EP2588544A1 - Exopolysaccharides pour la prévention et la lutte contre la formation de biofilms - Google Patents

Exopolysaccharides pour la prévention et la lutte contre la formation de biofilms

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Publication number
EP2588544A1
EP2588544A1 EP11729618.6A EP11729618A EP2588544A1 EP 2588544 A1 EP2588544 A1 EP 2588544A1 EP 11729618 A EP11729618 A EP 11729618A EP 2588544 A1 EP2588544 A1 EP 2588544A1
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EP
European Patent Office
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exopolysaccharides
hyd
eps
formation
biofilm
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11729618.6A
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German (de)
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Inventor
Jean Guezennec
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Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
Original Assignee
Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to the field of prevention of biofilms of undesirable microorganisms. More particularly, the invention provides a surface treatment method for protecting said surface against inadvertent adhesion of undesirable biofilms, the process according to the invention using exopolysaccharides. According to the invention, the surface to be treated is brought into contact, punctually or at regular intervals, with exopolysaccharides, preferably in solution, which are capable of forming on this surface a protective film of exopolysaccharides.
  • a biofilm is a community of microorganisms, particularly of the bacteria, fungus, algae or protozoan type, adhering to one another and to a surface.
  • the production of biofilm is characterized by the secretion of a matrix that is likely to adhere to many types of surface, including minerals, metals, glasses, synthetic resins.
  • Biofilms are generally observed in aqueous or wet environments.
  • This primary film is formed of organic materials present in the medium
  • biofilms can have numerous consequences in the industrial field, as well as in the environmental or health fields, in particular public health.
  • the present invention can therefore find an application in various fields.
  • biofilms induce corrosions, reduce the heat exchange in the exchangers and cause resistance to flow in the tubes and pipes.
  • the formation of biofilms could be at the origin of many cases of nosocomial diseases, especially when biofilm is fixed on catheter-type surgical equipment or in air conditioning or refrigeration systems. .
  • the invention is particularly interested in the formation of biofilms on any surface likely to be colonized in a natural environment, especially in the marine environment.
  • a biofilm In the marine environment, it is known that almost all immersed surfaces in the marine environment are subject to the development of a biofilm. The presence of this biofilm is at the root of many problems in the oceanographic field and for marine activities.
  • the means of control used against the stains installed are often toxic (in particular biocides) and can have disastrous consequences vis-à-vis the fauna and the flora of the marine environment.
  • regular cleaning of surfaces considerably increases the operating costs of marine industries.
  • the present invention is of particular interest in that it acts at the first stages of the adhesion phenomenon, namely the prevention of primary film formation and / or the modification of its structure and composition, and the prevention of reversible adhesion, effectively preventing the subsequent steps of permanent adhesion of unwanted biofilm, then hooking macro-organisms on this biofilm.
  • US 7,090,856 discloses a safe anti-salt agent which is nontoxic, and benign to the marine environment.
  • This agent is derived from Vibrio alginolyticus or Vibrio proteolyticus. It can be constituted by the supernatant of a fermentation of these bacteria, which is then desalinated and generally concentrated. It can be used alone or in paint, concrete or coating compositions. It can be used on marine surfaces as a permanent coating or a spray or rinse aid. It inhibits the adhesion of larvae of macro-organisms of the type including barnacles or polychaetes.
  • 7,090,856 does not disclose or suggest the prevention of primary film prevention agent which is responsible for the reversible adhesion initially and then permanently of the microorganisms. No. 7,090,856 also does not describe the specific prevention of adhesion of microorganisms on surfaces. In contrast, US 7,090,856 describes the prevention of the fixation of macroorganisms, by an action on the adhesion of larvae of macro-organisms to the unwanted biofilm already formed.
  • EP 1 170 359 describes a biological jelly comprising polysaccharides produced by a strain of the genus Alteromonas.
  • EP 1 170 359 discloses that said jelly inhibits the attachment of macro-organisms to a surface.
  • EP 1 170 359 does not disclose the prevention of adhesion of microorganisms on a surface.
  • EP 1 170 359 in fact describes a surface on which SHY1-1 bacteria producing a polysaccharide are attached, said polysaccharide inhibiting the attachment of macro-organisms to said surface.
  • WO9607752 describes exopolysaccharides of the family of the Hyphomonas as a metal binding agent for purifying water of said metals.
  • agent which is both environmentally friendly, and has the power to effectively prevent, and in full compliance with the environment, the formation of primary film or unwanted microscopic biofilm on a surface of a material.
  • An object of the present invention is the use of exopolysaccharides (EPS) as an agent for preventing the formation, on a surface, of a microscopic biofilm.
  • EPS exopolysaccharides
  • said EPSs comprise neutral oses, preferably glucose, rhamnose, mannose or galactose; acidic oses, preferably uronic acids such as glucuronic acid, galacturonic acid or hexuronic acid; amine oses, preferably N acetyl glucosamine or N actéyl galactosamine; sulphates and / or proteins.
  • said EPS are obtained by fermentation of bacteria from deep hydrothermal ecosystems.
  • said bacteria from deep hydrothermal ecosystems are of the genus Alteromonas or Pseudoalteromonas.
  • said exopolysaccharides are obtained by fermentation of bacteria Alteromonas macleodii or Alteromonas infernus.
  • said exopolysaccharides are selected from HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, and HYD 1666.
  • exopolysaccharides are associated with zosteric acid or one of its derivatives.
  • said exopolysaccharides are associated with one or more PAMs.
  • Another subject of the invention is a method of protecting a surface by preventing the formation of a microscopic biofilm, comprising the use of exopolysaccharides as described above, characterized in that a protective film of exopolysaccharides on said surface by contacting or grafting said surface with at least one exopolysaccharide.
  • said method further comprises a step of monitoring the formation or state of the exopolysaccharide film resulting from contacting or grafting said surface with at least one exopolysaccharide by any physical means. adapted chemical.
  • said surface is metallic, in that said physicochemical means is the measurement of the electrochemical potential variation of said surface.
  • the placing in contact is carried out punctually or at regular intervals, preferably by injecting an EPS solution with a concentration of 0.001 to 10%, preferably 0.01 to 1% by weight relative to the volume. total of the solution, close to a surface.
  • Another object of the invention is a method of modifying the physical characteristics of a surface such that the adhesion of an undesirable bacterial biofilm to said surface is limited, including the use of exopolysaccharides as described herein. above, characterized in that said surface is contacted or grafted with an exopolysaccharide.
  • Another object of the invention is a surface coated with exopolysaccharides, obtained using exopolysaccharides as described above, or by the method as described above.
  • Another object of the invention is a product comprising a surface as described above.
  • said product is a pipeline or a LNG terminal.
  • said product is a hospital tool, preferably a tube or catheter.
  • the invention relates to the use of exopolysaccharides (EPS) as an agent for preventing the formation of unwanted biofilms.
  • EPS exopolysaccharides
  • the Applicant suggests that the formation of an exopolysaccharide film on a surface modifies the composition and / or the primary film structure.
  • the primary film formed in the presence of EPS is hereinafter referred to as "modified primary film".
  • modified primary film The bacteria in the aqueous medium would then be unable to attach to this modified primary film.
  • the presence of EPS on the surface thus inhibits the formation of the microscopic biofilm.
  • the EPS partially replace the organic matter molecules in the modified primary film.
  • the modified primary film is formed of organic materials and EPS.
  • the modified primary film is formed solely of EPS.
  • the EPSs are also useful as an agent for preventing the formation, on a surface, of the primary film leading to undesirable biofilms.
  • the EPSs used in the present invention comprise neutral oses, acidic oses, amino oses, sulphates and / or proteins. According to one embodiment of the invention, the EPSs used in the present invention consist of neutral oses, acidic oses, amino oses, sulphates and / or proteins.
  • neutral osteos examples include, but are not limited to, glucose, rhamnose, mannose, galactose, ...
  • acidic hazards include, but are not limited to, uronic acids and especially glucuronic acid, galacturonic acid, hexuronic acid such as hexuronic acid of furan structure substituted on its carbon in position 3 by a lactyl residue ...
  • amino moieties include, but are not limited to, N acetyl glucosamine and N actéyl galactosamine, ...
  • the EPS comprise between 30 and 95% neutral osteos, preferably between 40 and 90%, even more preferably between 45 and 88% neutral osteos, in number of dared by compared to the total number of dared in the EPS.
  • the EPS comprise between 1 and 70% of acidic evanes, preferably between 5 and 60%, even more preferably between 8 and 53% of acidic osteos, in number of osteosities by compared to the total number of dared in the EPS.
  • the EPS comprise less than 30% aminos, preferably less than 20%, even more preferably less than 12% aminos, in number of dared with respect to the total number of dares in the EPS.
