EP2212702A1 - Marqueurs sanguins du rejet de l'intestin transplante - Google Patents

Marqueurs sanguins du rejet de l'intestin transplante

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Publication number
EP2212702A1
EP2212702A1 EP08872149A EP08872149A EP2212702A1 EP 2212702 A1 EP2212702 A1 EP 2212702A1 EP 08872149 A EP08872149 A EP 08872149A EP 08872149 A EP08872149 A EP 08872149A EP 2212702 A1 EP2212702 A1 EP 2212702A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
rejection
marker
concentration
citrulline
threshold variation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08872149A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Thierry Yandza
Nathalie Neveux
Luc Cynober
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Descartes
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Centre Hospitalier Universitaire de Nice
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Descartes
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Centre Hospitalier Universitaire de Nice
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Paris Descartes, Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA, Centre Hospitalier Universitaire de Nice filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2212702A1 publication Critical patent/EP2212702A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease

Definitions

  • the present invention relates to a method of detecting the rejection of an intestinal graft.
  • the present invention finds particular application in the medical field, more particularly in the field of transplants and the detection of graft rejection.
  • references in brackets ([]) refer to the list of references after the examples.
  • Irreversible chronic intestinal insufficiency has two main causes: a short anatomic bowel following, for example, small bowel resections, or a short functional bowel due to intestinal cell disease or intestinal motility disorders (dysfunction motor causing chronic partial obstructions and malabsorption).
  • the main result of chronic intestinal insufficiency is an addiction to parenteral nutrition.
  • This parenteral nutrition has several drawbacks first of all the material constraints of patient care as well as complications that can put the patient's vital prognosis at risk.
  • An alternative to parenteral nutrition and also to life-threatening patients is performing bowel transplantation. Since 2001, bowel transplantation has been steadily increasing. More than 140 transplants per year are performed in the United States. In France, the potential is 40 to 50 new cases per year.
  • graft rejection markers for gut transplants such as exist for kidney transplants or liver transplants would therefore prevent deaths from rejection of the graft and thus significantly reduce the number of deaths. due to rejection of the transplant.
  • citrulline in P. Crenn et al. 'Postabsorptive plasma citrulline concentration is a marker of absoptive enterocere mass and intestinal failure in humans. Gastroénterology "2000; 119: 1496-505 [1] is described as a marker of intestinal failure and in LC. Lutgens et al. "Myeloablative monitoring therapy-induced small bowel toxicity by serum citrulline concentration: a comparison with sugar permeability tests" Cancer 2005; 103: 191-9 [2] as a marker of cell death in the intestine. In the article of PA. Pappas et al. "Citrulline serum and rejection in small bowel transplantation: a preliminary report" Transplantation 2001; 72: 1212-16 [3], the authors linked citrulline with rejection of intestinal grafts and in PA.
  • the present invention is specifically intended to meet the above-mentioned needs and disadvantages by providing a method of detecting the rejection of an intestinal graft.
  • the method of the invention comprises the in vitro detection of rejection of an intestinal graft comprising the steps of: a) measuring the concentration in a liquid sample of at least two markers selected from the group consisting of: aspartate , citrulline, taurine and phenylalanine, b) calculation of the difference for each marker of said concentrations measured in step a) with a reference concentration of said marker, c) comparison for each marker of the absolute value of said difference with a discriminant threshold variation, d) assigning a score for each marker based on said comparison and summing said scores.
  • the detection of the rejection of an intestinal graft is observed in 100% of cases when the summation of the scores made in step d) is greater than or equal to 2.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the method of the invention.
  • the present invention also relates to the use of the method of the invention for the diagnosis of intestinal graft rejection.
  • the term "liquid sample” or “sample” is intended to mean any liquid sample capable of enabling the measurement of the concentration of at least two markers to be carried out. It may be for example any biological fluid, for example a blood sample, a plasma sample, a sample of cerebrospinal fluid, a sample of urine, saliva, sweat, synovial fluid, etc.
  • the liquid sample may come for example from a sample taken on a mammal or a rodent.
  • the mammal can be for example a human being, a pig and / or a monkey.
  • the liquid sample can come from a grafted or ungrafted individual, healthy or sick for example with intestinal, cardiac, renal, hepatic, pulmonary, pancreatic insufficiency, etc. and / or an individual who has had an intestinal transplant.
  • the liquid sample may also be a previously diluted, concentrated and / or purified sample. It may also be a solid or semi-solid sample previously treated to be solubilized, for example by dispersion in a physiological liquid.
  • the measurement of the concentration of the markers can be carried out by any means known to those skilled in the art.
  • the measurement of the concentration of at least one of the markers may be performed by means selected from the group consisting of High Performance Liquid Chromatography (HPLC), immunoassay, reverse phase gas chromatography with a precolumn of derivation with different reagents for example 9-fluorenymethylchloroformate, phenylisothiocyanate, dimethylaminaphthalenesulfonyl chloride, dimethylaminoazobenzenesulfonyl chloride and / or 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole, ions with a post-derivatization column using OPA and / or ninhydrin, automated ion exchange chromatography using the Hitachi L-8500A device as described in Boucher J, et al.
  • the reference concentration of step b) is a concentration for each marker determined by measurement in a sample from an individual or from a normalization of measurements from different samples from different samples. people.
  • the above-mentioned individual (s) may be, for example, an individual (s) who has not undergone gut transplantation, this or these individuals (s). ) may be a healthy individual (s) or waiting for a bowel transplant. It may be for example one or more individual (s) having an age, weight, size and / or physiological characteristics close to or identical to those of the individual from whom the sample on which is measured at step a) the concentration of the markers.
  • the measurement of the reference concentration can be carried out by any measuring means suitable for carrying out the method of the invention.
  • the measurement of the reference concentration can be carried out by the aforementioned measurement methods.
  • the reference concentration is measured on a sample taken from a patient before grafting.
  • the reference concentration for each marker is the concentration of said marker before grafting.
  • the calculation carried out in step b) corresponds to calculating the difference for each marker of the value measured in the liquid sample of step a) with the reference value as defined above.
  • the calculation carried out in step b) of the process of the invention can be carried out by any means known to those skilled in the art. For example by means of a calculator, by mental calculation, by an automated means etc.
  • the absolute value of the result of the calculation carried out in step b) is retained for step c) of the method of the invention.
  • the comparison made in step c) of the method of the invention makes it possible to determine whether the absolute value of the difference calculated in step b) for each marker is greater or less than a discriminant threshold variation for each marker.
  • a discriminatory threshold variation is understood to mean a value established for each marker corresponding to the minimum variation in the concentration of each marker in the presence of graft rejection. This discriminating threshold variation can also be called “discriminant value”.
  • the discriminating threshold variation may be determined by any means known to those skilled in the art.
  • the determination of the discriminant threshold variations of each marker has been carried out by the establishment of efficiency characteristic curves.
  • ROC Receiveiver operating characteristic
  • the absolute value of the difference between the reference concentration and the concentration in a liquid sample can be calculated: reference value - value in sample.
  • sensitivity means the probability that the absolute value of the difference is greater than the discriminatory threshold variation if the animal belongs to the rejection group
  • discriminatory threshold variation means the probability that the absolute value of the difference is less than or equal to the discriminatory threshold variation if the animal belongs to the no-rejection group
  • positive predictive value means the probability that the animal belongs to the rejection group if the absolute value of the difference is greater than the discriminatory threshold variation
  • negative predictive value means the probability that the animal belongs to the no-rejection group if the absolute value of the difference is less than or equal to the discriminant threshold variation.
  • Plasma levels of the four amino acids can be significantly correlated via sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value calculations at the onset of rejection.
  • the sensitivity of each marker can be determined by the probability that the absolute value of the difference is greater than the threshold if the animal belongs to the rejection group.
  • the specificity of each marker can be determined by the probability that the absolute value of the difference is less than or equal to the discriminatory threshold variation if the animal belongs to the no-rejection group.
  • the positive predictive value of each marker can be determined by the probability that the animal belongs to the rejection group if the absolute value of the difference is greater than the discriminant threshold variation.
  • the negative predictive value of each marker can be determined by the probability that the animal belongs to the no-rejection group if the absolute value of the difference is less than or equal to the discriminant threshold variation.
  • the logistic model can be written according to the following formula: lûgit ( ⁇ r) ⁇ log where ⁇ is the intercept and ⁇ 'is the vector of the parameters.
  • N the total number of observations
  • t the total number of pairs of responses
  • n c the number of matching pairs
  • na the number of discordant pairs
  • t - n c - nd the number of ex-aequo pairs.
  • AUC area under the curve
  • the discriminatory threshold variation of aspartate may be in the range from 18 to 24 ⁇ mol / L, preferably the discriminatory threshold variation of aspartate is 21 ⁇ mol / L.
  • the discriminatory threshold variation of taurine may be in the range from 17 to 23 ⁇ mol / L, preferably the discriminatory threshold variation of taurine is 20 ⁇ mol / L.
  • the discriminatory threshold variation of citrulline is in the range from 22 to 30 ⁇ mol / L, preferably the discriminatory threshold variation of citrulline is 26 ⁇ mol / L.
  • the discriminating threshold variation of phenylalanine is in the range from 34 to 46 ⁇ mol / L, preferably the discriminatory threshold change of phenylalanine is 40 ⁇ mol / L.
  • the assignment of a score for each marker made in step d) of the method of the invention corresponds to the allocation for each marker of the value 0 or 1.
