EP2185690A2 - Propagation of primary cells and use thereof - Google Patents

Propagation of primary cells and use thereof

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Publication number
EP2185690A2
EP2185690A2 EP08801277A EP08801277A EP2185690A2 EP 2185690 A2 EP2185690 A2 EP 2185690A2 EP 08801277 A EP08801277 A EP 08801277A EP 08801277 A EP08801277 A EP 08801277A EP 2185690 A2 EP2185690 A2 EP 2185690A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
cell
cells according
primary cells
gene
Prior art date
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Ceased
Application number
EP08801277A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Adrianus J. C. M. Braspenning
Stefan Holder
Heiner KÜPPER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PVH Prinz Von Hohenzollern Capital GmbH and Co KG
Original Assignee
Medicyte GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medicyte GmbH filed Critical Medicyte GmbH
Publication of EP2185690A2 publication Critical patent/EP2185690A2/en
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development

Definitions

  • the invention relates to a method for propagation or
  • cell lines have established themselves, these are cells that can propagate indefinitely on appropriate nutrient medium and are immortal.
  • tumor cells or tumor-like cells as well as well-known HeLa cells - cervical carcinoma cell line, COS cells, HEK-293 cells - kidney, Chinese hamster ovary (CHO) cells, HEp-2 - human epithelial laryngeal carcinoma cell line and many others such cell lines are described, for example, in EP833934 (Crucell).
  • Such cell lines are used, for example, for drug testing.
  • Table 1 Properties of cells with increased duplication capacity compared to other cell systems
  • the actual cell division ability depends on the age of the cell donor, the older the donor, the more divisions those cells have made.
  • the cells to be examined are overlaid with a special agarose (soft agar); Cells that have lost their natural contact inhibition ability grow into the soft agar as colonies. This is often referred to as transformation and is a prerequisite for tumorigenesis. This usually requires further steps, such as Cell immortalization. Natural cells have no ability to grow in soft agar.
  • a special agarose soft agar
  • Xenografts are not immunologically rejected and can grow into tumors, if they are malignant tumor cells.
  • Therapies for the treatment of degenerative diseases include e.g. Heart failure, liver cirrhosis, Parkinson's disease and insulin-dependent diabetes.
  • primary cells is understood to mean explants derived directly from body fluids or from body tissues with normal, ie not degenerated, cells of multicellular organisms such as, for example, humans Passage: Primary cells have natural differentiation properties and are mortal.
  • type I cells is used in the context of
  • Invention refers to such primary cells that can be propagated in culture, but after a few doublings cease to grow and die off.
  • Type I cells make up a small number of primary cell types. This mortality of cells severely limits their
  • type I cells examples are endothelial cells (vascular cells), keratinocytes (skin cells) or fibroblasts (connective tissue cells).
  • type II cells refers to those primary cells which, from the outset, have been able to arrest their ability to divide in the culture and therefore can not be multiplied.Type II cells form the vast majority of primary cells in multicellular organisms, such as humans. Examples of such type II cells are cardiomyocytes (heart muscle cells), - islet cells (insulin-producing cells of the pancreas), neurons (nerve cells) and others
  • the so-called extended life span is described, whereby the ability of the primary cells to divide for the development of cancer by the introduction of viral oncogenes such as SV40 TAg, adenovirus ElA, HPV E6 and E7 or cellular oncogenes such c-ras and c-myc is increased.
  • viral oncogenes such as SV40 TAg, adenovirus ElA, HPV E6 and E7 or cellular oncogenes such c-ras and c-myc.
  • the method attempts to immortalize the cells beyond the "extended life span" in order to investigate an influence of the viral or cellular genes on carcinogenesis.
  • telomere loss by, for example, telomerase have one unlimited divisibility or
  • the object is achieved by a method of propagating primary cells, wherein human primary cells in the following steps: a. isolated, bl. ) is functionally introduced into the cell with at least one proliferation gene or its gene product and / or b2. ) at least one cellular factor, one 7
  • Cell division arrest induced, inactivated, c.) The cells are cultured and / or passaged and d.) Harvested, wherein the harvested cells have no tumor properties.
  • more than three additional passages may be performed compared to untreated primary cells, more than five additional passages, preferably 20-40 additional passages.
  • Limiting cell divisions to 20-40 additional duplications eliminates the unwanted changes that are inevitable in immortalized cells after more than 60 duplications.
  • the invention relates to such a method with the steps a.) - d. ), wherein in step c.) Up to 20-40 passages can be achieved without the cells obtained have tumor properties.
  • the method according to the invention particularly advantageously ensures that the cells obtained do not assume any properties of tumor cells, in particular of malignant tumor cells, such as growth in soft agar or tumor growth in vivo (the growth of tumors in xenograft animal models).
  • tumor property does not refer to the ability of the enhanced duplication capacity of the target cells by the method of the invention.
  • no own immortalization of the cells obtained is achieved by the method according to the invention. Therefore, the method of the invention allows the accumulation or proliferation of obtained non-immortalized cells.
  • the cultivation is carried out in a manner known to the person skilled in the art
  • the method according to the invention allows the advantageous enrichment and propagation of primary cells with extended duplication capacity, which are essentially genetically unchanged as well as primary cells after cultivation, while most cell lines have many genetic alterations.
  • harvesting means that the cells obtained can be removed or recovered continuously or discontinuously from the multiplication and can be used and used in any desired units (amounts, quality, etc.).
  • proliferation or accumulation of primary cells means the provision of "cells with increased doubling capacity" (see Comparative Table 1), where the method feature is bl.) Or b2. ) in claim 1 lead to a structural change of primary cells of the starting material.
  • the extended doubling capacity advantageously allows the Generation of a significantly increased amount of cells.
  • a proliferation gene is one that enhances cell division and allows for a limited extended cell division capacity in the primary cell, with the likelihood of cell transformation or alteration of cell proliferation
  • the proliferation gene is non-immortalizing.
  • the proliferation gene is preferably selected from the group of viral proliferation genes: E6 and E7 of papillomaviruses such as HPV (human papilloma virus) and BPV (bovine papilloma virus); the large and small doses of polyomaviruses such as SV40, JK virus and BC virus; the proteins ElA and ElB of adenoviruses, EBNA proteins of Epstein Barr virus (EBV); and the proliferation gene of HTLV and herpesvirus Saimiri and their respective coding proteins or selected from the group of cellular proliferation genes, in particular the following classes of genes: myc, jun, ras, src, fyg, myb, E2F and Mdm2 and TERT (catalytic subunit of telomerase ), preferably the human telomerase h
  • said TAg (1-708 AS in the range of amino acids 1-121 and / or 137-708 is the transforming activity by means of point mutations, deletions and / or insertions, but with retention of the p53 binding domain ("bipartite domain") (Ruppert, 10
  • viral proliferation genes are preferred according to the invention; E6 and E7 of HPV or BPV are particularly preferred.
  • Proliferation genes of HPV types associated with malignant diseases can be used.
  • the best-known examples of high-risk papillomaviruses are HPV16 and HPV18, and other examples of the high-risk group are HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, and 82 but also the proliferation genes E6 and E7 can be used by so called "low risk" HPVs.
  • Well-known examples are the HPV types 6 and 11, other HPV types of the low-risk group are HPV 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, and 81.
  • Proliferation increase can be seen above all in the inactivation of the pRB pathway.
  • proliferation genes of different serotypes of one virus species or different virus species can be combined or even chimeric proliferation genes of different ones
  • Serotypes of a virus species or different virus species are produced and used.
  • one E6 domain in one chimeric gene may be derived from HPV 16 and another 11
  • proliferation genes may also be truncated or have one or more base changes without departing from the scope of the invention.
  • the proliferation genes mentioned above are preferred embodiments and are not intended to limit the invention.
  • the proliferation gene may also be the subject of a synthetic or engineered gene sequence.
  • Receptors are included or receptor-independent.
  • the aforementioned gene functions can also be transmitted via viral vectors in target cells. Examples are retroviral vectors, AAV vectors, adenovirus vectors and HSV vectors, to name just a few examples of vectors (review of viral vectors in: Lundstrom, K. 2004. Technol. Cancer Res.Treat. 3: 467-477 Robbins, PD and SC Ghivizzani 1998. Pharmacol Ther 80: 35-47).
  • “Functionally incorporated” in particular comprises the transfection of the target cells by means of at least one proliferation gene.
  • Expression of the aforementioned viral or cellular proliferation genes can be controlled by strong or weak constitutive promoters, tissue-specific promoters, inducible promoters (Meyer-Ficca, ML et al., 2004. Anal. Biochem. 334: 9-19), or the expression cassettes may be flanked by specific sequences for molecular excision systems. Examples are the Cre / Lox system (US Patent 4,959,317), the application of which results in the molecular removal of the expression constructs from the genome of the target cells.
  • the gene products of the proliferation genes can also be introduced functionally directly into the target cell as such or by means of a fusion protein.
