EP2257620A1 - Methode zur steigerung der reklonierungseffizienz - Google Patents

Methode zur steigerung der reklonierungseffizienz

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Publication number
EP2257620A1
EP2257620A1 EP09723350A EP09723350A EP2257620A1 EP 2257620 A1 EP2257620 A1 EP 2257620A1 EP 09723350 A EP09723350 A EP 09723350A EP 09723350 A EP09723350 A EP 09723350A EP 2257620 A1 EP2257620 A1 EP 2257620A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cell
cells
protein
medium
interest
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09723350A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen FIEDER
Lore Florin
Hitto Kaufmann
Thomas Krieg
Melanie BRIEGEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc filed Critical Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority to EP09723350A priority Critical patent/EP2257620A1/de
Publication of EP2257620A1 publication Critical patent/EP2257620A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/24—Genital tract cells, non-germinal cells from gonads
    • C12N2502/243—Cells of the female genital tract, non-germinal ovarian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to the field of cell culture technology and relates to methods for propagating / cloning cells, preferably cell lines, that are of importance for the production of biopharmaceuticals. Furthermore, the invention relates to methods for the production of proteins using cells that have been obtained and propagated by means of single cell deposition and compositions that allow an increase of single cells.
  • biopharmaceuticals For the biotechnological production of biologically active or therapeutic proteins in mammalian cells, so-called “biopharmaceuticals”, the corresponding
  • Mammalian cells are stably transfected with DNA specific for the respective biologically active
  • the use of serum-free or chemically defined media in the recloning step results in limited recloning efficiency, i. only a small percentage of the deposited cells survive and grow into a monoclonal cell line.
  • the cell suspension is serially diluted and the cells are then placed in a microtiter plate at different cell counts per well In high cell count wells, sufficient or no cell will survive, due to sufficient secretion of autocrine growth factors. the fewer cells survive, so that in this way the dilution can be adjusted so that statistically only one single cell survives per well and grows into a monoclonal line
  • These single cell clones are detected by visual and / or imaging techniques and the cell ions are cultured further into larger culture vessels ,
  • FACS technology In the FACS technology, a flow cytometer is used to generate single-cell clones. For this purpose, the cells are brought into a laminar flow and individually deflected into the wells of the microtiter plates. This ensures that the surviving colonies are indeed individual clones. Therefore, FACS technology is the preferred method over limited dilution.
  • a particularly disadvantageous effect of low recloning efficiency is when the subsequent analysis of the individual cell clones is to take place via an automated system:
  • An analysis robot can not usually differentiate between wells with living or dead cells and automatically measures all wells of the microtiter plate. With a recloning efficiency of only 10%, this means that in 90% of cases, the robot analyzes an empty well - and uses the same amount of reagents as it does for the analysis of a living cell clone. In case of example! 90% of the time as well as 90% of the material costs are wasted without data gain.
  • Serum contains an undefined mixture of different soluble proteins and growth factors that support the survival and proliferation of cells.
  • serum-free Zeillinienher ein therefore corresponds to the state-of-the-art in regulatory terms.
  • Another approach is to carry out a "limited dilution" for recloning, since this method only statistically leads to the formation of single-cell clones, but it is also possible for several clones to grow up in one well, is a multiple (usually 2-3-fold) repetition of this Necessary to ensure that the cell line obtained is truly a single clone
  • feeder lines Another approach is the use of "feeder” lines, the term comes from the English word “feed” and refers to a co-cultivation with cells that are mostly unable to divide, which serve to nourish the cells of the culture that are actually desired and to supply secreting growth factors.
  • Feeder cells can significantly increase the efficiency of recloning.
  • a disadvantage of this method is the high expense of generating the feeder cells parallel to the actual single cell deposit. Furthermore, the
  • the object of the present invention is to increase the efficiency of recloning in the serum-free FACS-based cloning of production cells.
  • the invention is based on the increase of the recloning efficiency without the use of feeder cells. 5
  • the recloning efficiency and thereby the quantity of the clones obtained can be significantly increased. This effect could be observed from concentrations of 100-500 ⁇ g / L IGF or 50-100 mg / L insulin in the cloning medium.
  • the effect of IGF on the recloning efficiency is significantly higher than that of insulin.
  • the use of IGF in insulin-free medium is therefore a preferred embodiment.
  • Optimum curves are observed with respect to recloning efficiency in both insulin and IGF.
  • the optimum for insulin is 100mg / L and for IGF 500 ⁇ g / L.
  • the level of recloning efficiency when using IGF is higher.
  • iGF optionally with feeder cells and albumin, in particular HSA
  • HSA histone deacetylase
  • albumin especially serum albumin (HSA) into the culture medium causes an increase in the recloning efficiency.
  • HSA serum albumin
  • a clear effect is already visible at low albumin, in particular HSA concentrations from 100 mg / L and can be increased by higher Albumi ⁇ - / HSA concentrations of 400-1000 mg / L even more.
  • albumin / HSA addition 500 mg / L.
  • Bumin / HSA concentration optimum in IGF-containing medium (without insulin supplement) is below 1000 mg / l (see Figures 2, 3 and 4).
  • the optimum concentration of albumin / HSA is in the range of 300-600 mg / l or 400-600 mg / l, preferably in the range of 400-500 mg / l, particularly preferably 400 mg / l. Also particularly preferred is an albumin / HSA concentration of 500 mg / l.
  • -6- Purified human material, recombinant material (from prokaryotes or eukaryotes) or recombinant plant material may be used as albumin / HSA-Que!
  • the highest recloning efficiency can be achieved by a combination of these approaches, i. the addition of IGF and Aibumin / HSA to a serum and insulin-free culture medium.
  • additional feeder cells can be used.
  • the primary target of recloning is the identification of high-producing cell clones.
  • Higher recloning efficiency due to the broader base of clones obtained and due to a normal distribution of clones in terms of productivity, leads to a higher probability of obtaining high-producing cell clones.
  • a further advantage of the method described is that the addition of IGF or insulin and optionally albumin / HSA increases the recloning efficiency to such an extent that feeder cells can be dispensed with. This reduces on the one hand the expense in the production and preculture of the feeder cells and at the same time increases the reproducibility of Einzelzeliklontechnik. Furthermore, it allows the use of technologies for the visual detection of the living cell count as a tool for clone analysis. Since the amount of product in the culture medium correlates linearly with the number of producing cells, the technological development is to record both the amount of product and the number of cells in order to determine the highest-producing cell clones.
  • feeder cells from the growing production cells are difficult to distinguish visually, they are included in themayl cell count, which leads to an inaccurate calculation of the total cell count and thus the specific productivity.
  • a method without feeder cell is therefore advantageous and represents a preferred embodiment.
  • the process further increases the cost-effectiveness of this process step and also enables the use of automated clone analysis technology in high-throughput.
  • the prior art describes the use of special media compositions to increase the recloning efficiency (WO2006047380).
  • Insulin is described as an essential component.
  • the use of IGF in place of insulin is explicitly pointed out as an alternative and superior possibility.
  • the data of the present application show that in particular by the combination of iGF ⁇ preferably ⁇ 800 ⁇ g / l or 100-500 ⁇ g / l) and albumin, in particular HSA (preferably ⁇ 1000 mg / l or 300-600 mg / l, in particular preferred 400-500mg / L) in an insulin-free medium, a further increase in recloning efficiency can be achieved.
  • the albumin (in particular HSA) concentrations used are in the present patent application below 1000 mg / l and thus significantly below those in the cited WO2006047380 patent.
  • DG44 cells are cultured for at least five passages in five varying media containing 5 different concentrations of IGF or insulin
  • FIGURE 2 is a diagrammatic representation of FIGURE 1
  • DG44 cells are cultured for at least five passages in BI-own medium (containing 50 ⁇ g / l IGF but no insulin) supplemented with different HSA concentrations (40, 400 and 1000 mg / l) and feeder cells.
  • Anschuessend individual cells are cloned using FACS. After 21 days, the growing clones are counted and the recloning efficiency is determined. For simplicity, the recloning efficiency is normalized, i. the highest value received is set to 100%.
  • DG44 and NSO cells are cultured in the appropriate media for at least five passages. Anschuessend individual cells are cloned using FACS. After 21 days, the growing clones are counted and the
  • Recloning efficiency normalized, i. the highest value received is
  • DG44 cultured in Bl-own medium without insulin supplement
  • 50 ⁇ g / l or 500 ⁇ g / l IGF supplement and with or without 500mg / l HSA supplement in the medium DG44 cells are cultured in the appropriate media for at least five passages. Subsequently, individual cells are cloned using FACS. After 21 days, the growing clones are counted and the recloning efficiency is determined. For simplicity, the recloning efficiency is normalized, i. the highest value received is set to 100%.
  • insulin is known to those skilled in the art There are a number of different insulin molecules (Gilman, AG et al., Eds., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, 1990, pp. 1463-1495) is Z, B. Zinc insulin Commonly used in cell culture is human zinc insulin or recombinant insulin The concentration of insulin
  • -11- can be measured in culture medium using routine experiments such as a commercially available insulin-specific ELISA.
  • insulin-free means that the culture medium contains no insulin, in particular no recombinant insulin and no insulin is added to it.
  • Albumin is the most abundant protein in plasma. It is produced in the liver and contributes to the maintenance of osmotic pressure in the blood. Albumin binds to nutrients and metabolites, helping to transport them.
  • albumin In serum-containing cell culture media, albumin is often the dominant serum component.
  • a preferred embodiment of the present invention is a biochemically defined serum-free and insulin-free single-cell cloning medium containing serumaibumin.
  • the term "albumin” in the present invention means a polypeptide component having the biological activity of albumin, which generally refers to any animal albumin, in particular a mammalian, such as human, bovine, equine, murine, rat and swine albumin, as well as albumin from birds, in particular
  • the albumin is human serum albumin (HSA)
  • HSA human serum albumin
  • the albumin is not derived from a natural animal source (serum).
  • recombinant or synthetic albumin especially recombinant HSA.
  • Recombinant HSA The production of recombinant HSA is well known in the art and may e.g. with the help of genetically modified yeasts (U.S.Patent No. 5,612,197).
  • Recombinant HSA can be obtained commercially from various suppliers, for example via Sigma-Aldrich (Recombinant HSA, Cat. No, A-7223).
  • HSA concentration of HSA can be determined by routine methods such as a commercially available ELISA (eg "Human Albumin ELISA Quantitation Kit", Bethyl Laboratories, Montgomery, TX).
  • the cell culture medium contains recombinant aibumin in a concentration sufficient to promote the growth of a single cell, especially a single CHO
  • recombinant albumin is in one
  • cloning / recloning in the context of Zeilkuitur means a technique by means of which one can obtain a cell population of identical cells from a cell of origin.
  • cell cloning or “single cell cloning” thus means a method in which individual cells are identified from a cell pool with cells of different genotype, isolated and then propagated to a cell population consisting of a multiplicity of genetically identical cells. If the cells are stored individually for this purpose, i.
  • Single clones or “single cell clones” or “clones” for short are genetically identical cells derived from one (1) single cell
  • a pool of stably transfected cells is not a cell clone of the same lineage, ie not a monoclonal cell population, even if genetically identical starting cells are transfected with an identical nucleic acid.
  • subclones / subcultures refers to different generations of cells originating from a cell of origin / culture by single or multiple passaging of the dividing cells, for example, “subclones / subcultures” when identical cells / cell cultures are cultured over several generations and be propagated.
  • cloning efficiency or “recloning efficiency” is defined as the percentage of cells that survive, divide, and form vital cell populations after storage. If, for example, 100 cells are distributed to 100 culture vessels in the case of cell sorting and 25 of these 100 individually deposited cells grow to cultures, the cloning efficiency is 25%.
  • effective or efficient recloning is meant a cloning efficiency of at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, and even more preferably at least 40%, according to a particularly preferred embodiment of the present invention effective recloning, a cloning with an efficiency of at least 50%, preferably of at least 60%, more preferably of at least 70% and even more preferably of at least 80%.
  • divisible / expandable in the sense of the present invention describes the potential of a tents / cell population to be able to divide endlessly, but at least over 2, preferably 4. This potential can be achieved, for example, by irradiation with 11371 Cs or mitomycin C treatment be reduced or completely disturbed.
  • derivative / derivative refers to cells genetically derived from a particular parent cell, such as by subculturing (with or without selection pressure) and / or generated by genetic manipulation, re-iso-cellizations of cells of the same cell type are also from the term "derivative / derivative".
  • all CHO cell lines are derivatives / derivatives of the hamster ovary cells isolated from Cricetulus griseus by Puck et al., 1958, regardless of whether they were obtained by subculturing, re-isolation or genetic manipulations.
  • feeder cell comes from the English word “feed” and means a co-cultivation with mostly divisive cells, which serve to supply the actually desired times of the culture with nutrients and sekret mandat growth factors.
  • living cells are arrested by irradiation with UV or gamma rays or treatment with mitomycin C in growth.
  • the resulting feeder lines live and produce and secrete growth factors but are unable to divide.
  • autologous feeder cell means that both the toll ⁇ ter cell and the row to be cultured in the presence of this feeder cell originate taxonomically from the same origin: for example, if the cell to be cultured is a hamster cell (subfamily Cricetinae), preferably around a cell of the genus Cricetulus or Mesocricetus, for example, a CHO or BHK cell, so each of this subfamily originally isolated
  • the term "autoimmune feeder line” means that both feeder cell and the cell to be cultivated originate taxonomically from the same genus or were originally isolated from the same genus (cell from Cricetulus or Mesocricetus, respectively) the cell to be cultivated, for example, a hamster cell of the genus Cricetulus or Mesocricetus, preferably a CHO or a BHK cell, so each of the respective genus originally isolated fairofer cell represents an autoimmune feecfer cell in the context of this invention.
  • an "auto-renal feeder cell” is present if the feeder cell and the cell to be cultivated originate from the same species, for example Cricetulus griseus or Mesocricetus auratus
  • there is an "auto-oxygenated feeder cell” if feeder cell and the cell to be cultivated come from the same species and have the same tissue tropism (eg Cricetulus griseus ovarian cells - CHO cells).
  • a feeder cell is an autoimmune feeder cell when both the feeder cell and the cell to be cultivated are from the same basic cell, for example, when both cells are originally CHO-DG44 cells or Descendants of this cell is.
  • the feecfer line conveys the same resistances, e.g. to antibiotics, such as the cell to be cultured. This is particularly advantageous if the cell deposition in the presence of a selection agent, e.g. an antibiotic.
