EP2448929A1 - Novel conjugates, preparation thereof, and therapeutic use thereof - Google Patents

Novel conjugates, preparation thereof, and therapeutic use thereof

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Publication number
EP2448929A1
EP2448929A1 EP10728799A EP10728799A EP2448929A1 EP 2448929 A1 EP2448929 A1 EP 2448929A1 EP 10728799 A EP10728799 A EP 10728799A EP 10728799 A EP10728799 A EP 10728799A EP 2448929 A1 EP2448929 A1 EP 2448929A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
gcr
compound
alkyl
cri
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10728799A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Hervé Bouchard
Marie-Priscille Brun
Alain Commerçon
Jidong Zhang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi SA
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Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41611078&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EP2448929(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sanofi SA filed Critical Sanofi SA
Publication of EP2448929A1 publication Critical patent/EP2448929A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D273/00—Heterocyclic compounds containing rings having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D261/00 - C07D271/00
    • C07D273/08—Heterocyclic compounds containing rings having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D261/00 - C07D271/00 having two nitrogen atoms and more than one oxygen atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D245/00—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D245/04—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D245/06—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring

Definitions

  • the present invention relates to conjugates of cryptophycins, the compositions containing them and their therapeutic application, especially as anticancer agents.
  • the invention also relates to the process for preparing these compounds as well as to the cryptophycin derivatives themselves. [Technical area]
  • Cryptophycins are secondary metabolites belonging to the class of depsipeptide macrocycles produced by cyanobacteria of the genus Nostoc. Their name refers to the fact that they are highly cytotoxic to cryptococcal yeasts.
  • the first representative of this class of molecules, cryptophycin-1 (C-1) was isolated in 1990 from cyanobacterium Nostoc sp (ATCC 53789) (see Ei ⁇ ler S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747-3789 ).
  • the structure, the general formula and the numbering of the carbon atoms of these compounds, as described in WO 98/08505, are given below:
  • Cryptophycins C-1 and C-52 which are characterized by an epoxide function shown below, have anticancer properties.
  • Phase II clinical trials in lung cancer were conducted with C-52 (LY 355073): see Edelman MJ. , et al., Lung Cancer 2003,
  • Cryptophycin C-55 a C-52 prodrug, is characterized by a chlorohydrin function instead of the epoxide function (Bionpally R.R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003, 52, 25-33).
  • C-55 has been very active but is not stable in solution.
  • Chlorhydrin glycinate derivatives such as the compound C-55 Gly have also been described to improve their stability.
  • Conjugate chemistry has been known for many years and has been applied to several cytotoxic families, for example maytansinoids (WO 04103272), taxanes (WO 06061258), tomaymycins (WO 09016516), leptomycins (WO 07144709), CC-1065 and its analogs (WO 2007102069); see also about conjugates, Monneret C, et al., Cancer Bulletin. 2000, 87 (1 1), 829-38; Jamaicart A.D., et al., Nature Clinical Practice Oncology 2007, 4, 245-255. However, it has not been applied to cryptophycin derivatives conjugated to antibodies or other targeting agents.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to propose novel conjugates based on cryptophycin derivatives, as well as novel cryptophycin derivatives capable of being conjugated.
  • EP 0830136 and WO 98/08505 describe cryptophycin derivatives but do not describe cryptophycin conjugates.
  • WO 98/08505 discloses cryptophycin derivatives of formula
  • R 54 is H, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 1 ;
  • ⁇ JaJkyJeORiQQ, SR 63 ; R 55 and R 56 represent H, a (C 1 -C 6 ) alkyl group,
  • WO 08010101 discloses an anti-EphA2 monoclonal antibody and the corresponding conjugates comprising one or more molecules of a cytotoxic compound attached to the monoclonal antibody.
  • WO 08047242 discloses an anti-CD38 monoclonal antibody as well as the corresponding conjugates comprising one or more molecules of a cytotoxic compound attached to the monoclonal antibody.
  • the cytotoxic compound may be selected from maytansinoids, taxanes, tomaymycins, leptomycins, CC-1065 and its analogs.
  • WO 2009/126934 discloses anti-CD70 antibodies and their conjugates with cytotoxic compounds; cryptophycin is cited among the cytotoxics.
  • WO 2009/134976 discloses conjugates with an optimized substitution rate to deliver the required amount of cytotoxic to the cell; cryptophycin is cited among the cytotoxics.
  • WO 2005/116255 discloses aptamer conjugates and a cytotoxic which may be a cryptophycin (see [0037] and Table 2), the linker may comprise a PEG chain ([0038]). More particularly, Cryptophycin Cryp-NH 2 is described:
  • WO 2006/096754 also describes aptamer conjugates and a cytotoxic which can also be a cryptophycin.
  • WO 2009/002993 discloses cytotoxic conjugates of formula BLA comprising hydrophilic linkers, for example the linker of formula:
  • the cytotoxic may be a cryptophycin (page 46) but without specifying the point of attachment of the linker.
  • An example of a conjugate is EC0262:
  • Conjugate a cell targeting agent to which at least one molecule of a cytotoxic compound is covalently attached;
  • Cell targeting agent (or "cell binding agent” in English): a molecule having an affinity for a biological target: it may be for example a ligand, a protein, an antibody, more particularly monoclonal, a protein or antibody fragment, a peptide, an oligonucleotide, an oligosaccharide.
  • the targeting agent has the function of directing the biologically active compound as a cytotoxic agent to the biological target.
  • the targeting agent is not an aptamer;
  • biological target an antigen (or group of antigens) preferentially localized on the surface of the cancerous cells or stromal cells associated with this tumor; such antigens may be, for example, a growth factor receptor, a mutant tumor suppressor or "tumor suppressor” product, a molecule related to angiogenesis, an adhesion molecule;
  • linker a set of atoms to covalently attach a cytotoxic compound to the targeting agent
  • Alkyl group a saturated aliphatic hydrocarbon group obtained by removing a hydrogen atom from an alkane.
  • the alkyl group can be linear or branched.
  • Cycloalkyl group a cyclic alkyl group comprising between 3 and 8 carbon atoms engaged in the cyclic structure.
  • cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl groups By way of examples, mention may be made of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl groups;
  • Heterocycloalkyl group a cycloalkyl group comprising at least one heteroatom (O, S, N) engaged in the ring and connected to the carbon atoms forming the ring;
  • Alkoxy group an -O-alkyl group, wherein the alkyl group is as defined above;
  • Alkanoyloxy group a group -O-CO-alkyl, where the alkyl group is as defined above;
  • Alkylene group a saturated divalent group of the formula -C n H 2n -, obtained by removing two hydrogen atoms from an alkane.
  • methylene groups -CH 2 -
  • ethylene -CH 2 CH 2 -
  • propylene -CH 2 CH 2 CH 2 -
  • butylene -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -
  • AA 'hexylene (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -) or the following branched groups n , / x ;
  • the alkylene group is of the formula - (CH 2 ) n -, n represents an integer;
  • the terminals are included (eg a range of "n from 1 to 6" or “from 1 to 6” includes terminals 1 and 6).
  • AcOEt ethyl acetate
  • ALK (C 1 -C 12 ) alkylene group, more particularly (C 1 -C ⁇ ) alkylene, more particularly of the form - (CH 2 ) n - n being an integer of 1 to 12, preferably 1 to 6
  • TLC thin layer chromatography
  • Fmoc fluorenylmethoxycarbonyl
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine-ethanesulfonic acid
  • mCPBA m-chloroperbenzoic acid
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • NMP N-methylpyrrolidinone
  • PA atmospheric pressure
  • PABAC "para-aminobenzylic alcohol carbonate"
  • PR reduced pressure
  • SEC chromatography steric exclusion
  • SPE solid phase extraction
  • TA room temperature
  • TBDMS tert-butyldimethylsilyl
  • TCEP tris- (2-carboxyethyl) -phosphine hydrochloride
  • TEA triethylamine
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TIPS triisopropylsilyl
  • THF tetrahydrofuran
  • t R retention time.
  • the invention relates to a targeting agent to which at least one cryptophycin derivative of formula (I) is attached:
  • R 1 represents a halogen atom and R 2 represents an -OH group, an acyl group derived from an amino acid AA or a (C 1 -C 4 ) alkanoyloxy group;
  • R 1 and R 2 together form an epoxy unit
  • AA means a natural or unnatural amino acid
  • R3 represents a group (C 1 -C ⁇ alkyl
  • R ⁇ and R 7 represent independently of each other H or a group (C 1 -C ⁇ alkyl);
  • R 1 0 represents at least one substituent of the phenyl ring selected from: H, -OH, (C 1 -C 4) alkoxy, a halogen atom or -NH 2, -NH (d-C6 ) alkyl or -N (Cr C 6 ) alkyl 2 ;
  • Rn represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H or a (Cr C 4 ) alkyl group;
  • the targeting agent and the cryptophycin derivative being covalently attached, the attachment being in the ortho (o), meta (m) or para (p) position of the phenyl ring bearing the CRi motif. positions ortho (o), meta (m) or para (p):
  • R 1 represents a halogen atom, more particularly Cl.
  • R 3 represents a group (Cr C ⁇ jalkyl, more particularly Me, Re and R 7 represent independently of each other H or a group (C 1 -C ⁇ ) alkyl, more particularly they represent independently of one another H or a group Me.
  • Rs and R 9 represent independently of each other H or a group (Cr C ⁇ alkyl), more particularly R 8 represents H and R 9 represents isobutyl.
  • Rio represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H, an OH group, (Cr C 4 ) alkoxy, a halogen atom. It can also be a group -NH 2 , -NH (C 1 -C 6 ) alkyl or - N (C 1 -C 6 ) alkyl 2 such as for example -NH 2 or -NMe 2 , preferably in position 3 or 4 on the phenyl nucleus. More particularly, the phenyl ring comprises two substituents at the 3- and 4-positions on the phenyl ring. Preferably it is 3-Cl and 4-methoxy. Rn represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H or a (C 1 -C 4 ) alkyl group; more particularly H.
  • each substituent R 1 to R n may also adopt one of the spatial configurations (for example R or S or else Z or E) as described in the examples.
  • AA represents a natural or unnatural amino acid. It can be an amino acid ⁇ , ⁇ or ⁇ . Mention may in particular be made of the following amino acids: alanine (Ala), ⁇ -alanine, 2-amino-2-cyclohexylacetic acid, 2-amino-2-phenylacetic acid, arginine (Arg), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys ), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), praline ( Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ , ⁇ -dimethyl ⁇ -aminobutyric acid,
  • Ri and R 2 may also together form an epoxy unit.
  • the attachment between the cryptophycin derivative and the targeting agent is carried out via a linker L positioned in the ortho (o), meta (m) or para (p) position of the phenyl ring bearing the CR-unit. i; thus, the conjugatable cryptophycin derivative has the formula (II):
  • (H) Attachment at the level of the targeting agent is at the other end of linker L at a reactive group present on the targeting agent.
  • L comprises at least one reactive chemical group (GCR1) with respect to a reactive chemical group (GCR2) present on the targeting agent.
  • GCR1 and GCR2 ensures the attachment of the compound of formula (II) to the targeting agent by formation of a covalent bond.
  • the cryptophycin derivative of formula (II) is capable of being conjugated to a targeting agent.
  • the cryptophycin derivatives of the present invention may exist in the form of bases or addition salts with acids, in particular pharmaceutically acceptable acids.
  • GCR1 As examples of GCR1, mention may be made of:
  • R 2 representing H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly Me; or l
  • the maleimido reactive group with R 2 representing H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly Me. More particularly, -SZ a may represent -SH or -SS (C 1 -C 6 ) alkyl, especially -SSMe, or -
  • Gl represents at least one electroinductive group such as -NO 2 or -HaI, especially -F. It may be for example
  • GCR1 may be chosen from one of those described in the examples.
  • GCR2 mention may be made of the ⁇ -amino groups of the lysines carried by the side chains of the lysine residues which are present on the surface of an antibody, the saccharide groups of the hinge region or thiols of cysteines by reduction of intra-chain disulfide bonds (Garnett M.C. et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 171-216).
  • the modifying agent may be an NHS activated ester of formula in which R represents a (C 1 -C 6 ) alkyl, aryl, heteroaryl or (C 3 -C 7 ) cycloalkyl group, (C 3 - C 7 ) heterocycloalkyl and ALK represents a (C 1 -C 6) alkylene group, for example, N-succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) or N-succinimidyl pyridyldithiobutyrate (SPDB or N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic) to introduce dithiopyridyl GCR2 reactive groups (see Bourdon MA, et al., Biochem J.
  • SPDP N-succinimidyl pyridyldithiopropionate
  • SPDB N-succinimidyl pyrid
  • X 3 , X 4 , X 5 , Xe represent H or a group (C 1 -C 6 alkyl),
  • - Xi and X 2 represent -H, -CONX 8 Xg, -NO 2 , Xs and X 9 represents H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, - X 7 represents -S ⁇ 3 -M + or H or a quaternary ammonium group
  • a represents an integer ranging from 0 to 4 and b denotes an integer ranging from 0 to 2000, preferably from 1 to 200; a and b can take any value between 0 and 4 or between 0 and 2000, respectively.
  • succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate SMCC
  • SMCC succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • sulfo-SMCC 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane sulfosuccinimidyl) -1-carboxylate
  • N-succinimidyl 3-maleimido-propanoate such as N-succinimidyl 6- (3-maleimidopropionamido) hexanoate
  • b is an integer between 0 and 2000, preferably between 1 and 200 (b can take any value between 0 and 2000), such as 3- (2- ⁇ 2- [3-maleimido-propionylamino] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -N-succinimidylpropanoate or MS (PEG) 2 ; such as maleimidoethyl succinate and N-succinimidyl succinate;
  • modifying agent described in WO 90/06774 is of formula in which :
  • - HaI represents a halogen atom
  • - X 10 represents a halogen atom or COOXi 4, nitro, (C 1 -C 8) unsubstituted or halogenated alkyl, (C 1 -C 8) alkoxy unsubstituted or halogen, (C 2 -C 8) unsubstituted or halogenated alkenyl, (C 2 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkynyl, (C 3 -C 8 ) unsubstituted cycloalkyl, aryl unsubstituted or substituted with one to three substituents selected from amino, halogen, group (C 1 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkyl, (C 1 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkoxy;
  • each of Xn, X 12 , X 13 independently represents a hydrogen atom or may represent X 3 ;
  • X 10 and X 11 together form a (C 2 -C 5 ) alkylene ring, unsubstituted or substituted with one to five (C 1 -C 4 ) alkyl group (s);
  • X 14 is -H or a (C 1 -C 8 ) alkyl group.
  • HaI represents a chlorine or bromine atom.
  • SIA iodoacetate
  • SBA succinimidyl-N-bromoacetate
  • SBAP succinimidyl-3- (N-bromoacetamido) propionate
  • Figures 1 and 2 illustrate modification of an amino group of a targeting agent by SPDP or by the preferred iminothiolane above.
  • GCR1 represents -SH
  • reaction between GCR1 and GCR2 is a cleavable disulfide bond.
  • targeting agent of GCR2 groups of maleimido type ( ) or haloacetamido eg bromo- or iodoacetamido Reciprocally, can be introduced on the targeting agent
  • GCR2 thiol groups (-SH), e.g. with an iminothiolane, in the case where GCR1 represents I
  • GCR2 is a non-cleavable sulfide bond.
  • GCR1 is of type (iii) above
  • a suitable modifying agent or to introduce acid (s) non-natural amine (s) in order to introduce the appropriate GCR2 functions.
  • GCR2 can be a group -C ⁇ CH
  • GCR 2 can be a carboxylic acid function
  • GCR2 can be a group -SH.
  • the cryptophycin derivative may be represented by the formula (IIa) or (Nb) below:
  • the cryptophycin derivative may be, in series C-52 and C-1, one of the following D 1 -D 8 :
  • L is in the para position of the CR-i motif.
  • the function of the PL linker precursor is to introduce the L linker at the level of the cryptophycin derivative after reaction between the group G and a chemical function present on PL.
  • G can also represent the group 2 n ⁇ (that is, Y represents the group
  • the deprotection can be carried out by treatment with a palladium catalyst, for example Pd (PPh 3 ) 4 in the presence of a "scavenger" amine, for example morpholine; activation can be carried out with N-N'-disuccinimidyl carbonate in the presence of a base, for example DIPEA or with NHS in the presence of a coupling agent, for example DCC.
  • a palladium catalyst for example Pd (PPh 3 ) 4
  • a "scavenger" amine for example morpholine
  • activation can be carried out with N-N'-disuccinimidyl carbonate in the presence of a base, for example DIPEA or with NHS in the presence of a coupling agent, for example DCC.
  • Figure 1 These derivatives are obtained by reaction between a cryptophycin derivative having a linker L 'comprising an amino or thiol group and a modifying agent for introducing a maleimido or haloacetamido group, respectively.
  • Nucleophilic substitution between a PL linker precursor carrying an amino function -NH- (an amine salt may also be suitable) and G - (CH 2 ) n CI or - (CH 2 ) n OMs (see, for example, . Table II, 1-4 PL, PL 7a, PL 8- IO PL21-23): this reaction may be conducted in an aprotic polar solvent in the presence of a base, such as TEA or DIPEA. See ex.1, compound 7 or ex.15, compound 48;
  • the linker L can be chosen from one of the following:
  • G represents a group - (CH 2 ) n -;
  • n an integer from 1 to 6;
  • X represents a single bond or a group -CO-, -COO-, or -CONR 12- , the group CO being attached to G ';
  • Y represents -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR 12 -, -NR 12 -, -NR 12 CO-, -NR 12 CONR '12 -, - NR 12 COO-, or -S (0 q -, the atom O or the group NR 12 being attached to G ";
  • Y ' represents a group -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR 12 -, -NR 12 -, -NR 12 CO-, -NR 12 CONR' 12 -, -
  • R12, R'i2, R13, Ru, R15 and R 16, R 17 and R 18 independently of one another H or (C 1 -C ⁇ Jalkyle;
  • t, u and y represent integers ranging from 0 (case of the absent group) to 20 and such that t + u + y is greater than or equal to 1;
  • q represents an integer that may be 0, 1 or 2;
  • Q represents a single bond, a (C 1 -C -alko) alkylene group or a (OCH 2 CH 2 ) group, i being an integer ranging from 1 to 20, more preferably from 1 to 10, more particularly from 1 to at 8, or from 1 to 6, even more particularly from 2 to 5. i can take each of the values of these ranges, in particular worth 2, 3, 4 or 5.
  • the linker L may be chosen from one of those of formula (IV):
  • W represents an integer ranging from 1 to 12, preferably from 1 to 6;
  • N represents an integer ranging from 1 to 6;
  • R 12 represents H or a group (C 1 -C ⁇ alkyl);
  • R19, R20, R21, R22 represent independently of each other H, an atom
  • T attached to (CH 2 ) n represents NR 12 OR O;
  • V 1 represents O, S, NR 12 ;
  • V 2 represents CR 22 or N
  • V 3 , V 4 , V 5 are chosen independently of one another from CR 22 or N.
  • AA denotes a natural or non-natural amino acid, more particularly chosen from: alanine (Ala), ⁇ -alanine, 2-amino-2-cyclohexylacetic acid, 2-amino-2-phenylacetic acid, arginine (Arg), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ , ⁇ -dimethyl ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ , ⁇ -dimethyl ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ ,
  • sequence (AA) W has the formula: wherein R 23 represents a residue of one of the amino acids described above.
  • sequences are the following: Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-Cit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lsy, Ala-Lys, Val -Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu -Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Al-Leu-Ala-Leu.
  • linker precursors are those comprising the corresponding -OH units:
  • WO 2005/082023 (see especially pages 61-64) describes how to obtain certain linker precursors.
  • the preparations of the PL25 and PL26 linker precursors described hereinafter can also be used to obtain other similar linker precursors comprising a further sequence (AA) W.
  • the linker L may also be selected from one of those described in Table II or from the exemplified compounds. In all linkers of formulas, NR 12 or NR 12 more particularly represents NH or NMe.
  • Pi is prepared according to information from WO 98/08505, WO 00/23429 or WO 00/34252 and the following publications Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295; Salamonczyk G. M., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6893-6900 or J. Med. Cftem. 1999, 42 (14), 2588-2603 (incorporated herein by reference).
  • an acidic medium for example, concentrated perchloric acid may be used;
  • 4- (Triisopropylsiloxymethyl) benzyltriphenylphosphonium bromide is obtained from 1- (bromomethyl) -4- (triisopropylsiloxymethyl) benzene (CAS No. 934667-38-6), the preparation of which is prepared from 1,4-benzenedimethanol (CAS N No. 589-29-7, commercial product) is described by Potier R. G, et al., Organic Letters 2007, 9 (7), 1187-1190.
  • Rn represents a (C 1 -C 4 ) alkyl group
  • diol which is either a commercial product or is obtained by C-alkylation Friedel-Crafts from 1,4-benzenedimethanol. .
  • C 4 ) alkyl are similarly obtained from a compound equivalent to compound 1 described on page 83 of the Nevill CR article. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991, 7 (1), 83-86 which is either a commercial product or is obtained by Friedel-Crafts C-alkylation from p-tolylacetic acid.
  • Triphenyl (p-vinylbenzyl) phosphonium bromide (CAS No. 1 18766-51-1) is obtained from the corresponding brominated derivative (see Drefahl G., et al., Chem.Ber., 1961, 94 (8), 2002-2010) whose preparation from 4-vinylbenzyl alcohol (CAS No. 1074-61-9, commercial product) is described in the article by Shimomura O., et al., Tetrahedron 2005, 61, 12160 -12,167.
  • the groups G-CH 2 CI or -CH 2 N 3 can be obtained: the introduction of -Cl can be carried out in the presence of CMS: see ex.1 -composed 2;
  • the group G -CH 2 NH 2 can be obtained by means of a reduction reaction using a phosphine such as TCEP.
  • a phosphine such as TCEP.
  • the group G-CH 2 NH 2 can be obtained by means of a Mitsunobu reaction using triphenylphosphine and DEAD.
  • a Mitsunobu reaction using triphenylphosphine and DEAD see: Mitsunobu O., Synthesis 1981, 1-28; Hughes DL, Org. Reactions 1992, 42, 335-656; Hughes DL, Org. Prep. 1996, 28, 127-164.
  • Schemes 5 and 5 'describe the case n 1 but they can also apply for n> 1.
  • the intermediate dimer of formula can be formed:
  • a suitable Grignard reagent for example a protected alkoxymagnesium bromide in the form of silylated ether
  • (4-Bromobenzyl) triphenylphosphonium bromide is a commercial product (CAS No. 51044-13-4).
  • the protected alkoxymagnesium bromides in the form of silylated ether can be prepared from the corresponding bromoalcohols by protecting the alcohol function with the appropriate chlorosilane and then by forming the organomagnesium in the presence of magnesium in an aprotic polar solvent anhydrous, such as THF. (see for example Organic Letters 2005, 7, 183-186).
  • Bromoalcohols, linear or branched having 1 to 6 carbon atoms, are commercially available, such as 3-bromo-1-propanol (CAS No.
  • chlorosilane may, for example, be tert-butyldimethylchlorosilane (CAS No. 18162-48-6) or triisopropylchlorosilane (CAS No. 13154-24-0).
  • G-CH 2 N 3 the conversion of -CH 2 OH to -CH 2 N 3 can be carried out in an aprotic polar solvent in the presence of diphenylphosphorazide and a base such as DBU, see Example 19, compound 60.
  • PL can be one of the following:
  • a coupling agent such as, for example, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride in solution in an anhydrous aprotic solvent such as DCM.
  • a base which may be a tertiary amine such as TEA or DIPEA.
  • the solvent may be DMF.
  • acid for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
  • the starting acid for example 4-methyl-4- (methyldithio) -pentanoic acid
  • a reducing agent such as, for example, sodium cyanoborohydride.
  • an acid solution for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
  • the starting aldehyde for example 2-methyl-2- (methyldithio) propanal
  • a suitably protected halogenated alcohol for example as a silyl ether
  • a protic polar solvent such as ethanol
  • O-methylhydroxylamine hydrochloride under reflux
  • a base such as sodium hydroxide
  • a borane dimethylsulfide solution in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF.
  • a reducing agent such as, for example, sodium triacetoxyborohydride.
  • This linker is prepared similarly to what is presented for PL 2 .
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a reducing agent such as sodium cyanoborohydride.
  • the conditions of Example 5, compound 17 can be used.
  • an acid solution for example hydrochloric acid (for example in solution in the dioxane).
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a phosphine for example triphenylphosphine
  • anhydrous protic polar solvent such as methanol
  • a base such as, for example, sodium methanolate
  • a reagent having a pyridyl disulfide unit is formed of the disulfide bond; the reaction is carried out in an anhydrous protic polar solvent such as methanol in the presence of a base such as, for example, sodium methanolate and a reagent having a pyridyl disulfide unit.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as DCM
  • mesyl chloride in the presence of a base such as, for example, TEA.
  • a protic polar solvent such as an ethanol / water mixture
  • a protic polar solvent such as ethanol
  • an acid solution for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
  • p U RbZb-ALK-OC (OCH 2 CH 2) -OH is prepared
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • an aprotic polar solvent such as DMF
  • a base such as potassium carbonate
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • a halogenated ester with the alcoholate of a monoprotected PEG diol in the form of tetrahydropyran ether (THP).
  • THF tetrahydropyran ether
  • ⁇ are diagrams below. d esS0US!
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as NaH
  • a nucleofugal group such as an alkyl halide
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a Lewis acid such as BF 3 etherate.
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid we can draw inspiration from the conditions of Example 16, compound 50.
  • an aprotic polar solvent such as DMF
  • a base such as potassium carbonate
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • a halogenated ester with the alcoholate of a monoprotected PEG diol in the form of tetrahydropyran ether (THP).
  • THF tetrahydropyran ether
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol.
  • an acid solution for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
  • an aprotic polar anhydride solvent such as DCM
  • a base such as TEA
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a coupling agent such as EDCI
  • a base such as DMAP
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a coupling agent such as the DIC / HOBt system.
  • ALK - (CH 2 ) i-6- (such as 1,6-hexanedioic acid monomethyl ester).
  • aprotic polar solvent such as DCM
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • Step (i): Following step (iii), the reactions of step (i) are repeated for the case R 12 H. case where ALK ⁇ CHpCH?
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • a Lewis acid such as BF 3 etherate.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as DCM
  • mesyl chloride in the presence of a base such as TEA.
  • an aprotic polar solvent such as acetone
  • a sodium halide such as sodium iodide.
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • THF tetrahydropyran ether
  • the preparation of this type of monoprotected PEG diol is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
  • the intermediate formed is hydrolyzed selectively at pH 5 to the hydroxy ester.
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol.
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • an aprotic polar solvent such as methanol
  • a protic polar solvent such as a two-stage ethanol / water mixture successive: displacement of the mesylate by thiourea then hydrolysis in situ of the isothiouronium salt by addition of a base such as sodium hydroxide.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • THF anhydrous aprotic polar solvent
  • THF tetrahydropyran ether
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a fert-butyl ester are commercially available (such as Fert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a diol
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid trifluoroacetic acid
  • an aprotic polar solvent such as methanol
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • a coupling agent such as EDCI
  • a base such as DMAP
  • THF anhydrous aprotic polar solvent
  • THF tetrahydropyran ether
  • a base such as NaH
  • an alkynyl halide such as propargyl bromide or 4-bromo-1-butyne.
  • THF tetrahydropyran ether
  • the preparation of this type of monoprotected PEG diol is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • an aprotic polar solvent such as acetone
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • an anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as NaH
  • an alkenyl halide such as allyl bromide or 4-bromo-1-butene.
  • hydrochloric acid eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • THF anhydrous aprotic polar solvent
  • THF tetrahydropyran ether
  • PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol.
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • an aprotic polar solvent such as acetonitrile
  • a polar solvent such as a THF / water mixture in the presence of triphenylphosphine.
  • a reducing agent such as sodium triacetoxyborohydride and, if necessary, acetic acid as catalyst.
  • a hydrochloric acid solution e.g. dioxane
  • trifluoroacetic acid we can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 29.
  • an aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • base such as sodium hydride
  • a benzyl halide such as benzyl chloride
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as sodium hydride
  • a nucleofugal group such as an alkyl halide
  • ZaSS-ALK-CHO aldehyde for example 2-methyl-2- (methyldithio) -propanal is commercially available or can be prepared by oxidation of an alcohol carrying a disulfide unit obtained from a suitably protected halogenated alcohol (for example in the form of silylated ether) by successive treatments with potassium thioacetate and a derivative thereof. of methanethiosulfonate type. prepared himself
  • an aprotic polar solvent such as DCM
  • an aprotic polar solvent such as acetonitrile
  • a polar solvent such as a THF / water mixture in the presence of triphenylphosphine.
  • an aprotic polar solvent such as dimethylformamide
  • coupling agents such as the N, N'-diisopropylcarbodiimide / 1-hydroxybenzotriazole system and a base such as TEA.
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid we can draw inspiration from the conditions of Example 7, compound 32.
  • an aprotic polar solvent such as THF or DMF
  • base such as sodium hydride
  • a benzyl halide such as benzyl chloride
  • anhydrous aprotic polar solvent such as DCM
  • a reducing agent such as sodium triacetoxyborohydride and, if necessary, acetic acid as catalyst.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as sodium hydride
  • a nucleofugal group such as an alkyl halide
  • ZaS-ALK-CO 2 H for example 4-methyl-4- (methyldithio) -pentanoic acid, may be commercially available or prepared from a halogenated carboxylic acid by successive treatments with potassium thioacetate and a derivative of methanethiosulfonate type.
  • anhydrous aprotic polar solvent such as DCM
  • mesyl chloride in the presence of a base such as TEA.
  • a protic polar solvent such as an ethanol / water mixture
  • a mixture of polar solvents such as an ethanol / water mixture
  • a reagent comprising a methanethiosulphonate function such as methyl-methanethiosulphonate in the presence of a base such as sodium carbonate.
  • a hydrochloric acid solution eg, dioxane solution
  • trifluoroacetic acid e.g, trifluoroacetic acid
  • anhydrous aprotic polar solvent such as THF
  • a base such as sodium hydride
  • a polar solvent such as a dimethoxyethane / THF / water mixture
  • a base such as sodium bicarbonate.
  • a polar solvent such as a DCM / methanol mixture
  • a coupling agent such as EEDQ.
  • an aprotic polar solvent such as a DCM / acetonitrile mixture.
  • a polar solvent such as a DME / THF / water mixture
  • a base such as sodium bicarbonate.
  • a polar solvent such as a DCM / methanol mixture
  • a coupling agent such as EEDQ.
  • TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
  • an aprotic polar solvent such as a DCM / acetonitrile mixture.
  • the PEG monoprotected diacids in allyl form are prepared according to the preparation description of the linker L 14 .
  • 2,5-Dioxo-pyrrolidin-1-yl bromoacetate and iodoacetate are commercial products with CAS numbers 42014-51-7 and 39028-27-8, respectively. Board
  • the conjugate is obtained by the process of:
  • step (ii) then optionally separating the conjugate formed in step (i) from the cryptophycin derivative and / or the unreacted targeting agent and / or aggregates that would have formed.
  • step (i) of the conjugate of step (i) is separated from unreacted cryptophycin derivative and aggregates that would have formed and the targeting agent is left in the solution. who would not have reacted.
  • the function of the contacting is to allow the chemical groups GCR1 and GCR2 to react in order to ensure the attachment of the cryptophycin derivative to the targeting agent by formation of a covalent bond; preferably,
  • GCR1 represents -SZ has: modifying the targeting agent with a modifying agent so as to introduce on the targeting agent of GCR2 groups suitable, including those described in the 2nd column of Table I:
  • the targeting agent comprises thiol chemical groups.
  • Aggregates means the associations that can be formed between two or more targeting agents, the targeting agents having been modified or not by conjugation. Aggregates are likely to form under the influence of a large number of parameters such as high concentration of targeting agent in the solution, pH of the solution, high shear forces, number of graft dimers and their hydrophobicity, temperature (see references cited in the introduction of J. Membrane Sci. 2008 , 318, 31 1-316), the influence of some of them sometimes not being clarified with precision. In the case of proteins or antibodies, reference may be made to AAPS Journal, “Protein Aggregation and Bioprocessing" 2006, 8 (3), E572-E579.
  • Aggregate content can be determined using known techniques such as SEC (see in this regard, Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480).
  • the aqueous solution of the targeting agent may be buffered using, for example, buffers such as, for example, potassium phosphate or N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES buffer) or a buffer mixture such as buffer A described later.
  • the buffer depends on the nature of the targeting agent.
  • the cryptophycin derivative is dissolved in a polar organic solvent, for example DMSO or DMA.
  • the reaction takes place at a temperature generally between 20 and 40 ° C.
  • the duration of the reaction can vary between 1 to 24 hours.
  • the reaction between the antibody and the cryptophycin derivative may be followed by SEC with a refractometric and / or ultraviolet detector to determine its progress. If the substitution rate is insufficient, it is possible to allow a longer reaction time and / or to add cryptophycin derivative.
  • SEC refractometric and / or ultraviolet detector
  • the conjugate can be purified for example by steric exclusion chromatography (SEC), by adsorption chromatography (such as the exchange agent). ions, IEC), by hydrophobic interaction chromatography (HIC), by affinity chromatography, by chromatography on mixed media such as ceramic hydroxyapatite or by HPLC. Purification by dialysis or diafiltration can also be used.
  • SEC steric exclusion chromatography
  • IEC hydrophobic interaction chromatography
  • HPLC hydrophobic interaction chromatography
  • purification by dialysis or diafiltration can also be used.
  • step (i) or (ii) the solution of the conjugate may undergo a step (iii) of ultrafiltration and / or diafiltration. At the end of these steps, the conjugate in aqueous solution is thus obtained.
  • the antibody may be selected from those described in particular in WO 04043344, WO 08010101, WO 08047242, WO 05009369 (anti- CA6) or WO 2010014812.
  • the antibody may be optionally modified with a modifying agent to promote attachment of the derived from cryptophycin (see above).
  • the antibody may be in particular monoclonal, polyclonal or multispecific. It can also be an antibody fragment. It can also be a murine, human, humanized or chimeric antibody. joint
  • a conjugate generally comprises of the order of 1 to 10 cryptophycin derivatives covalently attached to the targeting agent (this is the level of grafting or "drug-to-antibody ratio" or “DAR" " in English). This number varies according to the nature of the targeting agent and the cryptophycin derivative as well as the operating conditions used in the conjugation method (for example number of equivalents of cryptophycin derivative relative to the targeting agent, reaction time, nature of the solvent and the optional cosolvent).
  • Contacting the targeting agent with the cryptophycin derivative results in a mixture comprising a plurality of conjugates individually distinguishable from each other by different DARs; optionally the unreacted targeting agent; possibly aggregates.
  • the DAR that is determined on the final solution therefore corresponds to an average DAR.
  • UV spectroscopy may be a method used to determine the DAR. This method is inspired by that presented in Antony S.
  • a ⁇ 1 (CD x ⁇ D ⁇ 1 ) + (c A x ⁇ A ⁇ i)
  • a ⁇ 2 (c D X ⁇ D ⁇ 2 ) + (c A X ⁇ A ⁇ 2 )
  • CD and CA respectively denote the concentrations in the solution of the part of the conjugate relating to the cryptophycin derivative and the part of the conjugate relating to the antibody;
  • naked antibody is intended to mean the antibody to which no cryptophycin derivative is attached, that is to say the antibody before the conjugation step.
  • CD [( ⁇ A ⁇ ix A ⁇ 2 ) - ( ⁇ A ⁇ 2 x A ⁇ 1 )] / [( ⁇ D ⁇ 2 x ⁇ A ⁇ 1 ) - ( ⁇ A ⁇ 2 x ⁇ D ⁇ 1 )]
  • the average DAR then corresponds to c D / c A.
  • ⁇ 1 280 nm and according to the nature of the cryptophycin derivative, ⁇ 2 is chosen in the specific wavelength range 246 nm - 252 nm.
  • the DAR (UV) is preferably greater than 0.5, more particularly between 1 and 10, even more particularly between 2 and 7.
  • the conjugate can be used as an anti-cancer agent. Because of the presence of the targeting agent, the conjugate is made very selective for tumor cells rather than healthy cells.
  • the conjugate can be used alone or in combination with at least one other anticancer drug.
  • the conjugate is formulated in the form of an aqueous buffered solution at a concentration generally of between 1 and 10 mg / ml.
  • This solution can be injected as an infusion such that it can be rediluted to form an infusion solution.
  • the analysis is carried out on a Waters UPLC-SQD apparatus and an Acquity BEH Ci 8 1, 7 ⁇ m (2.1 ⁇ 50 mm) column at 50 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (2 min) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: from 5% to 50% B in 0.8 min; 1 min: 100% B, 1.85 min: 100% B, 1.95 min: 5% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
  • the analysis is carried out on a Waters UPLC-SQD apparatus and an Acquity BEH Ci ⁇ 1, 7 ⁇ m (2.1 ⁇ 50 mm) column at 70 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (2 min ) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 5% to 50% B in 1 min; 1, 3 min: 100% B; 1) , 45 min: 100% B, 1.75 min: 5% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
  • the analysis is carried out on a Waters ZQ apparatus and a Phenomenex Kinetex Ci ⁇ 100A 2.6 ⁇ m column (3 ⁇ 50mm) at 45 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (6 min) of A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 6% B: 0.8 min, 6% to 100% B in 4.1 min; 8 min: 100% B, 5.0-6.0 min: 6% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
  • the analysis is carried out on a Waters ZQ apparatus and a Phenomenex Kinetex Ci ⁇ 2.6 ⁇ m column (3 ⁇ 1000mm) at 50 ° C. with a flow rate of 0.8 ml / min, an elution gradient (8 min) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 4% B: 0.15 min; 4% to 100% B in 6.85 min; , 1 min: 100% B, 7.4-8.2 min: 4% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
  • MS Mass spectrometry
  • the spectra were carried out by direct introduction on a WATERS GCTof apparatus (direct introduction without LC).
  • the assay may require a prior step of deglycosylation of the conjugate. This is carried out by adding to the conjugate solution 2% by volume of a PNGase F enzyme solution (prepared by supplementing to 100 ml a vial of 100 units of N-glycanase enzyme lyophilisate with water. milliQ). The solution is homogenized using the vortex and incubated at 37 ° C. 19 h. The degly ⁇ sylated sample is ready to be analyzed by SEC-HRMS.
  • a PNGase F enzyme solution prepared by supplementing to 100 ml a vial of 100 units of N-glycanase enzyme lyophilisate with water. milliQ.
  • the solution is homogenized using the vortex and incubated at 37 ° C. 19 h.
  • the degly ⁇ sylated sample is ready to be analyzed by SEC-HRMS.
  • the 1 H NMR spectra were carried out on a Bruker Avance spectrometer, either DRX-300, DRX-400, DRX-500 or DMX-600. The chemical shifts are given in ppm.
  • the antibody is first modified with an NHS-activated ester, in order to introduce on its surface pyridyldisulphide groups.
  • NHS activated ester dissolved in DMA such that the final concentration of antibody is between 5 and 10 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 5%.
  • the reaction is continued for 2 h at RT.
  • a sample of the modified antibody is treated with dithiothreitol in order to reduce the disulfide bond, the pyridine-2-thione released is assayed by spectrometry (extinction coefficients: ⁇ 343 nm : 8080 M -1 cm -1 , ⁇ 28 o nm: 5100 M -1 cr ⁇ 1 pyridine-2-thione, and ⁇ o 28 nm: 208,380 M -1 cm -1 for the antibody). On average, from 3 to 6 pyridyldisulphide groups are grafted per molecule of antibody.
  • the reaction is continued overnight at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm.
  • the mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the degree of grafting of the cryptophycin derivative to the antibody. If the degree of substitution is insufficient, the mixture is treated with 1 to 5 eq.
  • the fractions containing the conjugated antibody in monomeric form are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml.
  • Amicon Ultra-15 Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore
  • a buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer.
  • the conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a Sephadex TM G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare columns) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pHs adapted to each conjugate.
  • the final conjugate is determined by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the average number of cytotoxic antibodies.
  • the substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
  • the antibody is first modified with an NHS-activated ester, in order to introduce on its surface pyridyldisulphide groups.
  • This antibody solution is treated with 5 to 10 eq.
  • NHS activated ester dissolved in DMA such that the final concentration of antibody is between 5 and 10 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 5%.
  • the reaction is continued for 2 h at RT.
  • the reaction is continued overnight at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm.
  • the mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the degree of grafting of the cryptophycin derivative to the antibody.
  • the mixture is treated with 1 to 5 eq. additional cryptophycin derivative (s) in the DMA for 3 h at 30 ° C or with agitation of about 2000 rpm.
  • the fractions containing the conjugated antibody in monomeric form are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml.
  • Amicon Ultra-15 Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore
  • a buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer.
  • the conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a Sephadex TM G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare columns) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pHs adapted to each conjugate.
  • the final conjugate is determined by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the average number of cytotoxic antibodies.
  • the substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
  • the reaction is continued for 3 h at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm.
  • the mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the level of cytotoxic grafting on the monomeric antibody population.
  • the mixture is treated with 1 to 5 eq. additional cryptophycin derivative (s) in the DMA for 3 h at 30 ° C or with agitation of about 2000 rpm.
  • conjugates containing conjugated antibody in form monomeric are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml.
  • Amicon Ultra-15 Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore
  • a buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer.
  • the conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a SephadexTM G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10 or Hiprep 26/10 desalting columns, GEHealthcare column) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pH adapted to each conjugate.
  • the final conjugate is assayed by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the degree of grafting.
  • the substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
  • Example 1 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - ⁇ 4- [4- (4-Mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Compound 1 (30 mg, 42.9 ⁇ mol, prepared according to Al-awar RS, et al., J. Med., Chem., 2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous DMF (2 ml) and the mixture is cooled to 0 ° C. before adding TEA (107 ⁇ mol) and then CMS (64.6 ⁇ mol). After 15 min, the bath is removed and stirring is continued for 12 h at RT. The mixture is diluted by adding AcOEt (2 ml) and the organic phase is washed with water (2x1 ml), with aq solution. saturated NaHCO 3 (1 ml) and aq. saturated with NaCl (1 ml).
  • Fert -butyl compound 5 4- (4-Methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoyl) -piperazine-1-carboxylate
  • Example 1 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-16 - [(S) -1- ( 2R, 3R) -3- ⁇ 4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) -ethyl] - 1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Example 2 (E) - (3S, 6R, 1 OR, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) 3- ⁇ 4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) -ethyl] -6-methyl-1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • the product (34 mg, 36.6 ⁇ mol) is placed in solution in ethanol (4.3 ml) / water (3.6 ml) and the mixture is cloudy.
  • the TCEP (146 ⁇ mol) is then added, the mixture becomes colorless and is stirred for 2 hours at RT.
  • the mixture is diluted by adding AcOEt (20 ml) and the organic phase is washed with a 1/1 mixture of water and an aq solution. saturated with NH 4 Cl (20 ml).
  • the phase aq. is extracted with 2x20 ml of AcOEt, the organic phases are combined and washed with a saturated solution of NaCl (20 ml).
  • a solution of the compound 14 (1.11 g, 6.185 mmol) in 30 ml of THF is purged with argon and cooled to 0 ° C. before adding, at 0 ° C., 1.44 g (6.80 mmol). ) of sodium triacetoxyborohydride. Stirring is continued for 15 h at RT: there remains imine starting; 1.44 g (6.80 mmol) of sodium triacetoxyborohydride and 354 ⁇ l (6.185 mmol) of acetic acid are added at 0 ° C. and the stirring is continued at RT for 3 h. The mixture is diluted in 50 ml of AcOEt and washed with water (50 ml). The pH of the aq phase.
  • the compound 16 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with the amine 15 by applying the method described for the preparation of the compound 30.
  • Example 4 can be obtained by applying the method described for the preparation of Example 6 to compound 16.
  • Fert-butyl 17 4- (2-methyl-2-methyl-disulfanyl-propyl) -piperazine-1-carboxylate compound
  • Example 7 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - ⁇ 4- [4 - ( ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoylamino-ethoxy ⁇ -ethoxy) -ethoxy] -ethyl ⁇ methylamino) -methyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Example 7 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - ⁇ 4- [4 - ( ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoylamino-ethoxy ⁇ -ethoxy) -ethoxy] -ethyl ⁇ methylamino) -methyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Example 7 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with amine 32 by applying the method described for the preparation of compound 30 and then by reduction of the disulfide by applying the method described for the preparation of Example 6 .
  • Example 8 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - ⁇ (S) -1 - [(2R, 3R) - 3 (4-Mercaptomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl ⁇ -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • Example 8 (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - ⁇ (S) -1 - [(2R, 3R) -3 (4-Mercaptomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl ⁇ -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
  • modified hu2H11 antibodies are obtained at a concentration of 4.28 mg / ml (9.42 mg, 91%) with an average of 4.68 molecules of pyridyldisulfides per antibody.
  • 1.68 ml (7.2 mg, 0.049 ⁇ mol) of modified hu2H11 antibody are treated with 1.03 mg of (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3- ⁇ 4 [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl ⁇ -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-te
  • 13.5 mg (0.092 ⁇ mol, 1.318 ml) of naked antibody hu2H11 at an initial concentration of 10.24 mg / ml are treated with 6 eq. N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic acid (0.18 mg, 0.551 ⁇ mol) in solution in 38.4 ⁇ l of DMA so that the final antibody concentration is 9 mg / ml in the mixture.
  • 1.333 ml (12.0 mg, 0.081 ⁇ mol) of the modified antibody mixture hu2H1 1 are successively added to 1. 760 ml of buffer pH ⁇ 7.5.
  • Example 13 (4- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl ⁇ ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl ⁇ -piperazin-1-yl) -acetate
  • Tert-Butyl 34 4-Methoxycarbonylmethyl-piperazine-1-carboxylate compound
  • the derivative 1 (20 mg, 28.6 ⁇ mol) is placed in solution in anhydrous DCM (1 ml) and the TEA (71.5 ⁇ mol) and then the CMS (45.8 ⁇ mol) are added. After 12 h at RT, the product 2 formed is not isolated. The TEA (85.7 ⁇ mol) then the piperazin-1-yl-methyl acetate hydrochloride (42.8 ⁇ mol) are added. The mixture is stirred an additional 72 hours at RT before anhydrous DMF (1 ml) and NaI (30 ⁇ mol) are added. The mixture was stirred 48 h at 45 ° C before being diluted with TAcOEt (5 mL). The organic phase is washed with water (2 ⁇ 2 ml), with aq solution.
  • the expected product 38 is obtained in the form of a yellow oil (314 mg, 100%).
  • Example 13 (4- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl ⁇ -piperazin-1-yl) -acetate
  • Example 13 can be obtained by activating the acid 41 according to the method described for Example 18.
  • Example 14 (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-yl ⁇ ethyl) oxiranyl] benzylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Compound 42 allyl 3- (2- ⁇ 2- [2- (2-tert-butoxycarbonylamino-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate
  • Example 14 (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl (1-yl) ethoxy) ethoxy) oxyanyl] benzylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Example 14 can be obtained by deprotecting compound 44 according to the method described for compound 41 and by activating the acid obtained according to the method described for example 18.
  • Example 15 (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa- ⁇ , 11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-yl ⁇ ethyl) oxiranyl] benzylmethylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Example 15 Acid (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1- ⁇ - (3S, 10R, 16S) -10- [3 4-chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16- 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] benzylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Example 15 can be prepared by activating the acid 49 according to the method described for Example 18.
  • Example 16 (2- ⁇ 2- [2- (4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S ) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- ⁇ 3-chloro-4-methoxy-benzyl ⁇ -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo 1, 4-Dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl] -oxiranyl ⁇ -benzyl-piperazin-1-yl) ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl
  • Compound 50 3- ⁇ 2- [2- (2-hydroxyethoxy) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -propanoic acid
  • the compound 54 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with the amine 53 by applying the method described for the preparation of the compound 30.
  • Compound 55 can be obtained according to the method described for compound 41.
  • Example 16 (2- ⁇ 2- [2- (4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- ⁇ 3-Chloro 4-methoxy-benzyl-3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ethyl] oxiranyl ⁇ -benzyl-piperazin-1-yl) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate
  • Example 16 can be obtained according to the method described for Example 18.
  • Example 17 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 2- [4- (4- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5 , 9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa- dec-13-en-16-yl) ethyl) oxiranyl] benzyl ⁇ -piperazin-1-yl) -1,1-dimethyl-4-oxo-butylsulfanyl] -acetylamino ⁇ -ethoxy) -ethoxy] -ethoxy 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ⁇ ethoxy) propan
  • Example 17 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 2- [4- (4- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxybenzyl) -S-isobutyl- ⁇ .-dimethyl- .delta.-tetraoxo-1-dioxa- ⁇ .H-diaza-cyclohexadec -IS- ⁇ n- ⁇ -yl) -ethyl-oxiranyl] benzyl-piperazin-1-yl) -1,1-dimethyl-4-oxo-butylsulfanyl-acetylamino-ethoxy) ethoxy-ethoxy ⁇ ethoxy) -propionate of 2,5-dioxyrimidin-1-yl To a solution, purged with argon, of the compound Ex1 (15.6 mg, 17.
  • Example 18 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2S, 3S) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10 - [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa- ⁇ , 11-diaza-cyclohexa-dec-13 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-enyl-16-yl ⁇ -ethyl) -oxiranyl] -benzyloxycarbonylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate
  • Derivative 57 (20 mg, 28.6 ⁇ mol, prepared according to Al-awar RS, et al., J.Med.Chem., 2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous DCM (0.3 ml), the solution is purged with argon before TEA (40 ⁇ mol) and then 4-nitrophenyl chloroformate (32.32 ⁇ mol) are added. . After stirring for 30 minutes at RT, the mixture is hydrolyzed and diluted in 7 ml of AcOEt.
  • Example 18 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 4 - [(2S, 3S) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10 - [3-Chloro-4-methoxybenzyl-5-isobutyl- ⁇ . ⁇ -dimethyl] .delta.-tetraoxo-1-dioxa- ⁇ .H-diaza-cyclohexa-dec-IS-en 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl (5-dioxo-pyrrolidin-1-yl) -5-yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] benzyloxycarbonylamino ⁇ ethoxy) ethoxy] ethoxy ⁇ ethoxy) propanoate
  • Example 19 (1- ⁇ 4-r (2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10-r3-Chloro-4-methoxy-benzyl) 3-Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] benzyl 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ⁇ -1H-1,2,3-triazol-4-yl) -butanoate
  • Example 19 (1- ⁇ 4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - ⁇ (E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl ⁇ -ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl ⁇ -1H-1, 2,3-triazol-4-yl) -butanoate
  • Example 20 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 1 - [1 - (4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec Methyl-13-en-16-yl) -ethyl] oxiranyl ⁇ -benzyl) -1,2,3-triazol-1-yl] -methoxy-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate , 5-dioxa-pyrrolidin-1-yl
  • Example 20 3- (2- ⁇ 2- [2- (2- ⁇ 1- [1- (4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -S-isobutyl- ⁇ -dimethyl- ⁇ -diethyl-tetraoxo-1-dioxa- ⁇ -H-diaza-cyclohexadec-IS- 1- (2-yl) -ethyl] -oxiranyl ⁇ -benzyl) -1,2,3-triazol-1-yl] -methoxy ⁇ -ethoxy) -ethoxy] -ethoxy ⁇ -ethoxy) -propanoate 2.5 g. dioxa-pyrrolidin-1-yl
  • Example 20 can be obtained from compounds 60 and 65 according to the method described for compound 61 and then activating the acid according to the method described for example 19.
  • Example 21 (4- ⁇ 1 - [(4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- ⁇ 3-chloro-4-methoxy-benzyl ⁇ -3-isobutyl-6, 6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl] -oxiranyl ⁇ -benzyl) -methylamino] methyl 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ⁇ -1,2,3-triazol-1-yl) -butanoate
  • Example 21 (4- ⁇ 1 - [(4 - ⁇ (2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- ⁇ 3-chloro-4 Methoxy-benzyl-3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl] oxiranyl ⁇ benzyl) methylamino] methyl] -1,2,3-triazol-1-yl) butanoate
  • Example 21 can be obtained by activation of the acid 69 according to the method described for Example 19.
  • Alolol 57 (36 mg, 51.48 ⁇ mol, prepared according to Al-awar RS, et al., J.Med.Chem.2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous THF (2 ml). The solution is purged with argon and cooled with an ice-water bath before adding the DPPA (74 ⁇ mol) then the DBU (80 ⁇ mol). The mixture is allowed to return to RT and stirring is continued overnight. The next day, the solution is cooled again with an ice-water bath, then 74 ⁇ mol of DPPA and 80 ⁇ mol of additional DBU are added. After 2 h of reaction at 0 ° C.
  • the compound 76 (6 mg, 4.93 ⁇ mol) is dissolved in a mixture of DCM (0.5 ml) and DMF (0.1 ml) and then the N, N'-disuccinimidyl carbonate is successively added. (6 mg, 23.42 ⁇ mol) and DIPEA (4 ⁇ l, 22.96 ⁇ mol). After 3 hours of reaction at RT, a solution aq. Saturated with NH 4 CI is added and the mixture is extracted 3 times with DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under RP. The crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 90/10.
  • Example 23 can be obtained by activating the acid 80 according to the method described for Example 22.
  • EXAMPLE 24 4 - ((2S, 3S) -3 - ⁇ (S) -1 - [(E) - (3S) [2-Methyl-2- (pyridin-2-yldisulfanyl) -propyl] -methyl-carbamate 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl] -ethyl ⁇ -oxiranyl) -benzyl
  • Example 24 4 - ((2S, 3S) -3 - ⁇ (S) - 1 - [(E) - (3S) [2-Methyl-2- (pyridin-2-yldisulfanyl) -propyl] -methyl-carbamate 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl] -ethyl ⁇ -oxiranyl) -benzyl
  • HRMS cryptophycin derivatives
  • -Lys- means that the attachment is to the ⁇ -amino groups of the lysines of the anti ⁇ rps.
  • the MDA-MB-231, MDA-A1 or HCT116 cells in their exponential growth phase are trypsinized and delivered in suspension in their respective culture medium (DMEM / F12 Gibco # 21331, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2 nM Gibco Glutamine # 25030 for MDA cells, DMEM Gibco # 11960, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2mM Glutamine Gibco # 25030 for HCT116 cells).
  • the cell suspension is seeded into Cytostar 96-well culture plates (GE Healthcare Europe, # RPNQ0163) in the complete culture medium containing serum at a density of 5000 cells / well (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT1 16). After 4 hours of incubation, successive dilutions of the cryptophycin derivatives are added to the wells at decreasing concentrations of 10 -7 to 10 -12 M (in triplicate for each concentration). The cells are cultured for 3 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere in the presence of cytotoxic agents.
  • Example 29 Evaluation of the inhibition of proliferation of MDA-MB-231, MDA-A1 and HCT116 cell lines by antibody-cytotoxic conjugates
  • the MDA-MB-231, MDA-A1 or HCT116 cells in their exponential growth phase are trypsinized and resuspended in their respective culture medium (DMEM / F12 Gibco # 21331, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2 nM Gibco glutamine # 25030 for MDA cells, DMEM Gibco # 1 1960, 10% SVF Gibco # 10500-056, 2 mM Glutamine Gibco # 25030 for 16 HCT1 cells.
  • the cell suspension is seeded into Cytostar 96-well culture plates (GE Healthcare Europe, # RPNQ0163) in the complete culture medium containing serum at a density of 5000 cells / well (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT1 16).
  • the data are expressed as a percentage of survival by making the ratio between the count obtained with the cells treated with the immunoconjugate and that obtained with the cells of the control wells (treated with the culture medium alone).
  • the naked antibody hu2H11 was added to the wells at a concentration of 1 ⁇ M at the start of the experiment and the inhibition of proliferation was measured as previously described.

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Abstract

The invention relates to a targeting agent, to which at least one cryptophycin is attached, of the formula (I), where: R1 is a halogen atom and R2 is an OH group, an acyl group derived from an amino acid AA or a (C1-C4)alkanoyloxy group; or else R1 and R2 together form an epoxy unit; AA denotes a natural or artificial amino acid; R3 is a (C1-C6)alkyl group; R4 and R5 are both H or together form a CH=CH double bond between C13 and C14; R6 and R7 are, independently from one another, H or a (C1-C6)alkyl group; R8 and R9 are, independently from one another, H or a (C1-C6)alkyl group; R10 is at least one substituent of the phenyl core selected from among: H, an OH group, (C1-C4)alkoxy, a halogen atom or a NH2, NH(C1-C6)alkyl, or N(C1-C6)alkyl group; R11 is at least one substituent of the phenyl core selected from among H or a (C1- C4)alkyl group; the targeting agent and the cryptophycin derivative being covalently bonded, the bond being located at the ortho (o), meta (m), or para (p) position of the phenyl core containing the CR1 unit.

Description

NOUVEAUX CONJUGUES, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN  NEW CONJUGATES, THEIR PREPARATION AND APPLICATION IN
THERAPEUTIQUE La présente invention se rapporte à des conjugués de cryptophycines, les compositions les contenant et leur application thérapeutique, notamment comme anticancéreux. L'invention se rapporte aussi au procédé de préparation de ces composés ainsi qu'aux dérivés de cryptophycines eux-mêmes. [Domaine technique]  The present invention relates to conjugates of cryptophycins, the compositions containing them and their therapeutic application, especially as anticancer agents. The invention also relates to the process for preparing these compounds as well as to the cryptophycin derivatives themselves. [Technical area]
Les cryptophycines sont des métabolites secondaires appartenant à la classe des macrocycles depsipeptidiques produits par les cyanobactéries du genre Nostoc. Leur nom se réfère au fait qu'elles sont hautement cytotoxiques vis-à-vis des levures du genre cryptococcus. Le premier représentant de cette classe de molécules, la cryptophycine-1 (C-1), a été isolé en 1990 de cyanobacterium Nostoc sp (ATCC 53789) (voir Eiβler S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747-3789). La structure, la formule générale ainsi que la numérotation des atomes de carbone de ces composés, telle que décrite dans WO 98/08505, sont rappelées ci-dessous :  Cryptophycins are secondary metabolites belonging to the class of depsipeptide macrocycles produced by cyanobacteria of the genus Nostoc. Their name refers to the fact that they are highly cytotoxic to cryptococcal yeasts. The first representative of this class of molecules, cryptophycin-1 (C-1), was isolated in 1990 from cyanobacterium Nostoc sp (ATCC 53789) (see Eiβler S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747-3789 ). The structure, the general formula and the numbering of the carbon atoms of these compounds, as described in WO 98/08505, are given below:
Les cryptophycines C-1 et C-52, qui se caractérisent par une fonction époxyde représentée ci- dessous, ont des propriétés anticancéreuses. Des essais cliniques de phase II dans le cancer du poumon ont été conduits avec C-52 (LY 355073) : voir Edelman MJ. , et al., Lung Cancer 2003, Cryptophycins C-1 and C-52, which are characterized by an epoxide function shown below, have anticancer properties. Phase II clinical trials in lung cancer were conducted with C-52 (LY 355073): see Edelman MJ. , et al., Lung Cancer 2003,
39, 197-199 ; Sessa C, et al., Eur.J.Cancer 2002, 38, 2388-96. La cryptophycine C-55, prodrogue de C-52, se caractérise quant à elle par une fonction chlorhydrine en lieu et place de la fonction époxyde (Bionpally R. R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003, 52, 25-33). C-55 s'est avérée très active mais n'est pas stable en solution. Des dérivés de type glycinate de chlorhydrine tel que le composé C-55 Gly ont également été décrits pour gagner en stabilité39, 197-199; Sessa C, et al., Eur.J.Cancer 2002, 38, 2388-96. Cryptophycin C-55, a C-52 prodrug, is characterized by a chlorohydrin function instead of the epoxide function (Bionpally R.R., et al., Cancer Chemother Pharmacol 2003, 52, 25-33). C-55 has been very active but is not stable in solution. Chlorhydrin glycinate derivatives such as the compound C-55 Gly have also been described to improve their stability.
(Liang J., et al., Investigational New Drugs 2005, 23, 213-224). (Liang J., et al., Investigational New Drugs 2005, 23, 213-224).
[Problème technique] [Technical problem]
La chimie des conjugués est connue depuis de nombreuses années et a été appliquée à plusieurs familles de cytotoxiques comme par exemple les maytansinoïdes (WO 04103272), les taxanes (WO 06061258), les tomaymycines (WO 09016516), les leptomycines (WO 07144709), le CC-1065 et ses analogues (WO 2007102069); voir aussi à propos des conjugués, Monneret C, et al., Bulletin du Cancer. 2000, 87(1 1 ), 829-38 ; Ricart A.D., et al., Nature Clinical Practice Oncology 2007, 4, 245-255. Cependant, elle n'a pas été appliquée aux dérivés de cryptophycine conjugués à des anticorps ou à d'autres agents de ciblage.  Conjugate chemistry has been known for many years and has been applied to several cytotoxic families, for example maytansinoids (WO 04103272), taxanes (WO 06061258), tomaymycins (WO 09016516), leptomycins (WO 07144709), CC-1065 and its analogs (WO 2007102069); see also about conjugates, Monneret C, et al., Cancer Bulletin. 2000, 87 (1 1), 829-38; Ricart A.D., et al., Nature Clinical Practice Oncology 2007, 4, 245-255. However, it has not been applied to cryptophycin derivatives conjugated to antibodies or other targeting agents.
Le problème technique qu'entend résoudre la présente invention est de proposer de nouveaux conjugués à base de dérivés de cryptophycine, ainsi que de nouveaux dérivés de cryptophycine aptes à être conjugués. The technical problem to be solved by the present invention is to propose novel conjugates based on cryptophycin derivatives, as well as novel cryptophycin derivatives capable of being conjugated.
[Art antérieur] [Prior art]
EP 0830136 et WO 98/08505 décrivent des dérivés de cryptophycines mais ne décrivent pas de conjugués de cryptophycines. WO 98/08505 décrit des dérivés de cryptophycines de formule  EP 0830136 and WO 98/08505 describe cryptophycin derivatives but do not describe cryptophycin conjugates. WO 98/08505 discloses cryptophycin derivatives of formula
(A) : dans laquelle Ar peut représenter un groupe Ar' de (A): in which Ar can represent a group Ar 'of
formu : dans laquelle R54 représente H, un groupe (C1-C6)alkyle, (C1;formu wherein R 54 is H, (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 1 ;
Cfi)alkyle(R57,R57',R57"), aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, COOR57, PO3H, SO3H, SO2R58, NR59R60, NHOR6-I, NHOR6-T, CN, NO2, OR62, CH9OR6?', CH9NRg6Rg6', (C1; Cfi) alkyl (R57, R57 ', R57 "), aryl, phenyl, heterocycloalkyl, halogen, COOR 57 , PO 3 H, SO 3 H, SO 2 R 58 , NR 59 R 60 , NHOR 6 -I , NHOR 6 -T, CN, NO 2 , OR 62 , CH 9 OR 6 ? ', CH 9 NR 6 R 6 ', (C 1 ;
ÇβJaJkyJeORiQQ, SR63 ; R55 et R56 représentent H, un groupe (C1-C6)alkyle, ÇβJaJkyJeORiQQ, SR 63 ; R 55 and R 56 represent H, a (C 1 -C 6 ) alkyl group,
C(R511R5?', R5?"), aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, COOR57, PO3H, SO3H, SO2R58, NRSgRg2, NHOR6I, NHCHR61', CN, NO2, OR62, CH9OR69', CH9OCORg5, CH9NRg6Rg6', (C1-C6)BIkVIeORi00, (C1-C6JaIkVIeN RMR60. WO 98/08505 décrit notamment les composés suivants : (∞mposé 24, schéma 4) C (R 511 R 5 ? ', R 5 ? "), Aryl, phenyl, heterocycloalkyl, a halogen atom, COOR 57 , PO 3 H, SO 3 H, SO 2 R 58 , NR S gRg 2 , NHOR 6I , NHCHR 61 ', CN, NO 2 , OR 62 , CH 9 OR 69 ', CH 9 OCORg 5 , CH 9 NR 6 R 6 ', (C 1 -C 6 ) BIkVIeORi 00 , (C 1 -C 6 JaRKVIeN RMR . WO 98/08505 describes in particular 60 the following compounds: (∞mposé 24, diagram 4)
(ex.74) (Ex.74)
qui se caractérisent pas le groupe terminal -NHC(=O)Ot-Bu. WO 98/08505 ne précise pas que ces composés sont aptes ou destinés à être conjugués. US 2007/0213511 décrit des immunoconjugués de calichéamicine. Parmi ceux-ci, mention est faite du MYLOTARG® (ou CMA-676) qui est un immunoconjugué de calichéamicine utilisé dans le traitement de l'AML (anti-CD33-calichéamicine). Voir aussi à propos des conjugués : WO 2006/042240. Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46(14), 2985-3007 et Al-awar R.S., et al., Mol.Cancer Ther. 2004, 3(9), 1061-1067 décrivent des dérivés de cryptophycine, ainsi que leurs évaluations in vivo. which are not characterized by the terminal group -NHC (= O) Ot-Bu. WO 98/08505 does not specify that these compounds are suitable or intended to be conjugated. US 2007/0213511 discloses immunoconjugates of calichéamicine. Among these, mention is made of Mylotarg ® (or CMA-676) which is a calicheamicin immunoconjugate used in the treatment of AML (anti-CD33-calicheamicin). See also about the conjugates: WO 2006/042240. Al-awar RS, et al., J.Med.Chem. 2003, 46 (14), 2985-3007 and Al-awar RS, et al., Mol.Cancer Ther. 2004, 3 (9), 1061-1067 describe cryptophycin derivatives, as well as their in vivo evaluations.
