EP2389577A1 - Systeme d'imagerie par balayage d'une surface d'un echantillon, support et dispositif de lecture correspondants - Google Patents

Systeme d'imagerie par balayage d'une surface d'un echantillon, support et dispositif de lecture correspondants

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EP2389577A1
EP2389577A1 EP10701665A EP10701665A EP2389577A1 EP 2389577 A1 EP2389577 A1 EP 2389577A1 EP 10701665 A EP10701665 A EP 10701665A EP 10701665 A EP10701665 A EP 10701665A EP 2389577 A1 EP2389577 A1 EP 2389577A1
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EP
European Patent Office
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sample
light beam
support
head
reading
Prior art date
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EP10701665A
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German (de)
English (en)
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EP2389577B1 (fr
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Jean-Marc Goujon
Patrick Guyader
Ronan Le Page
Michel Billon
Philippe Fravallo
Gilles Salvat
Maryline Queguiner
Cédric LEBAS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zoopole Developpement
Universite de Rennes 1
Agence Francaise de Securite Sanitaire des Aliments (AFSSA)
Original Assignee
Zoopole Developpement
Universite de Rennes 1
Agence Francaise de Securite Sanitaire des Aliments (AFSSA)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application granted granted Critical
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N35/00069—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides whereby the sample substrate is of the bio-disk type, i.e. having the format of an optical disk
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    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/10—Scanning

Definitions

  • the field of the invention is that of scanning imaging. More specifically, the invention relates to imaging by scanning a surface of a sample, such as a biological sample, and in particular, but not exclusively, a fluorescently labeled sample.
  • the invention can find applications in many fields such as, for example, the food industry, cosmetics, pharmaceuticals, the environment, polymer chemistry, surface control of materials.
  • Quality controls are thus implemented during the slaughter of animals, for example in the pig industry, to detect carcasses likely to pose public health problems.
  • fluorescence technique consists of mixing (or labeling) a biological sample coupled with an antibody with a fluorescent reagent (called fluorochrome or fluorophore), that is to say, giving it the ability to emit fluorescent light under the fluorescent light. action of a luminous radiation. Fluorescence labeling is known to those skilled in the art and will not be discussed in detail.
  • a scanning or fluorescence reading device uses a confocal microscope which subjects the fluorescent reagent labeled biological sample to a light excitation (from a laser source conventionally) and a scanning system. in general oscillating mirrors, which allows to successively position the focusing point of the light beam at different points of the biological sample.
  • a fluorescence measurement sensor detects the fluorescence emitted by the biological sample in response to the excitation light.
  • the intensity of the fluorescence detected is converted into electrical signals which can then be subjected to a suitable computer processing to obtain a 2D and / or 3D image of the biological sample and to obtain a logically relevant biological information. It is necessary in such a fluorescence reading device to ensure that each scanned point on the surface of the biological sample is placed in the focal plane of the light beam, despite the irregularities of the surface of the biological sample. In other words, the focal point of the confocal microscope must be continuously adjusted during scanning in order to follow the thickness variations of the biological sample.
  • the autofocus means are however sensitive to the support material of the biological sample.
  • the autofocus means may be "dazzled" by the reflection of the excitation laser and, therefore, may not function properly.
  • the scanning system of such a device further requires that the objective of the confocal microscope and the support of the slide carrying the biological sample are mobile, which is relatively complex and expensive to implement.
  • a rotary support for example a CD disk, on the surface of which are arranged two concentric zones, namely a data storage zone located towards the center of the disk, and a blade receiving zone. marked by a fluorescent substance, located on the outside of the disc.
  • the fluorescence imaging of the blades requires the rotation of the disk by a drive system and the implementation of high precision servo autofocus means which are, by nature, relatively expensive.
  • the invention aims in particular to overcome at least some of these various disadvantages of the state of the art.
  • an object of the present invention in at least one embodiment, to provide an imaging system of a surface of at least one sample, and in particular, but not exclusively, of fluorescence imaging of a surface of at least one biological sample, which is relatively simple and inexpensive to manufacture.
  • the invention aims to provide, in at least one embodiment, a system that reliably and quickly detect the presence of bacteria and / or microorganisms in biological samples.
  • a complementary objective of the invention in at least one embodiment, is to provide a system: which allows a high sample analysis rate; which has a resolution of the order of 1 micron (micrometer); which allows a fast acquisition of the fluorescence; - which is compact, possibly portable, and easy to use; and / or which allows the detection of point elements (of micrometric size) sporadically distributed on a sample.
  • an imaging system by scanning a surface of at least one sample comprising: a suitable support to be rotated about an axis, comprising: a data storage area; and - at least one receiving housing of a sample; a reading device comprising a first read head of data stored in said storage area, comprising first means for adjusting a first light beam.
  • the reading device further comprises: a second detection / measurement head of the light emitted by the sample under the action of a second excitation light beam, and second adjustment means of the second excitation light beam, controlled by a control signal of the first adjustment means of the first light beam of the first read head.
  • the invention proposes a scanning-imaging system of a surface of a sample, fluorescently labeled for example, which can be produced from a conventional CD or DVD player, accessible at low cost, and which initially comprises a laser reading head and rotating drive means of a conventional CD or DVD disc.
  • the optical precision of such a CD / DVD reader is compatible with the intended applications, in particular, but not exclusively, fluorescence imaging of a surface of at least one biological sample, labeled with a fluorescent substance. , in order to detect the possible presence of predetermined bacteria, sporadically distributed in these samples.
  • slides each supporting a biological sample are disposed on an area of an optical disk (CD or DVD for example) as described above also comprising a data storage area.
  • the invention proposes to add to the original laser reading head of the CD / DVD reader, which preferably is not modified, a second fluorescence measurement head which is integral with the laser reading head, the two heads can be translated by the same motor when the optical disk carrying the blades to be analyzed is rotated.
  • the scanning of the surface of the samples is mixed, that is to say that the CD / DVD disc rotates while the laser reading head, which reads the data stored on the CD / DVD disc, and the head Fluorescence measurement, which sweeps the surface of the samples arranged on the CD / DVD disc, are translated.
  • the fluorescence measuring head may, initially, be identical to the laser reading head, and in this case needs to be modified in order to obtain the desired laser excitation. It is also necessary to integrate fluorescence detection means.
  • the fluorescence measurement head comprises focusing actuators which make it possible to place the surface of a sample in the focal plane of the excitation light beam. These actuators allow the displacement of the focal point of the measuring head of the fluorescence laterally (parallel to the disc surface) and along the focal axis (perpendicularly to the surface of the disc).
  • the focus control signals (servo-control signals) of the laser reading head are duplicated, and possibly adjusted, to control the focusing actuators of the fluorescence measuring head and thus adapt the point of contact. focus to deformations (eg warping, ripples, etc.) and disc surface irregularities
  • the lateral servocontrol signals of the laser reading head are duplicated towards the fluorescence measurement head, to ensure identical lateral pointing of the two optics.
  • the system of the invention makes it possible to dispense with the expensive autofocus means of the prior art, while proposing a resolution of the order of 1 ⁇ m (micrometer).
  • the system of the invention is inexpensive to implement since it is manufactured from an existing device, accessible at low cost, and whose resolution is compatible with the applications envisaged.
  • the system of the invention allows the detection of point elements (of micrometric size in the case of bacteria), sporadically distributed and has a satisfactory level of sensitivity without generating significant playback time.
  • Such a system is particularly suitable for counting bacteria which requires only a relatively weak dynamic.
  • Such a system also allows the simultaneous detection of several bacteria. This simultaneous analysis can be adapted to the sector concerned according to the established or emerging pathogen that one wishes to control.
  • This system makes it possible, when used for the detection of bacteria on animal carcasses, to decide on a threshold of contamination in order to decide on the mode of diffusion (fresh or cooked meat) towards the consumer of animal meat.
  • the system of the invention allows a gain in quality of the products from which the samples are derived.
  • the first read head comprises: means for generating the first reading light beam, first optical means determining a first focusing point of said first reading light beam, and first adjustment means of the first focusing point; and the second detection / measurement head comprises: means for generating the second excitation light beam of said sample; second optical means determining a second focusing point of said second excitation light beam; means for detecting the light emitted by the sample in response to the light excitation, means for converting the detected light into electrical signals representative of an image of the surface of said at least one sample; and second adjustment means of the second focus point.
  • the first and second adjustment means make it possible to adjust the position of the first and second focal points respectively along the focal axis of the first and second optical means respectively.
  • the first and second adjustment means also make it possible to adjust the position of the first and second focus points respectively in a direction substantially perpendicular to the focal axis of the first and second optical means, respectively.
  • the invention is based on the duplication of the lateral and focusing signals of the actuators of the laser reading head of the storage medium, towards a measuring head (or reading) of the fluorescence of the sample or samples.