  • limited dilution refers to an alternative method for recloning, in which a cell suspension is serially diluted and the cells are subsequently deposited in a microtiter plate with different cell counts per well, in wells with high cell numbers several or all cells become due to sufficient secretion of autocrine growth factors
  • FACS technology In the FACS technology, a fluorescence-activated cell sorter (Flow Cytometer) is used to generate single cell clones. For this purpose, the cells are brought into a laminar flow and individually deflected into the wells of the microtiter plates. This ensures that the surviving colonies are indeed individual clones. Therefore, FACS technology is the preferred method over limited dilution.
  • Flow Cytometer Fluorescence-activated cell sorter
  • serum refers to the cell-free constituent of the blood Serum contains an undefined mixture of different soluble proteins and growth factors, which support the survival and proliferation of cells.
  • FBS bovine serum
  • Typical concentration ranges are 10-20% FCS or FBS as an addition to the culture medium.
  • serum-free means culture media as well as culturing conditions, characterized in that cells in the absence of animal and / or human serum, preferably in the absence of any
  • Serum isolated proteins preferably in the absence of non-recombinant proteins are cultivated.
  • the term "cells adapted to serum-free conditions" means those cells which can be propagated in the absence of animal or human serum or serum proteins.
  • protein-free means that the culture medium contains no animal proteins, with proteins isolated from bacteria, yeasts or fungi not being understood as animal proteins.
  • chemically defined describes a cell culture medium which is serum-free, preferably also protein-free, and which consists of chemically defined substances Chemically defined media thus consist of a mixture of predominantly pure individual substances
  • An example of a chemically defined medium is, for example, the CD CHO medium from Invitrogen (Carlsbad, CA, US).
  • serum-cultured cell refers to cells that are adapted to growth in liquid cultures (“suspension cultures”) and whose ability to adhere to vascular surfaces, such as cell culture dishes / bottles, has been reduced or lost.
  • Cells that are adapted to both serum-free growth and growth in suspension are referred to as "serum-free medium-adapted and non-adherent cells.” When these cells are produced from feeder cells, these cells are by definition by-products "Feeder lines adapted to serum-free medium and not adherent".
  • Conditioned medium means medium from a culture of living cells which is filtered and added to the fresh medium in the seeding microtiter plates.
  • the effect of the conditioned medium is based on its content of growth factors which sericinate from the cells of the preculture into the medium
  • Conditioned medium clearly has a positive effect on recloning efficiency, but the gains achieved are insignificant and insufficient as a sole measure of practical application.
  • Biopharmaceutically significant proteins / polypeptides include e.g. Antibodies, enzymes, cytokines, lyrnphokines, Adscosionsmoieküle, receptors and their derivatives or fragments, but are not limited to these. In general, all polypeptides that act as agonists or antagonists and / or find therapeutic or diagnostic use are important.
  • Other proteins of interest are, for example, proteins / polypeptides which are used for altering the properties of host cells in the context of so-called "cell engineering", such as anti-apoptotic proteins, chaperones, metabolic enzymes, glycosylation enzymes and their derivatives or fragments, but are not limited to these.
  • polypeptides is used for amino acid sequences or proteins and refers to polymers of amino acids of any length. This term also includes proteins which are posttranslationally modified by reactions such as cytosylation, phosphorylation, acetylation or protein processing , Deletions or insertion of amino acids, fusion with other proteins, while retaining its biological activity, and the polypeptides may multimerize to form homo- and heteromers.
  • Recombinant proteins are proteins which are produced by recombinant expression in host cells. Such recombinant proteins are produced under highest purity conditions in order to minimize the risk of contamination. Recombinant proteins are usually produced in appropriate host cells, e.g. Yeast cells, animal cells or prokaryotic cells (E. coli or other bacterial strains)
  • an expression vector such as a purified plasmid, bacteriophage, isolated DNA, mRNA, virus or other nucleic acid is used to introduce the recombinant protein into the host cell and integrate it into the host cell chromosome.
  • Eukaryotic expression systems are preferred because they typically possess the necessary cellular machinery to properly modify, process, and fold complex mammalian proteins such as antibodies.
  • Recombinant HSA is available, for example, from various commercial suppliers such as Sigma Aldrich.
  • therapeutic proteins are insulin, insulin-like growth factor, human growth hormone (hGH) and other growth factors, receptors, tissue plasminogen activator (tPA), erythropoietin (EPO), cytokines, for example, interleukins (IL) such as IL-1, IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-Q 1 IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15 , IL-16, IL-17, 1L-18, interferon (fFN) -a-pha, beta, gamma, omega or tau, tumor necrosis factor (TNF) such as TNF-alpha, beta or gamma, TRAIL, G-CSF, GM- CSF, M-CSF, MCP-1 and VEGF.
  • TNF tumor necrosis factor
  • antibodies are monoclonal, polyclonal, multispecific and single chain antibodies and fragments thereof, such as Fab, Fab ', F (ab') 2, Fc and Fc 'fragments, light (L) and heavy (H) immunoglobulin chains and their constant, variable or hypervariable regions as well as Fv and Fd fragments.
  • the antibodies may be of human or non-human origin. Humanized and chimeric antibodies are also considered.
  • fragment antigen-binding Fab
  • Fab fragments consist of the variable regions of both chains, which are held together by the adjacent constant regions. You can e.g. by treatment with a protease, such as papain, are generated from conventional antibodies or by DNA cloning. Other antibody fragments are
  • -20- F (ab ') 2 fragments which can be prepared by proteolytic digestion with pepsin.
  • VH variable region of the heavy
  • variable part Since covalent attachment via the cysteine residues of the constant chains is not possible with these Fv fragments, these Fv fragments are often otherwise stabilized.
  • variable region of heavy and light chain often by means of a short
  • scFv Single-chain Fv fragment
  • multimeric scFv derivatives In recent years, various strategies have been developed to produce multimeric scFv derivatives. The intention is to produce recombinant antibodies with improved pharmacokinetic properties and enhanced binding avidity. To achieve the suckerimerization of the scFv fragments, these are prepared as fusion proteins with multimerization domains. As the multimerization domains, e.g. the CH3 region of an IgG or coiled coil structures, such as the leucine zipper domains, in other strategies, the interaction between the VH and VL regions of the scFv fragment is used for multimerization (eg, , Tri- and pentabodies).
  • multimerization domains e.g. the CH3 region of an IgG or coiled coil structures, such as the leucine zipper domains
  • the interaction between the VH and VL regions of the scFv fragment is used for multimerization (eg, , Tri- and pentabodies).
  • a shortening of the peptide linker in the scFv molecule to 5-10 amino acids results in the formation of homodimers by superimposition of VH / VL chains .
  • the diabodies can additionally be stabilized by introducing disulfide bridges Examples of diabodies can be found in the literature.
  • mi ⁇ ibody refers to a bivalent, homodimeric scFv derivative which consists of a fusion protein which contains the CH3 region of an immunoglobulin, preferably IgG, particularly preferably IgGI, as the dimerization region which links the scFv fragments via a hinge protein. Region, also of IgG, and an unker region ..
  • trimers in the fragments designated bi-, tri- or They are also derivatives of scFv fragments, with multimerization being achieved via di-, tri-, or tetrameric coiled-coil structures.
  • antibody fusion or “antibody fusion protein” refers to the fusion / coupling of a protein with an antibody or part of a protein
  • Antibody Specifically, these include genetically engineered fusion proteins in which a therapeutic protein is coupled to the Fc portion of an antibody to thereby increase serum half-life / stability of the protein.
  • the term also includes antibody fusions consisting of a peptide and an antibody or part of an antibody.
  • preferred host cells are hamster cells, such as BHK21, BHK TK “, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1, and CHO-DG44 cells or derivatives / descendants of these Zeilünien.
  • Particularly preferred are CHO-DG44, CHO DUKX, CHO-K1 and BHK21 cells, in particular CHO-DG44 and CHO-DUKX cells
  • mouse myeloma cells preferably NSO and Sp2 / 0 cells, as well as derivatives / derivatives of these cell lines.
  • hamster and mouse cells which can be used according to the invention are given in the following Table 1.
  • other mammalian cells including, but not limited to, human, mouse, rat, monkey, rodent, or eukaryotic cells, including, but not limited to, yeast, insect, avian, and plant cells, may also be used be used as host cells for the production of biopharmaceutical proteins.
  • Recombinant mammalian cells preferably rodent cells, more preferably hamster cells, e.g. CHO or BHK cells.
  • Host cells are preferred when established, adapted, and cultured completely under serum-free conditions. Particularly preferred are host cells which are additionally established in medium, adapted and completely cultured, which is not only serum-free, but also free of any proteins / peptides of animal origin.
  • production cell or “producer cell” or “production clone” refers to a cell that is used in a process to produce a protein.
  • these include ge ⁇ etisch-modified cells that are used for the industrial production of recombinant proteins.
  • the term primarily refers to genetically-altered eukaryotic host cells which express a recombinant protein and are used for the production of this protein. These include in particular monoclonal cell lines for the production of therapeutic proteins.
  • the present invention relates to a method / method for cultivating a single line (1) comprising the following steps: a) cultivating a cell population, b) isolating one (1) single cell from said cell pool, and c) cultivating said single cell in a serum-free one and insulin-free medium containing insulin-like growth factor (IGF).
  • IGF insulin-like growth factor
  • the method according to the invention is characterized in that the medium IGF is contained in a concentration of less than 800 ⁇ g / l. Further preferred concentration ranges for IGF are 50-750 ⁇ g / L, and particularly preferred are 250-750 ⁇ g / L. ideally the IGF concentration is 500 ⁇ g / L.
  • the method according to the invention is characterized in that the isolation of the individual cell takes place by means of FACS.
  • the method according to the invention is characterized in that the cell originates from an established, immortalized cell line.
  • the cell is a recombinant cell, that is, it is a genetically engineered cell.
  • said cell is a cell which produces recombinant or heteroioge proteins.
  • it is a production cell used in biopharmaceutical protein production.
  • the present invention thus relates in particular to a method / a method for culturing a (1) individual recombinant production cell comprising the following steps: a) culturing a cell population, b) isolating one (1) individual recombinant production cell from said cell pool using FACS and
  • IGF insulin-like growth factor
  • the method according to the invention is characterized in that the cell is a non-human cell, preferably a hamster or mouse cell.
  • the method according to the invention is characterized in that the cell is a rodent cell, preferably a hamster or mouse cell.
  • the method according to the invention is characterized in that the cell is a Chinese hamster ovary (CHO) cell Another preferred cell is the NSO cell.
  • the method according to the invention is characterized in that said row is a eukaryotic cell such as a yeast, plant, worm, insect, avian, fish, reptile or mammalian cell.
  • the cell is a chicken or duck bird cell.
  • a eukaryotic cell if it is a vertebrate cell, especially if it is a mammalian cell.
  • the method according to the invention is characterized in that said mammalian cell is a Chinese hamster ovary (CHO) 1 a monkey kidney cell CV1, a monkey kidney cell COS, a human lens epithelium PER.C6 TM, a human embryonic kidney cell HEK293 or a human Myeloma cell, a human amniocyte cell line, a baby hamster ovary, an African green monkey kidney cell, a human cervical carcinoma cell line, a canine kidney cell, a rat liver cell, a human lung cell, a human liver cell, a mouse breast cancer cell or if it has a myeloma cell, a canine, Pig or Macaquenzelle is or a cell from the rat, rabbit, rabbit, cat, goat.
  • the method according to the invention is characterized in that said cell is a CHO cell type cell, a CHO K1 cell, a CHO DG44 cell, a CHO
  • CHO mutants Led to Lec35 Especially preferred is the CHO DG44 line.
  • the method according to the invention is characterized in that the medium additionally contains albumin.
  • albumin Preference is given here to recombinant albumin or human serum albumin (HSA). Particularly preferred is human recombinant serum albumin.
  • the method according to the invention is characterized in that albumin is contained in a concentration of less than 1 g / l.
  • the albumin / HSA concentration optimum in IGF-containing medium (without insulin supplement) is below 1000 mg / l (see Figures 2, 3 and 4).
  • Other preferred albumin / HSA concentration ranges are 250-999 mg / L, 250-900 mg / I and 250-750 mg / L.
  • a concentration of 400 mg / l and of 500 mg / l albumin in particular of recombinant human serum albumin.
  • the concentration optimum of albumin / HSA is in the range of 300-600 mg / l and 400-600 mg / l, preferably in the range of 400-500 mg / l.
  • the method according to the invention is characterized in that the single cell is cultured in the presence of feeder cells.
  • feeder cells are preferably autologous feeder cells, more preferably autologous CHO feeder cells.
  • the method according to the invention is characterized in that the isolation of one (1) individual cell in step b) is achieved by "limited dilution" or by means of a fluorescence activated cell sorting (FACS) device. Particularly preferred is the isolation of one (1) single cell by means of FACS.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the method according to the invention is characterized in that the line ( ⁇ ) in step a), b) and c) expresses a protein of interest.
  • the method according to the invention is characterized in that the protein of interest is a therapeutic protein, preferably an antibody, an antibody fusion protein or an antibody fragment.
  • the method according to the invention is characterized in that the protein of interest is a membrane-bound or a secreted protein, preferably an antibody, an antibody fusion protein or an antibody fragment.
  • Said antibody is preferably a monoclonal, polyclonal, mammalian, murine, chimeric, humanized, primatized, primate, human or antibody fragment or derivative thereof such as immunoglobulin light chain, immunoglobulin heavy chain, immunoglobulin light and heavy chain , a Fab fragment, an F (ab ') 2 fragment, an Fc part, an Fc-Fc fusion protein, an Fv fragment, a "single chai ⁇ " Fv fragment, a "single domain” Fv fragment, a tetravalent "single chain” Fv fragment, a disulfide-linked Fv fragment, a domain of deleted antibody or fragment, a "minibody", "diabody”, or a fusion polypeptide of one of said fragments with another peptide or polypeptide, an Fc-peptide fusion, a Fc-toxin infusion or a "scaffold" protein.
  • a preferred embodiment of the invention consists in the use of conditioned medium in order to increase the recloning efficiency, in particular after FACS-based single cell deposition.
  • the method according to the invention is characterized in that conditioned medium is used.
  • Conditioned medium is used in particular as a base medium or as a media additive in steps a) and / or b) and / or c). Preference is given to conditioned medium
  • conditioned medium is used in step c) as the base medium or as a media additive.
  • the proportion of conditioned medium may be from 10 to 100% of the total volume of medium, preferably a proportion of 30-75%, more preferably 50% conditioned medium.
  • the present invention also relates to a cell which is generated by a method according to the invention.
