EP2678672A1 - Biocapteur et procédé de fabrication d'un tel biocapteur - Google Patents

Biocapteur et procédé de fabrication d'un tel biocapteur

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Publication number
EP2678672A1
EP2678672A1 EP12705453.4A EP12705453A EP2678672A1 EP 2678672 A1 EP2678672 A1 EP 2678672A1 EP 12705453 A EP12705453 A EP 12705453A EP 2678672 A1 EP2678672 A1 EP 2678672A1
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EP
European Patent Office
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zone
radiation
sheet
resin
mask
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12705453.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jérôme POLESEL MARIS
Thomas Berthelot
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
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Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP2678672A1 publication Critical patent/EP2678672A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G—PHYSICS
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    • G01N29/022—Fluid sensors based on microsensors, e.g. quartz crystal-microbalance [QCM], surface acoustic wave [SAW] devices, tuning forks, cantilevers, flexural plate wave [FPW] devices
    • G—PHYSICS
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    • G01N29/036—Analysing fluids by measuring frequency or resonance of acoustic waves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
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    • G01N2291/042—Wave modes
    • G01N2291/0427—Flexural waves, plate waves, e.g. Lamb waves, tuning fork, cantilever

Definitions

  • the invention relates to a method for manufacturing a biosensor.
  • These chemical sensors are functionalized by molecules that can have a specific interaction with the biological material.
  • the detection of the specific interaction is related to changes in weight or force applied to a cantilever, or microbeam, otherwise called microlevier.
  • the silicon-based cantilevers, or microbeams can be put in series in the form of a matrix of sensors to improve the measurement statistics and thus the signal-to-noise ratio, but also to have different specific chemical interactions at the same time.
  • the external detection schemes of the silicon microbeam deflection mainly use the optical reflection detection of a laser known to those skilled in the art. This method is not very well adapted for detection in deflection of a cantilever matrix for difficulties in setting up one or more lasers and / or lenses for serial or parallel reading of an entire matrix of micro-beams.
  • an internal detection such as a piezoresistive sensor, piezoelectric or magneto-impedance has been implemented inside the microcarrier.
  • Each recessed sensor is addressed by metal electrodes.
  • the detection of the mechanical change, when the biomolecule functionalizing the biosensor is brought into contact with the biomolecule or the analyte to be detected and / or quantified can be carried out a) in dynamic mode when the cantilever is resonated at a frequency close to its resonance frequency to increase sensitivity detection, b) in static mode by detecting the deflection of the microbeam due to the modification of the surface stress of the microbeam when capturing the biomolecules.
  • the aim of the invention is to lift the solid sensor latch of integrated microleviers matrix operating in biological solution by proposing a new biosensor manufacturing process based on fluoropolymer materials, in particular piezoelectric materials, to produce biosensors equivalent to biosensors based on silicon technology but less expensive compared to these.
  • VUV radiation ultraviolet radiation (Vacuum Ultra Violet) of 200 to 100 nm wavelength, in the category of UV-C,
  • UV radiation radiation emitting at a wavelength of 400 to 280 nm, in the category of UV-A and UV-B,
  • Photosensitive or positive-type photoresist a photosensitive resin for which the portion exposed to UV or VUV radiation becomes soluble in a developer and / or the unexposed portion of the light-sensitive resin remains insoluble
  • Negative or Negative Photosensitive Resin A photosensitive resin for which the portion exposed to UV or VUV radiation becomes insoluble to a developer and / or the unexposed photosensitive resin portion remains soluble.
  • positive photoresists used in the invention are resins POSITIV 20 ® (KONTAKT CHEMIE) or resins 9260 AZ ®, 818 ® IF and SJR 5740 ® company MicroChem Corp. (Newton, USA),
  • Negative photoresists or negative type used in the invention are the following resins: AZ series resins MicroChemicals GmbH (Ulm, Germany) such that the resin AZ5214E ®, or SU8-2000 ® ® or SU8-3000 of MicroChem Corp. (Newton, USA).
  • PGMEA propylene glycol monomethyl ether acetate
  • SU8 ® resin the developer AZ ® 351B or AZ ® 726 for AZ5214E ® resin.
  • a solvent type Negative resist remover I 651 761 ® (Sigma-Aldrich).
  • biosensors of the invention comprise, in their simplest form:
  • microbeam also called a cantilever, which is the mobile part of the biosensor, connected to a support
  • At least one electrode at least a part of which is embedded in the microbeam
  • a mechano-electric transducer for converting the variations in the mechanical properties of the microbeam into an electrical signal, when the biological molecule A is brought into contact with a biological molecule B to be detected and / or quantified
  • the mechano-electric transducer uses a detection of the mechanical properties of the different microbeams according to the type of biosensors used.
  • the biosensor comprises only one electrode
  • a beam deflection inducing a variation of the electrical resistance of the electrode formed on the cantilever is detected: the detection is said to be piezoresistive.
  • the biosensor comprises a single electrode but also a ferromagnetic material on the part of the electrode embedded in the microbeam
  • the variation of the impedance of the ferromagnetic material is measured when the molecule A is brought into contact with the molecule B to detect and / or quantify.
  • Preferred ferromagnetic metals used in the invention to form the metal pad are selected from ferromagnetic metals with low coercive field, that is to say less than or equal to 2 Oersted.
  • the preferred metals are nickel, iron, cobalt or an alloy or mixture of at least two thereof.
  • the detection is performed by magneto-impedance.
  • the biosensor comprises two electrodes on the same face of the biosensor, a change in the resonance frequency of the microbeam is detected by mass change when the biomolecule A is brought into contact with the molecule B to be detected and / or quantified.
  • the detection is of the piezoelectric type.
  • the biosensor comprises two electrodes, one on one side of the biosensor and the other on the other side, the variation of the resonance frequency of the microbeam is measured by mass change when the biomolecule A is brought into contact with the molecule B to detect and / or quantify.
  • the detection is of the piezoelectric type.
  • the resonance frequency change is detected when the molecule A is contacted with the molecule B to be detected and / or quantified.
  • the detection is of the piezoelectric type.
  • the essential characteristic of the biosensor of the invention is that the microbeam attached to a support is made of a fluoropolymer material, possibly having piezoelectric properties, these properties being indispensable in the case where the type of detection is a piezoelectric detection.
  • the microbeam is integral with the support which is therefore also made of the same fluoropolymer material.
  • the preferred fluoropolymer materials used in the invention are, when the biosensor is not a piezoelectric-type biosensor, polyvinylidene fluoride (PVDF), or a copolymer of polyvinylidene fluoride and trifluoroethylene P (VDF-TrFe), or a polymer of tetrafluoroethylene (PTFE).
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • VDF-TrFe copolymer of polyvinylidene fluoride and trifluoroethylene P
  • PTFE polymer of tetrafluoroethylene
  • the fluoropolymer material used it is necessary for the fluoropolymer material used to be a fluoropolymer material having Piezoelectric. Examples of such materials are PVDF and P (VDF-TrFe) having piezoelectric properties.
  • the method of the invention makes it possible to manufacture a biosensor comprising:
  • microbeam which is the mobile part of the biosensor, connected to a support
  • At least one electrode at least a part of which is embedded in the micro-beam
  • a mechano-electric transducer for converting the variations in the mechanical properties of the microbeam into an electrical signal, when the biological molecule A is brought into contact with a biological molecule B to be detected and / or quantified
  • Non-limiting examples of A molecule B molecule pairs are as follows:
  • Detection of a particular antigen by a particular antibody allows, for example, whether or not a medium contains a particular antigen, for example to determine whether the medium is contaminated with the contaminant antigen or not.
  • RNA - molecule A DNA or RNA - molecule B: complementary strand.
  • - molecule A protein - molecule B: nucleic acid (DNA, RNA)
  • the detection of a particular antibody makes it possible, for example, to determine whether a human or animal subject has already had the disease of which the antigen is the marker.
  • the detection by a particular protein of a particular antibody makes it possible, for example, to detect certain markers of cancer, Alzheimer's disease, etc.
  • biosensor to screen drugs when the molecule A is an enzyme specific for a disease and that the molecule B is for example an inhibitor of this enzyme.
  • the possibilities of using the biosensor according to the invention are very wide.
  • the invention proposes a method of manufacturing a biosensor comprising:
  • microbeam which is the mobile part of the biosensor, connected to a support
  • the electrode at least one electrode, at least a part of which is embedded in the microcarrier, the electrode (s) optionally comprising a pad of ferromagnetic material,
  • a mechano-electric transducer for converting the variations in the mechanical properties of the microbeam into an electrical signal, when the biological molecule A is brought into contact with a biological molecule B to be detected and / or quantified
  • microbeam and its support are made of a fluoropolymer material and form an integral part
  • the interface between the fluoropolymer and the electrode is preferably of a covalent nature
  • step f functionalization, either of the zone prefunctionalized in step e), when this step is implemented, or of a zone of the microbeam, this zone being different from the embedding zone of the electrode (s) ( s),
  • step f grafting of at least one biological molecule A on the functionalized zone obtained in step f).
  • the electrode may be any conductive material which will be apparent to those skilled in the art.
  • it will be copper or gold.
  • the step d) of creating, in the fluoropolymer material sheet, the desired final shape of the biosensor and separating this form from the sheet, can be carried out:
  • step e) of prefunctionalization when such a step e) is implemented
  • step d) is carried out before step g) of grafting of biomolecule A as they make it possible not to damage or otherwise affect the biological molecule A during this step d).
  • step d several methods can be implemented to perform step d).
  • a first of these methods includes the following steps:
  • step d2) compressing the mold made in step d1) on the sheet of a fluoropolymer material, d3) cutting around the mold of the desired structure by stamping with heating and / or ultrasonic acoustic excitation of the cutting die.
  • a second method for implementing step d) comprises a step d4) of cutting the desired shape in the sheet of a fluoropolymer material by an excimer laser emitting in the wavelength range of the VUVs.
  • a third method for implementing step d) comprises the following steps:
  • step d6) the protocols established by E. Edqvist et al., J. Micromech can be used. Microeng. 18, 015007 (2008) and Frank D. Egitto, Pure & Appl. Chem. 62 (9), 1699-1708 (1990).
  • step d) can also be carried out only after the steps f) of functionalization and g) grafting of the biomolecule.
  • step d) is implemented before step e), after step e), or after step f).
  • a fourth method for implementing step d) comprises the following steps:
  • step d8) compressing the mold made in step d7) on the sheet of a fluoropolymer material
  • a fifth method for implementing step d) comprises a step d10) of manual cutting, preferably with a scalpel, under a microscope, of the desired shape of the final sensor.
  • the mold, in the first and fourth methods may be any material having a hardness greater than that of the fluoropolymer material.
  • a first method of manufacturing the electrodes comprises the following steps:
  • a mask made of a material not transparent to a VUV radiation comprising at least one opening or a zone of a material that is transparent to the VUV radiation, on the sheet made of fluoropolymer material, this opening or this zone having the shape desired electrode (s),
  • step a2) irradiation with said VUV radiation, under an inert gas, preferably nitrogen, of the sheet obtained in step a1),
  • step a4) a5) binding of Cu 2+ ions, by chelation, to PAA grafted in step a4), and a6) reduction of Cu 2+ ions to micro- or nano-particles of copper, preferably in the presence of NaBH 4 ,
  • step a2) irradiation with VUV radiation is carried out under an inert gas.
  • inert gas argon or nitrogen can be used as the inert gas argon or nitrogen.
  • Nitrogen will be preferred for cost issues.
  • Step a4) as in the rest of the text, all the grafting steps of acrylic acid molecules, by conventional chemistry, on irradiated areas VUV radiation can be performed with the following components and the following procedure:
  • the irradiated areas are contacted with a solution containing acrylic acid which is then polymerized.
  • This solution can see the percentage of acrylic acid vary from 0.5% to 100%.
  • the solutions will then be carried out by diluting the acrylic acid in ultrapure water or ethyl acetate, for example. Preferably, it will be necessary to take a solvent solubilizing acrylic acid to obtain a single phase.
  • Those skilled in the art can refer to the French patent application FR 0 955 859 for more information.
  • Mohr salt (NH 4) 2 Fe (S0 4) 2 .6H 2 0) will be added up to 0.25% by weight. The latter makes it possible to inhibit the homopolymerization of acrylic acid in solution and thus to promote the grafting on / in the irradiated material.
  • Step a5) as in the rest of the text, all the steps for fixing Cu 2+ ions by chelation, on the PAA, as well as the step a6) of reducing these Cu 2+ ions, are described fully in the US patent application 2010/0310800 filed April 30, 2010.
  • Step a5) as in the rest of the text, all the steps for fixing Cu 2+ ions by chelation can be carried out using the following compounds and according to the following procedure:
  • the step of fixing Cu 2+ ions of the process according to the present invention consists in putting the polymer-type compound capable of chelating (or complexing) the metal ions in the presence of such metal ions.
  • the acrylic acid polymer i.e., polyacrylic acid or PAA is preferably used as the polymer type compound.
  • This step is therefore a chelation step with complexation.
  • the term "metal ion” means an ion of the type M n + , with M representing a metal and n being an integer between 1 and 7, and generally between 1 and 4. Typically it is is an alkali metal ion, an alkaline earth metal, a lean metal (especially Al, Ga, In, Sn, Pb, Tl, Bi) or a transition metal.
  • the present invention relates more particularly to the ions of a transition metal.
  • a metal ion according to the invention is selected from the group consisting of Ag + , Ag 2+ , Ag 3+ , Au + , Au 3+ , Cd 2+ , Co 2+ , Cr + , Cu + , Cu 2 + , Fe 2+ , Hg 2+ , Mn 2+ , Ni + , Pd + , Pt + , Ti 4+ and Zn 2+ .
  • the preferred ion is Cu 2+ .
  • the metal ion is in an Si salt solution, advantageously in an aqueous saline solution, in the presence of an anionic counterion.
  • anionic counterions that can be used, mention may be made of a chloride (CF), a bromide (Br " ), a fluoride (F), an iodide (F), a sulphate (SO 4 2- ), a nitrate (NO 3 " ) or a phosphate (P0 4 3 ⁇ ).
  • the pH of the saline solution used during step (a5) may be necessary to control the pH of the saline solution used during step (a5) in particular for the groups (or structures) capable of chelating the ions
  • the metal compounds carried by the polymer-type compound are in a form suitable for this chelation, for example, in ionized form.
  • Those skilled in the art will know according to the chelating groups carried by the polymer-type compound and the Si solution, if it is necessary or not to modify the pH of this solution. If so, those skilled in the art knows different pairs acid / base capable of modifying the pH such as CH 3 COOH / NH 3 or CH 3 COOH / NaOH.
  • the chelation step may be carried out with stirring, in particular by using a stirrer, a magnetic bar, an ultrasonic bath or a homogenizer and at a temperature below 60 ° C., in particular between 5 and 50 ° C., and especially between 10 and 40 ° C.