  • the first reading head and the second measuring head are mounted on a common support movable in translation in a direction substantially perpendicular to the axis of rotation of the support when the support is driven in. rotation.
  • a calibrated thickness film is disposed on the upper surface of the support so as to crush the sample in the housing to a known thickness relative to the lower surface of the support.
  • the second detection / measurement head is able to detect / measure the fluorescence emitted by at least a sample labeled with a fluorescent preparation in response to an excitation light beam.
  • the imaging system of the invention can be implemented to scan the surface of a biological sample labeled with a fluorescent preparation (fluorophore).
  • control signal of the first adjustment means of the first light beam of the first read head takes account of at least one piece of information representative of at least one type of support defect. , such as variations in thickness, stored in the storage area of the support. Alternatively, or in addition, this information representative of at least one type of support defect can be measured by means of a distance measuring system placed on the second read head.
  • the invention also relates to a carrier to be rotated about an axis to be read by a scanning imaging system as previously described, comprising: a data storage and guidance area; and at least one receiving and reading housing of a sample.
  • the data stored in the corresponding zone comprise data characterizing the sample.
  • data stored in the data storage area includes information representative of at least one type of support defect, such as thickness variations.
  • This information can be read by the read head and transmitted to the measuring head of the fluorescence. They can then be used to adapt the autofocus of the fluorescence measurement head.
  • the housing receiving a sample comprises at least one expansion port.
  • an orifice or expansion zone may be provided in the sample receiving housing to allow extrusion of excess fluorescent preparation when it is crushed to a known thickness defined by the thick film. calibrated for example.
  • the invention further relates to a device for reading a medium as described above implemented in a system as described above.
  • FIG. 1 shows a view of a blade holder according to one embodiment of the invention ;
  • Figure 2 shows a sectional view of the blade holder of Figure 1;
  • FIG. 3 represents a device for fluorescence imaging of slides according to one embodiment of the invention;
  • FIG. 4 represents the fluorescence measurement head of the device of FIG. 3 according to one embodiment of the invention;
  • FIG. 5 represents a bottom view, in perspective, of the fluorescence measuring head according to one embodiment of the invention;
  • FIG. 6 represents a view from above, in perspective, of the measurement head of the fluorescence of FIG. 5.
  • the general principle of the invention proposes a scanning imaging system, for example fluorescence, of a surface of at least one sample that can be produced from a conventional CD or DVD player accessible at low cost. and which originally comprises a laser reading head and means for rotating a conventional CD or DVD disc.
  • the invention is based on the duplication of the lateral and focusing signals of the actuators of the laser reading head of the storage medium, towards a measuring head (or reading) of the fluorescence of the sample or samples, the two heads being mechanically linked . It should be noted that the scanning imaging technique of the invention does not use a confocal microscope.
  • the embodiment of the invention described hereinafter is intended to obtain an image of at least one biological sample, which is in the form of a malleable gel, and to detect in this sample the sporadic presence of microbial bacteria. a size close to 1 ⁇ m (micrometer). 6.1 Blade holder
  • Figure 1 illustrates a circular support of blades according to one embodiment of the invention.
  • the medium is an optical disc 1, for example a CD ("Compact Disc” (registered trademark)) or a DVD (“Digital Versatile Disc” (registered trademark)), generally consisting of polycarbonate.
  • CD Compact Disc
  • DVD Digital Versatile Disc
  • the disc 1 comprises at its center a circular orifice 2, allowing its insertion on a drive device in rotation of the disc 1.
  • the upper surface Sl of the disk 1 is divided into two concentric zones: a data recording zone 3 for reading and / or writing data which is situated towards the center of the disk 1, and a reception zone 4 at least one slide bearing a biological sample (not shown), which is located at the periphery of the disc 1.
  • blades 5 can be removably placed in cavities 8 (see FIG. 2) of disc 1 which are located in the receiving zone 4. These blades 5 are, for example, retained in the cavities 8 by flexible tongues (not shown).
  • the blades 5 can be stainless steel (type AISI 304) or polycarbonate, and can optionally be covered with aluminum foil to overcome the difficulties associated with too much high transparency of the blade.
  • FIG. 2 which is a sectional view of the disk 1, distinguishes the fluorescent preparation layer 6 deposited on the biological sample of the plate 5 and a metallization layer 7 deposited on the data recording zone 3 of the disk 1.
  • the combined thickness of the fluorescent preparation layer 6 and the plate 5 on which the sample is deposited may be greater than the depth of the cavity 8.
  • a film of calibrated thickness (of the order of few microns) can be deposited on the partially metallized disk 1.
  • This calibrated thickness film (not shown) comprises, for example, apertures (in other words, the film is perforated in places) intended to almost completely discover the sample plate and makes it possible to crush the fluorescent preparation 6 to a known thickness (the calibrated thickness film therefore has openings inside or at least at the edges of which the crushed preparation adopts the same thickness as the film), depending on the desired depth of field, against the lower surface S2 of the disk 1, and avoids problems due to the depth of field.
  • Orifices or expansion zones may be provided in the cavities 8, to allow extrusion of the excess fluorescent preparation 6 when it is crushed by the compression surface of the perforated film.
  • the compression surface is for example retained on the disc 1 by holding lugs 10, as shown in FIG. 1.
  • Another solution consists in producing a gel of known thickness, the biological sample in this example being in the form of form of a gel malleable. To do this, we have in the gel beads of calibrated diameter of a few micrometers, non-deformable and transparent, non-fluorescent material. The "gel" of the sample is compressed until the compression surfaces come into contact with the non-deformable balls. In each case, zones of expansion of the gel must be provided.
  • the reference 11 and the metallization 7 have a common surface that serves as a reference surface.
  • the surface lying in the extension of the metallized deposit 7 constituting the readable surface of the CD will preferably be used as a reference surface. In the case of a DVD, it is an accessible surface parallel to the extension of the reading metallization.
  • the metallization furthermore conventionally comprises the recording of all the guide-synchronization signals of the CD / DVD 1, as well as any data that may be used in the context of the invention, as described hereinafter.
  • Figure 3 shows schematically the disk 1 described above, when inserted into a CD / DVD player modified according to the invention.
  • the disc 1 can be rotated about an axis A by a CD / DVD drive motor at constant or variable speed.
  • the modified CD / DVD player according to the invention comprises a first reading head 20 and a second fluorescence measuring head 30 which are housed in a fixed frame 43 situated above the disk 1, and which are integral.
  • the two heads 20, 30 can move radially (direction referenced "X” in Figure 3) and vertically (direction referenced "Z” in Figure 2) relative to the disk 1.
  • the reading head 20 comprises, in a conventional manner, a laser diode able to emit a light beam, an optical system comprising at least one mirror or focusing lens of the light beam emitted on the data zone 3 of the disk 1, and a photoelectric diode adapted to detect the signal reflected by the surface of the data area 3 in response to the light excitation.
  • the signals detected by the photo diode can be processed by means of treatment, referenced " ⁇ P" in Figure 4.
  • the light beam 9 coming from the read head 20 of the disk 1 and the light beam 10 coming from the fluorescence measurement head 30 (for the analysis of the slides) are represented in FIG. 2.
  • the fluorescence signal emitted by the biological sample in response to the light excitation 10 and the signal reflected by the surface of the data area 3, on the other hand, have not been shown.
  • the surface of the biological samples of the slides 5 is scanned point by point by the light beam 10 coming from the measuring head of the fluorescence 30 by rotating the disk 1 and by translation of the two heads 20, 30.
  • the fluorescence measuring head 30 comprises a light excitation source, which may be a laser diode or an LED, for example, emitting a light beam 10 of the milliwatts (mW) fraction within a few minutes. milliwatts of power (preferably adjustable according to the speed of rotation of the disk 1) at a wavelength corresponding to the excitation of the fluorophores typically used (in this case of the order of 488 nm).
  • a light excitation source which may be a laser diode or an LED, for example, emitting a light beam 10 of the milliwatts (mW) fraction within a few minutes. milliwatts of power (preferably adjustable according to the speed of rotation of the disk 1) at a wavelength corresponding to the excitation of the fluorophores typically used (in this case of the order of 488 nm).
  • the measuring head of the fluorescence 30 further comprises an optics comprising at least one focusing lens (referenced 15 in FIG. 4) of the emitted light beam and means for detecting the fluorescence emitted by the plates 5 (referenced 32 on the FIG. 4), in a narrow band of wavelengths, in response to the light excitation 10.
  • These detection means may comprise one or more sensors (of the photomultiplier, photodiode, CDD or CMOS type) capable of generating an electrical signal depending on the amount of fluorescence detected.
  • the signals generated during the scanning of the biological samples placed on the slides 5 by the fluorescence measurement head 30 can be processed by processing means (referenced " ⁇ P" in the figure 4) to obtain an image of the surface of the samples, and to detect the possible presence of bacteria in these samples.