  • the present invention further relates to a method for producing a protein of interest in a cell, preferably a CHO line, under serum-free and insulin-free culture conditions comprising the steps of: a) producing a cell population containing a gene of interest which (c) culturing these cells under culture conditions allowing growth of the cells, c) isolating and depositing a single cell into a vessel, preferably into a 96 well plate, d) cultivating said single cell in Serum-free and
  • Insulin-free medium containing IGF optionally in the presence of albumin and / or feeder cells, e) selection of a cell according to its expression level
  • Protein of interest f) harvesting the protein of interest, for example by separating the cell portion from the supernatant; and g) purifying the protein of interest.
  • the method according to the invention is characterized in that preferably autologous feeder cells are used in step d).
  • the IGF concentration of less than 800 ⁇ g / l have.
  • the IGF concentration is preferably in the range between 50-750 ⁇ g / L, and particularly preferably in the range between 250-750 ⁇ g / L. Ideally, the IGF concentration is 500 ⁇ g / L.
  • Albumin (especially HSA) concentration of less than 1000mg / l include.
  • Albumin concentration is preferably in the range between 250-999 mg / L,
  • the optimum concentration of albumin, in particular HSA, is in the range of 300-600 mg / l or 400-600 rng / l, preferably in the range of 400-500 mg / l.
  • the method according to the invention is characterized in that the isolation of a single cell in step c) is performed by FACS.
  • DG44 cells are used.
  • step e) is automated.
  • an analysis robot is preferably used in e).
  • Such an automated method is particularly characterized in that the automated system consists of: i) (robot) station performing FACS-based single-cell cloning, ii) incubating to cultivate the lines after single cell cloning, linked to iii) robot station containing a protein -,
  • antibody-detecting assay performs, such as ELISA or HTRF ® (homogenous time resolved fluorescence) assay.
  • ELISA ELISA
  • HTRF ® homogenous time resolved fluorescence
  • the method according to the invention is characterized in that the protein of interest is a recombinant protein.
  • the method according to the invention is characterized in that the protein of interest is a therapeutic protein, preferably an antibody, an antibody fusion protein or an antibody fragment.
  • the method according to the invention is characterized in that the protein of interest is a membrane-bound or a secreted protein, preferably an antibody, an antibody fusion protein or an antibody fragment.
  • Said antibody is preferably a monoclonal, polyclonal, mammalian, murine, chimeric, humanized, primatized, primate, human or antibody fragment or derivative thereof such as immunoglobulin light chain, immunoglobulin heavy chain, immunoglobulin light and heavy chain , a Fab fragment, an F (ab ') 2 fragment, an Fc part, an Fc-Fc fusion protein, an Fv fragment, a "single chai ⁇ " Fv fragment, a "single domain” Fv fragment, a tetravalent "single chain” Fv fragment, a disulfide-linked Fv fragment, a domain of deleted antibody or fragment, a "minibody", "diabody”, or a fusion polypeptide of one of said fragments with another peptide of one
  • the present invention thus relates in particular to a method for producing a protein of interest, preferably an antibody, in a recombinant production time, preferably a CHO cell, under serum-free and insulin-free culture conditions comprising the following steps: a) Preparation of a cell population which a gene of interest which codes for a protein of interest; b) cultivation of these cells under serium-free culture conditions permitting growth of the cells; c) isolation and deposition of a single cell into a vessel, preferably into a 96-well plate , by FACS, d) cultivation of said single cell in serum-free and insulin-free medium containing IGF in a concentration below 800 ⁇ g / l or in a range of 250-750 ⁇ g / [, preferably 500 ⁇ g / l, preferably in the presence of Albumin in a concentration below 1000 mg / l and / or feeder cells, e) selection of a cell corresponding to i HREM level of expression of protein of interest, this selection is preferably
  • the present invention further relates to a protein which is produced by a method according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for selecting a production cell, wherein a method according to the invention as described above in various embodiments is applied.
  • the production cell according to the invention is characterized in that it is selected by one of the methods described according to the invention.
  • the production cell according to the invention is characterized in that the host cell is a hamster or mouse cell.
  • the production cell according to the invention is characterized in that the host cell is a hamster cell or a mouse myeloma cell, preferably a CHO or BHK cell. ZeIIe or an NSO cell.
  • a CHO DG44 cell is especially preferred.
  • the present invention further relates to the use of a production cell for biopharmaceutical protein production according to the invention.
  • the present invention also relates to a serum-free and insulin-free culture medium which enables the cultivation of one (1) single cell containing IGF (preferably ⁇ 800 ⁇ g / l or 250-750 ⁇ g / l, in particular 500 ⁇ g / l) and optionally Albumin (preferably ⁇ 1000 mg / l or 300-600 mg / l or 400-500 mg / l).
  • the single cell here is a CHO cell, particularly preferably a CHO DG44 cell.
  • the cells CHO-DG44 / dhfr (, Urlaub et al. 1983) " ' ⁇ are constantly supplemented as suspension lines in serum-free and with hypoxanthine and thymidine ex-Ceii medium (JRH, USA) or B -private medium Zelikulturflaschen! .
  • the cells NSO can be permanently cultured as suspension cells in serum-free hybridoma medium, Animal component-free medium (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA) in ZeI Iku Itu rf flaschen at 37 0 C in a humid atmosphere and 5% CO 2 .
  • the celizahia and viability can be determined with a CEDEX Cell Counter (Innovatis, DE) or trypanebiau staining and the cells are then seeded at a concentration of 1-3 x 10 5 / mL and passaged every 2-3 days.
  • the cells are irradiated with a radioactive radiation source (Cs137 Strahier, Gammacell 2000, Molsgaard Medical
  • the cells are seeded with ca, 10000 cells / well in 96-well microtiter plates in the cell-specific Ex-Ceil medium (JRH, USA) or Bl-own medium (eg TH-9) medium and at about 37 ° C and 5% CO 2 stored in Brutraumatmospreheat.
  • JRH, USA cell-specific Ex-Ceil medium
  • Bl-own medium eg TH-9
  • the process is carried out in accordance with NSO cells, wherein the feeder cells are kept / seeded in each specific for the cell medium.
  • the conditioned medium is obtained from the supernatant of a CHO cell culture.
  • the CHO cells are seeded at a seeding density of 0.3 ⁇ 10 6 cells / ml and cultured for two to four days.
  • the supernatant is separated from the cells by centrifugation and then sterile filtered through an O, 2 ⁇ m filter.
  • the resulting filtrate is used as a conditioned medium.
  • Cells expressing a fluorescent protein can alternatively be sorted according to their fluorescence intensity with respect to the intracellularly expressed fluorescent protein, and the cells are individually deposited in (optionally) 96 well microtiter plates equipped with feeder cells the cell deposition in Ex-CeII medium (JRH, USA) or in Bl-own medium (eg TH-9) with the appropriate supplements to IGF or Insulin and optionally or preferably HSA.
  • Ex-CeII medium JRH, USA
  • Bl-own medium eg TH-9
  • the cell deposit is carried out according to Hybridoma medium, Animal component free medium (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA).
  • CALCULATION OF THE RECONCILIATION EFFICIENCY Recloning efficiency is calculated from the quotient of positive wells per plate / total wells per plate. Positive wells are considered to be wells containing exactly one clone.
  • CHO DG44 cells are adapted for 5 passages to B [s own, serum-free medium. This is followed by a FACS-based single cell deposit with different insulin and IGF concentrations in medium supplemented with 500 mg / L HSA. After 21 days, the tall clones are counted and calculated from the proportion of grown clones in the total number of wells used, the recloning efficiency. Optimum curves can be observed for both insulin and IGF. The optimum for insulin is 100mg / L and for IGF 500 ⁇ g / L. ( Figure 1) The level of recloning efficiency when using IGF is higher than with insulin.
  • CHO DG44 cells are adapted for 5 passages the basal medium ExCeII 302 or lead medium (containing 50 ⁇ g / l IGF, but no insulin supplement). This is followed by a FACS-based single cell deposit with different HSA concentrations with and without feeder cells. After 21 days, the tall clones are counted and from this the proportion of grown clones in the total amount! the wells used calculated the recloning efficiency. It shows a positive effect of
  • Figure 2 shows that the HSA concentration optimum in IGF-containing medium (without insulin supplementation) at less than 100.0 mg /! lies.
  • CHO DG44 and NSO cells are adapted for 5 passages to Bl's own medium (CHO DG44) or CD hybridoma medium (Invitrogen). Thereafter, a

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Zellkulturtechnologie und betrifft Verfahren zur Vermehrung/Klonierung von Zeilen, vorzugsweise von Zeillinien, die für die Produktion von Biopharmazeutika von Bedeutung sind. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Proteinen unter Verwendung von Zellen, die mittels Einzelzeilablage gewonnen und vermehrt wurden sowie Zusammensetzungen, die eine Vermehrung von Einzelzellen ermöglichen. Durch die Verwendung von IGF insbesondere in Verbindung mit HSA im Kultivierungsmedium nach der Reklonierung kann die Reklonierungseffizienz und dadurch die Quantität der erhaltenen Klone signifikant gesteigert werden.

Description

METHODE ZUR STEIGERUNG DER REKLONIERUNGSEFFIZIENZ
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
TECHNISCHES GEBIET Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Zellkulturtechnologie und betrifft Verfahren zur Vermehrung/Klonierung von Zellen, vorzugsweise von Zelllinien, die für die Produktion von Biopharmazeutika von Bedeutung sind. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Proteinen unter Verwendung von Zellen, die mittels Einzelzellablage gewonnen und vermehrt wurden sowie Zusammensetzungen, die eine Vermehrung von Einzelzellen ermöglichen.
HINTERGRUND
Der Markt für Biopharmazeutika für die Therapie im Menschen wächst weltweit stark an mit einer Rate von 270 neuen Biopharmazeutika, die sich in klinischen Studien befinden und einem geschätzten Umsatzpotentia! von 30 Milliarden im Jahre 2003 (Werner 2004).
Momentan wird eine immer größer werdende Anzahl an Biopharmazeutika in Säugerzellen produziert, da diese die Fähigkeit zur korrekten Prozessierung und Modifikation eines humanen Proteins besitzen. Die erfolgreiche und ertragreiche Produktion von Biopharmazeutika in Säugerzellen ist daher entscheidend und hängt von den Charakteristika der rekombinanten monoklonalen Produzentenzelllinie ab, die im Herstellungsprozess verwendet wird. Darüber hinaus ist die Dauer der Zelllinieneπtwicklung ein entscheidender Zeitfaktor dabei wie schnell das Biopharmazeutikum in die klinischen Studien eintreten kann. Im Hinblick auf diese Aspekte besteht eine dringende Notwendigkeit, den Zelllinien- Entwickiungsprozess zu beschleunigen und effizienter zu gestalten.
Zur biotechnologischen Herstellung von biologisch aktiven bzw. therapeutischen Proteinen in Säugerzellen, sog. „Biopharmazeutika", werden die entsprechenden
Säugerzellen mit DNA stabil transfiziert, die für das jeweilige biologisch aktive
-1- Protein (oder seine Untereinheiten) kodiert. Nach dem Transfektionsprozess erhält man normaierweise einen Pool von Millionen unterschiedlicher transfizierter Zellen. Daher liegt der entscheidende Schritt zur Herstellung effizienter Produktionszelllinien in der Selektion und Vermehrung von Zellklonen, die zum einen sehr stabil wachsen und zum anderen eine hohe spezifische Produktivität an therapeutischem Protein zeigen (Produktbildung etc.). Da Millionen unterschiedlicher produktexprimierender Zellen vorliegen, ist es entscheidend, über hohen Durchsatz und Automatisierung eine Vielzahl von Zellen einzeln analysieren zu können, um geeignete Kandidaten (Einzelzellklone), die sowohl sehr robust wachsen als auch hohe Produkttiter liefern, aussortieren zu können. Diesen Vorgang der Einzelzellisolierung und Subkultivieruπg bezeichnet man auch als - Klonierung oder Reklonierung.
Die Verwendung von tierischen Zellkulturen zur Produktion von Biopharmazeutika fordert eine genotypisch und phenotypisch homogene, d.h. monoklonale Zeilkultur. Dies wird durch Reklonierungstechniken wie Jimited dilution' oder durch automatisierte Einzelzeilablage mitteis Fluorescence activated cell sorting (FACS) erreicht.
Es besteht jedoch die Schwierigkeit, typische rekombinante Produktionszellen wie Maus Myeloma- (NSO)1 Hamster Eierstock- (CHO)1 oder Hamster Nieren-Zellen (BHK) effektiv zu vermehren, insbesondere wenn diese an das Wachstum in serumfreien Suspensionskulturen adaptiert sind, also unter modernen produktionsrelevanten Zellkulturbedingungen, nach einer Reklonierung, bei der die Zellen einzeln unter serumfreien Kulturbedingungen in Mikrotiterplatten abgelegt werden.
Dies liegt daran, dass Zellen in vivo in den Gewebeverbund eingebettet sind und von benachbarten Zellen mit sezernierten auto- und parakrinen Wachstumsfaktoren versorgt werden. Sie sind daher nicht an isoliertes Wachstum
-2- aπgepasst und sterben ohne Stimulation durch Wachstumsfaktoren ab, sofern sie nicht langwierig an die neuen Bedingungen adaptiert werden.
Speziell die Verwendung von serumfreien oder chemisch definierten Medien im Reklonierungsschritt führt zu einer eingeschränkten Reklonierungseffizienz, d.h. nur ein geringer Prozentsatz der abgelegten Zellen überlebt und wächst zu einer monoklonalen Zelllinie heran.
Die aktuell angewandten Reklonierungstechniken „Limited dilution" und FACS generell sind dem Fachmann allgemein bekannt,
In der „Limited dilution" wird die Zelisuspension seriell verdünnt und die Zellen anschließend mit unterschiedlichen Zellzahlen pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte abgelegt. In Vertiefungen mit hohen Zellzahlen werden aufgrund ausreichender Sekretion autokriner Wachstumsfaktoren mehrere oder alle Zellen überleben. Je weniger Zellen pro Vertiefung eingesäät werden, desto weniger Zellen überleben, so dass auf diese Weise die Verdünnung so eingestellt werden kann, dass statistisch pro Vertiefung nur eine Einzelzelle überlebt und zu einer monoklonalen Linie heranwächst. Diese Einzelzellklone werden mittels visuellen und/oder bildgebenden Techniken detektiert und die Zellkione in größere Kulturgefäße weiterkultiviert.
