EP2269075A1 - Methode de detection et/ou de titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel - Google Patents

Methode de detection et/ou de titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel

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Publication number
EP2269075A1
EP2269075A1 EP09730577A EP09730577A EP2269075A1 EP 2269075 A1 EP2269075 A1 EP 2269075A1 EP 09730577 A EP09730577 A EP 09730577A EP 09730577 A EP09730577 A EP 09730577A EP 2269075 A1 EP2269075 A1 EP 2269075A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
atnc
pathological
protein
sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09730577A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Benoit Flan
Bruno You
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
LFB Biotechnologies SAS
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
LFB Biotechnologies SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA, LFB Biotechnologies SAS filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP2269075A1 publication Critical patent/EP2269075A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to a method for in vitro determination of infectivity related to unconventional transmissible agents (NCTA), its application, in particular to a method of evaluation and / or in vitro control of the efficacy of a method of obtaining or treating a biological product or method for evaluating and / or controlling in vitro a decontamination procedure or an in vitro evaluation method of the ability of a compound to modulate the infectivity associated with NCTA.
  • NCTA unconventional transmissible agents
  • TSEs Transmissible spongiform encephalopathies
  • CNS central nervous system
  • PrP prion protein
  • PrPsc is co-purified with infectivity and its accumulation precedes the appearance of histological lesions. It results from a modification of the conformation of the prion protein PrP. There has been no evidence of altering the expression of the gene encoding PrP or altering its translation (Prusiner, Biochemistry 1992; 31: 12277-88).
  • NCTAs prevents the use of inactivation processes conventionally used, such as the Tween-TNBP solvent / detergent treatment, which have proved their effectiveness in reducing the viral load of blood derivatives.
  • inactivation processes conventionally used such as the Tween-TNBP solvent / detergent treatment, which have proved their effectiveness in reducing the viral load of blood derivatives.
  • cryoprecipitable plasma proteins factor VIII, von
  • the method of titration of the infectivity associated with NCTAs conventionally used uses an in vivo titration method (for example the golden hamster to titrate infectivity related to the strain 263k), by intracerebral injection of different dilutions of a test product loaded with ATNC.
  • an in vivo titration method for example the golden hamster to titrate infectivity related to the strain 263k
  • intracerebral injection of different dilutions of a test product loaded with ATNC Depending on the number of affected animals in the different groups corresponding to the dilutions made, one can calculate an infectious titer and establish the reduction factor of a given method from an untreated reference.
  • this method has the disadvantage of being long (about one year), expensive and not compatible with a development on an industrial scale which requires a result on the effectiveness of the elimination of the prion, as quickly as possible.
  • PrPsc by Western-Blot (MacGregor, Transfusion J. Medicine 2001; 11: 3-14) or by ELISA generally require prior digestion. of the sample to be analyzed by Proteinase K, or denaturation by chaotropic agents to distinguish the pathological protein (PrPsc) from the normal protein (PrP).
  • WO 2005/022148 discloses an in vitro titration method, called "tissue culture infectivity assay” (TCIA), of an ATNC in a biological product, by means of bringing into contact stable transgenic cells supporting replication said ATNC with the biological product, and then culturing these cells during one or more passages to amplify the amount of ATNC present in the biological product by replicating the ATNC.
  • TCIA tissue culture infectivity assay
  • the TCIA consists of bringing together successive dilutions of an infectious homogenate (127-S scrapie strain) with cells in multiwell plate culture, at the rate of 5 wells per dilution. The number of positive wells is then evaluated by detection of PrPsc (indissociable marker of infectivity) after 8 to 10 passages, and the titre determined by the Spearman - Karber method.
  • PMCA Protein misfolding cyclic amplification
  • TCIA and PMCA processes nevertheless have disadvantages.
  • the in vitro TCIA titration method is still long (10 weeks) for routine use.
  • it is currently slightly less sensitive than the bioassay method involving infection of a laboratory animal.
  • the PMCA method although still in development, is at least as sensitive as the bioassay. However, it provides no evidence on the infectivity associated with the detected PrPsc and proves difficult to implement with plasma matrices.
  • the invention now provides an improved in vitro method for detecting and / or in vitro titrating an unconventional transmissible agent (ATNC) or a pathological conformation protein, a marker of ATNC-related infectivity, in a sample.
  • the method of the invention comprises, in a cell system in vitro culture, the replication or propagation, in cells in culture or on their surface, of the ATNC present in the sample, then the repeated incubation with a substrate allowing the amplification of the ATNC or the pathological conformation protein, prior to determining the presence and / or amount of the ATNC or pathological conformation protein in the sample.
  • the inventors have indeed demonstrated that it is possible, by associating the product resulting from the culturing of the cells with a substrate source for the pathological conformation protein (the substrate may contain, for example PrP) and / or the ATNC, to convert this substrate to pathological conformational protein (PrPsc) and / or detectable and quantifiable ATNC.
  • the substrate may contain, for example PrP
  • PrPsc pathological conformational protein
  • the invention relates to an in vitro method for detecting and / or titrating an unconventional transmissible agent (ATNC) or a pathological marker protein of the ATNC infectivity in a sample, comprising the steps of: i) contacting said sample with cells supporting replication or propagation of the ATNC, ii) culturing said cells to replicate or propagate ATNC present in said sample, iii) contacting and incubating the ATNC; ATNC with a substrate source for the pathological conformational protein and / or the ATNC, whereby the amount of pathological conformational protein and / or ATNC is amplified, iv) disaggregating the eventually formed aggregates, v) determining the presence and / or amount of pathological conformational protein and / or ATNC in the sample, wherein steps (iii) and (iv) constitute a cycle of operations that is repeated at least two times before step (v).
  • ATNC unconventional transmissible agent
  • the sample is selected from the group consisting of blood products and their derivatives, foods, and cosmetics
  • the invention also relates to an in vitro method of evaluating and / or controlling a process for obtaining or treating a biological product or a material likely to be contaminated by an NCTA, a method in which applies to said biological or material product, (A) upstream and (B) downstream of said process, a titration method as defined above, and in that the two values (A) and (B) are compared of title obtained.
  • Another subject of the invention concerns an in vitro method for evaluating and / or controlling a procedure for decontaminating a biological product or a material, in which method is applied to said biological or material product, (A) ) upstream and (B) downstream of said procedure, a titration method as defined above, and in that the two obtained values (A) and (B) of title are compared.
  • Yet another subject of the invention is an in vitro method for diagnosing a transmissible spongiform encephalopathy in a human or non-human animal, comprising detecting the presence in a biological sample of said subject of a non-transmissible transmissible agent. conventional (ATNC) or a pathological conformation protein, marker of the infectivity of the NCTA, by the method as defined above.
  • Another subject of the invention is an in vitro method for evaluating the capacity of a compound to modulate (ie inhibit or increase) the infectivity or replication or propagation of an ATNC.
  • the detection method of the invention makes it possible to detect amounts of ATNC at least equivalent to those detected by the methods known from the prior art, including the bioassay method, considered as the reference method. Moreover, it makes it possible to obtain results more quickly than the known methods of the prior art.
  • the Figure is an autoradiograph of a gel showing the detection of PrP sc by the method of the invention.
  • the tracks are as follows:
  • the term "ATNC" represents any unconventional transmissible agent, such as those responsible in humans for familial or sporadic CJD, Kuru disease or variant CJD, or those officials in natural TSE animals, such as ovine scrapie, bovine or feline spongiform encephalopathy, chronic wasting of deer or spongiform encephalopathy of mink, or EST strains experimentally adapted to laboratory animals .
  • PrPsc is here used to denote the prion protein of pathological conformation (or pathological conformation).
  • pathological form of PrP is the form of the protein whose conformation is correlated with the appearance of an EST in the infected human or non-human animal.
  • the ATNC is also referred to as "infectious agent".
  • the NCTA titrated by the method according to the invention is preferably of ovine, bovine, murine, cricetid, cervid, primate or human origin.
  • the ATNC may be the pathological conformation protein itself.
  • sample means any source of material that may be contaminated by a NCTA.
  • a source of material may for example be a liquid, a food product, a beverage, a cosmetic product or a product resulting from genetic engineering, a molecule capable of inhibiting the infectivity of an ATNC, this list not being limiting.
  • a biological sample for example a biological fluid or tissue or tissue extract.
  • the method of the invention can be carried out on homogenates or directly on samples ex vivo.
  • a tissue may be a tissue of the brain, vertebral column, or tonscillary tissue, this list not being limiting.
  • the sample may also be a composition derived from a human or animal source, such as growth hormones or cell extracts, such as pituitary extracts.
  • a composition can indeed be contaminated by an NCTA.
  • a biological fluid it may be blood, lymph, urine or milk, this list not being limiting.
  • the sample is a blood product or a derivative, for example a plasma derivative or a plasma protein concentrate.