WO 08010101 décrit un anticorps monoclonal anti-EphA2 ainsi que les conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé cytotoxique attachée(s) à l'anticorps monoclonal. WO 08047242 décrit un anticorps monoclonal anti-CD38 ainsi que les conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé cytotoxique attachée(s) à l'anticorps monoclonal. Le composé cytotoxique peut être choisi parmi les maytansinoïdes, les taxanes, les tomaymycines, les leptomycines, le CC-1065 et ses analogues. WO 08010101 discloses an anti-EphA2 monoclonal antibody and the corresponding conjugates comprising one or more molecules of a cytotoxic compound attached to the monoclonal antibody. WO 08047242 discloses an anti-CD38 monoclonal antibody as well as the corresponding conjugates comprising one or more molecules of a cytotoxic compound attached to the monoclonal antibody. The cytotoxic compound may be selected from maytansinoids, taxanes, tomaymycins, leptomycins, CC-1065 and its analogs.
WO 2009/126934 décrit des anticorps anti-CD70 et leurs conjugués avec des composés cytotoxiques ; la cryptophycine est citée parmi les cytotoxiques. WO 2009/134976 décrit des conjugués avec un taux de subsitution optimisé pour délivrer la quantité nécessaire de cytotoxique dans la cellule ; la cryptophycine est citée parmi les cytotoxiques. WO 2009/126934 discloses anti-CD70 antibodies and their conjugates with cytotoxic compounds; cryptophycin is cited among the cytotoxics. WO 2009/134976 discloses conjugates with an optimized substitution rate to deliver the required amount of cytotoxic to the cell; cryptophycin is cited among the cytotoxics.
WO 2005/116255 décrit des conjugués d'aptamères et d'un cytotoxique pouvant être une cryptophycine (voir [0037] et Tableau 2), le linker pouvant comprendre une chaîne PEG ([0038]). Plus particulièrement, la cryptophycine Cryp-NH2 est décrite : WO 2005/116255 discloses aptamer conjugates and a cytotoxic which may be a cryptophycin (see [0037] and Table 2), the linker may comprise a PEG chain ([0038]). More particularly, Cryptophycin Cryp-NH 2 is described:
ainsi que ses conjugués d'aptamères avec les linkers suivants : NHS-PEG-erythritol, pNP-PEG- erythritol, NHS-PEG-octaPEG, pNP-PEG-octaPEG et PEG-comb (Tableaux 3 et 4). La nature de l'enchaînement sur le cycle phényle (-CH2θ-C(=O)-CMe2-CH2NH-...) est différent de ce qui est envisagé dans la présente invention. WO 2006/096754 décrit également des conjugués d'aptamères et d'un cytotoxique qui peut être aussi une cryptophycine. as well as its aptamer conjugates with the following linkers: NHS-PEG-erythritol, pNP-PEG-erythritol, NHS-PEG-octaPEG, pNP-PEG-octaPEG and PEG-comb (Tables 3 and 4). The nature of the sequence on the phenyl ring (-CH 2 θ-C (= O) -CMe 2 -CH 2 NH -...) is different from what is envisaged in the present invention. WO 2006/096754 also describes aptamer conjugates and a cytotoxic which can also be a cryptophycin.
WO 2009/002993 décrit des conjugués de cytotoxique de formule B-L-A comprenant des linkers hydrophiles, par exemple le linker de formule : WO 2009/002993 discloses cytotoxic conjugates of formula BLA comprising hydrophilic linkers, for example the linker of formula:
Le cytotoxique peut être une cryptophycine (page 46) mais sans préciser le point d'attachement du linker. Un exemple de conjugué est le EC0262 :  The cytotoxic may be a cryptophycin (page 46) but without specifying the point of attachment of the linker. An example of a conjugate is EC0262:
dont le linker et le point d'ancrage sont différents de ce qui est envisagé dans la présente invention. whose linker and anchor are different from what is contemplated in the present invention.
[Définitions] [Definitions]
On entend par : We hear by :
• conjugué : un agent de ciblage cellulaire auquel est attaché de façon covalente au moins une molécule d'un composé cytotoxique ;  Conjugate: a cell targeting agent to which at least one molecule of a cytotoxic compound is covalently attached;
• agent de ciblage cellulaire (ou « cell binding agent » en anglais) : une molécule ayant une affinité pour une cible biologique : il peut s'agir par exemple d'un ligand, d'une protéine, d'un anticorps, plus particulièrement monoclonal, d'un fragment de protéine ou d'anticorps, d'un peptide, d'un oligonucléotide, d'un oligosaccharide. L'agent de ciblage a pour fonction de diriger le composé biologiquement actif comme un cytotoxique vers la cible biologique. De préférence, l'agent de ciblage n'est pas un aptamère ;  Cell targeting agent (or "cell binding agent" in English): a molecule having an affinity for a biological target: it may be for example a ligand, a protein, an antibody, more particularly monoclonal, a protein or antibody fragment, a peptide, an oligonucleotide, an oligosaccharide. The targeting agent has the function of directing the biologically active compound as a cytotoxic agent to the biological target. Preferably, the targeting agent is not an aptamer;
• cible biologique : un antigène (ou groupe d'antigènes) localisé préférentiellement à la surface des cellules cancéreuses ou cellules stromales associées à cette tumeur; ces antigènes pouvant être par exemple, un récepteur de facteur de croissance, un produit d'oncogène ou de gène « suppresseur de tumeur » muté, une molécule liée à l'angiogénèse, une molécule d'adhésion ;  • biological target: an antigen (or group of antigens) preferentially localized on the surface of the cancerous cells or stromal cells associated with this tumor; such antigens may be, for example, a growth factor receptor, a mutant tumor suppressor or "tumor suppressor" product, a molecule related to angiogenesis, an adhesion molecule;
• linker : un ensemble d'atomes permettant d'attacher de façon covalente un composé cytotoxique à l'agent de ciblage ;  • linker: a set of atoms to covalently attach a cytotoxic compound to the targeting agent;
• groupe alkyle : un groupe hydrocarboné aliphatique saturé obtenu en enlevant un atome d'hydrogène d'un alcane. Le groupe alkyle peut être linéaire ou ramifié. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, iso-butyle, tertio-butyle, pentyle, 2,2-diméthylpropyle, hexyle ; Alkyl group: a saturated aliphatic hydrocarbon group obtained by removing a hydrogen atom from an alkane. The alkyl group can be linear or branched. As examples, we mention may be made of methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, 2,2-dimethylpropyl and hexyl groups;
• groupe cycloalkyle : un groupe alkyle cyclique comprenant entre 3 et 8 atomes de carbone engagés dans la structure cyclique. A titre d'exemples, on peut citer les groupes cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle ;  Cycloalkyl group: a cyclic alkyl group comprising between 3 and 8 carbon atoms engaged in the cyclic structure. By way of examples, mention may be made of cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl groups;
• groupe hétérocycloalkyle : un groupe cycloalkyle comprenant au moins un hétéroatome (O, S, N) engagé dans le cycle et relié aux atomes de carbone formant le cycle ;  Heterocycloalkyl group: a cycloalkyl group comprising at least one heteroatom (O, S, N) engaged in the ring and connected to the carbon atoms forming the ring;
• groupe alcoxy : un groupe -O-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci-dessus ;  Alkoxy group: an -O-alkyl group, wherein the alkyl group is as defined above;
• groupe alcanoyloxy : un groupe -O-CO-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci- dessus ;  Alkanoyloxy group: a group -O-CO-alkyl, where the alkyl group is as defined above;
• groupe alkylène : un groupe divalent saturé de formule brute -CnH2n-, obtenu en enlevant deux atomes d'hydrogène d'un alcane. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthylène (-CH2-), éthylène (-CH2CH2-), propylène (-CH2CH2CH2-), butylène (-CH2CH2CH2CH2-), Alkylene group: a saturated divalent group of the formula -C n H 2n -, obtained by removing two hydrogen atoms from an alkane. By way of examples, mention may be made of the methylene groups (-CH 2 -), ethylene (-CH 2 CH 2 -), propylene (-CH 2 CH 2 CH 2 -), butylene (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -),
A A ' hexylène (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-) ou les groupes ramifiés suivants n , / x ; AA 'hexylene (-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -) or the following branched groups n , / x ;
« de préférence, le groupe alkylène est de formule -(CH2)n-, n représentant un nombre entier ;Preferably, the alkylene group is of the formula - (CH 2 ) n -, n represents an integer;
• dans les plages de valeurs, les bornes sont incluses (par ex. une plage du type « n allant de 1 à 6 » ou bien « compris entre 1 et 6 » inclut les bornes 1 et 6). • In the value ranges, the terminals are included (eg a range of "n from 1 to 6" or "from 1 to 6" includes terminals 1 and 6).
Abréviations utilisées Abbreviations used
AcOEt : acétate d'éthyle ; ALK : groupe (C1-Ci2)alkylène, plus particulièrement (C1-CβJalkylène, plus particulièrement de la forme -(CH2)n- n étant un entier de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ; aq. : aqueuse ; CCM : chromatographie sur couche mince (TLC en Anglais) ; CMS : chlorure de AcOEt: ethyl acetate; ALK: (C 1 -C 12 ) alkylene group, more particularly (C 1 -Cβ) alkylene, more particularly of the form - (CH 2 ) n - n being an integer of 1 to 12, preferably 1 to 6; : aqueous, TLC: thin layer chromatography (TLC);
méthanesulfonyle ; crypto désigne le motif de crypto désigne notamment l'un des dérivés de cryptophycine D1-D8 décrits plus loin ou un dérivé de cryptophycine d'un exemple ; Rf : facteur de rétention ; DAR : taux de substitution (drug-antibody ratio) ; DBU : 1 ,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène ; DCC : N,N'-dicyclohexylcarbodiimide ; DCM : dichlorométhane ; DEAD : diéthylazodicarboxylate ; DIC : N,N'-diisopropylcarbodiimide ; DIPEA : N,N-diisopropyléthylamine ; DMA : diméthylacétamide ; DMAP : 4-diméthylaminopyridine ; DME : diméthoxyéthane ; DMF : diméthylformamide ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; EEDQ : 2-éthoxy-1- éthoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoline ; EDCI : N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide ; EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique ; éq. : équivalent ; Fmoc : fluorénylméthoxycarbonyl ; HOBt : 1-hydroxybenzotriazole ; HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1- pipérazineéthanesulfonique ; mCPBA : acide m-chloroperbenzoïque ; NHS : N- hydroxysuccinimide ; NMP : N-méthylpyrrolidinone ; PA : pression atmosphérique ; PABAC : « para-aminobenzylic alcohol carbonate » ; PR : pression réduite ; SEC : chromatographie d'exclusion stérique ; SPE : extraction sur phase solide ; TA : température ambiante ; TBDMS : tert-butyldiméthylsilyl ; TCEP : chlorhydrate de tris-(2-carboxyéthyl)-phosphine ; TEA : triéthylamine ; TFA : acide trifluoroacétique ; TIPS : triisopropylsilyl ; THF : tétrahydrofurane ; tR : temps de rétention. methanesulfonyl; crypto means the reason for crypto denotes in particular one of the cryptophycin derivatives D 1 -D 8 described below or a cryptophycin derivative of an example; Rf: retention factor; DAR: drug-antibody ratio; DBU: 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene; DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCM: dichloromethane; DEAD: diethylazodicarboxylate; DIC: N, N'-Diisopropylcarbodiimide; DIPEA: N, N-diisopropylethylamine; DMA: dimethylacetamide; DMAP: 4-dimethylaminopyridine; DME: dimethoxyethane; DMF: dimethylformamide; DMSO: dimethyl sulfoxide; EEDQ: 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline; EDCI: N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide; EDTA: ethylene-diamine-tetraacetic acid; eq. : equivalent; Fmoc: fluorenylmethoxycarbonyl; HOBt: 1-hydroxybenzotriazole; HEPES: 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine-ethanesulfonic acid; mCPBA: m-chloroperbenzoic acid; NHS: N-hydroxysuccinimide; NMP: N-methylpyrrolidinone; PA: atmospheric pressure; PABAC: "para-aminobenzylic alcohol carbonate"; PR: reduced pressure; SEC: chromatography steric exclusion; SPE: solid phase extraction; TA: room temperature; TBDMS: tert-butyldimethylsilyl; TCEP: tris- (2-carboxyethyl) -phosphine hydrochloride; TEA: triethylamine; TFA: trifluoroacetic acid; TIPS: triisopropylsilyl; THF: tetrahydrofuran; t R : retention time.
[Description détaillée de l'invention] [Detailed description of the invention]
L'invention est relative à un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine de formule (I) :  The invention relates to a targeting agent to which at least one cryptophycin derivative of formula (I) is attached:
dans laquelle : in which :
• Ri représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe -OH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1-C4)alcanoyloxy ; R 1 represents a halogen atom and R 2 represents an -OH group, an acyl group derived from an amino acid AA or a (C 1 -C 4 ) alkanoyloxy group;
ou bien R1 et R2 forment ensemble un motif époxyde ; or R 1 and R 2 together form an epoxy unit;
• AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ;  • AA means a natural or unnatural amino acid;
• R3 représente un groupe (C1-CβJalkyle ; R3 represents a group (C 1 -Cβ alkyl);
• R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13 et C14 ; • R 4 and R 5 are both H or together form a double bond CH = CH between C13 and C14;
• Rβ et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; Rβ and R 7 represent independently of each other H or a group (C 1 -Cβ alkyl);
• Rs et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; • Rs and R 9 represent independently of each other H or a group (C 1 -Cβ alkyl);
• R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe -OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène ou bien un groupe -NH2, -NH(d-C6)alkyle ou -N(Cr C6)alkyle2 ; • R 1 0 represents at least one substituent of the phenyl ring selected from: H, -OH, (C 1 -C 4) alkoxy, a halogen atom or -NH 2, -NH (d-C6 ) alkyl or -N (Cr C 6 ) alkyl 2 ;
• Rn représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (Cr C4)alkyle ; Rn represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H or a (Cr C 4 ) alkyl group;
l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon covalente, l'attachement se situant en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRi. positions ortho (o), meta (m) ou para( p) : the targeting agent and the cryptophycin derivative being covalently attached, the attachment being in the ortho (o), meta (m) or para (p) position of the phenyl ring bearing the CRi motif. positions ortho (o), meta (m) or para (p):
Ri représente un atome d'halogène, plus particulièrement Cl. R3 représente un groupe (Cr Cβjalkyle, plus particulièrement Me. Re et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; plus particulièrement ils représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe Me. Rs et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (Cr Cβjalkyle ; plus particulièrement R8 représente H et R9 représente isobutyle. R 1 represents a halogen atom, more particularly Cl. R 3 represents a group (Cr Cβjalkyl, more particularly Me, Re and R 7 represent independently of each other H or a group (C 1 -Cβ) alkyl, more particularly they represent independently of one another H or a group Me. Rs and R 9 represent independently of each other H or a group (Cr C β alkyl), more particularly R 8 represents H and R 9 represents isobutyl.
Rio représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H, un groupe OH, (Cr C4)alcoxy, un atome d'halogène. Il peut s'agir aussi d'un groupe -NH2, -NH(C1-C6)alkyle ou - N(C1-C6)alkyle2 tel que par exemple -NH2 ou -NMe2, de préférence en position 3 ou 4 sur le noyau phényle. Plus particulièrement, le noyau phényle comprend deux substituants en position 3 et 4 sur le noyau phényle. De préférence, il s'agit de 3-CI et 4-méthoxy. Rn représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C1-C4)alkyle ; plus particulièrement H. Rio represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H, an OH group, (Cr C 4 ) alkoxy, a halogen atom. It can also be a group -NH 2 , -NH (C 1 -C 6 ) alkyl or - N (C 1 -C 6 ) alkyl 2 such as for example -NH 2 or -NMe 2 , preferably in position 3 or 4 on the phenyl nucleus. More particularly, the phenyl ring comprises two substituents at the 3- and 4-positions on the phenyl ring. Preferably it is 3-Cl and 4-methoxy. Rn represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H or a (C 1 -C 4 ) alkyl group; more particularly H.
Plus particulièrement, on pourra choisir l'un des substituants Ri à Rn parmi ceux décrits dans les exemples. Chaque substituant R1 à Rn pourra aussi adopter une des configurations spatiales (par ex. R ou S ou bien Z ou E) telle que décrite dans les exemples. More particularly, it will be possible to choose one of the substituents Ri to Rn from those described in the examples. Each substituent R 1 to R n may also adopt one of the spatial configurations (for example R or S or else Z or E) as described in the examples.
AA représente un acide aminé naturel ou non naturel. Il peut s'agir d'un acide aminé α, β ou γ. On peut citer notamment les acides aminés suivants : alanine (Ala), β-alanine, acide 2-amino-2- cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), praline (Pro), serine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide γ-aminobutyrique, acide α,α-diméthyl γ-aminobutyrique, acide β,β-diméthyl γ-aminobutyrique, omithine (Om), citrulline (Cit) ainsi que les formes protégées desdits acides aminés (par ex. par acétyl, formyl, tosyl, nitro). De préférence, il s'agit d'un acide aminé naturel. Plus particulièrement, il s'agit de la glycine. AA represents a natural or unnatural amino acid. It can be an amino acid α, β or γ. Mention may in particular be made of the following amino acids: alanine (Ala), β-alanine, 2-amino-2-cyclohexylacetic acid, 2-amino-2-phenylacetic acid, arginine (Arg), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys ), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), praline ( Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), γ-aminobutyric acid, α, α-dimethyl γ-aminobutyric acid, β, β-dimethyl γ acid aminobutyric, omithine (Om), citrulline (Cit) and protected forms of said amino acids (eg acetyl, formyl, tosyl, nitro). Preferably, it is a natural amino acid. More particularly, it is glycine.
Ri et R2 peuvent aussi former ensemble un motif époxyde. Ri and R 2 may also together form an epoxy unit.
L'attachement entre le dérivé de cryptophycine et l'agent de ciblage est réalisé par l'intermédiaire d'un linker L positionné en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR-i; ainsi, le dérivé de cryptophycine apte à la conjugaison a pour formule (II) : The attachment between the cryptophycin derivative and the targeting agent is carried out via a linker L positioned in the ortho (o), meta (m) or para (p) position of the phenyl ring bearing the CR-unit. i; thus, the conjugatable cryptophycin derivative has the formula (II):
(H) L'attachement au niveau de l'agent de ciblage se situe à l'autre extrémité du linker L au niveau d'un groupe réactif présent sur l'agent de ciblage. Ainsi, L comprend au moins un groupe chimique réactif (GCR1 ) vis-à-vis d'un groupe chimique réactif (GCR2) présent sur l'agent de ciblage. La réaction entre GCR1 et GCR2 assure l'attachement du composé de formule (II) sur l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente. Ainsi, le dérivé de cryptophycine de formule (II) est apte à être conjugué à un agent de ciblage. (H) Attachment at the level of the targeting agent is at the other end of linker L at a reactive group present on the targeting agent. Thus, L comprises at least one reactive chemical group (GCR1) with respect to a reactive chemical group (GCR2) present on the targeting agent. The reaction between GCR1 and GCR2 ensures the attachment of the compound of formula (II) to the targeting agent by formation of a covalent bond. Thus, the cryptophycin derivative of formula (II) is capable of being conjugated to a targeting agent.
Les dérivés de cryptophycine de la présente invention, y compris ceux exemplifiés, peuvent exister à l'état de bases ou de sels d'addition à des acides, notamment des acides pharmaceutiquement acceptables. The cryptophycin derivatives of the present invention, including those exemplified, may exist in the form of bases or addition salts with acids, in particular pharmaceutically acceptable acids.
A titre d'exemples de GCR1 , on peut citer : As examples of GCR1, mention may be made of:
(i) le groupe réactif -SZa pour lequel Z3 représente H ou le groupe -SR3 et R3 représentant un groupe (C1-C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ; (i) the reactant -SZ group wherein Z 3 is H or -SR 3 and R 3 is a (C 1 -C 6) alkyl, (C 3 -C 7) cycloalkyl, aryl, heteroaryl or ( C 3 -C 7 ) heterocycloalkyl;
(ii) le groupe réactif -C(=O)-ZbRb pour lequel Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, plus particulièrement -O-, et Rb représentant H ou un groupe (C1-CβJalkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ; (ii) the reactive group -C (= O) -Z b R b for which Z b represents a single bond, -O- or -NH-, more particularly -O-, and R b represents H or a group (C 1 -Cβ-alkyl, (C 3 -C 7 ) cycloalkyl, aryl, heteroaryl or (C 3 -C 7 ) heterocycloalkyl;
(iii) l'un des groupes réactifs suivants : -Cl, -N3, -OH, -NH2, le groupe réactif maléimido ou haloacétamido. avec R12 représentant H ou un groupe (C1-CβJalkyle, plus particulièrement Me dans le cas des composés de formule (III) : (iii) one of the following reactive groups: -Cl, -N 3 , -OH, -NH 2 , the maleimido reactive group or haloacetamido. with R 12 representing H or a group (C 1 -Cβ) alkyl, more particularly Me in the case of the compounds of formula (III):
I  I
comprenant le groupe G= -(CH2)nY avec Y= -Cl, -N3, -OH, -NH2, aveccomprising the group G = - (CH 2 ) n Y with Y = -Cl, -N 3 , -OH, -NH 2 , with
Ri2 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me ; ou l R 2 representing H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly Me; or l
(iv) le groupe réactif maléimido avec Ri2 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me. Plus particulièrement, -SZa peut représenter -SH ou -SS(C1-C6)alkyle, notamment -SSMe, ou - (iv) the maleimido reactive group with R 2 representing H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly Me. More particularly, -SZ a may represent -SH or -SS (C 1 -C 6 ) alkyl, especially -SSMe, or -
SS-hétéroaryle, notamment ou SS-heteroaryl, especially or
(Xi et X2 étant définis plus bas). Plus particulièrement, -ZbRb peut représenter -OH, -OCH3, -OCH2CH=CH2, // (Xi and X 2 being defined below). More particularly, -Z b R b may represent -OH, -OCH 3 , -OCH 2 CH = CH 2 , //
— ' dans lequel Gl représente au moins un groupe électroinductif tel que -NO2 ou -HaI, notamment -F. Il peut s'agir par exemple In which Gl represents at least one electroinductive group such as -NO 2 or -HaI, especially -F. It may be for example
des groupes suivants : x— ' ou . Un autre type de groupe -C(=O)ZbRb est following groups: x - 'or. Another type of group -C (= O) Z b R b is
le suivant : présentent une bonne réactivité.the following : have a good responsiveness.
Plus particulièrement, GCR1 pourra être choisi parmi l'un de ceux décrits dans les exemples. A titre d'exemple de GCR2, on peut citer les groupes ε-amino des lysines portés par les chaînes latérales des résidus lysine qui sont présents à la surface d'un anticorps, les groupes saccharides de la région charnière ou les thiols de cystéines par réduction de liaisons disulfures intra-chaînes (Garnett M. C, et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001 , 53, 171-216). Plus récemment d'autres approches ont été considérées comme l'introduction de cystéines par mutation (Junutula J. R., et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932; WO 09026274) ou l'introduction d'acides aminés non-naturels permettant d'autres types de chimie (de Graaf AJ. , et al., Bioconjugate Chem. 2009, Publication Date (Web): February 3, 2009 (Review); DOI: 10.1021/bc800294a ; WO 2006/069246 et selon Chin J.W., et al., JACS 2002, 124, 9026-9027 (technologie ReCode®)). Ces modes d'attachement utilisés avec les anticorps sont applicables à l'ensemble des agents de ciblage connus en fonction de leur structure. More particularly, GCR1 may be chosen from one of those described in the examples. By way of example of GCR2, mention may be made of the ε-amino groups of the lysines carried by the side chains of the lysine residues which are present on the surface of an antibody, the saccharide groups of the hinge region or thiols of cysteines by reduction of intra-chain disulfide bonds (Garnett M.C. et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 171-216). More recently, other approaches have been considered as the introduction of cysteines by mutation (Junutula JR, et al., Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932, WO 09026274) or the introduction of non-natural amino acids allowing other types of chemistry (de Graaf AJ, et al., Bioconjugate Chem 2009, Publication Date (Web): February 3, 2009 (Review); DOI: 10.1021 / bc800294a; WO 2006/069246 and according to Chin JW, et al., JACS 2002, 124, 9026-9027 (ReCode ® technology)). These attachment modes used with the antibodies are applicable to all targeting agents known according to their structure.
Il est également possible de modifier chimiquement l'agent de ciblage de façon à introduire de nouveaux groupes chimiques réactifs GCR2. Ainsi, il est bien connu de l'homme du métier comment modifier un anticorps à l'aide d'un agent de modification (voir notamment WO 2005/077090 page 14). La modification permet d'améliorer la réaction de conjugaison et d'utiliser une plus grande variété de groupes GCR1. It is also possible to chemically modify the targeting agent so as to introduce new GCR2 reactive chemical groups. Thus, it is well known to those skilled in the art how to modify an antibody using a modifying agent (see in particular WO 2005/077090 page 14). The modification improves the conjugation reaction and utilizes a wider variety of GCR1 groups.
Agents de modification permettant d'introduire des groupes disulfures Modification agents for introducing disulfide groups
L'agent de modification peut être un ester activé NHS de formule dans laquelle R représente un groupe (C1-C6)alkyle, aryle, hétéroaryle, (C3-C7)cycloalkyle, (C3- C7)hétérocycloalkyle et ALK représente un groupe (C1-CβJalkylène ; par exemple, on peut utiliser le N-succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) ou le N-succinimidyl pyridyldithiobutyrate (SPDB ou ester N-hydroxy-succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque) de façon à introduire des groupes réactifs GCR2 dithiopyridyl (voir Bourdon M.A., et al., Biochem. J. 1978, 173, 723- 737 ; US 5208020) lesquels peuvent ensuite réagir avec un groupe chimique réactif GCR1 de type -SH présent sur le linker du dérivé de cryptophycine afin de former une nouvelle liaison -S- S- (voir ex.9 pour un conjugué présentant une liaison disulfure). Le groupe N-hydroxysuccinimide réagit préférentiellement sur les groupes amino présents sur l'anticorps de façon à former des liaisons amides. Un autre exemple d'agent de modification est décrit dans WO 2004/016801 de The modifying agent may be an NHS activated ester of formula in which R represents a (C 1 -C 6 ) alkyl, aryl, heteroaryl or (C 3 -C 7 ) cycloalkyl group, (C 3 - C 7 ) heterocycloalkyl and ALK represents a (C 1 -C 6) alkylene group, for example, N-succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) or N-succinimidyl pyridyldithiobutyrate (SPDB or N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic) to introduce dithiopyridyl GCR2 reactive groups (see Bourdon MA, et al., Biochem J. 1978, 173, 723-737, US 5208020) which can then react with a GCR1 reactive chemical group. of -SH type present on the linker of the cryptophycin derivative in order to form a new -S- S- bond (see ex.9 for a conjugate having a disulfide bond) .The N-hydroxysuccinimide group reacts preferentially on the amino groups present on the the antibody to form amide bonds Another example of a modifying agent is described in WO 2004/016801.
formule ou un analogue pegylé de formule formula or a pegylated analogue of formula
dans WO 2009/134976 ou un analogue sulfonique in WO 2009/134976 or a sulfonic analogue
de formule dans WO 2009/134977 dans lesquelles : Formula in WO 2009/134977 in which:
- X3, X4, X5, Xe représentent H ou un groupe (C1-CβJalkyle, X 3 , X 4 , X 5 , Xe represent H or a group (C 1 -C 6 alkyl),
- Xi et X2 représentent -H, -CONX8Xg, -NO2, Xs et X9 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, - X7 représente -Sθ3-M+ ou H ou bien un groupe ammonium quaternaire - Xi and X 2 represent -H, -CONX 8 Xg, -NO 2 , Xs and X 9 represents H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, - X 7 represents -Sθ 3 -M + or H or a quaternary ammonium group
- a désigne un entier allant de 0 à 4 et b désigne un entier allant de 0 à 2000, de préférence entre 1 et 200 ; a et b peuvent prendre toutes les valeurs entre respectivement 0 et 4 ou entre 0 et 2000. Agents de modification permettant d'introduire des groupes maléimido  a represents an integer ranging from 0 to 4 and b denotes an integer ranging from 0 to 2000, preferably from 1 to 200; a and b can take any value between 0 and 4 or between 0 and 2000, respectively. Modification agents for introducing maleimido groups
Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane- 1-carboxylate (SMCC), un composé similaire décrit dans EP 0306943 ou un sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate). On peut citer comme  Another example of a modifying agent is succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), a similar compound described in EP 0306943 or a sulfo-SMCC (4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane sulfosuccinimidyl) -1-carboxylate). We can mention as
autres exemples : comme le 3-maléimido-propanoate de N-succinimidyle ; comme le 6-(3-maléimidopropionamido)hexanoate de N-succinimidyle ; b étant un nombre entier compris entre 0 et 2000, de préférence entre 1 et 200 (b peut prendre toutes les valeurs entre 0 et 2000), comme le 3-(2-{2-[3- maléimido-propionylamino]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de N-succinimidyle ou SM(PEG)2 ; comme le succinate de maléimidoéthyle et de N-succinimidyle ; other examples: such as N-succinimidyl 3-maleimido-propanoate; such as N-succinimidyl 6- (3-maleimidopropionamido) hexanoate; b is an integer between 0 and 2000, preferably between 1 and 200 (b can take any value between 0 and 2000), such as 3- (2- {2- [3-maleimido-propionylamino] -ethoxy} -ethoxy) -N-succinimidylpropanoate or MS (PEG) 2 ; such as maleimidoethyl succinate and N-succinimidyl succinate;
comme le 4-(4-maléimidophényl)butanoate de N-succinimidyle ou comme le 3-maléimidobenzoate de N-succinimidyle. such as N-succinimidyl 4- (4-maleimidophenyl) butanoate or such as N-succinimidyl 3-maleimidobenzoate.
Agents de modification permettant d'introduire des groupes thiols Modification agents for introducing thiol groups
Un autre exemple d'agent de modification décrit dans WO 90/06774 est de formule dans laquelle : Another example of modifying agent described in WO 90/06774 is of formula in which :
- HaI représente un atome d'halogène ;  - HaI represents a halogen atom;
- X10 représente un atome d'halogène ou le groupe COOXi4, nitro, (C1-C8)alkyle non substitué ou halogène, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogène, (C2-C8)alkényle non substitué ou halogène, (C2-C8) alkynyle non substitué ou halogène, (C3-C8)cycloalkyle non substitué, aryle non substitué ou substitué par un à trois substituants sélectionnés parmi amino, atome d'halogène, groupe (C1- C8)alkyle non substitué ou halogène, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogène ; - X 10 represents a halogen atom or COOXi 4, nitro, (C 1 -C 8) unsubstituted or halogenated alkyl, (C 1 -C 8) alkoxy unsubstituted or halogen, (C 2 -C 8) unsubstituted or halogenated alkenyl, (C 2 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkynyl, (C 3 -C 8 ) unsubstituted cycloalkyl, aryl unsubstituted or substituted with one to three substituents selected from amino, halogen, group (C 1 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkyl, (C 1 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkoxy;
- chacun des Xn, X12, X13 représente indépendamment un atome d'hydrogène ou bien peut représenter X3 ; each of Xn, X 12 , X 13 independently represents a hydrogen atom or may represent X 3 ;
ou X10 et X11 forment ensemble un cycle (C2-C5)alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupe(s) (C1-C4)alkyle ; or X 10 and X 11 together form a (C 2 -C 5 ) alkylene ring, unsubstituted or substituted with one to five (C 1 -C 4 ) alkyl group (s);
ou X1O ou X11 forment ensemble avec X-12 un cycle (C1-C5)alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupes (C1-C4) alkyle or X 10 or X 11 together with X- 12 form a (C 1 -C 5 ) alkylene ring, unsubstituted or substituted with one to five (C 1 -C 4 ) alkyl groups
et X14 est -H ou un groupe (C1-C8)alkyle. De préférence, HaI représente un atome de chlore ou de brome. On trouvera dans le tableau ci- dessous des possibilités pour X-10-X13 : and X 14 is -H or a (C 1 -C 8 ) alkyl group. Preferably, HaI represents a chlorine or bromine atom. The following table provides some possibilities for X-10-X13:
Un exemple d'iminothiolane préféré est le suivant : An example of a preferred iminothiolane is as follows:
Agents de modification permettant d'introduire des groupes haloacétamido Modification agents for introducing haloacetamido groups
Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidyl-4-(N-iodoacétyl)-aminobenzoate Another example of a modifying agent is succinimidyl-4- (N-iodoacetyl) -aminobenzoate
O O
,.0_  , .0_
/ ^N' / ^ N '
\ 1 "  \ 1 "
(SIAB) X° ° , ou des composés similaires parmi lesquels le succinimidyl-N-(SIAB) X ° °, or similar compounds among which succinimidyl-N-
O O
/— r ° / - r °
Y ° Y °
iodoacétate (SIA) ° , le succinimidyl-N-bromoacétate (SBA), ou le succinimidyl-3-(N- bromoacétamido)propionate (SBAP) ou un composé pegylé similaire décrit dans WO iodoacetate (SIA) °, succinimidyl-N-bromoacetate (SBA), or succinimidyl-3- (N-bromoacetamido) propionate (SBAP) or a similar pegylated compound described in WO
I il H  I he H
7 O Ofb ^  7 O Ofb ^
2009/134976 ° ° , b étant tel que décrit précédemment. Les figures 1 et 2 illustrent la modification d'un groupe amino d'un agent de ciblage par le SPDP ou bien par l'iminothiolane préféré ci-dessus. 2009/134976 ° °, b being as previously described. Figures 1 and 2 illustrate modification of an amino group of a targeting agent by SPDP or by the preferred iminothiolane above.
Ainsi, on peut introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 disulfures (-SSR), notamment Thus, it is possible to introduce on the targeting agent GCR2 disulfide groups (-SSR), in particular
— S^. — s^ - S ^ . - s ^
de type pyridyldisulfures s N ou s N , dans le cas où GCR1 représente -SH. De même, on peut introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 thiol (-SH), par ex. avec un iminothiolane, dans le cas où GCR1 représente disulfure (c'est-à-dire GCRI = -SZa avec Za≠H, par exemple Dans les deux cas, la liaison covalente qui se forme par of the type pyridyldisulfides s N or s N , in the case where GCR1 represents -SH. Similarly, GCR2 thiol (-SH) groups, e.g. with an iminothiolane, in the case where GCR1 is disulfide (i.e., GCRI = -SZ a with Z ≠ H, for example, In either case, the covalent bond that is formed by
réaction entre GCR1 et GCR2 est une liaison disulfure clivable. reaction between GCR1 and GCR2 is a cleavable disulfide bond.
Il est également possible, dans le cas où GCR1 représente -SH, d'introduire à la surface de It is also possible, in the case where GCR1 represents -SH, to introduce on the surface of
l'agent de ciblage des groupes GCR2 de type maléimido ( ) ou haloacétamido (par ex. bromo- ou iodoacétamido Réciproquement, on peut introduire sur l'agent de ciblage targeting agent of GCR2 groups of maleimido type ( ) or haloacetamido (eg bromo- or iodoacetamido Reciprocally, can be introduced on the targeting agent
des groupes GCR2 thiol (-SH), par ex. avec un iminothiolane, dans le cas où GCR1 représente IGCR2 thiol groups (-SH), e.g. with an iminothiolane, in the case where GCR1 represents I
. Dans ce cas, la liaison covalente qui se forme par réaction entre GCR1 et . In this case, the covalent bond that is formed by reaction between GCR1 and
GCR2 est une liaison sulfure non-clivable. GCR2 is a non-cleavable sulfide bond.
Plus particulièrement dans le cas où GCR1 est du type (iii) ci-dessus, il est possible de modifier chimiquement l'agent de ciblage à l'aide d'un agent de modification adéquat ou d'introduire un/des acide(s) aminé(s) non-naturel(s) afin d'introduire les fonctions GCR2 adéquates. Par exemple, More particularly in the case where GCR1 is of type (iii) above, it is possible to chemically modify the targeting agent with a suitable modifying agent or to introduce acid (s) non-natural amine (s) in order to introduce the appropriate GCR2 functions. For example,
- avec une fonction -N3 : GCR2 peut être un groupe -C≡CH ; with a function -N 3 : GCR2 can be a group -C≡CH;
- avec une fonction -OH ou -NH2 : GCR2 peut être une fonction acide carboxylique ;with a -OH or -NH 2 function : GCR 2 can be a carboxylic acid function;
- avec une fonction -Cl : GCR2 peut être un groupe -SH. with a function -Cl: GCR2 can be a group -SH.
Dans le cas où GCR1 représente un groupe réactif maléimido ou haloacétamido avec Ri2 représentant H ou (C1-C6)alkyle, plus particulièrement Me, le dérivé de cryptophycine peut être représenté par la formule (lia) ou (Nb) ci-dessous : In the case where GCR1 represents a maleimido reactive group or haloacetamido with R 2 representing H or (C 1 -C 6 ) alkyl, more particularly Me, the cryptophycin derivative may be represented by the formula (IIa) or (Nb) below:
(L* représente un fragment d'un linker L tel que L= -L*-maléimido ou bien L= -L*-haloacétamido) Le dérivé de cryptophycine pourra être, en série C-52 et C-1 , l'un des suivants D1-D8 : (L * represents a fragment of a linker L such that L = -L * -maleimido or else L = -L * -haloacetamido) The cryptophycin derivative may be, in series C-52 and C-1, one of the following D 1 -D 8 :
ou un motif équivalent décrit dans l'un des exemples. Plus particulièrement, L est en position para du motif CR-i. or an equivalent pattern described in one of the examples. More particularly, L is in the para position of the CR-i motif.
Procédé de préparation des dérivés de cryptophycine Process for the preparation of cryptophycin derivatives
Les composés de formule (II) sont préparés selon le Schéma 1 à partir d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) et d'un précurseur de linker (PL) :  The compounds of formula (II) are prepared according to Scheme 1 from a cryptophycin derivative of formula (III) and a linker precursor (PL):
Schéma 1  Diagram 1
G représente le groupe -CH=CH2, -(CH2)nY ou bien -(C1-Cβjalkylène-Y avec n étant un entier allant de 1 à 6 et Y représentant -OH, -SH, -Cl, -OGP dans lequel GP désigne un groupe partant tel que par exemple le groupe mésylate (OMs) ou tosylate, ou bien Y représentant -N3, -NH2, - COOH, -NR12-CH2-C=CH dans lequel Ri2 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. Le précurseur de linker PL a pour fonction d'introduire le linker L au niveau du dérivé de cryptophycine après réaction entre le groupe G et une fonction chimique présente sur PL. G represents the group -CH = CH 2 , - (CH 2 ) n Y or - (C 1 -Cβ) alkylene-Y with n being an integer ranging from 1 to 6 and Y representing -OH, -SH, -Cl, - OGP in which GP designates a leaving group such as, for example, the mesylate group (OMs) or tosylate, or Y representing -N 3 , -NH 2 , -COOH, -NR 12 -CH 2 -C = CH in which R 2 represents H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly the methyl group The function of the PL linker precursor is to introduce the L linker at the level of the cryptophycin derivative after reaction between the group G and a chemical function present on PL.
HS- ( v y K (CH ) > ? HS- (v Y K (CH)> ?
G peut aussi représenter le groupe 2 n < (c'est-à-dire que Y représente le groupe G can also represent the group 2 n < (that is, Y represents the group
~-^< ) choisi parmi l'un des 9 groupes suivants (R12 et R'12 représentent H ou un groupe (C1-C6)alkyle) : (CH2)^ . HS-ALKf ~ - ^ <) selected from one of the following nine groups (R 12 and R 12 represent H or a (C 1 -C 6) alkyl): (CH 2 ) ^. HS-ALKf
ou -(CH2)n-SH or - (CH 2 ) n -SH
Sur le Schéma 1 , plusieurs étapes et/ou réactions peuvent être nécessaires pour aboutir au dérivé de cryptophycine (II) à partir du dérivé de cryptophycine (III). Ainsi, par exemple, dans le cas où Z3=H, on préfère introduire un linker L pour lequel Za=-S(C1-C6)alkyle utilisant le précurseur de linker correspondant, puis à réduire la fonction disulfure -SS(C1-C6)alkyle en fonction thiol -SH. On peut utiliser pour cela par exemple le TCEP : voir à ce propos Burns J.A., et al., J.Org.Chem. 1991 , 56(8), 2648-2650. Cette transformation -SS(C1-C6)alkyle * -SH peut s'appliquer par exemple aux linkers L1-4 et L2i-23du Tableau II. In Scheme 1, several steps and / or reactions may be required to yield the cryptophycin (II) derivative from the cryptophycin (III) derivative. Thus, for example, in the case where Z 3 = H, it is preferred to introduce a linker L for which Z a = -S (C 1 -C 6 ) alkyl using the corresponding linker precursor, and then to reduce the disulfide -SH (C 1 -C 6 ) alkyl function in thiol -SH function. For this purpose, for example, the TCEP can be used: see, for example, Burns JA, et al., J.Org.Chem. 1991, 56 (8), 2648-2650. This -SS (C 1 -C 6 ) alkyl * -SH conversion can be applied, for example, to linkers L 1-4 and L 2 i- 23 of Table II.
De même, dans le cas où ZbRb= , on peut introduire un linker L pour lequel ZbRb=-O- allyle utilisant le précurseur de linker correspondant, puis déprotéger la fonction -COOH et Similarly, in the case where Z b R b = a linker L for which Z b R b = -O-allyl can be introduced using the corresponding linker precursor and then deprotecting the -COOH function and
introduire . La déprotection peut être réalisée par un traitement avec un catalyseur au palladium, par exemple Pd(PPh3)4 en présence d'une aminé « scavenger », par exemple la morpholine ; l'activation peut être réalisée avec le carbonate de N-N'-disuccinimidyle en présence d'une base, par exemple la DIPEA ou avec le NHS en présence d'un agent de couplage, par exemple le DCC. Cette transformation d'un groupe ZbRb à un autre groupe ZbRb (par ex. -O-allyle introduce . The deprotection can be carried out by treatment with a palladium catalyst, for example Pd (PPh 3 ) 4 in the presence of a "scavenger" amine, for example morpholine; activation can be carried out with N-N'-disuccinimidyl carbonate in the presence of a base, for example DIPEA or with NHS in the presence of a coupling agent, for example DCC. This transformation from a group Z b R b to another group Z b R b (eg -O-allyl
•* ) peut s'appliquer pour obtenir d'autres groupes ZbRb, notamment ceux décrits plus haut. • * ) can be applied to obtain other groups Z b R b , in particular those described above.
Dans le cas où Ri représente un atome d'halogène et R2 un groupe acyle, on préfère préparer d'abord un composé de formule (II) pour lequel R2 représente un groupe -OH (une fois le linker introduit), et introduire ensuite le groupe acyle à l'aide du composé acylant correspondant. Les Schémas l' et 1 " illustrent de même la préparation d'un dérivé de cryptophycine comprenant un linker comprenant respectivement un groupe maléimido ou haloacétamido (L* représente un fragment d'un linker L tel que L= -L*-maléimido ou bien L= -L*-haloacétamido). 1- -Crypto In the case where R 1 represents a halogen atom and R 2 an acyl group, it is preferred to first prepare a compound of formula (II) for which R 2 represents an -OH group (once the linker has been introduced), and to introduce then the acyl group using the corresponding acylating compound. Schemes 1 'and 1 "likewise illustrate the preparation of a cryptophycin derivative comprising a linker comprising a maleimido or haloacetamido group respectively (L * represents a fragment of a linker L such that L = -L * -maleimido or else L = -L * -haloacétamido). 1 - -Crypto
(Ma)  (My)
Schéma 1'  Figure 1
L'— Crypto The Crypto
(Mb)  (Mb)
Schéma 1" Ces dérivés sont obtenus par réaction entre un dérivé de cryptophycine∞mprenant un linker L' comprenant un groupe amino ou thiol et un agent de modification permettant d'introduire respectivement un groupe maléimido ou haloacétamido. Figure 1 These derivatives are obtained by reaction between a cryptophycin derivative having a linker L 'comprising an amino or thiol group and a modifying agent for introducing a maleimido or haloacetamido group, respectively.
Exemples de réactions entre le groupe G et une fonction chimique présente sur PL Examples of reactions between group G and a chemical function present on PL
• substitution nucléophile entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction aminé -NH- (un sel d'aminé peut également convenir) et G=-(CH2)nCI ou -(CH2)nOMs (voir par ex. Tableau II, PL1-4, PL7a, PL8-IO, PL21-23) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base, comme par exemple la TEA ou la DIPEA. Voir ex.1 , composé 7 ou ex.15, composé 48 ; Nucleophilic substitution between a PL linker precursor carrying an amino function -NH- (an amine salt may also be suitable) and G = - (CH 2 ) n CI or - (CH 2 ) n OMs (see, for example, . Table II, 1-4 PL, PL 7a, PL 8- IO PL21-23): this reaction may be conducted in an aprotic polar solvent in the presence of a base, such as TEA or DIPEA. See ex.1, compound 7 or ex.15, compound 48;
• acylation entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction halogénure de carbamoyle et G=-(CH2)nOH (voir par ex. Tableau II, PL5) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base aminé comme, par exemple la TEA. Acylation between a PL linker precursor bearing a carbamoyl halide function and G = - (CH 2 ) n OH (see, for example, Table II, PL 5 ): this reaction can be carried out in an aprotic polar solvent in the presence an amino base such as, for example, TEA.
Selon une variante, on peut également faire réagir un précurseur de linker PL porteur d'une fonction aminé -NH- et G=-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) obtenu à partir de G=-(CH2)nOH et de p-nitrophénylchloroformate (activation de l'alcool sous forme de carbonate) selon le schéma ci-dessous (Ri2= H ou (C1-C6)alkyle) : According to one variant, it is also possible to react a linker precursor PL carrying an amino function -NH- and G = - (CH 2 ) n OC (= O) -O- (4-nitrophenyl) obtained from G = - (CH 2 ) n OH and p-nitrophenylchloroformate (activation of the alcohol in the form of carbonate) according to the scheme below (Ri 2 = H or (C 1 -C 6 ) alkyl):
-NHR12 + crypto-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) -> crypto-(CH2)nO-C(=O)-NR12- -NHR 12 + crypto- (CH 2 ) n OC (= O) -O- (4-nitrophenyl) -> crypto- (CH 2 ) n OC (= O) -NR 12 -
• l'activation d'un alcool sous forme de carbonate peut aussi être utilisée pour faire réagir un précurseur de linker porteur d'une fonction -OH et G=-(CH2)nNH2 ou -(CH2)nOH pour obtenir respectivement une fonction carbamate (-O-C(=O)-NH-) ou carbonate (-O-C(=O)-O-) selon les schémas respectifs suivants : Activation of an alcohol in the form of carbonate may also be used to react a linker precursor carrying an -OH function and G = - (CH 2 ) n NH 2 or - (CH 2 ) n OH for respectively obtaining a carbamate function (-OC (= O) -NH-) or carbonate (-OC (= O) -O-) according to the following respective diagrams:
-O-C(=O)-O-(4-nitrophényle) + crypto-(CH2)nNH2 -> crypto-(CH2)nNH-C(=O)-O- -OH + crypto-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) ^ crypto-(CH2)nO-C(=O)-O-. (voir par ex. Tableau II, PL6a-6b, PL24-25) -OC (= O) -O- (4-nitrophenyl) + crypto- (CH 2 ) n NH 2 -> crypto- (CH 2 ) n NH-C (= O) -O- -OH + crypto- (CH) 2 ) n OC (= O) -O- (4-nitrophenyl) crypto- (CH 2 ) n OC (= O) -O-. (see eg Table II, PL 6a- 6b, PL 24-25 )
• estérification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction acide -COOH et G=- (CH2)nOH (voir par ex. Tableau II, PL14b) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base aminé comme, par exemple la DMAP et d'un agent de couplage, par exemple le DCC ; Esterification between a PL linker precursor carrying an acid function -COOH and G = - (CH 2 ) n OH (see, for example, Table II, PL 14b ): this reaction can be carried out in an aprotic polar solvent in the presence an amine base such as, for example, DMAP and a coupling agent, for example DCC;
• amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction acide -COOH et G=- (CH2)nNH2 (voir par ex. Tableau II, PL14a) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le HOBt ; Amidification between a PL linker precursor carrying an acid function -COOH and G = - (CH 2 ) n NH 2 (see, for example, Table II, PL 14a ): this reaction can be carried out in an aprotic polar solvent in presence of a coupling agent, for example EDCI or HOBt;
• amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction -NH2 et G=- (CH2)nCOOH (voir par ex. Tableau II, PL7c) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le HOBt ; • cycloaddition 1 ,3-dipolaire (appelée aussi chimie « click ») entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction alcyne terminale et G=-(CH2)nN3 ou bien entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction azide et G=-(CH2)nN R12-CH2C=CH (voir par ex. Tableau II, PL15-18) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire en présence de Cu(I) comme catalyseur (voir à ce propos, sur la cycloaddition de Huisgen : Rostovtsev V.V., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599 ; Tornoe C.W., et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 3057- 3064) ; Amidification between a PL linker precursor carrying a function -NH 2 and G = - (CH 2 ) n COOH (see, for example, Table II, PL 7c ): this reaction can be carried out in an aprotic polar solvent in the presence a coupling agent, for example EDCI or HOBt; 1,3-dipolar cycloaddition (also known as "click" chemistry) between a PL linker precursor carrying a terminal alkyne function and G = - (CH 2 ) n N 3 or between a PL linker precursor carrying a an azide function and G = - (CH 2 ) n NR 12 -CH 2 C = CH (see, for example, Table II, PL 15-18 ): this reaction can be carried out in a polar solvent in the presence of Cu (I) as a catalyst (see, in this connection, Huisgen cycloaddition: Rostovtsev VV, et al., Angew Chem Int, Ed., 2002, 41, 2596-2599, Tornoe CW, et al., J. Org Chem. 2002, 67, 3057-3064);
• métathèse entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction éthylénique terminale et G-CH=CH2 (voir Tableau II, PL19, PL20) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence du catalyseur de Grubbs de 2eme génération (CAS N°246047-72- 3, voir à ce propos, Poeylaut-Palena A.A., et al., J. Org. Chem. 2008, 73, 2024-2027. Metathesis between a PL linker precursor carrying a terminal ethylenic function and G-CH = CH 2 (see Table II, PL 19 , PL 20 ): this reaction can be carried out in an aprotic polar solvent in the presence of the Grubbs catalyst of 2 nd generation (CAS No. 246047-72- 3, see in this respect, Poeylaut Palena-AA, et al., J. Org. Chem. 2008, 73, 2024-2027.
A propos du linker L About the linker L
Le linker L pourra être choisi parmi l'un des suivants :  The linker L can be chosen from one of the following:
-G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1 , -G 'X (CR 13 R 14 ) t (OCH 2 CH 2 ) y (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ,
-G' X (CR13R14MOCH2CH2VV-(CR15R16)U Q GCR1 ; -G 'X (CR 13 R 14 MOCH 2 CH 2 VV- (CR 15 R 16 ) U Q GCR 1 ;
-G' X (CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1 , -G 'X (CR 13 R 14 ) t (CR 17 = CR 18 ) (CR 15 R 16 ) u (OCH 2 CH 2 ) y Q GCR 1,
-G' X (CR13R14MOCH2CH2)y(CR17=CR18)(CR15R16)u Q GCR1 , -G 'X (CR 13 R 14 MOCH 2 CH 2 ) y (CR 17 = CR 18 ) (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ,
-G' X (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipérazinyl-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl- méthyl-NR12-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 , -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ,-G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1, -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1, -G 'X (CR 13 R 14 ) t-phenyl- (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-furyl- (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-oxazolyl- (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-thiazolyl- (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-thienyl- (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-imidazolyl- (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-piperazinyl-CO (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t -piperidinylmethyl-NR 12 -CO (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14) t-piperidinyl (CR 15 R 16) u Y' Q RAG 1 -G 'X (CR 13 R 14) t-piperidinyl-NR 12 - (CR 15 R 16) u Y 'Q RAG 1 -G' X (CR 13 R 14) t-triazolyl- (CR 15 R 16) u Y 'Q RAG 1 -G' X (CR 13 R 14) t-triazolyl- (CR 15 R 16) u Y 'Q RAG 1
-G' X (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Q GCR1, -G' X (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-thiényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipérazinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-NR12- (CR15R16)u Q GCR1 , -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-phenyl- (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-furyl- (CR 15 R 16 ); and GCR 1 , -G' X (CR 13 R 14 ) t-oxazolyl- (CR 15 R 16 ) and GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-thiazolyl- (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-thienyl- (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-imidazolyl- (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-piperazinyl- (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-piperidinyl- (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t-piperidinyl-methyl-NR 12 - (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ; -G 'X (CR 13 R 14 ) t -piperidinyl-NR 12 - (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 , -G' X (CR 13 R 14 ) t-triazolyl- (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ;
ou or
-G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1 , -G "Y (CR 13 R 14 ) t (OCH 2 CH 2 ) y (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ,
-G" Y (CR13R14MOCH2CH2Vr-(CR15R16)U Q GCR1 ; -G "Y (CR 13 R 14 MOCH 2 CH 2 Vr- (CR 15 R 16 ) UQ GCR 1 ;
-G" Y (CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1 , -G "Y (CR 13 R 14 ) t (CR 17 = CR 18 ) (CR 15 R 16 ) u (OCH 2 CH 2 ) y Q GCR 1,
-G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR18)(CR15R16)u Q GCR1 , -G "Y (CR 13 R 14 ) t (OCH 2 CH 2 ) y (CR 17 = CR 18 ) (CR 15 R 16 ) u Q GCR 1 ,
-G" Y (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; - G" Y (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi; -G" Y (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-CO(CR15Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéιïdinyl-méthyl- NR12-CO(CRi5Ri6)U Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t~triazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi , -G "Y (CR 13 R 14 ) t-phenyl- (CR 15 R 16 ) u Y 'Q GCR 1 ; -G" Y (CR 13 R 14 ) t-furyl- (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; -G "Y (CR 13 R 14 ) t-oxazolyl- (CR 15 R 16 ) u Y 'Q GCR 1 ; -G" Y (CR 13 R 14 ) t-thiazolyl- (CR 15 R 16 ) u Y' Q GCR 1 ; - G "Y (CR 1 R 14 ) t-thienyl- (CR 1 R 6) y Y) QGR 1; G" Y (CR 1 R 3 ) t-imidazolyl- (CR 1 R 6) u Y 'Q GCR 1; -G "Y (CRi 3 Ri4) t-piperazinyl-CO (CR 15 Ri6) u Y 'Q AGIR; -G" Y (CRi 3 R 4) t -pipéιïdinyl-methyl-NR 12 -CO (CRi 5 R 6 ) UY 'Q GCRi; -G "Y (CR 1 R 14 ) t-piperidinyl- (CR 1 R 6) u Y 'Q GCR 1; -G" Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperidinyl-NR 12 - (CR 15 R 16) u Y' Q GCR 1; -G "Y (CR 1 R 3 4 ) t-triazolyl- (CR 1 R 5 ) u Y 'Q GCR 1 ,
-G" Y (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi, -G" Y (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi; -G" Y (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q CCRi ; G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-tιïazolyl- -G "Y (CR 1 R 3 ) 4 -t-phenyl- (CR 1 R 6); -G" Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-furyl- (CR 1 R 6) u Q GCR 1, -G "Y (CRi 3 R 4) t-oxazolyl- (CRi 5 Ri6) u Q AGIR; -G "Y (CRi 3 R 4) t-thiazolyl (CRi 5 Ri6) u Q AGIR; -G "Y (CR 1 R 3 ) 4 t-thienyl- (CR 1 R 6); -G" Y (CR 1 R 3 ) t-imidazolyl- (CR 1 R 6); -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperazinyl- (CR 1 R 6); -G" Y (CR 1 R 3 4 ) t-piperazinyl- (CR 1 R 6) u CCR 1; G "Y (CRi 3 R 4) t-piperidinyl (CRi 5 Ri6) u Q AGIR; -G" Y (CRi 3 R 4) t-piperidinyl-methyl-NR 12 - (CRi5Ri6) u Q AGIR; -G "Y (CRi 3 R 4) t-piperidinyl-NR 12 - (CRi5Ri6) u Q AGIR; -G" Y (CRi 3 R 4) t -tιïazolyl-
G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH2)n- ; G 'represents a group -CH = CH- or - (CH 2 ) n -;
G" représente un groupe -(CH2)n- ; G "represents a group - (CH 2 ) n -;
n représente un entier allant de 1 à 6 ; n represents an integer from 1 to 6;
X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -COO-, ou -CONR12-, le groupe CO étant attaché à G' ; X represents a single bond or a group -CO-, -COO-, or -CONR 12- , the group CO being attached to G ';
Y représente un groupe -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, - NR12COO- ou -S(0)q-, l'atome O ou le groupe NR12 étant attachés à G" ; Y represents -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR 12 -, -NR 12 -, -NR 12 CO-, -NR 12 CONR '12 -, - NR 12 COO-, or -S (0 q -, the atom O or the group NR 12 being attached to G ";
Y' représente un groupe -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, -Y 'represents a group -O-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR 12 -, -NR 12 -, -NR 12 CO-, -NR 12 CONR' 12 -, -
NR12COO-, -S(0)q-, -CO-, -COO-, ou -CONR12- ; NR 12 COO-, -S (O) q -, -CO-, -COO-, or -CONR 12 -;
R12, R'i2, R13, Ru, R15 et R16, R17 et R18 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; R12, R'i2, R13, Ru, R15 and R 16, R 17 and R 18 independently of one another H or (C 1 -CβJalkyle;
t, u et y représentent des nombres entiers pouvant aller de O (cas du groupe absent) à 20 et tels que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ; t, u and y represent integers ranging from 0 (case of the absent group) to 20 and such that t + u + y is greater than or equal to 1;
q représente un entier pouvant valoir O, 1 ou 2 ; q represents an integer that may be 0, 1 or 2;
Q représente une liaison simple, un groupe (C1-C-ιo)alkylène ou un groupe (OCH2CH2),, i étant un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. i peut prendre chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5. Q represents a single bond, a (C 1 -C -alko) alkylene group or a (OCH 2 CH 2 ) group, i being an integer ranging from 1 to 20, more preferably from 1 to 10, more particularly from 1 to at 8, or from 1 to 6, even more particularly from 2 to 5. i can take each of the values of these ranges, in particular worth 2, 3, 4 or 5.
Dans le cas du linker de formule -G" Y (CRi3Ri4)I(OCH2CH2V Y'-(CRi5Ri6)u Q GCRi, si y vaut O (pas de groupe PEG) et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut valoir O. Plus particulièrement, on exclut les linkers comprenant le motif terminal -NR12-C(=O)-O- (Y'=NR12 ; u=0 ; Q=liaison simple et GCRi=-C(=O)ZbRb). y représente un entier allant de 0 à 20, plus particulièrement de 1 à 20, plus particulièrement encore de 1 à 10, de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. y peut prendre chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5. Certains de ces linkers ont été décrits dans les demandes WO 07085930 et WO 09016516. In the case of the linker of formula -G "Y (CRi 3 Ri 4 ) I (OCH 2 CH 2 V Y '- (CRi 5 R 6 ) u Q GCRi, if y is equal to 0 (no PEG group) and Q represents a single bond, then u can not be 0. More particularly, the linkers comprising the terminal unit -NR 12 -C (= O) -O- (Y '= NR 12 , u = 0, Q = single bond are excluded. and GCRi = -C (= O) Z b R b ). y represents an integer ranging from 0 to 20, more particularly from 1 to 20, more particularly from 1 to 10, from 1 to 8, or from 1 to 6, more particularly from 2 to 5. y may take each of the values of these ranges, in particular worth 2, 3, 4 or 5. Some of these linkers have been described in applications WO 07085930 and WO 09016516.
Le linker L pourra être choisi parmi l'un de ceux de formule (IV) : The linker L may be chosen from one of those of formula (IV):
dans laquelle : in which :
• (AA)W représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par des liaisons peptidiques ; • (AA) W represents a sequence of w amino acids AA connected to each other by peptide bonds;
• w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ;  W represents an integer ranging from 1 to 12, preferably from 1 to 6;
• n représente un entier allant de 1 à 6 ;  N represents an integer ranging from 1 to 6;
• D représente l'un des motifs suivants :  • D is one of the following reasons:
pour lesquels : for which :
R12 représente H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; R 12 represents H or a group (C 1 -Cβ alkyl);
R19, R20, R21, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome  R19, R20, R21, R22 represent independently of each other H, an atom
d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C1-C4)alkyle ; halogen, -OH, -CN or a (C 1 -C 4 ) alkyl group;
T rattaché à (CH2)n représente NR12OU O ; T attached to (CH 2 ) n represents NR 12 OR O;
V1 représente O, S, NR12 ; V 1 represents O, S, NR 12 ;
V2 représente CR22 ou N ; V 2 represents CR 22 or N;
V3, V4, V5 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR22 ou N. V 3 , V 4 , V 5 are chosen independently of one another from CR 22 or N.
Un exemple de D2 est le suivant : AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel, plus particulièrement choisi parmi : alanine (Ala), β-alanine, acide 2-amino-2-cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide aspartique (Asp), cystéine (Cys), glutamine (Gln), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide γ-aminobutyrique, acide α,α-diméthyl γ-aminobutyrique, acide β,β-diméthyl γ- aminobutyrique, omithine (Om), citrulline (Cit). An example of D2 is: AA denotes a natural or non-natural amino acid, more particularly chosen from: alanine (Ala), β-alanine, 2-amino-2-cyclohexylacetic acid, 2-amino-2-phenylacetic acid, arginine (Arg), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), γ-aminobutyric acid, α, α-dimethyl γ-aminobutyric acid, β, β-dimethyl γ-aminobutyric acid, omithine (Om), citrulline (Cit).