  • the allocation is a function of the comparison made in step c) of the process of the invention for each marker. If the comparison reveals that the absolute value of the result of the calculation performed in step b) is greater than or equal to the discriminant threshold variation, a score of 1 is affected. If the absolute value of the result of the calculation performed in step b) is less than the discriminant threshold variation, a score of 0 is assigned. Finally after assigning a score for each marker a summation of said scores is made.
  • step d) when a result of the summation carried out in step d) leads to a score greater than or equal to 2, this corresponds to a rejection of the graft.
  • the present invention also comprises a method as defined above in which the measurement of step a) is carried out after grafting, and in which the reference concentration of the step b) corresponds to a measurement of the concentration of said marker before grafting.
  • this method is non-invasive and allows an early diagnosis of graft rejection without blind, ie random, iterative biopsies, performed without any real signs of rejection appeals, as is practiced in the first case. state of the art. Early detection of rejection increases the survival rate of patients from 11 to 80% by better medical management.
  • the noninvasive nature of the method of the invention also allows a better patient acceptance of the method of the invention compared to iterative intestinal biopsies.
  • the non-invasive nature also eliminates the risks associated with iterative intestinal biopsies with or without intestinal endoscopies, such as haemorrhages, digestive perforations, etc.
  • the method of the invention also makes it possible to have a diagnosis of transplant rejection that is 100% reliable, contrary to the state of the art. Indeed in the state of the art, the detection is by blind biopsy, the sample may therefore correspond to a part of organ not yet showing the histological signs of rejection and thus lead to misdiagnosis. ⁇ Q
  • the method of the invention thus allows a rapid, reliable, non-invasive detection of intestinal transplant rejection and indirectly an increase in the survival rate of transplant recipients. It allows early treatment of transplant rejection before it becomes irreversible and leads to loss of the graft, even death of the patient.
  • Example 1 Measurement of the concentration in a liquid sample of the markers.
  • FOOD COMBINED consisting of the following ingredients: wheat, barley, soybean meal, small seeds and cereal husks, oilseeds, beet pulp, corn, dicalcium phosphate, peas, premix additives, vegetable oil, calcium carbonate, maxid, threonine , lysine, salt, methionine.
  • the contents of the various elements being: crude protein 17.9%, fat crude 1, 3%, crude fiber 4.4%, crude ash 5.5%, lysine 11, 0 g / Kg, vitamin A 9000 IU / Kg, vitamin D3 2000 IU / Kg, vitamin E 20 IU / Kg , copper (as sulphate) 100 mg / kg and avilamycin 30 mg / kg.
  • the parameters studied in the incision (TO) and at sacrifice the 8th post-operative day (T1) were plasma levels of amino acids and the histology of the transplanted intestine.
  • Blood samples were collected from all individuals before transplantation. Samples were taken using a syringe connected to a catheter placed in the right external jugular vein. The volume of each sample was 4 ml. Separation of the plasma fraction and red blood cells was performed by centrifugation. These samples corresponded to the reference samples. After transplantation, blood samples were taken at the 8 th postoperative day. Samples were taken using a syringe connected to the central venous catheter placed in the external jugular vein during grafting. The volume of each sample was 4 ml. Separation of the plasma fraction and red blood cells was performed as previously described. These samples corresponded to the test samples. They were frozen at -80 ° C. while awaiting the determination of the amino acids.
  • the reagents used for the assay were: HPLC grade methanol and acetonitrile from CARLO-ERBA (Val de Breuil - France), L-citruline and tridecafluoro- hexanoic acid (TDFHA) from SIGMA-ALDRICH (L 1 ISLE D 1 ABEAU CHESNES -St QUENTIN
  • the samples were deproteinated by High Pressure Liquid Chromatography in ethanolic medium to determine the free amino acids. Thanks to an automated sampling and injection system (AGILENT - PARIS-France) the chromatography of amino acids applies the principle of ion pair chromatography.
  • the column had a stationary phase of type QS UPTISPHERE 120 A, 3 ⁇ m BP2, 50 ⁇ 2 mm (UP3 BP2 # 5QS Interchrom, Interchim, Montlucon, France).
  • the gradients that were applied (water - TDFHA and acetonitrile) were identical to those disclosed in the article by Monique Piraud et al. [7]
  • tandem mass spectrometric analyzes were performed using an API 3000 triple quadrupole mass spectrometer (Sciex Applied Biosystems, Toronto, Canada), the software of acquisition of results corresponding to version 1.4.1.
  • the specific transitions (non-isotopic amino acids) and those of the reference standards were used in positive mode and their optimal parameters of obtaining were applied to each molecule.
  • Simultaneous analysis of these transitions has led to the establishment of a method for qualitative and quantitative analysis of amino acids.
  • the limits of quantification values for each molecule were consistent with their plasma, urine and fluid cerebrospinal fluid (CSF) by pre-calibrating the data with a calibration line for each series of analyzes. These have been the subject of internal and external quality control (national and international) to verify the conformity of the results obtained and the proper functioning of the equipment.
  • the coefficients of variation (CV) of the results obtained were less than or equal to 5% in repetitiveness and reproducibility.
  • This method was chosen because it allows to dose 76 amino acids simultaneously with greater precision, faster (16 minutes of chromatography and detection by mass spectrometry) and more economically than the ion exchange column separation method. Indeed, the ion exchange column separation is followed by a postcolumn derivation with ninhydrin, this technique requiring a time of 120 minutes of sampling chromatography.
  • Example 2 Determination of the reference concentration for each marker.
  • a first method for determining the reference concentration for each individual and for each marker was made as shown in Example 1. It corresponds to the pre-transplant sample (TO) of a liquid sample for each individual and then measures for each marker of the concentration value in each sample before transplant.
  • TO pre-transplant sample
  • a second method was used during our experiments to determine the reference concentration for each marker. This corresponds to the sampling of a liquid sample as described in Example 1 in several healthy individuals. After taking samples, a measurement of the concentration as described in Example 1 of each marker in each sample was carried out. The different concentration measurements of each marker were then normalized.
  • the reference values according to the first method used for the individuals tested in Example 1 are presented in Table 1 below.
  • Sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value are as previously defined.
  • Plasma levels of four acids were significantly correlated via sensitivity calculations, specificity, positive predictive value, and negative predictive value at the onset of rejection.
  • the sensitivity of each marker was determined by the probability that the value of the variation between T1 and TO is greater than the threshold if the animal belongs to the rejection group.
  • the specificity of each marker was determined by the probability that the value of the variation between T1 and TO is less than or equal to the threshold if the animal belongs to the no-rejection group.
  • the positive predictive value of each marker was determined by the probability that the animal belongs to the rejection group if the value of the variation between T1 and TO is greater than the threshold.
  • the negative predictive value of each marker was determined by the probability that the animal belongs to the no-rejection group if the value of the variation between T1 and TO is less than or equal to the threshold.
  • the score was established from the variation of several amino acids by counting 1 point if the value is greater than the threshold and 0 points if the value is less than or equal to the threshold.
  • a logistic regression model was constructed using SAS software from SAS Institute Inc and described in SAS / STAT Software:
  • AUC area under the curve
  • Table 2 discriminant threshold variation, sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value of each marker.
  • Example 4 Calculation of the difference for each marker, assignment of a score for each marker and summation of the scores.
  • Example 3 Intestinal histology was performed on an intestine sample with an Olympus BX41 microscope at day 8 for each individual of Example 1.
  • the commonly accepted classification of intestinal rejection is as follows: for the "indeterminate" grade, the lesions are usually minimal and there is an increase of the cells in apoptosis but with less than 6 apoptoses for 10 glands and little or no inflammation .
  • apoptotic cells exceed 6 per 10 glands and a discrete to moderate predominantly mononuclear inflammatory infiltrate is observed.
  • moderate rejection grade 2
  • an increase in apoptotic cells is observed. Apoptotic cells become confluent and can result in glandular destruction and moderate to severe mononuclear infiltration.
  • severe rejection grade 3
  • greater glandular destruction with areas of disappearance of the glands, even erosions or ulcerations and a marked inflammatory infiltrate are observed.
  • Table 4 Distribution of individuals according to the score obtained.
  • Table 5 Percent distribution of individuals by score and group
  • - group 1 8 pigs received an autograft of intestine
  • - group 2 8 pigs received an allogeneic transplant but without any immunosuppressive treatment.
  • the pigs were anesthetized for transplantation according to the following protocol: intramuscular premedication was performed with 20-25 mg / kg of ketamine (Imalgene 1000, registered trademark, 10 ml, Merial, Lyon, France), and 0.004-0, 01 mg / kg of glycopyrrolate (Robinul V, registered trademark, 5 mL, Vétoquinol, Lure, France); induction with isofluorane gas (AEran, registered trademark, Baxter SA, Maurepas, France) administered with a mask.
  • ketamine Immalgene 1000, registered trademark, 10 ml, Merial, Lyon, France
  • 0.004-0 01 mg / kg of glycopyrrolate
  • Robot V registered trademark, 5 mL, Vétoquinol, Lure, France
  • isofluorane gas AEran, registered trademark, Baxter SA, Maurepas, France
  • the pigs were perfused intravenously with 50 ml / kg of 0.9% NaCl (B. Braun) and 65 ml / kg of glucose 5% (isotonic glucose Aguettant, registered trademark, Aguettant, Lyon, France).
  • a venous catheter was introduced into the external jugular vein to measure central venous pressure and perfuse.
  • Blood pressure was measured (SC 7000, Siemens, France) via a cervical catheter inserted into the carotid artery.
  • Heart rate and oxygen saturation were measured continuously using a pulse oximeter with a detector attached to a gingiva. (Model 9847 V, Nonin Medical Inc., Plumouth, UK).