  • cells supporting the replication or propagation of the ATNC is meant any cell capable of being infected by an ATNC, of replicating or propagating this ATNC and of producing PrPsc and / or infectivity. It is a preference cells in which the gene coding for the non-pathological conformation of the prion protein PrP has been integrated and / or overexpressed. More preferably, these cells are stable transgenic cells, which are capable of expressing PrP.
  • a "passage” is generally the transplanting of a portion of the cells of one culture dish into another box containing new culture medium. Each passage therefore dilutes the cells that no longer have room to divide into another box and the time of culture in a box allows the NCTA to replicate.
  • substrate source for the NCTA any non-infectious matrix capable of supporting replication of NCTAs by in vitro amplification cycles.
  • substrate source for the pathological conformation protein is meant any source of non-pathological conformational protein that can not modify the conformation of another protein to render it insoluble.
  • the substrate source for the ATNC and / or the non-pathological normal form of the protein may belong to the same species, or to a species different from the tested biological product.
  • This source may be, for example, derived from a non-pathological normal form of the protein of the same product as that contained in the sample to be tested.
  • the source of non-pathological normal form can be produced recombinantly or synthetically, using means known to those skilled in the art.
  • the cells used in step (i) of the method of the invention advantageously have the following criteria:
  • nerve cells nerve cells (neurons, glial cells) are not necessarily the best substrates for in vitro assay purposes, because of their poor adaptation in culture, it is preferred to establish transgenic cell lines by combining a type of specific cells and a particular transgene, by known techniques, necessary to provide an ideal environment for replication of the ATNC.
  • the cells of step (i) are rabbit epithelial cells, in particular cells of the Rov9 line (Vilette et al., PNAS, March 2001; 98, 4055-9).
  • transgenic and stable rabbit epithelial cells expressing ovine PrP are able to replicate a scrapie strain and produce ovine PrPsc after infection with an infectious brain homogenate containing ovine PrPsc.
  • the cell model constructed, the Rov9 line inducibly expresses exogenous PrP, which guarantees its maintenance during the incubation period necessary for the accumulation of PrPsc in these cells placed in contact with an infectious material.
  • the cells of step (i) are murine glial cells, particularly cells of the MovS2 or MovS6 line (Archer et al., Journal of Virology, 2004; 78 pp. 482-90). These lines consist of murine glial cells expressing ovine PrP and supporting the replication of ATNC of ovine origin. Contacting the sample to be tested:
  • Cells supporting the replication or propagation of the ATNC are contacted with the test sample likely to be infected by this ATNC, or with infectious material containing the NCTA as reference material, by examples of brain extracts from animals infected with NCTA, such as a sheep prion.
  • the contacting is carried out according to methods known to those skilled in the art (see, for example, Archer et al., Journal of Virology, Jan. 2000, pp. 4 82 30 49 0).
  • These cells are then cultured during one or more passages to allow the ATNC to replicate or propagate.
  • the transgenic cells may be brought into contact with at least one dilution of the sample that may be infected with the ATNC in a biologically acceptable aqueous solution, in particular with several dilutions, more particularly with serial dilutions or successive. These dilutions make it possible to refine the quantification of the infectivity in the sample tested.
  • the step of culturing the cells potentially infected with the biological product is required for the replication or the propagation of the ATNC, therefore to amplify an insufficient amount of ATNC, initially, to be detected.
  • the stable transgenic cell culture step ii) performed to amplify the amount of ATNC present in said biological sample by replication of the ATNC is carried out in DMEM + Ham-F12 medium (4: 1 ) supplemented with glutamine and fetal calf serum (5% final).
  • the cells are incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • a passage of the cells (split ratio of: 1 for 10) is carried out every week.
  • the product resulting from the culturing of the cells contains the marker protein (in particular PrP) in its pathological form, the quantity of which is greater than the quantity initially present in the biological sample, if it contains therein.
  • the marker protein (in particular PrP) in its pathological form and the ATNC accumulate within the cell culture (at the level of the infected cells and in the culture medium).
  • Step ii) of the method of the invention is followed by contacting and incubating the product resulting from culturing the cells with a substrate source for the pathological conformer and / or ATNC. .
  • This source of substrate may be provided for example in the form of a product of animal origin, for example a healthy brain homogenate, or material derived from in vitro culture.
  • This material may for example be derived from cells, such as MovS, Rov N2A (Weissmann et al., (2003), PNAS vol.100 No. 20, 666-11671), or even yeasts, fungi, or bacteria, this list is not limiting.
  • This material derived from in vitro culture can be expressed in various cellular compartments, such as the extracellular compartment (for example the supernatant, the exosomes, this list not being limiting) and / or membrane and / or cytosolic compartments (cell lysate). for example).
  • This step serves to allow the in vitro amplification of the pathological conformation protein (in particular PrPsc) and / or the ATNC harvested during step ii) by the conversion of the non-pathological form of the protein a marker (in particular PrP) (contained in the substrate) in pathological form, a non-pathological autoconversion of the form being theoretically impossible.
  • the protein in its pathological form would initiate the transformation of the non-pathological form into a pathological form.
  • step (ii) Incubation of the cell culture product of step (ii) with a substrate source for the pathological conformation protein and / or the ATNC is performed for a time sufficient to allow at least a portion of the proteins having non-pathological form, to be transformed into a pathological form of the protein, or to the NCTA to amplify.
  • each incubation step is carried out for a period of between 10 seconds and 4 hours, preferably between 20 minutes and 1 hour, and particularly preferably for 30 minutes.
  • the amplification medium may advantageously consist of a buffer typically composed of: (Ix PBS), 15mM NaCl and 1% Triton. and at least one substrate containing the marker protein (in particular PrP) in a non-pathological conformation (for example of a volume 10 times greater than the volume of the sample to be amplified).
  • a buffer typically composed of: (Ix PBS), 15mM NaCl and 1% Triton.
  • at least one substrate containing the marker protein (in particular PrP) in a non-pathological conformation for example of a volume 10 times greater than the volume of the sample to be amplified.
  • step iv) of the method of the invention consists of the disaggregation of the aggregates possibly formed, so as to release the particles of pathological conformation marker proteins and / or ATNC so that they can convert from other non-pathological proteins.
  • a solvent such as sodium dodecyl sulphate, dimethyl sulphoxide, acetonitrile, guanidine, urea, trifluoroethanol, diluted trifuroacetic acid, diluted formic acid, this list not being limiting
  • the modification of the physicochemical characteristics of the solution such as the pH, the temperature, the ionic strength, the dielectric constant
  • physical methods such as sonication, laser irradiation, freezing / thawing, autoclave incubation, high pressure, gentle homogenization, or other sources of irradiation, this list not being not limiting.
  • sonication is used. Sonication is a method known to those skilled in the art, and often used in PrP sc purification methods, by making it possible to increase the solubility of the aggregates.
  • the duration of the disintegration step is readily determinable by those skilled in the art, and may depend on the method of disintegration chosen. Preferably, the duration of the disintegration step is between 1 second and 60 minutes, more preferably between 5 seconds and 30 minutes, and more particularly between 5 seconds and 30 seconds.
  • the succession of steps iii) and iv), called the cycle is repeated at least twice, preferably between 5 and 100 times, preferably between 20 and 60 times.
  • This repeated cycle between 2 and 100 times constitutes a series of amplification cycles.
  • a series of cycles can also be repeated several times. In this case, the new series will be initiated from a volume of the previous series in place of the original NCTA sample.
  • Step (v) for detecting pathological proteins can be carried out by any method known to those skilled in the art.
  • the specific detection of PrPsc can be carried out by a first step of separation of the two isoforms PrPc and PrPsc.
  • This separation is carried out on the basis of the biochemical properties of PrPsc which make it possible to distinguish it from non-pathological proteins, in particular the fact that PrPsc is reported to be more resistant to protease-based treatments and less soluble even in the presence of detergents.
  • the first step after amplification is preferably the separation of the PrPc (non-pathological soluble normal form of PrP) from the sample, which can be effected for example by means of protease treatment, for example proteinase K or by centrifugation to separate soluble forms (PrPc) from insoluble forms (PrPsc).
  • digestion with proteinase K is a step prior to Western Blot, mainly digests PrPc and not PrPsc. It is indeed a property of PrPsc that it is relatively resistant to PK compared to PrPc. The subsequent detection step therefore no longer detects the non-pathological form of the protein because it has been digested by the protease.
  • the detection step can be carried out using the following methods: immunocytochemistry (for example by cell labeling and Facscan analysis) or immunochemistry (such as the Western blot or an ELISA test), or radioactivity test, test of fluorescence, electron microscopy, turbidimetry to detect aggregates, as well as structural tests including NMR (nuclear magnetic resonance), circular dichroism, Raman spectroscopy, UV absorption, a monoclonal antibody recognizing the pathological form of protein, this list not being limiting.
  • immunocytochemistry for example by cell labeling and Facscan analysis
  • immunochemistry such as the Western blot or an ELISA test
  • radioactivity test test of fluorescence, electron microscopy, turbidimetry to detect aggregates, as well as structural tests including NMR (nuclear magnetic resonance), circular dichroism, Raman spectroscopy, UV absorption, a monoclonal antibody recognizing the pathological form of protein, this list not being limiting.