  • Step a5) according to the invention is carried out, in a particular embodiment, at room temperature.
  • ambient temperature is meant a temperature of 20 ° C ⁇ 5 ° C.
  • Step a6) of reducing Cu 2 ions to micro-copper nanoparticles is well known to those skilled in the art.
  • This step a6) as all the steps in the remainder of this text, in the rest of the text, are steps of chemical or photochemical reduction of metal ions, can be implemented in the following way:
  • the chemical or photochemical reduction step of the process according to the invention consists in reducing the chelated (or complexed) metal ions by the polymer-type compound. Any reduction technique known to those skilled in the art can be used during this step.
  • this reduction step is a chemical reduction or a photoreduction.
  • the reducing solution S 2 is basic.
  • the reducing solution S 2 comprises a reducing agent, in particular chosen from the group consisting of sodium borohydride (NaBH 4 ), dimethylamine borane (DMAB-H (CH 3 ) 2 NBH 3 and hydrazine (N 2 H 4 ).
  • the pH of the reducing solution S 2 is neutral or basic, whereas for DMAB the pH of the solution S 2 is basic
  • the reducing agent is present in the reducing solution S 2 at a concentration of between 10 -4 and 5 M, in particular between 0.01 and 1 M and in particular of the order of 0.1 M (ie 0.1 M ⁇ 0.01 M).
  • chemical reduction step can be carried out at a temperature between 30 and 90 ° C, especially between 40 and 80 ° C and, in particular, between 50 and 80 ° C.
  • the step a6) chemical reduction can last between 30 sec and 1 h, in particular between 1 and 30 min and, in particular, between 2 and 20 min. This step may be a photoreduction step.
  • Ag ⁇ , Pt + , Pd + , and Au + ions can be reduced by UV irradiation (Edjala T et al, New Journal of Chemistry, Vol 32, Issue 8, 2008. Eda Ozkaraoglu, Ilknur Tune and Sefik Suzer , Polymer, Vol.50, Issue 2, 2009).
  • this reduction involves an intermediate which can typically be a counter-ion or an organic molecule which, subjected to UV irradiation, provides the electrons necessary for the reduction of metal ions.
  • this type of method may involve linear optical phenomena and nonlinear optics (typically a multiphoton process).
  • Step a7) just like all the steps which, in the rest of the text, are stages of growth or formation of a layer of copper or gold can be carried out according to the following procedure:
  • This step implements a metallization bath in which the activated polymers are immersed.
  • the metal growth is catalyzed by the metal particles deposited in step a6).
  • the metallization bath is a stable solution containing at least one metal cation and its complexing agent, a reducing agent and a stabilizer, generally in an alkaline medium.
  • the precursors of the metallic material reduced in step a6) of the process according to the invention predominantly have an oxidation degree of 0.
  • the metallization can then take place by immersion in a metallization bath and growth on the precursor particles at an oxidation degree of 0.
  • the samples are immersed in the solution described in Table 1 below, heated to 40 ° C in a water bath:
  • the samples were rinsed with ultrapure water, for example supplied by Millipore, under ultrasound for 10 minutes before being dried.
  • ultrapure water for example supplied by Millipore
  • XPS analysis confirms the presence of a metallic copper layer (in its reduced form, Cu °).
  • the copper layer is also visible to the naked eye.
  • the presence of carbon, nitrogen and oxygen after metallization is due to the presence of organic impurities at the extreme surface of the metallized substrate.
  • Oxygen can also come from the air oxidation of the copper layer prior to analysis.
  • a mask is used in a material not transparent to the VUV radiation comprising either one or more openings or one or more zones of a material that is transparent to the VUV radiation.
  • non-transparent material to VUV radiation mention may be made of copper and silicon and, as a material transparent to VUV radiation, mention may be made of fused silica, quartz, CaF and MgF 2 .
  • the electrodes may also be manufactured according to the method comprising the following steps:
  • irradiation with said UV radiation of the layer formed in step a8) through a mask of a non-transparent material to said UV radiation comprising at least one opening or a zone of a material transparent to said UV radiation, this opening or this zone having the desired shape (of) electrode (s),
  • step al2) fixation of Cu 2+ ions, by chelation, on PAA formed in step al 1), al 3) reduction of chelated Cu 2+ ions in PAA to form copper microparticles or nanoparticles allowing autocatalysing the metallization bath of step a4),
  • a UV-sensitive resin of a positive type is used, and the irradiated resin zones are then removed and after irradiation.
  • the mask used is a mask made of a material that is not transparent to UV radiation, comprising either openings (no material in this opening) or zones made of a material that is transparent to UV.
  • materials which are not transparent to UV are copper, silicon, certain inks, certain polymeric materials such as, for example, polyethylene terephthalate (PET) or polypropylene (PP).
  • UV-transparent materials are fused silica, quartz, calcium fluoride (CaF 2 ), magnesium fluoride (MgF 2 ), glass or silica.
  • Step a1) is a step of forming a PAA polymer by diazonium salt technology.
  • Diazonium salt technology is also known in the art as GraftFast ® technology.
  • This step like all the steps which in the following text refer to the grafting of acrylic acid molecules on the sheet of a fluoropolymer material by diazonium salt technology, is carried out as follows:
  • a solution of a diazonium salt is first prepared from 10 ml of a solution of 1-4 phenyldiamine at 0.1 M in HCl (0.5 M), to which was added 10 ml of 0.1 M NaNO 2 solution in water. To this solution of diazonium salt are added 200 mg of iron filings and then, after 5 minutes, 10 ml of AA.
  • the sample is then introduced into the reaction medium for 2 h, before being rinsed with water and introduced into a sodium hydroxide solution at pH 9.5 in the presence of ultrasound so as to solubilize the polyacrylic acid ( PAA) ungrafted. More details on this method can be found in French Patent FR 2 910 006.
  • the electrode manufacturing step a) can still be implemented according to a method which comprises the following steps:
  • step al7 binding of Cu 2+ ions, by chelation, to the PAA formed in step a6), 8) reduction of the chelated ions for the formation of micro- or nanoparticles of copper to activate the metallization bath of step al9)
  • step a20 depositing a layer of UV-sensitive resin, of positive type, on the surface of the sheet of fluoropolymer material and metallized obtained in step a11),
  • a21 irradiation, with said UV radiation, of the layer formed in step a20), through a mask made of a non-transparent material to said UV radiation comprising at least one opening or zone made of a transparent material UV radiation, this opening or this zone detouring the desired shape of the electrode (s),
  • Step al 7 Cu 2+ ion binding, by chelation, on PAA and reduction of these Cu 2+ ions, is fully described in US patent application 2010/0310800 filed April 30 2010.
  • step a23 As well as the steps which, in the rest of the text, are chemical etching elimination steps, of the layer of copper or gold formed, it is carried out by dipping the sheet a fluoropolymer material is in a solution of FeCl 3 , when the layer is copper, or aqua regia, which is a mixture of hydrochloric acid and concentrated nitric acid containing two or three volumes of hydrochloric acid for a volume of nitric acid, when the layer is gold.
  • a fluoropolymer material is in a solution of FeCl 3 , when the layer is copper, or aqua regia, which is a mixture of hydrochloric acid and concentrated nitric acid containing two or three volumes of hydrochloric acid for a volume of nitric acid, when the layer is gold.
  • the electrode forming step a) may further comprise the following steps:
  • step a30 depositing a UV-sensitive, positive-type resin layer on the sheet of a metallized fluoropolymer material obtained in step a29),
  • a31 irradiating, with said UV radiation of the layer formed in step a30), through a mask made of a material transparent to said UV radiation, comprising an opening or zone made of a material that is transparent to UV, this opening or this zone detouring the desired shape of the electrode (s),
  • step a33 removing, by chemical etching, in the areas where the resin has been irradiated, the copper layer if formed in step a29), preferably with FeCl 3 , or the gold layer, if formed in step a29), preferably with a mixture of HN0 3 / HCl (aqua regia), a34) removal of the remaining resin.
  • a last method for implementing step a) of forming the electrodes, in the method of the invention is a step which comprises the following steps:
  • a36 irradiating, with said UV radiation, the layer formed in step a35), through a mask made of a non-UV transparent material, comprising at least one opening or zone made of a material transparent to said UV radiation, this opening or zone having the desired shape of the electrodes,
  • step c) passivation of the electrodes When a pad of ferromagnetic material on the electrodes is not necessary, go directly to step c) passivation of the electrodes.
  • Step b) of forming a stud in a ferromagnetic material can be implemented by a method which comprises the following steps:
  • a mask made of a non-transparent material to said UV radiation comprising an opening or an area made of a material transparent to said UV radiation, this opening or this area having the shape and the location on the sheet obtained in step b1) of the desired pad on an area of the electrode previously obtained by steps a),
  • step b6) binding, by chelation, of metal ions selected from Ni, Fe, Fe, Co 2+ or a mixture of at least two thereof, on PAA grafted in step b5),
  • the step b5) of forming a PAA polymer in the areas where the irradiated resin has been removed by the diazonium salt technology corresponds to the implementation of the GraftFast ® technology which is fully described in the application. FR 0 758 660 and also above.
  • step b7) of chemical reduction of the metal ions fixed in step f6) it is carried out as above.
  • Step b8) just like all the steps which in this text refer to a step of growth of the metal layer, can be carried out from the following compounds and as follows:
  • the electrode of the fluoropolymer sheet, immersed in this bath, is connected to a current source with a carbon counter-electrode in the same bath for a current density of 14.5 mA / cm 2 .
  • This galvanic deposition will be preferentially under an external magnetic field (of the order of 0.2 milliTesla) applied to improve the magnetic properties of the ferromagnetic pad for the magneto-impedance sensor.
  • This step is carried out when the thickness of the metal layer obtained after reduction of the metal ions is not of a sufficient thickness, that is to say at a thickness of less than 1 micrometer.
  • Step c) of passivation of the electrodes comprises the following steps:
  • step c2) deposition or grafting, on the resin layer obtained in step c1), of a mask made of a material not transparent to UV radiation, comprising an opening or an area made of a material transparent to said UV radiation, this opening or this zone having the shape of the electrode (s),
  • Step c) passivation of the electrodes may also be implemented by a method which comprises the following steps:
  • step c) electrode passivation can also be implemented according to a method which comprises the following steps: 1) electrografting of an electrophoretic polymer material on the electrodes,
  • the electrophoretic polymer material which is electrografted in step l1) is, for example, a GLASSOPHOR ® cathodic electrophoretic paint (BASF, Germany).
  • the electrografting is carried out as follows:
  • the electrode to be passivated with an electrophoretic paint film is connected to the negative pole of a voltage source, and immersed in a bath of GLASSOPHOR ® .H 2 0 to 40% with a counter electrode plate connected to the positive pole of the source of tension. A voltage of 17 volts is then applied between the two electrodes until the current detected in the circuit becomes zero. The electrode covered with the passivating film is then removed from the bath and rinsed with Millipore ® ultrapure water.
  • step cl 2 The heating of step cl 2) is carried out at a temperature between 70 ° C and 130 ° C for about 30 minutes.
  • the functionalization step f) is intended to provide a zone of the microbeam with functions capable of reacting with functions of the biomolecule A, to allow the grafting of the biomolecule A.
  • step f) is, in the invention, a step of forming a layer of poly (acrylic acid) PAA polymer.
  • the method of the invention does not include step e) of prefunctionalization and two methods of functionalization (formation of a PAA polymer layer) are possible.
  • the first of these methods comprises the following steps: f) deposition or grafting of a mask in a non-transparent material to a VUV radiation, comprising an opening or a zone of a material transparent to said VUV radiation, this opening or this zone having the forming the zone of the sheet in a fluoropolymer material to be functionalized, this opening or this zone being located in the part of the mask corresponding to the microbeam to be formed, and outside the zone of the microbeam on which the electrode or electrodes are embedded or are recessed,
  • step f2 irradiation, by said VUV radiation, in an inert gas, preferably nitrogen, of the sheet obtained in step fl),
  • the step of grafting a mask onto the fluoropolymer sheet may be carried out by applying a mask made of a non-transparent material to the VUV radiation comprising either one or more openings or one or more zones made of a material that is transparent to the radiation.
  • VUV a material not transparent to VUV radiation
  • the second method for implementing step f) comprises the following steps:
  • PAA acrylic acid polymer
  • a zone of the microcarrier When for grafting the biomolecule A, it is necessary for a zone of the microcarrier to be provided with different functions of a carboxylic acid function, that is to say when, to graft the biomolecule A, functions such as amino functions (NH 2 ), thiol functions (SH), azide functions (N 3 ), alcohol (hydroxyl) functions (OH), alkene functions or maleimide groups, or activated ester groups, preferably groups succinimide ester, the method of the invention comprises a step e) of pre-functionalization of a zone of the microbeam, this prefunctionalized zone then being modified by grafting of an organic molecule which will then carry the function or the group necessary for react with a group of the biological molecule.
  • functions such as amino functions (NH 2 ), thiol functions (SH), azide functions (N 3 ), alcohol (hydroxyl) functions (OH), alkene functions or maleimide groups, or activated ester groups, preferably groups succinimide ester
  • a first method for implementing the pre-functionalization step e) comprises the following steps: el) depositing or grafting a mask made of a material not transparent to VUV radiation, comprising an opening or an area made of a material transparent to said VUV radiation, this opening or this area having the shape of the zone of the sheet of a material fluoropolymer to functionalize, this opening or this zone being located in the part of the mask corresponding to the microbeam to be formed, and outside the zone of the microbeam on which the (the) electrode (s) is (are) embedded (s) or built-in,
  • step e2 irradiation, by said VUV radiation, under an inert gas, preferably nitrogen, of the sheet obtained in step el),
  • a second method for implementing the pre-functionalization step e) comprises the following steps:
  • PAA acrylic acid polymer
  • Step f) of functionalization of the zones prefunctionalized by the first and the second prefunctionalization method described above is then a step noted flO), of modifying the PAA polymer formed in step e4) or in step e8) with an organic molecule, comprising at its end not bound to the PAA, NH 2 , or SH, or N 3 , or OH, or alkene, or maleimide groups, or activated ester groups, preferably succinimide, by conventional chemistry, in the zone irradiated in step e6).
  • this modification of the PAA is carried out by conventional chemistry; the PAA is modified by an organic molecule either by creating a amide bond, for example, between a carboxylic acid function of PAA and a primary or secondary amine function of the organic molecule, for example by the creation of an ester bond between a carboxylic acid function of PAA and an alcohol of the organic molecule.
  • the organic molecule thus grafted may then have another function or a group that can be functionalized or react with a biological molecule.
  • This function or this group may be an amino function NH 2 , a thiol function SH, an azide function N 3 , an alcohol function (hydroxyl), a terminal alkene function, a maleimide group, a succinimide ester-type activated group.
  • Those skilled in the art will be able to modify the PAA accordingly in order to be able to functionalize it with such an organic molecule.
