EP2449105A2 - Utilisation d'arn interferents pour le traitement d'une infection par le vih - Google Patents

Utilisation d'arn interferents pour le traitement d'une infection par le vih

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EP2449105A2
EP2449105A2 EP10745345A EP10745345A EP2449105A2 EP 2449105 A2 EP2449105 A2 EP 2449105A2 EP 10745345 A EP10745345 A EP 10745345A EP 10745345 A EP10745345 A EP 10745345A EP 2449105 A2 EP2449105 A2 EP 2449105A2
Authority
EP
European Patent Office
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seq
mir
hsa
interfering rna
mirna
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10745345A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Vincent Calvez
Anne-Geneviève MARCELIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Pierre et Marie Curie
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Original Assignee
Universite Pierre et Marie Curie
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite Pierre et Marie Curie, Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP filed Critical Universite Pierre et Marie Curie
Publication of EP2449105A2 publication Critical patent/EP2449105A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine, and more particularly to the treatment of infections with the HIV virus.
  • it relates to interfering RNAs capable of specifically blocking the replication of a strain of HIV virus resistant to an antiretroviral compound and their use for the treatment of infections with this type of virus.
  • the human immunodeficiency virus or HIV
  • HIV is a lentivirus-like retrovirus that infects humans and is responsible for the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • antiretroviral therapies to delay the onset of AIDS, by contrast, no vaccine or definitive treatment is available at this time.
  • HIV has an envelope composed in part of the membrane of the infected cell from which it is derived and of two types of glycoproteins, namely gp120 and gp41. Inside the envelope is a protein matrix composed of p17 proteins and containing the capsid consisting of p24 proteins and the nucleocapsid consisting of p6 and p7 proteins.
  • the HIV genome is a single-stranded RNA that is contained in the capsid in the presence of two enzymes, the p64 reverse transcriptase necessary for the transcription of the viral RNA into DNA, and the p32 integrase necessary for the integration of the Viral DNA in the DNA of the infected cell. These two enzymes as well as the protease plO which participates in the assembly of the viral particle, are specific for retroviruses and are therefore the main targets of antiretroviral treatments.
  • HIV resistance to antiretrovirals is a major problem in antiretroviral therapy because it leads to a decrease in the efficacy of treatments and an increase in patient mortality.
  • MiRNAs are single-stranded RNAs of about 21 to 24 nucleotides in length.
  • miRNAs are post-transcriptional repressors: by pairing with messenger RNAs, they guide their degradation, or the repression of their translation into protein.
  • the miRNA genes are transcribed as long precursors called "pri-miRNAs".
  • pre-miRNA an intermediate product called "pre-miRNA” by a complex named Microprocessor which is formed in animals by the enzymes Drosha and DGCR8 (Di George Critical Region 8 or Pasha) and in plants by an enzyme of the Dicer family.
  • the pre-miRNA is an RNA about 70 nucleotides long, folded into imperfect stem-loop by complementarity of bases between the first half and the second half of its sequence.
  • This pre-miRNA is transported from the nucleus to the cytosol by active GTP-dependent transport through interaction with exportin 5.
  • the pre-miRNA is then cleaved into the cytoplasm by an enzyme from the Dicer family to release a small double-stranded RNA.
  • RNA-induced Silencing Complex RNA-induced Silencing Complex
  • This complex of about 16OkDa has been described as being sufficient for translation repression miRNA activity.
  • other proteins such as geminine can also be added to the complex.
  • the double-stranded miRNA becomes single stranded and only the strand specific target mRNA is retained.
  • the target mRNA is then loaded into the RISC complex. At this stage, two paths are then possible depending on the composition of the complex. In the case where the complex contains the Ago2 protein, the target mRNA will be degraded. If the complex contains the Agol protein, the translation of the target mRNA will then be repressed.
  • the object of the present invention is to provide novel compounds that can be used in the treatment of an HIV virus strain resistant to an antiretroviral compound.
  • the inventors have demonstrated the existence of miRNAs capable of hybridizing preferentially to the genes of HIV strains resistant to antiretrovirals, in particular inhibitors of integrase or reverse transcriptase.
  • the studies presented in this document show that these miRNAs possess antiviral activity and are particularly capable of blocking the replication and viral production of HIV.
  • the present invention relates to an interfering RNA that hybridises preferentially with the mRNA of a gene coding for a mutant protein of a strain of the HIV virus, said mutant protein containing one or more mutations conferring on the viral strain a phenotype. resistance to an antiretroviral compound, for use in treating an infection with a strain of HIV virus resistant to said antiretroviral compound.
  • the HIV virus is the HIV-1 virus.
  • the interfering RNA is selected from the group consisting of siRNA, ssRNA, and miRNA.
  • the interfering RNA is a miRNA.
  • the mutant protein is selected from the group consisting of reverse transcriptase, protease, glycoprotein gp41 and integrase.
  • the mutant protein is the integrase of the HIV-1 virus and the antiretroviral compound is an integrase inhibitor, preferably the raltegravir or elvitegravir.
  • the integrase contains one or more mutations conferring on the viral strain a phenotype of resistance to said integrase inhibitor, wherein the mutated residues of the integrase are selected from the group consisting of the residue T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 and R263 of SEQ ID No. 1, and a combination thereof.
  • the mutation (s) are selected from the group consisting of E92Q, G 140S, G 140A and Y143R, and a combination thereof.
  • the interfering RNA is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-18a (SEQ ID No: 2), hsa-miR-92a-1 (SEQ ID No: 3), hsa- miR-185 * (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID NO: 5), hsa-miR-370 (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-518c * (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-595 (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-613 (SEQ ID NO: 9), hsa-miR-939 (SEQ ID NO: 10), hsa-miR-1228 * (SEQ ID NO: 11), hsa-miR-1231 (SEQ ID NO: 12) and hsa-miR-1909 (SEQ ID NO: 13), and a combination
  • the mutant protein is HIV-1 reverse transcriptase and the antiretroviral compound is a reverse transcriptase inhibitor.
  • the reverse transcriptase contains one or more mutations conferring on the viral strain a resistance phenotype to said reverse transcriptase inhibitor, the mutated residue (s) of the reverse transcriptase being chosen from the group consisting of residue D67 and T215 of SEQ. ID No. 14, and a combination thereof.
  • PARN interferes is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-138 (SEQ ID NO: 15) and hsa- miR-609 (SEQ ID No: 16), and a combination of those this.
  • the present invention relates to an expression vector comprising a nucleotide sequence coding for one of the interfering RNAs used according to the invention or coding for a precursor thereof, for use in the treatment of a infection with a strain of HIV resistant to an antiretroviral compound.
  • the present invention also relates to an interfering RNA that preferentially hybridizes with the mRNA of a gene encoding a mutant protein of a strain of the HIV virus, said mutant protein containing one or more mutations conferring on the viral strain a phenotype of resistance to an antiretroviral compound, or an expression vector comprising a sequence nucleotide encoding said interfering RNA or a precursor thereof for use in combination with said antiretroviral compound in the treatment of HIV infection.
  • the antiretroviral compound is an integrase or reverse transcriptase inhibitor.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one interfering RNA according to the invention and / or an expression vector according to the invention, and one or more pharmaceutically acceptable excipients and / or vehicles.
  • the pharmaceutical composition comprises at least one miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-185 * (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-370 (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-518c * (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-595 (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-609 (SEQ ID NO: 16), hsa-miR-613 (SEQ ID NO: 9), hsa- miR -939 (SEQ ID NO: 10), hsa-miR-1228 * (SEQ ID NO: 11), hsa-miR-1231 (SEQ ID NO: 12) and hsa-miR-1909
  • the inventors have identified miRNA sequences capable of binding specifically to the nucleotide sequences of HIV strains carrying resistance mutations to an antiretroviral compound. They have also demonstrated that these miRNAs are thus capable of blocking particularly efficiently the viral replication of said resistant strains.
  • the present invention relates to an interfering RNA that preferentially hybridizes with the mRNA of a gene encoding a mutant protein of a strain of the HIV virus, said mutant protein containing one or more mutations conferring the viral strain a phenotype of resistance to an antiretroviral compound, for use in the treatment of an infection with a strain of HIV virus resistant to said antiretroviral compound.
  • RNA interference is a phenomenon well known to those skilled in the art which makes it possible to specifically inhibit the expression of the target gene at the post-transcriptional level.