  • they are messenger proteins such as VP22, HIV TAT (Suzuki et al., 277 J. Biol. Chem. 2437-2443 2002 and Futaki 245 Int. J. Pharmaceut 1-7 (2002), (HIV) REV, Antennapedia Polypeptide (WO97 / 12912 and WO99 / 11809) or Penetratin (Derossi et al., 8 Trends Cell Biol., 84-87 (1998), Engrailed (Gherbassi, D. & Simon, HHJ Neural Transm. Suppl. Cells 728-732 (2000)) or Hoxa-5 (Chatelin et al., 55, Mech Dev. 111-117 (1996)), a polymer of L-arginine or D-arginine amino acid residues 13
  • At least one cellular factor which induces a cell division arrest is inactivated means that, for example, cell division arrest is activated in the course of the senescence program (reviewed in: Ben Porath, I. and RA Weinberg 2005. Int Biochem., Cell Biol.
  • cell division arrest which is activated as part of the differentiation program in cells
  • cardiac muscle cells that their ability to divide shortly after birth, which inter alia by expression of Cell cycle inhibitors such as pl ⁇ , p21, p27 are regulated (Brooks, G., et al., 1998. Cardiovasc. Res. 39, 301-311; Flink, IL et al., 1998. J. Mol. Cell Cardiol. Walsh, K. and Perlman, H. 1997. Curr Opin. Genet. Dev. 7, 597-602) 14
  • the protein p53 which is important for controlling the cell cycle, as well as all proteins which bind directly to p53, upstream (subsequently upstream) and / or downstream (downstream) downstream
  • the protein pl ⁇ / INK4a which is important for the control of the cell cycle, as well as all proteins which are directly binding to pl6 / INK4a, upstream (subsequently upstream) and / or downstream (downstream) factors of this p1 pathway, to the target Shapiro, GI et al., 2000. Cell Biochem., Biophys., 33: 189-197)
  • the protein pRb. which is important for the control of the cell cycle, can generally be obtained within the scope of the invention or the others
  • upstream members of the pRb family (eg plO7, pl30) as well as all proteins directly binding to members of the pRb family, upstream (hereinafter upstream) and / or 15
  • Downstream (hereinafter) downstream factors of this pRb pathway are switched off to achieve the goal of extended cell division capacity (overlooked via the pRb pathway in: Godefroy, N. et al., 2006 Apoptosis 11: 659-661, Seville, LL et al 2005. Curr. Cancer Drug Targets, 5: 159-170).
  • cellular factors e.g. p53, pRB, pI6, etc.
  • p53, pRB, pI6, etc. may e.g. by expression of dominant negative mutants of the respective factors (Herskowitz, I. 1987. Nature 329: 219-222; Küpper, JH, et al., 1995. Biochimie 77: 450-455), by inhibiting gene expression of these factors using antisense oligonucleotides (Zon, G. 1990. Ann.NYAcad. Sci 616: 161-172), RNAi molecules (Aagaard, L. and JJ Rossi, 2007. Adv.Drug Deliv. Re 59: 75-86; Chakraborty, C 2007. Curr. Drug Targets 8: 469-482),
  • the inactivation can also be effected by the action of specific antibodies (eg single-chain antibodies, intra-bodies, etc., overview in: Leath, CA, III, et al., 2004. Int. J. Oncol., 24: 765-771; Stocks, MR 2004. Drug Discov., Today 9: 960-966). Inactivation may also be accomplished by using chemical inhibitors of the cellular factors, for example, by using kinase 16
  • kinase inhibitor is the substance imatinib (Gleevec ®). This achieves a reduction in cell proliferation.
  • Imatinib is a specific inhibitor that blocks the activity of tyrosine kinase ABL in diseased cells and thus suppresses a pathologically increased multiplication of mutated blood stem cells.
  • Cells with extended doubling capacity can be produced universally by all type I and type II cells.
  • Cells with increased duplication capacity are suitable for basic biomedical research, the development and review of drugs, cosmetics, food and textile additives.
  • the invention therefore also relates, in a preferred embodiment, to a method for producing an assay comprising the following steps: a.) Providing a carrier material, b.) Immobilizing or fixing at least one harvested cell according to the method according to the invention on this carrier material and bringing it into contact this cell from b. ) with an analyte.
  • the invention relates to the use of the cells obtained according to the inventive method for carrying out 18
  • chemical substances e.g., synthetic or native substances and their mixtures
  • drugs drugs, cosmetics, cells.
  • the targets of such analytes may be arbitrary, e.g. DNA, RNA, proteins, lipids, sugars, etc.
  • the activity of one or more targets is often measured, for example, the reaction of one or more enzymes
  • the detection of a positive event can be done with a detection reagent in the broadest sense, e.g. by means of a fluorescently labeled antibody or the like.
  • a detection reagent in the broadest sense, e.g. by means of a fluorescently labeled antibody or the like.
  • suitable bioanalytical methods such as, for example, immunohistochemistry,
  • Antibody arrays Luminex / Luminol, ELISA, immunofluorescence, radioimmunoassays.
  • the invention relates to a cell bank containing harvested cells from the method according to the invention, ie "cells with extended doubling capacity", which are in suspension or can be arranged on a solid support. 19
  • solid support includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic bead, a silicon wafer, glass, plastic, metal, a chip, a mass spectrometric target, or a matrix of e.g. Proteins or other matrices such as e.g. PEG etc.
  • this corresponds to a grid that the order of magnitude of a microtiter plate
  • the carrier material may be in the form of spherical, unaggregated particles, so-called beads, fibers or a membrane, wherein a porosity of the matrix increases the surface area.
  • the porosity can be achieved, for example, in the customary manner by adding pore formers, such as cyclohexanol or 1-dodecanol, to the reaction mixture of the suspension polymerization.
  • the invention relates to a medicament containing harvested cells from the method according to the invention for the treatment of diseases, in particular cardiac insufficiency, liver cirrhosis, Parkinson's disease and insulin-dependent diabetes.
  • diseases in particular cardiac insufficiency, liver cirrhosis, Parkinson's disease and insulin-dependent diabetes.
  • the harvested cells are returned to the patient (e.g., by injecting cardiac cells into the heart muscle, etc.).
  • viral proliferation genes E6 and E7 of the low-risk HPV are used.
  • the invention relates to a starter culture containing harvested cells from the method according to the invention, ie such harvested cells consisting of "cells with extended doubling capacity" and conventional additives and excipients.
  • the harvested cells from the process according to the invention are used for culture on customary media, in particular as cocultivation cells (feeder cells), for enrichment of target cells (for example stem cells, etc.).
  • the harvested cells from the method according to the invention are used for the production of 3D cell models or in vitro tissues, not exclusively as models for the human skin and other organs (heart, liver, etc.), bone, Cartilage, if necessary. Applied to a support (so-called scaffold biomaterials).

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Abstract

The invention relates to a method for propagating or concentrating primary cells without tumorous characteristics and to the subsequent use thereof.

Description

Titel : Vermehrung von primären Zellen und deren VerwendungTitle: Propagation of primary cells and their use
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vermehrung oderThe invention relates to a method for propagation or
Anreicherung von primären Zellen ohne Tumoreigenschaften und deren weiteren Verwendung.Enrichment of primary cells without tumor properties and their further use.
Die Bereitstellung von geeigneten Zellen für den Menschen ist eine medizinische Herausforderung, sei es zu Zwecken im therapeutischen in-vivo Einsatz oder in der Entwicklung von in-vitro Zellsystemen einschließlich zugehöriger Zellkulturen. Darüber hinaus besteht ein großes Bedürfnis Zellkulturen zu etablieren, die möglichst ähnlich zu humanen Zellen sind, sei es für die Testung von Medikamenten, in der Forschung etc.The provision of suitable human cells is a medical challenge, whether for in vivo therapeutic use or in the development of in vitro cell systems, including cell cultures. In addition, there is a great need to establish cell cultures that are as similar as possible to human cells, be it for the testing of drugs, in research, etc.