  • the EPS comprise less than 50 sulphate molecules per 100 monosaccharides, preferably less than 40 sulphate molecules, even more preferably less than 35 sulphate molecules per 100 monosaccharides in the EPS.
  • the EPS comprise less than 50 proteins per 100 monosaccharides, preferably less than 40 proteins, more preferably less than 37 proteins per 100 monosaccharides in the EPS.
  • the EPS do not comprise aminoarabinose, aminoribose, heptose and / or xylose.
  • the EPSs used have a molecular mass greater than 500 kDa, preferably greater than 800 kDa, more preferably greater than 1000 kDa, still more preferably greater than 2000 kDa.
  • the exopolysaccharides (EPS) of the invention are obtained by fermentation of bacteria from deep hydrothermal ecosystems. More particularly, the EPS of the invention are those synthesized under controlled conditions (nutritional imbalance generated by a high carbon / nitrogen ratio due to a carbohydrate enriched nutritional medium) during the fermentation of bacteria from deep hydrothermal ecosystems (see for example Guezennec, J. (2002) Deep-sea hydrothermal winds: A new source of innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204-208).
  • these EPSs are chosen from HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, and HYD 1666.
  • these EPS are chosen from those synthesized by bacteria of the genus Alteromonas or Pseudoalteromonas, in accordance with to the taxonomy in force on the day of the present invention. If the taxonomy were to be modified, those skilled in the art could adapt the taxonomy modifications to deduce the EPS of the invention.
  • these bacteria are Alteromonas macleodii bacteria, and in this embodiment, preferably the EPS is HYD 657.
  • these bacteria are Alteromonas infernus bacteria, and in this embodiment, preferably the EPS is GY 785.
  • EPS is HYD 1545 or HYD 1644.
  • the present invention also relates to a method.
  • the method according to the invention is a method of protecting a surface by preventing the formation of undesirable bacterial biofilm on said surface, in which a protective film of exopolysaccharides is formed on said surface by contacting or grafting said surface with at least one exopolysaccharide according to the invention.
  • the EPSs are in solution in a polar solvent, preferably water.
  • the concentration of EPS in the solution is from 0.001 to 10%, preferably from 0.01 to 1%, very preferably from 0.02 to 0.5%, even more preferentially about 0.02%. % by weight / volume, based on the total volume of the solution.
  • said surface is brought into contact with an EPS solution as described above.
  • the EPS film is continuous on said surface.
  • the EPS film has a thickness of 0.1 to 100 ⁇ , preferably from 0.5 to 25 ⁇ , preferably from 1 to 10 ⁇ .
  • the conditions favoring the formation of a homogeneous film of EPS on the surfaces are preferably as follows:
  • contacting time from 10 seconds to 5 hours, preferably from 1 to 120 minutes, more preferably from 3 to 60 minutes, even more preferably from 5 to 30 minutes.
  • the placing in contact is carried out in a medium of circulating seawater.
  • the contacting or grafting is carried out prior to exposure of the surface to undesirable biofilm formation conditions, for example but not exclusively, prior to immersion in a medium of seawater.
  • the grafting is carried out on small surfaces, of the type in particular sensors.
  • the grafting could allow a better hold of EPS on the surface than a simple contact, and thus provide prolonged protection of the grafted surface.
  • the grafting can be implemented by any method known to those skilled in the art, in particular of the type described in WO2008078052.
  • the method may comprise means for monitoring, in particular by physicochemical methods, the filming power of the EPSs, their stability over time so as to optimize their use and to avoid any risk of heterogeneity of the clean surface to encourage risks, especially for metal surfaces (metals and alloys), corrosion risks.
  • the method according to the invention comprises a step of monitoring the formation of the exopolysaccharide film resulting from the contacting or grafting of said surface with at least one exopolysaccharide according to the invention, by any physicochemical means adapted.
  • the monitoring of the formation of the EPS film on metal surfaces can be measured by electrochemical measurements, in particular, but not exclusively, by measuring the electrochemical potential of the alloys or metals of the surface, electrochemical potential and the variation of this potential being measured with respect to a reference electrode.
  • the electrochemical potential of the alloys or metals of the surface varies. This electrochemical potential becomes stable when the film is homogeneous.
  • the electrochemical potential variation of the metal is measured after the first contact with the exopolysaccharides, and the contacting of the metal surface with the EPSs according to the process. of the invention (placed in contact with EPS in solution, or grafting) is continued until the electrochemical potential of the surface stabilizes.
  • the measurements are continued, and when the electrochemical potential of the surface is destabilized, the contact with the EPS is resumed until the electrochemical potential is stabilized again.
  • the alteration of the protective film can induce a variation of this electrochemical potential reflecting a risk of bacterial colonization and consequently an obligation to refilmer these same surfaces by contacting the EPS.
  • the method according to the invention further comprises a step of monitoring the state of the exopolysaccharide film, making it possible to trigger, if necessary, that is to say if the film does not is not homogeneous or degrades, bringing the surface into contact with EPS.
  • the destabilization of the film can be measured and followed by the variation of the electrochemical potential of the surface.
  • the invention therefore also relates to a method for controlling the presence of a protective film on a metal surface, in which the electrochemical potential of said surface is measured.
  • a variation of at least -10% of the electrochemical potential of a metal surface over a given period of time (1-30 minutes) induces bringing the surface into contact with EPS.
  • the device for measuring the electrochemical potential of the surface is coupled to an EPS injection apparatus, such that a pre-recorded threshold value on the measuring apparatus electrochemical potential triggers contact of the surface with a given amount of EPS.
  • the contacting is effected by injecting an EPS solution near the surface to be treated.
  • the contacting of the EPS with the surface is preferably renewable, and preferably renewed, especially on a metal surface when the electrochemical potential of the surface makes a variation of about 10%.
  • the method of the invention leads to a significant reduction in bacterial adhesion to the studied surfaces and therefore to the formation of the undesirable biofilm.
  • the Applicant has strong presumptions according to which the method of the invention would have a mechanism of a physical nature and that the action of the exopolysaccharides on the prevention of the primary film would not be of a chemical nature: thus, the invention is part of a respect for the environment, and avoids any impact on the bacterial flora.
  • the EPS film deposited by the process of the invention modifies the physical characteristics of the surface, for example by modifying the characteristics of the primary film.
  • the method according to the invention is also a method for modifying the adhesion characteristics of an undesirable bacterial biofilm on a surface, by modifying the physical characteristics of said surface due to the deposition of an exopolysaccharide film.
  • the subject of the invention is therefore a method for modifying the physical characteristics of a surface in such a way that the adhesion of an undesirable bacterial biofilm to said surface is limited, said physical characteristics of the surface likely to be modified being able to be modified. be: zeta potential or electrochemical potential; the contact angle; hydrophilicity; and Lewis acid-base characteristics.
  • the present invention is particularly advantageous in that EPSs are environmentally friendly, have no antimicrobial effect and are not biocidal. It should be noted that the present invention does not constitute one of cleaning a surface or a means of dissolving or combating an unwanted bacterial biofilm already installed.
  • the present invention also relates to a surface covered by an EPS film as described above, or obtained according to the surface protection method as described above.
  • said surface is metallic, mineral, such as, for example, cements and concretes, or plastic.
  • the present invention also relates to a product comprising a surface covered with an EPS film as described above.
  • the EPSs according to the invention are useful in the industrial field, such as marine terminals, in particular LNG terminals, microbiologically active water pipes, seawater or freshwater circuits.
  • the products comprising a surface covered by a film of EPS include, but are not limited to, pipes and ducts, platforms, including LNG terminals.
  • the EPS according to the invention are useful in the field of health, including public health.
  • the products comprising a surface covered by an EPS film include, but are not limited to, tubes and catheters, syringes, surgical tools, medical instruments.
  • the EPS film may be associated with an agent that enhances its action of inhibiting the formation of biofilms.
  • the agent associated with the EPS film and reinforcing its action of inhibiting the formation of biofilms is zosteric acid.
  • Zosteric acid is described as allowing the prevention of biofilm formation on surfaces (US 5,384,176, US 5,607,741, incorporated by reference).
  • zosteric acid is native.
  • the zosteric acid may be a chemically modified derivative, preferentially a zosteric acid derivative is a zosteric acid ester as described in US2007 / 128151, incorporated by reference.
  • the zosteric acid derivative is an acid derivative of zosteric acid.
  • zosteric acid is extracted from the seaweed Zostera marina.
  • the EPS film may be associated with antimicrobial agents, such as, for example, antimicrobial peptides (PAM).