  • an antibody specifically recognizing the pathological form and not the non-pathological form may itself be labeled.
  • an antibody may be for example the 15B3 antibody (Korth et al., 1997, Nature 1997 Nov6, 390 (6655): 74-7).
  • Titration of TNC A The detection of the pathological forms of the marker proteins or the NCTA may be associated with a determination of the amount of these proteins or the ATNC present in the sample.
  • the titration can be carried out using any titration method known to those skilled in the art. In particular, it can be performed on the model of the methods described in the documents WO2005022148 and WO2006117483 (in particular reference examples A and B).
  • the set of Western-blot results for the different dilutions and the different replicates can be analyzed by a statistical method known to those skilled in the art for establishing an infectious titer, such as the method of Spearman Karber (Schmidt NJ , Emmous RW, Diagnosis Procedures for Viral, Rickettsial and Chlaveydial Infection, 1989, 6th Edition).
  • the method of calculating the title is the Spearman - Karber method. This method assumes the dilution of the sample to be tested according to a geometric progression, that is to say of constant reason between successive dilutions, and a constant volume inoculation (generally 0.150 ml) of each dilution in five well at least. The most commonly used dilution factor is the decimal factor.
  • Logio median dose (Xo) - (d / 2) + dS (T 1 Ai 1 )
  • Xo logio of the reciprocal value of the lowest dilution at which all test inocula are positive.
  • d log10 of the dilution factor, also referred to as "no dilution” (i.e. the difference between log dilution intervals).
  • U 1 number of test inocula used at each dilution.
  • R 1 number of positive inocula of test (on ni).
  • the estimated standard deviation is calculated using the following formula:
  • V 1 Zn 1 proportion of positive assays (i.e., inoculum cups with reaction) at each dilution.
  • the method of the invention makes it possible to quantify the infectivity associated with NCTAs over a range of about 4 log, that is, 10,000 infectious units in vitro. This may, for example, make it possible to satisfy the criteria for validating the efficiency of the processes for obtaining biological products with respect to the elimination of NCTAs.
  • Applications of the NTCA infectivity determination method :
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a method of evaluation and / or in vitro control of a process for obtaining or treating a biological product likely to be contaminated. by an NCTA.
  • This evaluation and / or control method is characterized in that a titration method according to the invention, as described above, is applied to the biological product, upstream and downstream of said process, and in that the we compare the two title values obtained. By comparison between the two measurements, the degree of elimination or the reduction factor of the NCTA is determined.
  • the titration method according to the invention has the capacity to be easily applicable to any type of process for obtaining or purifying biological products, in particular blood products, such as blood plasma derivatives, using for example, chromatography or nanofiltration, in particular the chromatographies described in documents EP 0 359 593 and WO 02/092632, or the nanofiltration described in document WO / 2005/022148.
  • the implementation of the method of the invention makes it possible to evaluate and / or control the efficiency of a process (or a part of a process) for obtaining or treating, or even purifying of any biological product likely to be contaminated by an NCTA, in the elimination of this NCTA, by means of a titration using specific transgenic cell lines, promoting the replication of the ATNC, brought into contact with an infectious material or potentially infectious containing the ATNC to be tested.
  • the amounts of NCTA are measured upstream and downstream of the process (or part of the process) whose performance with respect to the NCTA is to be assessed. By comparing the two measurements, the degree of elimination of the pathogen is determined.
  • the implementation of the present method can be carried out during a process for obtaining a biological product or in the context of an elimination treatment of the NCTA according to obtaining the biological product.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a method of evaluation and / or in vitro control of a decontamination procedure.
  • a material In this case, the ATNC titre of a biological product containing an NCTA is determined using the titration method of the invention. This infected biological product is then contacted with the material to be decontaminated and the decontamination procedure is applied to this material. Finally, the title of the biological product having undergone the decontamination procedure is again determined. The two titration measurements performed upstream and downstream of the decontamination procedure are compared to evaluate the effectiveness of the decontamination procedure.
  • the material may, for example, be purification equipment, in particular a chromatography column, or be the sanitization of a chromatography column using sodium hydroxide.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a selection procedure and / or method for evaluating the ability of a candidate compound to modulate (reduce or increase) the titre of the infectious material.
  • the ATNC titre of a biological product containing an NCTA is determined using the titration method of the invention.
  • This infected biological product is then brought into contact with the test compound and the title of the biological product having undergone the decontamination procedure is again determined.
  • the two titration measurements made upstream and downstream of the contacting of the sample with the test compound are compared.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a selection procedure and / or evaluation method of a compound capable of inhibiting the infectivity of an ATNC.
  • the ATNC titre of a biological product containing an NCTA is determined, in the presence and then in the absence of the compound to be evaluated, by means of the titration method according to the invention.
  • the methods for bringing the compound into contact are determined according to whether the action of the compound prevents the initiation of an infectious cycle or blocks an infectious cycle already initiated. In all cases, the title of the biological product is determined with and without treatment with the product to be tested.
  • the two titration measurements performed are compared to evaluate the inhibitory activity of the ATNC infectivity of the compound.
  • the invention also relates to the application of the titration method according to the invention to a method for identifying a compound making it possible to modulate the transformation of the non-pathological form in the pathological form of a marker protein or the ATNC, for example the transformation of PrP into PrP sc .
  • the ATNC titre of a biological product containing an NCTA is determined using the titration method of the invention.
  • This infected biological product is then contacted with the test compound and the titration method of the invention is applied to again determine the title of the biological product.
  • the two titration measurements made upstream and downstream of the contact with the compound are compared to evaluate the effectiveness of the test compound.
  • MovS6 cells (Archer F. et al., 2004 supra) were selected as replication-supporting cells of the ATNCs, and the 127-S scrapie strain adapted to the Tg301 transgenic mice was used as a source of natural infectivity (Vilette JL and 2001, supra).
  • Tg301 transgenic mice carry a large DNA fragment isolated from an ovine artificial chromosome library, and ovine PrP expression levels are approximately 8-fold higher than those observed in sheep brains.
  • the source of initial infectivity was a brain homogenate (lot LN-3326) from infected mice at 200 mg / ml. The title of this sample is 5.7 logio uWB / ml and 6.35 TCIDso / ml.
  • MovS6 cells were cultured in DMEM + Ham-F12 medium (4: 1) supplemented with glutamine and fetal calf serum (final 5%) and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 . Each week 10% of the cells were re-seeded in each well. The remaining 90% of cells were either stored as a dry cell pellet previously washed in PBS, or removed. Assay plates were prepared 24 hours before inoculation. The cells were seeded in wells of approximately 2 cm 2 (24-well plate format), at the rate of 100,000 cells per well, ie approximately 50,000 cells / cm 2 .
  • the inoculum consisted of either the LN-3326 10-fold diluted sample or a healthy brain homogenate sample that served as a "Negative Control" (lot: LN-3777). Inoculations were performed in 5 replicates.
  • the cells were contacted for 24 hours with 150 ⁇ l of diluted inoculum, and then 1 ml of new culture medium was added. The cells were maintained in culture for an additional 72 hours, ie until the first passage during which, for each well, the entire cell layer was transferred to a well of about 9.6 cm 2 (6-well plate format).
  • the cell culture was then maintained for 10 weeks. Each week, for each well, the culture medium was changed and 10% of the cells were re-seeded.
  • the cells inoculated with the infected inoculum (LN-3326) not re-seeded were for 2 replicates on the 5, washed once in PBS and then stored at -80 ° C. in the form of a dry pellet (samples intended for amplification according to the method of the invention) and for the other 3 replicates preserved without prior dry-pellet washing (samples intended for detection by WB).
  • the cells inoculated with the healthy sample and not re-seeded were, for all the replicates, preserved without prior washing in the form of a dry pellet.
  • the cell pellets obtained made it possible to carry out the analyzes described below. Detection of PrPsc in cells:
  • PrPsc present on the membranes was detected by incubation with the antibody 6H4 (Prionics) then a secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (goat antibody "anti-mouse antibody”).
  • the labeled membranes were revealed by chemiluminescence.
  • One sample was considered positive if the electrophoretic profile of the three forms of glycosylated PrPsc was visible on autoradiograms.
  • Table 1 Number of positive wells after detection of PrPsc in MovS6 cell lysates.
  • PrPsc signal was observed in the lysates of MovS6 cells inoculated with the brain homogenate infected with strain 127-S. This signal was observed on the first pass (figure, wells 3 to 12).
  • PrPsc associated with the 127-S strain in the sample of brain homogenate LN-3326 previously diluted 10 times can be amplified by the method of the invention. Detection of PrPsc in this diluted sample indicates that the amplification rate is at least 2.5 to 3 log 10. Moreover, this amplification is specific for PrPsc since no signal is observed with the undiluted healthy homogenate sample.
