EP2334784A1 - Verwendung hsa-produzierender zellen - Google Patents

Verwendung hsa-produzierender zellen

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Publication number
EP2334784A1
EP2334784A1 EP09812708A EP09812708A EP2334784A1 EP 2334784 A1 EP2334784 A1 EP 2334784A1 EP 09812708 A EP09812708 A EP 09812708A EP 09812708 A EP09812708 A EP 09812708A EP 2334784 A1 EP2334784 A1 EP 2334784A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
cell
albumin
hsa
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09812708A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Lore Florin
Rebecca Bischoff
Jürgen FIEDER
Hitto Kaufmann
Thomas Krieg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc filed Critical Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority to EP09812708A priority Critical patent/EP2334784A1/de
Publication of EP2334784A1 publication Critical patent/EP2334784A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to the field of cell culture technology and relates to methods for propagating / cloning cells, preferably cell lines, that are of importance for the production of biopharmaceuticals. Furthermore, the invention relates to methods for the production of proteins using cells that have been obtained and propagated by means of single cell deposition and compositions that allow an increase of single cells.
  • biopharmaceuticals For the biotechnological production of biologically active or therapeutic proteins in mammalian cells, so-called “biopharmaceuticals”, the corresponding
  • Mammalian cells are stably transfected with DNA specific for the respective biologically active Protein (or its subunits) encoded. After the transfection process, one usually obtains a pool of millions of different transfected cells. Therefore, the crucial step in the production of efficient production cell lines is the selection and propagation of cell clones, which on the one hand grow very stably and, on the other hand, show a high specific productivity of therapeutic protein (product formation, etc.). With millions of different product-expressing cells, it is crucial to be able to analyze a large number of cells individually using high throughput and automation in order to sort out suitable candidates (single-cell clones) that can grow both robustly and deliver high product titers. This process of single cell isolation and subculturing is also referred to as - cloning or recloning.
  • genotypic and phenotypic homogeneity i. monoclonal cell culture. This is achieved by recloning techniques such as Jimited dilution or by automated single cell deposition using fluorescence activated cell sorting (FACS).
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the use of serum-free or chemically defined media in the recloning step results in limited recloning efficiency, i. only a fair percentage of the deposited cells survive and grow to a monoclonal cell line.
  • the cell suspension is serially diluted and the cells are then placed in a microtiter plate at different cell counts per well In high cell count wells, sufficient or no cells will survive, due to sufficient secretion of autocrine growth factors. the fewer cells survive, so that in this way the dilution can be adjusted so that statistically only one single cell per well survives and grows into a monoclonal line
  • These single cell clones are detected by visual and / or imaging techniques and the cell clones are further cultured into larger culture vessels ,
  • FACS technology In the FACS technology, a flow cytometer is used to generate single-cell clones. For this purpose, the cells are brought into a laminar flow and individually deflected into the wells of the microtiter plates. This ensures that the surviving colonies are indeed individual clones. Therefore, FACS technology is the preferred method over limited dilution.
  • a particularly disadvantageous effect of low recloning efficiency is when the subsequent analysis of the individual cell clones is to take place via an automated system:
  • An analysis robot can not usually differentiate between wells with living or dead cells and automatically measures all wells of the microtiter plate. With a recloning efficiency of only 10%, this means that in 90% of cases, the robot analyzes an empty well - and uses the same amount of reagents as it does for the analysis of a living cell clone. In the case study 90% of the time as well as 90% of the material costs are wasted without data gain.
  • serum e.g., fetal calf serum, FCS
  • FCS fetal calf serum
  • Another approach is to carry out a "limited dilution" for recloning, since this method only statistically leads to the formation of single cell clones, but it is also possible for several clones to grow up in one well, a multiple (usually 2-3-fold) repetition of this Necessary to ensure that the cell line obtained is truly a single clone Repeated cycles create a great deal of work and time, which adversely affects the required costs and timelines.
  • recombinant proteins are added to the recloning medium, which promote the survival and growth of individually deposited cells.
  • recombinant proteins are insulin, insulin-like growth factor (IGF), epithelial growth factor (EGF) or human serum albumin (HSA). These additives are obtained as purified proteins or protein solutions and added to the medium. Disadvantages of this method can be seen in the costs, the dependence on the availability of the recombinant proteins and their instability. Their disadvantages include: - storage at -70 0 C required
  • the object of the present invention is to increase the recloning efficiency in serum-free FACS-based cloning of production cells.
  • HSA-producing cells are used as feeder cells.
  • the feeder cells produce in the multi-well
  • HSA-producing cells as host cells for the production of biopharmaceuticals.
  • the cells are thereby enabled to promote their growth by secretion of HSA autologous even in the absence of feeder cells and recombinant additives.
  • the highest recloning efficiency can preferably be achieved via a combination of these approaches, ie by using HSA-producing host cells and HSA-conditioned medium.
  • additional feeder cells can be used.
  • HSA-producing cells as host or feeder cells or media conditioners, the recloning efficiency and thereby the quantity of clones obtained can be significantly increased. This effect was observed even at concentrations below 200 mg / L HSA, even ⁇ 100 mg / L in the cloning medium.
  • the efficacy / efficiency of secreted HSA on the recloning efficiency is therefore significantly higher than that of recombinant HSA, which is usually added in concentrations of 400 mg / L to> 2 g / L.
  • Feeder cells in different media He also shows in different cell lines / cell types such as hamster and mouse cells, but also human and various other cell systems.
  • HSA-producing cells both naturally HSA-producing cells (such as human liver cell lines) and genetically-altered cells of other species can be used.
  • transgenic HSA-producing production cell lines such as CHO, BHK, NSO, Sp2 / 0 or Per.C6 cells.
  • a particularly preferred embodiment is HSA-producing CHO cells.
  • the increased recloning efficiency forms the basis for the use of highly efficient automated cloning screening methods (screening robots).
  • screening robots In such systems, there is usually no selection of individual wells in the microtiter plate, but all are equally measured, regardless of whether they contain a living cell population or not.
  • a recloning efficiency of only 10% means that 90% of the wells are empty and therefore can not provide usable data, but are still analyzed. In terms of cost-effectiveness, this means that in 90% of cases time and money are spent in the form of reagents without data gain. Therefore, the efficiency of high throughput automation systems for early clone selection increases proportionally with the number of clones obtained after single cell deposition.
  • a further advantage of the method described is that the addition of HSA-producing cells as host cells and / or medium conditioner enhances the efficiency of recloning to the extent that feeder cells can be dispensed with. This reduces on the one hand the expense in the production and preculture of the feeder cells and at the same time increases the reproducibility of single cell cloning. Furthermore, it allows the use of technologies for the visual detection of the Kirdzelliere as a tool for clone analysis. Since the amount of product in the culture medium correlates linearly with the number of producing cells, technological development is concerned with detecting both the amount of product and the number of cells in order to determine the highest-producing cell clones, ie the cell clones with the highest specific productivity.
  • feeder cells are difficult to differentiate visually from the growing production cells, they are also included in the visual cell count determination, which leads to an inaccurate calculation of the total cell count and thus to the inaccurate determination of the important parameter of specific productivity.
  • a method without feeder cell is therefore advantageous and represents a preferred embodiment.
  • the process further increases the cost-effectiveness of this process step and also enables the use of automated cloning analysis technologies in high-throughput.
  • HSA-producing CHO cells are described in the literature, neither the use of HSA-producing cells as host cells for the production of any protein other than HSA, nor their use as feeder cells or as media conditioners to increase recloning efficiency.
  • FIGURE 1 APPLICATIONS OF THE INVENTION Schematic representation of the possible embodiments of HSA-producing cells: (1) for the preparation of conditioned medium
  • HSA-producing cells as host cells for biopharmaceutical production, i. the cell producing the protein of interest also secretes HSA, thereby promoting its own growth during recloning.
  • FIGURE 2 PREPARATION OF CONDITIONED MEDIUM OF HSA-PRODUCING CELLS TO INCREASE RECONCILIATION EFFICIENCY
  • FIGURE 3 INCREASE OF RECONCILIATION EFFICIENCY BY USING HSA-CONDITIONED MEDIUM
  • FIGURE 4 INCREASE OF RECONERATIVE EFFICIENCY BY HSA-PRODUCING FEEDER CELLS A single cell from a cell population is individually deposited on either autologous CHO-DG44 feeder cells or transgenic HSA-producing feeder cells. The recloning efficiency using DG44 cells was set to 1 (black bar). The gray bar represents the relative increase in recloning efficiency when using HSA-producing feeder cells. The bars show averages of 3 evaluated 96-well plates per condition.
  • FIGURE 5 COMBINATION OF HSA PRODUCING FEEDER AND
  • FIGURE 6 CONCENTRATION-DEPENDENT INCREASE OF RECONCILIATION EFFICIENCY BY ADDITION OF RECOMBINANT HSA
  • the graph shows the efficiency of recloning with the addition of recombinant HSA at said concentrations. Maximum efficiency was achieved in this experiment with the addition of 1000 mg / L recombinant HSA to the recloning medium; this value was set 100% and the measured efficiencies of the other approaches were plotted relative thereto.
  • insulin refers to a growth factor secreted by pancreatic beta cells Insulin is known to those skilled In the art of cell culture, human zinc insulin or recombinant insulin is widely used routine experiments such as a commercially available insulin-specific ELISA.
  • insulin-free means that the culture medium contains no insulin, in particular no recombinant insulin and no insulin is added to it.
  • Albumin is the most abundant protein in plasma. It is produced in the liver and contributes to the maintenance of osmotic pressure in the blood. Albumin binds to nutrients and metabolites and thus supports their transport.
  • albumin in the present invention means a
  • Polypeptide component having the biological activity of albumin having the biological activity of albumin.
  • albumin refers to any animal albumin, particularly a mammalian albumin, such as human, bovine, equine, murine, rat and porcine albumin and albumin from birds such as, in particular, chicken, etc.
  • the albumin is human serum albumin (HSA).
  • HSA human albumin
  • albumin also refers to human albumin as well as to albumin from other species
  • secreted HSA which is delivered directly from live HSA-producing cells, ie, without purification or separation, into the recloning medium
  • albumin or HSA is not added as a purified protein from the outside.
  • Recombinant HSA The production of recombinant HSA is well known in the art and may e.g. with the help of genetically modified yeasts (U.S.Patent No. 5,612,197).
  • Recombinant HSA can be obtained commercially from various suppliers, for example via Sigma-Aldrich (Recombinant HSA, Cat. No. A-7223). It is purified protein that can be added to the culture medium.
  • significantly lower concentration in the present invention means: at least two times lower concentration compared to recombinant or purified albumin,
  • a concentration at least fivefold lower than that of recombinant or purified albumin an albumin concentration which is at least 2 times lower than that of a comparable culture mixture containing recombinant or purified albumin,
  • an albumin concentration which is at least 5 times lower than that of a comparable culture mixture containing recombinant or purified
  • an albumin concentration which is lower by a factor of 2 to 100, 2 to 5, 5 to 100, 20 to 100, 5 to 10 than that of a comparable culture mixture containing recombinant or purified albumin, an albumin concentration below 200 mg / L , preferably below 100 mg / L, particularly preferably below 60 mg / L.
  • the secreted HSA is delivered by HSA-producing cells of a live culture directly into the recloning medium. It can be derived from three sources: (a) HSA-producing cells of a preculture used for the production of conditioned medium, (b) HSA-producing feeder cells, or (3) HSA-secreting host cells (if the individually deposited producer cells). Cells have been genetically engineered to secrete HSA themselves).
  • the concentration of HSA can be determined by routine methods such as a commercially available ELISA (e.g., "Human Albumin ELISA Quantitation Kit", Bethyl Laboratories, Montgomery, TX).
  • ELISA e.g., "Human Albumin ELISA Quantitation Kit", Bethyl Laboratories, Montgomery, TX.
  • albumin or HSA transgenic cell refers to any cell that delivers an albumin into the medium can either be a cell that naturally secretes albumin (eg, a liver cell) or a cell that is genetically, for example, via introduction of a Albumin or HSA expression construct has been altered so that it expresses albumin or HSA and releases into the medium.
  • a preferred embodiment in the present invention represent albumin or HSA-producing mammalian cells, particularly preferred are albumin or HSA-producing rodent cells, in particular albumin or HSA-producing CHO or NSO cells.
  • the "specific productivity" of a cell indicates the amount of a particular protein that is produced by a cell per unit of time, ie released into the medium in the case of secreted proteins.
  • cloning / recloning in the context of cell culture means a technique by means of which one can obtain a cell population of identical cells from a cell of origin.
  • cell cloning or “single cell cloning” thus means a method in which individual cells are identified from a cell pool with cells of different genotype, isolated and then propagated to a cell population consisting of a multiplicity of genetically identical cells.
  • the process is a "direct single-cell cloning." If several cells are simultaneously placed in a culture vessel This is described as a method of "indirect cloning", deposited, expanded into a cell population and divided by repeated dilution into cell populations of identical cells.
  • Single clones or “single cell clones” or “clones” for short are genetically identical cells derived from one (1) single cell, and a cell population consisting of identical cells of the same lineage is therefore also referred to as a "monoclonal cell population". If, during the cultivation of cells of the same origin, spontaneous genome changes occur, for example mutations and / or translocations, the individual cells of this cell population are nevertheless regarded as identical cells in the sense of the present invention, and the culture is understood as a monoclonal cell population.
  • a pool of stably transfected cells is not a cell clone of the same lineage, ie not a monoclonal cell population, even if genetically identical starting cells are transfected with an identical nucleic acid.
  • subclones / subcultures refers to different generations of cells originating from a cell of origin / culture by single or multiple passaging of the dividing cells, for example, “subclones / subcultures” when identical cells / cell cultures are cultured over several generations and be propagated.
  • cloning efficiency or “recloning efficiency” is defined as the percentage of cells that survive, divide, and form vital cell populations after storage. If, for example, 100 cells are distributed to 100 culture vessels in a cell sorting and 25 of these 100 individually deposited cells grow to cultures, the cloning efficiency is 25%.
  • effective or efficient recloning is meant a cloning efficiency of at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30% and even more preferably at least 40%.
  • effective recloning means cloning with an efficiency of at least 50%, preferably of at least 60%, more preferably of at least 70% and even more preferably of at least 80%.
  • visional / expandable in the sense of the present invention describes the potential of a cell / cell population to divide endlessly, but at least over 2, preferably 4. This potential can be determined, for example, by irradiation with [137I Cs or mitomycin C Treatment be reduced or completely disturbed.
  • derivative / progeny refers to cells that are genetically derived from a particular source cell, such as subcultivation (with or without selection pressure), and / or generated by genetic manipulation, and re-isolations of cells of the same cell type from the term "derivative / derivative".
  • source cell such as subcultivation (with or without selection pressure)
  • re-isolations of cells of the same cell type from the term "derivative / derivative”.
  • all CHO cell lines are derivatives / derivatives of the hamster ovary cells isolated from C ⁇ cetulus griseus by Puck et al., 1958, regardless of whether they were obtained by subculturing, re-isolation or genetic manipulations.
  • feed feeding and refers to a co-cultivation with mostly divisive cells, which serve to provide the cells of the culture actually desired with nutrients and sekret mandat growth factors.
  • living cells are arrested by irradiation with UV or gamma rays or treatment with mitomycin C in growth. The resulting feeder cells live and produce and secrete growth factors but are unable to divide.
  • autologous feeder cell means that both feeder cells and the cell to be cultivated in the presence of these feeder cells originate taxonomically from the same origin
  • a hamster cell subfamily Cricetinae
  • a cell of the genus Cricetulus or Mesocricetus for example, a CHO or BHK cell, so each isolated from this subfamily feec / er cell an autologous feec / er cell Cell to these hamster cells of the subfamily Cricetinae.
  • the term "autologous feeder cell” means that both feec / er cell and the cell to be cultivated are taxonomically derived from the same genus or were originally isolated from the same genus (Cell from Cricetulus or Mesocricetus). If the cell to be cultivated is, for example, a hamster cell of the genus Cricetulus or Mesocricetus, preferably a CHO or a BHK cell, then each of the genus originally isolated fever cell produces an autologous yeast Cell in the sense of this invention.