  • PAM antimicrobial peptides
  • the EPS film associated with the antimicrobial agents has antimicrobial effects, making it possible to accentuate the surface colonization inhibition effect. Such activity is particularly useful in the field of health.
  • Antimicrobial peptides (MAPs) are innate immune effector molecules, conserved during evolution and widespread throughout the living kingdom. A wide variety of PAMs has been identified in recent years, revealing a great diversity in terms of structures, sizes and modes of action. PAMs are generally characterized by a high representativeness in cationic and hydrophobic amino acids.
  • PAMs kill microorganisms, either by permeabilizing their membrane by a detergent-like effect or by the formation of pores, by blocking the synthesis of peptidoglycan component of the bacterial wall, or by the inhibition of bacterial metabolic pathways (Brodgen et al., 2005).
  • PAM Compared to chemical antibiotics, generally used, PAM have the advantage of being completely biodegradable. They appear as good candidates in substitution for conventional chemical antibiotics, because of their biological properties. Indeed, they have a broad spectrum of antimicrobial activity, little specificity, different modes of action and a safety on the environment.
  • PAMs can be produced by chemical synthesis or expression in bacterial or yeast recombinant (cloning, expression, purification) systems.
  • PAM may belong to the family of alpha-helical linear PAMs, to the family of PAMs with overrepresentation in one or more amino acids, to the family of hairpin PAMs (beta Hairpin) with 1 or 2 disulfide bridges to the family of beta cyclic PAM and alpha helix with 3 or more disulfide bridges (Bulet et al., Immunological reviews, 2004, 198: 169-184; Brogden, Nature Review Microbiology, 2005, 3: 238-250).
  • linear alpha-helical PAM examples include, but are not limited to, cecropin, stomoxyne, ponericin, spinigerin, oxyopinin, cupienin, clavanin, styeline, pardaxine, misgurine, pleurocidin, parasin, oncorhyncin, moronecidin, magainin, temporin, cathelicidin and indolicidin.
  • PAM enriched in one or more amino acids, proline, arginine, glycine, or tryptophan include, but are not limited to, bactenicins, PR-39, abaecins, apidaecins, drosocine, pyrrhocoricins, Cg-Prp, prophenine, and indolicin. .
  • hairpin PAMs containing 2 to 4 cysteines include, but are not limited to, tachyplesin, protrinin, thanatin, androctonin, gomesin, polyphemusine, hepcidin, brevinine, esculentine, tigerinine or bactenecine.
  • cyclic PAMs containing 6 or more cysteine or open-cycle residues include, but are not limited to, defensins (from vertebrates, invertebrates or plants), proin, heliomicin, drosomycin, ASABF, pBD, penaeidines, ALF and big - defensins.
  • the PAM is tachyplesin or defensin.
  • the PAMs are synthesized by chemical synthesis. According to another embodiment of the invention, the PAMs are synthesized by biological synthesis in a bacterial or fungal recombinant system and preferably in a yeast system.
  • the surface covered with the EPS film is brought into contact with a solution comprising one or more PAMs at a concentration of 1 to 10 CMI.
  • the PAMs may be in solution in a biologically acceptable polar solvent such as water, ethanol, trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH, TFE) or their mixture, for example water / TFE, preferably trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH).
  • a biologically acceptable polar solvent such as water, ethanol, trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH, TFE) or their mixture, for example water / TFE, preferably trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH).
  • the contacting is carried out at a constant temperature, preferably from 1 to 10 ° C, more preferably about 4 ° C.
  • the contacting is carried out for 24 to 120 hours, preferably for 48 to 96 hours, more preferably 72 hours.
  • EPS means the exopolysaccharides synthesized under controlled conditions (nutritional imbalance generated by a high carbon / nitrogen ratio due to a carbohydrate enriched nutrient medium) during the fermentation of bacteria from deep hydrothermal ecosystems, in particular but not exclusively , the following EPS: Reference Origin Oses Oses Oses Sulfates Proteins
  • EPS solution is meant a solution formed by a polar solvent, and an EPS or a mixture of EPS.
  • surface is meant the area, or the outer part of a mass of material which may be of synthetic origin, typically a polymeric material or a material of mineral origin, typically glass or concrete, or which may be a metal, especially copper, titanium; preferred metal surfaces are 316L stainless steel, titanium, Inconel 600, nickel, admiralty brass, and chrome.
  • primary film is meant a conditioning film composed of proteins or protein fragments, carbohydrates, lipids, mineral substances such as, for example mineral salts from the surrounding environment. This primary film stimulates bacterial adhesion.
  • unwanted biofilm is meant a film of microorganisms, usually bacteria, which cling to the primary film, in a first reversible and then irreversible adhesion step.
  • a biofilm is made up of microorganisms.
  • biofilm “microscopic biofilm”, “bacterial biofilm” and “unwanted biofilm” are interchangeable.
  • the macroorganisms attached to a surface do not form a biofilm within the meaning of the present invention.
  • grafting any means of attachment of EPS according to the invention on a surface.
  • contact angle is meant the angle at which a liquid interface meets a solid surface.
  • the contact angle is measured by a goniometer.
  • the contact angle measurement accounts for the ability of a liquid to spread over a surface.
  • the method consists in measuring the angle of the tangent of the profile of a drop deposited on the material, with the surface of the material. It measures the surface energy of the liquid or solid.
  • the measurement of the contact angle gives access to the free energy of a surface. It also allows discrimination of the polar or apolar nature of interactions at the liquid / solid interface. It is thus possible to deduce the hydrophilic or hydrophobic nature of a surface.
  • MIC is meant the minimum concentration from which an agent inhibits the visible growth of a microorganism after overnight incubation.
  • the methods for determining the MIC of an agent are well known in the state of the art.
  • FIG. 1 which is read with reference to example 1 below, is a graph illustrating the filming power of the EPSs, with the duration of the experiment on the abscissa, that is to say the exposure time of the filmed and non-filmed surfaces with circulating seawater, and on the ordinate the rate of coverage of the surface by EPS.
  • EPS have been tested. The results obtained with the following EPSs are shown in FIG. 1: HYD 721, MS 907, ST 716, HYD 1545, HYD 1644, GY 785 and HYD 657. The method, general, is explained with respect to the following 4 EPS:
  • EPS are known from the prior art, and described in particular in the following publications: ⁇ (HYD 657): Cambon-Bonavita M.A., G. Raguenippo, J. Jean, P. Vincent and J.
  • 316L stainless steel samples were used for studies of the influence of surface pretreatment with biopolymers from bacterial fermentation.
  • the steel samples were pre-conditioned by immersion in osmosis water supplemented with bacterial proteins and / or exopolysaccharides resulting from biotechnological fermentation processes at a concentration of 200 mg / liter (ie 0.02% weight / volume). . After two hours of contact at a constant temperature of 20 ° C., the different samples were rinsed with 200 ml of physiological saline and then dried under a laminar flow hood before experimentation. Non-pre-conditioned samples were used as references.
  • Dynamic adhesion tests were carried out using circulating seawater that was not renewed.
  • the bacterial colonization of samples unconditioned and conditioned by different exopolysaccharides was carried out via an electron microscope equipped with a camera connected to a computer and using dynamic adhesion cells.
  • a diluted bacterial culture is contacted in microwells with an EPS solution at known concentrations.
  • the result is obtained by measuring the optical density (OD) in the wells after 18 hours of growth at 30 ° C.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) is the lowest concentration at which EPS inhibits bacterial growth.
  • the minimum bactericidal concentration (MBC) is the lowest concentration at which EPS kills bacteria.
  • Escherichia coli SBS 363 Gram negative bacillus
  • Micrococcus luteus CIP 53.45 (Gram positive shell)
  • a first screening was performed on all EPS at a high concentration (100 or 500 ⁇ g / mL) to identify potentially active PSE.
  • a second test was performed with a dilution range of active EPS to identify the MIC.
  • the contents of the wells showing inhibition were spread on agar medium to identify CMB.
  • a diluted bacterial culture is contacted in microwells with an EPS solution at known concentrations. The result is obtained by measuring the optical density (OD) in the wells after 18 hours of growth at 30 ° C.
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) is the lowest concentration at which EPS inhibits bacterial growth.
  • the minimum bactericidal concentration (MBC) is the lowest concentration at which EPS kills bacteria.
  • Escherichia coli ATCC 8739 Gram negative bacillus
  • Bacillus subtilis ATCC 6633 Gram positive bacillus
  • Staphylococcus aureus ATCC 6538 (Gram positive shell)
  • Candida albicans ATCC 10231 (yeast)
  • Each EPS was dissolved in sterile water at 1 mg / mL and diluted to 0.5 mg / mL and 0.25 mg / mL. These solutions were used to perform antimicrobial tests at final concentrations of 100 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL and 25 ⁇ g / mL.