  • the in situ intestinal ischemia technique used in this example is derived from that described by Lauronen et al. Effects of extrinsic with or without ischemia-reperfusion injury on constitutional mucosal characteristics in porcine jejunoileum. "Dig Dis Sci 2001; 46 (3): 476-85 [9] and Pakarinen MP, Pirinen P, Lauronen J, Raivio P, Kuusanmaki P, Halttunen J.
  • the ileum was divided transversally proximally 10 cm from the ileocecal valve, at the apex of the The upper mesenteric artery was divided into the upper mesenteric artery, the superior mesenteric artery was removed from the duodenal branch to the second jejunal branch, and the jejunum corresponding to the first jejunal artery was sectioned.
  • the skeletonized mesenteric vessels and their colic branches remained the only connections maintaining the blood perfusion of the jejunoileon.
  • the skeletonized mesenteric vessels were clamped to produce jejunal ischemia. Superior was clamped at the proximal origin of the duodenal artery. The duodenal artery and the colonic artery were clamped separately at their origins to prevent the passage of the preservation solution into the systemic circulation while preventing arterial reflux in the jejunal circulation. The superior mesenteric vein was clamped distally from the colonic vein, allowing blood flow through the colonic vein. Subsequently, the superior mesenteric artery was catheterized downstream of the clamp via the first jejunal artery.
  • the jejunum thus isolated was washed with 1000 ml of cold solution (4 ° C.) of IGL-1 (Georges Lopez Institute, Lyon, France). A small incision of the superior mesenteric vein was made upstream of the clamp for allow the outlet of the effluent. After cold ischemia, the small incision in the superior mesenteric vein was closed with a 6-0 prolene suture. The first jejunal artery was linked to its origin and the vascular clamp was removed, allowing reperfusion of the jejunoileon. The jejunal length was then measured along the antimesenteric edges from the proximal end to the distal end. Seventy per cent of the proximal jejunoileon was resected.
  • the superior mesenteric artery and vein were dissected at the colonic branches.
  • the colonic branches have been linked and severed.
  • the proximal small intestine was sectioned about 30 cm downstream of the Treitz ligament.
  • the ileum was cut 10 cm upstream of the ileocaecal valve, at the top of the curve formed by the end of the superior mesenteric artery.
  • the corresponding mesentery has been sectioned.
  • heparin Choay registered trademark, 100 IU / kg
  • 800 mL / kg of donor blood was removed for use in transfusion into the recipient.
  • jejunoileon was washed with 1000 mL of cold IGL-1 solution (4 ° C) by the infrarenal aorta.
  • the graft then comprised the jejunum and the ileum in its entirety, the superior mesenteric artery in continuity with an abdominal aortic segment, the superior mesenteric vein in continuity with the portal vein.
  • the graft was temporarily stored in a cold solution (4 ° C) of IGL-1. The contents of the hail were not washed.
  • the graft was reduced from the proximal end of the jejunoileal segment, leaving approximately 4.5 m to account for 30 cm of proximal jejunum and 10 cm of native ileum left in the recipient.
  • the proximal small bowel was cut about 30 cm downstream of the Treitz ligament and the ileum was cut 10 cm upstream of the ileocecal valve.
  • the isolated iléojejunum was resected.
  • the entire colon and rectum of the recipient were kept.
  • the allograft was then implanted.
  • the abdominal aorta of the graft was anastomosed to the infrarenal abdominal aorta of the recipient with a 6-0 prolene suture.
  • the superior mesenteric vein was anastomosed to the inferior vena cava sub-renal. Digestive continuity was reestablished with anastomoses of the jejunum and the ileum.
  • Mesenteric gaps were closed In both groups, the mesentery has a whitish appearance before closure of the abdomen.
  • the animals were fed from the first postoperative day with food as shown in Example 1.
  • the animals were euthanized at 8 th postoperative day with an intravenous dose of sodium pentobarbital (Dolethal, trademark, Vétoquinol SA , Lure, France) after laparotomy under general anesthesia with isoflurane.
  • sodium pentobarbital Dolethal, trademark, Vétoquinol SA , Lure, France
  • Plasma concentration of citrulline was measured at TO and T1 as in Example 1.
  • the average weight measured at the time of transplantation was 25.8 ⁇ 7.6 kg in group 1, and 20.6 ⁇ 2.7 kg in group 2.
  • the length of the small remaining intestine was 5 ⁇ 0.2m in both groups.
  • Table 6 Mean plasma citrulline concentration in each of the two groups.
  • This concentration therefore has a discriminating power on the occurrence of rejection of intestinal graft.
  • Citrulline was characterized by a discriminating power of the occurrence of rejection lower than that of other markers (taurine, phenylalanine, aspartate), a number of patients based on citrulline with a risk of ⁇ of 20% makes it possible to highlight significant associations for other markers with sufficient statistical power (at least greater than 80%).
  • the number of subjects to be included is calculated with an ⁇ risk of 5% bilaterally and a risk ⁇ of 20% and is based on 3 studies.
  • the author's previous study shows a drop of more than 40% in citrulline in allografted pigs compared to autografted pigs where a strength of 16 was sufficient.
  • citrulline may be greater than in the study by Gondolesi et al. because the comparison does not concern the presence or not of intestinal mucosal lesions but on the occurrence or not of a rejection, so the number of patients to be included can be less than 60.
  • the method of the invention is applied to a liquid sample from a human selected from the group of fifty individuals as defined above.
  • the collection of the liquid sample is carried out by taking blood.
  • the reference concentration of each marker is that corresponding to the measurement made immediately before the intestinal graft or after the graft, but in the absence of histologically confirmed rejection.
  • the correlation of scores with graft rejection is performed as described in Example 5. Detection of rejection of the graft is observed when the sum of the scores of the markers is greater than 2.
  • the implementation of the method of the invention thus makes it possible to demonstrate 100% of the intestinal graft rejections as presented in Example 2 and is therefore suitable for use in the diagnosis of graft rejection.
  • underivatized amino acids of biological interest a new tool for the diagnosis of inherited disorders of amino acid metabolism. Rapid

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de détection du rejet d'une greffe d'intestin. Le procédé de détection de l'invention est un procédé de détection in vitro du rejet d'une greffe d'intestin comprenant des étapes de mesure de la concentration dans un échantillon liquide de marqueurs, calcul de la différence pour chaque marqueur avec une concentration de référence, comparaison pour chaque marqueur de la différence avec une variation seuil discriminante et affectation d'un score. La présente invention trouve notamment une application dans le domaine médical, plus particulièrement dans le domaine des transplantations et la détection du rejet des greffes.

Description

MARQUEURS SANGUINS DU REJET DE L'INTESTIN TRANSPLANTÉ
DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un procédé de détection du rejet d'une greffe d'intestin.
La présente invention trouve notamment une application dans le domaine médical, plus particulièrement dans le domaine des transplantations et la détection du rejet des greffes. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentées après les exemples.
État de la technique
L'insuffisance intestinale chronique irréversible a deux causes principales : un grêle court anatomique consécutif par exemple à des résections de l'intestin grêle, ou un grêle court fonctionnel dû à une maladie de la cellule intestinale ou à des troubles de la motricité intestinale (dysfonction motrice provoquant des obstructions partielles chroniques et une malabsorption). Le résultat principal de l'insuffisance intestinale chronique est une dépendance à la nutrition parentérale. Cette nutrition parentérale présente plusieurs inconvénients tout d'abord les contraintes matérielles de prise en charge des patients ainsi que des complications pouvant mettre en jeu le pronostic vital des patients. Une alternative à la nutrition parentérale et également à la mise en jeu du pronostic vital des patients est la réalisation de greffe d'intestin. La transplantation de l'intestin connaît depuis 2001 une augmentation constante. Plus de 140 greffes par an sont réalisées aux Etats-Unis. En France, Ie potentiel est de 40 à 50 nouveaux cas par an. Ainsi, selon le registre international de transplantation intestinale, 1292 transplantations ont été effectuées dans le monde chez 1210 patients. Sur ces 1210 patients transplantés, en mars 2005 seulement 658 étaient toujours en vie et ce malgré l'augmentation du taux de survie des transplantés. Une des causes principales de décès des patients transplantés après le sepsis, est le rejet du greffon représentant 9% des décès. De plus, le sepsis, qui est responsable de 50% des décès, complique le plus souvent le traitement du rejet diagnostiqué tardivement.
L'identification de marqueurs de rejet du greffon pour les greffes d'intestin tel qu'il en existe pour les transplantations rénales ou les transplantations du foie permettrait donc de prévenir les décès dus au rejet de la greffe donc de réduire significativement le nombre de décès dus au rejet de la greffe.
Des études dans l'état de la technique ont proposé la citrulline plasmatique comme un marqueur potentiel du rejet de la greffe d'intestin. En effet, la citrulline dans P. Crenn et al. « Postabsorptive plasma citrulline concentration is a marker of absoptive enterocte mass and intestinal failure in humans. Gastroénterology » 2000 ;119 :1496-505 [1] est décrite comme un marqueur de l'insuffisance intestinale et dans LC. Lutgens et al. « Monitoring myeloablative therapy-induced small bowel toxicity by sérum citrulline concentration : a comparaison with sugar permeability tests » Cancer 2005 ; 103 : 191 -9 [2] comme un marqueur de la mort cellulaire dans l'intestin. Dans l'article de PA. Pappas et al. « Sérum citrulline and rejection in small bowel transplantation : a preliminary report » Transplantation 2001 ; 72 :1212-16 [3], les auteurs ont lié la citrulline avec le rejet des greffes intestinales et dans PA.