  • the term "interfering RNA” or “RNAi” as used herein refers to any single or double stranded RNA that interferes with a specific messenger RNA thereby leading to its degradation and / or decrease in her protein translation. This term encompasses small interfering RNAs (siRNAs), double-stranded RNAs (dsRNAs), single-stranded RNAs (ssRNAs), short hairpin RNAs (ssRNAs), DNA-directed RNAi (ddARNi) and microRNAs (miRNAs). .
  • siRNAs small interfering RNAs
  • dsRNAs double-stranded RNAs
  • ssRNAs single-stranded RNAs
  • ssRNAs short hairpin RNAs
  • ddARNi DNA-directed RNAi
  • miRNAs microRNAs
  • the interfering RNAs used according to the invention may be in single-stranded or duplex form or in a mixture of both. They may contain modified nucleotides or chemical modifications allowing them, for example, to increase their resistance to nucleases and thus to increase their lifespan in the cell. They may in particular comprise at least one modified or non-natural nucleotide such as, for example, a nucleotide comprising a modified base, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine or diamino. -2.6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization.
  • modified nucleotide such as, for example, a nucleotide comprising a modified base, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine or diamino. -2.6-purine, bromo-5-de
  • interfering RNAs used according to the invention can also be modified at the level of the internucleotide linkage, for example phosphorothioates,
  • H-phosphonates or alkyl-phosphonates or at the level of the backbone such as alpha-oligonucleotides, 2'-O-alkyl ribose or PNA (Peptid Nucleic
  • the interfering RNAs can be natural, synthetic RNA or produced by recombinant techniques. These interfering RNAs can be prepared by any method known to those skilled in the art such as, for example, chemical synthesis, library screening, in vivo transcription or recombinant DNA or amplification techniques.
  • the interfering RNA is selected from the group consisting of siRNA, ssRNA, and miRNA.
  • the interfering RNA is a siRNA in double-stranded form of about 15 to 50 nucleotides in length, preferably about 15 to 30 nucleotides.
  • SiRNAs are perfectly complementary to their target mRNAs.
  • PARN interferes is a ssRNA in single-stranded, stem-loop form, of about 25 to 30 nucleotides and whose loop size varies between 4 to 23 nucleotides.
  • the interfering RNA is a miRNA.
  • miRNA or “microRNA” encompasses single-stranded and double-stranded miRNAs.
  • the miRNAs are in double-stranded form.
  • MiRNAs are partially complementary of their target mRNAs and have a size of between 10 and 25 nucleotides, preferably between 20 and 25 nucleotides.
  • the miRNAs used according to the invention can be administered in the form of precursors.
  • miRNAs can be administered in the form of pre-miRNAs or pri-miRNAs.
  • Pri miRNAs are miRNA precursors that are cleaved into the nucleus of cells to form pre-miRNAs.
  • a pri-miRNA may include one or more pre-miRNAs.
  • Pre-miRNAs are also precursors of miRNAs. They comprise between 60 and 80 nucleotides and are folded into an imperfect stem-loop structure. These pre-miRNAs are cleaved into the cytoplasm to form double-stranded miRNAs and then single-stranded miRNAs capable of interacting with a protein from the Argonaute family to form the RISC complex that either the target mRNA is degraded or the translation this mRNA is repressed.
  • hybridizing herein means that Watson-Crick hydrogen bonds can be established between the complementary bases of two nucleic acid strands to form a duplex.
  • preferentially hybridizing herein means that the interfering RNA used according to the invention is capable of hybridizing to a gene or a transcript encoding a mutant protein of a strain of HIV virus in Hybridization conditions of high or medium stringency.
  • the ability of the interfering RNA used according to the invention to preferentially hybridize to a gene or a transcript coding for a mutant protein of a strain of the HIV virus can also be evaluated by means of a competition test.
  • the interfering RNA is placed in the presence of an equivalent amount (i) of the gene or transcript of a protein of a strain of HIV not resistant to an antiretroviral compound and (ii) the gene or transcript of the same protein from an HIV strain resistant to an antiretroviral compound and carrying one or more mutations. This mixture is produced under conditions of medium or high stringency for hybridization.
  • the interfering RNA preferentially hydrides to a gene or a transcript encoding a mutant protein of an HIV strain if, under these conditions, at least 60% interfering RNA hybridizes with the gene or transcript of the mutant protein, preferably at least 70%, and most preferably at least 80%, at least 90% or at least 95%, and less 40% of the interfering RNA hybridizes with the gene or transcript of the unmutated protein, preferably less than 20%, less than 15%, less than 10% or less than 5%.
  • interfering RNA used according to the invention to preferentially hybridize to a gene or a transcript coding for a mutant protein of a strain of the HIV virus can also be evaluated by means of bio-computer tools well known to the patient. skilled person.
  • mRNA of a gene encoding a protein is used to designate the ribonucleotide sequence derived from the transcription of the gene coding for the corresponding protein. This term includes the 3 'and 5' untranslated regions (3'-UTR and 5'-UTR), the exons and possibly unsprayed introns.
  • the HIV virus can be of the HIV-1 or HIV-2 type, preferably of the HIV-1 type.
  • antiretroviral-resistant HIV virus strain refers to an HIV strain for which the administration of said antiretroviral compound has no effect, or has a diminished effect, on replication or viral production.
  • the mutant protein conferring on the viral strain a phenotype of resistance to an antiretroviral compound may be any protein encoded by the genome of the HIV virus such as, for example, reverse transcriptase, protease, glycoprotein gp41, integrase, pi7 protein, p24 protein, p7 protein, p6 protein or glycoprotein gp120.
  • the mutant protein is selected from the group consisting of reverse transcriptase, protease, glycoprotein gp41 and integrase.
  • antiretroviral compound refers to a molecule used for the treatment of retro-virus related infections, including HIV. These molecules are essentially directed against enzymes or other molecules specific for this type of virus.
  • the antiretroviral molecules may be reverse transcriptase inhibitors, ie nucleoside inhibitors such as zidovudine, lamivudine, emtricitabine, didanosine, stavudine, abacavir, zalcitabine or tenofovir, non-nucleoside inhibitors such as efavirenz, nevirapine, etravirine or delavirdine, or nucleotide analogues such as tenofovir or fosalvudine; protease inhibitors such as amprenavir, tipranavir, indinavir, saquinavir, fosamprenavir, ritonavir, darunavir, atazanavir or nelfinavir;
  • the mutant protein is the integrase and the antiretroviral compound is an integrase inhibitor.
  • integrase inhibitors block the action of integrase and thus prevent the viral genome from binding to that of the target cell.
  • the integrase contains one or more mutations conferring on the viral strain a phenotype of resistance to an integrase inhibitor, preferably raltegravir (Isentress or MK-0518, CAS No. 518048-05 -0) or elvitegravir (JTK-303 or GS 9137, CAS No. 697761-98-1).
  • the mutated residue (s) are selected from the group consisting of the residue T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 and R263 of SEQ ID No. 1, and a combination of these.
  • the mutated residue (s) are selected from the group consisting of the residue E92, G140 and Y143 of SEQ ID No. 1, and a combination thereof.
  • the one or more mutations are selected from the group consisting of E92Q, G140S, G140A, Y143R and Y143C, and a combination thereof.
  • Amino acid residues are identified herein by the one-letter code of the amino acid and its position within the protein sequence.
  • the universally recognized one-letter amino acid code is: G for Glycine, P for Proline, A for Alanine, V for Valine, L for Leucine, I for Isoleucine, M for Methionine, C for Cysteine, F for Phenylalanine, Y for Tyrosine, W for Tryptophan, H for Histidine, K for Lysine, R for Arginine, Q for Glutamine, N for Asparagine, E for Glutamic Acid, D for Aspartic Acid, S for Serine and T for Threonine.
  • the residue T66 thus corresponds to a threonine at position 66 of the protein sequence.
  • amino acid mutations are identified herein by the one-letter code of the mutated amino acid followed by its position within the protein sequence and the one-letter code of the amino acid substituting for the amino acid mutant. initial amino acid.
  • the E92Q mutation corresponds to the substitution of glutamic acid at position 92 with glutamine.