  • the contents of the wells showing inhibition were plated on agar culture medium to determine CMB.
  • the strains grow in the presence of any EPS.

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Abstract

L'invention concerne des exopolysaccharides de préférence obtenus par fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds en tant qu'agents de prévention de la formation, sur une surface, de biofilms indésirables. L'invention concerne également un procédé de protection d'une surface par prévention de la formation du film primaire conduisant à des biofilms indésirables, dans lequel on met en contact ou l'on greffe ladite surface avec au moins un exopolysaccharide selon l'invention. L'invention concerne en outre un procédé de modification des caractéristiques physique d'une surface de telle manière que l'adhésion d'un biofilm bactérien indésirable sur ladite surface se trouve limitée.

Description

EXOPOLYSACCHARIDES POUR LA PRÉVENTION ET LA LUTTE CONTRE
LA FORMATION DE BIOFILMS
[Domaine de l'invention]
La présente invention concerne le domaine de la prévention de biofilms de microorganismes indésirables. Plus particulièrement, l'invention propose un procédé de traitement de surface en vue de protéger ladite surface contre l'adhésion intempestive de biofilms indésirables, le procédé selon l'invention mettant en œuvre des exopolysaccharides. Selon l'invention, la surface à traiter est mise en contact, ponctuellement ou à intervalles régulier, avec des exopolysaccharides, de préférence en solution, qui sont capables de former sur cette surface un film protecteur d'exopolysaccharides.
Un biofilm est une communauté de microorganismes, notamment du type bactérie, champignon, algue ou protozoaire, adhérant entre eux et à une surface. La production de biofilm est caractérisée par la sécrétion d'une matrice qui est susceptible d'adhérer à de nombreux types de surface, notamment minéraux, métaux, verres, résines synthétiques. Les biofilms sont généralement observés dans des milieux aqueux ou humides.
Le phénomène d'adhésion d'un biofilm indésirable se déroule en plusieurs séquences :
1. Formation d'un film primaire qui va conditionner la surface. Ce film primaire est formé de matières organiques présentes dans le milieu ;
2. Adhésion réversible des micro-organismes par des liaisons chimiques non-covalentes ou faibles ;
3. Adhésion permanente des micro-organismes facilitée par la production d'exopolymères saccharidiques ou de protéines ou glycoprotéines qui constituent des points d'ancrage pour une colonisation ultérieure de plus grande ampleur. Le film de micro-organismes fixés de façon permanente sur une surface constitue le biofilm au sens de la présente invention ; 4. En milieu marin, la colonisation d'une surface par un biofilm peut permettre, à terme, l'attachement d'organismes supérieurs (balanes, moules, et plus généralement macro-organismes et macro-salissures). [Problème technique]
La formation de biofilms peut avoir de nombreuses conséquences tant dans le domaine industriel, que dans le domaine environnemental ou celui de la santé, notamment de la santé publique. La présente invention peut donc trouver une application dans des domaines variés.
Dans le domaine industriel, les biofilms induisent des corrosions, diminuent l'échange thermique dans les échangeurs et provoquent des résistances à l'écoulement dans les tubes et tuyaux. Dans le domaine de la santé, il est reconnu que la formation de biofilms pourrait être à l'origine de nombreux cas de maladies nosocomiales, notamment lorsque du biofilm se fixe sur du matériel chirurgical de type cathéter ou dans les systèmes de climatisation ou de réfrigération.
L'invention s'intéresse particulièrement à la formation de biofilms sur toute surface susceptible d'être colonisée en milieu naturel, notamment en milieu marin. Dans le milieu marin, il est connu que presque toutes les surfaces immergées en milieu marin sont sujettes au développement d'un biofilm. La présence de ce biofilm est à l'origine de nombreux problèmes dans le domaine océanographique et pour les activités marines. Les moyens de lutte employés contre les salissures installées sont souvent toxiques (notamment biocides) et peuvent avoir des conséquences désastreuses vis-à-vis de la faune et de la flore de l'environnement marin. D'autre part, les nettoyages réguliers de surfaces augmentent considérablement les coûts d'exploitation des industries marines.
II existe donc un réel besoin de développer des approches alternatives aux traitements traditionnels contre les salissures et les biofilms indésirables.
La présente invention présente un intérêt particulier en ce qu'elle agit au niveau des premières étapes du phénomène d'adhésion, à savoir la prévention de la formation de film primaire et/ou la modification de sa structure et de sa composition, et la prévention de l'adhésion réversible, prévenant de fait les étapes ultérieures d'adhésion permanente de biofilm indésirable, puis d'accrochage de macro-organismes sur ce biofilm. [État de la technique]
Il existe des agents anti- salis sures dans l'état de la technique. Par exemple, US 7,090,856 décrit un agent anti- salis sures qui est non toxique, et bénin pour l'environnement marin. Cet agent est issu de Vibrio alginolyticus ou Vibrio proteolyticus . II peut être constitué par le surnageant d'une fermentation de ces bactéries, qui est ensuite dessalé et généralement concentré. Il peut être utilisé seul ou dans des compositions de peinture, de béton ou de revêtement. Il peut être utilisé sur des surfaces marines sous forme de revêtement permanent ou d'un spray ou liquide de rinçage. Il inhibe l'adhésion de larves de macro-organismes du type notamment balane ou polychètes. Toutefois, US 7,090,856 ne décrit ni ne suggère la prévention d'agent de prévention du film primaire qui est à l'origine de l'adhésion réversible dans un premier temps, puis permanente, des microorganismes. US 7,090,856 ne décrit pas non plus la prévention spécifique de l'adhésion des microorganismes sur les surfaces. Au contraire, US 7,090,856 décrit la prévention de la fixation de macro-organismes, par une action sur l'adhésion des larves de macro-organismes au biofilm indésirable déjà constitué.
De même, la demande de brevet EP 1 170 359 décrit une gelée biologique comprenant des polysaccharides produite par une souche du genre Alteromonas . EP 1 170 359 décrit que ladite gelée inhibe l'attachement de macro-organismes sur une surface. EP 1 170 359 ne décrit pas la prévention de l'adhésion de micro-organismes sur une surface.
Il est connu de l'homme du métier que la présence de microorganismes fixés sur une surface est un préalable à la fixation de macro-organismes sur ladite surface. Par contre, il est également connu que la présence d'un biofilm microscopique n'entraîne pas automatiquement la fixation de macro-organismes. Ainsi, l'absence de fixation de macroorganismes ne signifie pas qu'il n'y a pas de biofilm sur une surface. EP 1 170 359 décrit en effet une surface sur laquelle sont fixées des bactéries SHY1-1 produisant un polysaccharide, ledit polysaccharide inhibant l'attachement des macro-organismes sur ladite surface.
Par ailleurs, WO9607752 décrit des exopolysaccharides de la famille des Hyphomonas comme agent de liaison avec un métal, pour purifier des eaux desdits métaux. A la connaissance de la Demanderesse, aucun document de l'art antérieur ne décrit ni ne suggère d'agent, qui soit à la fois respectueux de l'environnement, et qui aie le pouvoir de prévenir efficacement, et en parfait respect de l'environnement, la formation de film primaire ou d'un biofilm microscopique indésirable sur une surface d'un matériau.
[Résumé]
Un objet de la présente invention est l'utilisation d'exopolysaccharides (EPS) en tant qu'agent de prévention de la formation, sur une surface, d'un biofilm microscopique.
Dans un mode de réalisation, lesdits EPS comprennent des oses neutres, de préférence glucose, rhamnose, mannose ou galactose ; des oses acides, de préférence des acides uroniques tels que acide glucuronique, acide galacturonique ou acide hexuronique ; des oses aminés, de préférence N acétyl glucosamine ou N actéyl galactosamine ; des sulfates et/ou des protéines.
Dans un autre mode de réalisation, lesdits EPS sont obtenus par fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds.
Dans un autre mode de réalisation, lesdites bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds sont du genre Alteromonas ou Pseudoalteromonas .
Dans un autre mode de réalisation, lesdits exopolysaccharides sont obtenus par fermentation de bactéries Alteromonas macleodii ou Alteromonas infernus.
Dans un autre mode de réalisation, lesdits exopolysaccharides sont choisis parmi HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, et HYD 1666.
Dans un autre mode de réalisation, lesdits exopolysaccharides sont associés à l'acide zostérique ou à l'un de ses dérivés.
Dans un autre mode de réalisation, lesdits exopolysaccharides sont associés à un ou plusieurs PAM.
