EP2480670A1 - Procédé d'imagerie cellulaire pour la visualisation de la biogenèse des microarns dans les cellules - Google Patents

Procédé d'imagerie cellulaire pour la visualisation de la biogenèse des microarns dans les cellules

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Publication number
EP2480670A1
EP2480670A1 EP10770603A EP10770603A EP2480670A1 EP 2480670 A1 EP2480670 A1 EP 2480670A1 EP 10770603 A EP10770603 A EP 10770603A EP 10770603 A EP10770603 A EP 10770603A EP 2480670 A1 EP2480670 A1 EP 2480670A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
cell
marker
dgcr8
drosha
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10770603A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jérôme CAVAILLE
Marie-Line Bortolin-Cavaille
Clément BELLEMER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2480670A1 publication Critical patent/EP2480670A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes

Definitions

  • the present invention relates to a method for visualizing the biogenesis of at least one microRNA, preferably a group of microRNAs, in a cell, by transforming said cell with a vector coding for a protein chosen from the protein DGCR8 ( DiGeorge syndrome critical gene region 8), Drosha protein, and their derivatives, coupled to a marker, and the detection of said marker.
  • MicroRNAs are short RNAs (preferably between 15 to 30 nucleotides, and more preferably between 19 and 23 nucleotides) capable of modulating the expression of genes negatively. By their ability to regulate a large number of genes, they are involved in many biological processes such as the control of apoptosis, proliferation and cell differentiation.
  • microRNAs begins in the nucleus by the cleavage of a precursor RNA: pri-miRNA. These cleavages are made by a specific complex: the "Microprocessor" comprising the DGCR8 and Drosha proteins, which cleavages release a labile intermediate, the pre-miRNA, from which the microRNA is generated following a second series of cleavages catalyzed by the protein. DICER.
  • the present invention relates to a cell imaging method for tracking, in living cells, the dynamics and recruitment of the Microprocessor (Drosha-DGCR8 complex) on nascent transcripts.
  • the exploitation of a cell system of the reporter-gene type makes it possible to screen the molecules on living human cells with the main objective of identifying drugs or cellular factors capable of modulating, positively or negatively, the activity of the microprocessor, and therefore the production of microRNAs.
  • the inventors have demonstrated a system making it possible to monitor the dynamics and the mode of action of the microprocessor in the cells, in particular human living cells, more particularly in the cells of the JEG3 human choriocarcinoma line (ATCC HTB-36). and this with
  • a signal from the marker for example a strong and localized fluorescent signal, thus perfectly recognizable by the tools well known to those skilled in the art, for example video-microscopy.
  • the present invention relates to a method for visualizing the biogenesis of at least one microRNA, preferably a group of microRNAs, in a cell characterized in that it comprises the following steps: i) transformation said cell by a vector encoding a protein selected from DGCR8 protein (DiGeorge syndrome critical region gene 8), Drosha protein, and derivatives thereof, said protein being coupled to a marker;
  • step (iii) the detection of said marker.
  • This step (iii) allows the visualization of the biogenesis of said at least one microRNA, preferably said group of microRNAs, said protein selected from the DGCR8 protein, the Drosha protein, and their derivatives binding to the pri-miRNAs in the course of training in the vicinity of transcription sites.
  • the method according to the invention is characterized in that the said protein is the DGCR8 protein or its derivative chosen from the group consisting of the isoform CRA_a of Homo sapiens (accession number EAX02998 or NP_073557, SEQ ID N ° 1), the isoform CRA_b of Homo sapiens (accession number EAX02999, SEQ ID No. 2), the isoform CRA_c of Homo sapiens (accession number EAX03000, SEQ ID No.
  • the isoform CRA_a of Mus musculus (accession number EDK97512 (SEQ ID NO: 4), EDK97515 (SEQ ID NO: 5), NP_201581 (SEQ ID NO: 6),), the isofome CRA_b of Mus musculus (accession number Accession EDK97513, SEQ ID NO: 7), isoform CRA_c of Mus musculus (accession number EDK97514, SEQ ID NO: 8), isoform CRA_a of Norwegian Rattus (accession number EDL77930 (SEQ ID NO: 9 ), EDL77931 (SEQ ID NO: 10)), the CRA_b isofome of Norwegian Rattus (accession number EDL77932, SEQ ID No. 11) and their derivatives.
  • derivative any protein having a percentage identity with the protein to which this term applies of at least 70%, preferably 80%, more preferably 90%, and even more preferably 95%.
  • percent identity between two amino acid sequences in the sense of the present invention, is meant to designate a percentage of identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistics and the differences between the two sequences being randomly distributed over their entire length. "Better alignment” or “optimal alignment” means the alignment for which the determined percentage of identity as below is the highest. Sequence comparisons between two amino acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being made by segment or by "comparison window” to identify and compare the local regions of sequence similarity. .
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be realized, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981), by means of the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) ), using the Pearson-Lipman (1988) similarity search method, using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
  • transformation is meant the modification of the genetic inheritance of a cell by introduction of foreign genetic information.
  • This transformation can be carried out by electroporation, conjugation, transfection, transduction, protoplast fusion, or any other technique known to those skilled in the art.
  • the process according to the invention is characterized in that the transformation step is a transfection step, preferably carried out transiently using a calcium phosphate chemical method or via the use of the lipofectamine 2000 transfectant, invitrogen .
  • vector is meant a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus in which is inserted a polynucleotide encoding the DGCR8 protein or a derivative thereof, which protein is coupled to a marker.
  • the techniques of constructing these vectors and inserting polynucleotides into these vectors are known to those skilled in the art. In general, any vector capable of maintaining, self-replicating or spreading in a host organism and especially in order to induce the expression of a protein can be used. Those skilled in the art will choose the appropriate vectors, in particular according to the host organism to be transformed and according to the transformation technique used.
  • the vectors of the present invention are especially used to transform a host organism for the expression of a protein selected from DGCR8 protein, Drosha protein, and their derivatives coupled to a marker in the host organism.
  • a protein selected from DGCR8 protein, Drosha protein, and their derivatives coupled to a marker in the host organism is a plasmid.
  • Marker means any means, biological, chemical or physical capable of generating a signal that can be detected and, where appropriate, allowing the quantification of the expression of a target gene in a cell. Such markers are well known to those skilled in the art. A nonlimiting list of these markers includes enzymes that produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, contact angle variation or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunneling effect, etc.
  • enzymes that produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such
  • markers according to the invention may also be antibodies, more particularly antibodies specific for the proteins constituting the microprocessor, or the connecting elements.
  • the method according to the invention is characterized in that said marker is a fluorescent marker.
  • fluorescent marker any colored substance, natural, artificial or synthetic, absorbing light energy (excitation light) and restoring it in the form of fluorescent light (emission light).
  • green fluorescent protein or "Green Fluorescent Protein” (GFP), yellow fluorescent protein or “Yellow Fluorescent Protein” (YFP), cyan fluorescent protein or “Cyan Fluorescent Protein” (CFP ), cytochrome b5, or Alexa fluorine type markers, such as Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 555.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • YFP yellow fluorescent protein or “Yellow Fluorescent Protein”
  • CFP Cyan Fluorescent Protein
  • CFP Cyan Fluorescent Protein
  • cytochrome b5 or Alexa fluorine type markers, such as Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 555.
  • Cytochrome b5 which is red in color, has an absorption maximum at 412 nm.
  • GFP is a small protein consisting of 238 amino acids, organized into 11 antiparallel beta strands and a central alpha helix. We are talking about a "beta-can" structure. The N-terminal and C-terminal ends are accessible for fusion with other proteins. Unmodified, wild-type (wGFP) GFP has two excitation maxima. The first is with a wavelength of 395 nm (UV light), the second at 475 nm (blue light). The maximum emission wavelength is 504 nm.
  • PSC is a protein produced from a mutant of the gene encoding green fluorescent protein. This protein emits fluorescence at a wavelength of 480 nm when it receives light with a wavelength of 458 nm.
  • YFP is a protein produced from a mutant of the gene encoding green fluorescent protein. This protein emits fluorescence at a wavelength of 527 nm, when excited by a wavelength of 514 nm.
  • Alexa Fluor type markers are fluorochromes produced by Invitrogen. These flurochromes can be coupled to primary or secondary antibodies.
  • the fluorescent marker is GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the method according to the invention is characterized in that said marker is a protein marker.
  • the process according to the invention is characterized in that the protein chosen from the DGCR8 protein, the Drosha protein, and their derivatives coupled to a protein marker is a fusion protein, preferably a DGCR8-GFP fusion protein. or Drosha-GFP and particularly preferably, this fusion protein is the DGCR8-GFP fusion protein having the sequence SEQ ID No. 12.