  • an "autologous fever cell” is present, provided that the feeder cell and the cell to be cultivated originate from the same species, for example Cricetulus griseus or Mesocricetus auratus ..
  • a fever cell is an autologous feeder cell when both the yeast cell and the cell to be cultured are from the same basic cell, for example, when both cells are originally around CHO-DG44 cells or derivatives of this cell is.
  • the fever cell gives the same resistance, eg to antibiotics, as the cell to be cultivated. This is particularly advantageous if the cell deposition in the presence of a selection agent, such as an antibiotic, takes place.
  • a selection agent such as an antibiotic
  • One aspect of the present invention specifically describes the use of HSA-producing feeder cells to increase recloning efficiency.
  • autologous HSA-producing feeder cells are used.
  • limited dilution refers to an alternative method of recloning, in which a cell suspension is serially diluted and the cells are subsequently deposited in a microtiter plate with different cell counts per well In wells with high cell numbers, several or all cells will survive due to sufficient secretion of autocrine growth factors.
  • conditioned medium is understood to mean medium from a culture of living cells. The effect of the conditioned medium is based on its content of growth factors that have been seriated by the cells of the preculture into the medium and thereby “conditioned” it. Accordingly, the term “medium conditioning cells” or “medium conditioners” refers to cells used to produce conditioned medium.
  • HSA-producing cells as medium conditioners such that the conditioned medium thus obtained contains, inter alia, the HSA secreted by these cells.
  • serum refers to the cell-free constituent of the blood Serum contains an undefined mixture of different soluble proteins and growth factors that support the survival and proliferation of cells
  • FCS fetal calf serum
  • FBS bovine serum
  • concentration ranges are 10-20% FCS or FBS as an addition to the culture medium.
  • serum-free means culture media as well as culturing conditions, characterized in that cells are cultured in the absence of animal and / or human serum, preferably in the absence of any proteins isolated from serum, preferably in the absence of non-recombinantly derived proteins
  • cells adapted to serum-free conditions refers to those cells that can be propagated in the absence of animal or human serum or serum proteins.
  • protein-free means that the culture medium contains no animal proteins, with proteins isolated from bacteria, yeasts or fungi not being understood as animal proteins.
  • chemically defined describes a cell culture medium which is serum-free, preferably also protein-free, and which consists of chemically defined substances Chemically defined media thus consist of a mixture of predominantly pure individual substances
  • An example of a chemically defined medium is, for example, the CD CHO medium from Invitrogen (Carlsbad, CA, US).
  • serum-cultured cell refers to cells that are adapted to growth in liquid cultures ("suspension cultures”) and whose ability to adhere to vascular surfaces, such as cell culture dishes / bottles, has been reduced or lost.
  • Cells showing both serum-free growth and growth in suspension are adapted as "serum-free medium-adapted and non-adherent cells.” If these cells are used to produce fever cells, these cells are by definition "adapted to serum-free medium and not adhering to fever. cells.
  • protein / product of interest refers to biopharmaceutically significant proteins / polypeptides, including e.g. Antibodies, enzymes, cytokines, lymphokines, adhesion molecules, receptors and their derivatives or fragments.
  • a protein / product of interest is not limited to these examples. In general, all polypeptides that act as agonists or antagonists and / or find therapeutic or diagnostic use are important.
  • Other proteins of interest are, for example, proteins / polypeptides which are used to alter the properties of host cells in the context of so-called "cell engineering", such as anti-apoptotic proteins, chaperones, metabolic enzymes, glycosylation enzymes and their derivatives or fragments, but are not limited to these.
  • polypeptides is used for amino acid sequences or proteins and refers to polymers of amino acids of any length
  • Expression also includes proteins that are posttranslational in response to, for example, glycosylation, phosphorylation, acetylation or
  • Protein processing can be modified.
  • the structure of the polypeptide may be e.g. by substitutions, deletions or insertion of amino acids, fusion with other proteins, while retaining its biological activity.
  • the polypeptides can multimerize and homo- and
  • Recombinant proteins are proteins which are produced by recombinant expression in host cells. Such recombinant
  • Recombinant proteins are produced under highest cleanliness requirements in order to achieve this Minimize the risk of contamination.
  • Recombinant proteins are usually produced in suitable host cells, such as yeast cells, animal cells or prokaryotic cells (E. coli or other bacterial strains) by using an expression vector such as a plasmid, bacteriophage, nude DNA or virus to introduce the recombinant protein into the host cell introduce.
  • Recombinant proteins are usually purified as commercially available concentrated protein solutions or in powder form.
  • Recombinant HSA is available, for example, from various commercial suppliers such as Sigma Aldrich.
  • therapeutic proteins are insulin, insulin-like growth factor, human growth hormone (hGH) and other growth factors, receptors, tissue plasminogen activator (tPA), erythropoietin (EPO), cytokines, for example, interleukins (IL) such as IL-1, IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15 , IL-16, IL-17, IL-18, interferon (IFN) -alpha, beta, gamma, omega or tau, tumor necrosis factor (TNF) such as TNF-alpha, beta or gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 and VEGF.
  • IL interleukins
  • IFN interferon
  • TNF tumor necrosis factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • antibodies are monoclonal, polyclonal, multispecific and single chain antibodies and fragments thereof, e.g. Fab, Fab ', F (ab') 2, Fc and Fc 'fragments, light (L) and heavy (H) immunoglobulin chains and their constant, variable or hypervariable regions as well as Fv and Fd fragments (Chamov et al., 1999).
  • the antibodies may be of human or non-human origin. Humanized and chimeric antibodies are also considered.
  • fragment antigen-binding Fab
  • fragment antigen-binding Fab
  • fragment antigen-binding Fab
  • They can be produced, for example, by treatment with a protease, for example papain, from conventional antibodies or else by DNA cloning.
  • Other antibody fragments are F (ab ') 2 fragments, which can be prepared by proteolytic digestion with pepsin.
  • VH variable region of the severe
  • variable part Since covalent attachment via the cysteine residues of the constant chains is not possible with these Fv fragments, these Fv fragments are often otherwise stabilized.
  • variable region of heavy and light chain often by means of a short
  • scFv Single-chain Fv fragment
  • a person skilled in the art refers to a bivalent homodimeric scFv derivative as the "diabody.”
  • Amino acids result in the formation of homodimers by superposition of VHA / L chains.
  • the diabodies can additionally be stabilized by introduced disulfide bridges. Examples of diabodies can be found in the literature, eg in Perisic et al. (1994).
  • minibody refers to a divalent, homodimeric scFv derivative which consists of a fusion protein which contains the CH3 region of an immunoglobulin, preferably IgG, particularly preferably IgGI, as a dimerization region which links the scFv fragments via a hinge Region, also of IgG, and a linker region
  • IgG immunoglobulin
  • IgGI immunoglobulin receptor 1
  • fragments designated by the skilled person as mini-antibodies which have a bi-, tri- or tetravalent structure, are likewise derivatives of scFv fragments. Multimethylation is achieved via di-, tri- or tetrameric coiled-coil structures (Pack et al., 1993 and 1995, Lovejoy et al., 1993).
  • antibody fusion refers to the fusion / coupling of a protein with an antibody or part of an antibody. Specifically, these include genetically engineered fusion proteins in which a therapeutic protein is coupled to the Fc portion of an antibody to thereby increase serum half-life / stability of the protein. The term also includes antibody fusions consisting of a peptide and an antibody or part of an antibody.
  • Host cells preferred in the invention are hamster cells such as BHK21, BHK TK “ , CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 and CHO-DG44
  • CHO-DG44 CHO-DUKX
  • CHO-K1 CHO-K1
  • BHK21 especially CHO-DG44 and CHO-DUKX cells.
  • mouse myeloma cells preferably NSO and Sp2 / 0 cells, as well as derivatives / derivatives of these cell lines.
  • hamster and mouse cells which can be used according to the invention are given in the following Table 1.
  • other mammalian cells including, but not limited to, human, mouse, rat, monkey, rodent, or eukaryotic cells, including, but not limited to, yeast, insect, avian, and plant cells, may also be used be used as host cells for the production of biopharmaceutical proteins.
  • mammalian cells preferably rodent cells, particularly murine cells such as NSO and hamster cells such as e.g. CHO or BHK cells preferred
  • Host cells are preferred when established, adapted, and cultured completely under serum-free conditions. Particularly preferred are host cells, which are additionally established in medium, adapted and completely cultured, which is not only serum-free, but also free of any proteins / peptides of animal origin.
  • production cell or “producer cell” or “production clone” refers to a cell that is used in a process to produce a protein. In particular, this includes genetically-altered cells that are used for the industrial production of recombinant proteins. In the context of this invention, the term primarily refers to genetically-modified eukaryotic host cells that express a recombinant protein and are used to produce this protein. These include in particular monoclonal cell lines for the production of therapeutic proteins.
  • the invention describes a method for cultivating a single cell comprising the following steps: (a) culturing a cell population, (b) isolating a single cell from said cell pool and (c) cultivating said single cell in a conditioned medium, i) which albumin, preferably human serum albumin (HSA), which is secreted by live albumin transgene cells directly into said medium.
  • albumin preferably human serum albumin (HSA)
  • HSA human serum albumin
  • the present invention describes a method wherein the albumin secreted from living albumin transgenic cells in step c) at significantly lower concentration achieves the same effect on recloning efficiency as recombinant albumin.
  • the invention describes a method of cultivating a single cell comprising the steps of: (a) culturing a cell population, (b) isolating a single cell from said cell pool, and (c) culturing said single cell in a conditioned medium, i) which albumin , preferably human serum albumin (HSA), which is secreted by live albumin transgenic cells directly into said medium, ii) the albumin secreted by live albumin transgenic cells at significantly lower concentration achieves the same effect on recloning efficiency as recombinant or purified albumin.
  • albumin preferably human serum albumin (HSA)
  • HSA human serum albumin
  • the present invention describes a process wherein the albumin secreted by live albumin transgenic cells already at at least two times lower concentration achieves the same effect on recloning efficiency as recombinant albumin.
  • the present invention describes a process wherein the albumin secreted by live albumin transgenic cells is already at least fivefold lower Concentration achieved the same effect on the recloning efficiency as recombinant or purified albumin.
  • the present invention describes a process wherein the albumin concentration in i) is at least 2 times lower, preferably at least 5 times lower than that of a comparable culture mixture containing recombinant or purified albumin.
  • the present invention describes a method wherein the single cell in step (b) and (c) expresses a protein of interest.
  • process step c) is carried out under serum-free conditions, preferably using chemically defined and / or insulin-free medium.
  • the present invention describes a process wherein albumin is contained in process step (c) in a concentration below 200 mg / L, preferably below 100 mg / L, particularly preferably below 60 mg / L.
  • the present invention describes a process wherein albumin is contained in process step (c) ii) in a concentration which is lower by a factor of 2 to 100, 2 to 5, 5 to 100, 20 to 100 or 5 to 10, preferably at least in a concentration which is lower by a factor of 5, more preferably at least in a concentration which is lower by a factor of 10.
  • the present invention describes a process wherein, in method step (c), the cell supernatant of living albumin transgenes is added to cells which are taken between culture days 1 to 4.
  • the present invention describes a method wherein in step (c) the cell supernatant of live albumin transgenic cells is added, which is taken on Day 2 of cultivation.
  • the present invention describes a method wherein the cell supernatant is taken from a cell culture with 1 to 4 million, preferably from 1 to 2 million albumin-transgenic cells / ml.
  • the Cell supernatant from a cell culture of 1 to 4 million, preferably taken from 1 to 2 million albumin-transgenic cells / ml and the albumin concentration in i) is at least factor 5 to 10, preferably at least 10 times lower than that of a comparable culture mixture containing recombinant or purified albumin.
  • the present invention describes a method wherein the conditioned medium in method step c) is produced by adding live albumin-transgenic feeder cells. Preferably, at most 50,000 albumin-transgenic feeder cells / ml are added. Further preferred is a method according to the invention wherein the albumin-transgenic feeder cells remain continuously over a period of at least 2 weeks in the medium of method step c).
  • the conditioned medium in step c) is generated by adding live albumin-transgenic feeder cells with 50 0000 albumin-transgenic feeder cells / ml or less are added and the albumin concentration in i) by at least a factor of 5 to 100, preferably by a factor of 20 to 100 (preferably by a factor greater than 100) is lower than that of a comparable culture mixture containing recombinant or purified albumin.
  • the present invention describes a method wherein the conditioned medium in method step (c) is generated in that the individual cell from method step (b) and (c) is an albumin-transgenic cell.
  • the single cell is both transgenic for albumin and for a gene of interest, and the single cell produces both albumin and, at the same time, a protein of interest.
  • the present invention describes a method wherein in step c) a) live albumin-transgenic feeder cells are added or b) the cell supernatant of live albumin-transgenic cells which is added between the cultivation day 1 to 4, preferably on the cultivation day 2, is added.
  • the invention also describes a cell which is generated by one of the methods according to the invention.
  • the invention further describes a method of producing a protein of interest in a cell, preferably a CHO cell, preferably under serum-free culture conditions, comprising the steps of: a) producing a cell population containing a gene of interest which is a protein (b) culturing these cells under culture conditions allowing growth of the cells; c) isolating and depositing a single cell into a vessel, eg in a 96-well plate, d) cultivation of said single cell in conditioned medium in the presence of a) cell supernatant of live albumin-transgenic cells, which is between culture days 1 to 3, preferably on
  • C) living albumin-transgenic feeder cells e) selection of a cell according to its expression level of protein of interest, f) harvesting the protein of interest, for example by separating the cell portions from the supernatant, and g) purification of the protein of interest.
  • the present invention describes a method characterized in that the protein of interest is a recombinant protein, preferably a therapeutic protein, preferably an antibody or an antibody fusion protein or an antibody fragment.
  • the present invention describes a method characterized in that the single cell is a hamster or mouse cell, preferably a mouse myeloma cell, more preferably a CHO or BHK cell or an NSO cell.
  • the present invention describes a method characterized in that the live albumin transgenic cell is from the same species as the single cell.
  • the cell is a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell
  • the cell is a hamster or mouse cell, also preferably a mouse myeloma cell, more preferably a CHO or BHK cell or an NSO cell, depending on the species
  • the present invention describes a method characterized in that it is autologous albumin-transgenic cells or feeder cells
  • the present invention describes a method characterized in that the the isolation of a single cell in step b) is achieved by "limited dilution" or by means of a fluorescence activated cell sorting (FACS) device.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the present invention describes a method characterized in that the single cell in step (b) and (c) expresses a protein of interest.
  • the protein of interest is a therapeutic protein, preferably an antibody, an antibody fusion protein or an antibody fragment.
  • the invention further describes a protein which is prepared by a method according to the invention.
  • the invention also describes a method for the selection of a production cell, wherein a method according to the invention is used.
  • the invention further describes the use of a production cell for biopharmaceutical protein production according to the invention.
  • the invention also describes a serum-free conditioned culture medium which enables the cultivation of a single cell, comprising: a) cell supernatant of live albumin-transgenic cells taken between culture day 1 to 4, preferably on cultivation day 2, or b) live Albumin-transgenic feeder cells for conditioning the medium.
  • the medium according to the invention preferably contains an albumin concentration below 200 mg / L, furthermore preferably below 100 mg / L, particularly preferably below 60 mg / L.
  • autologous feeder cells are used.
  • the present invention describes a medium characterized in that the single cell cultured therein is a CHO cell. Most preferably, this single cell expresses a protein of interest.
  • the cells CHO-DG44 / dhfr ⁇ ⁇ (Urlaub et al., 1983) are permanently stored as suspension cells in serum-free and hypoxanthine-and-thymidine-supplemented HyQ SFM 4 CHO medium (HyClone) or Bl-own medium in cell culture flasks at 37 ° C cultivated in a humid atmosphere and 5% CO2.
  • the cell counts and the viability are determined with a CEDEX Cell Counter (Innovatis, DE) or by trypan blue staining and the cells are then seeded in a concentration of 1 - 3 x10 5 / mL and passaged every 2 - 3 days.
  • Recombinant CHO-DG44 are used for single cell cloning
  • the cultivation of cloned recombinant cells is analogous to these cells.
  • the medium used is also HyQ medium, Ex-CeII medium (JRH, USA) or Bl's own medium without hypoxanthine and thymidine.
