EP2235166A1 - Vecteurs vaccinaux derives de leporipoxvirus - Google Patents

Vecteurs vaccinaux derives de leporipoxvirus

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Publication number
EP2235166A1
EP2235166A1 EP08872097A EP08872097A EP2235166A1 EP 2235166 A1 EP2235166 A1 EP 2235166A1 EP 08872097 A EP08872097 A EP 08872097A EP 08872097 A EP08872097 A EP 08872097A EP 2235166 A1 EP2235166 A1 EP 2235166A1
Authority
EP
European Patent Office
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protein
virus
cells
leporipoxvirus
region
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08872097A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Stéphane BERTAGNOLI
Béatrice PIGNOLET
Jacqueline Gelfi
Christelle Camus-Bouclainville
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
ECOLE Nationale Veterinaire Toulouse
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
ECOLE Nationale Veterinaire Toulouse
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA, ECOLE Nationale Veterinaire Toulouse filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP2235166A1 publication Critical patent/EP2235166A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2710/24061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/24062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering

Definitions

  • the present invention relates to novel vaccine vectors derived from Leporipoxviruses and in particular from the myxomatosis virus.
  • the genus Leporipoxvirus belongs to the family of Poxviridae. This genus, whose type species is the myxomatosis virus (VM), includes poxviruses specific to Leporidae. Myxomatosis virus, also known as Myxoma virus, is the causative agent of myxomatosis, a major infectious disease in European rabbits, and endemic in Europe. Poxviridae have an intracytoplasmic replicative cycle in which different viral forms are successively observed: IMV (mature intracellular virions), EVI (enveloped intracellular virions) and EEV (enveloped extracellular virions).
  • IMV mature intracellular virions
  • EVI enveloped intracellular virions
  • EEV enveloped extracellular virions
  • IMVs are formed in the cytoplasm of infected cells, and have a single membrane. They represent the vast majority of viral progeny and are released during lysis of the host cell. A small part of IMV acquires an additional double envelope derived from the Golgi apparatus or endosomes, constituting the IEV viral forms. IEVs migrate to the cell surface and fuse with the cell membrane. They lose their outermost envelope and release EEV into the extracellular environment.
  • Recombinant poxviruses have been shown to be effective as vaccination vectors by their ability to elicit an immune response against foreign antigens. Their exclusively cytoplasmic replicative cycle avoids possible complications resulting from the integration of viral DNA into the genome of the infected cell. They are able to integrate large fragments of foreign DNA (more than 25 kbp) by homologous recombination. They are also able to correctly express the proteins of interest and to induce a good immune response. Leporipoxviruses also have the advantage of having a very narrow host spectrum in vivo which gives them a significant safety of use.
  • transgenes are inserted in intergenic zones, or in zones containing genes that are not essential for viral replication.
  • the majority of the insertion sites that have been identified are located near the genomic endings, where non-essential genes are located in the viral cycle (MACKETT et al., J Virol, 49, 857-864, 1984, PERKUS et al. al., Virology, 180, 406-410, 1991).
  • PCT Application WO 02072852 describes the use of recombinant Leporipoxviruses for obtaining vaccine vectors that can be used in animals other than Leporidae, especially in birds, felines, canines, pigs, sheep, cattle, horses, as well as in humans. It is indicated that in these vectors, the transgene expressing the vaccine antigen of interest may be inserted at the level of the gene coding for thymidine kinase, or at one of the genes coding for the virulence factors MI1L, SERP- 1, -2 and -3 or MGF.
  • poxviruses With regard to poxviruses, the only vectors of this type described to date have been obtained from recombinant vaccinia virus in which the vaccine antigens of interest are fused to the B5R envelope protein of EEV virions (KATZ and MOSS, AIDS Res Hum Retroviruses, 13, 1497-1500, 1997, BARCHICHAT and KATZ, Virus Res, 90, 243-251, 2002, KWAK et al., Virology, 322, 337-348, 2004).
  • KATZ and MOSS AIDS Res Hum Retroviruses, 13, 1497-1500, 1997, BARCHICHAT and KATZ, Virus Res, 90, 243-251, 2002, KWAK et al., Virology, 322, 337-348, 2004.
  • the inventors have now identified two Leporipoxvirus envelope proteins to which an antigen of interest can be fused, without this fusion altering the functions of these proteins in viral morphogenesis.
  • M071L and M022L proteins called M071L and M022L in the myxomatosis virus (CAMERON et al., Virology, 264, 298-31, 1999).
  • M071L GenBank: NPJD51785, GI: 9633707
  • M071L is a 324 aa protein encoded by a late gene; it has a molecular weight of about 36.8 kDa; it is integrated into the IMV membrane of which it constitutes the immunodominant antigenic component.
  • gpO71L NP_051960, GI: 9633880
  • H3L protein which is involved in the maturation of virus particles (DA Fonseca et al., J. Virol., 74, 7518-7528, 2000).
  • M071L has 90% identity and 94% sequence similarity with gpO71L and 35% identity and 61% similarity with H3L.
  • sequence of the M071L protein of the myxomatosis virus (identical to the GenBank sequence NP__051785) is represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 1; the sequence of the M022L protein of the myxomatosis virus (identical to the GenBank NP_051736 sequence) is represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO: 2.
  • the inventors have found that when a sequence coding for an exogenous protein is fused to the sequence coding for M071L, so as to obtain a chimeric protein comprising said exogenous protein fused at the C-terminal end of M071L, this chimeric protein was expressed comparable to the native M071L protein.
  • this C-terminal fusion does not interfere with the function of the M071L protein in viral morphogenesis, and in modified Myxoma virus expressing the chimeric protein, it is localized as the native M071L protein, at the level of the IMV membrane.
  • the exogenous protein is presented on the surface of IMV and can also induce an immune response.
  • the inventors have also found that, on the other hand, when the exogenous protein was fused to the N-terminus of M071L, it was not possible to obtain a recombinant virus expressing the fused protein, suggesting a lethal modification of the protein. M071L.
  • the inventors have found that the fusion of an exogenous protein at its C-terminal end produced a non-functional chimeric protein, and resulted in the absence of formation of viral particles.
  • the exogenous protein is fused to the N-terminal end of M022L, the chimeric protein obtained preserves, in modified Myxoma virus expressing this protein, the function and the localization of the native M022L protein, and allows the presentation of the exogenous protein on the surface of EEV and the induction of a humoral and cellular immune response directed against this exogenous protein.
  • modified Myxoma viruses expressing the chimeric proteins described above although they have a morphology and a capacity for replication comparable to those of the wild strain from which they originate, have a considerably reduced pathogenicity. .
  • the subject of the present invention is therefore a modified Leporipoxvirus characterized in that it expresses a chimeric coat protein selected from: a) a chimeric coat protein comprising:
  • a region A consisting of a protein having at least 85%, preferably at least 90%, and most preferably at least 95% identity, or at least 90%, preferably at least 92%, and most preferably at least 96% sequence similarity with the M071L protein defined by the sequence SEQ ID NO: 1; a region B constituted by an exogenous protein of interest, said region B being fused to the C-terminal end of said region A; b) a chimeric coat protein comprising:
  • region A consisting of a protein having at least 85%, preferably at least 90%, and most preferably at least 95% identity, or at least 90%, preferably at least 92%, and most preferably at least 96% sequence similarity with the M022L protein defined by the sequence SEQ ID NO: 2;
  • region B consisting of an exogenous protein of interest, said region B being fused to the N-terminus of said region A directly, or possibly via a peptide linker of a few amino acids.
  • the percentages of identity and similarity referred to herein are calculated using the BLASTP program, using the default parameters, on a comparison window consisting of the complete sequence of the protein.
  • the exogenous protein of interest is expressed on the surface of IMV in the case of Leporipoxviruses expressing a chimeric protein as defined in a) above, and on the surface of EEV in the case of Leporipoxviruses expressing a chimeric protein as defined in (b) above.
  • a modified Leporipoxvirus expresses a chimeric protein as defined in a) above, and a chimeric protein as defined in b) above. These two chimeric proteins may contain the same protein of interest or two different proteins of interest.
  • the present invention also encompasses any modified Leporipoxvirus expressing a chimeric protein comprising a Leporipoxvirus IMV membrane protein fused with an exogenous protein of interest.
  • the exogenous protein of interest can be any protein against which it is desired to induce a response.
  • humoral and / or cellular immune system Its size can vary from a few amino acids to a few hundred amino acids.