Un autre objet de l'invention est un procédé de protection d'une surface par prévention de la formation d'un biofilm microscopique, comprenant l'utilisation d'exopolysaccharides tels que décrits ci-dessus, caractérisé en ce que l'on forme un film protecteur d'exopolysaccharides sur ladite surface par mise en contact ou greffage de ladite surface avec au moins un exopolysaccharide.
Dans un mode de réalisation, ledit procédé comprend en outre une étape de suivi de la formation ou de l'état du film d'exopolysaccharides résultant de la mise en contact ou du greffage de ladite surface avec au moins un exopolysaccharide par tout moyen physico- chimique adapté.
Dans un autre mode de réalisation, ladite surface est métallique, en ce que ledit moyen physicochimique est la mesure de la variation de potentiel électrochimique de ladite surface.
Dans un autre mode de réalisation, la mise en contact est effectuée ponctuellement ou à intervalles réguliers, de préférence par injection d'une solution d'EPS de concentration de 0.001 à 10%, de préférence 0.01 à 1% en poids par rapport au volume total de la solution, à proximité d'une surface.
Un autre objet de l'invention est un procédé de modification des caractéristiques physiques d'une surface de telle manière que l'adhésion d'un biofilm bactérien indésirable sur ladite surface se trouve limitée, comprenant l'utilisation d'exopolysaccharides tels que décrits ci-dessus, caractérisé en ce que l'on met en contact ou l'on greffe ladite surface avec un exopolysaccharide.
Un autre objet de l'invention est une surface recouverte d'exopolysaccharides, obtenue par utilisation d'exopolysaccharides tels que décrits ci-dessus, ou par le procédé tel que décrit ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un produit comprenant une surface tel que décrite ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, ledit produit est une canalisation ou un terminal méthanier.
Dans un autre mode de réalisation, ledit produit est un outil hospitalier, de préférence un tube ou un cathéter.
[Description détaillée]
Ainsi, l'invention concerne l'utilisation d'exopolysaccharides (EPS) comme agent de prévention de la formation de biofilms indésirables.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, la Demanderesse suggère que la formation d'un film d'exopolysaccharides sur une surface modifie la composition et/ou la structure du film primaire. Le film primaire formé en présence d'EPS est dénommé ci- après « film primaire modifié ». Les bactéries du milieu aqueux seraient alors incapables de se fixer sur ce film primaire modifié. La présence d'EPS sur la surface inhiberait ainsi la formation du biofilm microscopique.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS remplacent en partie les molécules de matière organique dans le film primaire modifié. Selon ce mode de réalisation, le film primaire modifié est formé de matières organiques et d'EPS.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le film primaire modifié est formé uniquement d'EPS. Selon ce mode de réalisation, les EPS sont également utiles comme agent de prévention de la formation, sur une surface, du film primaire conduisant à des biofilms indésirables.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS utilisés dans la présente invention comprennent des oses neutres, des oses acides, des oses aminés, des sulfates et/ou des protéines. Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS utilisés dans la présente invention consistent en des oses neutres, des oses acides, des oses aminés, des sulfates et/ou des protéines.
Des exemples d'osés neutres incluent, mais ne sont pas limités à, glucose, rhamnose, mannose, galactose, ...
Des exemples d'osés acides incluent, mais ne sont pas limités à, acides uroniques et notamment acide glucuronique, acide galacturonique, acide hexuronique tel que l'acide hexuronique de structure furanique substitué sur son carbone en position 3 par un résidu lactyle...
Des exemples d'osés aminés incluent, mais ne sont pas limités à, N acétyl glucosamine et N actéyl galactosamine, ...
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS comprennent entre 30 et 95% d'osés neutres, de préférence entre 40 et 90%, encore plus préférentiellement entre 45 et 88% d'osés neutres, en nombre d'osés par rapport au nombre total d'osés dans l'EPS.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS comprennent entre 1 et 70% d'osés acides, de préférence entre 5 et 60%, encore plus préférentiellement entre 8 et 53% d'osés acides, en nombre d'osés par rapport au nombre total d'osés dans l'EPS.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS comprennent moins de 30% d'osés aminés, de préférence moins de 20%, encore plus préférentiellement moins de 12% d'osés aminés, en nombre d'osés par rapport au nombre total d'osés dans l'EPS.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS comprennent moins de 50 molécules de sulfates pour 100 oses, de préférence moins de 40 molécules de sulfate, encore plus préférentiellement moins de 35 molécules de sulfate pour 100 oses dans l'EPS.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS comprennent moins de 50 protéines pour 100 oses, de préférence moins de 40 protéines, encore plus préférentiellement moins de 37 protéines pour 100 oses dans l'EPS. Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS ne comprennent pas d'aminoarabinose, d'aminoribose, d'heptose et/ou de xylose.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS utilisés ont une masse moléculaire supérieure à 500 kDa, de préférence supérieure à 800 kDa, plus préférentiellement supérieure à 1000 kDa, encore plus préférentiellement supérieure à 2000 kDa.
Suivant un mode de réalisation préféré, les exopolysaccharides (EPS) de l'invention sont obtenus par fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds. Plus particulièrement, les EPS de l'invention sont ceux synthétisés dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel généré par un rapport Carbone/Azote élevé dû à un milieu nutritionnel enrichi en carbohydrates) lors de la fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds (voir par exemple Guezennec, J. (2002). Deep-sea hydrothermal vents: A new source of innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest? Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204-208).
Suivant un premier mode de réalisation, ces EPS sont choisis parmi HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, et HYD 1666.
Suivant un second mode de réalisation, ces EPS sont choisis parmi ceux synthétisés par des bactéries du genre Alteromonas ou Pseudoalteromonas, conformément à la taxonomie en vigueur au jour de la présente invention. Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire les EPS de l'invention. Avantageusement, ces bactéries sont des bactéries Alteromonas macleodii, et dans ce mode de réalisation, de préférence l'EPS est HYD 657. Suivant un troisième mode de réalisation, ces bactéries sont des bactéries Alteromonas infernus, et dans ce mode de réalisation, de préférence l'EPS est GY 785. De préférence l'EPS est HYD 1545 ou HYD 1644.
La présente invention concerne également un procédé. Le procédé selon l'invention est un procédé de protection d'une surface par prévention de la formation de biofilm bactérien indésirable sur ladite surface, dans lequel on forme un film protecteur d'exopolysaccharides sur ladite surface par mise en contact ou greffage de ladite surface avec au moins un exopolysaccharide selon l'invention.
Suivant un mode de réalisation préféré pour la mise en œuvre du procédé de l'invention, les EPS sont en solution dans un solvant polaire, de préférence de l'eau. Suivant un mode de réalisation particulier, la concentration d'EPS dans la solution est de 0,001 à 10%, de préférence 0,01 à 1%, très préférentiellement, 0,02 à 0,5%, encore plus préférentiellement environ 0,02% en poids/volume, par rapport au volume total de la solution.
De préférence, dans le procédé de l'invention, on met en contact ladite surface avec une solution d'EPS telle que décrite ci-dessus.
Cette mise en contact ou ce greffage ont pour conséquence la formation d'un film homogène sur ladite surface. Selon un mode de réalisation de l'invention, le film d'EPS est continu sur ladite surface. Selon un mode de réalisation de l'invention, le film d'EPS a une épaisseur de 0.1 à 100 μιη, de préférence de 0.5 à 25 μιη, préférentiellement de 1 à 10 μιη.
Les conditions favorisant la formation d'un film homogène d'EPS sur les surfaces sont de préférence les suivantes :
Température comprise entre 5 et 30°C, de préférence de 10 à 25°C. - Solution de 0,001 à 10%, de préférence 0,01 à 1%, très préférentiellement, 0,02 à 0,5%, encore plus préférentiellement environ 0.02%, soit 200 mg/1 en poids/volume, par rapport au volume total de la solution. durée de mise en contact de 10 secondes à 5 heures, de préférence de 1 à 120 minutes, plus préférentiellement de 3 à 60 minutes, encore plus préférentiellement de 5 à 30 minutes. Suivant un premier mode de réalisation, la mise en contact est effectuée en milieu d'eau de mer circulante.
Suivant un second mode de réalisation, la mise en contact ou le greffage est réalisé préalablement à l'exposition de la surface aux conditions de formation de biofilm indésirable, par exemple mais non exclusivement, préalablement à une immersion en milieu d'eau de mer. De préférence, le greffage est effectué sur des petites surfaces, du type notamment capteurs. Le greffage pourrait permettre une meilleure tenue des EPS à la surface qu'une simple mise en contact, et assurer ainsi une protection prolongée de la surface greffée. Le greffage peut être mis en œuvre par toute méthode connue de l'homme du métier, notamment du type de celle décrite dans WO2008078052.