L'enchaînement (AA)W a pour formule : dans laquelle R23 représente un résidu d'un des acides aminés décrits ci- dessus. Des exemples d'enchaînements sont les suivants : Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-Cit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lsy, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu-Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala- Leu-Ala-Leu. The sequence (AA) W has the formula: wherein R 23 represents a residue of one of the amino acids described above. Examples of sequences are the following: Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-Cit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lsy, Ala-Lys, Val -Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu -Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Al-Leu-Ala-Leu.
Les précurseurs de linkers sont ceux comprenant les motifs -OH correspondants : The linker precursors are those comprising the corresponding -OH units:
WO 2005/082023 (voir notamment pages 61-64) décrit comment obtenir certains précurseurs de linkers. Les préparations des précurseurs de linkers PL25 et PL26 décrites ci-après peuvent également être utilisées pour obtenir d'autres précurseurs de linkers similaires comprenant un autre enchaînement (AA)W. WO 2005/082023 (see especially pages 61-64) describes how to obtain certain linker precursors. The preparations of the PL25 and PL26 linker precursors described hereinafter can also be used to obtain other similar linker precursors comprising a further sequence (AA) W.
Le linker L pourra être choisi également parmi l'un de ceux décrits dans le Tableau II ou parmi les composés exemplifiés. Dans toutes les formules de linkers, NR12 ou NR'12 représente plus particulièrement NH ou NMe. The linker L may also be selected from one of those described in Table II or from the exemplified compounds. In all linkers of formulas, NR 12 or NR 12 more particularly represents NH or NMe.
Préparation des composés de formule (III) Preparation of compounds of formula (III)
cas où G=-(CH,)nQH ou -CH=CH, Br- where G = - (CH,) n QH or -CH = CH, Br
P7 = co P8 = compose de fomule (III) avec P 7 = co P 8 = compound of formula (III) with
G-CH2CH2OH G-CH 2 CH 2 OH
Schéma 2 Figure 2
Pi est préparé selon renseignement des demandes WO 98/08505, WO 00/23429 ou WO 00/34252 ainsi que des publications suivantes Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 ; Salamonczyk G. M., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6893-6900 ou J. Med. Cftem.1999, 42 (14), 2588-2603 (incorporées ici par référence). Dans les pages 158-159 de « The isolation, characterization and development of a novel class of potent antimitotic macrocyclic depsipeptides : the cryptophycins », Chap.9, in « Anticancer agents from natural products », Taylor&Francis, CRC press book, isbn=0-8493-1863-7 sont donnés les schémas de synthèse permettant de préparer les différents fragments (A, B, C et D) de cryptophycine et d'aboutir à Pi. Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 décrit sur les schémas 1-6 la voie d'accès à l'un des dérivés de cryptophycine de la Figure 1 mais ces schémas peuvent s'appliquer à la préparation de Pi en utilisant les réactifs de départ idoines.  Pi is prepared according to information from WO 98/08505, WO 00/23429 or WO 00/34252 and the following publications Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295; Salamonczyk G. M., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6893-6900 or J. Med. Cftem. 1999, 42 (14), 2588-2603 (incorporated herein by reference). In pages 158-159 of "The isolation, characterization and development of a novel class of potent antimitotic macrocyclic depsipeptides: the cryptophycins", Chap.9, in "Anticancer agents from natural products," Taylor & Francis, CRC press book, isbn = 0 -8493-1863-7 are given the synthetic schemes for preparing the different fragments (A, B, C and D) of cryptophycin and lead to Pi. Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 describes in Schemes 1-6 the pathway to one of the cryptophycin derivatives of Figure 1 but these schemes can be applied to the preparation of Pi using the appropriate starting reagents. .
Pi permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine à l'aide des étapes détaillées ci-après : Etape (i) : ouverture du cycle époxyde de Pi en milieu acide permettant d'obtenir la fonction diol. On peut utiliser par exemple l'acide perchlorique concentré ; Pi makes it possible to prepare other cryptophycin derivatives using the steps detailed below: Step (i): opening of the epoxide ring of Pi in an acidic medium making it possible to obtain the diol function. For example, concentrated perchloric acid may be used;
Etape (ii) : coupure oxydante du diol à l'aide par exemple du periodate de sodium ; Step (ii): oxidizing cleavage of the diol using, for example, sodium periodate;
Etape (iii) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium adéquat, par exemple un bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi ; Step (iii): Wittig reaction using a suitable phosphonium halide, for example a bromide, and a strong base such as for example BuLi;
Etape (iv) : réaction d'époxydation de Corey-Chaykovsky faisant intervenir un sel de sulfonium chiral, par exemple un triflate, en présence d'une base telle que par exemple KOH.  Step (iv): Corey-Chaykovsky epoxidation reaction involving a chiral sulphonium salt, for example a triflate, in the presence of a base such as, for example, KOH.
Etape (v) : déprotection de l'éther silylé en utilisant par exemple une solution de fluorure de tétrabutylammonium. Le bromure de 4-(triisopropylsiloxyméthyl)benzyltriphénylphosphonium est obtenu partir du 1- (bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N° 934667-38-6) dont la préparation à partir de 1 ,4-benzènediméthanol (CAS N° 589-29-7, produit commercial) est décrite par Potîer R. G , et ai., Organic Letters 2007, 9(7), 1187-1190. Les composés pour lesquels Rn représente un groupe (C1-C4)alkyle sont obtenus de façon semblable à partir du diol correspondant qui est soit un produit commercial soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à partir du 1 ,4- benzènediméthanol. Step (v): deprotection of the silylated ether using, for example, a solution of tetrabutylammonium fluoride. 4- (Triisopropylsiloxymethyl) benzyltriphenylphosphonium bromide is obtained from 1- (bromomethyl) -4- (triisopropylsiloxymethyl) benzene (CAS No. 934667-38-6), the preparation of which is prepared from 1,4-benzenedimethanol (CAS N No. 589-29-7, commercial product) is described by Potier R. G, et al., Organic Letters 2007, 9 (7), 1187-1190. The compounds for which Rn represents a (C 1 -C 4 ) alkyl group are similarly obtained from the corresponding diol which is either a commercial product or is obtained by C-alkylation Friedel-Crafts from 1,4-benzenedimethanol. .
A partir du 1-(bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N°135408-73-0), dont la préparation est décrite sur le schéma 4a de EP 0496548 ou en page 83 de l'article de Nevill CR.From 1- (bromomethyl) -4- (triisopropylsiloxymethyl) -benzene (CAS No. 135408-73-0), the preparation of which is described in scheme 4a of EP 0496548 or page 83 of the Nevill CR article .
Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991 , 7(1 ), 83-86, on peut obtenir le bromure de phosphonium correspondant. Les composés pour lesquels Rn représente un groupe (d-Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991, 7 (1), 83-86, the corresponding phosphonium bromide can be obtained. Compounds for which Rn represents a group (d-
C4)alkyle sont obtenus de façon semblable à partir d'un composé équivalent au composé 1 décrit en page 83 de l'article de Nevill CR. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991 , 7(1 ), 83-86 qui est soit un produit commercial, soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à partir de l'acide p-tolylacétique. C 4 ) alkyl are similarly obtained from a compound equivalent to compound 1 described on page 83 of the Nevill CR article. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991, 7 (1), 83-86 which is either a commercial product or is obtained by Friedel-Crafts C-alkylation from p-tolylacetic acid.
Le trifluorométhanesulfonate de (1 R,4R,5R,6R)-4,7,7-triméthyl-6-(4-vinyl-benzyl)-6-thionia- bicyclo[3.2.1]octane utilisé à l'étape (iv) est obtenu à partir du (1 R,4R,5R)-isothiocineole (voir Aggarwal V. et al., JACS 2010, 732, 1828-1830) dont la préparation à partir du (R)-limonène (CAS N°95327-98-3, produit commercial) est décrite dans cette même référence. (1R, 4R, 5R, 6R) -4,7,7-trimethyl-6- (4-vinylbenzyl) -6-thionicbicyclo [3.2.1] octane trifluoromethanesulfonate used in step (iv) ) is obtained from (1 R, 4R, 5R) -isothiocinole (see Aggarwal V. et al., JACS 2010, 732, 1828-1830) whose preparation from (R) -limonene (CAS No. 95327 -98-3, commercial product) is described in this same reference.
Le bromure de triphényl(p-vinylbenzyl)phosphonium (CAS N°1 18766-51-1 ) est obtenu à partir du dérivé brome correspondant (voir Drefahl G., et al., Chem.Ber. 1961 , 94(8), 2002-2010) dont la préparation à partir de l'alcool 4-vinylbenzylique (CAS N°1074-61-9, produit commercial) est décrite dans l'article de Shimomura O. , ét al., Tetrahedron 2005, 61, 12160-12167. Triphenyl (p-vinylbenzyl) phosphonium bromide (CAS No. 1 18766-51-1) is obtained from the corresponding brominated derivative (see Drefahl G., et al., Chem.Ber., 1961, 94 (8), 2002-2010) whose preparation from 4-vinylbenzyl alcohol (CAS No. 1074-61-9, commercial product) is described in the article by Shimomura O., et al., Tetrahedron 2005, 61, 12160 -12,167.
A partir de P7 ou de P8 qui sont des composés de formule (III) pour lesquels G=-(CH2)nOH, on peut obtenir d'autres composés de formule (III) ayant d'autres groupes G. From P 7 or P 8 which are compounds of formula (III) for which G = - (CH 2 ) n OH, it is possible to obtain other compounds of formula (III) having other groups G.
Schéma 3  Figure 3
A partir du groupe G-CH2OH, on peut obtenir les groupes G-CH2CI ou -CH2N3 : - l'introduction de -Cl peut être réalisée en présence de CMS : voir ex.1 -composé 2 ;From the group G-CH 2 OH, the groups G-CH 2 CI or -CH 2 N 3 can be obtained: the introduction of -Cl can be carried out in the presence of CMS: see ex.1 -composed 2;
- l'azidation peut être réalisée en présence du diphénylphosphorazide (PhO)2P(=O)N3 et d'une base, par exemple le DBU. Le Schéma 3 décrit ces réactions pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. cas où G-(CH7)XOOH the azidation can be carried out in the presence of diphenylphosphorazide (PhO) 2 P (= O) N 3 and a base, for example DBU. Figure 3 describes these reactions for the case n = 1 but it can also be applied for n> 1. where G- (CH 7 ) XOOH
Schéma 4 A partir du groupe G-(CH2^OH, on peut obtenir le groupe G=-CH2COOH par une oxydation. Le Schéma 4 décrit une double oxydation : 1ere oxydation à l'aide du réactif de Dess-Martin (voir "Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis"; Paquette L. A., Ed.; Wiley: Chichester, UK, 1995, Vol. 7, 4982-4987 ou Boeckman R.K. Jr., et al., JJ. "The Dess-Martin Periodinane" Org. Synth. 2004, 10, 696-702) suivie d'une 2ème oxydation de type Pinnick en présence de 2-méthyl- 2-butène (Pinnick H.W., Tetrahedron 1981 , 37, 2091-2096). Le Schéma 4 décrit ces réactions pour le cas d'un composé de départ pour lequel n=2 mais il peut s'appliquer également pour n>2. Scheme 4 From the group G- (CH 2 ) OH, the group G = -CH 2 COOH can be obtained by oxidation Figure 4 describes a double oxidation: 1 st oxidation using the Dess-Martin reagent (see "Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis"; LA Packet, Wiley Ed .: Chichester, UK, 1995, Vol.7, 4982-4987 or Boeckman RK Jr., et al., JJ. "The Dess-Martin Periodinane Synth.Org 2004, 10, 696-702) followed by 2nd Pinnick oxidation in the presence of 2-methyl-2-butene (Pinnick HW, Tetrahedron 1981, 37, 2091-2096). describes these reactions for the case of a starting compound for which n = 2 but it can also be applied for n> 2.
Schéma 5  Figure 5
A partir du groupe G-CH2N3 dont la préparation est décrite dans le Schéma 3, on peut obtenir le groupe G -CH2NH2 à l'aide d'une réaction de réduction utilisant une phosphine comme le TCEP. A ce propos, voir : Faucher A.-M. et al., Synthetic Comm 2003, 33, 3503-3511 : From the group G-CH 2 N 3 , the preparation of which is described in Scheme 3, the group G -CH 2 NH 2 can be obtained by means of a reduction reaction using a phosphine such as TCEP. In this regard, see: Faucher A.-M. et al., Synthetic Comm 2003, 33, 3503-3511:
Schéma 5' Selon une variante, à partir du groupe G-CH2OH, on peut obtenir le groupe G-CH2NH2 à l'aide d'une réaction de Mitsunobu utilisant la triphénylphosphine et le DEAD. A ce propos, voir : Mitsunobu O., Synthesis 1981 , 1-28 ; Hughes D. L., Org. Reactions 1992, 42, 335-656 ; Hughes D. L., Org. Prep. 1996, 28, 127-164. Les Schémas 5 et 5' décrivent le cas n=1 mais ils peuvent s'appliquer également pour n>1. Figure 5 According to one variant, from the group G-CH 2 OH, the group G-CH 2 NH 2 can be obtained by means of a Mitsunobu reaction using triphenylphosphine and DEAD. In this regard, see: Mitsunobu O., Synthesis 1981, 1-28; Hughes DL, Org. Reactions 1992, 42, 335-656; Hughes DL, Org. Prep. 1996, 28, 127-164. Schemes 5 and 5 'describe the case n = 1 but they can also apply for n> 1.
Cas où G≈-fCHpïn-NRip-CHpC≡CH Case where G≈-fCHpin-NRip-CHpC≡CH
A partir du groupe G— (CH2)nCI, on peut obtenir le groupe G=- (CH2)n-NR12-CH2-C≡CH à l'aide d'une substitution nucléophile utilisant le composé de formule NHR12-CH2-C=CH (Ri2=H : propargylamine ; Ri2=(C1-C6)alkyle : préparé selon Mock W. L., et al., J. Org. Chem. 1989, 54 (22), 5302-8). From the group G- (CH 2 ) n CI, the group G = - (CH 2 ) n -NR 12 -CH 2 -C≡CH can be obtained by means of a nucleophilic substitution using the compound of formula NHR 12 -CH 2 -C = CH (R 2 = H: propargylamine, R 2 = (C 1 -C 6 ) alkyl: prepared according to Mock WL, et al., J. Org Chem 1989, 54 (22) , 5302-8).
Cas où G=-(CH?)n-SH Case where G = - (CH?) N -SH
Schéma 6  Figure 6
A partir du groupe G=- (CH2)nCI, on peut obtenir le groupe G=-(CH2)nSH par une fonctionnalisation directe à l'aide de triméthylsilylthiolate de tétrabutylammonium préparé in situ à partir de fluorure de tétrabutylammonium et d'hexaméthyldisilathiane selon Hu J. et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 4959-4961 (voir ex.8). Le Schéma 6 décrit cette réaction pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. Au cours de cette réaction, il peut se former le dimère intermédiaire de formule : From the group G = - (CH 2 ) n Cl, the group G = - (CH 2 ) n SH can be obtained by direct functionalization using tetrabutylammonium trimethylsilylthiolate prepared in situ from tetrabutylammonium fluoride and of hexamethyldisilathiane according to Hu J. et al., J. Org. Chem. 1999, 64, 4959-4961 (see ex.8). Figure 6 describes this reaction for the case n = 1 but it can also apply for n> 1. During this reaction, the intermediate dimer of formula can be formed:
Cas où G=-ALK-SH Case where G = -ALK-SH
Schéma 7 P3 permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine selon le Schéma 7 : Figure 7 P 3 makes it possible to prepare other cryptophycin derivatives according to Scheme 7:
Etape (i) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium adéquat, par exemple un bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi ; Step (i): Wittig reaction using a suitable phosphonium halide, for example a bromide, and a strong base such as for example BuLi;
Etape (ii) : couplage de Kumada utilisant un réactif de Grignard adéquat, par exemple un bromure d'alcoxymagnésium protégés sous forme d'éther silylé, en présence d'un catalyseur au palladium ou au nickel (voir par exemple Organic Letters 2009, 11, 5686-5689 ou Synthesis 2009, -/47, 2408-2412). Step (ii): coupling of Kumada using a suitable Grignard reagent, for example a protected alkoxymagnesium bromide in the form of silylated ether, in the presence of a palladium or nickel catalyst (see, for example, Organic Letters 2009, 11 , 5686-5689 or Synthesis 2009, 477, 2408-2412).
Les étapes (iii) à (v) sont décrites sur le Schéma 2 et l'étape (vi) sur le Schéma 6. Steps (iii) to (v) are described in Scheme 2 and step (vi) in Scheme 6.
Le bromure de (4-bromobenzyl)triphénylphosphonium est un produit commercial (CAS N° 51044- 13-4). Les bromures d'alcoxymagnésium protégés sous forme d'éther silylé peuvent être préparés à partir des bromoalcools correspondants par protection de la fonction alcool avec le chlorosilane adéquat puis par formation de l'organomagnésien en présence de magnésium dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF (voir par exemple Organic Letters 2005, 7, 183-186). Les bromoalcools, linéaires ou ramifiés comportant 1 à 6 atomes de carbone, sont commercialement disponibles, comme le 3-bromo-1-propanol (CAS N° 627-18-9) ou le 1-bromo- 2-propanol (CAS N° 19686-73-8) ou peuvent être préparés à partir des bromoesters ou bromocétones correspondantes selon des méthodes décrites dans la littérature. Le chlorosilane peut, par exemple, être le tert-butyldiméthylchlorosilane (CAS N°18162-48-6) ou le triisopropyl- chlorosilane (CAS N°13154-24-0). (4-Bromobenzyl) triphenylphosphonium bromide is a commercial product (CAS No. 51044-13-4). The protected alkoxymagnesium bromides in the form of silylated ether can be prepared from the corresponding bromoalcohols by protecting the alcohol function with the appropriate chlorosilane and then by forming the organomagnesium in the presence of magnesium in an aprotic polar solvent anhydrous, such as THF. (see for example Organic Letters 2005, 7, 183-186). Bromoalcohols, linear or branched having 1 to 6 carbon atoms, are commercially available, such as 3-bromo-1-propanol (CAS No. 627-18-9) or 1-bromo-2-propanol (CAS No. 19686-73-8) or can be prepared from the corresponding bromoesters or bromoketones according to methods described in the literature. The chlorosilane may, for example, be tert-butyldimethylchlorosilane (CAS No. 18162-48-6) or triisopropylchlorosilane (CAS No. 13154-24-0).
Cas où G=-(CH2)n-maléimido Case where G = - (CH2) n-maleimido
Schéma 8  Figure 8
En complément du schéma l' qui décrit une méthode de préparation de dérivés de cryptophycine comprenant un motif maléimido, à partir du groupe G-CH2OH, on peut obtenir le groupe par une réaction de Mitsunobu en présence de triphéhylphosphine et de DEAD selon Matuszak N. et al., J. Med. Chem. 2009, 52, 7410-7420. Le Schéma 8 décrit cette réaction pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. Les Schémas 1-8 ci-dessus sont données pour un linker en position para mais pourraient s'appliquer identiquement pour les positions ortho ou meta. De même, ils sont donnés pour un dérivé de cryptophycine mais pourraient s'appliquer à la préparation d'autres dérivés de formule (II), notamment D1-D8. In addition to the scheme which describes a method for the preparation of cryptophycin derivatives comprising a maleimido unit, from the group G-CH 2 OH, the group can be obtained. by a Mitsunobu reaction in the presence of triphenylphosphine and DEAD according to Matuszak N. et al., J. Med. Chem. 2009, 52, 7410-7420. Figure 8 describes this reaction for the case n = 1 but it can also apply for n> 1. Schemes 1-8 above are given for a linker in the para position but could apply identically for the ortho or meta positions. Similarly, they are given for a cryptophycin derivative but could be applied to the preparation of other derivatives of formula (II), in particular D 1 -D 8 .
Plus particulièrement, dans le cas de la C-52, on pourra utiliser les composés suivants dont les préparations sont décrites dans Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 ou dans WO 9808505 : More particularly, in the case of C-52, the following compounds whose preparations are described in Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 or in WO 9808505:
5  5
9 9 9 9
D'autre part, à partir du composé 31 b pour lequel G-CH2OH, il est possible d'obtenir les composés pour lesquels G-CH2CI ou -CH2N3 : On the other hand, from compound 31b for which G-CH 2 OH, it is possible to obtain compounds for which G-CH 2 Cl or -CH 2 N 3 :
• G-CH2CI : voir exemple 1 , composé 2 ; G-CH 2 CI: see Example 1, compound 2;
• G-CH2N3 : la conversion de -CH2OH en -CH2N3 peut être réalisée dans un solvant polaire aprotique en présence de diphénylphosphorazide et d'une base comme le DBU, voir exemple 19, composé 60. • G-CH 2 N 3 : the conversion of -CH 2 OH to -CH 2 N 3 can be carried out in an aprotic polar solvent in the presence of diphenylphosphorazide and a base such as DBU, see Example 19, compound 60.
• G=- CH2maléimido : la conversion de -CH2OH en -CH2maléimido peut être réalisée dans un solvant polaire aprotique en présence de maléimide, de triphénylphosphine et de DEAD. L'enseignement de J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 pourrait s'appliquer à d'autres dérivés de cryptophycine comprenant d'autres substituants Rβ-Rg. Préparation des précurseurs de linker PL • G = - CH 2 maleimido: the conversion of -CH 2 OH to -CH 2 maleimido can be carried out in an aprotic polar solvent in the presence of maleimide, triphenylphosphine and DEAD. The teaching of J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 could apply to other cryptophycin derivatives comprising other Rβ-Rg substituents. Preparation of PL linker precursors
PL pourra être l'un des suivants :  PL can be one of the following:
Za S ALK N  Za S ALK N
PL1 ^NH préparé selon le schéma ci-dessous : PL 1 ^ NH prepared according to the scheme below:
Etape (i) : activation de l'acide à l'aide de NHS ; l'activation est réalisée à TA en présence d'un agent de couplage comme par exemple le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3- éthylcarbodiimide en solution dans un solvant aprotique anhydre comme le DCM. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 4.  Step (i): activation of the acid with NHS; the activation is carried out at RT in the presence of a coupling agent such as, for example, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride in solution in an anhydrous aprotic solvent such as DCM. We can draw inspiration from the conditions of Example 1, compound 4.
Etape (ii) : amidification avec la pipéridine N-Boc ; le couplage peptidique est réalisé dans un solvant polaire aprotique à TA en présence d'une base, qui peut être une aminé tertiaire comme la TEA ou la DIPEA. Le solvant peut être le DMF. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 5. Step (ii): amidification with piperidine N-Boc; the peptide coupling is carried out in an aprotic polar solvent at RT in the presence of a base, which may be a tertiary amine such as TEA or DIPEA. The solvent may be DMF. We can draw inspiration from the conditions of Example 1, compound 5
Etape (iii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1 , composé 6.  Step (iii): deprotection of the amine with a solution of acid, for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane). We can draw inspiration from the conditions of Example 1, compound 6.
L'acide de départ, par exemple l'acide 4-méthyl-4-(méthyldithio)-pentanoïque, peut être commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogène par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. Voir aussi US 2719170.  The starting acid, for example 4-methyl-4- (methyldithio) -pentanoic acid, may be commercial or prepared from a halogenated carboxylic acid by successive treatments with potassium thioacetate and a methanethiosulfonate derivative. . See also US 2719170.
PL2 préparé selon le schéma ci-dessous : PL 2 prepared according to the diagram below:
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un complexe intermédiaire en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent réducteur comme par exemple le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 17.  Step (i): reductive amination with an aldehyde; the reaction is carried out at RT in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF in two stages: formation of an intermediate complex in the presence of titanium isopropoxide and reduction in situ with a reducing agent such as, for example, sodium cyanoborohydride. We can draw inspiration from the conditions of Example 5, compound 17.
Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 18.  Step (ii): deprotection of the amine with an acid solution, for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane). We can draw inspiration from the conditions of Example 5, compound 18.
L'aldéhyde de départ, par exemple le 2-méthyl-2-(méthyldithio)-propanal, peut être commercial ou préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un alcool halogène convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate.  The starting aldehyde, for example 2-methyl-2- (methyldithio) propanal, may be commercially available or prepared by oxidation of an alcohol carrying a disulfide unit obtained from a suitably protected halogenated alcohol (for example as a silyl ether) by successive treatments with potassium thioacetate and a methanethiosulfonate derivative.
PL3 ZaS ALK-NHR 12 préparé selon les schémas ci-dessous : PL 3 Zas ALK - NHR 12 ep pr ar ed according to the schemes below:
cas où Ri?=H where Ri? = H
Etape (i) : formation d'une oxime ; l'aldéhyde précédemment décrit est mis en solution dans un solvant polaire protique comme l'éthanol puis traité par le chlorhydrate de O- méthylhydroxylamine au reflux en présence d'une base comme l'hydroxyde de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 11.  Step (i): formation of an oxime; the aldehyde previously described is dissolved in a protic polar solvent such as ethanol and then treated with O-methylhydroxylamine hydrochloride under reflux in the presence of a base such as sodium hydroxide. We can draw inspiration from the conditions of Example 3, compound 11.
Etape (ii) : réduction de l'oxime ; l'oxime est réduite par un traitement au reflux avec une solution de borane diméthylsulfure dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 12. cas où R-ι?≠H Step (ii): reduction of the oxime; the oxime is reduced by refluxing with a borane dimethylsulfide solution in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF. We can draw inspiration from the conditions of Example 3, compound 12. case where R-ι? ≠ H
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'un agent réducteur comme par exemple le triacétoxyborohydrure de sodium.  Step (i): reductive amination with an aldehyde; the reaction is carried out at RT in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF in the presence of a reducing agent such as, for example, sodium triacetoxyborohydride.
PL4 préparé selon le schéma ci-dessous PL 4 prepared according to the diagram below
Ce linker est préparé de façon semblable à ce qui est présenté pour PL2. This linker is prepared similarly to what is presented for PL 2 .
Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un complexe intermédiaire en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent réducteur comme le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 17. Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 5, composé 18.  Step (i): reductive amination with an aldehyde; the reaction is carried out at RT in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF in two stages: formation of an intermediate complex in the presence of titanium isopropoxide and reduction in situ with a reducing agent such as sodium cyanoborohydride. The conditions of Example 5, compound 17 can be used. Step (ii): deprotection of the amine with the aid of an acid solution, for example hydrochloric acid (for example in solution in the dioxane). We can draw inspiration from the conditions of Example 5, compound 18.
Etape (i) : protection de l'aminé ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'aminé avec le dicarbonate de di-fert-butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.  Step (i): protection of the amine; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment of the amine with di-tert-butyl dicarbonate in the presence of a base such as TEA.
Etape (ii) : transformation de l'alcool en bromure ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le THF par traitement de la fonction alcool avec CBr4 en présence d'une phosphine par exemple la triphénylphosphine ; voir à ce propos Appel R. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1975, 14, 801-81 1 ou Desmaris N., ét al., Tetrahedron Letters 2003, 44(41 ), 7589-7591.Step (ii): conversion of the alcohol into bromide; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as THF by treatment of the alcohol function with CBr 4 in the presence of a phosphine, for example triphenylphosphine; see in this regard Appel R. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1975, 14, 801-81 1 or Desmaris N., et al., Tetrahedron Letters 2003, 44 (41), 7589-7591.
Etape (iii) : substitution du bromure par le thioacétate ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DMF en utilisant comme nucléophile le thioacétate de potassium. Step (iii): substitution of bromide with thioacetate; the reaction is carried out at RT in an anhydrous aprotic polar solvent such as DMF using as nucleophile potassium thioacetate.
Etape (iv) : formation de la liaison disulfure ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire protique anhydre comme le méthanol en présence d'une base comme par exemple le méthanolate de sodium et d'un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure. Step (iv): formation of the disulfide bond; the reaction is carried out in an anhydrous protic polar solvent such as methanol in the presence of a base such as, for example, sodium methanolate and a reagent having a pyridyl disulfide unit.
Selon une variante : According to a variant:
Etape (v) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.  Step (v): activation of the alcohol as mesylate; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM by treatment with mesyl chloride in the presence of a base such as, for example, TEA.
Etape (vi) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme NaOH.  Step (vi): formation of the free thiol; the reaction is carried out at reflux of a protic polar solvent such as an ethanol / water mixture in two successive stages: displacement of the mesylate by thiourea and then hydrolysis in situ of the isothiouronium salt by addition of a base such as NaOH.
Etape (vii) : activation du thiol sous forme de pyridyl-disulfure ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire protique comme l'éthanol par traitement avec un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure en présence d'un acide comme l'acide acétique. Step (vii): activation of thiol as pyridyl disulfide; the reaction is carried out at RT in a protic polar solvent such as ethanol by treatment with a reagent comprising a pyridyl disulfide unit in the presence of an acid such as acetic acid.
Etape (viii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane).  Step (viii): deprotection of the amine with an acid solution, for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane).
Etape (ix) : activation de l'aminé sous forme de chlorure de carbamoyle ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le diphosgène en présence d'une base comme la TEA. pU RbZb-OC-ALK- (OCH2CH2), -OH préparé se|on |e schéma cj.dessous ; Step (ix): activation of the amine in the form of carbamoyl chloride; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM by treatment with diphosgene in the presence of a base such as TEA. p U RbZb-ALK-OC (OCH 2 CH 2) -OH is prepared | is | c j e scheme. below ;
cas où ALK=CH9CH? where ALK = CH 9 CH?
voie A: way A:
voie B: track B:
Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Step (i): deprotection with a hydrochloric acid solution (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid.
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure allylique et d'une base comme le carbonate de potassium.  Step (ii): protecting the carboxylic acid in the form of allylic ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DMF in the presence of allyl bromide and a base such as potassium carbonate.
Etape (iii) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. Step (iii): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treating a protected unsaturated acid in the form of an ester with the alkoxide generated by the action of sodium in a catalytic amount.
cas où ALK≠CHpCH? case where ALK ≠ CHpCH?
X X
Etape (iv) : élongation de la chaine PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par ex. Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., ét al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. pL7 RbZbOC-ALK- (OCH2CH2),-NHR12 préparé se|on ^ schémas ci.desS0US ! Step (iv): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alcoholate of a monoprotected PEG diol in the form of tetrahydropyran ether (THP). The preparation of this type of monoprotected PEG diol is well described in the literature, see e.g. Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou EG, et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol. Start from PEG diols are commercially available for i = 3 to 12. A p-ALK RbZbOC L7 (OCH 2 CH 2), - NHR 12 is prepared | ^ are diagrams below. d esS0US!
cas où R-i? =H where Ri? = H
cas où R-i? ≠H where Ri? ≠ H
cas où ALK≠CHpCH? case where ALK ≠ CHpCH?
cas où R17=H case where R 17 = H
Tr-^NHR12 Tr ^ NHR 12
Etape (i) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 14, composé 42. Step (i): protection of the carboxylic acid in the form of allylic ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM in the presence of allyl alcohol, an agent such as EDCI and a base like DMAP. It will be possible to draw inspiration from the conditions of Example 14, compound 42.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 14, composé 43.  Step (ii): deprotection with a solution of hydrochloric acid (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid. It will be possible to draw inspiration from the conditions of Example 14, compound 43.
Etape (iii) : alkylation de l'atome d'azote ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme NaH en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 15, composé 46.  Step (iii): alkylation of the nitrogen atom; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treatment with a base such as NaH in the presence of a reagent bearing a nucleofugal group such as an alkyl halide. We can draw inspiration from the conditions of Example 15, compound 46.
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium comme décrit dans WO 2007/127440 ; Step (iv): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alcoholate of a benzophenone-imine-PEG-alcohol generated by the action of NaH or potassium naphthalenide as described in WO 2007/127440;
Etape (v) : saponification de l'ester ; la réaction est réalisée par réaction de l'ester avec de la lithine en présence d'eau. Step (v): saponification of the ester; the reaction is carried out by reacting the ester with lithium hydroxide in the presence of water.
Etape (vi) : protection de l'aminé ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'aminé avec le dicarbonate de di-fert-butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA.  Step (vi): protection of the amine; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment of the amine with di-tert-butyl dicarbonate in the presence of a base such as TEA.
Les amino-PEG-acides sont commercialement disponibles pour i=3,5,6,10 ou peuvent être préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et de l'amino-PEG-alcool correspondant. Amino-PEG-acids are commercially available for i = 3.5, 6, 10 or may be prepared from F-butyl acrylate and the corresponding amino-PEG-alcohol.
Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3, 4, 7, 8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction aminé par la benzophénone peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF3. The amino-PEG-alcohols are commercially available for, for example, i = 3, 4, 7, 8 or can be prepared from PEG diols, commercially available for i = 3 to 12, according to the procedure described in US 7230101. of the amine function by benzophenone can be carried out by azeotropic dehydration in the presence of a Lewis acid such as BF 3 etherate.
PL8 préparé selon les schémas ci-dessous : PL 8 prepared according to the diagrams below:
cas où ALK=CH9CH 2where ALK = CH 9 CH 2
Etape (i) : déprotection du composé de départ à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 50. Step (i): deprotection of the starting compound with a solution of hydrochloric acid (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid. We can draw inspiration from the conditions of Example 16, compound 50.
Etape (ii) : protection de la fonction acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure allylique et d'une base comme le carbonate de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 51. Step (ii): protection of the carboxylic acid function in the form of allylic ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DMF in the presence of allyl bromide and a base such as potassium carbonate. We can draw inspiration from the conditions of Example 16, compound 51.
Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.  Step (iii): activation of the alcohol as mesylate; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM by treatment with mesyl chloride in the presence of a base such as TEA.
Etape (iv) : réaction entre la fonction mésylate et la fonction aminé du composé H , Step (iv): reaction between the mesylate function and the amine function of compound H,
(alkylation) ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'une base comme la TEA. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 16, composé 52. (alkylation); the reaction is carried out at RT in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM in the presence of a base such as TEA. The conditions of Example 16, compound 52 can be inspired.
cas où ALK≠ CHpCH?  case where ALK ≠ CHpCH?
<") ^ ^^ /^O X ALK^/^OH <" ) ^ ^^ / ^ OX ALK ^ / ^ OH
Etape (v) : élongation de la chaine PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par ex. Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i= 3 à 12.  Step (v): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alcoholate of a monoprotected PEG diol in the form of tetrahydropyran ether (THP). The preparation of this type of monoprotected PEG diol is well described in the literature, see e.g. Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol. The starting PEG diols are commercially available for i = 3 to 12.
PL9 préparé selon le schéma ci-dessous : PL 9 prepared according to the diagram below:
Etape (i) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme l'acétonitrile avec un halogénoalkylcarboxylate d'allyle comme le bromoacétate d'allyle en présence d'une base comme par exemple la TEA. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 13, composé 38.  Step (i): alkylation of the amine; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as acetonitrile with an allyl haloalkylcarboxylate such as allyl bromoacetate in the presence of a base such as TEA. It will be possible to draw inspiration from the conditions of Example 13, compound 38.
Etape (ii) : déprotection de l'aminé à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 13, composé 39.  Step (ii): deprotection of the amine with an acid solution, for example hydrochloric acid (eg in solution in dioxane). We can draw inspiration from the conditions of Example 13, compound 39.
L'halogénoalkylcarboxylate d'allyle peut être obtenu à partir de l'alcool allylique et de l'halogénure d'halogénoacyle correspondant et commercialement disponible pour ALK=-(CH2)i-6- (comme le bromure de bromoacétyle ou le chlorure de 4-butanoyle). The allyl halogenoalkylcarboxylate can be obtained from allyl alcohol and the haloacyl halide and the corresponding commercially available for ALK = - (CH 2) i- 6 - (such as bromoacetyl bromide or 4-butanoyl chloride).
PL10 préparé selon les schémas ci-dessous :PL 10 prepared according to the diagrams below:
cas où ALK≠ CHpCH? case where ALK ≠ CHpCH?
Etape (i) : ouverture de l'anhydride cyclique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydride comme le DCM en présence d'une base comme la TEA.  Step (i): opening of the cyclic anhydride; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar anhydride solvent such as DCM in the presence of a base such as TEA.
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP.  Step (ii): protecting the carboxylic acid in the form of allylic ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM in the presence of allyl alcohol, a coupling agent such as EDCI and a base such as DMAP.
Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane).  Step (iii): deprotection with a hydrochloric acid solution (eg, dioxane solution).
Etape (iv) : couplage peptique ; la réaction entre l'acide carboxylique et l'aminé est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'un agent de couplage comme le système DIC / HOBt.  Step (iv): peptic coupling; the reaction between the carboxylic acid and the amine is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM in the presence of a coupling agent such as the DIC / HOBt system.
Etape (v) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.  Step (v): saponification of the methyl ester; the reaction is carried out at RT in a mixture of polar solvents such as a THF / water mixture in the presence of lithium hydroxide.
Les diacides monoprotégés sous forme d'ester méthylique sont commercialement disponibles pour ALK=-(CH2)i-6- (comme l'ester monométhylique de l'acide 1 ,6-hexanedioïque). Mono-protected diacids in methyl ester form are commercially available for ALK = - (CH 2 ) i-6- (such as 1,6-hexanedioic acid monomethyl ester).
PL11 préparé selon les schémas ci-dessous : PL 11 prepared according to the diagrams below:
cas où ALK=CH9CH? where ALK = CH 9 CH?
Etape (i) : formation de l'amide et activation de l'acide ; les deux étapes sont réalisées successivement dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : réaction entre la fonction aminé et l'halogénoacétate de N-hydroxysuccinimidyle puis addition in situ d'un agent de couplage comme le DIC. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 17, composé 56. Step (i): formation of the amide and activation of the acid; both stages are realized successively in an aprotic polar solvent such as DCM: reaction between the amine function and the N-hydroxysuccinimidyl haloacetate and then in situ addition of a coupling agent such as DIC. The conditions of Example 17, compound 56 can be inspired.
Etape (ii) : protections de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique et de l'aminé sous forme de trifluoroacétamide ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : protection de l'acide par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane en présence de méthanol puis protection de l'aminé par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base comme la TEA.  Step (ii): protecting the carboxylic acid in the form of methyl ester and the amine in the form of trifluoroacetamide; the reaction is carried out in two successive stages in an aprotic polar solvent such as DCM: protection of the acid by treatment with trimethylsilyldiazomethane in the presence of methanol and then protection of the amine by addition of trifluoroacetic anhydride and a base such as TEA.
Etape (iii) : alkylation de l'aminé et saponification de l'ester ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF : alkylation de l'aminé par traitement avec une base comme NaH en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle R12HaI puis addition de lithine et d'eau. Etape (i) : suite à l'étape (iii), on reprend les réactions de l'étape (i) pour le cas R12=H. cas où ALK≠CHpCH? Step (iii): alkylation of the amine and saponification of the ester; the reaction is carried out in two successive stages in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF: alkylation of the amine by treatment with a base such as NaH in the presence of a reagent bearing a nucleofuge group such as an alkyl halide R 12 HaI then addition of lithium and water. Step (i): Following step (iii), the reactions of step (i) are repeated for the case R 12 = H. case where ALK ≠ CHpCH?
cas où R12=H where R 12 = H
HO ΛALK- OV J^^ OJ Tr^ NH, HO ΛALK- OV Y ^^ OJ Tr ^ NH,
cas où R12≠H where R 12 ≠ H
Z=Br ou I  Z = Br or I
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium (cf. WO 2007/127440) ;  Step (iv): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alcoholate of a benzophenoneimine-PEG-alcohol generated by the action of NaH or potassium naphthalenide ( see WO 2007/127440);
Etape (v) : clivage sélectif de l'imine par hydrogénation en présence de palladium sur charbon (cf. Wessjohann, L. ét al., Synthesis 1989, 5, 359-63) ; Etape (vi) : protection de l'aminé par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base∞mme la TEA. Step (v): Selective cleavage of imine by hydrogenation in the presence of palladium on charcoal (see Wessjohann, L. et al., Synthesis 1989, 5, 359-63); Step (vi): protection of the amine by addition of trifluoroacetic anhydride and a base∞me TEA.
Les amino-PEG-acides sont∞mmercialement disponibles pour i=3, 5, 6, 10 ou peuvent être préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et de l'amino-PEG-alcool correspondant.  The amino-PEG-acids are commercially available for i = 3, 5, 6, 10 or can be prepared from the F-butyl acrylate and the corresponding amino-PEG-alcohol.
Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3, 4, 7, 8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction aminé par la benzophénone peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF3. The amino-PEG-alcohols are commercially available for, for example, i = 3, 4, 7, 8 or can be prepared from PEG diols, commercially available for i = 3 to 12, according to the procedure described in US 7230101. of the amine function by benzophenone can be carried out by azeotropic dehydration in the presence of a Lewis acid such as BF 3 etherate.
PL12 z= Br ou ' préparé selon les schémas ci-dessous :PL 12 z = Br or 'prepared according to the diagrams below:
Voie A : Way A:
Voie B :  Path B:
V- Η:z V- Η: z
cas où ALK≠ CH7CH7 case where ALK ≠ CH 7 CH 7
r O ^\ ^>^z r O ^ \ ^> ^ z
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.  Step (i): activation of the alcohol as mesylate; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM by treatment with mesyl chloride in the presence of a base such as TEA.
Etape (ii) : échange mésylate / halogène ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire aprotique comme l'acétone avec un halogénure de sodium comme l'iodure de sodium.  Step (ii): mesylate / halogen exchange; the reaction is carried out at the reflux of an aprotic polar solvent such as acetone with a sodium halide such as sodium iodide.
Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.  Step (iii): deprotection with a solution of hydrochloric acid (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid.
Etape (iv) : activation de l'acide ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC. Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. Step (iv): activation of the acid; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC. Step (v): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treating an unsaturated acid protected in the form of an ester with the alkoxide generated by the action of sodium in catalytic amount.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. L'intermédiare formé est hydrolyse sélectivement à pH 5 en hydroxy ester.  Step (vi): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alkyd of PEG diol monoprotected in tetrahydropyran ether (THP). The preparation of this type of monoprotected PEG diol is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. The intermediate formed is hydrolyzed selectively at pH 5 to the hydroxy ester.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol. The starting PEG diols are commercially available for i = 3 to 12.
PL13 préparé se|on \es schémas ci-dessous :PL 13 prepared itself | we are schemas below:
Voie A : Way A:
Voie B : Path B:
cas où ALK≠CH?CH2 case where ALK ≠ CH? CH 2
Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du trifluoroacétate de la fonction hydroxy peut se former. Il est clivé lors de l'étape suivante (ii).  Step (i): deprotection with a hydrochloric acid solution (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid. In the latter case, trifluoroacetate of the hydroxy function can be formed. It is cleaved in the next step (ii).
Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane.  Step (ii): protection of the carboxylic acid in the form of methyl ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as methanol by treatment with trimethylsilyldiazomethane.
Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.  Step (iii): activation of the alcohol as mesylate; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM by treatment with mesyl chloride in the presence of a base such as TEA.
Etape (iv) : formation du thiol libre et saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium. Step (iv): formation of the free thiol and saponification of the methyl ester; the reaction is carried out at reflux of a protic polar solvent such as a two-stage ethanol / water mixture successive: displacement of the mesylate by thiourea then hydrolysis in situ of the isothiouronium salt by addition of a base such as sodium hydroxide.
Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.  Step (v): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treating a protected unsaturated acid in the form of an ester with the alkoxide generated by the action of sodium in a catalytic amount.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol Step (vi): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alkyd of PEG diol monoprotected in tetrahydropyran ether (THP). The preparation of this type of diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.Monoprotected PEG is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E. G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
Le linker avec n = 8 (l'acide 3-[2-mercaptoéthoxy-hepta-(éthylèneoxy)]propionique) est disponible commercialement. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10- trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol The linker with n = 8 (3- [2-mercaptoethoxy-hepta- (ethyleneoxy)] propionic acid) is commercially available. PEG alcohols with a protected acid function in the form of a fert-butyl ester are commercially available (such as Fert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a diol
PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. PEG. The starting PEG diols are commercially available for i = 3 to 12.
PL14 préparé selon le schéma ci-dessous : PL 14 prepared according to the diagram below:
cas où ALK=CH7CH7 where ALK = CH 7 CH 7
cas où ALK≠CHpCH? case where ALK ≠ CHpCH?
Etape (i) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.  Step (i): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treating a protected unsaturated acid in the form of an ester with the alkoxide generated by the action of sodium in a catalytic amount.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du trifluoroacétate de la fonction alcool éventuellement présente sur la structure peut se former. Ce trifluoroacétate est clivé lors de l'étape suivante (iii). Step (ii): deprotection with a solution of hydrochloric acid (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid. In the latter case, trifluoroacetate of the function Any alcohol present on the structure may form. This trifluoroacetate is cleaved in the next step (iii).
Etape (iii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane.  Step (iii): protection of the carboxylic acid in the form of methyl ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as methanol by treatment with trimethylsilyldiazomethane.
Etape (iv) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.  Step (iv): saponification of the methyl ester; the reaction is carried out at RT in a mixture of polar solvents such as a THF / water mixture in the presence of lithium hydroxide.
Etape (v) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP.  Step (v): protection of the carboxylic acid in the form of allylic ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM in the presence of allyl alcohol, a coupling agent such as EDCI and a base such as DMAP.
Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol Step (vi): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alkyd of PEG diol monoprotected in tetrahydropyran ether (THP). The preparation of this type of diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.Monoprotected PEG is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. ,  Starting PEG diols are commercially available for i = 3 to 12.
PL15 prépare selon les schémas ci-dessous :PL 15 prepares according to the diagrams below:
Voie A : Way A:
Voie B :  Path B:
cas ou ALK≠CH ?CH? case or ALK ≠ CH ? CH ?
Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'une base comme NaH et d'un halogénure d'alkynyle comme le bromure de propargyle ou le 4-bromo-1-butyne. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 63. Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 65. Step (i): nucleophilic substitution; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF in the presence of a base such as NaH and an alkynyl halide such as propargyl bromide or 4-bromo-1-butyne. We can draw inspiration from the conditions of Example 20, compound 63. Step (ii): deprotection with a solution of hydrochloric acid (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid. The conditions of Example 20, compound 65 can be inspired.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.  Step (iii): Activation of the carboxylic acid as NHS ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 20, composé 64.  Step (iv): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treating a protected unsaturated acid in the form of an ester with the alkoxide generated by the action of sodium in a catalytic amount. It will be possible to draw inspiration from the conditions of Example 20, compound 64.
Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.  Step (v): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alkyd of PEG diol monoprotected in tetrahydropyran ether (THP). The preparation of this type of monoprotected PEG diol is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.  PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol. The starting PEG diols are commercially available for i = 3 to 12.
PL16 RbZbOc-ALK-(OCH2CH2),' 3 préparé selon les schémas ci-dessous PL 16 RbZbOc-ALK- (OCH 2 CH 2 ), 3 prepared according to the diagrams below
cas où ALK≠CHpCH?case where ALK ≠ CHpCH?
Etape (i) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.  Step (i): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treating a protected unsaturated acid in the form of an ester with the alkoxide generated by the action of sodium in a catalytic amount.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.  Step (ii): deprotection with a solution of hydrochloric acid (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à Step (iii): Activation of the carboxylic acid as NHS ester; the reaction is carried out at
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
Etape (iv) : élongation de la chaîne hydroxy azido PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate de l'hydroxy azido PEG. Les alcools azido PEG sont commercialement disponibles ou peuvent être préparés à partir des diols PEG correspondants commercialement disponibles pour i=3 à 12. 17 préparé selon le schéma ci-dessous : Step (iv): elongation of the hydroxy azido chain PEG; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alkoxide of the hydroxy azido PEG. PEG azido alcohols are commercially available or can be prepared from the corresponding commercially available PEG diols for i = 3 to 12. 17 prepared according to the diagram below:
Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté.  Step (i): activation of the carboxylic acid in NHS ester form; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
Les acides porteurs d'un groupement acétylénique sont commercialement disponibles pour ALK=-(CH2)m- avec m=1 à 10 (comme l'acide 3-butynoïque). The acids carrying an acetylenic group are commercially available for ALK = - (CH 2 ) m - with m = 1 to 10 (such as 3-butynoic acid).
PL •18 Rbzb-co-ALK' 'préparé selon le schéma ci-dessous PL • 18 R b z b -co-ALK ' ' prepared according to the diagram below
Etape (i) : substitution nucléophile de l'halogénure par l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétone en présence d'azoture de sodium.  Step (i): nucleophilic substitution of the halide with azide; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as acetone in the presence of sodium azide.
Etape (ii) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à TA dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine.  Step (ii): saponification of the methyl ester; the reaction is carried out at RT in a mixture of polar solvents such as a THF / water mixture in the presence of lithium hydroxide.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à Step (iii): Activation of the carboxylic acid as NHS ester; the reaction is carried out at
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
Les esters méthyliques porteurs d'un motif halogénoalkyle sont commercialement disponibles pour ALK = -(CH2Jm- avec m=1 à 6 (comme le bromoacétate de méthyle). The methyl esters bearing a haloalkyl moiety are commercially available for ALK = - (CH 2 J m - with m = 1 to 6 (such as methyl bromoacetate).
PL19 prépare selon les schémas ci-dessous : PL 19 prepare according to the diagrams below:
cas où ALK=CH7CH? where ALK = CH 7 CH?
voie A : way A:
voie B :  track B:
cas où ALK≠CH?CH? | case where ALK ≠ CH ? CH ? |
Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'une base comme NaH et d'un halogénure d'alkènyle comme le bromure d'allyle ou le 4-bromo-1 -butène.  Step (i): nucleophilic substitution; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF in the presence of a base such as NaH and an alkenyl halide such as allyl bromide or 4-bromo-1-butene.
Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique.  Step (ii): deprotection with a solution of hydrochloric acid (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid.
Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à Step (iii): Activation of the carboxylic acid as NHS ester; the reaction is carried out at
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique.  Step (iv): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treating a protected unsaturated acid in the form of an ester with the alkoxide generated by the action of sodium in a catalytic amount.
Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogène avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol Step (v): elongation of the PEG chain; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment of a halogenated ester with the alkyd of PEG diol monoprotected in tetrahydropyran ether (THP). The preparation of this type of diol
PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem.Monoprotected PEG is well described in the literature, see for example Richard A. et al. Chem.
Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 or Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090.
Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester fert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de fert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12.  PEG alcohols with a protected acid function in the form of a tert-butyl ester are commercially available (such as tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate) or prepared from F-butyl acrylate and a PEG diol. The starting PEG diols are commercially available for i = 3 to 12.
PL20 préparé selon le schéma ci-dessous : PL 20 prepared according to the diagram below:
Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à Step (i): activation of the carboxylic acid in NHS ester form; the reaction is carried out at
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
Les acides porteurs d'un groupement éthylénique sont commercialement disponibles pour ALK=- The acids carrying an ethylenic group are commercially available for ALK = -
(CH2Jm- avec m= 1 à 10 (comme l'acide 3-butènoïque). (CH 2 Jm- with m = 1 to 10 (such as 3-butenoic acid).
PL21 préparé se|on |es schémas ci_desS0US :PL 21 is prepared | it | es c i_ patterns of sS0US:
cas où Ri ? et R'-i 2= H Boc Bocwhere Ri? and R'-i 2 = H Boc Boc
,2,BBoo i,NR'<9Boc , 2 , BBoo i , NR '<9 Boc
I"1" j.N 'R' Boo I " 1 " j .N ' R' Boo
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en présence d'oxyde0 d'argent et d'iodure de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé Step (i): activation of the alcohol in the form of tosylate; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with tosyl chloride in the presence of silver oxide and potassium iodide. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, composed of
23. 23.
Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 24. Step (ii): nucleophilic substitution of tosylate; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as acetonitrile by treatment with sodium azide. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 24.
5 Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 26. Step (iii): azide reduction; the reaction is carried out in a polar solvent such as a THF / water mixture in the presence of triphenylphosphine. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 26.
Etape (iv) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme le0 triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme catalyseur. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 27.  Step (iv): reductive amination with an aldehyde; the reaction is carried out at RT in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM in the presence of a reducing agent such as sodium triacetoxyborohydride and, if necessary, acetic acid as catalyst. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 27.
Etape (v) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 29. Step (v): deprotection with a hydrochloric acid solution (e.g. dioxane) or trifluoroacetic acid. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 29.
Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base comme l'hydrure de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle.  Step (vi): protection of the NHBoc function; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment with 1 equivalent of base such as sodium hydride followed by a benzyl halide such as benzyl chloride.
Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido ; la réaction est réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en présence d'un catalyseur comme l'hydroxyde de palladium.  Step (vii): cleavage of the benzyl group and reduction of the azido function; the reaction is carried out in a protic solvent such as methanol with hydrogen in the presence of a catalyst such as palladium hydroxide.
Etape (viii) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 25.  Step (viii): alkylation of the amine; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treatment with a base such as sodium hydride in the presence of a reagent bearing a nucleofugal group such as an alkyl halide. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 25.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'aldéhyde ZaSS-ALK- CHO, par exemple le 2-méthyl-2-(méthyldithio)-propanal, est commercial ou peut être préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un alcool halogène convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. préparé se|on ,es schémas ci_desS0US : Amino-PEG-alcohols protected or not by a Boc group on the amino function are commercially available (such as N-Boc-aminoethoxy-ethoxy-ethanol or 1-amino-3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) or can be prepared from PEG diols, commercially available for i = 3 to 12, according to the procedure described in US 7230101. ZaSS-ALK-CHO aldehyde, for example 2-methyl-2- (methyldithio) -propanal is commercially available or can be prepared by oxidation of an alcohol carrying a disulfide unit obtained from a suitably protected halogenated alcohol (for example in the form of silylated ether) by successive treatments with potassium thioacetate and a derivative thereof. of methanethiosulfonate type. prepared himself | we , schemas c i_ of sS0US:
cas où Ri ?=H et R'i 2≠ H where Ri? = H and R'i 2 ≠ H
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en présence d'oxyde d'argent et d'iodure de potassium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé Step (i): activation of the alcohol in the form of tosylate; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with tosyl chloride in the presence of silver oxide and potassium iodide. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, composed of
23. 23.
Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 24.  Step (ii): nucleophilic substitution of tosylate; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as acetonitrile by treatment with sodium azide. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 24.
Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 26.  Step (iii): azide reduction; the reaction is carried out in a polar solvent such as a THF / water mixture in the presence of triphenylphosphine. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 26.
Etape (iv) : couplage peptidique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le diméthylformamide en présence d'agents de couplage comme le système N, N'- diisopropylcarbodiimide/1-hydroxybenzotriazole et d'une base comme la TEA.  Step (iv): peptide coupling; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as dimethylformamide in the presence of coupling agents such as the N, N'-diisopropylcarbodiimide / 1-hydroxybenzotriazole system and a base such as TEA.
Etape (v) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 7, composé 32.  Step (v): deprotection with a hydrochloric acid solution (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid. We can draw inspiration from the conditions of Example 7, compound 32.
Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base comme l'hydrure de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle. Step (vi): protection of the NHBoc function; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as THF or DMF by treatment with 1 equivalent of base such as sodium hydride followed by a benzyl halide such as benzyl chloride.
Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido ; la réaction est réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en présence d'un catalyseur comme l'hydroxyde de palladium.  Step (vii): cleavage of the benzyl group and reduction of the azido function; the reaction is carried out in a protic solvent such as methanol with hydrogen in the presence of a catalyst such as palladium hydroxide.
Etape (viii) : alkylation de l'aminé par amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme le triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme catalyseur. Step (viii): alkylation of the amine by reductive amination with an aldehyde; the reaction is carried out at RT in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM in the presence of a reducing agent such as sodium triacetoxyborohydride and, if necessary, acetic acid as catalyst.
Etape (ix) : alkylation du groupe NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 6, composé 25.  Step (ix): alkylation of the NHBoc group; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treatment with a base such as sodium hydride in the presence of a reagent bearing a nucleofugal group such as an alkyl halide. We can draw inspiration from the conditions of Example 6, compound 25.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'acide carboxylique Amino-PEG-alcohols protected or not by a Boc group on the amino function are commercially available (such as N-Boc-aminoethoxy-ethoxy-ethanol or 1-amino-3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) or can be prepared from PEG diols, commercially available for i = 3 to 12, according to the procedure described in US 7230101. The carboxylic acid
ZaS-ALK-C02H, par exemple l'acide 4-méthyl-4-(méthyldithio)-pentanoïque, peut être commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogène par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. ZaS-ALK-CO 2 H, for example 4-methyl-4- (methyldithio) -pentanoic acid, may be commercially available or prepared from a halogenated carboxylic acid by successive treatments with potassium thioacetate and a derivative of methanethiosulfonate type.
PL23 ZaS-(CH2CH2O)1-CH2CH2-NHR12 préparé selon les schémas ci-dessous PL 23 ZaS- (CH 2 CH 2 O) 1 -CH 2 CH 2 -NHR 12 pre pa re according to the schemes below
Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA.  Step (i): activation of the alcohol as mesylate; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as DCM by treatment with mesyl chloride in the presence of a base such as TEA.
Etape (ii) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium.  Step (ii): formation of the free thiol; the reaction is carried out at reflux of a protic polar solvent such as an ethanol / water mixture in two successive stages: displacement of the mesylate by thiourea and then hydrolysis in situ of the isothiouronium salt by addition of a base such as sodium hydroxide .
Etape (iii) : protection du thiol ; la réaction est réalisée dans un mélange de solvants polaires comme un mélange éthanol/eau avec un réactif comportant une fonction méthanethiosulfonate comme le méthyl-méthanethiosulfonate en présence d'une base comme le carbonate de sodium. Step (iii): thiol protection; the reaction is carried out in a mixture of polar solvents such as an ethanol / water mixture with a reagent comprising a methanethiosulphonate function such as methyl-methanethiosulphonate in the presence of a base such as sodium carbonate.
Etape (iv) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Step (iv): deprotection with a hydrochloric acid solution (eg, dioxane solution) or trifluoroacetic acid.
Etape (v) : alkylation de l'aminé ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge∞mme un halogénure d'alkyle. Step (v): alkylation of the amine; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treatment with a base such as sodium hydride in the presence a reagent carrying a nucleofuge group∞mme an alkyl halide.
Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction aminé sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. Amino-PEG-alcohols protected or not by a Boc group on the amino function are commercially available (such as N-Boc-aminoethoxy-ethoxy-ethanol or 1-amino-3,6,9-trioxaundecanyl-11-ol) or can be prepared from PEG diols, commercially available for i = 3 to 12, according to the procedure described in US 7230101.
Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC.  Step (i): activation of Fmoc-L-valine as NHS ester; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC.
Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange diméthoxyéthane/THF/eau en présence d'une base comme le bicarbonate de sodium.  Step (ii): peptide coupling between Fmoc-L-valine-NHS and L-citrulline; the reaction is carried out in a polar solvent such as a dimethoxyethane / THF / water mixture in the presence of a base such as sodium bicarbonate.
Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de couplage comme l'EEDQ.  Step (iii): peptide coupling with 4-aminobenzyl alcohol; the reaction is carried out in a polar solvent such as a DCM / methanol mixture in the presence of a coupling agent such as EEDQ.
Etape (iv) : déprotection de l'aminé Fmoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine.  Step (iv): deprotection of the amine Fmoc; the reaction is carried out in a polar solvent such as a DCM / methanol mixture in the presence of a base such as diethylamine.
Etape (v) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le chlorhydrate d'EDCI.  Step (v): Activation of the carboxylic acid as NHS ester; the reaction is carried out in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as EDCI hydrochloride.
Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile.  Step (vi): peptide coupling between the dipeptide and the NHS ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as a DCM / acetonitrile mixture.
Les diacides monoprotégés sous forme d'ester allylique sont commercialement disponibles pour n=2 (succinate de monoallyle) ou peuvent être préparés par transestérification des monoesters méthyliques ou tert-butyliques qui sont commercialement disponibles pour n = 2 à 6. Mono-protected diacids in the form of allyl ester are commercially available for n = 2 (monoallyl succinate) or can be prepared by transesterification of monoesters methyl or tert-butyl compounds which are commercially available for n = 2 to 6.
Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC.  Step (i): activation of Fmoc-L-valine as NHS ester; the reaction is carried out in an anhydrous aprotic polar solvent such as THF by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC.
Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DME/THF/eau en présence d'une base comme le bicarbonate de sodium.  Step (ii): peptide coupling between Fmoc-L-valine-NHS and L-citrulline; the reaction is carried out in a polar solvent such as a DME / THF / water mixture in the presence of a base such as sodium bicarbonate.
Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de couplage comme l'EEDQ.  Step (iii): peptide coupling with 4-aminobenzyl alcohol; the reaction is carried out in a polar solvent such as a DCM / methanol mixture in the presence of a coupling agent such as EEDQ.
Etape (iv) : déprotection de l'aminé Fmoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine.  Step (iv): deprotection of the amine Fmoc; the reaction is carried out in a polar solvent such as a DCM / methanol mixture in the presence of a base such as diethylamine.
Etape (v) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à Step (v): Activation of the carboxylic acid as NHS ester; the reaction is carried out at
TA dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. TA in an aprotic polar solvent such as DCM by treatment with NHS in the presence of a coupling agent such as DCC supported.
Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS ; la réaction est réalisée à TA dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile.  Step (vi): peptide coupling between the dipeptide and the NHS ester; the reaction is carried out at RT in an aprotic polar solvent such as a DCM / acetonitrile mixture.
Les diacides PEG monoprotégés sous forme allyle sont préparés selon la description de préparation du linker L14. The PEG monoprotected diacids in allyl form are prepared according to the preparation description of the linker L 14 .
Le bromoacétate et l'iodoacétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle sont des produits commerciaux dont les numéros CAS sont respectivement 42014-51-7 et 39028-27-8. Tableau 2,5-Dioxo-pyrrolidin-1-yl bromoacetate and iodoacetate are commercial products with CAS numbers 42014-51-7 and 39028-27-8, respectively. Board
κ> κ>
Procédé de préparation du conjugué Process for preparing the conjugate
Le conjugué est obtenu par le procédé consistant à :  The conjugate is obtained by the process of:
(i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse de l'agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution du dérivé de cryptophycine de formule (II) ;  (i) contacting and allowing to react an aqueous solution of the optionally buffered targeting agent and a solution of the cryptophycin derivative of formula (II);
(ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé de cryptophycine et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient formés. (ii) then optionally separating the conjugate formed in step (i) from the cryptophycin derivative and / or the unreacted targeting agent and / or aggregates that would have formed.
Plus particulièrement, on ne sépare à l'étape (ii) le conjugué de l'étape (i) que du dérivé de cryptophycine n'ayant pas réagi et des agrégats qui se seraient formés et on laisse dans la solution l'agent de ciblage qui n'aurait éventuellement pas réagi. More particularly, step (i) of the conjugate of step (i) is separated from unreacted cryptophycin derivative and aggregates that would have formed and the targeting agent is left in the solution. who would not have reacted.