In der FACS-Technolgie wird ein Flow Cytometer zur Generierung von Einzelzellklonen verwandt. Dazu werden die Zellen in einen laminaren Strom gebracht und jeweils einzeln in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten abgelenkt. Dadurch ist sichergestellt, dass es sich bei den überlebenden Kolonien tatsächlich um Einzelklone handelt. Daher ist die FACS-Technologie gegenüber der Limited Dilution die bevorzugte Methode.
Die Verwendung von serumfreien oder chemisch definierten Medien im Reklonierungsschritt führt zu einer eingeschränkten Reklonierungseffizienz, d.h. nur wenige Prozent der einzeln abgelegten Zellen wachsen zu einer monoklonalen Zelllinie heran.
-3- Bei geringer Reklonierungseffizienz müssen daher viele Mikrotiterpiatten mit Einzelzeϊien bestückt werden, um die gewünschte Zahl an Einzelklonen zu erhalten, wodurch Aufwendungen an Zeit und Kosten (z.B. für Medien, Platten etc) entstehen.
Besonders nachteilig wirkt sich eine geringe Reklonierungseffizienz dann aus, wenn die anschließende Analyse der Einzelzellklone über ein automatisiertes System erfolgen soll: Ein Analyse-Roboter kann üblicherweise nicht zwischen Vertiefungen mit lebenden oder toten Zellen differenzieren und vermisst automatisch alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte. Bei einer Reklonierungseffizienz von nur 10% bedeutet dies, dass der Roboter in 90% der Fälle eine leere Vertiefung analysiert - und dafür die gleich Menge an Reagentien verbraucht wie für die Analyse eines lebenden Zellklons. Im Fallbeispie! werden also 90% der Zeit wie auch 90% der Materialkosten ohne Datengewinn vergeudet.
Zur Lösung dieses Problems wurde dem Medium in der Vergangenheit oft Serum {z.B. Fötales Kälberserum, FCS) zugesetzt. Serum enthält eine nicht definierte Mischung unterschiedlicher löslicher Proteine und Wachstumsfaktoren, welche das Überleben und die Proliferation von Zellen unterstützen. Aus regulatorischen Gründen wird die Verwendung von nϊcht-definierbaren Zusätzen wie Serum, auch aufgrund der Gefahr der Infektion mit bovinen Viren, jedoch zunehmend weniger toliert. Eine durchgängig serum-freie Zeillinienherstellung entspricht daher in regulatorischer Hinsicht dem State-of-the-Art.
Ein weiterer Lösungsansatz besteht in der Durchführung einer „limited dilution" zur Reklonierung. Da diese Methode nur statistisch zur Entstehung von Einzelzellklonen führt, durchaus aber auch mehrere Klone in einer Vertiefung hochwachsen können, ist eine mehrfache {üblicherweise 2-3-malige) Wiederholung dieses Verfahrens notwendig, um sicherzustellen, dass es sich bei der erhaltenen Zelllinie wirklich um einen einzigen Klon handelt. Durch diese
-4- wiederholten Zyklen entsteht ein hoher Aufwand an Arbeit und Zeit, der sich nachteilig auf die benötigten Kosten und Tiimeiines auswirkt.
Ein weiterer Lösungsansatz besteht in dem Einsatz von „Feeder"-Zeilen. Die 5 Bezeichnung kommt von dem englischen Worte „feed" = füttern und bezeichnet eine Ko-Kultivierung mit meist teilungsunfähigen Zellen, die dazu dienen, die eigentlich gewünschten Zellen der Kultur mit Nährstoffen und seziernierten Wachstumsfaktoren zu versorgen.
Durch Feederzellen kann die Reklonierungseffizienz signifikant erhöht werden.o Nachteilig bei dieser Methode ist allerdings der hohe Aufwand der Generierung der Feederzellen parallel zur eigentlichen Einzelzellablage. Desweiteren ist die
Reproduzierbarkeit nicht gewährleistet, da die Qualität der Feederzeilen, ihre
Sekretionstätigkeit und Vitalität nach Wachstums-Arretierung nur sehr schwer standardisierbar sind. Darüber hinausgehend kann die Anwesenheit von5 Feederzellen bei einer automatisierten Klonanalyse störend wirken oder sie, je nach Art des eingesetzten Assays, sogar unmöglich machen, indem sie die
Ergebnisse verfälschen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die0 Reklonierungseffizienz bei der serumfreien FACS-basierten Klonierung von Produktionszellen zu steigern.
Weiter liegt der Erfindung die Steigerung der Reklonierungseffizienz ohne Verwendung von Feederzellen zugrunde. 5
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das technische Problem der reduzierten Reklonierungseffizienz in serumfreiem, vorzugsweise chemisch-definiertem Medium, wird durch die Zugabe von IGF (Insulin-like growth factor) oder Insulin in das Medium gelöst. D
-5- Durch die Verwendung von IGF bzw. Insulin im Kultivierungsmedium nach der Reklonierung kann die Rekloπierungseffizienz und dadurch die Quantität der erhaltenen Klone signifikant gesteigert werden. Dieser Effekt konnte ab Konzentrationen von 100-500μg/L IGF bzw. 50-100mg/L Insulin im Klonierungsmedium beobachtet werden. Die Wirkung von IGF auf die Reklonierungseffizienz ist dabei deutlich höher als diejenige von Insulin. Die Verwendung von IGF in Insulin-freiem Medium ist daher eine bevorzugte Ausführungsform. Es sind bezüglich der Reklonierungseffizienz sowohl bei Insulin als auch bei IGF Optimumskurven zu beobachten. Das Optimum bei Insulin liegt bei 100mg/L und bei IGF bei 500μg/L. Der Level an Reklonierungseffizienz bei der Verwendung von IGF ist höher.
Der positive Einfluß von iGF optional mit Feederzellen und Albumin, insbesondere HSA auf die Reklonierungseffizienz zeigt sich bei verschiedenen Zelilinien / Zelltypen wie beispielsweise Hamster- und Mauszellen, aber auch humanen und diversen anderen Zellsystemen.
Desweiteren bewirkt die Zugabe von Albumin, insbesondere Serum-Albumin (HSA) in das Kulturmedium eine Steigerung der Reklonierungseffizienz. Ein deutlicher Effekt ist dabei schon bei geringen Albumin-, insbesondere HSA - Konzentrationen ab 100 mg/L sichtbar und lässt sich durch höhere Albumiπ-/HSA- Konzentrationen von 400-1000 mg/L noch steigern. Insbesondere zeigt sich ein positiver Effekt bei einem Albumin-/HSA-Zusatz von 500mg/L. Das A!bumin-/HSA Konzentrationsoptimum in IGF enthaltendem Medium (ohne Insulin Supplement) liegt bei unter 1000mg/l (siehe Abbildungen 2, 3 und 4). Das Konzentrationsoptimum von Albumin-/HSA liegt im Bereich von 300-600mg/l bzw. 400-600mg/l, vorzugsweise im Bereich von 400-500mg/l, besonders bevorzugt bei 400mg/l. Ebenfalls besonders bevorzugt ist eine Albumin-/HSA Konzentration von 500mg/l.
-6- Als Albumin /HSA-Que!Ie kann aufgereinigtes humanes Material, rekombinates Material (aus Pro- oder Eukaryonten) oder rekombinates pflanzliches Material verwendet werden.
Eine Albumin-/HSA-abhängige Steigerung der Reklonierungseffizienz wird sowohl in Ab- als auch in Anwesenheit von Feederzellen in verschiedenen Zellünien beobachtet.
Die höchste Reklonierungseffizienz kann über eine Kombination dieser Ansätze, d.h. die Zugabe von IGF und Aibumin/HSA zu einem serum- und Insulin-freien Kulturmedium, erzielt werden. Optional und je nach Art des anschließenden Analyse-Verfahrens, können zusätzlich Feederzellen verwendet werden.
Die hier beschriebene Methode zur Steigerung der Reklonierungs-Effizienz in serumfreien Medien durch Zusatz von IGF oder Insulin und optional Albumin/HSA resultiert in einem effektiveren Klonscreening und dadurch zu einem effizienteren Zelllinien-Entwicklungsprozess.
In der biopharmazeutischen Entwicklung besteht das primäre Ziel der Reklonierung in der Identifizierung von hoch-produzierenden Zellklonen. Eine höhere Reklonierungseffizienz führt durch die breitere Basis an erhaltenen Klonen und bedingt durch eine Normalverteilung der Klone hinsichtlich Produktivität zu einer höheren Wahrscheinlichkeit, hoch-produzierende Zellklone zu erhalten.
Da bei höherer Reklonierungseffizienz weniger Zellen in Platten abgelegt werden müssen, um die gleich Anzahl lebender Zeilklone zu erhalten, ergibt sich darüber hinaus eine signifikante Ersparnis sowohl an Zeit und Aufwand als auch an Kosten. Der Prozessschritt wird insgesamt ökonomischer.
Weiterhin bildet die erhöhte Reklonierungseffizient die Grundlage für den Einsatz von hocheffizienten automatisierten Klonscreening-Verfahren (Screening Robot).
-7- In derartigen Systemen erfolgt zumeist keine Selektion einzelner Vertiefungen in der Mikrotiterplatte, sondern alle werden gleichermaßen vermessen, ungeachtet dessen, ob sie eine lebende Zellpopulation enthalten oder nicht. Durch die Analyse alier Vertiefungen der Platte steigt die Anzahl der untersuchten Klone direkt proportional mit der Anzahl der hochwachsenden Klone. Eine Reklonierungseffizienz von nur 10% führt dazu, dass 90% der Vertiefungen leer sind und daher keine verwertbaren Daten liefern können, aber dennoch analysiert werden. Für die Wirtschaftlichkeit bedeutet das, dass in 90% der Fälle Zeit und Geld in Form von Reagentien ohne Datengewinn aufgewendet werden. Daher steigt die Effizienz von High throughput Automatisierungssystemen für die frühe Kionselektion proportional mit der Anzahl der erhaltenen Klone nach der Einzelzellablage.
Ein weiterer Vorteil der beschriebenen Methode besteht darin, dass durch Zusatz von IGF oder Insulin und optional Albumin / HSA die Reklonierungseffizienz soweit gesteigert wird, dass auf Feederzellen verzichtet werden kann. Dies reduziert zum einen den Aufwand bei der Herstellung und Vorkultur der Feederzellen und erhöht zugleich die Reproduzierbarkeit der Einzelzeliklonierung. Desweiteren ermöglich sie den Einsatz von Technologien zur visuellen Erfassung der Lebendzellzahi als Werkzeug zur Klonanalyse. Da die Produktmenge im Kulturmedium linear mit der Anzahl der produzierenden Zellen korreliert, geht die technologische Entwicklung dahin, sowohl die Produktmenge als auch die Zellzahl zu erfassen, um anhand dessen die höchst-produzierenden Zellklone zu ermitteln.
Da Feederzellen von den heranwachsenden Produktionszellen visuell nur schwer unterscheidbar sind, werden sie bei der visuallen Zellzahlbestimmung mit erfasst, was zu einer ungenauen Berechnung der Gesamtzellzahl und damit der spezifischen Produktivität führt. Ein Verfahren ohne Feederzelle ist daher vorteilhaft und stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar.
-8- Anwendungsmöglichkeiten für das beschriebene Verfahren finden sich insbesondere in der biopharmazeutischen Produktion.
Die Erhöhung der Reklonierungseffizienz bei der Generierung von Produktionszeilen für die biopharmazeutische Produktion führt zu einer höheren Wahrscheinlichkeit für einen hochproduzierenden Klon und damit zu einer verbesserten bzw. beschleunigten Produkteπtwicklung.
Das Verfahren steigert desweiteren die Wirtschaftlichkeit dieses Prozesschrittes und ermöglicht darüber hinaus den Einsatz automatisierter Klonanalyse- Technololgien im High-Troughput.
Der Stand der Technik beschreibt die Verwendung von spezieilen Medienkompositionen zur Steigerung der Reklonierungseffizienz (WO2006047380). Insulin wird hierbei als essentieller Bestandteil beschrieben. In der vorliegenden Patentanmeldung wird jedoch explizit die Verwendung von IGF an Stelle von Insulin als alternative und überlegene Möglichkeit aufgezeigt. Weiterhin zeigen die Daten der vorliegenden Anmeldung, dass insbesondere durch die Kombination von iGF {bevorzugt <800μg/l bzw. 100-500μg/l) und Albumin, insbesondere HSA (bevorzugt <1000mg/l bzw. 300-600mg/l, insbesondere bevorzugt 400-500mg/l) in einem Insulin-freien Medium eine weitere Steigerung der Reklonierungseffizienz erreicht werden kann. Die verwendeten Albumin- (insbesonder HSA)-Konzentrationen liegen dabei in der vorliegenden Patentanmeldung unter 1000mg/l und damit signifikant unter denen in der genannten Patentschrift WO2006047380.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
ABBILDUNG 1 :
Einfluß von IGF im Vergleich zu Insulin auf die Reklonierungseffizienz in HSA supplementiertem Medium. DG44 Zeilen werden für mindestens fünf Passagen in fünf variierenden Medien kultiviert, welche 5 fünf verschiedene Konzentrationen an IGF oder Insulin
-9- enthalten, Anschüessend werden einzelne Zellen mittels FACS kloniert. Nach 21 Tagen werden die wachsenden Klone gezählt und die Reklonierungseffizienz wird bestimmt. Zur Vereinfachung wird die Reklonierungseffizienz normalisiert, d.h. der höchste erhaltene Wert wird auf 100% gesetzt.
ABBILDUNG 2:
Einfluß von HSA Supplementierung auf die Reklonierungseffizienz in serumfreiem und Insulin-freiem Medium.
DG44 Zellen werden für mindestens fünf Passagen in BI-eigenem Medium (enthaltend 50μg/l IGF, aber kein Insulin), welches mit verschiedenen HSA Konzentrationen (40, 400 und 1000mg/l) supplementiert ist sowie mit Feederzellen kultiviert. Anschüessend werden einzelne Zellen mittels FACS kloniert. Nach 21 Tagen werden die wachsenden Klone gezählt und die Reklonierungseffizienz wird bestimmt. Zur Vereinfachung wird die Reklonierungseffizienz normalisiert, d.h. der höchste erhaltene Wert wird auf 100% gesetzt.
ABBILDUNG 3
Reklonierungseffizienz in den Zelllinien DG44 in Bl-eigenem Medium (enthaltend
50μg/l !GF, kein Insulin-Supplement) und NSO in kommerziellem CD Hybridoma Medium von Invitrogen (enthaltend IGF in einer Konzentration von unter 800 μg/l, kein Insulin-Supplement) mit und ohne Feederzellen sowie mit und ohne 500rng/l
HSA Supplementierung im Medium.