  • the size (or diameter) of the spot (or “spot” in English) of the light beam 10 on the surface of the biological samples is preferably controlled to ensure the desired resolution of the area to be scanned.
  • the intensity of the light beam 10 can be adjusted according to the response to excitation, to increase the signal-to-noise ratio. A compromise is also necessary between the wavelength, the surface of the spot and the depth of field.
  • the system of the invention therefore takes into account the predictable variations in height (in the Z direction) between the focusing point 21 of the read head 20 on the data recording zone 3 of the disk 1 and the focusing point. 31 of the fluorescence measuring head 30 on the surface of the biological samples, as shown in FIG. 2. Due to the rigidity of the material (polycarbonate in this example) of the disk 1, the irregularities of the surface Sl of the disk 1 , which may be due to a curvature of the disk 1, are assumed to be identical, or at least predictable, over the entire radius of the disk 1, from a measurement taken at the location of the read head 20.
  • an autofocus command (called autofocus complement) may be applied to the fluorescence measurement head 30 to compensate for these irregularities.
  • This control can be performed by slaving by means of piezoelectric shims the position of the fiber carrying the excitation light power in the Z direction. A static adjustment of the position of the fiber carrying the excitation light power along the X and / or Y can also be performed.
  • This autofocus complement can be made confocal on the excitation fiber.
  • the autofocus correction calculated by the read head 20 of the disk 1 to compensate for the irregularities of the surface Sl also serves to compensate for the same irregularities for the reading of the fluorescence.
  • Signals autofocusing the read head 20 are thus directed as such (arrow 60 of Figure 2) to the measuring head of the fluorescence 30, so that the depth of field of the measuring head of the fluorescence 30 ' It does not have to be controlled.
  • the flatness defects of the upper surface Sl of the disk 1 are compensated by duplicating the autofocus control signals (focusing signals) of the read head 20 on the measuring head of the fluorescence 30, after having possibly amplified them.
  • the lateral servo signals of the read head 20 are duplicated (arrow 60) towards the measurement head of the fluorescence 30, to also ensure identical lateral pointing of the two optics (we will speak here of the first autofocus stage).
  • the movement of the two heads 20, 30 being made in step-by-step, the linearization of the movement of the heads 20, 30 is obtained by radial control of the respective focusing lenses of the reading and measuring heads 30.
  • the data area 3 and the sample support area 4 are referenced with respect to the lower surface S2 of the disk 1 which is assumed to be flat or which exhibits pitch variations of low spatial frequency.
  • FIG. 4 schematically illustrates an embodiment of the fluorescence measurement head 30.
  • the light beam 10 emitted by the laser source 16 of the fluorescence measurement head 30 can be conveyed by an optical fiber Fb to a focusing lens 15 which concentrates the light beam 10 in the form of a "spot" 31 on the surface of the biological sample (not shown) disposed on the plate 5.
  • the fluorescence 32 emitted by the biological sample in response to the light excitation 10 can be collected via this same lens 15, by a set of optical fibers Fa, and then routed to a system comprising one or more filters 17 and a detector 18 of photomultiplier type (PMT) for example.
  • PMT photomultiplier type
  • Such a photomultiplier is capable of generate electrical signals depending on the amount of fluorescence detected.
  • FIG 5 is a bottom view, in perspective, of the measuring head of the fluorescence 30 according to a particular embodiment.
  • This figure shows the original support plate 100 of a laser reading head on which the focusing lens 15 is mounted.
  • a cable Fa + Fb comprising the optical fibers Fa and Fb is removably mounted on this support plate.
  • Figure 6 shows this same fluorescence measurement head 30 when viewed from above.
  • the optical fiber cable Fa + Fb is held on the support plate 100 by a plurality of fixing elements 112 such as screws, the cable being held in position by four centering elements 1 10 and a resilient seal 111.
  • an additional autofocus (which will also be called the second autofocus stage) can be applied to the head of the fluorescence measurement head 30.
  • This complement can be performed by slaving by means of piezoelectric shims arranged in housings 120, the position of the fiber carrying the excitation light power in the Z direction.
  • a static adjustment of the position of the fiber conveying the excitation light power along the X and / or Y directions can also be carried out .
  • the X, Y and Z autofocus signals of the read head 20 are duplicated (arrow 60) towards the measurement head of the fluorescence 30.
  • These autofocus signals are applied to the conventional focusing actuators (FIG. not shown) of the fluorescence measuring head 30, which comprise at least the focusing lens 15, and which allow the displacement of the measuring head of the fluorescence 30 in the X, Y and / or Z directions.
  • the metallization layer 7 deposited on the data recording zone 3 of the disk 1 may constitute a reference surface, as well as monitoring the "spiral" information, for the enslavement of the focusing optics. This is achieved with a simple continuous CD playback (no range jump, regardless of the type of information).
  • Seizure information may be etched on the area 3 of the disk 1, to identify the set of blades attached thereto.
  • Information characterizing the analysis of the blades arranged on the disk can also be engraved on the zone 3. It will thus be possible to store on the disk the date and time of the analysis, the result of the analysis (positive when bacteria are detected or negative if not), etc. Similarly, it is envisaged to pre-characterize the disks under laboratory conditions (no misalignment under these conditions), during the manufacture of the disk for example, and to store in the data zone 3 information representative of certain types. non-evolutive defects (variation of thickness of the optical disk for example). This pre-characterization phase of the disk, for example its optical thickness at the level of the fluorescence reading head, can be performed by Fizeau type interferometry. This information is read by the read head 20 and transmitted to the measuring head of the fluorescence 30.
  • This compensation can be s' by modifying the focusing signal (first autofocus stage), and / or for example by means of the aforementioned piezoelectric shims (second autofocus stage).
  • the system of the invention makes it possible to detect and to count the microorganisms in biological samples in short time, of the order of 3 or 4 hours, for example, and to draw information on the contamination of an animal carcass.
  • the system of the invention can be used to scan a sample in depth (according to Z) and thus obtain a 3D image of the sample. Such scanning however requires modulating the focusing signal and / or using slower disk rotation speeds and / or making several successive confocal passes, by varying the focusing of the light beam.
  • Such a system can be implemented in parallel with an automatic system for taking biological samples by impaction, fluorescence-labeled samples and archival sample support slides.
  • Such a system can be used by industrial and food risk control organizations, and is an alternative to control methods based on animal serology or bacteriological.
  • the industrialist or the control body using the system of the invention thus has a tool for packaging the meat, or any other food product, according to the information representative of the contamination obtained, without slowing down the process. slaughter or processing.
  • the principle of the invention also significantly reduces the manufacturing cost of fluorescence imaging devices, such as those used for the analysis of biological samples.
  • the system of the invention can also allow the imaging of chips of biological samples ("biochips" in English) even if the reading of such chips does not require a resolution as high as for slides.
  • the invention can be implemented for the biological analysis of industrial and consumer products (perishable and non-perishable), in particular in the field of human and animal health.
  • the invention can find applications in many fields such as, for example, agribusiness (poultry industry, pigs, etc.), cosmetics, pharmaceuticals, the environment, polymer chemistry (analysis of plastics) , surface control of materials, etc. More generally, the invention can also be implemented for the analysis of any flat sample, in direct lighting and reflection imaging. diffusion.
  • the angle of incidence of the light beams coming from the reading and measuring heads of the fluorescence is zero.
  • the collection must be sufficient, which limits to rather low angles; in the case of confocal detection, the flux may decrease with the angle; - the optical geometry of the original reading head must be respected.
  • the scanning and autofocus system of the invention is not dependent on the reading mode of the sample.
  • the reading of the sample can be performed by any type of excitation light source or illumination: incoherent illumination (no fluorescence analysis possible in this case, and preferably in confocal or back-diffusion), confocal (in reflection as in fluorescence), by transmission (this requires for example a movable collector on the other side of the disc which follows the transverse movement of the heads 20 and 30), by reflection, etc.
  • incoherent illumination no fluorescence analysis possible in this case, and preferably in confocal or back-diffusion
  • confocal in reflection as in fluorescence
  • transmission this requires for example a movable collector on the other side of the disc which follows the transverse movement of the heads 20 and 30
  • reflection etc.
  • optical fibers multicore fibers, hole fibers, etc.

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Abstract

L'invention concerne un système d'imagerie par balayage d'une surface d'au moins un échantillon comprenant : un support apte à être entraîné en rotation autour d'un axe, comprenant : une zone de stockage de données; et - au moins un logement de réception d'un échantillon; un dispositif de lecture comprenant une première tête de lecture des données stockées dans ladite zone de stockage, comprenant des premiers moyens d'ajustement d'un premier faisceau lumineux. Selon l'invention, le dispositif de lecture comprend en outre: - une deuxième tête de détection/mesure de la lumière émise par l'échantillon sous l'action d'un deuxième faisceau lumineux d'excitation, et des deuxièmes moyens d'ajustement du deuxième faisceau lumineux d'excitation, pilotés par un signal de contrôle des premiers moyens d'ajustement du premier faisceau lumineux de la première tête de lecture.