  • the mutant protein is the integrase
  • the antiretroviral compound is an integrase inhibitor
  • the interfering RNA used according to the invention is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-18a (SEQ ID No: 2), hsa-miR-92a-1 (SEQ ID No: 3), hsa-miR-185 * (SEQ ID NoA), hsa-miR-219-1-3p (SEQ ID No: 5) , hsa-miR-370 (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-518c * (SEQ ID NO: 7), hsamR-595 (SEQ ID No: 8), hsa-miR-613 (SEQ ID No : 9), hsa-miR-939 (SEQ ID NO: 10), hsa-miR-1228 * (SEQ ID NO: 11), hsa-miR-1231
  • miRNA is selected from the group consisting of hsa-miR-185 * (SEQ ID NOA), hsa-miR-370 (SEQ ID No: 6), hsa-miR-518c * (SEQ ID No: 7). ), hsa-miR-595 (SEQ ID NO: 8), hsamR-939 (SEQ ID No: 10), hsa-miR-1228 * (SEQ ID No: 11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No: 12) and hsa-miR-1909 (SEQ ID No: 13), and a combination thereof.
  • SEQ ID NOA hsa-miR-185 *
  • hsa-miR-370 SEQ ID No: 6
  • hsa-miR-518c * SEQ ID No: 7
  • hsa-miR-595 SEQ ID NO: 8
  • hsamR-939 SEQ ID No: 10
  • miRNA is selected from the group consisting of hsa-miR-518c * (SEQ ID No: 7), hsa-miR-939 (SEQ ID No: 10), hsa-miR-1231 (SEQ ID No : 12) and hsa-miR-1909 (SEQ ID NO: 13), and a combination thereof.
  • the integrase comprises the mutation E92Q in SEQ ID No. 1 and the interfering PARN used according to the invention is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-1231 (SEQ ID No: 12) , hsa-miR-370 (SEQ ID No: 6) and hsa-miR-18a (SEQ ID No: 2), and a combination thereof.
  • the integrase comprises the G140S mutation in SEQ ID No.
  • the interfering PARN used according to the invention is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-939 (SEQ ID No: 10 ) and hsa-miR-185 * (SEQ ID No. A), and a combination thereof.
  • the integrase comprises the G140A mutation in SEQ ID No. 1 and the interfering RNA used according to the invention is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-92a-1 ( SEQ ID NO: 3) and hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID NO: 5), and a combination thereof.
  • the integrase comprises the Y143C mutation in SEQ ID No. 1 and the interfering RNA used according to the invention is miRNA hsa-miR-1909 (SEQ ID No: 13).
  • the integrase comprises the mutation Y143R in SEQ ID No. 1 and the interfering RNA used according to the invention is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-613 (SEQ ID No: 9) and hsa-miR-1228 * (SEQ ID No: 11), and a combination thereof.
  • the mutant protein is reverse transcriptase and the antiretroviral compound is a reverse transcriptase inhibitor.
  • the reverse transcriptase contains one or more mutations conferring on the viral strain a phenotype of resistance to a reverse transcriptase inhibitor.
  • the mutated residue (s) are selected from the group consisting of residue D67 and T215 of SEQ ID No. 14, and a combination thereof.
  • the mutant protein is reverse transcriptase
  • the antiretroviral compound is a reverse transcriptase inhibitor
  • the interfering RNA used according to the invention is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-138 (SEQ ID No: 15) and hsa-miR-609 (SEQ ID No: 16), and a combination thereof.
  • the interfering RNAs used according to the invention are capable of blocking or reducing the replication and / or viral production of a strain of HIV virus resistant to an antiretroviral compound.
  • decrease is meant a decrease of at least 30, 40, 50, 60, 70, 80 or 90% in viral replication and / or viral production.
  • interfering RNAs used according to the invention can be administered in the form of precursors or DNA molecules coding for them.
  • the present invention relates to an expression vector comprising a nucleotide sequence coding for an interfering RNA that hybridizes preferentially with the mRNA of a gene encoding a mutant protein of a strain of the HIV virus, said mutant protein containing one or more mutations conferring on the viral strain a resistance phenotype to an antiretroviral compound, or encoding a precursor thereof, for use in the treatment of an infection with a strain of the HIV virus resistant to an antiretroviral compound.
  • the expression vector according to the invention comprises the elements allowing the expression of said nucleotide sequence in eukaryotic cells.
  • Such vectors are well known to those skilled in the art and have in particular been described in the patent application WO 06/085016 or in the articles of Barton and Medzhitov, 2002; Tiscornia et al, 2004; Xia et al, 2002 and Shen et al, 2003.
  • the present invention also relates to an interfering RNA that hybridises preferentially with the mRNA of a gene encoding a mutant protein of a strain of the HIV virus, said mutant protein containing one or more mutations conferring on the viral strain a phenotype of resistance to an antiretroviral compound, or an expression vector comprising a nucleotide sequence encoding said interfering RNA or a precursor of said RNA, for use in combination with said antiretroviral compound in the treatment of HIV infection.
  • RNA interferes or the expression vector used according to the invention is as described above.
  • the antiretroviral compound is an integrase inhibitor or a reverse transcriptase inhibitor.
  • the antiretroviral compound is an integrase inhibitor and the interfering RNA is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-18a (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-92a-1 (SEQ ID NO: 3), hsa-miR-185 * (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID NO: 5), hsa-miR-370 (SEQ ID NO: 6) ), hsa-miR-518c * (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-595 (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-613 (SEQ ID NO: 9), hsa-miR-939 (SEQ ID No: 10), hsa-miR-1228 * (SEQ ID No: 11), hsa- miR-1231 (SEQ ID No: 12) and hsa miRNA selected from the group
  • the antiretroviral compound is a reverse transcriptase inhibitor and the interfering RNA is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-138 (SEQ ID No: 15) and hsa-miR-609 ( SEQ ID No: 16), and a combination thereof.
  • interfering RNA used according to the invention and the antiretroviral compound can be administered simultaneously, if necessary within the same composition, or sequentially.
  • the present invention also relates to an interfering RNA that hybridises preferentially with the mRNA of a gene encoding a mutant protein of a strain of the HIV virus, said mutant protein containing one or more mutations conferring on the viral strain a phenotype of resistance to an antiretroviral compound, or an expression vector comprising a nucleotide sequence coding for said interfering RNA or a precursor of said RNA, for the preparation of a medicament for the treatment of an infection by a strain of HIV virus resistant to said antiretroviral compound.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active ingredient, at least one interfering RNA that preferentially hybridizes with the mRNA of a gene encoding a mutant protein of a strain of the HIV virus.
  • said mutant protein containing one or more mutations conferring on the viral strain a phenotype of resistance to an antiretroviral compound, and / or at least one expression vector comprising a nucleotide sequence coding for said interfering RNA or a precursor of said RNA, and a or a number of pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers.
  • the interfering RNA included in the composition according to the invention can be any interfering RNA included in the composition according to the invention.
  • Interfering RNA as described in this application.
  • the interfering RNA is selected from the group consisting of siRNA, ssRNA, and miRNA.
  • the interfering RNA is a miRNA.
  • the interfering RNA is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-18a (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-92a-1 (SEQ ID NO: 3), hsa- miR -185 * (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID NO: 5), hsa-miR-370 (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-518c * (SEQ ID No: 7), hsa-miR-595 (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-613 (SEQ ID NO: 9), hsa-miR-939 (SEQ ID NO: 10), hsa-miR-1228 * (SEQ ID NO: 11), hsamR-1231 (SEQ ID NO: 12), hsa-miR-1909 (SEQ ID NO: 13), hsa-miR-
  • the interfering RNA is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-185 * (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-370 (SEQ ID NO: 6), hsa-miR -518c * (SEQ ID No: 7), hsa-miR-595 (SEQ ID No: 8), hsa-miR-609 (SEQ ID No: 16), hsa-miR-613 (SEQ ID No: 9), hsa-miR-939 (SEQ ID No: 10), hsamR-1228 * (SEQ ID No: 11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No: 12) and hsa-miR-1909 (SEQ ID No: 13), and a combination thereof.
  • hsa-miR-185 * SEQ ID NO: 4
  • hsa-miR-370 SEQ ID NO: 6
  • composition according to the invention may also further comprise one or more antiretroviral compounds such as reverse transcriptase inhibitors, protease inhibitors, fusion inhibitors, maturation inhibitors, or integrase inhibitors.
  • antiretroviral compounds such as reverse transcriptase inhibitors, protease inhibitors, fusion inhibitors, maturation inhibitors, or integrase inhibitors.
  • the latter may be inhibitors of the same type (inhibition of the same viral mechanism or of the same enzyme) or inhibitors of different types.
  • the composition according to the invention is a vaccine.
  • the vehicle of the present composition facilitates the penetration of the interfering RNA or the expression vector used according to the invention into the cells of the organism to be treated, and / or protects the interfering RNA or the vector expression of a possible degradation that may affect its effectiveness.
