le Vérapamil (données non présentées). Ceci a été probablement dû à la saturation du signal de fluorescence observée dans les couches supérieures des échantillons de peau.
Les résultats présentés dans l'exemple 4 et dans l'exemple 5 montrent que l'absorption cutanée de Vinblastine et de Rhodamine 123, deux substrats des transporteurs ABC, a été inhibée par le Vérapamil, un inhibiteur du transporteur ABC. Ceci indique que les transporteurs ABC de la peau, principalement le MDR1 , sont impliqués dans l'absorption et la distribution cutanées humaines de la Vinblastine et la Rhodamine 123.
EXEMPLE 5 :
Implication des transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution du Leucotriène- C4 dans des échantillons de peau humaine
La molécule substrat modèle Leucotriène-C4 (LTC4) a été utilisée tout au long de cette expérience. Le Leucotriène-C4 est connue pour être un substrat physiologique du transporteur MRP1 . La molécule inhibitrice modèle MK571 a été utilisée tout au long de cette expérience. Le MK571 est connu pour être un inhibiteur spécifique de MRP1 . Du LTC4 marquée au tritium a été utilisée. La concentration de la solution LTC4 utilisée était de 68.5 nM (0.01 m Ci/m L).
Le MK571 a été préparé avec une concentration finale de 2 mM dans l'eau.
Le véhicule utilisé pour traiter les échantillons de peau témoins était constitué de 100% d'eau. Les échantillons de peau ont été traités d'abord avec la solution d'inhibiteur MK571 . Pour ce faire, 10 μί de solution MK571 ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau, en utilisant une micropipette, correspondant à 10 μί/οηι2 de surface cutanée. La durée du traitement avec l'inhibiteur a été de 30 minutes.
En parallèle, d'autres échantillons de peau (échantillons témoins) ont été traités avec le véhicule de l'inhibiteur utilisé, constitué. Pour ce faire, 10 μί d'eau ont été appliqués à la surface d'échantillons de peau en utilisant une micropipette. La durée du traitement avec le véhicule a été de 30 minutes.
À la fin de la période de traitement par l'inhibiteur, les échantillons de peau à la fois témoins et ceux traités par l'inhibiteur ont été traités avec la solution de LTC4. Pour ce faire, 10 μί de la solution de LTC4 à 68,5 nM ont été appliqués à la surface de chaque échantillon de peau, correspondant à 10 Ucm2. La durée du traitement avec le LTC4 a été de 6 heures.
À la fin de la période de traitement avec le LTC4, le fluide récepteur a été analysé par comptage de scintillation liquide dans le but de mesurer la quantité de LTC4 ayant atteint le fluide récepteur (absorption).
La distribution du LTC4 dans la peau a été analysée par autoradiographie. Les conditions expérimentales sont identiques à celles décrites précédemment pour la Vinblastine.
Les expériences d'absorption cutanée in vitro du LTC4 ont été réalisées avec des échantillons de peau fraîche provenant de 3 différents donneurs. Les expériences ont été réalisées dans des plaques Transwell à 6 puits, avec une surface de peau traitée de 1 cm2 et des capacités de fluide récepteur de 1 ,5 mL. Le volume de traitement de la surface cutanée était de 10 μί, correspondant à 0.69 pmol et 222000 dpm. Trois différentes expériences ont été réalisées avec des échantillons de peau provenant de trois donneurs différents. Dans chaque expérience, chaque condition a été réalisée en triple (N = 9 au total). La Figure 13 (effet du MK571 sur l'absorption cutanée du LTC4 dans des échantillons de peau humaine) présente l'effet de l'inhibiteur MK571 sur l'absorption cutanée du LTC4 dans des échantillons de peau humaine.
La Figure 14 (distribution cutanée du LTC4 dans des échantillons de peau analysés par autoradiographie de coupes de peau) présente la distribution du LTC4 dans de la peau humaine avec et sans traitement avec l'inhibiteur de MRP1 MK571 , analysée par autoradiographie.
Ce résultat montre que, dans des échantillons de peau humaine, l'absorption cutanée in vitro du LTC4 après 6 heures de traitement était très faible et représentait environ 1.7% de la dose appliquée. Cependant, l'absorption cutanée du LTC4 est nettement supérieure à celle de la Vinblastine et de la Rhodamine 123.
De plus, le résultat montre que, dans les échantillons de peau humaine, l'absorption cutanée du LTC4 a été significativement réduite par un traitement au MK571 (test t, p < 0,05). En effet, l'absorption du LTC4 a été réduite d'environ 17% par le MK571 appliqué par voie topique. Comme le MK571 est un inhibiteur spécifique du transporteur MRP1 , ce résultat suggère que le transporteur MRP1 est impliqué dans l'absorption cutanée du LTC4. Les résultats de la distribution du LTC4 analysée par autoradiographie montrent que, dans les coupes de peau sans traitement avec l'inhibiteur, un signal radioactif apparenté au LTC4 est observé dans la partie la plus supérieure de la coupe de peau correspondant à l'épiderme. Aucun signal n'a été observé dans les couches plus profondes. Dans la peau traitée avec l'inhibiteur, on a observé une augmentation notoire de l'intensité du signal apparenté au LTC4, notamment dans les couches plus profondes correspondant au derme. Ceci indique que le traitement de la peau avec l'inhibiteur fait augmenter la pénétration du LTC4 dans les couches plus profondes d'un échantillon de peau. Ce résultat est conforme au résultat obtenu dans la Figure 13, montrant que le traitement avec l'inhibiteur fait diminuer, de manière notoire, la quantité du LTC4 absorbée dans le fluide récepteur.