Im Stand der Technik haben sich Zelllinien etabliert, dies sind Zellen, die sich auf entsprechendem Nährboden unbegrenzt fortpflanzen können und immortal sind. Bekannt sind insbesondere Tumorzellen oder tumorähnliche Zellen sowie einschlägig bekannt HeLa-Zellen - Cervix-Karzinom Zelllinie, COS-Zellen, HEK-293 Zellen - Niere, Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen, HEp-2 - humane epitheliale Larynxkarzinom- Zelllinie u.v.a. Die Herstellung von solchen Zelllinien ist beispielsweise in EP833934 (Crucell) beschrieben. Solche Zelllinien werden beispielsweise zur Medikamententestung eingesetzt. Nachteilig an solchen Zelllinien sind jedoch die genetischen Veränderungen (solche wie Punktmutationen, Austausche von Chromosomenstücken (Rearrangements) , Erhöhung der Kopienzahl von Genen (Genamplifikation) und sogar Veränderungen der Chromosomensätze (Aneuploidie) ) sowie die Tumor-Eigenschaften infolge eintretender Immortalisierung und unbegrenzter Teilungsfähigkeit. Es ist bekannt, dass sich die Zellen solcher Zelllinien im Lauf der Kultivierung durch spontane Mutationen allmählich verändern und sich zu einer malignen Zellpopulation entwickeln können und genetisch instabil sind. Nach Erkenntnis der Erfinder tritt hierbei eine kritische Schwelle von angesammelten Mutationen schon nach etwa 60 Zellteilungen in der Kultur ein. Dies können Mutationen sein, die zur Aktivierung von Onkogenen oder Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen. In einer Zellpopulation können sich daher solche Zellen durchsetzen, die aufgrund der angesammelten Mutationen eine erhöhte Zellteilungsaktivität haben. Dieser Selektionsprozess entspricht der Präkanzerose bei der Tumorentstehung; zusätzlich haben die im Handel erhältlichen Zelllinien zumeist eine nicht bekannte Anzahl von Verdopplungen bereits hinter sich, falls sie nicht ohnehin von malignen Tumorzellen abstammen.In the prior art, cell lines have established themselves, these are cells that can propagate indefinitely on appropriate nutrient medium and are immortal. Especially known are tumor cells or tumor-like cells as well as well-known HeLa cells - cervical carcinoma cell line, COS cells, HEK-293 cells - kidney, Chinese hamster ovary (CHO) cells, HEp-2 - human epithelial laryngeal carcinoma cell line and many others such cell lines are described, for example, in EP833934 (Crucell). Such cell lines are used, for example, for drug testing. Disadvantages of such cell lines, however, are the genetic changes (such as point mutations, exchanges of chromosome fragments (rearrangements), increase in the copy number of genes (gene amplification) and even Changes in the chromosome sets (aneuploidy)) as well as the tumor characteristics as a result of immortalization and unlimited ability to divide. It is known that the cells of such cell lines gradually change in the course of cultivation by spontaneous mutations and can develop into a malignant cell population and are genetically unstable. According to the inventors, a critical threshold of accumulated mutations already occurs after about 60 cell divisions in the culture. These may be mutations that lead to activation of oncogenes or inactivation of tumor suppressor genes. In a cell population, therefore, those cells can prevail which have an increased cell division activity due to the accumulated mutations. This selection process corresponds to precancerous lesions during tumorigenesis; In addition, the commercially available cell lines usually have an unknown number of duplications already behind them, if they are not already derived from malignant tumor cells.
Tabelle 1: Eigenschaften von Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität verglichen mit anderen Zellsystemen Table 1: Properties of cells with increased duplication capacity compared to other cell systems
a) Die tatsächliche Zellteilungsfähigkeit hängt vom Alter des Zellspenders ab, je älter der Spender, desto mehr Teilungen haben jene Zellen durchgeführt.a) The actual cell division ability depends on the age of the cell donor, the older the donor, the more divisions those cells have made.
b) Die zu untersuchenden Zellen werden mit einer speziellen Agarose überschichtet (Soft Agar) ; Zellen, die ihre natürliche Fähigkeit zur Kontaktinhibition verloren haben, wachsen als Kolonien in den Soft Agar hinein. Dies wird oft auch als Transformation bezeichnet und ist eine Voraussetzung für Tumorentstehung. Diese bedarf aber meist noch weiterer Schritte wie z.B. Zell-Immortalisierung. Natürliche Zellen haben keine Fähigkeit zum Wachstum in Soft Agar.b) The cells to be examined are overlaid with a special agarose (soft agar); Cells that have lost their natural contact inhibition ability grow into the soft agar as colonies. This is often referred to as transformation and is a prerequisite for tumorigenesis. This usually requires further steps, such as Cell immortalization. Natural cells have no ability to grow in soft agar.
c) Um maligne Entartung von Zellen nachzuweisen, reicht in der Regel der Soft Agar Test nicht aus. Ein gängiger und dem Fachmann bekannter Test ist das Grafting von den zu testenden Zellen in immundefekten Mäusen (engl, nude mice oder SCID mice) . Aufgrund des eingeschränkten oder fehlenden Immunsystems werden sogar Zellen anderer Spezies 3ac) In order to detect malignant degeneration of cells, the soft agar test is usually insufficient. A common and well-known test is the grafting of the cells to be tested in immunodeficient mice (nude mice or SCID mice). Due to the limited or lacking immune system even cells of other species become 3a
(Xenografts) nicht immunologisch abgestoßen und können zu Tumoren auswachsen, sofern es sich um maligne Tumorzellen handelt .(Xenografts) are not immunologically rejected and can grow into tumors, if they are malignant tumor cells.
Es besteht jedoch ein großer Bedarf, solche Zellen aus primären Zellkulturen zu gewinnen, welche im Vergleich zu primären Zellen eine Erweiterung ihrer natürlichen Teilungsfähigkeit aufweisen, jedoch möglichst keine Eigenschaften von Tumorzellen haben, insbesondere solche von malignen Tumorzellen, wie z.B. Wachstum in Soft Agar oder gar Tumorwachstum in vivo und zudem weitgehend keine Mutationen angesammelt haben.However, there is a great need to obtain such cells from primary cell cultures that have an extension of their natural ability to divide as compared to primary cells, but have as few tumor cell properties as possible, especially those from malignant tumor cells, e.g. Growth in soft agar or even tumor growth in vivo and have accumulated largely no mutations.
Die Verfügbarkeit von primären Zellen ist nicht nur für die Forschung sowie in der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie von großer Bedeutung, sondern auch für Zell-basierte The availability of primary cells is not only of great importance for research and in the biotechnology and pharmaceutical industries, but also for cell-based ones
Therapien zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen. Dazu zählen z.B. Herzmuskelschwäche, Leberzirrhose, Parkinson- Krankheit und Insulin-abhängiger Diabetes.Therapies for the treatment of degenerative diseases. These include e.g. Heart failure, liver cirrhosis, Parkinson's disease and insulin-dependent diabetes.
Der Mangel an primären Zellen limitiert bisher jedoch ihre Anwendung.However, the lack of primary cells has limited their use so far.
Unter dem Begriff „primäre Zellen" werden im Rahmen der Erfindung direkt aus Körperflüssigkeiten oder aus Körpergeweben gewonnene Explantate mit normalen, d.h. nicht entarteten Zellen, von vielzelligen Organismen, wie z.B. dem Menschen, verstanden. Primäre Zellkulturen sind in Kultur genommene primäre Zellen bis zur ersten Passage. Primäre Zellen haben die natürlichen Differenzierungseigenschaften und sind mortal . Unter dem Begriff „Typ I Zellen" werden im Rahmen derWithin the scope of the invention, the term "primary cells" is understood to mean explants derived directly from body fluids or from body tissues with normal, ie not degenerated, cells of multicellular organisms such as, for example, humans Passage: Primary cells have natural differentiation properties and are mortal. The term "type I cells" is used in the context of
Erfindung solche primäre Zellen bezeichnet, die in Kultur zur Vermehrung gebracht werden können, jedoch nach ein paar wenigen Verdopplungen aufhören zu wachsen und absterben. Typ I Zellen machen eine kleine Anzahl von primären Zelltypen aus. Diese Sterblichkeit der Zellen limitiert stark ihreInvention refers to such primary cells that can be propagated in culture, but after a few doublings cease to grow and die off. Type I cells make up a small number of primary cell types. This mortality of cells severely limits their
Kommerzialisierung. Beispiele für solche Typ I Zellen sind Endothelzellen (Gefäßzellen) , Keratinozyten (Hautzellen) oder Fibroblasten (Bindegewebszellen) . Unter dem Begriff „Typ II Zellen" werden im Rahmen der Erfindung solche primäre Zellen bezeichnet, die von Anfang an in der Kultur eine Arretierung ihrer Teilungsfähigkeit haben und daher nicht zur Vermehrung gebracht werden können. Typ II Zellen bilden die überwiegende Mehrheit von primären Zellen in vielzelligen Organismen, wie z.B. dem Menschen. Beispiele für solche Typ II Zellen sind Kardiomyozyten (Herzmuskelzellen) , - Inselzellen (Insulin-produzierende Zellen der Bauchspeicheldrüse), Neuronen (Nervenzellen) u.a.Commercialization. Examples of such type I cells are endothelial cells (vascular cells), keratinocytes (skin cells) or fibroblasts (connective tissue cells). In the context of the invention, the term "type II cells" refers to those primary cells which, from the outset, have been able to arrest their ability to divide in the culture and therefore can not be multiplied.Type II cells form the vast majority of primary cells in multicellular organisms, such as humans. Examples of such type II cells are cardiomyocytes (heart muscle cells), - islet cells (insulin-producing cells of the pancreas), neurons (nerve cells) and others
Es ist lange bekannt, dass primäre Zellkulturen eine begrenzte Zellteilungsfähigkeit haben. Leonard Hayflick vom Wistar Institut (US) entdeckte bereits 1961, dass Fibroblasten von Neugeborenen 80-90 'Zellteilungen machen können, die von 70- jährigen Personen teilten sich nur noch 20-30 Mal (Übersicht in: HAYFLICK, LEONARD The biology of human aging. American Journal of the Medical Sciences. 265 ( 6) : 432-446, June 1973) . Nach diesen Teilungszahlen gehen die Zellen in die Seneszenz. Ferner ist für primäre Zellen die so genannte verlängerte Lebensspanne (engl. Extended Life Span) beschrieben, wobei die Teilungsfähigkeit der primären Zellen zur Untersuchung der Krebsentstehung durch das Einschleusen von viralen Onkogenen wie SV40 TAg, Adenovirus ElA, HPV E6 und E7 oder zellulären Onkogenen wie c-ras und c-myc erhöht wird. In den untersuchten Systemen wurde mittels Selektion, Mutagenese und weiterenIt has long been known that primary cell cultures have limited cell division ability. Leonard Hayflick of the Wistar Institute (US) discovered as early as 1961 that neonatal fibroblasts can make 80-90 'cell divisions, whereas 70-year-olds divide up to 20-30 times (see: HAYFLICK, LEONARD The biology of human aging American Journal of Medical Sciences 265 (6): 432-446, June 1973). After these division numbers, the cells go into senescence. Furthermore, for primary cells, the so-called extended life span is described, whereby the ability of the primary cells to divide for the development of cancer by the introduction of viral oncogenes such as SV40 TAg, adenovirus ElA, HPV E6 and E7 or cellular oncogenes such c-ras and c-myc is increased. In the systems studied, selection, mutagenesis and others were used
Verfahren versucht, die Zellen über die „Extended Life Span" hinaus zu immortalisieren, um einen Einfluss der viralen oder zellulären Gene auf die Krebsentstehung untersuchen zu können.The method attempts to immortalize the cells beyond the "extended life span" in order to investigate an influence of the viral or cellular genes on carcinogenesis.