  • the cells NSO can be permanently cultured as suspension cells in serum-free hybridoma medium, animal component free medium (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA) in cell culture flasks at 37 ° C in a humid atmosphere and 5% CO 2 .
  • the cell counts and the viability can be determined with a CEDEX Cell Counter (Innovatis, DE) or by trypan blue staining and the cells are then seeded in a concentration of 1 - 3 x10 5 / mL and passaged every 2 - 3 days.
  • the cells are irradiated with a radioactive radiation source (Cs137 emitter, Gammacell 2000, Molsgaard Medical
  • HSA-producing feeder cells takes place in the same way. The process is carried out in accordance with NSO cells, wherein the feeder cells are kept / seeded in each specific for the cell medium.
  • the conditioned medium is obtained from the supernatant of an animal cell culture.
  • the cells are seeded at an adequate seeding density and cultured for 1-7 days.
  • the supernatant is separated from the cells by centrifugation and then sterile filtered.
  • the resulting filtrate is used as a conditioned medium.
  • the HSA concentration is determined using the Human Albumin ELISA Quantitation Kit from Bethyl (Cat. No. E80-129) according to the manufacturer's instructions.
  • the cell deposition takes place in Ex-CeII medium (JRH, USA) or Bl-own medium with the corresponding supplements to HSA and preferably IGF or insulin.
  • NSO cells cell deposition is carried out according to Hybridoma medium, Animal component free medium (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA).
  • EXAMPLE 1 PREPARATION OF HSA-PRODUCING CHO CELLS Serum-free suspension-growing CHO-DG44 cells (Urlaub and Chasin, 1980) are transfected with a plasmid carrying an expression cassette for human serum albumin (HSA) and DHFR as a selection marker. Subsequent cultivation in HT-free medium produces stably transfected HSA cell pools. With the help of an HSA-specific ELISA, those pools are selected that secrete the most HSA. These are subjected to gene amplification by culturing in the presence of methotrexate (MTX).
  • HSA human serum albumin
  • MTX methotrexate
  • HSA-producing cell lines are produced from the initially heterogeneous cell population and these in turn are tested for their specific HSA productivity. These lines are subjected to another round of gene amplification by culturing in medium with increased MTX concentration to further increase the HSA secretion rate. Since MTX can also lead to a reduction in cell growth, the cell lines obtained are then examined for both increased productivity and their growth properties, and the cell line with the highest productivity with good growth is selected. From this cell a cell bank is made, which can be used in all future experiments.
  • EXAMPLE 2 INCREASE OF RECONERATIVE EFFICIENCY BY USING CONDITIONED MEDIUM OF HSA-PRODUCING CELLS
  • One possible embodiment of the present invention is the use of HSA-producing cells to increase recloning efficiency.
  • a culture of HSA-producing cells is prepared which condition the culture medium for several days, ie deliver growth factors and, in particular, the HSA secreted by them into the medium. On the day of recloning this is conditioned Separate medium from the live HSA-producing cells by centrifugation, filter (optional) and add 1: 1 to the recloning medium.
  • conditioned medium is recovered from a 2, 3, 4, 5, 6, and 7 day culture and used for the recloning experiment.
  • the positive control is fresh medium to which 500 mg / L of purified, recombinant HSA has been added.
  • the use of conditioned medium of HSA-producing cells leads to a marked increase in the efficiency of single cell deposition over the negative control.
  • the recloning efficiency also increases, but not as much as by the 2-5 day conditioned medium of HSA-secreting cells.
  • the HSA concentration in the conditioned medium increases continuously over time, yet the recloning efficiency decreases when using medium conditioned for more than 5 days.
  • EXAMPLE 3 INCREASE OF RECONSTITUTING EFFICIENCY IN DIFFERENT MEDIA
  • conditioned medium of HSA-producing cells are recloned to different media: in one approach, the single cell becomes Bl's own medium deposited in the presence of CHO-DG44 feeder cells ( Figure 3A), one in a commercial medium without feeder cells ( Figure 3B).
  • Figure 3A Bl's own medium deposited in the presence of CHO-DG44 feeder cells
  • Figure 3B one in a commercial medium without feeder cells
  • the use of the conditioned medium of HSA-secreting cells leads to a significant increase in the recloning efficiency. which is both higher than in the negative control and in the positive control in which recombinant HSA was added to the recloning medium.
  • Conditioned medium Medium from a preculture of HSA-producing cells is added to the recloning medium once before sowing the individually deposited cells. Thus, they only receive HSA-containing medium only once at the beginning during the three-week phase of high growth after recloning. In contrast, HSA-producing feeder cells could continuously supply the high-growth single-cell clones with HSA.
  • HSA-producing feeder cells could continuously supply the high-growth single-cell clones with HSA.
  • CHO-DG44 cells are deposited individually in four 96-well plates each with HSA-producing and non-HSA-producing feeder cells. As in the previous example, the recloning medium contains 50% conditioned medium from an HSA-producing preculture. After three weeks, the tall monoclonal cell colonies in each cell culture plate are counted and the recloning efficiency calculated.
  • EXAMPLE 6 INCREASED RECONNECTION EFFICIENCY OF NSO CELLS
  • HSA has a cross-species positive effect on recloning efficiency.
  • murine NSO hybridoma cells producing a therapeutic protein are subjected to recloning. They are stored on the one hand in fresh medium, on the other hand in medium, the conditioned medium of an HSA-producing CHO cell culture was added and in a third approach to HSA-producing feeder cells.
  • HSA-producing cells Compared with the recloning in fresh medium or conditioned medium of a cell culture of non-HSA-secreting cells, the use of HSA-producing cells has a positive effect on the recloning efficiency. This applies both to the use of conditioned medium of HSA-secreting cells and of HSA-producing feeder cells.
  • EXAMPLE 7 USE OF SEPARATED HSA INCREASES THE RECONCILIATION EFFICIENCY OF HUMAN CELLS
  • human HEK293-based production cells are recloned in the presence and absence of conditioned medium of HSA-producing cells. Opposite the recloning in fresh medium or conditioned medium of a 'cell culture not HSA-secreting cells, the use of HSA-producing cells has a positive effect on the recloning efficiency. This applies both to the use of conditioned medium of HSA-secreting cells and of HSA-producing feeder cells. It can be concluded that the effect of secreted HSA affects the recloning efficiency of individually deposited cells of several species, ie is valid across species.
  • EXAMPLE 8 INCREASED RECONNECTION EFFICIENCY BY HSA-PRODUCING CELLS INCREASES THE PROBABILITY OF IDENTIFYING HIGH-PRODUCTION CELLS
  • the level of specific productivity of producer cells in a heterogeneous cell population is normally distributed. This means that most cells show moderate productivity, while few cells produce much and only a very small percentage produce a lot of recombinant product. This circumstance explains the expense involved in cell-line screening and identification of high-producer cells in industrial cell line development programs. It also means that the likelihood of finding these high producers correlates directly with the efficiency of recloning: the more cells that grow up after recloning, the more likely they are to have a high producer cell.
  • a heterogeneous population of stably transfected CHO producer cells secreting a therapeutic protein is subjected to recloning. They are placed once in recloning medium to which 50% conditioned medium was added to the parent CHO-DG44 cell (batch 1), and once in 50% conditioned medium from a culture of HSA-producing cells (batch 2). As in the previous examples, in the approaches in which mediums of HSA-producing cells were used, more cells grow into clonal cell lines.
  • 100 clones are selected in the next step and their productivity determined by a product-specific ELISA.
  • the distribution of specific productivity over these 100 clones in each case shows a normal distribution.
  • the mean of this curve is significantly shifted to the right towards higher productivities.
  • the mean of the productivity of the 10 highest producing cells from this approach 2 is higher than that of the 10 highest cell lines from the Recloning approach without HSA-producing cells (approach 1).
  • the cell line selected to be the highest producing clone for the production of the therapeutic protein is also from batch 2.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Zellkulturtechnologie und betrifft Verfahren zur Vermehrung/Klonierung von Zellen, vorzugsweise von Zelllinien, die für die Produktion von Biopharmazeutika von Bedeutung sind. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Proteinen unter Verwendung von Zellen, die mittels Einzelzellablage gewonnen und vermehrt wurden sowie Medien-Zusammensetzungen, die eine Vermehrung von Einzelzellen ermöglichen. Durch die Verwendung Albumin-bzw. bevorzugt HSA-produzierender Zellen zum Konditionieren von Medium, als Feederzellen oder als Wirtszellen kann die Reklonierungseffizienz und dadurch die Quantität der erhaltenen Klone signifikant gesteigert werden. Es ist auch eine Kombination dieser Ansätze möglich. Durch die Verwendung von Albumin-bzw. bevorzugt HSA-produzierenden Zellen kann auch in Serum- und/oder Insulin-freiem Medium und in unterschiedlichen Zelltypen eine Steigerung der Reklonierungseffizienz erzielt werden.

Description

VERWENDUNG HSA-PRODUZIERENDER ZELLEN
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
TECHNISCHES GEBIET Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Zellkulturtechnologie und betrifft Verfahren zur Vermehrung/Klonierung von Zellen, vorzugsweise von Zelllinien, die für die Produktion von Biopharmazeutika von Bedeutung sind. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Proteinen unter Verwendung von Zellen, die mittels Einzelzellablage gewonnen und vermehrt wurden sowie Zusammensetzungen, die eine Vermehrung von Einzelzellen ermöglichen.
HINTERGRUND
Der Markt für Biopharmazeutika für die Therapie im Menschen wächst weltweit stark. Über 900 Biopharmazeutika werden derzeit in klinischen Studien getestet mit einem geschätzten Umsatzpotential von 50 Milliarden im Jahre 2010 (Datamonitor 2007).
Momentan wird eine immer größer werdende Anzahl an Biopharmazeutika in Säugerzellen produziert, da diese die Fähigkeit zur korrekten Prozessierung und Modifikation eines humanen Proteins besitzen. Die erfolgreiche und ertragreiche Produktion von Biopharmazeutika in Säugerzellen ist daher entscheidend und hängt von den Charakteristika der rekombinanten monoklonalen Produzentenzelllinie ab, die im Herstellungsprozess verwendet wird. Darüber hinaus ist die Dauer der Zelllinienentwicklung ein entscheidender Zeitfaktor dabei wie schnell das Biopharmazeutikum in die klinischen Studien eintreten kann. Im Hinblick auf diese Aspekte besteht eine dringende Notwendigkeit, den Zelllinien- Entwicklungsprozess zu beschleunigen und effizienter zu gestalten.
Zur biotechnologischen Herstellung von biologisch aktiven bzw. therapeutischen Proteinen in Säugerzellen, sog. „Biopharmazeutika", werden die entsprechenden
Säugerzellen mit DNA stabil transfiziert, die für das jeweilige biologisch aktive Protein (oder seine Untereinheiten) kodiert. Nach dem Transfektionsprozess erhält man normalerweise einen Pool von Millionen unterschiedlicher transfizierter Zellen. Daher liegt der entscheidende Schritt zur Herstellung effizienter Produktionszelllinien in der Selektion und Vermehrung von Zellklonen, die zum einen sehr stabil wachsen und zum anderen eine hohe spezifische Produktivität an therapeutischem Protein zeigen (Produktbildung etc.). Da Millionen unterschiedlicher produktexprimierender Zellen vorliegen, ist es entscheidend, über hohen Durchsatz und Automatisierung eine Vielzahl von Zellen einzeln analysieren zu können, um geeignete Kandidaten (Einzelzellklone), die sowohl sehr robust wachsen als auch hohe Produkttiter liefern, aussortieren zu können. Diesen Vorgang der Einzelzellisolierung und Subkultivierung bezeichnet man auch als - Klonierung oder Reklonierung.
Die Verwendung von tierischen Zellkulturen zur Produktion von Biopharmazeutika fordert eine genotypisch und phenotypisch homogene, d.h. monoklonale Zellkultur. Dies wird durch Reklonierungstechniken wie Jimited dilution' oder durch automatisierte Einzelzellablage mittels Fluorescence activated cell sorting (FACS) erreicht.
Es besteht jedoch die Schwierigkeit, typische rekombinante Produktionszellen wie Maus Myeloma- (NSO), Hamster Eierstock- (CHO), oder Hamster Nieren-Zellen (BHK), insbesondere wenn diese an das Wachstum in serumfreien Suspensionskulturen adaptiert sind, also unter modernen produktionsrelevanten Zellkulturbedingungen, nach einer Reklonierung effektiv zu vermehren, bei der die Zellen einzeln unter serumfreien Kulturbedingungen in Mikrotiterplatten abgelegt werden.
Dies liegt daran, dass Zellen in vivo in den Gewebeverbund eingebettet sind und von benachbarten Zellen mit sezernierten auto- und parakrinen Wachstumsfaktoren versorgt werden. Sie sind daher nicht an isoliertes Wachstum angepasst und sterben ohne Stimulation durch Wachstumsfaktoren ab, sofern sie nicht langwierig an die neuen Bedingungen adaptiert werden.
Speziell die Verwendung von serumfreien oder chemisch definierten Medien im Reklonierungsschritt führt zu einer eingeschränkten Reklonierungseffizienz, d.h. nur ein gerniger Prozentsatz der abgelegten Zellen überleben und wachsen zu einer monoklonalen Zelllinie heran.
Die aktuell angewandten Reklonierungstechniken „Limited dilution" und FACS sind dem Fachmann allgemein bekannt.
In der „Limited dilution" wird die Zellsuspension seriell verdünnt und die Zellen anschließend mit unterschiedlichen Zellzahlen pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte abgelegt. In Vertiefungen mit hohen Zellzahlen werden aufgrund ausreichender Sekretion autokriner Wachstumsfaktoren mehrere oder alle Zellen überleben. Je weniger Zellen pro Vertiefung eingesät werden, desto weniger Zellen überleben, so dass auf diese Weise die Verdünnung so eingestellt werden kann, dass statistisch pro Vertiefung nur eine Einzelzelle überlebt und zu einer monoklonalen Linie heranwächst. Diese Einzelzellklone werden mittels visuellen und/oder bildgebenden Techniken detektiert und die Zellklone in größere Kulturgefäße weiterkultiviert.
In der FACS-Technolgie wird ein Flow Cytometer zur Generierung von Einzelzellklonen verwandt. Dazu werden die Zellen in einen laminaren Strom gebracht und jeweils einzeln in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten abgelenkt. Dadurch ist sichergestellt, dass es sich bei den überlebenden Kolonien tatsächlich um Einzelklone handelt. Daher ist die FACS-Technologie gegenüber der Limited Dilution die bevorzugte Methode.
Die Verwendung von serumfreien oder chemisch definierten Medien im Reklonierungsschritt führt zu einer eingeschränkten Reklonierungseffizienz, d.h. nur wenige Prozent der einzeln abgelegten Zellen wachsen zu einer monoklonalen Zelllinie heran. Bei geringer Reklonierungseffizienz müssen daher viele Mikrotiterplatten mit Einzelzellen bestückt werden, um die gewünschte Zahl an Einzelklonen zu erhalten, wodurch Aufwendungen an Zeit und Kosten (z.B. für Medien, Platten etc) entstehen.
Besonders nachteilig wirkt sich eine geringe Reklonierungseffizienz dann aus, wenn die anschließende Analyse der Einzelzellklone über ein automatisiertes System erfolgen soll: Ein Analyse-Roboter kann üblicherweise nicht zwischen Vertiefungen mit lebenden oder toten Zellen differenzieren und vermisst automatisch alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Bei einer Reklonierungseffizienz von nur 10% bedeutet dies, dass der Roboter in 90% der Fälle eine leere Vertiefung analysiert - und dafür die gleich Menge an Reagentien verbraucht wie für die Analyse eines lebenden Zellklons. Im Fallbeispiel werden also 90% der Zeit wie auch 90% der Material kosten ohne Datengewinn vergeudet.
Zur Lösung dieses Problems wurde dem Medium in der Vergangenheit oft Serum (z.B. Fötales Kälberserum, FCS) zugesetzt. Serum enthält eine nicht definierte Mischung unterschiedlicher löslicher Proteine und Wachstumsfaktoren, das das Überleben und die Proliferation von Zellen unterstützt. Aus regulatorischen Gründen wird die Verwendung von nicht-definierbaren Zusätzen wie Serum, auch aufgrund der Gefahr der Infektion mit bovinen Viren, jedoch zunehmend weniger toliert. Eine durchgängig serum-freie Zelllinienherstellung entspricht daher in regulatorischer Hinsicht dem State-of-the-Art.