  • the step e) of prefunctionalization comprises the following steps:
  • the functionalization step f) is a step of activating the poly (aminophenylene) polymer layer formed in step el4) in a poly (diazonium phenylene) layer.
  • step el 4 the following starting compounds and the following protocol may be used:
  • the primer was prepared according to the protocol that was illustrated in [Chem. Mater. 2007, 19, 6323-6330].
  • PVDF Polyvinylidene fluoride
  • Step f1) as well as all the steps which in the rest of the text is a step of modifying a poly (aminophenylene) polymer layer into poly (diazonium phenylene), is described in patent application FR 0 857 260.
  • Glucose oxidase (Sigma Aldrich) was dissolved in ultrapure water (1 mg in 3 mL). 200 of this solution was deposited on the sample previously coated with a layer of poly (diazonium phenylene). The deposit was made without special precautions and at room temperature. After 10 min of reaction, the support is rinsed with ultrapure water and then subjected to washing under sonication: ultrapure water 2 min / ethanol 2 min ultrapure water 2 min.
  • a fourth method and a fifth method of prefunctionalization of a zone of the microbeam may also be used when, in order to graft biomolecule A onto the microbeam, it is necessary for this zone of the microbeam to be provided with different functions of carboxylic acid functions. .
  • a fourth method for implementing the prefunctionalization step e) comprises the following steps:
  • el 5 depositing or grafting, on the fluoropolymer material sheet, a mask, made of a material not transparent to VUV radiation, comprising an opening or an area made of a material transparent to said VUV radiation, said opening or zone having the desired shape of the zone to be functionalized, and being located in the zone of the mask corresponding to the microbeam to be formed but different from that in which the (the) electrode (s) is (are) recessed (s) or recessed,
  • step e1 el9 binding of Cu 2+ ions, by chelation, on PAA grafted in step e1), e20) growing, in the zone where the Cu ions have been fixed, a layer of a metal chosen from copper, gold, platinum or silver, by reducing the Cu 2+ ions when the layer to be formed must be made of copper, or in a metal bath, when the layer to be formed must be of a metal other than copper.
  • the fifth method for implementing the prefunctionalization step e) comprises the following steps:
  • step e22 irradiating, with said UV radiation, the layer formed in step e21), through a mask made of a material not transparent to said UV radiation comprising an opening or an area made of a material transparent to said UV radiation, said opening or this zone having the desired shape of the zone to be functionalized, and being located in the zone of the mask corresponding to the microbeam to be created but different from that in which the (the) electrode (s) is (are) embedded (s) or built-in,
  • Stage f) of functionalization of the region of the microbeam functionalized by the fourth and fifth prefunctionalization methods depends, again, on the function that it is necessary to graft on the prefunctionalized zone so that it reacts with a reactive function of biomolecule A.
  • the step f) of functionalization comprises the following steps:
  • fl2 deposition of a positive type resin, sensitive to UV radiation, on the sheet comprising the metallized zone obtained in step e20) or on the sheet comprising the metallized zone obtained in step e26), fl3) irradiation of the sheet obtained in step fl2), through a mask of a material not transparent to said UV radiation, having an opening or a zone of a material transparent to said UV radiation, this opening or this zone corresponding to the metallized zone of the sheet other than F (the) electrode (s) defined in (a),
  • This method of functionalization is applicable regardless of the nature of the metal layer which has been grown in step e20) or in step e26), respectively.
  • a specific method of prefunctionalization of the prefunctionalized (metallized) zones, using the fourth and fifth prefunctionalization methods of the invention, when these zones are in gold, is a method which comprises the following steps:
  • Biomolecule A is grafted onto the functions and reactive free end groups of the molecule bound to step f11).
  • a particular functionalization method f) when the functionalized (metallized) zones obtained by the prefunctionalization methods e), according to the invention, are in a metal different from gold, is a method which comprises the following steps:
  • f20 deposition of a positive type resin, sensitive to UV radiation, on the sheet comprising the metallized zone obtained in step e20) or on the sheet comprising the metallized zone obtained in step e26), f21) irradiation of the sheet obtained in step f20), through a mask made of a material not transparent to said UV radiation, comprising an opening or a zone of a material transparent to said UV radiation, this opening or this zone corresponding to the metallized zone of the sheet other than the electrode (s) defined in protocols a),
  • the biomolecule A is then grafted on these functions or free reactive groups of the organic biomolecule set in step 25).
  • the zone of the functionalized microbeam, the molecule at step g) of grafting of biomolecule A is a reaction step of the reactive functions of biomolecule A with the free reactive functions present on the functionalized zone of the microbeam.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de fabrication d'un biocapteur. Le biocapteur de l'invention comprend une micropoutre, qui est la partie mobile du biocapteur, reliée à un support, au moins une électrode dont une partie au moins est encastrée sur la micropoutre, au moins une molécule biologique A greffée sur la micropoutre dans une zone différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s), un transducteur mécano-électrique de conversion en signal électrique des variations des propriétés mécaniques de la micropoutre, lorsque la molécule biologique A est mise en contact avec une molécule biologique B à détecter et/ou quantifier. Le procédé de l'invention est caractérisé en ce que la micropoutre et son support sont en un matériau fluoropolymère et forment une pièce intégrale, et en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) formation sur feuille en un matériau fluoropolymère d'au moins une électrode, b) optionnellement formation d'un plot en un matériau ferromagnétique sur la(les) électrode(s), c) passivation de la(des) électrode(s), d) création dans la feuille en un matériau polymère de la forme désirée finale du biocapteur et séparation de cette forme de la feuille, e) optionnellement préfonctionnalisation d'une zone de la micropoutre, cette zone étant différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s), f) fonctionnalisation soit de la zone préfonctionnalisée lorsque l'étape e) est mise en oeuvre, soit d'une zone de la micropoutre, cette zone étant différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s), g) greffage d'au moins une molécule biologique A sur la zone fonctionnalisée obtenue à l'étape f). L'invention trouve application dans le domaine de la détection de molécules biologiques, en particulier.

Description

BIOCAPTEUR ET PROCEDE DE FABRICATION D'UN TEL BIOCAPTEUR
L'invention concerne un procédé de fabrication d'un biocapteur.
La plupart des capteurs chimiques basés sur les cantilevers ou micropoutres utilisent la technologie bien connue du silicium.
Ces capteurs chimiques sont fonctionnalisés par des molécules qui peuvent avoir une interaction spécifique avec la matière biologique.
On parle alors de biocapteurs.
Les applications de ces capteurs hautement sensibles concernent le domaine de la protéomique, de l'hybridation de brins d'ADN ou d'ARN et de la culture et du criblage cellulaire.
La détection de l'interaction spécifique est liée aux changements de poids ou de force appliqués sur un cantilever, ou micropoutre, autrement appelé microlevier.
Ce changement mécanique est détecté par un capteur externe ou interne au cantilever. Les cantilevers, ou micropoutres, à base de silicium peuvent être mis en série sous forme d'une matrice de capteurs pour améliorer la statistique de mesure et ainsi le rapport signal-sur-bruit, mais également pour avoir différentes interactions chimiques spécifiques en même temps. Cependant, les schémas de détection externe de la déflection de la micropoutre en silicium utilisent principalement la détection optique par réflexion d'un laser connue de l'Homme du métier. Cette méthode n'est pas très bien adaptée pour une détection en déflection d'une matrice de cantilevers pour des difficultés de mise en place d'un ou plusieurs lasers et/ou de lentille pour la lecture sérielle ou parallèle d'une matrice entière de micropoutres. Cela sera d'autant plus le cas si la matrice contient un très grand nombre (plus d'une dizaine) de microleviers fonctionnant en simultané. De plus, les interfaces air/liquide mal contrôlées peuvent induire des artefacts de mesures empêchant une détection stable de la déflection de la micropoutre en solution biologique.
Donc, pour lever ces verrous techniques de détection massive de matrice de capteurs, une détection interne telle qu'avec un capteur piezorésistif, piézoélectrique, ou à magnéto-impédance a été mise en œuvre à l'intérieur de la micropoutre.
Chaque capteur encastré est adressé par des électrodes métalliques.
La détection du changement mécanique, lorsque la biomolécule fonctionnalisant le biocapteur est mise en contact avec la biomolécule ou l'analyte à détecter et/ou quantifier peut être effectuée a) en mode dynamique lorsque le cantilever est mis en résonance à une fréquence proche de sa fréquence de résonance pour augmenter la sensibilité de la détection, b) en mode statique par détection de la déflexion de la micropoutre due à la modification de la contrainte de surface de la micropoutre lors de la captation des biomolécules.
La technologie au silicium est très coûteuse pour la mise en oeuvre de tels capteurs internes intégrés dans des cantilevers de quelques micromètres ou même millimètres avec des électrodes. De plus, les électrodes acheminant le signal électrique issu du capteur interne du microlevier sont en contact direct avec la solution biologique où opère le microlevier. Etant donné le caractère hautement conducteur et ionique de la solution biologique et pour des raisons évidentes de problèmes de court-circuit et/ou de corrosion du métal composant les électrodes, ce dispositif ne pourra pas fonctionner dans ce cas.
L'invention vise à lever le verrou de détection massive de matrice de microleviers à capteur intégré fonctionnant en solution biologique en proposant un nouveau procédé de fabrication de biocapteurs basé sur des matériaux fluoropolymère, en particulier piézoélectriques, pour fabriquer des biocapteurs équivalents aux biocapteurs basés sur la technologie du silicium mais moins coûteux en comparaison à ceux-ci.
Dans la description qui suit, les termes suivants ont la signification suivante :
« rayonnement VUV » : rayonnement ultraviolet (Vacuum Ultra Violet) de 200 à 100 nm de longueur d'onde, dans la catégorie des UV-C ,
« rayonnement UV » : rayonnement émettant à une longueur d'onde de 400 à 280 nm, dans la catégorie des UV-A et UV-B,
« résine photosensible positive ou de type positif » : résine photosensible pour laquelle la partie exposée à un rayonnement UV ou VUV devient soluble dans un révélateur et/ou la portion de résine photosensible non exposée reste insoluble,
« résine photosensible négative ou de type négatif » : résine photosensible pour laquelle la partie exposée au rayonnement UV ou VUV devient insoluble à un révélateur et/ou la portion de résine photosensible non exposée reste soluble.
Des exemples de résines photosensibles positives utilisables dans l'invention sont les résines POSITIV 20® (KONTAKT CHEMIE) ou résines AZ 9260®, SI 818® et SJR 5740® de la société MicroChem Corp. (Newton, USA),
Pour éliminer les zones de résine irradiées on peut utiliser les révélateurs suivants : une solution OH.H20 ou NaOH.H20 à 0.25 mol/1. Pour une élimination totale de la résine (irradiée ou non-irradiée) on utilisera un solvant type acétone ou DMSO (Diméthylsulfoxide). Les résines photosensibles négatives ou de type négatif utilisables dans l'invention sont les résines suivantes : série des résines AZ de MicroChemicals GmbH (Ulm, Germany) telle que la résine AZ5214E®, ou la SU8-2000® ou SU8-3000® de MicroChem Corp. (Newton, USA).
Pour éliminer les zones de résine non irradiées, on peut utiliser les révélateurs suivants : du PGMEA (propylene glycol monomethyl ether acétate) pour la résine SU8®, ou le révélateur AZ 351B® ou AZ 726® pour la résine AZ5214E®. Pour une élimination totale de la résine (irradiée ou non-irradiée) on utilisera un solvant du type Négative resist remover I 651761® (Sigma- Aldrich).
« propriété mécanique de la micropoutre » : changement de masse, de la fréquence de résonance, du facteur de qualité, de la contrainte mécanique surfacique ou de la constante de raideur de la micropoutre.
Les biocapteurs de l'invention comprennent, dans leur plus simple expression :
- une micropoutre, appelée aussi cantilever, qui est la partie mobile du biocapteur, reliée à un support,
- au moins une électrode dont au moins une partie est encastrée sur la micropoutre,
- au moins une molécule biologique A greffée sur la micropoutre dans une zone différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
- un transducteur mécano-électrique de conversion en signal électrique des variations des propriétés mécaniques de la micropoutre, lorsque la molécule biologique A est mise en contact avec une molécule biologique B à détecter et/ou quantifier,
Le transducteur mécano-électrique utilise une détection des propriétés mécaniques de la micropoutre différente selon le type de biocapteurs utilisés.
Lorsque le biocapteur comprend une électrode seulement, on détecte une déflexion de poutre induisant une variation de la résistance électrique de l'électrode formée sur le cantilever : la détection est dite de type piezorésistif.
Lorsque le biocapteur comprend une seule électrode mais également un plot en un matériau ferromagnétique sur la partie de l'électrode encastrée dans la micropoutre, on mesure la variation de l'impédance du matériau ferromagnétique lorsque la molécule A est mise en contact avec la molécule B à détecter et/ou quantifier. Les métaux ferromagnétiques préférés utilisés dans l'invention pour former le plot métallique sont choisis parmi les métaux ferromagnétiques à champ coercitif faible, c'est-à-dire inférieur ou égal à 2 Oersted.
Les métaux préférés sont, le nickel, le fer, le cobalt ou un alliage ou mélange de deux au moins de ceux-ci.
La détection est effectuée par magnéto-impédance.
Lorsque le biocapteur comprend deux électrodes sur la même face du biocapteur, on détecte un changement de la fréquence de résonance de la micropoutre par changement de masse lorsque la biomolécule A est mise en contact avec la molécule B à détecter et/ou quantifier.
La détection est de type piézoélectrique.
Lorsque le biocapteur comprend deux électrodes l'une sur une face du biocapteur et l'autre sur l'autre face, on mesure la variation de la fréquence de résonance de la micropoutre par changement de masse lorsque la biomolécule A est mise en contact avec la molécule B à détecter et/ou quantifier.
La détection est de type piézoélectrique.
Lorsque le biocapteur comprend trois électrodes, deux électrodes sur une première face du biocapteur et l'autre sur l'autre face en vis-à-vis avec les deux électrodes de la première face, on détecte le changement de fréquence de résonnance lorsque la molécule A est mise en contact avec la molécule B à détecter et/ou quantifier.
La détection est du type piézoélectrique.
La caractéristique essentielle du biocapteur de l'invention est que la micropoutre reliée à un support est en un matériau fluoropolymère, éventuellement ayant des propriétés piézoélectriques, ces propriétés étant indispensables dans le cas où le type de détection est une détection piézoélectrique.
La micropoutre est intégrale avec le support qui est donc également constitué du même matériau fluoropolymère.
Les matériaux fluoropolymères préférés utilisés dans l'invention sont, lorsque le biocapteur n'est pas un biocapteur à détection de type piézoélectrique, le polyvinylidène fluorure (PVDF), ou un copolymère de polyvinylidène fluorure et de trifluoroéthylène P(VDF-TrFe), ou un polymère de tétrafluoroéthylène (PTFE). Lorsque le biocapteur selon l'invention est un biocapteur à détection piézoélectrique, il est nécessaire que le matériau fluoropolymère utilisé soit un matériau fluoropolymère ayant des propriétés piézoélectriques. Les exemples de tels matériaux sont le PVDF et le P(VDF-TrFe) ayant des propriétés piézoélectriques.