  • Amplification of PrPSc associated with the 127-S strain in cell lysates A dilution studied (10 "), the homogenate LN-3326 induced the production of detectable PrP Sc by Western blot from the 4 th passage. This time corresponds to the time required for PrPsc propagation in the cell culture to reach the level of minimum concentration detectable by Western-blot. This delay also proves a de novo production of PrPsc by the cells.
  • the PrPsc present in the infected cells is detected at the first pass and for all subsequent passages. This amplification seems specific since PrPsc was not detected in uninfected cells.

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de détection et/ou titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique, marqueur de l'infectiosité liée à l'ATNC, dans un échantillon, comprenant : la réplication ou la propagation dans des cellules en culture de l'ATNC présent dans l'échantillon, puis l'incubation répétée avec un substrat permettant l'amplification de l'ATNC ou de la protéine de conformation pathologique, conformère non-pathologique de l'ATNC, avant la détermination de la présence et/ou de la quantité de l'ATNC ou de la protéine de conformation pathologique dans l'échantillon.

Description

Méthode de détection et/ou de titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel
La présente invention concerne une méthode de détermination in vitro de l'infectiosité liée aux agents transmissibles non conventionnels (ATNC), son application, notamment à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro de l'efficacité d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination ou à une méthode d'évaluation in vitro de la capacité d'un composé à moduler l'infectiosité liée aux ATNC.
Etat de la technique :
Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) regroupent un ensemble de maladies génétiques ou acquises caractérisées par une dégénérescence du système nerveux central (SNC). La forme la plus fréquente chez l'homme est la maladie de Creutzfeldt-
Jakob (MCJ), mais il existe également des EST chez de nombreux mammifères
(notamment la tremblante du mouton et l'encéphalopathie spongiforme bovine). L'agent étiologique de ces maladies est classé dans la catégorie des "agents transmissibles non conventionnels" (ATNC). La signature de la maladie est la présence d'une protéine extracellulaire, appelée protéine prion (PrP), qui est transformée au cours de la maladie en une forme insoluble, résistante aux protéases telles que la protéinase K, et qui s'accumule dans le système nerveux central. Cette forme anormale pathologique de la PrP, appelée
PrPsc, est co-purifîée avec l'infectiosité et son accumulation précède l'apparition des lésions histologiques. Elle résulte d'une modification de la conformation de la protéine prion PrP. Il n'a pas été mis en évidence de modification de l'expression du gène codant pour Ia PrP, ni d'altération de sa traduction (Prusiner, Biochemistry 1992 ; 31 :12277-88 ).
Les données actuellement disponibles ne permettent pas de démontrer que l'agent transmissible responsable des EST se trouve sous une forme infectante dans les dérivés sanguins (Brown et al, 2001, Semin Hematol.;38(4 Suppl 9):2-6).
Toutefois, on ne peut conclure à son absence, cette incertitude résultant, d'une part, de la probable concentration très faible dans le sang et, d'autre part, de la très longue période d'incubation cliniquement silencieuse caractéristique de ces maladies, qui précède l'apparition des signes cliniques.
En outre, l'exceptionnelle résistance des ATNC empêche le recours à des procédés d'inactivation classiquement mis en œuvre, tels que le traitement solvant/détergent Tween- TNBP, qui ont fait la preuve de leur efficacité pour réduire la charge virale des dérivés sanguins, tels que les protéines cryoprécipitables du plasma (facteur VIII, facteur von
Willebrand, etc.). Etant donné que l'obtention ou le traitement de produits biologiques, tels que les protéines plasmatiques de la coagulation, doit incorporer des étapes d'élimination/inactivation virales en vue d'un usage thérapeutique, l'industrie pharmaceutique des médicaments dérivés du sang cherche aujourd'hui à évaluer le risque théorique de transmission du variant de la MCJ par les produits dérivés du sang.
Actuellement, la méthode de titrage de l'infectiosité liée aux ATNC classiquement mise en œuvre utilise une méthode de titrage in vivo (par exemple le hamster doré pour titrer l'infectiosité liée à la souche 263k), par injection intracérébrale de différentes dilutions d'un produit à tester chargé en ATNC. Selon le nombre d'animaux atteints dans les différents groupes correspondant aux dilutions effectuées, on peut calculer un titre infectieux et établir le facteur de réduction d'un procédé donné à partir d'une référence non traitée. Cependant, cette méthode présente l'inconvénient d'être longue (environ un an), coûteuse et peu compatible avec un développement à l'échelle industrielle qui requiert un résultat sur l'efficacité de l'élimination du prion, le plus rapidement possible.
En outre, il est souvent nécessaire d'introduire une étape de concentration de l'agent infectieux de façon à augmenter la sensibilité des méthodes de titrage. Toutes les procédures de concentration d'agents infectieux responsables de l'EST passent aujourd'hui par une purification de la PrPsc.
D'autres méthodes ont été proposées pour le titrage in vitro des agents infectieux des EST.
Les techniques de détection de la PrPsc par Western-Blot (Mac Gregor, Transfusion J. Médecine 2001 ; 1 1, 3-14) ou par ELISA nécessitent généralement une digestion préalable de l'échantillon à analyser par la Protéinase K, ou une dénaturation par des agents chaotropiques pour distinguer la protéine pathologique (PrPsc) de la protéine normale (PrP).
Une autre méthode de titrage a récemment été développée basée sur l'utilisation des anticorps spécifiques de la PrPsc ne reconnaissant pas la PrP (Korth et al, Nature 1997 Nov6, 390 (6655) : 74-7).
Le brevet US 6,150,583 décrit quant à lui la production d'animaux transgéniques exprimant une PrP marquée par un épitope hétérologue exposé ou non à la surface de la protéine prion, selon la conformation de cette dernière.
Le document WO 2005/022148 décrit une méthode de titrage in vitro, appelée « TCIA » ("tissue culture infectivity assay"), d'un ATNC dans un produit biologique, au moyen de la mise en contact de cellules transgéniques stables supportant la réplication dudit ATNC avec le produit biologique, puis la culture de ces cellules pendant un ou plusieurs passages pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans le produit biologique par réplication de l'ATNC. Plus précisément, le TCIA consiste à mettre en contact des dilutions successives d'un homogénat infectieux (souche de tremblante 127-S) avec des cellules en culture sur plaque multi-puits, à raison de 5 puits par dilution. Le nombre de puits positifs est alors évalué par détection de la PrPsc (marqueur indissociable de l'infectiosité) au bout de 8 à 10 passages, et le titre déterminé par la méthode de Spearman - Karber.
Le procédé appelé « PMCA » (Protein misfolding cyclic amplification), décrit dans le document Saborio et al. (Nature ; 2001, 411, 810-3) prévoit de son côté la mise en contact de formes pathologiques provenant d'un tissu ou d'un fluide issu d'un animal contaminé avec une forme non pathologique de la protéine d'ATNC, afin de convertir cette dernière en une forme pathologique.
Les procédés TCIA et PMCA présentent néanmoins des désavantages. Ainsi la méthode de titrage TCIA in vitro s'avère encore longue (10 semaines) pour un usage de routine. En outre elle est à ce jour légèrement moins sensible que la méthode de bioessai impliquant l'infection d'un animal de laboratoire.
La méthode de la PMCA, bien qu'encore en développement, s'avère au moins aussi sensible que le bioessai. Cependant elle ne fournit aucune preuve sur l'infectiosité associée à la PrPsc détectée et s'avère difficile à mettre en oeuvre avec des matrices plasmatiques.
En outre il a été rapporté une reproductibilité incertaine ainsi que des résultats faussement positifs (TSE meeting, Cambridge Healthtech Institute's 12th annual, 2008 Feb 11-12). Il existe donc encore un fort besoin de mettre au point une méthode de détermination de l'infectiosité applicable à l'échelle industrielle, c'est-à-dire notamment : reproductible, compatible avec diverses matrices (par exemple les dérivés du sang), sensible (avec une sensibilité équivalente au bio-essai), et relativement rapide.
Résumé de l'invention :
L'invention fournit maintenant une méthode in vitro améliorée pour la détection et/ou le titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique, marqueur de l'infectiosité liée à l'ATNC, dans un échantillon. La méthode de l'invention comprend dans un système cellulaire en culture in vitro, la réplication ou la propagation, dans des cellules en culture ou à leur surface, de l'ATNC présent dans l'échantillon, puis l'incubation répétée avec un substrat permettant l'amplification de l'ATNC ou de la protéine de conformation pathologique, avant la détermination de la présence et/ou de la quantité de l'ATNC ou de la protéine de conformation pathologique dans l'échantillon..