Um Zellen zusätzlich zu der verlängerten Lebensspanne hinaus zu vermehren, muss ein Verfahren verwendet werden, welches die bei jeder Zellteilung auftretende Verkürzung der chromosomalen Telomere kompensiert. Eine Möglichkeit dazu ist die Verwendung der Telomerase (Harley, C. B. and B. Villeponteau. 1995. Telomeres and telomerase in aging and cancer. Curr.Opin.Genet . Dev. 5:249-255.) - Zellen, welche den Telomerverlust beispielsweise durch Telomerase kompensieren können, haben eine unbegrenzte Teilungsfähigkeit bzw.To augment cells in addition to the extended life span, a method must be used which compensates for the shortening of chromosomal telomeres that occurs with each cell division. One way to do that is to use it telomerase (Harley, CB and B. Villeponteau, 1995. Telomeres and telomerase in aging and cancer, Curr.Opin.Genet. Dev. 5: 249-255.) - Cells that can compensate for telomere loss by, for example, telomerase have one unlimited divisibility or
Immortalität . Dabei treten jedoch im Lauf der Zellteilungen nachteilig unvermeidlicherweise Mutationen auf, die früher oder später zur Krebsentstehung führen müssen.Immortality. In the course of the cell divisions, however, there are disadvantageously inevitable mutations, which sooner or later must lead to the onset of cancer.
Nicht bekannt im Stand der Technik ist jedoch eine gezielte Anreicherung oder Vermehrung - auch Gewinnung - von primären Zellen unter Vermeidung der Entstehung von Eigenschaften von Tumorzellen wie Wachstum in Soft Agar oder Tumorwachstum in vivo.Not known in the prior art, however, is a targeted enrichment or propagation - including recovery - of primary cells while avoiding the emergence of properties of tumor cells such as growth in soft agar or tumor growth in vivo.
Daher ist es Aufgabe der Erfindung ein solches Verfahren zur Anreicherung oder Vermehrung von primären Zellen bereitzustellen, die verfahrensgemäß weitgehenst keine Tumoreigenschaften aufweisen.It is therefore an object of the invention to provide such a method for enrichment or propagation of primary cells, which according to the method have far-reaching tumor properties.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Vermehrung von primären Zellen gelöst, wobei humane primäre Zellen in den folgenden Schritten: a . ) isoliert, bl . ) mit mindestens einem Proliferationsgen oder dessen Genprodukt in die Zelle funktionell eingebracht wird und / oder b2. ) mindestens ein zellulärer Faktor, der einen 7The object is achieved by a method of propagating primary cells, wherein human primary cells in the following steps: a. isolated, bl. ) is functionally introduced into the cell with at least one proliferation gene or its gene product and / or b2. ) at least one cellular factor, one 7
Zellteilungsarrest induziert, inaktiviert wird, c.) die Zellen kultiviert und / oder passagiert und d.) geerntet werden, wobei die geernteten Zellen keine Tumoreigenschaften aufweisen.Cell division arrest induced, inactivated, c.) The cells are cultured and / or passaged and d.) Harvested, wherein the harvested cells have no tumor properties.
Vorzugsweise können mehr als drei zusätzliche Passagen im Vergleich zu unbehandelten primären Zellen, mehr als fünf zusätzliche Passagen, vorzugsweise 20 - 40 zusätzliche Passagen, durchgeführt werden. Durch die Begrenzung der Zellteilungen auf 20-40 zusätzliche Verdopplungen entfallen die unerwünschten Veränderungen, die bei immortalisierten Zellen nach mehr als 60 Verdopplungen zwingend auftreten.Preferably, more than three additional passages may be performed compared to untreated primary cells, more than five additional passages, preferably 20-40 additional passages. Limiting cell divisions to 20-40 additional duplications eliminates the unwanted changes that are inevitable in immortalized cells after more than 60 duplications.
Daher betrifft die Erfindung ein solches Verfahren mit den Schritten a.) - d. ) , wobei in Schritt c.) bis zu 20 - 40 Passagen erreicht werden können, ohne dass die erhaltenen Zellen Tumoreigenschaften aufweisen.Therefore, the invention relates to such a method with the steps a.) - d. ), wherein in step c.) Up to 20-40 passages can be achieved without the cells obtained have tumor properties.
Besonders vorteilhaft gewährleistet daher das erfindungsgemäße Verfahren, dass die erhaltenen Zellen keine Eigenschaften von Tumorzellen annehmen, insbesondere von malignen Tumorzellen, wie z.B. Wachstum in Soft Agar oder Tumorwachstum in vivo (das Anwachsen von Tumoren in Xenograft-Tiermodellen) . Der Begriff „Tumoreigenschaft" bezieht sich jedoch nicht auf die Fähigkeit der erweiterten Verdopplungskapazität der Zielzellen durch das erfindungsgemäße Verfahren. Ferner wird vorteilhaft keine eigene Immortalisierung der erhaltenen Zellen durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht. Daher erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Anreicherung oder Vermehrung von erhaltenen nicht- immortalisierten Zellen.Therefore, the method according to the invention particularly advantageously ensures that the cells obtained do not assume any properties of tumor cells, in particular of malignant tumor cells, such as growth in soft agar or tumor growth in vivo (the growth of tumors in xenograft animal models). However, the term "tumor property" does not refer to the ability of the enhanced duplication capacity of the target cells by the method of the invention. Furthermore, advantageously no own immortalization of the cells obtained is achieved by the method according to the invention. Therefore, the method of the invention allows the accumulation or proliferation of obtained non-immortalized cells.
Die Kultivierung erfolgt auf für den Fachmann bekanntenThe cultivation is carried out in a manner known to the person skilled in the art
Kulturmedien .Culture media.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die vorteilhafte Anreicherung und Vermehrung von primären Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität, die zudem im Wesentlichen genetisch unverändert vorliegen wie primäre Zellen nach Kultivierung, während die meisten Zelllinien viele genetische Veränderungen aufweisen.The method according to the invention allows the advantageous enrichment and propagation of primary cells with extended duplication capacity, which are essentially genetically unchanged as well as primary cells after cultivation, while most cell lines have many genetic alterations.
Der erfindungsgemäße Begriff „Ernten" bedeutet, dass die erhaltenen Zellen kontinuierlich oder diskontinuierlich aus der Vermehrung entnommen oder gewonnen werden können und in beliebigen Einheiten (Mengen, Qualität, etc. ) weiter eingesetzt und verwendet werden können.The term "harvesting" according to the invention means that the cells obtained can be removed or recovered continuously or discontinuously from the multiplication and can be used and used in any desired units (amounts, quality, etc.).
Der Begriff „Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen" bedeutet die Bereitstellung von „Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität" (siehe vergleichende Tabelle 1), wobei das Verfahrensmerkmal bl.) oder b2. ) im Anspruch 1 zu einer strukturellen Veränderung von primären Zellen des Ausgangsmaterials führen. Die erweiterte Verdopplungskapazität erlaubt vorteilhaft die Erzeugung einer wesentlich vergrößerten Zellmenge.The term "proliferation or accumulation of primary cells" means the provision of "cells with increased doubling capacity" (see Comparative Table 1), where the method feature is bl.) Or b2. ) in claim 1 lead to a structural change of primary cells of the starting material. The extended doubling capacity advantageously allows the Generation of a significantly increased amount of cells.