La mise en contact a pour fonction de laisser réagir les groupes chimiques GCR1 et GCR2 afin d'assurer l'attachement du dérivé de cryptophycine sur l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente ; de préférence, The function of the contacting is to allow the chemical groups GCR1 and GCR2 to react in order to ensure the attachment of the cryptophycin derivative to the targeting agent by formation of a covalent bond; preferably,
• lorsque GCR1 représente -SZa : on modifie l'agent de ciblage à l'aide d'un agent de modification de façon à introduire sur l'agent de ciblage des groupes GCR2 adaptés, notamment ceux décrits dans la 2eme colonne du Tableau I : • when GCR1 represents -SZ has: modifying the targeting agent with a modifying agent so as to introduce on the targeting agent of GCR2 groups suitable, including those described in the 2nd column of Table I:
o des groupes chimiques disulfures dans le cas où GCR1 représente -SH ;  disulfide chemical groups in the case where GCR1 represents -SH;
o des groupes chimiques thiol dans le cas où GCR1 représente -SZa avec Za≠H ; o des groupes chimiques maléimido ou iodoacétamido dans le cas où GCR1 représente -SH ; thiol chemical groups in the case where GCR1 represents -SZ a with Z a ≠ H; o maleimido or iodoacetamido chemical groups in the case where GCR1 represents -SH;
Dans le cas d'un anticorps (MAb), on trouve les formules des conjugués dans la 4eme colonne du Tableau I ; In the case of an antibody (MAb) include formulas conjugates in the 4 th column of Table I;
• lorsque GCR1 représente -C(=O)-ZbRb : la réaction a lieu préférentiellement sur les fonctions amino de l'agent de ciblage, notamment les groupes ε-amino portés par les chaînes latérales des résidues lysine (Lys) d'un anticorps. Dans le cas d'un anticorps (MAb), on obtient dans ce cas un conjugué de formule : MAb-[N H-C(=O)-L*-Crypto]d avec L* = fragment d'un linker L comprenant GCR1=-C(=O)-ZbRb et tel que L= -L*C(=O)-ZbRb ;When GCR1 represents -C (= O) -Z b Rb: the reaction takes place preferentially on the amino functions of the targeting agent, in particular the ε-amino groups carried by the side chains of the lysine residues (Lys) of an antibody. In the case of an antibody (MAb), there is obtained in this case a conjugate of formula: MAb- [N HC (= O) -L * -Crypto] d with L * = fragment of a linker L comprising GCR1 = -C (= O) -Z b R b and such that L = -L * C (= O) -Z b R b ;
• en présence d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) avec G= -(CH2)nY, l'agent de ciblage comprend des groupes -SH lorsque Y= -Cl, des groupes -C≡CH lorsque Y= -N3 ou des groupes acide carboxylique lorsque Y= -OH ou -NH2 ; In the presence of a cryptophycin derivative of formula (III) with G = - (CH 2 ) n Y, the targeting agent comprises -SH groups when Y = -Cl, -C≡CH groups when Y = -N 3 or carboxylic acid groups when Y = -OH or -NH 2 ;
• en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type maléimido ou haloacétamido, l'agent de ciblage comprend des groupes chimiques thiols.  In the presence of a cryptophycin derivative comprising a reactive chemical group GCR1 of maleimido or haloacetamido type, the targeting agent comprises thiol chemical groups.
On entend par « agrégats » les associations qui peuvent se former entre deux agents de ciblage ou plus, les agents de ciblage ayant été modifiés ou non par conjugaison. Les agrégats sont susceptibles de se former sous l'influence d'un grand nombre de paramètres tels qu'une concentration élevée en agent de ciblage dans la solution, le pH de la solution, des forces de cisaillement élevées, le nombre de dimères greffés et leur caractère hydrophobe, la température (voir les références citées dans l'introduction de J. Membrane Sci. 2008, 318, 31 1-316), l'influence de certains d'entre eux n'étant parfois pas éclaircie avec précision. Dans le cas des protéines ou des anticorps, on pourra se reporter à AAPS Journal, « Protein Aggregation and Bioprocessing » 2006, 8(3), E572-E579. La teneur en agrégats peut être déterminée à l'aide de techniques connues telles que la SEC (voir à ce propos, Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480). La solution aqueuse de l'agent de ciblage peut être tamponnée à l'aide par exemple de tampons tels que par exemple le phosphate de potassium ou l'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2- éthanesulfonique (tampon HEPES) ou un mélange de tampons tel que le tampon A décrit plus loin. Le tampon dépend de la nature de l'agent de ciblage. Le dérivé de cryptophycine est mis en solution dans un solvant organique polaire, par exemple le DMSO ou la DMA. "Aggregates" means the associations that can be formed between two or more targeting agents, the targeting agents having been modified or not by conjugation. Aggregates are likely to form under the influence of a large number of parameters such as high concentration of targeting agent in the solution, pH of the solution, high shear forces, number of graft dimers and their hydrophobicity, temperature (see references cited in the introduction of J. Membrane Sci. 2008 , 318, 31 1-316), the influence of some of them sometimes not being clarified with precision. In the case of proteins or antibodies, reference may be made to AAPS Journal, "Protein Aggregation and Bioprocessing" 2006, 8 (3), E572-E579. Aggregate content can be determined using known techniques such as SEC (see in this regard, Analytical Biochemistry 1993, 212 (2), 469-480). The aqueous solution of the targeting agent may be buffered using, for example, buffers such as, for example, potassium phosphate or N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES buffer) or a buffer mixture such as buffer A described later. The buffer depends on the nature of the targeting agent. The cryptophycin derivative is dissolved in a polar organic solvent, for example DMSO or DMA.
La réaction a lieu à une température comprise généralement entre 20 et 40°C. La durée de la réaction peut varier entre 1 à 24 h. La réaction entre l'anticorps et le dérivé de cryptophycine peut être suivie par SEC avec un détecteur réfractométrique et/ou ultraviolet afin d'en déterminer l'état d'avancement. Si le taux de substitution est insuffisant, on peut laisser réagir plus longtemps et/ou ajouter du dérivé de cryptophycine. On pourra se reporter à la méthode générale donnée dans la partie exemples pour plus de détails sur des conditions particulières. Des modes particuliers sont décrits dans les exemples 9, 10, 1 1 , 25, 26 ou 27. The reaction takes place at a temperature generally between 20 and 40 ° C. The duration of the reaction can vary between 1 to 24 hours. The reaction between the antibody and the cryptophycin derivative may be followed by SEC with a refractometric and / or ultraviolet detector to determine its progress. If the substitution rate is insufficient, it is possible to allow a longer reaction time and / or to add cryptophycin derivative. We can refer to the general method given in the examples section for more details on particular conditions. Particular modes are described in Examples 9, 10, 11, 25, 26 or 27.
L'homme du métier dispose de différentes techniques chromatographiques pour la séparation de l'étape (ii) : le conjugué peut être purifié par exemple par chromatographie d'exclusion stérique (SEC), par chromatographie d'adsorption (comme l'échangeuse d'ions, IEC), par chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), par chromatographie d'affinité, par chromatographie sur des supports mixtes comme l'hydroxyapatite céramique ou par HPLC. La purification par dialyse ou diafiltration peut également être utilisée. Those skilled in the art have different chromatographic techniques for the separation of step (ii): the conjugate can be purified for example by steric exclusion chromatography (SEC), by adsorption chromatography (such as the exchange agent). ions, IEC), by hydrophobic interaction chromatography (HIC), by affinity chromatography, by chromatography on mixed media such as ceramic hydroxyapatite or by HPLC. Purification by dialysis or diafiltration can also be used.
Après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué peut subir une étape (iii) d'ultrafiltration et/ou de diafiltration. On obtient donc à l'issue de ces étapes le conjugué en solution aqueuse. After step (i) or (ii), the solution of the conjugate may undergo a step (iii) of ultrafiltration and / or diafiltration. At the end of these steps, the conjugate in aqueous solution is thus obtained.
Anticorps Antibody
L'anticorps (voir à ce propos, Janeway et al. « Immunobiology », 5eme édition, 2001 , Garland Publishing, New York) pourra être choisi parmi ceux décrits notamment dans WO 04043344, WO 08010101 , WO 08047242, WO 05009369 (anti CA6) ou WO 2010014812. L'anticorps peut être éventuellement modifié à l'aide d'un agent de modification afin de favoriser l'attachement du dérivé de cryptophycine (voir ci-dessus). L'anticorps peut être notamment monoclonal, polyclonal ou multispécifique. Il peut s'agir aussi d'un fragment d'anticorps. Il peut s'agir aussi d'un anticorps murin, humain, humanisé ou chimérique. Conjugué The antibody (see in this, Janeway et al. "Immunobiology", 5 th Edition, 2001, Garland Publishing, New York) may be selected from those described in particular in WO 04043344, WO 08010101, WO 08047242, WO 05009369 (anti- CA6) or WO 2010014812. The antibody may be optionally modified with a modifying agent to promote attachment of the derived from cryptophycin (see above). The antibody may be in particular monoclonal, polyclonal or multispecific. It can also be an antibody fragment. It can also be a murine, human, humanized or chimeric antibody. joint
Un conjugué comprend généralement de l'ordre de l'ordre de 1 à 10 dérivés de cryptophycine attachés de façon covalente à l'agent de ciblage (il s'agit du taux de greffage ou "drug-to- antibody ratio" ou "DAR" en Anglais). Ce nombre varie en fonction de la nature de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine ainsi que des conditions opératoires utilisées dans le procédé de conjugaison (par exemple nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine par rapport à l'agent de ciblage, temps de réaction, nature du solvant et de l'éventuel cosolvant). La mise en contact de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine conduit à un mélange comprenant plusieurs conjugués se distinguant individuellement les uns des autres par des DAR différents ; éventuellement l'agent de ciblage n'ayant pas réagi ; éventuellement des agrégats. Le DAR qui est déterminé sur la solution finale correspond donc à un DAR moyen.  A conjugate generally comprises of the order of 1 to 10 cryptophycin derivatives covalently attached to the targeting agent (this is the level of grafting or "drug-to-antibody ratio" or "DAR" " in English). This number varies according to the nature of the targeting agent and the cryptophycin derivative as well as the operating conditions used in the conjugation method (for example number of equivalents of cryptophycin derivative relative to the targeting agent, reaction time, nature of the solvent and the optional cosolvent). Contacting the targeting agent with the cryptophycin derivative results in a mixture comprising a plurality of conjugates individually distinguishable from each other by different DARs; optionally the unreacted targeting agent; possibly aggregates. The DAR that is determined on the final solution therefore corresponds to an average DAR.
Dans le cas où l'agent de ciblage est un anticorps, la spectroscopie UV peut être une méthode utilisée pour déterminer le DAR. Cette méthode s'inspire de celle présentée dans Antony S.In the case where the targeting agent is an antibody, UV spectroscopy may be a method used to determine the DAR. This method is inspired by that presented in Antony S.
Dimitrov (ed), LLC, 2009, « Therapeutic Antibodies and Protocols », vol. 525, 445, Springer Science. Elle consiste à mesurer l'absorbance d'une solution de conjugué après l'étape de séparation (ii) à deux longueurs d'onde notées λ1 et λ2. On utilise les coefficients d'extinction molaires suivants de l'anticorps nu et du dérivé de cryptophycine mesurés préalablement à la conjugaison. Dimitrov (ed), LLC, 2009, "Therapeutic Antibodies and Protocols," Vol. 525, 445, Springer Science. It consists in measuring the absorbance of a conjugate solution after the separation step (ii) at two wavelengths denoted λ1 and λ2. The following molar extinction coefficients of the naked antibody and the cryptophycin derivative measured prior to conjugation are used.
Les absorbances de la solution de conjugué à λ1 et λ2 (Aλ1) et (Aλ2) sont mesurées soit sur le pic correspondant du spectre SEC (ceci permet de calculer un "DAR(SEC)") ou en utilisant un spectrophotomètre UV classique (ceci permet de calculer un "DAR(UV)"). Les absorbances peuvent être exprimées sous la forme : The absorbances of the conjugate solution at λ1 and λ2 (A λ1 ) and (A λ2 ) are measured either on the corresponding peak of the SEC spectrum (this makes it possible to calculate a "DAR (SEC)") or by using a conventional UV spectrophotometer (this makes it possible to calculate a "DAR (UV)"). Absorbances can be expressed as:
Aλ1 = (CD x εD λ1) + (cA x εA λi) A λ1 = (CD x ε D λ1 ) + (c A x ε A λ i)
Aλ2 = (cD X εD λ2) + (cA X εA λ2) A λ2 = (c D X ε D λ2 ) + (c A X ε A λ2 )
équations pour lesquelles : equations for which:
• CD et CA désignent respectivement les concentrations dans la solution de la partie du conjugué relative au dérivé de cryptophycine et la partie du conjugué relative à l'anticorps ;  • CD and CA respectively denote the concentrations in the solution of the part of the conjugate relating to the cryptophycin derivative and the part of the conjugate relating to the antibody;
• εD λi et εD λ2 désignent respectivement les coefficients d'absorption molaires du dérivé de cryptophycine avant conjugaison aux deux longueurs d'onde λ1 et λ2, coefficients mesurés sur les composés de formule (II) de type SZa avec Za=-SMe ou de type -C(=O)- ZbRb avec ZbRb= OMe ou OCH2-CH=CH2 ; • εA λi et εA %2 désignent respectivement les coefficients d'absorption molaires de l'anticorps nu aux deux longueurs d'onde λ1 et λ2. • ε D λ i and ε D λ2 respectively denote the molar absorption coefficients of the cryptophycin derivative before conjugation at the two wavelengths λ1 and λ2, coefficients measured on the compounds of formula (II) of type SZ a with Z a = -SMe or of type -C (= O) - Z b R b with Z b R b = OMe or OCH 2 -CH = CH 2 ; • ε A λ i and ε A% 2 respectively denote the molar absorption coefficients of the naked antibody at the two wavelengths λ1 and λ2.
On entend par anticorps nu, l'anticorps auquel n'est attaché aucun dérivé de cryptophycine, c'est-à-dire l'anticorps avant l'étape de conjugaison. The term "naked antibody" is intended to mean the antibody to which no cryptophycin derivative is attached, that is to say the antibody before the conjugation step.
La résolution de ces deux équations conduit à : Solving these two equations leads to:
CD = [(εA λi x Aλ2) - (εA χ2 x Aλ1 )] / [(εD λ2 x εA λ1 ) - (εA λ2 x εD λ1 )] CD = [(ε A λ ix A λ 2 ) - (ε A χ 2 x A λ 1 )] / [(ε D λ 2 x ε A λ 1 ) - (ε A λ 2 x ε D λ 1 )]
cA = [Aλi - (cD x εD λ1)] / εA λ1 c A = [A λ i - (c D x ε D λ 1 )] / ε A λ 1
Le DAR moyen correspond alors à cD / cA. Dans le cas des dérivés de cryptophycine, on peut considérer la longueur d'onde λ1= 280 nm et selon la nature du dérivé de cryptophycine, λ2 est choisie dans la gamme de longueurs d'onde spécifiques 246 nm - 252 nm. Le DAR(UV) est de préférence supérieur à 0,5, plus particulièrement compris entre 1 et 10, encore plus particulièrement entre 2 et 7. The average DAR then corresponds to c D / c A. In the case of cryptophycin derivatives, we can consider the wavelength λ1 = 280 nm and according to the nature of the cryptophycin derivative, λ2 is chosen in the specific wavelength range 246 nm - 252 nm. The DAR (UV) is preferably greater than 0.5, more particularly between 1 and 10, even more particularly between 2 and 7.
Le conjugué peut être utilisé en tant qu'anticancéreux. De par la présence de l'agent de ciblage, le conjugué est rendu très sélectif vis-à-vis des cellules tumorales plutôt que des cellules saines.The conjugate can be used as an anti-cancer agent. Because of the presence of the targeting agent, the conjugate is made very selective for tumor cells rather than healthy cells.
Ceci permet de diriger le dérivé de cryptophycine dans un environnement proche de celles-ci ou directement à l'intérieur de celles-ci (à ce propos, voir les publications suivantes qui décrivent l'utilisation de conjugués d'anticorps monoclonaux dans le traitement de cancers : « Antibody- drug conjugates for cancer therapy » Carter PJ. , et al., Cancer J. 2008, 14, 154-169 ;This makes it possible to direct the cryptophycin derivative in an environment close to or directly within them (in this regard, see the following publications which describe the use of monoclonal antibody conjugates in the treatment of cancers: "Antibody-drug conjugates for cancer therapy" Carter PJ, et al., Cancer J. 2008, 14, 154-169;
« Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs » Chari R., Ace. Chem. Res."Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs" Chari R., Ace. Chem. Res.
2008, 41, 98-107). Il est possible de traiter des cancers solides ou liquides. Le conjugué peut être utilisé seul ou en combinaison avec au moins un autre anticancéreux. 2008, 41, 98-107). It is possible to treat solid or liquid cancers. The conjugate can be used alone or in combination with at least one other anticancer drug.
Le conjugué est formulé sous forme d'une solution aqueuse tamponnée à une concentration généralement comprise entre 1 et 10 mg/ml. Cette solution peut être injectée sous forme de perfusion telle qu'elle ou bien être rediluée pour former une solution de perfusion. The conjugate is formulated in the form of an aqueous buffered solution at a concentration generally of between 1 and 10 mg / ml. This solution can be injected as an infusion such that it can be rediluted to form an infusion solution.
[Exemples] [Examples]
Méthodes analytiques utilisées  Analytical methods used
Chromatographie liquide haute pression - Spectrométrie de masse (LCMS)  High Pressure Liquid Chromatography - Mass Spectrometry (LCMS)
Méthode A1  Method A1
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne XBridge C-is 2,5 μm (3x50 mm) à 70°C avec un débit de 0,9 ml/min, un gradient d'élution (7 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 100% B en 5,3 min ; 5,5 min : 100% B ; 6,3 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Méthode A2 The analysis is carried out on a Waters ZQ apparatus and an XBridge C-is 2.5 μm (3x50 mm) column at 70 ° C. with a flow rate of 0.9 ml / min, an elution gradient (7 min) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 5% to 100% B in 5.3 min, 5.5 min: 100% B; , 3 min: 5% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode. Method A2
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne Acquity BEH Ci8 1 ,7 μm (2,1 x50 mm) à 50°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 50% B en 0,8 min ; 1 ,2 min : 100% B ; 1 ,85 min : 100% B ; 1 ,95 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. The analysis is carried out on a Waters UPLC-SQD apparatus and an Acquity BEH Ci 8 1, 7 μm (2.1 × 50 mm) column at 50 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (2 min) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: from 5% to 50% B in 0.8 min; 1 min: 100% B, 1.85 min: 100% B, 1.95 min: 5% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
Méthode A3 Method A3
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne Acquity BEH Ciβ 1 ,7 μm (2,1 x50 mm) à 70°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2 min) de (A) eau / 0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile / 0,1 % acide formique (gradient : de 5% à 50% B en 1 min ; 1 ,3 min : 100% B ; 1 ,45 min : 100% B ; 1 ,75 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. The analysis is carried out on a Waters UPLC-SQD apparatus and an Acquity BEH Ciβ 1, 7 μm (2.1 × 50 mm) column at 70 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (2 min ) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 5% to 50% B in 1 min; 1, 3 min: 100% B; 1) , 45 min: 100% B, 1.75 min: 5% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
Méthode A4 A4 method
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne Phenomenex Kinetex Ciβ 100A 2,6 μm (3χ50mm) à 45°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (6 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : 6% B : 0,8 min ; de 6% à 100% B en 4,1 min ; 4,8 min : 100% B ; 5,0-6,0 min : 6% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. The analysis is carried out on a Waters ZQ apparatus and a Phenomenex Kinetex Ciβ 100A 2.6 μm column (3 χ 50mm) at 45 ° C. with a flow rate of 1 ml / min, an elution gradient (6 min) of A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 6% B: 0.8 min, 6% to 100% B in 4.1 min; 8 min: 100% B, 5.0-6.0 min: 6% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode.
Méthode A5 Method A5
L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne Phenomenex Kinetex Ciβ 2,6 μm (3χ1000mm) à 50°C avec un débit de 0,8 ml/min, un gradient d'élution (8 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1 % acide formique (gradient : 4% B : 0,15 min ; de 4% à 100% B en 6,85 min ; 7,1 min : 100% B ; 7,4-8,2 min : 4% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Spectrométrie de masse (MS) The analysis is carried out on a Waters ZQ apparatus and a Phenomenex Kinetex Ciβ 2.6 μm column (3 χ 1000mm) at 50 ° C. with a flow rate of 0.8 ml / min, an elution gradient (8 min) of (A) water / 0.1% formic acid and (B) acetonitrile / 0.1% formic acid (gradient: 4% B: 0.15 min; 4% to 100% B in 6.85 min; , 1 min: 100% B, 7.4-8.2 min: 4% B) and electrospray ionization in positive and / or negative mode. Mass spectrometry (MS)
Les spectres ont été réalisés par introduction directe sur un appareil WATERS GCTof (introduction directe sans LC).  The spectra were carried out by direct introduction on a WATERS GCTof apparatus (direct introduction without LC).
Chromatographie d'exclusion stérique - Spectrométrie de masse haute résolution (SEC-HRMS) L'analyse peut nécessiter une étape préalable de déglycosylation du conjugué. Celle-ci est réalisée en ajoutant à la solution de conjugué 2% en volume d'une solution d'enzyme PNGase F (préparée en complétant à 100 ml un flacon de 100 unités de lyophilisât d'enzyme N-glycanase avec de l'eau milliQ). La solution est homogénéisée à l'aide du vortex et incubée à 37°C pendant 19 h. L'échantillon dégly∞sylé est prêt à être analysé par SEC-HRMS. L'analyse chromatographique est réalisée sur un appareil Agilent HP1100 et une colonne Waters Biosuite 250 HR SEC 4 μm (4,6x300 mm) à 30°C avec un débit de 0,4 ml/min et une élution isocratique de (A) formiate d'ammonium 25 mM pH=7 / (B) acétonitrile 70/30 de 15 min. La spectrométrie de masse est réalisée sur un appareil Waters QTOF II avec une ionisation électrospray en mode positif. Les spectres de masse sont déconvolués avec le logiciel Waters MaxEnti . Size Exclusion Chromatography - High Resolution Mass Spectrometry (SEC-HRMS) The assay may require a prior step of deglycosylation of the conjugate. This is carried out by adding to the conjugate solution 2% by volume of a PNGase F enzyme solution (prepared by supplementing to 100 ml a vial of 100 units of N-glycanase enzyme lyophilisate with water. milliQ). The solution is homogenized using the vortex and incubated at 37 ° C. 19 h. The degly∞sylated sample is ready to be analyzed by SEC-HRMS. Chromatographic analysis is performed on an Agilent HP1100 and a Waters Biosuite 250 HR SEC 4 μm (4.6x300 mm) column at 30 ° C with a flow rate of 0.4 ml / min and isocratic elution of (A) formate ammonium 25mM pH = 7 / (B) acetonitrile 70/30 15 min. Mass spectrometry is carried out on a Waters QTOF II device with electrospray ionization in positive mode. Mass spectra are deconvolved with the Waters MaxEnti software.
Chromatographie d'exclusion stérique (SEC HPLC) Size Exclusion Chromatography (SEC HPLC)
L'analyse est réalisée sur un appareil Merck Lachrom Elite HPLC avec un détecteur spectrophotométrique L2455 DAD et une colonne Tosoh Bioscience TSKgel G3000 SWXL 5μm (7,8x300 mm) avec un débit de 0,5 ml/min et une élution isocratique de 30 min avec un tampon pH=7 contenant 0,2 M de KCI, 0,052 M de KH2PO4, 0,107 M de K2HPO4 et 20% en volume d'isopropanol. Résonance magnétique nucléaire 1H (RMN) The analysis is carried out on a Merck Lachrom Elite HPLC apparatus with a spectrophotometric detector L2455 DAD and a Tosoh Bioscience column TSKgel G3000 SWXL 5μm (7.8x300 mm) with a flow rate of 0.5 ml / min and an isocratic elution of 30 min. with a pH = 7 buffer containing 0.2 M KCl, 0.052 M KH 2 PO 4 , 0.107 M K 2 HPO 4 and 20% by volume of isopropanol. 1 H Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Les spectres RMN 1H ont été réalisés sur un spectromètre Bruker Avance soit DRX-300, DRX- 400, DRX-500 ou DMX-600. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm. The 1 H NMR spectra were carried out on a Bruker Avance spectrometer, either DRX-300, DRX-400, DRX-500 or DMX-600. The chemical shifts are given in ppm.
Méthode générale utilisée pour préparer les conjugués dans le cas des dérivés de crvptophvcine comprenant un linker L terminé par -SZ3 General method used to prepare the conjugates in the case of derivatives comprising a linker L crvptophvcine terminated -SZ 3
Méthode en deux étapes successives Two-step method
1èrθ étape 1 st stage
L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin d'introduire à sa surface des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H1 1 dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl (désigné par tampon A) est traitée par 5 à 10 éq. de l'ester activé NHS en solution dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit comprise entre 5 et 10 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La réaction est poursuivie pendant 2 h à TA. Le mélange est déposé sur une colonne de filtration sur gel (matrice Sephadex™ G25, GE Healthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de HEPES, 0,05 M de NaCl et 2 mM d'EDTA. L'anticorps modifié est élue avec le tampon HEPES pH=8, collecté puis dosé par spectrométrie UV afin de déterminer la concentration en anticorps de l'échantillon ainsi que le nombre de groupements pyridyldisulfures. Un prélèvement de l'anticorps modifié est traité avec le dithiothréitol afin de réduire la liaison disulfure, la pyridine-2-thione libérée est dosée par spectrométrie (coefficients d'extinction : ε343 nm : 8080 M-1cm-1, ε28o nm : 5100 M-1crτï1 pour la pyridine-2-thione, et ε28o nm : 208380 M-1cm-1 pour l'anticorps). En moyenne, de 3 à 6 groupements pyridyldisulfures sont greffés par molécule d'anticorps. The antibody is first modified with an NHS-activated ester, in order to introduce on its surface pyridyldisulphide groups. A solution of hu2H1 1 antibody in aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.05 M potassium phosphate and 0.05 M NaCl (designated buffer A) is treated with 5 to 10 eq. NHS activated ester dissolved in DMA such that the final concentration of antibody is between 5 and 10 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 5%. The reaction is continued for 2 h at RT. The mixture is deposited on a gel filtration column (Sephadex ™ G25 matrix, GE Healthcare) previously equilibrated in an aqueous buffer pH = 8 containing 0.05 M HEPES, 0.05 M NaCl and 2 mM EDTA. . The modified antibody is eluted with the HEPES buffer pH = 8, collected and then assayed by UV spectrometry in order to determine the antibody concentration of the sample as well as the number of pyridyldisulphide groups. A sample of the modified antibody is treated with dithiothreitol in order to reduce the disulfide bond, the pyridine-2-thione released is assayed by spectrometry (extinction coefficients: ε 343 nm : 8080 M -1 cm -1 , ε 28 o nm: 5100 M -1 crτï 1 pyridine-2-thione, and ε o 28 nm: 208,380 M -1 cm -1 for the antibody). On average, from 3 to 6 pyridyldisulphide groups are grafted per molecule of antibody.
2èmθ étape La solution d'anticorps modifié de la 1ere étape est diluée dans le tampon aqueux pH=8 décrit ci- dessus puis traitée par une solution du dérivé de cryptophycine (5 éq.) de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20% ; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est exprimé par rapport au nombre de molécules de pyridyldisulfures introduites lors de la première étape. La réaction est poursuivie pendant la nuit à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage du dérivé de cryptophycine sur l'anticorps. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice Sephadex™ G25 (colonnes Nap-5, - 10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le nombre moyen de cytotoxique par anticorps. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué. 2 èmθ step The modified antibody solution of the 1 st step is diluted in aqueous buffer pH = 8 described above and then treated with a solution of cryptophycin derivative (5 eq.) Such that the final concentration of antibody is from 3 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 20%; the number of equivalents of cryptophycin derivative is expressed relative to the number of pyridyldisulphide molecules introduced during the first step. The reaction is continued overnight at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm. The mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the degree of grafting of the cryptophycin derivative to the antibody. If the degree of substitution is insufficient, the mixture is treated with 1 to 5 eq. additional cryptophycin derivative (s) in the DMA for 3 h at 30 ° C or with agitation of about 2000 rpm. The mixture is filtered on a Millex® -SV 5 μm filter (PVDF membrane, Durapore, Millipore) and then purified by gel filtration using a Superdex 200 μg matrix (HiLoad 16/60 desalting column, GEHealthcare) previously equilibrated in an aqueous buffer. pH = 6.5 containing 0.01 M phosphate, 0.14 M NaCl and 10% to 20% NMP. The fractions containing the conjugated antibody in monomeric form are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml. A buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer. The conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a Sephadex ™ G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare columns) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pHs adapted to each conjugate. The final conjugate is determined by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the average number of cytotoxic antibodies. The substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
Méthode en deux étapes « one-pot » Two-step one-pot method
L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin d'introduire à sa surface des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H1 1 dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl est diluée avec le tampon phosphate pH=6,5 et une solution aq. d'HEPES 1 N de telle sorte que la proportion finale de tampon phosphate initial pH=6,5 et d'HEPES soit de 96/4 afin d'obtenir un pH≈7,5-8. Cette solution d'anticorps est traitée par 5 à 10 éq. de l'ester activé NHS en solution dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit comprise entre 5 et 10 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La réaction est poursuivie pendant 2 h à TA. La solution d'anticorps ainsi modifié est directement diluée avec un mélange 96/4 de tampon phosphate pH=6,5 et d'HEPES puis traitée par une solution du dérivé de cryptophycine (4 éq.) dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20% ; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est exprimé par rapport au nombre d'équivalents d'ester activé NHS introduits lors de la première étape. La réaction est poursuivie pendant la nuit à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage du dérivé de cryptophycine sur l'anticorps. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice Sephadex™ G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le nombre moyen de cytotoxique par anticorps. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué. The antibody is first modified with an NHS-activated ester, in order to introduce on its surface pyridyldisulphide groups. A solution of hu2H1 1 antibody in aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.05 M potassium phosphate and 0.05 M NaCl is diluted with phosphate buffer pH = 6.5 and aq solution. of HEPES 1 N such that the final proportion of initial phosphate buffer pH = 6.5 and HEPES is 96/4 in order to obtain a pH≈7.5-8. This antibody solution is treated with 5 to 10 eq. NHS activated ester dissolved in DMA such that the final concentration of antibody is between 5 and 10 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 5%. The reaction is continued for 2 h at RT. The antibody solution thus modified is directly diluted with a 96/4 mixture of phosphate buffer pH = 6.5 and HEPES and then treated with a solution of the cryptophycin derivative (4 eq.) In the DMA so that the final antibody concentration of 3 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 20%; the number of equivalents of derivative of cryptophycin is expressed relative to the number of equivalents of activated NHS ester introduced in the first step. The reaction is continued overnight at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm. The mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the degree of grafting of the cryptophycin derivative to the antibody. If the degree of substitution is insufficient, the mixture is treated with 1 to 5 eq. additional cryptophycin derivative (s) in the DMA for 3 h at 30 ° C or with agitation of about 2000 rpm. The mixture is filtered on a Millex® -SV 5 μm filter (PVDF membrane, Durapore, Millipore) and then purified by gel filtration using a Superdex 200 μg matrix (HiLoad 16/60 desalting column, GEHealthcare) previously equilibrated in an aqueous buffer. pH = 6.5 containing 0.01 M phosphate, 0.14 M NaCl and 10% to 20% NMP. The fractions containing the conjugated antibody in monomeric form are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml. A buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer. The conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a Sephadex ™ G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10, Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare columns) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pHs adapted to each conjugate. The final conjugate is determined by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the average number of cytotoxic antibodies. The substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
Méthode générale utilisée pour préparer les conjugués dans le cas de dérivés de crvptophvcine comprenant un linker terminé par -C(=O)ZhRh General method used to prepare the conjugates in the case of crvptophvcine derivatives comprising a linker terminated by -C (= O) R h Z h
Une solution d'anticorps hu2H11 dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de HEPES, 0,05 M de NaCl et 2 mM d'EDTA ou étant composé d'un mélange 96/4 d'un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl / HEPES 1 N est traitée avec un excès d'une solution dans le DMA du dérivé de cryptophycine de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20%. La réaction est poursuivie pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est analysé par SEC HPLC afin de déterminer le taux de greffage de cytotoxique sur la population d'anticorps monomériques. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec 1 à 5 éq. supplémentaire(s) de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h à 30°C ou sous une agitation d'environ 2000 rpm. Le mélange est filtré sur filtre Millex©-SV 5 μm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice SephadexTM G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10 ou colonne Hiprep 26/10 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le taux de greffage. Le taux de substitution peut également être calculé à partir de la déconvolution du spectre SEC-HRMS du conjugué. A solution of hu2H11 antibody in an aqueous buffer pH = 8 containing 0.05 M HEPES, 0.05 M NaCl and 2 mM EDTA or consisting of a 96/4 mixture of an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.05 M potassium phosphate and 0.05 M NaCl / 1 N HEPES is treated with an excess of a solution in the DMA of the cryptophycin derivative such that the final concentration of antibodies is 3 mg / ml and the percentage of DMA in the aqueous buffer of 20%. The reaction is continued for 3 h at 30 ° C or with stirring of about 2000 rpm. The mixture is analyzed by SEC HPLC to determine the level of cytotoxic grafting on the monomeric antibody population. If the degree of substitution is insufficient, the mixture is treated with 1 to 5 eq. additional cryptophycin derivative (s) in the DMA for 3 h at 30 ° C or with agitation of about 2000 rpm. The mixture is filtered on a Millex® -SV 5 μm filter (PVDF membrane, Durapore, Millipore) and then purified by gel filtration using a Superdex 200 μg matrix (HiLoad 16/60 desalting column, GEHealthcare) previously equilibrated in an aqueous buffer. pH = 6.5 containing 0.01 M phosphate, 0.14 M NaCl and 10% to 20% NMP. Fractions containing conjugated antibody in form monomeric are collected, pooled and concentrated on Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k or 50k membrane, Millipore) to a concentration of between 2 and 5 mg / ml. A buffer change is finally made to remove the organic solvent from the conjugate conservation buffer. The conjugate is deposited on a gel filtration column composed of a SephadexTM G25 matrix (Nap-5, -10, PD-10 or Hiprep 26/10 desalting columns, GEHealthcare column) previously equilibrated with an aqueous buffer of composition and pH adapted to each conjugate. The final conjugate is assayed by UV spectrometry using the extinction coefficients determined for the antibody and the corresponding cryptophycin derivative in order to measure the antibody concentration and the degree of grafting. The substitution rate can also be calculated from the deconvolution of the SEC-HRMS spectrum of the conjugate.
Les méthodes décrites pour le cas de l'anticorps hu2H11 pourraient s'appliquer aussi de façon semblable à d'autres anticorps, ainsi qu'à d'autres agents de ciblage. The methods described for the case of the hu2H11 antibody could also be applied in a similar way to other antibodies as well as to other targeting agents.
Exemple 1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone Example 1: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4- [4- (4-Mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Composé 2 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-16-{(S)-1-[(R)-3-(4-chloro- méthyl-phényO-oxiranylj-éthylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS- ène-2,5,9,12-tétraone Compound 2: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -16 - {(S) -1 - [(R) -3- (4-chloro)} methyl-phenyl-oxiranyl] ethyl-S-isobutyl-δ-dimethyl-1H-dioxa-δH-diaza-cyclohexadec-IS-ene-2,5,9,12-tetraone
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Le composé 1 (30 mg ; 42,9 μmol, préparé selon Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DMF anhydre (2 ml) et le mélange est refroidi à 0°C avant ajout de la TEA (107 μmol) puis du CMS (64,6 μmol). Après 15 min, le bain est retiré et l'agitation est poursuivie 12 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (2 ml) et la phase organique est lavée par de l'eau (2x1 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (1 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (1 ml). La phase organique est séchée sur MgSO4 et, après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit 2 est obtenu sous forme d'une huile incolore qui cristallise (25 mg ; 81 %). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,77 - 0,83 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,04 - 1 ,07 (m, 3 H) ; 1 ,14 (s, 3 H) ; 1 ,29 - 1 ,36 (m, 1 H) ; 1 ,54 - 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,80 - 1 ,87 (m, 1 H) ; 2,24 - 2,33 (m, 1 H) ; 2,63 - 2,73 (m, 2 H) ; 2,96 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,28 - 3,32 (m, 1 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,93 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=11 ,3, 8,0, 3,6 Hz, 1 H) ; 4,78 (s, 2 H) ; 4,93 (dd, J=9,6, 3,6 Hz, 1 H) ; 5,13 (dd, J=10,8, 5,1 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,8 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=15,0, 11 ,2, 3,7 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8.5, 1 ,9 Hz, 1 H) ; 7.23 (d, J=9,6 Hz, 1 H) ; 7,29 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,47 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 713 [M + H]+ ; m/z = 715 [M - H]" ; tR = 5, 17 min. Compound 1 (30 mg, 42.9 μmol, prepared according to Al-awar RS, et al., J. Med., Chem., 2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous DMF (2 ml) and the mixture is cooled to 0 ° C. before adding TEA (107 μmol) and then CMS (64.6 μmol). After 15 min, the bath is removed and stirring is continued for 12 h at RT. The mixture is diluted by adding AcOEt (2 ml) and the organic phase is washed with water (2x1 ml), with aq solution. saturated NaHCO 3 (1 ml) and aq. saturated with NaCl (1 ml). The organic phase is dried over MgSO 4 and, after filtration and evaporation of the solvents under RP, the product 2 is obtained in the form of a colorless oil which crystallizes (25 mg, 81%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.77-0.83 (m, 6H); 1, 02 (s, 3H); 1, 04 - 1, 07 (m, 3H); 1, 14 (s, 3H); 1, 29-1.36 (m, 1H); 1, 54-1.63 (m, 2H); 1.80 - 1.87 (m, 1H); 2.24 - 2.33 (m, 1H); 2.63 - 2.73 (m, 2H); 2.96 - 3.06 (m, 3H); 3.28 - 3.32 (m, 1H); 3.83 (s, 3H); 3.93 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.27 (ddd, J = 11, 3.8, 3.6 Hz, 1H); 4.78 (s, 2H); 4.93 (dd, J = 9.6, 3.6 Hz, 1H); 5.13 (dd, J = 10.8, 5.1 Hz, 1H); 5.81 (d, J = 14.8 Hz, 1H); 6.49 (ddd, J = 15.0, 11.2, 3.7 Hz, 1H); 7.07 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.18 (dd, J = 8.5, 1.9 Hz, 1H); 7.23 (d, J = 9.6 Hz, 1H); 7.29 (d, J = 1.9 Hz, 1H); 7.34 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 7.47 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 8.35 (d, J = 8.2 Hz, 1H). LCMS (A1): ES m / z = 713 [M + H] + ; m / z = 715 [M - H] "; t R = 5, 17 min.
Composé 4 : 4-Méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl 4-methyl-4-methyl-4-methyldisulfanyl-pentanoate compound
3 4  3 4
A une solution, purgée à l'argon, du composé 3 (3,05 g, 15,7 mmol, préparé selon WO 2007085930) dans le DCM (30 ml) sont successivement ajoutés le NHS (17,3 mmol) et le chlorure d'EDCI (17,3 mmol). Le mélange est agité 3 h à TA avant d'être lavé avec un tampon phosphate pH=6 (2x30 ml) puis avec une solution saturée de NaCl (30 ml), séché sur MgSO4 et concentré à sec. L'huile ambrée obtenue qui cristallise est lavée par un mélange heptane/AcOEtTo a solution, purged with argon, of compound 3 (3.05 g, 15.7 mmol, prepared according to WO 2007085930) in DCM (30 ml) are successively added NHS (17.3 mmol) and chloride. EDCI (17.3 mmol). The mixture is stirred for 3 h at RT before being washed with a phosphate buffer pH = 6 (2 × 30 ml) and then with a saturated solution of NaCl (30 ml), dried over MgSO 4 and concentrated to dryness. The amber oil obtained which crystallizes is washed with a heptane / AcOEt mixture.
75/25 et filtrée sur un verre fritte pour donner le composé 4 sous la forme d'un solide blanc (2,08 g, 45%). Le filtrat est concentré à sec et le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 50/50 à 0/100. Les fractions contenant le produit attendu sont concentrées à sec et reprises dans de l'éther isopropylique (5 ml) ; le précipité est filtré sur verre fritte pour donner le composé 4 attendu (1 g, 22%). RMN 1H (40075/25 and filtered through a sintered glass to give compound 4 as a white solid (2.08 g, 45%). The filtrate is concentrated to dryness and the crude obtained is purified by chromatography on silica gel, eluting with a 50/50 to 0/100 heptane / AcOEt mixture. The fractions containing the expected product are concentrated to dryness and taken up in isopropyl ether (5 ml); the precipitate is filtered on sintered glass to give the expected compound 4 (1 g, 22%). 1 H NMR (400
MHz, DMSO-d6): 1 ,29 (s, 6 H) ; 1 ,92 à 1 ,98 (m, 2 H) ; 2,41 (s, 3 H) ; 2,72 à 2,78 (m, 2 H) ; 2,81 (s, 4 H). LCMS (A4) : El, m/z = 291 [M + H]+. MHz, DMSO-d6): 1.29 (s, 6H); 1.92 to 1.98 (m, 2H); 2.41 (s, 3H); 2.72 to 2.78 (m, 2H); 2.81 (s, 4H). LCMS (A4): EI, m / z = 291 [M + H] + .
Composé 5 : 4-(4-Méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-piperazine-1-carboxylate de fert-butyle Fert -butyl compound 5: 4- (4-Methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoyl) -piperazine-1-carboxylate
Dans un tube Wheatton sont chargés le composé 4 (200 mg, 686 μmol), la 1-Boc-pipérazine (686 μmol), la TEA (755 μmol) et le DMF (1 ,6 ml). Le mélange est agité à TA pendant la nuit puis dilué avec de TAcOEt (5 ml), lavé avec de l'eau (2x5 ml), séché sur MgSO4 et concentré à sec. Le brut est repris dans de l'éther isopropylique (3 ml) ; le précipité est filtré sur verre fritte pour donner le composé 5 (213 g, 86%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,41 (s, 9 H) ; 1 ,73 à 1 ,87In a Wheatton tube are loaded 4 (200 mg, 686 μmol), 1-Boc-piperazine (686 μmol), TEA (755 μmol) and DMF (1.6 ml). The mixture is stirred at RT overnight and then diluted with TAcOEt (5 mL), washed with water (2 x 5 mL), dried over MgSO 4 and concentrated to dryness. The crude is taken up in isopropyl ether (3 ml); the precipitate is filtered on sintered glass to give compound 5 (213 g, 86%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 1.27 (s, 6H); 1, 41 (s, 9H); 1, 73 to 1, 87
(m, 2 H) ; 2,34 à 2,41 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 3,23 à 3,36 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,39 à 3,45 (m, 4 H). LCMS (A2) : ES m/z = 363 [M + H]+ ; m/z = 307 [M + H - C4H8]" ; tR = 1 ,08 min. (m, 2H); 2.34 to 2.41 (m, 2H); 2.40 (s, 3H); 3.23 to 3.36 (partially masked m, 4H); 3.39 to 3.45 (m, 4H). LCMS (A2) ES m / z = 363 [M + H] + ; m / z = 307 [M + H - C 4 H 8] "; t R = 1, 08 min.
Composé 6 : Chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one Compound 6: 4-methyl-4-methyldisulfanyl-1-piperazin-1-yl-pentan-1-one hydrochloride
A une solution du composé 5 (213 mg, 588 μmol) dans le dioxane (4,4 ml) est ajoutée une solution HCl 4M dans le dioxane (4,4 ml). L'agitation est poursuivie 4 h à TA. Le mélange est filtré sur verre fritte, le solide obtenu est rincé avec du dioxane (2 ml) puis de l'éther isopropylique (2 ml) pour donner le composé 6 (132 mg, 75%) sous la forme d'un solide crème. RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,73 à 1 ,85 (m, 2 H) ; 2,37 à 2,45 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3H) ; 2,98 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,62 à 3,73 (m, 4H) ; 9,39 (m étalé, 2 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 263 [M + H]+ ; tR = 2,40 min. To a solution of compound 5 (213 mg, 588 μmol) in dioxane (4.4 ml) was added 4M HCl in dioxane (4.4 ml). Stirring is continued for 4 h at RT. The mixture is filtered on sintered glass, the solid obtained is rinsed with dioxane (2 ml) and then isopropyl ether (2 ml) to give compound 6 (132 mg, 75%) in the form of a cream solid . 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 1.27 (s, 6H); 1.73-185 (m, 2H); 2.37 to 2.45 (m, 2H); 2.40 (s, 3H); 2.98 to 3.15 (m, 4H); 3.62 to 3.73 (m, 4H); 9.39 (spread m, 2H). LCMS (A1) ES m / z = 263 [M + H] + ; t R = 2.40 min.
Composé 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)-1-Compound 7: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-16 - [(S) -1-
((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone ((2R, 3R) -3- {4- [4- (4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -1,4-dioxa-8 , 11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le composé 1 (20,3 mg ; 29,0 μmol) est placé en solution dans le DMF anhydre (0,77 ml) et la TEA (72,6 μmol) puis le CMS (43,6 μmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2 formé n'est pas isolé et la TEA (58,0 μmol) puis le chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin- 1-yl-pentan-1-one 6 (34,8 μmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant d'être dilué par de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (2 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (2 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 98/2. Un solide blanc, 7, est obtenu (5,7 mg ; 21 %). CCM (DCM 90/MeOH 10): Rf=0,6 ; RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 0,75 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,28 - 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,52 - 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,76 - 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,27 - 2,38 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,64 - 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,05 (m, 2 H) ; 3,24 - 3,34 (m, 6 H) ; 3,44 (br. s., 4 H) ; 3,49 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H) ; 5,08 - 5,15 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,2, 11 ,3, 3,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H) ; 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H) ; 7,25 - 7,34 (m, 5 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H) ; LCMS (A1 ) : ES m/z = 943 [M + H]+ ; m/z = 941 [M - H]" ; tR = 4,03 min. Compound 1 (20.3 mg, 29.0 μmol) is placed in solution in anhydrous DMF (0.77 ml) and the TEA (72.6 μmol) then the CMS (43.6 μmol) are added. After 12 h at RT, the product 2 formed is not isolated and the TEA (58.0 μmol) and then the hydrochloride of 4-methyl-4-methyldisulfanyl-1-piperazin-1-yl-pentan-1-one 6 (34.8 μmol) are added. The mixture is stirred an additional 72 hours at RT before being diluted with TAcOEt (10 ml). The organic phase is washed with water (2 × 2 ml), with aq solution. saturated with NaHCO 3 (2 ml) and with aq solution. saturated with NaCl (2 ml). After drying over MgSO 4 and filtration, the solvents are evaporated under RP. The crude of the reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 99/1 to 98/2 mixture. A white solid, 7, is obtained (5.7 mg, 21%). TLC (DCM 90 / MeOH 10): Rf = 0.6; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 0.75-0.81 (m, 6H); 1, 01 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1, 26 (s, 6H); 1, 28-1.33 (m, 1H); 1, 52-1.61 (m, 2H); 1.76-1.83 (m, 2H); 2.27 - 2.38 (m, 4H); 2.39 (s, 3H); 2.64 - 2.74 (m, 2H); 2.95 - 3.05 (m, 2H); 3.24 - 3.34 (m, 6H); 3.44 (br s, 4H); 3.49 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.88 (d, J = 1.7 Hz, 1H); 4.22 - 4.29 (m, 1H); 4.92 (dd, J = 9.9, 3.5 Hz, 1H); 5.08 - 5.15 (m, 1H); 5.81 (d, J = 14.2 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 15.2, 11.3, 3.5 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H); 7.22 (d, J = 9.3 Hz, 1H); 7.25 - 7.34 (m, 5H); 8.34 (d, J = 8.1 Hz, 1H); LCMS (A1): ES m / z = 943 [M + H] +; m / z = 941 [M - H] "; t R = 4.03 min.
Exemple 1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)-1- ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]- 1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone Example 1: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-16 - [(S) -1- ( 2R, 3R) -3- {4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] - 1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le produit 7 (9,6 mg ; 10,2 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (1 ,2 ml) / eau (1 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (25,4 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 5 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (1 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit final, Ex1 , est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,5 mg ; 71 %). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,56 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,27 - 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,56 - 1 ,64 (m, 2 H) ; 1 ,73 - 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,26 - 2,33 (m, 3 H) ; 2,36 - 2,45 (m, 4 H) ; 2,63 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 - 3,36 (m, 1 H) ; 3,42 - 3,51 (m, 6 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,0, 11 ,4, 3,4 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8,3, 1 ,5 Hz, 1 H) ; 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 - 7,36 (m, 5 H) ; 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; LCMS (A2) : ES m/z = 897 [M + H]+ ; m/z = 895 [M - H]" ; tR = 0,97 min. Product 7 (9.6 mg, 10.2 μmol) is placed in solution in ethanol (1.2 ml) / water (1 ml) and the mixture is cloudy. The TCEP (25.4 μmol) is then added and the mixture is stirred for 5 h at RT. The mixture is diluted by adding AcOEt and the organic phase is washed with a 1/1 mixture of water and an aq solution. saturated with NH 4 Cl (1 ml). After drying the organic phase over MgSO 4 , filtration and evaporation of the solvents under RP, the final product, Ex1, is obtained in the form of a white solid (6.5 mg, 71%). TLC (DCM 90 / MeOH 10): Rf = 0.56; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.76-0.81 (m, 6H); 1, 01 (s, 3H); 1, 06 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 13 (s, 3H); 1, 24 (s, 6H); 1, 27-1.31 (m, 1H); 1.56-1.64 (m, 2H); 1.73 - 1.85 (m, 3H); 2.26 - 2.33 (m, 3H); 2.36 - 2.45 (m, 4H); 2.63 - 2.75 (m, 2H); 2.95 - 3.06 (m, 3H); 3.34 - 3.36 (m, 1H); 3.42 - 3.51 (m, 6H); 3.82 (s, 3H); 3.89 (s, 1H); 4.22 - 4.29 (m, 1H); 4.92 (dd, J = 9.8, 3.4 Hz, 1H); 5.12 (dd, J = 10.8, 4.9 Hz, 1H); 5.81 (d, J = 15.2 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 15.0, 11.4, 3.4 Hz, 1H); 7.06 (d, J = 8.3 Hz, 1H); 7.18 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H); 7.24 (d, J = 9.8 Hz, 1H); 7.26 - 7.36 (m, 5H); 8.37 (d, J = 7.8 Hz, 1H); LCMS (A2): ES m / z = 897 [M + H] + ; m / z = 895 [M - H] "; t R = 0.97 min.
Exemple 2 : (E)-(3S,6R,1 OR, 16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 - ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-6-méthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone Example 2: (E) - (3S, 6R, 1 OR, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) 3- {4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6-methyl-1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Composé 9 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-16-{(S)-1-[(R)-3-(4-chloro- méthyl-phényO-oxiranyll-éthylJ-S-isobutyl-δ-méthyl-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-ène- 2,5,9, 12-tétraone Compound 9: (E) - (3S, 6R, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -16 - {(S) -1 - [(R) -3- (4- chloromethyl-phenyl-oxiranyl-ethyl-S-isobutyl-δ-methyl-1-dioxa-δ-H-diaza-cyclohexadec-IS-ene-2,5,9,12-tetraone
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Le composé 8 (49 mg ; 71 ,4 μmol, qui peut être préparé selon Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem. Compound 8 (49 mg, 71.4 μmol, which can be prepared according to Al-awar R. S., et al., J.Med.Chem.
2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (5 ml) et le mélange est refroidi à 0°C avant ajout de la DIPEA (428 μmol) puis du CMS (214 μmol). Le mélange est laissé revenir à TA et l'agitation est poursuivie 40 h à TA. Le mélange est hydrolyse avec 5 ml d'eau, la phase aq. extraite par du DCM (3*5 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aq. saturée de NaHCOs (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/MeOH 100/0 à 90/10. Le composé 9 est obtenu sous forme d'un solide blanc (37 mg ; 79%). RMN 1H (500 MHz, DMSO- d6): 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,80 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,54 (m, 1 H) ; 1 ,60 (m, 1 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,78 (m, 3 H) ; 2,97 à 3,05 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,41 (m, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,92 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,8 et 8,2 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,77 (s, 2 H) ; 4,88 (dd, J=3,8 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,5 et 5,3 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,7 et 9,1 Hz, 1 H) ; 7,29 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,45 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 703 [M + H]+ ; m/z = 701 [M - H]" ; m/z = 747 [M - H + HCO2H]" pic de base ; tR = 1 ,17 min. Composé 10 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6-méthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone 2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous DCM (5 ml) and the mixture is cooled to 0 ° C. before adding DIPEA (428 μmol) and then CMS (214 μmol). The mixture is allowed to return to RT and stirring is continued for 40 h at RT. The mixture is hydrolyzed with 5 ml of water, the aq phase. extracted with DCM (3 * 5 ml). The organic phases are collected, washed with solution aq. saturated with NaHCO 3 (10 ml) and with aq solution. saturated with NaCl (10 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and evaporation of the solvents under PR, the crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / MeOH mixture 100/0 to 90/10. Compound 9 is obtained as a white solid (37 mg, 79%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.78 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 0.80 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 1, 01 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1.30 (m, 1H); 1.54 (m, 1H); 1.60 (m, 1H); 1.82 (m, 1H); 2.27 (m, 1H); 2.60 to 2.78 (m, 3H); 2.97 to 3.05 (m, 2H); 3.15 (m, 1H); 3.41 (m, 1H); 3.81 (s, 3H); 3.92 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.26 (ddd, J = 3.8 and 8.2 and 11.5 Hz, 1H); 4.77 (s, 2H); 4.88 (dd, J = 3.8 and 9.6 Hz, 1H); 5.12 (ddd, J = 1.5 and 5.3 and 11.2 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 1.5 and 15.0 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.7 and 11, 2 and 15.0 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.23 (dd, J = 2.7 and 9.1 Hz, 1H); 7.29 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 7.32 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 7.45 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 8.34 (d, J = 8.2 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 703 [M + H] + ; m / z = 701 [M - H] ', m / z = 747 [M - H + HCO 2 H] "base peak; t R = 1, 17 min. Compound 10: (E) - (3S, 6R, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6-methyl-16 - [(S) - 1 - (( 2R, 3R) -3- {4- [4- (4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -1,4-dioxa-8,11 diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le composé 9 (36,6 mg ; 52 μmol) est placé en solution dans l'acétonitrile anhydre (3 ml) puis sont successivement ajoutés la DIPEA (260 μmol) et le composé 6 (156 μmol). Le milieu réactionnel est agité 20 h à TA puis hydrolyse par addition de 4 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec de TAcOEt (3*4 ml), les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution aq. saturée de NaHCO3 (5 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (5 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 10 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (39 mg ; 80%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,80 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,53 (m, 1 H) ; 1 ,60 (m, 1 H) ; 1 ,75 à 1 ,84 (m, 3 H) ; 2,26 à 2,37 (m, 7 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,61 à 2,77 (m, 3 H) ; 2,96 à 3,05 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,44 (m, 4 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=4,0 et 8,1 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,88 (dd, J=3,8 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,6 et 5,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,6 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 1 1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,6 et 9,2 Hz, 1 H) ; 7,27 (d, J=8,4 Hz, 2 H) ; 7,29 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,4 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 929 [M + H]+ ; m/z = 927 [M - H]" ; m/z = 973 [M - H + HCO2H]- pic de base ; tR = 0,99 min. Exemple 2 : (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6-méthyl-16-[(S)-1-Compound 9 (36.6 mg, 52 μmol) is placed in solution in anhydrous acetonitrile (3 ml) and then DIPEA (260 μmol) and compound 6 (156 μmol) are successively added. The reaction medium is stirred for 20 h at RT and then hydrolyzed by addition of 4 ml of water. The phase aq. is extracted with TAcOEt (3 * 4 ml), the organic phases are combined, washed with an aq solution. saturated with NaHCO 3 (5 ml) and with aq solution. saturated with NaCl (5 ml). After drying over MgSO 4 and filtration, the solvents are evaporated under RP. The crude of the reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 100/0 to 95/5. Compound 10 is obtained as a white solid (39 mg, 80%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-de): 0.78 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 0.80 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 1, 01 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 26 (s, 6H); 1.30 (m, 1H); 1.53 (m, 1H); 1.60 (m, 1H); 1.75 to 1.84 (m, 3H); 2.26 to 2.37 (m, 7H); 2.39 (s, 3H); 2.61 to 2.77 (m, 3H); 2.96 to 3.05 (m, 2H); 3.15 (m, 1H); 3.38 (partially masked m, 1H); 3.44 (m, 4H); 3.48 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.88 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.27 (ddd, J = 4.0 and 8.1 and 11.5 Hz, 1H); 4.88 (dd, J = 3.8 and 9.6 Hz, 1H); 5.12 (ddd, J = 1, 6 and 5.3 and 1, 5 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 1, 6 and 15.1 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.6 and 11.5 and 15.1 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.23 (dd, J = 2.6 and 9.2 Hz, 1H); 7.27 (d, J = 8.4 Hz, 2H); 7.29 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 7.32 (d, J = 8.4 Hz, 2H); 8.35 (d, J = 8.1Hz, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 929 [M + H] + ; m / z = 927 [M - H] ', m / z = 973 [M - H + HCO 2 H] - base peak; t R = 0.99 min. Example 2: (E) - (3S, 6R, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6-methyl-16 - [(S) -1-
((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-((2R, 3R) -3- {4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -
1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone 1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le produit 10 (34 mg ; 36,6 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (4,3 ml) / eau (3,6 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (146 μmol) est ensuite additionné, le mélange devient incolore et est agité 2 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (20 ml) et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (20 ml). La phase aq. est extraite par 2x20 ml d'AcOEt, les phases organiques sont rassemblées et lavées avec une solution saturée de NaCl (20 ml). Après séchage sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/MeOH 98/2 à 90/10. Le composé Ex2 est obtenu sous forme d'un solide blanc (28,2 mg ; 87%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,77 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,79 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,27 (m, 1 H) ; 1 ,31 (s, 6 H) ; 1 ,53 (m, 1 H) ; 1 ,59 (m, 1 H) ; 1 ,77 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,24 à 2,32 (m, 3 H) ; 2,34 à 2,44 (m, 4 H) ; 2,62 à 2,76 (m, 4 H) ; 2,98 à 3,04 (m, 2 H) ; 3,15 (m, 1 H) ; 3,41 (m, 1 H) ; 3,46 (m, 4 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,4 et 8,3 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,88 (dd, J=3,7 et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=2,0 et 5,3 et 11 ,1 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=2,0 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,1 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,9 et 9,3 Hz, 1 H) ; 7,27 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 7,29 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,32 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 883 [M + H]+ ; m/z = 881 [M - H]" ; tR = 0,92 min. Exemple 3 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)- 3-{4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4- dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone The product (34 mg, 36.6 μmol) is placed in solution in ethanol (4.3 ml) / water (3.6 ml) and the mixture is cloudy. The TCEP (146 μmol) is then added, the mixture becomes colorless and is stirred for 2 hours at RT. The mixture is diluted by adding AcOEt (20 ml) and the organic phase is washed with a 1/1 mixture of water and an aq solution. saturated with NH 4 Cl (20 ml). The phase aq. is extracted with 2x20 ml of AcOEt, the organic phases are combined and washed with a saturated solution of NaCl (20 ml). After drying over MgSO 4 , filtration and evaporation of the solvents under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a 98/2 to 90/10 DCM / MeOH mixture. Ex2 is obtained as a white solid (28.2 mg, 87%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.77 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 0.79 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 1, 01 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 04 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1.27 (m, 1H); 1, 31 (s, 6H); 1.53 (m, 1H); 1.59 (m, 1H); 1.77 (m, 2H); 1.82 (m, 1H); 2.24 to 2.32 (m, 3H); 2.34 to 2.44 (m, 4H); 2.62 to 2.76 (m, 4H); 2.98 to 3.04 (m, 2H); 3.15 (m, 1H); 3.41 (m, 1H); 3.46 (m, 4H); 3.48 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 4.26 (ddd, J = 3.4 and 8.3 and 11.5 Hz, 1H); 4.88 (dd, J = 3.7 and 10.0 Hz, 1H); 5.12 (ddd, J = 2.0 and 5.3 and 11, 1 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 2.0 and 15.0 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.7 and 11, 1 and 15.0 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.3 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.0 and 8.3 Hz, 1H); 7.23 (dd, J = 2.9 and 9.3 Hz, 1H); 7.27 (d, J = 8.5 Hz, 2H); 7.29 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 7.32 (d, J = 8.5 Hz, 2H); 8.35 (d, J = 8.3 Hz, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 883 [M + H] + ; m / z = 881 [M - H] "; t R = 0.92 min Example 3: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3. Isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3- {4 - [(2-mercapto-2-methyl-propylamino) -methyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6 6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Composé 11 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propionaldéhyde O-méthyl-oxime Compound 11: 2-Methyl-2-methyl-disulfanyl-propionaldehyde O-methyl-oxime
5 g (33,3 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans 50 ml d'éthanol, sous atmosphère inerte. Sont successivement ajoutés une suspension de 5,56 g (66,54 mmol) de chlorure d'O-méthylhydroxylamine dans 50 ml d'éthanol puis 6,65 ml (66,54 mmol) de NaOH. Le mélange, blanc trouble, est chauffé au reflux pendant la nuit. Après retour à TA, le mélange est versé dans 500 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec l'AcOEt (3x175 ml), les phases organiques rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (200 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le composé 11 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (5,89 g, 32,9 mmol). 5 g (33.3 mmol) of 2- (methyldithio) -isobutyraldehyde are dissolved in 50 ml of ethanol under an inert atmosphere. A suspension of 5.56 g (66.54 mmol) is successively added of O-methylhydroxylamine chloride in 50 ml of ethanol then 6.65 ml (66.54 mmol) of NaOH. The cloudy white mixture is refluxed overnight. After returning to RT, the mixture is poured into 500 ml of water. The phase aq. is extracted with AcOEt (3x175 ml), the combined organic phases, washed with saturated NaCl solution (200 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the compound 11 is obtained in the form of a colorless oil (5.89 g, 32.9 mmol).