  • It may be in particular an antigenic protein derived from a viral, bacterial or parasitic pathogen, or an antigenic fragment of said protein, or a recombinant protein combining various antigenic fragments, originating from the same antigen or different antigens.
  • Modified Leporipoxviruses according to the invention can be obtained from wild Leporipoxviruses, or attenuated Leporipoxviruses. These may include myxomatosis virus or rabbit fibroid virus.
  • strains of myxomatosis virus from which can be constructed modified viruses according to the invention include: strain LA ⁇ SANNE (ATCC VR-115), strain Moses (ATCC VR-II 6), the strains described in Application FR 2736358, and in particular strains LEON 162 (L162): CNCM 1-1595; HUNGARIAN (HG): CNCM 1-1593; FINISTERE (F9): CNCM 1-1596; R 801: CNCM 1-1598; TOULOUSE 1 (Tl): CNCM 1-1592, as well as the attenuated strain SG 33 (CNCM I-1594).
  • strain LA ⁇ SANNE ATCC VR-115
  • strain Moses ATCC VR-II 6
  • the strains described in Application FR 2736358 and in particular strains LEON 162 (L162): CNCM 1-1595; HUNGARIAN (HG): CNCM 1-1593; FINISTERE (F9): CNCM 1-1596; R 801: CNCM 1-1598; TOULOUSE 1 (T
  • strains of rabbit fibroid virus from which can be constructed modified viruses according to the invention include: the strain
  • the modified Leporipoxviruses according to the invention can be produced by conventional techniques used for the production of recombinant poxviruses, which implement a homologous recombination between the genome of a poxvirus in which it is desired to insert a sequence of interest, and a transfer vector, containing the sequence that one wishes to insert, framed by sequences of the genome of the poxvirus flanking the site where the insertion must take place. Homologous recombination occurs in host cells infected with the selected poxvirus and transfected with the transfer vector.
  • the present invention also relates to tools for the production of modified Leporipoxviruses in accordance with the invention, and in particular: a polynucleotide encoding a chimeric envelope protein, as defined above, an expression cassette containing said polynucleotide under the control of a suitable promoter, and a recombinant vector containing said expression cassette.
  • the promoter used in the expression cassettes in accordance with the invention is that of the gene coding for the envelope protein to which the exogenous protein of interest is fused.
  • These expression cassettes may also include a marker gene facilitating the selection of recombinant viruses. This may be, for example, a gene conferring a selective advantage on recombinant viruses, such as an antibiotic resistance gene, such as mycophenolic acid or geneticin, or a gene allowing the visualization of the plaques. lyse containing the recombinant virus, such as the LacZ gene, the gus gene, or a gene encoding a fluorescent protein.
  • Host cells that can be used for producing the modified compounds according to the invention are those usually used for the production of Leporipoxvirus; these include normal or tumorous rabbit cells, normal or tumor monkey cells, avian, normal or tumor cells, or human tumor cells.
  • the modified Leporipoxviruses in accordance with the invention can be used to obtain vaccines, not only in leporids, but also in other animal species, including birds and mammals, and in particular sheep, cattle, swine, equines, canines, felines, and primates, especially humans.
  • Said vaccines can be formulated for parenteral use, for example intradermally, intramuscularly, or subcutaneously, orally, or mucosally, for example intranasal.
  • the amount of virus modified per vaccine dose is chosen so as to allow a level of expression of the exogenous protein of sufficient interest to induce an immune response against this protein. It may depend in particular on the nature of said exogenous protein, the species and the age of the subject to be vaccinated, the type of immune response (cellular or humoral) that it is desired to favor. Usually, it will be between 10 3 and 10 9 pfu (plaque forming units) per vaccine dose.
  • Three recombinant viruses derived from the strain strain Jardin 1 were constructed. Two produce the M022L protein fused with either GFP (Green Fluorescent Protein) or with the ectodomain of the M2 protein (M2e) (GenBank: AY340089) of the avian influenza A virus in its amino-terminal part (Tl-N-gfp- M022L and Tl-N-M2e-M022L). The third product protein M071L fused with M2e in its carboxy-terminal part (Tl-C-M2e-M071L). Material and methods :
  • the myxomatous viruses of strain Jardin 1 (Tl), as well as the modified viruses are propagated on RK13 cells in medium consisting of DMEM (Dubelcco's Minimal Eagle Medium, Gibco®) supplemented with penicillin at 100 IU / ml final and streptomycin at 100 ⁇ g / ml, supplemented with 2% fetal calf serum (FCS).
  • DMEM Dubelcco's Minimal Eagle Medium, Gibco®
  • FCS fetal calf serum
  • the selection of recombinant viruses gpt + was carried out in the selection medium MX-HAT consisting of DMEM 5% SVF supplemented with mycophenolic acid 25 ⁇ g / ml (Sigma®), with Xanthine 250 ⁇ g / ml (Sigma®), with hypoxanthine 15 ⁇ g / ml , Aminopterin 0.176 ⁇ g / mL and Thymidine 4 ⁇ g / mL.
  • MX-HAT consisting of DMEM 5% SVF supplemented with mycophenolic acid 25 ⁇ g / ml (Sigma®), with Xanthine 250 ⁇ g / ml (Sigma®), with hypoxanthine 15 ⁇ g / ml , Aminopterin 0.176 ⁇ g / mL and Thymidine 4 ⁇ g / mL.
  • the M022L gene was amplified by PCR using primers F-GFPM022L and R-GFP-M022L and cloned in amino-terminal fusion with GFP (Green Fluorescent Protein) in the plasmid pEGFP-F (Clontech) resulting in plasmid pGFPM022L.
  • the GFP-M022L fragment was removed from the pGFP-M022L by double NheI and BamHI digestion, followed by treatment with the Klenow fragment of DNA polymerase I (Invitrogen) in order to produce ends on both sides. francs.
  • the plasmid pCR2-promM022L was opened with EcoRV and then dephosphorylated with "Shrimp Alkaline Phosphatase" (Promega).
  • the GFP-M022L fragment was cloned into pCR2promM022L resulting in plasmid pPROM-GFP-M022L.
  • Simple underlining indicates restriction sites
  • wave underlining indicates the zone of hybridization of the long primers between them.
  • the sequence of the gpt selection gene under the control of the early-late mixed promoter p7 / 5 was obtained by PCR with Taq Expand High Fidelity (Roche) on the plasmid pRB-gpt with the primers F-gpt-Xho I and R -gpt-EcoR I.
  • the PCR product ( ⁇ 750 bp) was inserted directly into the pGEM®-T commercial vector (Promega) to give the pGEMT-gpt vector.
  • the left recombination box was obtained by PCR amplification of the 3 'sequence of the M070R gene ( ⁇ 500 bp) of the Tl strain of the myxomatous virus with the primers F-M070RNco I and R-M070R-EcoR I.
  • Straight recombination was obtained by PCR amplification of the 5 'sequence of the M071L gene ( ⁇ 450 bp) of the Tl strain of myxomatous virus with the primers F-M071L-Nde I and R-M071L-Pst I.
  • the sequence corresponding to the ectodomain of M2 was obtained and amplified by PCR ( ⁇ 120 bp) using two pairs of primers: a pair of long overlapping primers, T5-promEcoR I and T6-Nco I, and a pair of short primers corresponding to the 5 'end of each long primer, Pl-EcoR I and P2-Nco I.
  • the PCR products digested with the appropriate restriction enzymes were sequentially inserted into the pGEMT-gpt vector digested with these same enzymes. .
  • Figure 2A The restriction sites used are indicated to the left of the white arrows. On the right are indicated genes or gene fragments inserted in the previous vector thanks to the same enzymes
  • the left recombination box was obtained by PCR amplification of the 3 'sequence of the M022L gene ( ⁇ 500 bp) of the Tl strain of the myxomatous virus with the primers F-M022LNco I and R-M022L-Apa I.
  • Straight recombination was obtained by PCR amplification of the 5 'sequence of the M023R gene ( ⁇ 400 bp) of the Tl strain of the myxomatous virus with the primers F-M023R-Xho I and R-M023R-Pst I.
  • the sequence corresponding to the ectodomain of M2 was obtained and amplified by PCR ( ⁇ 120 bp) using two pairs of primers: a pair of long overlapping primers, T5-prom-M022L and T ⁇ -Nco I, and a pair of primers 5 'end of each long primer, Pl-promM022L and P2-Nco I.