  • fusion protein is meant a construct that contains several proteins of different origin. This fusion protein is encoded by a nucleic acid obtained by recombinant DNA technologies, well known to those skilled in the art.
  • the fusion protein consists of a protein and a marker.
  • detection of the marker is meant the detection of the signals emitted by the marker, for example the detection of fluorescence in the case where the marker is a fluorescent marker.
  • the process according to the invention is characterized in that the step of detecting fluorescence is done by microscopy, advantageously using a fluorescence microscope or any other technique well known to those skilled in the art.
  • the invention can also be implemented by means of immunolabeling.
  • immunolabeling is meant the use of an antibody specific for the protein of interest for its direct or indirect detection.
  • the invention thus relates to a method for visualizing the biogenesis of at least one microRNA, preferably a group of microRNAs, in a cell, characterized in that it comprises the following steps:
  • the coupling of the antibody with the marker allows the direct detection of the protein which one wishes to follow the recruitment. This is called direct immunofluorescence.
  • fragment of DGCR8 or “fragment of Drosha” is meant respectively a part of the peptide sequence of said proteins.
  • a fragment of a protein can represent 1 to 99% of the peptide sequence of said protein to which this expression refers.
  • the respective fragments of the DGCR8 and Drosha proteins comprise between 1 and 100, preferably 1 to 50 amino acids, of the respective peptide sequences of DGCR8 and Drosha.
  • the invention also relates to a method for visualizing the biogenesis of at least one microRNA, preferably a group of microRNAs, in a cell, characterized in that it comprises the following steps: a) incubating the cell with at least one primary antibody selected from antibodies directed against a protein selected from DGCR8 protein, Drosha protein and fragments thereof; then
  • step b incubating the cell with at least one secondary antibody specific for the primary antibody (s) of step a);
  • Coupling of the marker to the secondary antibody allows indirect detection of the primary antibody. This is called indirect immunofluorescence. Indirect immunofluorescence allows amplification of fluorescence signals and facilitates monitoring of recruitment of DGCR8 and / or Drosha proteins, and thus monitoring of microRNA biogenesis.
  • the primary antibody directed against DGCR8 is a goat antibody.
  • DGCR8 or anti-DGCR8 antibody
  • a goat antibody is marketed by the company Sant Cruz, under the name "Sc-48473".
  • the primary antibody against Drosha is a rabbit antibody.
  • Such an antibody is marketed by Abcam under the name "ab 12286”.
  • the labeled secondary antibody directed against the primary anti-DGCR8 antibody is a donkey antibody.
  • Such antibodies are marketed by Invitrogen under the names Invitrogen Al 1055 and Invitrogen A21432.
  • the Invitrogen A1 1055 antibody is coupled to an Alexa Fluor 488 type marker. This marker is excited at a wavelength of about 495 nm and emits at a wavelength of about 519 nm.
  • the Invitrogen A21432 antibody is coupled to an Alexa Fluor 555 type marker. This marker is excited at a wavelength of about 555 nm and emits at a wavelength of about 565 nm.
  • the labeled secondary antibody directed against the primary anti-Drosha antibody is a donkey antibody.
  • Invitrogen A21206 antibodies are marketed by Invitrogen under the names Invitrogen A21206 and Invitrogen A31572.
  • the Invitrogen A21206 antibody is coupled to an Alexa Fluor 488 type marker while the Invitrogen A31572 antibody is coupled to an Alexa Fluor 555 type marker.
  • the present invention thus makes it possible to monitor the recruitment of DGCR8 proteins and / or Drosha proteins.
  • the invention makes it possible to monitor the simultaneous recruitment of these two proteins. If the method of the invention is carried out with the Invitrogen Al 1055 and Invitrogen A31572 antibodies, the DGCR8 protein will be visible at a wavelength of about 519 nm while the Drosha protein will be visible at a desired length. wave of about 565 nm.
  • the antibodies may be labeled with fluorescent markers.
  • the antibodies may be labeled with enzymatic markers, such as the streptavidin-biotin system.
  • said cell is cultured on a support, fixed and permeabilized before any incubation according to steps i) or a).
  • said cell is cultured on a suitable support, such as glass coverslips. Said cell is then fixed on said support according to the conventional techniques of the prior art.
  • this fixation can be done using aldehyde fixatives such as glutaraldehyde or paraformaldehyde (PFA) or coagulating fixers, such as methanol, ethanol or acetone.
  • this fixation is carried out using paraformaldehyde.
  • Formaldehyde acts on the -NH2 groups of proteins. As such, its action leads to the crosslinking of membrane proteins and the attachment of cells.
  • This fixation can be followed a washing step, preferably 3 washes with PBS for a period of about 5 minutes.
  • said cell also undergoes a permeabilization step, prior to step i) or a) incubation.
  • a permeabilization step prior to step i) or a) incubation.
  • the conditions for implementing such permeabilization are well known to those skilled in the art.
  • it is carried out using detergents, such as triton, saponin, sodium dodecyl sulphate (SDS), tween, digitonin, or sodium borohydride.
  • the permeabilization is done by triton treatment, preferably with tritonX-100 or by treatment with ethanol, preferably 70% ethanol at a temperature of 4 ° C. for at least 12 hours.
  • the fixative is present at a concentration of between 0.1 and 1% relative to the volume of buffer, preferably at a concentration of about 0.4%.
  • said cell can then undergo a saturation step of non-specific binding sites.
  • This saturation can be performed with bovine serum albumin (BSA), or with serum of the same species as the primary antibody or the secondary antibody.
  • BSA bovine serum albumin
  • this saturation is performed with BSA.
  • said cell undergoes a washing step.
  • This washing can be carried out according to the operating conditions well known to those skilled in the art. Preferably, it is 3 washes with phosphate buffered saline (PBS) for about 5 minutes.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the antibodies are coupled to fluorescent markers.
  • the detection of marker according to step ii) or c) comprises mounting said cell in a mounting medium adapted for detecting the fluorescent marker.
  • This mounting medium is a suitable medium for preserving the fluorescence of the markers.
  • the conditions for detecting the marker depend on the nature of said marker and are well known to those skilled in the art. Typically, this detection is done by microscopy.
  • the mounting medium of said cell is a medium comprising Moviol.
  • This mounting medium may also comprise 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). The presence of DAPI in the mounting medium allows the visualization of nuclear DNA. The presence of DAPI therefore allows the visualization of the cell nucleus.
  • the method of the invention may further comprise the detection of transcription sites according to conventional techniques of the prior art such as in situ hybridization (FISH RNA).
  • FISH RNA in situ hybridization
  • the method according to the invention therefore allows the simultaneous detection of the transcription sites of said cell (the inci-C19MC nascent transcripts) and the microprocessor (Drosha and DGCR8), thus facilitating the monitoring of the biogenesis of pri-microRNAs in said cell.
  • the invention is very advantageous since it allows the preservation of DGCR8 and Drosha proteins while optimizing the labeling and monitoring of the biogenesis of microRNAs.
  • the method according to the invention is characterized in that said cell is a placenta cell, preferably a primate placenta cell, even more preferably a human placenta cell.
  • the method according to the invention is characterized in that said placenta cell is derived from a choriocarcinoma, preferably said cell is selected from the group comprising human choriocarcinoma lines JEG 3 (ATCC HTB-36), JAR (ATCC HTB-144) and BeWo (ATCC CCL-98). More preferably, said cell is derived from the human choriocarcinoma line JEG 3 (ATCC HTB-36).
  • This immortalized line is easy to handle and cultured in DMEM (4.5 g / ml glucose, 5% penicillin / streptomycin antibiotic serum) and expresses strongly, constitutively and monoallelically the C19 TM locus.
  • the C19 TM chromosomal locus is a gene locus, positioned on human chromosome 19 and contains 46 tandem microRNA genes spanning approximately 100kb.
  • the genes of these microRNAs are mainly, if not exclusively, expressed in the placenta.
  • the method according to the invention is characterized in that said at least one microRNA, preferably said group of microRNAs, is encoded by the chromosomal locus C19MC (chromosome 19 miRNA cluster), preferably said miRNA is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 58.
  • the process according to the invention is characterized in that it is intended to identify compounds capable of modulating the expression of at least one microRNA, preferably a group of microRNAs, and in that it comprises in addition the steps of:
  • the invention relates to a method for screening compounds capable of modulating the expression of at least one microRNA, preferably a group of microRNAs, in a cell, characterized in that it comprises the following steps:
  • the present invention relates to a method for screening compounds capable of modulating the expression of at least one microRNA, preferably a group of microRNAs, in a cell, characterized in that it comprises the following steps:
  • the present invention also relates to a method for screening compounds capable of modulating the expression of at least one microRNA, preferably a group of microRNAs, in a cell, characterized in that it comprises the following steps:
  • step B incubating the cell with at least one secondary antibody specific for the primary antibody (s) of step B);
  • the purpose of the molecule screening method according to the invention is to identify molecules or cellular factors capable of modulating the action of the microprocessor in the nucleoplasm and therefore the expression of microRNAs, in particular by inhibiting the recruitment of the protein. DGCR8 or Drosha protein.