DG44 und NSO Zellen werden in den entsprechenden Medien über mindestens fünf Passagen hinweg kultiviert. Anschüessend werden einzelne Zellen mittels FACS kloniert. Nach 21 Tagen werden die wachsenden Klone gezählt und die
Reklonierungseffizienz wird bestimmt. Zur Vereinfachung wird die
Reklonierungseffizienz normalisiert, d.h. der höchste erhaltene Wert wird auf
100% gesetzt.
-10- ABBiLDUNG 4
Rekionierungseffizienz in der Zelllinie DG44 (kultiviert in Bl-eigenem Medium ohne Insulin-Supplement) mit 50μg/l bzw. 500μg/l IGF Supplement und mit bzw. ohne 500mg/l HSA Supplement im Medium. DG44 Zellen werden in den entsprechenden Medien über mindestens fünf Passagen hinweg kultiviert. Anschliessend werden einzelne Zellen mittels FACS kloniert. Nach 21 Tagen werden die wachsenden Klone gezählt und die Rekionierungseffizienz wird bestimmt. Zur Vereinfachung wird die Rekionierungseffizienz normalisiert, d.h. der höchste erhaltene Wert wird auf 100% gesetzt.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DEFINITIONEN Bevor die Erfindung nachfolgend anhand nicht-beschränkender Ausführungsbeispiele näher erläutert wird, sei darauf verwiesen, dass die Verwendung unbestimmter Artikel, beispielsweise „ein" oder „eine", sowie die bestimmter Artikel, wie „der", „die", „das" Einzahl u n d Mehrzahl des entsprechenden Begriffs einschließen, es sei denn, dass eine der beiden Formen explizit ausgeschlossen und auf eine bestimmte Form (Einzahl, Mehrzahl) verwiesen wird. So schließt der Begriff „eine Zelle" automatisch „mehrere Zellen" mit ein, es sei denn es wird explizit darauf verwiesen, dass nur eine einzige Zelle gemeint ist. Einzahl ist beispielsweise dort explizit gemeint, wo „ein" durch (1) ergänzt ist.
Der Begriff „Insulin" ist dem Fachmann bekannt. Es gibt eine Reihe verschiedener Insulinmoleküle (Gilman, A. G. et al., Eds., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, 1990, pp. 1463-1495). Eine Insuiinform ist z,B. das Zink-Insulin. Häufigen Einsatz in der Zellkultur findet humanes Zink-Insulin oder rekombinantes Insulin. Die Konzentration von Insulin
-11- kann man im Kulturmedium messen, indem man routinemäßige Experimente wie einen kommerziell erhältlichen Insulin-spezifischen ELISA verwendet.
Der Begriff „Insulin-frei" meint, dass das Kulturmedium kein Insulin, insbesondere kein rekombinantes Insulin enthält und ihm auch kein Insulin zugesetzt wird.
Albumin ist das am häufigsten vorkommende Protein im Plasma. Es wird in der Leber produziert und trägt zur Erhaltung des osmotischen Druckes im Blut bei. Albumin bindet an Nährstoffe und Metaboliten, und hilft dadurch diese zu transportieren.
In Serum-haitigeπ Zellkulturmedien ist Albumin häufig die dominierende Serumkomponente. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein biochemisch definiertes Serum-freies und Insulin-freies Medium zur Einzelzellklonierung dar, welches Serumaibumin enthält. Der Begriff „Albumin" meint in der vorliegenden Erfindung eine Polypeptidkomponente, welche die biologische Aktivität von Albumin aufweist. Albumin bezeichnet generell irgendein tierisches Albumin insbesondere ein Säugeralbumin wie beispielsweise humanes, bovines, pferdeartiges, murines, rattenartiges und schweäneartiges Albumin sowie Albumin aus Vögeln wie insbesondere Huhn etc. Vorzugsweise ist das Albumin humanes Serumalbumin (HSA). Vorzugsweise stammt das Albumin nicht aus einer natürlichen tierieschen Quelle (Serum). Besonders bevorzugt ist rekombinantes oder synthetisches Albumin, insbesondere rekombinantes HSA.
Die Produktion von rekombinantem HSA ist im Stand der Technik wohl bekannt und kann z.B. mit Hilfe von genetisch modifizierten Hefen gewonnen werden (U.S. Pat. NO. 5,612,197). Rekombinantes HSA ist kommerziell über diverse Anbieter zu beziehen beispielsweise über Sigma-Aldrich (Recombinant HSA, Cat. No, A- 7223).
-12- Die Konzentration von HSA kann durch Routine-Methoden wie einen kommerziell erhältlichen ELISA ermittelt werden (z.B. "Human Albumin ELISA Quantitation Kit", Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)
Gemäß, dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Zellkulturmedium rekombinantes Aibumin in einer ausreichenden Konzentration, um das Wachstum einer einzelnen Zelle, insbesondere einer einzelnen CHO
Zelle, zu ermöglichen. Beispielsweise ist rekombinantes Albumin in einer
Konzentration von ungefähr 100mg/L bis ungefähr 1000mg/L, bevorzugt in einer
Konzentration von ungefähr 300mg/L bis ungefähr 800mg/L und besonders bevorzugt in einer Konzentration von ungefähr 500mg/L im Medium enthalten.
Der Begriff „Klonierung/Rekionierung", „klonieren/reklonieren" meint im Zusammenhang mit Zeilkuitur eine Technik, mit deren Hilfe man eine Zellpopulation identischer Zellen aus einer Ursprungszelle erhalten kann. Der Ausdruck „Zellklonierung" oder auch „Einzelzellkionierung" meint somit ein Verfahren, bei dem aus einem Zellpool mit Zellen unterschiedlichen Genotyps einzelne Zeilen identifiziert, isoliert und anschließend zu einer Zellpopulation bestehend aus einer Vielzahl genetisch identischer Zellen vermehrt werden. Werden die Zellen hierzu einzeln abgelegt, d.h. lediglich eine (1 ) Zelle pro Kuiturgefäß, und anschließend zu einer Zellpopulation identischer Zellen expandiert, so handelt es sich bei dem Verfahren um eine „direkte Einzelzellkionierung". Werden mehrere Zellen gleichzeitig in ein Kulturgefäß abgelegt, zu einer Zellpopulation expandiert und diese durch wiederholtes Verdünnen (= limited dilution) in Zellpopulationen identischer Zellen aufgeteilt, so beschreibt dies ein Verfahren der „indirekten Klonierung".
Bei „Einzelklonen" oder „Einzelzellklonen" oder kurz „Klonen" handelt es sich um genetisch identische Zellen, die von einer (1 ) einzigen Zelle abstammen. Eine
Zellpopulation bestehend aus identischen Zellen gleicher Abstammung bezeichnet man folglich auch als „monoklonale Zeilpopulation". Kommt es während der
-13- Kultivierung von Zellen gleichen Ursprungs zu spontanen Genomveränderungen, beispielsweise zu Mutationen und/oder Translokationen, so werden die einzelnen Zellen dieser Zellpopulation dennoch als identische Zellen im Sinne der vorliegenden Erfindung angesehen, und die Kultur als monoklonale Zeilpopulation verstanden. Dagegen handelt es sich bei einem Pool an stabil transflzierten Zellen (Transfektanteπ) nicht um Zellklone gleicher Abstammung, also nicht um eine monoklonale Zellpopulation, auch wenn genetisch identische Ausgangszellen mit einer identischen Nukleinsäure transfiziert werden.
Der Begriff „Subklone/Subkulturen" bezieht sich auf verschiedene Zellgenerationen, die ausgehend von einer Ursprungszelle/Ursprungskultur durch einfaches oder mehrfaches Passagieren der sich teilenden Zellen entstehen. Von „Subklonen/ Subkulturen" spricht man beispielsweise, wenn identische Zellen/Zellkulturen über mehrere Generationen kultiviert und vermehrt werden.
Der Begriff „Klonierungseffizienz" oder „Reklonierungseffizienz" ist definiert als der Prozentsatz an Zellen, die nach der Ablage überleben, sich teilen und vitale Zeilpopulationen ausbilden. Werden beispielsweise bei einer Zelisortierung 100 Zellen auf 100 Kulturgefäße verteilt und wachsen 25 dieser 100 einzeln abgelegten Zeilen zu Kulturen heran, so beträgt die Klonierungseffizienz 25%.
Unter einer „effektiven oder effizienten Reklonierung" versteht man eine Klonierungseffizienz von zumindest 10%, vorzugsweise von zumindest 20%, weiter bevorzugt von zumindest 30% und noch weiter bevorzugt von zumindest 40%. Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung versteht man unter einer effektiven Reklonierung eine Klonierung mit einer Effizienz von mindestens 50%, vorzugsweise von mindestens 60%, besonders bevorzugt von mindestens 70% und noch weiter bevorzugt von mindestens 80%.
-14- Der Ausdruck „teilungsfähig/expandierbar" im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt das Potential einer Zelte/Zellpopulation sich endlos, zumindest aber über 2, vorzugsweise 4, Passagen teilen zu können. Dieses Potential kann beispielsweise durch Bestrahlung mit 11371Cs- oder durch Mitomycin C Behandlung reduziert oder gänzlich gestört werden.
Der Ausdruck „Derivat/Abkömmling" bezieht sich auf Zellen, die genetisch auf eine bestimmte Ausgangszelle zurückzuführen sind und beispielsweise durch Subkultivierung (mit oder ohne Selektionsdruck) entstehen und/oder durch genetische Manipulation generiert werden. Re-Isoiierungen von Zellen des gleichen Zelltyps sind ebenfalls von dem Ausdruck „Derivat/Abkömmling" erfasst. So stellen beispielsweise alle CHO-Zelllinien Derivate/Abkömmlinge der von Puck et al., 1958 isolierten Hamsterovarzellen aus Cricetulus griseus dar, unabhängig ob sie durch Subkultivierung, Re-Isolierung oder genetische Manipulationen erhalten wurden.
Der Begriff „Feederzelle" kommt von dem englischen Worte „feed" = füttern und bezeichnet eine Ko-Kultivierung mit meist teilungsunfähigen Zellen, die dazu dienen, die eigentlich gewünschten Zeiten der Kultur mit Nährstoffen und seziernierten Wachstumsfaktoren zu versorgen. Zur Herstellung werden lebende Zellen durch Bestrahlung mit UV- oder Gammastraheln oder Behandlung mit MitomycinC im Wachstum arretiert. Die resultierenden Feederzeilen leben und produzieren und sezernieren Wachstumsfaktoren, können sich aber nicht mehr teilen.
Der Begriff „autologe feeder-Zelle" meint, dass sowohl feeαter-Zelle als auch die in Gegenwart dieser feecfer-Zelle zu kultivierende Zeile taxonomisch dem gleichen Ursprung entstammen. Handelt es sich bei der zu kultivierenden Zelle beispielsweise um eine Hamsterzelle (Unterfamilie Cricetinae), vorzugsweise um eine Zelle der Gattung Cricetulus bzw. Mesocricetus, beispielsweise um eine CHO- bzw. BHK-ZeIIe, so stellt jede aus dieser Unterfamilie ursprünglich isolierte
-15- feβder-Ze\\e eine autoioge feecfer-Zelle zu diesen Hamsterzellen der Unterfamilie Cricetinae dar.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform meint der Begriff „autoioge feeder- Zeile", dass sowohl feecfer-Zelle als auch die zu kultivierende Zelle taxonomisch der gleichen Gattung entstammen oder ursprünglich aus derselben Gattung isoliert wurden (Zelle aus Cricetulus bzw. Mesocricetus), Handelt es sich bei der zu kultivierenden Zelle beispielsweise um eine Hamsterzelle der Gattung Cricetulus bzw. Mesocricetus, vorzugsweise urn eine CHO- bzw. eine BHK-ZeIIe, so stellt jede aus der jeweiligen Gattung ursprünglich isolierte feeofer-Zelle eine autoioge feecfer-Zelle im Sinne dieser Erfindung dar.
Nach einer weiter bevorzugten Ausführungsform liegt eine „autoioge feecfer-Zelle" vor, sofern feeder-Zelle und die zu kultivierende Zelle der gleichen Art entstammen, beispielsweise Cricetulus griseus oder Mesocricetus auratus. Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt eine „autoioge feecfer-Zelle" vor, sofern feecfer-Zelle und die zu kultivierende Zelle der gleichen Art entstammen und über den gleichen Gewebstropismus verfügen (z.B. Ovarzellen aus Cricetulus griseus - CHO-Zellen).
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einer feecfer-Zelie um eine autoioge feecfer-Zelle, wenn sowohl feecfer-Zelle als auch zu kultivierende Zelle der gleichen Basiszelle entstammen, beispielsweise wenn es sich bei beiden Zellen ursprünglich um CHO-DG44 Zellen bzw. Abkömmlinge dieser Zelle handelt. Nach einer weiter bevorzugten Ausführungsform vermittelt die feecfer-Zeile die selben Resistenzen, z.B. gegenüber Antibiotika, wie die zu kultivierende Zelle. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn die Zellablage in Gegenwart eines Selektionsmittels, z.B. eines Antibiotikums, erfolgt.
Der Begriff „limited dilution" bezeichnet ein alternatives Verfahren zur Reklonierung. Dabei wird eine Zellsuspension seriell verdünnt und die Zellen anschließend mit unterschiedlichen Zellzahlen pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte abgelegt, in Vertiefungen mit hohen Zellzahlen werden aufgrund ausreichender Sekretion autokriner Wachstumsfaktoren mehrere oder alle Zellen
-16- überleben. Je weniger Zeilen pro Vertiefung eingesäät werden, desto weniger Zellen überleben, so dass auf diese Weise die Verdünnung so eingestellt werden kann, dass statistisch pro Vertiefung nur eine Einzelzelie überlebt und zu einer monoklonalen Linie heranwächst. Da diese Methode nur statistisch zur Entstehung von Einzelzellklonen führt, durchaus aber auch mehrere Klone in einer Vertiefung hochwachsen können, ist eine mehrfache (üblicherweise 2-3-maiige) Wiederholung dieses Verfahrens notwendig, um sicherzustellen, dass es sich bei der erhaltenen Zelllinie wirklich um einen einzigen Klon handelt.
In der FACS-Technolgie wird ein Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sorter (Flow Cytometer) zur Generierung von Einzelzellklonen verwandt. Dazu werden die Zellen in einen laminaren Strom gebracht und jeweils einzeln in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten abgelenkt. Dadurch ist sichergestellt, dass es sich bei den überlebenden Kolonien tatsächlich um Einzelklone handelt. Daher ist die FACS- Technologie gegenüber der Limited Dilution die bevorzugte Methode.