Ein weiterer Lösungsansatz besteht in der Durchführung einer „limited dilution" zur Reklonierung. Da diese Methode nur statistisch zur Entstehung von Einzelzellklonen führt, durchaus aber auch mehrere Klone in einer Vertiefung hochwachsen können, ist eine mehrfache (üblicherweise 2-3-malige) Wiederholung dieses Verfahrens notwendig, um sicherzustellen, dass es sich bei der erhaltenen Zelllinie wirklich um einen einzigen Klon handelt. Durch diese wiederholten Zyklen entsteht ein hoher Aufwand an Arbeit und Zeit, der sich nachteilig auf die benötigten Kosten und Timelines auswirkt.
Ein weiterer Lösungsansatz besteht in dem Einsatz von „Feeder"-Zellen. Die Bezeichnung kommt von dem englischen Worte „feed" = füttern und bezeichnet eine Ko-Kultivierung mit meist teilungsunfähigen Zellen, die dazu dienen, die eigentlich gewünschten Zellen der Kultur mit Nährstoffen und seziernierten Wachstumsfaktoren zu versorgen. Durch Feederzellen kann die Reklonierungseffizienz signifikant erhöht werden.
In einem weiteren Lösungsansatz werden dem Reklonierungsmedium recombinante Proteine zugesetzt, die das Überleben und Wachstum der einzeln abgelegten Zellen fördern. Beispiele verwendeter recombinanter Proteine sind Insulin, Insulin-like Growth Factor (IGF), Epithelial Growth Factor (EGF) oder Humanes Serum Albumin (HSA). Diese Additive werden als gereinigte Proteine oder Proteinlösungen bezogen und dem Medium zugesetzt. Nachteile dieser Methode sind in den Kosten, der Abhängigkeit von der Verfügbarkeit der recombinanten Proteine sowie deren Instabilität zu sehen. Deren Nachteile sind unter anderem: - Lagerung bei -700C erforderlich,
- Gefher-/Auftau-Zyklen führen zur Inaktivierung und müssen daher vermieden werden,
- rascher Verlust der Aktivität in Lösung unter Kultivierungsbedingungen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die Reklonierungseffizienz bei der serumfreien FACS-basierten Klonierung von Produktionszellen zu steigern. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Lösung dieses technische Problems der reduzierten Reklonierungseffizienz in serumfreiem, vorzugsweise chemisch-definiertem und/oder Insulin-freiem Medium wird durch die Verwendung von transgenen Albumin bzw. HSA-produzierenden Zellen bzw. durch die Verwendung von durch solche HSA-produzierenden Zellen konditioniertem Medium erreicht. Das HSA wird dabei also nicht als gereinigtes Protein von außen dem Medium zugesetzt, sondern es wird vielmehr direkt von lebenden Zellen in das Reklonierungs-Medium abgegeben.
Hierbei sind folgende Ausführungsformen möglich:
1. Verwendung einer HSA-produzierenden Zelle zur Herstellung von konditioniertem Medium für die Einzelzellablage.
2. Verwendung von HSA-produzierenden Zellen als Feeder-Zellen. Im Gegenseatz zur Verwendung von recombinantem HSA, das dem Medium einmalig zugesetzt wird, produzieren die Feederzellen in der Multiwell-
Platte nach der Einzelzellablage kontinuierlich HSA und unterstützen so das Wachstum der abgelegten Zellen längerfristig als nach einmaliger Zugabe des recombinanten Proteins.
3. Verwendung von HSA-produzierenden Zellen als Wirtszellen zur Herstellung von Biopharmazeutika. Die Zellen werden dadurch in die Lage versetzt, ihr Wachstum durch Sekretion von HSA autolog auch in Abwesenheit von Feederzellen und recombinanten Zusatzstoffen zu fördern.
Die höchste Reklonierungseffizienz kann bevorzugt über eine Kombination dieser Ansätze, d.h. durch Verwendung von HSA-produzierenden Wirtszellen und HSA- konditioniertem Medium, erzielt werden. Optional und je nach Art des anschließenden Analyse-Verfahrens, können zusätzlich Feederzellen verwendet werden. Durch die Verwendung von HSA-produzierenden Zellen als Wirts- oder Feederzellen oder Medien-Konditionierer kann die Reklonierungseffizienz und dadurch die Quantität der erhaltenen Klone signifikant gesteigert werden. Dieser Effekt konnte schon ab Konzentrationen von unter 200 mg/L HSA, sogar <100 mg/L im Klonierungsmedium beobachtet werden. Die Wirkungsamkeit / Effektivität von sezerniertem HSA auf die Reklonierungseffizienz ist demnach deutlich höher als diejenige von recombinantem HSA, das üblicherweise in Konzentrationen von 400 mg/L bis >2 g/L zugesetzt wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung von HSA-produzierenden
Zellen in Insulin-freiem Medium.
Der positive Einfluß von HSA-produzierenden Zellen und/oder deren Medium auf die Reklonierungseffizienz zeigt sich sowohl in An- als auch in Abwesenheit von
Feederzellen in verschiedenen Medien. Er zeigt sich darüber hinaus bei verschiedenen Zelllinien / Zelltypen wie beispielsweise Hamster- und Mauszellen, aber auch humanen und diversen anderen Zellsystemen.
Als HSA-produzierende Zellen können sowohl natürlicherweise HSA- produzierende Zellen (wie humane Leberzelllinien) als auch genetisch-veränderte Zellen anderer Spezies eingesetzt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform stellen transgene HSA-produzierende Produktionszelllinien wie CHO-, BHK-, NSO-, Sp2/0- oder Per.C6-Zellen dar. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform sind HSA-produzierende CHO-Zellen.
Die hier beschriebene Methode zur Steigerung der Reklonierungs-Effizienz in serumfreien Medien durch Verwendung von HSA-produzierenden Zellen oder von ihnen konditioniertem Medium resultiert in einem effektiveren Klonscreening und dadurch zu einem effizienteren Zelllinien-Entwicklungsprozess. In der biopharmazeutischen Eintwicklung besteht das primäre Ziel der Reklonierung in der Identifizierung von hoch-produzierenden Zeilklonen. Eine höhere Reklonierungseffizienz führt durch die breitere Basis an erhaltenen Klonen und bedingt durch eine Normalverteilung der Klone hinsichtlich Produktivität zu einer höheren Wahrscheinlichkeit, hoch-produzierende Zellklone zu erhalten.
Da bei höherer Reklonierungseffizienz weniger Zellen in Platten abgelegt werden müssen, um die gleich Anzahl lebender Zellklone zu erhalten, ergibt sich darüber hinaus eine signifikante Ersparnis sowohl an Zeit und Aufwand als auch an Kosten. Der Prozessschritt wird insgesamt ökonomischer.
Weiterhin bildet die erhöhte Reklonierungseffizient die Grundlage für den Einsatz von hocheffizienten automatisierten Klonscreening-Verfahren (Screening Robot). In derartigen Systemen erfolgt zumeist keine Selektion einzelner Vertiefungen in der Mikrotiterplatte, sondern alle werden gleichermaßen vermessen, ungeachtet dessen, ob sie eine lebende Zellpopulation enthalten oder nicht. Durch die Analyse aller Vertiefungen der Platte steigt die Anzahl der untersuchten Klone direkt proportional mit der Anzahl der hochwachsenden Klone. Eine Reklonierungseffizienz von nur 10% führt dazu, dass 90% der Vertiefungen leer sind und daher keine verwertbaren Daten liefern können, aber dennoch analysiert werden. Für die Wirtschaftlichkeit bedeutet das, dass in 90% der Fälle Zeit und Geld in Form von Reagentien ohne Datengewinn aufgewendet werden. Daher steigt die Effizienz von High throughput Automatisierungssystemen für die frühe Klonselektion proportional mit der Anzahl der erhaltenen Klone nach der Einzelzellablage.
Ein weiterer Vorteil der beschriebenen Methode besteht darin, dass durch Zusatz von HSA-produzierenden Zellen als Wirtszellen und/ oder Medium-Konditionierer die Reklonierungseffizienz soweit gesteigert wird, dass auf Feederzellen verzichtet werden kann. Dies reduziert zum einen den Aufwand bei der Herstellung und Vorkultur der Feederzellen und erhöht zugleich die Reproduzierbarkeit der Einzelzellklonierung. Desweiteren ermöglich sie den Einsatz von Technologien zur visuellen Erfassung der Lebendzellzahl als Werkzeug zur Klonanalyse. Da die Produktmenge im Kulturmedium linear mit der Anzahl der produzierenden Zellen korreliert, geht die technologische Entwicklung dahin, sowohl die Produktmenge als auch die Zellzahl zu erfassen, um anhand dessen die höchst-produzierenden Zellklone zu ermitteln, d.h. die Zellklone mit der höchsten spezifischen Produktivität.
Da Feederzellen von den heranwachsenden Produktionszellen visuell nur schwer unterscheidbar sind, werden sie bei der visuallen Zellzahlbestimmung mit erfasst, was zu einer ungenauen Berechnung der Gesamtzellzahl und damit zur ungenauen Bestimmung des wichtigen Parameters der spezifischen Produktivität führt. Eine Verfahren ohne Feederzelle ist daher vorteilhaft und stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar.
Anwendungsmöglichkeiten für das beschriebene Verfahren finden sich insbesondere in der biopharmazeutischen Produktion.
Die Erhöhung der Reklonierungseffizienz bei der Generierung von Produktionszellen für die biopharmazeutische Produktion führt zu einer höheren
Wahrscheinlichkeit für einen hochproduzierenden Klon und damit zu einer verbesserten bzw. beschleunigten Produktentwicklung.
Das Verfahren steigert desweiteren die Wirtschaftlichkeit dieses Prozesschrittes und ermöglicht darüber hinaus den Einsatz automatisierter Klonanalyse- Technologien im High-Troughput.
Im Stand der Technik wird zwar der Zusatz rekombinanter Proteine zu Insulin- haltigem Medium beschrieben, um die Reklonierungseffizienz zu steigern (WO2006047380). Demgegenüber wird in der vorliegenden Patentanmeldung jedoch explizit die Verwendung von sezerniertem Albumin bzw. HSA, bzw. Medium von Albumin- bzw. HSA-produzierenden Zellen, als alternative und überlegene Möglichkeit aufgezeigt. Dabei wird das HSA nicht als rekombinantes, aufgereinigtes Protein exogen dem Medium zugesetzt, sondern das HSA wird von den Albumin-transgenen Zellen direkt in das Reklonierungs-Medium sezerniert.
HSA-produzierende CHO-Zellen sind in der Literatur zwar beschrieben jedoch wird weder die Verwendung HSA-produzierender Zellen als Wirtszellen für die Produktion eines anderen Proteins als HSA beschrieben, noch ihre Verwendung als Feederzellen oder als Medien-Konditionierer zur Steigerung der Reklonierungseffizienz.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
ABBILDUNG 1 : ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN DER ERFINDUNG Schematische Darstellung der möglichen Ausführungsformen von HSA- produzierenden Zellen: (1 ) zur Herstellung von konditioniertem Medium
(2) als Feederzellen
(3) Verwendung von HSA-produzierende Zellen als Wirtszellen für die biopharmazeutische Produktion, d.h. die Zelle, die das Protein von Interesse produziert, sezerniert zusätzlich HSA und fördert dadurch während der Reklonierung ihr eigenes Wachstum.
Diese Anwendungsmöglichkeiten können zur weiteren Steigerung der Reklonierungseffizienz kombiniert werden.
ABBILDUNG 2: HERSTELLUNG VON KONDITIONIERTEM MEDIUM VON HSA- PRODUZIERENDEN ZELLEN ZUR STEIGERUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ
(A) Dargestellt ist die relative Reklonierungseffizienz bei Verwendung von frischem Reklonierungsmedium ohne Zusätze (Neg. Kontrolle, weiß) sowie die relative Steigerung der Reklonierung durch Zusatz von 500 mg/L rekombinantem HSA (Pos. Kontrolle, grau) oder 50% konditioniertem Medium von einer Kultur HSA-produzierender Zellen, das nach den angegebenen Tagen aus der Kultur entnommen und zugesetzt wurde (schwarze Balken).
(B) Tabellarische Übersicht über die in den obigen Medien gemessenen HSA- Konzentrationen. Die Reklonierungseffizienz ist bei Verwendung von 2-5 Tage lang konditioniertem Medium am höchsten. Sie ist dabei deutlich höher als bei Zusatz von rekombinantem HSA ins Medium, obwohl die gemessenen HSA-Konzentrationen im konditionierten Medium um Faktor 5-50 geringer sind. Längere Konditionierung führt trotz höherem HSA-Gehalt im Medium zu einer verringerten Reklonierungseffizienz. ABBILDUNG 3: STEIGERUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ DURCH VERWENDUNG VON HSA-KONDITIONIERTEM MEDIUM
(A) Einfluss von HSA-konditioniertem Medium in Anwesenheit von Feederzellen. Dargestellt ist die relative Reklonierungseffizienz von Zellen, die einzeln auf 10.000 wachstums-arretierte Feederzellen abgelegt werden. Die negativ Kontrolle zeigt die Reklonierungseffizienz in Boehringer-eigenem Medium ohne Zusätze (hier auf 1 gesetzt), bei der positiv-Kontrolle wurde dem Medium 500 mg/L rekombinantes HSA zugesetzt. Durch die Verwendung von konditioniertem Medium einer 2 oder 4 Tage alten Kultur HSA-produzierender Zellen kann eine weitere Steigerung der Reklonierungseffizienz erreicht werden. Die in diesem Medium gemessenen HSA-Konzentrationen sind oberhalb der Balken angegeben.
(B) Einfluss von HSA-konditioniertem Medienzusatz zu kommerziellen Medium (HyQ SFM 4 CHO Medium). Die Grafik zeigt die Reklonierungseffizienz in einem anderen Medium als in (A) ohne Verwendung von Feederzellen. In diesem Medium wächst in Medium ohne Zusätze keine einzeln abgelegte Zelle zu einer lebenden Kultur heran. Durch Zugabe von rekombinantem HSA (500 mg/L, dunkelgrauer Balken) überleben einige Zellen. Eine höhere Reklonierungseffizienz wird dagegen durch Verwendung von konditioniertem Medium HSA- produzierender Zellen erreicht (hellgrauer Balken). Die Balken sind jeweils Mittelwerte von 3-5 ausgewerteten 96-well Platten pro Bedingung; Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.
ABBILDUNG 4: STEIGERUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ DURCH HSA-PRODUZIERENDE FEEDERZELLEN Eine einzelne Zelle aus einer Zellpopulation wird einzeln entweder auf autologe CHO-DG44 Feederzellen oder transgene HSA-produzierende Feederzellen abgelegt. Die Reklonierungseffizienz bei Verwendung von DG44-Zellen wurde 1 gesetzt, (schwarzer Balken). Der graue Balken stellt die relative Steigerung der Reklonierungseffizienz bei Verwendung von HSA-produzierenden Feederzellen dar. Die Balken zeigen Mittelwerte aus 3 ausgewerteten 96-well Platten pro Bedingung. ABBILDUNG 5: KOMBINATION VON HSA-PRODUZIERENDEN FEEDER- UND
WIRTSZELLEN
Dargestellt ist die Reklonierungseffizienz in Ansätzen mit untransfizierten DG44- Zellen, die auf autologe Feederzellen abgelegt werden (1 gesetzt, schwarz), bei Reklonierung einer HSA-produzierenden Zelle in Anwesenheit von DG44- Feederzellen (grau). Die Kombination, d.h. die Ablage einer HSA-produzierenden Zelle auf HSA-transgenen Feederzellen (weiss), führt zu einer weiteren deutlichen Steigerung der Reklonierungseffizienz. Gezeigt sind jeweils die Mittelwerte aus 3 ausgewerteten 96-well Platten, die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichungen.