Tous les résultats présentés avec les molécules modèles utilisées comme substrat et inhibiteur des transporteurs ABC, couplées à un système d'absorption cutanée humaine, apporte la preuve que le modèle présenté dans ces travaux représente un outil sensible, facile et approprié pour l'étude de l'implication des transporteurs ABC dans l'absorption et la distribution cutanées de substances médicamenteuses appliquées par voie topique. EXEMPLE 6 :
Immunolocalization du transporteur MRP1 dans la peau humaine
Un prélèvement de peau humaine (femme, 75 ans) issu de lifting a été utilisé pour étudier la localisation du transporteur MRP1 par immunohistochimie. Des biopsies de peau ont été incluses dans du cryomatrix (Shandon Thermo) et des coupes sériées de 4 μηη d'épaisseur ont été réalisées au cryomicrotome. Les cryocoupes ont été récupérées sur des lames en verre (superfrost plus Thermo, 1.0mm 25x75) et conservées à -20°C. L'anticorps primaire MRPm6 (Tebu-bio) dirigé contre MRP1 a été utilisé. Il s'agit d'un anticorps monoclonal produit chez la souris avec une concentration de 500 μg mL. L'anticorps primaire a été utilisé à une dilution 1/100 (5 μg/mL). L'anticorps secondaire fourni avec le Kit Ultra Vision LP, HRP/AEC (Labvision-Thermofisher) a été utilisé selon les instructions du fournisseur. La révélation a été effectué à l'aide du substrat Aminoethyl carbazole (AEC) qui a permis d'obtenir un précipité rouge sur le site réactionnel. La Figure 15 (Localisation du transporteur MRP1 dans la peau humaine par immunohistochimie) présente la localisation du trasporteur MRP1 dans la peau humaine révélée par immunohistochimie. Les images correspondant aux contrôles négatifs (absence de l'anticorps primaire) sont présentées à gauche, et les images obtenues après immuno- détection de MRP1 sont présentées à droite.
L'immunohistochimie a révélé que le transporteur MRP1 est bien détecté au niveau de la peau, et qu'il est principalement localisé au niveau des annexes du derme (glandes sudoripares, follicules pileux, muscles lisses). Des résultats similaires avec MDR1 ont été reportés récemment (Skazik C. et al, 201 1 ) montrant une localisation préférentielle au niveau du derme. La localisation de MRP1 au niveau des annexes, en particulier au niveau des follicules pileux est en faveur d'un rôle de ce transporteur MRP1 dans l'absorption cutanée.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé pour évaluer l'influence de transporteurs d'une cassette de liaison à ΓΑΤΡ (ABC) sur la pénétration d'une substance médicamenteuse dans la peau humaine, le procédé comprenant les étapes consistant à : (1 ) Préparer ex vivo des échantillons de peau humaine et maintenir les échantillons de peau dans des conditions de culture d'organes ;
(2) Mettre en contact un premier échantillon de peau avec un inhibiteur spécifique d'un transporteur ABC solubilisé dans un véhicule, dans des conditions de culture d'organes ;
(3) Mettre en contact un deuxième échantillon de peau (témoin) avec le véhicule, dans des conditions de culture d'organes ;
(4) Mettre en contact à la fois l'échantillon de peau témoin et celui traité avec l'inhibiteur du transporteur ABC avec une substance médicamenteuse, dans des conditions de culture d'organes ;
(5) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse recueillie dans le récepteur liquide (absorption) après pénétration à travers la peau ;
(6) Déterminer, pour chaque échantillon de peau, la quantité de substance médicamenteuse située dans les échantillons de peau (distribution) ; et
(7) Comparer le niveau d'absorption de la substance médicamenteuse dans le premier échantillon de peau (avec inhibiteur) avec celui de l'échantillon de peau témoin (sans inhibiteur).
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel des échantillons de peau humaine sont préparés ex vivo sans graisse sous-cutanée.
3. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les conditions de culture d'organes sont, de préférence, de 37°C environ pendant une durée allant de 1 minute environ à 72 heures environ.
4. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le premier échantillon de peau est mis en contact avec l'inhibiteur du transporteur ABC, de préférence à 37°C environ pendant une durée allant de 1 minute environ à 1 heure environ.
5. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le deuxième échantillon de peau est mis en contact avec le véhicule, de préférence à 37°C environ pendant une durée allant de 1 minute environ à 1 heure environ.
6. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel à la fois le premier (inhibiteur) et le deuxième (témoin) échantillons de peau sont mis en contact avec la substance médicamenteuse, de préférence à 37°C environ et pendant une durée allant de 1 heure environ à 72 heures environ et, plus préférablement, de 16 heures environ.
7. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la substance médicamenteuse utilisée est choisie pour le traitement de maladies de peau telles que des maladies inflammatoires de la peau, maladies de peau virales, maladies de peau fongiques, maladies de peau bactériennes et maladies cancéreuses de la peau.
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