Der Begriff „Serum" bezeichnet den zellfreien Bestandteil des Blutes. Serum enthält eine nicht definierte Mischung unterschiedlicher löslicher Proteine und Wachstumsfaktoren, die das Überleben und die Proliferation von Zellen unterstützt. Für die Zellkultur werden vornehmlich fötales Käiberemm (FCS) oder bovines Serum (FBS) eingesetzt. Übliche Konzentrationsbereiche sind 10-20% FCS oder FBS als Zusatz zum Kultivierungsmedium.
Der Begriff „serumfrei" meint Kulturmedien wie auch Kultivierungsbedingungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass Zellen in Abwesenheit von tierischem und/oder humanem Serum, vorzugsweise in Abwesenheit von jeglichen aus
Serum isolierten Proteinen, vorzugsweise in Abwesenheit von nicht rekombinant gewonnenen Proteinen kultiviert werden. Folglich meint der Ausdruck „an serumfreie Bedingungen adaptierte Zellen" solche Zeilen, die in Abwesenheit von tierischem oder humanem Serum bzw. Serumproteinen vermehrt werden können.
-17- Der Begriff „proteinfrei" meint, dass das Kulturmedium keine tierischen Proteine enthält, wobei aus Bakterien, Hefen oder Pilzen isolierte Proteine nicht als tierische Proteine verstanden werden.
Der Begriff „chemisch definiert" beschreibt ein Zellkulturmedium, welches serumfrei, vorzugsweise auch proteinfrei ist, und das aus chemisch definierten Substanzen besteht. Chemisch definierte Medien bestehen somit aus einer Mischung aus vorwiegend reinen Einzelsubstanzen. Ein Beispiel für ein chemisch definiertes Medien ist beispielsweise das CD-CHO-Medium der Firma Invitrogen (Carlsbad, CA, US).
Der Ausdruck „eine in Suspension kultivierbare Zelle" bezieht sich auf Zellen, die an das Wachstum in flüssigen Kulturen („Suspensionskulturen") adaptiert sind und deren Fähigkeit zu Adhäsion an Gefäßoberflächen, beispielsweise an Zellkulturschalen / -flaschen eingeschränkt bzw. verloren gegangen ist. Zellen, die sowohl an serumfreies Wachstum als auch an das Wachstum in Suspension adaptiert sind, werden als „an serumfreies Medium adaptierte und nicht adhärente Zellen" bezeichnet. Stellt man aus solchen Kulturen feeder-Zellen her, so handelt es sich definitionsgemäß bei diesen Zellen um „an serumfreies Medium adaptierte und nicht adhärente feeder-Zeilen".
Unter "konditioniertem Medium" versteht man Medium aus einer Kultur lebender Zellen, das gefiltert und dem frischen Medium in den Aussaat-Mikrotiterplatten zugesetzt wird, Die Wirkung des konditionierten Mediums beruht auf seinem Gehalt an Wachstumsfaktoren, die von den Zellen der Vorkultur in das Medium serzierniert wurden und es dadurch „konditioniert" haben. Konditioniertes Medium hat eindeutig einen positiven Einfluss auf die Reklonierungseffizienz. Die erzielten Steigerungen sind aber geringfügig und als alleinige Maßnahme für die praktische Anwendung nicht ausreichend. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von konditioniertem Medium, um die
-18- Reklonierungseffizienz insbesondere nach FACS-basierter Einzelzellabiage zu erhöhen.
Protein/Produkt von Interesse: Biopharmazeutisch bedeutsame Proteine/Polypeptide umfassen z.B. Antikörper, Enzyme, Cytokine, Lyrnphokine, Adhäsionsmoieküle, Rezeptoren sowie deren Derivate bzw. Fragmente, sind aber nicht auf diese beschränkt. Im Allgemeinen sind alle Polypeptide bedeutsam, die als Agonisten oder Antagonisten wirken und/oder therapeutische oder diagnostische Anwendung finden können. Andere Proteine von Interesse sind beispielsweise Proteine/Polypeptide, die zur Veränderung der Eigenschaften von Wirtszellen im Rahmen des sogenannten „Cell Engineering" verwendet werden, wie z.B. anti-apoptotische Proteine, Chaperone, Stoffwechseienzyme, Glykosylieruπgsenzyme sowie deren Derivate bzw. Fragmente, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Der Ausdruck „Polypeptide" wird für Aminosäuresequenzen oder Proteine verwendet und bezeichnet Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge. Dieser Ausdruck schließt auch Proteine ein, die posttransiational durch Reaktionen wie beispielsweise GSykosyiierung, Phosphorylierung, Acetyiierung oder Proteinprozessierung modifiziert werden. Die Struktur des Polypeptids kann z.B. durch Substitutionen, Deletionen oder Insertion von Aminosäuren, Fusion mit anderen Proteinen, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität modifiziert werden. Zudem können die Polypeptide multimerisieren und Homo- und Heteromere bilden.
Unter rekombinanten Proteinen versteht man Proteine, welche durch rekombinante Expression in Wirtszeilen produziert werden. Solche rekombinanten Proteine werden unter höchsten Reinheitsauflagen produziert, um das Kontaminationsrisiko möglichst gering zu halten. Rekombinante Proteine werden üblicherweise in passenden Wirtszellen produziert wie z.B. Hefezeilen, tierische Zellen oder prokaryotische Zellen (E. coli oder andere Bakterienstämme) indem
-19- ein Expressionsvektor wie beispielsweise ein gereinigtes Plasmid, ein Bakteriophage, eine isolierte DNA, mRNA, Viren oder eine andere Nukleinsäure benutzt wird, um das rekombinante Protein in die Wirtszelle einzuführen und es dort ins Wirtszellchromosom integrieren zu lassen. Eukaryotische Expressionssysteme sind bevorzugt, da diese typischerweise die notwendige zelluläre Maschinerie besitzen, um komplexe Säugerproteine wie Antikörper korrekt zu modifizieren, zu prozessieren und zu falten.
Rekombinantes HSA ist beispielsweise von diversen kommerziellen Anbietern wie Sigma Aldrich erhältlich.
Beispiele für therapeutische Proteine sind Insulin, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, humanes Wachstumshormon (hGH) und andere Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Gewebeplasminogenaktivator (tPA), Erythropoetiπ (EPO), Cytokine, beispielsweise Interleukine (IL) wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-Q1 IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, 1L-18, Interferon (fFN)-aipha, beta, gamma, omega oder tau, Tumornekrosefaktor (TNF) wie z.B. TNF-alpha, beta oder gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 und VEGF. Weitere Beispiele sind monoklonale, polyklonale, multispezifische und einzelkettige (single chain) Antikörper und Fragmente davon, wie z.B. Fab, Fab', F(ab')2, Fc und Fc'-Fragmente, leichte (L) und schwere (H) Immunglobulinketten und deren konstante, variable oder hypervariable Regionen sowie Fv- und Fd-Fragmente. Die Antikörper können humanen oder nichthumanen Ursprungs sein. Auch humanisierte und chimäre Antikörper kommen in Frage.
Fab-Fragmente (Fragment antigen-binding = Fab) bestehen aus den variablen Regionen beider Ketten, die durch die angrenzenden konstanten Regionen zusammengehalten werden. Sie können z.B. durch Behandlung mit einer Protease, wie beispielsweise Papain, aus konventionellen Antikörpern erzeugt werden oder aber auch durch DNA-Klonieruπg. Weitere Antikörperfragmente sind
-20- F(ab')2-Fragmente, die durch proteolytischen Verdau mit Pepsin hergestellt werden können.
Durch Genklonierung können auch verkürzte Antikörperfragmente hergestellt werden, die nur aus den variablen Region der schweren (VH) und der leichten
Kette (VL) bestehen. Diese werden als Fv-Fragmente (Fragment variable =
Fragment des variablen Teils) bezeichnet. Da bei diesen Fv-Fragmenten die kovalente Verbindung über die Cysteinreste der konstanten Ketten nicht möglich ist, werden diese Fv-Fragmente oft anderweitig stabilisiert. Dazu werden die variablen Region der schweren und leichten Kette häufig mittels eines kurzen
Peptidfragments von ca. 10 - 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15
Aminosäuren, miteinander verknüpft. Auf diese Weise entsteht eine einzelne
Polypeptidkette, in der VH und VL durch einen Peptidlinker miteinander verbunden sind. Solche Antikörperfragmente werden auch als single-chain Fv-Fragment (scFv) bezeichnet. Beispiele von scFv-Antikörpern sind bekannt und beschrieben.
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Strategien entwickelt um multimere scFv-Derivate herzustellen. Die Intention besteht in der Erzeugung von rekombinanten Antikörpern mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften und verstärkter Bindungsavidität. Zur Erreichung der Muitimerisierung der scFv- Fragmente werden diese als Fusionsproteine mit Multimerisierungsdomänen hergestellt. Als Multimerisierungsdomänen können dabei z.B. die CH3-Region eines IgGs oder Helixstrukturen {„coiled coil structure") wie die Leucin-Zipper- Domänen fungieren. In anderen Strategien wird die Interaktion zwischen den VH- und VL-Regionen des scFv-Fragments für eine Multimerisäerung genutzt (z.B. Dia- , Tri- und Pentabodies).
Als „Diabody" bezeichnet ein Fachmann ein bivalentes homodimeres scFv- Derivat. Die Verkürzung des Peptidlinkers im scFv-Moleküle auf 5 - 10 Aminosäuren resultiert in der Bildung von Homodimeren durch Überlagerung von VH/VL-Ketten. Die Diabodies können zusätzlich durch eingeführte Disulfidbrücken stabilisiert werden. Beispiele von Diabodies finden sich in der Literatur.
-21- Ais „Miπibody" bezeichnet der Fachmann ein bivalentes, homodimeres scFv- Derivat. Es besteht aus einem Fusionsproteiπ, das die CH3-Region eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, besonders bevorzugt IgGI, als Dimerisierungsregion enthält. Diese verbindet die scFv-Fragmente über eine Hinge-Region, ebenfalls von IgG, und eine Unker-Region..
Mit „Triabody" bezeichnet der Fachmann ein trivalentes homotrimeres scFv- Derivat. Die direkte Fusion von VH-VL ohne Verwendung einer Linkersequenz führt zur Ausbildung von Trimeren. Bei den vom Fachmann als Mini-Antikörper bezeichneten Fragmenten, die eine bi- , tri- oder tetravalente Struktur haben, handelt es sich ebenfalls um Derivate von scFv-Fragmeπten. Die Multimerisierung wird dabei über di-, tri- oder tetramere „coiled coil"-Strukturen erzielt.
Der Begriff „Antikörper-Fusion" oder „Antikörper-Fusionsprotein" bezeichnet die Fusion/Kopplung eines Proteins mit einem Antikörper oder einem Teil eines
Antikörpers. Insbesondere zählen dazu gentechnisch hergestellt Fusionsproteine, bei denen ein therapeutisches Protein an den Fc-Teil eines Antikörpers gekoppelt wird, um auf diese Weise eine die Halbwertszeit / Stabilität des Proteins im Serum zu erhöhen. Der Begriff umfasst auch Antikörper-Fusionen, die aus einem Peptid und einem Antikörper oder einem Teil eines Antikörpers bestehen.
Wirtszellen:
Im Rahmen der Erfindung bevorzugte Wirtszellen sind Hamsterzellen wie z.B. BHK21, BHK TK", CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 und CHO-DG44 Zellen oder Derivate/Abkömmlinge dieser Zeilünien. Besonders bevorzugt sind CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 und BHK21 Zellen, insbesondere CHO-DG44 und CHO-DUKX Zellen. Ebenfalls geeignet sind Myelomzellen der Maus, vorzugsweise NSO und Sp2/0 Zellen sowie Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien.
-22- Beispiele für Hamster- und Mäusezelien, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Aber auch Derivate und Abkömmlinge dieser Zellen, andere Säugerzellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Zelllinien von Mensch, Maus, Ratte, Affen, Nagetieren, oder eukaryontische Zellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hefe-, Insekten- , Vogel- und Pflanzenzellen, können ebenfalls als Wirtszellen zur Produktion von biopharmazeutischen Proteinen verwendet werden.
Tabelle 1: Hamster- and Mäuse-Produktionszelllinien
-23-
Erfindungsgemäß sind insbesondere rekombinante Säugerzelien, vorzugsweise Nagerzellen, besonders bevorzugt Hamsterzeilen, wie z.B. CHO- oder BHK- Zellen.
Wirtszellen sind bevorzugt, wenn sie etabliert, adaptiert und komplett unter serumfreien Bedingungen kultiviert werden. Besonders bevorzugt sind Wirtszellen, die zusätzlich in Medium etabliert, adaptiert und komplett kultiviert werden, weiches nicht nur serumfrei ist, sondern auch noch frei von jeglichen Proteinen /Peptiden tierischen Ursprungs.
Kommerziell erhältliche Medien wie Harn 's F12 (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Iπvitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-I nvtirogen), serumfreies CHO Medium (Sigma), und proteinfreies CHO Medium (Sigma) sind Beispiele passender Nährlösungen.
Der Begriff „Produktionszelle,, oder „Produzenten-Zelle" oder „Produktionsklon" bezeichnet eine Zelle, die in einem Prozess zur Herstellung eines Proteins verwendet wird. Insbesondere gehören dazu geπetisch-veränderte Zellen, die zur industriellen Produktion von recombinanten Proteinen eingesetzt werden. Im
Rahmen dieser Erfindung bezeichnet der Begriff vor allem genetisch-veränderte eukaryontische Wirtszellen, die ein recombinantes Protein exprimieren und zur Hersteilung dieses Proteins eingesetzt werden. Darunter fallen insbesondere monoklonale Zelllinien zur Produktion von therapeutischen Proteinen.