ABBILDUNG 6: KONZENTRATIONS-ABHÄNGIGE STEIGERUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ DURCH ZUGABE VON REKOMBINANTEM HSA Die Graphik zeigt die Effizienz der Reklonierung bei Zugabe von rekombinantem HSA in den genannten Konzentrationen. Die maximale Effizienz wurde in diesem Experiment bei Zusatz von 1000 mg/L rekombinantem HSA zum Reklonierungsmedium erzielt; dieser Wert wurde 100% gesetzt und die gemessenen Effizienzen der anderen Ansätze relativ dazu aufgetragen.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DEFINITIONEN
Bevor die Erfindung nachfolgend anhand nicht-beschränkender Ausführungsbeispiele näher erläutert wird, sei darauf verwiesen, dass die Verwendung unbestimmter Artikel, beispielsweise „ein" oder „eine", sowie die bestimmter Artikel, wie „der", „die", „das" Einzahl u n d Mehrzahl des entsprechenden Begriffs einschließen, es sei denn, dass eine der beiden Formen explizit ausgeschlossen und auf eine bestimmte Form (Einzahl, Mehrzahl) verwiesen wird. So schließt der Begriff „eine Zelle" automatisch „mehrere Zellen" mit ein, es sei denn es wird explizit darauf verwiesen, dass nur eine einzige Zelle gemeint ist. Einzahl ist beispielsweise dort explizit gemeint, wo „ein" durch (1 ) ergänzt ist.
Der Begriff „Insulin" bezeichnet einen Wachstumsfaktor, der von pankreatischen Beta-Zellen sezerniert wird. Insulin ist dem Fachmann bekannt. Häufigen Einsatz in der Zellkultur findet humanes Zink-Insulin oder rekombinantes Insulin. Die Konzentration von Insulin kann man im Kulturmedium messen, indem man routinemäßige Experimente wie einen kommerziell erhältlichen Insulinspezifischen ELISA verwendet.
Der Begriff „Insulin-frei" meint, dass das Kulturmedium kein Insulin, insbesondere kein rekombinantes Insulin enthält und ihm auch kein Insulin zugesetzt wird.
Albumin ist das am häufigsten vorkommende Protein im Plasma. Es wird in der Leber produziert und trägt zur Erhaltung des osmotischen Druckes im Blut bei. Albumin bindet an Nährstoffe und Metaboliten und und unterstützt so deren Transport.
Der Begriff „Albumin" meint in der vorliegenden Erfindung eine
Polypeptidkomponente, welche die biologische Aktivität von Albumin aufweist.
Albumin bezeichnet generell irgendein tierisches Albumin insbesondere ein Säugeralbumin wie beispielsweise humanes, bovines, pferdeartiges, murines, rattenartiges und schweineartiges Albumin sowie Albumin aus Vögeln wie insbesondere Huhn etc. Vorzugsweise ist das Albumin humanes Serumalbumin (HSA). In der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe „HSA" und „Albumin" synonym verwandt, d.h. „HSA" referiert ebenso auf humanes Albumin wie auf Albumine anderer Tierarten. In der vorliegenden Erfindung wird explizit unterscheiden zwischen rekombinantem HSA, das dem Kulturmedium von aussen zugesetzt wird, und "sekretiertem HSA", das von lebenden HSA-produzierenden Zellen direkt, dh. ohne Aufreinigung oder Abtrennung, in das Reklonierungsmedium abgegeben wird. Wenn von Albumin bzw. HSA gesprochen wird, welches von lebenden Albumin-transgenen Zellen direkt in das Zellkulturmedium sekretiert wird, ist gemeint, dass Albumin bzw. HSA nicht als gereinigtes Protein von außen zugegeben wird.
Die Produktion von rekombinantem HSAJst im Stand der Technik wohl bekannt und kann z.B. mit Hilfe von genetisch modifizierten Hefen gewonnen werden (U.S. Pat. NO. 5,612,197). Rekombinantes HSA ist kommerziell über diverse Anbieter zu beziehen beispielsweise über Sigma-Aldrich (Recombinant HSA, Cat. No. A- 7223). Es handelt sich dabei um gereinigtes Protein, das dem Kultivierungsmedium zugesetzt werden kann.
Die Daten der vorliegenden Erfindung zeigen, dass „sekretiertes HSA" gegenüber rekombinantem HSA eine deutlich höhere Wirksamkeit / Effektivität besitzt, denn es bewirkt schon in signifikant geringeren Konzentrationen eine deutliche Steigerung der Rekonierungseffizienz.
Der Begriff „signifikant geringere Konzentration" meint in der vorliegenden Erfindung: - eine mindestens zweifach geringere Konzentration im Vergleich zu rekombinantem bzw. aufgereinigtem Albumin,
- eine mindestens fünffach geringere Konzentration im Vergleich zu rekombinantem bzw. aufgereinigtem Albumin, - eine Albuminkonzentration die mindestens Faktor 2 geringer ist als diejenige von einem vergleichbaren Kulturansatz enthaltend rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin,
- eine Albuminkonzentration die mindestens Faktor 5 geringer ist als diejenige von einem vergleichbaren Kulturansatz enthaltend rekombinantes bzw. aufgereinigtes
Albumin,
- eine Albuminkonzentration, die um den Faktor 2 bis 100, 2 bis 5, 5 bis 100, 20 bis 100, 5 bis 10 geringer ist als diejenige von einem vergleichbaren Kulturansatz enthaltend rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin, - eine Albuminkonzentration unter 200 mg/L, bevorzugt unter 100 mg/L, insbesondere bevorzugt unter 60 mg/L.
Im Unterschied zu rekombinantem HSA wird das sekretierte HSA von HSA- produzierenden Zellen einer lebenden Kultur direkt in das Reklonierungsmedium abgegeben. Es kann dabei aus drei Quellen stammen: (a) aus HSA- produzierenden Zellen einer Vorkultur, die der Herstellung von konditioniertem Medium dient, (b) HSA-produzierenden Feederzellen, oder (3) HSA- sezernierenden Wirtszellen (wenn die einzeln abgelegten Produzenten-Zellen genetisch so verändert wurden, dass sie selbst HSA sezernieren).
Die Konzentration von HSA kann durch Routine-Methoden wie einen kommerziell erhältlichen ELISA ermittelt werden (z.B. "Human Albumin ELISA Quantitation Kit", Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)
Der Begriff „Albumin- bzw. HSA-transgene Zelle", „Albumin- bzw. HSA- produzierende Zelle" oder „Albumin- bzw. HSA-sezernierende bzw. sekretierende Zelle" bezeichnet jede Zelle, die ein Albumin in das Medium abgibt. Dies kann entweder eine Zelle sein, die natürlicherweise Albumin sezerniert (z.B. eine Leberzelle) oder eine Zelle, die genetisch, beispielsweise über Einbringen eines Albumin- bzw. HSA-Expressionskonstruktes, so verändert wurde, dass sie Albumin bzw. HSA exprimiert und in das Medium abgibt. Eine bevorzugte Ausführungsform in der vorliegenden Erfindung stellen Albumin- bzw. HSA- produzierende Säugerzellen dar, besonders bevorzugt sind Albumin- bzw. HSA- produzierende Nagetierzellen, insbesondere Albumin- bzw. HSA-produzierende CHO- oder NSO-Zellen. Die genannten Begriffe wie „Albumin- bzw. HSA- transgene Zelle", „Albumin- bzw. HSA-produzierende Zelle" und „Albumin- bzw. HSA-sezernierende bzw. sekretierende Zelle" werden in der vorliegenden Anmeldung austauschbar verwendet.
Die „spezifische Produktivität" einer Zelle gibt die Menge eines bestimmten Proteins an, die von einer Zelle pro Zeiteinheit produziert, d.h. bei sekretierten Proteinen ins Medium abgegeben wird. Die spezifische Produktivität berechnet sich aus dem Quotienten der Konztentration des Produktes im Medium (=Titer, bestimmt, z.B. über ELISA) und der Anzahl der über den betrachteten Zeitraum vorhandenen produzierenden Zellen, auch bezeichnet als „IVC" (Integral der Lebendzellzahl über die Zeit). Die spezifische Produktivität wird üblicherweise in ,pcd' (= pg/cell*day = Picogramm sezerniertes Protein pro Zelle und Tag) angegeben).
Der Begriff „Klonierung/Reklonierung", „klonieren/reklonieren" meint im Zusammenhang mit Zellkultur eine Technik, mit deren Hilfe man eine Zellpopulation identischer Zellen aus einer Ursprungszelle erhalten kann. Der Ausdruck „Zellklonierung" oder auch „Einzelzellklonierung" meint somit ein Verfahren, bei dem aus einem Zellpool mit Zellen unterschiedlichen Genotyps einzelne Zellen identifiziert, isoliert und anschließend zu einer Zellpopulation bestehend aus einer Vielzahl genetisch identischer Zellen vermehrt werden. Werden die Zellen hierzu einzeln abgelegt, d.h. lediglich eine (1 ) Zelle pro Kulturgefäß, und anschließend zu einer Zellpopulation identischer Zellen expandiert, so handelt es sich bei dem Verfahren um eine „direkte Einzelzellklonierung". Werden mehrere Zellen gleichzeitig in ein Kulturgefäß abgelegt, zu einer Zellpopulation expandiert und diese durch wiederholtes Verdünnen (= limited dilution) in Zellpopulationen identischer Zellen aufgeteilt, so beschreibt dies ein Verfahren der „indirekten Klonierung".
Bei „Einzelklonen" oder „Einzelzellklonen" oder kurz „Klonen" handelt es sich um genetisch identische Zellen, die von einer (1 ) einzigen Zelle abstammen. Eine Zellpopulation bestehend aus identischen Zellen gleicher Abstammung bezeichnet man folglich auch als „monoklonale Zellpopulation". Kommt es während der Kultivierung von Zellen gleichen Ursprungs zu spontanen Genomveränderungen, beispielsweise zu Mutationen und/oder Translokationen, so werden die einzelnen Zellen dieser Zellpopulation dennoch als identische Zellen im Sinne der vorliegenden Erfindung angesehen, und die Kultur als monoklonale Zellpopulation verstanden. Dagegen handelt es sich bei einem Pool an stabil transfizierten Zellen (Transfektanten) nicht um Zellklone gleicher Abstammung, also nicht um eine monoklonale Zellpopulation, auch wenn genetisch identische Ausgangszellen mit einer identischen Nukleinsäure transfiziert werden.
Der Begriff „Subklone/Subkulturen" bezieht sich auf verschiedene Zellgenerationen, die ausgehend von einer Ursprungszelle/Ursprungskultur durch einfaches oder mehrfaches Passagieren der sich teilenden Zellen entstehen. Von „Subklonen/ Subkulturen" spricht man beispielsweise, wenn identische Zellen/Zellkulturen über mehrere Generationen kultiviert und vermehrt werden.
Der Begriff „Klonierungseffizienz" oder „Reklonierungseffizienz" ist definiert als der Prozentsatz an Zellen, die nach der Ablage überleben, sich teilen und vitale Zellpopulationen ausbilden. Werden beispielsweise bei einer Zellsortierung 100 Zellen auf 100 Kulturgefäße verteilt und wachsen 25 dieser 100 einzeln abgelegten Zellen zu Kulturen heran, so beträgt die Klonierungseffizienz 25%.
Unter einer „effektiven oder effizienten Reklonierung" versteht man eine Klonierungseffizienz von zumindest 10%, vorzugsweise von zumindest 20%, weiter bevorzugt von zumindest 30% und noch weiter bevorzugt von zumindest 40%. Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung versteht man unter einer effektiven Reklonierung eine Klonierung mit einer Effizienz von mindestens 50%, vorzugsweise von mindestens 60%, besonders bevorzugt von mindestens 70% und noch weiter bevorzugt von mindestens 80%.
Der Ausdruck „teilungsfähig/expandierbar" im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt das Potential einer Zelle/Zellpopulation sich endlos, zumindest aber über 2, vorzugsweise 4, Passagen teilen zu können. Dieses Potential kann beispielsweise durch Bestrahlung mit [137lCs- oder durch Mitomycin C Behandlung reduziert oder gänzlich gestört werden.
Der Ausdruck „Derivat/Abkömmling" bezieht sich auf Zellen, die genetisch auf eine bestimmte Ausgangszelle zurückzuführen sind und beispielsweise durch Subkultivierung (mit oder ohne Selektionsdruck) entstehen und/oder durch genetische Manipulation generiert werden. Re-Isolierungen von Zellen des gleichen Zelltyps sind ebenfalls von dem Ausdruck „Derivat/Abkömmling" erfasst. So stellen beispielsweise alle CHO-Zelllinien Derivate/Abkömmlinge der von Puck et al., 1958 isolierten Hamsterovarzellen aus Cήcetulus griseus dar, unabhängig ob sie durch Subkultivierung, Re-Isolierung oder genetische Manipulationen erhalten wurden.
Der Begriff „Feederzelle" kommt von dem englischen Worte „feed" = füttern und bezeichnet eine Ko-Kultivierung mit meist teilungsunfähigen Zellen, die dazu dienen, die eigentlich gewünschten Zellen der Kultur mit Nährstoffen und seziernierten Wachstumsfaktoren zu versorgen. Zur Herstellung werden lebende Zellen durch Bestrahlung mit UV- oder Gammastraheln oder Behandlung mit MitomycinC im Wachstum arretiert. Die resultierenden Feederzellen leben und produzieren und sezernieren Wachstumsfaktoren, können sich aber nicht mehr teilen. Der Begriff „autologe feeder-Ze\\e" meint, dass sowohl feeder-Ze\\e als auch die in Gegenwart dieser feeder-Ze\\e zu kultivierende Zelle taxonomisch dem gleichen Ursprung entstammen. Handelt es sich bei der zu kultivierenden Zelle beispielsweise um eine Hamsterzelle (Unterfamilie Cricetinae), vorzugsweise um eine Zelle der Gattung Cricetulus bzw. Mesocricetus, beispielsweise um eine CHO- bzw. BHK-ZeIIe, so stellt jede aus dieser Unterfamilie ursprünglich isolierte feec/er-Zelle eine autologe feec/er-Zelle zu diesen Hamsterzellen der Unterfamilie Cricetinae dar. Nach einer bevorzugten Ausführungsform meint der Begriff „autologe feeder- Zelle", dass sowohl feec/er-Zelle als auch die zu kultivierende Zelle taxonomisch der gleichen Gattung entstammen oder ursprünglich aus derselben Gattung isoliert wurden (Zelle aus Cricetulus bzw. Mesocricetus). Handelt es sich bei der zu kultivierenden Zelle beispielsweise um eine Hamsterzelle der Gattung Cricetulus bzw. Mesocricetus, vorzugsweise um eine CHO- bzw. eine BHK-ZeIIe, so stellt jede aus der jeweiligen Gattung ursprünglich isolierte feec/er-Zelle eine autologe feec/er-Zelle im Sinne dieser Erfindung dar.
Nach einer weiter bevorzugten Ausführungsform liegt eine „autologe feec/er-Zelle" vor, sofern feec/er-Zelle und die zu kultivierende Zelle der gleichen Art entstammen, beispielsweise Cricetulus griseus oder Mesocricetus auratus. Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt eine „autologe feec/er-Zelle" vor, sofern feec/er-Zelle und die zu kultivierende Zelle der gleichen Art entstammen und über den gleichen Gewebstropismus verfügen (z.B. Ovarzellen aus Cricetulus griseus - C HO-Zellen). Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einer feec/er-Zelle um eine autologe feec/er-Zelle, wenn sowohl feec/er-Zelle als auch zu kultivierende Zelle der gleichen Basiszelle entstammen, beispielsweise wenn es sich bei beiden Zellen ursprünglich um CHO-DG44 Zellen bzw. Abkömmlinge dieser Zelle handelt. Nach einer weiter bevorzugten Ausführungsform vermittelt die feec/er-Zelle die selben Resistenzen, z.B. gegenüber Antibiotika, wie die zu kultivierende Zelle. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn die Zellablage in Gegenwart eines Selektionsmittels, z.B. eines Antibiotikums, erfolgt. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung beschreibt insbesondere die Verwendung von HSA-produzierenden Feederzellen zur Steigerung der Reklonierungseffizienz. In einer bevorzugten Ausführungsform werden autologe HSA-produzierende Feederzellen eingesetzt.