Pappas et al « An analysis of the association between sérum citrulline and acute rejection among 26 récipients of intestinal transplant » Am J
Transplantation 2004 ;4 :1124-32 [4] les auteurs décrivent la citrulline comme un marqueur potentiel de rejet de greffe d'intestin.
Cependant les essais cliniques utilisant ce marqueur n'ont pas permis de démontrer que ce marqueur était fiable. En effet de nombreux facteurs confondant et méthodologiques tels que l'âge, le recul postopératoire, la fonction rénale et le stress chirurgical ont altéré les résultats et ont empêché de confirmer que la citrulline plasmatique est bien un marqueur du rejet de la transplantation d'intestin.
Le seul moyen actuel de confirmation du diagnostique de rejet est la réalisation de biopsies itératives à l'aveugle avec un examen histologique en espérant un diagnostique précoce du rejet.
Le diagnostic précoce du rejet d'une greffe d'intestin permet d'améliorer la prise en charge des patients et le devenir des patients. II existe donc un réel besoin de disposer de marqueurs fiables et d'un procédé de détection non invasif desdits marqueurs, permettant d'obtenir un diagnostic rapide du rejet de greffe d'intestin afin de détecter le plus précocement et avec le plus de sécurité possible le rejet d'une greffe d'intestin, permettant ainsi de diminuer le nombre de rejets et de décès lié un rejet de greffe d'intestin.
Description de l'invention La présente invention a précisément pour but de répondre aux besoins et inconvénients précités en fournissant un procédé de détection du rejet d'une greffe d'intestin.
Le procédé de l'invention comprend la détection in vitro du rejet d'une greffe d'intestin comprenant les étapes de : a) mesure de la concentration dans un échantillon liquide d'au moins deux marqueurs choisis dans le groupe comprenant : l'aspartate, la citrulline, la taurine et la phénylalanine, b) calcul de la différence pour chaque marqueur desdites concentrations mesurées à l'étape a) avec une concentration de référence dudit marqueur, c) comparaison pour chaque marqueur de la valeur absolue de ladite différence avec une variation seuil discriminante, d) affectation d'un score pour chaque marqueur en fonction de ladite comparaison et sommation desdits scores.
Selon l'invention, la détection du rejet d'une greffe d'intestin est observée dans 100% des cas quand la sommation des scores réalisée à l'étape d) est supérieure ou égale à 2.
La présente invention se rapporte également à un kit pour la mise en œuvre du procédé de l'invention.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation du procédé de l'invention pour le diagnostic de rejet de greffe intestinale. Selon la présente invention par « échantillon liquide » ou « échantillon » on entend tout échantillon liquide susceptible de permettre la réalisation de la mesure de la concentration d'au moins deux marqueurs. Il peut s'agir par exemple de tout liquide biologique, par exemple un échantillon de sang, un échantillon plasmatique, un échantillon de liquide céphalorachidien, un échantillon d'urine, de salive, de sueur, liquide synovial, etc.
Selon la présente invention, l'échantillon liquide peut provenir par exemple d'un prélèvement effectué sur un mammifère ou un rongeur. Le mammifère peut être par exemple un être humain, un cochon et/ou un singe. Selon la présente invention, l'échantillon liquide peut provenir d'un individu greffé ou non greffé, sains ou malade par exemple présentant une insuffisance intestinale, cardiaque, rénale, hépatique, pulmonaire, pancréatique, etc. et/ou d'un individu ayant subi une greffe d'intestin.
Selon la présente invention, l'échantillon liquide peut être également un échantillon préalablement dilué, concentré et/ou purifié. Il peut s'agir également d'un échantillon solide ou semi solide traité préalablement pour être solubilisé, par exemple par dispersion dans un liquide physiologique.
Selon la présente invention, la mesure de la concentration des marqueurs peut être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple, la mesure de la concentration d'au moins un des marqueurs peut être effectuée par un moyen choisi dans le groupe comprenant la Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC), l'immunodosage, la chromatographie gazeuse en phase inverse avec une précolonne de dérivation avec différents réactifs par exemple du 9-fluorenyméthylchloroformate, du phénylisothiocyanate, du chlorure de diméthylaminaphthalènesulfonyle, du chlorure de diméthylaminoazobenzenesulfonyle et/ou du 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3- diazole, une chromatographie échangeuse d'ions avec une post colonne de dérivation utilisant de OPA et/ou de ninhydrine, une chromatographie échangeuse d'ions automatisée utilisant le dispositif Hitachi L-8500A tel que décrit dans Le Boucher J, et al. Amino acid détermination in biological fluids by automated ion-exchange chromatography : performance of Hitachi L-8500A. Clinical Chemistry 1997;43:1421-28 [5]. La présente invention décrit également un procédé tel que défini précédemment dans lequel à l'étape a) on mesure la concentration de 2, ou de 3, ou de 4 marqueurs.
Selon la présente invention, la concentration de référence de l'étape b) est une concentration pour chaque marqueur déterminée par mesure dans un échantillon provenant d'un individu ou issue d'une normalisation de mesures à partir de différents d'échantillons provenant de différents individus.
Selon la présente invention, le ou les individu(s) précité(s) peut (peuvent) être par exemple un ou des individu(s) n'ayant pas subi(s) de transplantation d'intestin, ce ou ces individu(s) peut (peuvent) être un ou des individu(s) sain(s) ou en attente d'une greffe d'intestin. Il peut s'agir par exemple d'un ou plusieurs individu(s) ayant un âge, un poids, une taille et/ou des caractéristiques physiologiques proches voir identiques à celles de l'individu duquel provient l'échantillon sur lequel on mesure à l'étape a) la concentration des marqueurs.
Selon la présente invention, la mesure de la concentration de référence peut être effectuée par tout moyen de mesure adapté à la réalisation du procédé de l'invention. Par exemple la mesure de la concentration de référence peut être réalisée par les méthodes de mesure précitées. Dans un mode particulier de réalisation de la présente invention présenté ci-après la concentration de référence est mesurée sur un échantillon prélevé sur un patient avant greffe. Dans ce mode de réalisation, la concentration de référence pour chaque marqueur est la concentration dudit marqueur avant greffe.
Selon la présente invention, le calcul effectué à l'étape b) correspond au calcul de la différence pour chaque marqueur de la valeur mesurée dans l'échantillon liquide de l'étape a) avec la valeur de référence telle que définie précédemment. Selon la présente invention, le calcul effectué à l'étape b) du procédé de l'invention peut être effectué par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple au moyen d'une calculatrice, par calcul mental, par un moyen automatisé etc. Selon la présente invention, on retient pour l'étape c) du procédé de l'invention la valeur absolue du résultat du calcul effectué à l'étape b).
Selon la présente invention, la comparaison effectuée à l'étape c) du procédé de l'invention permet de déterminer si la valeur absolue de la différence calculée à l'étape b) pour chaque marqueur est supérieure ou inférieure à une variation seuil discriminante pour chaque marqueur.
Selon la présente invention par « une variation seuil discriminante» on entend une valeur établie pour chaque marqueur correspondant à la variation minimale de la concentration de chaque marqueur en présence de rejet de greffe. Cette variation seuil discriminante peut également être appelée « valeur discriminante ».
Selon la présente invention, la variation seuil discriminante peut être déterminée par tout moyen connue de l'homme du métier. Par exemple la détermination des variations seuils discriminantes de chaque marqueur a été effectuée par l'établissement de courbes de caractéristiques d'efficacité
(« receiver operating characteristic » ou « ROC ») construites à partir des différents seuils étudiés puis par la recherche du seuil offrant le meilleur compromis de la sensibilité (Se) et de la spécificité (Sp) : maximisation de l'indice de Youden (Se + Sp -1).
Pour chaque acide aminé, on peut calculer la valeur absolue de la différence entre la concentration de référence et la concentration dans un échantillon liquide: valeur de référence - valeur dans échantillon.
Pour chaque seuil de variation étudié, on peut calculer la sensibilité, spécificité, la valeur prédictive positive et négative.
Selon la présente invention, par« sensibilité » on entend la probabilité que la valeur absolue de la différence soit supérieure à la variation seuil discriminante si l'animal appartient au groupe rejet,
Selon la présente invention, par « spécificité » on entend la probabilité que la valeur absolue de la différence soit inférieure ou égale à la variation seuil discriminante si l'animal appartient au groupe absence de rejet , Selon la présente invention par « valeur prédictive positive » on entend la probabilité que l'animal appartienne au groupe rejet si la valeur absolue de la différence est supérieure à la variation seuil discriminante,
Dans la présente invention par « valeur prédictive négative » on entend la probabilité que l'animal appartienne au groupe absence de rejet si la valeur absolue de la différence est inférieure ou égale à la variation seuil discriminante.
Les taux plasmatiques des quatre acides aminés peuvent être significativement corrélés via les calculs de la sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative à la survenue du rejet
La sensibilité de chaque marqueur peut être déterminée par la probabilité que la valeur absolue de la différence soit supérieure au seuil si l'animal appartient au groupe rejet.
La spécificité de chaque marqueur peut être déterminée par la probabilité que la valeur absolue de la différence soit inférieure ou égale à la variation seuil discriminante si l'animal appartient au groupe absence de rejet.
La valeur prédictive positive de chaque marqueur peut être déterminée par la probabilité que l'animal appartienne au groupe rejet si la valeur absolue de la différence est supérieure à la variation seuil discriminante. La valeur prédictive négative de chaque marqueur peut être déterminée par la probabilité que l'animal appartienne au groupe absence de rejet si la valeur absolue de la différence est inférieure ou égale à la variation seuil discriminante.