Les inventeurs ont en effet mis en évidence qu'il est possible, en associant le produit résultant de la mise en culture des cellules à une source de substrat pour la protéine de conformation pathologique (le substrat pouvant contenir par exemple la PrP) et/ou l'ATNC, de convertir ce substrat en protéine de conformation pathologique (PrPsc) et / ou en ATNC détectable et quantifiable. Plus précisément, l'invention vise une méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, dans un échantillon, comportant les étapes consistant à : i) mettre ledit échantillon en contact avec des cellules supportant la réplication ou la propagation de l'ATNC, ii) cultiver lesdites cellules pour répliquer ou propager IATNC présent dans ledit échantillon, iii) mettre en contact et incuber l'ATNC avec une source de substrat pour la protéine de conformation pathologique et/ou l'ATNC, par ce en quoi la quantité de protéine de conformation pathologique et/ou d' ATNC est amplifiée, iv) désagréger les agrégats éventuellement formés, v) déterminer la présence et/ou la quantité de protéine de conformation pathologique et/ou d'ATNC dans l'échantillon, les étapes (iii) et (iv) constituant un cycle d'opérations qui est répété au moins deux fois avant l'étape (v).
De préférence l'échantillon est choisi dans le groupe constitué par les produits sanguins et leurs dérivés, les aliments, et les produits cosmétiques
L'invention vise également une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval dudit procédé, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un produit biologique ou d'un matériel, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval de ladite procédure, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues. Encore un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de diagnostic d'une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un sujet humain ou animal non-humain, comprenant la détection de la présence dans un échantillon biologique dudit sujet, d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique, marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, par la méthode telle que définie ci- dessus.
Enfin un autre objet de l'invention est une méthode in vitro d'évaluation de la capacité d'un composé à moduler (c'est à dire inhiber ou augmenter) l'infectiosité ou la réplication ou la propagation d'un ATNC.
La méthode de détection de l'invention permet de détecter des quantités d'ATNC au moins équivalentes à celles détectées par les procédés connus de l'art antérieur, dont la méthode du bioessai, considérée comme la méthode de référence. Par ailleurs, elle permet d'obtenir des résultats plus rapidement que les méthodes connues de l'art antérieur.
Légende de la Figure :
La Figure est une autoradiographie d'un gel montrant la détection de la PrPsc par la méthode de l'invention. Les pistes sont les suivantes :
1 : marqueur de Poids Moléculaire
2 à 12 : Lysats de cellules inoculées par LN-3326 et récoltées respectivement de passage 1 à 10
13 : Lysat de cellules inoculées par LN-3777 (homogénat de cerveau sain)
14 : Homogénat de cerveau infecté (LN-3326) dilué 10 fois
Description détaillée de l'invention :
Définitions
Dans le cadre de l'invention, le terme "ATNC" représente tout agent transmissible non conventionnel, tels que ceux responsables chez l'être humain de la MCJ familiale ou sporadique, de la maladie du Kuru ou du variant MCJ, ou bien encore ceux responsables chez les animaux d'EST naturelles, telles que la tremblante ovine, l'encéphalopathie spongiforme bovine ou féline, le dépérissement chronique des cervidés ou l'encéphalopathie spongiforme du vison, ou enfin de souches d'EST expérimentalement adaptées à l'animal de laboratoire. On désigne ici par PrPsc la protéine prion de conformation pathologique (ou conformère pathologique). La forme dite « pathologique » de la PrP est la forme de la protéine dont la conformation est corrélée à l'apparition d'une EST chez l'animal humain ou non-humain infecté.
Dans le contexte de l'invention, l'ATNC est également désigné par le terme «agent infectieux ». L'ATNC titré par la méthode selon l'invention est de préférence d'origine ovine, bovine, murine, cricétidienne, cervidée, primate ou humaine. De manière préférentielle, l'ATNC peut être la protéine de conformation pathologique elle-même.
Par « échantillon», on désigne toute source de matière susceptible d'être contaminée par un ATNC. Une telle source de matière peut par exemple être un liquide, un produit alimentaire, une boisson, un produit cosmétique ou un produit issu du génie génétique, une molécule susceptible d'inhiber l'infectiosité d'un ATNC, cette liste n'étant pas limitative. De préférence il s'agit d'un échantillon biologique, par exemple un liquide biologique ou un tissu ou extrait de tissu. Dans le cas d'un tissu, la méthode de l'invention peut être réalisée sur des homogénats ou directement sur des échantillons ex vivo. Un tel tissu peut être un tissu du cerveau, de colonne vertébrale, ou tissu tonscillaire, cette liste n'étant pas limitative. L'échantillon peut également être une composition dérivée d'une source humaine ou animale, comme les hormones de croissance ou les extraits cellulaires, comme les extraits pituitaires. Une telle composition peut en effet être contaminée par un ATNC. Dans le cas d'un liquide biologique, celui-ci peut être le sang, la lymphe, l'urine ou le lait, cette liste n'étant pas limitative. De manière préférentielle, l'échantillon est un produit sanguin ou un dérivé, par exemple un dérivé plasmatique ou un concentré de protéine plasmatique.
Par « cellules supportant la réplication ou la propagation de l'ATNC », telles qu'utilisées à l'étape (i), on désigne toute cellule capable d'être infectée par un ATNC, de répliquer ou propager cet ATNC et de produire de la PrPsc et/ou de l'infectiosité. H s'agit de préférence de cellules dans lesquelles le gène codant pour le conformère non-pathologique de la protéine prion PrP a été intégré et / ou sur-exprimé. De préférence encore, ces cellules sont des cellules transgéniques stables, qui sont capables d'exprimer la PrP.
Un "passage" est généralement le repiquage d'une partie des cellules d'une boîte de culture dans une autre boîte contenant du milieu de culture neuf. Chaque passage permet donc de diluer les cellules qui n'ont plus la place pour se diviser dans une autre boîte et le temps de culture dans une boîte permet à l'ATNC de se répliquer.
Par « source de substrat pour l'ATNC », on désigne toute matrice non infectieuse susceptible de supporter la réplication des ATNC par des cycles d'amplification in vitro.
Par « source de substrat pour la protéine de conformation pathologique », on désigne toute source de protéine de conformation non-pathologique, ne pouvant pas modifier la conformation d'une autre protéine pour la rendre insoluble. De manière préférentielle, la source de substrat pour l'ATNC et/ou pour la forme normale non pathologique de la protéine peut appartenir à la même espèce, ou à une espèce différente du produit biologique testé. Cette source peut être, par exemple, issue d'une forme normale non pathologique de la protéine du même produit que celui contenu dans l'échantillon à tester. De manière alternative, la source de forme normale non pathologique peut être produite de manière recombinante ou synthétique, en mettant en œuvre des moyens connus de l'homme du métier.
Cellules de l'étape (i) :
Les cellules utilisées à l'étape (i) de la méthode de l'invention présentent avantageusement les critères suivants :
- l'adéquation entre la vitesse de réplication ou multiplication des cellules et la durée d'incubation nécessaire à la mise en évidence d'une réplication de l'ATNC dans les cellules infectées; - la stabilité des cellules après leur mise en contact avec l'agent infectieux qui peut être mise en évidence par l'absence de cytotoxicité liée à l'accumulation de l'ATNC dans les cellules;
- leur bonne sensibilité à l'infection, évaluée par exemple par la multiplicité d'infection faible permettant d'obtenir une accumulation de l'ATNC dans les cellules exposées à l'agent infectieux.
Etant donné que les cellules nerveuses (neurones, cellules gliales) ne sont pas nécessairement les meilleurs substrats à des fins de titrage in vitro, du fait de leur mauvaise adaptation en culture, on préfère établir des lignées cellulaires transgéniques par combinaison d'un type de cellules spécifiques et d'un transgène particulier, par des techniques connues, nécessaire pour fournir un environnement idéal à la réplication de l'ATNC.
Dans un mode de réalisation préféré, les cellules de l'étape (i) sont des cellules épithéliales de lapin, en particulier des cellules de la lignée Rov9 (Vilette et al. PNAS, Mars 2001 ; 98, 4055-9).
Vilette et al. ont montré que des cellules épithéliales de lapin, transgéniques et stables, exprimant la PrP ovine (transgène), sont capables de répliquer une souche de tremblante et de produire la PrPsc ovine après infection par un homogénat de cerveau infectieux contenant de la PrPsc ovine. Le modèle cellulaire construit, la lignée Rov9, exprime de façon inductible la PrP exogène, ce qui garantit son maintien lors de la période d'incubation nécessaire à l'accumulation de la PrPsc dans ces cellules mises en contact avec un matériel infectieux.
Dans un autre mode de réalisation, les cellules de l'étape (i) sont des cellules gliales murines, en particulier des cellules de la lignée MovS2ou MovS6 (Archer et al. Journal of Virology, 2004 ; 78 p. 482-90). Ces lignées consistent en des cellules gliales murines exprimant la PrP ovine et supportant la réplication d'ATNC d'origine ovine. Mise en contact avec l'échantillon à tester :
Les cellules supportant la réplication ou la propagation de l'ATNC sont mises en contact, avec l'échantillon à tester, susceptible d'être infecté par cet ATNC, ou avec un matériel infectieux contenant l'ATNC en tant que matériel de référence, par exemple des extraits de cerveaux d'animaux infectés par un ATNC, tels qu'un prion d'ovin. La mise en contact est réalisée selon des méthodes connues de l'homme du métier (voir par exemple Archer et al. Journal of Virology, Jan. 2 004, p. 4 82 3 0 49 0),
Ces cellules sont ensuite cultivées pendant un ou plusieurs passages pour permettre à l'ATNC de se répliquer ou de se propager.