Der Begriff „limited dilution" bezeichnet ein alternatives Verfahren zur Reklonierung. Dabei wird eine Zellsuspension seriell verdünnt und die Zellen anschließend mit unterschiedlichen Zellzahlen pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte abgelegt. In Vertiefungen mit hohen Zellzahlen werden aufgrund ausreichender Sekretion autokriner Wachstumsfaktoren mehrere oder alle Zellen überleben. Je weniger Zellen pro Vertiefung eingesäät werden, desto weniger Zellen überleben, so dass auf diese Weise die Verdünnung so eingestellt werden kann, dass statistisch pro Vertiefung nur eine Einzelzelle überlebt und zu einer monoklonalen Linie heranwächst. Da diese Methode nur statistisch zur Entstehung von Einzelzellklonen führt, durchaus aber auch mehrere Klone in einer Vertiefung hochwachsen können, ist eine mehrfache (üblicherweise 2-3-malige) Wiederholung dieses Verfahrens notwendig, um sicherzustellen, dass es sich bei der erhaltenen Zelllinie wirklich um einen einzigen Klon handelt.
Unter dem Begriff „konditioniertes Medium" versteht man Medium aus einer Kultur lebender Zellen. Die Wirkung des konditionierten Mediums beruht auf seinem Gehalt an Wachstumsfaktoren, die von den Zellen der Vorkultur in das Medium serzierniert wurden und es dadurch „konditioniert" haben. Dementsprechend bezeichnet der Begriff „Medium-konditionierende Zellen" oder „Medium-Konditionierer" Zellen, die zur Herstellung von konditioniertem Medium verwandt werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung beschreibt die Verwendung von HSA- produzierenden Zellen als Medium-Konditionierer, so dass das so erhaltene konditionierte Medium u.a. das von diesen Zellen sezernierte HSA enthält. Der Begriff „Serum" bezeichnet den zellfreien Bestandteil des Blutes. Serum enthält eine nicht definierte Mischung unterschiedlicher löslicher Proteine und Wachstumsfaktoren, die das Überleben und die Proliferation von Zellen unterstützt. Für die Zellkultur werden vornehmlich fötales Kälbererum (FCS) oder bovines Serum (FBS) eingesetzt. Übliche Konzentrationsbereiche sind 10-20% FCS oder FBS als Zusatz zum Kultivierungsmedium.
Der Begriff „serumfrei" meint Kulturmedien wie auch Kultivierungsbedingungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass Zellen in Abwesenheit von tierischem und/oder humanem Serum, vorzugsweise in Abwesenheit von jeglichen aus Serum isolierten Proteinen, vorzugsweise in Abwesenheit von nicht rekombinant gewonnenen Proteinen kultiviert werden. Folglich meint der Ausdruck „an serumfreie Bedingungen adaptierte Zellen" solche Zellen, die in Abwesenheit von tierischem oder humanem Serum bzw. Serumproteinen vermehrt werden können.
Der Begriff „proteinfrei" meint, dass das Kulturmedium keine tierischen Proteine enthält, wobei aus Bakterien, Hefen oder Pilzen isolierte Proteine nicht als tierische Proteine verstanden werden.
Der Begriff „chemisch definiert" beschreibt ein Zellkulturmedium, welches serumfrei, vorzugsweise auch proteinfrei ist, und das aus chemisch definierten Substanzen besteht. Chemisch definierte Medien bestehen somit aus einer Mischung aus vorwiegend reinen Einzelsubstanzen. Ein Beispiel für ein chemisch definiertes Medien ist beispielsweise das CD-CHO-Medium der Firma Invitrogen (Carlsbad, CA, US).
Der Ausdruck „eine in Suspension kultivierbare Zelle" bezieht sich auf Zellen, die an das Wachstum in flüssigen Kulturen („Suspensionskulturen") adaptiert sind und deren Fähigkeit zu Adhäsion an Gefäßoberflächen, beispielsweise an Zellkulturschalen / -flaschen eingeschränkt bzw. verloren gegangen ist. Zellen, die sowohl an serumfreies Wachstum als auch an das Wachstum in Suspension adaptiert sind, werden als „an serumfreies Medium adaptierte und nicht adhärente Zellen" bezeichnet. Stellt man aus solchen Kulturen feec/er-Zellen her, so handelt es sich definitionsgemäß bei diesen Zellen um „an serumfreies Medium adaptierte und nicht adhärente feec/er-Zellen".
Der Begriff Protein/Produkt von Interesse bezieht sich auf biopharmazeutisch bedeutsame Proteine/Polypeptide umfassend z.B. Antikörper, Enzyme, Cytokine, Lymphokine, Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren sowie deren Derivate bzw. Fragmente. Ein Protein / Produkt von Interesse ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt. Im Allgemeinen sind alle Polypeptide bedeutsam bzw. von Interesse, die als Agonisten oder Antagonisten wirken und/oder therapeutische oder diagnostische Anwendung finden können. Andere Proteine von Interesse sind beispielsweise Proteine/Polypeptide, die zur Veränderung der Eigenschaften von Wirtszellen im Rahmen des sogenannten „Cell Engineering" verwendet werden, wie z.B. anti-apoptotische Proteine, Chaperone, Stoffwechselenzyme, Glykosylierungsenzyme sowie deren Derivate bzw. Fragmente, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Der Ausdruck „Polypeptide" wird für Aminosäuresequenzen oder Proteine verwendet und bezeichnet Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge. Dieser
Ausdruck schließt auch Proteine ein, die posttranslational durch Reaktionen wie beispielsweise Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung oder
Proteinprozessierung modifiziert werden. Die Struktur des Polypeptids kann z.B. durch Substitutionen, Deletionen oder Insertion von Aminosäuren, Fusion mit anderen Proteinen, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität modifiziert werden. Zudem können die Polypeptide multimerisieren und Homo- und
Heteromere bilden.
Unter rekombinanten Proteinen versteht man Proteine, welche durch rekombinante Expression in Wirtszellen produziert werden. Solche rekombinanten
Proteine werden unter höchsten Reinheitsauflagen produziert, um das Kontaminationsrisiko möglichst gering zu halten. Rekombinante Proteine werden üblicherweise in passenden Wirtszellen produziert wie z.B. Hefezellen, tierische Zellen oder prokaryotische Zellen (E. coli oder andere Bakterienstämme) indem ein Expressionsvektor wie beispielsweise ein Plasmid, Bakteriophage, nakte DNA oder ein Virus benutzt wird, um das rekombinante Protein in die Wirtszelle einzuführen. Rekombinante Proteine werden üblicherweise gereinigt als konzentrierte Protein-Lösungen oder in Pulverform kommerziell angeboten. Rekombinantes HSA ist beispielsweise von diversen kommerziellen Anbietern wie Sigma Aldrich erhältlich.
Beispiele für therapeutische Proteine sind Insulin, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, humanes Wachstumshormon (hGH) und andere Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Gewebeplasminogenaktivator (tPA), Erythropoetin (EPO), Cytokine, beispielsweise Interleukine (IL) wie IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, Interferon (IFN)-alpha, beta, gamma, omega oder tau, Tumornekrosefaktor (TNF) wie z.B. TNF-alpha, beta oder gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 und VEGF. Weitere Beispiele sind monoklonale, polyklonale, multispezifische und einzelkettige (Single chain) Antikörper und Fragmente davon, wie z.B. Fab, Fab', F(ab')2, Fc und Fc'-Fragmente, leichte (L) und schwere (H) Immunglobulinketten und deren konstante, variable oder hypervariable Regionen sowie Fv- und Fd-Fragmente (Chamov et al., 1999). Die Antikörper können humanen oder nicht-humanen Ursprungs sein. Auch humanisierte und Chimäre Antikörper kommen in Frage.
Fab-Fragmente (Fragment antigen-binding = Fab) bestehen aus den variablen Regionen beider Ketten, die durch die angrenzenden konstanten Regionen zusammengehalten werden. Sie können z.B. durch Behandlung mit einer Protease, wie beispielsweise Papain, aus konventionellen Antikörpern erzeugt werden oder aber auch durch DNA-Klonierung. Weitere Antikörperfragmente sind F(ab')2-Fragmente, die durch proteolytischen Verdau mit Pepsin hergestellt werden können.
Durch Genklonierung können auch verkürzte Anti körperfrag mente hergestellt werden, die nur aus den variablen Region der schweren (VH) und der leichten
Kette (VL) bestehen. Diese werden als Fv-Fragmente (Fragment variable =
Fragment des variablen Teils) bezeichnet. Da bei diesen Fv-Fragmenten die kovalente Verbindung über die Cysteinreste der konstanten Ketten nicht möglich ist, werden diese Fv-Fragmente oft anderweitig stabilisiert. Dazu werden die variablen Region der schweren und leichten Kette häufig mittels eines kurzen
Peptidfragments von ca. 10 - 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15
Aminosäuren, miteinander verknüpft. Auf diese Weise entsteht eine einzelne
Polypeptidkette, in der VH und VL durch einen Peptidlinker miteinander verbunden sind. Solche Antikörperfragmente werden auch als single-chain Fv-Fragment (scFv) bezeichnet. Beispiele von scFv-Antikörpern sind bekannt und beschrieben, siehe z.B. Huston et al. (1988).
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Strategien entwickelt um multimere scFv-Derivate herzustellen. Die Intention besteht in der Erzeugung von rekombinanten Antikörpern mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften und verstärkter Bindungsavidität. Zur Erreichung der Multimerisierung der scFv- Fragmente werden diese als Fusionsproteine mit Multimerisierungsdomänen hergestellt. Als Multimerisierungsdomänen können dabei z.B. die CH3-Region eines IgGs oder Helixstrukturen („coiled coil structure") wie die Leucin-Zipper- Domänen fungieren. In anderen Strategien wird die Interaktion zwischen den VH- und VL-Regionen des scFv-Fragments für eine Multimerisierung genutzt (z.B. Dia- , Tri- und Pentabodies).
Als „Diabody" bezeichnet ein Fachmann ein bivalentes homodimeres scFv- Derivat. Die Verkürzung des Peptidlinkers im scFv-Moleküle auf 5 - 10
Aminosäuren resultiert in der Bildung von Homodimeren durch Überlagerung von VHA/L-Ketten. Die Diabodies können zusätzlich durch eingeführte Disulfidbrücken stabilisiert werden. Beispiele von Diabodies finden sich in der Literatur, z.B. bei Perisic et al. (1994).
Als „Minibody" bezeichnet der Fachmann ein bivalentes, homodimeres scFv- Derivat. Es besteht aus einem Fusionsprotein, das die CH3-Region eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, besonders bevorzugt IgGI , als Dimehsierungsregion enthält. Diese verbindet die scFv-Fragmente über eine Hinge-Region, ebenfalls von IgG, und eine Linker-Region. Beispiele solcher Minibodies sind bei Hu et al. (1996) beschrieben.
Mit „Thabody" bezeichnet der Fachmann ein trivalentes homothmeres scFv- Derivat (Kortt et al., 1997). Die direkte Fusion von VH-VL ohne Verwendung einer Linkersequenz führt zur Ausbildung von Trimeren.
Bei den vom Fachmann als Mini-Antikörper bezeichneten Fragmenten, die eine bi- , tri- oder tetravalente Struktur haben, handelt es sich ebenfalls um Derivate von scFv-Fragmenten. Die Multimehsierung wird dabei über di-, tri- oder tetramere „coiled coil"-Strukturen erzielt (Pack et al., 1993 und 1995; Lovejoy et al., 1993).
Der Begriff „Antikörper-Fusion" oder „Antikörper-Fusionsprotein" bezeichnet die Fusion/Kopplung eines Proteins mit einem Antikörper oder einem Teil eines Antikörpers. Insbesondere zählen dazu gentechnisch hergestellt Fusionsproteine, bei denen ein therapeutisches Protein an den Fc-Teil eines Antikörpers gekoppelt wird, um auf diese Weise eine die Halbwertszeit / Stabilität des Proteins im Serum zu erhöhen. Der Begriff umfasst auch Antikörper-Fusionen, die aus einem Peptid und einem Antikörper oder einem Teil eines Antikörpers bestehen.
Im Rahmen der Erfindung bevorzugte Wirtszellen sind Hamsterzellen wie z.B. BHK21 , BHK TK", CHO, CHO-K1 , CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 und CHO-DG44
Zellen oder Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien. Besonders bevorzugt sind CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 und BHK21 Zellen, insbesondere CHO-DG44 und CHO-DUKX Zellen. Ebenfalls geeignet sind Myelomzellen der Maus, vorzugsweise NSO und Sp2/0 Zellen sowie Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien.
Beispiele für Hamster- und Mäusezellen, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Aber auch Derivate und Abkömmlinge dieser Zellen, andere Säugerzellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Zelllinien von Mensch, Maus, Ratte, Affen, Nagetieren, oder eukaryontische Zellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hefe-, Insekten- , Vogel- und Pflanzenzellen, können ebenfalls als Wirtszellen zur Produktion von biopharmazeutischen Proteinen verwendet werden.
Tabelle 1 : Bekannte Produktionszelllinien
Erfindungsgemäß sind insbesondere rekombinante Säugerzellen, vorzugsweise Nagerzellen, besonders murine Zellen wie NSO und Hamsterzellen wie z.B. CHO- oder BHK-Zellen bevorzugt
Wirtszellen sind bevorzugt, wenn sie etabliert, adaptiert und komplett unter serumfreien Bedingungen kultiviert werden. Besonders bevorzugt sind Wirtszellen, die zusätzlich in Medium etabliert, adaptiert und komplett kultiviert werden, welches nicht nur serumfrei ist, sondern auch noch frei von jeglichen Proteinen /Peptiden tierischen Ursprungs.
Kommerziell erhältliche Medien wie Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invtirogen), serumfreies CHO Medium (Sigma), und proteinfreies CHO Medium (Sigma) sind Beispiele passender Nährlösungen.
Der Begriff „Produktionszelle,, oder „Produzenten-Zelle" oder „Produktionsklon" bezeichnet eine Zelle, die in einem Prozess zur Herstellung eines Proteins verwendet wird. Insbesondere gehören dazu genetisch-veränderte Zellen, die zur industriellen Produktion von recombinanten Proteinen eingesetzt werden. Im Rahmen dieser Erfindung bezeichnet der Begriff vor allem genetisch-veränderte eukaryontische Wirtszellen, die ein recombinantes Protein exprimieren und zur Herstellung dieses Proteins eingesetzt werden. Darunter fallen insbesondere monoklonale Zelllinien zur Produktion von therapeutischen Proteinen.
Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Kultivierung einer einzelnen Zelle umfassend die folgenden Schritte: (a) Kultivierung einer Zellpopulation, (b) Isolierung einer einzelnen Zelle aus besagtem Zellpool und (c) Kultivierung der besagten Einzelzelle in einem konditionierten Medium, i) welches Albumin, bevorzugt humanes Serum Albumin (HSA), enthält, das von lebenden Albumintransgenen Zellen direkt in besagtes Medium sekretiert wird. In einer spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei das in Verfahrensschritt c) von lebenden Albumin-transgenen Zellen sezernierte Albumin bei signifikant geringerer Konzentration den gleichen Effekt auf die Reklonierungseffizienz erzielt wie rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin. Die Erfindung beschreibt insbesondere ein Verfahren zur Kultivierung einer einzelnen Zelle umfassend die folgenden Schritte: (a) Kultivierung einer Zellpopulation, (b) Isolierung einer einzelnen Zelle aus besagtem Zellpool und (c) Kultivierung der besagten Einzelzelle in einem konditionierten Medium, i) welches Albumin, bevorzugt humanes Serum Albumin (HSA), enthält, das von lebenden Albumin-transgenen Zellen direkt in besagtes Medium sekretiert wird, ii) wobei das von lebenden Albumin-transgenen Zellen sezernierte Albumin bei signifikant geringerer Konzentration den gleichen Effekt auf die Reklonierungseffizienz erzielt wie rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin. In einer spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei das von lebenden Albumin-transgenen Zellen sezernierte Albumin bereits in mindestens zweifach geringerer Konzentration den gleichen Effekt auf die Reklonierungseffizienz erzielt wie rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin. In einer bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei das von lebenden Albumin-transgenen Zellen sezernierte Albumin bereits in mindestens fünffacher geringerer Konzentration den gleichen Effekt auf die Reklonierungseffizienz erzielt wie rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin. In einer spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei die Albuminkonzentration in i) mindestens Faktor 2 geringer, bevorzugt mindestens Faktor 5 geringer ist als diejenige von einem vergleichbaren Kulturansatz enthaltend rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei die einzelne Zelle in Schritt (b) und (c) ein Protein von Interesse exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Verfahrensschritt c) unter serumfreien Bedingungen durchgeführt, vorzugsweise unter Verwendung von chemischdefiniertem und/oder Insulin-freiem Medium. In einer spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei Albumin in Verfahrensschritt (c) in einer Konzentration unter 200 mg/L enthalten ist, bevorzugt unter 100 mg/L, insbesondere bevorzugt unter 60 mg/L. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei Albumin in Verfahrensschritt (c) ii) in einer um den Faktor 2 bis 100, 2 bis 5, 5 bis 100, 20 bis 100 bzw. 5 bis 10 geringeren Konzentration enthalten ist, bevorzugt mindestens in einer um den Faktor 5 geringeren Konzentration, besonders bevorzugt mindestens in einer um den Faktor 10 geringeren Konzentration.