  • the PCR products digested with the appropriate restriction enzymes were inserted sequential in the pGEMT-gpt vector digested with the same enzymes.
  • the RK13 cells were infected 48 h after culturing with T1 virus at a MOI of 0.05. After 2 hours of adsorption at 37 ° C., the inoculum is removed and the cells rinsed 3 times with OptiMEM. The cells thus infected are then transfected with the mixture of 10 ⁇ g of plasmid DNA (each of the abovementioned transfer plasmids) and 20 ⁇ g of lipofectamine (Invitrogen) deposited on these cells for 5 hours. The cells are then rinsed 3 times and put back into DMEM medium plus PS, 2% FCS in culture at 37 ° C., 5% CO 2 until a cytopathic effect of about 80-90% is obtained. .
  • plasmid DNA each of the abovementioned transfer plasmids
  • lipofectamine Invitrogen
  • recombination mixtures consisting of the cell lysate containing wild-type virus and recombinant virus undergo three cycles of freezing / thawing.
  • ten BP100 each containing 9.10 6 RK13 cells of 48h are infected with the recombination mixture.
  • the liquid medium is replaced by solid medium (MEME + PS, 1% low melting point agarose, 25 mM final hepes, 3% final NaHCO 3 , 2% FCS).
  • solid medium MEME + PS, 1% low melting point agarose, 25 mM final hepes, 3% final NaHCO 3 , 2% FCS.
  • the lysis plaques containing the recombinant viruses are identified after observation by fluorescence microscopy and isolated.
  • the RK13 cells are pre-treated for 5h30 with the selection medium before the application of the recombination mixtures, then the inoculums are replaced by an appropriate volume of selection medium, before the application of the medium.
  • solid supplied with MPA, Xanthine and HAT.
  • the purification of the recombinant viruses is then carried out by several passages / isolations in limiting dilution: a mother of recombinant virus is isolated, undergoes three cycles of freezing / thawing and spread at different dilutions to isolate a daughter beach which will undergo again this same protocol.
  • the viruses thus obtained are then amplified and titrated. Results:
  • the Tl-N-gfp-M022L, Tl-N-M2e-M022L and Tl-C-M2e-MO71L viruses form lysis plaques in RK13 cells comparable to those formed by the wild-type T1 virus. indicates that these fusions do not alter viability or viral proliferation in vitro.
  • the observation of lysis plaques obtained after infection with Tl-N-gfp-M022L virus under a fluorescence microscope shows, on the other hand, that the fusion protein is expressed in all ranges.
  • the recombinant viruses obtained in Example 1 were tested in vivo (rabbits, mice and sheep), on the one hand to explore the pathogenicity for the target species of the VM (rabbits) and on the other hand to verify the implementation in place of an immune response against transgenic products in the target species and non-target species of the VM.
  • mice of the BaIbC type were infected intraperitoneally with 5.10 pfu of Tl-N-M2e-M022L or Tl-C-M2e-M071L virus at the rate of two injections at 21-day intervals .
  • a batch of two uninfected mice served as a control.
  • the mice were monitored (presence of lesions, general status assessment) regularly up to 42 days post-inoculation, then sacrificed and bled to extract the sera.
  • the presence of anti-GFP antibodies in the sera of rabbits inoculated with the virus Tl-NgfpM022L was tested by immunofluorescence.
  • the RK13 cells were transfected with 2 ⁇ g of plasmid pEGFP-F (clontech) using 3 ⁇ l of Fugen ⁇ (Roche). After 48 hours of culturing at 37 ° C., 5% CO2, the cells are fixed with 4% paraformaldheddy in PBS. A detection of GFP by immunofluorescence is then performed. The cells are permeabilized with 0.1% Triton X100 in PBS. After rinsing, 300 ⁇ l of the differently diluted sera (1/100, 1/300) in PBS Tween are deposited on the cells.
  • the presence of anti-M2e antibodies in rabbit and mouse sera inoculated with Tl-N-M2e-M022L or Tl-C-M2e-M071L viruses was tested by immunofluorescence.
  • the RK13 cells were infected with avian H7N1 influenza virus (MOI of 0.3) or with influenza virus of the human H1N1 type (MOI of 0.1) and then fixed at 8 h.
  • the detection of the M2 protein follows the protocol mentioned above, the sera of rabbits and mice being diluted respectively to 1 / 200th and 1 / 100th.
  • the anti-mouse IgG and anti-IgG secondary antibodies of FITC-coupled rabbits were used at the 1: 200 dilution.
  • the cellular response against the product of the fused transgene was explored in both sheep inoculated with Tl-N-gfp-M022L virus.
  • the principle is to measure by lymphoproliferation flow cytometry after restimulation by gfp PBMCs isolated and cultivated in the presence of a fluorochrome (CFSE).
  • CFSE fluorochrome
  • the blood is collected on EDTA tube, then diluted (1: 2) with PBS.
  • the mixture is loaded onto a density gradient (FicollPaque plus, Amersham) and then centrifuged at 800g for 20 minutes.
  • the PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the PBMCs are cultured at 37 ° C. under a 5% CO 2 atmosphere.
  • the RPMIc culture medium consists of RPMI 1640 Glutamax, 25 mM Hepes (Gibco-BRL), to which is added 10% of fetal calf serum (FCS), 1% of sodium pyruvate (Gibco-BRL), 1% non-essential amino acids (Gibco-BRL), 1% ⁇ -mercaptoethanol (Gibco-BRL),
  • the PBMCs are labeled with CFSE (Molecular Probes).
  • the cells are taken up in PBS at a concentration of 10 7 cells / ml.
  • a 2X solution (2.5 ⁇ M) of CFSE in PBS is added volume by volume to the cells. Everything is incubated 10 minutes away from light.
  • SVF is added volume to volume to neutralize the marking.
  • the mixture is incubated for 3 minutes.
  • the tube is then supplemented with RPMIc and centrifuged at 300 g for 10 minutes at 4 ° C. The washing is repeated in a new tube.
  • the cell concentration is adjusted to 6.10 6 cells / ml with RPMIc.
  • the cells are cultured in P24 plates at a rate of 3.10 6 cells per well under 1M.
  • rGFP (Clonetech) protein (10 to 0.1 ⁇ g)
  • the cells are thus cultured at 37 ° C., under a 5% CO 2 atmosphere. After 6 days of incubation, the cells are harvested, washed in FACS buffer (PBS, 2.5 mM EDTA, 0.5% BSA) and labeled with anti-CD2 antibodies coupled to A647 and anti-CD4 coupled to phycoerythrin (Serotec). . Viability is determined by the addition of propidium iodide at 1 ⁇ g / ml just prior to acquisition (BD Biosciences Pharmingen). The acquisition is performed with a FACScalibur (Becton Dickinson). The analysis is performed with the Flowjo software. Results:
  • the recombinant MVs are non-pathogenic:
  • the sera of rabbits infected with Tl-N-gfp-M022L virus were taken at 0, 10, 20 and 30 days post-infection.
  • the presence of anti-GFP antibodies was tested in immunofluorescence on cells transfected with the plasmid pEGFP-F allowing transient expression of the GFP protein in eukaryotic cells.
  • the GFP emitting in the green the detection was carried out thanks to a red fluorochrome, the TRITC. It is thus well check the presence of anti-GFP antibodies by colocalization of natural GFP fluorescence and immunostaining ⁇ 1.
  • the results obtained with the serum of a rabbit taken at day 30 post-infection with the Tl-N-gfp-M022L virus are shown in Figure 3.
  • the left panels (A, C and E) show the location of the GFP .
  • the panels on the right (B, D, and F) show the labeling obtained with the aid of various sera: polyclonal serum anti-myxomatous virus (B), serum rabbit 40451 taken at J30 postinfection diluted 1/100 ( D), and this same serum diluted to 1/300 (F).
  • FIG. 4A Serums of rabbits infected with OJ (Tl-N-M2e-M022L in 1 and Tl-C-M2e-M071L in 2) and in J30 (Tl-N-M2e-M022L in 3 and Tl-C-M2e ⁇ M071L in 4)
  • mice were immunized with either of the M2e-expressing viruses. The sera were taken 42 days after inoculation and tested by immunofluorescence.
  • FIG. 4B serum of uninfected mice (1) and infected with Tl-N-M2e-M022L virus (2) or Tl-C-M2e-M071L virus (3)
  • Panel A control ewe: in 1, cells restimulated with culture medium; in 2, cells restimulated with 3 ⁇ g of GFP
  • Panel B ewes inoculated with Tl-Ngfp-M022L: in 1, 2 and 3, restimulated cells with respectively 10, 3 and 1 ⁇ g of GFP; at 4, cells restimulated with VM, and in 5 cells restimulated with culture medium.