Ainsi, le procédé de l'invention permet de fabriquer un biocapteur comprenant :
- une micropoutre, qui est la partie mobile du biocapteur, reliée à un support,
- au moins une électrode dont une partie au moins est encastrée sur la micro poutre,
- au moins une molécule biologique A greffée sur la micro poutre dans une zone différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
- un transducteur mécano-électrique de conversion en signal électrique des variations des propriétés mécaniques de la micropoutre, lorsque la molécule biologique A est mise en contact avec une molécule biologique B à détecter et/ou quantifier,
Des exemples, non limitatifs, de couples molécule A- molécule B sont les suivants :
- molécule A : anticorps-molécule B : antigène.
Une détection d'un antigène particulier par un anticorps particulier permet de savoir, par exemple, si un milieu contient ou pas un antigène particulier, par exemple pour déterminer si le milieu est contaminé ou pas par l'antigène du contaminant.
- molécule A : ADN ou ARN - molécule B : brin complémentaire.
- molécule A : sucre - molécule B : protéine.
- molécule A : protéine - Molécule B : Acide nucléique (ADN, ARN)
- molécule A : Acide nucléique (ADN, ARN) - Molécule B : Protéine
- molécule A : protéine - molécule B : protéine
- molécule A : antigène - molécule B : anticorps.
La détection d'un anticorps particulier permet par exemple, de déterminer si un sujet humain ou animal a déjà eu la maladie dont l'antigène est le marqueur.
- molécule A protéine - molécule B anticorps ou une autre protéine.
La détection par une protéine particulière d'un anticorps particulier permet par exemple de détecter certains marqueurs du cancer, de la maladie d' Alzheimer etc...
Dans ce contexte, on peut également se servir du biocapteur pour cribler des médicaments lorsque la molécule A est une enzyme spécifique d'une maladie et que la molécule B est par exemple un inhibiteur de cette enzyme. Ainsi, les possibilités d'utilisation du biocapteur selon l'invention sont très larges.
L'invention propose un procédé de fabrication d'un biocapteur comprenant :
- une micropoutre, qui est la partie mobile du biocapteur, reliée à un support,
- au moins une électrode dont une partie au moins est encastrée sur la micropoutre, la(les) électrode(s) comprenant, optionnellement, un plot en un matériau ferromagnétique,
- au moins une molécule biologique A greffée sur la micropoutre, dans une zone différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
- un transducteur mécano-électrique de conversion en signal électrique des variations des propriétés mécaniques de la micropoutre, lorsque la molécule biologique A est mise en contact avec une molécule biologique B à détecter et/ou quantifier,
caractérisé en ce que :
- la micropoutre et son support sont en un matériau fluoropolymère et forment une pièce intégrale,
et en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) formation sur une feuille en un matériau fluoropolymère d'au moins une électrode, dont l'interface entre le fluoropolymère et l'électrode est préférentiellement de nature covalente,
b) optionnellement, formation d'un plot en un matériau ferromagnétique, sur une zone de la(des) électrode(s),
c) passivation de la(des) électrode(s),
d) création, dans la feuille en un matériau fluoropolymère, de la forme désirée finale du biocapteur et séparation de cette forme de la feuille,
e) optionnellement, préfonctionnalisation d'une zone de la micropoutre, cette zone étant différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
f) fonctionnalisation, soit de la zone préfonctionnalisée à l'étape e), lorsque cette étape est mise en œuvre, soit d'une zone de la micropoutre, cette zone étant différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
g) greffage d'au moins une molécule biologique A sur la zone fonctionnalisée obtenue à l'étape f).
Cette combinaison d'étapes où les liaisons entre les électrodes et le matériau fluoropolymère, les liaisons entre la zone fonctionnalisée et le matériau fluoropolymère et les liaisons entre la zone fonctionnalisée et la molécule A sont de nature covalente permet d'obtenir un biocapteur qui a une durée de vie et une sensibilité améliorée par rapport aux biocapteurs, de taille de l'ordre de quelques dizaines de microns, de l'art antérieur, dans lesquels les électrodes et la fonctionnalisation de la micropoutre sont effectuées respectivement par dépôt physique et par liaisons chimiques faibles, créant des interactions de type physisorption caractérisées par une faible adhérence des matériaux.
Les méthodes connues de création d'interfaces co val entes en un matériau polymère n'étaient, jusqu'à présent, utilisées que pour les dispositifs d'une taille de quelques dizaines de centimètres ou millimètres.
De plus, on ne connaissait pas de méthode de formation de la structure du biocapteur et de libération de la feuille en un matériau fluoropolymère.
L'électrode peut être en tout matériau conducteur qui apparaîtra à l'homme de l'art.
De préférence dans l'invention, elle sera en cuivre ou en or.
L'étape d) de création, dans la feuille en un matériau fluoropolymère, de la forme désirée finale du biocapteur et de séparation de cette forme de la feuille, peut être effectuée :
- soit, après l'étape c) de passivation des électrodes,
- soit, après l'étape e) de préfonctionnalisation lorsqu'une telle étape e) est mise en œuvre,
- soit, après l'étape f) de fonctionnalisation
- soit après l'étape g) de greffage de la biomolécule A.
Les modes de mise en œuvre préférés dans l'invention sont ceux dans lesquels l'étape d) est mise en œuvre avant l'étape g) de greffage de la biomolécule A car ils permettent de ne pas endommager ou autrement affecter la molécule biologique A lors de cette étape d).
Dans ce cas, plusieurs méthodes peuvent être mise en œuvre pour réaliser l'étape d).
Une première de ces méthodes comprend les étapes suivantes :
dl) fabrication d'un moule de découpe creux ou à la forme de la structure du capteur final voulu,
d2) compression du moule fabriqué à l'étape dl) sur la feuille en un matériau fluoropolymère, d3) découpe autour du moule de la structure voulue par emboutissage avec chauffage et/ou excitation acoustique par ultrasons du moule de découpe.
Une deuxième méthode pour mettre en oeuvre l'étape d) comprend une étape d4) de découpe de la forme voulue dans la feuille en un matériau fluoropolymère, par un laser Excimère émettant dans le domaine des longueurs d'onde des VUV.
On pourra s'inspirer de la technique par ablation de fluoropolymère par source laser VUV de D. Riedel et al, Appl. Phys. A 69, 375-380 (1999).
Une troisième méthode pour mettre en oeuvre l'étape d) comprend les étapes suivantes :
d5) dépôt d'un masque ou d'un pochoir comprenant une ouverture détourant la forme finale voulue du capteur sur la feuille en un matériau fluoropolymère, et
d6) découpe par attaque profonde réactive ionique sèche, plus connue sous l'anglicisme DRIE (Deep Reactive-Ion Etching), des contours de l'ouverture du masque ou du pochoir.
Pour l'étape d6) on pourra s'inspirer des protocoles établis par E. Edqvist et al, J. Micromech. Microeng. 18, 015007 (2008) et Frank D. Egitto, Pure & Appl. Chem. 62(9), 1699-1708 (1990).
Mais, dans le procédé de l'invention, l'étape d) peut être également mise en œuvre seulement après les étapes f) de fonctionnalisation et g) de greffage de la biomolécule.
Dans ce cas, deux méthodes particulières devront être appliquées.
Ces deux méthodes particulières peuvent être également appliquées bien entendu, dans le cas où l'étape d) est mise en œuvre avant l'étape e), après l'étape e), ou après l'étape f).
Ainsi, une quatrième méthode pour mettre en œuvre l'étape d) comprend les étapes suivantes :
d7) fabrication d'un moule de découpe creux ou à la forme de la structure du capteur final voulu,
d8) compression du moule fabriqué à l'étape d7) sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
d9) découpe, autour du moule, de la structure voulue, par emboutissage du moule à température ambiante.
Une cinquième méthode pour mettre en œuvre l'étape d) comprend une étape dlO) de découpe manuelle, de préférence avec un scalpel, sous microscope, de la forme voulue du capteur final. Le moule, dans les première et quatrième méthodes pourra être en tout matériau ayant une dureté supérieure à celle du matériau fluoropolymère.
Il sera plus particulièrement en cuivre ou en silicium ou en nickel.
Différentes méthodes de formation des électrodes peuvent être utilisées. Une première méthode de fabrication des électrodes comprend les étapes suivantes :
al) dépôt ou greffage d'un masque en un matériau non transparent à un rayonnement VUV, comprenant au moins une ouverture ou une zone en un matériau transparent au rayonnement VUV, sur la feuille en matériau fluoropolymère, cette ouverture ou cette zone ayant la forme voulue de la(des) électrode(s),
a2) irradiation par ledit rayonnement VUV, sous gaz inerte, de préférence l'azote, de la feuille obtenue à l'étape al),
a3) retrait du masque,
a4) greffage, par chimie conventionnelle, de molécules d'acide acrylique, pour former un polymère d'acide polyacrylique (PAA), dans les zones irradiées obtenues à l'étape a2),
a5) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA greffé à l'étape a4), et a6) réduction des ions Cu2+ en micro- ou nano-particules de cuivre, de préférence en présence de NaBH4,
a7) croissance, sur les zones où se trouvent les micro- ou nano-particules de cuivre, d'une couche de cuivre ou d'or, par un bain de métallisation.
A l'étape a2), l'irradiation par le rayonnement VUV se fait sous gaz inerte.
En tant que gaz inerte on peut utiliser l'argon ou l'azote.
On préférera l'azote pour des questions de coûts.
L'étape a4), tout comme dans la suite du texte, toutes les étapes de greffage de molécules d'acide acrylique, par chimie conventionnelle, sur des zones irradiées par rayonnement VUV peut être effectuée avec les composants suivants et le mode opératoire suivant :
Après irradiation VUV, les zones irradiées sont mises en contact avec une solution contenant de l'acide acrylique qui est ensuite polymérisée. Cette solution pourra voir le pourcentage d'acide acrylique varier de 0,5% à 100%. Les solutions seront alors réalisées en diluant l'acide acrylique dans de l'eau ultrapure ou de l'acétate d'éthyle par exemple. De préférence, il faudra prendre un solvant solubilisant l'acide acrylique afin d'obtenir une seule phase. L'homme de l'art pourra se référer à la demande de brevet français FR 0 955 859 pour plus d'informations.
Lorsque les dilutions seront réalisées dans l'eau, du sel de Mohr ((NH4)2Fe(S04)2.6H20) sera ajouté à la hauteur de 0,25% en poids. Ce dernier permet d'inhiber l'homopolymérisation de l'acide acrylique en solution et donc de favoriser le greffage sur/dans le matériau irradié.
L'étape a5), tout comme dans la suite du texte, toutes les étapes de fixation d'ions Cu2+ par chélation, sur le PAA, ainsi que l'étape a6) de réduction de ces ions Cu2+, sont décrites de façon complète dans la demande de brevet US 2010/0310800 déposée le 30 avril 2010.
L'étape a5), tout comme dans la suite du texte, toutes les étapes de fixation d'ions Cu2+ par chélation, peut être effectuée des composés suivants et suivant le mode opératoire suivant :
L'étape de fixation d'ions Cu2+ du procédé selon la présente invention consiste à mettre le composé de type polymère apte à chélater (ou complexer) les ions métalliques en présence de tels ions métalliques.
Ici, le polymère de l'acide acrylique, c'est-à-dire le poly(acide acrylique) ou PAA est utilisé préférentiellement en tant que composé de type polymère.
Cette étape est donc une étape de chélation avec complexation.
Par « ion métallique », on entend, dans le cadre de la présente invention un ion de type Mn+, avec M représentant un métal et n un nombre entier compris entre 1 et 7, et généralement entre 1 et 4. Typiquement il s'agit d'un ion d'un métal alcalin, d'un métal alcalino-terreux, d'un métal pauvre (notamment Al, Ga, In, Sn, Pb, Tl, Bi) ou d'un métal de transition. La présente invention concerne plus particulièrement les ions d'un métal de transition. Avantageusement, un ion métallique selon l'invention est choisi dans le groupe constitué par Ag+, Ag2+, Ag3+, Au+, Au3+, Cd2+, Co2+, Cr +, Cu+, Cu2+, Fe2+, Hg2+, Mn2+, Ni +, Pd+, Pt+, Ti4+ et Zn2+. Lors de cette étape l'ion privilégié est le Cu2+.
Lors de cette étape du procédé selon l'invention, l'ion métallique se trouve dans une solution saline Si, avantageusement dans une solution saline aqueuse, en présence d'un contre-ion anionique. A titre de contre-ions anioniques utilisables, on peut citer un chlorure (CF) un bromure (Br"), un fluorure (F ), un iodure (F), un sulfate (S04 2~), un nitrate (N03 ") ou un phosphate (P04 3~).
Il peut être nécessaire de contrôler le pH de la solution saline utilisée lors de l'étape (a5) notamment pour que les groupements (ou structures) aptes à chélater les ions métalliques portés par le composé de type polymère soient sous une forme adéquate pour cette chélation, par exemple, sous une forme ionisée. L'homme du métier saura en fonction des groupements chélateurs portés par le composé de type polymère et de la solution Si, s'il est nécessaire ou non de modifier le pH de cette solution. Dans l'affirmative, l'homme du métier connaît différents couples acide/base aptes à modifier le pH tels que CH3COOH/NH3 ou CH3COOH/NaOH.
Enfin, l'étape de chélation peut être effectuée sous agitation notamment en utilisant un agitateur, un barreau magnétique, un bain à ultrasons ou un homogénéisateur et à une température inférieure à 60°C, notamment comprise entre 5 et 50°C et, en particulier, comprise entre 10 et 40°C. L'étape a5) selon l'invention est réalisée, dans une forme de mise en œuvre plus particulière, à température ambiante. Par « température ambiante », on entend une température de 20°C ± 5°C.
L'étape a6), de réduction des ions Cu2 en micro- nano-particules de cuivre est bien connue de l'homme de l'art.
Cette étape a6), comme toutes les étapes dans la suite de ce texte, dans la suite du texte, sont des étapes de réduction chimique ou photochimique d'ions métalliques, peut être mise en œuvre de la façon suivante :
L'étape de réduction chimique ou photochimique du procédé selon l'invention consiste à réduire les ions métalliques chélatés (ou complexés) par le composé de type polymère. Toute technique de réduction connue de l'homme du métier est utilisable lors de cette étape. Avantageusement, cette étape de réduction est une réduction chimique ou une photoréduction .