Selon la présente invention, on peut construire un modèle de régression logistique comportant pour variable dépendante la variable rejet et pour variable indépendante Ie score tel que décrit dans SAS/STAT Software: "Changes and enhancements through release 6.11". In. 6.11 éd. Cary, NC, USA; 1996.[6]. Soit
Y la réponse d'un animal, notée 0 en l'absence de rejet et 1 en présence de rejet, soit x le vecteur des variables indépendantes, soit π la probabilité de la réponse à modéliser, le modèle logistique peut s'écrire selon la formule suivante : lûgit(τr) ≡ log dans laquelle α est l'intercepte et β' est le vecteur des paramètres. Soit N le nombre total d'observations, soit t le nombre total de paires de réponses, soit nc le nombre de paires concordantes, na le nombre de paires discordantes et t - nc - nd le nombre de paires ex-aequo. L'aire sous la courbe (AUC) peut être calculée de la façon suivante :
C = (nc + 0,5 (t - nc - nd)) / t
Le calcul des probabilités précédentes peut être réalisé par calcul des aires sous la courbe (AUC). Selon la présente invention, la variation seuil discriminante de l'aspartate peut être comprise dans la gamme allant de 18 à 24 μmol/L, de préférence la variation seuil discriminante d'aspartate est de 21 μmol/L.
Selon la présente invention, la variation seuil discriminante de taurine peut être comprise dans la gamme allant de 17 à 23 μmol/L, de préférence la variation seuil discriminante de taurine est de 20 μmol/L.
Selon la présente invention, la variation seuil discriminante de citrulline est comprise dans la gamme allant de 22 à 30 μmol/L, de préférence la variation seuil discriminante de citrulline est de 26 μmol/L.
Selon la présente invention, la variation seuil discriminante de phénylalanine est comprise dans la gamme allant de 34 à 46 μmol/L, de préférence la variation seuil discriminante de phénylalanine est de 40 μmol/L.
Selon la présente invention, l'affectation d'un score pour chaque marqueur effectuée à l'étape d) du procédé de l'invention correspond à l'attribution pour chaque marqueur de la valeur 0 ou 1. L'attribution est fonction de la comparaison effectuée à l'étape c) du procédé de l'invention pour chaque marqueur. Si la comparaison révèle que la valeur absolue du résultat du calcul effectué à l'étape b) est supérieure ou égale à la variation seuil discriminante, un score de 1 est affecté. Si la valeur absolue du résultat du calcul effectué à l'étape b) est inférieure à la variation seuil discriminante, un score de 0 est affecté. Enfin après affectation d'un score pour chaque marqueur une sommation desdits scores est effectué.
Selon la présente invention, lorsqu'un résultat de la sommation effectuée à l'étape d) conduit à un score supérieur ou égale à 2 ceci correspond à un rejet de greffe.
Selon un mode de réalisation particulier de réalisation de l'invention, la présente invention comprend également un procédé tel que défini précédemment dans lequel la mesure de l'étape a) est effectuée après greffe, et dans lequel la concentration de référence de l'étape b) correspond à une mesure de la concentration dudit marqueur avant greffe.
Les expérimentations menées par les inventeurs de la présente ont démontré que le procédé de l'invention permet de déterminer avec certitude le rejet d'une greffe d'intestin.
Ce procédé présente de très nombreux avantages au regard des procédés de l'état de la technique.
Tout d'abord ce procédé est non invasif permettant un diagnostic précoce du rejet du greffon sans biopsies itératives à l'aveugle, c'est-à-dire aléatoires, réalisée sans véritables signes d'appels du rejet, comme cela est pratiqué dans l'état de Ia technique. La détection précoce du rejet permet d'augmenter le taux de survie des patients de 11 à 80% par une meilleure prise en charge médicale.
Le caractère non invasif du procédé de l'invention permet également une meilleure acceptation par le patient du procédé de l'invention par rapport à des biopsies intestinales itératives. Le caractère non invasif permet également d'éliminer les risques liés aux biopsies intestinales itératives avec ou sans endoscopies intestinales, tels que les hémorragies, les perforations digestives, etc.
Le procédé de l'invention permet en outre d'avoir un diagnostic du rejet de greffe fiable à 100% au contraire de l'état de la technique. En effet dans l'état de la technique, la détection se fait par biopsie à l'aveugle, le prélèvement peut donc correspondre à une partie d'organe ne présentant pas encore les signes histologiques de rejet et donc conduire à un mauvais diagnostic. χ Q
Le procédé de l'invention permet donc une détection rapide, fiable, non invasive du rejet de greffe d'intestin et indirectement une augmentation du taux de survie des personnes greffées. Il permet de traiter précocement le rejet de greffe avant qu'il devienne irréversible et entraîne une perte du greffon, voir la mort du patient.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous fournis à titre illustratif et non limitatifs.
EXEMPLES
Exemple 1 : Mesure de la concentration dans un échantillon liquide des marqueurs.
A/ population étudiée.
Dans cet exemple, 24 cochons femelles Large WithexLandrace pesant entre 25 et 30kg, anesthésiés, intubés et ventilés ont été utilisés. Deux groupes ont été étudiés : - groupe 1 , 8 cochons ont reçu une autogreffe d'intestin, et
- groupe 2, 8 cochons ont reçu une greffe allogénique mais sans aucun traitement immunosuppresseur.
Les individus des deux groupes ont reçu un greffon intestinal segmentaire de 5 ± 0,,2 m après exérèse de 70% du grêle proximal. Tous les individus ont été sacrifiés au 8eme jour post-opératoire.
La survie des individus à J8 a été de 100% dans les deux groupes.
Tous les individus ont été nourris dès le premier jour post-opératoire, à volonté, avec l'aliment complet pour porcelets de la société SAS BERMOND
ALIMENT BETAIL composé des ingrédients suivants : blé, orge, tourteaux de soja, petites graines et enveloppes de céréales, oléagineux, pulpes de betteraves, maïs, phosphate bicalcique, pois, prémélange d'additifs, huile végétale, carbonate de calcium, maxid, thréonine, lysine, sel, méthionine. Les teneurs des différents éléments étant : protéine brute 17,9 %, matières grasses brutes 1 ,3 %, cellulose brute 4,4 %, cendres brutes 5,5%, lysine 11 ,0 g/Kg, vitamine A 9 000 Ul/Kg, vitamine D3 2 000 Ul/Kg, vitamine E 20 Ul/Kg, cuivre (sous forme sulfate) 100 mg/Kg et avilamycine 30 mg/Kg.
Les paramètres étudiés à l'incision (TO) et au moment du sacrifice au 8ème jour post opératoire (T1) ont été les taux plasmatiques des acides aminés et l'histologie de l'intestin transplanté.
B/ Préparation de l'échantillon
Des échantillons de sang ont été prélevés chez tous les individus avant transplantation. Les prélèvements ont été effectués en utilisant une seringue connectée à un cathéter placé dans Ia veine jugulaire externe droite. Le volume de chaque échantillon était de 4 ml. La séparation de la fraction plasmatique et des globules rouges a été effectuée par centrifugation. Ces échantillons correspondaient aux échantillons de référence. Après greffe, des échantillons de sang ont été prélevés au 8ème jour postopératoire. Les prélèvements ont été effectués en utilisant une seringue connectée au cathéter veineux central placé dans la veine jugulaire externe lors de la greffe. Le volume de chaque échantillon était de 4 ml. La séparation de la fraction plasmatique et des globules rouges a été effectuée tel que décrit précédemment. Ces échantillons correspondaient aux échantillons tests. Ils ont été congelés à -8O0C en attendant le dosage des acides aminés.
C/ Mesure de la concentration des marqueurs
Après prélèvement des échantillons avant et après greffe tel qu'effectué précédemment, la concentration de la citrulline, de la taurine, de l'aspartate et de la phénylalanine a été mesurée dans chacun des échantillons.
Le dosage de la citruline, phénylalanine, l'acide aspartique et la taurine dans les liquides biologiques a été réalisé par Chromatographie Haute Pression (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) tel que décrit dans l'article de PIRAUD Monique et al. « Ion pairing, reversed phase liquid chromatography/ electrospray ionization mass spectrométrie analysis of 76 underivatized amino acids of biological interest: a new tool for diagnosis of inherited disorders of amino acids metabolism ». Rapid Com Mass Spectrometry, 2005; 19lμ: 1587-1602. [7]
Les réactifs utilisés pour le dosage étaient :le méthanol HPLC grade et l'acétonitrile provenant de la société CARLO-ERBA (Val de Breuil - France), La L-citruline et l'acide tridécafluoraheptanoique (TDFHA) provenant de la société SIGMA-ALDRICH (L1ISLE D1ABEAU CHESNES -St QUENTIN
FALLAVIER- France). Les standards internes de référence utilisés étaient la
DL- Alanine (2,3,3-D4), l'isotope stable deutéré de l'alanine, la phenylalanine
(noyau D5) et l'acide L-aspartique (2,3,3-D3), provenant de la société CAMBRIDGE ISOTOPE LABORATORY (Andover, MA, USA). L'eau stérile
(Versol-Laboratoires AGUETTANT - LYON -France) a été utilisée pour la préparation des réactifs en solution aqueuse.