Composé 12 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamine Compound 12: 2-Methyl-2-methyl-disulfanyl-propylamine
Dans un ballon purgé à l'argon, sont successivement introduits, à TA, 1 ,78 g (9,9 mmol) d'éther d'oxime 11 , 19 ml de THF anhydre et 99,5 ml d'une solution 2M de borane méthylsulfure dans le THF. Le mélange est chauffé 16 h au reflux. La réaction est ensuite arrêtée, le mélange laissé revenir à TA avant que 100 ml de MeOH soient ajoutés goutte à goutte prudemment, à 0°C tant que la mousse se forme puis à TA. Le mélange est évaporé sous PR pour donner environ 2,8 g d'une huile jaune qui est reprise dans 30 ml d'une solution HCl 5 à 6N dans l'isopropanol. Le mélange est porté au reflux 1 h puis laissé à TA pendant la nuit. Après évaporation sous PR, le résidu obtenu est repris avec 80 ml de HCl 1 N puis extrait avec le diéthyle éther (3*20 ml). La phase aq. est traitée avec de l'ammoniaque aqueux à 30% jusqu'à obtention d'un pH de 12,5-13, ie 12 ml (phase aq. violet pâle) puis à nouveau extraite avec 3*20 ml d'éther. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées à sec sous PR pour donner 760 mg de brut. Ce résidu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 12 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (301 mg, 20%). LCMS (A2) : ES m/z = 152 [M + H]+ ; tR = 0,27 min. Composé 13 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)- 3-{4-[(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamino)-méthyl]-phenyl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone In a flask purged with argon are successively introduced, at RT, 1.78 g (9.9 mmol) of oxime ether 11, 19 ml of anhydrous THF and 99.5 ml of a 2M solution of borane methylsulfide in THF. The mixture is heated for 16 hours under reflux. The reaction is then stopped, the mixture allowed to return to RT before 100 ml of MeOH is added dropwise cautiously, at 0 ° C as the foam is formed then at RT. The mixture is evaporated under RP to give about 2.8 g of a yellow oil which is taken up in 30 ml of a 6N HCl solution in isopropanol. The mixture is refluxed 1 h and then left at RT overnight. After evaporation under RP, the residue obtained is taken up with 80 ml of 1N HCl and then extracted with diethyl ether (3 * 20 ml). The phase aq. is treated with 30% aqueous ammonia until a pH of 12.5-13 is obtained, ie 12 ml (pale violet aq. phase) and then extracted again with 3.20 ml of ether. The organic phases are combined, dried over MgSO 4 , filtered and evaporated to dryness under RP to give 760 mg of crude. This residue is finally purified by chromatography on silica gel, eluting with a 100/0 to 90/10 DCM / methanol mixture. Compound 12 is obtained as a pale yellow oil (301 mg, 20%). LCMS (A2): ES m / z = 152 [M + H] + ; t R = 0.27 min. Compound 13: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4 - [(2-methyl-2-methyl-disulfanyl-propylamino) -methyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13 -ene-2,5,9, 12-tetraone
A une solution, purgée à l'argon, de 25 mg (35 μmol) du composé 2 dans 3,1 ml de DMF anhydre sont successivement ajoutés, à TA, 9,8 μl (70 μmol) de TEA et 6,3 mg (42 μmol) du composé 12. L'agitation est poursuivie sous agitation à 40°C. Après 72 h de réaction, il reste du composé 2 de départ, sont alors ajoutés 9,8 μl (70 μmol) de TEA et 6,3 mg (42 μmol) de l'aminé 12. Après 72h supplémentaires à 40°C, il reste encore du composé 2 : 6,3 mg (42 μmol) de l'aminé 12 sont ajoutés et l'agitation poursuivie à 40°C. Un jour plus tard, la réaction est complète. Le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 2x10 ml d'eau, 10 ml d'une solution saturée de NaHCOs et 10 ml d'une solution saturée de NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, celle- ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 30 mg de brut. Ce résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 93/7. Le composé 13 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (23,3 mg, 81 %). CCM (DCM 90/ MeOH 10) : Rf=0,55 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 à 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,07 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,27 à 1 ,33 (m, 7 H) ; 1 ,52 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (sxt, J=6,8 Hz, 1 H) ; 2,06 (s large, 1 H) ; 2,25 à 2,34 (m, 1 H) ; 2,37 (s, 3 H) ; 2,57 (s, 2 H) ; 2,66 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,97 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,33 à 3,38 (m, 1 H) ; 3,75 (s, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=5,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,82 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,30 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,35 (d, J=8,2 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 832 [M + H]+ ; m/z = 830 [M - H]" ; tR = 0,96 min. To a solution, purged with argon, 25 mg (35 μmol) of compound 2 in 3.1 ml of anhydrous DMF are successively added, at RT, 9.8 μl (70 μmol) of TEA and 6.3 mg (42 μmol) of compound 12. The stirring is continued with stirring at 40 ° C. After 72 hours of reaction, there remains the starting compound 2, are then added 9.8 μl (70 μmol) of TEA and 6.3 mg (42 μmol) of the amine 12. After 72h additional at 40 ° C, compound 2 still remains: 6.3 mg (42 μmol) of amine 12 are added and stirring continued at 40 ° C. A day later, the reaction is complete. The mixture is diluted in 10 ml of AcOEt, washed with 2x10 ml of water, 10 ml of saturated NaHCO 3 solution and 10 ml of saturated NaCl solution. After drying the organic phase over MgSO 4 , it is filtered and then evaporated under RP to give 30 mg of crude. This residue is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 98/2 to 93/7. Compound 13 is obtained as a white powder (23.3 mg, 81%). TLC (DCM 90 / MeOH 10): Rf = 0.55; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.76 to 0.81 (m, 6H); 1, 02 (s, 3H); 1, 07 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 13 (s, 3H); 1.27 to 1.33 (m, 7H); 1, 52-1.63 (m, 2H); 1.82 (sxt, J = 6.8 Hz, 1H); 2.06 (bs, 1H); 2.25 to 2.34 (m, 1H); 2.37 (s, 3H); 2.57 (s, 2H); 2.66 to 2.76 (m, 2H); 2.97 to 3.06 (m, 3H); 3.33 to 3.38 (m, 1H); 3.75 (s, 2H); 3.83 (s, 3H); 3.88 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.27 (ddd, J = 3.7 and 8.0 and 11.4 Hz, 1H); 4.93 (dd, J = 3.7 and 9.7 Hz, 1H); 5.12 (dd, J = 5.8 and 11.3 Hz, 1H); 5.82 (dd, J = 1.5 and 15.2 Hz, 1H); 6.49 (ddd, J = 3.8 and 1, 3 and 15.2 Hz, 1H); 7.07 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.18 (dd, J = 1, 9 and 8.5 Hz, 1H); 7.23 (dd, J = 2.6 and 9.5 Hz, 1H); 7.26 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 7.30 (d, J = 1, 9 Hz, 1H); 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H); 8.35 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 832 [M + H] + ; m / z = 830 [M - H] "; t R = 0.96 min.
Exemple 3 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa- 8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone Example 3: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4 - [(2-Mercapto-2-methyl-propylamino) -methyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13 -ene-2,5,9, 12-tetraone
Le produit 13 (10,6 mg ; 12,8 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (1 ,5 ml) / eau (1 ,26 ml). Le TCEP (9,1 mg, 31 ,9 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 2 h 30 à TA. Le mélange est dilué dans 15 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (5 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 92/8. Le composé Ex3 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,4 mg ; 63%). CCM (DCM 90/MeOH 10) : Rf=0,47 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,80 à 0,86 (m, 6 H) ; 1 ,06 (s, 3 H) ; 1 ,1 1 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,18 (s, 3 H) ; 1 ,31 à 1 ,38 (m, 7 H) ; 1 ,57 à 1 ,67 (m, 2 H) ; 1 ,87 (sxt, J=6,8 Hz, 1 H) ; 2,29 à 2,38 (m, 1 H) ; 2,56 (s, 2 H) ; 2,70 à 2,80 (m, 2 H) ; 3,00 à 3,1 1 (m, 3 H) ; 3,39 à 3,43 (m, 1 H) ; 3,82 (s, 2 H) ; 3,87 (s, 3 H) ; 3,92 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,31 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,97 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,17 (dd, J=5,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,86 (dd, J=1 ,4 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,54 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,1 1 (d, J=8,7 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=1 ,9 et 8,7 Hz, 1 H) ; 7,27 (dd, J=2,7 et 9,6 Hz, 1 H) ; 7,31 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 7,34 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,42 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 786 [M + H]+ ; m/z = 784 [M - Hf ; tR = 0,92 min. Exemple 4 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[({2-mercapto-2-méthyl-propyl}-méthyl-amino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone Product 13 (10.6 mg, 12.8 μmol) is dissolved in ethanol (1.5 ml) / water (1.26 ml). TCEP (9.1 mg, 31.9 μmol) is then added and the mixture is stirred for 2 h at RT. The mixture is diluted in 15 ml of AcOEt and the organic phase is washed with a 1/1 mixture of water and an aq solution. saturated with NH 4 Cl (5 ml). After drying the organic phase over MgSO 4 , filtration and evaporation of the solvents under RP, the crude obtained is finally purified by chromatography on silica gel, eluting with a 98/2 to 92/8 DCM / methanol mixture. Compound Ex3 is obtained as a white solid (6.4 mg, 63%). TLC (DCM 90 / MeOH 10): Rf = 0.47; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.80 to 0.86 (m, 6H); 1, 06 (s, 3H); 1.11 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 18 (s, 3H); 1.31 to 1.38 (m, 7H); 1.77-1.67 (m, 2H); 1.87 (sxt, J = 6.8 Hz, 1H); 2.29 to 2.38 (m, 1H); 2.56 (s, 2H); 2.70 to 2.80 (m, 2H); 3.00 to 3.11 (m, 3H); 3.39 to 3.43 (m, 1H); 3.82 (s, 2H); 3.87 (s, 3H); 3.92 (d, J = 1, 9 Hz, 1H); 4.31 (ddd, J = 3.6 and 8.0 and 11.5 Hz, 1H); 4.97 (dd, J = 3.7 and 9.7 Hz, 1H); 5.17 (dd, J = 5.8 and 11.3 Hz, 1H); 5.86 (dd, J = 1, 4 and 15.1 Hz, 1H); 6.54 (ddd, J = 3.8 and 1 1, 3 and 15.1 Hz, 1H); 7.1 (d, J = 8.7 Hz, 1H); 7.23 (dd, J = 1, 9 and 8.7 Hz, 1H); 7.27 (dd, J = 2.7 and 9.6 Hz, 1H); 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 7.34 (d, J = 1.9 Hz, 1H); 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 8.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 786 [M + H] + ; m / z = 784 [M-H f; t R = 0.92 min. Example 4: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4 - [({2-Mercapto-2-methyl-propyl} -methylamino) -methyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Composé 14 : Méthyl-[2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-prop-(E)-ylidène]-amine Compound 14: Methyl- [2-methyl-2-methyldisulfanyl-prop- (E) -ylidene] -amine
1 g (6,66 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans 10 ml de THF anhydre, sous atmosphère inerte. La solution de méthylamine 2M dans le THF (33,3 ml, 66,6 mmol) est ajoutée puis le mélange est agité 5 h à TA. Il est dilué dans 50 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (30 ml), une solution saturée de NaCl (30 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le composé 14 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (1 ,01 g, 93%). RMN 1H (400 MHz, chloroforme-d): 1 ,46 (s, 6 H) ; 2,36 (s, 3 H) ; 3,32 (s, 3 H) ; 7,52 (s, 1 H). 1 g (6.66 mmol) of 2- (methyldithio) -isobutyraldehyde are dissolved in 10 ml of anhydrous THF under an inert atmosphere. The solution of 2M methylamine in THF (33.3 ml, 66.6 mmol) is added and the mixture is stirred for 5 hours at RT. It is diluted in 50 ml of AcOEt, washed with water (30 ml), saturated NaCl solution (30 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the compound 14 is obtained in the form of a pale yellow oil (1.01 g, 93%). 1 H NMR (400 MHz, chloroform-d): 1.46 (s, 6H); 2.36 (s, 3H); 3.32 (s, 3H); 7.52 (s, 1H).
Composé 15 : 2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamine Compound 15: 2-Methyl-2-methyl-disulfanyl-propylamine
Une solution du composé 14 (1 ,01 g, 6,185 mmol) dans 30 ml de THF est purgée à l'argon et refroidie à 0°C avant que soit ajouté, à 0°C, 1 ,44 g (6,80 mmol) de triacétoxyborohydrure de sodium. L'agitation est poursuivie 15 h à TA: il reste de l'imine de départ ; 1 ,44 g (6,80 mmol) de triacétoxyborohydrure de sodium et 354 μl (6,185 mmol) d'acide acétique sont ajoutés à 0°C puis l'agitation poursuivie à TA pendant 3 h. Le mélange est dilué dans 50 ml d'AcOEt et lavé avec de l'eau (50 ml). Le pH de la phase aq. est ajusté à 12 environ par ajout de 14 ml d'une solution aq. de soude 1 N puis elle est extraite avec de l'éther diéthylique (3χ50 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (50 ml), séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le composé 15 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (695 mg, 68%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,47 (m étalé, 1 H) ; 2,31 (s, 3 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,53 (m, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 166 [M + H]+ ; tR = 0,28 min. Composé 16 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-{(S)-1-[(2R,3R)- 3-(4-{[(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-méthyl-amino]-méthyl}-phényl)-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone A solution of the compound 14 (1.11 g, 6.185 mmol) in 30 ml of THF is purged with argon and cooled to 0 ° C. before adding, at 0 ° C., 1.44 g (6.80 mmol). ) of sodium triacetoxyborohydride. Stirring is continued for 15 h at RT: there remains imine starting; 1.44 g (6.80 mmol) of sodium triacetoxyborohydride and 354 μl (6.185 mmol) of acetic acid are added at 0 ° C. and the stirring is continued at RT for 3 h. The mixture is diluted in 50 ml of AcOEt and washed with water (50 ml). The pH of the aq phase. is adjusted to about 12 by adding 14 ml of aq solution. of 1N soda and it is extracted with diethyl ether (3 χ 50 mL). The organic phases are combined, washed with saturated NaCl solution (50 ml), dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the compound is obtained in the form of a colorless oil (695 mg, 68%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1.25 (s, 6H); 1.47 (m spread, 1H); 2.31 (s, 3H); 2.38 (s, 3H); 2.53 (m, 2H). LCMS (A2) ES m / z = 166 [M + H] + ; t R = 0.28 min. Compound 16: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - ((S) -1 - [(2R, 3R) - 3 - (4 - {[(2-methyl-2-méthyldisulfanyl-propyl) -methyl-amino] -methyl} -phenyl) -oxiranyl) -ethyl] -6,6- dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le∞mposé 16 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 15 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30.  The compound 16 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with the amine 15 by applying the method described for the preparation of the compound 30.
Exemple 4 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-Example 4: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - {(S) -1 - [(2R, 3R) -3 -
(4-{[(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-méthyl-amino]-méthyl}-phényl)-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-(4 - {[(2-mercapto-2-methyl-propyl) -methyl-amino] -methyl} -phenyl) -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-
1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone 1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
L'exemple 4 peut être obtenu en appliquant la méthode décrite pour la préparation de l'exemple 6 au composé 16. Example 4 can be obtained by applying the method described for the preparation of Example 6 to compound 16.
Exemple 5 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6- diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone Example 5: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4- [4- (2-Mercapto-2-methyl-propyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Composé 17 : 4-(2-Méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazine-1-carboxylate de fert-butyle Fert-butyl 17: 4- (2-methyl-2-methyl-disulfanyl-propyl) -piperazine-1-carboxylate compound
A une solution, purgée à l'argon, de 1-Boc-pipérazine (1 ,0 g, 5,37 mmol) dans le THF anhydre (20 ml) sont ajoutés le 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol). Le mélange est agité 20 min à TA puis un nouvel ajout de 2-(méthyldithio)- isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol) est réalisé. L'agitation est poursuivie 2 h puis 12 ml d'éthanol sont ajoutés et l'agitation poursuivie 5 min. Sont ajoutés du cyanoborohydrure de sodium (5,37 mmol), le mélange est agité 1 h avant que soient ajoutées 5,37 mmoles supplémentaires de cyanoborohydrure de sodium. L'agitation est poursuivie 1 h. Le mélange est concentré à sec puis repris dans TAcOEt. De l'eau est ajoutée entraînant la formation d'un précipité qui est filtré sur verre fritte, rincé avec de TAcOEt et de l'eau. Le solide obtenu est solubilisé dans une solution aq. HCl 1 N (50 ml), le milieu est neutralisé avec une solution aq. NaOH 5N puis extrait au DCM. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec DCM/méthanol 100/0 à 97/3. Le composé 17 est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (650 mg ; 40%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,42 (s, 2H) ; 2,44 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,27 (m partiellement masqué, 4 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 321 [M + H]+ ; m/z = 265 pic de base ; tR = 3,02 min. To a solution, purged with argon, of 1-Boc-piperazine (1.0 g, 5.37 mmol) in anhydrous THF (20 ml) is added 2- (methyldithio) -isobutyraldehyde (5.37 mmol). ) and titanium (IV) isopropoxide (6.71 mmol). The mixture is stirred for 20 minutes at RT and then a new addition of 2- (methyldithio) -isobutyraldehyde (5.37 mmol) and titanium (IV) isopropoxide (6.71 mmol) is produced. Stirring is continued for 2 h and then 12 ml of ethanol are added and the stirring is continued for 5 min. Sodium cyanoborohydride (5.37 mmol) is added and the mixture is stirred for 1 h before an additional 5.37 mmol of sodium cyanoborohydride is added. Stirring is continued for 1 hour. The mixture is concentrated to dryness and then taken up in TAcOEt. Water is added resulting in the formation of a precipitate which is filtered through sintered glass, rinsed with TAcOEt and water. The solid obtained is solubilized in an aq solution. 1N HCl (50 ml), the medium is neutralized with solution aq. 5N NaOH and then extracted with DCM. The organic phases are combined, washed with saturated NaCl solution, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated under RP. The crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with DCM / methanol 100/0 to 97/3. Compound 17 is obtained as a pale yellow oil (650 mg, 40%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.26 (s, 6H); 1.39 (s, 9H); 2.39 (s, 3H); 2.42 (s, 2H); 2.44 to 2.48 (m, 4H); 3.27 (partially masked m, 4H). LCMS (A1) ES m / z = 321 [M + H] + ; m / z = 265 base peak; t R = 3.02 min.
Composé 18 : Chlorhydrate de 1-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazine Compound 18: 1- (2-methyl-2-methyl-disulfanyl-propyl) -piperazine hydrochloride
A une solution du composé 17 (322 mg, 1 ,01 mmol) dans le dioxane (13 ml) est ajoutée une solution HCl 4M dans le dioxane (5 ml). L'agitation est poursuivie 16 h à TA. Le mélange est filtré sur verre fritte, le solide obtenu est rincé avec du dioxane pour donner le composé 18 (231 mg, 90%) sous la forme d'une poudre blanche. RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,31 (s large, 6 H) ; 2,42 (s, 3 H) ; 2,59 à 3,38 (m très étalé, 10 H) ; 8,78 (m étalé, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 221 [M + H]+ ; tR = 0,46 min. To a solution of compound 17 (322 mg, 1.01 mmol) in dioxane (13 ml) was added 4M HCl in dioxane (5 ml). Stirring is continued for 16 hours at RT. The mixture is filtered on sintered glass, the solid obtained is rinsed with dioxane to give compound 18 (231 mg, 90%) in the form of a white powder. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1.31 (brs, 6H); 2.42 (s, 3H); 2.59 to 3.38 (very broad m, 10H); 8.78 (spread m, 2H). LCMS (A2) ES m / z = 221 [M + H] + ; t R = 0.46 min.
Composé 19 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[4-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone Compound 19: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-16 - [(S) - 1 - (( 2R, 3R) -3- {4- [4- (2-methyl-2-methyl-disulfanyl-propyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -1,4-dioxa-8,11 diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (15,02 mg, 20,93 μmol) dans le DMF anhydre (0,9 ml) est ajoutée une solution du composé 18 (25,12 μmol) et de TEA (52,3 μmol) dans le DMF (1 ml). Le mélange est agité à 40°C sous argon. Après 24 h, 25,12 μmol du composé 18 et 31 ,4 μmol de TEA sont ajoutés. Après 24 h supplémentaires à 40°C, la réaction est terminée. Le mélange est dilué avec de TAcOEt (6 ml) et lavée avec de l'eau (2x6 ml), une solution saturée de NaHCO3 (6 ml) et une solution saturée de NaCl (6 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, celle-ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 46 mg de brut. Le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 19 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (5,2 mg, 28%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,27 à 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,85 (m, 1 H) ; 2,23 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,37 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,41 (s, 2 H) ; 2,53 à 2,56 (m, 4 H) ; 2,63 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,8 et 7,8 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,92 (dd, J=3,8 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,07 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 901 [M + H]+ ; m/z = 451 pic de base ; tR = 4,33 min. To a solution, purged with argon, of compound 2 (15.02 mg, 20.93 μmol) in anhydrous DMF (0.9 ml) is added a solution of compound 18 (25.12 μmol) and TEA. (52.3 μmol) in DMF (1 ml). The mixture is stirred at 40 ° C under argon. After 24 hours, 25.12 μmol of compound 18 and 31.4 μmol of TEA are added. After another 24 hours at 40 ° C, the reaction is complete. The mixture was diluted with TAcOEt (6 mL) and washed with water (2x6 mL), saturated NaHCO 3 solution (6 mL) and saturated NaCl solution (6 mL). After drying the organic phase over MgSO 4 , it is filtered and then evaporated under RP to give 46 mg of crude. The residue is purified by chromatography on silica gel, eluting with a 100/0 to 95/5 DCM / methanol mixture. Compound 19 is obtained as a white powder (5.2 mg, 28%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.76 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 0.78 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 1, 01 (s, 3H); 1, 06 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 13 (s, 3H); 1.25 (s, 6H); 1.27 to 1.33 (m, 1H); 1.51-1.63 (m, 2H); 1.76 to 1.85 (m, 1H); 2.23 to 2.32 (m, 1H); 2.37 (m, 4H); 2.39 (s, 3H); 2.41 (s, 2H); 2.53 to 2.56 (m, 4H); 2.63 to 2.76 (m, 2H); 2.94 to 3.06 (m, 3H); 3.34 (partially masked m, 1H); 3.40 to 3.48 (m, 2H); 3.82 (s, 3H); 3.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 4.26 (ddd, J = 3.8 and 7.8 and 11.3 Hz, 1H); 4.92 (dd, J = 3.8 and 9.8 Hz, 1H); 5.07 to 5.14 (m, 1H); 5.81 (d, J = 15.2 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 3.8 and 11, 3 and 15.2 Hz, 1H); 7.06 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.18 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.21-7.32 (m, 6H); 8.35 (d, J = 8.3 Hz, 1H). LCMS (A1) ES m / z = 901 [M + H] + ; m / z = 451 base peak; t R = 4.33 min.
Exemple 5 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9, 12-tétraone Example 5: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4- [4- (2-Mercapto-2-methyl-propyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le produit 19 (5,7 mg ; 6,3 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (0,8 ml) / eau (0,5 ml). Le TCEP (4,54 mg, 15,83 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 1 h à TA. Le mélange est dilué dans 7 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (7 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 95/5. Le composé Ex5 est obtenu sous forme d'un solide blanc (2,95 mg ; 55%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,27 (s, 6 H) ; 1 ,29 à 1 ,34 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,29 (m, 1 H) ; 2,37 (s, 2 H) ; 2,39 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,57 à 2,62 (m, 4 H) ; 2,65 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,96 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m, partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,12 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,2 Hz, 1 H); 6,49 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,36 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 855 [M + H]+ ; m/z = 428 [M + 2H]2+ pic de base ; tR = 4, 13 min. Product 19 (5.7 mg, 6.3 μmol) is placed in solution in ethanol (0.8 ml) / water (0.5 ml). TCEP (4.54 mg, 15.83 μmol) is then added and the mixture is stirred for 1 hour at RT. The mixture is diluted in 7 ml of AcOEt and the organic phase is washed with a 1/1 mixture of water and an aq solution. saturated with NH 4 Cl (7 ml). After drying the organic phase over MgSO 4 , filtration and evaporation of the solvents under PR, the crude obtained is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 99/1 to 95/5. The compound Ex5 is obtained as a white solid (2.95 mg, 55%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.77 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 0.78 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 1, 02 (s, 3H); 1, 06 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 13 (s, 3H); 1, 27 (s, 6H); 1, 29 to 1, 34 (m, 1H); 1, 52-1.63 (m, 2H); 1.82 (m, 1H); 2.29 (m, 1H); 2.37 (s, 2H); 2.39 to 2.41 (m, 4H); 2.57 to 2.62 (m, 4H); 2.65 to 2.76 (m, 2H); 2.96 to 3.06 (m, 3H); 3.34 (m, partially masked, 1H); 3.46 (s, 2H); 3.83 (s, 3H); 3.88 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 4.27 (ddd, J = 3.7 and 8.0 and 11.5 Hz, 1H); 4.93 (dd, J = 3.7 and 9.7 Hz, 1H); 5.12 (m, 1H); 5.82 (d, J = 15.2 Hz, 1H); 6.49 (ddd, J = 3.7 and 11.5 and 15.2 Hz, 1H); 7.07 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.18 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.21 to 7.33 (m, 6H); 8.36 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A1): ES m / z = 855 [M + H] + ; m / z = 428 [M + 2H] 2+ base peak; t R = 4.13 min.
Exemple 6 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-méthyl-propyl]amino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone Example 6: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4- [4 - ({2- [2- (2- {2-methyl- [2-mercapto-2-methyl-propyl] amino-ethoxy} -ethoxy) -ethoxy] -ethyl} methylamino) methyl ] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Composé 20 : Toluène-4-sulfonate de 2-{2-[2-(2-hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyle Compound 20: 2- {2- [2- (2-Hydroxyethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethyl Toluene-4-sulfonate
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 5 g (25,74 mmol) de tetraéthylèneglycol dans 68,7 ml de DCM sont successivement ajoutés, par portion afin de maintenir une agitation convenable, 8,95 g (38,61 mmol) d'oxyde d'argent et 5,40 g (28,31 mmol) de chlorure de tosyle. 855 mg (5,15 mmol) de Kl sont ajoutés par petites portions afin de maintenir la température du mélange inférieure à 5°C. L'agitation est poursuivie 1 h en maintenant la température inférieure à 5°C. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel, le résidu est rincé au DCM puis le filtrat concentré à sec sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 99/1 à 95/5. Le composé 20 est obtenu sous forme d'une huile incolore (5,4 g, 60%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,43 (s, 3 H) ; 3,40 (m, 2 H) ; 3,44 à 3,52 (m, 10 H) ; 3,58 (m, 2 H) ; 4,11 (m, 2 H) ; 4,53 (t, J=5,4 Hz, 1 H) ; 7,48 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,78 (d, J=8,3 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 349 [M + H]+ ; m/z = 371 [M + Na]+ ; tR = 0,69 min. Composé 21 : 1-Azido-3,6-9-trioxaundecane-11-ol To a solution, purged with argon and cooled to 0 ° C, 5 g (25.74 mmol) of tetraethylene glycol in 68.7 ml of DCM are successively added, portionwise to maintain proper agitation, 8.95 g (38.61 mmol) of silver oxide and 5.40 g (28.31 mmol) of tosyl chloride. 855 mg (5.15 mmol) of Kl are added in small portions to keep the temperature of the mixture below 5 ° C. Stirring is continued for 1 h while keeping the temperature below 5 ° C. After returning to RT, the mixture is filtered on Clarcel, the residue is rinsed with DCM and the filtrate is concentrated to dryness under RP. The crude is purified by chromatography on silica gel using a DCM / methanol 99/1 to 95/5 mixture as eluent. Compound 20 is obtained as a colorless oil (5.4 g, 60%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 2.43 (s, 3H); 3.40 (m, 2H); 3.44 to 3.52 (m, 10H); 3.58 (m, 2H); 4.11 (m, 2H); 4.53 (t, J = 5.4 Hz, 1H); 7.48 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 7.78 (d, J = 8.3 Hz, 2H). LCMS (A2) ES m / z = 349 [M + H] + ; m / z = 371 [M + Na] + ; t R = 0.69 min. Compound 21: 1-Azido-3,6-9-trioxaundecan-11-ol
A une solution de 5,4 g (15,51 mmol) du composé 20 dans 40,6 ml d'acétonitrile anhydre sont ajoutés 1 ,34 g (20,63 mmol) deNaN3 puis le mélange est chauffé 6 h 30 au reflux. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Il reste du composé 20 de départ : le brut est repris dans 25 ml d'acétonitrile anhydre et 230 mg (3,5 mmol) de NaN3 sont ajoutés. Le mélange est chauffé au reflux pendant 5 h. Après retour à TA, il est filtré sur Clarcel et concentré à sec sous PR pour donner le composé 21 sous la forme d'une huile jaune pâle (3,37 g, 99%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 3,37 à 3,43 (m, 4 H) ; 3,45 à 3,58 (m, 10 H) ; 3,60 (m, 2 H) ; 4,54 (t, J=5,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 220 [M + H]+ ; m/z = 242 [M + Na]+ pic de base ; tR = 0,39 min. To a solution of 5.4 g (15.51 mmol) of compound 20 in 40.6 ml of anhydrous acetonitrile is added 1.34 g (20.63 mmol) of NaN 3 and then the mixture is heated for 6 hours under reflux. . After returning to RT, the mixture is filtered on Clarcel and concentrated under PR. It remains of compound 20 starting: the crude is taken up in 25 ml of anhydrous acetonitrile and 230 mg (3.5 mmol) of NaN 3 were added. The mixture is refluxed for 5 hours. After returning to RT, it is filtered through Clarc and concentrated to dryness under RP to give compound 21 as a pale yellow oil (3.37 g, 99%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 3.37 to 3.43 (m, 4H); 3.45 to 3.58 (m, 10H); 3.60 (m, 2H); 4.54 (t, J = 5.1Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 220 [M + H] + ; m / z = 242 [M + Na] + base peak; t R = 0.39 min.
Composé 22 : N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthoxy-éthanol Compound 22: N-Boc-aminoethoxy-ethoxy-ethoxy-ethanol
A une solution, inertée à l'argon, de 320 mg de palladium sur charbon 10% dans 5 ml d'AcOEt est ajoutée une solution de 3,25 g (14,8 mmol) du composé 21 , 6,46 g (29,6 mmol) de dicarbonate de fert-butyle et 4,13 ml (29,6 mmol) de TEA dans 45 ml d'AcOEt. La réaction est réalisée 17 h à 30°C sous une pression d'hydrogène de 2 bars. Après retour à TA et PA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 22 est obtenu sous forme d'une huile incolore (2,92 g, 67%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,42 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,53 (m, 10 H) ; 4,54 (t large, J=5,1 Hz, 1 H) ; 6,71 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 316 [M + Na]+ ; m/z = 194 pic de base ; tR = 2,81 min. To a solution, inert with argon, of 320 mg of 10% palladium on carbon in 5 ml of AcOEt is added a solution of 3.25 g (14.8 mmol) of compound 21, 6.46 g (29 g). , 6 mmol) of tert-butyl dicarbonate and 4.13 ml (29.6 mmol) of TEA in 45 ml of AcOEt. The reaction is carried out for 17 hours at 30 ° C. under a hydrogen pressure of 2 bar. After return to TA and PA, the mixture is filtered on Clarcel and concentrated under PR. The crude is purified by chromatography on silica gel using as eluent a 98/2 to 90/10 DCM / methanol mixture. Compound 22 is obtained as a colorless oil (2.92 g, 67%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1.37 (s, 9H); 3.06 (q, J = 6.1 Hz, 2H); 3.37 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 3.42 (m, 2H); 3.46 to 3.53 (m, 10H); 4.54 (broad t, J = 5.1 Hz, 1H); 6.71 (broad t, J = 6.1 Hz, 1H). LCMS (A1): ES m / z = 316 [M + Na] + ; m / z = 194 base peak; t R = 2.81 min.
Composé 23 : Toluène-4-sulfonate de 2-{2-[2-(2-tert-butoxycarbonylamino-éthoxy)-éthoxy]- éthoxy}-éthyle Compound 23: 2- {2- [2- (2-tert-Butoxycarbonylamino-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethyl Toluene-4-sulfonate
A une solution, purgée à l'argon, de 3,06 g (10,42 mmol) du composé 22 dans 20 ml de DCM sont ajoutés 2,53 ml (31 ,26 mmol) de pyridine. Le mélange est refroidi à 0°C puis une solution de 2,98 g (15,63 mmol) de chlorure de tosyle dans 10 ml de DCM est ajoutée goutte à goutte. L'agitation est poursuivie 15 h à TA. Le mélange est dilué dans 20 ml de DCM, lavé avec une solution saturée de NaHCOβ (30 ml), de l'eau (2x30 ml), une solution saturée de NaCl (30 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 23 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (4,38 g, 94%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 2,42 (s, 3 H) ; 3,05 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,46 (m, 8 H) ; 3,58 (m, 2 H) ; 4,10 (m, 2 H) ; 6,71 (t large, J=6,1 Hz, 1 H) ; 7,48 (d, J=7,8 Hz, 2 H) ; 7,78 (d, J=7,8 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 448 [M + H]+ ; m/z = 470 [M + Na]+ ; m/z = 348 pic de base ; m/z = 492 [M - H + HCO2H]- ; tR = 1 ,00 min. To a solution, purged with argon, of 3.06 g (10.42 mmol) of compound 22 in 20 ml of DCM are added 2.53 ml (31, 26 mmol) of pyridine. The mixture is cooled to 0 ° C. and then a solution of 2.98 g (15.63 mmol) of tosyl chloride in 10 ml of DCM is added dropwise. Stirring is continued for 15 hours at RT. The mixture is diluted in 20 ml of DCM, washed with saturated NaHCO 3 solution (30 ml), water (2 × 30 ml), saturated NaCl solution (30 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel using a DCM / methanol mixture 100/0 to 90/10 as eluent. Compound 23 is obtained as a pale yellow oil (4.38 g, 94%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1, 37 (s, 9H); 2.42 (s, 3H); 3.05 (q, J = 6.1 Hz, 2H); 3.36 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 3.46 (m, 8H); 3.58 (m, 2H); 4.10 (m, 2H); 6.71 (broad t, J = 6.1 Hz, 1H); 7.48 (d, J = 7.8 Hz, 2H); 7.78 (d, J = 7.8 Hz, 2H). LCMS (A2) ES m / z = 448 [M + H] + ; m / z = 470 [M + Na] + ; m / z = 348 base peak; m / z = 492 [M - H + HCO 2 H] -; t R = 1, 00 min.
Composé 24 : (2-{2-[2-(2-Azido-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-carbamate de fert-butyle Compound 24: Fert -butyl (2- {2- [2- (2-Azido-ethoxy) ethoxy] -ethoxy} -ethyl) -carbamate
A une solution de 4,38 g (9,79 mmol) du composé 23 dans 25 ml d'acétonitrile sont ajoutés 846 mg (13,02 mmol) d'azoture de sodium puis le mélange est chauffé 6 h au reflux. Il reste du composé de départ en proportion importante : après retour à TA, 1 ,7 g (26,13 mmol) sont ajoutés au mélange. L'agitation est maintenue 24 h au reflux. Après retour à TA, le mélange est filtré sur Clarcel et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 24 est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (2,16 g, 69%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,37 (s, 9 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,34 à 3,43 (m, 4 H) ; 3,46 à 3,58 (m, 8 H) ; 3,60 (m, 2 H) ; 6,70 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 341 [M + Na]+ ; tR = 0,81 min. Composé 25 : (2-{2-[2-(2-Azido-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-méthyl-carbamate de tert-butyle To a solution of 4.38 g (9.79 mmol) of compound 23 in 25 ml of acetonitrile are added 846 mg (13.02 mmol) of sodium azide and then the mixture is heated for 6 hours under reflux. The starting compound remains in substantial proportion: after returning to RT, 1.7 g (26.13 mmol) is added to the mixture. Stirring is maintained 24 hours at reflux. After returning to RT, the mixture is filtered on Clarcel and concentrated under PR. The crude product is purified by chromatography on silica gel, using a 98/2 to 90/10 DCM / methanol mixture as eluent. Compound 24 is obtained as a pale yellow oil (2.16 g, 69%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1.37 (s, 9H); 3.06 (q, J = 6.1 Hz, 2H); 3.34 to 3.43 (m, 4H); 3.46 to 3.58 (m, 8H); 3.60 (m, 2H); 6.70 (broad t, J = 6.1 Hz, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 341 [M + Na] + ; t R = 0.81 min. Compound 25: tert-Butyl (2- {2- [2- (2-Azido-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethyl) methyl-carbamate
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 2,06 g (6,47 mmol) du composé 24 dans To a solution, purged with argon and cooled to 0 ° C, of 2.06 g (6.47 mmol) of compound 24 in
25 ml de THF anhydre sont successivement ajoutés, à 0°C, 854 mg (21 ,35 mmol) de NaH 60% en dispersion dans une huile minérale (par portion) et 886 μl (14,23 mmol) d'iodure de méthyle.25 ml of anhydrous THF are successively added, at 0 ° C., 854 mg (21.35 mmol) of 60% NaH in dispersion in a mineral oil (per portion) and 886 μl (14.23 mmol) of methyl iodide. .
L'agitation est poursuivie 1 h à 0°C puis 16 h à TA. Le mélange est filtré sur Clarcel, lavé avec duStirring is continued for 1 h at 0 ° C. and then 16 h at RT. The mixture is filtered on Clarcel, washed with
THF et concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange de DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé 25 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (1 ,67 g, 78%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t partiellement masqué,J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,38 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,56 (m, 10 H) ;THF and concentrated under PR. The crude is purified by chromatography on silica gel, using as eluent a mixture of DCM / methanol 99/1 to 90/10. Compound 25 is obtained as a colorless oil (1.67 g, 78%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 1.39 (s, 9H); 2.80 (bs, 3H); 3.29 (t partially masked, J = 5.6 Hz, 2H); 3.38 (m, 2H); 3.46 to 3.56 (m, 10H);
3,60 (t, J=5,4 Hz, 2 H). 3.60 (t, J = 5.4 Hz, 2H).
Composé 26 : (2-{2-[2-(2-Amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-méthyl-carbamate de fert-butyle Compound 26: Fert -butyl (2- {2- [2- (2-amino-ethoxy) ethoxy] -ethoxy} -ethyl) methyl-carbamate
A une solution, purgée à l'argon, de 1 ,66 g (4,99 mmol) du composé 25 dans 20 ml de THF sont successivement ajoutés 1 ,31 g (4,994 mmol) de triphénylphosphine et 108 μl (5,99 mmol) d'eau. L'agitation est poursuivie 25h30 puis le mélange est concentré à sec et purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 26 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (1 ,23 g, 80%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,65 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,56 (m, 10 H). LCMS (A2) : ES m/z = 307 [M + H]+ ; tR = 0,49 min. To a solution, purged with argon, 1.66 g (4.99 mmol) of compound 25 in 20 ml of THF are successively added 1.31 g (4.994 mmol) of triphenylphosphine and 108 μl (5.99 mmol). ) of water. Stirring is continued for 25 h 30 then the mixture is concentrated to dryness and purified by SPE filtration on a SCX cartridge (Varian) conditioned and washed with methanol and then eluted with a 0.5 N ammonia solution in methanol. Compound 26 is obtained as a colorless oil (1.23 g, 80%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 1.39 (s, 9H); 2.65 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 2.80 (bs, 3H); 3.29 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.36 (t, J = 5.7 Hz, 2H); 3.45 to 3.56 (m, 10H). LCMS (A2) ES m / z = 307 [M + H] + ; t R = 0.49 min.
Composé 27 : Méthyl-[2-(2-{2-[2-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamino)-éthoxy]-éthoxy}- éthoxy)-éthyl]-carbamate de fert-butyle Compound 27: Fert -butyl methyl- [2- (2- {2- [2- (2-methyl-2-methyldisulfanyl-propylamino) -ethoxy] -ethoxy} ethoxy) -ethyl] -carbamate
A une solution, purgée à l'argon, de 131 mg (426 μmol) du composé 26 dans 3 ml de DCM sont successivement ajoutés 64 mg (426 μmol) de 2-méthyldithio-isobutyraldéhyde, 126 mg (596 μmol) de triacétoxyborohydrure de sodium et 24,4 μl (426 μmol) d'acide acétique. L'agitation est poursuivie 6 h à TA sous Ar, la réaction est quenchée par addition de 1 ml d'une solution aq. de soude 1 N puis le mélange est extrait avec 10 ml d'éther diéthylique. Après concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/isopropanol 90/10 qui ne permet pas de séparer l'attendu de l'aminé résiduelle de départ. Le produit obtenu est à nouveau purifié par chromatographie sur phase inverse RP18 en utilisant comme éluant un mélange eau/acétonitrile 95/5 à 5/95. le composé 27 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (67 mg, 36%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 1 ,58 (m étalé, 1 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,59 (s, 2 H) ; 2,68 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,46 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,54 (m, 12 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 441 [M + H]+ ; tR = 3,29 min. Composé 28 : Méthyl-{2-[2-(2-{2-[méthyl-(2-méhyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-amino]-éthoxy}- éthoxy)-éthoxy]-éthyl}-carbamate de fert-butyle To a solution, purged with argon, of 131 mg (426 μmol) of compound 26 in 3 ml of DCM are successively added 64 mg (426 μmol) of 2-methyldithioisobutyraldehyde, 126 mg (596 μmol) of triacetoxyborohydride. sodium and 24.4 μl (426 μmol) of acetic acid. Stirring is continued for 6 h at RT under Ar, the reaction is quenched by addition of 1 ml of aq solution. 1N sodium hydroxide then the mixture is extracted with 10 ml of diethyl ether. After concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel using a DCM / isopropanol 90/10 mixture as eluent, which does not make it possible to separate the expected from the residual amine starting material. The product obtained is purified again by RP18 reverse phase chromatography using as eluent a water / acetonitrile mixture 95/5 to 5/95. compound 27 is obtained in the form a colorless oil (67 mg, 36%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1.25 (s, 6H); 1.39 (s, 9H); 1. 58 (m spread, 1H); 2.38 (s, 3H); 2.59 (s, 2H); 2.68 (t, J = 5.6 Hz, 2H); 2.80 (bs, 3H); 3.46 (t, J = 5.6 Hz, 2H); 3.48 to 3.54 (m, 12H). LCMS (A1): ES m / z = 441 [M + H] + ; t R = 3.29 min. Compound 28: Fertilized methyl- {2- [2- (2- {2- [methyl- (2-methyl-2-methyldisulfanyl-propyl) -amino] -ethoxy} -ethoxy) -ethoxy] -ethyl} -carbamate butyl
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 65 mg (148 μmol) du composé 27 dans 1 ml de DCM sont successivement ajoutés 19,5 mg (487 μmol) de NaH 60% en dispersion dans une huile minérale et 20 μl (325 μmol) d'iodure de méthyle. L'agitation est poursuivie 45 min à 0°C puis 72 h à TA. Le mélange est filtré sur Clarcel puis concentré sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluent un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé 28 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (43 mg, 64%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,32 (s, 3 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,54 (m, 2 H) ; 2,61 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,42 à 3,54 (m, 14 H). LCMS (A2) : ES m/z = 455 [M + H]+ ; tR = 0,77 min. To a solution, purged with argon and cooled to 0 ° C, 65 mg (148 μmol) of compound 27 in 1 ml of DCM are successively added 19.5 mg (487 μmol) of 60% NaH dispersed in a mineral oil and 20 μl (325 μmol) of methyl iodide. Stirring is continued for 45 min at 0 ° C and then 72 h at RT. The mixture is filtered on Clarcel and then concentrated under PR. The crude is purified by chromatography on silica gel using as eluent a DCM / methanol 99/1 to 90/10. Compound 28 is obtained as a colorless oil (43 mg, 64%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-de): 1, 25 (s, 6H); 1.39 (s, 9H); 2.32 (s, 3H); 2.39 (s, 3H); 2.54 (m, 2H); 2.61 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 2.80 (bs, 3H); 3.42 to 3.54 (m, 14H). LCMS (A2) ES m / z = 455 [M + H] + ; t R = 0.77 min.
Composé 29 : Méthyl-(2-{2-[2-(2-méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-(2-méthyl-2-méthyl- disulfanyl-propyl)-amine Compound 29: Methyl- (2- {2- [2- (2-methylamino-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethyl) - (2-methyl-2-methyl-disulfanyl-propyl) -amine
A une solution de 43 mg (95 μmol) du composé 28 dans 1 ,5 ml de DCM sont ajoutés 351 μl de TFA. L'agitation est poursuivie 5 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 29 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (25 mg, 75%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,75 (m étalé, 1 H) ; 2,27 (s, 3 H) ; 2,32 (s, 3 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,53 (m, 2 H) ; 2,57 à 2,64 (m, 4 H) ; 3,44 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,46 à 3,55 (m, 10 H). LCMS (A2) : ES m/z = 355 [M + H]+ ; tR = 0,30 min. To a solution of 43 mg (95 μmol) of compound 28 in 1.5 ml of DCM are added 351 μl of TFA. Stirring is continued for 5 h at RT and then the mixture is concentrated to dryness. The crude is purified by SPE filtration on a SCX cartridge (Varian) conditioned and washed with methanol and then eluted with a 0.5 N ammonia solution in methanol. Compound 29 is obtained as a colorless oil (25 mg, 75%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 1.25 (s, 6H); 1.75 (m spread, 1H); 2.27 (s, 3H); 2.32 (s, 3H); 2.39 (s, 3H); 2.53 (m, 2H); 2.57 to 2.64 (m, 4H); 3.44 (t, J = 5.7 Hz, 2H); 3.46 to 3.55 (m, 10H). LCMS (A2) ES m / z = 355 [M + H] + ; t R = 0.30 min.
Composé 30 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl]amino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone Compound 30: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4- [4 - ({2- [2- (2- {2-methyl- [2-methyl-2-methyldisulfanyl-propyl] amino-ethoxy} -ethoxy) -ethoxy] -ethyl} methylamino) -methyl ] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
A une solution, purgée à l'argon, de 15,3 mg (21 ,3 μmol) de composé 2 dans 1 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 18,6 μl (106,6 μmol) de DIPEA et une solution de 22,7 mg (64 μmol) du composé 29 dans 1 ml d'acétonitrile anhydre. L'agitation est poursuivie 24 h sous Ar à 40°C. Après retour à TA, le mélange est dilué avec 7 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (2 x 3 ml), une solution saturée de NaHCOs (3 ml), une solution saturée de NaCl (3 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 90/10. Le composé 30 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (14,6 mg, 66%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 0,76 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,31 (s, 3 H) ; 2,38 (s, 3 H) ; 2,45 à 2,54 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,60 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,63 à 2,75 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,44 à 3,54 (m, 14 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,9 et 8,3 et 11 ,7 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 , 5 et 5,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,5 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,5 et 1 1 ,5 et 15,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,27 à 7,33 (m, 3 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1035 [M + H]+ ; m/z = 518 [M + 2H]2+ pic de base ; tR = 0,86 min. To a solution, purged with argon, of 15.3 mg (21, 3 μmol) of compound 2 in 1 ml of acetonitrile anhydrous are successively added 18.6 μl (106.6 μmol) of DIPEA and a solution of 22.7 mg (64 μmol) of compound 29 in 1 ml of anhydrous acetonitrile. Stirring is continued for 24 h under Ar at 40 ° C. After returning to RT, the mixture is diluted with 7 ml of AcOEt, washed with water (2 x 3 ml), saturated NaHCO 3 solution (3 ml), saturated NaCl solution (3 ml) and dried. on MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel using a 90/10 DCM / methanol mixture as eluent. Compound 30 is obtained as a colorless solid (14.6 mg, 66%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.76 (d, J = 6.1 Hz, 3H); 0.76 (d, J = 6.1 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1, 04 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1, 24 (s, 6H); 1.29 (m, 1H); 1.50 to 1.62 (m, 2H); 1.81 (m, 1H); 2.15 (s, 3H); 2.27 (m, 1H); 2.31 (s, 3H); 2.38 (s, 3H); 2.45 to 2.54 (partially masked m, 4H); 2.60 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 2.63 to 2.75 (m, 2H); 2.92 to 3.06 (m, 3H); 3.25 to 3.35 (partially masked m, 1H); 3.44 to 3.54 (m, 14H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.9 and 8.3 and 11.7 Hz, 1H); 4.91 (dd, J = 3.4 and 9.8 Hz, 1H); 5.11 (ddd, J = 1.5 and 5.7 and 11.5 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 1.5 and 15.5 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.5 and 1, 5 and 15.5 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.0 and 8.8 Hz, 1H); 7.20 to 7.26 (m, 3H); 7.27 to 7.33 (m, 3H); 8.35 (d, J = 8.3 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 1035 [M + H] + ; m / z = 518 [M + 2H] 2+ base peak; t R = 0.86 min.
Exemple 6 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-méthyl-propyl]amino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone Example 6: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4- [4 - ({2- [2- (2- {2-methyl- [2-mercapto-2-methyl-propyl] amino-ethoxy} -ethoxy) -ethoxy] -ethyl} methylamino) methyl ] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
A une solution de 10,9 mg (10,5 μmol) du composé 30 dans 1 ,24 ml d'éthanol est ajoutée une solution de 12,06 mg (42,1 μmol) de TCEP dans 1 ,04 ml d'eau. L'agitation est poursuivie 4 h à TA. Le mélange est dilué avec 6 ml d'AcOEt, lavé avec un mélange 1/1 eau/NH4Clsat (6 ml), une solution saturée de NaCl (6 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utlisant un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le composé Ex6 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (7,36 mg, 71 %). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,34 (s, 3 H) ; 2,44 (s, 2 H) ; 2,51 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,60 (s, 1 H) ; 2,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,66 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,37 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,45 à 3,55 (m, 14 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,6 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,27 à 7,32 (m, 3 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 989 [M + H]+ ; m/z = 495 [M + 2H]2+ pic de base ; tR = 3,24 min. To a solution of 10.9 mg (10.5 μmol) of compound 30 in 1.24 ml of ethanol is added a solution of 12.06 mg (42.1 μmol) of TCEP in 1.04 ml of water. . Stirring is continued for 4 h at RT. The mixture is diluted with 6 ml of AcOEt, washed with 1/1 water / sat. NH 4 Cl (6 ml), saturated NaCl solution (6 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel using a DCM / methanol 99/1 to 90/10. The compound Ex6 is obtained in the form of a white solid (7.36 mg, 71%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.76 (d, J = 5.9 Hz, 3H); 0.78 (d, J = 5.9 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1, 04 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.25 (s, 6H); 1.28 (m, 1H); 1.51 to 1.62 (m, 2H); 1.80 (m, 1H); 2.15 (s, 3H); 2.27 (m, 1H); 2.34 (s, 3H); 2.44 (s, 2H); 2.51 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 2.60 (s, 1H); 2.63 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 2.66 to 2.74 (m, 2H); 2.93 to 3.04 (m, 3H); 3.25 to 3.37 (partially masked m, 1H); 3.45 to 3.55 (m, 14H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 1.5 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.7 and 8.0 and 11.5 Hz, 1H); 4.91 (dd, J = 3.4 and 9.8 Hz, 1H); 5.11 (ddd, J = 1.5 and 5.6 and 11.5 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 1.5 and 15.2 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.9 and 11, 5 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.8 Hz, 1H); 7.20 to 7.26 (m, 3H); 7.27-7.32 (m, 3H); 8.35 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A1): ES m / z = 989 [M + H] + ; m / z = 495 [M + 2H] 2+ base peak; t R = 3.24 min.
Exemple 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1 -((2R,3R)- 3-{4-[4-({2-[2-(2-{4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylamino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone Example 7: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4- [4 - ({2- [2- (2- {4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoylamino-ethoxy} -ethoxy) -ethoxy] -ethyl} methylamino) -methyl] -phenyl} -oxiranyl) ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
H H
.-CL /N^ I ^) O^ O„ HN^ .-CL / N ^ I ^ ) O ^ O "HN ^
HS O  HS O
y N N O  y N N O
/ H / H
Composé 31 : Méthyl-[2-(2-{2-[2-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylamino)-éthoxy]-éthoxy}- éthoxy)-éthyl]-carbamate de tert-butyle Compound 31: tert-Butyl methyl- [2- (2- {2- [2- (4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoylamino) -ethoxy] -ethoxy} ethoxy) -ethyl] -carbamate
270 mg (649 μmol) du composé 4, 199 mg (649 μmol) du composé 26 sont dissous dans 1 ,5 ml de DMF puis 100 μl (714 μmol) de TEA sont ajoutés au mélange. L'agitation est poursuivie 16 h à TA. Le mélange est dilué avec 10 ml d'AcOEt, lavé avec de l'eau (2x5 ml), une solution saturée de NaCl (5 ml) et séché sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 31 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (251 mg, 80%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,39 (s, 9 H) ; 1 ,79 (m, 2 H) ; 2,16 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,18 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,54 (m, 12 H) ; 7,88 (t large, J=5,9 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + H]+ ; m/z = 505 [M + Na]+ ; m/z = 527 [M - H + HCO2H]- ; tR = 1 ,04 min. 270 mg (649 μmol) of compound 4, 199 mg (649 μmol) of compound 26 are dissolved in 1.5 ml of DMF and then 100 μl (714 μmol) of TEA are added to the mixture. Stirring is continued for 16 hours at RT. The mixture is diluted with 10 ml of AcOEt, washed with water (2 × 5 ml), saturated NaCl solution (5 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel using a DCM / methanol mixture 98/2 to 90/10 as eluent. Compound 31 is obtained as a colorless oil (251 mg, 80%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1.24 (s, 6H); 1.39 (s, 9H); 1.79 (m, 2H); 2.16 (m, 2H); 2.40 (s, 3H); 2.80 (bs, 3H); 3.18 (q, J = 5.9 Hz, 2H); 3.39 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.45 to 3.54 (m, 12H); 7.88 (broad t, J = 5.9 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 483 [M + H] + ; m / z = 505 [M + Na] + ; m / z = 527 [M-H + HCO 2 H] -; t R = 1.04 min.
Composé 32 : N-(2-{2-[2-(2-Méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-4-méthyl-4-méthyl- disulfanyl-pentamide O 31 O 32 ° Compound 32: N- (2- {2- [2- (2-Methylamino-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethyl) -4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentamide O 31 O 32 °
A une solution de 251 mg (520 μmol) du composé 31 dans 8 ml de DCM sont ajoutés 1 ,93 ml (26 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie 3 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut est dissout dans le minimum de DCM puis plusieurs entraînements au toluène sont réalisés. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 32 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (159 mg, 80%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-Cy6): 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,79 (m, 2 H) ; 2,15 (m, 2 H) ; 2,27 (s, 3 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 2,58 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,18 (q, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,44 (t, J=5,7 Hz, 2 H) ; 3,47 à 3,54 (m, 8 H) ; 7,89 (t large, J=5,7 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 383 [M + H]+ ; tR = 2,68 min. Exemple 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3- {4-[4-({2-[2-(2-{4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoylamino-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone To a solution of 251 mg (520 μmol) of compound 31 in 8 ml of DCM is added 1.93 ml (26 mmol) of TFA. Stirring is continued for 3 h at RT and the mixture is concentrated to dryness. The crude is dissolved in the minimum of DCM and several toluene drives are carried out. The crude is purified by SPE filtration on a SCX cartridge (Varian) conditioned and washed with methanol and then eluted with a 0.5 N ammonia solution in methanol. Compound 32 is obtained as a colorless oil (159 mg, 80%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-Cy 6 ): 1.24 (s, 6H); 1.79 (m, 2H); 2.15 (m, 2H); 2.27 (s, 3H); 2.40 (s, 3H); 2.58 (t, J = 5.7 Hz, 2H); 3.18 (q, J = 5.7 Hz, 2H); 3.39 (t, J = 5.7 Hz, 2H); 3.44 (t, J = 5.7 Hz, 2H); 3.47 to 3.54 (m, 8H); 7.89 (broad t, J = 5.7 Hz, 1H). LCMS (A1) ES m / z = 383 [M + H] + ; t R = 2.68 min. Example 7: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3 - {4- [4 - ({2- [2- (2- {4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoylamino-ethoxy} -ethoxy) -ethoxy] -ethyl} methylamino) -methyl] -phenyl} -oxiranyl) ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
L'exemple 7 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 32 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30 puis par réduction du disulfure en appliquant la méthode décrite pour la préparation de l'exemple 6.  Example 7 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with amine 32 by applying the method described for the preparation of compound 30 and then by reduction of the disulfide by applying the method described for the preparation of Example 6 .
Exemple 8 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-{(S)-1 -[(2R,3R)- 3-(4-mercaptométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza- cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tétraone Example 8: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - {(S) -1 - [(2R, 3R) - 3 (4-Mercaptomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl} -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Composé 33 : dimère de l'exemple 8 Compound 33: dimer of Example 8
Le composé 2 (24,5 mg ; 34,1 μmol) est placé en solution dans le THF anhydre (2,5 ml) et le mélange est refroidi à -10°C avant ajout d'hexaméthyldisilathiane (44,3 μmol) puis d'une solution de fluorure de tétrabutylammonium 1 M dans le THF (40,9 μmol). Le mélange est ramené à TA et l'agitation est poursuivie 1 h30. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (5 ml) et la phase organique est lavée par une solution aq. saturée de NH4CI (5 ml). La phase aq. est extraite par de TAcOEt (2x5 ml). Les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl (5 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 97/3. Un solide blanc, le composé 33, est obtenu (19 mg ; 78%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 0,78 (m, 12 H) ; 1 ,00 (s, 6 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 6 H) ; 1 ,11 (s, 6 H) ; 1 ,30 (m, 2 H) ; 1 ,49 - 1 ,63 (m, 4 H) ; 1 ,82 (m, 2 H) ; 2,26 (m, 2 H) ; 2,63 - 2,72 (m, 4 H) ; 2,93 - 3,05 (m, 6 H) ; 3,25 - 3,37 (m partiellement masqué, 2 H) ; 3,81 (s, 6 H) ; 3,82 (s, 4 H) ; 3,89 (d, J=2,0 Hz, 2 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7, 8,0 et 1 1 ,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7, 9,6 Hz, 2 H) ; 5,10 (ddd, J=1 ,3, 5,3 et 10,8 Hz, 2 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,3, 15,3 Hz, 2 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7, 10,8 et 15,3 Hz, 2 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 7,17 (dd, J=2,0, 8,6 Hz, 2 H) ; 7,22 (dd, J=2,5, 9,3 Hz, 2 H) ; 7,26 - 7,32 (m, 10 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1427 [M + H]+ ; tR = 1 ,31 min. Compound 2 (24.5 mg, 34.1 μmol) is placed in solution in anhydrous THF (2.5 ml) and the mixture is cooled to -10 ° C. before adding hexamethyldisilathiane (44.3 μmol) and then a solution of 1M tetrabutylammonium fluoride in THF (40.9 μmol). The mixture is brought back to AT and the stirring is continued for 1 hour 30 minutes. The mixture is diluted by adding AcOEt (5 ml) and the organic phase is washed with aq solution. saturated with NH 4 Cl (5 ml). The phase aq. is extracted with TAcOEt (2x5 ml). The organic phases are combined, washed with an aq solution. saturated with NaCl (5 ml). After drying over MgSO 4 and filtration, the solvents are evaporated under RP. The crude of the reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 100/0 to 97/3 mixture. A white solid, compound 33, is obtained (19 mg, 78%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-de): 0.78 (m, 12H); 1.00 (s, 6H); 1, 04 (d, J = 6.8 Hz, 6H); 1, 11 (s, 6H); 1.30 (m, 2H); 1, 49-1.63 (m, 4H); 1.82 (m, 2H); 2.26 (m, 2H); 2.63 - 2.72 (m, 4H); 2.93 - 3.05 (m, 6H); 3.25 - 3.37 (partially masked m, 2H); 3.81 (s, 6H); 3.82 (s, 4H); 3.89 (d, J = 2.0 Hz, 2H); 4.25 (ddd, J = 3.7, 8.0 and 11.5 Hz, 2H); 4.91 (dd, J = 3.7, 9.6 Hz, 2H); 5.10 (ddd, J = 1, 3, 5.3 and 10.8 Hz, 2H); 5.79 (dd, J = 1, 3, 15.3 Hz, 2H); 6.47 (ddd, J = 3.7, 10.8 and 15.3 Hz, 2H); 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 2H); 7.17 (dd, J = 2.0, 8.6 Hz, 2H); 7.22 (dd, J = 2.5, 9.3 Hz, 2H); 7.26 - 7.32 (m, 10H); 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H). LCMS (A2) ES m / z = 1427 [M + H] + ; t R = 1, 31 min.
Exemple 8 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3- (4-mercaptométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13- ène-2,5,9,12-tétraone Example 8: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - {(S) -1 - [(2R, 3R) -3 (4-Mercaptomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl} -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le composé 33 (11 mg ; 7,7 μmol) est placé en solution dans le méthanol (8,8 ml). Le TCEP (76,7 μmol) en solution dans 2,2 ml d'eau est ensuite additionné et le mélange est agité 2 h à TA. Le mélange est dilué dans 20 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (20 ml). La phase aq. est extraite par de l'AcOEt (2x15 ml). Les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl (15 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Un solide blanc, Ex8, est obtenu (4,7 mg ; 31 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 0,79 (d, J=6,4 Hz, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,50 - 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,62 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,84 (t large, J=6,5 Hz, 1 H) ; 2,93 - 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,73 (d large, J=6,5 Hz, 2 H) ; 3,81 (s., 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7, 8,0 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,6, 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,3, 5,3 et 1 1 ,4 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,3, 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,4, 11 ,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9, 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,3, 9,5 Hz, 1 H) ; 7,25 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 2 H) ; 7,35 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 715 [M + H]+ ; m/z = 713 [M - H]-; tR = 1 ,18 min. Exemple 9 : hu2H11 -SPDB-ExI Compound 33 (11 mg, 7.7 μmol) is placed in solution in methanol (8.8 ml). The TCEP (76.7 μmol) dissolved in 2.2 ml of water is then added and the mixture is stirred for 2 hours at RT. The mixture is diluted in 20 ml of AcOEt and the organic phase is washed with a 1/1 mixture of water and an aq solution. saturated with NH 4 Cl (20 ml). The phase aq. is extracted with AcOEt (2x15 ml). The organic phases are combined, washed with an aq solution. saturated with NaCl (15 ml). After drying over MgSO 4 and filtration, the solvents are evaporated under RP. The crude of the reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 95/5. A white solid, Ex8, is obtained (4.7 mg, 31%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 0.79 (d, J = 6.4 Hz, 6H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.30 (m, 1H); 1.50 - 1.63 (m, 2H); 1.80 (m, 1H); 2.27 (m, 1H); 2.62 - 2.75 (m, 2H); 2.84 (broad t, J = 6.5 Hz, 1H); 2.93 - 3.06 (m, 3H); 3.34 (partially masked m, 1H); 3.73 (d, J = 6.5 Hz, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.7, 8.0 and 11.4 Hz, 1H); 4.91 (dd, J = 3.6, 9.6 Hz, 1H); 5.11 (ddd, J = 1, 3, 5.3 and 11.4 Hz, 1H); 5.79 (dd, J = 1, 3, 15.2 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.4, 11, 3 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 1, 9, 8.5 Hz, 1H); 7.22 (dd, J = 2.3, 9.5 Hz, 1H); 7.25 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 7.28 (d, J = 1.9 Hz, 2H); 7.35 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H). LCMS (A2) ES m / z = 715 [M + H] + ; m / z = 713 [M-H] -; t R = 1, 18 min. Example 9: hu2H11 -SPDB-ExI
Selon la méthode générale en deux étapes, 10,4 mg (0,071 μmol, 1 ,174 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 8,86 mg/ml sont traités par 7 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,16 mg, 0,496 μmol) en solution dans 34,2 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 8 mg/ml dans le mélange. Après purification, on obtient 2,2 ml d'anticorps hu2H11 modifiés à une concentration de 4,28 mg/ml (9,42 mg, 91 %) avec en moyenne 4,68 molécules de pyridyldisulfures par anticorps. 1 ,68 ml (7,2 mg, 0,049 μmol) d'anticorps hu2H11 modifié sont traités avec 1 ,03 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4- mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4- dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone (composé Ex1 , 1 ,148 μmol) en solution dans 101 ,2 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 10% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCl. On obtient alors 1 ,5 ml de conjugué Ex9 à une concentration de 1 ,1 mg/ml avec en moyenne 3 dérivés de cryptophycine par anticorps (HRMS) et une pureté monomérique de 99,9%. Exemple 10 : hu2H11-SPDB-Ex2 According to the general two-step method, 10.4 mg (0.071 μmol, 1. 174 ml) of naked antibody hu2H11 at an initial concentration of 8.86 mg / ml are treated with 7 eq. N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic acid (0.16 mg, 0.496 μmol) dissolved in 34.2 μl of DMA so that the final concentration of antibodies is 8 mg / ml in the mixture. After purification, 2.2 ml of modified hu2H11 antibodies are obtained at a concentration of 4.28 mg / ml (9.42 mg, 91%) with an average of 4.68 molecules of pyridyldisulfides per antibody. 1.68 ml (7.2 mg, 0.049 μmol) of modified hu2H11 antibody are treated with 1.03 mg of (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3- {4 [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone (compound Ex1, 1, 148 μmol) dissolved in 101.2 μl of DMA. After purification on Superdex in the presence of 10% NMP and concentration on Amicon Ultra-15, the final buffer change is carried out in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M phosphate and 0.14 M NaCl. 1.5 ml of Ex9 conjugate are then obtained at a concentration of 1.1 mg / ml with an average of 3 cryptophycin derivatives per antibody (HRMS) and a monomeric purity of 99.9%. Example 10: hu2H11-SPDB-Ex2
Selon la méthode générale en une étape, 13,5 mg (0,092 μmol, 1 ,318 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,18 mg, 0,551 μmol) en solution dans 38,4 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2 h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,333 ml (12,0 mg, 0,081 μmol) du mélange d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,760 ml de tampon pH≈7,5-8, 543 μl de DMA puis 1 ,73 mg de (E)-(3S,6R,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl- 16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-6-méthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone (composé Ex2, 1 ,958 μmol) en solution dans 182 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 1 ,5 ml de conjugué Ex10 à une concentration de 2,83 mg/ml avec en moyenne 3,7 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 98,8%.  According to the one-step general method, 13.5 mg (0.092 μmol, 1.318 ml) of naked antibody hu2H11 at an initial concentration of 10.24 mg / ml are treated with 6 eq. N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic acid (0.18 mg, 0.551 μmol) in solution in 38.4 μl of DMA so that the final antibody concentration is 9 mg / ml in the mixture. After stirring for 2 h at approximately 2000 rpm at RT, 1.333 ml (12.0 mg, 0.081 μmol) of the modified antibody mixture hu2H1 1 are successively added to 1. 760 ml of buffer pH≈7.5. 8, 543 μl of DMA then 1.73 mg of (E) - (3S, 6R, 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl- [- (S) -1 - ((2R, 3R) -3- {4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} oxiranyl) -ethyl] -6-methyl 1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone (compound Ex2, 1,958 μmol) dissolved in 182 μl of DMA. After purification on Superdex in the presence of 20% NMP and concentration on Amicon Ultra-15, the final buffer change is carried out in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M of histidine, 10% of sucrose (w). / v) and 5% NMP (v / v). 1.5 ml of Ex10 conjugate are then obtained at a concentration of 2.83 mg / ml with an average of 3.7 cryptophycin derivatives per antibody and a monomeric purity of 98.8%.