Description

Système d'imagerie par balayage d'une surface d'un échantillon, support et dispositif de lecture correspondants.
1. Domaine de l'invention
Le domaine de l'invention est celui de l'imagerie par balayage. Plus précisément, l'invention concerne l'imagerie par balayage d'une surface d'un échantillon, tel un échantillon biologique, et en particulier, mais non exclusivement, d'un échantillon marqué par fluorescence.
L'invention peut trouver des applications dans de nombreux domaines tels que, par exemple, l' agro-alimentaire, la cosmétique, la pharmaceutique, l'environnement, la chimie des polymères, le contrôle de surface des matériaux.
2. Art antérieur
La présence et la maîtrise de bactéries et/ou de micro -organismes indésirables, telles que les salmonelles et listéria, dans des produits alimentaires notamment, est une préoccupation croissante des autorités de sécurité sanitaire des aliments et des industriels.
Des contrôles de qualité sont ainsi mis en œuvre lors de l'abattage des animaux, par exemple dans la filière porcine, pour détecter les carcasses susceptibles de poser des problèmes de santé publique.
Il est ainsi courant que les carcasses des animaux soient contrôlées visuellement, une telle approche restant toutefois peu fiable.
Il est également connu de mettre en œuvre des contrôles bactériologiques, basés sur la bactériologie pure ou sur des méthodes combinées dites « rapides ». Ce type de contrôle reste cependant fastidieux, coûteux et nécessite au moins 48 heures avant la délivrance d'une information représentative du niveau de contamination. Les contrôles bactériologiques nécessitent en outre de disposer d'un laboratoire équipé et de personnels qualifiés.
Par ailleurs, les contrôles utilisant des méthodes moléculaires basées sur l'amplification génique nécessitent une incubation préalable qui retarde d'autant l'obtention d'une information représentative du niveau de contamination. Enfin, les contrôles sérologiques visent à rechercher et à identifier l'éventuelle présence d'anticorps qui indiquerait la présence de bactéries/micro- organismes susceptibles, au-delà d'un seuil prédéterminé, de rendre la viande animale impropre à la consommation.
L'utilisation de telles méthodes de contrôle est fastidieuse et coûteuse lorsque l'on recherche plusieurs pathogènes à partir d'un même échantillon biologique. En outre, ces méthodes ne sont adaptées que lorsque la contamination sur l'échantillon biologique est importante et homogène.
Dans le cas de prélèvements analysés à l'aide d'un microscope, il est connu d'utiliser des dispositifs de balayage ou de lecture par fluorescence permettant l'analyse par fluorescence de tels prélèvements. La technique de fluorescence consiste à mélanger (ou marquer) un échantillon biologique couplé avec un anticorps avec un réactif le rendant fluorescent (appelé fiuorochrome ou fiuorophore), c'est-à-dire lui donnant la capacité d'émettre une lumière fluorescente sous l'action d'un rayonnement lumineux. Le marquage par fluorescence est connu de l'homme du métier et ne sera pas abordé en détail. Une technique particulière de marquage par fluorescence est présenté dans la publication technique « Fravalo P, Chanet JP, Mas M, Huchet E, Queguiner S, Salvat G : Feasability of fluorescent détection oj pathogens on pork carcasses ; Berl Munch Tierarztl Wochenschr ; 2001 Sep-Oct ; 114(9-10): 393-6. Un dispositif de balayage ou de lecture par fluorescence met en œuvre, par exemple, un microscope confocal qui soumet l'échantillon biologique marqué d'un réactif fluorescent à une excitation lumineuse (issue d'une source laser classiquement) et un système de balayage, en général des miroirs oscillants, qui permet de positionner successivement le point de focalisation du faisceau lumineux en différents points de l'échantillon biologique. Un capteur de mesure de la fluorescence (un photomultiplicateur classiquement) détecte la fluorescence émise par l'échantillon biologique en réponse la lumière d'excitation. L'intensité de la fluorescence détectée est convertie en signaux électriques qui peuvent ensuite faire l'objet d'un traitement informatique adapté pour obtenir une image 2D et/ou 3D de l ' échantillon biologique et en tirer une information bio logiquement pertinente. II est nécessaire dans un tel dispositif de lecture par fluorescence de s'assurer que chaque point balayé de la surface de l'échantillon biologique est placé dans le plan focal du faisceau lumineux, malgré les irrégularités de la surface de l'échantillon biologique. En d'autres termes, il convient de régler en continu, lors du balayage, le point focal du microscope confocal afin de suivre les variations d'épaisseur de l'échantillon biologique. Ceci est particulièrement contraignant dans la mesure où la résolution nécessaire pour une telle application est de l'ordre de quelques micromètres (μm) et que la profondeur de champ est faible. II a été proposé de remédier à ce problème en utilisant, dans le microscope confocal, des moyens de focalisation réglables (également appelés moyens d'autofocus), qui permettent d'obtenir la précision voulue.
Les moyens d'autofocus sont toutefois sensibles au matériau support de l'échantillon biologique. En particulier, dans le cas où le support est une lame métallique, les moyens d'autofocus peuvent êtres « éblouis » par la réflexion du laser d'excitation et, par conséquent, peuvent ne pas fonctionner correctement.
Le système de balayage d'un tel dispositif nécessite en outre que l'objectif du microscope confocal et le support de la lame portant l'échantillon biologique soient mobiles, ce qui est relativement complexe et coûteux à mettre en œuvre. II est ainsi connu d'utiliser un support rotatif, par exemple un disque CD, sur la surface duquel sont aménagées deux zones concentriques, à savoir une zone de stockage de données, située vers le centre du disque, et une zone de réception de lames marquées par une substance fluorescente, située à l'extérieur du disque. L'imagerie par fluorescence des lames nécessite la mise en rotation du disque par un système d'entraînement et la mise en œuvre de moyens d'autofocus asservis de haute précision qui sont, par nature, relativement coûteux.
Un autre inconvénient lié à l'utilisation de tels disques est que la surface du disque n'est pas toujours parfaitement plane, ce qui peut fausser les mesures de fluorescence et dégrader la qualité de l'image obtenue, par défocalisation notamment.
En outre, lorsque la surface de l'échantillon biologique est irrégulière, il est nécessaire que les moyens d'autofocus soient très rapides, ou que la vitesse de rotation du disque soit relativement faible.
3. Objectifs de l'invention
L'invention a notamment pour objectif de pallier au moins certains de ces différents inconvénients de l'état de la technique.
Plus précisément, l'un des objectifs de la présente invention, dans au moins un mode de réalisation, est de fournir un système d'imagerie d'une surface d'au moins un échantillon, et en particulier, mais non exclusivement, d'imagerie par fluorescence d'une surface d'au moins un échantillon biologique, qui soit relativement simple et peu coûteux à fabriquer.
En particulier, l'invention a pour objectif de fournir, dans au moins un mode de réalisation, un système qui permette de détecter de manière fiable et rapide la présence de bactéries et/ou de micro-organismes dans des échantillons biologiques. Par ailleurs, un objectif complémentaire de l'invention, dans au moins un mode de réalisation, est de fournir un système : qui permette une cadence d'analyse d'échantillons élevée ; qui présente une résolution de l'ordre de 1 μm (micromètre) ; qui permette une acquisition rapide de la fluorescence ; - qui soit peu encombrant, éventuellement portable, et simple à utiliser ; et/ou qui permette la détection d'éléments ponctuels (de taille micrométrique) sporadiquement distribués sur un échantillon.
4. Exposé de l'invention Ces objectifs, ainsi que d'autres, sont atteints selon l'invention à l'aide d'un système d'imagerie par balayage d'une surface d'au moins un échantillon comprenant : un support apte à être entraîné en rotation autour d'un axe, comprenant : une zone de stockage de données ; et - au moins un logement de réception d'un échantillon ; un dispositif de lecture comprenant une première tête de lecture des données stockées dans ladite zone de stockage, comprenant des premiers moyens d'ajustement d'un premier faisceau lumineux. Selon l'invention, le dispositif de lecture comprend en outre : une deuxième tête de détection/mesure de la lumière émise par l'échantillon sous l'action d'un deuxième faisceau lumineux d'excitation, et des deuxièmes moyens d'ajustement du deuxième faisceau lumineux d'excitation, pilotés par un signal de contrôle des premiers moyens d'ajustement du premier faisceau lumineux de la première tête de lecture. Ainsi, l'invention propose un système d'imagerie par balayage d'une surface d'un échantillon, marqué par fluorescence par exemple, qui peut être réalisé à partir d'un lecteur CD ou DVD classique, accessible à faible coût, et qui comprend à l'origine une tête de lecture laser et des moyens d'entrainement en rotation d'un disque CD ou DVD classique. La précision de l'optique d'un tel lecteur CD/DVD est compatible avec les applications envisagées, en particulier, mais non exclusivement, l'imagerie par fluorescence d'une surface d'au moins un échantillon biologique, marqué par une substance fluorescente, afin de détecter la présence éventuelle de bactéries prédéterminées, sporadiquement distribuées dans ces échantillons. Dans le système de l'invention, des lames supportant chacune un échantillon biologique sont disposées sur une zone d'un disque optique (CD ou DVD par exemple) tel que décrit précédemment comprenant également une zone de stockage de données.