  • the abscissa axis measures the intensity of the green fluorescence (CFSE) and the ordinate axis the intensity of the red fluorescence (CD4 labeling).
  • CFSE green fluorescence
  • CD4 labeling the intensity of the red fluorescence
  • Leporipoxviruses thus constitute non-replicative vaccine vectors, particularly interesting for use in species other than leporids.

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Abstract

L'invention est relative à des Leporipoxvirus modifiés, exprimant une protéine d'enveloppe chimérique résultant de la fusion d'une protéine d'enveloppe de virions intracellulaires matures ou d' une protéine d' enveloppe de virions extracellulaires enveloppés avec une protéine exogène. Ces Leporipoxvirus modifiés sont utilisables notamment pour l'obtention de vaccins.

Description

VECTEURS VACCINAUX DERIVES DE LEPORIPOXVIRUS
La présente invention est relative à de nouveaux vecteurs vaccinaux dérivés des Leporipoxvirus et notamment du virus de la myxomatose.
Le genre des Leporipoxvirus appartient à la famille de Poxviridae. Ce genre, dont l'espèce type est le virus de la myxomatose (VM), regroupe des poxvirus spécifiques des Léporidés. Le virus de la myxomatose, également dénommé Myxoma virus, est l'agent responsable de la myxomatose, une maladie infectieuse majeure chez le lapin européen, et endémique en Europe. Les Poxviridae ont un cycle réplicatif intracytoplasmique au cours duquel différentes formes virales sont successivement observées : les IMV (virions intracellulaires matures), les IEV (virions intracellulaires enveloppés) et les EEV (virions extracellulaires enveloppés) .
Les IMV sont formés dans le cytoplasme des cellules infectées, et possèdent une seule membrane. Ils représentent la très grande majorité de la progénie virale et sont libérés lors de la lyse de la cellule hôte. Une petite partie des IMV acquiert une double enveloppe supplémentaire dérivée de l'appareil de Golgi ou des endosomes, constituant les formes virales IEV. Les IEV migrent à la surface cellulaire et fusionnent avec la membrane cellulaire. Ils perdent ainsi leur enveloppe la plus externe et libèrent des EEV dans le milieu extracellulaire.
Les poxvirus recombinés ont montré leur efficacité en tant que vecteurs de vaccination par leur capacité à produire une réponse immunitaire contre des antigènes étrangers. Leur cycle réplicatif exclusivement cytoplasmique permet d'éviter les complications éventuelles résultant de l'intégration d'ADN viral dans le génome de la cellule infectée. Ils sont capables d'intégrer de grands fragments d'ADN étranger (plus de 25 kpb) par recombinaison homologue. Ils sont en plus capables d'exprimer correctement les protéines d' intérêt et d' induire une bonne réponse immunitaire. Les Leporipoxvirus présentent en outre l'avantage de posséder un spectre d'hôtes très étroit in vivo ce qui leur confère une sécurité d'emploi non négligeable. D'autre part, bien que non-réplicatifs in vitro dans certains types cellulaires (bovins, ovins, félins) , ils permettent néanmoins l'expression de transgènes. Ils présentent donc un grand intérêt pour l'obtention de vecteurs vaccinaux, non seulement chez les Léporidés, mais également chez d'autres espèces animales.
Classiquement chez les poxvirus, les transgènes sont insérés dans des zones intergéniques, ou dans des zones contenant des gènes non essentiels à la réplication virale. La majorité des sites d'insertion qui ont été mis en évidence se situent à proximité des terminaisons génomiques, où sont localisés des gènes non essentiels au cycle viral (MACKETT et al . , J Virol, 49, 857-864, 1984; PERKUS et al., Virology, 180, 406-410, 1991) .
Dans le cas des Leporipoxvirus, des vecteurs vaccinaux exprimant des antigènes étrangers ont également été obtenus. BERTAGNOLI et al. (J Virol, 70, 5061-5066, 1996), et la Demande FR 2736358 décrivent l'obtention de vecteurs vaccinaux dérivés de Myxoma virus recombinants, qui permettent de protéger des lapins à la fois contre la myxomatose et la Maladie hémorragique virale du lapin. Pour construire ces vecteurs, un gène codant pour la protéine de capside VP60 du virus de la Maladie hémorragique virale a été inséré dans le génome du Myxoma virus au niveau de gènes non-essentiels, en l'occurrence soit le gène codant pour la thymidine kinase (TK) , soit les gènes codant pour les facteurs de virulence MGF (myxoma growth factor) et MIlL.
Plus récemment, l'utilisation de virus myxomateux atténués recombinés capables de produire la protéine de capside du virus de la calicivirose féline a montré une bonne efficacité vaccinale chez le chat (MCCABE et al., Vaccine, 20, 2454-2462, 2002; MCCABE and SPIBEY, Vaccine, 23, 5380-5388, 2005) . Dans ces vecteurs, le transgène codant pour la protéine de capside a été inséré au niveau des gènes codant pour les facteurs de virulence MGF et MIlL. De même, la Demande PCT WO 02072852 décrit l'utilisation de Leporipoxvirus recombinants pour l'obtention de vecteurs vaccinaux utilisables chez des animaux autres que les Léporidés, notamment chez des oiseaux, des félins, des canins, des porcins, des ovins, des bovins, des équins, ainsi que chez l'homme. Il est indiqué que dans ces vecteurs, le transgène exprimant l'antigène vaccinal d'intérêt peut être inséré au niveau du gène codant pour la thymidine kinase, ou au niveau de l'un des gènes codant pour les facteurs de virulence MIlL, SERP- 1, -2 et -3 ou MGF.
La majorité des vaccins fondés sur des vecteurs poxviraux produit des antigènes cytoplasmiques, qui sont sécrétés ou exprimés à la surface des cellules infectées. Récemment, il a été proposé d'exprimer des antigènes vaccinaux à la surface des particules virales, dans le but d'améliorer la réponse immunitaire. Cette approche a déjà été utilisée dans le cas de vecteurs vaccinaux dérivés de divers virus, par exemple le poliovirus (MANDL et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 8216- 8221, 1998), le virus de l'hépatite B (ULRICH et al., Adv Virus Res, 50, 141-182, 1998), ou le virus de l'hépatite A (KUSOV et al., Antiviral Res, 73, 101-111, 2007) . En ce qui concerne les poxvirus, les seuls vecteurs de ce type décrits à ce jour ont été obtenus à partir de virus de la vaccine recombinants dans lequel les antigènes vaccinaux d' intérêt sont fusionnés à la protéine d'enveloppe B5R des virions EEV (KATZ and MOSS, AIDS Res Hum Retroviruses, 13, 1497-1500, 1997; BARCHICHAT and KATZ, Virus Res, 90, 243-251, 2002; KWAK et al., Virology, 322, 337-348, 2004) .
Cette approche n'avait pas pu être envisagée jusqu'à présent dans le cas des Leporipoxvirus, car ceux-ci ne possèdent pas d'homologue de la protéine B5R.
Les Inventeurs ont maintenant „ identifié deux protéines d' enveloppe des Leporipoxvirus auxquelles il est possible de fusionner un antigène d'intérêt, sans que cette fusion altère les fonctions de ces protéines dans la morphogénèse virale.
Il s'agit des protéines dénommées M071L et M022L chez le virus de la myxomatose (CAMERON et al., Virology, 264, 298- 318, 1999). M071L (GenBank : NPJD51785, GI: 9633707) est une protéine de 324 aa codée par un gène tardif ; elle présente une masse moléculaire d'environ 36,8 kDa ; elle est intégrée à la membrane des IMV dont elle constitue la composante antigénique immunodominante . Son homologue chez un autre Leporipoxvirus, le virus du fibrome du lapin (WILLER et al., Virology, 264, 319-343, 1999), est dénommée gpO71L (NP_051960, GI:9633880) . Son homologue chez le virus de la vaccine est la protéine H3L, qui est impliquée dans la maturation des particules virales (DA FONSECA et al., J. Virol., 74, 7518-7528, 2000). M071L présente 90% d'identité et 94 % de similarité de séquence avec gpO71L et 35% d'identité et 61% de similarité avec H3L.