Lorsque cette étape est une étape de réduction chimique, cette dernière met en œuvre une solution réductrice S . Avantageusement, la solution réductrice S2 est basique. La solution réductrice S2 comprend un agent réducteur, notamment choisi dans le groupe constitué par le borohydrure de sodium (NaBH4), le diméthylamineborane (DMAB - H(CH3)2NBH3 et l'hydrazine (N2H4). Lorsque l'agent réducteur est NaBH4, le pH de la solution réductrice S2 est neutre ou basique, alors que, pour du DMAB, le pH de la solution S2 est basique. L'agent réducteur est présent dans la solution réductrice S2 à une concentration comprise entre 10"4 et 5 M, notamment entre 0,01 et 1 M et, en particulier, de l'ordre de 0,1 M (i.e. 0,1 M ± 0,01 M). L'étape de réduction chimique peut être effectuée à une température comprise entre 30 et 90°C, notamment, entre 40 et 80°C et, en particulier, entre 50 et 80°C. De plus, l'étape a6) réduction chimique peut durer entre 30 sec et 1 h, notamment entre 1 et 30 min et, en particulier, entre 2 et 20 min. Cette étape peut être une étape de photoréduction. Typiquement des ions Ag÷, Pt+, Pd+, et Au+ peuvent être réduits par irradiation UV ( edjala T et al, New Journal Of Chemistry, Vol. 32, Issue 8, 2008. ; Eda Ozkaraoglu, Ilknur Tune and Sefik Suzer, Polymer, Vol.50, Issue 2, 2009). Généralement, cette réduction fait intervenir un intermédiaire qui peut être typiquement un contre-ion ou une molécule organique qui, soumis à une irradiation UV, fournit les électrons nécessaires à la réduction des ions métalliques. De plus, ce type de procédé peut faire intervenir des phénomènes d'optique linéaire et d'optique non linéaire (typiquement un processus multiphotonique). L'utilisation de laser peut permettre d'obtenir une nano ou microstructuration du dépôt métallique (Tanaka T, Ishikawa A, Kawata S, Applied Physics Letters, vol 88, Issue 8, 2006. ; aneko , Sun HB, Duan XM, Kawata S, Applied physics Letters, Vol. 83, Issue 7, 2003). Cette photoréduction est avantageusement effectuée dans une solution S3. Les différentes caractéristiques et propriétés de la solution S2 telle que précédemment définie s'appliquent également à la solution S3.
Il convient de remarquer que la mise en œuvre d'une seule étape de fixation d'ions Cu + et d' une seule étape de réduction de ces ions peut ne pas suffire pour atteindre la métallisation souhaitée. Dans ce cas, au moins un nouveau cycle avec une nouvelle étape a5) et une nouvelle étape a6), doit être réalisé. On peut envisager de réaliser, après le 1er cycle de chélation/réduction, de 1 à 20 cycles supplémentaires, notamment de 1 à 15 cycles supplémentaires et, en particulier de 1 à 10 cycles supplémentaires. Par « cycle supplémentaire », on entend une étape a5) suivie d'une étape a6).
Il convient également de souligner que, malgré plusieurs cycles de chélation/réduction, il est possible qu'il n'y ait pas formation d'un métal mais seulement d'une forme plus réduite que celle de l'ion métallique à savoir un oxyde métallique. Cette variante est fonction du métal considéré, des conditions lors des étapes de réduction et de l'environnement notamment de la présence d'oxygène. Un choix adapté des conditions (potentiel d'oxydoréduction du réducteur dans le cadre de la réduction chimique par exemple) permet d'obtenir le type d'entité métallique désiré. En modulant les conditions expérimentales, il est ainsi possible d'obtenir des substrats métallisés comportant différentes entités métalliques : métal ou oxyde métallique et également des ions métalliques.
Le procédé pour mettre en œuvre les étapes a5) et a6), ainsi que toutes les étapes qui, dans la suite du texte se rapportent à une étape de fixation d'ions Cu2+ par chélation sur le PAA et leur réduction chimique, est décrit plus complètement dans la demande brevet FR 0 952 891. L'étape a7), tout comme toutes les étapes qui, dans la suite du texte, sont des étapes de croissance ou formation d'une couche de cuivre ou d'or peut être effectuée selon le mode opératoire suivant :
Cette étape met en œuvre un bain de métallisation dans lequel les polymères activés sont immergés. Dans ce bain, la croissance métallique est catalysée par les particules métalliques déposées à l'étape a6). Le bain de métallisation est une solution stable contenant au moins un cation métallique et son complexant, un réducteur et un stabilisateur, généralement en milieu alcalin. Les précurseurs du matériau métallique réduits à l'étape a6) du procédé selon l'invention présentent majoritairement un degré d'oxydation de 0.
Ainsi, la métallisation peut alors avoir lieu par immersion dans un bain de métallisation et croissance sur les particules de précurseurs à un degré d'oxydation de 0.
Pour la métallisation pour former une couche de cuivre, les échantillons sont immergés dans la solution décrite dans le Tableau 1 ci-après, chauffée à 40°C dans un bain- marie :
Tableau 1 : Composition du bain de métallisation de cuivre
Après 15 min, les échantillons ont été rincés à l'eau ultrapure, par exemple fournie la société Millipore, sous ultrasons pendant 10 min avant d'être séchés.
L'analyse infrarouge révèle la disparition des pics des différents polymères.
L'analyse XPS confirme la présence d'une couche de cuivre métallique (sous sa forme réduite, Cu°). La couche de cuivre est également visible à l'œil nu. La présence de carbone, azote et oxygène après métallisation est due à la présence d'impuretés organiques à l'extrême surface du substrat métallisé. L'oxygène peut également provenir de l'oxydation à l'air de la couche de cuivre avant l'analyse. Dans cette méthode, on utilise un masque en un matériau non transparent au rayonnement VUV comportant soit une ou des ouvertures, soit une ou des zones en un matériau transparent au rayonnement VUV.
En tant que matériau non transparent au rayonnement VUV, on peut citer le cuivre et le silicium et en tant que matériau transparent au rayonnement VUV, on peut citer la silice fondue, le quartz, le CaF et le MgF2.
Les électrodes peuvent également être fabriquées selon la méthode comprenant les étapes suivantes :
a8) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
a9) irradiation, avec ledit rayonnement UV de la couche formée à l'étape a8) au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant au moins une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme voulue(des) électrode(s),
al 0) élimination de la résine irradiée et du masque,
ai l) formation d'un polymère PAA, dans les zones où la résine a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium,
al2) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA formé à l'étape al 1), al 3) réduction des ions Cu2+ chélatés dans le PAA pour former des micro- ou nano-particules de cuivre permettant d'autocatalyser le bain de métallisation de l'étape al4),
al4) croissance, par bain de métallisation, d'une couche de cuivre ou d'or sur les zones comprenant les micro- ou nano-particules de cuivre.
al 5) élimination de la résine photosensible restante.
Dans cette méthode, on utilise une résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, et on élimine alors et après l'irradiation, les zones de résine irradiées.
Cependant, on pourrait également utiliser une couche de résine photosensible de type négatif, mais dans ce cas les zones en un matériau transparent au rayonnement UV, ou les ouvertures du masque, devront détourer la forme voulue pour la(les) électrodes et ce sont les zones de résine non irradiées qui seront éliminées à l'étape al 0).
Le masque utilisé est un masque en un matériau non transparent au rayonnement UV comprenant soit des ouvertures (absence de matériau dans cette ouverture) soit des zones en un matériau transparent aux UV. Des exemples de matériaux non transparents aux UV sont le cuivre, le silicium, certaines encres, certains matériaux polymères tels que par exemple, le polyéthylène téréphtalate (PET) ou le polypropylène (PP).
Des exemples de matériaux transparents aux UV sont la silice fondue, le quartz, le fluorure de calcium (CaF2), le fluorure de magnésium (MgF2), le verre ou la silice.
L'étape ai l) est une étape de formation d'un polymère PAA par la technologie au sel de diazonium. La technologie au sel de diazonium est également connue, dans l'art, comme la technologie GraftFast®.
Cette étape, comme toutes les étapes qui, dans la suite du texte se réfèrent au greffage de molécules d'acide acrylique sur la feuille en un matériau fluoropolymère, par la technologie au sel de diazonium, s'effectue de la façon suivante :
Une solution d'un sel de diazonium est tout d'abord préparée à partir de 10 ml d'une solution de 1-4 phenyldiamine à 0,1 M dans HC1 (0,5 M), à laquelle ont été ajoutés 10 ml d'une solution de NaN02 à 0,1 M dans de l'eau. A cette solution de sel de diazonium, sont ajoutés 200 mg de limaille de fer, puis, après 5 min, 10 mL d'AA.
L'échantillon est ensuite introduit dans le milieu réactionnel pendant 2 h, avant d'être rincé à l'eau et introduit dans une solution de soude à pH de 9,5 en présence d'ultrasons de façon à solubiliser l'acide polyacrylique (PAA) non greffé. On trouvera plus de détails sur cette méthode dans le brevet français FR 2 910 006.
L'étape a) de fabrication des électrodes peut encore être mise en œuvre selon une méthode qui comprend les étapes suivantes :
al 6) formation d'un polymère PAA sur la feuille en un matériau fluoropolymère, par la technologie au sel de diazonium.
al7) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA formé à l'étape al6), al 8) réduction des ions chélatés pour la formation de micro- ou de nano- particules de cuivre pour activer le bain de métallisation de l'étape al9)
al 9) croissance, par bain de métallisation, d'une couche de cuivre ou d'or sur les zones comprenant les micro- ou nano-particules de cuivre.
a20) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la surface de la feuille en matériau fluoropolymère et métallisée obtenue à l'étape al9),
a21) irradiation, avec ledit rayonnement UV, de la couche formée à l'étape a20), au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant au moins une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone détourant la forme voulue de la(des) électrode(s),
a22) élimination de la résine irradiée,
a23) élimination du cuivre ou de l'or, par gravure chimique, de préférence avec FeCl3 lorsque la couche formée à l'étape al 9) est en cuivre, ou avec un mélange HNO3/HCI (eau régale), lorsque la couche formée à l'étape al 9) est de l'or, dans les zones où la résine a été éliminée,
a24) élimination de la résine photosensible restante.
L'étape al 7), de fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA et de réduction de ces ions Cu2+, est décrite de façon complète dans la demande de brevet US 2010/0310800 déposée le 30 avril 2010.
Quant à l'étape a23), tout comme les étapes qui, dans la suite du texte, sont des étapes d'élimination par gravure chimique, de la couche de cuivre ou d'or formée, elle s'effectue par trempage de la feuille en un matériau fluoropolymère soit dans une solution de FeCl3, lorsque la couche est en cuivre, soit dans l'eau régale, qui est un mélange d'acide chlorhydrique et d'acide nitrique concentré contenant deux ou trois volumes d'acide chlorhydrique pour un volume d'acide nitrique, lorsque la couche est en or.
L'étape a) de formation des électrodes peut encore comprendre les étapes suivantes :
a25) irradiation d'une feuille en un matériau fluoropolymère avec un rayonnement VUV, sous gaz inerte, de préférence l'azote,
a26) greffage sur la feuille obtenue à l'étape a25) de molécules d'acide acrylique, par chimie conventionnelle, pour former un polymère d'acide acrylique PAA,
a27) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA greffé à l'étape a26), a28) réduction des ions Cu2+ en micro- ou nano-particules de cuivre, de préférence avec NaBH4,
a29) croissance, sur les zones comprenant les micro- ou nano-particules de cuivre, d'une couche de cuivre ou d'or, par un bain de métallisation,
a30) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fluoropolymère métallisé obtenue à l'étape a29),
a31 ) irradiation, avec ledit rayonnement UV de la couche formée à l'étape a30), au travers d'un masque en un matériau transparent audit rayonnement UV, comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent aux UV, cette ouverture ou cette zone détourant la forme voulue de la(des) électrodes,
a32) élimination de la résine irradiée et du masque,
a33) élimination, par gravure chimique, dans les zones où la résine a été irradiée, de la couche de cuivre si formée à l'étape a29), de préférence avec FeCl3, ou de la couche d'or, si formée à l'étape a29), de préférence avec un mélange HN03/HC1 (eau régale), a34) élimination de la résine restante.
Enfin, une dernière méthode pour mettre en œuvre l'étape a) de formation des électrodes, dans le procédé de l'invention, est une étape qui comprend les étapes suivantes :
a35) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la surface de la feuille en matériau fluoropolymère,
a36) irradiation, avec ledit rayonnement UV, de la couche formée à l'étape a35), au travers d'un masque en un matériau non transparent aux UV, comportant au moins une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou zone ayant la forme voulue des électrodes,
a37) élimination des zones de résine irradiée et du masque, a38) dépôt, d'or dans les zones dans lesquelles la résine a été éliminée, par évaporation physique sous vide, de préférence par plasma ou chauffage, ou pulvérisation
a39) élimination de la résine photosensible restante.
Une fois l'électrode formée, et lorsque l'on veut former un plot en matériau ferromagnétique sur cette électrode, on procédera ensuite à l'étape b) de formation d'un plot en un matériau ferromagnétique.
Lorsqu'un plot en matériau ferromagnétique sur les électrodes n'est pas nécessaire, on passera directement à l'étape c) de passivation des électrodes.
L'étape b) de formation d'un plot en un matériau ferromagnétique peut être mise en œuvre par une méthode qui comprend les étapes suivantes :
bl) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la feuille en un matériau fluoropolymère comportant les électrodes,
b2) dépôt ou greffage d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV, comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme et la localisation, sur la feuille obtenue à l'étape bl) du plot voulu sur une zone de l'électrode préalablement obtenue par les étapes a),
b3) irradiation par audit rayonnement UV, de la feuille obtenue à l'étape b2),
b4) élimination de la résine photosensible irradiée et du masque,
b5) formation d'un polymère PAA dans les zones où la résine irradiée a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium,
b6) fixation, par chélation, d'ions métalliques choisis parmi Ni , Fe , Fe , Co2+ ou d'un mélange de deux au moins de ceux-ci, sur le PAA greffé à l'étape b5),
b7) réduction des ions métalliques fixés à l'étape b6),
b8) optionnellement, croissance de la couche de métal ainsi obtenue, b9) élimination de la résine photosensible restante.
L'étape b5) de formation d'un polymère PAA dans les zones où la résine irradiée a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium correspond à la mise en œuvre de la technologie GraftFast® qui est décrite de façon complète dans la demande de brevet FR 0 758 660 et également ci-dessus.
Quant à l'étape b7) de réduction chimique des ions métalliques fixés à l'étape f6), elle s'effectue comme précédemment.
L'étape b8), tout comme toutes les étapes qui, dans ce texte se réfèrent à une étape de croissance de la couche métallique, peut s'effectuer à partir des composés suivants et de la façon suivante :
bain de galvanoplastie contenant pour un dépôt contrôlé de permalloy
(NiFe) :
NiS04.6H20 à 0,7mol/l
FeSQ4.7H20 à 0,03mol/l
NiCl2.6H20 à 0,02mol/l
H3BO3 à 0,4mol/l
Saccharine à 0,016mol/l.
avec un pH 2,3 et une température 40°C.