Dans un premier temps, les prélèvements ont été déprotéinés par Chromatographie Liquide à Haute Pression en milieu éthanolique pour doser les acides aminés libres. Grâce à un système automatisé de prélèvement et d'injection (AGILENT - PARIS-France) la chromatographie des acides aminés applique le principe de chromatographie par appariement d'ions. La colonne possédait une phase stationnaire de type QS UPTISPHERE 120 A, 3 μm BP2, 50 x 2 mm (UP3 BP2#5QS Interchrom, Interchim, Montluçon, France). Les gradients qui ont été appliqués (eau - TDFHA et Acétonitrile) étaient identiques à ceux divulgués dans l'article de Monique Piraud et al. [7]
Après la séparation des aminoacides par chromatographie HPLC telle que décrite précédemment, les analyses par spectrométrie de masse en tandem ont été réalisées au moyen d'un spectromètre de masse API 3000 triple quadrupole (Sciex Applied Biosystems, Toronto, Canada), le logiciel d'acquisition des résultats correspondant à la version 1.4.1. Les transitions spécifiques (des acides aminés non-isotopiques) et celles des standards de référence ont été utilisées en mode positif et leurs paramètres optimaux d'obtention ont été appliqués à chaque molécule. L'analyse simultanée de ces transitions a permis la mise en place d'une méthode d'analyse qualitative et quantitative des aminoacides. Les limites des valeurs de quantification pour chaque molécule étaient compatibles avec leur dosage dans le plasma, l'urine et le liquide céphalorachidien (LCR) grâce à la calibration préalable des données par une droite d'étalonnage pour chaque série d'analyses. Celles-ci ont fait l'objet d'un contrôle de qualité interne et externe (national et international) pour vérifier la conformité des résultats obtenus et le bon fonctionnement de l'équipement. Les coefficients de variation (CV) des résultats obtenus étaient inférieurs ou égaux à 5 % en répétitivité et reproductibilité.
Cette méthode a été choisie car elle permet de doser 76 aminoacides simultanément avec une plus grande précision, plus rapidement (16 minutes de chromatographie et de détection par spectrométrie de masse) et plus économiquement que la méthode de séparation sur colonne échange d'ion. En effet, la séparation sur colonne échange d'ion est suivie d'une dérivation postcolonne avec la ninhydrine, cette technique nécessitant un temps de 120 minutes de chromatographie par prélèvement.
Exemple 2 : Détermination de la concentration de référence pour chaque marqueur.
La détermination de Ia concentration de référence a été effectuée de deux manières lors des expériences.
Une première méthode de détermination de la concentration de référence pour chaque individu et pour chaque marqueur a été faite telle que présentée à l'exemple 1. Elle correspond au prélèvement avant greffe (TO) d'un échantillon liquide pour chaque individu puis mesure pour chaque marqueur de la valeur de la concentration dans chaque échantillon avant greffe.
Une seconde méthode a été utilisée durant nos expériences afin de déterminer la concentration de référence pour chaque marqueur. Celle-ci correspond au prélèvement d'un échantillon liquide tel que décrit à l'exemple 1 chez plusieurs individus sains. Après prélèvements, une mesure de la concentration telle que décrit à l'exemple 1 de chaque marqueur dans chaque échantillon a été effectuée. Les différentes mesures de concentration de chaque marqueur ont été ensuite normalisées. Les valeurs de référence selon la première méthode utilisée pour les individus testés à l'exemple 1 sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : concentrations de référence de chaque marqueur pour chaque individu de l'exemple 1
Exemple 3 : détermination des variations seuils discriminants
La détermination des variations seuils discriminantes de chaque marqueur a été effectuée par l'établissement de courbes (ROC) construites à partir des différents seuils étudiés puis par la recherche du seuil offrant le meilleur compromis de la sensibilité (Se) et de la spécificité (Sp) : maximisation de l'indice de Youden (Se + Sp -1). 1) Pour chaque acide aminé, on a calculé la valeur absolue de la différence entre TO et T1 : valeur à T1 - valeur à TO
2) Pour chaque seuil de variation étudié, on a calculé la sensibilité, spécificité, la valeur prédictive positive et négative :
La sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive, la valeur prédictive négative sont telles que définies précédemment.
Les taux plasmatiques de quatre acides ont été significativement corrélés via les calculs de la sensibilité, la spécificité, Ia valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative à la survenue du rejet
La sensibilité de chaque marqueur a été déterminée par la probabilité que la valeur de la variation entre T1 et TO soit supérieure au seuil si l'animal appartient au groupe rejet. La spécificité de chaque marqueur a été déterminée par la probabilité que la valeur de la variation entre T1 et TO soit inférieure ou égale au seuil si l'animal appartient au groupe absence de rejet.
La valeur prédictive positive de chaque marqueur a été déterminée par la probabilité que l'animal appartienne au groupe rejet si la valeur de la variation entre T1 et TO est supérieure au seuil.
La valeur prédictive négative de chaque marqueur a été déterminée par la probabilité que l'animal appartienne au groupe absence de rejet si la valeur de la variation entre T1 et TO est inférieure ou égale au seuil.
3) établissement du score
Le score a été établi à partir de la variation de plusieurs acides aminés en comptabilisant 1 point si la valeur est supérieure au seuil et 0 point si la valeur est inférieure ou égale au seuil.
Dans le cas d'un score construit à partir de 4 acides aminés (taurine, phénylalanine, aspartate, citrulline), avec les seuils suivants : taurine : seuil = 20 ; phénylalanine : seuil = 40 ; aspartate : seuil = 21 ; citrulline : seuil = -26 : -animal n°i avec les valeurs taurine = 15; phénylalanine = 45; aspartate = 25; citrulline = -5: score = 3,
-animal n°j avec les valeurs taurine = 15; phénylalanine = 32; aspartate = 25; citrulline = -35 : score = 1 ,
4) Calcul des aires sous la courbe (AUC)
On a construit un modèle de régression logistique à l'aide du logiciel SAS provenant de l'entreprise SAS Institute Inc et décrit dans SAS/STAT Software:
"Changes and enhancements through release 6.11". In. 6.11 éd. Cary, NC, USA; 1996. [6]. Ce modèle comporte pour variable dépendante la variable rejet et pour variable indépendante Ie score tel qu'établi au point 3).
Soit Y la réponse d'un animal notée 0 en l'absence de rejet et 1 en présence de rejet, soit x le vecteur des variables indépendantes, soit π la probabilité de la réponse à modéliser, le modèle logistique s'écrit selon la formule suivante :
p -Λ. dans laquelle α est l'intercepte et β' est le vecteur des paramètres.
Soit N le nombre total d'observations, soit t le nombre total de paires de réponses, soit nc Ie nombre de paires concordantes, nd le nombre de paires discordantes et t - nc - nd le nombre de paires ex-aequo. L'aire sous la courbe (AUC) est calculée de la façon suivante :
C = (nc + 0,5 (t - nc - nd)) / 1
L'établissement de cette courbe nous a permis de calculer les différentes valeurs statistiques pour la réalisation de la présente invention.
La valeur de la variation seuil discriminante de chaque marqueur, la sensibilité la spécificité, la valeur prédictive positive ainsi que sa valeur prédictive négative sont présentées dans le tableau 2.
Tableau 2 : variation seuil discriminante, sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive, valeur prédictive négative de chaque marqueur.
Exemple 4 :Calcul de la différence pour chaque marqueur, affectation d'un score pour chaque marqueur et sommation des scores.
Le calcul de la différence de concentration entre la concentration de référence et la concentration après greffe de chaque marqueur pour les individus de l'exemple 1 a été effectué par calcul de la valeur absolue de la différence entre TO et T1 : valeur à T1 - valeur à TO
La concentration pour chaque individu après greffe est présentée dans le tableau 3
- concentration non mesurée
Tableau 3 : concentration pour chaque individu et chaque marqueur après greffe.
L'affectation du score pour chaque individu a été effectuée en fonction de la comparaison pour chaque marqueur de la valeur absolue de la différence avec le taux discriminant. Lorsque la valeur absolue de la différence d'un marqueur était supérieure à son taux discriminant un score de +1 a été affecté. Lorsque la valeur absolue de la différence d'un marqueur était inférieure à son taux discriminant un score de +0 a été affecté. Cette affectation du score a été faite pour chaque individu et pour chaque marqueur. Après affectation du score par marqueur la somme des scores par individu a été faite afin de donner le score total. Exemple 5 : Vérification de la corrélation entre la sommation des scores et le rejet.
Cette expérience a été menée à partir des individus de l'exemple 3. Une histologie intestinale a été effectuée sur un prélèvement d'intestin avec un microscope Olympus BX41 à J8 pour chaque individu de l'exemple 1.
La classification communément admise du rejet intestinal est la suivante : pour le grade "indéterminé", les lésions sont habituellement minimes et il y a une augmentation des cellules en apoptoses mais avec moins de 6 apoptoses pour 10 glandes et peu voire pas, d'inflammation. Pour Ie rejet minime (grade 1), les cellules en apoptoses dépassent 6 pour 10 glandes et un infiltrat inflammatoire à prédominance mononuclée discret à modéré est observé. Dans le rejet modéré (grade 2), une augmentation des cellules en apoptose est observée. Les cellules en apoptose deviennent confluentes et peuvent aboutir à des destructions glandulaires et un infiltrat mononuclée modéré à sévère. Enfin dans le rejet sévère (grade 3) une destruction glandulaire plus importante avec des zones de disparition des glandes voire des érosions ou des ulcérations et un infiltrat inflammatoire marqué sont observés. Ces observations sont décrites dans l'article de Ruiz P et al. « Histological criteria for the identification of acute cellular rejection in human small bowel allografts: results of the pathology workshop at the VIII International Small Bowel Transplant Symposium ». Transplant Proc 2004;36:335-337 [8].
L'observation histologique des prélèvements des individus de l'exemple 1 n'a révélé aucune anomalie (normale) dans le groupe 1 tandis que tous les individus du groupe 2 ont présenté un rejet modéré à sévère du greffon.