M022L (GenBank NPJD51736, GI: 9633658) est la protéine majoritairement présente sur l'enveloppe des formes virales EEV. C'est une protéine de 371 aa qui présente une masse moléculaire d'environ 41,5 kDa. Son homologue chez le virus du fibrome du lapin est dénommée gpO22L (NP_051911, GI =9633833). Son homologue chez le virus de la vaccine est la protéine F13L, qui est impliquée dans la formation de la membrane des IEV (HUSAIN and MOSS, J Virol, 75, 7528-7542, 2001) . M022L présente 92% d' identité et 95 % de similarité de séquence avec gpO22L et 55% d'identité et 71% de similarité avec F13L.
La séquence de la protéine M071L du virus de la myxomatose (identique à la séquence GenBank NP__051785) est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ; la séquence de la protéine M022L du virus de la myxomatose (identique à la séquence GenBank NP_051736) est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
Les Inventeurs ont constaté que lorsqu' une séquence codant pour une protéine exogène était fusionnée à la séquence codant pour M071L, de manière à obtenir une protéine chimérique comprenant ladite protéine exogène fusionnée à l'extrémité C- terminale de M071L, cette protéine chimérique était exprimée de manière comparable à la protéine M071L native. En outre, cette fusion C-terminale n' interfère pas avec la fonction de la protéine M071L dans la morphogénèse virale, et chez les Myxoma virus modifiés exprimant la protéine chimérique, celle-ci est localisée comme la protéine M071L native, au niveau de la membrane des IMV. La protéine exogène est présentée à la surface des IMV et peut également induire une réponse immunitaire. Les Inventeurs ont également constaté, qu'en revanche, lorsque la protéine exogène était fusionnée à l'extrémité N-terminale de M071L il n'était pas possible d'obtenir un virus recombinant exprimant la protéine fusionnée, suggérant une modification létale de la protéine M071L.
Dans le cas de M022L, les Inventeurs ont constaté que la fusion d'une protéine exogène à son extrémité C-terminale produisait une protéine chimérique non-fonctionnelle, et aboutissait à l'absence de formation de particules virales. En revanche, lorsque la protéine exogène est fusionnée à l'extrémité N-terminale de M022L, la protéine chimérique obtenue conserve, chez les Myxoma virus modifiés exprimant cette protéine, la fonction et la localisation de la protéine M022L native, et permet la présentation de la protéine exogène à la surface des EEV et l'induction d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre cette protéine exogène.
En outre les Inventeurs ont observé que les Myxoma virus modifiés exprimant les protéines chimériques décrites ci- dessus, bien qu'ils présentent une morphologie et une capacité de réplication comparables à celles de la souche sauvage dont ils sont issus, ont un pouvoir pathogène considérablement atténué.
La présente invention a en conséquence pour objet un Leporipoxvirus modifié, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine d' enveloppe chimérique choisie parmi : a) une protéine d'enveloppe chimérique comprenant :
- une région A constituée par une protéine possédant au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, ou au moins 90%, de préférence au moins 92%, et de manière tout à fait préférée au moins 96% de similarité de séquence avec la protéine M071L définie par la séquence SEQ ID NO: 1; - une région B constituée par une protéine exogène d'intérêt, ladite région B étant fusionnée à l'extrémité C- terminale de ladite région A ; b) une protéine d'enveloppe chimérique comprenant :
- une région A constituée par une protéine possédant au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, ou au moins 90%, de préférence au moins 92%, et de manière tout à fait préférée au moins 96% de similarité de séquence avec la protéine M022L définie par la séquence SEQ ID NO: 2 ;
- une région B constituée par une protéine exogène d'intérêt, ladite région B étant fusionnée à l'extrémité N- terminale de ladite région A, directement, ou éventuellement par l'intermédiaire d'un lieur peptidique de quelques acides aminés.
Sauf indication contraire, les pourcentages d'identité et de similarité auxquels il est fait référence ici sont calculés l'aide du programme BLASTP, en utilisant les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée par la séquence complète de la protéine.
La protéine exogène d' intérêt est exprimée à la surface des IMV dans le cas des Leporipoxvirus exprimant une protéine chimérique telle que définie en a) ci-dessus, et à la surface des EEV dans le cas des Leporipoxvirus exprimant une protéine chimérique telle que définie en b) ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré d'un Leporipoxvirus modifié conforme à l'invention, il exprime une protéine chimérique telle que définie en a) ci-dessus, et une protéine chimérique telle que définie en b) ci-dessus. Ces deux protéines chimériques peuvent contenir la même protéine d' intérêt ou deux protéines d'intérêt différentes.
La présente invention englobe également tout Leporipoxvirus modifié exprimant une protéine chimérique comprenant une protéine de membrane d' IMV de Leporipoxvirus, fusionnée avec une protéine exogène d'intérêt.
La protéine exogène d' intérêt peut être n' importe quelle , protéine contre laquelle on souhaite induire une réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire. Sa taille peut varier de quelques acides aminés à quelques centaines d'acides aminés.
Il peut s'agir notamment d'une protéine antigénique dérivée d'un pathogène viral, bactérien, ou parasitaire, ou d'un fragment antigénique de ladite protéine, ou bien d'une protéine recombinante associant divers fragments antigéniques, issus d'un même antigène ou d'antigènes différents.
Des Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention peuvent être obtenus à partir de Leporipoxvirus sauvages, ou de Leporipoxvirus atténués. Il peut s'agir notamment de virus de la myxomatose ou de virus du fibrome du lapin.
A titre d' exemples non limitatifs de souches de virus de la myxomatose à partir desquelles peuvent être construits des virus modifiés conformes à l'invention, on citera : la souche LAϋSANNE(ATCC VR-115), la souche Moses (ATCC VR-Il 6) , les souches décrites dans la Demande FR 2736358, et notamment les souches LEON 162 (L162) : CNCM 1-1595 ; HONGROIS (HG) : CNCM 1-1593 ; FINISTERE (F9) : CNCM 1-1596 ; R 801 : CNCM 1-1598 ; TOULOUSE 1 (Tl) : CNCM 1-1592 , ainsi que la souche atténuée SG 33 (CNCM I- 1594) .
A titre d' exemples non limitatifs de souches de virus du fibrome du lapin à partir desquelles peuvent être construits des virus modifiés conformes à l'invention, on citera : la souche
Original A (souche Boerlage) (ATCC VR-112) , la souche Patuxent
(ATCC VR-113), la souche Kasza (ATCC VR-364).
Les Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention peuvent être produits par les techniques classiques utilisées pour la production des poxvirus recombinants, qui mettent en œuvre une recombinaison homologue entre le génome d'un poxvirus dans lequel on souhaite insérer une séquence d' intérêt, et un vecteur de transfert, contenant la séquence que l'on souhaite insérer, encadrée par des séquences du génome du poxvirus flanquant le site où doit avoir lieu l'insertion. La recombinaison homologue intervient dans des cellules-hôtes infectées par le poxvirus choisi, et transfectées par le vecteur de transfert. La présente invention a également pour objet des outils permettant la production des Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention, et notamment : un polynucléotide codant pour une protéine d'enveloppe chimérique, telle que définie ci- dessus, une cassette d'expression contenant ledit polynucléotide, sous contrôle d'un promoteur approprié, et un vecteur recombinant contenant ladite cassette d'expression.
Préférentiellement, le promoteur utilisé dans les cassettes d'expression conformes à l'invention, le promoteur est celui du gène codant pour la protéine d' enveloppe à laquelle est fusionnée la protéine exogène d'intérêt. Ces cassettes d' expression peuvent également comprendre un gène marqueur facilitant la sélection des virus recombinants. Il peut s'agir par exemple d'un gène conférant un avantage sélectif aux virus recombinants, tel qu'un gène de résistance à un antibiotique, tel que l'acide mycophénolique ou la généticine, ou d'un gène permettant la visualisation des plages de lyse contenant le virus recombinant, tels que le gène LacZ, le gène gus, ou un gène codant pour une protéine fluorescente.
Des cellules hôtes utilisables pour la production des modifiés conformes à l'invention sont celles habituellement utilisées pour la production de Leporipoxvirus ; il s'agit notamment de cellules de lapin, normales ou tumorales, de cellules de singe, normales ou tumorales, de cellules avaires, normales ou tumorales, ou de cellules tumorales humaines.
Les Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention sont utilisables pour l'obtention de vaccins, non seulement chez les léporidés, mais aussi chez d'autres espèces animales, incluant les oiseaux et les mammifères, et notamment les ovins, les bovins, les porcins, les équins, les canins, les félins, et les primates, en particulier l'homme.