  • natural cationic polymers such as chitosan or atelocollagen
  • synthetic polymers such as poly (L-lysine), polyethyleneimine (PEI) or dendrimers, which form complexes with nucleic acids of the invention
  • liposomes cationic liposomes
  • galactosylated liposomes ligand coated liposomes enabling them to target a type of cells such as immuno liposomes coated with an antibody specific for the target cell (Zheng et al., 2009); liposomes arranged in a nanoparticle formed by polymers (Carmona et al., 2009) or multilayer films of polycations and polyanions.
  • composition according to the invention can be adapted for oral, sublingual, parenteral, topical, rectal or transdermal administration according to standard protocols well known to those skilled in the art.
  • the composition is adapted for oral administration, for example in the form of a tablet, a capsule, or an oral solution, or parenterally, in particular in the form of a injectable solution, especially intravenously, intradermally or subcutaneously.
  • interfering RNAs are administered at doses ranging from 0.1 to 20 mg per kilogram per day, preferably from 1 to 10 mg per kilogram per day. Administrations may be weekly or daily or repeated several times a day.
  • RNAs interfering agents may be administered in unit dose form comprising from 0.05 to 20 mg of interfering RNA, preferably from 0.1 to 5 mg.
  • the present invention further relates to an interfering RNA according to the invention as a medicament.
  • the interfering RNA is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-18a (SEQ ID No: 2), hsa-miR-92a- 1 (SEQ ID No: 3), hsa- miR-185 * (SEQ ID NoA), hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID No: 5), hsa-miR-370 (SEQ ID No: 6), hsa-miR-518c * (SEQ ID No: 7), hsa-miR-595 (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-613 (SEQ ID NO: 9), hsa-miR-939 (SEQ ID NO: 10), hsa-miR-1228 * (SEQ ID NO: 11), hsa-miR-1231 (SEQ ID NO: 12),
  • the interfering RNA is a miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-185 * (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-370 (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-518c * (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-595 (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-609 (SEQ ID NO: 16), hsa-miR-613 (SEQ ID NO: 9), hsa-miR -939 (SEQ ID NO: 10), hsa-miR-1228 * (SEQ ID NO: 11), hsa-miR-1231 (SEQ ID NO: 12) and hsa-miR-1909 (SEQ ID NO: 13), and a combination thereof.
  • hsa-miR-185 * SEQ ID NO: 4
  • hsa-miR-370 SEQ ID NO: 6
  • the present invention also relates to a method of treating an HIV virus strain resistant to an antiretroviral compound comprising administering to a subject, including human, a therapeutically effective amount of an interfering RNA, a expression vector or a pharmaceutical composition as defined above.
  • treatment refers to an improvement or disappearance of symptoms, a slowing of progression of the disease, a cessation of the course of the disease or a disappearance of the disease. This term includes both preventive and curative treatment.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount sufficient to have an inhibitory effect on replication and / or viral production.
  • the cells were cultured in DMEM medium with 5% fetal calf serum.
  • Plasmid pNL4-3 contains the complete genome of the wild strain of HIV-1 virus. Viral strains containing antiretroviral viral resistance mutations were obtained by site-directed mutagenesis by modifying plasmid pNL4-3. The viruses used in these experiments do not present other mutations. Viruses comprising the mutation E92Q (cag), E92Q (caa), G 140S (agc), G 140S (agt), G 140A
  • the interfering RNAs used in these experiments are double-stranded RNA whose sequence corresponds to a miRNA included in the following list: hsa-miR-18a (SEQ ID NO: 1]
  • Hela-P4 cells were contacted with this transfection solution before being incubated at 37 ° C (under 5% CO 2 ) for 4 to 6 hours. The cells were then washed and resuspended in DMEM medium with 5% fetal calf serum.
  • p24 antigenemia was measured in cultures transfected with and without miRNA. Inhibitory concentration 50, i.e., the concentration of miRNAs to decrease p24 antigen production by 50%, was calculated.
  • Measuring the production of p24 antigen at each concentration of miRNA made it possible to define the IC50 of the various miRNAs tested. The values of these IC50 are shown in the table below.

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Abstract

La présente invention concerne des ARN interférents, en particulier des miARN, capables de bloquer spécifiquement la réplication d'une souche de virus du VIH résistante à un composé antirétro viral, et leur utilisation pour le traitement des infections par ce type de virus.

Description

Utilisation d'ARN interférents pour le traitement d'une infection par le VIH
La présente invention relève du domaine de la médecine, et plus particulièrement de celui du traitement des infections par le virus du VIH. Elle concerne notamment des ARN interférents capables de bloquer spécifiquement la réplication d'une souche de virus du VIH résistante à un composé antirétroviral et leur utilisation pour le traitement des infections par ce type de virus.
Arrière-plan technologique de l'invention
Le virus de l'immunodéficience humaine, ou VIH, est un rétrovirus du genre des lentivirus qui infecte l'homme et est responsable du syndrome d'immunodéfîcience acquise (SIDA). Bien qu'il existe des traitements antirétroviraux permettant de retarder l'apparition du SIDA, en revanche, aucun vaccin ou traitement définitif n'est disponible à l'heure actuelle.
Le VIH dispose d'une enveloppe composée en partie de la membrane de la cellule infectée dont il est issu et de deux types de glycoprotéines, à savoir gpl20 et gp41. À l'intérieur de l'enveloppe, se trouve une matrice protéique composée de protéines pl7 et renfermant la capside constituée de protéines p24 et la nucléocapside constituée de protéines p6 et p7. Le génome du VIH est un ARN simple brin qui est contenu dans la capside en présence de deux enzymes, la transcriptase inverse p64 nécessaire à la transcription de l'ARN viral en ADN, et l'intégrase p32 nécessaire à l'intégration de l'ADN viral dans l'ADN de la cellule infectée. Ces deux enzymes ainsi que la protéase plO qui participe à l'assemblage de la particule virale, sont spécifiques des rétrovirus et sont donc les principales cibles des traitements antirétroviraux.
Dans les cinq dernières années, l'arsenal des antirétroviraux s'est enrichi de neuf nouvelles molécules et de trois nouvelles classes d'inhibiteurs. Les antirétroviraux ont pour but d'interférer avec différents mécanismes : d'une part, les enzymes du VIH nécessaires à sa réplication et d'autre part, ses mécanismes d'entrée dans la cellule. Les protéines cibles de ces molécules sont donc essentiellement la transcriptase inverse, l'intégrase, la protéase et la glycoprotéine gp41. Parmi les antirétroviraux les plus récents, le raltégravir, premier représentant de la classe des inhibiteurs de l'intégrase (INI), a récemment obtenu son Autorisation de Mise sur le Marché. L'elvitégravir, deuxième médicament de cette classe, est actuellement en essai clinique. Les résultats des différents essais cliniques ayant évalué l'utilisation de ces deux molécules sont très encourageants en ce qui concerne le succès virologique, la tolérance et la réponse immuno logique. Cependant, comme pour les autres antirétroviraux, des résistances aux INI apparaissent dans les études in vitro et in vivo. Ces résistances sont caractérisées par la sélection de mutations sur le gène de l'intégrase du VIH qui ont un impact sur la sensibilité du virus aux INI. Les mutations mises en évidence chez les patients en échec thérapeutique sont principalement localisées dans le domaine catalytique central de l'enzyme situé entre les acides aminés 50 et 212.
Le phénomène de résistance du VIH aux antirétroviraux est un problème majeur dans la thérapeutique antirétro virale car il entraîne une diminution de l'efficacité des traitements et une augmentation de la mortalité des patients.