  • this screening method indeed makes it possible to screen different molecules having an influence on the recruitment of the DGCR8 protein only, of the Drosha protein only, or of the two DGCR8 and Drosha proteins.
  • Deregulation of the production of microRNAs being involved in pathological contexts such as cancer this screening method according to the invention also allows the detection of molecules or cellular factors involved in such pathological contexts.
  • the compounds to be tested according to the screening method according to the invention may be of lipidic, carbohydrate, protein or nucleic nature.Preferentially, these compounds are siRNAs, more preferably siRNAs of human genomic siRNA library. In particular, the compounds to be tested may be described in artificial or natural chemical libraries.
  • measurement of expression is meant the location and the qualitative and / or quantitative measurement of the marker used, in particular in the case of a fluorescent marker, of the measurement of fluorescence, implemented according to known techniques. of the skilled person.
  • the fluorescent label used eg GFP
  • FIG. 1 Schematic representation of the C19MC chromatin locus (-100 kb). This figure represents the gene organization of the miRNAs by revealing the repeated nature of this locus: the majority of the miRNA genes are contained in introns themselves located within a non-coding sequence (400-700 nt) repeated in direct tandem.
  • the loop stem represents a miRNA gene (the pre-miRNA) and the oligonucleotide probes used for the fluorescent in situ hybridization experiments (FISH RNA) are symbolized by gray rectangles.
  • Figure 2 FISH RNA visualization of nascent pri-miRNAs in JEG3 choriocarcinomas.
  • JEG3 cells are hybridized with Cy3 (a and d) or Alexa fluorine 488 (b and e) coupled oligonucleotide probes that reveal intron or exon sequences of pri-miRNA as indicated.
  • Cy3 a and d
  • Alexa fluorine 488 b and e
  • Figure 3 The histograms show the proportion of nuclei with 0, 1, 2, or 3 pri-miRNA signals (more than 300 nuclei analyzed).
  • FIG. 4 Drosha and DGCR8 concentrate at the C19MC locus by immunofluorescence.
  • the JEG3 cells are hybridized with pri-miRNA probes before being immuno-labeled with antibodies against the endogenous proteins Drosha (high) and DGCR8 (low).
  • Figure 5 Effect of loss of DGCR8 function on Drosha recruitment.
  • the JEG3 cells are transfected with siRNA against DGCR8 (or control siRNA) and then hybridized with an oligo probe detecting pri-miRNA (b and e) before being immuno-labeled with an antibody against Drosha (a and d).
  • the superposition of the DGCR8 and pri-miRNA signals are shown (c and f).
  • FIG. 6 Histograms indicate the proportion of nuclei with a Drosha (left) or DGCR8 (right) signal in cells transfected with siRNA against DGCR8 or Drosha mRNAs. The value observed in the control cells is reduced to 100%.
  • FIG. 7 Visualization of recruitment of GFP-DGCR8 at the C19MC locus on fixed cells.
  • a eukaryotic vector expressing a GFP-DGCR8 fusion (GFP-DGCR8) is transiently transfected into JEG3 cells which are subsequently hybridized with oligos which reveal pri-miRNAs (pri-miRNA).
  • pri-miRNA pri-miRNA
  • Figure 8 Visualization of recruitment of GFP-Drosha at the C19MC locus on fixed cells.
  • a eukaryotic vector expressing a GFP-DROSHA fusion is transfected from transiently in JEG3 cells that are subsequently hybridized with oligos that reveal pri-miRNAs (pri-miRNA).
  • pri-miRNA pri-miRNA
  • Figure 10 Automated visualization of DGCR8 protein at the C19MC locus (96-well plates)
  • Example 1 The biogenesis of microRNAs
  • microRNAs or miRNAs
  • the inventors have implemented a cellular imaging approach enabling them to monitor the intranuclear fate of pri-miRNA transcripts in fixed or living culture cells.
  • the inventors used the chromosomal locus positioned on chromosome 19 (chromosomal domain 19q13), which contains 46 microRNA genes: this is the C19MC locus.
  • Most of the pre-miRNA genes of C19MC are integrated into highly repetitive sequences of a length of 400 to 700 nucleotides ( Figure 1).
  • C19MC-HG C19MC Host Gene
  • FISH RNA fluorescence in situ hybridization
  • RNA signals correspond to the unspliced (or partially spliced) pri-miRNA transcripts, and not to the spliced introns detached from the pri-miRNA since they are also revealed with exon probes ( Figure 2, d, e, f). These signals were detected near one of the three FISH DNA-revealed DNA signals (data not shown), indicating that they represent freshly obtained transcripts in the vicinity of the transcription sites (note: JEG3s are triploid).
  • the inventors Using the intronic and exonic probes, the inventors have also demonstrated numerous signals in the form of points surrounding the intronic RNA signals globally, particularly in the vicinity of the transcription site (data not shown). These signals correspond to the pri-miRNAs, which leave their transcription site and cross the nucleoplasm. These hybridizations by FISH RNA also show that the chromosomal locus C19MC is preferentially, indeed exclusively, expressed mono-allelically by JEG3 human choriocarcinoma line (data not shown and FIG. 3).
  • Example 2 the microprocessor associates with the pri-miRNAs
  • the inventors To determine if the microprocessor can be visualized on the pri-miRNAs of the freshly synthesized C19MC locus, the inventors combined FISH RNA experiments with immunofluorescence protein detection experiments, according to techniques well known to those skilled in the art. . The inventors have thus been able to detect the endogenous Drosha or DGCR8 proteins (FIG. 4). The inventors have observed a co-localization of intense immunofluorescence signals for Drosha and DGCR8 with the signals of the pri-miRNAs indicating that the microprocessor associates with the unspliced pri-miRNAs in the vicinity of the transcription site.
  • DGCR8 has a role in the recruitment and / or stabilization of Drosha at the level of pri-miRNAs
  • the JEG3 cells were transfected with the plasmid encoding the DGCR8 protein, coupled to GFP according to techniques well known to those skilled in the art.
  • GFP-coupled DGCR8 protein concentrates at the C19MC locus ( Figure 7). Duplicate signals at C19MC are also visible on living cells, indicating that these signals are not artifacts related to the fixation and / or hybridization steps.
  • the detected GFP-tagged signals are co-localized with the RNA signals around the transcription sites, but also with the signals seen throughout the nucleus. This suggests that pri-miRNAs may be at locations other than their transcription sites.
  • JEG3 cells were transfected with the plasmid encoding the Drosha protein, coupled to GFP according to techniques well known to those skilled in the art. The inventors have thus shown that the Drosha protein coupled to GFP also concentrates at the C19MC locus (FIG. 8).
  • DGCR8 and Drosha are necessary and sufficient to allow the maturation of pri-miRNAs.
  • proteomic analysis has revealed other proteins associated with the microprocessor such as, for example, RNA helicases, heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP) and other proteins having an RNA binding motif.
  • RNA helicases RNA helicases
  • hnRNP heterogeneous nuclear ribonucleoproteins
  • the techniques used to visualize the biogenesis of pri-miRNAs at the C19MC locus allowed the inventors to determine the presence of other RNA-binding proteins.
  • hnRNP C1 / C2 EWS, ILF3 / NFAR / NF90 and RNA helicase A (RHA) at the C19MC locus (data not shown), indicating that these proteins are likely to play a role in the synthesis, nuclear and maturation of pri-miRNAs encoded by the C19MC locus.
  • the recruitment of hnRNP C1 / C2 is specific since hnRNP A1 and other hnRNP analyzed, such as hnRNP M1M2, U and A2 / B1, are not concentrated at the C19MC locus.
  • nucleolin, hnRNP A1, p68 and 672 RNA helicases, or even exosomes (PSsclOO) are not found to be significantly concentrated at the C19MC locus (data not shown).
  • JEG3 cells are cultured on glass slides previously treated with 1% gelatin. These cells are fixed for 15 minutes at room temperature with 4% paraformaldehyde in phosphate buffered saline (PBS). The cells thus fixed subsequently undergo a permeabilization step for 5 to 7 minutes at a temperature of 4 ° C. in a medium consisting of Triton X-100 concentrated to 0.4% in PBS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cells are then incubated in a humid chamber with successively the primary anti-Drosha and anti-DGCR8 antibodies in PBS1X / 1% BSA medium as described below: the cells are incubated with a primary anti-DGCR8 antibody at a dilution of 1/300 and at room temperature.
  • a primary anti-DGCR8 antibody is marketed by Santa Cruz under the name "sc-48473".