L'électrode de la feuille en fluoropolymère, immergée dans ce bain, étant reliée à une source de courant avec une contre-électrode en carbone dans le même bain pour une densité de courant de 14,5mA/cm2. Ce dépôt galvanique se fera préférentiellement sous un champ magnétique externe (de l'ordre de 0,2 milliTesla) appliqué pour améliorer les propriétés magnétiques du plot ferromagnétique pour le capteur à magnéto-impédance. Cette étape est mise en œuvre lorsque l'épaisseur de la couche métallique obtenue après réduction des ions métalliques n'est pas d'une épaisseur suffisante, c'est-à-dire à une épaisseur inférieure à 1 micromètre.
L'étape c) de passivation des électrodes, selon un premier mode de mise en œuvre, comprend les étapes suivantes :
cl) dépôt à la tournette de résine époxy SU8®, de type négatif, sur la feuille en un matériau fluoropolymère comportant les électrodes,
c2) dépôt ou greffage, sur la couche de résine obtenue à l'étape cl), d'un masque en un matériau non transparent à un rayonnement UV comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la(des) électrode(s),
c3) irradiation avec ledit rayonnement UV de la couche de résine SU8® au travers du masque,
c4) élimination du masque et de la résine non irradiée,
c5) durcissement sous recuit, entre 70°C et 120°C pendant 1 minute de la résine restante.
Les zones de résine SU8®, commercialisée par la société MicroChem Corp. (Newton, USA), non irradiées s'éliminent avec le révélateur PGMEA (propylene glycolmonomethyl ether acétate ).
L'étape c) de passivation des électrodes peut être également mise en œuvre par une méthode qui comprend les étapes suivantes :
c6) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la feuille en un matériau fluoropolymère comportant les électrodes,
cl) irradiation avec ledit rayonnement UV de la couche de résine sensible au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau non transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou zone ayant la forme de la(des) électrode(s),
c8) enlèvement du masque et élimination de la résine irradiée,
c9) dépôt pyrolytique d'une couche de parylène de type N ([2,2]paracyclophane) ou C (Chloro[2,2]paracyclophane) dans les zones où la résine a été éliminée,
clO) élimination de la résine sensible au rayonnement UV restante.
Mais cette étape c) de passivation des électrodes peut également être mise en œuvre selon une méthode qui comprend les étapes suivantes : ci l) électrogreffage d'un matériau polymère électrophorétique sur les électrodes,
cl 2) durcissement du matériau polymère électrophorétique par chauffage. Le matériau polymère électrophorétique qui est électrogreffé à l'étape ci l) est, par exemple, une peinture électrophorétique cathodique GLASSOPHOR® (BASF, Germany).
L' électrogreffage s'effectue de la façon suivante :
L'électrode à passiver avec un film de peinture électrophorétique est connectée au pôle négatif d'une source de tension, et immergé dans un bain de GLASSOPHOR®.H20 à 40% avec une contre- électrode en platine connectée au pôle positif de la source de tension. Une tension de 17 volts est ensuite appliquée entre les deux électrodes jusqu'à ce que le courant détecté dans le circuit devienne nul. L'électrode recouverte du film passivant est ensuite retirée du bain et rincée à l'eau ultrapure Millipore®.
Le chauffage de l'étape cl 2) est effectué à une température comprise entre 70°C et 130°C pendant environ 30 minutes.
L'étape f) de fonctionnalisation a pour but de doter une zone de la micropoutre de fonctions aptes à réagir avec des fonctions de la biomolécule A, pour permettre le greffage de la biomolécule A.
Lorsque la fonction apte à réagir avec une fonction de la biomolécule A est une fonction acide carboxylique (COOH), l'étape f) est, dans l'invention, une étape de formation d'une couche de polymère poly(acide acrylique) PAA.
Dans ce cas, le procédé de l'invention ne comprend pas d'étape e) de préfonctionnalisation et, deux méthodes de fonctionnalisation (formation d'une couche de polymère PAA) sont possibles.
La première de ces méthodes comprend les étapes suivantes : fl) dépôt ou greffage d'un masque en un matériau non transparent à un rayonnement VUV, comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement VUV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone de la feuille en un matériau fluoropolymère à fonctionnaliser, cette ouverture ou cette zone étant située dans la partie du masque correspondant à la micropoutre à former, et en dehors de la zone de la micropoutre sur laquelle la ou les électrodes sont encastrées ou sont à encastrer,
f2) irradiation, par ledit rayonnement VUV, sous gaz inerte, de préférence l'azote, de la feuille obtenue à l'étape fl),
f3) enlèvement du masque, f4) formation, par chimie conventionnelle, d'un polymère d'acide polyacrylique PAA, dans les zones irradiées.
L'étape fl) de greffage d'un masque sur la feuille en fluoropolymère peut s'effectuer en appliquant un masque en un matériau non transparent au rayonnement VUV comportant soit une ou des ouvertures, soit une ou des zones en un matériau transparent au rayonnement VUV. En tant que matériau non transparent au rayonnement VUV, on peut citer le cuivre et le silicium et en tant que matériau transparent au rayonnement VUV, on peut citer la silice fondue, le quartz, le CaF2 et le MgF2.
La seconde méthode pour mettre en œuvre l'étape f) comprend les étapes suivantes :
f5) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
f6) irradiation par ledit rayonnement UV de la couche de résine sensible au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone à fonctionnaliser et étant située dans la partie du masque correspondant à la partie micropoutre à former et en dehors de la zone de la micropoutre sur laquelle la(les) électrode(s) est(sont) encastrée(s) ou à encastrer,
f7) élimination de la résine irradiée et du masque,
f8) formation d'un polymère d'acide acrylique (PAA), dans les zones où la résine a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium,
f9) élimination de la résine restante.
Lorsque pour greffer la biomolécule A, il est nécessaire qu'une zone de la micropoutre soit munie de fonctions différentes d'une fonction acide carboxylique, c'est-à- dire lorsque pour greffer la biomolécule A il faut que des fonctions telles que des fonctions aminé (NH2), des fonctions thiol (SH), des fonctions azoture (N3), des fonctions alcool (hydroxyle) (OH), des fonctions alcène ou des groupes maléimide, ou des groupes ester activés, de préférence des groupes ester de succinimide, le procédé de l'invention comprend une étape e) de pré fonctionnai isation d'une zone de la micropoutre, cette zone préfonctionnalisée étant ensuite modifiée par greffage d'une molécule organique qui portera alors la fonction ou le groupe nécessaire pour réagir avec un groupe de la molécule biologique.
Dans ce cas, une première méthode pour mettre en œuvre l'étape de préfonctionnalisation e) comprend les étapes suivantes : el) dépôt ou greffage d'un masque en un matériau non transparent à un rayonnement VUV, comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement VUV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone de la feuille en un matériau fluoropolymère à fonctionnaliser, cette ouverture ou cette zone étant située dans la partie du masque correspondant à la micropoutre à former, et en dehors de la zone de la micropoutre sur laquelle la(les) électrode(s) est(sont) encastrée(s) ou à encastrer,
e2) irradiation, par ledit rayonnement VUV, sous gaz inerte, de préférence l'azote, de la feuille obtenue à l'étape el),
e3) enlèvement du masque,
e4) formation d'un polymère d'acide polyacrylique PAA, par chimie conventionnelle, dans les zones irradiées.
Une seconde méthode pour mettre en œuvre l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
e5) dépôt d'une couche de résine de type positif, sensible à un rayonnement UV sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
eô) irradiation par ledit rayonnement UV de la couche de résine sensible au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone à fonctionnaliser et étant située dans la partie du masque correspondant à la partie micropoutre à former et en dehors de la zone de la micropoutre sur laquelle la(les) électrode(s) est(sont) encastrée(s) ou à encastrer,
e7) élimination de la résine irradiée et du masque,
eS) formation d'un polymère d'acide acrylique (PAA), dans les zones où la résine a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium, et
e9) élimination de la résine restante.
L'étape f) de fonctionnalisation des zones préfonctionnalisées par la première et la seconde méthode de préfonctionnalisation décrite ci-dessus est alors une étape notée flO), de modification du polymère PAA formé à l'étape e4) ou a l'étape e8) avec une molécule organique, comprenant, à son extrémité non liée au PAA, des fonctions NH2, ou SH, ou N3, ou OH, ou alcène, ou des groupes maléimide, ou des groupes ester activés, de préférence des groupes ester de succinimide, par chimie conventionnelle, dans la zone irradiée à l'étape e6).
Comme précédemment, cette modification du PAA est effectuée par chimie conventionnelle ; le PAA est modifié par une molécule organique soit par création d'une liaison amide par exemple entre une fonction acide carboxylique du PAA et une fonction aminé primaire ou secondaire de la molécule organique soit par la création par exemple d'une liaison ester entre une fonction acide carboxylique du PAA et un alcool de la molécule organique. La molécule organique ainsi greffée pourra présenter alors une autre fonction ou un groupe pouvant être fonctionnalisé ou réagir avec une molécule biologique. Cette fonction ou ce groupe pourront être une fonction aminé NH2, une fonction thiol SH, une fonction azoture N3, une fonction alcool (hydroxyle), une fonction alcène terminal, un groupe maléimide, un groupe ester activé du type ester de succinimide. L'homme de l'art sera capable modifier en conséquence le PAA afin de pouvoir le fonctionnaliser avec une telle molécule organique.
Lorsque l'étape g) de greffage de la biomolécule A s'effectue par réaction des fonctions réactives de la biomolécule A avec des fonctions diazonium présentes sur la zone de la micropoutre, l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
elO) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
el 1) irradiation par ledit rayonnement UV de la couche de résine sensible au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone à fonctionnaliser, et étant située dans la partie du masque correspondant à la micropoutre à former, mais en dehors de la zone de la micropoutre dans laquelle la(les) électrode(s) est(sont) encastrée(s) ou à encastrer,
el2) élimination de la résine irradiée,
el 3) enlèvement du masque,
el4) greffage d'une couche de polymère poly(aminophénylène), sur la zone où la résine a été éliminée.
Dans ce cas, l'étape f) de fonctionnalisation est une étape fi l) d'activation de la couche de polymère poly(aminophénylène) formée à l'étape el4) en couche de poly(diazonium phénylène).
Pour mettre en œuvre l'étape el 4), on pourra utiliser les composés de départ suivants et le protocole suivant :
L'apprêt à été préparé d'après le protocole qui a été illustré dans [Chem. Mater. 2007, 19, 6323-6330].
Des échantillons ont été plongées durant 40 min dans un mélange comportant 2 ml d'une solution aqueuse de NH2-Ph-NH2 (5.10 3 M dans HCl 0,5 M), 2 ml de solution aqueuse de NaN02 (5.10 3 M) et 80 mg de limaille de fer. A la différence du protocole Chem. Mater. 2007, 19,6323-6330, la réaction est faite ici à 35 °C afin d'obtenir des films plus épais.
Des bandes de membranes de Polyfluorure de vinylidène (PVDF)P (1 cm x 4 cm et 25 μηι d'épaisseur) ont été plongées durant 120 min dans un mélange comportant 2 ml d'une solution aqueuse de NH2-Ph-NH2 (5.10"3 M dans HCl 0,5 M), 2 ml de solution aqueuse de NaN02 (5.10"3 M) et 80 mg de limaille de fer. A la différence du protocole Chem. Mater. 2007, 19,6323-6330, la réaction est faite ici à 35 °C afin d'obtenir des films plus épais.
L'étape fi l), tout comme toutes étapes qui, dans la suite du texte est une étape de modification d'une couche de polymère du type poly(aminophénylène) en poly(diazonium phénylène), est décrite dans la demande de brevet FR 0 857 260.
Pour la mettre en œuvre, on pourra utiliser les composés de départ suivants et le protocole suivant :
Les surfaces revêtues de l'apprêt ont été plongées dans une solution aqueuse de HCl 0,5 M et de NaN02 5.10"2 M. Durant cette étape, la concentration de NaN02 n'a pas besoin d'être précise, il y a toujours un excès par rapport aux fonctions aminés présentes à la surface.
La formation des sels de diazonium a pu être suivie par spectrométrie IR : un pic à 2270 cm"1 correspondant au diazonium. La réaction mise en œuvre ici peut être schématisée de la façon suivante :
Pour plus d'information, l'homme de l'art pourra se référer à la demande de brevet français n°0 857 269.
Lorsque la surface est recouverte avec une couche active de poly(diazonium phénylène) le protocole de greffage de la molécule A est le suivant :
De l'ADN de faible poids moléculaire de sperme de Saumon (Fluka) a été dissous dans de l'eau ultrapure, par exemple fournie la société Millipore, (1 mg dans 3 mL). 200 de cette solution ont été déposés sur l'échantillon préalablement recouvert d'une couche de poly(diazonium phénylène). Le dépôt à été réalisé sans précaution particulière et à température ambiante. Après 10 min de réaction, le support est rincé avec de l'eau ultrapure millipore puis soumis à des lavages sous sonication : ultrapure millipore® 2 min/éthanol 2 min/ ultrapure millipore® 2 min.
L'apparition de bandes à 1226 cm"1 et à 1080 cm"1 sur le support comportant la couche auto-adhésive activée confirme la présence et le greffage co valent d'ADN à la surface.
De la glucose oxydase (Sigma Aldrich) a été dissoute dans de l'eau ultrapure (1 mg dans 3 mL). 200 de cette solution a été déposés sur l'échantillon préalablement recouvert d'une couche de poly(diazonium phénylène). Le dépôt à été réalisé sans précaution particulière et à température ambiante. Après 10 min de réaction, le support est rincé avec de l'eau ultrapure puis soumis à des lavages sous sonication : eau ultrapure 2 min/éthanol 2 min eau ultrapure 2 min.
L'apparition de bandes à 1659 cm (Amide I), à 1546 cm"1 (Ami de II) et 1255 cm"1 (Amide III) sur le support comportant la couche auto-adhésive activée confirme la présence et le greffage covalent de la glucose oxydase à la surface.
Mais une quatrième méthode et une cinquième méthode de préfonctionnalisation d'une zone de la micropoutre peuvent être également utilisées lorsque, pour greffer la biomolécule A sur la micropoutre, il est nécessaire que cette zone de la micropoutre soit munie de fonctions différentes de fonctions acide carboxylique.
Ainsi, une quatrième méthode pour mettre en œuvre l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
el 5) dépôt ou greffage, sur la feuille en un matériau fluoropolymère, d'un masque, en un matériau non transparent à un rayonnement VUV, comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement VUV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme voulue de la zone à fonctionnaliser, et étant située dans la zone du masque correspondant à la micropoutre à former mais différente de celle dans laquelle la(les) électrode(s) est(sont) encastrée(s) ou à encastrer,
el 6) irradiation par ledit rayonnement VUV, sous gaz inerte, de la feuille obtenue à l'étape el 5),
el7) retrait du masque,
el 8) formation, par chimie conventionnelle, d'une couche d'un polymère d'acide acrylique (PAA) dans les zones irradiées obtenues à l'étape el6),
el9) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA greffé à l'étape el 8), e20) croissance, dans la zone où les ions Cu ont été fixés, d'une couche en un métal choisi parmi le cuivre, l'or, le platine ou l'argent, par réduction des ions Cu2+ lorsque la couche à former doit être en cuivre, ou dans un bain métallique, lorsque la couche à former doit être en un métal différent du cuivre.