De précédents travaux ont démontré l'interaction entre des micro ARN (miARN) et des virus. Les miARN sont des ARN simple-brin longs d'environ 21 à 24 nucléotides. Il existe plusieurs centaines de gènes de microARN dans les génomes de la plupart des organismes pluricellulaires et, à ce jour, environ 500 miARN ont été identifiés chez l'humain. Les miARN sont des répresseurs post-transcriptionnels : en s'appariant à des ARN messagers, ils guident leur dégradation, ou la répression de leur traduction en protéine. Les gènes de miARN sont transcrits sous la forme de longs précurseurs appelés « pri-miARN ». Ces précurseurs sont clivés dans le noyau en un produit intermédiaire appelé « pre-miARN » par un complexe nommé Microprocesseur qui est formé chez les animaux par les enzymes Drosha et DGCR8 (Di George Critical Région 8 ou Pasha) et chez les plantes par une enzyme de la famille Dicer. Le pre-miARN est un ARN long d'environ 70 nucléotides, replié en tige-boucle imparfaite par complémentarité de bases entre la première moitié et la deuxième moitié de sa séquence. Ce pre-miARN est transporté du noyau au cytosol par transport actif GTP- dépendant grâce à une interaction avec l'exportine 5. Le pre-miARN est ensuite clivé dans le cytoplasme par une enzyme de la famille Dicer pour libérer un petit ARN double-brin appelé « miARN». Ce miARN double brin interagit alors avec une protéine de la famille Argonaute (Agol ou Ago2) pour former le complexe RISC (RNA- induced Silencing Complex). Ce complexe d'environ 16OkDa a été décrit comme étant suffisant à l'activité des miARN de répression de la traduction. Cependant d'autres protéines telles que la geminine peuvent également s'ajouter au complexe. Au cours de la formation du complexe RISC, le miARN double brin devient simple brin et seul le brin spécifique de l'ARNm cible est conservé. L'ARNm cible est alors chargé au sein du complexe RISC. A ce stade, deux voies sont alors possibles selon la composition du complexe. Dans le cas où le complexe contient la protéine Ago2, l'ARNm cible sera dégradé. Si le complexe contient la protéine Agol, la traduction de l'ARNm cible sera alors réprimée.
Il a été précédemment démontré que certains miARN des cellules hôtes étaient capables de cibler des ARN viraux et possédaient donc un rôle antiviral ou au contraire permettaient au virus de s'accumuler dans la cellule. Cette situation a notamment été décrite pour le miARN hsa-miR-122a spécifiquement exprimé dans le foie et favorisant la réplication de IARN du virus de l'hépatite B (Chen et al, 2007).
Résumé de l'invention
L'objectif de la présente invention est de fournir de nouveaux composés pouvant être utilisés dans le traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante à un composé antirétroviral.
Les inventeurs ont démontré l'existence de miARN capables de s'hybrider préférentiellement aux gènes de souches de VIH résistantes aux antirétroviraux, notamment aux inhibiteurs de l'intégrase ou de la transcriptase inverse. Les études présentées dans ce document montrent que ces miARN possèdent une activité antivirale et sont notamment capables de bloquer la réplication et la production virale du VIH.
Ainsi, la présente invention concerne un ARN interfèrent qui s 'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH, ladite protéine mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un composé antirétroviral, pour une utilisation dans le traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante audit composé antirétroviral. De préférence, le virus VIH est le virus VIH-I.
Selon un mode de réalisation, l'ARN interfèrent est choisi dans le groupe constitué d'un ARNsi, d'un ARNsh et d'un miARN. De préférence, l'ARN interfèrent est un miARN.
Selon un mode de réalisation, la protéine mutante est choisie dans le groupe constitué de la transcriptase inverse, la protéase, la glycoprotéine gp41 et l'intégrase.
Selon un mode de réalisation particulier, la protéine mutante est l'intégrase du virus VIH-I et le composé antirétroviral est un inhibiteur d'intégrase, de préférence le raltégravir ou l'elvitégravir. Selon un mode de réalisation, l'intégrase contient une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance audit inhibiteur d'intégrase, le ou les résidus mutés de l'intégrase étant choisis dans le groupe constitué du résidu T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 et R263 de la SEQ ID No. 1, et une combinaison de ceux-ci. De préférence, la ou les mutations sont choisies dans le groupe constitué de E92Q, G 140S, G 140A et Y143R, et une combinaison de celles-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, l' ARN interfèrent est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-18a (SEQ ID No :2), hsa-miR-92a-l (SEQ ID No :3), hsa-miR-185* (SEQ ID No :4), hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID No :5), hsa-miR- 370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci.
Selon un autre mode de réalisation, la protéine mutante est la transcriptase inverse du virus VIH-I et le composé antirétro viral est un inhibiteur de la transcriptase inverse. De manière préférée, la transcriptase inverse contient une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance audit inhibiteur de transcriptase inverse, le ou les résidus mutés de la transcriptase inverse étant choisis dans le groupe constitué du résidu D67 et T215 de la SEQ ID No. 14, et une combinaison de ceux-ci. Selon un mode de réalisation particulier, PARN interfèrent est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-138 (SEQ ID No :15) et hsa- miR-609 (SEQ ID No :16), et une combinaison de ceux-ci.
Dans un second aspect, la présente invention concerne un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour l'un des ARN interférents utilisés selon l'invention ou codant pour un précurseur de celui-ci, pour une utilisation dans le traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante à un composé antirétro viral.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne également un ARN interfèrent qui s'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH, ladite protéine mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un composé antirétro viral, ou un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour ledit ARN interfèrent ou pour un précurseur de celui-ci, pour une utilisation en combinaison avec ledit composé antirétroviral dans le traitement d'une infection par le virus VIH. De préférence, le composé antirétroviral est un inhibiteur d'intégrase ou de transcriptase inverse.
Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un ARN interfèrent selon l'invention et/ou un vecteur d'expression selon l'invention, et un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables. De préférence, la composition pharmaceutique comprend au moins un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-185* (SEQ ID No :4), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-609 (SEQ ID No :16), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa- miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci. Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un ou plusieurs composés antirétro viraux.
Description détaillée de l'invention
Les inventeurs ont identifié des séquences de miARN capables de se fixer spécifiquement sur les séquences nucléotidiques de souches de VIH portant des mutations de résistance à un composé antirétroviral. Ils ont également démontré que ces miARN étaient ainsi capables de bloquer de manière particulièrement efficace la réplication virale desdites souches résistantes.
Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention concerne un ARN interfèrent qui s'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH, ladite protéine mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un composé antirétroviral, pour une utilisation dans le traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante audit composé antirétroviral.
L'interférence par l'ARN est un phénomène bien connu de l'homme du métier qui permet d'inhiber de manière spécifique l'expression du gène cible au niveau post- transcriptionnel. Le terme « ARN interfèrent » ou « ARNi », tel qu'utilisé dans le présent document, se réfère à tout ARN, simple ou double brin, qui interfère avec un ARN messager spécifique conduisant ainsi à sa dégradation et/ou à la diminution de sa traduction en protéine. Ce terme englobe les petits ARN interférents (ARNsi), les ARN bicaténaires (ARNdb), les ARN monocaténaires (ARNsb), les ARN courts à épingle à cheveux (ARNsh), les ARNi ADN-dirigés (ddARNi) et les microARN (miARN).
Les ARN interférents utilisés selon l'invention peuvent être sous forme simple brin ou en duplexe ou en un mélange des deux. Ils peuvent contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d'augmenter leur résistance aux nucléases et ainsi d'augmenter leur durée de vie dans la cellule. Ils peuvent notamment comprendre au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthyl- 5-désoxycytidine, la diméthylarnino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6- purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation.
Les ARN interférents utilisés selon l'invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les
H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme par exemple les alpha- oligonucléotides, les 2'-O-alkyl ribose ou les PNA (Peptid Nucleic
Acid) (M. Egholm et al, 1992).
Les ARN interférents peuvent être des ARN naturels, synthétiques ou produits par des techniques de recombinaison. Ces ARN interférents peuvent être préparés par toutes méthodes connues de l'homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, le criblage de banques, la transcription in vivo ou des techniques d'ADN recombinant ou d'amplification.
Selon un mode de réalisation, l'ARN interfèrent est choisi dans le groupe constitué d'un ARNsi, d'un ARNsh et d'un miARN.
Selon un mode de réalisation particulier, l'ARN interfèrent est un ARNsi sous forme double brin d'environ 15 à 50 nucléotides de longueur, de préférence d'environ 15 à 30 nucléotides. Les ARNsi sont parfaitement complémentaires de leurs ARNm cibles.
Selon un autre mode de réalisation particulier, PARN interfèrent est un ARNsh sous forme simple brin, en forme de tige-boucle, d'environ 25 à 30 nucléotides et dont la taille de la boucle varie entre 4 à 23 nucléotides.