  • the cells are also incubated with a primary anti-Drosha antibody at a dilution of 1/300 and at a temperature of 37 ° C.
  • a primary anti-Drosha antibody is marketed by Abcam under the name "ab 12286”.
  • the cells then undergo 3 washes for 10 minutes in PBS at room temperature.
  • the cells are then incubated with the secondary antibodies respectively directed against the anti-DGCR8 and anti-Drosha antibodies as described below:
  • the cells are incubated with an anti-DGCR8 antibody at a dilution of about 1/500 and at room temperature.
  • anti-DGCR8 antibody sold by Invitrogen under the references Al 1055 and A21432:
  • the cells then undergo 3 washes for 10 minutes in PBS at room temperature.
  • the slides are then mounted to Moviol / DAPI at a concentration of
  • the inventors have succeeded in implementing a technique allowing simultaneous visualization of the transcription sites of the cells treated according to the process of the invention, the recruitment of DGCR8 and the recruitment of the Drosha protein.
  • the superposition of the signals testifies to the relevance of the method for monitoring the biogenesis of microRNAs.
  • Example 8 Monitoring the biogenesis of microRNAs in an automated manner
  • the inventors have implemented the protocol as defined in Example 6 by culturing JEG3 cells on 96-well plates which are conventionally used when it comes to developing high throughput screening strategies.
  • the vast majority of nuclei here revealed by DAPI labeling
  • IF immunofluorescent
  • the signal-to-noise ratio is such that it allows automated and highly specific recognition by imaging software (Part B of Figure 9).
  • FIG. 10 illustrates the detection of the DGCR8 protein according to this protocol and with the aid of such software.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de visualisation de la biogenèse d'au moins un microARN, de préférence d'un groupe de microARNs dans une cellule vivante, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes; la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour une protéine choisie parmi la protéine DGCR8 (DiGeorge syndrome critical région gène 8), la protéine Drosha, et leurs dérivés, laquelle protéine est couplée à un marqueur; l'expression de ladite protéine couplée audit marqueur; et la détection dudit marqueur.

Description

Procédé d'imagerie cellulaire pour la visualisation de la biogenèse des microARNs dans les cellules
La présente invention concerne un procédé de visualisation de la biogenèse d'au moins un micro ARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, grâce à la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour une protéine choisie parmi la protéine DGCR8 (DiGeorge syndrome critical région gene 8), la protéine Drosha, et leurs dérivés, couplée à un marqueur, et la détection dudit marqueur. Les microARNs (miARNs) sont des ARN de courtes tailles (préférentiellement entre 15 à 30 nucléotides, et plus préférentiellement entre 19 et 23 nucléotides) capables de moduler négativement l'expression des gènes. Par leur capacité à réguler un grand nombre de gènes, ils sont impliqués dans de nombreux processus biologiques tels que le contrôle de l'apoptose, de la prolifération et de la différentiation cellulaire.
La production des microARNs débute dans le noyau par le clivage d'un ARN précurseur : le pri-miARN. Ces clivages sont réalisés par un complexe spécifique : « le Microprocesseur » comprenant les protéines DGCR8 et Drosha, lesquels clivages libèrent un intermédiaire labile, le pré-miARN, à partir duquel le microARN est généré suite à une seconde série de clivages catalysés par la protéine DICER.
Des dérégulations de la production des microARNs aussi bien transcriptionelles que post-transcriptionelles sont fréquemment décrites dans des contextes pathologiques tels que les cancers, laissant présager que les microARNs puissent constituer des cibles thérapeutiques dans certaines pathologies. Ainsi il serait intéressant de disposer d'un outil de criblage permettant d'identifier les molécules ou facteurs cellulaires capables de moduler la production de microARNs. La présente invention porte sur un procédé d'imagerie cellulaire permettant de suivre, dans des cellules vivantes, la dynamique et le recrutement du Microprocesseur (complexe Drosha-DGCR8) sur des transcrits naissants. L'exploitation d'un système cellulaire de type gène-rapporteur permet de cribler les molécules sur des cellules humaines vivantes avec comme objectif principal l'identification de drogues ou de facteurs cellulaires capables de moduler, positivement ou négativement, l'activité du Microprocesseur, et donc la production des microARNs. Les inventeurs ont mis en évidence un système permettant de suivre la dynamique et le mode d'action du microprocesseur dans les cellules, notamment les cellules vivantes humaines, plus particulièrement dans les cellules de la lignée de choriocarcinome humain JEG3 (ATCC HTB-36), et ceci avec
> une très grande efficacité (plus de 90% des cellules transfectées sont analysables) ;
un excellent rapport signal spécifique/bruit de fond; et
> un signal du marqueur, par exemple un signal fluorescent fort et localisé, donc parfaitement reconnais sable avec les outils bien connu de l'homme du métier, comme par exemple la vidéo-microscopie.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de visualisation de la biogenèse d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule caractérisée en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour une protéine choisie parmi la protéine DGCR8 (DiGeorge syndrome critical région gene 8), la protéine Drosha, et leurs dérivés, ladite protéine étant couplée à un marqueur;
ii) l'expression de ladite protéine couplée audit marqueur; et
iii) la détection du dit marqueur. Cette étape (iii) permet la visualisation de la biogénèse dudit au moins un microARN, de préférence dudit groupe de microARNs, ladite protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha, et leurs dérivés se fixant sur les pri-miARNs en en cours de formation au voisinage des sites de transcription.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite protéine est la protéine DGCR8 ou son dérivé choisie dans le groupe constitué de l'isoforme CRA_a d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX02998 ou NP_073557, SEQ ID N°l), l'isoforme CRA_b d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX02999, SEQ ID N°2), l'isoforme CRA_c d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX03000, SEQ ID N°3 ), l'isoforme CRA_a de Mus musculus (numéro d'accession EDK97512 (SEQ ID N°4), EDK97515 (SEQ ID N°5), NP_201581 (SEQ ID N°6),), l'isofome CRA_b de Mus musculus (numéro d'accession EDK97513, SEQ ID N°7), l'isoforme CRA_c de Mus musculus (numéro d'accession EDK97514, SEQ ID N°8), l'isoforme CRA_a de Rattus norvégiens (numéro d'accession EDL77930 (SEQ ID N°9), EDL77931 (SEQ ID N°10)), l'isofome CRA_b de Rattus norvégiens (numéro d'accession EDL77932, SEQ ID N°l l) et leurs dérivés.
Par « dérivé », on entend toute protéine possédant un pourcentage d'identité avec la protéine à laquelle ce terme s'applique d'au moins 70%, préférentiellement 80%, plus préférentiellement 90%, et encore plus préférentiellement 95%.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fentre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
Par « transformation » on entend la modification du patrimoine génétique d'une cellule par introduction d'une information génétique étrangère. Cette transformation peut s'effectuer par électroporation, conjugaison, transfection, transduction, fusion de protoplastes, ou toute autre technique connue de l'homme du métier. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape de transformation est une étape de transfection, préférentiellement effectuée de manière transitoire selon une méthode chimique au phosphate de calcium ou via l'utilisation du transfectant lipofectamine 2000, invitrogen.
Par "vecteur", on entend un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré un polynucléotide codant pour la protéine DGCR8 ou l'un de ses dérivés, laquelle protéine étant couplée à un marqueur. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion de polynucléotide s dans ces vecteurs sont connues de l'homme du métier. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans un organisme hôte et notamment afin d'induire l'expression d'une protéine peut être utilisé. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés notamment en fonction de l'organisme hôte à transformer et en fonction de la technique de transformation mise en œuvre. Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte en vue de l'expression d'une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha, et leurs dérivés couplée à un marqueur dans l'organisme hôte. De manière préférée, dans le cadre de cette invention, le vecteur codant pour ladite protéine et son marqueur est un plasmide.
Par "marqueur", on entend tout moyen, biologique, chimique ou physique capable d'engendré un signal que l'on peut détecter et le cas échéant permettant la quantification de l'expression d'un gène cible dans une cellule. De tels marqueurs sont bien connus de l'homme du métier. Une liste non limitative de ces marqueurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32 P, 35 S ou 125 I. Leur composition dépendra en particulier du gène cible et de la méthode de détection de l'expression dudit gène cible. Les marqueurs selon l'invention peuvent également être des anticorps, plus particulièrement des anticorps spécifiques des protéines constituant le microprocesseur, ou les éléments s'y liant. De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur fluorescent.
Par "marqueur fluorescent", on entend toute substance colorée, naturelle, artificielle ou synthétique, absorbant de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et la restituant sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). Dans le cadre de l'invention on utilisera préférentiellement la protéine fluorescente verte ou « Green Fluorescent Protein » (GFP), la protéine fluorescente jaune ou « Yellow Fluorescent Protein » (YFP), la protéine fluorescente cyan ou « Cyan Fluorescent Protein » (CFP), le cytochrome b5, ou les marqueurs de type Alexa fluor, tel qu' Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 555.