Im Rahmen dieser Erfindung ist ein Proliferationsgen ein solches, dass die Zellteilung verbessert und eine begrenzt erweiterte Zellteilungskapazität in der primären Zelle ermöglicht, wobei die Wahrscheinlichkeit von Zelltransformation oder Veränderungen derIn the context of this invention, a proliferation gene is one that enhances cell division and allows for a limited extended cell division capacity in the primary cell, with the likelihood of cell transformation or alteration of cell proliferation
Differenzierungseigenschaften sehr stark reduziert wird im Vergleich zu den Zelllinien, die Stand der Technik sind. Insbesondere ist das Proliferationsgen nicht-immortalisierend. Erfindungsgemäß ist das Proliferationsgen vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der viralen Proliferationsgenen: E6 und E7 von Papillomviren wie z.B. HPV (humanes Papillomvirus) und BPV (bovines Papillomvirus) ; das große und kleine TAg von Polyomaviren wie z.B. SV40, JK-Virus und BC-Virus; die Proteine ElA und ElB von Adenoviren, EBNA- Proteine von Epstein Barr Virus (EBV) ; sowie das Proliferationsgen von HTLV und Herpesvirus Saimiri und jeweils deren kodierenden Proteine oder ausgewählt aus der Gruppe der zellulären Proliferationsgene, insbesondere folgenden Klassen von Genen: myc, jun, ras, src, fyg, myb, E2F und Mdm2 und TERT (katalytische Untereinheit der Telomerase) , vorzugsweise der humanen Telomerase hTERT) . In einer weiteren Ausführungsform ist das genannte TAg (1-708 AS, z:b. SV 40) im Bereich der Aminosäuren 1-121 und / oder 137 bis 708 mittels Punktmutationen, Deletionen und / oder Insertionen die transformierende Aktivität, jedoch unter Erhalt der p53 Bindungsdomäne („bipartite Domäne") (Ruppert, 10Differentiation properties is greatly reduced compared to the cell lines that are state of the art. In particular, the proliferation gene is non-immortalizing. According to the invention, the proliferation gene is preferably selected from the group of viral proliferation genes: E6 and E7 of papillomaviruses such as HPV (human papilloma virus) and BPV (bovine papilloma virus); the large and small doses of polyomaviruses such as SV40, JK virus and BC virus; the proteins ElA and ElB of adenoviruses, EBNA proteins of Epstein Barr virus (EBV); and the proliferation gene of HTLV and herpesvirus Saimiri and their respective coding proteins or selected from the group of cellular proliferation genes, in particular the following classes of genes: myc, jun, ras, src, fyg, myb, E2F and Mdm2 and TERT (catalytic subunit of telomerase ), preferably the human telomerase hTERT). In a further embodiment said TAg (1-708 AS, eg: SV 40) in the range of amino acids 1-121 and / or 137-708 is the transforming activity by means of point mutations, deletions and / or insertions, but with retention of the p53 binding domain ("bipartite domain") (Ruppert, 10
Stilman (1993), Analysis of a protein binding domain p53, Mol. Cell. Biol. 13, 3811-3820), ausgeschaltet.Stilman (1993), Analysis of a protein binding domain p53, Mol. Cell. Biol. 13, 3811-3820), switched off.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind jedoch virale Proliferationsgene, besonders bevorzugt sind E6 und E7 von HPV oder BPV. Dabei können Proliferationsgene von HPV-Typen verwendet werden, die in Zusammenhang mit malignen Erkrankungen stehen. Die bekanntesten Beispiele für „High Risk" Papillomviren sind HPV16 und HPV18. Weitere Beispiele der High Risk Gruppe sind HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 und 82. Es können aber auch die Proliferationsgene E6 und E7 von so genannten „low risk" HPVs verwendet werden. Bekannte Beispiele sind die HPV-Typen 6 und 11, weitere HPV Typen der Low-Risk Gruppe sind HPV 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, und 81.However, viral proliferation genes are preferred according to the invention; E6 and E7 of HPV or BPV are particularly preferred. Proliferation genes of HPV types associated with malignant diseases can be used. The best-known examples of high-risk papillomaviruses are HPV16 and HPV18, and other examples of the high-risk group are HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, and 82 but also the proliferation genes E6 and E7 can be used by so called "low risk" HPVs. Well-known examples are the HPV types 6 and 11, other HPV types of the low-risk group are HPV 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, and 81.
Die Bedeutung der E6 Proteine im Zusammenhang mitThe importance of E6 proteins in connection with
Proliferationssteigerung sind vor allem in der Inaktivierung des p53 Weges sowie der Induktion der Telomerase zu sehen. Die Bedeutung der E7 Proteine im Zusammenhang mitIncreases in proliferation are mainly seen in the inactivation of the p53 pathway as well as the induction of telomerase. The importance of E7 proteins in connection with
Proliferationssteigerung sind vor allem in der Inaktivierung des pRB-Weges zu sehen. Im Zusammenhang der Erfindung können auch die Proliferationsgene verschiedener Serotypen einer Virusspezies oder verschiedener Virusspezies kombiniert werden oder sogar chimäre Proliferationsgene von verschiedenenProliferation increase can be seen above all in the inactivation of the pRB pathway. In the context of the invention also the proliferation genes of different serotypes of one virus species or different virus species can be combined or even chimeric proliferation genes of different ones
Serotypen einer Virusspezies oder verschiedener Virusspezies hergestellt und eingesetzt werden. Z. B kann eine E6 Domäne in einem Chimären Gen z.B. von HPV 16 abstammen und eine andere 11Serotypes of a virus species or different virus species are produced and used. For example, one E6 domain in one chimeric gene may be derived from HPV 16 and another 11
von HPV 6. Selbstverständlich können die Proliferationsgene auch trunktiert sein oder einen oder mehrere Basenaustausche haben, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Die oben ■ erwähnten Proliferationsgene stellen bevorzugte Ausführungsformen dar und sollen die Erfindung nicht einschränken. Das Proliferationsgen kann ebenfalls Gegenstand einer synthetischen oder künstlich hergestellten Gensequenz sein.of HPV 6. Of course, the proliferation genes may also be truncated or have one or more base changes without departing from the scope of the invention. The proliferation genes mentioned above are preferred embodiments and are not intended to limit the invention. The proliferation gene may also be the subject of a synthetic or engineered gene sequence.
Diese Faktoren werden in die Zielzellen, derenThese factors are in the target cells, whose
Zellteilungskapazität erweitert werden soll, „funktionell eingebracht" und hierbei können nicht abschließend folgende Gentransfersysteme verwendet werden: Transfer von Expressionskonstrukte der vorstehend genannten Genfunktionen in Zellen mit der klassischen Calzium-Phosphatmethode (Wigler, M. et al., 1977. Cell 11:223-232), mit Lipofektion (Feigner, P. L. et al, 1987. Proc.Natl . Acad. Sei . U. S . A 84:7413-7417), mit Elektroporation (Wolf, H. et al., 1994. Biophys.J. 66:524- 531), mit Mikroinjektion (Diacumakos, E. G. 1973. Methods Cell Biol. 7:287-311), über Konjugate, welche über zelluläreThe following gene transfer systems can not be used conclusively: Transfer of expression constructs of the abovementioned gene functions into cells with the classical calcium phosphate method (Wigler, M. et al., 1977. Cell 11: 223- 232), with lipofection (Feigner, PL et al., 1987. Proc. Natl. Acad., Sci., A 84: 7413-7417), with electroporation (Wolf, H. et al., 1994. Biophys 66: 524-531), with microinjection (Diacumakos, EC 1973. Methods Cell Biol. 7: 287-311), via conjugates which are expressed via cellular
Rezeptoren aufgenommen werden oder Rezeptor-unabhängig. Die vorstehend genannten Genfunktionen können auch über virale Vektoren in Zielzellen übertragen werden. Beispiele sind retrovirale Vektoren, AAV-Vektoren, Adenovirus-Vektoren und HSV-Vektoren, um nur einige Beispiele von Vektoren zu nennen (Übersicht über virale Vektoren in: Lundstrom, K. 2004. Technol. Cancer Res.Treat. 3:467-477; Robbins, P. D. and S. C. Ghivizzani. 1998. Pharmacol . Ther . 80:35-47) . Der Begriff 12Receptors are included or receptor-independent. The aforementioned gene functions can also be transmitted via viral vectors in target cells. Examples are retroviral vectors, AAV vectors, adenovirus vectors and HSV vectors, to name just a few examples of vectors (review of viral vectors in: Lundstrom, K. 2004. Technol. Cancer Res.Treat. 3: 467-477 Robbins, PD and SC Ghivizzani 1998. Pharmacol Ther 80: 35-47). The term 12
„funktionell eingebracht" umfasst insbesondere die Transfektion der Zielzellen mittels mindestens einem Proliferationsgen."Functionally incorporated" in particular comprises the transfection of the target cells by means of at least one proliferation gene.
Die Expression der vorstehend genannten viralen oder zellulären Proliferationsgene kann durch starke oder schwache konstitutiven Promotoren kontrolliert werden, von Gewebespezifischen Promotoren, von induzierbaren Promotoren (Meyer-Ficca, M. L. et al. 2004. Anal . Biochem. 334:9-19) oder die Expressionskassetten können von spezifischen Sequenzen für molekulare Exzisionssysteme flankiert sein. Beispiele sind das Cre/Lox System (US Patent 4,959,317), dessen Anwendung zur molekularen Entfernung der Expressionskonstrukte aus dem Genom der Zielzellen führt.Expression of the aforementioned viral or cellular proliferation genes can be controlled by strong or weak constitutive promoters, tissue-specific promoters, inducible promoters (Meyer-Ficca, ML et al., 2004. Anal. Biochem. 334: 9-19), or the expression cassettes may be flanked by specific sequences for molecular excision systems. Examples are the Cre / Lox system (US Patent 4,959,317), the application of which results in the molecular removal of the expression constructs from the genome of the target cells.