Lesdits vaccins peuvent être formulés pour une utilisation par voie parentérale, par exemple par voie intradermique, intramusculaire, ou sous-cutanée, par voie orale, ou par voie muqueuse, par exemple intra-nasale. La quantité de virus modifiés par dose vaccinale est choisie de manière à permettre un niveau d' expression de la protéine exogène d' intérêt suffisant pour induire une réponse immunitaire contre cette protéine. Elle peut dépendre notamment de la nature de ladite protéine exogène, de l'espèce et de l'âge du sujet à vacciner, du type de réponse immunitaire (cellulaire ou humorale) que l'on souhaite privilégier. Habituellement, elle sera comprise entre 103 et 109 ufp (unités formant plage) par dose vaccinale.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant la construction de Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention, et leur utilisation vaccinale. EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DE VIRUS MYXOMATEUX RECOMBINES EXPRIMANT UNE PROTEINE EXOGENE EN FUSION AVEC M022L OU M071L
Trois virus recombinés issus du virus de souche Toulouse 1 ont été construits. Deux produisent la protéine M022L fusionnée soit avec la GFP (Green Fluorescent Protein) soit avec l'ectodomaine de la protéine M2 (M2e) (GenBank : AY340089) du virus influenza A aviaire dans sa partie amino-terminale (Tl-N- gfp-M022L et Tl-N-M2e-M022L) . Le troisième produit la protéine M071L fusionnée avec M2e dans sa partie carboxy-terminale (Tl-C- M2e-M071L) . Matériel et Méthodes :
1. Cellules et virus :
Les virus myxomateux de souche Toulouse 1 (Tl), ainsi que les virus modifiés sont propagés sur cellules RK13 en milieu constitué de DMEM (Dubelcco's Minimal Eagle Médium, Gibco®) additionné de pénicilline à 100 Ul/ml final et streptomycine à 100 μg/ml, supplémenté avec 2% de sérum de veau fœtal (SVF) . La sélection des virus recombinés gpt+ a été réalisée dans le milieu de sélection MX-HAT constitué de DMEM 5% SVF supplémenté en acide Mycophénolique 25μg/mL (Sigma®) , en Xanthine 250μg/mL (Sigma®) , en Hypoxanthine 15μg/mL, en Aminoptérine 0,176μg/mL et en Thymidine 4μg/mL. 2. Construction des plasmides de transfert:
2.1- Plasmide de transfert pour la fusion N-gfp-M022L :
Les amorces utilisées pour construire ce plasmide sont listées dans le Tableau I ci-dessous.
Tableau I
La séquence en amont du gène M022L, contenant le promoteur naturel de M022L a été amplifiée avec les amorces F- pM022L et RpM022L et clonée dans le plasmide pCR2 (Invitrogen) aboutissant au plasmide pCR2-promM022L. Le gène M022L a été amplifié par PCR grâce aux amorces F-GFPM022L et R-GFP-M022L et clone en fusion amino-terminale avec la GFP (Green Fluorescent Protein) dans le plasmide pEGFP-F (Clontech) aboutissant au plasmide pGFPM022L. Le fragment GFP-M022L a été sorti du pGFP- M022L par double digestion Nhel et BamHI, suivi d'un traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymerase I (Invitrogen) afin de produire de part et d'autres des extrémités bouts francs. Parallèlement, le plasmide pCR2-promM022L a été ouvert par EcoRV puis déphosphorylé par la « Shrimp Alkaline Phosphatase » (Promega) . Le fragment GFP-M022L a été clone dans le pCR2promM022L aboutissant au plasmide pPROM-GFP-M022L. Ces étapes de construction sont schématisées sur la Figure 1.
2.2- Plasmide de transfert pour les fusions N-M2e-M022L et C-M2e- M071L :
Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau II ci-dessous. Tableau II
Le soulignage simple indique les sites de restriction, le soulignage en vague indique la zone d'hybridation des amorces longues entre elles.
La séquence du gène de sélection gpt sous la dépendance du promoteur mixte précoce-tardif p7/5 a été obtenue par PCR avec la Taq Expand High Fidelity (Roche) sur le plasmide pRB-gpt avec les amorces F-gpt-Xho I et R-gpt-EcoR I. Le produit de PCR (≈750 pb) a été inséré directement dans le vecteur commercial pGEM®-T (Promega) pour donner le vecteur pGEMT-gpt . 2.2.1-Construction de la fusion carboxy--terminale M071L-M2e (plasmide pGEMTM070R-gpt-M2e-M071L)
La boîte de recombinaison gauche a été obtenue par amplification par PCR de la séquence 3' du gène M070R (≈500 pb) de la souche Tl du virus myxomateux avec les amorces F-M070RNco I et R-M070R-EcoR I. La boîte de recombinaison droite a été obtenue par amplification par PCR de la séquence 5' du gène M071L (≈450 pb) de la souche Tl du virus myxomateux avec les amorces F-M071L- Nde I et R-M071L-Pst I. La séquence correspondant à l' ectodomaine de M2 a été obtenue et amplifiée par PCR (≈120 pb) grâce à deux couples d'amorces : un couple d'amorces longues chevauchantes, T5-promEcoR I et T6-Nco I, et un couple d'amorces courtes correspondant à l'extrémité 5' de chaque amorce longue, Pl-EcoR I et P2-Nco I. Les produits de PCR digérés par les enzymes de restriction adéquates ont été insérés de manière séquentielle dans le vecteur pGEMT-gpt digéré par ces mêmes enzymes. Ces étapes de construction sont schématisées sur la Figure 2A. Les sites de restriction utilisés sont indiqués à gauche des flèches blanches. A droite sont indiqués les gènes ou fragments de gène insérés dans le vecteur précédent grâce aux mêmes enzymes
2.2.2- Construction de la fusion amino-terminale M2e-M022L (plasmide pGEMTM022L-gpt-M2e-M023R)
La boîte de recombinaison gauche a été obtenue par amplification par PCR de la séquence 3' du gène M022L (≈500 pb) de la souche Tl du virus myxomateux avec les amorces F-M022LNco I et R-M022L-Apa I. La boîte de recombinaison droite a été obtenue par amplification par PCR de la séquence 5' du gène M023R (≈400 pb) de la souche Tl du virus myxomateux avec les amorces F-M023R- Xho I et R-M023R-Pst I. La séquence correspondant à l' ectodomaine de M2 a été obtenue et amplifiée par PCR (≈120 pb) grâce à deux couples d'amorces : un couple d'amorces longues chevauchantes, T5-prom-M022L et Tβ-Nco I, et un couple d'amorces courtes correspondant à l'extrémité 5' de chaque amorce longue, Pl- promM022L et P2-Nco I. Les produits de PCR digérés par les enzymes de restriction adéquates ont été insérés de manière séquentielle dans le vecteur pGEMT-gpt digéré par les mêmes enzymes. Ces étapes de construction sont schématisées sur la Figure 2B.
3. Isolement des virus recombinés :
Les cellules RK13 ont été infectées 48h après mises en culture par du virus Tl à une MOI de 0,05. Après 2h d'adsorption à 37°C, l'inoculum est retiré et les cellules rincées 3 fois avec de l'OptiMEM. Les cellules ainsi infectées, sont ensuite transfectées grâce au mélange 10 μg d'ADN plasmidique (chacun des plasmides de transfert susnommés) et 20 μg de lipofectamine (Invitrogen) déposé sur ces cellules pendant 5h. Les cellules sont ensuite rincées 3 fois et remises dans du milieu DMEM plus PS, 2% SVF en culture à 370C, 5% CO2 jusqu'à l'obtention d'un effet cytopathique de l'ordre de 80-90%. Ces mélanges de recombinaison, constitué du lysat cellulaire contenant du virus sauvage et du virus recombiné subissent trois cycles de congélation/décongélation. Pour la fusion gfp-M022L, dix BPlOO contenant chacune 9.106 cellules RK13 de 48h sont infectées avec le mélange de recombinaison. Après 48h, le milieu liquide est remplacé par du milieu solide (MEME + PS, agarose low melting point 1%, hepes 25 mM final, NaHCO3 3% final, 2% SVF) . Après 48h à 37°C, 5% CO2, les plages de lyse contenant les virus recombinés, sont identifiées après observation en microscopie à fluorescence et isolées. Pour les fusions M2e-M071L et M2eM022L, les cellules RK13 sont prétraitées pendant 5h30 avec le milieu de sélection avant l'application des mélanges de recombinaison, puis les inoculums sont remplacés par un volume adéquat de milieu de sélection, avant l'application du milieu solide (complémenté en MPA, Xanthine et HAT) . La purification des virus recombinés est ensuite effectuée par plusieurs passages/isolements en dilution limite : une plage mère de virus recombiné est isolée, subie trois cycles de congélation/décongélation et étalée à différentes dilutions permettant d' isoler une plage fille qui subira à nouveau ce même protocole. Les virus ainsi obtenus sont ensuite amplifiés et titrés. Résultats :
Expression des protéines de fusion
L'observation en microscopie à fluorescence de cellules RK13 " transfectées avec le plasmide pGFP-M022L montre que la protéine de fusion est bien exprimée, et sa localisation intracellulaire semble être similaire à celle précédemment décrite pour la protéine F13L qui est l'homologue de M022L chez le virus de la vaccine en condition de transfection (HUSAIN et al., Virology, 308, 233-242, 2003). Il apparaît donc que la fusion amino-terminale n'altère pas la production et la stabilité de la protéine M022L.