Le cytochrome b5, de couleur rouge, possède un maximum d'absorption à 412 nm.
La GFP est une petite protéine constituée de 238 acides aminés, organisés en 11 brins beta antiparallèles et une hélice alpha centrale. On parle d'une structure en « beta-can ». Les extrémités N-terminal et C-terminal sont accessibles pour la fusion avec d'autres protéines. La GFP non modifiée, dite sauvage (wild type : wGFP) a deux maxima d'excitation. Le premier se trouve avec une longueur d'onde de 395 nm (lumière UV), le deuxième à 475 nm (lumière bleue). La longueur d'onde d'émission maximale est à 504 nm.
La CFP est une protéine produite à partir d'un mutant du gène codant la protéine fluorescente verte. Cette protéine émet de la fluorescence à une longueur d'onde de 480 nm lorsqu'elle reçoit une lumière de longueur d'onde de 458 nm.
La YFP est une protéine produite à partir d'un mutant du gène codant la protéine fluorescente verte. Cette protéine émet de la fluorescence à une longueur d'onde de 527 nm, lorsqu'elle est excitée par une lumière de longueur d'onde de 514 nm. Les marqueurs de type Alexa Fluor sont des fluorochromes produits par la société Invitrogen. Ces flurochromes peuvent être couplés à des anticorps primaires ou secondaires.
De manière préférée, dans le cadre de cette invention, le marqueur fluorescent est la GFP (Green Fluorescent Protein).
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur protéique.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha, et leurs dérivés couplée à un marqueur protéique est une protéine de fusion, de préférence une protéine de fusion DGCR8-GFP ou Drosha-GFP et de manière particulièrement préférée, cette protéine de fusion est la protéine de fusion DGCR8-GFP présentant la séquence SEQ ID N°12.
Par "protéine de fusion", on entend une construction qui renferme plusieurs protéines d'origine différente. Cette protéine de fusion est codée par un acide nucléique obtenu par les technologies d'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier.
Dans la plupart des cas, une de ces protéines est celle que l'on veut étudier tandis que l'autre lui confère des propriétés qui la rendent facile à détecter. Dans le cadre de cette invention, la protéine de fusion est constituée d'une protéine et d'un marqueur.
Par « détection du marqueur », on entend la détection des signaux émis par le marqueur, par exemple la détection de la fluorescence dans le cas où le marqueur est un marqueur fluorescent.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape de détection de la fluorescence se fait par microscopie, avantageusement à l'aide d'un microscope à fluorescence ou selon tout autre technique bien connue de l'homme du métier.
De manière préférée, l'invention peut également être mise en œuvre à l'aide d'un immunomarquage. Par "immunomarquage", on entend l'utilisation d'un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt pour sa détection de manière directe ou indirecte.
L'invention concerne ainsi un procédé de visualisation de la biogénèse d'au moins un micro ARN, de préférence un groupe de micro ARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
i) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps choisi parmi les anticorps dirigés contre une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha et leurs fragments, ledit anticorps étant couplé à un marqueur; et
ii) la détection dudit marqueur.
Le couplage de l'anticorps avec le marqueur permet la détection directe de la protéine dont on souhaite suivre le recrutement. On parle alors d'immunofluorescence directe.
Par "fragment de DGCR8" ou "fragment de Drosha", on entend respectivement une partie de la séquence peptidique desdites protéines. Typiquement, un fragment d'une protéine peut représenter 1 à 99 % de la séquence peptidique de ladite protéine à laquelle cette expression se réfère. Préférentiellement, les fragments respectifs des protéines DGCR8 et Drosha compte entre 1 et 100, préférentiellement 1 à 50 acides aminés des séquences peptidiques respectives de DGCR8 et Drosha.
L'invention concerne également un procédé de visualisation de la biogénèse d'au moins un micro ARN, de préférence un groupe de micro ARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps primaire choisi parmi les anticorps dirigés contre une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha et leurs fragments; puis
b) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps secondaire spécifique du ou des anticorps primaire(s) de l'étape a); et
c) la détection dudit marqueur.
Le couplage du marqueur à l'anticorps secondaire permet la détection indirecte de l'anticorps primaire. On parle alors d'immunofluorescence indirecte. L'immunofiuorescence indirecte permet une amplification des signaux de fluorescence et facilite le suivi du recrutement des protéines DGCR8 et/ou Drosha, et ainsi le suivi de la biogénèse de micro ARNs.
Préférentiellement, l'anticorps primaire dirigé contre DGCR8 (ou anticorps anti-DGCR8) est un anticorps de chèvre. Un tel anticorps est commercialisé par la société Sant Cruz, sous la dénomination "Sc-48473".
Préférentiellement, l'anticorps primaire dirigé contre Drosha (ou anticorps anti-Drosha) est un anticorps de lapin. Un tel anticorps est commercialisé par la société Abcam, sous la dénomination "ab 12286".
Préférentiellement, l'anticorps secondaire marqué dirigé contre l'anticorps primaire anti-DGCR8 est un anticorps d'âne. De tels anticorps sont commercialisés par la société Invitrogen sous les dénominations Invitrogen Al 1055, et Invitrogen A21432. L'anticorps Invitrogen Al 1055 est couplé à un marqueur de type Alexa Fluor 488. Ce marqueur est excité à une longueur d'onde d'environ 495 nm et émet à une longueur d'onde d'environ 519 nm. L'anticorps Invitrogen A21432 est couplé à un marqueur de type Alexa Fluor 555. Ce marqueur est excité à une longueur d'onde d'environ 555 nm et émet à une longueur d'onde d'environ 565 nm. Préférentiellement, l'anticorps secondaire marqué dirigé contre l'anticorps primaire anti-Drosha est un anticorps d'âne. De tels anticorps sont commercialisés par la société Invitrogen sous les dénominations Invitrogen A21206 et Invitrogen A31572. L'anticorps Invitrogen A21206 est couplé à un marqueur de type Alexa Fluor 488 tandis que l'anticorps Invitrogen A31572 est couplé à un marqueur de type Alexa Fluor 555.
La présente invention permet ainsi de suivre le recrutement des protéines DGCR8 et/ou des protéines Drosha. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'invention permet de suivre le recrutement simultané de ces deux protéines. Si l'on met en œuvre le procédé de l'invention avec les anticorps Invitrogen Al 1055 et Invitrogen A31572, la protéine DGCR8 sera visible à une longueur d'onde d'environ 519 nm tandis que la protéine Drosha sera visible à une longueur d'onde d'environ 565 nm.
Alternativement, les anticorps peuvent être marqués par des marqueurs fluorescents. Dans un autre mode de réalisation, les anticorps peuvent être marqués avec des marqueurs de type enzymatique, tels que le système streptavidine-biotine. De préférence, ladite cellule est cultivée sur un support, fixée et perméabilisée avant tout incubation selon les étapes i) ou a).
Préférentiellement, ladite cellule est cultivée sur un support approprié, tel que des lamelles en verre. Ladite cellule est ensuite fixée sur ledit support selon les techniques classiques de l'art antérieur. Typiquement, cette fixation peut se faire à l'aide de fixateurs aldéhydiques tels que le glutaraldéhyde ou le paraformaldéhyde (PFA) ou de fixateurs coagulants, tels que le méthanol, l'éthanol ou l'acétone. Préférentiellement, cette fixation s'effectue à l'aide de paraformaldéhyde. Le formaldéhyde agit sur les groupements -NH2 des protéines. A ce titre, son action entraîne la réticulation des protéines de la membrane et la fixation des cellules. Cette fixation peut être suivie d'une étape de lavage, préférentiellement 3 lavages avec du PBS pendant une durée d'environ 5 minutes. L'homme du métier veillera à mettre en œuvre des conditions adaptées permettant la conservation des structures cellulaires et le respect de la nature de la cellule traitée. Il veillera ainsi à utiliser des solutions présentant une osmolalité et une concentration ionique adéquates.
Préférentiellement, ladite cellule subit également une étape de perméabilisation, préalablement à l'étape i) ou a) d'incubation. Les conditions de mise en œuvre d'une telle perméabilisation sont bien connues de l'homme du métier. Typiquement, elle s'effectue à l'aide de détergents, tels que le triton, la saponine, le dodecylsulfate de sodium (SDS), le tween, la digitonine, ou le borohydrure de sodium. Préférentiellement, la perméabilisation se fait par traitement au triton, préférentiellement au tritonX-100 ou par traitement à l'éthanol, préférentiellement l'éthanol à 70% à une température de 4°C pendant au moins 12h. Typiquement, le fixateur est présent à une concentration comprise entre 0,1 et 1% par rapport au volume de tampon, préférentiellement à une concentration d'environ 0,4%.