In einer bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei in Verfahrensschritt (c) der Zellüberstand lebender Albumintransgenen Zellen zugesetzt wird, welcher zwischen dem Kultivierungstag 1 bis 4 entnommen wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei in Verfahrensschritt (c) der Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen zugesetzt wird, welcher am Kultivierungstag 2 entnommen wird.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei der Zellüberstand von einer Zellkultur mit 1 bis 4 Millionen, bevorzugt von 1 bis 2 Millionen Albumin-transgener Zellen / ml entnommen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Zellüberstand von einer Zellkultur mit 1 bis 4 Millionen, bevorzugt von 1 bis 2 Millionen Albumin-transgener Zellen / ml entnommen und die Albuminkonzentration in i) ist mindestens Faktor 5 bis 10, bevorzugt um mindestens Faktor 10 geringer ist als diejenige von einem vergleichbaren Kulturansatz enthaltend rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei das konditionierte Medium in Verfahrensschritt c) durch Zugabe von lebenden Albumin-transgenen Feeder-Zellen erzeugt wird. Bevorzugt werden hierbei höchstens 50 0000 Albumin-transgene Feederzellen / ml zugegeben. Weiterhin bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren wobei die Albumin-transgenen Feederzellen kontinuierlich über einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen im Medium von Verfahrensschritt c) verbleiben. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das konditionierte Medium in Verfahrensschritt c) durch Zugabe von lebenden Albumin-transgenen Feeder- Zellen erzeugt wobei 50 0000 Albumin-transgene Feederzellen / ml oder weniger zugegeben werden und wobei die Albuminkonzentration in i) um mindestens Faktor 5 bis 100, bevorzugt um Faktor 20 bis 100 (bevorzugt auch um einen Faktor größer als 100) geringer ist als diejenige von einem vergleichbaren Kulturansatz enthaltend rekombinantes bzw. aufgereinigtes Albumin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei das konditionierte Medium in Verfahrensschritt (c) dadurch erzeugt wird, dass die einzelne Zelle aus Verfahrensschritt (b) und (c) eine Albumin-transgene Zelle ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die einzelne Zelle sowohl transgen für Albumin als auch für ein Gen von Interesse und die einzelne Zelle produziert sowohl Albumin als auch gleichzeitig ein Protein von Interesse. In einer spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wobei in Verfahrensschritt c) a) lebende Albumin-transgene Feeder-Zellen zugegeben werden oder b) der Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen, welcher zwischen dem Kultivierungstag 1 bis 4, bevorzugt am Kultivierungstag 2, entnommen wird, zugegeben wird.
Die Erfindung zudem beschreibt eine Zelle, die nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren generiert wird.
Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Produktion eines Proteins von Interesse in einer Zelle, bevorzugt einer CHO Zelle, bevorzugt unter Serum- freien Kultivierungsbedingungen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung einer Zellpopulation, welche ein Gen von Interesse enthält, welches für ein Protein von Interesse kodiert, b) Kultivierung dieser Zellen unter Kultivierungsbedingungen, die ein Wachstum der Zellen ermöglicht, c) Isolierung und Deponierung einer einzelnen Zelle in ein Gefäß, z.B. in eine 96-Lochplatte, d) Kultivierung der besagten einzelnen Zelle in konditioniertem Medium in Gegenwart von a) Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen, welcher zwischen dem Kultivierungstag 1 bis 3, bevorzugt am
Kultivierungstag 2, entnommen wird, oder b) lebenden Albumin-transgenen Feeder-Zellen, e) Selektion einer Zelle entsprechend ihrem Expressionslevel an Protein von Interesse, f) Ernte des Proteins von Interesse, beispielsweise durch Abtrennung der Zellanteile vom Überstand, und g) Aufreinigung des Proteins von Interesse.
In einer spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein rekombinantes Protein ist, bevorzugt ein therapeutisches Protein, bevorzugt ein Antikörper oder ein Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment. In einer spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren dadurch charakterisiert, dass die einzelne Zelle eine Hamster- oder Mauszelle ist, bevorzugt eine Maus-Myelomzelle, insbesondere bevorzugt eine CHO- oder BHK-ZeIIe oder eine NSO Zelle. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren dadurch charakterisiert, dass die lebende Albumin-transgene Zelle von der gleichen Spezies stammt wie die einzeln abgelegte Zelle. Bevorzugt ist die Zelle eine „Chinese Hamster Ovary" (CHO) Zelle. Weiterhin bevorzugt ist die Zelle eine Hamster- oder Mauszelle, ebenso bevorzugt eine Maus-Myelomzelle, insbesondere bevorzugt eine CHO- oder BHK-ZeIIe oder eine NSO Zelle, je nach Spezies der einzeln abgelegten Zelle. In einer speziellen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren dadurch charakterisiert, dass es sich um autologe Albumin-transgene Zellen bzw. Feeder-Zellen handelt. In einer weiteren speziellen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren dadurch charakterisiert, dass die die Isolierung einer einzelnen Zelle in Schritt b) durch "limited dilution" oder mit Hilfe eines "fluorescence activated cell sorting" (FACS)-Gerätes erreicht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren dadurch charakterisiert, dass die einzelne Zelle in Schritt (b) und (c) ein Protein von Interesse exprimiert. Insbesondere ist das Protein von Interesse ein therapeutisches Protein, bevorzugt ein Antikörper, ein Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment.
Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Protein, welches nach einem erfindungsgemäß beschriebenen Verfahren hergestellt wird.
Die Erfindung beschreibt zudem ein Verfahren zur Selektion einer Produktionszelle, wobei ein erfindungsgemäßes Verfahren angewendet wird. Die Erfindung beschreibt weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Produktionszelle für die biopharmazeutische Proteinherstellung. Die Erfindung beschreibt zudem ein Serum-freies konditioniertes Kulturmedium, welches die Kultivierung einer einzelnen Zelle ermöglicht, enthaltend: a) Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen, welcher zwischen dem Kultivierungstag 1 bis 4, bevorzugt am Kultivierungstag 2, entnommen wird, oder b) lebende Albumin-transgene Feeder-Zellen zur Konditionierung des Mediums. Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Medium eine Albuminkonzentration unter 200 mg/L, weiterhin bevorzugt unter 100 mg/L, insbesondere bevorzugt unter 60 mg/L. Bevorzugt werden autologe Feeder-Zellen verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Medium dadurch charakterisiert, dass die darin kultivierte einzelne Zelle eine CHO Zelle ist. Insbesondere bevorzugt exprimiert diese einzelne Zelle ein Protein von Interesse.
Beim Praktizieren der vorliegenden Erfindung werden, sofern nicht anderweitig angegeben, dem Fachmann allgemein bekannte und konventionelle Techniken aus der Zellbiologie, Molekularbiologie, der Zellkultur, der Fermentationstechnik etc. angewendet. Die folgenden experimentellen Angaben haben illustrativen Charakter und sind nicht limitierend.
EXPERIMENTELLER TEIL
MATERIAL UND METHODEN
KULTIVIERUNG DER ZELLEN
Die Zellen CHO-DG44/dhfr~Λ (Urlaub et al., 1983) werden permanent als Suspensionszellen in serum-freiem und mit Hypoxanthin und Thymidin supplementiertem HyQ SFM 4 CHO Medium (HyClone) oder Bl-eigenes Medium in Zellkulturflaschen bei 37°C in feuchter Atmosphäre und 5% CO2 kultiviert. Die Zellzahlen sowie die Viabilität werden mit einem CEDEX Cell Counter (Innovatis, DE) oder durch Trypanblau-Färbung bestimmt und die Zellen dann in einer Konzentration von 1 - 3 x105/mL eingesät und alle 2 - 3 Tage passagiert. Für die Einzelzellklonierung werden rekombinante CHO-DG44 verwendet Die Kultivierung klonierter rekombinanter Zellen erfolgt analog zu diesen Zellen. Als Medium wird ebenfalls HyQ Medium, Ex-CeII Medium (JRH, USA) oder Bl-eigenes Medium ohne Hypoxanthin und Thymidin verwendet.
Die Zellen NSO lassen sich permanent als Suspensionszellen in serum-freiem Hybridoma Medium, Animal component free Medium (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA) in Zellkulturflaschen bei 37°C in feuchter Atmosphäre und 5% CO2 kultivieren. Die Zellzahlen sowie die Viabilität kann mit einem CEDEX Cell Counter (Innovatis, DE) oder durch Trypanblau-Färbung bestimmt werden und die Zellen werden dann in einer Konzentration von 1 - 3 x105/mL eingesät und alle 2 - 3 Tage passagiert.
HERSTELLUNG VON FEEDER-ZELLEN DURCH BESTRAHLUNG Serum- und proteinfrei wachsende suspendierte CHO-Zellen (nicht transfizierte
Zellen), werden bei 180g für 10 Minuten abzentrifugiert und auf eine
Zellkonzentration von 1 x 106/mL in HBSS (Hank's balanced salt Solution) eingestellt.
Danach erfolgt die Bestrahlung der Zellen mit einer radioaktiven Bestrahlungsquelle (Cs137-Strahler, Gammacell 2000, Fa. Molsgaard Medical
A/S, Dänemark) mit einer Energiedosisleistung von 4Gy/min. Nach der Bestrahlung werden die Zellen mit ca. 10000 Zellen/Vertiefung in 96-Loch- Mikrotiterplatten in dem für die Zelle spezifischen Ex-CeII Medium (JRH, USA) oder Bl-eigenem Medium (z.B. TH-9 ) Medium eingesät und bei ca. 37°C und 5% CO2 in Brutraumatmosphäre gelagert. Die Herstellung von HSA-produzierenden Feederzellen erfolgt in gleicher Weise. Das Verfahren wird entsprechend mit NSO-Zellen durchgeführt, wobei die feeder- Zellen in dem jeweils für die Zellen spezifischen Medium gehalten/eingesät werden.
HERSTELLUNG VON KONDITIONIERTEM MEDIUM
Das konditionierte Medium wird aus dem Überstand einer tierischen Zellkultur erhalten. Die Zellen werden mit einer adäquaten Einsaatdichte eingesetzt und für 1 -7 Tage kultiviert. Der Überstand wird durch Zentrifugation von den Zellen getrennt und anschließend sterilfiltriert. Das erhaltene Filtrat wird als konditioniertes Medium eingesetzt.
BESTIMMUNG DER HSA-KONZENTRATION DURCH ELISA
Die HSA-Konzentration wird mit Hilfe des Human Albumin ELISA Quantitation Kit der Firma Bethyl (Cat.-No. E80-129) nach Herstellerangaben bestimmt.
FACS-BASIERTE ZELLABLAGE
Die automatische Zellablage (Einzel- oder Mehrzellablage) wird mit einem mit Argon-Laser (488nm) bestückten Flow Cytometer (Coulter EPICS Altra (Fa. Beckman-Coulter, Miami, FL, USA) mittels Autoclone-Einheit durchgeführt. Die Zellen werden hierbei in der exponentiellen Wachstumsphase abzentrifugiert und auf eine passende Zellkonzentration in Puffer aufgenommen. Anschließend werden die Zellen mit der „Hypersort-Option" mit einer Geschwindigkeit von 8000- 12000 Zellen/Sekunde nach ihrer Lage im Streulicht sortiert. Zellen, die ein Fluoreszenzprotein exprimieren, lassen sich alternativ gemäß ihrer Fluoreszenzintensität in Bezug auf das intrazellulär exprimierte Fluoreszenzprotein sortieren. Die Zellen werden jeweils einzeln in (optional) mit feeder-Zellen bestückten 96-Loch Mikrotiterplatten abgelegt.
Bei der Sortierung von CHO-Zellen erfolgt die Zellablage in Ex-CeII Medium (JRH, USA) oder Bl-eigenem Medium mit den entsprechenden Supplementen an HSA und vorzugsweise IGF oder Insulin.
Für NSO-Zellen erfolgt die Zellablage entsprechend in Hybridoma Medium, Animal component free Medium (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA).
BERECHNUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ Die Reklonierungseffizienz berechnet sich aus dem Quotienten positive Vertiefungen je Platte/Gesamtvertiefungen je Platte. Als positive Vertiefungen werden Vertiefungen angesehen, in denen sich genau ein Klon befindet.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 : HERSTELLUNG HSA-PRODUZIERENDER CHO-ZELLEN Serum-frei in Suspension wachsende CHO-DG44 Zellen (Urlaub und Chasin, 1980) werden mit einem Plasmid transfiziert, das eine Expressionskassette für humanes Serum-Albumin (HSA) und DHFR als Selektionsmarker trägt. Durch anschließende Kultivierung in HT-freiem Medium werden stabil transfizierte HSA- Zellpools hergestellt. Mit Hilfe eines HSA-spezifischen ELISA werden diejenigen Pools ausgewählt, die am meisten HSA sekretieren. Diese werden einer Genamplifizierung durch Kultivierung in Anwesenheit von Methotrexat (MTX) unterworfen. Über eine anschließende Limited Dilution werden aus der anfangs heterogenen Zellpopulation HSA-produzierende Zelllinien hergestellt und diese wiederum auf ihre spezifische HSA-Produktivität gestestet. Diese Linien werden durch Kultivierung in Medium mit erhöhter MTX-Konzentration einer weiteren Runde der Gen-Amplifikation unterzogen, um die HSA-Sekretionsrate weiter zu steigern. Da MTX zugleich zu eine Reduktion des Zellwachstums führen kann, werden die erhaltenen Zelllinien anschließend sowohl auf erhöhte Produktivität als auch ihre Wachstumseigenschaften hin untersucht und die Zelllinie mit der höchsten Produktivität bei gutem Wachstum ausgewählt. Von dieser Zelle wird eine Zellbank hergestellt, auf die bei allen künftigen Versuchen zurückgegriffen werden kann.
BEISPIEL 2: STEIGERUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ DURCH VERWENDUNG VON KONDITIONIERTEM MEDIUM VON HSA- PRODUZIERENDEN ZELLEN Eine mögliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung von HSA-produzierenden Zellen zur Steigerung der Reklonierungseffizienz. Dabei wird vor der Reklonierung eine Kultur HSA- produzierender Zellen angesetzt, die über mehrere Tage das Kulturmedium konditionieren, d.h. Wachstumsfaktoren und v.a. das von ihnen sezernierte HSA in das Medium abgeben. Am Tag der Reklonierung wird dieses konditionierte Medium durch Zentrifugation von den lebenden HSA-produzierenden Zellen abgetrennt, filtriert (optional) und 1 :1 dem Reklonierungsmedium zugegeben. Um die optimale Zeitdauer der Medien-Konditionierung zu ermitteln, wird konditioniertes Medium aus einer 2, 3, 4, 5, 6, und 7 Tage alten Kultur gewonnen und für den Reklonierungsversuch eingesetzt. Als Positiv-Kontrolle dient frisches Medium, dem 500 mg/L gereinigtes, recombinantes HSA zugesetzt wurde. Wie in Figure 2A,B zu sehen, führt die Vewendung von konditioniertem Medium HSA-produzierender Zellen zu einer deutlichen Steigerung der Einzelzellablagen- Effizienz gegenüber der Negativ-Kontrolle. Durch Zugabe von rekombinantem HSA (Pos. Kontrolle) erhöht sich die Reklonierungseffizienz ebenfalls, jedoch nicht so stark wie durch das 2-5 Tage konditionierte Medium HSA-sezernierender Zellen. Die HSA-Konzentration im konditioniertem Medium steigt über die Zeit kontinuierlich an, dennoch fällt die Reklonierungseffizienz bei Verwendung von Medium, das länger als 5 Tage konditioniert wurde, ab. Überraschenderweise wird die höchste Effizienzsteigerung durch konditioniertes Medium von Tag 2, 3 oder 4 erzielt, in dem die HSA-Konzentration mit 10-ca. 60 mg/L viel geringer ist als die in der Positiv-Kontrolle verwendete Konzentration von rekombinantem HSA. Dies zeigt, dass das sezernierte HSA schon in geringen Konzentrationen aktiv ist und im Vergleich zu rekombinantem HSA eine um den Faktor 5-50 höhere Effektivität im Bezug auf die Steigerung der Reklonierungseffizienz besitzt.