La cinquième méthode pour mettre en œuvre l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
e21) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
e22) irradiation, avec ledit rayonnement UV, de la couche formée à l'étape e21), au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme voulue de la zone à fonctionnaliser, et étant située dans la zone du masque correspondant à la micropoutre à créer mais différente de celle dans laquelle la(les) électrode(s) est(sont) encastrée(s) ou à encastrer,
e23) élimination de la résine irradiée et enlèvement du masque,
e24) greffage d'une couche en un polymère PAA, par la technologie au sel de diazonium, dans les zones où la résine a été éliminée,
e25) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA greffé à l'étape e24), dans les zones où la résine a été éliminée,
c26) croissance, dans la zone où les ions Cu2+ ont été fixés, d'une couche en un métal choisi parmi le cuivre, l'or, le platine ou l'argent, par réduction des ions Cu2+, lorsque la couche est en cuivre, ou dans un bain métallique lorsque la couche est un métal différent du cuivre,
e27) élimination de la résine restante.
L'étape f) de fonctionnalisation de la zone de la micropoutre fonctionnalisée par les quatrième et cinquième méthodes de préfonctionnalisation dépend, là encore, de la fonction qu'il est nécessaire de greffer sur la zone préfonctionnalisée pour qu'elle réagisse avec une fonction réactive de la biomolécule A.
Ainsi, lorsque la biomolécule A est greffée par l'intermédiaire d'une fonction réactive réagissant avec une fonction diazonium de la zone voulue de la micropoutre, l'étape f) de fonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
fl2) dépôt d'une résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille comprenant la zone métallisée obtenue à l'étape e20) ou sur la feuille comprenant la zone métallisée obtenue à l'étape e26), fl3) irradiation de la feuille obtenue à l'étape fl2), au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV, comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone correspondant à la zone métallisée de la feuille autre que F (les) électrode(s) défini e(s) dans les protocoles a),
fl4) élimination de la résine irradiée et du masque,
fl 5) greffage d'une couche de polymère poly(aminophénylène) sur la zone où la résine a été éliminée,
fl6) élimination de la résine restante,
fl7) activation de la couche de poly(aminophénylène) en couche de poly(diazonium phénylène).
Cette méthode de fonctionnalisation est applicable quelque soit la nature de la couche métallique qui a été mise à croître à l'étape e20) ou à l'étape e26), respectivement.
Une méthode spécifique de préfonctionnalisation des zones préfonctionnalisées (métallisées), en employant les quatrième et cinquième méthodes de préfonctionnalisation de l'invention, lorsque ces zones sont en or, est une méthode qui comprend les étapes suivantes :
fl 8) création d'une couche auto-assemblée alcane thiol/Au sur une zone métallisée de la feuille, différente de celle(s) où l'(les) électrode(s) a (ont) été formée(s) par les étapes a),
fl9) liaison de la partie libre de la molécule correspondant à alcane thiol de la couche mono-assemblée obtenue à l'étape £24) avec une molécule organique comprenant des fonctions terminales libres réactives NH2, ou SH, ou N3, ou OH, ou alcène, ou des groupes terminaux libres maléimide, ou esters activés, de préférence esters de succinimide.
La biomolécule A est greffée sur les fonctions et groupes terminaux libres réactifs de la molécule liée à l'étape fl9).
Enfin, une méthode de fonctionnalisation f) particulière lorsque les zones fonctionnalisées (métallisées) obtenues par les méthodes de préfonctionnalisation e), selon l'invention, sont en un métal différent de l'or, est une méthode qui comprend les étapes suivantes :
f20) dépôt d'une résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille comprenant la zone métallisée obtenue à l'étape e20) ou sur la feuille comprenant la zone métallisée obtenue à l'étape e26), f21) irradiation de la feuille obtenue à l'étape f20), au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV, comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone correspondant à la zone métallisée de la feuille autre que l'(les) électrode(s) défini e(s) dans les protocoles a),
f22) élimination de la résine irradiée et du masque,
f23) formation, par la technologie au sel de diazonium, dans la zone irradiée à l'étape £21), d'un polymère obtenu par polymérisation de monomères comprenant des fonctions vinyliques ou acrylates,
£24) élimination de la résine restante,
£25) modification, par chimie conventionnelle, du polymère formé à l'étape £23) par réaction des groupes réactifs du polymère avec les groupes réactifs d'une molécule organique comprenant des fonctions terminales libres NH2, ou SH, ou N3, ou OH, ou alcène, ou des groupes terminaux libres maléimide, ou esters activés, de préférence esters de succinimide.
La biomolécule A est alors greffée sur ces fonctions ou groupes réactifs libres de la biomolécule organique fixée à l'étape £25).
D'une manière générale, la zone de la micropoutre fonctionnalisée, la molécule à l'étape g) de greffage de la biomolécule A est une étape de réaction des fonctions réactives de la biomolécule A avec les fonctions réactives libres présentes sur la zone fonctionnalisée de la micropoutre.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de fabrication d'un biocapteur comprenant :
- une micropoutre, qui est la partie mobile du biocapteur, reliée à un support,
- au moins une électrode dont une partie au moins est encastrée sur la micropoutre, la(les) électrode(s) comprenant, optionnellement, un plot en un matériau ferromagnétique,
- au moins une molécule biologique A greffée sur la micropoutre, dans une zone différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
- un transducteur mécano-électrique de conversion en signal électrique des variations des propriétés mécaniques de la micropoutre, lorsque la molécule biologique A est mise en contact avec une molécule biologique B à détecter et/ou quantifier,
caractérisé en ce que :
- la micropoutre et son support sont en un matériau fluoropolymère et forment une pièce intégrale,
et en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) formation sur une feuille en un matériau fluoropolymère d'au moins une électrode, dont l'interface entre le fluoropolymère et l'électrode est préférentiellement de nature covalente,
b) optionnellement, formation d'un plot en un matériau ferromagnétique, sur une zone de la(des) électrode(s),
c) passivation de la(des) électrode(s),
d) création, dans la feuille en un matériau fluoropolymère, de la forme désirée finale du biocapteur et séparation de cette forme de la feuille,
e) optionnellement, préfonctionnalisation d'une zone de la micropoutre, cette zone étant différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
f) fonctionnalisation soit de la zone préfonctionnalisée à l'étape e), lorsque l'étape e) est mise en œuvre, soit d'une zone de la micropoutre, cette zone étant différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
g) greffage d'au moins une molécule biologique A sur la zone fonctionnalisée obtenue à l'étape f).
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d) de création, dans la feuille en un matériau fluoropolymère, de la forme désirée finale du biocapteur, et séparation de cette forme de la feuille, est mise en œuvre entre l'étape f) de fonctionnalisation et l'étape g) de greffage d'au moins une molécule biologique A.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d) de création, dans la feuille en un matériau fluoropolymère, de la forme désirée finale du biocapteur et séparation de cette forme de la feuille, est mise en œuvre après l'étape g) de greffage d'au moins une molécule biologique A.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape e) de préfonctionnalisation d'une zone de la micropoutre, et en ce que l'étape d) de création, dans la feuille en un matériau fluoropolymère, de la forme désirée finale du biocapteur et séparation de cette forme de la feuille, est mise en œuvre après l'étape e) de préfonctionnalisation et avant l'étape f) de fonctionnalisation de cette même zone.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape a) de fabrication des électrodes comprend les étapes suivantes :
al) dépôt ou greffage d'un masque en un matériau non transparent à un rayonnement VUV, comprenant au moins une ouverture ou zone en un matériau transparent au rayonnement VUV, sur la feuille en matériau fluoropolymère, cette ouverture ou zone ayant la forme voulue de la(des) électrode(s),
a2) irradiation par ledit rayonnement VUV, sous gaz inerte, de préférence l'azote, de la feuille obtenue à l'étape al),
a3) retrait du masque,
a4) greffage, par chimie conventionnelle, de molécules d'acide acrylique, pour former un polymère d'acide polyacrylique (PAA), dans les zones irradiées obtenues à l'étape a2),
a5) fixation d'ions Cu 2+ , par chélation, sur le PAA greffé à l'étape a4), a6) réduction des ions Cu 2 H" en micro- ou nano-particules de cuivre, de préférence en présence de NaBH4,
a7) croissance, sur les zones où se trouvent les micro- ou nano-particules de cuivre, d'une couche de cuivre ou d'or, par un bain de métallisation.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape a) de fabrication des électrodes comprend les étapes suivantes :
a8) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
a9) irradiation, avec ledit rayonnement UV de la couche formée à l'étape a8) au travers d'un masque, en un matériau non transparent au rayonnement UV, comportant au moins une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme voulue de la(des) électrodes,
alO) élimination de la résine irradiée et du masque,
ai l) formation d'un polymère PAA, dans les zones où la résine a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium,
al2) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA formé à l'étape al 1), al 3) réduction des ions Cu2+ chélatés pour former des micro- ou nano- particules de cuivre permettant d'autocatalyser le bain de métallisation de l'étape al4),
al4) croissance, par bain de métallisation, d'une couche de cuivre ou d'or sur les zones comprenant les micro- ou nano-particules de cuivre,
al 5) élimination de la résine photosensible restante.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape a) de fabrication des électrodes comprend les étapes suivantes :
al 6) formation d'un polymère PAA sur la feuille en un matériau fluoropolymère, par la technologie au sel de diazonium,
al 7) fixation d'ions Cu2 , par chélation, sur le PAA formé à l'étape a 16), al 8) réduction des ions Cu2 ' chélatés en micro- ou nano-particules de cuivre pour activer le bain de métallisation de l'étape al 9)
al 9) croissance, par bain de métallisation, d'une couche de cuivre ou d'or sur les zones comprenant les micro- ou nano-particules de cuivre,
a20) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la surface de la feuille en matériau fluoropolymère et métallisée obtenue à l'étape al 9),
a21 ) irradiation, avec ledit rayonnement UV, de la couche formée à l'étape a20), au travers d'un masque en un matériau transparent audit rayonnement UV comportant au moins une ouverture ou une zone en un matériau non transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone détourant la forme voulue de la(des) électrode(s),
a22) élimination de la résine irradiée et du masque,
a23) élimination du cuivre ou de l'or, par gravure chimique, de préférence avec FeCl3 lorsque la couche formée à l'étape a 19) est en cuivre, ou avec un mélange HNO3/HCI (eau régale), lorsque la couche formée à l'étape al 9) est de l'or, dans les zones où la résine a été éliminée,
a24) élimination de la résine photosensible restante.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape a) de formation des électrodes comprend les étapes suivantes : a25) irradiation d'une feuille en un matériau fluoropolymère avec un rayonnement VUV, sous gaz inerte, de préférence l'azote,
a26) greffage sur la feuille obtenue à l'étape a25) de molécules d'acide acrylique, par chimie conventionnelle, pour former un polymère d'acide acrylique PAA, a27) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA greffé à l'étape a26), a28) réduction des ions Cu en micro- ou nano-particules de cuivre, de préférence avec NaBH4,
a29) croissance, sur les zones comprenant les micro- ou nano-particules de cuivre, d'une couche de cuivre ou d'or, par un bain de métallisation,
a30) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fluoropolymère métallisé obtenue à l'étape a29),
a31) irradiation, avec ledit rayonnement UV de la couche formée à l'étape a30), au travers d'un masque en un matériau transparent audit rayonnement UV, comprenant une ouverture ou une zone en un matériau non transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone détourant la forme voulue de la(des) électrodes,
a32) élimination de la résine irradiée et du masque,
a33) élimination, par gravure chimique, dans les zones où la résine a été irradiée soit de la couche de cuivre si formée à l'étape a29), de préférence avec FeCl3, soit de la couche d'or, si formée à l'étape a29), de préférence avec un mélange HN03/HC1 (eau régale),
a34) élimination de la résine restante.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape a) de fabrication des électrodes comprend les étapes suivantes :
a35) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la surface de la feuille en matériau fluoropolymère,
a36) irradiation, avec ledit rayonnement UV, de la couche formée à l'étape a35), au travers d'un masque en un matériau transparent audit rayonnement UV, comportant au moins une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme voulue des électrodes,
a37) élimination des zones de résine irradiée et du masque, a38) dépôt d'or dans les zones dans lesquelles la résine a été éliminée, par évaporation physique sous vide, de préférence par plasma ou chauffage, ou pulvérisation,
a39) élimination de la résine photosensible restante.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape b) de formation d'un plot en un matériau ferromagnétique sur la(les) électrode(s) et en ce que ladite étape b) comprend les étapes suivantes :
bl) dépôt d'une couche de résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la feuille en un matériau fluoropolymère comportant les électrodes,
b2) dépôt ou greffage d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV, comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou zone ayant la forme et la localisation, sur la feuille obtenue à l'étape bl) du plot voulu sur une zone de l'électrode préalablement obtenue à l'étape a),
b3) irradiation par ledit rayonnement UV, de la feuille obtenue à l'étape b2), b4) élimination de la résine photosensible irradiée et du masque,
b5) formation d'un polymère PAA dans les zones où la résine irradiée a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium,
b6) fixation, par chélation, d'ions métalliques choisis parmi Ni , Fe , Fe ,
Co2+ ou d'un mélange de deux au moins de ceux-ci, sur le PAA greffé à l'étape b5),
b7) réduction des ions métalliques fixés à l'étape b6), en micro- ou nano- particules,
b8) optionnellement, croissance de la couche de métal ainsi obtenue, b9) élimination de la résine photosensible restante.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que l'étape c) de passivation des électrodes comprend les étapes suivantes :
cl) dépôt à la tournette de résine époxy SU8®, de type négatif, sur la feuille en un matériau fluoropolymère comportant les électrodes,
c2) dépôt ou greffage sur la couche de résine obtenue à l'étape cl) d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent au rayonnement UV, cette ouverture ou zone ayant la forme de la(des) électrode(s),
c3) irradiation avec ledit rayonnement UV de la couche de résine SU8® au travers du masque,
c4) élimination du masque et de la résine non irradiée,
c5) durcissement sous recuit, entre 70°C et 120°C pendant 1 minute de la résine restante.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que l'étape c) de passivation des électrodes comprend les étapes suivantes :
c6) dépôt d'une résine sensible à un rayonnement UV, de type positif, sur la feuille en un matériau fluoropolymère comportant les électrodes,
c7) irradiation avec ledit rayonnement UV de la couche de résine sensible, au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou zone ayant la forme de la(des) électrode(s),
c8) enlèvement du masque et élimination de la résine irradiée,
c9) dépôt pyrolytique d'une couche de parylène de type N ([2,2]paracyclophane) ou C (Chloro[2,2]paracyclophane) dans les zones où la résine a été éliminée,
clO) élimination de la résine sensible restante.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que l'étape c) de passivation des électrodes comprend les étapes suivantes :
ci l) électrogreffage d'un matériau polymère électrophorétique sur les électrodes,
cl 2) durcissement du matériau polymère électrophorétique par chauffage.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 3 et 5 à l3, caractérisé en ce que :
- l'étape g) de greffage de la biomolécule A est une étape de greffage de fonctions réactives de la biomolécule A avec une zone de la micropoutre fonctionnalisée avec des fonctions acide carboxylique (COOH),
- ledit procédé ne comprend pas d'étape e) de préfonctionnalisation, et
- l'étape f) de fonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
fl) dépôt ou greffage d'un masque en un matériau non transparent à un rayonnement VUV, comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement VUV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone de la feuille en un matériau fluoropolymère à fonctionnaliser, cette ouverture ou cette zone étant située dans la partie du masque correspondant à la micropoutre à former, et en dehors de la zone de la micropoutre sur laquelle la (ou les) électrodes est (sont) encastrée(s) ou à encastrer,
f2) irradiation, par ledit rayonnement VUV, sous gaz inerte, de préférence l'azote, de la feuille obtenue à l'étape fl),
f3) enlèvement du masque, f4) formation, par chimie conventionnelle, d'un polymère d'acide polyacrylique PAA, dans les zones irradiées.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 à 13, caractérisé en ce que :
- l'étape g) de greffage de la biomolécule A est une étape de réaction de fonctions réactives de la biomolécule A avec une zone de la micropoutre fonctionnalisée avec des fonctions acide carboxylique,
- ledit procédé ne comprend pas d'étape e) de préfonctionnalisation, et
- l'étape f) de fonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
f5) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
f6) irradiation par ledit rayonnement UV de la couche de résine sensible au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone à fonctionnaliser et étant située dans la partie du masque correspondant à la partie micropoutre à former et en dehors de la zone de la micropoutre sur laquelle la(les) électrodes est(sont) encastrée(s) ou à encastrer,
f7) élimination de la résine irradiée et du masque,
f8) formation d'un polymère d'acide acrylique (PAA), dans les zones où la résine a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium,
f9) élimination de la résine restante.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que :
- l'étape g) de greffage de la biomolécule A est une étape de réaction de fonctions réactives de la biomolécule A avec des fonctions de la micropoutre différentes de fonctions acide carboxylique, de préférence avec des fonctions aminé (NH2), thiol (SH), azoture (N3), alcool (OH), alcène, ou des groupes maléimide, ou avec des groupes esters activés, de préférence esters de succinimide,
- ledit procédé comprend l'étape e) de préfonctionnalisation, et
- l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
el) dépôt ou greffage d'un masque en un matériau non transparent à un rayonnement VUV, comprenant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement VUV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone de la feuille en un matériau fluoropolymère à fonctionnaliser, cette ouverture ou cette zone étant située dans la partie du masque correspondant à la micropoutre à former, et en dehors de la zone de la micropoutre sur laquelle la ou les électrodes sont encastrées ou sont à encastrer,
e2) irradiation, par ledit rayonnement VUV, sous gaz inerte, de préférence l'azote, de la feuille obtenue à l'étape el),
e3) enlèvement du masque,
e4) formation d'un polymère d'acide polyacrylique PAA, par chimie conventionnelle, dans les zones irradiées.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que :
- l'étape g) de greffage de la biomolécule A est une étape de réaction de fonctions réactives de la biomolécule A avec des fonctions de la micropoutre différentes de fonctions acide carboxylique, de préférence avec des fonctions NH2, ou SH, ou N3, ou OH, ou alcène, ou un groupe maléimide, ou avec un groupe ester activé, de préférence ester de succinimide, et
- l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
c5) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
e6) irradiation par ledit rayonnement UV de la couche de résine sensible, au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone à fonctionnaliser et étant située dans la partie du masque correspondant à la partie micropoutre à former et en dehors de la zone de la micropoutre sur laquelle la (ou les) électrodes est (sont) encastrée(s) ou à encastrer,
e7) élimination de la résine irradiée et du masque,
e8) formation d'un polymère d'acide acrylique (PAA), dans les zones où la résine a été éliminée, par la technologie au sel de diazonium, et
e9) élimination de la résine restante.