Optionnellement, ladite cellule peut ensuite subir une étape de saturation des sites non spécifiques de fixation. Cette saturation peut s'effectuer avec de l'albumine de sérum bovin (BSA), ou bien avec du sérum de la même espèce que l'anticorps primaire ou l'anticorps secondaire. Préférentiellement, cette saturation s'effectue avec du BSA.
Préférentiellement, après chaque étape d'incubation avec un anticorps, ladite cellule subit une étape de lavage. Ce lavage peut s'effectuer selon les conditions opératoires bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, il s'agit de 3 lavages au tampon phosphate salin (PBS) pendant environ 5 minutes.
De manière préférée, pour la mise en œuvre de la méthode de l'invention, les anticorps sont couplés à des marqueurs fluorescents. Dans ce cas, la détection du marqueur selon l'étape ii) ou c) comprend le montage de ladite cellule dans un milieu de montage adapté à la détection du marqueur fluorescent. Ce milieu de montage est un milieu adapté permettant de préserver la fluorescence des marqueurs. Les conditions permettant la détection du marqueur dépendent de la nature dudit marqueur et sont bien connues de l'homme du métier. Typiquement, cette détection se fait par microscopie. Typiquement, le milieu de montage de ladite cellule est un milieu comprenant du Moviol. Ce milieu de montage peut également comprendre du 4,6-diamidino-2- phénylindole (DAPI). La présence du DAPI dans le milieu de montage permet la visualisation de l'ADN nucléaire. La présence de DAPI permet donc la visualisation du noyau cellulaire.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention peut comprendre en outre la détection des sites de transcription selon les techniques classiques de l'art antérieur telles que l'hybridation in situ (ARN FISH). Le procédé selon l'invention permet donc la détection simultanée des sites de transcription de ladite cellule (les transcrits naissants pri-C19MC) et le microprocesseur (Drosha et DGCR8), facilitant ainsi le suivi de la biogénèse des pri-microARNs dans ladite cellule.
L'invention est très avantageuse puisqu'elle permet la préservation des protéines DGCR8 et Drosha tout en optimisant le marquage et le suivi de la biogénèse de micro ARNs.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite cellule est une cellule de placenta, de préférence une cellule de placenta de primates, encore plus préférentiellement une cellule humaine de placenta.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ladite cellule de placenta est issue d'un choriocarcinome, de préférence ladite cellule est choisie dans le groupe comprenant les lignées de choriocarcinome humains JEG 3 (ATCC HTB-36), JAR (ATCC HTB-144) et BeWo (ATCC CCL-98). De manière encore préférée, ladite cellule est issue de la lignée de choriocarcinome humain JEG 3 (ATCC HTB-36). Cette lignée immortalisée est facile à manipuler et cultivée dans du DMEM (4,5 g/ml de glucose, 5% sérum de veau sous antibiotiques pénicilline/streptomycine) et exprime de manière forte, constitutive et monoallélique le locus C19MC.
Le locus chromosomique C19MC est un locus génique, positionné sur le chromosome 19 humain et contient 46 gènes de micro ARNs organisés en tandem et s'étalant sur environ lOOkb. Les gènes de ces microARNs sont principalement, voire exclusivement, exprimés dans le placenta.
Ainsi, de manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit au moins un micro ARN, de préférence ledit groupe de microARNs, est codé par le locus chromosomique C19MC (chromosome 19 miRNA cluster), de préférence ledit miARN est choisi dans le groupe comprenant SEQ ID N° 13 à SEQ ID N°58.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est destiné à identifier des composés capables de moduler l'expression d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, et en ce qu'il comprend en outre les étapes de :
1) mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester,
2) mesure de l'expression dudit marqueur en présence et en absence dudit composé à tester, et
3) sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression du marqueur. Ainsi, l'invention porte sur un procédé de criblage de composés capables de moduler l'expression d'au moins un microARN, de préférence un groupe de micro ARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha, et leurs dérivés, laquelle protéine est couplée à un marqueur ;
l'expression de ladite protéine couplée audit marqueur;
la mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester;
la mesure de l'expression dudit marqueur en présence et en absence dudit composé à tester; et
la sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression du marqueur.
La présente invention concerne un procédé de criblage de composés capables de moduler l'expression d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
1) la mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester;
2) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps choisi parmi les anticorps dirigés contre une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha et leurs fragments, ledit au moins un anticorps étant couplé à un marqueur;
3) la détection dudit marqueur en présence et en absence dudit composé à tester; et
4) la sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression du marqueur. La présente invention porte également sur un procédé de criblage de composés capables de moduler l'expression d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
A) la mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester;
B) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps primaire choisi parmi les anticorps dirigés contre une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha et leurs fragments;
C) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps secondaire spécifique de ou des anticorps primaire(s) de l'étape B);
D) la détection dudit marqueur en présence et en absence dudit composé à tester; et
E) la sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression du marqueur. La méthode de criblage de molécule selon l'invention a pour objectif d'identifier des molécules ou des facteurs cellulaires capables de moduler l'action du Microprocesseur dans le nucléoplasme et donc l'expression des microARNs, en particulier en inhibant le recrutement de la protéine DGCR8 ou de la protéine Drosha.
Cette méthode permet en effet de cribler des molécules différentes ayant une influence sur le recrutement de la protéine DGCR8 uniquement, de la protéine Drosha uniquement, ou bien des deux protéines DGCR8 et Drosha. Des dérégulations de la production des microARNs étant impliquées dans des contextes pathologiques tels que le cancer, cette méthode de criblage selon l'invention permet en outre la mise en évidence de molécules ou facteurs cellulaires impliqués dans de tels contextes pathologiques. Les composés à tester selon la méthode de criblage selon l'invention peuvent être de nature lipidique, glucidique, protéique ou nucléique .Préférentiellement, ces composés sont des siRNA, plus préférentiellement des siRNA de banque de siRNA pangénomique humaine. En particulier, les composés à tester pourront être décrits dans des chimiothèques artificielles ou naturelles.
Par "mesure de l'expression", on entend la localisation et la mesure qualitative et/ou quantitative du marqueur utilisé, en particulier dans le cas d'un marqueur fluorescent, de la mesure de la fluorescence, mise en œuvre selon les techniques connues de l'homme du métier. Ainsi par exemple, dans le procédé selon la présente invention, il pourra être mesuré de manière qualitative par microscopie automatisée la présence ou l'absence du marqueur fluorescent utilisé (par exemple GFP) dans ladite cellule au niveau du site de transcription.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1: Représentation schématique du locus chromatinien C19MC (-100 kb). Cette figure représente l'organisation génique des miARN en faisant apparaître le caractère répété de ce locus: la majorité des gènes des miARN est contenue dans des introns eux même localisés au sein d'une séquence non-codante (400-700 nt) répétée en tandem direct. La tige boucle représente un gène de miARN (le pre-miARN) et les sondes oligonucléotidiques utilisées pour les expériences d'hybridation fluorescente in situ (ARN FISH) sont symbolisés par des rectangles gris.
Figure 2 : Visualisation par ARN FISH des pri-miARN naissants dans les choriocarcinomes JEG3. Les cellules JEG3 sont hybridées avec des sondes oligonucléotidiques couplées au Cy3 (a et d) ou Alexa fluor 488 (b et e) qui révèlent des séquences introniques ou exoniques du pri-miARN comme indiqué. Dans la majorité des noyaux, on observe un seul signal ARN après superposition de ces signaux (c et f) qui, dans 50% des cas, présente une forme caractéristique en doublets ou en haltères: ce sont les pri-miARN non maturés au voisinage du site de transcription (Fig.lD).
Figure 3 : Les histogrammes montrent la proportion de noyaux avec 0, 1, 2, ou 3 signaux pri-miARN (plus de 300 noyaux analysés).
Figure 4: Drosha et DGCR8 se concentrent au locus C19MC par immunofluorescence. Les cellules JEG3 sont hybridées avec des sondes révélant le pri-miARN avant d'être immuno-marquées avec des anticorps dirigés contre les protéines endogènes Drosha (haut) et DGCR8 (bas).
Figure 5 : Effet de la perte de fonction de DGCR8 sur le recrutement de Drosha. Les cellules JEG3 sont transfectées par un siARN contre DGCR8 (ou un siARN contrôle) puis sont hybridées avec une sonde oligo détectant le pri-miARN (b et e) avant d'être immuno-marquées avec un anticorps contre Drosha (a et d). La superposition des signaux DGCR8 et pri-miRNA sont montrés (c et f).