La corrélation entre le rejet observé histologiquement et Ie score calculé ont été vérifiés tel que décrit précédemment.
La répartition des individus en fonction du score obtenu et le rejet éventuel de la greffe est présenté dans Ie tableau 4.
Tableau 4 : répartition des individus en fonction du score obtenu.
Tel que présenté dans le tableau 5, il a été vérifié et confirmé qu'un score supérieur ou égal à 2 pour un individu permet de prédire la présence d'un rejet de greffe dans 100% des cas.
' calcul des % par rapport au total général : 5/16 = 31 ,25% ; 3/16 = 18,75% ; 1/16 = 6,25%,... f calcul des % par rapport au total de la ligne
Tableau 5 : répartition du pourcentage des individus en fonction du score et du groupe
Exemple 6 : Etude de la concentration plasmatique de citrulline. 2
Cet exemple à été réalisé sur une population de cochons comme dans l'exemple 1.
Comme dans l'exemple 1 , deux groupes ont été formés :
- groupe 1 : 8 cochons ont reçu une autogreffe d'intestin, et - groupe 2 : 8 cochons ont reçu une greffe allogénique mais sans aucun traitement immunosuppresseur.
A/ Anesthésie des cochons.
Les cochons ont été anesthésiés pour la transplantation selon le protocole suivant : une prémédication intramusculaire a été pratiquée avec 20-25 mg/kg de kétamine (Imalgène 1000, marque déposée, 10 ml_, Mérial, Lyon, France), et 0,004-0,01 mg/kg de glycopyrrolate (Robinul V, marque déposée, 5 mL, Vétoquinol, Lure, France) ; induction avec du gaz isofluorane (AErran, marque déposée, Baxter SA, Maurepas, France) administré avec un masque. Les animaux ont été intubés en utilisant un laryngoscope et un tube endotrachéal (Hudson RCI, marque déposée, Sheridan/CF, ID 6, 0-7, 0mm) et ventilé mécaniquement (Modèle 2000 de ventilateur anesthésique Vétérinaire, Hallowell FC) (flux respiratoire : 15 - 20/min ; FIO2=30%). Pendant ces opérations, les cochons ont été perfusés par voie intraveineuse 50mL/kg de NaCI à 0,9% (B. Braun) et 65ml_/kg glucose 5% (glucose isotonique Aguettant, marque déposée, Aguettant, Lyon, France). Avant incision abdominale, un cathéter veineux a été introduit dans la veine jugulaire externe pour mesurer la pression veineuse centrale et perfuser.
La pression artérielle a été mesurée (SC 7000, Siemens, France) via un cathéter cervical inséré dans l'artère carotide.
Le rythme cardiaque ainsi que la saturation en oxygène ont été mesurées continuellement en utilisant un sphygmo-oxymètre avec un détecteur fixé à une gencive. (Modèle 9847 V, Nonin Médical Inc, Plumouth, UK).
B/ dommages ischémique due à la reperfusion in situ.
La technique d'ischémie intestinale in-situ utilisée dans le présent exemple dérive de celle décrite par Lauronen et al. "Effects of extrinsic denervation with or without ischemia-reperfusion injury on constitutional mucosal characteristics in porcine jejunoileum". Dig Dis Sci 2001 ;46(3):476-85 [ 9 ] et de Pakarinen MP, Pirinen P, Lauronen J, Raivio P, Kuusanmaki P, Halttunen J. Effects of transection and extrinsic denervation and a model of autotransplantation of the porcine jejunoileum on cholestérol biodynamics. J Ped Surg 2003;38(11):1585- 90 [10]. L'iléon a été sectionné de manière transversale coté proximal à 10 cm de la valve iléocécale, au sommet de la courbe formée par l'extrémité de l'artère mésentérique supérieure. Le mésentère correspondant a été sectionné. L'artère mésentérique supérieure a été libérée de la branche duodénale à la seconde branche jéjunale. Le jéjunum correspondant à la première artère jéjunale a été sectionné au niveau de la première artère jéjunale, à environ 30 cm distalement du ligament de Treitz. le mésentère correspondant a été sectionné de manière transversale jusqu'à l'origine de la première artère jéjunale. Toutes les connections nerveuses et lymphatiques du jéjunum, sauf les vaisseaux mésentériques supérieurs, ont été section nées. L'artère mésentérique supérieure, la veine mésentérique supérieure et les branches coliques, provenant du tronc principal des vaisseaux mésentériques, ont été squelettisés sur une longueur d'au moins 2 cm (entre l'origine de l'artère duodénale et la seconde artère jéjunale). Ainsi, les vaisseaux mésentériques squelettisés et leurs branches coliques sont restés les seules connections maintenant la perfusion sanguine du jéjunoiléon.
Après l'injection intraveineuse de 100 Ul/kg de poids corporelle d'héparine (Heprin Choay marque déposée), les vaisseaux mésentériques squelettisés ont été clampés afin de produire une ischémie jéjunale. supérieure a été clampée au niveau de l'origine proximale de l'artère duodénale. L'artère duodénale et l'artère colique ont été clampées séparément au niveau de leurs origines afin de prévenir le passage de la solution de conservation dans la circulation systémique tout en prévenant le reflux artériel dans la circulation jéjunale. La veine mésentérique supérieure a été clampée distalement de la veine colique, permettant un flux sanguin à travers la veine colique. Par la suite, l'artère mésentérique supérieure a été cathétérisée en aval du clamp, via la première artère jéjunale. Le jéjunum ainsi isolé a été lavé avec 1000 mL de solution froide (4°C) d'IGL-1 (Institut Georges Lopez, Lyon, France). Une petite incision de la veine mésentérique supérieure a été faite en amont du clamp pour permettre la sortie de l'effluent. Après l'ischémie froide, la petite incision dans la veine mésentérique supérieure a été refermée par une suture de prolène 6-0. La première artère jéjunale a été liée à son origine et le clamp vasculaire a été enlevé, permettant une reperfusion du jéjunoiléon. La longueur jéjunale a ensuite été mesurée le long des bords antimésentériques à partir de l'extrémité proximale vers l'extrémité distale. Soixante-dix pour cent du jéjunoiléon proximal a été réséqué. De ce fait, environ 5 m du petit intestin incluant 30 cm du jéjunum proximal et les 30% du grêle distal sont restés in situ. La continuité intestinale a été rétablie en réanastomosant le jéjunum à l'iléon. Les brèches mésentériques ont ensuite été refermées.
C/ Allogreffe.
Chez le donneur, l'artère et la veine mésentérique supérieures ont été disséqués au niveau des branches coliques. Les branches coliques ont été liées et sectionnées. Le petit intestin proximal a été sectionné à environ 30 cm en aval du ligament de Treitz. L'iléon a été sectionné à 10 cm en amont de la valve iléocaecale, au sommet de la courbe formée par l'extrémité de l'artère mésentérique supérieure. Le mésentère correspondant a été sectionné. Après l'injection intraveineuse d'héparine (Héparine Choay, marque déposée, 100 Ul/kg), 800 mL/kg de sang du donneur ont été prélevés pour être utilisés pour une transfusion chez le receveur. Ensuite, jéjunoiléon isolé a été lavé avec 1000 mL de solution IGL-1 froide (4°C) par l'aorte sous-rénale. Le greffon a alors comporté le jéjunum et l'iléon en totalité, l'artère mésentérique supérieure en continuité avec un segment d'aorte abdominale, la veine mésentérique supérieure en continuité avec la veine porte. Le greffon a été temporairement conservé dans une solution froide (4°C) d'IGL-1. Le contenu du grêle n'a pas été lavé. Après reperfusion, le greffon a été réduit à partir de l'extrémité proximale du segment jéjunoiléal, laissant environ 4,5 m pour prendre en compte les 30 cm de jéjunum proximal et les 10 cm d'iléon natifs laissés chez le receveur.
Chez le receveur, le petit intestin proximal a été sectionné à environ 30 cm en aval du ligament de Treitz et l'iléon a été sectionné à 10 cm en amont de la valvule iléocaecale. L'iléojéjunum isolé a été réséqué. La totalité du colon et du rectum du receveur ont été conservés. L'allogreffe a été ensuite implanté. L'aorte abdominale du greffon a été anastomosée à l'aorte abdominale sous- rénale du receveur par une suture au prolène 6-0. La veine mésentérique supérieure a été anastomosée à la veine cave inférieure sous-rénale. La continuité digestive a été rétablie avec des anastomoses du jéjunum et de l'iléon. Les brèches mésentériques ont été refermées Dans les deux groupes, le mésentère a une apparence blanchâtre avant la fermeture de l'abdomen.
D/ Soins post-opératoires. A la fin de l'intervention, une dose unique intramusculaire de 4 mg/kg d'acide Tolfenamic (Tolfedine 4%, marque déposée, Vétoquinol, Lure, France) a été administrée à tous les animaux pour l'analgésie postopératoire et une dose unique intramusculaire de 15 mg/kg d'amoxycillin à longue durée d'action (Clamoxyl L.A, marque enregistrée, Pfizer) a été administrée comme traitement prophylactique antimicrobien. Les animaux ont été extubés après l'opération et placés dans des cages métaboliques avec des lampes chauffantes. Chaque animal a reçu une 25OmL de glucose 5% en intraveineuse le premier et le deuxième jour après l'opération en utilisant le cathéter veineux central laissé dans la veine jugulaire externe. Les animaux ont été nourris à partir du premier jour post opératoire avec les aliments tels que présenté dans l'exemple 1. Les animaux ont été euthanasiés au 8ème jour postopératoire avec une dose intraveineuse de pentobarbital de sodium (Dolethal, marque enregistrée, Vétoquinol SA, Lure, France) après une laparotomie sous anesthésie générale à l'isoflurane.