Selon un mode de réalisation préférée, l'ARN interfèrent est un miARN. Le terme « miARN » ou « microARN » englobe les miARN simple brin et double brin. De préférence, les miARN sont sous forme double brin. Les miARN sont partiellement complémentaires de leurs ARNm cibles et ont une taille comprise entre 10 et 25 nucléotides, de préférence entre 20 et 25 nucléotides. Les miARN utilisés selon l'invention peuvent être administrés sous la forme de précurseurs. Les miARN peuvent notamment être administrés sous la forme de pré-miARN ou de pri-miARN. Les pri- miARN sont des précurseurs de miARN qui sont clivés dans le noyau des cellules pour former des pré-miARN. Un pri-miARN peut comprendre un ou plusieurs pré-miARN. Les pré-miARN sont également des précurseurs des miARN. Ils comprennent entre 60 et 80 nucléotides et sont repliés en une structure tige-boucle imparfaite. Ces pré-miARN sont clivés dans le cytoplasme pour former des miARN double-brin puis des miARN simple brin capables d'interagir avec une protéine de la famille Argonaute pour former le complexe RISC grâce auquel soit l'ARNm cible est dégradé, soit la traduction de cet ARNm est réprimée.
Le terme « qui s 'hybride » signifie, dans le présent document, que des liaisons hydrogène de type Watson-Crick peuvent s'établir entre les bases complémentaires de deux brins d'acide nucléique pour former un duplexe. Le terme « qui s'hybride préférentiellement » signifie dans le présent document que l'ARN interfèrent utilisé selon l'invention est capable de s'hybrider à un gène ou un transcrit codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH dans des conditions d'hybridation de forte ou de moyenne stringence. Les conditions de forte ou de moyenne stringence sont largement décrites dans la littérature, par exemple dans Sambrook et al., (1989), Maniatis et al., (1982 ou l'une de ses récentes rééditions) et dans Ausubel et al., (1995), et ces conditions peuvent être adaptées par l'homme du métier en fonction de la taille des fragments nucléotidiques, selon les enseignements appropriés connus.
La capacité de l'ARN interfèrent utilisé selon l'invention à s'hybrider préférentiellement à un gène ou un transcrit codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH peut également être évaluée au moyen d'un test de compétition. L'ARN interfèrent est mis en présence d'une quantité équivalente (i) du gène ou du transcrit d'une protéine d'une souche de VIH non résistante à un composé antirétroviral et (ii) du gène ou du transcrit de la même protéine issue d'une souche VIH résistante à un composé antirétroviral et portant une ou plusieurs mutations. Ce mélange est réalisé dans des conditions de moyenne ou de forte stringence permettant l'hybridation. L'ARN interfèrent s'hydride préférentiellement à un gène ou un transcrit codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH si, dans ces conditions, au moins 60% de l'ARN interfèrent s'hybride avec le gène ou le transcrit de la protéine mutante, de préférence au moins 70%, et de manière tout particulièrement préférée au moins 80%, au moins 90% ou au moins 95%, et si moins de 40% de l'ARN interfèrent s'hybride avec le gène ou le transcrit de la protéine non mutée, de préférence moins de 20%, moins de 15%, moins de 10% ou moins de 5%.
La capacité de l'ARN interfèrent utilisé selon l'invention à s'hybrider préférentiellement à un gène ou un transcrit codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH peut également être évaluée au moyen d'outils bio informatiques bien connus de l'homme du métier.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « ARNm d'un gène codant pour une protéine » est utilisé pour désigner la séquence ribonucléotidique issue de la transcription du gène codant pour la protéine correspondante. Ce terme englobe les régions en 3' et en 5' non traduites (3'-UTR et 5'-UTR), les exons et, éventuellement, les introns non épissés.
Le virus VIH peut être du type VIH-I ou VIH-2, de préférence du type VIH-I .
Tel qu'utilisé dans le présent document, le terme « souche de virus VIH résistante à un composé antirétroviral » désigne une souche de VIH pour laquelle l'administration dudit composé antirétroviral n'a pas d'effet, ou a un effet diminué, sur la réplication ou la production virale.
La protéine mutante conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un composé antirétroviral peut être toute protéine codée par le génome du virus du VIH telle que, par exemple, la transcriptase inverse, la protéase, la glycoprotéine gp41, l'intégrase, la protéine pi 7, la protéine p24, la protéine p7, la protéine p6 ou la glycoprotéine gpl20. De préférence, La protéine mutante est choisie dans le groupe constitué de la transcriptase inverse, la protéase, la glycoprotéine gp41 et l'intégrase.
Le terme « composé antirétroviral » tel qu'utilisé dans ce document, désigne une molécule utilisée pour le traitement des infections liées à des rétro virus, notamment au VIH. Ces molécules sont essentiellement dirigées contre les enzymes ou autre molécules spécifiques de ce type de virus. Les molécules antirétro virales peuvent être des inhibiteurs de la transcriptase inverse c'est-à-dire des inhibiteurs nucléosidiques tels que la zidovudine, la lamivudine, l'emtricitabine, la didanosine, la stavudine, l'abacavir, la zalcitabine ou le tenofovir, des inhibiteurs non nucléosidiques tels que l'efavirenz, le nevirapine, l'étravirine ou la delavirdine, ou des analogues nucléotidiques tels que le tenofovir ou la fosalvudine ; des inhibiteurs de la protéase tels que l'amprenavir, le tipranavir, l'indinavir, le saquinavir, le fosamprenavir, le ritonavir, le darunavir, l'atazanavir ou le nelfînavir ; des inhibiteurs de la fusion tels que l'enfuvirtide ; des inhitibiteurs d'entrée tels que le maraviroc, le vicriviroc ou le TNX-355 ; des inhibiteurs de maturation tels que le bevirimat ; ou des inhibiteurs d'intégrase tels que le raltégravir, l'elvitégravir ou le MK-2048.
Selon un mode de réalisation particulier, la protéine mutante est l'intégrase et le composé antirétroviral est un inhibiteur d'intégrase. Dans le cas d'un virus non résistant aux inhibiteurs d'intégrase, ces derniers bloquent l'action de l'intégrase et empêchent ainsi le génome viral de se lier à celui de la cellule cible. Selon ce mode de réalisation de l'invention, l'intégrase contient une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un inhibiteur d'intégrase, de préférence le raltégravir (Isentress ou MK-0518, numéro CAS 518048-05-0) ou l'elvitégravir (JTK-303 ou GS 9137, numéro CAS 697761-98-1). De manière particulière, le ou les résidus mutés sont choisis dans le groupe constitué du résidu T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 et R263 de la SEQ ID No. 1, et une combinaison de ceux-ci. De manière préférée, le ou les résidus mutés sont choisis dans le groupe constitué du résidu E92, G140 et Y143 de la SEQ ID No. 1, et une combinaison de ceux-ci. De manière tout particulièrement préférée, la ou les mutations sont choisies dans le groupe constitué de E92Q, G140S, G140A, Y143R et Y143C, et une combinaison de celles-ci.
Les résidus d'acides aminés sont identifiés dans le présent document par le code à une lettre de l'acide aminé et sa position au sein de la séquence protéique. Le code à une lettre des acides aminés universellement reconnu est le suivant : G pour Glycine, P pour Proline, A pour Alanine, V pour Valine, L pour Leucine, I pour Isoleucine, M pour Méthionine, C pour Cystéine, F pour Phénylalanine, Y pour Tyrosine, W pour Tryptophane, H pour Histidine, K pour Lysine, R pour Arginine, Q pour Glutamine, N pour Asparagine, E pour Acide Glutamique, D pour Acide Aspartique, S pour Serine et T pour Thréonine. A titre d'exemple, le résidu T66 correspond donc à une thréonine en position 66 de la séquence protéique.
Les mutations d'acides aminés sont identifiées dans le présent document par le code à une lettre de l'acide aminé muté suivi de sa position au sein de la séquence protéique et du code à une lettre de l'acide aminé se substituant à l'acide aminé initial. A titre d'exemple, la mutation E92Q correspond à la substitution de l'acide glutamique en position 92 par une glutamine.