L'invention se propose d'adjoindre à la tête de lecture laser d'origine du lecteur CD/DVD, qui de préférence n'est pas modifiée, une seconde tête de mesure de la fluorescence qui est solidaire de la tête de lecture laser, les deux têtes pouvant être translatées par un même moteur lorsque le disque optique portant les lames à analyser est mis en rotation.
Ainsi donc, dans le système de l'invention, le balayage de la surface des échantillons est mixte, c'est-à-dire que le disque CD/DVD tourne pendant que la tête de lecture laser, qui lit les données stockées sur le disque CD/DVD, et la tête de mesure de la fluorescence, qui balaie la surface des échantillons disposés sur le disque CD/DVD, sont translatées.
La tête de mesure de la fluorescence peut, à l'origine, être identique à la tête de lecture laser, et nécessite dans ce cas d'être modifiée afin d'obtenir l'excitation laser souhaitée. Il est également nécessaire d'y intégrer des moyens de détection de la fluorescence.
Afin que l'image obtenue de la surface de chaque échantillon biologique soit nette, la tête de mesure de la fluorescence comprend des actuateurs de focalisation qui permettent de placer la surface d'un échantillon dans le plan focal du faisceau lumineux d'excitation. Ces actuateurs permettent le déplacement du point focal de la tête de mesure de la fluorescence latéralement (parallèlement à la surface du disque) et selon l'axe focal (perpendiculairement à la surface du disque).
Selon l'invention, les signaux de commande de focalisation (signaux d'asservissement) de la tête de lecture laser sont dupliqués, et éventuellement ajustés, pour commander les actuateurs de focalisation de la tête de mesure de la fluorescence et adapter ainsi le point de focalisation aux déformations (par exemple voilage, ondulations, etc) et aux irrégularités de surface du disque
CD/DVD. En complément des signaux d'asservissement de focalisation (selon l'axe focal), les signaux d'asservissement latéral de la tête de lecture laser sont dupliqués vers la tête de mesure de la fluorescence, pour assurer un pointage latéral identique des deux optiques.
Ainsi, le système de l'invention permet de s'affranchir des moyens d'autofocus coûteux de l'art antérieur, tout en proposant une résolution de l'ordre de lμm (micromètre).
Le système de l'invention est peu coûteux à mettre en œuvre puisqu'il est fabriqué à partir d'un dispositif existant, accessible à bas coût, et dont la résolution est compatible avec les applications envisagées. Le système de l'invention permet la détection d'éléments ponctuels (de taille micrométrique dans le cas des bactéries), sporadiquement distribués et présente un niveau de sensibilité satisfaisant sans engendrer de temps de lecture conséquent.
Un tel système est particulièrement adapté au comptage de bactéries qui ne nécessite qu'une dynamique relativement faible. Un tel système permet en outre la détection simultanée de plusieurs bactéries. Cette analyse simultanée peut être adaptée à la filière concernée selon le pathogène établi ou émergeant qu'on souhaite maîtriser.
Ce système permet, lorsqu'il est utilisé pour la détection de bactéries sur des carcasses d'animaux, de statuer sur un seuil de contamination afin de décider du mode de diffusion (viande fraîche ou cuite) vers le consommateur de la viande animale.
Plus généralement, le système de l'invention permet un gain en qualité des produits dont sont issus les échantillons.
Dans un mode de réalisation particulier du système de l'invention, la première tête de lecture comprend : des moyens de génération du premier faisceau lumineux de lecture, des premiers moyens optiques déterminant un premier point de focalisation dudit premier faisceau lumineux de lecture, et des premiers moyens d' ajustement du premier point de focalisation ; et la deuxième tête de détection/mesure comprend : des moyens de génération du deuxième faisceau lumineux d'excitation dudit échantillon ; des seconds moyens optiques déterminant un second point de focalisation dudit deuxième faisceau lumineux d'excitation ; des moyens de détection de la lumière émise par l'échantillon en réponse à l'excitation lumineuse, des moyens de conversion de la lumière détectée en signaux électriques représentatifs d'une image de la surface dudit au moins un échantillon ; et des seconds moyens d'ajustement du second point de focalisation. Avantageusement, les premiers et seconds moyens d'ajustement permettent d'ajuster la position du premier et du second point de focalisation respectivement selon l'axe focal des premiers et des seconds moyens optiques respectivement. Selon un aspect particulier, les premiers et seconds moyens d'ajustement permettent en outre d'ajuster la position du premier et du second point de focalisation respectivement dans une direction sensiblement perpendiculaire à l'axe focal des premiers et des seconds moyens optiques respectivement.
L 'invention repose sur la duplication des signaux latéraux et de focalisation des actuateurs de la tête de lecture laser du support de stockage, vers une tête de mesure (ou de lecture) de la fluorescence du ou des échantillons.
Dans un mode de réalisation préférentiel de l'invention, la première tête de lecture et la deuxième tête de mesure sont montées sur un support commun mobile en translation suivant une direction sensiblement perpendiculaire à l'axe de rotation du support lorsque le support est entraîné en rotation.
Ainsi, la liaison mécanique des deux têtes permet une fabrication relativement simple et peu coûteuse du système.
Selon un aspect particulier, un film d'épaisseur calibrée est disposé sur la surface supérieure du support de façon à écraser l'échantillon dans le logement à une épaisseur connue par rapport à la surface inférieure du support.
Ainsi, pour s'assurer que la surface des échantillons biologiques déposés sur les lames et la surface de lecture du disque CD/DVD suivent les mêmes déplacements selon l'axe de rotation du disque CD/DVD, on utilise un film d'épaisseur calibrée sur la surface supérieure du support de manière à ce que_ces surfaces sont référencées sur la même surface inférieure du disque CD/DVD. Ce film d'épaisseur calibrée est ajouré aux endroits où la lecture doit avoir lieu. Ainsi, lorsque l'échantillon est pressé contre la surface inférieure du CD/DVD, la quantité excédentaire de préparation biologique est extrudée dans des zones prévues à cet effet, et les zones à analyser possèdent une épaisseur connue. Dans un mode de réalisation de l'invention, la deuxième tête de détection/mesure est apte à détecter/mesurer la fluorescence émise par au moins un échantillon marqué par une préparation fluorescente en réponse à un faisceau lumineux d'excitation.
Ainsi, le système d'imagerie de l'invention peut être mis en œuvre pour balayer la surface d'un échantillon biologique marqué par une préparation fluorescente (fluorophore).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le signal de contrôle des premiers moyens d'ajustement du premier faisceau lumineux de la première tête de lecture tient compte d'au moins une information représentative d'au moins un type de défaut du support, tels que des variations d'épaisseur, mémorisées dans la zone de stockage du support. Alternativement, ou en complément, cette information représentative d'au moins un type de défaut du support peut être mesurées au moyen d'un système de mesure de distance placé sur la deuxième tête de lecture.
L'invention concerne également un support— à être entraîné en rotation autour d'un axe pour être lu par un système d'imagerie par balayage tel que décrit précédemment, comprenant : une zone de stockage de données et de guidage ; et au moins un logement de réception et de lecture d'un échantillon, Selon l'invention, les données stockées dans la zone correspondante comprennent des données caractérisant l'échantillon.
Selon un aspect particulier données stockées dans la zone de stockage de données comprennent des informations représentatives d'au moins un type de défaut du support, tels que des variations d'épaisseur.
On pourra ainsi pré-caractériser le support, lors de sa fabrication par exemple, et stocker dans la zone de données des informations représentatives de certains types de défauts non évolutifs (variation d'épaisseur du support par exemple).
Ces informations pourront être lues par la tête de lecture et transmises vers la tête de mesure de la fluorescence. Elles peuvent alors servir à adapter l'autofocus de la tête de mesure de la fluorescenceτ
Selon un autre aspect particulier, le logement de réception d'un échantillon comprend au moins un orifice d'expansion.
Ainsi, un orifice ou zone d'expansion peut être prévu dans le logement de réception d'un échantillon pour permette l'extrusion de l'excédent de préparation fluorescente lorsque celle-ci est écrasée à une épaisseur connue définie par le film d'épaisseur calibrée par exemple.