Selon l'invention, le procédé peut comprendre des moyens de suivi, notamment par des méthodes physico-chimiques, du pouvoir filmant des EPS, de leur stabilité dans le temps de manière à en optimiser l'utilisation et éviter tout risque d'hétérogénéité de surface propre à encourager des risques, notamment pour les surfaces métalliques (métaux et alliages), des risques de corrosion.
Suivant un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend une étape de suivi de la formation du film d' exopolysaccharides résultant de la mise en contact ou du greffage de ladite surface avec au moins un exopolysaccharide selon l'invention, par tout moyen physico-chimique adapté. En particulier, le suivi de la formation du film d'EPS sur des surfaces métalliques (métaux et alliages) peut être mesuré par des mesures électrochimiques notamment, mais non exclusivement, par la mesure du potentiel électrochimique des alliages ou métaux de la surface, ledit potentiel électrochimique et la variation de ce potentiel étant mesurés par rapport à une électrode de référence.
En effet, lors de la mise en contact des EPS avec la surface et pendant la formation du biofilm d'EPS, le potentiel électrochimique des alliages ou métaux de la surface varie. Ce potentiel électrochimique devient stable lorsque le film est homogène. Ainsi, suivant un mode de réalisation particulier, lorsque la surface est métallique, on mesure de la variation de potentiel électrochimique du métal après la première mise en contact avec les exopolysaccharides, et la mise en contact de la surface métallique avec les EPS selon le procédé de l'invention (mise en contact avec les EPS en solution, ou greffage) est poursuivie jusqu'à ce que le potentiel électrochimique de la surface se stabilise.
Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, on poursuit les mesures, et lorsque le potentiel électrochimique de la surface se déstabilise, on reprend la mise en contact avec les EPS jusqu'à stabilisation, à nouveau, du potentiel électrochimique. En effet, l'altération du film protecteur peut induire une variation de ce potentiel électrochimique traduisant un risque de colonisation bactérienne et par voie de conséquence une obligation de refilmer ces mêmes surfaces par remise en contact avec les EPS. Ainsi, suivant un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de suivi de l'état du film d'exopolysaccharide, permettant de déclencher, si nécessaire, c'est-à-dire si le film n'est pas homogène ou se dégrade, la remise en contact de la surface avec des EPS. Lorsque la surface est métallique, la déstabilisation du film peut être mesurée et suivie par la variation du potentiel électrochimique de la surface.
L'invention a donc également pour objet un procédé de contrôle de la présence d'un film protecteur sur une surface métallique, dans lequel on mesure le potentiel électrochimique de ladite surface. Suivant un mode de réalisation préféré, une variation d'au moins -10% du potentiel électrochimique d'une surface métallique sur une période de temps donnée (1-30 minutes) induit la remise en contact de la surface avec des EPS. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, l'appareil de mesure du potentiel électrochimique de la surface est couplé à un appareil d'injection d'EPS, de telle manière qu'une valeur-seuil préenregistrée sur l'appareil de mesure du potentiel électrochimique déclenche la mise en contact de la surface avec une quantité donnée d'EPS. Selon un mode de réalisation préféré, la mise en contact s'effectue par injection d'une solution d'EPS à proximité de la surface à traiter.
Ainsi, selon le procédé de l'invention, la mise en contact des EPS avec la surface est de préférence renouvelable, et de préférence renouvelée, notamment sur une surface métallique lorsque le potentiel électrochimique de la surface effectue une variation d'environ 10%. Le procédé de l'invention conduit à une réduction significative de l'adhésion bactérienne sur les surfaces étudiées donc de la formation du biofilm indésirable.
La Demanderesse a de fortes présomptions selon lesquelles le procédé de l'invention aurait un mécanisme de nature physique et que l'action des exopolysaccharides sur la prévention du film primaire ne serait pas de nature chimique : ainsi, l'invention s'inscrit dans une démarche de respect de l'environnement, et évite tout impact sur la flore bactérienne.
Selon la présente invention, le film d'EPS déposé par le procédé de l'invention modifie les caractéristiques physiques de la surface, par exemple en modifiant les caractéristiques du film primaire. Ainsi, le procédé selon l'invention est également un procédé de modification des caractéristiques d'adhésion d'un biofilm bactérien indésirable sur une surface, par modification des caractéristiques physique de ladite surface du fait du dépôt d'un film d' exopolysaccharides. L'invention a donc pour objet un procédé de modification des caractéristiques physique d'une surface de telle manière que l'adhésion d'un biofilm bactérien indésirable sur ladite surface se trouve limitée, lesdites caractéristiques physique de la surface susceptibles d'être modifiées pouvant être : le potentiel zeta ou le potentiel électrochimique ; l'angle de contact ; l'hydrophilie ; et les caractéristiques acide-base de Lewis. La présente invention est particulièrement avantageuse en ce que les EPS respectent parfaitement l'environnement, n'ont aucun effet antimicrobien et ne sont pas biocides. Il est à noter que la présente invention ne constitue pas un de nettoyer une surface, ni un moyen de dissoudre ou de lutter contre un biofilm bactérien indésirable déjà installé.
La présente invention concerne également une surface recouverte par un film d'EPS tel que décrit ci-dessus, ou obtenue selon le procédé de protection de surface tel que décrit ci-dessus. Selon un mode de réalisation, ladite surface est métallique, minérale, telle que, par exemple, des ciments et des bétons, ou plastique.
La présente invention a également pour objet un produit comprenant une surface recouverte par un film d'EPS telle que décrite ci-dessus. Selon un mode de réalisation, les EPS selon l'invention sont utiles dans le domaine industriel, tels que les terminaux marins, notamment les terminaux méthaniers, les canalisations d'eau microbiologiquement active, les circuits d'eaux de mer ou d'eau douce... Selon ce mode de réalisation, les produits comprenant une surface recouverte par un film d'EPS incluent, mais ne sont pas limités à, des tubes et conduits de canalisations, des plateformes, notamment de terminaux méthaniers.
Selon un autre mode de réalisation, les EPS selon l'invention sont utiles dans le domaine de la santé, et notamment de la santé publique. Selon ce mode de réalisation, les produits comprenant une surface recouverte par un film d'EPS incluent, mais ne sont pas limités à, des tubes et cathéters, des seringues, des outils chirurgicaux, des instruments médicaux.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le film d'EPS peut-être associé à un agent renforçant son action d'inhibition de la formation des biofilms.
Suivant un mode de réalisation, l'agent associé au film d'EPS et renforçant son action d'inhibition de la formation des biofilms est l'acide zostérique. L'acide zostérique est décrit comme permettant la prévention de la formation de biofilms sur des surfaces (US 5,384,176, US5,607,741, incorporés par référence).
Suivant un mode de réalisation, l'acide zostérique est natif. Suivant un autre mode de réalisation, l'acide zostérique peut être un dérivé modifié chimiquement, préférentiellement un dérivé de l'acide zostérique est un ester d'acide zostérique tel que décrit dans US2007/128151, incorporée par référence. Suivant un mode de réalisation préféré, le dérivé de l'acide zostérique est un dérivé acide de l'acide zostérique.
Suivant un mode de réalisation, l'acide zostérique est extrait de l'algue Zostera marina.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le film d'EPS peut être associé à des agents antimicrobiens, tels que, par exemple, des peptides antimicrobiens (PAM). Selon ce mode de réalisation, le film d'EPS associé aux agents antimicrobiens possède des effets antimicrobiens, permettant d'accentuer l'effet d'inhibition de colonisation de surfaces. Une telle activité est notamment utile dans le domaine de la santé. Les peptides antimicrobiens (PAM) sont des molécules effectrices de l'immunité innée, conservées au cours de l'évolution et répandues dans tout le règne vivant. Une grande variété de PAMs a été identifiée au cours des dernières années, révélant une grande diversité en termes de structures, tailles et modes d'action. Les PAMs sont généralement caractérisés par une forte représentativité en acides aminés cationiques et hydrophobes. Ces molécules ont le plus souvent un caractère amphiphile essentiel pour leur interaction avec les membranes bactériennes (Bulet et al. 2004). Les PAMs tuent les microorganismes, soit en perméabilisant leur membrane par un effet de type détergent ou par la formation de pores, soit par le blocage de la synthèse de peptidoglycane composant la paroi bactérienne, soit encore par l'inhibition des voies métaboliques bactériennes (Brodgen et al., 2005).
Par rapport aux antibiotiques chimiques, généralement utilisés, les PAM présentent l'avantage d'être totalement biodégradables. Ils apparaissent comme de bons candidats en substitution aux antibiotiques chimiques conventionnels, du fait de leurs propriétés biologiques. En effet, ils présentent un large spectre d'activité antimicrobienne, peu de spécificité, différents modes d'actions et une innocuité sur le milieu.