Exemple 11 : hu2H11-SPDB-Ex5 Example 11: hu2H11-SPDB-Ex5
Selon la méthode générale en une étape, 9,45 mg (0,064 μmol, 0,923 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,13 mg, 0,398 μmol) en solution dans 26,88 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,0 ml (9,0 mg, 0,061 μmol) du milieu réactionnel d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,45 ml de tampon pH≈ 7,5-8, 265 μl de DMA puis 1 ,26 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3- isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}- oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone (composé Ex5, 1 ,472 μmol) en solution dans 285 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 2,5 ml de conjugué Ex12 à une concentration de 1 ,70 mg/ml avec en moyenne 3,7 / 3,1 dérivés de cryptophycine (UV / HRMS) par anticorps et une pureté monomérique de 98,0%. According to the one-step general method, 9.45 mg (0.064 μmol, 0.923 ml) of naked antibody hu2H11 at an initial concentration of 10.24 mg / ml are treated with 6 eq. N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic acid (0.13 mg, 0.398 μmol) in solution in 26.88 μl of DMA so that the final antibody concentration is 9 mg / ml in the mixture. After stirring for 2 h at approximately 2000 rpm at RT, are successively added to 1.0 ml. (9.0 mg, 0.061 μmol) of the modified hu2H1 1 antibody reaction medium, 45 ml of buffer pH≈ 7.5-8, 265 μl of DMA and then 1.26 mg of (E) - (3S, 10R 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3- {4- [4- (2-mercapto 2-methyl-propyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl) oxiranyl) ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2 5,9,12-tetraone (compound Ex5, 1, 472 μmol) in solution in 285 μl of DMA. After purification on Superdex in the presence of 20% NMP and concentration on Amicon Ultra-15, the final buffer change is carried out in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M of histidine, 10% of sucrose (w). / v) and 5% NMP (v / v). 2.5 ml of Ex12 conjugate are then obtained at a concentration of 1.70 mg / ml with an average of 3.7 / 3.1 cryptophycin derivatives (UV / HRMS) per antibody and a monomeric purity of 98.0%.
Exemple 12 : hu2H11-SPDB-Ex6 Example 12: hu2H11-SPDB-Ex6
Selon la méthode générale en une étape, 10,31 mg (0,070 μmol, 1 ,006 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 10,24 mg/ml sont traités par 6 éq. de l'ester N-hydroxy- succinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,14 mg, 0,429 μmol) en solution dans 29,32 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 9 mg/ml dans le mélange. Après 2 h d'agitation à environ 2000 rpm à TA, sont successivement ajoutés à 1 ,1 ml (9,9 mg, 0,067 μmol) du mélange d'anticorps hu2H1 1 modifié 1 ,595 ml de tampon pH≈ 7,5-8, 291 μl de DMA puis 1 ,60 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16- [(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-({2-[2-(2-{2-méthyl-[2-mercapto-2-méthyl-propyl]amino-éthoxy} -éthoxy)- éthoxy]-éthyl}méthylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza- cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone (composé Ex6, 1 ,617 μmol) en solution dans 314 μl de DMA. Après purification sur Superdex en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15, le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 3 ml de conjugué Ex12 à une concentration de 1 ,97 mg/ml avec en moyenne 3,4 dérivés de cryptophycine par anticorps (HRMS) et une pureté monomérique de 99,8%. Exemple 13 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}- éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1 -yl)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1 -yle Composé 34 : 4-Méthoxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle According to the general one-step method, 10.31 mg (0.070 μmol, 1.00 ml) of naked antibody hu2H11 at an initial concentration of 10.24 mg / ml are treated with 6 eq. N-hydroxy-succinimidyl ester of 4- (2-pyridyldithio) butanoic acid (0.14 mg, 0.429 μmol) dissolved in 29.32 μl of DMA so that the final concentration of antibodies is 9 mg / ml in the mixture. After stirring for 2 h at approximately 2000 rpm at RT, 1.15 ml (9.9 mg, 0.067 μmol) of the modified hu2H1 1 antibody mixture are successively added to 1. 595 ml of pH 7.5 buffer. 8, 291 μl of DMA then 1.60 mg of (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-16- [(S) -1 - ((2R, 3R) -3- {4- [4 - ({2- [2- (2- {2-methyl- [2-mercapto-2-methyl-propyl] amino-ethoxy} -ethoxy) - ethoxy] ethyl] methylamino) methyl] phenyl) oxiranyl) ethyl] -6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9, 12-tetraone (compound Ex6, 1, 617 μmol) in solution in 314 .mu.l of DMA. After purification on Superdex in the presence of 20% NMP and concentration on Amicon Ultra-15, the final buffer change is carried out in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M of histidine, 10% of sucrose (w). / v) and 5% NMP (v / v). 3 ml of Ex12 conjugate are then obtained at a concentration of 1.97 mg / ml with an average of 3.4 cryptophycin derivatives per antibody (HRMS) and a monomeric purity of 99.8%. Example 13: (4- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl} ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl} -piperazin-1-yl) -acetate Tert-Butyl 34: 4-Methoxycarbonylmethyl-piperazine-1-carboxylate compound
200 mg (1 ,07 mmol) de pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle sont placés en solution dans l'acétonitrile anhydre (10 ml). La TEA (1 ,07 mmol) puis le bromoacétate de méthyle (1 ,61 mmol) sont ensuite ajoutés. La suspension blanche est agitée 48 h à TA avant ajout d'une solution aq. saturée de NaHCOs (10 ml). La phase aq. est extraite par du DCM (3x10 ml), les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aq. saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit brut est obtenu. Ce brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le produit attendu 34, une huile incolore est alors obtenu (174,8 mg ; 63%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,66 ; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,40 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,28 à 3,33 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,61 (s, 3 H). 200 mg (1.07 mmol) of tert-butyl piperazine-1-carboxylate are placed in solution in anhydrous acetonitrile (10 ml). TEA (1.07 mmol) and then methyl bromoacetate (1.61 mmol) are then added. The white suspension is stirred for 48 h at RT before adding aq solution. saturated with NaHCOs (10 ml). The phase aq. is extracted with DCM (3x10 ml), the organic phases are combined, washed with aq solution. saturated with NaCl and dried over MgSO 4 . After filtration and evaporation of the solvents under PR, the crude product is obtained. This crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a 98/2 DCM / methanol mixture. The expected product 34, a colorless oil is then obtained (174.8 mg, 63%). TLC (DCM 90 / MeOH 10): Rf = 0.66; 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ): 1.39 (s, 9H); 2.40 to 2.48 (m, 4H); 3.25 (s, 2H); 3.28 to 3.33 (partially masked m, 4H); 3.61 (s, 3H).
Composé 35 : Chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle Compound 35: Piperazin-1-yl-methyl acetate hydrochloride
Le composé 34 (174 mg ; 0,67 mmol) est placé en solution dans le dioxane anhydre (5 ml) et une solution HCl 4 M dans le dioxane (0,02 mmol) est ajoutée. Le mélange est agité 5 h à TA puis la suspension est filtrée sur verre fritte. Le solide ainsi obtenu est lavé par du dioxane (2 ml) puis par de l'éther isopropylique (2 ml) avant d'être séché sous vide. Un solide beige, 35, est obtenu (131 mg ; 100%). RMN 1H (300 MHz, DMSO-cfe): 2,88 à 2,97 (m, 4 H) ; 3,09 à 3,19 (m, 4 H) ; 3,53 à 3,59 (m, 2 H) ; 3,65 (s, 3 H) ; 8,65 à 9,22 (m étalé, 2 H). Compound 34 (174 mg, 0.67 mmol) is placed in solution in anhydrous dioxane (5 ml) and a solution of 4 M HCl in dioxane (0.02 mmol) is added. The mixture is stirred for 5 h at RT and the suspension is filtered on sintered glass. The solid thus obtained is washed with dioxane (2 ml) and then with isopropyl ether (2 ml) before being dried under vacuum. A beige solid, 35, is obtained (131 mg, 100%). 1 H NMR (300 MHz, DMSO-cfe): 2.88 to 2.97 (m, 4H); 3.09 to 3.19 (m, 4H); 3.53 to 3.59 (m, 2H); 3.65 (s, 3H); 8.65 to 9.22 (m spread, 2H).
Composé 36 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate de méthyle Compound 36: (4- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl} -ethyl) oxiranyl] Methyl benzyl} -piperazin-1-yl) -acetate
Le dérivé 1 (20 mg ; 28,6 μmol) est placé en solution dans le DCM anhydre (1 ml) et la TEA (71 ,5 μmol) puis le CMS (45,8 μmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2 formé n'est pas isolé. La TEA (85,7 μmol) puis le chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle 35 (42.8 μmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant que du DMF anhydre (1 ml) et NaI (30 μmol) ne soient ajoutés. Le mélange est agité 48 h à 45°C avant d'être dilué par de TAcOEt (5 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (2 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (2 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 98/2. Le composé 36 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (8,2 mg ; 34%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,45 ; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 0,77 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,27 à 1 ,32 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,74 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,30 (m, 1 H) ; 2,37 (s large, 4 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,18 à 3,52 (m, partiellement masqué, 9 H) ; 3,60 (s, 3 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,31 (m, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,8 et 9,9 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 839 [M + H]+ ; m/z = 420 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 837 [M - H]" ; m/z = 883 [M + HCO2H - H] " (pic de base) ; tR = 3,57 min. The derivative 1 (20 mg, 28.6 μmol) is placed in solution in anhydrous DCM (1 ml) and the TEA (71.5 μmol) and then the CMS (45.8 μmol) are added. After 12 h at RT, the product 2 formed is not isolated. The TEA (85.7 μmol) then the piperazin-1-yl-methyl acetate hydrochloride (42.8 μmol) are added. The mixture is stirred an additional 72 hours at RT before anhydrous DMF (1 ml) and NaI (30 μmol) are added. The mixture was stirred 48 h at 45 ° C before being diluted with TAcOEt (5 mL). The organic phase is washed with water (2 × 2 ml), with aq solution. saturated with NaHCO 3 (2 ml) and with aq solution. saturated with NaCl (2 ml). After drying on MgSO 4 and filtration, the solvents are evaporated under PR. The crude reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 100/0 to 98/2. Compound 36 is obtained as a white solid (8.2 mg, 34%). TLC (DCM 90 / MeOH 10): Rf = 0.45; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 0.77 (d, J = 6.1 Hz, 3H); 0.78 (d, J = 6.1 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 7.1 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1, 27 to 1, 32 (m, 1H); 1.50-1.60 (m, 2H); 1.74 to 1.84 (m, 1H); 2.21 to 2.30 (m, 1H); 2.37 (brs, 4H); 2.64 to 2.74 (m, 2H); 2.94 to 3.06 (m, 3H); 3.18 to 3.52 (m, partially masked, 9H); 3.60 (s, 3H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 4.20 to 4.31 (m, 1H); 4.91 (dd, J = 3.8 and 9.9 Hz, 1H); 5.11 (m, 1H); 5.80 (d, J = 15.2 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 3.8 and 1 1, 2 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.3 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.3 Hz, 1H); 7.20 to 7.33 (m, 6H); 8.34 (d, J = 8.1 Hz, 1H). LCMS (A1) ES m / z = 839 [M + H] + ; m / z = 420 [M + 2H] 2+ (base peak); m / z = 837 [M - H] ', m / z = 883 [M + HCO2H - H] "(base peak); t R = 3.57 min.
Composé 37 : Bromoacétate d'allyle Compound 37: Allyl bromoacetate
288 mg (4,95 mmol) d'alcool allylique sont mis en solution dans 25 ml de DCM. La solution est refroidie à 0°C puis 760 μl (5,45 mmol) de TEA et 3,03 mg (24,8 μmol) de DMAP sont ajoutés. Le mélange est agité à 0°C puis 1 ,0 g (4,95 mmol) de bromure de bromoacétyle sont ajoutés. La réaction est poursuivie pendant la nuit à TA. On ajoute de l'eau au mélange ; la phase aq. est lavée avec du DCM. Les fractions organiques sont rassemblées, lavées avec de l'eau et une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit 37 est obtenu (747 mg, 84%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 4,18 (s, 2 H) ; 4,64 (td, J=1 ,5 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,25 (qd, J=1 ,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,35 (qd, J=1 ,5 et 17,2 Hz, 1 H) ; 5,92 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,2 Hz, 1 H). 288 mg (4.95 mmol) of allyl alcohol are dissolved in 25 ml of DCM. The solution is cooled to 0 ° C. and then 760 μl (5.45 mmol) of TEA and 3.03 mg (24.8 μmol) of DMAP are added. The mixture was stirred at 0 ° C and then 1.0 g (4.95 mmol) bromoacetyl bromide was added. The reaction is continued overnight at RT. Water is added to the mixture; the phase aq. is washed with DCM. The organic fractions are combined, washed with water and saturated NaCl solution and dried over MgSO 4 . After filtration and evaporation of the solvents under PR, the product 37 is obtained (747 mg, 84%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 4.18 (s, 2H); 4.64 (td, J = 1.5 and 5.4 Hz, 2H); 5.25 (qd, J = 1.5 and 10.5 Hz, 1H); 5.35 (qd, J = 1.5 and 17.2 Hz, 1H); 5.92 (tdd, J = 5.4 and 10.5 and 17.2 Hz, 1H).
Composé 38 : 4-Allyloxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de fert-butyle Fert -butyl compound 38: 4-Allyloxycarbonylmethyl-piperazine-1-carboxylate
A une solution de 200 mg (1 ,07 mmol) de 1-Boc-pipérazine dans 8 ml d'acétonitrile sont ajoutés 150 μl (1 ,07 mmol) de TEA et 250 mg (1 ,40 mmol) de bromoacétate d'allyle 37. Le mélange est agité à TA pendant la nuit. La réaction est arrêtée par ajout d'une solution saturée de NaHCOs. Le mélange est extrait avec TAcOEt (3 fois) ; les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation du solvant sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le produit attendu 38 est obtenu sous la forme d'une huile jaune (314 mg ; 100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,45 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25 à 3,34 (m partiellement masqué, 6 H) ; 4,57 (td, J=1 ,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,22 (qd, J=1 ,5 et 10,3 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,5 et 17,1 Hz, 1 H) ; 5,83 à 5,98 (m, 1 H). LCMS (A2):ES m/z = 285 [M + H]+ ; m/z = 229 pic de base ; tR = 0,51 min. To a solution of 200 mg (1.07 mmol) of 1-Boc-piperazine in 8 ml of acetonitrile are added 150 μl (1.07 mmol) of TEA and 250 mg (1.40 mmol) of allyl bromoacetate. 37. The mixture is stirred at RT overnight. The reaction is stopped by adding a saturated solution of NaHCOs. The mixture is extracted with TAcOEt (3 times); the organic phases are combined, washed with saturated NaCl solution and dried over MgSO 4 . After filtration and evaporation of the solvent under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 100/0 to 95/5. The expected product 38 is obtained in the form of a yellow oil (314 mg, 100%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1.39 (s, 9H); 2.45 to 2.48 (m, 4H); 3.25 at 3.34 (partially masked m, 6H); 4.57 (td, J = 1.5 and 5.6 Hz, 2H); 5.22 (qd, J = 1.5 and 10.3 Hz, 1H); 5.30 (qd, J = 1.5 and 17.1 Hz, 1H); 5.83 to 5.98 (m, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 285 [M + H] + ; m / z = 229 base peak; t R = 0.51 min.
Composé 39 : Chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate d'allyle Compound 39: Piperazin-1-yl-allyl acetate hydrochloride
314 mg (1 ,10 mmol) du composé 38 sont dissous dans 12,6 ml de dioxane puis 5,5 ml (22,0 mmol) d'une solution HCl 4M dans le dioxane sont ajoutés. L'agitation est poursuivie pendant la nuit à TA. Le mélange est concentré à sec pour donner le composé attendu 39 sous la forme d'une huile jaune (260 mg ; 100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,79 à 2,88 (m, 4 H) ; 3,07 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,48 à 3,51 (m, 2 H) ; 4,60 (td, J=1 ,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,23 (qd, J=1 ,5 et 10,3 Hz, 1 H) ; 5,32 (qd, J=1 ,5 et 7,4 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,98 (m, 1 H) ; 8,74 (s large, 2 H). LCMS (A2): ES m/z = 185 [M + H]+ ; tR = 0, 19 min. Composé 40 (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate d'allyle 314 mg (1.10 mmol) of compound 38 are dissolved in 12.6 ml of dioxane and then 5.5 ml (22.0 mmol) of a 4M solution of HCl in dioxane are added. Stirring is continued overnight at RT. The mixture is concentrated to dryness to give the expected compound 39 as a yellow oil (260 mg, 100%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 2.79 to 2.88 (m, 4H); 3.07 to 3.15 (m, 4H); 3.48 to 3.51 (m, 2H); 4.60 (td, J = 1.5 and 5.6 Hz, 2H); 5.23 (qd, J = 1.5 and 10.3 Hz, 1H); 5.32 (qd, J = 1.5 and 7.4 Hz, 1H); 5.86 to 5.98 (m, 1H); 8.74 (s wide, 2H). LCMS (A2) ES m / z = 185 [M + H] + ; t R = 0, 19 min. Compound 40 (4- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] 3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl} -ethyl) oxiranyl] benzyl} -piperazin-1-yl) allyl acetate
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (28,3 mg, 39,5 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (2,5 ml) est ajoutée une solution du composé 39 (1 18,5 μmol) et de TEA (198 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ml). L'agitation est poursuivie 24 h à 40°C. Le mélange est dilué dans de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (10 ml), par une solution aq. saturée de NaHCO3 (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le composé 40 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,2 mg ; 56%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,75 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,25 à 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,74 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,27 (dt, J=11 ,3 et 14,2 Hz, 1 H) ; 2,32 à 2,42 (m, 4 H) ; 2,52 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,32 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 1 1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,56 (td, J=1 ,5 et 5,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,21 (qd, J=1 ,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=16,2 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,95 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,8 et 11 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 865 [M + H]+ ; m/z = 433,5 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 863 [M - H]" ; m/z = 909 [M + HCO2H - H]" ; tR = 0,92 min. To a solution, purged with argon, of compound 2 (28.3 mg, 39.5 μmol) in anhydrous acetonitrile (2.5 ml) is added a solution of compound 39 (1 18.5 μmol) and of TEA (198 μmol) in anhydrous acetonitrile (1 ml). Stirring is continued for 24 h at 40 ° C. The mixture is diluted in TAcOEt (10 ml). The organic phase is washed with water (10 ml), with aq solution. saturated with NaHCO 3 (10 ml) and with aq solution. saturated with NaCl (10 ml). After drying over MgSO 4 and filtration, the solvents are evaporated under RP. The crude of the reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a 98/2 DCM / methanol mixture. Compound 40 is obtained as a white solid (19.2 mg, 56%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.75 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 0.77 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.25 to 1.33 (m, 1H); 1.50 to 1.61 (m, 2H); 1.74 to 1.84 (m, 1H); 2.27 (dt, J = 11, 3 and 14.2 Hz, 1H); 2.32 to 2.42 (m, 4H); 2.52 (partially masked m, 4H); 2.64 to 2.74 (m, 2H); 2.94 to 3.05 (m, 3H); 3.25 (s, 2H); 3.32-3.35 (partially masked m, 1H); 3.40 to 3.48 (m, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.7 and 8.0 and 11.6 Hz, 1H); 4.56 (td, J = 1.5 and 5.5 Hz, 2H); 4.91 (dd, J = 3.7 and 9.7 Hz, 1H); 5.11 (m, 1H); 5.21 (qd, J = 1.5 and 10.5 Hz, 1H); 5.30 (qd, J = 1.5 and 17.3 Hz, 1H); 5.80 (d, J = 16.2 Hz, 1H); 5.86 to 5.95 (m, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.8 and 11, 2 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.19 to 7.32 (m, 6H); 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 865 [M + H] + ; m / z = 433.5 [M + 2H] 2+ (base peak); m / z = 863 [M - H] ', m / z = 909 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 0.92 min.
Composé 41 : Acide (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétique Compound 41: (4- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-chloro-4-methoxy] -acetate benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl} -ethyl) oxiranyl ] -benzyl} -piperazin-1-yl) -acetic acid
A une solution sous argon du composé 40 (12,8 mg, 14,8 μmol) dans le THF anhydre sont ajoutés le tétrakis(triphénylphospine)palladium (1 ,48 μmol) et la morpholine (148 μmol). Après 3 h de réaction, le mélange est concentré à sec et repris dans 5 ml de DCM. La phase organique est lavée par une solution de 1 ml HCl 0,1 N dans 3 ml d'eau (pH≈5), séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée pour donner le composé 41 (6,7 mg, 55%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,42 (d, J=6,6 Hz, 4 H) ; 2,58 à 2,76 (m, 6 H) ; 2,97 à 3,09 (m, 3 H) ; 3,14 (s large, 2 H) ; 3,33 (m masqué, 1 H) ; 3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,8 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,29 (m, 1 H) ; 4,89 à 4,93 (m, 1 H) ; 5,06 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,43 à 6,50 (m, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 825 [M + H]+ ; m/z = 413 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 823 [M - H]" ; tR = 0,86 min. To a solution under argon of compound 40 (12.8 mg, 14.8 μmol) in anhydrous THF are added tetrakis (triphenylphospine) palladium (1.48 μmol) and morpholine (148 μmol). After 3 hours of reaction, the mixture is concentrated to dryness and taken up in 5 ml of DCM. The organic phase is washed with a solution of 1 ml of 0.1 N HCl in 3 ml of water (pH≈5), dried over MgSO 4 , filtered and evaporated to give compound 41 (6.7 mg, 55%). . 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.76 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 0.78 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.28 (m, 1H); 1.52-1.59 (m, 2H); 1.76 to 1.84 (m, 1H); 2.21 to 2.32 (m, 1H); 2.42 (d, J = 6.6 Hz, 4H); 2.58 to 2.76 (m, 6H); 2.97 to 3.09 (m, 3H); 3.14 (bs, 2H); 3.33 (masked m, 1H); 3.46 (bs, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 1.8 Hz, 1H); 4.20 to 4.29 (m, 1H); 4.89 to 4.93 (m, 1H); 5.06 to 5.14 (m, 1H); 5.80 (d, J = 15.2 Hz, 1H); 6.43 to 6.50 (m, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.20-7.32 (m, 6H); 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 825 [M + H] + ; m / z = 413 [M + 2H] 2+ (base peak); m / z = 823 [M - H] "; R t = 0.86 min.
Exemple 13 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Example 13: (4- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl} -ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl} -piperazin-1-yl) -acetate
L'exemple 13 peut être obtenu en activant l'acide 41 selon la méthode décrite pour l'exemple 18.  Example 13 can be obtained by activating the acid 41 according to the method described for Example 18.
Exemple 14 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5- dioxo-pyrrolidin-1-yle Composé 42 : 3-(2-{2-[2-(2-tert-Butoxycarbonylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate d'allyle Example 14: (2- {2- [2- (2- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-yl} ethyl) oxiranyl] benzylamino} ethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate Compound 42: allyl 3- (2- {2- [2- (2-tert-butoxycarbonylamino-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoate
A une solution d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecanoïque (50 mg, 137 μmol) dans 1 ,25 ml de DCM sont successivement ajoutés le chlorhydrate d'EDCI (164,2 μmol), la DMAP (13,7 μmol) et l'alcool allylique (164,2 μmol). Le mélange est agité à TA pendant 16 h puis évaporé à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 42 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (37,5 mg ; 67%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,37 (s, 9 H) ; 2,57 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,44 à 3,53 (m, 12 H) ; 3,64 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,55 (td, J=1 ,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (qd, J=1 , 6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,90 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 6,70 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) ES m/z = 406 [M + H]+ ; m/z = 428 [M + Na]+ ; m/z = 306 pic de base ; tR = 0,91 min. Composé 43 : Chlorhydrate du 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle To a solution of Boc-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid (50 mg, 137 μmol) in 1.25 ml of DCM are successively added EDCI hydrochloride (164.2 μmol), DMAP (13.7 μmol) and allyl alcohol (164.2 μmol). The mixture is stirred at RT for 16 h and then evaporated to dryness. The crude product is purified by chromatography on silica gel, eluting with a 100/0 to 95/5 DCM / methanol mixture. Compound 42 is obtained as a colorless oil (37.5 mg, 67%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 1.37 (s, 9H); 2.57 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 3.06 (q, J = 6.1 Hz, 2H); 3.37 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 3.44 to 3.53 (m, 12H); 3.64 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 4.55 (td, J = 1, 6 and 5.4 Hz, 2H); 5.20 (qd, J = 1, 6 and 10.5 Hz, 1H); 5.30 (qd, J = 1, 6 and 17.3 Hz, 1H); 5.90 (tdd, J = 5.4 and 10.5 and 17.3 Hz, 1H); 6.70 (broad t, J = 6.1 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 406 [M + H] + ; m / z = 428 [M + Na] + ; m / z = 306 base peak; t R = 0.91 min. Compound 43: Allyl 3- (2- {2- [2- (2-amino-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoate hydrochloride
A une solution du composé 42 (37,5 mg, 92,5 μmol) dans 2 ml de dioxane sont ajoutés 460 μl (1 ,85 mmol) d'une solution d'acide chlorhydrique 4M dans le dioxane. L'agitation est poursuivie à TA pendant la nuit puis le milieu réactionnel est évaporé à sec pour donner le composé 43 sous la forme d'une huile incolore (31 mg, quantitatif). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,58 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,96 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,53 (m, 8 H) ; 3,55 à 3,58 (m, 4 H) ; 3,60 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,65 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,56 (td, J=1 ,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,21 (qd, J=1 ,6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1 ,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,91 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 7,91 (m étalé, 3 H). LCMS (A2) : ES m/z = 306 [M + H]+ ; tR = 0,42 min. To a solution of compound 42 (37.5 mg, 92.5 μmol) in 2 ml of dioxane are added 460 μl (1.85 mmol) of a solution of 4M hydrochloric acid in dioxane. Stirring is continued at RT overnight and the reaction medium is evaporated to dryness to give compound 43 in the form of a colorless oil (31 mg, quantitative). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 2.58 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 2.96 (t, J = 5.4 Hz, 2H); 3.48 to 3.53 (m, 8H); 3.55 to 3.58 (m, 4H); 3.60 (t, J = 5.4 Hz, 2H); 3.65 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 4.56 (td, J = 1, 6 and 5.4 Hz, 2H); 5.21 (qd, J = 1, 6 and 10.5 Hz, 1H); 5.30 (qd, J = 1, 6 and 17.3 Hz, 1H); 5.91 (tdd, J = 5.4 and 10.5 and 17.3 Hz, 1H); 7.91 (spread m, 3H). LCMS (A2) ES m / z = 306 [M + H] + ; t R = 0.42 min.
Composé 44 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl] -S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-i δ-ylJ-éthyl)- oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle Compound 44: (2- {2- [2- (2- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -S-isobutyl-δ.δ-dimethyl-δ-diethyl-tetraoxo-1-dioxa-δ-H-diaza-cyclohexadec-IS-en-δ-d Allyl ethyl (1-ethyl) oxiranyl] benzylamino} ethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (12,7 mg, 17,7 μmol) dans 1 ,48 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 22,2 μl de TEA (159 μmol) et 30,2 mg du composé 43 (88,4 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 24 h : il reste du composé 2 de départ ; 22,2 μl de TEA (159 μmol) et 30,2 mg du composé 43 (88,4 μmol) sont à nouveau ajoutés au mélange et l'agitation poursuivie à 40°C pendant 48 h supplémentaires. 2 ml d'eau sont ajoutés au mélange qui est ensuite extrait avec 2x2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOs (2 ml), une solution saturée de chlorure de sodium (2 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 44 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (4,8 mg ; 27%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,77 (m, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,56 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,61 à 2,73 (m, 4 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,28 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,45 à 3,53 (m, 14 H) ; 3,63 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ;3,72 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,86 (s large, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 8,2 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,55 (dm, J=5,4 Hz, 2 H) ; 4,90 (dd, J=3,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J= 1 ,4 et 5,4 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,19 (dm, J=10,8 Hz, 1 H) ; 5,29 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,21 (m, 1 H) ; 7,24 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,33 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 986 [M + H]+ ; m/z = 493,5 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 984 [M - H]- ; m/z = 1030 [M - H + HCO2H]- pic de base ; tR = 0,95 min. Exemple 14 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]- 3-isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle To a solution, purged with argon, of compound 2 (12.7 mg, 17.7 μmol) in 1.48 ml of anhydrous acetonitrile are successively added 22.2 μl of TEA (159 μmol) and 30.2 ml. mg of compound 43 (88.4 μmol). Stirring is continued at 40 ° C for 24 h: the starting compound 2 remains; 22.2 μl of TEA (159 μmol) and 30.2 mg of compound 43 (88.4 μmol) are again added to the mixture and the stirring continued at 40 ° C. for another 48 hours. 2 ml of water are added to the mixture which is then extracted with 2x2 ml of AcOEt. The organic phases are combined, washed with saturated NaHCO 3 solution (2 ml), saturated sodium chloride solution (2 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 100/0 to 95/5. Compound 44 is obtained as a white solid (4.8 mg, 27%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.77 (m, 6H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.29 (m, 1H); 1.49 to 1.60 (m, 2H); 1.81 (m, 1H); 2.26 (m, 1H); 2.56 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 2.61 to 2.73 (m, 4H); 2.93 to 3.04 (m, 3H); 3.28 to 3.38 (partially masked m, 1H); 3.45 to 3.53 (m, 14H); 3.63 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 3.72 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.86 (bs, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.4 and 8.2 and 11.4 Hz, 1H); 4.55 (dm, J = 5.4 Hz, 2H); 4.90 (dd, J = 3.9 and 9.8 Hz, 1H); 5.1 (ddd, J = 1, 4 and 5.4 and 11, 2 Hz, 1H); 5.19 (dm, J = 10.8 Hz, 1H); 5.29 (dm, J = 17.2 Hz, 1H); 5.79 (dd, J = 1, 4 and 15.2 Hz, 1H); 5.90 (m, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.9 and 1 1, 2 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.0 and 8.8 Hz, 1H); 7.21 (m, 1H); 7.24 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 7.28 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 8.35 (d, J = 8.2 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 986 [M + H] + ; m / z = 493.5 [M + 2H] 2+ base peak; m / z = 984 [M-H] -; m / z = 1030 [M-H + HCO 2 H] - base peak; t R = 0.95 min. Example 14: (2- {2- [2- (2- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl (1-yl) ethoxy) ethoxy) oxyanyl] benzylamino} ethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate
L'exemple 14 peut être obtenu en déprotégeant le composé 44 selon la méthode décrite pour le composé 41 et en activant l'acide obtenu selon la méthode décrite pour l'exemple 18.  Example 14 can be obtained by deprotecting compound 44 according to the method described for compound 41 and by activating the acid obtained according to the method described for example 18.
Exemple 15 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-δ,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl-méthyl-amino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Example 15: (2- {2- [2- (2- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-δ, 11-diaza-cyclohexadec-13-en-16 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-yl} ethyl) oxiranyl] benzylmethylamino} ethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate
Composé 45 : Acide 3-[2-(2-{2-[2-(fert-butoxycarbonyl-méthyl-amino)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- éthoxy]-propanoïque ,N. ,-0Compound 45: 3- [2- (2- {2- [2- (Fert-Butoxycarbonyl-methyl-amino) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -ethoxy] -propanoic acid ,NOT. , -0
520 mg (1 ,423 mmol) d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecanoïque sont mis en solution dans 14 ml de THF anhydre puis le mélange est refroidi à 0°C avant que soient ajoutés, par spatulées, 85,4 mg (2,135 mmol) d'hydrure de sodium. L'agitation est poursuivie pendant 10 min à 0°C puis 150,6 μl (2,419 mmol) d'iodure de méthyle sont ajoutés à 0°C. La température est laissée revenir à TA et l'agitation poursuivie 2 h. 8 ml d'eau sont ajoutés au mélange dont le pH est ensuite acidifié par addition d'acide acétique pour obtenir pH≈4. Il est extrait par 3*10 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec 10 ml d'une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filration et concentration à sec sous PR, le composé 45 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (414 mg, 77%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 1 ,38 (s, 9 H) ; 2,43 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,29 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,45 à 3,52 (m, 14 H) ; 3,60 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 12,01 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 402 [M + Na]+ ; m/z = 378 [M - H]- ; m/z = 280 pic de base ; tR = 0,95 min. Composé 46 : 3-[2-(2-{2-[2-(fert-Butoxycarbonyl-méthyl-amino)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-éthoxy]- propanoate d'allyle 520 mg (1.423 mmol) of Boc-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoic acid are dissolved in 14 ml of anhydrous THF and the mixture is then cooled to 0 ° C. before being added, by spatulas, 85.4 mg (2.135 mmol) of sodium hydride. Stirring is continued for 10 min at 0 ° C. and then 150.6 μl (2.419 mmol) of methyl iodide are added at 0 ° C. The temperature is allowed to return to RT and stirring continued for 2 hours. 8 ml of water are added to the mixture, the pH of which is then acidified by addition of acetic acid to obtain pH≈4. It is extracted with 3 * 10 ml of AcOEt. The organic phases are combined, washed with 10 ml of saturated NaCl solution and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration to dryness under RP, the compound 45 is obtained in the form of a colorless oil (414 mg, 77%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 1.38 (s, 9H); 2.43 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 2.80 (bs, 3H); 3.29 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.45 to 3.52 (m, 14H); 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 12.01 (m spread, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 402 [M + Na] + ; m / z = 378 [M-H] -; m / z = 280 base peak; t R = 0.95 min. Compound 46: allyl-3- [2- (2- {2- [2- (2-butoxycarbonyl-methyl-amino) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -ethoxy] -propanoate
A une solution de 540 mg (1 ,423 mmol) du composé 45 dans 15 ml de DCM anhydre sont successivement ajoutés 327 mg (1 ,71 mmol) d'EDCI, 17,4 mg (142 μmol) de DMAP et 116 μl (1 ,71 mmol) d'alcool allylique. L'agitation est poursuivie 15 h à TA puis le mélange est concentré à sec. Le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 46 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (337 mg ; 56%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,38 (s, 9 H) ; 2,57 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,80 (s large, 3 H) ; 3,22 à 3,33 (m partiellement masqué, 2 H) ; 3,44 à 3,54 (m, 14 H) ; 3,64 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,55 (d large, J=4,9 Hz, 2 H) ; 5,20 (d large, J=10,3 Hz, 1 H) ; 5,30 (d large, J=17,1 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 442 [M + Na]+ ; m/z = 320 pic de base ; tR = 0,98 min. To a solution of 540 mg (1.423 mmol) of compound 45 in 15 ml of anhydrous DCM are added successively 327 mg (1.71 mmol) of EDCI, 17.4 mg (142 μmol) of DMAP and 116 μl ( 1.71 mmol) of allyl alcohol. Stirring is continued for 15 h at RT and the mixture is concentrated to dryness. The crude product obtained is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 90/10. Compound 46 is obtained as a colorless oil (337 mg, 56%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 1.38 (s, 9H); 2.57 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 2.80 (bs, 3H); 3.22 to 3.33 (partially masked m, 2H); 3.44 to 3.54 (m, 14H); 3.64 (t, J = 6.1 Hz, 2H); 4.55 (broad d, J = 4.9 Hz, 2H); 5.20 (bd, J = 10.3 Hz, 1H); 5.30 (broad d, J = 17.1 Hz, 1H); 5.90 (m, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 442 [M + Na] + ; m / z = 320 base peak; t R = 0.98 min.
Composé 47 : 3-(2-{2-[2-(2-Méthylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle Compound 47: allyl 3- (2- {2- [2- (2-methylaminoethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate
A une solution de 337 mg (0,802 mmol) du composé 46 dans 20 ml de DCM sont ajoutés 1 ,19 ml (16,04 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie pendant 3 h à TA puis le mélange est concentré à sec sous PR. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 47 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (208 mg, 81 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-de): 2,27 (s, 3 H) ; 2,54 à 2,61 (m, 4 H) ; 3,44 (t, J=5,6 Hz, 2 H) ; 3,47 à 3,52 (m, 12 H) ; 3,65 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,56 (d large, J=5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (d large, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (d large, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 320 [M + H]+ ; tR = 0,42 min. To a solution of 337 mg (0.802 mmol) of compound 46 in 20 ml of DCM was added 1.19 ml (16.04 mmol) of TFA. Stirring is continued for 3 h at RT and then the mixture is concentrated to dryness under RP. The crude is purified by SPE filtration on a conditioned SCX (Varian) cartridge and washed with methanol and then eluted with 0.5 N ammonia solution in methanol. Compound 47 is obtained as a colorless oil (208 mg, 81%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 2.27 (s, 3H); 2.54 to 2.61 (m, 4H); 3.44 (t, J = 5.6 Hz, 2H); 3.47 to 3.52 (m, 12H); 3.65 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 4.56 (broad d, J = 5.4 Hz, 2H); 5.20 (broad d, J = 10.5 Hz, 1H); 5.30 (d, J = 17.2Hz, 1H); 5.90 (m, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 320 [M + H] + ; t R = 0.42 min.
Composé 48 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle Compound 48: (2- {2- [2- (2- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [ 3-Chloro-4-methoxybenzyll-5-isobutyl-δ.δ-dimethyl-4α-tetraoxo-1-dioxa-δ-H-diaza-cyclohexadec-IS-en-δ-yl allyl ethyl (ethyl) oxiranyl] benzylamino} ethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate
A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (40 mg, 55,7 μmol) dans 5 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 48,5 μl de DIPEA (279 μmol) et 53 mg du composé 47 (167 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 15 h ; 5 ml d'eau sont ajoutés au mélange qui est ensuite extrait avec 4x5 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOβ (5 ml), une solution saturée de NaCl (5 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 48 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (45,3 mg ; 80%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 0,76 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,56 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,63 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,49 à 3,51 (m, 12 H) ; 3,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,63 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 8,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,55 (d large, J=5,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,5 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 5,19 (dm, J=10,3 Hz, 1 H) ; 5,29 (dm, J=17,6 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,25 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,30 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1000 [M + H]+ ; m/z = 500,5 [M + 2H]2+ ; m/z = 1044 [M - H + HCO2H]- ; tR = 1 ,01 min. To a solution, purged with argon, of compound 2 (40 mg, 55.7 μmol) in 5 ml of anhydrous acetonitrile are successively added 48.5 μl of DIPEA (279 μmol) and 53 mg of compound 47 (167 mg). ĩmol). Stirring is continued at 40 ° C for 15 h; 5 ml of water are added to the mixture which is then extracted with 4x5 ml of AcOEt. The organic phases are combined, washed with saturated NaHCO 3 solution (5 ml), saturated NaCl solution (5 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 100/0 to 90/10. Compound 48 is obtained as a colorless solid (45.3 mg, 80%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-de): 0.76 (d, J = 5.9 Hz, 3H); 0.78 (d, J = 5.9 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1, 04 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.29 (m, 1H); 1.50 to 1.61 (m, 2H); 1.80 (m, 1H); 2.15 (s, 3H); 2.28 (m, 1H); 2.52 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 2.56 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 2.63 to 2.73 (m, 2H); 2.94 to 3.06 (m, 3H); 3.25 to 3.35 (partially masked m, 1H); 3.48 (s, 2H); 3.49 to 3.51 (m, 12H); 3.52 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 3.63 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 1.5 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.4 and 8.3 and 11.5 Hz, 1H); 4.55 (broad, J = 5.0 Hz, 2H); 4.91 (dd, J = 3.7 and 9.5 Hz, 1H); 5.1 (ddd, J = 1.5 and 5.7 and 11.5 Hz, 1H); 5.19 (dm, J = 10.3 Hz, 1H); 5.29 (dm, J = 17.6 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 1.5 and 15.2 Hz, 1H); 5.90 (m, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.7 and 11.5 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.0 and 8.5 Hz, 1H); 7.22 (dd, J = 2.9 and 9.8 Hz, 1H); 7.25 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 7.28 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 7.30 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 8.35 (d, J = 8.3 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 1000 [M + H] + ; m / z = 500.5 [M + 2H] 2+ ; m / z = 1044 [M - H + HCO 2 H] -; t R = 1.11 min.
Composé 49 : Acide (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy- benzylj-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque 19 mg (18,9 μmol) du composé 48 sont mis en solution dans 3,8 ml de THF anhydre et purgés à l'argon. 6 μl (18,9 μmol) de diéthylamine sont ajoutés au mélange qui est agité 15 min à TA avant que soient ajoutés 4,45 mg (19,8 μmol) d'acétate de palladium (II) et 18,89 mg de triphénylphosphine supportée. L'agitation est poursuivie 6 jours à TA: il reste du départ mais la réaction n'évolue plus. Le mélange est filtré, concentré à sec, repris dans 2 ml de THF anhydre et traité avec 10 μl (31 ,5 μmol) de diéthylamine et 10 mg de tétrakis(triphényl-phospine)palladium pendant 1 h. Le mélange est hydrolyse avec 2 ml d'une solution aq. d'hydrogénosulfate de sodium 2M et extrait avec 3 * 2 ml de DCM. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (2 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice greffée diol en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 49 est obtenu sous la forme d'un solide incolore (5,4 mg ; 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 (t, J=5,9 Hz, 3 H) ; 0,78 (t, J=5,9 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,51 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,15 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,42 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,52 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 2,64 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,44 (m partiellement masqué, 3 H) ; 3,45 à 3,51 (m, 12 H) ; 3,53 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,59 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=4,2 et 7,8 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (dd, J=5,4 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,27 (m, 3 H) ; 7,28 à 7,32 (m, 3 H) ; 8,38 (d large, J=7,8 Hz, 1 H) ; 11 ,22 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 960 [M + H]+ ; m/z = 480,5 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 958 [M - H]- ; tR = 0,90 min. Compound 49: Acid (2- {2- [2- (2- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -S-isobutyl-δ · d-dimethyl-δ-diethyl-tetraoxo-1-dioxa-δ-H-diaza-cyclohexadec-IS-en-i-yl } ethyl) -oxiranyl] benzylamino} ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoic 19 mg (18.9 μmol) of compound 48 are dissolved in 3.8 ml of anhydrous THF and purged with argon. 6 μl (18.9 μmol) of diethylamine are added to the mixture, which is stirred for 15 minutes at RT before the addition of 4.45 mg (19.8 μmol) of palladium (II) acetate and 18.89 mg of triphenylphosphine. supported. The agitation is continued for 6 days at RT: it remains the start but the reaction no longer evolves. The mixture is filtered, concentrated to dryness, taken up in 2 ml of anhydrous THF and treated with 10 μl (31.5 mmol) of diethylamine and 10 mg of tetrakis (triphenylphospine) palladium for 1 h. The mixture is hydrolyzed with 2 ml of aq solution. of 2M sodium hydrogen sulphate and extracted with 3 * 2 ml of DCM. The organic phases are combined, washed with saturated NaCl solution (2 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel grafted diol, eluting with a DCM / methanol 98/2 to 90/10. Compound 49 is obtained as a colorless solid (5.4 mg, 30%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.76 (t, J = 5.9 Hz, 3H); 0.78 (t, J = 5.9 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1, 04 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.31 (m, 1H); 1.51 to 1.62 (m, 2H); 1.80 (m, 1H); 2.15 (s, 3H); 2.28 (m, 1H); 2.42 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 2.52 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 2.64 to 2.73 (m, 2H); 2.94 to 3.04 (m, 3H); 3.25 to 3.44 (partially masked m, 3H); 3.45 to 3.51 (m, 12H); 3.53 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 3.59 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 4.2 and 7.8 and 11.5 Hz, 1H); 4.91 (dd, J = 3.4 and 9.8 Hz, 1H); 5.11 (dd, J = 5.4 and 11.2 Hz, 1H); 5.80 (d, J = 15.2 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.7 and 11, 2 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.3 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.0 and 8.3 Hz, 1H); 7.21 to 7.27 (m, 3H); 7.28-7.32 (m, 3H); 8.38 (d, J = 7.8 Hz, 1H); 11, 22 (m very spread, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 960 [M + H] + ; m / z = 480.5 [M + 2H] 2+ base peak; m / z = 958 [M-H] -; t R = 0.90 min.
Exemple 15 : Acide (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{€-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle Example 15: Acid (2- {2- [2- (2- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1- {- (3S, 10R, 16S) -10- [3 4-chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16- 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl yl} -ethyl) oxiranyl] benzylamino} ethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate
L'exemple 15 peut être préparé en activant l'acide 49 selon la méthode décrite pour l'exemple 18. Exemple 16 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-méthoxy-benzyl}- 3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)- éthyl]-oxiranyl}-benzyl-piperazin-1 -yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle Composé 50 : Acide 3-{2-[2-(2-hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoïque Example 15 can be prepared by activating the acid 49 according to the method described for Example 18. Example 16: (2- {2- [2- (4 - {(2R, 3R) -3 - [(S ) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- {3-chloro-4-methoxy-benzyl} -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo 1, 4-Dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl] -oxiranyl} -benzyl-piperazin-1-yl) ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoate 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl Compound 50: 3- {2- [2- (2-hydroxyethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -propanoic acid
A une solution de 300 mg (1 ,08 mmol) de 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de fert-butyle dans 6 ml de DCM sont ajoutés 1 ,6 ml (21 ,56 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie à TA pendant 3h. Le mélange est concentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués pour donner le composé 50 sous la forme d'une huile jaune pâle (240 mg, quantitatif).  To a solution of 300 mg (1.08 mmol) of tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate in 6 ml of DCM is added 1.6 ml (21, 56 mmol) of TFA. Stirring is continued at RT for 3 hours. The mixture is concentrated to dryness, taken up in the minimum of DCM and several toluene workouts are carried out to give the compound 50 in the form of a pale yellow oil (240 mg, quantitative).
Composé 51 : 3-{2-[2-(2-Hydroxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoate d'allyle Compound 51: allyl 3- {2- [2- (2-hydroxy-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -propanoate
A une solution de 240 mg (1 ,08 mmol) du composé 50 dans 3 ml de DCM sont successivement ajoutés 248 mg (1 ,29 mmol) d'EDCI, 13,2 mg (1 ,29 mmol) de DMAP et 88 μl (1 ,29 mmol) d'alcool allylique. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h puis le mélange est concentré à sec sous PR et le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 51 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (144 mg, 51 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 2,57 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,41 (m, 2 H) ; 3,46 à 3,52 (m, 10 H) ; 3,65 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,52 (t, J=5,5 Hz, 1 H) ; 4,56 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,50 (dm, J=17,4 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). Composé 52 : 4-(2-{2-[2-(2-Allyloxycarbonyl-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthyl)-piperazine-1- carboxylate de fert-butyle To a solution of 240 mg (1.08 mmol) of compound 50 in 3 ml of DCM are successively added 248 mg (1.29 mmol) of EDCI, 13.2 mg (1.29 mmol) of DMAP and 88 μl. (1, 29 mmol) of allyl alcohol. Stirring is continued at RT for 15 h and then the mixture is concentrated to dryness under RP and the crude purified by chromatography on silica gel using a DCM / methanol mixture 98/2 to 90/10 as eluent. Compound 51 is obtained as a colorless oil (144 mg, 51%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 2.57 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 3.41 (m, 2H); 3.46 to 3.52 (m, 10H); 3.65 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 4.52 (t, J = 5.5 Hz, 1H); 4.56 (m, 2H); 5.20 (dm, J = 10.5 Hz, 1H); 5.50 (dm, J = 17.4 Hz, 1H); 5.90 (m, 1H). Compound 52: Fert -butyl 4- (2- {2- [2- (2-Allyloxycarbonyl-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethyl) -piperazine-1-carboxylate
A une solution, refroidie à 0°C, de 94 mg (357 μmol) du composé 51 dans 3,7 ml de DCM sont successivement ajoutés 125 μl (893 μmol) de TEA et 30,4 μl (393 μmol) de chlorure de mésyle, l'agitation est poursuivie à TA pendant 1 h. Le mélange est concentré à sec sous PR puis repris dans 5 ml d'acétonitrile. 249 μl (1 ,785 mmol) de TEA et 200 mg (1 ,071 mmol) de Boc-pipérazine sont ajoutés à la solution et le mélange est agité et chauffé 15 h à 40°C. Après retour à TA, le mélange est concentré à sec et purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 52 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (69 mg, 45%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,39 (s, 9 H) ; 2,33 (m, 4 H) ; 2,46 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 2,57 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,28 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,45 à 3,53 (m, 10 H) ; 3,64 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,55 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H). Composé 53 : 3-{2-[2-(2-Piperazin-1-yl-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-propanoate d'allyle To a solution cooled to 0 ° C., 94 mg (357 μmol) of compound 51 in 3.7 ml of DCM are successively added 125 μl (893 μmol) of TEA and 30.4 μl (393 μmol) of sodium chloride. mesyl, stirring is continued at RT for 1 h. The mixture is concentrated to dryness under RP and then taken up in 5 ml of acetonitrile. 249 μl (1.785 mmol) of TEA and 200 mg (1.07 mmol) of Boc-piperazine are added to the solution and the mixture is stirred and heated for 15 h at 40 ° C. After returning to RT, the mixture is concentrated to dryness and purified by chromatography on silica gel, using as eluent a 98/2 to 90/10 DCM / methanol mixture. Compound 52 is obtained as a colorless oil (69 mg, 45%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 1.39 (s, 9H); 2.33 (m, 4H); 2.46 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 2.57 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 3.28 (partially masked m, 4H); 3.45 to 3.53 (m, 10H); 3.64 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 4.55 (m, 2H); 5.20 (dm, J = 10.5 Hz, 1H); 5.30 (dm, J = 17.2 Hz, 1H); 5.90 (m, 1H). Compound 53: allyl 3- {2- [2- (2-Piperazin-1-yl-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -propanoate
A une solution de 110 mg (256 μmol) du composé 52 dans 10 ml de DCM sont ajoutés 380 μl (5,11 mmol) de TFA. L'agitation est poursuivie 24 h à TA. Le mélange est∞ncentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués. Le brut est purifié par filtration SPE sur une cartouche SCX (Varian) conditionnée et lavée avec du méthanol puis éluée avec une solution d'ammoniaque 0,5 N dans le méthanol. Le composé 53 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (47 mg, 55%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,58 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,10 à 3,36 (m large, 6 H) ; 3,45 à 3,78 (m partiellement masqué, 16 H) ; 4,56 (m, 2 H) ; 5,20 (dm, J=10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (dm, J=17,2 Hz, 1 H) ; 5,90 (m, 1 H) ; 9,00 (m étalé, 1 H). To a solution of 110 mg (256 μmol) of compound 52 in 10 ml of DCM are added 380 μl (5.11 mmol) of TFA. Stirring is continued for 24 h at RT. The mixture is dry concentrated, taken up in the minimum of DCM and several toluene drives are carried out. The crude is purified by SPE filtration on a SCX cartridge (Varian) conditioned and washed with methanol and then eluted with a 0.5 N ammonia solution in methanol. Compound 53 is obtained as a colorless oil (47 mg, 55%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 2.58 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 3.10 to 3.36 (broad m, 6H); 3.45 to 3.78 (partially masked m, 16H); 4.56 (m, 2H); 5.20 (dm, J = 10.5 Hz, 1H); 5.30 (dm, J = 17.2 Hz, 1H); 5.90 (m, 1H); 9.00 (spread m, 1 H).
Composé 54 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle Compound 54: (2- {2- [2- (4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- {3-Chloro 4-methoxy-benzyl-3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) allyl ethyl] oxiranyl} -benzyl-piperazin-1-yl) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoate
Le composé 54 peut être obtenu par substitution nucléophile du groupement chloro du dérivé 2 par l'aminé 53 en appliquant la méthode décrite pour la préparation du composé 30. The compound 54 can be obtained by nucleophilic substitution of the chloro group of the derivative 2 with the amine 53 by applying the method described for the preparation of the compound 30.
Composé 55 : Acide (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-méthoxy- benzylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque Compound 55: Acid (2- {2- [2- (4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- {3- 4-chloro-methoxybenzyl-5-isobutyl-δ-dimethyl-4α-tetraoxo-1α-dioxa-δ-H-diaza-cyclohexadec-1-en-1-yl) -ethyl ] -oxiranyl} -benzyl-piperazin-1-yl) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoic acid
Le composé 55 peut être obtenu selon la méthode décrite pour le composé 41.  Compound 55 can be obtained according to the method described for compound 41.
Exemple 16 : (2-{2-[2-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl-piperazin-1-yl)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Example 16: (2- {2- [2- (4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- {3-Chloro 4-methoxy-benzyl-3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-ethyl] oxiranyl} -benzyl-piperazin-1-yl) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoate
L'exemple 16 peut être obtenu selon la méthode décrite pour l'exemple 18. Exemple 17 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4- méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa- dec-13-èn-16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1 -yl)-1 ,1 -diméthyl-4-oxo-butylsulfanyl]- acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1 -yle Example 16 can be obtained according to the method described for Example 18. Example 17: 3- (2- {2- [2- (2- {2- [4- (4- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5 , 9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa- dec-13-en-16-yl) ethyl) oxiranyl] benzyl} -piperazin-1-yl) -1,1-dimethyl-4-oxo-butylsulfanyl] -acetylamino} -ethoxy) -ethoxy] -ethoxy 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl} ethoxy) propanoate
Composé 56 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-Bromo-acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Compound 56: 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl 2,5-di (2 - {2- [2- (2- (2-bromoacetylamino) ethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate
A une solution d'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propionique (671 mg, 2,53 mmol) dans le DCM (10 ml) est ajoutée une solution du bromoacétate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle (2,53 mmol) dans 4,7 ml de DCM. L'agitation est poursuivie 15 min à TA puis le DCC est ajouté au mélange. Après 4 h de réaction, le mélange est filtré sur verre fritte puis le filtrat est évaporé et purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 94/6. L'huile obtenue (800 mg) est à nouveau purifiée par chromatographie sur gel de silice greffée cyano, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1. On obtient le composé 56 sous la forme d'une huile incolore (611 mg, 50%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 2,81 (s, 4 H) ; 2,92 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,23 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,43 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,55 (m, 12 H) ; 3,72 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,85 (s, 2 H) ; 8,30 (t large, J=5,9 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + H]+ ; m/z = 481 [M - H]" ; tR = 0,51 min. To a solution of 3- (2- {2- [2- (2-aminoethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propionic acid (671 mg, 2.53 mmol) in DCM (10 ml ) a solution of 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl bromoacetate (2.53 mmol) in 4.7 ml of DCM is added. Stirring is continued for 15 minutes at RT and the DCC is added to the mixture. After 4 hours of reaction, the mixture is filtered on sintered glass and the filtrate is then evaporated and purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 99/1 to 94/6. The oil obtained (800 mg) is again purified by chromatography on cyano-grafted silica gel, eluting with a DCM / methanol 99/1 mixture. Compound 56 is obtained as a colorless oil (611 mg, 50%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 2.81 (s, 4H); 2.92 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.23 (q, J = 5.9 Hz, 2H); 3.43 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.48 to 3.55 (m, 12H); 3.72 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.85 (s, 2H); 8.30 (broad t, J = 5.9 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 483 [M + H] + ; m / z = 481 [M - H] "; t R = 0.51 min.
Composé 7 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)-1- ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,1 1-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone Compound 7: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-16 - [(S) -1- ( 2R, 3R) -3- {4- [4- (4-methyl-4-methyl-disulfanyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -1,4-dioxa-8.1 1-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
A une solution purgée à l'argon du composé 2 (19,8 mg, 27,6 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (2,5 ml) sont successivement ajoutés la TEA (138 μmol) et le chlorhydrate de la 4-méthyl-4- méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one 6 (83 μmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 24 h puis le mélange est dilué dans de TAcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x10 ml), par une solution aq. saturée de NaHCU3 (10 ml) et par une solution aq. saturée de NaCl (10 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Une poudre blanche, 7, est obtenue (19,4 mg ; 75%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,6 ; RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 0,75 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 , 12 (s, 3 H) ; 1 ,26 (s, 6 H) ; 1 ,28 - 1 ,33 (m, 1 H) ; 1 ,52 - 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,76 - 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,27 - 2,38 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,64 - 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 - 3,05 (m, 2 H) ; 3,24 - 3,34 (m, 6 H) ; 3,44 (br. s., 4 H) ; 3,49 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,22 - 4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H) ; 5,08 - 5, 15 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,2, 1 1 ,3, 3,5 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H) ; 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H) ; 7,25 - 7,34 (m, 5 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 943 [M + H]+ ; m/z = 941 [M - H]" ; tR = 4,03 min. To an argon purged solution of compound 2 (19.8 mg, 27.6 μmol) in anhydrous acetonitrile (2.5 ml) are successively added TEA (138 μmol) and 4-methyl hydrochloride. Methyldisulfanyl-1-piperazin-1-yl-pentan-1-one 6 (83 μmol). Stirring is continued at 40 ° C for 24 h and then the mixture is diluted with TAcOEt (10 mL). The organic phase is washed with water (2 × 10 ml), with aq solution. saturated with NaHCU 3 (10 ml) and with aq solution. saturated with NaCl (10 ml). After drying over MgSO 4 and filtration, the solvents are evaporated under RP. The crude of the reaction is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 99/1 to 90/10. A white powder, 7, is obtained (19.4 mg, 75%). TLC (DCM 90 / MeOH 10): Rf = 0.6; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 0.75-0.81 (m, 6H); 1, 01 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1, 26 (s, 6H); 1, 28-1.33 (m, 1H); 1, 52-1.61 (m, 2H); 1.76-1.83 (m, 2H); 2.27 - 2.38 (m, 4H); 2.39 (s, 3H); 2.64 - 2.74 (m, 2H); 2.95 - 3.05 (m, 2H); 3.24 - 3.34 (m, 6H); 3.44 (br s, 4H); 3.49 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.88 (d, J = 1.7 Hz, 1H); 4.22 - 4.29 (m, 1H); 4.92 (dd, J = 9.9, 3.5 Hz, 1H); 5.08-5.15 (m, 1H); 5.81 (d, J = 14.2 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 15.2, 1 1, 3, 3.5 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 1H); 7.22 (d, J = 9.3 Hz, 1H); 7.25 - 7.34 (m, 5H); 8.34 (d, J = 8.1 Hz, 1H). LCMS (A1): ES m / z = 943 [M + H] +; m / z = 941 [M - H] "; t R = 4.03 min.
Nota : le composé 7 peut être préparé également à partir de G=OMs (voir exemple 1) Composé Ex1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16- [(S)-1-((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)- éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone Note: Compound 7 can be prepared also from G = OMs (see Example 1) Compound Ex1: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3 Isobutyl-6,6-dimethyl-16 - [(S) -1 - ((2R, 3R) -3- {4- [4- (4-mercapto-4-methyl-pentanoyl) -piperazin-1-ylmethyl) ] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le composé 7 (17,9 mg ; 18,97 μmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (2,2 ml) / eau (1 ,8 ml) et le mélange se trouble. Le TCEP (47,4 μmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 3 h à TA, puis dilué par ajout d'AcOEt (20 ml) et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aq. saturée de NH4CI (20 ml) puis par 20 ml d'une solution saturée en NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit Ex1 est obtenu sous forme d'un solide blanc (15,6 mg ; 92%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,56 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,76 - 0,81 (m, 6 H) ; 1 ,01 (s, 3Compound 7 (17.9 mg, 18.97 μmol) is placed in solution in ethanol (2.2 ml) / water (1.8 ml) and the mixture is cloudy. The TCEP (47.4 μmol) is then added and the mixture is stirred for 3 h at RT, then diluted by adding AcOEt (20 ml) and the organic phase is washed with a 1/1 mixture of water and water. a solution aq. saturated with NH 4 Cl (20 ml) then with 20 ml of a saturated solution of NaCl. After drying the organic phase over MgSO 4 , filtration and evaporation of the solvents under RP, the product Ex 1 is obtained in the form of a white solid (15.6 mg, 92%). TLC (DCM 90 / MeOH 10): Rf = 0.56; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.76-0.81 (m, 6H); 1, 01 (s, 3
H) ; 1 ,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,24 (s, 6 H) ; 1 ,27 - 1 ,31 (m, 1 H) ; 1 ,56 - 1 ,64 (m, 2H); 1, 06 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 13 (s, 3H); 1, 24 (s, 6H); 1, 27-1.31 (m, 1H); 1, 56 - 1, 64 (m, 2
H) ; 1 ,73 - 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,26 - 2,33 (m, 3 H) ; 2,36 - 2,45 (m, 4 H) ; 2,63 - 2,75 (m, 2 H) ; 2,95H); 1.73 - 1.85 (m, 3H); 2.26 - 2.33 (m, 3H); 2.36 - 2.45 (m, 4H); 2.63 - 2.75 (m, 2H); 2.95
- 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 - 3,36 (m, 1 H) ; 3,42 - 3,51 (m, 6 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 1 H) ; 4,22 -3.06 (m, 3H); 3.34 - 3.36 (m, 1H); 3.42 - 3.51 (m, 6H); 3.82 (s, 3H); 3.89 (s, 1H); 4.22 -
4,29 (m, 1 H) ; 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H) ; 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=15,0, 11 ,4, 3,4 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=8,3, 1 ,5 Hz, 14.29 (m, 1H); 4.92 (dd, J = 9.8, 3.4 Hz, 1H); 5.12 (dd, J = 10.8, 4.9 Hz, 1H); 5.81 (d, J = 15.2 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 15.0, 11.4, 3.4 Hz, 1H); 7.06 (d, J = 8.3 Hz, 1H); 7.18 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1
H) ; 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 - 7,36 (m, 5 H) ; 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z =H); 7.24 (d, J = 9.8 Hz, 1H); 7.26 - 7.36 (m, 5H); 8.37 (d, J = 7.8 Hz, 1H). LCMS (A2): ES m / z =
897 [M + H]+ ; m/z = 895 [M - H]" ; tR = 0,97 min. 897 [M + H] + ; m / z = 895 [M - H] "; t R = 0.97 min.