In einer weiteren Ausführungsform können die Genprodukte der Proliferationsgene ebenfalls direkt in die Zielzelle als solches oder mittels eines Fusionsproteins funktionell eingebracht werden. Vorzugsweise handelt es sich um Messenger- Proteine, wie VP22, HIV TAT (Suzuki et al., 277 J. Biol. Chem. 2437-2443 2002 and Futaki 245 Int. J. Pharmaceut. 1-7 (2002), (HIV) REV, Antennapedia Polypeptid (WO97/12912 and WO99/11809) oder Penetratin (Derossi et al., 8 Trends Cell Biol., 84-87 (1998), Engrailed (Gherbassi, D. & Simon, H. H. J. Neural Transm. Suppl 47-55 (2006), Morgan, R. 580 FEBS Lett . , 2531- 2533 (2006), Han, K. et al. 10 Mol. Cells 728-732 (2000)) oder Hoxa-5 (Chatelin et al. 55 Mech. Dev. 111-117 (1996)), ein Polymer aus L-Arginin oder D-Arginin Aminosäureresten 13In a further embodiment, the gene products of the proliferation genes can also be introduced functionally directly into the target cell as such or by means of a fusion protein. Preferably, they are messenger proteins such as VP22, HIV TAT (Suzuki et al., 277 J. Biol. Chem. 2437-2443 2002 and Futaki 245 Int. J. Pharmaceut 1-7 (2002), (HIV) REV, Antennapedia Polypeptide (WO97 / 12912 and WO99 / 11809) or Penetratin (Derossi et al., 8 Trends Cell Biol., 84-87 (1998), Engrailed (Gherbassi, D. & Simon, HHJ Neural Transm. Suppl. Cells 728-732 (2000)) or Hoxa-5 (Chatelin et al., 55, Mech Dev. 111-117 (1996)), a polymer of L-arginine or D-arginine amino acid residues 13
(Can. Patent No. 2,094,658; U.S. Pat . No. 4,701,521; WO98/52614), ein Polymer aus L-Lysin or D- Lysin Aminosäureresten (Mai et al., 277 J. Biol. Chem. 30208-30218 (2002), Park et al. 13 Mol. Cells 202-208 (2002), Mi et al. 2 Mol. Ther. 339-347 (2000)), Transkriptionsfaktoren wie BETA2/neuro D, PDX-I (Noguchi and Matsumoto 60 Acta Med. Okayama 1-11, (2006), Noguchi et al. 52 Diabetes 1732-1737 (2003), Noguchi et al. 332 Biochem. Biophys . Res. Commun. 68- 74 (2005)), Nuclear Localization Signal , (Yoneda et al . 201 Exp. Cell Res. 313-320 (1992), Histone derived peptides(Can. Patent No. 2,094,658; U.S. Pat No. 4,701,521; WO98 / 52614), a polymer of L-lysine or D-lysine amino acid residues (Mai et al., 277 J. Biol. Chem. 30208-30218 (2002) Cells 202-208 (2002), Mi et al., 2 moles Ther., 339-347 (2000)), transcription factors such as BETA2 / neuro D, PDX-I (Noguchi and Matsumoto 60 Acta Med Okayama 1-11, (2006), Noguchi et al 52 Diabetes 1732-1737 (2003), Noguchi et al., 332 Biochem Biophys Res. Commun 68- 74 (2005)), Nuclear Localization Signal, (Yoneda et al., 201 Exp. Cell Res., 313-320 (1992), histone derived peptides
(Lundberg and Johansson 291 Biochem. Biophys. Res. Comm. 367- 371 (2002)), ein Polymer aus kationischen Makromolekülen, FGF- 1 und FGF-2, Lactoferrin u.a., wie einschlägig in der Literatur beschrieben. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „mindestens ein zellulärer Faktor, der einen Zellteilungsarrest induziert, inaktiviert wird", verstanden, dass z.B. Zellteilungsarrest im Zuge des Seneszenzprogramms aktiviert wird (Übersicht in: Ben Porath, I. and R. A. Weinberg. 2005. Int . J. Biochem. Cell Biol. 37:961-976.) oder um denjenigen Zellteilungsarrest, der im Rahmen des Differenzierungsprogramms bei Zellen aktiviert wird. Beispielsweise ist bei Herzmuskelzellen bekannt, dass sie schon kurz nach der Geburt ihre Teilungsfähigkeit einstellen, was u.a. durch Expression von Zellzyklus- Inhibitoren wie plδ, p21, p27 reguliert wird (Brooks, G., et al. 1998. Cardiovasc. Res. 39, 301-311; Flink, I. L. et al . , 1998. J. Mol. Cell Cardiol. 30, 563-578; Walsh,K. and Perlman,H. 1997. Curr. Opin. Genet . Dev. 7, 597-602) . Ähnliche 14(Lundberg and Johansson 291 Biochem Biophys Res. Comm., 367-371 (2002)), a polymer of cationic macromolecules, FGF-1 and FGF-2, lactoferrin, among others, as described in the literature. In the context of this invention, "at least one cellular factor which induces a cell division arrest is inactivated" means that, for example, cell division arrest is activated in the course of the senescence program (reviewed in: Ben Porath, I. and RA Weinberg 2005. Int Biochem., Cell Biol. 37: 961-976.) Or cell division arrest, which is activated as part of the differentiation program in cells For example, it is known in cardiac muscle cells that their ability to divide shortly after birth, which inter alia by expression of Cell cycle inhibitors such as plδ, p21, p27 are regulated (Brooks, G., et al., 1998. Cardiovasc. Res. 39, 301-311; Flink, IL et al., 1998. J. Mol. Cell Cardiol. Walsh, K. and Perlman, H. 1997. Curr Opin. Genet. Dev. 7, 597-602) 14
Vorgänge treffen sicherlich auf die Mehrzahl aller primären Zelltypen zu. Eine Ausschaltung von Zellzyklusinhibitoren in differenzierten Zellen könnte somit bewirken, dass die Zellen wieder in die Proliferation gehen. Das trifft im Kontext der Erfindung auch auf weitere hier nicht erwähnte Zellzyklus- inhibitorische Proteine zu.Processes certainly apply to the majority of all primary cell types. Removal of cell cycle inhibitors in differentiated cells could thus cause the cells to re-proliferate. In the context of the invention, this also applies to other cell cycle inhibitory proteins not mentioned here.
Im Rahmen der Erfindung kann allgemein das für die Kontrolle des Zellzyklus wichtige Protein p53 sowie sämtliche an p53 direkt bindende Proteine, vorgeschaltete (nachfolgend upstream) und/ oder nachgeschaltete (nachfolgend) downstreamIn the context of the invention, it is generally possible to use the protein p53, which is important for controlling the cell cycle, as well as all proteins which bind directly to p53, upstream (subsequently upstream) and / or downstream (downstream) downstream
Faktoren dieses p53 Pathways ausgeschaltet werden, um das Ziel der erweiterten Zellteilungskapazität zu erreichen (Übersicht über den p53 Pathway in: Giono, L. E. and J. J. Manfredi. 2006. J. Cell Physiol 209:13-20; Farid, N. R. 2004. Cancer Treat.Res. 122:149-164) .Factors of this p53 pathway are turned off to achieve the goal of extended cell division capacity (review of the p53 pathway in: Giono, LE and JJ Manfredi, 2006 J. Cell Physiol 209: 13-20; Farid, NR 2004. Cancer Treat. Res. 122: 149-164).
Im Rahmen der Erfindung kann allgemein das für die Kontrolle des Zellzyklus wichtige Protein plβ/INK4a sowie sämtliche an pl6/INK4a direkt bindende Proteine, vorgeschaltete (nachfolgend upstream) und/ oder nachgeschaltete (nachfolgend) downstream Faktoren dieses pl6 Pathways ausgeschaltet werden, um das Ziel der erweiterten Zellteilungskapazität zu erreichen (Übersicht über den pl6/INK4a Pathway in: Shapiro, G. I. et al., 2000. Cell Biochem. Biophys . 33:189-197) Im Rahmen der Erfindung kann allgemein das für die Kontrolle des Zellzyklus wichtige Protein pRb bzw. die anderenIn the context of the invention, it is generally possible to eliminate the protein plβ / INK4a, which is important for the control of the cell cycle, as well as all proteins which are directly binding to pl6 / INK4a, upstream (subsequently upstream) and / or downstream (downstream) factors of this p1 pathway, to the target Shapiro, GI et al., 2000. Cell Biochem., Biophys., 33: 189-197) Within the scope of the invention, the protein pRb., which is important for the control of the cell cycle, can generally be obtained within the scope of the invention or the others
Mitglieder der pRb-Familie (z.B. plO7, pl30) sowie sämtliche an Mitglieder der pRb-Familie direkt bindende Proteine, vorgeschaltete (nachfolgend upstream) und/ oder 15Members of the pRb family (eg plO7, pl30) as well as all proteins directly binding to members of the pRb family, upstream (hereinafter upstream) and / or 15
nachgeschaltete (nachfolgend) downstream Faktoren dieses pRb Pathways ausgeschaltet werden, um das Ziel der erweiterten Zellteilungskapazität zu erreichen (übersieht über den pRb Pathway in: Godefroy, N. et al. 2006. Apoptosis. 11:659-661; Seville, L. L. et al. 2005. Curr. Cancer Drug Targets. 5:159- 170) .Downstream (hereinafter) downstream factors of this pRb pathway are switched off to achieve the goal of extended cell division capacity (overlooked via the pRb pathway in: Godefroy, N. et al., 2006 Apoptosis 11: 659-661, Seville, LL et al 2005. Curr. Cancer Drug Targets, 5: 159-170).