Les PAMs peuvent être produits par synthèse chimique ou par l'expression en système recombinant (clonage, expression, purification) bactérien ou levure.
Suivant un mode de réalisation de l'invention, les PAM peuvent appartenir à la famille des PAM linéaires à hélice alpha, à la famille des PAM présentant une surreprésentation en un ou plusieurs acides aminés, à la famille des PAM à épingles à cheveux (bêta Hairpin) avec 1 ou 2 ponts disulfures, à la famille des PAM cycliques à feuillet bêta et hélice alpha avec 3 ponts disulfure ou plus (Bulet et al., Immunological reviews, 2004, 198 : 169-184 ; Brogden, Nature Review Microbiology, 2005, 3 :238-250).
Des exemples de PAM linéaires à hélice alpha incluent, mais ne sont pas limités à, cécropine, stomoxyne, ponéricine, spinigérine, l'oxyopinine, la cupiennine, clavanine, styeline, pardaxine, misgurine, pleurocidine, parasine, oncorhyncine, moronécidine, magainine, temporine, cathelicidine et indolicidine.
Des exemples de PAM enrichis en un ou plusieurs acides aminés, proline, arginine, glycine, ou tryptophane, incluent, mais ne sont pas limités aux bacténicines, PR-39, abaecines, apidaecines, drosocine, pyrrhocoricines, Cg-Prp, prophenine et indolicine.
Des exemples de PAM en épingles à cheveux contenant 2 à 4 cysteines incluent, mais ne sont pas limités à, la tachyplesine, la protégrine, la thanatine, l'androctonine, la gomesine, la polyphemusine, l'hepcidine, la brevinine, l'esculentine, la tigerinine ou la bactenecine.
Des exemples de PAM cycliques contenant 6 ou plus résidus de cystéines ou à cycle ouvert incluent, mais ne sont pas limités à, défensines (de vertébrés, invertébrés ou plantes), termicine, héliomicine, drosomycine, ASABF, pBD, pénaeidines, ALF et big- défensines.
Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, le PAM est la tachyplesine ou une défensine.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les PAM sont synthétisés par synthèse chimique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les PAM sont synthétisés par synthèse biologique en système recombinant bactérien ou fongique et de préférence, en système levure.
Selon un mode de réalisation, la surface recouverte du film d'EPS est mise en contact avec une solution comprenant un ou plusieurs PAM à une concentration de 1 à 10 CMI.
Selon l'invention, les PAM peuvent être en solution dans un solvant polaire biologiquement acceptable tel que l'eau, l'éthanol, le trifluoroéthanol (CF3CH2OH, TFE) ou leur mélange comme par exemple eau/TFE, de préférence le trifluoroéthanol (CF3CH2OH).
Selon un mode de réalisation de l'invention, la mise en contact est réalisée à une température constante, préférentiellement de 1 à 10 °C, plus préférentiellement environ 4 °C.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la mise en contact est réalisée pendant 24 à 120 heures, préférentiellement pendant 48 à 96 heures, plus préférentiellement 72 heures.
[Définitions]
Par EPS, on entend les exopolysaccharides synthétisés dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel généré par un rapport Carbone/ Azote élevé dû à un milieu nutritionnel enrichi en carbohydrates) lors de la fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds, en particulier mais non exclusivement, les EPS suivants : Référence Origine Oses Oses Oses Sulfates Protéines
EPS neutres acides aminés
HYD 657 Hydrothermale 58 30 0 5 2 profond
HYD 1644 id 38 32 0 10 5
HYD 1545 id 49 34 0 11 1
GY 785 id 51 37 0 6 4
MS 907 id 50 37 0 0 0
ST 716 id 46 41 2 5 4
HYD 721 id 57 11 0 8 3
GY 772 id 43 50 2 0 3
HYD 750 id 44 16 2 5 16
GY 768 id 37 37 2 8 2
GY 788 id 30 28 3 8 5
BI746 id 34 18 6 8 4
GY 786 id 37 32 4 5 6
GY 685 id 61 8 1 11 2
GY 686 id 46 8 2 15 7
ST 719 id 56 10 3 18 7
HYD 1574 id 66 9 1 13 3
HYD 1579 id 52 8 4 13 3
HYD 1582 id 49 12 3 16 9
HYD 1584 id 52 10 4 14 8
ST 708 id 49 8 1 10 12
ST 722 id 49 8 3 13 8
ST 342 id 42 7 2 17 18
ST 349 id 50 5 2 9 16
HYD 1625 id 46 40 2 13 4
HYD 1666 id 48 36 1 10 6
Les compositions relatives de ces EPS sont indiquées dans le tableau suivant :
: les quantités relatives sont indiquées en % d'osés par rapport au nombre total d'osés dans l'EPS
: les quantités relatives sont indiquées en nombre de molécules pour 100 oses dans l'EPS. Par « solution d'EPS », on entend une solution formée par un solvant polaire, et un EPS ou un mélange d'EPS.
Par « surface », on entend la superficie, ou la partie extérieure d'une masse de matériau qui peut être d'origine synthétique, typiquement un matériau polymérique ou un matériau d'origine minérale, typiquement du verre ou du béton, ou qui peut être un métal, en particulier cuivre, le titane ; les surfaces métalliques préférées sont inox 316L, le titane, l'Inconel 600, le nickel, le laiton amirauté, et le chrome.
Par « film primaire », on entend un film conditionnant composé de protéines ou de fragments protéiques, de glucides, de lipides, de matières minérales comme par exemple des sels minéraux, issus du milieu environnant. Ce film primaire stimule l'adhésion bactérienne.
Par « biofilm indésirable », on entend un film de microorganismes, généralement des bactéries, qui viennent s'accrocher au film primaire, dans une première étape d'adhésion réversible puis irréversible. Dans le sens de la présente invention, un biofilm est constitué de micro-organismes. Les termes « biofilm », « biofilm microscopique », « biofilm bactérien » et « biofilm indésirable » sont interchangeables. Ainsi, les macroorganismes fixés à une surface ne forment pas un biofilm au sens de la présente invention.
Par « greffage », on entend tout moyen de fixation des EPS selon l'invention sur une surface.
Par « angle de contact », on entend l'angle auquel une interface liquide rencontre une surface solide. L'angle de contact est mesuré par un goniomètre. La mesure d'angle de contact rend compte de l'aptitude d'un liquide à s'étaler sur une surface. La méthode consiste à mesurer l'angle de la tangente du profil d'une goutte déposée sur le matériau, avec la surface du matériau. Elle permet de mesurer l'énergie de surface du liquide ou du solide. La mesure de l'angle de contact permet d'accéder à l'énergie libre d'une surface. Elle permet aussi la discrimination de la nature polaire ou apolaire des interactions à l'interface liquide/solide. On peut ainsi déduire le caractère hydrophile ou hydrophobe d'une surface.
Par « CMI », on entend la concentration minimale à partir de laquelle un agent inhibe la croissance visible d'un microorganisme après incubation sur la nuit. Les méthodes de détermination de la CMI d'un agent sont bien connues dans l'état de l'art.
Les exemples qui suivent montrent des modes de réalisation particuliers de l'invention, qui illustrent non limitativement l'invention.
[Description succincte de la figure]
La Figure 1, qui se lit en regard de l'exemple 1 ci-dessous, est un graphe illustrant le pouvoir filmant des EPS, avec en abscisse la durée de l'expérimentation c'est-à-dire le temps d'exposition des surfaces filmées et non filmées à une eau de mer circulante, et en ordonnée le taux de recouvrement de la surface par les EPS. [Exemples]
Exemple 1 - Efficacité des EPS pour limiter la contamination par biofilm bactérien indésirable
De nombreux EPS ont été testés. Sont reportés sur la figure 1 les résultats obtenus avec les EPS suivant : HYD 721, MS 907, ST 716, HYD 1545, HYD 1644,GY 785 et HYD 657. La méthode, générale, est expliquée en regard des 4 EPS suivants :
HYD 657
GY 785
HYD 1545
HYD 1644
Ces EPS sont connus de l'art antérieur, et décrits notamment dans les publications suivantes : · (HYD 657) : Cambon-Bonavita M.A., G. Raguénès, J. Jean, P. Vincent and J.