Exemple 17 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-1 ,1-diméthyl-4-oxo-butylsulfanyl]-acétylamino}-éthoxy)- éthoxy]-éthoxy}-éthoxy )-propa noate de 2 , 5-d ioxo-py rrol id i n- 1 -y le A une solution, purgée à l'argon, du composé Ex1 (15,6 mg, 17,8 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ,0 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (19,12 μmol) et le composé 56 (19,12 μmol). L'agitation est poursuivie à TA pendant 4 h puis 29,5 μmol supplémentaires de DIPEA sont ajoutés et l'agitation poursuivie pendant 16 h. Le lendemain, sont ajoutés 29,5 μmol supplémentaires de composé 56 et de DIPEA et le mélange est chauffé à 50°C. Après 24 h supplémentaires de réaction, 22,6 μmol de composé 56 et 29,5 μmol de DIPEA sont ajoutés et le mélange chauffé à 60°C pendant 24 h supplémentaires. Le chauffage est alors arrêté et l'agitation poursuivie à TA pendant 64 h. Le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par 2x10 ml d'eau puis par 10 ml d'une solution saturée en NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le produit Ex17 est obtenu sous forme d'un solide incolore (9,2 mg ; 41 %). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,77 à 0,82 (m, 6 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,06 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,13 (s, 3 H) ; 1 ,23 (s, 6 H) ; 1 ,26 à 1 ,35 (m, 1 H) ; 1 ,52 à 1 ,64 (m, 2 H) ; 1 ,68 à 1 ,77 (m, 2 H) ; 1 ,78 à 1 ,86 (m, 1 H) ; 2,26 à 2,33 (m, 3 H) ; 2,35 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,68 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,82 (s, 4 H) ; 2,93 (t, J=6.0 Hz, 2 H) ; 2,96 à 3,07 (m, 4 H) ; 3,13 (s, 2 H) ; 3,20 (q, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,33 (m, 1 H) ; 3,38 à 3,57 (m, 18 H) ; 3,73 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 2 H) ; 4,27 (m, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,8 et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,13 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 11 ,1 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,15 à 7,37 (m, 7 H) ; 8,01 (t, J=5,8 Hz, 1 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1299 [M + H]+ ; m/z = 650 [M + 2H]2+ ; m/z = 1297 [M - H]" ; tR = 0,92 min. Example 17: 3- (2- {2- [2- (2- {2- [4- (4- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxybenzyl) -S-isobutyl-δ.-dimethyl- .delta.-tetraoxo-1-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec -IS-ηn-δ-yl) -ethyl-oxiranyl] benzyl-piperazin-1-yl) -1,1-dimethyl-4-oxo-butylsulfanyl-acetylamino-ethoxy) ethoxy-ethoxy} ethoxy) -propionate of 2,5-dioxyrimidin-1-yl To a solution, purged with argon, of the compound Ex1 (15.6 mg, 17.8 μmol) in anhydrous acetonitrile (1.0 ml) are successively added the DIPEA (19.12 μmol) and the compound 56 (19.12 μmol). Stirring is continued at RT for 4 h and then an additional 29.5 μmol of DIPEA are added and stirring continued for 16 h. The next day, an additional 29.5 μmol of compound 56 and DIPEA are added and the mixture is heated to 50 ° C. After a further 24 hours of reaction, 22.6 μmol of compound 56 and 29.5 μmol of DIPEA are added and the mixture heated at 60 ° C for an additional 24 hours. Heating is then stopped and stirring continued at RT for 64 hours. The mixture is diluted in 10 ml of AcOEt and the organic phase is washed with 2x10 ml of water and then with 10 ml of saturated NaCl solution. After drying the organic phase over MgSO 4 , filtration and evaporation of the solvents under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol 99/1 to 90/10. The product Ex17 is obtained as a colorless solid (9.2 mg, 41%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.77 to 0.82 (m, 6H); 1, 02 (s, 3H); 1, 06 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 13 (s, 3H); 1, 23 (s, 6H); 1, 26 to 1, 35 (m, 1H); 1.52-1.64 (m, 2H); 1.68 to 1.77 (m, 2H); 1.78-1.86 (m, 1H); 2.26 to 2.33 (m, 3H); 2.35 to 2.41 (m, 4H); 2.68 to 2.76 (m, 2H); 2.82 (s, 4H); 2.93 (t, J = 6.0 Hz, 2H); 2.96 to 3.07 (m, 4H); 3.13 (s, 2H); 3.20 (q, J = 5.8 Hz, 2H); 3.33 (m, 1H); 3.38 to 3.57 (m, 18H); 3.73 (t, J = 5.8 Hz, 2H); 3.83 (s, 3H); 3.89 (s, 2H); 4.27 (m, 1H); 4.93 (dd, J = 3.8 and 10.0 Hz, 1H); 5.13 (m, 1H); 5.82 (d, J = 15.4 Hz, 1H); 6.49 (ddd, J = 3.8 and 11, 1 and 15.4 Hz, 1H); 7.07 (d, J = 8.8 Hz, 1H); 7.15 to 7.37 (m, 7H); 8.01 (t, J = 5.8 Hz, 1H); 8.35 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 1299 [M + H] + ; m / z = 650 [M + 2H] 2+ ; m / z = 1297 [M - H] "; t R = 0.92 min.
Exemple 18 : 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1 -{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-δ,11-diaza-cyclohexa-dec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Example 18: 3- (2- {2- [2- (2- {4 - [(2S, 3S) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10 - [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-δ, 11-diaza-cyclohexa-dec-13 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl-1-enyl-16-yl} -ethyl) -oxiranyl] -benzyloxycarbonylamino} ethoxy) ethoxy] ethoxy} -ethoxy) -propanoate
Composé 58 : Carbonate de 4-((2S,3S)-3-{(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle et de 4-nitrophényle  Compound 58: 4 - ((2S, 3S) -3 - {(S) -1 - [(E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxybenzyl) -N isobutyl-δ, δ-dimethyl-β-α-tetraoxo-β-dioxa-δ-H-diaza-cyclohexadec-IS-en-δ-yl-ethyl-oxiranyl) -benzyl and 4 nitrophenyl
Le dérivé 57 (20 mg ; 28,6 μmol, préparé selon Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (0,3 ml), la solution est purgée à l'argon avant que soient ajoutés la TEA (40 μmol) puis le chloroformate de 4-nitrophényle (32,32 μmol). Après 3h30 d'agitation à TA, le mélange est hydrolyse et dilué dans 7 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée à sec pour donner le composé 58 sous la forme d'un solide blanc (23 mg, 93%). LCMS (A3) : ES m/z = 864 [M + H]+ ; m/z = 908 [M + HCO2H - H]" ; tR = 1 ,43 min. Derivative 57 (20 mg, 28.6 μmol, prepared according to Al-awar RS, et al., J.Med.Chem., 2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous DCM (0.3 ml), the solution is purged with argon before TEA (40 μmol) and then 4-nitrophenyl chloroformate (32.32 μmol) are added. . After stirring for 30 minutes at RT, the mixture is hydrolyzed and diluted in 7 ml of AcOEt. The organic phase is washed with water and then with a saturated solution of NaCl, dried over MgSO 4 , filtered and evaporated to dryness to give compound 58 in the form of a white solid (23 mg, 93%). LCMS (A3): ES m / z = 864 [M + H] + ; m / z = 908 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 1, 43 min.
Composé 59 : Acide 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.S.Θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexa-dec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque fj η o i o i Compound 59: 3- (2- {2- [2- (2- {4 - [(2S, 3S) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) - 10- [3-Chloro-4-methoxybenzyl-5-isobutyl-δ-dimethyl] naphthalene-tetraoxo-1-dioxa-δ-H-diaza-cyclohexa-dec-1-en N-yl-ethyl-oxiranyl-benzyloxycarbonylamino-ethoxy-ethoxy-ethoxy-ethoxy-propanoic acid
Y Y
5 °8 J T^ i / " Hx TT l— " ° ° 59 ° ~ V ° J Y^ i / " H":ι Ό:° 5 ° 8 ° / 1 "Hx TT l- " ° ° 59 ° ~ V ° JY ^ i / "H": ι Ό: °
A une solution, purgée à l'argon, du composé 58 (23 mg, 26,6 μmol) dans l'acétonitrile anhydre (1 ,6 ml) sont successivement ajoutés l'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propionique (39,9 μmol) et la TEA (53,2 μmol). Après 24 h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée avec 10 ml d'eau contenant 250 μl d'HCl 0,1 N (pH≈4). La phase aq. est extraite avec 10 ml d'AcOEt (2x) ; les phases organiques sont rassemblées, lavées avec 10 ml d'eau puis 10 ml d'une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées à sec pour donner le composé 59 sous la forme d'un solide jaune très pâle (18,5 mg, 70%). LCMS (A3) : ES m/z = 990 [M + H]+ ; m/z = 988 [M - H]" ; tR = 1 ,32 min. To a solution, purged with argon, of the compound 58 (23 mg, 26.6 μmol) in anhydrous acetonitrile (1.6 ml) are successively added the acid 3- (2- {2- [2- (2-amino-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propionic acid (39.9 μmol) and TEA (53.2 μmol). After stirring for 24 h at RT, the mixture is diluted in 10 ml of AcOEt. The organic phase is washed with 10 ml of water containing 250 μl of 0.1 N HCl (pH≈4). The phase aq. is extracted with 10 ml of AcOEt (2x); the organic phases are combined, washed with 10 ml of water and then 10 ml of saturated NaCl solution, dried over MgSO 4 , filtered and evaporated to dryness to give compound 59 in the form of a very pale yellow solid ( 18.5 mg, 70%). LCMS (A3): ES m / z = 990 [M + H] + ; m / z = 988 [M - H] "; t R = 1, 32 min.
Exemple 18 : 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3S)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy- benzyll-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexa-dec-IS-èn-iδ- yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5- dioxo-pyrrolidin-1-yle Example 18: 3- (2- {2- [2- (2- {4 - [(2S, 3S) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10 - [3-Chloro-4-methoxybenzyl-5-isobutyl-δ.δ-dimethyl] .delta.-tetraoxo-1-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexa-dec-IS-en 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl (5-dioxo-pyrrolidin-1-yl) -5-yl} -ethyl) oxiranyl] benzyloxycarbonylamino} ethoxy) ethoxy] ethoxy} ethoxy) propanoate
A une solution, purgée à l'argon, du composé 59 (18,5 mg, 18,6 μmol) dans le THF (1 ,5 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (55,8 μmol) et le carbonate de N,N'-disuccinimidyle (37,2 μmol). Après 19 h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 10 ml d'eau (2 fois) puis 10 ml d'une solution saturée de NaCl, séché sur MgSO4 et évaporé à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 100/0 à 0/100 contenant 10% d'isopropanol. Le produit Ex17 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,08 mg ; 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,83 à 0,88 (m, 6 H) ; 0,97 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,47 à 1 ,56 (m, 1 H) ; 1 ,58 à 1 ,68 (m, 2 H) ; 1 ,82 à 1 ,90 (m, 1 H) ; 2,39 à 2,47 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,66 (m, 1 H) ; 2,71 (dd, J=11 ,5 et 14,4 Hz, 1 H) ; 2,80 (s, 4 H) ;To a solution, purged with argon, of the compound 59 (18.5 mg, 18.6 μmol) in THF (1.5 ml) are successively added the DIPEA (55.8 μmol) and the N carbonate, N'-disuccinimidyl (37.2 μmol). After stirring for 19 h at RT, the mixture is diluted in 10 ml of AcOEt, washed with 10 ml of water (twice) and then 10 ml of saturated NaCl solution, dried over MgSO 4 and evaporated to dryness. . The crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a heptane / AcOEt 100/0 to 0/100 mixture containing 10% isopropanol. The product Ex17 is obtained in the form of a white solid (6.08 mg, 30%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.83 to 0.88 (m, 6H); 0.97 (d, J = 7.1 Hz, 3H); 1, 02 (s, 3H); 1, 15 (s, 3H); 1.47 to 1.56 (m, 1H); 1. 58 to 1.68 (m, 2H); 1.82 to 1.90 (m, 1H) ; 2.39 to 2.47 (m, 1H); 2.60 to 2.66 (m, 1H); 2.71 (dd, J = 11, 5 and 14.4 Hz, 1H); 2.80 (s, 4H);
2.91 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 2,94 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,14 (q, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,37 à 3,56 (m partiellement masqué, 15 H) ; 3,71 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,79 (m, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,27 (ddd, J=3,8 et 8,0 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,96 à 5,05 (m, 3 H) ; 5,1 1 (m, 1 H) ; 5,88 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 1 1 ,3 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,14 à 7,39 (m, 8 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1087 [M + H]+ ; m/z = 1085 [M - H]" ; tR = 1 ,09 min. 2.91 (t, J = 6.0 Hz, 2H); 2.94 to 3.07 (m, 3H); 3.14 (q, J = 6.0 Hz, 2H); 3.37 to 3.56 (partially masked m, 15H); 3.71 (t, J = 6.0 Hz, 2H); 3.79 (m, 1H); 3.81 (s, 3H); 4.27 (ddd, J = 3.8 and 8.0 and 11.3 Hz, 1H); 4.96 to 5.05 (m, 3H); 5.1 (m, 1H); 5.88 (d, J = 15.4 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 3.8 and 1 1, 3 and 15.4 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H); 7.14-7.39 (m, 8H); 8.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 1087 [M + H] + ; m / z = 1085 [M - H] "; t R = 1, 09 min.
Exemple 19 : (1-{4-r(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-r3-Chloro-4-méthoxy-benzvn-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}- éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-1H-1,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Example 19: (1- {4-r (2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10-r3-Chloro-4-methoxy-benzyl) 3-Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl} -ethyl) oxiranyl] benzyl 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl} -1H-1,2,3-triazol-4-yl) -butanoate
Composé 60 : (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-Azidométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tetraone Compound 60: (E) - (3S, 10R, 16S) -16 - {(S) -1 - [(2R, 3R) -3- (4-Azidomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl} -10- ( 3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
A une solution, purgée à l'argon, de 60 mg (85,8 μmol) de composé 1 dans 9 ml de THF anhydre sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide. Le mélange est agité à TA pendant To a solution, purged with argon, of 60 mg (85.8 μmol) of compound 1 in 9 ml of anhydrous THF are added 25.9 μl (120 μmol) of diphenylphosphorazide. The mixture is stirred at RT for
10 min puis refroidi à 0°C avant que soient ajoutés 18,0 μl (120 μmol) de DBU. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h. La réaction n'est pas complète : sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide et 18,0 μl (120 μmol) de DBU puis l'agitation est poursuivie pendant 24 h.10 min and then cooled to 0 ° C. before adding 18.0 μl (120 μmol) of DBU. Stirring is continued at RT for 15 h. The reaction is not complete: 25.9 μl (120 μmol) of diphenylphosphorazide and 18.0 μl (120 μmol) of DBU are added, followed by stirring for 24 hours.
11 reste encore du composé 1 de départ : sont ajoutés 25,9 μl (120 μmol) de diphénylphosphorazide et 18,0 μl (120 μmol) de DBU puis l'agitation est poursuivie pendant 24 h. Le milieu réactionnel est hydrolyse par addition de 6 ml d'eau puis extrait avec du DCM (3*6 ml). Les phase organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (8 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 60 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (46 mg, 74%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 0,76 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ;1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,63 (m, 2 H) ; 1 ,82 (m, 1 H) ; 2,27 (m, 1 H) ; 2,63 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,95 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ;25.9 μl (120 μmol) of diphenylphosphorazide and 18.0 μl (120 μmol) of DBU are added, followed by stirring for 24 hours. The reaction medium is hydrolyzed by adding 6 ml of water and then extracted with DCM (3 * 6 ml). The organic phases are combined, washed with saturated NaCl solution (8 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel using a DCM / methanol mixture 100/0 to 90/10 as eluent. Compound 60 is obtained as a white solid (46 mg, 74%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6): 0.76 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 0.78 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.30 (m, 1H); 1.49 to 1.63 (m, 2H); 1.82 (m, 1H); 2.27 (m, 1H); 2.63 to 2.74 (m, 2H); 2.95 to 3.05 (m, 3H); 3.25 to 3.38 (partially masked m, 1H); 3.81 (s, 3H);
3.92 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,46 (s, 2 H) ; 4,92 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,7 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 7,38 (d, J=8,3 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 724 [M + H]+ ; m/z = 722 [M - H]" ; m/z = 768 [M - H + HCO2H]" pic de base ; tR = 1 ,18 min. 3.92 (d, J = 1.9 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.6 and 8.0 and 11.5 Hz, 1H); 4.46 (s, 2H); 4.92 (dd, J = 3.6 and 9.6 Hz, 1H); 5.1 (ddd, J = 1.5 and 5.7 and 11.3 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 1.5 and 15.1 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 3.8 and 11, 3 and 15.1 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.6 Hz, 1H); 7.22 (dd, J = 2.6 and 9.5 Hz, 1H); 7.28 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 7.34 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 7.38 (d, J = 8.3 Hz, 2H); 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 724 [M + H] + ; m / z = 722 [M - H] ', m / z = 768 [M - H + HCO 2 H] "base peak; t R = 1, 18 min.
Composé 61 : Acide (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoïque Compound 61: Acid (1- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-chloro-4-methoxy] benzyl] -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl} -ethyl) oxiranyl ] -benzyl} -1H-1, 2,3-triazol-4-yl) -butanoic
A une suspension de 22 mg (30,4 μmol) du composé 60 dans 500 μl d'eau est ajoutée une solution de 6,8 mg (60,8 μmol) d'acide 5-hexynoïque dans 500 μl de THF. Sont ensuite ajoutés 122 μl (12,2 μmol) d'une solution aq. 0,1 M de sulfate de cuivre et 122 μl (24,3 μmol) d'une solution aq. 0,2M d'ascorbate de sodium. L'agitation est poursuivie pendant 2 h à TA. Le mélange est hydrolyse par addition de 2 ml d'eau puis extrait avec de TAcOEt (3 * 2 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (3 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 61 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,4 mg, 76%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de): 0,73 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ;1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,29 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,76 à 1 ,85 (m, 3 H) ; 2,20 à 2,30 (m, 3 H) ; 2,62 (t, J=7,7 Hz, 2 H) ; 2,65 à 2,72 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,28 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,10 (ddd, J=1 ,6 et 5,2 et 1 1 ,2 Hz, 1 H) ; 5,53 (s, 2 H) ; 5,78 (dd, J=1 ,6 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,7 et 1 1 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,3 et 9,5 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,92 (s, 1 H) ; 8,37 (d large, J=8,0 Hz, 1 H) ; 12,03 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 836 [M + H]+ ; m/z = 418,5 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 834 [M - H]" ; tR = 1 ,04 min. Composé 62 : (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tétraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-en-iδ-ylJ-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de méthyle A une solution de 5 mg (6 μmol) du composé 61 dans 500 μl de DCM et 200 μl de méthanol sont ajoutés 4,5 μl (9,0 μmol) d'une solution de triméthylsilyldiazométhane 2M dans l'hexane. L'agitation est poursuivie 30 min. Le mélange est concentré sous PR et purifié par filtration sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le composé 62 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (5 mg, 98%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,72 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,99 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,59 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 1 ,83 (m, 2 H) ; 2,25 (m, 1 H) ; 2,35 (t, J=7,6 Hz, 2 H) ; 2,62 (t, J=7,6 Hz, 2 H) ; 2,65 à 2,72 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 à 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,57 (s, 3 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,3 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,89 (dd, J=3,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,09 (ddd, J=1 ,5 et 5,4 et 1 1 ,4 Hz, 1 H) ; 5,53 (s, 2 H); 5,78 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,4 et 11 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,0 et 8,8 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,5 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,92 (s, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 850 [M + H]+ ; m/z = 425,5 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 848 [M - H]" ; m/z = 894 [M - H + HCO2H]" pic de base ; tR = 1 ,11 min. To a suspension of 22 mg (30.4 μmol) of compound 60 in 500 μl of water is added a solution of 6.8 mg (60.8 μmol) of 5-hexynoic acid in 500 μl of THF. 122 μl (12.2 μmol) of an aq solution are then added. 0.1 M copper sulfate and 122 μl (24.3 μmol) of aq solution. 0.2M sodium ascorbate. Stirring is continued for 2 h at RT. The mixture is hydrolyzed by addition of 2 ml of water and then extracted with TAcOEt (3 * 2 ml). The organic phases are combined, washed with saturated NaCl solution (3 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel using a DCM / methanol mixture 98/2 to 90/10 as eluent. Compound 61 is obtained as a white solid (19.4 mg, 76%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-de): 0.73 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 0.75 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1, 04 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 11 (s, 3H); 1.29 (m, 1H); 1.50-1.59 (m, 2H); 1.76 to 1.85 (m, 3H); 2.20 to 2.30 (m, 3H); 2.62 (t, J = 7.7 Hz, 2H); 2.65 to 2.72 (m, 2H); 2.94 to 3.04 (m, 3H); 3.28 to 3.38 (partially masked m, 1H); 3.81 (s, 3H); 3.89 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.6 and 8.0 and 11.5 Hz, 1H); 4.90 (dd, J = 3.6 and 9.6 Hz, 1H); 5.10 (ddd, J = 1, 6 and 5.2 and 11.2 Hz, 1H); 5.53 (s, 2H); 5.78 (dd, J = 1, 6 and 15.0 Hz, 1H); 6.46 (ddd, J = 3.7 and 11, 2 and 15.0 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 1, 9 and 8.5 Hz, 1H); 7.22 (dd, J = 2.3 and 9.5 Hz, 1H); 7.28 (d, J = 1.9 Hz, 1H); 7.31 (s, 4H); 7.92 (s, 1H); 8.37 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 12.03 (very spread m, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 836 [M + H] + ; m / z = 418.5 [M + 2H] 2+ base peak; m / z = 834 [M - H] "; t R = 1, 04 min Compound 62: (1- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) -. (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] -3-isobutyl-δ, δ-dimethyl-η-tetraoxo-1-dioxa-δ.H- Methyl diaza-cyclohexadec-1-en-1-yl-ethyl-oxiranyl] -benzyl} -1H-1,2,3-triazol-4-yl) -butanoate To a solution of 5 mg (6 μmol) of compound 61 in 500 μl of DCM and 200 μl of methanol are added 4.5 μl (9.0 μmol) of a solution of 2M trimethylsilyldiazomethane in hexane. Stirring is continued for 30 minutes. The mixture is concentrated under RP and purified by filtration on silica gel, eluting with a 98/2 DCM / methanol mixture. Compound 62 is obtained as a white solid (5 mg, 98%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.72 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 0.75 (d, J = 6.4 Hz, 3H); 0.99 (s, 3H); 1, 04 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 11 (s, 3H); 1.28 (m, 1H); 1.50-1.59 (m, 2H); 1.79 (m, 1H); 1.83 (m, 2H); 2.25 (m, 1H); 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H); 2.62 (t, J = 7.6 Hz, 2H); 2.65 to 2.72 (m, 2H); 2.94 to 3.05 (m, 3H); 3.25 to 3.38 (partially masked m, 1H); 3.57 (s, 3H); 3.81 (s, 3H); 3.89 (d, J = 1.5 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.7 and 8.3 and 11.4 Hz, 1H); 4.89 (dd, J = 3.4 and 9.8 Hz, 1H); 5.09 (ddd, J = 1.5 and 5.4 and 11.4 Hz, 1H); 5.53 (s, 2H); 5.78 (dd, J = 1.5 and 15.2 Hz, 1H); 6.46 (ddd, J = 3.4 and 11, 4 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.0 and 8.8 Hz, 1H); 7.22 (dd, J = 2.5 and 9.8 Hz, 1H); 7.28 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 7.31 (s, 4H); 7.92 (s, 1H); 8.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 850 [M + H] + ; m / z = 425.5 [M + 2H] 2+ base peak; m / z = 848 [M - H] ', m / z = 894 [M - H + HCO 2 H] "base peak; t R = 1, 11 min.
Exemple 19 : (1-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-Chloro-4-méthoxy-benzyl]-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-1 H-1 ,2,3-triazol-4-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Example 19: (1- {4 - [(2R, 3R) -3 - ((S) -1 - {(E) - (3S, 10R, 16S) -10- [3-Chloro-4-methoxy-benzyl] Isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl} -ethyl) oxiranyl] 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl -benzyl} -1H-1, 2,3-triazol-4-yl) -butanoate
A une solution, purgée à l'argon, de 13,4 mg (16 μmol) du composé 61 dans 1 ,2 ml de THF sont successivement ajoutés 8,4 μl (48,1 μmol) de DIPEA et 8,21 mg (32,04 μmol) de carbonate de N,N'-disuccinimidyle. L'agitation est poursuivie à TA pendant 26 h. Le mélange est hydrolyse par addition de 2 ml d'eau puis extrait avec 2x2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par filtration sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le produit obtenu contient 0,15 mol de NHS. Il est repris dans 2 ml de DCM et lavé avec de l'eau (2x3 ml) puis séché sur MgSO4. Après filtration et concentration à sec, on obtient le composé Ex19 sous la forme d'un solide blanc (12,56 mg, 84%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,73 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,75 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,60 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 1 ,95 (quin, J=7,5 Hz, 2 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,65 à 2,77 (m, 6 H) ; 2,81 (s large, 4 H) ; 2,92 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,89 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,1 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,09 (ddd, J=1 ,4 et 5,5 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,54 (s, 2 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,4 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,46 (ddd, J=3,8 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 (dd, J=2,5 et 9,6 Hz, 1 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,31 (s, 4 H) ; 7,95 (s, 1 H) ; 8,33 (d, JJ==88,,11 HHzz,, 11 HH)).. LLCCMMSS ((AA22)) :: EESS mm//zz == 993333 [[MM ++ H]+ ; m/z = 467 [M + 2H]2+ pic de base ; m/z = 977 [M - H + HCO2H]" pic de base ; tR = 1 ,08 min. To a solution, purged with argon, of 13.4 mg (16 μmol) of compound 61 in 1, 2 ml of THF are successively added 8.4 μl (48.1 μmol) of DIPEA and 8.21 mg ( 32.04 μmol) of N, N'-disuccinimidyl carbonate. Stirring is continued at RT for 26 hours. The mixture is hydrolyzed by adding 2 ml of water and then extracted with 2x2 ml of AcOEt. The organic phases are combined and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by filtration on silica gel, eluting with a 98/2 DCM / methanol mixture. The product obtained contains 0.15 mol of NHS. It is taken up in 2 ml of DCM and washed with water (2 × 3 ml) and then dried over MgSO 4 . After filtration and concentration to dryness, the compound Ex19 is obtained in the form of a white solid (12.56 mg, 84%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.73 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 0.75 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1, 04 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 11 (s, 3H); 1.30 (m, 1H); 1.49 to 1.60 (m, 2H); 1.79 (m, 1H); 1.95 (quin, J = 7.5 Hz, 2H); 2.26 (m, 1H); 2.65 to 2.77 (m, 6H); 2.81 (brs, 4H); 2.92 to 3.05 (m, 3H); 3.34 (partially masked m, 1H); 3.81 (s, 3H); 3.89 (d, J = 1, 9 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.7 and 8.1 and 11.5 Hz, 1H); 4.90 (dd, J = 3.6 and 9.6 Hz, 1H); 5.09 (ddd, J = 1, 4 and 5.5 and 11.3 Hz, 1H); 5.54 (s, 2H); 5.79 (dd, J = 1, 4 and 15.1 Hz, 1H); 6.46 (ddd, J = 3.8 and 11, 3 and 15.1 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.21 (dd, J = 2.5 and 9.6 Hz, 1H); 7.28 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 7.31 (s, 4H); 7.95 (s, 1H); 8.33 (d, J = 88, 11 HHz, 11 HH)). LLCCMMSS ((AA22)) :: EESS mm // zz = 993333 [[MM ++ H] + ; m / z = 467 [M + 2H] 2+ base peak; m / z = 977 [M-H + HCO 2 H] - peak base, t R = 1. 08 min.
Exemple 20 : 3-(2-{2-[2-(2-{1 -[1 -(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1 -((E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy- benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn- 16-yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-1,2,3-triazol-1-yl]-méthoxy}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxa-pyrrolidin-1-yle Example 20: 3- (2- {2- [2- (2- {1 - [1 - (4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec Methyl-13-en-16-yl) -ethyl] oxiranyl} -benzyl) -1,2,3-triazol-1-yl] -methoxy-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoate , 5-dioxa-pyrrolidin-1-yl
Composé 63 : 2-{2-[2-(2-Prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthanol Compound 63: 2- {2- [2- (2-Prop-2-ynyloxy-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethanol
A une solution, purgée à l'argon et refroidie à 0°C, de 1 g (5,15 mmol) de tetraethylèneglycol dans 25 ml de THF anhydre sont ajoutés 144 mg (3,60 mmol) de NaH à 60% en dispersion dans une huile minérale. L'agitation est poursuivie 30 min à 0°C puis 194 μl (2,58 mmol) de bromure de propargyle sont ajoutés. L'agitation est poursuivie à TA pendant 15 h. Le mélange est concentré sous PR puis le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 63 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (789 mg, 65%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 3,40 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,42 (t, J=5,5 Hz, 2 H) ; 3,48 (q, J=5,5 Hz, 2 H) ; 3,51 à 3,58 (m, 12 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 4,53 (t, J=5,5 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 233 [M + H]+ ; tR = 0,38 min. To a solution, purged with argon and cooled to 0 ° C, 1 g (5.15 mmol) of tetraethyleneglycol in 25 ml of anhydrous THF are added 144 mg (3.60 mmol) of 60% NaH in dispersion. in a mineral oil. Stirring is continued for 30 minutes at 0 ° C. and then 194 μl (2.58 mmol) of propargyl bromide are added. Stirring is continued at RT for 15 h. The mixture is concentrated under RP and the crude product is purified by chromatography on silica gel, using a 98/2 to 90/10 DCM / methanol mixture as eluent. Compound 63 is obtained as a colorless oil (789 mg, 65%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 3.40 (t, J = 2.4 Hz, 1H); 3.42 (t, J = 5.5 Hz, 2H); 3.48 (q, J = 5.5 Hz, 2H); 3.51 to 3.58 (m, 12H); 4.14 (d, J = 2.4 Hz, 2H); 4.53 (t, J = 5.5 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 233 [M + H] + ; t R = 0.38 min.
Composé 64 : 3-(2-{2-[2-(2-Prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de tert- butyle Compound 64: tert-butyl 3- (2- {2- [2- (2-prop-2-ynyloxy-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoate
A une solution, purgée à l'argon, de 790 mg (3,40 mmol) du composé 63 dans 8,8 ml de THF anhydre sont ajoutés 4,4 mg (190 μmol) de sodium. Le mélange est chauffé à 40°C pendant 2 h pour le solubiliser entièrement ; après retour à TA, 740 μl (5,09 mmol) d'acrylate de fert-butyle sont ajoutés au mélange. L'agitation est poursuivie pendant 15 h à TA puis le mélange est concentré sous PR et le brut purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 64 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (944 mg, 77%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): 1 ,44 (s, 9 H) ; 2,41 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 3,38 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,46 à 3,62 (m, 16 H) ; 3,59 (t, J=6,2 Hz, 2 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H). LCMS (A1 ) : ES m/z = 361 [M + H]+ ; m/z = 383 [M + Na]+ ; tR = 3,79 min. To a solution, purged with argon, of 790 mg (3.40 mmol) of compound 63 in 8.8 ml of anhydrous THF are added 4.4 mg (190 μmol) of sodium. The mixture is heated at 40 ° C for 2 h to solubilize it completely; after returning to RT, 740 μl (5.09 mmol) of tert-butyl acrylate are added to the mixture. Stirring is continued for 15 h at RT, then the mixture is concentrated under RP and the crude purified by chromatography on silica gel, using as eluent a 98/2 to 90/10 DCM / methanol mixture. Compound 64 is obtained as a colorless oil (944 mg, 77%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): 1.44 (s, 9H); 2.41 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 3.38 (t, J = 2.4 Hz, 1H); 3.46 to 3.62 (m, 16H); 3.59 (t, J = 6.2 Hz, 2H); 4.14 (d, J = 2.4 Hz, 2 H). LCMS (A1) ES m / z = 361 [M + H] + ; m / z = 383 [M + Na] + ; t R = 3.79 min.
Composé 65 : Acide 3-(2-{2-[2-(2-prop-2-ynyloxy-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque Compound 65: 3- (2- {2- [2- (2-prop-2-ynyloxy-ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoic acid
A une solution de 944 mg (2,62 mmol) de∞mposé 64 sont ajoutés 2 ml (52,4 mmol) de TFA. Le mélange est agité 6 h à TA puis concentré à sec, repris dans le minimum de DCM et plusieurs entraînements au toluène sont effectués. Le composé 65 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (722 mg, 91 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 2,44 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,46 à 3,56 (m, 16 H) ; 3,60 (t, J=6,4 Hz, 2 H) ; 4,14 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 7,44 à 9,73 (m très étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 305 [M + H]+ ; m/z = 303 [M - H]-; tR = 0,48 min. To a solution of 944 mg (2.62 mmol) of compound 64 are added 2 ml (52.4 mmol) of TFA. The mixture is stirred for 6 h at RT and then concentrated to dryness, taken up in the minimum of DCM and several toluene workouts are carried out. Compound 65 is obtained as a colorless oil (722 mg, 91%). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 2.44 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 3.39 (t, J = 2.4 Hz, 1H); 3.46 to 3.56 (m, 16H); 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 4.14 (d, J = 2.4 Hz, 2H); 7.44 to 9.73 (m very spread, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 305 [M + H] + ; m / z = 303 [M-H] -; t R = 0.48 min.
Exemple 20 : 3-(2-{2-[2-(2-{1-[1-(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy- benzyO-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.δ.θ.^-tetraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-èn-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-1 ,2,3-triazol-1-yl]-méthoxy}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)- propanoate de 2,5-dioxa-pyrrolidin-1-yle Example 20: 3- (2- {2- [2- (2- {1- [1- (4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -S-isobutyl-δ-dimethyl-δ-diethyl-tetraoxo-1-dioxa-δ-H-diaza-cyclohexadec-IS- 1- (2-yl) -ethyl] -oxiranyl} -benzyl) -1,2,3-triazol-1-yl] -methoxy} -ethoxy) -ethoxy] -ethoxy} -ethoxy) -propanoate 2.5 g. dioxa-pyrrolidin-1-yl
L'exemple 20 peut être obtenu à partir des composés 60 et 65 selon la méthode décrite pour le composé 61 puis en activant l'acide selon la méthode décrite pour l'exemple 19. Exemple 21 : (4-{1 -[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1 -((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)- éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1,2,3-triazol-1-yl)-butanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle  Example 20 can be obtained from compounds 60 and 65 according to the method described for compound 61 and then activating the acid according to the method described for example 19. Example 21: (4- {1 - [(4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- {3-chloro-4-methoxy-benzyl} -3-isobutyl-6, 6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl] -oxiranyl} -benzyl) -methylamino] methyl 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl} -1,2,3-triazol-1-yl) -butanoate
Composé 66 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)- 1-((2R,3R)-3-{4-[(méthyl-prop-2-ynyl-amino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-1 ,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone Compound 66: (E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-16 - [(S) - 1 - (( 2R, 3R) -3- {4 - [(methyl-prop-2-ynyl-amino) -methyl] -phenyl} -oxiranyl) -ethyl] -1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13 ene-2,5,9,12-tetraONE
A une solution, purgée à l'argon, de 40 mg (55,7 μmol) du composé 2 dans 5 ml d'acétonitrile anhydre sont successivement ajoutés 48,5 μl (279 μmol) de DIPEA et 13,9 μl (167 μmol) de N- méthylpropargylamine. Le mélange est chauffé à 40°C pendant 15 h. Il reste du composé 2 de départ : sont à nouveau ajoutés 48,5 μl (279 μmol) de DIPEA et 13,9 μl (167 μmol) de N- méthylpropargylamine. Après 24 h d'agitation à 40°C, le mélange est dilué avec 5 ml d'AcOEt puis lavé avec 5 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*5 ml d'AcOEt, les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaHCOs (10 ml), une solution saturée de NaCl (10 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 66 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (45 mg, quant.). RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe): 0,78 (m, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,20 (s, 3 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,63 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,17 (t, J=2,4 Hz, 1 H) ; 3,27 (d, J=2,4 Hz, 2 H) ; 3,33 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,50 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=1 ,7 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,4 et 7,8 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 4,92 (dd, J=3,5 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,5 et 11 ,2 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 11 ,2 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,1 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,1 et 9,4 Hz, 1 H) ; 7,25 à 7,33 (m, 5 H) ; 8,33 (d, J=7,8 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 750 [M + H]+ ; ES m/z = 375,5 [M + 2H]2+ pic de base ; ES m/z = 748 [M - H]- ; m/z = 794 [M - H + HCO2H]- ; tR = 0,91 min. To a solution, purged with argon, of 40 mg (55.7 μmol) of compound 2 in 5 ml of anhydrous acetonitrile are successively added 48.5 μl (279 μmol) of DIPEA and 13.9 μl (167 μmol ) N-methylpropargylamine. The mixture is heated at 40 ° C for 15 h. Of the starting compound 2, 48.5 μl (279 μmol) of DIPEA and 13.9 μl (167 μmol) of N-methylpropargylamine are again added. After stirring for 24 h at 40 ° C., the mixture is diluted with 5 ml of AcOEt and then washed with 5 ml of water. The phase aq. is extracted with 3 * 5 ml of AcOEt, the organic phases are combined, washed with saturated NaHCO 3 solution (10 ml), saturated NaCl solution (10 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on silica gel using a DCM / methanol mixture 98/2 to 90/10 as eluent. Compound 66 is obtained as a white solid (45 mg, quant.). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-cfe): 0.78 (m, 6H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.30 (m, 1H); 1.49 to 1.61 (m, 2H); 1.81 (m, 1H); 2.20 (s, 3H); 2.28 (m, 1H); 2.63 to 2.76 (m, 2H); 2.92 to 3.07 (m, 3H); 3.17 (t, J = 2.4 Hz, 1H); 3.27 (d, J = 2.4 Hz, 2H); 3.33 (partially masked m, 1H); 3.50 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.88 (d, J = 1.7 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.4 and 7.8 and 11.4 Hz, 1H); 4.92 (dd, J = 3.5 and 9.7 Hz, 1H); 5.1 (ddd, J = 1.5 and 5.5 and 11.2 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 1.5 and 15.0 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.9 and 11, 2 and 15.0 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.1 and 8.6 Hz, 1H); 7.22 (dd, J = 2.1 and 9.4 Hz, 1H); 7.25-7.33 (m, 5H); 8.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 750 [M + H] + ; ES m / z = 375.5 [M + 2H] 2+ base peak; ES m / z = 748 [M-H] -; m / z = 794 [M - H + HCO 2 H] -; t R = 0.91 min.
Composé 67 : 4-Azido-butyrate d'éthyle Compound 67: 4-ethyl azido-butyrate
2,86 ml (20 mmol) de 4-bromo-butanoate d'éthyle et 2,6 g (40 mmol) de NaN3 sont mis en solution dans 30 ml d'un mélange acétone/eau 2/1. Le mélange est chauffé 7 h au reflux. Après retour à TA et concentration sous PR, le résidu est repris dans 50 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*30 ml de DCM. Les phases organiques sont réunies, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous PR pour donner le composé 67 sous la forme d'une huile incolore (3 g, 95%). RMN 1H (400 MHz, chloroforme-cf): 1 ,27 (t, J=7,2 Hz, 3 H) ; 1 ,92 (m, 2 H) ; 2,41 (t, J=7,2 Hz, 2 H) ; 3,36 (t, J=6,7 Hz, 2 H) ; 4,15 (q, J=7,2 Hz, 2 H). 2.86 ml (20 mmol) of ethyl 4-bromo-butanoate and 2.6 g (40 mmol) of NaN 3 are dissolved in 30 ml of a 2/1 acetone / water mixture. The mixture is heated for 7 hours under reflux. After returning to RT and concentration under RP, the residue is taken up in 50 ml of water. The phase aq. is extracted with 3 * 30 ml of DCM. The organic phases are combined, dried over MgSO 4 , filtered and concentrated under RP to give compound 67 as a colorless oil (3 g, 95%). 1 H NMR (400 MHz, chloroform-cf): 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 1.92 (m, 2H); 2.41 (t, J = 7.2 Hz, 2H); 3.36 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 4.15 (q, J = 7.2 Hz, 2H).
Composé 68 : Acide 4-azido-butanoïque Compound 68: 4-azido-butanoic acid
A une solution de 3 g (19,9 mmol) du composé 67 dans 47 ml de méthanol et 37 ml d'eau sont ajoutés, par petites fractions, 5,58 g (99,5 mmol) de potasse. Le mélange est agité à TA pendant 6 h puis concentré sous PR jusqu'à environ 28 ml. Le résidu est dilué avec 25 ml d'eau et extrait avec 2x20 ml de DCM. La phase aq. est acidifiée à pH≈1 par addition d'HCl concentré puis extraite avec 3*25 ml d'éther diéthylique. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (25 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration à sec sous PR, le composé 68 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (2,05 g, 80%). RMN 1H (400 MHz, chloroforme-cf): 1 ,93 (m, 2 H) ; 2,49 (t, J=7,1 Hz, 2 H) ; 3,39 (t, J=6,7 Hz, 2 H) ; 11 ,24 (m étalé, 1 H). Composé 69 : Acide (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-méthoxy- benzylJ-S-isobutyl-δ.δ-diméthyl^.S.Θ.^-tétraoxo-i ^-dioxa-δ.H-diaza-cyclohexadec-IS-en-iδ- yl)-éthyl]-oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoïque To a solution of 3 g (19.9 mmol) of compound 67 in 47 ml of methanol and 37 ml of water are 5.58 g (99.5 mmol) of potassium hydroxide added in small portions. The mixture is stirred at RT for 6 h and then concentrated under RP to about 28 ml. The residue is diluted with 25 ml of water and extracted with 2x20 ml of DCM. The phase aq. is acidified to pH≈1 by addition of concentrated HCl and then extracted with 3.25 ml of diethyl ether. The organic phases are combined, washed with saturated NaCl solution (25 ml) and dried over MgSO 4 . After filtration and concentration to dryness under RP, the compound 68 is obtained in the form of a colorless oil (2.05 g, 80%). 1 H NMR (400 MHz, chloroform-cf): 1.93 (m, 2H); 2.49 (t, J = 7.1 Hz, 2H); 3.39 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 11, 24 (spread m, 1H). Compound 69: Acid (4- {1 - [(4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- {3-chloro} 4-Methoxy-benzyl-S-isobutyl-δ-dimethyl-1-yl-tetraoxo-1-dioxa-6H-diaza-cyclohexadec-IS-en-yl-ethyl] - oxiranyl} -benzyl) -methylamino] -methyl} -1,2,3-triazol-1-yl) -butanoic
A une solution de 24 mg (32 μmol) du composé 66 dans 545 μl de THF sont successivement ajoutés 8,3 mg (13 μmol) de composé 68, 545 μl d'eau, 128 μl d'une solution aq. 0,1 M de sulfate de cuivre et 128 μl d'une solution aq. 0,2M d'ascorbate de sodium. Le mélange est 45 min agité à TA puis dilué avec 2 ml d'eau. La phase aq. est extraite avec 3*2 ml d'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (2 ml) et filtrées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice greffée diol en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 90/10. Le composé 69 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (22,6 mg, 80%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,76 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,11 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,50 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,81 (m, 1 H) ; 2,03 (m, 2 H) ; 2,10 (s, 3 H) ; 2,20 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 2,30 (m, 1 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,03 (m, 3 H) ; 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,61 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 7,7 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,37 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,5 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (dd, J=1 ,5 et 15,1 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,7 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,23 (dd, J=2,5 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,02 (s, 1 H) ; 8,39 (d large, J=7,7 Hz, 1 H) ; 12,14 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 879 [M + H]+ ; m/z = 877 [M - H]- ; tR = 0,86 min. To a solution of 24 mg (32 μmol) of compound 66 in 545 μl of THF are successively added 8.3 mg (13 μmol) of compound 68, 545 μl of water, 128 μl of an aq. 0.1 M copper sulphate and 128 μl of aq. 0.2M sodium ascorbate. The mixture is stirred for 45 minutes at RT and then diluted with 2 ml of water. The phase aq. is extracted with 3 * 2 ml of AcOEt. The organic phases are combined, washed with saturated NaCl solution (2 ml) and filtered through MgSO 4 . After filtration and concentration under RP, the crude is purified by chromatography on diol-grafted silica gel using as eluent a 90/2 DCM / methanol 98/2 mixture. Compound 69 is obtained as a white solid (22.6 mg, 80%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.76 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 0.78 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 11 (s, 3H); 1.30 (m, 1H); 1.50 to 1.62 (m, 2H); 1.81 (m, 1H); 2.03 (m, 2H); 2.10 (s, 3H); 2.20 (t, J = 7.0 Hz, 2H); 2.30 (m, 1H); 2.64 to 2.74 (m, 2H); 2.94 to 3.03 (m, 3H); 3.35 (partially masked m, 1H); 3.48 (s, 2H); 3.61 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.7 and 7.7 and 11.5 Hz, 1H); 4.37 (t, J = 7.0 Hz, 2H); 4.91 (dd, J = 3.6 and 9.6 Hz, 1H); 5.11 (ddd, J = 1.5 and 5.5 and 11.3 Hz, 1H); 5.80 (dd, J = 1.5 and 15.1 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.7 and 11, 3 and 15.1 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.23 (dd, J = 2.5 and 9.8 Hz, 1H); 7.26 (d, J = 8.5 Hz, 2H); 7.28 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 7.34 (d, J = 8.5 Hz, 2H); 8.02 (s, 1H); 8.39 (broad d, J = 7.7 Hz, 1H); 12.14 (m spread, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 879 [M + H] + ; m / z = 877 [M-H] -; t R = 0.86 min.
Composé 70 : (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-Chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoate de méthyle Compound 70: (4- {1 - [(4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- (3-Chloro-4) Methoxy-benzyl-3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl Methyl (oxiranyl) benzyl) methylamino] methyl] -1,2,3-triazol-1-yl) butanoate
A une solution, purgée à l'argon, de 5,5 mg (6,2 μmol) du composé 69 dans 0,5 ml de DCM et 0,2 ml de méthanol sont ajoutés 4,7 μl (9,3 μmol) de triméthylsilyldiazométhane. Le mélange est agité 45 min à TA puis concentré à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant un mélange DCM/méthanol 98/2 à 95/5. Le composé 70 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (3,4 mg, 62%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,75 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,77 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,1 1 (s, 3 H) ; 1 ,28 (m, 1 H) ; 1 ,49 à 1 ,61 (m, 2 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 2,07 (m, 2 H) ; 2,10 (m, 3 H) ; 2,26 (m, 1 H) ; 2,31 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 2,62 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,93 à 3,04 (m, 3 H) ; 3,27 à 3,37 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,48 (s, 2 H) ; 3,58 (s, 3 H) ; 3,61 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,2 et 11 ,6 Hz, 1 H) ; 4,38 (t, J=7,0 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,9 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,11 (ddd, J=1 ,5 et 5,3 et 1 1 ,2 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,9 et 1 1 ,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,16 (dd, J=2,2 et 8,6 Hz, 1 H) ; 7,22 (dd, J=2,4 et 9,8 Hz, 1 H) ; 7,26 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 7,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 7,33 (d, J=8,6 Hz, 2 H) ; 8,03 (s, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 893 [M + H]+ ; m/z = 447 [M + 2H]2+ pic de base; m/z = 891 [M - H]- ; m/z = 937 [M -H + HCO2H]- pic de base ; tR = 0,90 min. To a solution, purged with argon, of 5.5 mg (6.2 μmol) of compound 69 in 0.5 ml of DCM and 0.2 ml of methanol are added 4.7 μl (9.3 μmol) trimethylsilyldiazomethane. The mixture is stirred for 45 minutes at RT and then concentrated to dryness. The crude is purified by chromatography on silica gel using a 95/2 DCM / methanol mixture as eluent. Compound 70 is obtained as a white solid (3.4 mg, 62%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.75 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 0.77 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1.11 (s, 3H); 1.28 (m, 1H); 1.49 to 1.61 (m, 2H); 1.80 (m, 1H); 2.07 (m, 2H); 2.10 (m, 3H); 2.26 (m, 1H); 2.31 (t, J = 7.0 Hz, 2H); 2.62 to 2.74 (m, 2H); 2.93 to 3.04 (m, 3H); 3.27 to 3.37 (partially masked m, 1H); 3.48 (s, 2H); 3.58 (s, 3H); 3.61 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.7 and 8.2 and 11.6 Hz, 1H); 4.38 (t, J = 7.0 Hz, 2H); 4.91 (dd, J = 3.9 and 9.8 Hz, 1H); 5.11 (ddd, J = 1.5 and 5.3 and 11.2 Hz, 1H); 5.79 (dd, J = 1.5 and 15.2 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.9 and 1 1, 2 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 7.16 (dd, J = 2.2 and 8.6 Hz, 1H); 7.22 (dd, J = 2.4 and 9.8 Hz, 1H); 7.26 (d, J = 8.6 Hz, 2H); 7.28 (d, J = 2.2 Hz, 1H); 7.33 (d, J = 8.6 Hz, 2H); 8.03 (s, 1H); 8.34 (d, J = 8.2 Hz, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 893 [M + H] + ; m / z = 447 [M + 2H] 2+ base peak; m / z = 891 [M-H] -; m / z = 937 [M-H + HCO 2 H] - base peak; t R = 0.90 min.
Exemple 21 : (4-{1-[(4-{(2R,3R)-3-[(S)-1-((E)-(3S,10R,16S)-10-{3-chloro-4-méthoxy-benzyl}-3- isobutyl-6,6-diméthyl-2, 5,9,12-tétraoxo-1 ,4-dioxa-8, 11 -diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl)-éthyl]- oxiranyl}-benzyl)-méthylamino]-méthyl}-1 ,2,3-triazol-1-yl)-butanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Example 21: (4- {1 - [(4 - {(2R, 3R) -3 - [(S) -1 - ((E) - (3S, 10R, 16S) -10- {3-chloro-4 Methoxy-benzyl-3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl) -ethyl 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl] oxiranyl} benzyl) methylamino] methyl] -1,2,3-triazol-1-yl) butanoate
L'exemple 21 peut être obtenu par activation de l'acide 69 selon la méthode décrite pour l'exemple 19. Exemple 22  Example 21 can be obtained by activation of the acid 69 according to the method described for Example 19. EXAMPLE 22
Composé 71 : (E)-(3S,10R,16S)-16-((S)-1-r(2S,3S)-3-(4-Azidométhvl-phénvl)-oxiranvll-éthyl)-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone Compound 71: (E) - (3S, 10R, 16S) -16 - ((S) -1-r (2S, 3S) -3- (4-Azidomethyl-phenyl) oxiranyl-ethyl) -10- (3) 4-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
L'al∞ol 57 (36 mg ; 51 ,48 μmol, préparé selon Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985- 3007) est placé en solution dans le THF anhydre (2 ml). La solution est purgée à l'argon et refroidie avec un bain d'eau glacée avant d'additionner le DPPA (74 μmol) puis le DBU (80 μmol). Le mélange est laissé revenir à TA et l'agitation est poursuivie toute la nuit. Le lendemain, la solution est de nouveau refroidie avec un bain d'eau glacée puis sont ajoutés 74 μmol de DPPA et 80 μmol de DBU supplémentaires. Après 2 h de réaction à 0°C et 2 h à TA, le mélange est hydrolyse avec 5 ml d'eau puis est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous PR. Le brut est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 57 est obtenu sous forme d'un solide incolore (24 mg ; 64%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,84 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,86 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ;0,98 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,48 à 1 ,67 (m, 3 H) ; 1 ,88 (m, 1 H) ; 2,45 (m, 1 H) ;2,63 (m, 1 H) ; 2,71 (dd, J=11 ,5 et 14,0 Hz, 1 H) ; 2,97 à 3,08 (m, 3 H) ; 3,36 (m partiellement masqué, 1 H); 3,82 (s large, 4 H) ; 4,28 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,5 Hz, 1 H) ; 4,44 (s, 2 H) ; 4,99 (dd, J=3,7 et 9,5 Hz, 1 H) ; 5,12 (ddd, J=1 ,4 et 5,7 et 11 ,4 Hz, 1 H) ; 5,88 (dd, J=1 ,4 et 15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 11 ,4 et15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,26 à 7,32 (m, 4 H) ; 7,36 (d,J=8,5 Hz, 2 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 722 [M - H]- ; m/z = 724 [M + H]+ ; m/z = 768 [M + HCO2H - H]" ; tR = 1 , 19 min. Alolol 57 (36 mg, 51.48 μmol, prepared according to Al-awar RS, et al., J.Med.Chem.2003, 46, 2985-3007) is placed in solution in anhydrous THF (2 ml). The solution is purged with argon and cooled with an ice-water bath before adding the DPPA (74 μmol) then the DBU (80 μmol). The mixture is allowed to return to RT and stirring is continued overnight. The next day, the solution is cooled again with an ice-water bath, then 74 μmol of DPPA and 80 μmol of additional DBU are added. After 2 h of reaction at 0 ° C. and 2 h at RT, the mixture is hydrolyzed with 5 ml of water and is then extracted 3 times with DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated under RP. The crude is then purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 95/5. Compound 57 is obtained as a colorless solid (24 mg, 64%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-α) δ (ppm): 0.84 (d, J = 6.3 Hz, 3H); 0.86 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.98 (d, J = 7.1 Hz, 3H); 1, 03 (s, 3H); 1, 15 (s, 3H); 1.48 to 1.67 (m, 3H); 1.88 (m, 1H); 2.45 (m, 1H), 2.63 (m, 1H); 2.71 (dd, J = 11, 5 and 14.0 Hz, 1H); 2.97 to 3.08 (m, 3H); 3.36 (partially masked m, 1H); 3.82 (bs, 4H); 4.28 (ddd, J = 3.6 and 8.0 and 11.5 Hz, 1H); 4.44 (s, 2H); 4.99 (dd, J = 3.7 and 9.5 Hz, 1H); 5.12 (ddd, J = 1, 4 and 5.7 and 11.4 Hz, 1H); 5.88 (dd, J = 1, 4 and 15.2 Hz, 1H); 6.49 (ddd, J = 3.8 and 11, 4 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.18 (dd, J = 2.2 and 8.5 Hz, 1H); 7.26-7.32 (m, 4H); 7.36 (d, J = 8.5 Hz, 2H); 8.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2): ES m / z = 722 [M-H] -; m / z = 724 [M + H] + ; m / z = 768 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 1, 19 min.
Composé 72 : (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2S,3S)-3-(4-Aminométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone Compound 72: (E) - (3S, 10R, 16S) -16 - {(S) -1 - [(2S, 3S) -3- (4-Aminomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl} -10- ( 3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone
Le composé 71 (22 mg, 30,38 μmol) est mis en solution dans un mélange méthanol (1 ml) / eau (0,2 ml) avant addition de TCEP (34,89 μmol). La solution obtenue est laissée sous agitation toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est ensuite repris avec une solution aq. saturée en NaHCOβ et extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. L'intermédiaire 72 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide incolore (21 mg, 99%) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. LCMS (A5) : ES m/z = 696 [M - H]- ; m/z = 698 [M + H]+ ; m/z = 742 [M + HCO2H - H]" ; fo = 3,19 min. Compound 71 (22 mg, 30.38 μmol) is dissolved in a mixture of methanol (1 ml) / water (0.2 ml) before addition of TCEP (34.89 μmol). The resulting solution is left stirring overnight at RT and is concentrated under RP. The residue is then taken up with aq solution. saturated with NaHCOβ and extracted 3 times with DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under RP. Intermediate 72 is thus obtained as a colorless solid (21 mg, 99%) which is used crude in the next step. LCMS (A5): ES m / z = 696 [M-H] -; m / z = 698 [M + H] + ; m / z = 742 [M + HCO 2 H - H] "; fo = 3.19 min.
Composé 74 : FmocVal-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72 Compound 74: FmocVal-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycin 72
Le composé 72 (21 mg, 30,08 μmol) est mis en solution dans un mélange acétonitrile (2 ml) / DMF anhydre (0,5 ml) avant l'addition d'une solution du composé 73 (23 mg, 30,1 μmol ; préparé selon WO 2006/110476) dans l'acétonitrile (2 ml). Le mélange est laissé 22 h sous agitation à TA puis est concentré sous PR. Le résidu est repris dans le DCM et lavé avec une solution aq. saturée en NaHCOs puis séché sur Na2SO4, fitré et concentré sous PR. Le brut est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 74 est obtenu sous forme d'un solide blanc (22 mg) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. LCMS (A5) : ES m/z = 1325 [M + H]+ ; m/z = 1369 [M + HCO2H - H]" ; tR = 4,30 min. Compound 72 (21 mg, 30.08 μmol) is dissolved in acetonitrile (2 ml) / anhydrous DMF (0.5 ml) before adding a solution of compound 73 (23 mg, 30, 1 μmol, prepared according to WO 2006/110476) in acetonitrile (2 ml). The mixture is stirred for 22 hours at RT and is concentrated under RP. The residue is taken up in DCM and washed with aq solution. saturated with NaHCO 3 then dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under PR. The crude is then purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 90/10. Compound 74 is obtained as a white solid (22 mg) which is used crude in the next step. LCMS (A5): ES m / z = 1325 [M + H] + ; m / z = 1369 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 4.30 min.
Composé 75 : Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72 Compound 75: Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycin 72
Le composé 74 (22 mg, 16,59 μmol) est mis en solution dans le DMF (3 ml) avant addition de pipéridine (150 μl, 1 ,51 mmol) et agitation 30 min à TA. Le mélange est concentré sous PR ; le résidu est mis en solution dans le minimum de méthanol et précipité avec de l'éther. Le composé 75 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (15 mg, 82%). LCMS (A5) : ES m/z = 1103 [M + H]+ ; m/z = 1101 [M - H]- ; m/z = 1 148 [M + HCO2H - H]" ; tR = 3,38 min. Compound 74 (22 mg, 16.59 μmol) is dissolved in DMF (3 ml) before addition of piperidine (150 μl, 1. 51 mmol) and stirring for 30 min at RT. The mixture is concentrated under PR; the residue is dissolved in the minimum of methanol and precipitated with ether. Compound 75 is thus obtained in the form of a white solid (15 mg, 82%). LCMS (A5): ES m / z = 1103 [M + H] + ; m / z = 1101 [M-H] -; m / z = 1148 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 3.38 min.
Composé 76 : Acide glutarique-Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 72 Compound 76: Glutaric acid-Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycin 72
Une solution d'anhydride glutarique (8 mg, 70 μmol) dans le DMF anhydre (200 μl) est additionnée au composé 75 (15 mg, 13,59 μmol) conditionné sous argon. La solution obtenue est agitée toute la nuit à TA avant addition d'une solution aq. saturée en NH4CI et extraction 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. Le résidu obtenu est repris dans le DCM et précipité à l'éther. Après filtration sur fritte et lavage à l'éther, le composé 76 est obtenu sous la forme d'un solide beige (8 mg, 48%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,80 à 0,92 (m, 12 H) ; 0,96 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ;1 ,02 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,30 à 1 ,72 (m, 9 H) ; 1 ,86 (m, 1 H) ; 2,00 (m, 1 H) ; 2,11 à 2,26 (m, 4 H) ;2,42 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,91 à 3,1 1 (m, 5 H) ; 3,38 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,76 (d,J=1 ,8 Hz, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,17 (m, 3 H) ; 4,27 (m, 1 H) ; 4,37 (m, 1 H) ; 4,90 à 5,04 (m, 3 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,50 (m large, 2 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,20 (m étalé, 1 H) ; 6,48 (m, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,1 1 à 7,32 (m, 9 H) ; 7,60 (m, 2 H) ; 7,75 (m, 1 H) ; 7,89 (m, 1 H) ; 8,28 (m étalé, 1 H) ; 8,41 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; 9,92 (s large, 1 H); 12,06 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1217 [M + H]+ ; m/z = 1215 [M - H]- ; tR = 1 ,05 min. A solution of glutaric anhydride (8 mg, 70 μmol) in anhydrous DMF (200 μl) is added to the compound 75 (15 mg, 13.59 μmol) conditioned under argon. The resulting solution is stirred overnight at RT before addition of aq solution. saturated with NH 4 Cl and extraction 3 times with DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under RP. The residue obtained is taken up in DCM and precipitated with ether. After filtration on frit and washing with ether, compound 76 is obtained in the form of a beige solid (8 mg, 48%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm): 0.80 to 0.92 (m, 12H); 0.96 (d, J = 7.1 Hz, 3H); 1.02 (s, 3H); 1, 15 (s, 3H); 1.30 to 1.72 (m, 9H); 1.86 (m, 1H); 2.00 (m, 1H); 2.11 to 2.26 (m, 4H), 2.42 (m, 1H); 2.60 to 2.74 (m, 2H); 2.91 to 3.11 (m, 5H); 3.38 (partially masked m, 1H); 3.76 (d, J = 1.8 Hz, 1H); 3.81 (s, 3H); 4.17 (m, 3H); 4.27 (m, 1H); 4.37 (m, 1H); 4.90 to 5.04 (m, 3H); 5.11 (m, 1H); 5.50 (m, 2H); 5.88 (bd, J = 15.2 Hz, 1H); 6.20 (m spread, 1H); 6.48 (m, 1H); 7.06 (d, J = 8.3 Hz, 1H); 7.1 to 7.32 (m, 9H); 7.60 (m, 2H); 7.75 (m, 1H); 7.89 (m, 1H); 8.28 (m spread, 1H); 8.41 (d, J = 7.8 Hz, 1H); 9.92 (brs, 1H); 12.06 (m spread, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 1217 [M + H] + ; m / z = 1215 [M-H] -; t R = 1.05 min.
Exemple 22 Example 22
Le∞mposé 76 (6 mg, 4,93 μmol) est mis en solution dans un mélange de DCM (0,5 ml) et de DMF (0,1 ml) puis sont successivement ajoutés le carbonate de N,N'-disuccinimidyle (6 mg, 23,42 μmol) et la DIPEA (4 μl, 22,96 μmol). Après 3 h de réaction à TA, une solution aq. saturée en NH4CI est additionnée et le mélange est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques reunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé Ex22 est obtenu sous forme d'un solide blanc (4 mg ; 61 %). RMN 1H (500 MHz, DMSO-de) δ (ppm) : 0,80 à 0,90 (m, 12 H) ; 0,96 (d, J=7,3 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,15 (s, 3 H) ; 1 ,32 à 1 ,76 (m, 7 H) ; 1 ,80 à 1 ,89 (m, 3 H) ; 1 ,97 (m, 1 H) ; 2,29 (m, 2 H) ; 2,44 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,75 (m, 4 H) ; 2,81 (s, 4 H) ; 2,89 à 3,08 (m, 5 H) ; 3,41 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,77 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,14 à 4,24 (m, 3 H) ; 4,27 (ddd, J=3,9 et 8,3 et 1 1 ,5 Hz, 1 H) ; 4,38 (m, 1 H) ; 4,93 à 5,03 (m, 3 H) ; 5,1 1 (m, 1 H) ; 5,39 (s large, 2 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 5,96 (t, J=5,9 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,7 et 11 ,1 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,16 à 7,36 (m, 9 H) ; 7,59 (d, J=7,8 Hz, 2 H) ; 7,76 (t, J=6,1 Hz, 1 H) ; 7,88 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 8,10 (d, J=7,3 Hz, 1 H) ; 8,41 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 9,97 (s large, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1314 [M + H]+ ; m/z = 1358 [M + HCO2H - H]" ; tR = 1 ,06 min. The compound 76 (6 mg, 4.93 μmol) is dissolved in a mixture of DCM (0.5 ml) and DMF (0.1 ml) and then the N, N'-disuccinimidyl carbonate is successively added. (6 mg, 23.42 μmol) and DIPEA (4 μl, 22.96 μmol). After 3 hours of reaction at RT, a solution aq. Saturated with NH 4 CI is added and the mixture is extracted 3 times with DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under RP. The crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 90/10. The compound Ex22 is obtained in the form of a white solid (4 mg, 61%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 0.80 to 0.90 (m, 12H); 0.96 (d, J = 7.3 Hz, 3H); 1, 03 (s, 3H); 1, 15 (s, 3H); 1.32 to 1.76 (m, 7H); 1.80 to 1.89 (m, 3H); 1.97 (m, 1H); 2.29 (m, 2H); 2.44 (m, 1H); 2.60 to 2.75 (m, 4H); 2.81 (s, 4H); 2.89 at 3.08 (m, 5H); 3.41 (partially masked m, 1H); 3.77 (d, J = 2.0 Hz, 1H); 3.81 (s, 3H); 4.14 to 4.24 (m, 3H); 4.27 (ddd, J = 3.9 and 8.3 and 11.5 Hz, 1H); 4.38 (m, 1H); 4.93 to 5.03 (m, 3H); 5.1 (m, 1H); 5.39 (bs, 2H); 5.88 (bd, J = 15.2 Hz, 1H); 5.96 (t, J = 5.9 Hz, 1H); 6.48 (ddd, J = 3.7 and 11, 1 and 15.2 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.3 Hz, 1H); 7.16 to 7.36 (m, 9H); 7.59 (d, J = 7.8 Hz, 2H); 7.76 (t, J = 6.1 Hz, 1H); 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H); 8.10 (d, J = 7.3 Hz, 1H); 8.41 (d, J = 8.3 Hz, 1H); 9.97 (wide, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 1314 [M + H] + ; m / z = 1358 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 1, 06 min.