D'autre part, les virus Tl-N-gfp-M022L, Tl-N-M2e- M022L et Tl-C-M2e-MO71L forment des plages de lyse en cellules RK13 comparables à celles formées par le virus sauvage Tl, ce qui indique que ces fusions n' altèrent ni la viabilité ni la prolifération virale in vitro. L'observation de plages de lyse obtenues après infection par le virus Tl~N-gfp-M022L au microscope à fluorescence montre d'autre part que la protéine de fusion est exprimée dans la totalité des plages.
EXEMPLE 2 : PROPRIETES IMMUNOGENES DE VIRUS MYXOMA.TEUX RECOMBINES EXPRIMANT UNE PROTEINE EXOGENE EN FUSION AVEC M022L OU M071L
Les virus recombinés obtenus à l'Exemple 1 ont été testés in vivo (lapins, souris et ovins), d'une part pour explorer le pouvoir pathogène pour l'espèce cible du VM (lapins) et d'autre part pour vérifier la mise en place d'une réponse immunitaire contre les produits des transgènes chez l'espèce cible et des espèces non cibles du VM.
Matériel et Méthodes :
1. Immunisation et suivi clinique chez l'espèce cible:
Des lots de quatre lapins mâles New Zealand de 10 semaines ont été inoculés à l'oreille par voie intradermique avec 5.103 ufp (unité formant plage) de chacun des virus recombinés dilués dans de l'OptiMEM sans PS ni SVF. Des prises de sang sur tube sec ont été effectuées à JO, JlO, J20 et J30 post-infection et les sérums extraits. Un groupe contrôle de quatre animaux a été inoculé de la même façon avec la même dose de virus Tl (virus parental) . Un suivi clinique a été effectué par observation régulière des lapins : présence de lésions évocatrices, évaluation de l'état général.
3. Immunisation et suivi clinique chez les espèces non-cibles :
- Des lots de quatre souris mâles de 8 semaines de type BaIbC ont été infectés par voie intrapéritonéale avec 5.10 ufp de virus Tl-N-M2e-M022L ou Tl-C-M2e-M071L à raison de deux injections à 21 jours d'intervalle. Un lot de deux souris non- infectées a servi de témoin. Les souris ont été surveillées (présence de lésions, évaluation de l'état général) régulièrement jusqu'à 42 jours post-inoculation, puis sacrifiées et saignées pour extraire les sérums .
- Deux brebis adultes ont été inoculées par voie intradermique avec 5.107 ufp de virus Tl-Ngfp-M022L à JO, J8 et J24, puis par voie intramusculaire à J90. Une surveillance clinique a été effectuée par observation régulière (présence de lésions évocatrices, évaluation de l'état général) durant 7 jours après chaque inoculation et des prises de sang ont été réalisées sur tubes EDTA pour extraction des cellules mononuclées périphériques du sang (PBMCs) à JO et JIlO post-inoculation.
4. Analyse des sérums :
- La présence d' anticorps anti-GFP dans les sérums des lapins inoculés avec le virus Tl-NgfpM022L a été testée par immunofluorescence . Les cellules RK13 ont été transfectées avec 2 μg de plasmide pEGFP-F (clontech) à l'aide de 3 μl de Fugenβ (Roche) . Après 48h de mise en culture à 37 °C, 5% CO2, les cellules sont fixées avec de la paraformaldhèdyde 4% dans du PBS. Une détection de la GFP par immunofluorescence est ensuite réalisée. Les cellules sont perméabilisées avec du Triton X100 0,1% dans du PBS. Après rinçages, 300 μl des sérums différemment dilués (1/100 ; 1/300) dans du PBS Tween sont déposés sur les cellules. Le tout est incubé Ih à 37 °C. 3 rinçages avec du PBS Tween sont effectués. L'anticorps secondaire anti-IgG de lapins biotinylé (Sigma) dilué au 1/200 dans du PBS Tween est déposé dans les cupules et incubé Ih à 370C. La révélation est effectuée grâce à de l'extravidin couplée au TRITC (Sigma) : 300 μl d'extravidin couplée au TRITC diluée au 1/200 dans du PBS sont déposés dans chaque cupule et laissé incubé 30 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite rincées trois fois avec du PBS avant d' être montées entre lame et lamelle avec du PBSglycérol (50%-50%) pour l' observation.
- La présence d' anticorps anti-M2e dans les sérums de lapins et de souris inoculés avec les virus Tl-N-M2e-M022L ou Tl- C-M2e-M071L a été testée par immunofluorescence. Les cellules RK13 ont été infectées par du virus influenza de type H7N1 aviaire (MOI de 0,3) ou par du virus influenza de type HlNl humain (MOI de 0,1) puis fixées 8 h p.i. La détection de la protéine M2 suit le protocole précédemment cité, les sérums de lapins et de souris étant dilués respectivement au l/200éme et l/100éme. Les anticorps secondaires anti-IgG de souris et anti- IgG de lapins couplés FITC ont été utilisés a la dilution l/200éme.
5. Analyse de la réponse cellulaire chez les ovins :
La réponse cellulaire contre le produit du transgène fusionné a été explorée chez les deux ovins inoculés avec le virus Tl-N-gfp-M022L. le principe est de mesurer par cytométrie de flux la lymphoprolifération après restimulation par la gfp des PBMCs isolés et cultivés en présence d'un fluorochrome (CFSE) .
-Isolement des PBMCs
Le sang est collecté sur tube EDTA, puis dilué (1 :2) avec du PBS. Le mélange est chargé sur un gradient de densité (FicollPaque plus, Amersham) puis centrifugé à 800g pendant 20 minutes. Les PBMCs (cellules mononuclées périphériques du sang) sont collectées, lavées dans du PBS et récupérées par centrifugation à 870 g pendant 10 minutes à 40C. Les PBMCs sont cultivés à 370C sous atmosphère 5% CO2. Le milieu de culture RPMIc est constitué de RPMI 1640 Glutamax, 25 mM Hepes (Gibco- BRL), auquel est ajouté 10 % de sérum de veau fœtal (SVF), 1 % de pyruvate de sodium (Gibco-BRL) , 1 % d'acides aminés non essentiels (Gibco-BRL), 1 % de β-mercapto-éthanol (Gibco-BRL),
100 unités/ml de pénicilline ainsi que 100 μg/ml de streptomycine .
Test de lymphoprolifération
Après isolement, les PBMCs sont marqués au CFSE (Molecular Probes) . Les cellules sont reprises dans du PBS à une concentration de 107 cellules/ml. Une solution 2X (2.5 μM) de CFSE dans du PBS est ajoutée volume à volume aux cellules. Le tout est incubé 10 minutes à l'abri de la lumière. Puis du SVF est ajouté volume à volume pour neutraliser le marquage. Le mélange est mis à incuber pendant 3 minutes. Puis le tube est complété avec du RPMIc et centrifugé à 300 g pendant 10 minutes à 4°C. Le lavage est répété dans un nouveau tube. La concentration cellulaire est ajustée à 6.106 cellules/ml avec du RPMIc. Les cellules sont mises en culture en plaques P24 à raison de 3.106 cellules par puits sous ImI. Des quantités variables de protéine rGFP (Clonetech) (10 à 0.1 μg) sont ajoutées aux cellules. Les cellules sont ainsi mises en culture à 370C, sous atmosphère 5 % CO2. Après 6 jours d'incubation, les cellules sont récoltées, laver dans du tampon FACS (PBS, 2.5 mM EDTA, 0.5 % BSA) et marquées avec des anticorps anti-CD2 couplés au A647 et anti-CD4 couplés à la phycoérytrine (Sérotec) . La viabilité est déterminée grâce à l'ajout d' iodure de propidium à 1 μg/ml juste avant l'acquisition (BD Biosciences Pharmingen) . L'acquisition est réalisée avec un FACScalibur (Becton Dickinson) . L'analyse est réalisée avec le logiciel Flowjo. Résultats :
1- Les MV recombinés sont non pathogènes :
Chez les lapins infectés avec le virus parental Tl, on observe une évolution normale de la maladie avec une mort dans les dix à quinze jours.