Guézennec. (2002). A novel polymer produced by a bacterium isolated from a deep-sea hydro thermal vent polychaete annelid. Journal of Applied Microbiology, 93, 310-315,
• (GY 785) : Raguénès G, Pères A, Ruimy R, Pignet P, R Christen R, Loaec M, Rougeaux H, Barbier G and Guézennec, J. (1997). Alteromonas infernus sp.nov, a new polysaccharide producing bacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent. J. Appl. Bacteriol. 82: 422-430,
• (HYD 1545) : Vincent, P., Pignet, P., Talmont F, Bozzi, L., Fournet, B., Milas, M., Guézennec, J., Rinaudo M and Prieur, D. (1994). Production and characterization of an exopolysaccharide excreted by a deep-sea hydrothermal vent bacterium isolated from the polychaete Alvinella pompejana. Appl. Environ. Microbiol 60(11) : 4134-4141,
• (HYD 1644) : Dubreucq G, Domon B, Fournet B (1996) Structure détermination of a novel uronic acid residue isolated from the exopolysaccharide produced by a bacterium originating from deep-sea hydrothermal vents. Carbohydr Res 290: 175- • Guezennec, J. (2002). Deep-sea hydrothermal vents: A new source of innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest? Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204-208. Expérimentations :
Des échantillons d'acier inoxydable 316L ont été utilisés pour les études portant sur l'influence d'un prétraitement des surfaces par des biopolymères issus de fermentation bactérienne. Les échantillons d'acier ont été pré-conditionnés par immersion dans une eau osmosée additionnée de protéines et/ou d' exopolysaccharides bactériens résultant de procédés biotechnologiques de fermentation à une concentration de 200 mg/litre (soit 0,02% poids/volume). Après deux heures de contact à une température constante de 20°C, les différents échantillons ont été rincés avec 200 ml d'eau physiologique puis séchées sous hotte à flux laminaire avant expérimentation. Des échantillons non pré-conditionnés ont été utilisés comme références.
Les essais d'adhésion en régime dynamique ont été réalisés en utilisant une eau de mer circulante non renouvelée. Le suivi de la colonisation bactérienne des échantillons non conditionnés et conditionnés par différents exopolysaccharides a été réalisé via un microscope électronique équipé d'une caméra relié à un ordinateur et en utilisant des cellules d'adhésion en dynamique.
Les pré-conditionnements des surfaces par quelques exopolysaccharides ont conduit à des réductions sensibles du pourcentage de recouvrement des supports (acier inoxydable 316L) testés. Après 120 heures d'expérimentation et sans renouvellement du conditionnement par adjonction complémentaire d'exopolymères dans le dispositif expérimental, les taux de contamination (de recouvrement par les bactéries) sont restés compris entre 5 et 10%.
Ainsi, ces mesures réalisées en eau de mer naturelle circulante ont démontré des taux de recouvrement de surface (inox 316L et verre) par des bactéries marines, inférieurs à 10% après 6 jours d'exposition sans renouvellement du biofilm, comparativement à une valeur témoin de 70 % en l'absence d'un film de polysaccharide. Exemple 2 : test démontrant l'absence d'activité antimicrobienne du film d'EPS.
Principe :
Une culture bactérienne diluée est mise en contact dans des micropuits, avec une solution d'EPS à des concentrations connues. Le résultat est obtenu par mesure de la densité optique (DO) dans les puits après 18 h de pousse à 30°C. La concentration minimale inhibitrice (CMI) est la concentration la plus basse à laquelle l'EPS inhibe la croissance des bactéries. La concentration minimale bactéricide (CMB) est la concentration la plus basse à laquelle l'EPS tue les bactéries.
Méthode :
Les tests ont été réalisés sur 3 bactéries :
Escherichia coli SBS 363 (bacille Gram négatif)
Micrococcus luteus CIP 53.45 (coque Gram positif)
Pseudomonas sp (souche marine)
Un premier criblage a été réalisé sur tous les EPS à une concentration élevée (100 ou 500 μg/mL) pour repérer les EPS potentiellement actifs. Un second test a été réalisé avec une gamme de dilution des EPS actifs pour repérer la CMI. Le contenu des puits montrant une inhibition a été étalé sur milieu gélosé pour repérer la CMB.
Résultats: Aucun EPS ne s'est révélé actif.
Tableau récapitulatif des résultats Exemple 3 : second test démontrant que le film d'EPS n'est pas biocide
Principe :
Une culture bactérienne diluée est mise en contact dans des micropuits, avec une solution d'EPS à des concentrations connues. Le résultat est obtenu par mesure de la densité optique (DO) dans les puits après 18 h de pousse à 30°C. La concentration minimale inhibitrice (CMI) est la concentration la plus basse à laquelle l'EPS inhibe la croissance des bactéries. La concentration minimale bactéricide (CMB) est la concentration la plus basse à laquelle l'EPS tue les bactéries. Méthode :
Les tests ont été réalisés sur 4 bactéries et 1 levure:
Escherichia coli ATCC 8739 (bacille Gram négatif)
Bacillus subtilis ATCC 6633 (bacille Gram positif)
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (bacille Gram négatif)
Staphylococcus aureus ATCC 6538 (coque Gram positif)
Candida albicans ATCC 10231 (levure)
Chaque EPS a été mis en solution dans de l'eau stérile à 1 mg/mL puis dilué à 0,5 mg/mL et 0,25 mg/mL. Ces solutions ont été utilisées pour réaliser les tests antimicrobiens aux concentrations finales 100 μg/mL, 50 μg/mL et 25 μg/mL.
Le contenu des puits montrant une inhibition a été étalé sur milieu de culture gélosé pour déterminer la CMB.
Résultats
Aux concentrations testées, les souches poussent en présence de n'importe quel EPS.
Activité antibactérienne (CMI μg/mL)
Escherichi Pseudomonas Staphylococc Candida
Concentration Bacillus
a aeruginosa us aureus albicans s testées subtilis
EPS coli ATCC 9027 ATCC 6538 ATCC
^g/mL) ATCC
ATCC 10231
6633
8739
GY 785 100 - 50 - 25 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100
HYD 1545 100 - 50 - 25 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100
HYD 1644 100 - 50 - 25 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100
HYD 657 100 - 50 - 25 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'exopolysaccharides (EPS) en tant qu'agent de prévention de la formation, sur une surface, d'un biofilm microscopique.
2. Utilisation d'exopolysaccharides selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits EPS comprennent des oses neutres, de préférence glucose, rhamnose, mannose ou galactose ; des oses acides, de préférence des acides uroniques tels que acide glucuronique, acide galacturonique ou acide hexuronique ; des oses aminés, de préférence N acétyl glucosamine ou N actéyl galactosamine ; des sulfates et/ou des protéines.
3. Utilisation d'exopolysaccharides selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que lesdits EPS sont obtenus par fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds.
4. Utilisation d'exopolysaccharides selon la revendication 3, caractérisée en ce que lesdites bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds sont du genre Alteromonas ou Pseudoalteromonas.
5. Utilisation d'exopolysaccharides selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, caractérisée en ce que lesdits exopolysaccharides sont obtenus par fermentation de bactéries Alteromonas macleodii ou Alteromonas infernus.
6. Utilisation d'exopolysaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits exopolysaccharides sont choisis parmi HYD 657, HYD
1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, et HYD 1666.
7. Utilisation d'exopolysaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdits exopolysaccharides sont associés à l'acide zostérique ou à l'un de ses dérivés.
8. Utilisation d'exopolysaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdits exopolysaccharides sont associés à un ou plusieurs PAM.
9. Procédé de protection d'une surface par prévention de la formation d'un biofilm microscopique, comprenant l'utilisation d'exopolysaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'on forme un film protecteur d'exopolysaccharides sur ladite surface par mise en contact ou greffage de ladite surface avec au moins un exopolysaccharide.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de suivi de la formation ou de l'état du film d'exopolysaccharides résultant de la mise en contact ou du greffage de ladite surface avec au moins un exopolysaccharide par tout moyen physico-chimique adapté.
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite surface est métallique, en ce que ledit moyen physicochimique est la mesure de la variation de potentiel électrochimique de ladite surface.
12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que la mise en contact est effectuée ponctuellement ou à intervalles réguliers, de préférence par injection d'une solution d'EPS de concentration de 0.001 à 10%, de préférence 0.01 à 1% en poids par rapport au volume total de la solution, à proximité d'une surface.
13. Procédé de modification des caractéristiques physiques d'une surface de telle manière que l'adhésion d'un biofilm bactérien indésirable sur ladite surface se trouve limitée, comprenant l'utilisation d'exopolysaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on met en contact ou l'on greffe ladite surface avec un exopolysaccharide.
14. Surface recouverte d'exopolysaccharides, obtenue par utilisation d'exopolysaccharides selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou par le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 12.
15. Produit comprenant une surface selon la revendication 14.
16. Produit selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit produit est une canalisation ou un terminal méthanier.
17. Produit selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit produit est un outil hospitalier, de préférence un tube ou un cathéter.
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