Exemple 23 Example 23
Composé 77: (E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-Aminométhyl-phényl)-oxiranyl]-éthyl}-10- (3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène- 2,5,9, 12-tétraone Le composé 60 (23 mg, 31 ,76 μmol) est mis en solution dans un mélange de méthanol (1 ml) et d'eau (0,2 ml) avant addition de TCEP (34,90 μmol) et de DCM (la quantité suffisante pour solubiliser). La solution obtenue est laissée sous agitation toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est ensuite repris avec une solution aq. saturée en NaHCOs et extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le brut est enfin purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 77 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (12 mg, 59%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe) δ (ppm) : 0,78 (d, J=6,4 Hz, 6 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,30 (m, 1 H) ; 1 ,47 à 1 ,62 (m, 2 H) ; 1 ,79 (m, 1 H) ; 2,22 à 2,32 (m, 3 H) ; 2,63 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,92 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,35 (m partiellement maqué, 1 H) ; 3,71 (s, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,86 (d, J=1 ,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 4,90 (dd, J=3,6 et 9,6 Hz, 1 H) ; 5,1 1 (ddd, J=1 ,5 et 5,2 et 11 ,3 Hz, 1 H) ; 5,79 (dd, J=1 ,5 et 15,0 Hz, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 1 1 ,3 et 15,0 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=1 ,9 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à 7,26 (m, 3 H) ; 7,28 (d, J=1 ,9 Hz, 1 H) ; 7,34 (d, J=8,0 Hz, 2 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 698 [M + H]+ ; m/z = 696 [M - H]- ; m/z = 742 [M + HCO2H - H]" ; tR = 0,87 min. Compound 77: (E) - (3S, 10R, 16S) -16 - {(S) -1 - [(2R, 3R) -3- (4-Aminomethyl-phenyl) -oxiranyl] -ethyl} -10- ( 3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tetraone The compound 60 (23 mg, 31.76 μmol) is dissolved in a mixture of methanol (1 ml) and water (0.2 ml) before addition of TCEP (34.90 μmol) and DCM (the sufficient amount to solubilize). The resulting solution is left stirring overnight at RT and is concentrated under RP. The residue is then taken up with aq solution. saturated with NaHCO 3 and extracted 3 times with DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure. The crude is finally purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 90/10. Compound 77 is thus obtained in the form of a white solid (12 mg, 59%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-α) δ (ppm): 0.78 (d, J = 6.4 Hz, 6H); 1.00 (s, 3H); 1.05 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1.30 (m, 1H); 1.47 to 1.62 (m, 2H); 1.79 (m, 1H); 2.22 to 2.32 (m, 3H); 2.63 to 2.73 (m, 2H); 2.92 to 3.05 (m, 3H); 3.35 (partially mulled m, 1H); 3.71 (s, 2H); 3.81 (s, 3H); 3.86 (d, J = 1.6 Hz, 1H); 4.25 (ddd, J = 3.6 and 8.0 and 11.3 Hz, 1H); 4.90 (dd, J = 3.6 and 9.6 Hz, 1H); 5.1 (ddd, J = 1.5 and 5.2 and 11.3 Hz, 1H); 5.79 (dd, J = 1.5 and 15.0 Hz, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.6 and 1, 3 and 15.0 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (dd, J = 1, 9 and 8.5 Hz, 1H); 7.19 to 7.26 (m, 3H); 7.28 (d, J = 1.9 Hz, 1H); 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 698 [M + H] + ; m / z = 696 [M-H] -; m / z = 742 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 0.87 min.
Composé 78 : FmocVal-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77 Compound 78: FmocVal-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycin 77
Le composé 77 (10 mg, 14,32 μmol) est mis en solution dans le DMF anhydre (0,1 ml) avant l'addition d'une solution de l'intermédiaire 73 (1 1 mg, 14,35 μmol ; préparé selon WO 2006/110476) dans un mélange d'acétonitrile (1 ml) et de DMF (0,1 ml). Le mélange est laissé sous agitation 3 h à TA puis est concentré sous PR. Le résidu est alors purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 78 est obtenu sous forme d'un solide blanc (18 mg, 95%). LCMS (A5) : ES m/z = 1325 [M + H]+ ; m/z = 1369 [M + HCO2H - H]" ; tR = 4,32 min. Compound 77 (10 mg, 14.32 μmol) is dissolved in anhydrous DMF (0.1 ml) before the addition of a solution of Intermediate 73 (11 mg, 14.35 μmol; according to WO 2006/110476) in a mixture of acetonitrile (1 ml) and DMF (0.1 ml). The mixture is stirred for 3 h at RT and is concentrated under RP. The residue is then purified by chromatography on silica gel, eluting with a 100/0 to 90/10 DCM / methanol mixture. Compound 78 is obtained as a white solid (18 mg, 95%). LCMS (A5): ES m / z = 1325 [M + H] + ; m / z = 1369 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 4.32 min.
Composé 79 : Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77 Compound 79: Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycin 77
Le composé 78 (42 mg, 31 ,68 μmol) est mis en solution dans le DMF (5 ml) avant addition de pipéridine (150 μl, 1 ,51 mmol) et agitation 30 min à TA. Le mélange est concentré sous PR et le résidu est mis en solution dans le minimum de méthanol et est précipité avec de l'éther. Le composé 79 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (21 mg, 60%). LCMS (A4) : ES m/z = 1103 [M + H]+ ; m/z = 1101 [M - H]- ; m/z = 1 147 [M + HCO2H - H]" ; tR = 3,67 min. Compound 78 (42 mg, 31.68 μmol) is dissolved in DMF (5 ml) before addition of piperidine (150 μl, 1. 51 mmol) and stirring for 30 minutes at RT. The mixture is concentrated under RP and the residue is dissolved in the minimum of methanol and precipitated with ether. The Compound 79 is thus obtained in the form of a white solid (21 mg, 60%). LCMS (A4): ES m / z = 1103 [M + H] + ; m / z = 1101 [M-H] -; m / z = 1147 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 3.67 min.
Composé 80 : Acide glutarique-Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycine 77 Compound 80: Glutaric acid-Val-Cit-PABAC-α-amino-cryptophycin 77
Le composé 79 (20 mg, 18,12 μmol) est mis en solution dans un mélange de DMF (100 μl) et de DCM anhydre (500 μl) avant addition d'anhydride glutarique (4 mg, 35,06 μmol). La solution obtenue est agitée toute la nuit à TA puis est concentrée sous PR. Le résidu est repris dans un minimum de DCM et de méthanol, précipité avec un mélange d'éther et de pentane et est filtré sur fritte. Le composé 80 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide blanc (23 mg, 104% brut) qui est utilisé brut dans l'étape suivante. RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 0,78 (d, J=6,3 Hz, 6 H) ; 0,84 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 0,86 (d, J=6,6 Hz, 3 H) ; 1 ,00 (s, 3 H) ; 1 ,04 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1 ,12 (s, 3 H) ; 1 ,22 à 1 ,47 (m, 3 H) ; 1 ,51 à 1 ,64 (m, 3 H) ; 1 ,72 (m, 3 H) ; 1 ,80 (m, 1 H) ; 1 ,99 (m, 1 H) ; 2,20 (m, 4 H) ; 2,28 (m, 1 H) ; 2,59 à 2,73 (m, 2 H) ; 2,90 à 3,07 (m, 5 H) ; 3,32 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (s large, 1 H) ; 4,19 (m, 3 H) ; 4,24 (m, 1 H) ; 4,38 (m, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,3 et 9,6 Hz, 1 H) ; 4,97 (s large, 2 H) ; 5,10 (dd, J=4,4 et 10,7 Hz, 1 H) ; 5,40 (s large, 2 H) ; 5,79 (d large, J=15,1 Hz, 1 H) ; 5,99 (m large, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,6 et 11 ,3 et 15,1 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (d large, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,34 (m, 8 H) ; 7,60 (d large, J=8,2 Hz, 2 H) ; 7,76 (t large, J=5,4 Hz, 1 H) ; 7,83 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 8,09 (d large, J=7,1 Hz, 1 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H) ; 9,95 (s large, 1 H) ; 1 1 ,98 (m étalé, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1217 [M + H]+ ; m/z = 1215 [M - H]- ; tR = 1 ,03 min. Compound 79 (20 mg, 18.12 μmol) is dissolved in a mixture of DMF (100 μl) and anhydrous DCM (500 μl) before addition of glutaric anhydride (4 mg, 35.06 μmol). The resulting solution is stirred overnight at RT and is concentrated under RP. The residue is taken up in a minimum of DCM and methanol, precipitated with a mixture of ether and pentane and filtered on a frit. The compound 80 is thus obtained in the form of a white solid (23 mg, 104% crude) which is used crude in the next step. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cfe): 0.78 (d, J = 6.3 Hz, 6H); 0.84 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 0.86 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 1.00 (s, 3H); 1, 04 (d, J = 6.9 Hz, 3H); 1, 12 (s, 3H); 1, 22 to 1, 47 (m, 3H); 1. 51 to 1.64 (m, 3H); 1.72 (m, 3H); 1.80 (m, 1H); 1.99 (m, 1H); 2.20 (m, 4H); 2.28 (m, 1H); 2.59 to 2.73 (m, 2H); 2.90 to 3.07 (m, 5H); 3.32 (partially masked m, 1H); 3.81 (s, 3H); 3.87 (bs, 1H); 4.19 (m, 3H); 4.24 (m, 1H); 4.38 (m, 1H); 4.91 (dd, J = 3.3 and 9.6 Hz, 1H); 4.97 (brs, 2H); 5.10 (dd, J = 4.4 and 10.7 Hz, 1H); 5.40 (bs, 2H); 5.79 (broad, J = 15.1 Hz, 1H); 5.99 (broad m, 1H); 6.47 (ddd, J = 3.6 and 11, 3 and 15.1 Hz, 1H); 7.05 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 7.17 (broad, J = 8.5 Hz, 1H); 7.20 to 7.34 (m, 8H); 7.60 (broad, J = 8.2 Hz, 2H); 7.76 (broad t, J = 5.4 Hz, 1H); 7.83 (d, J = 8.5 Hz, 1H); 8.09 (bd, J = 7.1 Hz, 1H); 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 9.95 (brs, 1H); 11, 98 (m spread, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 1217 [M + H] + ; m / z = 1215 [M-H] -; t R = 1.03 min.
Exemple 23 Example 23
L'exemple 23 peut être obtenu en activant l'acide 80 selon la méthode décrite pour l'exemple 22. Example 23 can be obtained by activating the acid 80 according to the method described for Example 22.
Exemple 24 : [2-Méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-méthyl-carbamate de 4-((2S,3S)-3- {(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12- tétraoxo-1 ,4-dioxa-8,11 -diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle EXAMPLE 24 4 - ((2S, 3S) -3 - {(S) -1 - [(E) - (3S) [2-Methyl-2- (pyridin-2-yldisulfanyl) -propyl] -methyl-carbamate 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl] -ethyl} -oxiranyl) -benzyl
Composé 81 : Méthyl-[2-méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-amine Compound 81: Methyl- [2-methyl-2- (pyridin-2-yldisulfanyl) -propyl] -amine
A une solution de l'aminé 15 (478 mg, 2,90 mmol) dans le MeOH (35 ml) est additionné le TCEP (831 mg, 2,9 mmol). Après 2 h de réaction à TA la solution obtenue est additionnée goutte à goutte, sous atmosphère d'argon, à une solution de 2,2'-dipyridyldisulfide (960 mg, 4,36 mmol) dans l'éthanol (70 ml). Après en∞re 2 h de réaction à TA le mélange est concentré sous PR. Le résidu est repris dans le DCM et est lavé avec une solution aq. saturée en NaHCOs. La phase organique est séparée puis la phase aq. extraite encore 2 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 85/15. Le composé 81 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (587 mg, 89%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-cfe): 1 ,25 (s, 6 H) ; 1 ,80 (m étalé, 1 H) ; 2,19 (s, 3 H) ; 2,45 (s, 2 H) ; 7,22 (ddd, J=1 ,5 et 5,0 et 7,0 Hz, 1 H) ; 7,74 à 7,85 (m, 2 H) ; 8,42 (ddd, J=1 ,1 et 1 ,5 et 5,0 Hz,1 H). To a solution of the amine (478 mg, 2.90 mmol) in MeOH (35 ml) was added TCEP (831 mg, 2.9 mmol). After 2 hours of reaction at RT, the solution obtained is added dropwise, under an argon atmosphere, to a solution of 2,2'-dipyridyldisulphide (960 mg, 4.36 mmol) in ethanol (70 ml). After enerre 2 hours of reaction at RT the mixture is concentrated under PR. The residue is taken up in DCM and washed with aq solution. saturated with NaHCOs. The organic phase is separated then the aq phase. extracted twice more at DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under RP. The crude product is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 98/2 to 85/15. Compound 81 is obtained as a pale yellow oil (587 mg, 89%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-cis): 1.25 (s, 6H); 1.80 (m spread, 1H); 2.19 (s, 3H); 2.45 (s, 2H); 7.22 (ddd, J = 1.5 and 5.0 and 7.0 Hz, 1H); 7.74 to 7.85 (m, 2H); 8.42 (ddd, J = 1.1, 1.5 and 5.0 Hz, 1H).
Exemple 24 : [2-Méthyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)-propyl]-méthyl-carbamate de 4-((2S,3S)-3-{(S)- 1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo- 1 ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle Example 24: 4 - ((2S, 3S) -3 - {(S) - 1 - [(E) - (3S) [2-Methyl-2- (pyridin-2-yldisulfanyl) -propyl] -methyl-carbamate 10R, 16S) -10- (3-chloro-4-methoxy-benzyl) -3-isobutyl-6,6-dimethyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11- diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl] -ethyl} -oxiranyl) -benzyl
A une solution de l'intermédiaire 58 (21 mg, 24,3 μmol) dans le DCM anhydre sont successivement ajoutés l'aminé 81 (10 mg, 43,79 μmol) et la DIPEA (8 μl, 45,43 μmol). Après 24 h à TA une solution aq. saturée en NaHCOs est additionnée et le mélange est extrait 3 fois au DCM. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2S04, filtrées et concentrées sous PR. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé Ex24 est ainsi obtenu sous la forme d'un solide incolore (7 mg, 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): 0,82 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,84 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,97 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1 ,03 (s, 3 H) ; 1 ,14 (s, 3 H) ; 1 ,25 (s large, 6 H) ; 1 ,45 à 1 ,68 (m, 3 H) ; 1 ,88 (m, 1 H) ; 2,42 (m partiellement masqué, 1 H) ; 2,58 à 2,75 (m, 2 H) ; 2,83 à 3,09 (m, 6 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s large, 4 H) ; 4,28 (m, 1 H) ; 4,91 à 5,17 (m, 4 H) ; 5,88 (d large, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,49 (m, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H) ; 7,15 à 7,38 (m, 8 H) ; 7,80 (m large, 2 H) ; 8,39 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; 8,43 (d large, J=4,6 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 953 [M + H]+ ; m/z = 477 [M + 2H]2+ ; m/z = 997 [M + HCO2H - H]" ; tR = 1 ,23 min. To a solution of intermediate 58 (21 mg, 24.3 μmol) in anhydrous DCM are successively added amine 81 (10 mg, 43.79 μmol) and DIPEA (8 μl, 45.43 μmol). After 24 h at RT a solution aq. Saturated NaHCO 3 is added and the mixture is extracted 3 times with DCM. The combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under RP. The crude is purified by chromatography on silica gel, eluting with a DCM / methanol mixture 100/0 to 95/5. The compound Ex24 is thus obtained in the form of a colorless solid (7 mg, 30%). 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ): 0.82 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 0.84 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 0.97 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 1, 03 (s, 3H); 1, 14 (s, 3H); 1, 25 (bs, 6H); 1.45 to 1.68 (m, 3H); 1.88 (m, 1H); 2.42 (partially masked m, 1H); 2.58 to 2.75 (m, 2H); 2.83 to 3.09 (m, 6H); 3.34 (partially masked m, 1H); 3.46 (bs, 2H); 3.81 (bs, 4H); 4.28 (m, 1H); 4.91 to 5.17 (m, 4H); 5.88 (bd, J = 15.2 Hz, 1H); 6.49 (m, 1H); 7.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 7.15 to 7.38 (m, 8H); 7.80 (broad m, 2H); 8.39 (d, J = 7.8 Hz, 1H); 8.43 (broad d, J = 4.6 Hz, 1H). LCMS (A2) ES m / z = 953 [M + H] + ; m / z = 477 [M + 2H] 2+ ; m / z = 997 [M + HCO 2 H - H] "; t R = 1, 23 min.
Exemple 25 : hu2H11-Ex17 Example 25: hu2H11-Ex17
Selon la méthode générale, 8,31 mg (0,057 μmol, 1 ,468 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration de 5,66 mg/ml sont traités par 5 éq. du composé Ex17 (0,442 mg, 0,340 μmol) en solution dans 37,3 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le mélange. Après purification sur Superdex 200 pg et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 2,15 ml de conjugué à une concentration de 2,48 mg/ml avec en moyenne 2,2 cytotoxiques par anticorps et une pureté monomérique de 99,7% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCl sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1 ,5 ml d'une solution de conjugué Ex25 à une concentration de 1 ,06 mg/ml avec en moyenne 2,8 dérivés de cryptophycine (déterminé par UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,7%. Exemple 26 : hu2H11-Ex18  According to the general method, 8.31 mg (0.057 μmol, 1.468 ml) of nu hu2H11 antibody at a concentration of 5.66 mg / ml are treated with 5 eq. compound Ex17 (0.442 mg, 0.340 μmol) in solution in 37.3 μl of DMA so that the final antibody concentration is 3 mg / ml in the mixture. After purification on Superdex 200 μg and concentration on Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k membrane, Millipore), 2.15 ml of conjugate is obtained at a concentration of 2.48 mg / ml with an average of 2.2 cytotoxic antibodies per antibody and monomeric purity of 99.7% in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M phosphate, 0.14 M NaCl and 20% by volume of NMP. The final buffer change is carried out in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M phosphate and 0.14 M NaCl on 1 ml of conjugate. 1.5 ml of an Ex25 conjugate solution at a concentration of 1.06 mg / ml are then obtained with an average of 2.8 cryptophycin derivatives (determined by UV) with antibody and a monomeric purity of 99.7%. Example 26: hu2H11-Ex18
Selon la méthode générale, 7,8 mg (0,053 μmol, 1 ,458 ml) d'anticorps nus hu2H11 à une concentration de 5,35 mg/ml sont traités par 6 éq. du composé Ex18 (0,578 mg, 0,531 μmol, pureté 60%) en solution dans 272 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le mélange. Après purification sur Superdex 200 pg et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 2,35 ml de conjugués à une concentration de 2,49 mg/ml avec en moyenne 2,5 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 100% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de chlorure de sodium sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1 ,5 ml de d'une solution de conjugué Ex26 à une concentration de 0,84 mg/ml avec en moyenne 2,22 dérivés de cryptophycine (déterminé par UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,9%. Exemple 27 : hu2H11-Ex19 According to the general method, 7.8 mg (0.053 μmol, 1.458 ml) of naked antibody hu2H11 at a concentration of 5.35 mg / ml are treated with 6 eq. compound Ex18 (0.578 mg, 0.531 μmol, purity 60%) in solution in 272 μl of DMA so that the final antibody concentration is 3 mg / ml in the mixture. After purification on Superdex 200 μg and concentration on Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k membrane, Millipore), 2.35 ml of conjugates are obtained at a concentration of 2.49 mg / ml with an average of 2.5 antibody-based cryptophycin derivatives. and a monomeric purity of 100% in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M phosphate, 0.14 M NaCl and 20% by volume of NMP. The final buffer change is carried out in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M phosphate and 0.14 M sodium chloride on 1 ml of conjugate. 1.5 ml of an Ex26 conjugate solution at a concentration of 0.84 mg / ml are then obtained with an average of 2.22 cryptophycin derivatives (determined by UV) with antibody and a monomeric purity of 99.9%. . Example 27: hu2H11-Ex19
Selon la méthode générale, 12 mg (81 ,7 μmol, 1 ,172 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration de 10,24 mg/ml sont traités par 2 * 5 éq. du composé Ex19 (0,382 mg, 0,41 μmol) en solution dans 44,3 μl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le milieu réactionnel. Après purification sur Superdex 200 pg en présence de 20% de NMP et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 1 ,04 ml de conjugués dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH = 6,5 contenant 0,01 M d'histidine, 10% de sucrose (w/v) et 5% de NMP (v/v). On obtient alors 1 ,5 ml d'une solution de conjugué Ex27 à une concentration de 2,66 mg/ml avec en moyenne 1 ,4 dérivés de cryptophycine (HRMS) par anticorps et une pureté monomérique de 99,8%.  According to the general method, 12 mg (81.7 μmol, 1. 172 ml) of hu2H11 naked antibody at a concentration of 10.24 mg / ml are treated with 2 * 5 eq. compound Ex19 (0.382 mg, 0.41 μmol) dissolved in 44.3 μl of DMA so that the final antibody concentration is 3 mg / ml in the reaction medium. After purification on Superdex 200 μg in the presence of 20% NMP and concentration on Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k membrane, Millipore), 1.04 ml of conjugates are obtained in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M of phosphate, 0.14 M NaCl and 20% by volume of NMP. The final buffer change is carried out in an aqueous buffer pH = 6.5 containing 0.01 M of histidine, 10% of sucrose (w / v) and 5% of NMP (v / v). 1.5 ml of an Ex27 conjugate solution at a concentration of 2.66 mg / ml are then obtained with, on average, 1.4 cryptophycin derivatives (HRMS) per antibody and a monomeric purity of 99.8%.
Les exemples donnés ci-dessus ont été réalisés par un dérivé de cryptophycine particulier (souvent le dérivé D1) mais pourraient s'appliquer à un autre dérivé du groupe D1-D8 ou au dérivé de cryptophycine de formule générale (II). De même, les exemples de conjugués des exemples 10, 1 1 , 12, 25, 26 et 27 pourraient s'appliquer à d'autres anticorps que hu2H11. The examples given above were made by a particular cryptophycin derivative (often the derivative D 1 ) but could be applied to another derivative of the group D 1 -D 8 or to the derivative of cryptophycin of general formula (II). Similarly, the conjugate examples of Examples 10, 11, 12, 25, 26 and 27 could be applied to antibodies other than hu2H11.
note : dans lesdits exemples, -Lys- signifie que l'attachement se fait sur les groupes ε-amino des lysines de l'anti∞rps. note: in said examples, -Lys- means that the attachment is to the ε-amino groups of the lysines of the anti¬rps.
Exemple 28 : évaluation de l'inhibition de la prolifération des lignées cellulaires MDA-MB- 231, MDA-A1 et HCT116 par les cytotoxiques, étude réalisée sur les composés de formule (II) de type SZa avec Za = SMe ou de type -C(=O)-ZbRb avec ZbRb = OMe ou OCH2-CH=CH2 Les cellules MDA-MB-231 , MDA-A1 ou HCT116 dans leur phase de croissance exponentielle sont trypsinées et remises en suspension dans leur milieu de culture respectif (DMEM/F12 Gibco #21331 , 10% SVF Gibco #10500-056, 2 nM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules MDA ; DMEM Gibco #11960, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 mM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules HCT116). La suspension cellulaire est ensemencée dans des plaques de culture 96 puits Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) dans le milieu de culture complet contenant du sérum à une densité de 5000 cellules/puits (MDA-MB-231 , MDA-A1 , HCT1 16). Après 4 h d'incubation, des dilutions successives des dérivés de cryptophycine sont ajoutées dans les puits à des concentrations décroissantes de 10-7 à 10-12 M (en triplicate pour chaque concentration). Les cellules sont cultivées 3 jours à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2 en présence des cytotoxiques. Le 4e jour, 10 μl d'une solution de thymidine 14C (0,1 μCi/puits, Perkin Elmer #NEC56825000) sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de thymidine 14C est mesurée 96 heures après le début de l'expérience avec un compteur radioactif microbétâ (Perkin Elmer). Les données sont exprimées sous la forme d'un pourcentage de survie en faisant le ratio entre le décompte obtenu avec les cellules traitées par le cytotoxique et celui obtenu avec les cellules des puits contrôlés (traitées par le milieu de culture seul). EXAMPLE 28 Evaluation of the Inhibition of the Proliferation of the MDA-MB-231, MDA-A1 and HCT116 Cell Lines by Cytotoxic Fibers, Study on Compounds of Formula (II) of SZ a with Z a = SMe or of type -C (= O) -Z b R b with Z b R b = OMe or OCH 2 -CH = CH 2 The MDA-MB-231, MDA-A1 or HCT116 cells in their exponential growth phase are trypsinized and delivered in suspension in their respective culture medium (DMEM / F12 Gibco # 21331, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2 nM Gibco Glutamine # 25030 for MDA cells, DMEM Gibco # 11960, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2mM Glutamine Gibco # 25030 for HCT116 cells). The cell suspension is seeded into Cytostar 96-well culture plates (GE Healthcare Europe, # RPNQ0163) in the complete culture medium containing serum at a density of 5000 cells / well (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT1 16). After 4 hours of incubation, successive dilutions of the cryptophycin derivatives are added to the wells at decreasing concentrations of 10 -7 to 10 -12 M (in triplicate for each concentration). The cells are cultured for 3 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere in the presence of cytotoxic agents. The 4 th day, 10 .mu.l of a solution of thymidine 14 C (0.1 .mu.Ci / well, Perkin Elmer # NEC56825000) are added to each well. The incorporation of 14 C thymidine is measured 96 hours after the start of the experiment with a radioactive microbeta counter (Perkin Elmer). The data are expressed as a percentage of survival by the ratio between the count obtained with the cells treated with the cytotoxic and that obtained with the cells of the controlled wells (treated with the culture medium alone).
Exemple 29 : évaluation de l'inhibition de la prolifération des lignées cellulaires MDA-MB- 231, MDA-A1 et HCT116 par les conjugués anticorps-cytotoxique Example 29: Evaluation of the inhibition of proliferation of MDA-MB-231, MDA-A1 and HCT116 cell lines by antibody-cytotoxic conjugates
Les cellules MDA-MB-231 , MDA-A1 ou HCT116 dans leur phase de croissance exponentielle sont trypsinées et remises en suspension dans leur milieu de culture respectif (DMEM/F12 Gibco #21331 , 10% SVF Gibco #10500-056, 2 nM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules MDA ; DMEM Gibco #1 1960, 10% SVF Gibco #10500-056, 2 mM Glutamine Gibco #25030 pour les cellules HCT1 16). La suspension cellulaire est ensemencée dans des plaques de culture 96 puits Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) dans le milieu de culture complet contenant du sérum à une densité de 5000 cellules/puits (MDA-MB-231 , MDA-A1 , HCT1 16). Après 4 h d'incubation, des dilutions successives des dérivés de cryptophycine sont ajoutées dans les puits à des concentrations décroissantes de 10-7 à 10-12 M (en triplicate pour chaque concentration). Les cellules sont cultivées à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2 en présence des immunoconjugués anticorps-cytotoxique pendant 3 jours. Le 4e jour, 10 μl d'une solution de thymidine 14C (0,1 μCi/puits, Perkin Elmer #NEC56825000) sont ajoutés dans chaque puits. L'incorporation de thymidine 14C est mesurée 96 h après le début de l'expérience avec un compteur radioactif microbétâ (Perkin Elmer). Les données sont exprimées sous la forme d'un pourcentage de survie en faisant le ratio entre le décompte obtenu avec les cellules traitées par l'immunoconjugué et celui obtenu avec les cellules des puits contrôles (traitées par le milieu de culture seul). Dans certaines expériences, l'anticorps nu hu2H11 a été ajouté dans les puits à une concentration de 1 μM au début de l'expérience et l'inhibition de la prolifération a été mesurée comme précédemment décrit. The MDA-MB-231, MDA-A1 or HCT116 cells in their exponential growth phase are trypsinized and resuspended in their respective culture medium (DMEM / F12 Gibco # 21331, 10% Gibco SVF # 10500-056, 2 nM Gibco glutamine # 25030 for MDA cells, DMEM Gibco # 1 1960, 10% SVF Gibco # 10500-056, 2 mM Glutamine Gibco # 25030 for 16 HCT1 cells. The cell suspension is seeded into Cytostar 96-well culture plates (GE Healthcare Europe, # RPNQ0163) in the complete culture medium containing serum at a density of 5000 cells / well (MDA-MB-231, MDA-A1, HCT1 16). After 4 hours of incubation, successive dilutions of the cryptophycin derivatives are added to the wells at decreasing concentrations of 10 -7 to 10 -12 M (in triplicate for each concentration). The cells are cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere in the presence of antibody-cytotoxic immunoconjugates for 3 days. The 4 th day, 10 .mu.l of a solution of thymidine 14 C (0.1 .mu.Ci / well, Perkin Elmer # NEC56825000) are added to each well. The incorporation of 14 C thymidine is measured 96 h after the start of the experiment with a radioactive microbeta counter (Perkin Elmer). The data are expressed as a percentage of survival by making the ratio between the count obtained with the cells treated with the immunoconjugate and that obtained with the cells of the control wells (treated with the culture medium alone). In some experiments, the naked antibody hu2H11 was added to the wells at a concentration of 1 μM at the start of the experiment and the inhibition of proliferation was measured as previously described.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivé de cryptophycine de formule (II) : 1. Cryptophycin derivative of formula (II):
dans laquelle :  in which :
• Ri représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe -OH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1 -C4)alcanoyloxy ; R 1 represents a halogen atom and R 2 represents an -OH group, an acyl group derived from an amino acid AA or a (C 1 -C 4 ) alkanoyloxy group;
ou bien R1 et R2 forment ensemble un motif époxyde ; or R 1 and R 2 together form an epoxy unit;
• AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ;  • AA means a natural or unnatural amino acid;
• R3 représente un groupe (C1 -CβJalkyle ; • R 3 represents a group (C 1 -Cβ alkyl);
• R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13 et C14 ; • R 4 and R 5 are both H or together form a double bond CH = CH between C13 and C14;
• Rβ et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1 -CβJalkyle ;Rβ and R 7 represent independently of each other H or a group (C 1 -Cβ alkyl);
• Rs et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1 -CβJalkyle ; • R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupeRs and R 9 represent independently of each other H or a group (C 1 -C 6 alkyl); R 10 represents at least one substituent of the phenyl ring chosen from: H, a group
OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène ou bien un groupe -NH2, -NH(C1-C6)alkyle ou - N(C1-C6)alkyle2 ; OH, (C 1 -C 4 ) alkoxy, a halogen atom or a group -NH 2 , -NH (C 1 -C 6 ) alkyl or - N (C 1 -C 6 ) alkyl 2 ;
• Rn représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C1 -C4)alkyle ; Rn represents at least one substituent of the phenyl ring selected from H or a (C 1 -C 4 ) alkyl group;
" L représente un linker en position ortho (o), meta (m) ou para (p), de préférence para, du noyau phényle porteur du motif GCRi choisi parmi :  "L represents a linker in the ortho (o), meta (m) or para (p) position, preferably para, of the phenyl ring bearing the GCRi unit chosen from:
-G' X (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y(CRi5Ri6)u Q GCRi , -G 'X (CRi 3 Ri4) t (OCH 2 CH 2) y (CRi5Ri6) u Q AGIR,
-G' X (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y-Y'-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 14 ) t (OCH 2 CH 2 ) y-Y' - (CR 15 R 16) u Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t(CRi7=CRi8)(CRi5Ri6)u(OCH2CH2)y Q GCRi , -G 'X (CRi 3 Ri 4 ) t (CRi 7 = CRi 8 ) (CRi 5 RI 6 ) u (OCH 2 CH 2 ) y Q GCRi ,
-G' X (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y(CRi7=CRi8)(CRi5Ri6)u Q GCRi , -G 'X (CRi 3 RI 4 ) t (OCH 2 CH 2 ) y (CRi 7 = CRi 8 ) (CRi 5 RI 6 ) u Q GCRi ,
-G' X (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 4 ) t-phenyl- (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 14 ) t-furyl- (CR 1 R 6) u Y' Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 4 ) t-oxazolyl- (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 ) 4 t-thiazolyl- (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 14 ) t-thienyl- (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 4 ) t-imidazolyl- (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-CO(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 4 ) t-piperazinyl-CO (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-CO(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperidinyl-methyl-NR 12 -CO (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi , -G 'X (CRi 3 Ri 4 ) t-piperidinyl- (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCRi,
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi , -G' X (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi, -G 'X (CRi 3 Ri 4 ) t-piperidinyl-NR 12 - (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1, -G 'X (CR 1 R 14 ) t-triazolyl- (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1,
-G' X (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi, -G 'X (CR 1 R 14 ) t-triazolyl- (CR 1 R 5 ) u Y' Q GCR 1,
-G' X (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 14 ) t-phenyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi; -G 'X (CR 1 R 14 ) t-furyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 R 4 ) t-oxazolyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi; -G 'X (CR 1 R 3 4 ) t-thiazolyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 4 ) t-thienyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 14 ) t-imidazolyl- (CR 15 R 16);
-G' X (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperazinyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CRi 3 Ri4) t-piperidinyl (CRi 5 Ri6) u Q AGIR;
-G' X (CRi3Ri4)rpipéridinyl-méthyl-NRi2-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 R 4 ) piperidinyl-methyl-NR 1 2- (CR 1 R 5 );
-G' X (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi , -G 'X (CRi 3 R14) t-piperidinyl-NR 12 - (CRi5Ri6) u Q GCRi,
-G' X (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G 'X (CR 1 R 3 ) 4 t-triazolyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
ou or
-G" Y (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y(CRi5Ri6)u Q GCRi , -G "Y (CRi 3 Ri 4 ) t (OCH 2 CH 2 ) y (CRi 5 R 16) u Q GCR 1,
-G" Y (CRi3Ri4)I(OCH2CH2Vr-(CRi5Ri6)U Q GCRi ; -G "Y (CRi 3 R 4) B (OCH 2 CH 2 Vr- (CRi 5 R 6) U Q AGIR;
-G" Y (CRi3Ri4)t(CRi7=CRi8)(CRi5Ri6)u(OCH2CH2)y Q GCRi , -G "Y (CRi 3 Ri 4 ) t (CRi 7 = CRi 8 ) (CRi 5 RI 6 ) u (OCH 2 CH 2 ) y Q GCR 1 ,
-G" Y (CRi3Ri4)t(OCH2CH2)y(CRi7=CRi8)(CRi5Ri6)u Q GCRi ,-G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t (OCH 2 CH 2 ) y (CR 1 =CR 1 8) (CR 1 R 6) u Q GCR 1,
-G" Y (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 4 ) t-phenyl- (CR 1 R 5 ) u Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-furyl- (CR 1 R 5 ) 6 Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 4 ) 4 -t-oxazolyl- (CR 1 R 6) u Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 4 ) t-thiazolyl- (CR 1 R 6) u Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 4 ) t-thienyl- (CR 1 R 5 ) u Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 14 ) t-imidazolyl- (CR 15 R 16);
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-CO(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperazinyl-CO (CR 1 R 5 ) u Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-méthyl-NRi2-CO(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ;-G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperidinyl-methyl-NR 1 2 -CO (CR 1 R 5 ) u Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperidinyl- (CR 1 R 5 ) u Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NRi2-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperidinyl-NR 1 2 - (CR 1 R 5 ) u Y 'Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Y' Q GCRi, -G "Y (CR 1 R 3 4 ) t-triazolyl- (CR 1 R 5 ) u Y 'Q GCR 1,
-G" Y (CRi3Ri4)t-phényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-phenyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-furyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi; -G "Y (CR 1 R 3 4 ) t-furyl- (CR 1 R 5 ) 6 Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-oxazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-oxazolyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-thiazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-thiazolyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-thiényl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 4 ) t-thienyl- (CR 1 R 5 ) u Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-imidazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G "Y (CRi 3 Ri4) t-imidazolyl- (CRi 5 Ri6) u Q AGIR;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperazinyl- (CR 1 R 6) u Q GCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipérazinyl-(CRi5Ri6)u Q CCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperazinyl- (CR 1 R 5 ) u Q CCR 1;
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 3 R 4 ) t-piperidinyl- (CR 1 R 6) u Q GCR 1; -G "Y (CR 13 R 14) t-piperidinyl-methyl-NR 12 - (CR 15 R 16);
-G" Y (CRi3Ri4)t-pipéridinyl-NR12-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G "Y (CRi 3 Ri4) t-piperidinyl-NR 12 - (CRi5Ri6) u Q AGIR;
-G" Y (CRi3Ri4)t-triazolyl-(CRi5Ri6)u Q GCRi ; -G "Y (CR 1 R 14 ) t-triazolyl- (CR 15 R 16);
formules dans lesquelles : formulas in which:
" G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH2)n- ; "G 'represents a group -CH = CH- or - (CH 2 ) n -;
• G" représente un groupe -(CH2)n- ; • G "represents a group - (CH 2 ) n -;
• n représente un entier allant de 1 à 6 ;  N represents an integer ranging from 1 to 6;
• X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -COO-, ou -CONR12-, le groupe CO étant attaché à G' ; X represents a single bond or a group -CO-, -COO-, or -CONR 12- , the group CO being attached to G ';
- Y représente un groupe -O-, -OCO, -OCOO, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-,Y represents a group -O-, -OCO, -OCOO, -OCONR 12 -, -NR 12 -, -NR 12 CO-,
-NR12CONR'12-, -NR12COO-, ou -S(0)q-, l'atome O ou le groupe NR12 étant attachés à G" ; -NR 12 CONR '12 -, -NR 12 COO-, or -S (0) q -, O atom or the group NR 12 being attached to G ";
• q représente un entier pouvant valoir O, 1 ou 2 ;  Q represents an integer that can be 0, 1 or 2;
- Y' représente un groupe -O-, -OCO, -OCOO, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, Y 'represents a group -O-, -OCO, -OCOO, -OCONR 12 -, -NR 12 -, -NR 12 CO-,
-NR12CONRV, -NR12COO-, -S(0)q-, -CO-, -COO-, ou -CONR12- ; -NR 12 CONRV, -NR 12 COO-, -S (O) q -, -CO-, -COO-, or -CONR 12 -;
" R12, R'i2, R13, Ru, R15, Rie, R17 et R18 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1 -CβJalkyle ; "R12, R'i2, R13, Ru, R15, Rie, R17 and R 18 independently of one another H or (C 1 -CβJalkyle;
• t, u et y représentent des entiers pouvant aller chacun de O à 20 et tels que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ;  T, u and y represent integers each of which can range from 0 to 20 and such that t + u + y is greater than or equal to 1;
- dans le cas du linker de formule -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y'-(CR15R16)u Q- in the case of the linker of the formula -G "Y (CR 13 R 1 4) t (OCH 2 CH 2) y -Y '- (CR 15 R 1 6) u Q
GCR1, si y vaut O et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut valoir O ;GCR 1 , if y is 0 and Q is a simple bond, then u can not be O;
• Q représente une liaison simple, un groupe (C1 -C-ιo)alkylène ou un groupe (OCH2CH2)ι, i représentant un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5 ; • Q represents a single bond, a (C 1 -C-ιo) alkylene or a (OCH 2 CH 2) ι, i representing an integer ranging from 1 to 20, more preferably from 1 to 10, even more particularly from 1 to 8, or from 1 to 6, still more particularly from 2 to 5;
• GCR1 représente -SZa , -C(=O)-ZbRb, avec R12 représentant• GCR1 represents -SZ a, -C (= O) -Z b R b, with R 12 representing
H ou (C1 -C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; ou bien L est choisi parmi : H or (C 1 -C 6 ) alkyl, more particularly the methyl group; or else L is chosen from:
formules dans lesquelles : représente l'un des 9 groupes suivants : formulas in which: represents one of the following 9 groups:
^^s ALK~ ^^ ~ s ALK
• n représente un entier allant de 1 à 6 ;  N represents an integer ranging from 1 to 6;
• ALK représente un groupe (C1-Ci2)alkylène ; • ALK represents a (C 1 -Ci 2 ) alkylene group;
• Ri2 et R'12 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (d- C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; • i représente un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5 ; • R 2 and R '12 independently of one another H or (d- C 6) alkyl, especially methyl; I represents an integer ranging from 1 to 20, more particularly from 1 to 10, more particularly from 1 to 8, or from 1 to 6, even more particularly from 2 to 5;
ou bien L est un linker de formule (IV) : ^ dans laquelle : or L is a linker of formula (IV): in which:
• (AA)W représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par des liaisons peptidiques ; • (AA) W represents a sequence of w amino acids AA connected to each other by peptide bonds;
• w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ;  W represents an integer ranging from 1 to 12, preferably from 1 to 6;
• n représente un entier allant de 1 à 6 ;  N represents an integer ranging from 1 to 6;
" D représente l'un des motifs suivants :  "D is one of the following reasons:
pour lesquels :  for which :
• R12 représente H ou un groupe (C1 -CβJalkyle ; R 12 represents H or a group (C 1 -Cβ alkyl);
• R19, R20, R21, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome R 19 , R 20 , R 21 and R 22 independently of one another represent an atom
d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C1 -C4)alkyle ; halogen, -OH, -CN or a (C 1 -C 4 ) alkyl group;
• T rattaché à (CH2)n représente NR12 OU O ; • T attached to (CH 2 ) n represents NR 12 OR O;
• V1 représente O, S, NR12 ; • V 1 represents O, S, NR 12 ;
• V2 représente CR22 ou N ; • V 2 is CR 22 or N;
" V3, V4, V5 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR22 ou N ; V 3 , V 4 , V 5 are independently selected from CR 22 or N;
• Za représente H ou le groupe -SR3, Ra représentant un groupe (C1 -CβJalkyle, (C3- C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ; Z a represents H or the group -SR 3, R a representing a (C 1 -Cβ) alkyl, (C 3 -C 7 ) cycloalkyl, aryl, heteroaryl or (C 3 -C 7 ) heterocycloalkyl group;
• Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, Rb représentant H ou un groupe (C1- C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle. Z b represents a single bond, -O- or -NH-, wherein R b represents H or a (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 3 -C 7 ) cycloalkyl, aryl, heteroaryl or (C 3 -C 7 ) heterocycloalkyl.
2. Dérivé dé cryptophycine selon la revendication 1 dans lequel R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène. The cryptophycin derivative according to claim 1 wherein R 10 is at least one substituent of the phenyl ring selected from: H, OH, (C 1 -C 4 ) alkoxy, halogen.
3. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 ou 2 dans lequel GCR1 représente -SZa ou -C(=O)-ZbRb. The cryptophycin derivative according to claim 1 or 2 wherein GCR1 is -SZ a or -C (= O) -Z b R b .
4. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 à 3 dans lequel The cryptophycin derivative according to claim 1 to 3 wherein
représente l'un des 7 groupes suivants :  represents one of the following 7 groups:
' 12 '12
O)I-CH2CH2'' "(CH2 O) I-CH 2 CH 2 ''"(CH 2
5. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 à 4 dans lequel n vaut 1. The cryptophycin derivative according to claim 1 to 4 wherein n is 1.
6. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 dans lequel L est choisi parmi : The cryptophycin derivative according to claim 1 wherein L is selected from:
• Ri2 et R'12 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (d- C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; • R 2 and R '12 independently of one another H or (d- C 6) alkyl, especially methyl;
• i représente un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5 ; I represents an integer ranging from 1 to 20, more particularly from 1 to 10, more particularly from 1 to 8, or from 1 to 6, even more particularly from 2 to 5;
• Z3 représente H ou le groupe -SR3, R3 représentant un groupe (C1 -C6)alkyle, (C3- C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ; • Z 3 represents H or the group -SR 3, R 3 representing a (C 1 -C 6 ) alkyl, (C 3 -C 7 ) cycloalkyl, aryl, heteroaryl or (C 3 -C 7 ) heterocycloalkyl group;
• Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, Rb représentant H ou un groupe (Cr Cβjalkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle. • Z b represents a single bond, -O- or -NH-, where R b represents H or a group (Cr C β alkyl, (C 3 -C 7 ) cycloalkyl, aryl, heteroaryl or (C 3 -C 7 ) heterocycloalkyl.
7. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 dans lequel L est choisi parmi : The cryptophycin derivative according to claim 1 wherein L is selected from:
Ri2 représentant H ou un groupe (C1 -C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. R 2 representing H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly the methyl group.
8. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 7 dans lequel R12 représente H. The cryptophycin derivative according to claim 7 wherein R 12 is H.
9. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 7 dans lequel R12 représente (d- C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. The cryptophycin derivative according to claim 7 wherein R 12 is (d-C 6 ) alkyl, more preferably methyl.
10. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 à 9 dans lequel Za représente H ou -S(C1 -C6)alkyle, notamment -SMe, ou -S-hétéroaryle, notamment ou ZbRb 10. Cryptophycin derivative according to claim 1 to 9 wherein Z a represents H or -S (C 1 -C 6 ) alkyl, especially -SMe, or -S-heteroaryl, in particular or Z b R b
représente -O(C1 -C6)alkyle, -OH, -OCH3, -OCH2CH=CH2, ou ou cationrepresents -O (C 1 -C 6 ) alkyl, -OH, -OCH 3 , -OCH 2 CH = CH 2 , or or cation
dans lequel Gl représente au moins un groupe électroinductif, ou encore dans lequel -C(=O)ZbRb représente in which Gl represents at least one electroinductive group, or in which -C (= O) Z b Rb represents
11. Dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 10 défini selon l'une des formules suivantes, L étant de préférence en position para : 11. Cryptophycin derivative according to one of claims 1 to 10 defined according to one of the following formulas, L being preferably in the para position:
12. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 1 choisi parmi : 12. The cryptophycin derivative according to claim 1, chosen from:
RbZb  RbZb
^O ^ O
Za, Zb et Rb étant tels que définis à la revendication 1 ou 10.Z a , Z b and R b being as defined in claim 1 or 10.
13. Dérivé de cryptophycine de formule (III) : dans laquelle les groupes Ri à Rn ont les mêmes significations qu'à la revendication 1 , 1 1 ou 12 et G représente un groupe -(CH2)nY, se situant en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRi, de préférence en para, 13. Cryptophycin derivative of formula (III): in which the groups R 1 to R n have the same meanings as in claim 1, 1 1 or 12 and G represents a group - (CH 2 ) n Y, which is in the ortho (o), meta (m) or para position; (p) phenyl ring bearing the CRi motif, preferably in para,
n étant un entier allant de 1 à 6 et Y désignant -N3 ; -NR12-CH2-C≡CH dans lequel R12 n being an integer from 1 to 6 and Y denoting -N 3 ; -NR 12 -CH 2 -C≡CH wherein R 12
représente H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; -OMs ; -OC(=O)-O-(4-nitrophényle), ou , Ri2 représentant H ou (C1 -C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. is H or (C 1 -C 6) alkyl, -OMs, -OC (= O) -O- (4-nitrophenyl), or Wherein R 2 is H or (C 1 -C 6 ) alkyl, more preferably methyl.
14. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 13 dans lequel Y représente -N3 ; -NR12- CH2-C≡CH dans lequel Ri2 représente H ou un groupe (C1-CβJalkyle ; -OMs ou -OC(=O)-The cryptophycin derivative of claim 13 wherein Y is -N 3 ; -NR 12 - CH 2 -C≡CH wherein R 2 is H or a group (C 1 -Cβ) alkyl; -OMs or -OC (= O) -
O-(4-nitrophényle). O- (4-nitrophenyl).
15. Dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 12 ou bien selon formule (III) de la revendication 13 avec G= -(CH2)nY avec Y= -Cl, -N3, -OH, -NH2, maléimido, haloacétamido destiné à être conjugué à un agent de ciblage. 15. Cryptophycin derivative according to one of claims 1 to 12 or according to formula (III) of claim 13 with G = - (CH 2 ) n Y with Y = -Cl, -N 3 , -OH, -NH 2 , maleimido, haloacetamido to be conjugated to a targeting agent.
16. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 15 dans lequel l'agent de ciblage est un ligand, une protéine, un anticorps, plus particulièrement monoclonal, un fragment de protéine ou d'anticorps, un peptide, un oligonucléotide ou un oligosaccharide. The cryptophycin derivative according to claim 15 wherein the targeting agent is a ligand, a protein, an antibody, more particularly monoclonal, a protein or antibody fragment, a peptide, an oligonucleotide or an oligosaccharide.
17. Procédé de préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine, dénoté conjugué, consistant à : A method of preparing a targeting agent to which at least one cryptophycin derivative, denoted conjugated, is attached, comprising:
(i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse d'un agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution du dérivé de cryptophycine tel que défini à l'une des revendications 1 à 16 ;  (i) contacting and allowing to react an aqueous solution of an optionally buffered targeting agent and a solution of the cryptophycin derivative as defined in one of claims 1 to 16;
(ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé de cryptophycine et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient formés.  (ii) then optionally separating the conjugate formed in step (i) from the cryptophycin derivative and / or the unreacted targeting agent and / or aggregates that would have formed.
18. Procédé selon la revendication 17 dans lequel : 18. The method of claim 17 wherein:
> en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type -SZa, l'agent de ciblage comprend : in the presence of a cryptophycin derivative comprising a reactive chemical group GCR1 of -SZ a type, the targeting agent comprises:
• des groupes chimiques disulfures dans le cas où GCR1 représente -SH ; Disulfide chemical groups in the case where GCR1 represents -SH;
• des groupes chimiques thiols dans le cas où GCR1 représente -SZa avec Za≠H ; • des groupes chimiques maléimido ou lodoacétamido dans le cas où GCR1 représente -SH , Thiols chemical groups in the case where GCR1 represents -SZ a with Z a ≠ H; • maleimido or lodoacetamido chemical groups in the case where GCR1 represents -SH,
> en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type -C(=O)-ZbRb, on fait réagir le dérivé de cryptophycine avec les fonctions amino de l'agent de ciblage, notamment les groupes ε-amino portés par les chaînes latérales des résidues lysine (Lys) d'un anticorps , in the presence of a cryptophycin derivative comprising a reactive chemical group GCR1 of type -C (= O) -Z b R b , the cryptophycin derivative is reacted with the amino functions of the targeting agent, in particular the groups ε-amino carried by the side chains of the lysine residues (Lys) of an antibody,
> en présence d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) avec G= -(CH2)nY, l'agent de ciblage comprend des groupes -SH lorsque Y= -Cl ou -maléimido, des groupes - C≡CH lorsque Y= -N3 ou des groupes acide carboxyhque lorsque Y= -OH ou -NH2 , > en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactifin the presence of a cryptophycin derivative of formula (III) with G = - (CH 2 ) n Y, the targeting agent comprises -SH groups when Y = -Cl or -maleimido, - C≡CH groups when Y = -N 3 or carboxylic acid groups when Y = -OH or -NH 2 ,> in the presence of a cryptophycin derivative comprising a reactive chemical group
GCR1 de type maléimido ou haloacétamido, l'agent de ciblage comprend des groupes chimiques thiols GCR1 of the maleimido or haloacetamido type, the targeting agent comprises thiol chemical groups
19. Procédé selon la revendication 17 ou 18 dans lequel 19. The method of claim 17 or 18 wherein
> en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif in the presence of a cryptophycin derivative comprising a reactive chemical group
GCR1 de type -SZa, l'agent de ciblage est modifié à l'aide d'un agent de modification GCR1 of type -SZ a , the targeting agent is modified using a modifying agent
choisi parmi un composé de formule dans laquelle R représente un groupe (C1-CβJalkyle, aryle, hétéroaryle, (C3-C7)cycloalkyle, (C3- C7)hétérocycloalkyle et ALK représente un groupe (C1 -CβJalkylène , selected from a compound of formula wherein R is (C 1 -C 6 ) alkyl, aryl, heteroaryl, (C 3 -C 7 ) cycloalkyl, (C 3 -C 7 ) heterocycloalkyl, and ALK is (C 1 -C 6) alkylene,
un analogue pegylé de formule ou un analogue sulfonique de formule u n analogous pegylated of formula or a sulfonic analogue of formula
lesquelles X3 X4, X5, Xe représentent H ou un groupe which X 3 X 4 , X 5 , Xe represent H or a group
(C1 -C6)alkyle, Xi et X2 représentent -H, -CONX8X9, -NO2, X8 et X9 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, X7 représente -SO3-M+ ou H ou bien un groupe ammonium quaternaire et a désigne un entier allant de 0 à 4 et b désigne un entier allant de 0 à (C 1 -C 6 ) alkyl, X 1 and X 2 represent -H, -CONX 8 X 9 , -NO 2 , X 8 and X 9 represents H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, X 7 represents - SO 3 -M + or H or a quaternary ammonium group and a denotes an integer ranging from 0 to 4 and b denotes an integer ranging from 0 to
2000 , dans laquelle - HaI représente un atome d'halogène ; 2000, in which - HaI represents a halogen atom;
- X-io représente un atome d'halogène ou le groupe COOX14, nitro, (C1-C8)alkyle non substitué ou halogène, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogène, (C2-C8)alkényle non substitué ou halogène, (C2-C8) alkynyle non substitué ou halogène, (C3-C8)cycloalkyle non substitué, aryle non substitué ou substitué par un à trois substituants sélectionnés parmi amino, atome d'halogène, groupe (C1-C8)alkyle non substitué ou halogène, (C1-C8)alkoxy non substitué ou halogène ; X 10 represents a halogen atom or the COOX 14 , nitro, (C 1 -C 8 ) alkyl unsubstituted or halogen, (C 1 -C 8 ) alkoxy unsubstituted or halogen, (C 2 -C 8) group; ) unsubstituted or halogenated alkenyl, (C 2 -C 8 ) unsubstituted or halogenated alkynyl, (C 3 -C 8 ) unsubstituted cycloalkyl, aryl unsubstituted or substituted with one to three substituents selected from amino, halogen, (C 1 -C 8 ) unsubstituted or halogenated, (C 1 -C 8 ) alkoxy unsubstituted or halogenated;
- chacun des Xn , X12, X13 représente indépendamment un atome d'hydrogène ou bien peut représenter X3 ; each of Xn, X 12 , X 13 independently represents a hydrogen atom or can represent X 3 ;
ou X10 et X11 forment ensemble un cycle (C2-C5)alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupe(s) (C1-C4)alkyle ; or X 1 0 and X 11 together form a (C 2 -C 5 ) alkylene ring, unsubstituted or substituted with one to five (C 1 -C 4 ) alkyl group (s);
ou X10 ou X11 forment ensemble avec X12 un cycle (C1-C5)alkylène, non substitué ou substitué par un à cinq groupes (C1-C4) alkyle or X 10 or X 11 together with X 12 form a (C 1 -C 5 ) alkylene ring, unsubstituted or substituted by one to five (C 1 -C 4 ) alkyl groups
et X14 est -H ou un groupe (C1-C8)alkyle ; and X 14 is -H or a (C 1 -C 8 ) alkyl group;
> en présence d'un dérivé de cryptophycine comprenant un groupe chimique réactif GCR1 de type -SH, l'agent de ciblage est modifié à l'aide d'un agent de modification choisi parmi succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate ; sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate ;  in the presence of a cryptophycin derivative comprising a reactive chemical group GCR1 of -SH type, the targeting agent is modified using a modifying agent chosen from succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane; 1-carboxylate; 4- (N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate sulfosuccinimidyl;
ALK désignant un groupe et b étant un nombre ALK designating a group and b being a number
entier compris entre 0 et 2000 ; ; ; succinimidyl-N- bromoacétate ; succinimidyl-3-(N-bromoacétamido)propionate ; , b étant un nombre entier compris entre 0 et 2000. integer between 0 and 2000; ; ; succinimidyl-N-bromoacetate; succinimidyl-3- (N-bromoacetamido) propionate; , b being an integer from 0 to 2000.
20. Conjugué susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 17 à 19. 20. Conjugate obtainable by the process according to one of claims 17 to 19.
21. Conjugué selon la revendication 20 caractérisé par un DAR déterminé à partir de la déconvolution du spectre HRMS supérieur à 1 , de préférence compris entre 2 et 10 et plus particulièrement entre 2 et 7. 21. Conjugate according to claim 20 characterized by a DAR determined from the deconvolution of the HRMS spectrum greater than 1, preferably between 2 and 10 and more particularly between 2 and 7.
22. Conjugué selon la revendication 20 caractérisé par un DAR déterminé à l'aide d'un spectrophotomètre UV supérieur à 0,5, de préférence supérieur à 1 , plus particulièrement compris entre 1 et 10, encore plus particulièrement entre 2 et 7, le DAR étant calculé par l'équation : 22. Conjugate according to claim 20 characterized by a DAR determined using a UV spectrophotometer greater than 0.5, preferably greater than 1, more particularly between 1 and 10, even more particularly between 2 and 7, the DAR being calculated by the equation:
DAR = CD / CA  DAR = CD / CA
dans laquelle :  in which :
CD = [(εA λi x Aλ2) - (εA χ2 x Aλ1 )] / [(εD λ2 x εA λ1 ) - (εA λ2 x εD λ1 )] CD = [(ε A λ ix A λ 2 ) - (ε A χ 2 x A λ 1 )] / [(ε D λ 2 x ε A λ 1 ) - (ε A λ 2 x ε D λ 1 )]
CA = [Aλi - (cD x εD λ1)] / εA λ1 CA = [A λ i - (c D x ε D λ1 )] / ε A λ1
et  and
Aλ1 et Aλ2 désignant respectivement les absorbances de la solution de conjugué respectivement aux longueurs d'onde λ1 et λ2 ; A λ1 and A λ2 respectively denoting the absorbances of the conjugate solution respectively at the wavelengths λ1 and λ2;
εD λ1 et εD λ2 désignant respectivement les coefficients d'absorption molaires du dérivé de cryptophycine avant conjugaison à deux longueurs d'onde λ1 et λ2, coefficients mesurés sur les composés de formule (II) de type -SZa avec Za = -SMe ou de type -C(=O)-ZbRb avec ZbRb = -OMe ou -OCH2-CH=CH2 ; ε D λ1 and ε D λ2 denoting respectively the molar absorption coefficients of the cryptophycin derivative before conjugation at two wavelengths λ1 and λ2, coefficients measured on the compounds of formula (II) of type -SZ a with Z a = -SMe or of type -C (= O) -Z b R b with Z b R b = -OMe or -OCH 2 -CH = CH 2 ;
εA λ1 et εA λ2 désignant respectivement les coefficients d'absorption molaires de l'anticorps nu avant conjugaison aux deux longueurs d'onde λ1 et λ2. ε A λ1 and ε A λ2 respectively denoting the molar absorption coefficients of the naked antibody before conjugation at the two wavelengths λ1 and λ2.
23. Conjugué selon la revendication 22 dans lequel λ1 = 280 nm et λ2 est choisie dans la gamme de longueurs d'onde spécifiques 246 nm - 252 nm. The conjugate of claim 22 wherein λ1 = 280 nm and λ2 is selected from the specific wavelength range 246 nm - 252 nm.
24. Solution de conjugué susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 17 à 19 ou comprenant le conjugué tel que défini à l'une des revendications 20 à 23. 24. Conjugate solution obtainable by the method according to one of claims 17 to 19 or comprising the conjugate as defined in one of claims 20 to 23.
25. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 13 pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dudit dérivé de cryptophycine. 25. Use of a cryptophycin derivative according to one of claims 1 to 13 for the preparation of a targeting agent which is attached at least one of said cryptophycin derivative.
26. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) : 26. Use of a cryptophycin derivative of formula (III):
dans laquelle :  in which :
G représente un groupe -CH=CH2 ou -(CH2)nY, se situant en position ortho (o), meta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRi, de préférence en para ; G represents a group -CH = CH 2 or - (CH 2 ) n Y, located in the ortho (o), meta (m) or para (p) position of the phenyl ring bearing the CRi unit, preferably in para;
Y représente -OH ; -Cl ; -N3 ; -NH2 ; -SH ; -COOH ; -NR12-CH2-C≡CH dans lequel R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; -OGP dans lequel GP désigne un groupe partant ; -OC(=O)-O-(4- nitrophényle) ; -maléimido. ou de formule : les groupes Ri à Rn ayant les mêmes significations qu'à la revendication 1 , 1 1 ou 12 et n étant un entier allant de 1 à 6, pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dudit dérivé de cryptophycine. Y is -OH; -Cl; -N 3 ; -NH 2 ; -SH; -COOH; -NR 12 -CH 2 -C≡CH wherein R 12 is H or a (C 1 -C 6 ) alkyl group, more particularly the methyl group; -OGP in which GP designates a leaving group; -OC (= O) -O- (4-nitrophenyl); -maléimido. or of formula: the groups R 1 to R n having the same meanings as in claim 1, 1 1 or 12 and n being an integer from 1 to 6, for the preparation of a targeting agent to which at least one of said cryptophycin derivative is attached .
27. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine choisi parmi l'un des suivants : 27. Use of a cryptophycin derivative selected from one of the following:
Za, Zb et Rb étant tels que définis à la revendication 1 ou 10, pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine. Z a , Z b and R b being as defined in claim 1 or 10, for the preparation of a targeting agent which is attached at least one cryptophycin derivative.
28. Dérivé de cryptophycine de formule : 28. Cryptophycin derivative of formula:
les groupes Ri à Rn ayant les mêmes significations qu'à la revendication 1 , 1 1 ou 12 et n étant un entier allant de 1 à 6,  the groups R 1 to R n having the same meanings as in claim 1, 1 1 or 12 and n being an integer ranging from 1 to 6,
29. Dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 15 pour utilisation en tant qu'anticancéreux. The cryptophycin derivative according to one of claims 1 to 15 for use as an anti-cancer agent.
30. Conjugué selon la revendication 20 à 23 pour utilisation en tant qu'anticancéreux. 30. Conjugate according to claim 20 to 23 for use as an anti-cancer agent.
31. Solution de conjugué selon la revendication 24 pour utilisation en tant qu'anticancéreux. 31. Conjugate solution according to claim 24 for use as an anti-cancer agent.
32. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 1 à 15 pour la préparation d'un médicament anticancéreux. 32. Use of a cryptophycin derivative according to one of claims 1 to 15 for the preparation of an anticancer drug.
33. Utilisation d'un conjugué selon la revendication 20 à 23 pour la préparation d'un médicament anticancéreux. 33. Use of a conjugate according to claim 20 to 23 for the preparation of an anticancer drug.
34. Utilisation d'une solution de conjugué selon la revendication 24 pour la préparation d'un médicament anticancéreux. 34. Use of a conjugate solution according to claim 24 for the preparation of an anticancer drug.
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