De manière avantageuse, les cellules transgéniques peuvent être mises en contact avec au moins une dilution de l'échantillon susceptible d'être infecté par l'ATNC dans une solution aqueuse biologiquement acceptable, en particulier avec plusieurs dilutions, tout particulièrement avec des dilutions sériées ou successives. Ces dilutions permettent d'affiner la quantification de l'infectiosité dans l'échantillon testé.
Plusieurs réplicats de cellules peuvent être mis en contact avec la même dilution du produit biologique, afin d'offrir une résolution statistique plus fine aux résultats.
Culture des cellules (étape U) :
L'étape de culture des cellules potentiellement infectées par le produit biologique, selon toute technique connue de l'homme du métier, est requise pour la réplication ou la propagation de l'ATNC, donc pour amplifier une quantité d'ATNC insuffisante, initialement, pour être détectée.
Dans un exemple de réalisation, l'étape ii) de culture des cellules transgéniques stables effectuée pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans ledit échantillon biologique par réplication de l'ATNC, est réalisée en milieu DMEM + Ham-F12 (4 :1) complémenté en glutamine et sérum de veau fœtal (5% final). Les cellules sont incubées à 37°C sous 5% de CO2. Un passage des cellules (split ratio de : 1 pour 10) est réalisé chaque semaine. Le produit résultant de la mise en culture des cellules contient la protéine marqueur (notamment PrP) sous sa forme pathologique, dont la quantité est supérieure à la quantité initialement présente dans l'échantillon biologique, si celui-ci en contient. La protéine marqueur (notamment PrP) sous sa forme pathologique et l'ATNC s'accumulent au sein de la culture cellulaire (au niveau des cellules infectées et dans le milieu de culture).
Mise en contact avec une source de substrat pour la protéine de conformation pathologique et/ou l'ATNC (étape Hi) :
L'étape ii) de la méthode de l'invention est suivie de la mise en contact et de l'incubation du produit résultant de la mise en culture des cellules avec une source de substrat pour le conformère pathologique et/ou pour 1"ATNC.
Cette source de substrat peut être apportée par exemple sous la forme d'un produit d'origine animale, par exemple un homogénat de cerveau sain, ou encore de matériel issu de culture in vitro. Ce matériel peut être par exemple issu de cellules, telles que MovS, Rov N2A (Weissmann et al. (2003), PNAS vol.100 n°20 pi 666-11671), ou encore des levures, des mycètes, ou des bactéries, cette liste n'étant pas limitative. Ce matériel issu de culture in vitro peut être exprimé dans divers compartiments cellulaires, comme le compartiment extracellulaire (par exemple le surnageant, les exosomes, cette liste n'étant pas limitative) et/ou des compartiments membranaires et/ou cytosoliques (lysat de cellules par exemple). Cette étape a pour fonction de permettre l'amplification in vitro de la protéine de conformation pathologique (notamment PrPsc) et/ou de l'ATNC récolté au cours de l'étape ii) par la conversion de la forme non-pathologique de la protéine marqueur (notamment PrP) (contenue dans le substrat) en forme pathologique, une autoconversion de la forme non-pathologique étant théoriquement impossible. La protéine sous sa forme pathologique initierait la transformation de la forme non-pathologique en forme pathologique.
En fin de réaction de conversion, la forme non-pathologique non convertie n'est pas détectée par le système de détection, comme il sera expliqué plus loin. L'incubation du produit de la culture cellulaire de l'étape (ii) avec une source de substrat pour la protéine de conformation pathologique et/ou l' ATNC est réalisée pendant une durée suffisante pour permettre à au moins une partie des protéines possédant une forme non pathologique, d'être transformée en une forme pathologique de la protéine, ou à l'ATNC de s'amplifier. De préférence, chaque étape d'incubation est effectuée pendant une durée comprise entre 10 secondes et 4 heures, préférentiellement entre 20 minutes et 1 heure, et de manière particulièrement préférée pendant 30 minutes.
Le milieu d'amplification peut être avantageusement constitué d'un tampon typiquement composé de : (PBS Ix), NaCl 15OmM et Triton 1%. et au minimum d'un substrat contenant la protéine marqueur (notamment PrP) dans une conformation non pathologique (par exemple d'un volume 10 fois supérieur au volume de l'échantillon à amplifier).
Séparation des agrégats :
II s'avère que les protéines converties en formes pathologiques (type PrPsc) peuvent s'agréger entre elles et aux autres particules de forme pathologique (PrPsc), empêchant la conversion d'autres protéines de forme non pathologique en forme pathologique. Ceci est un inconvénient car la méthode pourrait ainsi être ralentie par le faible nombre de « foyers de conversion » présents dans le milieu réactionnel.
Ainsi, l'étape iv) de la méthode de l'invention consiste en la désagrégation des agrégats éventuellement formés, de manière à libérer les particules de protéines marqueurs de conformation pathologique et/ou d'ATNC pour que celles-ci puissent convertir d'autres protéines non pathologiques.
De nombreuses méthodes peuvent être utilisées pour désagréger les agrégats durant l'étape iv) de la méthode de l'invention. On peut citer à titre d'exemple le traitement avec un solvant (comme le dodecyl sulfate de sodium, le dimethylsulfoxide, l'acétonitrile, la guanidine, l'urée, le trifiuoroéthanol, l'acide trifuroacétique dilué, l'acide formique dilué, cette liste n'étant pas limitative), la modification des caractéristiques physico-chimiques de la solution, telles que le pH, la température, la force ionique, la constante diélectrique, ainsi que les méthodes physiques, comme la sonication, l'irradiation au laser, la congélation/décongélation, l'incubation en autoclave, la haute pression, l'homogénéisation douce, ou encore d'autres sources d'irradiation, cette liste n'étant pas limitative. Préférentiellement, on utilise la sonication. La sonication est une méthode connue de l'homme du métier, et souvent mise en œuvre dans les méthodes de purification de la PrPsc, en permettant d'augmenter la solubilité des agrégats.
Il est possible que tous les agrégats ne soient pas désagrégés lors de la mise en œuvre d'une seule étape de désagrégation. Dans ce cas, la concentration de protéines pathologiques augmente au fur et à mesure des étapes de désagrégation.
La durée de l'étape de désagrégation est aisément déterminable par l'homme du métier, et elle peut dépendre de la méthode de désagrégation choisie. De manière préférentielle, la durée de l'étape de désagrégation est comprise entre 1 seconde et 60 minutes, plus préférentiellement entre 5 secondes et 30 minutes, et plus particulièrement entre 5 secondes et 30 secondes.
Avantageusement, la succession des étapes iii) et iv), appelée cycle, est répétée au moins 2 fois, préférentiellement entre 5 et 100 fois, de préférence entre 20 et 60 fois.
Ce cycle répété entre 2 et 100 fois constitue une série de cycles d'amplification. Une série de cycles peut également être répétée plusieurs fois. Dans ce cas, la nouvelle série sera initiée à partir d'un volume de la série précédente à la place de l'échantillon d'ATNC initial.
Détection des protéines :
L'étape (v) de détection des protéines pathologiques peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier.
La détection spécifique de la PrPsc peut être réalisée par une première étape de séparation des deux isoformes PrPc et PrPsc. Cette séparation est effectuée sur la base de propriétés biochimiques de la PrPsc qui permettent de la distinguer des protéines non pathologiques, en particulier le fait que la PrPsc est rapportée davantage résistante aux traitements à base de protéases et moins soluble même en présence de détergents. Ainsi, la première étape après l'amplification est de préférence la séparation de la PrPc (forme normale soluble non pathologique de la PrP) de l'échantillon, qui peut être effectuée par exemple au moyen de traitement par protéase, par exemple la protéinase K, ou par centrifugation pour séparer les formes solubles (PrPc) des formes insolubles (PrPsc).
Dans un mode de réalisation particulier, la digestion par la protéinase K est une étape préalable au Western Blot, digère principalement la PrPc et pas le PrPsc. C'est en effet une propriété de la PrPsc que d'être relativement résistante à la PK comparativement à la PrPc. L'étape de détection ultérieure ne détecte donc plus la forme non pathologique de la protéine car celle-ci a été digérée par la protéase.
L'étape de détection peut être effectuée à l'aide des méthodes suivantes : immunocytochimie (par exemple par marquage des cellules et analyse au Facscan) ou immunochimie (comme le Western-blot ou un test ELISA), ou test de radioactivité, test de fluorescence, microscopie électronique, test de turbidimétrie pour détecter les agrégats, ainsi que des tests structurels incluant la RMN (résonance magnétique nucléaire), le dichroïsme circulaire, la spectroscopie de Raman, l'absorption UV, un anticorps monoclonal reconnaissant la forme pathologique de la protéine, cette liste n'étant pas limitative.