Selon un mode de réalisation préférée, la protéine mutante est l'intégrase, le composé antirétroviral est un inhibiteur d'intégrase et l'ARN interfèrent utilisé selon l'invention est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-18a (SEQ ID No :2), hsa-miR-92a-l (SEQ ID No :3), hsa-miR-185* (SEQ ID No A), hsa-miR-219-1- 3p (SEQ ID No :5), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa- miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR- 1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci. De manière particulière, le miARN est choisi dans le groupe constitué hsa-miR-185* (SEQ ID No A), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa- miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci. D'une manière préférée, le miARN est choisi dans le groupe constitué hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR- 1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, l'intégrase comprend la mutation E92Q dans la SEQ ID No. 1 et PARN interfèrent utilisé selon l'invention est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6) et hsa-miR-18a (SEQ ID No :2), et une combinaison de ceux-ci. Selon un autre mode de réalisation particulier, l'intégrase comprend la mutation G140S dans la SEQ ID No. 1 et PARN interfèrent utilisé selon l'invention est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-939 (SEQ ID No :10) et hsa-miR-185* (SEQ ID No A), et une combinaison de ceux-ci. Selon encore un autre mode de réalisation particulier, l'intégrase comprend la mutation G140A dans la SEQ ID No. 1 et l'ARN interfèrent utilisé selon l'invention est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-92a- 1 (SEQ ID No :3) et hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID No :5), et une combinaison de ceux-ci. Selon encore un autre mode de réalisation particulier, l'intégrase comprend la mutation Y143C dans la SEQ ID No. 1 et l'ARN interfèrent utilisé selon l'invention est le miARN hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13). Selon encore un autre mode de réalisation particulier, l'intégrase comprend la mutation Y143R dans la SEQ ID No. 1 et l'ARN interfèrent utilisé selon l'invention est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-613 (SEQ ID No :9) et hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), et une combinaison de ceux-ci.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la protéine mutante est la transcriptase inverse et le composé antirétroviral est un inhibiteur de transcriptase inverse. Dans le cas d'un virus non résistant aux inhibiteurs de transcriptase inverse, ces derniers bloquent la synthèse d'ADN proviral à partir de l'ARN viral. Selon ce mode de réalisation de l'invention, la transcriptase inverse contient une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un inhibiteur de transcriptase inverse. De manière particulière, le ou les résidus mutés sont choisis dans le groupe constitué du résidu D67 et T215 de la SEQ ID No. 14, et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation préférée, la protéine mutante est la transcriptase inverse, le composé antirétroviral est un inhibiteur de transcriptase inverse et l'ARN interfèrent utilisé selon l'invention est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-138 (SEQ ID No :15) et hsa-miR-609 (SEQ ID No :16), et une combinaison de ceux-ci.
Les ARN interférents utilisés selon l'invention sont capables de bloquer ou diminuer la réplication et/ou la production virale d'une souche de virus VIH résistante à un composé antirétroviral. Par « diminution », il est entendu une diminution d'au moins 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% de la réplication virale et/ou de la production virale.
Les ARN interférents utilisés selon l'invention peuvent être administrés sous la forme de précurseurs ou de molécules d'ADN codant pour ceux-ci.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour un ARN interfèrent qui s 'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH, ladite protéine mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un composé antirétroviral, ou codant pour un précurseur de celui-ci, pour une utilisation dans le traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante à un composé antirétroviral.
Le vecteur d'expression selon l'invention comprend les éléments permettant l'expression de ladite séquence nucléotidique dans les cellules eucaryotes. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier et ont notamment été décrits dans la demande de brevet WO 06/085016 ou dans les articles de Barton and Medzhitov, 2002 ; Tiscornia et al, 2004 ; Xia et al, 2002 et Shen et al, 2003.
La présente invention concerne aussi un ARN interfèrent qui s 'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH, ladite protéine mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un composé antirétroviral, ou un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour ledit ARN interfèrent ou un précurseur dudit ARN, pour une utilisation en combinaison avec ledit composé antirétroviral dans le traitement d'une infection par le virus VIH.
L'ARN interfèrent ou le vecteur d'expression utilisé selon l'invention est tel que décrit ci-dessus.
De manière particulière, le composé antirétroviral est un inhibiteur d'intégrase ou un inhibiteur de transcriptase inverse.
Selon un mode de réalisation particulier, le composé antirétroviral est un inhibiteur d'intégrase et l'ARN interfèrent est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-18a (SEQ ID No :2), hsa-miR-92a-l (SEQ ID No :3), hsa-miR- 185* (SEQ ID No :4), hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID No :5), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa- miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le composé antirétroviral est un inhibiteur de transcriptase inverse et l'ARN interfèrent est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-138 (SEQ ID No :15) et hsa-miR-609 (SEQ ID No :16), et une combinaison de ceux-ci.
L'ARN interfèrent utilisé selon l'invention et le composé antirétroviral peuvent être administrés simultanément, le cas échéant au sein d'une même composition, ou séquentiellement.
La présente invention concerne également un ARN interfèrent qui s 'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH, ladite protéine mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un composé antirétroviral, ou un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour ledit ARN interfèrent ou un précurseur dudit ARN, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante audit composé antirétroviral.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, au moins un ARN interfèrent qui s'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour une protéine mutante d'une souche du virus VIH, ladite protéine mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un composé antirétroviral, et/ou au moins un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour ledit ARN interfèrent ou un précurseur dudit ARN, et un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables.
L' ARN interfèrent compris dans la composition selon l'invention peut être tout
ARN interfèrent tel que décrit dans la présente demande. De préférence, l'ARN interfèrent est choisi dans le groupe constitué d'un ARNsi, d'un ARNsh et d'un miARN. De manière particulièrement préférée, l'ARN interfèrent est un miARN.
Selon un mode de réalisation, l'ARN interfèrent est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-18a (SEQ ID No :2), hsa-miR-92a-l (SEQ ID No :3), hsa- miR-185* (SEQ ID No :4), hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID No :5), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa- miR-1231 (SEQ ID No :12), hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), hsa-miR-138 (SEQ ID No :15) et hsa-miR-609 (SEQ ID No :16), et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, l'ARN interfèrent est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-185* (SEQ ID No :4), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-609 (SEQ ID No :16), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa- miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci.
La composition selon l'invention peut également comprendre en outre un ou plusieurs composés antirétroviraux tels que des inhibiteurs de la transcriptase inverse, des inhibiteurs de la protéase, des inhibiteurs de la fusion, des inhibiteurs de maturation, ou des inhibiteurs d'intégrase. Dans le cas où la composition comprend plusieurs composés antirétroviraux, ces derniers peuvent être des inhibiteurs de même type (inhibition du même mécanisme viral ou de la même enzyme) ou des inhibiteurs de types différents.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention est un vaccin.
De manière avantageuse, le véhicule de la présente composition facilite la pénétration de l'ARN interfèrent ou au vecteur d'expression utilisé selon l'invention dans les cellules de l'organisme à traiter, et/ou protège l'ARN interfèrent ou le vecteur d'expression d'une éventuelle dégradation pouvant nuire à son efficacité. Parmi les véhicules utilisables, on peut notamment citer les polymères cationiques naturels tels que le chitosan ou l'atelocollagène, ou synthétiques tels que le po Iy(L- lysine), le polyéthylènimine (PEI) ou les dendrimères, qui forment des complexes avec les acides nucléiques de l'invention ; les liposomes ; les liposomes cationiques ; les liposome galactosylés ; les liposomes recouverts d'un ligand leur permettant de cibler un type de cellules tels que les immuno liposomes recouvert d'un anticorps spécifique de la cellule cible (Zheng et al., 2009) ; les liposomes disposés au sein d'une nanoparticule formée par des polymères (Carmona et al., 2009) ou encore des films multicouches de polycations et polyanions.
La composition selon l'invention peut être adaptée pour une administration par voie orale, sublinguale, parentérale, topique, rectale ou transdermique selon des protocoles classiques bien connus de l'homme du métier. De manière préférée, la composition est adaptée pour une administration par voie orale, par exemple sous la forme d'un comprimé, d'une gélule, ou d'une solution buvable, ou par voie parentérale, en particulier sous la forme d'une solution injectable, notamment par voie intraveineuse, intradermique ou sous cutanée.
Il est entendu que la dose à administrer peut être adaptée par l'homme du métier en fonction de nombreux paramètres tels que la physiologie du patient, l'état pathologique ou le mode d'administration. Typiquement, les ARN interférents sont administrés à des doses pouvant varier entre 0,1 et 20 mg par kilo et par jour, préférentiellement de 1 à 10 mg par kilo et par jour. Les administrations peuvent être hebdomadaires ou quotidiennes voire répétées plusieurs fois par jour. Les ARN interférents peuvent être administrés sous forme de dose unitaire comprenant de 0,05 à 20 mg d'ARN interférents, préférentiellement de 0,1 à 5 mg.
La présente invention concerne en outre un ARN interfèrent selon l'invention en tant que médicament. Selon un mode de réalisation particulier, l'ARN interfèrent est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-18a (SEQ ID No :2), hsa-miR-92a- 1 (SEQ ID No :3), hsa-miR-185* (SEQ ID No A), hsa-miR-219-l-3p (SEQ ID No :5), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12), hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), hsa-miR-138 (SEQ ID No :15) et hsa-miR-609 (SEQ ID No :16), et une combinaison de ceux-ci. De manière préférée, l'ARN interfèrent est un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-185* (SEQ ID No :4), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR- 518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-609 (SEQ ID No :16), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No :11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci.