L'invention concerne en outre un dispositif de lecture d'un support tel que décrit précédemment mis en œuvre dans un système tel que décrit précédemment.
5. Liste des figures
D'autres caractéristiques et avantages des modes de réalisation de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation préférentiel de l'invention, donné à titre d'exemple indicatif et non limitatif (tous les modes de réalisation de l'invention ne sont pas limités aux caractéristiques et avantages de ce mode de réalisation préférentiel), et des dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente une vue d'un support de lames selon un mode de réalisation de l'invention ; la figure 2 représente une vue en coupe du support de lames de la figure 1 ; la figure 3 représente un dispositif d'imagerie par fluorescence de lames selon un mode de réalisation de l'invention ; - la figure 4 représente la tête de mesure de la fluorescence du dispositif de la figure 3 selon un mode de réalisation de l'invention ; la figure 5 représente une vue de dessous, en perspective, de la tête de mesure de la fluorescence selon un mode de réalisation de l'invention ; la figure 6 représente une vue de dessus, en perspective, de la tête de mesure de la fluorescence de la figure 5.
6. Description d'un mode de réalisation de l'invention
Le principe général de l'invention propose un système d'imagerie par balayage, par fluorescence par exemple, d'une surface d'au moins un échantillon qui peut être réalisé à partir d'un lecteur CD ou DVD classique, accessible à faible coût, et qui comprend à l'origine une tête de lecture laser et des moyens d'entraînement en rotation d'un disque CD ou DVD classique. L'invention repose sur la duplication des signaux latéraux et de focalisation des actuateurs de la tête de lecture laser du support de stockage, vers une tête de mesure (ou de lecture) de la fluorescence du ou des échantillons, les deux têtes étant mécaniquement liées. II est à noter que la technique d'imagerie par balayage de l'invention ne met pas en oeuvre de microscope confocal.
Le mode de réalisation de l'invention décrit ci-après vise à obtenir une image d'au moins un échantillon biologique, qui se présente sous la forme d'un gel malléable, et à détecter dans cet échantillon la présence sporadique de bactéries d'une taille voisine de 1 μm (micromètre). 6.1 Support de lames
La figure 1 illustre un support circulaire de lames selon un mode de réalisation de l'invention. Le support est un disque optique 1, par exemple un CD (« Compact Disc » (marque déposée)) ou un DVD (« Digital Versatile Disc » (marque déposée)), constitué généralement de polycarbonate.
De manière classique, le disque 1 comprend en son centre un orifice circulaire 2, permettant son insertion sur un dispositif d'entraînement en rotation du disque 1.
La surface supérieure Sl du disque 1 est divisée en deux zones concentriques : une zone 3 d'enregistrement de données servant à la lecture et/ou l'écriture de données qui est située vers le centre du disque 1, et une zone 4 de réception d'au moins une lame 5 portant un échantillon biologique (non représenté), qui est située à la périphérie du disque 1.
Dans ce mode de réalisation, plusieurs lames 5 peuvent être placées de façon amovible dans des cavités 8 (voir figure 2) du disque 1 qui sont situées dans la zone de réception 4. Ces lames 5 sont, par exemple, retenues dans les cavités 8 par des languettes flexibles (non représentées). Les lames 5 peuvent être en inox (de type AISI 304) ou en polycarbonate, et peuvent éventuellement être recouvertes d'une feuille d'aluminium pour pallier les difficultés liées à une trop grande transparence de la lame.
D'autres dispositions des lames 5 sur le disque 1 sont, bien entendu, envisageables.
Avant leur analyse, les échantillons biologiques disposés sur les lames 5 ont été marqués par une préparation fluorescente (fluorophore), par exemple un colorant commercial comme le « Alexa Fluor 488 » de Molecular Probes (marques déposées), dont la bande d'absorption peut se situer par exemple autour de 488 nm (nanomètre), la longueur d'onde de fluorescence se situant autour de 519 nm. On distingue sur la figure 2, qui est une vue en coupe du disque 1 , la couche de préparation fluorescente 6 déposée sur l'échantillon biologique de la lame 5 et une couche de métallisation 7 déposée sur la zone 3 d'enregistrement de données du disque 1.
L'épaisseur combinée de la couche de préparation fluorescente 6 et de la lame 5 sur laquelle l'échantillon est déposé peut être supérieure à la profondeur de la cavité 8. Dans ce cas, un film d'épaisseur calibrée (de l'ordre de quelques microns) peut être déposé sur le disque 1 partiellement métallisé. Ce film d'épaisseur calibrée (non représenté) comprend par exemple des ouvertures (en d'autres termes, le film est ajouré par endroits) destinées à découvrir presque totalement la lame 5 d'échantillon et permet d'écraser la préparation fluorescente 6 à une épaisseur connue (le film d'épaisseur calibrée possède donc des ouvertures à l'intérieur ou au moins aux abords desquels la préparation écrasée adopte la même épaisseur que le film), dépendant de la profondeur de champ souhaitée, contre la surface inférieure S2 du disque 1, et évite des problèmes dus à la profondeur de champ. Des orifices ou zones d'expansion (non représentés) peuvent être prévus dans les cavités 8, pour permette l'extrusion de l'excédent de préparation fluorescente 6 lorsque celle-ci est écrasée par la surface de compression du film ajouré. La surface de compression est par exemple retenue sur le disque 1 par des ergots de maintien 10, comme illustré sur la figure 1. Une autre solution consiste à réaliser un gel d'épaisseur connue, l'échantillon biologique dans cet exemple se présentant sous la forme d'un gel malléable. Pour ce faire, on dispose dans le gel des billes de diamètre calibré de quelques micromètres, non déformables et transparentes, de matériau non fluorescent. La compression du « gel » de l'échantillon s'effectue jusqu'à ce que les surfaces de compression entrent en contact avec les billes non déformables. Dans chaque cas, il faut prévoir des zones d'expansion du gel.
Il est à noter que la référence 11 et la métallisation 7 présentent une surface commune qui sert de surface référence. Ainsi donc, on utilisera de préférence comme surface de référence la surface se situant dans le prolongement du dépôt métallisé 7 constituant la surface lisible du CD. Dans le cas d'un DVD, il s'agit d'une surface accessible, parallèle au prolongement de la métallisation de lecture.
La métallisation comporte en outre classiquement l'inscription de tous les signaux de guidage-synchronisation du CD/DVD 1, ainsi que d'éventuelles données utilisables dans le cadre de l'invention, telles que décrites ci-après. 6.2 Système d'imagerie par fluorescence des lames
La figure 3 représente schématiquement le disque 1 décrit précédemment, lorsqu'il est inséré dans un lecteur CD/DVD modifié conformément à l'invention. Le disque 1 peut être mis en rotation autour d'un axe A par un moteur du lecteur CD/DVD, à vitesse constante ou variable. Le lecteur CD/DVD modifié selon l'invention comprend une première tête de lecture 20 et une deuxième tête de mesure de la fluorescence 30 qui sont logées dans un bâti 43 fixe situé au-dessus du disque 1, et qui sont solidaires. Les deux têtes 20, 30 peuvent se déplacer radialement (direction référencée « X » sur la figure 3) et verticalement (direction référencée « Z » sur la figure 2) par rapport au disque 1.
La tête de lecture 20 comprend, de manière classique, une diode laser apte à émettre un faisceau lumineux, une optique comprenant au moins un miroir ou lentille de focalisation du faisceau lumineux émis sur la zone de données 3 du disque 1, et une diode photoélectrique apte à détecter le signal réfléchi par la surface de la zone de données 3 en réponse à l'excitation lumineuse. Les signaux détectés par la diode photoélectrique peuvent être traités par des moyens de traitement, référencés « μP » sur la figure 4.
Le faisceau lumineux 9 issu de la tête de lecture 20 du disque 1 et le faisceau lumineux 10 issu de la tête de mesure de la fluorescence 30 (pour l'analyse des lames) sont représentés sur la figure 2. Le signal de fluorescence émis par l'échantillon biologique en réponse à l'excitation lumineuse 10 et le signal réfléchi par la surface de la zone de données 3 n'ont en revanche pas été représentés.
La surface des échantillons biologiques des lames 5 est balayée point par point par le faisceau lumineux 10 issu de la tête de mesure de la fluorescence 30 par entraînement en rotation du disque 1 et par translation des deux têtes 20, 30.
Les deux têtes 20, 30 étant solidaires, elles sont donc guidées simultanément en translation sur des moyens de guidage 40 du bâti 43, par un système classique d'entraînement, commandé par le lecteur CD/DVD, comprenant un pignon 41 et une roue dentée 42. Plus précisément, la tête de mesure de la fluorescence 30 comprend une source d'excitation lumineuse, qui peut être une diode laser ou une diode électroluminescente LED par exemple, émettant un faisceau lumineux 10 de la fraction de milliwatts (mW) à quelques milliwatts de puissance (de préférence ajustable selon la vitesse de rotation du disque 1) à une longueur d'onde correspondant à l'excitation des fluorophores utilisés typiquement (dans ce cas de l'ordre de 488 nm).