18. Procédé selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que l'étape f) de fonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
fl O) modification, du PAA formé à l'étape e4) ou à l'étape e8), avec une molécule organique, comprenant, à son extrémité non liée au PAA, des fonctions NH2, ou SH, ou N3, ou OH, ou alcène, ou des groupes maléimide, ou des groupes esters activés, de préférence des groupes esters de succinimide.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que : - l'étape g) de greffage de la biomolécule A est une étape de greffage de fonctions réactives de la biomolécule A avec des fonctions diazonium de la micropoutre,
- ledit procédé comprend une étape de préfonctionnalisation e), et
- l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
elO) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fiuoropolymère,
el l) irradiation par ledit rayonnement UV de la couche de résine sensible, au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme de la zone à fonctionnaliser, et étant située dans la partie du masque correspondant à la micropoutre, mais en dehors de la zone de la micropoutre dans laquelle la(les) électrode(s) sont encastrées ou à encastrer,
el2) élimination de la résine irradiée,
el3) enlèvement du masque,
el4) greffage d'une couche de polymère poly(aminophénylène), sur la zone où la résine a été éliminée, et
en ce que l'étape f) de fonctionnalisation est une étape fi l) d'activation de la couche de polymère poly(aminophénylène) formée à l'étape el 4) en couche de poly(diazonium phényîène).
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend une étape e) de préfonctionnalisation et en ce que l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
el5) dépôt ou greffage, sur la feuille en un matériau fiuoropolymère, d'un masque, en un matériau non transparent audit rayonnement VUV, comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent à un rayonnement VUV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme voulue de la zone à fonctionnaliser, et étant située dans la zone du masque correspondant à la micropoutre à former, mais en dehors de celle dans laquelle la (ou les) électrodes est (sont) encastrée(s) ou à encastrer,
e 16) irradiation par ledit rayonnement VUV, sous gaz inerte, de la feuille obtenue à l'étape el 5),
el 7) retrait du masque,
el 8) formation, par chimie conventionnelle, d'une couche d'un polymère d'acide acrylique (PAA) dans les zones irradiées obtenues à l'étape el6),
el9) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA greffé à l'étape el8), e20) croissance, dans les zones où les ions Cu ont été fixés, d'une couche en un métal choisi parmi le cuivre, l'or, le platine ou l'argent par réduction des ions Cu2+ lorsque la couche à former doit être en cuivre, ou dans un bain du métal voulu, lorsque la couche à former doit être en un métal différent du cuivre.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape e) de préfonctionnalisation et en ce que l'étape e) de préfonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
e21) dépôt d'une couche de résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
e22) irradiation, avec ledit rayonnement UV, de la couche formée à l'étape e21) au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone ayant la forme voulue de la zone à fonctionnaliser, et étant située dans la zone du masque correspondant à la micropoutre à créer mais différente de celle dans laquelle la (ou les) électrodes est (sont) encastrée(s) ou à encastrer,
e23) élimination de la résine irradiée et enlèvement du masque,
e24) greffage d'une couche en un polymère PAA, par la technologie au sel de diazonium, dans les zones où la résine a été éliminée,
e25) fixation d'ions Cu2+, par chélation, sur le PAA greffé à l'étape e24), dans les zones où la résine a été éliminée,
c26) croissance, dans les zones où les ions Cu2 " ont été fixés, d'une couche de métal choisi parmi le cuivre, l'or, le platine ou l'argent, sur la couche formée à l'étape e25), par réduction des ions Cu +, lorsque la couche doit être en cuivre ou dans un bain du métal voulu lorsque la couche doit être en un métal différent du cuivre,
e27) élimination de la résine restante.
22. Procédé selon la revendication 20 ou 21 , caractérisé en ce que l'étape g) de greffage de la biomolécule A est une étape de réaction d'une fonction réactive de la biomolécule A avec une fonction diazonium de la micropoutre et en ce que l'étape f) de fonctionnalisation de ladite zone de la micropoutre comprend les étapes suivantes :
fl2) dépôt d'une résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille comprenant une zone métallisée obtenue à l'étape e20) ou sur la feuille comprenant une zone métallisée obtenue à l'étape e26),
fl3) irradiation de la feuille obtenue à l'étape fl2), au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV, comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone correspondant à la zone métallisée de la feuille, autre que l'(les) électrode(s) définie(s) dans les protocoles a),
fl4) élimination de la résine irradiée et du masque,
fl5) greffage d'une couche de polymère poly(aminophénylène) sur la zone où la résine a été éliminée,
fl6) élimination de la résine restante,
fl7) activation de la couche de poly(aminophénylène) en couche de poly(diazonium phénylène),
23. Procédé selon la revendication 20 ou 21 caractérisé en ce que la couche formée à l'étape e20) ou à l'étape e27) est une couche d'or et en ce que l'étape f) de fonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
fl 8) création d'une couche auto-assemblée alcane thiol/Au sur une zone métallisée de la feuille, différente de celle(s) où l'(les) électrode(s) a (ont) été formée(s) par les étapes a),
fl9) liaison de la partie libre de la molécule correspondant à l'alcane thiol de la couche mono-assemblée obtenue à l'étape fl 8) avec une molécule organique comprenant des fonctions terminales libres NH2, ou SH, ou N3, ou OH, ou alcène, ou un groupe terminal libre maléimide ou ester activé, de préférence ester de succinimide,
et en ce que la biomolécule A est greffée avec ces fonctions aux groupes terminaux libres réactifs de la molécule organique greffée à l'étape fl9).
24. Procédé selon la revendication 20 ou 21 caractérisé en ce que l'étape g) de greffage de la biomolécule A est une étape de réaction de fonctions réactives de la biomolécule A avec des fonctions N¾, ou SH, ou N3, ou OH, ou alcène, ou les groupes maléimide, ou les groupes esters activés, de préférence esters de succinimide, présents sur une zone de la micropoutre, et en ce que l'étape f) de fonctionnalisation comprend les étapes suivantes :
f20) dépôt d'une résine, de type positif, sensible à un rayonnement UV, sur la feuille comprenant une zone métallisée obtenue à l'étape e20) ou sur la feuille comprenant une zone métallisée obtenue à l'étape e26),
fl21) irradiation de la feuille obtenue à l'étape f20), au travers d'un masque en un matériau non transparent audit rayonnement UV, comportant une ouverture ou une zone en un matériau transparent audit rayonnement UV, cette ouverture ou cette zone correspondant à la zone métallisée de la feuille, autre que l'(les) électrode(s) définie(s) dans les protocoles a),
f22) élimination de la résine irradiée et du masque, £23) formation, par la technologie au sel de diazonium, dans la zone irradiée à l'étape f21) d'un polymère obtenu à partir de monomères comprenant des fonctions vinyliques ou acrylates
f24) élimination de la résine restante,
f25) modification, par chimie conventionnelle, du polymère formé à l'étape £23) par réaction des groupes réactifs du polymère avec les groupes réactifs d'une molécule organique comprenant des fonctions terminales libres NH2, ou SH, ou N3, ou OH, ou al cène, ou des groupes terminaux libres maléimide, ou esters activés, de préférence esters de succinimide,
et en ce que la biomolécule A est greffée sur les fonctions aux groupes libres de la molécule organique préférée à l'étape £25).
25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4-24, caractérisé en ce que l'étape d) de création de la forme et de séparation de la structure finale du biocapteur de la feuille en un matériau fluoropolymère comprend les étapes suivantes :
dl) fabrication d'un moule de découpe creux ou à la forme de la structure du capteur final voulu,
d2) compression du moule fabriqué à l'étape dl) sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
d3) découpe autour du moule de la structure voulue emboutissage avec chauffage et/ou excitation acoustique par ultrasons du moule de découpe.
26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que l'étape d) de création de la forme du capteur final et son détachement de la feuille en un matériau fluoropolymère comprend une étape d4) de découpe de la forme voulue dans la feuille en un matériau fluoropolymère, par un laser Excimère émettant dans le domaine des longueurs d'onde des VUV.
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 , 2 et 4 à 24, caractérisé en ce que l'étape d) de création de la forme du capteur final et son détachement de la feuille en un matériau fluoropolymère comprend les étapes suivantes :
d5) dépôt d'un masque ou d'un pochoir comprenant une ouverture détourant la forme finale voulue du capteur, sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
d6) découpe par attaque profonde réactive ionique sèche (DRIE) des contours de l'ouverture du masque ou du pochoir.
28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que l'étape d) de création de la forme du capteur final et son détachement de la feuille en un matériau fluoropolymère comprend les étapes suivantes :
d7) fabrication d'un moule de découpe creux ou à la forme de la structure du capteur final voulu en un matériau ou en alliage ayant une dureté supérieure au matériau fluoropolymère à découper,
d8) compression du moule fabriqué à l'étape d7) sur la feuille en un matériau fluoropolymère,
d9) découpe autour du moule de la structure voulue par emboutissage, à température ambiante.
29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que l'étape d) de création de la forme du capteur final et son détachement de la feuille en un matériau fluoropolymère comprend une étape dlO) de découpe manuelle, de préférence avec un scalpel, sous microscope, de la forme du capteur final.
30. Biocapteur caractérisé en ce qu'il comprend:
- une micropoutre réalisée en un matériau fluoropolymère, qui est la partie mobile du biocapteur, reliée à un support également réalisé en matériau fluoropolymère et avec lequel la micropoutre forme une pièce intégrale,
- au moins une électrode passivée dont une partie au moins est encastrée sur la micropoutre, la(les) électrode(s) comprenant, optionnellement, un plot en un matériau feiTomagnéti que,
- au moins une molécule biologique A greffée sur la micropoutre par fonctionnalisation d'une zone de la micropoutre, ladite zone étant différente de la zone d'encastrement de la(des) électrode(s),
- un transducteur mécano-électrique de conversion en signal électrique des variations des propriétés mécaniques de la micropoutre, lorsque la molécule biologique A est mise en contact avec une molécule biologique B à détecter et/ou quantifier.
31. Biocapteur selon la revendication 30, caractérisé en ce que le biocapteur n'est pas un biocapteur piézoélectrique et en ce que le matériau fluoropolymère est en un matériau choisi parmi le PVDF, le PTFE ou le P(VDF-TrFE).
32. Biocapteur selon la revendication 30, caractérisé en ce que le biocapteur est un biocapteur à détection piézoélectrique et en ce que le matériau fluoropolymère a des propriétés piézoélectriques, de préférence choisi parmi le PVDF ou le P(VDF-TrFE) ayant des propriétés piézoélectriques.
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