-24- AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode / ein Verfahren zur Kultivierung einer (1 ) einzelnen Zeile umfassend die folgenden Schritte: a) Kultivierung einer Zeilpopulation, b) Isolierung einer (1 ) einzelnen Zelle aus besagtem Zelipool und c) Kultivierung der besagten Einzelzelle in einem serumfreien und Insulinfreien Medium, welches „insulin-like growth factor" (IGF) enthält.
in einer spezieilen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass das Medium IGF in einer Konzentration von unter 800 μg/l enthalten ist. Weitere bevorzugte Konzentrationsbereiche für IGF sind 50-750 μg/L, und insbesondere bevorzugt sind 250-750 μg/L. idealerweise beträgt die IGF -Konzentration 500 μg/L.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die Isolierung der einzelnen Zelle mittels FACS erfolgt. In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die Zelle aus einer etablierten, immortalisierten Zelllinie stammt. In einer weiteren Ausführungsform ist die Zelle eine rekombinante Zelle, das heißt sie ist eine genetisch veränderte Zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist besagte Zelle eine Zelle, welche rekombinante bzw. heteroioge Proteine produziert. Es handelt sich in dieser bevorzugten Ausführungsform also um eine Produktionszelie, die bei der biopharmazeutischen Proteinherstellung eingesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft also insbesondere eine Methode / ein Verfahren zur Kultivierung einer (1) einzelnen rekombinanten Produktionszelle umfassend die folgenden Schritte: a) Kultivierung einer Zellpopulation, b) Isolierung einer (1) einzelnen rekombinanten Produktionszelle aus besagtem Zelipool mittels FACS und
-25- c) Kultivierung der besagten Einzelzelle in einem serumfreien und Insulinfreien Medium, welches „insulin-like growth factor" (IGF) in einem Konzentrationsbereich von 250-750μg/l (bevorzugt 500μg/l) enthält.
In einer weiteren Ausführuπgsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die Zelle eine nicht-humane Zelle ist, bevorzugt eine Hamster- oder Mauszelle. In einer spezifischen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die Zelle eine Nagerzelle (rodent) ist, bevorzugt eine Hamster- oder Mauszelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die Zelle eine „Chinese Hamster Ovary" (CHO) Zelle ist. Eine weitere bevorzugte Zelle ist die NSO Zelle.
In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die besagte Zeile eine eukaryotische Zelle ist wie beispielsweise eine Hefe-, Pflanzen-, Wurm-, Insekten-, Vogel-, Fisch-, Reptilien-, oder Säugetierzelie. Insbesondere bevorzugt ist die Zelle eine Vogelzelle aus Huhn oder Ente. Besonders bevorzugt ist eine eukaryotische Zelle, wenn sie eine Vertebratenzelle ist, insbesondere wenn sie eine Säugetierzelle ist. In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die besagte Säugetierzelie eine Chinese Hamster Ovary (CHO)1 eine affenartige Nierenzelie CV1 , eine affenartige Nierenzeile COS, eine humane LinsenepithelzeSle PER.C6™, eine humane embryonale Nierenzelle HEK293 ist oder eine humane Myelomzelle, eine human Amniozytenzeile, eine Baby-Hamsternierenzelie, eine afrikanische Grünaffen-Nierenzelle, eine humane cervicale Karzinomzeile, eine Hundenierenzeile, eine Rattenleberzelle, eine humane Lungenzeiie, eine humane Leberzelle, eine Maus-Brustkrebszelle oder wenn sie eine Myelomzelle, eine Hunde-, Schwein- oder Macaquenzelle ist bzw. eine Zelle aus der Ratte, Kaninchen, Hase, Katze, Ziege. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die besagte Zelle eine CHO Wiϊdtypzelle, eine CHO K1 Zelle, eine CHO DG44 Zelle, eine CHO DUKX-B11 Zelle, eine CHO
-26- Pro-5 Zelle oder eine Mutante oder ein Abkömmling hiervon ist. Insbesondere bevorzugt sind auch die CHO Mutanten Led bis Lec35. Ganz besonders bevozugt ist die CHO DG44 Zeile.
In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass das Medium zusätzlich Albumin enthält. Bevorzugt ist hierbei rekombinantes Albumin oder humanes Serumalbumin (HSA). Besonders bevorzugt ist humanes rekombinantes Serumalbumin. In einer spezieilen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass Albumin in einer Konzentration von weniger als 1g/L enthalten ist. Das Albumin / HSA Konzentrationsoptimum in IGF enthaltendem Medium (ohne Insulin Supplement) liegt bei unter 1000mg/l (siehe Abbildungen 2, 3 und 4). Weitere bevorzugte Albumin / HSA -Konzentrationsbereiche sind 250- 999 mg/L, 250-900mg/I und 250-750 mg/L. Besonders bevorzugt ist eine Konzentration von 400 mg/l sowie von 500 mg/L Albumin, insbesondere von rekombinantem humanem Serumalbumin. Das Konzentrationsoptimum von Albumin / HSA liegt im Bereich von 300-600mg/i bzw. 400-600mg/l, vorzugsweise im Bereich von 400-500mg/l.
In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die einzelne Zelle in der Gegenwart von Feederzellen kultiviert wird. Hierbei handelt es sich bevorzugt um autologe Feederzellen, besonders bevorzugt um autologe CHO Feederzellen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die Isolierung einer (1 ) einzelnen Zelle in Schritt b) durch "limited dilution" oder mit Hilfe eines "fluorescence activated cell sorting" (FACS)- Gerätes erreicht wird. Besonders bevorzugt ist die Isolierung einer (1) einzelnen Zelle mittels FACS.
-27- In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass die Zeile(π) in Schritt a), b) und c) ein Protein von Interesse exprimiert(en).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfinduπgsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein therapeutisches Protein ist, bevorzugt ein Antikörper, ein Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment. In einer speziellen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein membranständiges oder ein sekretiertes Protein ist, bevorzugt ein Antikörper, ein Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment.
Der besagte Antikörper ist bevorzugt ein monoklonaler, polyklonaler, vom Säugetier abstammender, muriner, chimerer, humanisierter, primatisierter, primaten, humaner oder ein Antikörperfragment oder ein Derivat hiervon wie beispielsweise eine Immunoglobulin leichte Kette, eine Immunoglobulin schwere Kette, eine Immunoglobulin leichte und schwere Kette, ein Fab Fragment, ein F(ab')2 Fragment, ein Fc Teil, ein Fc-Fc Fusionsprotein, ein Fv Fragment, ein „Single chaiπ" Fv Fragment, ein „Single domain" Fv Fragment, ein tetravalentes „Single chain" Fv Fragment, ein Disulfid-verknüpftes Fv Fragment, ein Domänen deletierter Antikörper oder Fragment, ein „minibody", „diabody", oder ein Fusionspolypeptid eines der genannten Fragmente mit einem anderen Peptid oder Polypeptid, eine Fc-Peptidfusion, eine Fc-Toxinfusion oder ein „scaffold" Protein.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von konditiniertem Medium, um die Reklonierungseffizienz insbesondere nach FACS- basierter Einzelzellablage zu erhöhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass konditiniertes Medium eingesetzt wird. Konditioniertes Medium wird insbesondere als Grundmedium oder als Medienzusatz in den Schritten a) und/oder b) und/oder c) verwendet. Bevorzugt wird konditioniertes
-28- Medium in Schritt c) verwendet. Insbesondere wird konditioniertes Medium in Schritt c) ais Grundmedium verwendet oder als Medienzusatz. Der Anteil an konditioniertem Medium kann dabei von 10-100% des Gesamtvolumens an Medium betragen, bevorzugt ist ein Anteil von 30-75%, besonders bevorzugt sind 50% konditioniertes Medium.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Zelle, die nach einer erfindungsgemäßen Methode generiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Produktion eines Proteins von Interesse in einer Zelle, bevorzugt einer CHO Zeile, unter Serum- freien und Insulin-freien Kultivierungsbedingungen umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung einer Zellpopulation, welche ein Gen von Interesse enthält, welches für ein Protein von Interesse kodiert, b) Kultivierung dieser Zellen unter Kultivierungsbedingungen, die ein Wachstum der Zellen ermöglicht, c) Isolierung und Deponierung einer einzelnen Zelle in ein Gefäß, bevorzugt in eine 96 -Loch platte, d) Kultivierung der besagten einzelnen Zelle in Serum-freiem und
Insulin-freiem Medium enthaltend IGF, optional in Gegenwart von Albumin und / oder Feederzellen, e) Selektion einer Zelle entsprechend ihrem Expressionslevel an
Protein von Interesse, f) Ernte des Proteins von Interesse beispielsweise durch Abtrennung der Zellanteiie vom Überstand und g) Aufreinigung des Proteins von Interesse.
In einer speziellen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch charakterisiert, dass in Schritt d) bevorzugt autologe Feederzellen eingesetzt werden.
-29- Weiterhin bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die Kuitivierungsbedingungen eine
IGF Konzentration von unter 800μg/l aufweisen. Die IGF Konzentration liegt hierbei bevorzugt im Bereich zwischen 50-750 μg/L, und insbesondere bevorzugt im Bereich zwischen 250-750 μg/L. Idealerweise beträgt die IGF -Konzentration 500 μg/L.
Weiterhin bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die Kultivierungsbedingungen eine
Albumin (insbesondere HSA) Konzentration von unter 1000mg/l umfassen. Die
Albumin Konzentration liegt hierbei bevorzugt im Bereich zwischen 250-999 mg/L,
250-900mg/l und 250-750 mg/L. Besonders bevorzugt ist eine Konzentration von 400 mg/i sowie von 500 mg/L Albumin, insbesondere von rekombinantem humanem Serumaibumin. Das Konzentrationsoptimum von Albumin, insbesondere HSA iiegt im Bereich von 300-600mg/l bzw. 400-600rng/l, vorzugsweise im Bereich von 400-500mg/l.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch charakterisiert, dass die Isolierung einer einzelnen Zelle in Schritt c) durch FACS erfolgt.
Weiterhin bevorzugt ist eine Ausführungsform des Verfahrens, bei welcher CHO
DG44 Zellen eingesetzt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch charakterisiert, dass Schritt e) automatisiert wird.
Insbesondere wird in e) bevorzugt ein Analyse-Roboter eingesetzt.
Ein solches automatisiertes Verfahren ist besonders dadurch gekennzeichnet, dass das automatisierte System besteht aus: i) (Roboter)station, weiche FACS-basierte Einzeizellklonierung durchführt, ii) Inkubator zur Kultivierung der Zeilen nach erfolgter Einzeizellklonierung, verbunden mit iii) Roboterstation, welche einen Protein-, insbesondere Antikörper- detektierenden-Assay durchführt, wie z.B. ELISA oder HTRF® (homogenous time resolved fluorescence) assay. Besonders bevorzugt ist ein automatisiertes Verfahren, das die Durchführung der
Schritte c) bis e) in 96- oder 384-Lochplatten erlaubt.
-30- Weiterhin bevorzugt ist ein möglichst frühes automatisiertes Screening auf rekombinante Proteinproduktion in den Monierten Zellen, z.B. vor der ersten Passagierung der Zellen (immediate early screen) wie in PCT/EP2007/059663 (=EP1901068) beschrieben. Diese Anmeldung wird hiermit als Referenz inkorporiert. Bevorzugt ist insbesondere ein automatisiertes Verfahren, welches einen Durchsatz von mindestens 250 Messungen innerhalb von 12 Stunden, besonders bevorzugt von mindestens 500, 2000, 4000, 10000 bzw. 14000 Messungen innerhalb von 12 Stunden aufweist.
In einer speziellen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein rekombinantes Protein ist. in einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein therapeutisches Protein ist, bevorzugt ein Antikörper, ein Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment.
In einer spezieilen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Methode dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein membranständiges oder ein sekretiertes Protein ist, bevorzugt ein Antikörper, ein Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment. Der besagte Antikörper ist bevorzugt ein monoklonaler, polyklonaler, vom Säugetier abstammender, muriner, chimerer, humanisierter, primatisierter, primaten, humaner oder ein Antikörperfragment oder ein Derivat hiervon wie beispielsweise eine Immunoglobulin leichte Kette, eine Immunoglobulin schwere Kette, eine Immunoglobulin leichte und schwere Kette, ein Fab Fragment, ein F(ab')2 Fragment, ein Fc Teil, ein Fc-Fc Fusionsprotein, ein Fv Fragment, ein „Single chaiπ" Fv Fragment, ein „Single domain" Fv Fragment, ein tetravalentes „Single chain" Fv Fragment, ein Disulfid-verknüpftes Fv Fragment, ein Domänen deletierter Antikörper oder Fragment, ein „minibody", „diabody", oder ein Fusionspolypeptid eines der genannten Fragmente mit einem anderen Peptid oder Polypeptid, eine Fc-Peptidfusion, eine Fc-Toxinfusion oder ein „scaffold" Protein.
-31- Die vorliegende Erfindung betrifft also insbesondere ein Verfahren zur Produktion eines Proteins von Interesse, bevorzugt eines Antikörpers, in einer rekombinanten Produktionszeit, bevorzugt einer CHO Zelle, unter Serum-freien und Insulin-freien Kuitivieruπgsbedingungen umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung einer Zellpopulation, welche ein Gen von Interesse enthält, welches für ein Protein von Interesse kodiert, b) Kultivierung dieser Zeilen unter Serurn-freien Kultivierungsbedingungen, die ein Wachstum der Zellen ermöglicht, c) Isolierung und Deponierung einer einzelnen Zeile in ein Gefäß, bevorzugt in eine 96-Lochplatte, mittels FACS, d) Kultivierung der besagten einzelnen Zelle in Serum-freiem und Insulin-freiem Medium enthaltend IGF in einer Konzentration unter 800μg/l bzw. in einem Bereich von 250-750μg/[, bevorzugt 500μg/l, bevorzugt in Gegenwart von Albumin in einer Konzentration unter 1000mg/l und / oder Feederzellen, e) Selektion einer Zelle entsprechend ihrem Expressionslevel an Protein von Interesse, wobei diese Selektion bevorzugt mittels Roboterstation, welche einen Protein- bzw. Antikörper-detektierenden-Assay durchführt, wie z.B. ELISA oder HTRF® (homogenous time resolved fluorescence) erfolgt und wobei der Durchsatz mindestens 250 Messungen innerhalb von 12 Stunden, besonders bevorzugt von mindestens 500, 2000, 4000, 10000 bzw. 14000 Messungen innerhalb von 12 Stunden beträgt, f) Ernte des Proteins von Interesse beispielsweise durch Abtrennung der Zellanteile vom Überstand und g) Aufreinigung des Proteins von Interesse.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Protein, welches nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zur Selektion einer Produktionszelle, wobei eine erfindungsgemäße Methode wie oben in verschiedenen Ausführungsformen beschrieben angewendet wird.