La tête de mesure de la fluorescence 30 comprend en outre une optique comprenant au moins une lentille de focalisation (référencé 15 sur la figure 4) du faisceau lumineux émis et des moyens de détection de la fluorescence émise par les lames 5 (référencée 32 sur la figure 4), dans une bande étroite de longueurs d'onde, en réponse à l'excitation lumineuse 10. Ces moyens de détection peuvent comprendre un ou plusieurs capteurs (de type photomultiplicateur, photodiode, CDD ou CMOS) capables de générer un signal électrique fonction de la quantité de fluorescence détectée. Les signaux générés lors du balayage des échantillons biologiques disposés sur les lames 5 par la tête de mesure de la fluorescence 30 peuvent être traités par des moyens de traitement (référencés « μP » sur la figure 4) pour obtenir une image de la surface des échantillons, et détecter la présence éventuelle de bactéries dans ces échantillons.
La taille (ou diamètre) de la tache (ou « spot » en anglais) du faisceau lumineux 10 sur la surface des échantillons biologiques est de préférence contrôlée pour assurer la résolution souhaitée de la zone à balayer. L'intensité du faisceau lumineux 10 peut être ajustée en fonction de la réponse à l'excitation, pour augmenter le rapport signal/bruit. Un compromis est également nécessaire entre la longueur d'onde, la surface de la tache et la profondeur de champ.
Il est en outre important, pour que l'image obtenue soit nette, que la surface des échantillons biologiques soit constamment dans le plan focal de la tête de mesure de la fluorescence 30.
Le système de l'invention prend donc en compte les variations prévisibles de hauteur (selon la direction Z) entre le point de focalisation 21 de la tête de lecture 20 sur la zone 3 d'enregistrement de données du disque 1 et le point de focalisation 31 de la tête de mesure de la fluorescence 30 sur la surface des échantillons biologiques, comme représenté sur la figure 2. Du fait de la rigidité du matériau (polycarbonate dans cet exemple) du disque 1 , les irrégularités de la surface Sl du disque 1, qui peuvent êtres dues à une courbure du disque 1, sont supposées identiques, ou du moins prévisibles, sur tout le rayon du disque 1, à partir d'une mesure prise à l'endroit de la tête de lecture 20.
On pourra, dans certains cas, appliquer une commande d'autofocus (appelé complément d'autofocus) à la tête de mesure de la fluorescence 30 pour compenser ces irrégularités. Cette commande peut être effectuée en asservissant au moyen de cales piézoélectriques la position de la fibre véhiculant la puissance lumineuse d'excitation selon la direction Z. Un ajustement statique de la position de la fibre véhiculant la puissance lumineuse d'excitation selon les directions X et/ou Y peut également être effectué. Ce complément d'autofocus peut être réalisé de manière confocale sur la fibre d'excitation.
Selon l'invention, la correction d'autofocus calculée par la tête de lecture 20 du disque 1 pour compenser les irrégularités de la surface Sl sert également à compenser les mêmes irrégularités pour la lecture de la fluorescence. Les signaux d'autofocus de la tête de lecture 20 sont donc dirigés tels quels (flèche 60 de la figure 2) vers la tête de mesure de la fluorescence 30, si bien que la profondeur de champ de la tête de mesure de la fluorescence 30 n'a pas à être contrôlée.
En d'autres termes, les défauts de planéité de la surface supérieure Sl du disque 1 sont compensés en dupliquant les signaux de commande d'autofocus (signaux de focalisation) de la tête de lecture 20 sur la tête de mesure de la fluorescence 30, après les avoir éventuellement amplifiés.
En complément des signaux d'asservissement de focalisation 60 (selon l'axe focal), les signaux d'asservissement latéral de la tête de lecture 20 sont dupliqués (flèche 60) vers la tête de mesure de la fluorescence 30, pour assurer également un pointage latéral identique des deux optiques (on parlera par la suite de premier étage d'autofocus). Le mouvement des deux têtes 20, 30 étant réalisé en pas-à-pas, la linéarisation du mouvement des têtes 20, 30 est obtenu par contrôle radial des lentilles de focalisation respectives des têtes de lecture 20 et de mesure 30.
Dans un mode préférentiel de réalisation, pour que la duplication de signaux soit efficace en termes de focalisation, la zone de données 3 et la zone de support d'échantillons 4 sont référencées par rapport à la surface inférieure S2 du disque 1 qui est supposée plane ou qui présente des variations de hauteur de faible fréquence spatiale.
6.3 Tête de mesure de la fluorescence
La figure 4 illustre, de manière schématique, un mode de réalisation de la tête de mesure de la fluorescence 30. Le faisceau lumineux 10 émis par la source laser 16 de la tête de mesure de la fluorescence 30 peut être acheminé par une fibre optique Fb jusqu'à une lentille de focalisation 15 qui permet de concentrer le faisceau lumineux 10 sous la forme d'un « spot » 31 sur la surface de l'échantillon biologique (non représenté) disposé sur la lame 5. La fluorescence 32 émise par l'échantillon biologique en réponse à l'excitation lumineuse 10 peut être recueillie via cette même lentille 15, par un jeu de fibres optiques Fa, et acheminée ensuite vers un système comprenant un ou plusieurs filtres 17 et un détecteur 18 de type photomultiplicateur (PMT) par exemple. Un tel photomultiplicateur est capable de générer des signaux électriques fonction de la quantité de fluorescence 30 détectée. Ces signaux peuvent être traités par des moyens de traitement μP pour obtenir une image 2D et/ou 3D de la surface de l'échantillon de la lame 5, et détecter la présence éventuelle de bactéries dans cet échantillon. La figure 5 est une vue de dessous, en perspective, de la tête de mesure de la fluorescence 30 selon un mode particulier de réalisation. On distingue sur cette figure la plaque support 100 d'origine d'une tête de lecture laser sur laquelle est montée la lentille de focalisation 15. Un câble Fa+Fb comprenant les fibres optiques Fa et Fb est monté de manière amovible sur cette plaque support 100. La figure 6 représente cette même tête de mesure de la fluorescence 30 en vue de dessus. Le câble de fibres optiques Fa+Fb est maintenue sur la plaque support 100 par plusieurs éléments de fixation 112 tels que des vis, le maintien en position du câble étant assuré par quatre éléments de centrage 1 10 et un joint d'élasticité 111. Selon le cas, un complément d'autofocus (que l'on appellera également deuxième étage d'autofocus) pourra être appliqué à la tête de tête de mesure de la fluorescence 30. Ce complément peut être effectué en asservissant au moyen de cales piézoélectriques, disposées dans des logements 120, la position de la fibre véhiculant la puissance lumineuse d'excitation selon la direction Z. Un ajustement statique de la position de la fibre véhiculant la puissance lumineuse d'excitation selon les directions X et/ou Y peut également être effectué. 6.4 Actuateurs de focalisation
Comme souligné précédemment, les signaux d'autofocus en X, Y et Z de la tête de lecture 20 sont dupliqués (flèche 60) vers la tête de mesure de la fluorescence 30. Ces signaux d'autofocus sont appliqués aux actuateurs de focalisation classiques (non représentés) de la tête de mesure de la fluorescence 30, qui comprennent au moins la lentille de focalisation 15, et qui permettent le déplacement de la tête de mesure de la fluorescence 30 selon les directions X, Y et/ou Z. Par ailleurs, la couche de métallisation 7 déposée sur la zone 3 d'enregistrement de données du disque 1 peut constituer une surface de référence, ainsi que de suivi de la « spirale » des informations, pour l'asservissement de l'optique de focalisation. Ceci est réalisé avec une simple lecture continue de CD (pas de saut de plage, quel que soit le type d'informations).
Des informations de référencement peuvent être gravées sur la zone 3 du disque 1, pour identifier le jeu de lames qui y est attaché.