Die Inaktivierung zellulärer Faktoren wie z.B. p53, pRB, pl6 etc. kann z.B. durch Expression dominant negativer Mutanten der entsprechenden Faktoren erfolgen (Herskowitz, I. 1987. Nature 329:219-222; Küpper, J. H., et al. 1995. Biochimie 77:450-455), durch Inhibition der Genexpression dieser Faktoren mithilfe von antisense Olignukleotiden (Zon, G. 1990. Ann.N.Y.Acad.Sci. 616:161-172), RNAi Molekülen (Aagaard, L. and J. J. Rossi. 2007. Adv.Drug Deliv.Rev. 59:75-86; Chakraborty, C. 2007. Curr. Drug Targets. 8:469-482),The inactivation of cellular factors, e.g. p53, pRB, pI6, etc. may e.g. by expression of dominant negative mutants of the respective factors (Herskowitz, I. 1987. Nature 329: 219-222; Küpper, JH, et al., 1995. Biochimie 77: 450-455), by inhibiting gene expression of these factors using antisense oligonucleotides (Zon, G. 1990. Ann.NYAcad. Sci 616: 161-172), RNAi molecules (Aagaard, L. and JJ Rossi, 2007. Adv.Drug Deliv. Re 59: 75-86; Chakraborty, C 2007. Curr. Drug Targets 8: 469-482),
Morpholinos (Angerer, L. M. and R. C. Angerer. 2004. Methods Cell Biol. 74:699-711) , Ribozymen (Sioud, M. and P. O. Iversen. 2005. Curr. Drug Targets. 6:647-653) oder durch Gen- Knockout (Le, Y. and B. Sauer. 2000. Methods Mol. Biol. 136:477-485; Yamamura, K. 1999. Prog. Exp. Tumor Res. 35:13-24). Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur vielfach beschrieben. Die Inaktivierung kann auch durch die Wirkung spezifischer Antikörpern erfolgen (z.B. Single chain Antikörper, intra bodies etc.; Übersicht in: Leath, C. A., III, et al. 2004. Int . J.Oncol. 24:765-771; Stocks, M. R. 2004. Drug Discov. Today 9:960-966) . Die Inaktivierung kann auch durch Verwendung von chemischen Inhibitoren der zellulären Faktoren erfolgen, beispielsweise durch Verwendung von Kinase 16Morpholinos (Angerer, LM and RC Angerer, 2004. Methods Cell Biol. 74: 699-711), ribozymes (Sioud, M. and PO Iversen, 2005. Curr. Drug Targets. 6: 647-653) or by gene knockout (Le, Y. and B. Sauer, 2000. Methods Mol. Biol. 136: 477-485; Yamamura, K. 1999. Prog. Exp. Tumor Res. 35: 13-24). These processes are known to the person skilled in the art and have been described many times in the literature. The inactivation can also be effected by the action of specific antibodies (eg single-chain antibodies, intra-bodies, etc., overview in: Leath, CA, III, et al., 2004. Int. J. Oncol., 24: 765-771; Stocks, MR 2004. Drug Discov., Today 9: 960-966). Inactivation may also be accomplished by using chemical inhibitors of the cellular factors, for example, by using kinase 16
Inhibitoren.Inhibitors.
Ein Beispiel für einen Kinase-Inhibitor ist die Substanz Imatinib (Glivec®) . Dadurch wird eine Reduktion der Zellproliferation erreicht. Imatinib ist ein spezifischer Hemmstoff, der die Aktivität der Tyrosinkinase ABL in erkrankten Zellen blockiert und damit eine krankhaft gesteigerte Vermehrung mutierten Blutstammzellen unterdrückt.An example of a kinase inhibitor is the substance imatinib (Gleevec ®). This achieves a reduction in cell proliferation. Imatinib is a specific inhibitor that blocks the activity of tyrosine kinase ABL in diseased cells and thus suppresses a pathologically increased multiplication of mutated blood stem cells.
Diese verfahrensgemäß erhaltenen Zellen mit erweiteter Verdopplungskapazität sind zwischen den primären Zellen und den immortalisierten Zelllinien einzuordnen: Zellen mit erweiteter Verdopplungskapazität weisen die meisten der natürlichen Eigenschaften primärer Zellen auf, können vorteilhaft wesentlich mehr Zellteilungen durchführen. Die Vorteile sind wie folgt:These extended-double-capacity cells obtained according to the invention are to be classified between the primary cells and the immortalized cell lines: cells with increased doubling capacity have most of the natural properties of primary cells and can advantageously carry out considerably more cell divisions. The advantages are as follows:
Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität lassen sich universell von allen Typ I und Typ II Zellen erzeugen. Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität eignen sich für die biomedizinische Grundlagenforschung, die Entwicklung und Überprüfung von Medikamenten, Kosmetika, Lebensmittel- und Textilzusatzstoffen.Cells with extended doubling capacity can be produced universally by all type I and type II cells. Cells with increased duplication capacity are suitable for basic biomedical research, the development and review of drugs, cosmetics, food and textile additives.
Weiterhin vorteilhaft ist die einfache und kostengünstige Handhabung in der Zellkultur, d.h. keine teuren Medienadditive sind notwendig.Further advantageous is the simple and inexpensive handling in the cell culture, i. no expensive media additives are necessary.
Beispiel zur Erläuterung der erweiterten Verdopplungskapazität der geernteten Zellen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren: 17Example for Explaining the Expanded Duplication Capacity of the Harvested Cells from the Method of the Invention: 17
Startkultur aus 1000 primären Endothelzellen, welche eine replikative Kapazität von 15 Verdopplungen haben: Ausbeute an verfügbaren Zellen = 2E15 x 1000 = 3,3 xlOE7 ZellenStarting culture of 1000 primary endothelial cells, which have a replicative capacity of 15 doublings: yield of available cells = 2E15 x 1000 = 3.3 xlOE7 cells
Startkultur aus 1000 „Zellen mit erweiterterStart culture from 1000 "cells with extended
Verdopplungskapazität", welche eine replikative Kapazität von 40 Verdopplungen haben:Doubling capacity ", which have a replicative capacity of 40 doublings:
Ausbeute an verfügbaren Zellen = 2E40 x 1000 = 1,1 xlOE15 Zellen, also acht Zehnerpotenzen mehr.Yield of available cells = 2E40 x 1000 = 1.1 xlOE15 cells, ie eight orders of magnitude more.
Aufgrund dieser vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäß erhaltenen geernteten „Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität" können nachstehende Verfahren und Verwendungen solcher geernteten Zellen vorteilhaft angegangen werden.Because of these advantageous properties of the harvested "extended-duplication-capacity cells" obtained according to the present invention, the following methods and uses of such harvested cells can be advantageously addressed.
Die Erfindung betrifft daher in einer bevorzugten Ausführungsform ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen eines Assays, umfassend die folgenden Schritte: a.) Bereitstellen eines Trägermaterials, b.) Immobilisieren oder Fixieren von mindestens einer geernteten Zelle gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren auf diesem Trägermaterial und In Kontakt bringen dieser Zelle aus b. ) mit einem Analyten.The invention therefore also relates, in a preferred embodiment, to a method for producing an assay comprising the following steps: a.) Providing a carrier material, b.) Immobilizing or fixing at least one harvested cell according to the method according to the invention on this carrier material and bringing it into contact this cell from b. ) with an analyte.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der erhaltenen Zellen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Durchführung 18Furthermore, the invention relates to the use of the cells obtained according to the inventive method for carrying out 18
eines Assays, wobei solche „Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität" mit mindestens einem Analyten ausgewählt aus der Gruppe chemische Substanzen (z.B. synthetische oder native Substanzen und deren Gemische) , Medikamente, Wirkstoffe, Kosmetika, Zellen versetzt werden.an assay in which such "extended duplication capacity cells" are added with at least one analyte selected from the group of chemical substances (e.g., synthetic or native substances and their mixtures), drugs, drugs, cosmetics, cells.