Figure 6 : Les histogrammes indiquent la proportion de noyaux avec un signal Drosha (gauche) ou DGCR8 (droite) dans les cellules transfectées par des siARN contre les ARNm de DGCR8 ou Drosha. La valeur observée dans les cellules contrôles est ramenée à 100%.
Figure 7 : Visualisation du recrutement de GFP-DGCR8 au locus C19MC sur cellules fixées. Un vecteur eucaryote exprimant une fusion GFP-DGCR8 (GFP-DGCR8) est transfecté de manière transitoire dans les cellules JEG3 qui sont par la suite hybridées avec des oligos qui révèlent les pri-miARN (pri-miARN). En haut : représentation schématique de la fusion GFP-DGCR8 avec notamment les domaines protéiques fonctionnels de DGCR8.
Figure 8: Visualisation du recrutement de GFP-Drosha au locus C19MC sur cellules fixées. Un vecteur eucaryote exprimant une fusion GFP-DROSHA est transfecté de manière transitoire dans les cellules JEG3 qui sont par la suite hybridées avec des oligos qui révèlent les pri-miARN (pri-miARN). En haut : représentation schématique de la fusion GFP-Drosha avec notamment les domaines protéiques fonctionnels de Drosha.
Figure 9: Visualisation simultanée dans les choriocarcinomes JEG3:
-des pri-miARN naissants par ARN FISH au locus C19MC,
-du recrutement de la protéine DGCR8; et
-du recrutement de la protéine Drosha.
Figure 10: Visualisation automatisée de la protéine DGCR8 au locus C19MC (plaques 96 puits)
A) Détection des signaux IF-DGCR8 dans la grande majorité des noyaux (un champs de noyaux (visualisé par marquage DAPI) choisi au hasard est montré)
B) Reconnaissance automatisée des signaux IF-DGCR8 à l'aide d'un logiciel d'imagerie.
EXEMPLES
Exemple 1 : La biogénèse des microARNs
Pour mettre en lumière l'organisation de la biogénèse de microARNs (ou miARNs), les inventeurs ont mis en œuvre une approche d'imagerie cellulaire leur permettant de suivre le devenir intranucléaire des transcrits de pri-miARNs dans des cellules en culture fixées ou vivantes. Pour ce faire, les inventeurs ont utilisé le locus chromosomique positionné sur le chromosome 19 (domaine chromosomique 19ql3) qui contient 46 gènes de micro ARNs : c'est le locus C19MC. La plupart des gènes de pre-miARNs de C19MC sont intégrés dans des séquences hautement répétées d'une longueur de 400 à 700 nucléotides (Figure 1). Les inventeurs ont exploité la nature répétitive de C19MC-HG (C19MC Host Gene) pour effectuer une hybridation in situ en fluorescence (méthode dite « ARN FISH») à l'aide de sondes oligonucléotidiques capable de s'hybrider avec les séquences introniques et exoniques répétitives de C19MC-HG (Figure 2). En utilisant une lignée cellulaire de choriocarcinomes de type JEG3 ainsi que deux différentes sondes ADN, s'hybridant respectivement avec les séquences en amont et en aval des pre-miARNs, les inventeurs ont mis en évidence d'important signaux correspondant aux pri-miARN nucléaires, et ceci, dans la majorité des cellules (données non montrées).
Les inventeurs ont constaté qu'environ 50% de ces signaux pri-ARN sont visualisés sous forme de doublet (Figure 2 a,b,c) ou sous une forme plus complexe encore pouvant s'étendre sur plusieurs μιη de longueur et occuper une place importante dans le noyau (non montré). Ces signaux ARN correspondent aux transcrits pri-miRNA non-épissés (ou partiellement épissés), et non pas aux introns épissés détachés du pri- miARN puisqu'ils sont aussi révélés avec des sondes exoniques (Figure 2, d,e,f). Ces signaux ont été détectés à proximité d'un des trois signaux ADN révélées par ADN FISH (données non montrées), ce qui indique qu'ils représentent des transcrits fraîchement obtenus au voisinage des sites de transcription (note : les JEG3 sont triploides).
A l'aide des sondes introniques et exoniques, les inventeurs ont également mis en évidence de nombreux signaux sous forme de points entourant globalement les signaux d'ARN introniques, notamment dans le voisinage du site de transcription (données non montrées). Ces signaux correspondent aux pri-miARNs, qui quittent leur site de transcription et traversent le nucléoplasme. Ces hybridations par ARN FISH montrent également que le locus chromosomique C19MC est préférentiellement, voire exclusivement, exprimé de manière mono-allélique par la lignée de choriocarcinome humain JEG3 (données non montrées et figure 3).
Exemple 2 : le Microprocesseur s'associe avec les pri-miARNs
Pour déterminer si le Microprocesseur peut être visualisé sur les pri-miARNs du locus C19MC fraîchement synthétisé, les inventeurs ont combiné des expériences d'ARN FISH avec des expériences de détection de protéines par immunofluorescence, selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Les inventeurs ont ainsi pu détecter les protéines Drosha ou DGCR8 endogènes (Figure 4). Les inventeurs ont observé une co-localisation d'intenses signaux d' immunofluorescence pour Drosha et DGCR8 avec les signaux des pri-miARNs indiquant que le Microprocesseur s'associe avec les pri-miARNs non épissés au voisinage du site de transcription. Cette accumulation nucléaire importante du Microprocesseur a également été démontrée dans deux autres lignées cellulaires de choriocarcinome, JAR et BeWO, qui expriment les gènes du locus C19MC. Par contre, les cellules HeLA et HEK293 qui n'expriment pas les gènes localisés sur le locus C19MC ne montrent que de très faibles signaux liés au Microprocesseur (données non montrées).
Le recrutement dépend de la transcription et survient vraisemblablement via l'interaction avec les ARNs, puisqu'il n'y a pas de détection dans les cellules traitées par l'Actinomycine, dans lesquelles C19MC-HG n'est pas détecté au environ du site de transcription du C19MC (données non montrées). Exemple 3 : DGCR8 a un rôle dans le recrutement et/ou la stabilisation de Drosha au niveau des pri-miARNs
Afin de déterminer si le recrutement de Drosha et DGCR8 sur les transcrits de C19MC est interdépendant, l'expression de ces deux protéines a été diminuée à l'aide d'ARNi (selon les techniques bien connues de « knocking-down »), et l'impact de la déficience en DGCR8 sur la distribution intra-nucléaire de Drosha (et vice-versa) a été évalué. Les inventeurs ont ainsi validé le test de déficience de gènes en montrant que seulement 20% des cellules issues de la lignée de choriocarcinome de type JEG3, transformées avec des siRNA (petits ARN interférents) dirigés contre des ARNm codant pour DGCR8 ou Drosha, présentent des signaux d'immunofluorescence détectables des protéines cibles au locus C19MC (données non montrées). La proportion de noyaux présentant un signal Drosha au niveau du locus C19MC est fortement réduite dans les cellules déficientes en DGCR8 (Figures 5 et 6 (gauche)), ce qui indique que DGCR8 a un rôle dans le recrutement et/ou la stabilisation de Drosha au niveau des pri-miARNs. La déficience en Drosha a également un impact quant au recrutement de DGCR8, même si une fraction importante du noyau présente toujours des protéines DGCR8 au niveau du locus C19MC (données non montrées et Figure 6 (droite)). Les inventeurs ont également constaté qu'en absence de Drosha, DGCR8 est redistribuée dans le noyau, ainsi que dans le nucléole (données non montrées).
Exemple 4: Visualisation du recrutement de GFP-DGCR8 dans les cellules vivantes
Afin d'élucider le mécanisme par lequel le Microprocesseur est dirigé vers les transcrits du locus C19MC, les cellules JEG3 ont été transfectées par le plasmide codant pour la protéine DGCR8, couplée à GFP selon les techniques bien connues de l'homme du métier.
Les inventeurs ont montré que la protéine DGCR8 couplée à la GFP se concentre au niveau du locus C19MC (Figure 7). Des signaux en forme de doublet au niveau de C19MC sont également visibles sur des cellules vivantes, ce qui indique que ces signaux ne sont pas des artefacts liés aux étapes de fixation et/ou d'hybridation. En outre, les signaux détectés liés au marqueur GFP sont co-localisés avec les signaux d'ARN autour des sites de transcription, mais aussi avec les signaux observés dans l'ensemble du noyau. Ceci suggère que les pri-miARNs peuvent se trouver à des localisations autres que leurs sites de transcription.
Exemple 5: Visualisation du recrutement de GFP-Drosha dans les cellules vivantes
Comme décrit dans l'exemple 4, des cellules JEG3 ont été transfectées par le plasmide codant pour la protéine Drosha, couplée à GFP selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Les inventeurs ont ainsi montré que la protéine Drosha couplée à la GFP se concentre également au niveau du locus C19MC (Figure 8).