Des informations caractérisant l'analyse des lames disposées sur le disque peuvent également être gravées sur la zone 3. On pourra ainsi stocker sur le disque la date et l'heure de l'analyse, le résultat de l'analyse (positif lorsque des bactéries sont détectées ou négatif dans le cas contraire), etc. De même, il est envisagé de pré-caractériser les disques dans des conditions de laboratoire (pas de désaxement dans ces conditions), lors de la fabrication du disque par exemple, et de stocker dans la zone de données 3 des informations représentatives de certains types de défauts non évolutifs (variation d'épaisseur du disque optique par exemple). Cette phase de pré-caractérisation du disque, par exemple son épaisseur optique au niveau de la tête de lecture de fluorescence, peut être effectuée par interférométrie de type Fizeau. Ces informations sont lues par la tête de lecture 20 et transmises vers la tête de mesure de la fluorescence 30. Elles peuvent alors servir à renseigner le premier étage d'autofocus et/ou le système de complément d'autofocus (deuxième étage d'autofocus) de la tête de mesure de la fluorescence 30, qui compare le signal de focalisation réellement appliqué à la tête de lecture avec celui stocké, et en déduit et compense la présence d'éventuels défauts de positionnement du disque 1. Cette compensation peut s'effectuer par modification du signal de focalisation (premier étage d'autofocus), et/ou par exemple au moyen des cales piézo-électriques mentionnées auparavant (deuxième étage d'autofocus). 6.5 Variantes
Ainsi donc, dans l'application décrite ci-dessus à titre d'exemple, le système de l'invention permet de détecter et de dénombrer les micro -organismes dans des échantillons biologiques dans des délais courts, de l'ordre de 3 ou 4 heures par exemple, et d'en tirer une information sur la contamination d'une carcasse animale. Le système de l'invention peut être utilisé pour balayer un échantillon en profondeur (selon Z) et ainsi obtenir une image en 3D de l'échantillon. Un tel balayage nécéessite toutefois de moduler le signal de focalisation et/ou d'utiliser des vitesses de rotation du disque plus lentes et/ou d'effectuer plusieurs passages successifs en confocal, en faisant varier la focalisation du faisceau lumineux.
Un tel système pourra être mis en œuvre en parallèle d'un système automatique de prélèvement d'échantillons biologiques par impaction, de marquage des échantillons par fluorescence et d'archivages des lames support d'échantillon. Un tel système peut être utilisé par les industriels et les organismes de contrôle des risques alimentaires, et constitue une alternative aux méthodes de contrôle basées sur la sérologie des animaux ou bactériologiques.
L'industriel ou l'organisme de contrôle utilisant le système de l'invention dispose ainsi d'un outil permettant de conditionner la viande, ou tout autre produit alimentaire, en fonction de l'information représentative de la contamination obtenue, sans ralentir le processus d'abattage ou de transformation.
Le principe de l'invention réduit en outre de façon importante le coût de fabrication des dispositifs d'imagerie par fluorescence, tels que ceux utilisés pour l'analyse d'échantillons biologiques. Le système de l'invention peut également permettre l'imagerie de puces d'échantillons biologiques (« biochips » en anglais) même si la lecture de telles puces ne nécessite pas une résolution aussi élevée que pour des lames.
L'invention peut être mise en œuvre pour l'analyse biologique de produits industriels et de consommation (périssables et non-périssables), en particulier dans le domaine de la santé humaine et animale.
L'invention peut trouver des applications dans de nombreux domaines tels que, par exemple, l'agro-alimentaire (filière avicole, porcine, etc), la cosmétique, la pharmaceutique, l'environnement, la chimie des polymères (analyse des plastiques), le contrôle de surface des matériaux, etc. Plus généralement, l'invention peut également être mis en œuvre pour l'analyse de tout échantillon plan, en éclairage direct et imagerie par réflexion- diffusion.
Dans le mode de réalisation décrit ci-dessus, l'angle d'incidence des faisceaux lumineux issus des têtes de lecture et de mesure de la fluorescence est nul. Il est toutefois envisageable de mettre en œuvre des têtes de lecture et de mesure avec un angle d'incidence non nul. Cependant, dans le cas de la fluorescence, il faut que la collecte soit suffisante, ce qui limite à des angles assez faibles ; dans le cas d'une détection confocale, le flux risque de décroître avec l'angle ; - il convient en outre de respecter la géométrie optique de la tête de lecture originale.
Il est également envisageable d'utiliser comme support rotatif des lames d'autres types de disque optique, comme par exemple un disque Blu-Ray (marque déposée). On envisage également l'utilisation d'autres formes de lames nécessitant des formes de cavités correspondantes dans le disque et d'autres supports biologiques que des lames. On pourra ainsi utiliser des films (en réflexion ou en fluorescence par exemple), à condition que ces films soient suffisamment solides pour ne pas être déformés par la force centrifuge due au mouvement en rotation du disque. L'utilisation de films peut nécessiter dans certains cas d'adapter la vitesse de rotation du disque et peut limiter le type d'échantillon à analyser.
Le système de balayage et d'autofocus de l'invention n'est pas dépendant du mode de lecture de l'échantillon. Ainsi, la lecture de l'échantillon peut être effectuée par tout type de source lumineuse d'excitation ou d'éclairage : éclairage incohérent (pas d' analyse par fluorescence possible dans ce cas, et préférentiellement en confocal ou en rétro-diffusion), confocal (en réflexion comme en fluorescence), par transmission (ceci nécessite par exemple un collecteur mobile de l'autre côté du disque qui suit le mouvement transverse des têtes 20 et 30), par réflexion, etc. On envisage en outre d'utiliser différents types de fibres optiques (fibres multicoeurs, fibres à trous, etc) et d'autres moyens de collecte que des fibres optiques selon les applications envisagées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Système d'imagerie par balayage d'une surface d'au moins un échantillon comprenant : un support apte à être entraîné en rotation autour d'un axe, comprenant : - une zone de stockage de données ; et au moins un logement de réception d'un échantillon ; un dispositif de lecture comprenant— une première tête de lecture des données stockées dans ladite zone de stockage, comprenant des premiers moyens d'ajustement d'un premier faisceau lumineux, caractérisé en ce que ledit dispositif de lecture comprend en outre : une deuxième tête de détection/mesure de la lumière émise par l'échantillon sous l'action d'un deuxième faisceau lumineux d'excitation, et des deuxièmes moyens d'ajustement du deuxième faisceau lumineux d'excitation, pilotés par un signal de contrôle des premiers moyens d'ajustement du premier faisceau lumineux de la première tête de lecture.
2. Système selon la revendication 1 , caractérisé en ce que : la première tête de lecture comprend : des moyens de génération du premier faisceau lumineux de lecture, - des premiers moyens optiques déterminant un premier point de focalisation dudit premier faisceau lumineux de lecture, et des premiers moyens d'ajustement du premier point de focalisation ; et la deuxième tête de détection/mesure comprend : - des moyens de génération du deuxième faisceau lumineux d'excitation dudit échantillon ; des seconds moyens optiques déterminant un second point de focalisation dudit deuxième faisceau lumineux d'excitation ; des moyens de détection de la lumière émise par l'échantillon en réponse à l'excitation lumineuse, des moyens de conversion de la lumière détectée en signaux électriques représentatifs d'une image de la surface dudit au moins un échantillon ; et des seconds moyens d'ajustement du second point de focalisation.
3. Système selon la revendication 2, caractérisé en ce que les premiers et seconds moyens d'ajustement permettent d'ajuster la position du premier et du second point de focalisation respectivement selon l'axe focal des premiers et des seconds moyens optiques respectivement.
4. Système selon la revendication 3, caractérisé en ce que les premiers et seconds moyens d'ajustement permettent en outre d'ajuster la position du premier et du second point de focalisation respectivement dans une direction sensiblement perpendiculaire à l'axe focal des premiers et des seconds moyens optiques respectivement.
5. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la première tête de lecture et la deuxième tête de mesure sont montés sur un support commun mobile en translation suivant une direction sensiblement perpendiculaire à l'axe de rotation dudit support lorsque le support est entraîné en rotation.
6. Système selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'un film d'épaisseur calibrée est disposé sur la surface supérieure du support de façon à écraser l'échantillon dans le logement à une épaisseur connue-par rapport à la surface inférieure du support.
7. Système selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la deuxième tête de détection/mesure est apte à détecter/mesurer la fluorescence émise par au moins un échantillon marqué par une préparation fluorescente en réponse à un faisceau lumineux d'excitation.
8. Système selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le signal de contrôle des premiers moyens d'ajustement du premier faisceau lumineux de la première tête de lecture tient compte d'au moins une information représentative d'au moins un type de défaut du support, tels que des variations d'épaisseur, mémorisées dans la zone de stockage du support.
9. Support apte à être entraîné en rotation autour d'un axe pour être lu par un système d'imagerie par balayage selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant : une zone de stockage de données ; et au moins un logement de réception d'un échantillon, caractérisé en ce que les données stockées dans la zone correspondante comprennent des données caractérisant l'échantillon.
10. Support selon la revendication 9, caractérisé en ce que les données stockées dans la zone de stockage de données comprennent des informations représentatives d'au moins un type de défauts du support, tels que des variations d'épaisseur.
11. Support selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que ledit au moins un logement comprend au moins un orifice d'expansion.
12. Dispositif de lecture d'un support selon l'une des revendications 9 à 11 mis en œuvre dans un système selon l'une des revendications 1 à 8.
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