II est également possible de détecter la forme pathologique des protéines au moyen d'un anticorps reconnaissant spécifiquement la forme pathologique et pas la forme non pathologique. Pour rendre sa détection plus aisée, cet anticorps peut être lui-même marqué.. Un tel anticorps peut être par exemple l'anticorps 15B3 (Korth et al., 1997, Nature 1997 Nov6, 390 (6655) : 74-7).
Titrage des A TNC : La détection des formes pathologiques des protéines marqueurs ou de l'ATNC peut être associée à une détermination de la quantité de de ces protéines ou de l'ATNC présent dans l'échantillon.
Le titrage peut être effectué au moyen de toute méthode de titrage connue de l'homme du métier. En particulier il peut être effectué sur le modèle des méthodes décrites dans les documents WO2005022148 et WO2006117483 (notamment les exemples de référence A et B).
L'ensemble des résultats de Western-blot pour les différentes dilutions et les différents réplicats peut être analysé par une méthode statistique connue de l'homme du métier permettant d'établir un titre infectieux, comme par exemple la méthode de Spearman Karber (Schmidt N.J., Emmous R.W., Diagnostic Procédures for viral, ricketsial and chlaveydial Infection, 1989, 6ème Edition).
Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode de calcul du titre est la méthode de Spearman - Karber. Cette méthode suppose la dilution de l'échantillon à tester selon une progression géométrique, c'est-à-dire de raison constante entre les dilutions successives, et un ensemencement d'un volume constant (en général 0,150 ml) de chaque dilution dans cinq puits au moins. Le facteur de dilution le plus couramment utilisé est le facteur décimal.
Pour que la formule de Spearman-Karber soit applicable, il est nécessaire d'utiliser un nombre constant de puits ensemencés à l'aide de chaque dilution, un facteur de dilution constant et une gamme de dilutions suffisamment large pour encadrer à la fois les dilutions de part et d'autres desquelles cent pour cent des puits donneront une réaction positive, et les dilutions de part et d'autre desquelles cent pour cent des puits donneront une réaction négative.
Si une ou plusieurs de ces conditions ne sont pas satisfaites, on suppose parfois que pour un facteur de dilution constant, la dilution supérieure ou inférieure venant après la dernière effectuée aurait donné le résultat souhaité. Une telle "fabrication" de données ne repose sur aucun fondement théorique, mais si elle est appliquée avec suffisamment de prudence, elle n'est pas dangereuse. Cependant, il est préférable de répéter le titrage avec une gamme plus appropriée de dilutions, ce qui est indispensable s'il y a de graves lacunes dans les données.
Selon la formule de Spearman-Karber:
Logio dose médiane = (Xo) - (d/2) + dS (T1Ai1)
où:
Xo= logio de la valeur réciproque de la dilution la plus basse à laquelle tous les inoculums d'épreuve sont positifs.
d= loglO du facteur de dilution, dit aussi « pas de dilution » (c'est-à-dire la différence entre les intervalles des logarithmes de dilution).
U1= nombre d'inoculums d'épreuve utilisés à chaque dilution .
R1= nombre d'inoculums positifs d'épreuve (sur ni).
S (1Vn1) =S (P) = somme de la proportion d'épreuves positives commençant à la dilution la plus basse et donnant cent pour cent de résultats positifs.
La sommation commence à la dilution Xo.
L'écart-type estimatif est calculé à l'aide de la formule suivante:
Log écart-type = d*V(E(p*(l-p)/(ni-l)))
Avec p = V1Zn1 = proportion d'épreuves positives (c'est-à-dire de cupules d'inoculum présentant une réaction) à chaque dilution.
La méthode de l'invention permet de quantifier l'infectiosité liée aux ATNC sur une gamme d'environ 4 log, c'est-à-dire de 10000 unités infectieuses in vitro. Ceci peut, par exemple, permettre de satisfaire aux critères de validation de l'efficacité des procédés d'obtention de produits biologiques vis-à-vis de l'élimination des ATNC. Applications de la méthode de détermination de l'infectiosité liée aux ATNC :
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC. Cette méthode d'évaluation et/ou de contrôle est caractérisée en ce qu'on applique au produit biologique, en amont et en aval dudit procédé, une méthode de titrage selon l'invention, telle que décrite précédemment, et en ce que l'on compare les deux valeurs de titre obtenues. Par comparaison entre les deux mesures, on détermine le degré d'élimination ou le facteur de réduction de l'ATNC.
En particulier, la méthode de titrage selon l'invention a la capacité d'être aisément applicable à tout type de procédé d'obtention ou de purification de produits biologiques, en particulier de produits sanguins, tels que les dérivés de plasma sanguins, utilisant par exemple les chromatographies ou la nanofiltration, en particulier les chromatographies décrites dans les documents EP 0 3 59 593 et WO 02/092632 ou la nanofiltration décrite dans le document WO/2005/022148.
Ainsi, la mise en œuvre de la méthode de l'invention permet d'évaluer et/ou de contrôler l'efficacité d'un procédé (ou d'une partie d'un procédé) d'obtention ou de traitement, voire de purification, de tout produit biologique, susceptible d'être contaminé par un ATNC, dans l'élimination de cet ATNC, grâce à un titrage utilisant des lignées cellulaires transgéniques spécifiques, favorisant la réplication de l'ATNC, mises en contact avec un matériel infectieux ou potentiellement infectieux contenant l'ATNC à tester. On mesure les quantités d'ATNC en amont et en aval du procédé (ou de la partie du procédé) dont on veut apprécier l'efficacité à l'égard de l'ATNC. Par comparaison des deux mesures, on détermine le degré d'élimination de l'agent pathogène. Ainsi, la mise en œuvre de la présente méthode peut être effectuée au cours d'un procédé d'obtention d'un produit biologique ou dans le cadre d'un traitement d'élimination de l'ATNC suivant l'obtention du produit biologique.
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination d'un matériel. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le matériel à décontaminer puis on applique la procédure de décontamination à ce matériel. Enfin, on détermine à nouveau le titre du produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la procédure de décontamination sont comparées pour évaluer l'efficacité de la procédure de décontamination. Le matériel peut, par exemple, être un matériel de purification, en particulier une colonne de chromatographie, ou encore être la sanitisation d'une colonne de chromatographie à l'aide de soude.
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation de la capacité d'un composé candidat à moduler (réduire ou augmenter) le titre du matériel infectieux. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le composé à tester puis on détermine à nouveau le titre du produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la mise en contact de l'échantillon avec le composé à tester sont comparées.
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation d'un composé susceptible d'inhiber l'infectiosité d'un ATNC. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC, en présence puis en absence du composé à évaluer, au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. Les modalités de la mise en présence du composé sont déterminées selon que l'action du composé prévient l'initiation d'un cycle infectieux ou bloque un cycle infectieux déjà initié. Dans tous les cas, on détermine le titre du produit biologique avec et sans traitement avec le produit à tester. Les deux mesures de titre effectuées sont comparées pour évaluer l'activité inhibitrice de l'infectiosité d'un ATNC du composé.
L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'identification d'un composé permettant de moduler la transformation de la forme non-pathologique en la forme pathologique d'une protéine marqueur ou de l'ATNC, par exemple la transformation de PrP en PrPsc. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le composé à tester puis on applique la méthode de titrage de l'invention afin de déterminer à nouveau le titre du produit biologique. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la mise en contact avec le composé sont comparées pour évaluer l'efficacité du composé à tester.
La méthode de l'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui ne limite pas la portée de l'invention.
EXEMPLES :
Matériels et Méthodes
Les cellules MovS6 (Archer F. et al. 2004 supra) ont été sélectionnées comme cellules supportant la réplication des ATNC, et la souche de tremblante 127-S adaptée aux souris transgéniques Tg301 a été utilisée comme source d'infectiosité naturelle (Vilette JL et al. 2001 supra). Les souris transgéniques Tg301 portent un large fragment d'ADN isolé d'une librairie de chromosomes artificiels ovins, et les niveaux d'expression de la PrP ovine est environ 8 fois supérieur à celui observé dans le cerveau de mouton. La source d'infectiosité initiale consistait en un homogénat de cerveaux (lot LN-3326) de souris infectées à 200 mg / ml. Le titre de cet échantillon est de 5.7 logio uWB/ml et 6.35 TCIDso/ml. Culture cellulaire et inoculation : Les cellules MovS6 ont été cultivées en milieu DMEM + Ham-F12 (4 :1) complémenté en glutamine et sérum de veau fœtal (5% final) et incubées à 37°C sous 5% de CO2. Chaque semaine 10% des cellules ont été ré-ensemencées dans chaque puits. Les 90% de cellules restantes ont été soit conservées sous forme de culot cellulaire sec préalablement lavé en PBS, soit éliminées. Des plaques de titrages ont été préparées 24 heures avant l'inoculation. Les cellules ont été ensemencées dans des puits d'environ 2cm2 (format de plaque 24 puits), à raison de 100.000 cellules par puits, soit environ 50.000 cellules/cm2.