Exemple 6 : Les protéines associées au Microprocesseur
DGCR8 et Drosha sont nécessaire et suffisant pour permettre la maturation des pri-miARNs. Cependant, une analyse protéomique a mis en évidence d'autre protéine associées au Microprocesseur comme par exemple des hélicases à ARN, des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP) et d'autres protéines présentant un motif de liaison ARN. Les techniques mises en œuvre pour visualiser la biogénèse des pri-miARNs au niveau du locus C19MC ont permis aux inventeurs de déterminer la présence d'autres protéines liant l'ARN. Les inventeurs ont ainsi montré que la présence de hnRNP C1/C2, EWS, ILF3/NFAR/NF90 et RNA hélicase A (RHA) au niveau du locus C19MC (données non montrées), ce qui indique que ces protéines jouent vraisemblablement un rôle dans la synthèse, l'organisation intra nucléaire et la maturation des pri-miARNs codés par le locus C19MC. Le recrutement des hnRNP C1/C2 est spécifique puisque les hnRNP Al et d'autres hnRNP analysés, tels que les hnRNP M1M2, U et A2/B1, ne se retrouvent pas concentrés au niveau du locus C19MC. Les inventeurs ont également montré que la nucléoline, les hnRNP Al, les hélicases à ARN p68 et 672, ou encore les exosomes (PSsclOO), ne se retrouvent pas concentrés de manière significative au niveau du locus C19MC (données non montrées).
Exemple 7: Détection de la biogénèse de microARNs par immunofluorescence dirigée contre les protéines du Microprocesseur Protocole
Des cellules JEG3 sont cultivées sur des lamelles en verre préalablement traitées à 1% gélatine. Ces cellules sont fixées pendant 15 minutes à température ambiante par 4% de paraformaldéhyde dans du tampon phosphate salin (PBS). Les cellules ainsi fixées subissent par la suite une étape de perméabilisation pendant 5 à 7 minutes à une température de 4°C dans un milieu constitué de Triton X-100 concentré à 0.4% dans PBS.
Les cellules sont ensuite incubées dans une chambre humide avec successivement les anticorps primaires anti-Drosha et anti-DGCR8 dans un milieu PBS1X/1%BSA comme décrit ci après: les cellules sont incubées avec un anticorps primaire anti-DGCR8 à une dilution de 1/300 et à température ambiante. Un tel anticorps est commercialisé par Santa cruz sous la dénomination "sc-48473".
les cellules sont également incubées avec un anticorps primaire anti-Drosha à une dilution de 1/300 et à une température de 37°C. Un tel anticorps est commercialisé par Abcam sous la dénomination "ab 12286".
Les cellules subissent ensuite 3 lavages de 10 minutes dans du PBS à température ambiante.
Les cellules sont ensuite incubées avec les anticorps secondaires respectivement dirigés contre les anticorps anti-DGCR8 et anti-Drosha comme décrit ci après:
les cellules sont incubées avec un anticorps anti-DGCR8 à une dilution d'environ 1/500 et à température ambiante. De tels anticorps sont commercialisés par la société Invitrogen sous les références Al 1055 et A21432:
>■ les cellules sont également incubées avec des anticorps anti-Drosha et à une dilution de 1/500 et à une température de 37°C. De tels anticorps sont commercialisés par la société Invitrogen sous les références A21206, ou A31572.
Les cellules subissent ensuite 3 lavages de 10 minutes dans du PBS à température ambiante.
Les lamelles sont ensuite montées au Moviol/DAPI à une concentration de
O. ^g/ml. La présence de DAPI dans le milieu de montage permet la visualisation de l'ADN nucléaire. Résultat
Comme montré sur la figure 9, les inventeurs ont réussi à mettre en œuvre une technique permettant la visualisation simultanée des sites de transcription des cellules traitées selon le procédé de l'invention, du recrutement de la DGCR8 et du recrutement de la protéine Drosha. La superposition des signaux témoigne de la pertinence du procédé pour le suivi de la biogénèse de micro ARNs.
Exemple 8: Suivi de la biogénèse de microARNs de manière automatisée
Les inventeurs ont mis en œuvre le protocole tel que défini à l'exemple 6 en cultivant les cellules JEG3 sur des plaques-96 puits qui sont classiquement utilisées lorsqu'il s'agit de développer des stratégies de criblages à haut débit. Comme l'indique la partie A de la figure 9, la grande majorité des noyaux (ici révélés par marquage au DAPI) présente un immunofluorescent (IF) évident (illustré ici par la détection de DGCR8). Fait remarquable, le rapport signal/bruit est tel qu'il permet une reconnaissance automatisée et hautement spécifique par des logiciels d'imagerie (partie B de la figure 9). La figure 10 illustre la détection de la protéine DGCR8 selon ce protocole et à l'aide d'un tel logiciel.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de visualisation de la biogénèse d'au moins un micro ARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
i) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps choisi parmi les anticorps dirigés contre une protéine choisie parmi la protéine DGCR8 (DiGeorge syndrome critical région gene 8), la protéine Drosha et leurs fragments, ledit anticorps étant couplé à un marqueur; et
ii) la détection dudit marqueur.
2. Procédé de visualisation de la biogénèse d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps primaire choisi parmi les anticorps dirigés une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha et leurs fragments; puis
b) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps secondaire spécifique de ou des anticorps primaire(s) de l'étape a); et
c) la détection dudit marqueur.
3. Procédé de visualisation de la biogenèse d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha, et leurs dérivés, laquelle protéine est couplée à un marqueur ;
> l'expression de ladite protéine couplée audit marqueur ; et
la détection dudit marqueur.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite protéine est la protéine DGCR8 ou son dérivé choisie dans le groupe constitué de l'isoforme CRA_a d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX02998 ou NP_073557), l'isoforme CRA_b d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX02999), l'isoforme CRA_c d'Homo sapiens (numéro d'accession EAX03000), l'isoforme CRA_a de Mus musculus (numéro d'accession EDK97512, EDK97515, NP_201581), l'isoforme CRA_b de Mus musculus (numéro d'accession EDK97513), l'isoforme CRA_c de Mus musculus (numéro d'accession EDK97514), l'isoforme CRA_a de Rattus norvégiens (numéro d'accession EDL77930, EDL77931), l'isoforme CRA_b de Rattus norvégiens (numéro d'accession EDL77932) et leurs dérivés.
5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur fluorescent, de préférence ledit marqueur fluorescent est la GFP (Green Fluorescent Protein).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que ledit marqueur est un marqueur protéique.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite protéine couplée à un marqueur protéique est une protéine de fusion, de préférence une protéine de fusion DGCR8-GFP ou Drosha-GFP et de manière particulièrement préférée la protéine de fusion DGCR8-GFP présentant la séquence SEQ ID N°12.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'étape de détection de la fluorescence se fait par microscopie.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite cellule est une cellule de placenta, de préférence une cellule humaine de placenta.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite cellule de placenta est une cellule issue d'un choriocarcinome, de préférence ladite cellule est choisie dans le groupe comprenant les lignées de choriocarcinome humains JEG 3 (ATCC HTB-36), JAR (ATCC HTB-144) et BeWo (ATCC CCL-98).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit microARN est codé par le locus chromosomique C19MC (chromosome 19 miRNA cluster), de préférence ledit microARN est choisi dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N°13 à 58.
12. Procédé de criblage de composés capables de moduler l'expression d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: la transformation de ladite cellule par un vecteur codant pour une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha, et leurs dérivés, laquelle protéine est couplée à un marqueur ;
l'expression de ladite protéine couplée audit marqueur ;
la mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester;
la mesure de l'expression dudit marqueur en présence et en absence dudit composé à tester; et
la sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression dudit marqueur.
13. Procédé de criblage de composés capables de moduler l'expression d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
1) la mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester;
2) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps choisi parmi les anticorps dirigés contre une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha et leurs fragments, ledit anticorps étant couplé à un marqueur;
3) la détection dudit marqueur en présence et en absence dudit composé à tester; et
4) la sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression du marqueur.
14. Procédé de criblage de composés capables de moduler l'expression d'au moins un microARN, de préférence un groupe de microARNs, dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
A) la mise en contact de ladite cellule avec un composé à tester;
B) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps primaire choisi parmi les anticorps dirigés contre une protéine choisie parmi la protéine DGCR8, la protéine Drosha et leurs fragments; puis
C) l'incubation de la cellule avec au moins un anticorps secondaire spécifique de ou des anticorps primaire(s) de l'étape B);
D) la détection dudit marqueur en présence et en absence dudit composé à tester; et
E) la sélection du ou des composés permettant d'induire une diminution ou une augmentation, de préférence une diminution, de l'expression du marqueur.
15. Procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que lesdits composés à tester sont des siRNA.
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