E/ Résultats
Le temps de survie, le poids, l'apparence des selles et de l'intestin 8 jours après transplantation ont été observés comme dans l'exemple 5.
La concentration plasmatique de la citrulline a été mesurée à TO et T1 comme dans l'exemple 1.
Le poids moyen mesuré au moment de la transplantation était de 25.8 ± 7.6 kg dans le groupe 1, et 20.6 ± 2.7 kg dans le groupe 2. La longueur du petit intestin restant était de 5 ± 0,2m dans les deux groupes.
Tous les animaux ont survécu jusqu'à la fin de l'étude, le taux de survie au 8ème jour était donc de 100%.
Une variation du poids des cochons dans chaque groupe a été observée :
- dans le groupe 1 , une perte de poids allant jusqu'à 10% et un gain de poids allant jusqu'à 6% a été observé, - dans le groupe 2, une perte de poids allant de 10 à 15% a été observée.
Les observations histologiques au 8ème jour après transplantation de l'intestin dans le groupe 1 étaient normales sans signe de rejet.
Les observations histologiques au 8ème jour après transplantation de l'intestin dans le groupe 2 présentaient des signes de rejet de greffe chez tous les individus. Le niveau de rejet de greffe était situé entre 3 et 4 pour tous les individus de ce groupe. Le petit intestin et le colon natif ne présentaient aucun signes histologiques anormales.
La concentration plasmatique moyenne de la citrulline avant greffe et au 8eme jour pour chaque groupe d'individus est représentée dans le tableau 6 suivant :
Tableau 6 : moyenne de la concentration plasmatique de citrulline dans chacun des deux groupes.
Les résultats présentés dans le tableau 6 décrivent avant une différence significative de la concentration plasmatique de la citrulline pour les individus du groupe 2 au 8ème jour. La concentration plasmatique de la citrulline est donc significativement corrélée avec la survenue du rejet de greffe d'intestin.
Cette concentration présente donc un pouvoir discriminant sur la survenue de rejet de greffe d'intestin.
Exemple 7 : Application du procédé de l'invention chez l'être humain.
1) nombre de patients Le calcul du nombre de patients inclus, c'est-à-dire utilisés dans le présent test, est basé sur la citrulline car celle-ci a été associée au risque de rejet comme dans l'exemple 6 précédent.
La citrulline a été caractérisée par un pouvoir discriminant de la survenue de rejet inférieur à celui d'autres marqueurs (taurine, phénylalanine, aspartate), un nombre de patients basé sur la citrulline avec un risque β de 20% permet de mettre en évidence des associations significatives pour les autres marqueurs avec une puissance statistique suffisante (au moins supérieure à 80%).
Le nombre de sujets à inclure est calculé avec un risque α de 5% en bilatéral et un risque β de 20% et se base sur 3 études. L'étude précédente de l'auteur montre une baisse de plus de 40% de la citrulline chez les cochons allogreffés par rapport aux cochons autogreffés où un effectif de 16 était suffisant.
L'étude de Gondolosi et al Gondolesi G et al. « The value of plasma citrulline to predict mucosal injury in intestinal allografts ». Am J Transplant. 2006 Nov;6(1 1):2786-90 [1 1] réalisée chez des hommes transplantés, retrouve une baisse de 40% des taux de citrulline en cas de lésions de la muqueuse intestinale (23+/-15) par rapport aux patients sans lésion muqueuse (38+/-23).
Sous cette hypothèse, en choisissant un écart-type moyen de 20, un effectif minimum de 60 patients est nécessaire pour mettre en évidence un tel écart. L'étude de David Al et al. « An association of lower sérum citrulline levels within 30 days of acute rejection in patients following small intestine transplantation. » Transplant Proc. 2006 Jul-Aug;38(6):1731-2 [12] , il a été observé une baisse de 35% du taux de citrulline en cas de rejet c'est-à-dire 18,8 en période libre versus 12,4 dans le mois précédant le rejet. Le nombre de sujets nécessaire est alors de 30 avec un écart-type de 6.
En conséquence, un effectif de 50 patients est choisi pour trois raisons :
- La baisse des taux de citrulline pourrait être plus importante que dans l'étude de Gondolesi et al. car la comparaison ne porte pas sur la présence ou pas de lésions muqueuses intestinales mais sur la survenue ou pas d'un rejet, donc le nombre de patients à inclure peut être inférieur à 60.
- Une sécurité par rapport à l'étude de David et al. [12] est prise au cas où la différence observée est plus faible, un effectif supérieur à 30 est nécessaire. - Les groupes à comparer dans notre étude (rejet versus non rejet) ne sont pas d'effectifs identiques, ce qui entraîne une perte de puissance statistique. D'après les données de la littérature, le taux de rejet observé est de 60% environ.
2) Application du procédé.
Le procédé de l'invention est appliqué à un échantillon liquide provenant d'un être humain choisi dans le groupe des cinquante individus tel que défini précédemment.
Le prélèvement de l'échantillon liquide est effectué par prise de sang. La concentration de référence de chaque marqueur est celle correspondant à la mesure faite immédiatement avant la greffe intestinale ou après la greffe, mais en l'absence de rejet confirmée histologiquement.
La mesure de la concentration de chaque marqueur est effectuée par la technique citée précédemment dans l'exemple 1 c) . Le calcul de la différence pour chaque marqueur est effectué par simple soustraction.
L'affectation du score par marqueur est effectué telle que décrit dans l'exemple 4.
La sommation des scores par marqueur est effectué telle que décrit dans l'exemple 4.
La corrélation des scores avec le rejet de greffe est effectué telle que décrit dans l'exemple 5. La détection du rejet de la greffe est observée quand la somme des scores des marqueurs est supérieur à 2.
La mise en œuvre du procédé de l'invention permet donc de mettre en évidence 100% des rejets de greffe d'intestin comme présenté dans l'exemple 2 et donc est adapté à une utilisation pour le diagnostique de rejet de greffe.
Listes des références
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[2] LC. Lutgens et al. « Monitoring myeloablative therapy-induced small bowel toxicity by sérum citrulline concentration : a comparaison with sugar permeability tests ». Cancer 2005 ; 103 :191-9.
[3] PA. Pappas et al. « Sérum citrulline and rejection in small bowel transplantation : a preliminary report ». Transplantation 2001 ; 72 : 1212- 16.
[4] PA. Pappas et al « An analysis of the association between sérum citrulline and acute rejection among 26 récipients of intestinal transplant. » Am J Transplantation 2004 ;4 :1124-32
[5] Le Boucher J, et al. « Amino acid détermination in biological fluids by automated ion-exchange chromatography : performance of Hitachi L-
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection in vitro du rejet d'une greffe d'intestin comprenant les étapes de : a) mesure de la concentration dans un échantillon liquide d'au moins deux marqueurs choisis dans le groupe comprenant : l'aspartate, la citrulline, la taurine et la phénylalanine, b) calcul de la différence pour chaque marqueur desdites concentrations mesurées à l'étape a) avec une concentration de référence dudit marqueur, c) comparaison pour chaque marqueur de la valeur absolue de ladite différence avec une variation seuil discriminante, d) affectation d'un score pour chaque marqueur, en fonction de ladite comparaison de la manière suivante : si la comparaison révèle que ladite valeur absolue du résultat du calcul effectué à l'étape b) est supérieure ou égale à la variation seuil discriminante, un score de 1 est affecté, si ladite valeur absolue du résultat du calcul effectué à l'étape b) est inférieure à la variation seuil discriminante, un score de 0 est affecté, et sommation desdits scores, une sommation supérieure à 2 indiquant un rejet de greffe.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel à l'étape a) on mesure la concentration d'au moins trois desdits marqueurs.
3. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel on mesure à l'étape a) la concentration des quatre marqueurs.
4. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel la variation seuil discriminante de l'aspartate est comprise dans la gamme allant de 18 à 24 μmol/L , la variation seuil discriminante de taurine est comprise dans la gamme allant de 17 à 23 μmol/L, la variation seuil discriminante de citrulline est comprise dans la gamme allant de 22 à 30 μmol/L et la variation seuil discriminante de phénylalanine est comprise dans la gamme allant de 34 à 46 μmol/L.
5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la mesure de l'étape a) est effectuée après greffe, et dans lequel la concentration de référence de l'étape b) correspond à une mesure de la concentration dudit marqueur avant greffe.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la mesure de la concentration d'au moins un des marqueurs est réalisée par une des techniques suivantes : Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC), l'immunodosage, la chromatographie gazeuse en phase inverse avec une précolonne de dérivation avec différents réactifs par exemple du 9-fluorenyméthylchloroformate, du phénylisothiocyanate, du chlorure de diméthylaminaphthalènesulfonyle, du chlorure de diméthylaminoazobenzenesulfonyle et/ou du 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa- 1 ,3-diazoie, une chromatographie échangeuse d'ions avec une post colonne de dérivation utilisant de OPA et/ou de ninhydrine, une chromatographie échangeuse d'ions automatisée utilisant le dispositif Hitachi L-8500A.
7. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour le diagnostique d'un rejet de greffe intestinal.
8 . Utilisation d'un kit, comprenant des moyens de mesure de la concentration d'au moins deux marqueurs choisis dans le groupe comprenant la taurine, l'aspartate, la phénylalanine et la citrulline pour la détection d'un rejet de greffe d'intestin.
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