L'inoculum était constitué soit de l'échantillon LN-3326 dilué 10 fois, soit d'un échantillon d'homogénat de cerveau sain qui a servi de «Contrôle négatif» (lot : LN-3777). Les inoculations ont été réalisées en 5 réplicats.
Les cellules ont été mises en contact pendant 24 heures avec 150 μl d'inoculum dilué, puis 1 ml de milieu de culture neuf était ajouté. Les cellules ont été maintenues en culture 72 heures supplémentaires, soit jusqu'au premier passage au cours duquel pour chaque puits, la totalité du tapis cellulaire a été transférée dans un puits d'environ 9.6cm2 (format de plaque 6 puits).
La culture cellulaire a alors été maintenue pendant 10 semaines. Chaque semaine, pour chaque puits le milieu de culture a été changé et 10% des cellules ont été re-ensemencées. Les cellules inoculées avec l'inoculum infecté (LN-3326) non re-ensemencées ont été pour 2 réplicats sur les 5, lavées une fois en PBS puis conservées à -800C sous forme de culot sec (échantillons destinés à une amplification selon la méthode de l'invention) et pour les 3 autres réplicats conservées sans lavage préalable en culot sec (échantillons destinés à une détection par WB). Les cellules inoculées avec l'échantillon sain et non re-ensemencées ont été, pour tous les réplicats, conservées sans lavage préalable sous la forme de culot sec. Les culots cellulaires obtenus permettaient d'effectuer les analyses décrites ci après. Détection de la PrPsc dans les cellules :
Les culots cellulaires, conservés à chaque passage, ont permis de rechercher la PrPsc produite par les cellules. La détection de la PrPsc produite a été réalisée soit directement par Western-blot pour les échantillons de culot cellulaire non lavé, soit par un Western blot après amplification par la méthode de l'invention pour les échantillons de culot cellulaire lavé.
- Détection directement par Western-blot : Les échantillons de culots cellulaires non lavés (3 réplicats sur les 5) ont été décongelés et repris dans 60μl de PBS. Les cellules ont été lysées par sonication pendant 15 secondes à l'aide d'un bain à sonication (puissance: 15W). 20μl de lysat cellulaire soniqué ont été prélevés pour être traités par la Protéinase K. Le produit de la digestion a été dénaturé puis analysé par électrophorèse en gel de poly-acrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Les protéines ayant migré dans le gel ont été transférées sur une membrane PVDF par électro-transfert. La PrPsc présente sur les membranes a été détectée par incubation avec l'anticorps 6H4 (Prionics) puis un anticorps secondaire marqué à la phosphatase alcaline (anticorps de chèvre « anti-anticorps de souris »). Les membranes marquées ont été révélées par chemi-luminescence. Un échantillon était considéré comme positif si le profil électrophorétique des trois formes de PrPsc glycosylée était visible sur les autoradiogrammes.
- Détection par la méthode de l'invention : Chacun des échantillons de culots cellulaires lavés a été décongelé puis repris dans 90μl de solution d'homogénat de cerveau sain à 5% et placé en microtube de 200μl. Un cycle des étapes (iii) à (v) était composé d'une phase d'incubation de 30 minutes à température 37°C suivi d'une phase de sonication de 20 secondes. Une série de 50 cycles a été réalisée sur les échantillons à l'aide de l'automate Sonicateur Misonix 3000 (niveau de puissance réglé à 7). A partir de 18μl de produit d'amplification, une digestion par la protéinase K suivie d'une analyse par Western-blot a été réalisée pour détecter la présence éventuelle de PrPsc.
Résultats La détection de la PrPsc dans les différents échantillons est représentée sur la figure et résumée dans le tableau 1.
Tableau 1 : Nombre de puits positifs après détection de la PrPsc dans les lysats de cellules MovS6.
* LN-3326 : inoculum infecté par la souche de scrapie 127S ** LN-3777 : inoculum non infecté Nr : Non testé
Aucun signal de PrPsc n'a été détecté dans l'échantillon constitué d'homogénat de cerveau sain. De même aucun signal n'a été observé dans le lysat de cellules MovS6 inoculées avec cet homogénat de cerveau sain (figure, puits 2 et 13).
Un signal spécifique de la PrPsc a été observé dans l'échantillon constitué d'homogénat de cerveau infecté par la souche de tremblante 127-S dilué 106 fois (figure, puits 14). Compte tenu du titre de 5,7 logio uWB/ml de cet homogénat, de la limite de détection de la méthode du Western-blot de 2.36 logio uWB/ml, la PrPsc dans cet échantillon dilué n'a pas été détectée par la seule méthode du Western-blot.
Un signal spécifique de la PrPsc a été observé dans les lysats des cellules MovS6 inoculées avec l'homogénat de cerveau infecté par la souche 127-S. Ce signal a été observé dès le premier passage (figure, puits 3 à 12).
Conclusions :
Amplification de la PrPsc liée à la souche 127-S dans l'homogénat de cerveau LN- 3326 :
Ces données montrent que la PrPsc associée à la souche 127-S dans l'échantillon d'homogénat de cerveau LN-3326 préalablement dilué 10 fois, peut être amplifiée par la méthode de l'invention. La détection de la PrPsc dans cet échantillon dilué indique que le taux d'amplification est d'au moins 2,5 à 3 logio. Par ailleurs, cette amplification est spécifique de la PrPsc puisqu'aucun signal n'est observé avec l'échantillon d'homogénat sain non dilué.
Amplification de la PrPsc associée à la souche 127-S dans les lysats de cellules : A la dilution étudiée (10" ), l'homogénat LN-3326 a induit la production de PrPsc détectable en Western-blot à partir du 4eme passage. Ce délai correspond au temps nécessaire à la propagation de la PrPsc dans la culture cellulaire pour atteindre le niveau de concentration minimale détectable par Western-blot. Ce délai prouve en outre une production de novo de la PrPsc par les cellules.
Avec la méthode de l'invention, la PrPsc présente dans les cellules infectées est détectée dès le premier passage et pour tous les passages suivants. Cette amplification semble spécifique puisque la PrPsc n'a pas été détectée dans les cellules non infectées.
Ainsi, ces données semblent indiquer que la méthode de l'invention, par rapport à la méthode du Western-blot, permet de détecter plus précocement la PrPsc produite par les cellules infectées.

Claims

Revendications
1. Méthode in vitro de détection et/ou titrage d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, dans un échantillon, comportant les étapes consistant à : i) mettre ledit échantillon en contact avec des cellules supportant la réplication ou la propagation de l'ATNC, ii) cultiver lesdites cellules pour répliquer ou propager IATNC présent dans ledit échantillon, iii) mettre en contact et incuber l'ATNC avec une source de substrat pour la protéine de conformation pathologique et/ou l'ATNC, par ce en quoi la quantité de protéine de conformation pathologique et/ou d'ATNC est amplifiée, iv) désagréger les agrégats éventuellement formés, v) déterminer la présence et/ou la quantité de protéine de conformation pathologique et/ou d'ATNC dans l'échantillon, les étapes (iii) et (iv) constituant un cycle d'opérations qui est répété au moins deux fois avant l'étape (v).
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la protéine de conformation pathologique, marqueur de IATNC, est la protéine prion PrPsc.
3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle les cellules de l'étape (i) sont des cellules dans lesquelles le gène codant pour le conformère non-pathologique de la protéine prion PrP a été intégré.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la détermination de la présence et/ou de la quantité de la protéine de conformation pathologique à l'étape (v) est réalisée par immunochimie ou immunocytochimie.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les cellules sont des cellules épithéliales de lapin, en particulier des cellules de la lignée Rov9.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les cellules sont des cellules gliales murines, en particulier des cellules de la lignée MovS2 ou MovS6.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit cycle des étapes (iii) et (iv) est répété de 5 à 60 fois avant l'étape (v).
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle en ce que l'échantillon est choisi dans le groupe constitué par les produits sanguins et leurs dérivés, les aliments, et les produits cosmétiques.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le substrat pour la forme pathologique de la protéine et/ou pour l'ATNC est apporté sous la forme d'un homogénat de cerveau sain.
10. Méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval dudit procédé, une méthode de titrage selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
1 1. Méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un produit biologique ou d'un matériel, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval de ladite procédure, une méthode de titrage selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
12. Méthode in vitro d'évaluation de la capacité d'un composé à moduler l'infectiosité d'un produit biologique infectieux, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique infectieux, (A) en présence et (B) en absence dudit composé à évaluer, une méthode de titrage selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
13. Méthode in vitro de diagnostic d'une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un sujet humain ou animal non-humain, comprenant la détection de la présence dans un échantillon biologique dudit sujet, d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou d'une protéine de conformation pathologique, marqueur de l'infectiosité de l'ATNC, par la méthode telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 9.
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