-32- In einer spezifischen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Produktionszelie dadurch charakterisiert, dass sie durch eine der erfindungsgemäß beschriebenen Methoden selektioniert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße ProduktionszeNe dadurch charakterisiert, dass die Wirtszelle eine Hamster- oder Mauszelle ist In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Produktionszelie dadurch charakterisiert, dass die Wirtszelie eine Hamsterzelle oder eine Maus- Myelomzelle ist, bevorzugt eine CHO- oder BHK-ZeIIe oder eine NSO Zelle. Insbesondere bevorzugt ist eine CHO DG44 Zelle.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Produktionszelle für die biopharmazeutische Proteinhersteliung.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein Serum-freies und Insulin-freies Kulturmedium, welches die Kultivierung einer (1) einzelnen Zelle ermöglicht, enthaltend IGF (bevorzugt <800μg/l, bzw. 250-750μg/l, insbesondere 500μg/l) und optional Albumin (bevorzugt < 1000mg/l bzw. 300-600mg/l oder 400-500mg/l). Bevorzugt ist die einzelne Zelle hierbei eine CHO Zelle, insbesondere bevorzugt eine CHO DG44 Zelle.
Die folgenden Beispiele sind nicht-einschränkender Natur. Sie stellen lediglich mögliche Ausführungsformeπ dar. Der Fachmann kann die beschriebenen Bedingungen jederzeit problemlos auf andere Ausführungsformen anpassen / übertragen.
-33- EXPERIMENTELLER TEIL
MATERIAL UND METHODEN
KULTIVIERUNG DER ZELLEN
Die Zellen CHO-DG44/dhfr"'~ (Urlaub et al., 1983) werden permanent als Suspensionszeilen in serum-freiem und mit Hypoxanthin und Thymidin supplementiertem Ex-CeII Medium (JRH, USA) oder in B!-eigenem Medium in Zelikulturflaschen bei 370C in feuchter Atmosphäre und 5% CO2 kultiviert. Die Zelizahien sowie die Viabilität werden mit einem CEDEX Cell Counter (Innovatis, DE) oder durch Trypanblau-Färbung bestimmt und die Zellen dann in einer Konzentration von 1 - 3 x105/mL eingesät und alle 2 - 3 Tage passagiert. Für die Einzelzellklonierung werden rekombinante CHO-DG44 verwendet Die Kultivierung klonierter rekombinanter Zellen erfolgt analog zu diesen Zellen. Als Medium wird ebenfalls Ex-CeII Medium (JRH, USA) oder Bl-eigenes Medium ohne Hypoxanthin und Thymidin verwendet.
Die Zellen NSO lassen sich permanent als Suspensionszellen in serum-freiem Hybridoma Medium, Animal component free Medium (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA) in ZeI Iku Itu rf laschen bei 370C in feuchter Atmosphäre und 5% CO2 kultivieren. Die Zelizahien sowie die Viabilität kann mit einem CEDEX Cell Counter (Innovatis, DE) oder durch Trypanbiau-Färbung bestimmt werden und die Zeilen werden dann in einer Konzentration von 1 - 3 x105/mL eingesät und alle 2 - 3 Tage passagiert.
HERSTELLUNG VON FEEDER-ZELLEN DURCH BESTRAHLUNG Serum- und proteinfrei wachsende suspendierte CHO-Zellen (nicht transfizierte
Zeilen), werden bei 180g für 10 Minuten abzentrifugiert und auf eine
Zelikonzentration von 1 x 106/mL in HBSS (Hank's balanced salt Solution) eingestellt.
Danach erfolgt die Bestrahlung der Zellen mit einer radioaktiven Bestrahlungsqueile (Cs137-Strahier, Gammacell 2000, Fa. Molsgaard Medical
A/S, Dänemark) mit einer Energiedosisleistung von 4Gy/min. Nach der
-34- Bestrahlung werden die Zeilen mit ca, 10000 Zellen/Vertiefung in 96-Loch- Mikrotiterplatten in dem für die Zelle spezifischen Ex-Ceil Medium (JRH, USA) oder Bl-eigenem Medium (z.B. TH-9 ) Medium eingesät und bei ca. 37°C und 5% CO2 in Brutraumatmosphäre gelagert. Das Verfahren wird entsprechend mit NSO-Zellen durchgeführt, wobei die feeder- Zellen in dem jeweils für die Zellen spezifischen Medium gehalten/eingesät werden.
HERSTELLUNG VON KONDITIONIERTEM MEDIUM Das konditionierte Medium wird aus dem Überstand einer CHO-Zellkultur erhalten, Die CHO-Zellen werden mit einer Einsaatdichte von 0,3x106 Zellen/mL eingesät und für zwei bis vier Tage kultiviert. Der Überstand wird durch Zentrifugation von den Zellen getrennt und anschließend über einen O,2μm-Filter sterilfiltriert. Das erhaltene Filtrat wird als konditioniertes Medium eingesetzt.
FACS-BASIERTE ZELLABLAGE
Die automatische Zellablage (Einzel- oder Mehrzellablage) wird mit einem mit Argon-Laser (488nm) bestückten Flow Cytometer (Coulter EPICS Altra (Fa. Beckman-Coulter, Miami, FL, USA) mittels Autoclone-Einheit durchgeführt. Die Zellen werden hierbei in der exponentiellen Wachstumsphase abzentrifugiert und auf eine Zellkonzentration von 1 - 1 ,5 x107/mL in HBSS aufgenommen. Anschließend werden die Zellen mit der „Hypersort-Option" mit einer Geschwindigkeit von 8000-12000 Zellen/Sekunde nach ihrer Lage im Streulicht sortiert. Zellen, die ein Fluoreszenzprotein exprimieren, lassen sich alternativ gemäß ihrer Fluoreszenzintensität in Bezug auf das intrazellulär exprimierte Fluoreszenzprotein sortieren. Die Zellen werden jeweils einzeln in (optional) mit feeder-Zeilen bestückten 96~Loch Mikrotiterplatten abgelegt. Bei der Sortierung von CHO-Zellen erfolgt die Zellablage in Ex-CeII Medium (JRH, USA) oder in Bl-eigenem Medium (z.B. TH-9) mit den entsprechenden Supplementen an IGF oder Insulin und optional bzw. vorzugsweise HSA.
-35- Für NSO-Zellen erfolgt die Zeilablage entsprechend in Hybridoma Medium, Animal component free Medium (Sigma, Aldrich, St. Louis, USA).
BERECHNUNG DER REKLONIERUNGSEFFiZIENZ Die Reklonierungseffizienz berechnet sich aus dem Quotienten positive Vertiefungen je Platte/Gesamtvertiefungen je Platte. Als positive Vertiefungen werden Vertiefungen angesehen, in denen sich genau ein Klon befindet.
BEISPIEL 1 Einfluss von Insulin und !GF auf die Reklonierungseffizienz in HSA- supplementiertem Medium.
CHO DG44 Zellen werden für 5 Passagen an das B [-eigene, Serum-freie Medium adaptiert. Danach erfolgt eine FACS-basierte Einzelzellablage mit unterschiedlichen Insulin und IGF-Konzentrationen in mit 500mg/L HSA suppiementiertem Medium. Nach 21 Tagen werden die hochgewachsenen Klone ausgezählt und daraus über den Anteil der gewachsenen Klone an der Gesamtanzahl der verwendeten Wells die Reklonierungseffizienz errechnet. Es sind sowohl bei Insulin als auch bei IGF Optimumskurven zu beobachten. Das Optimum bei Insulin liegt bei 100mg/L und bei IGF bei 500μg/L. (Abbildung 1 ) Der Level an Rekionierungseffizienz bei der Verwendung von IGF ist höher als bei Insulin.
BEISPIEL 2:
Einfluß von HSA-Zusatz im Medium auf die Rekionierungseffizienz CHO DG44 Zellen werden für 5 Passagen das Basalmedium ExCeII 302 oder Bleigenes Medium adaptiert (enthaltend 50μg/l IGF, aber kein Insulin-Supplement). Danach erfolgt eine FACS-basierte Einzelzellablage mit unterschiedlichen HSA- Konzentrationen mit und ohne Feederzellen. Nach 21 Tagen werden die hochgewachsenen Klone ausgezählt und daraus über den Anteil der gewachsenen Klone an der Gesamtanzah! der verwendeten Wells die Reklonierungseffizienz errechnet. Es zeigt sich ein positiver Effekt der
-36- Verwendung von HSA, wobei ein HSA-Zusatz von ca. 400mg/L ausreichend bzw. optimal ist {Abbildung 2). Abbildung 2 verdeutlicht, dass das HSA Konzeπtrationsoptimum in IGF enthaltendem Medium (ohne Insulin Supplementation) bei unter 100.0mg/! liegt.
BEISPIEL 3
Einfluß der Verwendung von HSA-suppiementiertem Medium auf die
Reklonierungseffizienz von CHO DG44- und NSÜ-Zellen.
CHO DG44- und NSO-Zelieπ werden für 5 Passagen an Bl-eigenes Medium (CHO DG44) bzw. CD-Hybridoma-Medium (Invitrogen) adaptiert. Danach erfolgt eine
FACS-basierte Einzelzellablage mit und ohne Feederzellen und mit und ohne
500mg/L HSA. Nach 21 Tagen werden die hochgewachsenen Klone ausgezählt und daraus über den Anteil der gewachsenen Klone an der Gesamtanzahl der verwendeten Wells die Rekionierungseffizienz errechnet (Abbildung 3), Es zeigt sich bei beiden Zelllinien der positive Einfluß von Feederzellen und HSA auf die Reklonierungseffizienz der beiden Zelltypen. Die Reklonierungseffizienz bei den CHO DG44-Zellen ist höher als bei den NSO-Zellen.
BEISPIEL 4 Einfluß der Kombination von HSA und IGF auf die Reklonierungseffizienz
Mit den Zellen einer CHO-DG44 Kultur wird eine FACS-basierte Einzelzellablage mit Feederzellen mit unterschiedlichen HSA- und !GF-Konzentrationeπ durchgeführt. Nach 21 Tagen werden die hochgewachsenen Klone ausgezählt und anhand dessen die Reklonierungseffizienz bestimmt. Abbildung 4 zeigt sowohl für HSA als auch für IGF eine konzentrationsabhängige Steigerung der Reklonierungseffizienz. Darüber hinaus zeigt sich ein additiver bzw. synergistischer Effekt von HSA und IGF. Entsprechend wird die höchste Reklonierungseffizienz bei der Zugabe beider Proteine (500mg/L HSA und 500μg/L IGF) zum Kultivierungsmedium erzielt.
-37-

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Eine Methode zur Kultivierung einer einzelnen Zelle umfassend die folgenden Schritte: 5 a) Kultivierung einer Zellpopulation, b) Isolierung einer einzelnen Zeile aus besagtem Zellpool und c) Kultivierung der besagten Einzelzelle in einem serumfreien und Insulinfreien Medium, welches „insulin-iike growth factor" (IGF) enthält. o
2. Die Methode gemäß Anspruch 1 dadurch charakterisiert, dass iGF in einer Konzentration von unter 800 μg/l enthalten ist.
3. Die Methode gemäß Anspruch 1 oder 2 dadurch charakterisiert, dass die Zelle eine Hamster- oder Mauszelie ist. 5
4. Die Methode gemäß Anspruch 3 dadurch charakterisiert, dass die Zeile eine „Chinese Hamster Ovary" (CHO) Zelle ist.
5. Die Methode gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 dadurch charakterisiert, dassD das Medium zusätzlich Albumin enthält.
6. Die Methode gemäß Anspruch 5 dadurch charakterisiert, dass Albumin in einer Konzentration von weniger als 1g/L enthalten ist. 5
7. Die Methode gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 dadurch charakterisiert, dass die einzelne Zelle in der Gegenwart von Feederzellen kultiviert wird.
8. Die Methode gemäß Anspruch 7 dadurch charakterisiert, dass es sich um autologe Feederzellen handelt. 0
-38-
9. Die Methode gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 dadurch charakterisiert, dass die Isolierung einer einzelnen Zelle in Schritt b) durch "limited dilution" oder mit Hilfe eines "fluorescence activated cell sorting" (FACS)-Gerätes erreicht wird.
10. Die Methode gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 dadurch charakterisiert, dass die Zelle{n) in Schritt a), b) und c) ein Protein von Interesse exprimier(en).
11. Die Methode gemäß Anspruch 10 dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein therapeutisches Protein ist, bevorzugt ein Antikörper, ein
Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment.
12. Die Methode gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 dadurch charakterisiert, dass konditiniertes Medium zugesetzt wird.
13. Eine Zelle, die nach der Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 generiert wird.
14. Ein Verfahren zur Produktion eines Proteins von Interesse in einer Zelle, bevorzugt einer CHO Zelle, unter Serum-freien und insulin-freien
Kultivierungsbedingungen umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung einer Zellpopuiation, welche ein Gen von Interesse enthält, weiches für ein Protein von Interesse kodiert, b) Kultivierung dieser Zellen unter Kultivierungsbedingungen, die ein Wachstum der Zellen ermöglicht, c) Isolierung und Deponierung einer einzelnen Zelle in ein Gefäß, bevorzugt in eine 96-Lochplatte, d) Kultivierung der besagten einzelnen Zelle in Serum-freiem und Insulin-freiem Medium enthaltend IGF, optional in Gegenwart von Albumin und / oder Feederzellen,
-39- e) Selektion einer Zelle entsprechend ihrem Expressionslevel an Protein von Interesse, f) Ernte des Proteins von Interesse beispielsweise durch Abtrennung der Zellanteile vorn Überstand und g) Aufreinigung des Proteins von Interesse.
15. Das Verfahren gemäß Anspruch 14 dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein rekombinantes Protein ist.
16. Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 14 oder 15 dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein therapeutisches Protein ist.
17. Das Verfahren gemäß Anspruch 16 dadurch charakterisiert, dass das Protein von Interesse ein Antikörper ist oder ein Antikörperfusionsprotein oder ein Antikörperfragment.
18. Ein Protein, welches nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 hergestellt wird.
19. Ein Verfahren zur Selektion einer Produktionszelle, wobei eine Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 12 angewendet wird.
20. Eine Produktionszelle, welche durch eine der Methoden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 selektioniert wird.
21. Eine Produktionszelle gemäß Anspruch 20 dadurch charakterisiert, dass die Wirtszelle eine Hamster- oder Mauszelle ist.
22. Eine Produktionszelle gemäß Anspruch 21 dadurch charakterisiert, dass die Wirtszelle eine Hamsterzelle oder eine Maus-Myelomzel!e ist, bevorzugt eine CHO- oder BHK-ZeIIe oder eine NSO Zelle.
-40-
23. Verwendung einer Produktionszelle gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22 für die biopharmazeutische Proteinherstellung.
24. Ein Serum-freies und Insulin-freies Kulturmedium, welches die Kultivierung einer einzelnen Zelle ermöglicht, enthaltend IGF und optional Albumin.
25. Das Medium gemäß Anspruch 24 dadurch charakterisiert, dass die einzelne Zeile eine CHO Zelle ist.
-41-
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