La présente invention concerne également une méthode de traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante à un composé antirétroviral comprenant l'administration à un sujet, notamment humain, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un ARN interfèrent, d'un vecteur d'expression ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus.
Le terme « traitement » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une amélioration ou disparition des symptômes, un ralentissement de la progression de la maladie, un arrêt de l'évolution de la maladie ou une disparition de la maladie. Ce terme englobe aussi bien le traitement préventif que curatif.
Le terme « quantité thérapeutiquement efficace » tel qu'utilisé ici, se réfère à une quantité suffisante pour avoir un effet inhibiteur sur la réplication et/ou la production virale.
Les exemples qui suivent sont présentés dans un but illustratif et non limitatif. Exemples
Matériels et méthodes
Lignée cellulaire et souches virales
Les expérimentations ont été effectuées avec des cellules Hela-P4 qui sont permissives à la réplication du VIH-I de sous type B utilisé dans ces expériences et dont le génome complet est clone dans le plasmide pNL4-3 (numéro d'entrée GenBank:
AF324493.1). Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM avec 5% de sérum de veau fœtal.
Le plasmide pNL4-3 contient le génome complet de la souche sauvage du virus VIH-I. Les souches virales contenant des mutations de résistance aux antirétro viraux ont été obtenues par mutagénèse dirigée en modifiant le plasmide pNL4-3. Les virus utilisés dans ces expériences ne présentent donc pas d'autres mutations. Les virus comprenant la mutation E92Q (cag), E92Q (caa), G 140S (agc), G 140S (agt), G 140A
(gca), Y143C (tgc) ou Y143R (cgc) dans le gène codant pour l'intégrase ont ainsi été obtenus. Ces mutations correspondent aux mutations les plus fréquemment observées chez les patients en échec thérapeutique. Une même mutation de résistance peut être codée par des séquences nucléotidiques différentes.
ARN interférents
Les ARN interférents utilisés lors de ces expériences sont des ARN double brin dont la séquence correspond à un miARN compris dans la liste suivante : hsa-miR-18a (SEQ
ID No :2), hsa-miR-92a-l (SEQ ID No :3), hsa-miR-185* (SEQ ID No A), hsa-miR-
219-l-3p (SEQ ID No :5), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID
No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939
(SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No : 11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR- 1909 (SEQ ID No : 13).
Transfection des cellules
24 heures avant la transfection, 4.104 cellules ont été mises en cultures dans chaque puits de plaques 24 puits. Le lendemain, les cellules Hela-P4 ont été co- transfectées avec 0, 5, 10, 20 et 50 pMol d'un miARN et avec 100 ng d'un plasmide codant pour le génome complet d'un VIH-I sauvage (pNL4-3) ou muté. Cette transfection a été réalisée à l'aide du kit Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Une solution de transfection comprenant 100 ng de pNL4-3 ou de pNL4-3 muté, 5 à 50 pMol d'un miRNA et 1 μL de Lipofectamine2000 a été dilué dans 50 μL de milieu OptiMEM. Les cellules Hela-P4 ont été mises en contact avec cette solution de transfection avant d'être incubées à 37°C (sous 5% de CO2) durant 4 à 6 heures. Les cellules ont ensuite été lavées et remises en cultures dans du milieu DMEM avec 5 % de sérum de veau fœtal.
Détermination de la CI 50
Après la transfection, les cultures cellulaires ont été suivies pendant 6 jours afin de détecter la production de VIH dans le surnageant en mesurant la production d'antigène p24 mesurée par technique ELISA (tests ELISA réalisés sur 150 μL de surnageant de culture cellulaire) et exprimée en pg/ml. Afin d'évaluer la capacité du miARN étudié à inhiber la production virale, l'antigénémie p24 a été mesurée dans les cultures transfectées avec et sans miARN. La concentration inhibitrice 50, c'est-à-dire la concentration de miARN permettant de diminuer la production d'antigène p24 de 50%, a ainsi été calculée.
Effets des miARN sur la réplication du VIH-I résistant aux inhibiteurs d'intégrase
La mesure de la production d'antigène p24 à chaque concentration de miARN a permis de définir la CI50 des différents miARN testés. Les valeurs de ces CI50 sont présentées dans le tableau ci-dessous.
Ces résultats démontrent que les miARN qui s'hybrident préférentiellement avec l'ARNm du gène codant pour une intégrase contenant une mutation conférant au virus une résistance aux anti-rétroviraux, sont capables d'inhiber la production virale d'une telle souche avec une grande efficacité.
Références bibliographiques
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Claims

Revendications
1. ARN interfèrent qui s'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour une intégrase mutante d'une souche du virus VIH, ladite intégrase mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un inhibiteur d'intégrase, pour une utilisation dans le traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante audit inhibiteur d'intégrase.
2. ARN interfèrent selon la revendication 1, ledit virus VIH étant le virus VIH-I.
3. ARN interfèrent selon la revendication 1 ou 2, ledit ARN étant choisi dans le groupe constitué d'un miARN, d'un ARNsi et d'un ARNsh.
4. ARN interfèrent selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit ARN étant un miARN.
5. ARN interfèrent selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ledit inhibiteur d'intégrase étant le raltégravir ou l'elvitégravir.
6. ARN interfèrent selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ladite intégrase contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance audit inhibiteur d'intégrase, le ou les résidus mutés de l'intégrase étant choisis dans le groupe constitué du résidu T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 et R263 de la SEQ ID No. 1, et une combinaison de ceux-ci.
7. ARN interfèrent selon la revendication 6, ladite ou lesdites mutations étant choisies dans le groupe constitué de E92Q, G140S, G140A, Y143R et Y143C, et une combinaison de celles-ci.
8. ARN interfèrent selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit ARN interfèrent étant un miARN étant choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-18a (SEQ ID No :2), hsa-miR-92a-l (SEQ ID No :3), hsa-miR-185* (SEQ ID No A), hsa-miR- 219-l-3p (SEQ ID No :5), hsa-miR-370 (SEQ ID No :6), hsa-miR-518c* (SEQ ID No :7), hsa-miR-595 (SEQ ID No :8), hsa-miR-613 (SEQ ID No :9), hsa-miR-939 (SEQ ID No :10), hsa-miR-1228* (SEQ ID No : 11), hsa-miR-1231 (SEQ ID No :12) et hsa-miR-1909 (SEQ ID No :13), et une combinaison de ceux-ci.
5
9. ARN interfèrent qui s'hybride préférentiellement avec l'ARNm d'un gène codant pour la transcriptase inverse mutante d'une souche du virus VIH, ladite transcriptase inverse mutante contenant une ou plusieurs mutations conférant à la souche virale un phénotype de résistance à un inhibiteur de transcriptase inverse, le ou les résidus mutés 10 de la transcriptase inverse étant choisis dans le groupe constitué du résidu D67 et T215 de la SEQ ID No. 14, et une combinaison de ceux-ci, pour une utilisation dans le traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante audit inhibiteur de transcriptase inverse.
15 10. ARN interfèrent selon la revendication 9, ledit ARN étant choisi dans le groupe constitué d'un miARN, d'un ARNsi et d'un ARNsh.
11. ARN interfèrent selon la revendication 9 ou 10, ledit ARN étant un miARN.
20 12. ARN interfèrent selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, ledit ARN interfèrent étant un miARN choisi dans le groupe constitué de hsa-miR-138 (SEQ ID No :15) et hsa-miR-609 (SEQ ID No :16), et une combinaison de ceux-ci.
13. Vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour un ARN 25 interfèrent tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou codant pour un précurseur dudit ARN interfèrent, pour une utilisation dans le traitement d'une infection par une souche du virus VIH résistante à un composé antirétroviral.
14. ARN interfèrent tel que défini à l'une des revendications 1 à 12 ou vecteur 30 d'expression tel que défini à la revendication 13, pour une utilisation en combinaison avec un composé antirétroviral, dans le traitement d'une infection par le virus VIH.
15. Composition pharmaceutique comprenant au moins un ARN interfèrent tel que défini dans les revendications 1 à 12 et/ou au moins un vecteur d'expression tel que défini dans la revendication 13, et un ou plusieurs excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables.
16. Composition pharmaceutique selon la revendication 15 comprenant en outre un ou plusieurs composés antirétro viraux.
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