BEISPIEL 3: STEIGERUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ IN UNTERSCHIEDLICHEN MEDIEN Um zu testen, ob die beobachtete Steigerung der Reklonierungseffizienz durch Verwendung von konditioniertem Medium HSA-produzierender Zellen Medienunabhängig funktioniert, werden einzelne Zellen unterschiedlichen Medien rekloniert: In einem Ansatz wird die einzelne Zelle in Bl-eigenes Medium in Anwesenheit von CHO-DG44 Feederzellen abgelegt (Abbildung 3A), einem einem weiteren in einem kommerziellen Medium ohne Feederzellen (Abbildung 3B). In beiden Medien führt der Einsatz des konditioniertem Mediums HSA- seziernierender Zellen zu einer deutlichen Steigerung der Reklonierungseffizienz, die sowohl höher ist als in der Negativ-Kontrolle, als auch in der Positiv-Kontrolle, bei der dem Reklonierungsmedium rekombinantes HSA zugesetzt wurde. Im Ansatz ohne Feederzellen in kommerziellem Medium überleben in der negativ- Kontrolle keine Zellen, durch die Verwendung des konditionierten Mediums HSA- produzierender Zellen können aber 5-13% Reklonierungseffizienz erzielt werden. In beiden Versuchen zeigt sich erneut, dass das sezernierte HSA aus dem konditionierten Medium in deutlich geringeren Konzentrationen wirkt und damit effizienter ist als rekombinant dem Medium zugesetztes HSA.
BEISPIEL 4: STEIGERUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ DURCH HSA- PRODUZIERENDE FEEDERZELLEN
Konditioniertes Medium Medium aus einer Vorkultur HSA-produzierender Zellen wird dem Reklonierungsmedium einmalig vor der Saat der einzeln abgelegten Zellen zugefügt. Diese erhalten also nur zu Beginn während der dreiwöchigen Phase des Hochwachsens nach der Reklonierung nur einmalig HSA-enthaltendes Medium. HSA-produzierende Feederzellen könnten demgegenüber die hochwachsenden Einzelzellklone kontinuierlich mit HSA versorgen. Um zu untersuchen, ob die Verwendung HSA-produzierender Feederzellen zu einer weiteren Steigerung der Reklonierungseffizienz führt, werden CHO-DG44- Zellen einzeln in je vier 96-well-Platten mit HSA-produzierenden und nicht HSA- produzierenden Feederzellen abgelegt. Wie im Beispiel zuvor enthält das Reklonierungsmedium 50% konditioniertes Medium aus einer HSA- produzierenden Vorkultur. Nach drei Wochen werden die hochgewachsenen monoklonalen Zellkolonien in jeder Zellkulturplatte ausgezählt und die Reklonierungseffizienz berechnet.
Wie Abbildung 4 zeigt, ist die Reklonierungseffizienz bei Verwendung von HSA- produzierenden Feederzellen deutlich höher als in den Platten mit normalen Feederzellen. Die Steigerung beträgt ca. 25%. Demnach kann durch die Kombination von HSA-konditioniertem Medium und HSA-produzierenden Feederzellen eine weitere signifikante Steigerung der Reklonierungseffizienz erreicht werden. BEISPIEL 5: HSA-PRODUZIERENDE WIRTSZELLEN ZEIGEN EINE
GESTEIGERTE REKLONIERUNGSEFFIZIENZ
Eine weitere Möglichkeit zur Steigerung der Reklonierungseffizienz könnte darin bestehen, HSA-produzierende Wirtszellen zur Produktion eines therapeutischen Proteins einzusetzen. Auf diese Weise könnten bei der Reklonierung die einzeln abgelegten Produzentenzellen selbst HSA produzieren und sich über einen autokrinen Loop selbst stimulieren. Um zu prüfen, ob dieses Verfahren in der Tat zu erhöhten Reklonierungseffizienzen führt, werden sowohl normale CHO-DG44 Zellen als auch HSA-produzierende Zellen jeweils einzeln auf DG44- und HSA- produzierende Feederzellen ausgesät. Nach drei Wochen werden die hochgewachsenen Kolonien ausgezählt und die Reklonierungseffizienz für alle drei Ansätze berechnet. In Abbildung 5 ist zu sehen, dass die Reklonierungseffizienz in den Kulturplatten mit unveränderten CHO-DG44 Wirts- und Feederzellen am geringsten ist. Werden dagegen HSA-produzierende Zellen rekloniert, wachsen bereits mehr monoklonale Kolonien hoch. Dies zeigt, dass die Wahrscheinlichkeit einer HSA- produzierenden Zelle, die Reklonierung zu überleben und eine vermehrungsfähige Kultur zu bilden, höher ist als die einer Zelle, die kein HSA sekretiert. Die größte Steigerung der Reklonierungseffizienz wird durch Kombination erreicht, indem eine HSA-produzierende Wirtszelle auf HSA-produzierende Feederzellen ausgesät wird. Dieser Ansatz führt zu einer weiteren Steigerung der Reklonierungseffizienz von über 40%. Gegenüber dem Kontrollansatz ohne HSA- produzierende Feederzellen kann sogar eine über 50%-ige Steigerung erzielt werden.
BEISPIEL 6: GESTEIGERTE REKLONIERUNGEFFIZIENZ VON NSO-ZELLEN Die vorangegangenen Experimente zeigen, dass die Reklonierungseffizienz von Hamster-Zellen durch sekretiertes humanes Serum-Albumin gesteigert werden kann. Diese Ergebnisse lassen erwarten, dass sich HSA spezies-übergreifend positiv auf die Reklonierungseffizienz auswirkt. Um diese Hypothese zu testen, werden murine NSO Hybridomzellen, die ein therapeutisches Protein produzieren, einer Reklonierung unterworfen. Dabei werden sie zum einen in frisches Medium abgelegt, zum anderen in Medium, dem konditioniertes Medium einer HSA-produzierenden CHO-Zellkultur beigefügt wurde und in einem dritten Ansatz auf HSA-produzierende Feederzellen.
Gegenüber der Reklonierung in frischem Medium oder konditioniertem Medium einer Zellkultur nicht HSA-sezernierender Zellen wirkt sich die Verwendung HSA- produzierender Zellen positiv auf die Reklonierungseffizienz aus. Dies gilt sowohl für die Verwendung von konditioniertem Medium HSA-seziernierender Zellen als auch von HSA-produzierenden Feederzellen.
Dies zeigt, dass humanes HSA, das aus Hamster-Zellen sezerniert wird, die Reklonierung von murinen Zellen unterstützen kann.
BEISPIEL 7: VERWENDUNG VON SEZERNIERTEM HSA STEIGERT DIE REKLONIERUNGEFFIZIENZ VON HUMANEN-ZELLEN
Um diese Erkenntnis auf eine noch breitere Basis zu stellen, werden humane HEK293-basierte Produktionszellen in An- und Abwesenheit von konditioniertem Medium HSA-produzierender Zellen rekloniert. Gegenüber der Reklonierung in frischem Medium oder konditioniertem Medium einer'Zellkultur nicht HSA-sezernierender Zellen wirkt sich die Verwendung HSA- produzierender Zellen positiv auf die Reklonierungseffizienz aus. Dies gilt sowohl für die Verwendung von konditioniertem Medium HSA-seziernierender Zellen als auch von HSA-produzierenden Feederzellen. Daraus kann geschlossen werden, dass die Wirkung von sekzerniertem HSA die Reklonierungseffizienz von einzeln abgelegten Zellen mehrerer Spezies wirkt, also Tierart-übergreifend gültig ist. BEISPIEL 8: GESTEIGERTE REKLONIERUNGSEFFIIZIENZ DURCH HSA- PRODUZIERENDE ZELLEN ERHÖHT DIE WAHRSCHEINLICHKEIT DER IDENTIFIZIERUNG VON HOCHPRODUZENTEN-ZELLEN Die Höhe der spezifischen Produktivität von Produzentenzellen in einer heterogenen Zellpopulation ist normalverteilt. Dies bedeutet, dass die meisten Zellen eine mittlere Produktivität zeigen, während wenige Zellen viel und nur ein sehr geringer Prozentsatz sehr viel rekombinantes Produkt produzieren. Dieser Umstand erklärt den Aufwand, der in industriellen Zelllinien-Entwicklungsprogrammen auf das Zell-Screening und die Identifizierung von Hochproduzenten-Zellen verwandt wird. Es bedeutet zugleich auch, dass die Wahrscheinlichkeit, diese Hochproduzenten zu finden, direkt mit der Reklonierungseffizienz korreliert: Je mehr Zellen nach Reklonierung hochwachsen, desto wahrscheinlicher ist es, dass sich unter diesen eine Hochproduzentenzelle befindet. Um dies in der Praxis zu verifizieren, wird eine heterogene Population von stabil- transfizierten CHO-Produzentenzellen, die eine therapeutisches Protein sezernieren, einer Reklonierung unterzogen. Dabei werden sie einmal in Reklonierungsmedium abgelegt, dem 50% konditioniertes Medium der parentalen CHO-DG44-Zelle zugegeben wurde (Ansatz 1 ), und einmal in 50% konditioniertes Medium aus einer Kultur HSA-produzierender Zellen (Ansatz 2). Wie in den vorherigen Beispielen wachsen in den Ansätzen, in denen Medium HSA-produzierender Zellen verwandt wurde, mehr Zellen zu klonalen Zelllinien heran.
Von beiden Reklonierungs-Bedingungen werden im nächsten Schritt 100 Klone ausgewählt und ihre Produktivität durch einen produkt-spezifischen ELISA bestimmt. Die Verteilung der spezifischen Produktivität über diese jeweils 100 Klone zeigt in beiden Fällen eine Normalverteilung. In den 100 Klonen, die aus den Zellen hochgewachsen sind, die unter Verwendung von Medium aus HSA- konditioniertem Medium rekloniert wurden (Ansatz 2), ist der Mittelwert dieser Kurve aber signifikant nach rechts hin zu höheren Produktivitäten verschoben. Auch der Mittelwert der Produktivität der 10 höchst-produzierenden Zellen aus diesem Ansatz 2 ist höher als derjenige der 10 höchsten Zelllinien aus dem Reklonierungsansatz ohne HSA-produzierende Zellen (Ansatz 1 ). Entsprechend stammt auch die Zelllinie, die als höchst-produzierender Klon für die Produktion des therapeutsichen Proteins ausgewählt wird, aus Ansatz 2. Dies bestätigt, dass aus dem Reklonierungsansatz mit HSA-produzierenden Zellen tatsächlich mehr Zellen mit höheren Produktivitäten erhalten werden, wodurch sich die Wahrscheinlichkeit, diese zu identifizieren. Zugleich steigt damit auch die Wahrscheinlichkeit, die wenigen Zellen zu finden, die das rekombinante Protein-Produkt in sehr hohen Raten produzieren und damit einen Hoch- Produzenten-Klon für die Produktion auswählen und einsetzen zu können.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Kultivierung einer einzelnen Zelle umfassend die folgenden
Schritte: (a) Kultivierung einer Zellpopulation,
(b) Isolierung einer einzelnen Zelle aus besagtem Zellpool und
(c) Kultivierung der besagten Einzelzelle in einem konditionierten Medium, welches Albumin, bevorzugt humanes Serum Albumin (HSA), enthält, das von lebenden Albumin-transgenen Zellen direkt in besagtes Medium sekretiert wird.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das in Verfahrensschritt c) von lebenden Albumin-transgenen Zellen sezernierte Albumin bei signifikant geringerer Konzentration den gleichen Effekt auf die Reklonierungseffizienz erzielt wie rekombinantes bzw. aufgereinigtes
Albumin.
3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Albumin in Verfahrensschritt (c) in einer Konzentration unter 200 mg/L enthalten ist, bevorzugt unter 100 mg/L, insbesondere bevorzugt unter 60 mg/L.
4. Das Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei in Verfahrensschritt (c) der Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen zugesetzt wird, welcher zwischen dem Kultivierungstag 1 bis 4 entnommen wird.
5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei in Verfahrensschritt (c) der Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen zugesetzt wird, welcher am Kultivierungstag 2 entnommen wird.
6. Das Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei der Zellüberstand von einer Zellkultur mit 1 bis 4 Millionen, bevorzugt von 1 bis 2 Millionen Albumin- transgener Zellen / ml entnommen wird.
7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das konditionierte Medium in Verfahrensschritt c) durch Zugabe von lebenden Albumintransgenen Feeder-Zellen erzeugt wird.
8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei höchstens 50 0000 Albumin- transgene Feederzellen / ml zugegeben werden.
9. Das Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Albumin-transgenen Feederzellen kontinuierlich über einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen im Medium von Verfahrensschritt c) verbleiben.
10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das konditionierte Medium in Verfahrensschritt (c) dadurch erzeugt wird, dass die einzelne Zelle aus Verfahrensschritt (b) und (c) eine Albumin-transgene Zelle ist.
11. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei in Verfahrensschritt c): a) lebende Albumin-transgene Feeder-Zellen zugegeben werden oder b) der Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen, welcher zwischen dem Kultivierungstag 1 bis 4, bevorzugt am Kultivierungstag 2, entnommen wird, zugegeben wird.
12. Ein Verfahren zur Produktion eines Proteins von Interesse in einer Zelle, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung einer Zellpopulation, welche ein Gen von Interesse enthält, welches für ein Protein von Interesse kodiert, b) Kultivierung dieser Zellen unter Kultivierungsbedingungen, die ein Wachstum der Zellen ermöglicht, c) Isolierung und Deponierung einer einzelnen Zelle in ein Gefäß, , d) Kultivierung der besagten einzelnen Zelle in konditioniertem Medium in Gegenwart von i. Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen, welcher zwischen dem Kultivierungstag 1 bis 3, bevorzugt am Kultivierungstag 2, entnommen wird, oder ii. lebenden Albumin-transgenen Feeder-Zellen, e) Selektion einer Zelle entsprechend ihrem Expressionslevel an Protein von Interesse, f) Ernte des Proteins von Interesse und g) Aufreinigung des Proteins von Interesse.
13. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch charakterisiert, dass die einzelne Zelle eine Hamster- oder Mauszelle ist, bevorzugt eine Maus-Myelomzelle, insbesondere bevorzugt eine CHO- oder BHK-ZeIIe oder eine NSO Zelle.
14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 dadurch charakterisiert, dass die lebende Albumin-transgene Zelle von der gleichen Spezies stammt wie die einzeln abgelegte Zelle.
15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch charakterisiert, dass die einzelne Zelle in Schritt (b) und (c) ein Protein von Interesse exprimiert.
16. Das Verfahren gemäß Anspruch 15 dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein therapeutisches Protein ist, bevorzugt ein
Antikörper, ein Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment.
17. Ein Serum-freies konditioniertes Kulturmedium, welches die Kultivierung einer einzelnen Zelle ermöglicht, enthaltend: i. Zellüberstand lebender Albumin-transgenen Zellen, welcher zwischen dem Kultivierungstag 1 bis 3 entnommen wird, oder ii. lebende Albumin-transgene Feeder-Zellen zur Konditionierung des Mediums.
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