Chez les lapins infectés avec les virus recombinés, on observe une légère inflammation localisée au niveau du point d'inoculation. Dans les 20 jours post-infection, tous les lapins ont conservé un très bon état général. Quelques myxomes secondaires de petite taille sur les paupières ont parfois été observés, mais aucune surinfection bactérienne respiratoire n'a été constatée.
Concernant les espèces non-cibles (souris et ovins) aucun signe clinique local ou général n'a été observé.
L'ensemble de ces données montre l'innocuité des virus recombinés, bien qu'ils aient été construits à partir d'une souche pathogène.
2- Production d' anticorps contre les antigènes fusionnés avec M022L ou MO7IL.
Chez une espèce cible :
Les sérums de lapins infectés avec le virus Tl-N-gfp- M022L ont été prélevés à JO, JlO, J20 et J30 post-infection. La présence d' anticorps anti-GFP a été testée en immunofluorescence sur des cellules transfectées avec le plasmide pEGFP-F permettant une expression transitoire de la protéine GFP en cellules eucaryotes. La GFP émettant dans le vert, la détection a été réalisée grâce à un fluorochrome rouge, le TRITC. On peut ainsi ainsi vérifier la présence d'anticorps anti-GFP par colocalisation de la fluorescence naturelle de la GFP et de 1 λimmunomarquage . Les résultats obtenus avec le sérum d'un lapin prélevé à J30 post-infection avec le virus Tl-N-gfp-M022L sont illustrés par la Figure 3. Les panneaux de gauche (A, C et E) montrent la localisation de la GFP. Les panneaux de droite (B, D, et F) montrent le marquage obtenu à l'aide de différents sérums : le sérum polyclonal anti-virus myxomateux (B) , le sérum du lapin 40451 prélevé à J30 postinfection dilué au 1/100 (D) , et ce même sérum dilué au 1/300 (F) .
De même, la présence d'anticorps anti-M2e a été vérifiée pour les sérums des lapins infectés avec les virus Tl-N-
M2e-M022L et Tl-C-M2e-M071L prélevés à JO et J30. Pour cela des cellules RK13 préalablement infectées par un virus influenza
(HlNl) ont été soumises à un test d' immunofluorescence . Les résultats sont illustrés par la Figure 4A : Sérums de lapins infectés à JO (Tl-N-M2e-M022L en 1 et Tl-C-M2e- M071L en 2) et à J30 (Tl-N-M2e-M022L en 3 et Tl-C-M2e~M071L en 4)
La fluorescence spécifique observée avec les sérums récoltés à J30 sur les lapins infectés signale la production d'anticorps anti-M2e. contre le produit du transgène fusionné par les lapins infectés.
Chez une espèce non-cible :
Afin de vérifier si les virus recombinés étaient capables d' induire une réponse sérologique contre le produit du transgène chez une espèce non-cible, des immunisé des souris ont été immunisées avec l'un ou l'autre des virus exprimant M2e en fusion. Les sérums ont été prélevés 42 jours après inoculation et testés par immunofluorescence .
Les résultats sont illustrés par la Figure 4B : Sérum de souris non infectées (1) et infectées par le virus Tl-N-M2e- M022L (2) ou le virus Tl-C-M2e-M071L (3)
On observe une fluorescence spécifique avec les sérums des souris inoculées par les virus Tl-N-M2e-M022L ou Tl-C- M2e-M071L, signalant la production d'anticorps anti-M2e.
3. Induction d' une réponse cellulaire contre un antigène fusionné avec M022L.
Afin de vérifier si une réponse immunitaire spécifique à médiation cellulaire pouvait être induite contre une protéine antigénique fusionnée à une protéine d'enveloppe du VM, une expérience de stimulation-marquage de PBMCs de moutons a été effectuée. La prolifération des PBMCs de moutons inoculés avec le virus Tl-Ngfp-M022L a été mesurée par cytométrie de flux après restimulation avec la GFP et marquage des sous-populations de lymphocytes T (CD2+ et CD4+) .
Les résultats sont illustrés par la Figure 5.
Panel A (brebis témoin) : en 1, cellules restimulées avec du milieu de culture ; en 2, cellules restimulées avec 3 μg de GFP Panel B (brebis inoculée avec Tl-Ngfp-M022L) : en 1, 2 et 3, cellules restimulées avec respectivement 10, 3 et 1 μg de GFP; en 4, cellules restimulées avec du VM, et en 5 cellules restimulées avec du milieu de culture.
Pour chacun des cadrans, l'axe des abscisses mesure l'intensité de la fluorescence verte (CFSE) et l'axe des ordonnées l'intensité de la fluorescence rouge (marquage CD4). Dans le coin de chaque cadran est indiqué le pourcentage de cellules de ce cadran vis- à- vis de la population totale CD2+ (ensemble des lymphocytes T) .
On observe qu'aucune dilution de fluorescence pour la population de lymphocytes T du témoin n'a lieu après les restimulations (maximum d'intensité de fluorescence en 1 et 2). En revanche, la fluorescence décroît significativement lorsque les lymphocytes T de la brebis inoculée sont re-stimulés par la GFP et ceci quelle que soit la dose appliquée (panel B, 1, 2 et 3). Ceci est plus marqué pour les lymphocytes CD4+ (cadrans supérieurs) que pour les lymphocytes CD8+ (cadrans inférieurs) . Cette décroissance de fluorescence après stimulation par la GFP signale une lymphoprolifération, témoin d'une réponse cellulaire chez les animaux inoculés.
Conclusion :
Les résultats ci-dessus illustrent la capacité de Leporipoxvirus exprimant un antigène protéique exogène fusionné à une protéine d'enveloppe d' IMV ou d'EEV à induire une réponse immunitaire aussi bien humorale que cellulaire contre cet antigène exogène, y compris chez des espèces non-cibles des Leporipoxvirus. En outre, l'inoculation de ces Leporipoxvirus n'induit aucun effet secondaire, notamment chez les espèces non- cible, ce qui conforte leur innocuité.
Ces Leporipoxvirus constituent donc des vecteurs vaccinaux non réplicatifs, particulièrement intéressants pour l'utilisation chez des espèces autres que les léporidés.

Claims

REVENDICATIONS
1) Leporipoxvirus modifié, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine d' enveloppe chimérique choisie parmi : a) une protéine d'enveloppe chimérique comprenant :
- une région A constituée par une protéine possédant au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, ou au moins 90%, de préférence au moins 92%, et de manière tout à fait préférée au moins 96% de similarité de séquence avec la protéine M071L définie par la séquence SEQ ID NO: 1 ;
- une région B constituée par une protéine exogène d'intérêt, ladite région B étant fusionnée à l'extrémité C- terminale de ladite région A ; b) une protéine d'enveloppe chimérique comprenant :
- une région A constituée par une protéine possédant au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, ou au moins 90%, de préférence au moins 92%, et de manière tout à fait préférée au moins 96% de similarité de séquence avec la protéine M022L définie par la séquence SEQ ID NO: 2 ;
- une région B constituée par une protéine exogène d'intérêt, ladite région B étant fusionnée à l'extrémité N- terminale de ladite région A.
2) Leporipoxvirus modifié selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine chimérique telle que définie en a) dans ladite revendication 1, et une protéine chimérique telle que définie en b) dans ladite revendication 1.
3) Leporipoxvirus modifié selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir du virus de la myxomatose ou du virus du fibrome du lapin.
4 ) Polynucléotide codant pour une protéine d'enveloppe chimérique telle que définie en a) ou en b) dans la revendication 1.
5) Cassette d'expression comprenant un polynucléotide selon la revendication 4. 6) Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 5.
7) Leporipoxvirus modifié selon une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'utilisation en tant que vaccin.
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