Die Targets solcher Analyten können beliebig sein, z.B. DNA, RNA, Proteine, Lipide, Zucker etc. Im Fall eines Zell-Assays wird oft die Aktivität eines oder mehrerer Targets gemessen, beispielweise die Reaktion eines oder mehrerer Enzyme, derThe targets of such analytes may be arbitrary, e.g. DNA, RNA, proteins, lipids, sugars, etc. In the case of a cell assay, the activity of one or more targets is often measured, for example, the reaction of one or more enzymes
Transport einer Substanz durch eine biologische Membran, die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor, oder umfassender die Replikation der DNA, die Zellteilung oder der Zelltod, um nur einige Beispiele zu nennen.Transport of a substance through a biological membrane, binding of a ligand to a receptor, or more comprehensive replication of DNA, cell division or cell death, to name but a few examples.
Der Nachweis eines positiven Ereignisses kann mit einem Nachweisreagenz im weitesten Sinne erfolgen, z.B. mittels einem fluoresenzmarkiertem Antikörper oder dergleichen. Zu nennen sind hier insbesondere dazu geeignete bioanalytische Verfahren, wie zum Beispiel Immunhistochemie,The detection of a positive event can be done with a detection reagent in the broadest sense, e.g. by means of a fluorescently labeled antibody or the like. Particularly noteworthy here are suitable bioanalytical methods, such as, for example, immunohistochemistry,
Antikörperarrays, Luminex / Luminol, ELISA, Immunfluoreszenz, Radioimmunoassays .Antibody arrays, Luminex / Luminol, ELISA, immunofluorescence, radioimmunoassays.
Ferner betrifft die Erfindung eine Zellbank enthaltend geernteten Zellen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren, also solche „Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität", die in Suspension sind oder angeordnet auf einem festen Träger sein können. 19Furthermore, the invention relates to a cell bank containing harvested cells from the method according to the invention, ie "cells with extended doubling capacity", which are in suspension or can be arranged on a solid support. 19
Der Begriff "fester Träger" umfasst Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches Kügelchen, ein Silizium-Wafer, Glas, Kunststoff, Metall, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix aus z.B. Proteinen oder anderweitige Matrices wie z.B. PEG etc.The term "solid support" includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic bead, a silicon wafer, glass, plastic, metal, a chip, a mass spectrometric target, or a matrix of e.g. Proteins or other matrices such as e.g. PEG etc.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung (synonym: Array) entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer MikrotiterplatteIn a further preferred embodiment of the arrangement according to the invention (synonymous: array), this corresponds to a grid that the order of magnitude of a microtiter plate
(96 Wells, 384 Wells oder mehr), eines Silizium-Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt .(96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
Das Trägermaterial (Matrix) kann in der Form von sphärischen, unaggregierten Partikeln, sog. Beads, Fasern oder einer Membran vorliegen, wobei eine Porosität der Matrix die Oberfläche erhöht. Die Porosität kann beispielsweise in üblicher Weise durch Zugabe von Porenbildnern, wie Cyclohexanol oder 1-Dodecanol zu der Reaktionsmischung der Suspensionspolymerisation erreicht werden.The carrier material (matrix) may be in the form of spherical, unaggregated particles, so-called beads, fibers or a membrane, wherein a porosity of the matrix increases the surface area. The porosity can be achieved, for example, in the customary manner by adding pore formers, such as cyclohexanol or 1-dodecanol, to the reaction mixture of the suspension polymerization.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Arzneimittel enthaltend geerntete Zellen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere Herzmuskelschwäche, Leberzirrhose, Parkinson-Krankheit und Insulin-abhängiger Diabetes. Bei diesen degenerativen Erkrankungen werden die vermehrten Zellen aus einer körpereigenen primären Zelle des 20Furthermore, the invention relates to a medicament containing harvested cells from the method according to the invention for the treatment of diseases, in particular cardiac insufficiency, liver cirrhosis, Parkinson's disease and insulin-dependent diabetes. In these degenerative diseases, the increased cells from an endogenous primary cell of the 20
Patienten erhalten. Die geernteten Zellen werden dem Patienten zurückgegeben (z.B. durch Einspritzen von Herzzellen in den Herzmuskel, etc.).Patients received. The harvested cells are returned to the patient (e.g., by injecting cardiac cells into the heart muscle, etc.).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden als virales Proliferationsgene E6 und E7 der low risk HPV verwendet.In a preferred embodiment, viral proliferation genes E6 and E7 of the low-risk HPV are used.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Starterkultur enthaltend geerntete Zellen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren, also solche geerntete Zellen bestehend aus „Zellen mit erweiterter Verdopplungskapazität" und übliche Zusatz- und Hilfsstoffe.Furthermore, the invention relates to a starter culture containing harvested cells from the method according to the invention, ie such harvested cells consisting of "cells with extended doubling capacity" and conventional additives and excipients.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung werden die geernteten Zellen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren für eine Kultur auf üblichen Medien verwendet, insbesondere als Kokultivierungszellen (Feederzellen) , zur Anreicherung von Targetzellen (z.B. Stammzellen, etc.) .In a further embodiment of the invention, the harvested cells from the process according to the invention are used for culture on customary media, in particular as cocultivation cells (feeder cells), for enrichment of target cells (for example stem cells, etc.).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die geernteten Zellen aus dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Herstellung von 3D-Zellmodellen oder in-vitro Gewebe verwendet, nicht abschließend als Modelle für die humane Haut und anderen Organen (Herz, Leber, etc.), Knochen, Knorpel, ggfs. auf einen Träger aufgebracht (sogenannte Scaffold- Biomaterialien) . In a further embodiment of the invention, the harvested cells from the method according to the invention are used for the production of 3D cell models or in vitro tissues, not exclusively as models for the human skin and other organs (heart, liver, etc.), bone, Cartilage, if necessary. Applied to a support (so-called scaffold biomaterials).

Claims

21Patentansprüche 21Patentansprüche
1. Verfahren zur Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass humane primäre Zellen a. ) isoliert, bl.) mit mindestens einem Proliferationsgen oder dessen1. A method for propagation or accumulation of primary cells, characterized in that human primary cells a. ) isolated, bl.) With at least one proliferation gene or its
Genprodukt in die Zelle funktionell eingebracht wird und / oder b2. ) mindestens ein zellulärer Faktor, der einenGene product is introduced into the cell functionally and / or b2. ) at least one cellular factor, one
Zellteilungsarrest induziert, inaktiviert wird, c.) die Zellen kultiviert und / oder passagiert und d. ) geerntet werden, wobei die geernteten Zellen keine Tumoreigenschaften aufweisen.Cell division arrest is induced, inactivated, c.) The cells are cultured and / or passaged and d. ), wherein the harvested cells have no tumor properties.
2. Verfahren zur Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen nach Anspruch 1, wobei in Schritt c.) 20 bis zu 40 Passagen erfolgen.2. A method for propagation or accumulation of primary cells according to claim 1, wherein in step c.) 20 up to 40 passages.
3. Verfahren zur Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die geerntetenA method of propagating or accumulating primary cells according to claim 1 or 2, wherein the harvested
Zellen in Schritt d.) keine zusätzliche Wachstumsfähigkeit in Soft Agar oder Tumorwachstum in vivo aufweisen.Cells in step d.) Have no additional growth ability in soft agar or tumor growth in vivo.
4. Verfahren zur Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die erhaltenen Zellen nicht-immortalisiert sind. 22A method of propagating or accumulating primary cells according to any one of the preceding claims, wherein the resulting cells are non-immortalized. 22
5. Verfahren zur Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Proliferationsgen in bl . ) ein zelluläres und / oder virales Proliferationsgen ist.5. A method for propagation or accumulation of primary cells according to claim 1, characterized in that the proliferation gene in bl. ) is a cellular and / or viral proliferation gene.
6. Verfahren zur Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zelluläre Proliferationsgen aus der Gruppe myc, jun, ras, src, fyg, myb, E2F und Mdm2 und TERT ausgewählt ist oder das virale Proliferationsgen aus der Gruppe E6 und E7 von Papillomviren wie z.B. HPV; das große und kleine TAg von Polyomaviren wie z.B. SV40, JK- Virus und BC-Virus; die Proteine ElA und ElB von Adenoviren, EBNA- Proteine von Epstein Barr Virus (EBV) ; sowie HTLV und Herpesvirus Saimiri ausgewählt ist.6. Method for propagating or enriching primary cells according to one of the preceding claims, characterized in that the cellular proliferation gene is selected from the group myc, jun, ras, src, fyg, myb, E2F and Mdm2 and TERT or the viral proliferation gene the group E6 and E7 of papillomaviruses such as HPV; the large and small TAg of polyomaviruses, e.g. SV40, JK virus and BC virus; the proteins ElA and ElB of adenoviruses, EBNA proteins of Epstein Barr virus (EBV); as well as HTLV and herpesvirus Saimiri is selected.
7. Verfahren zur Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zelluläre Faktoren in b.) aus der Gruppe p53, plβ, pRB, plO7, pl30 oder deren jeweiligen upstream oder downstream Faktoren oder daran bindende Proteine im Pathway ausgewählt ist und die Inaktivierung solcher zellulärer Faktoren mittels Expression dominant negativer Mutanten erfolgt oder durch Inhibition der Genexpression dieser Faktoren mithilfe von antisense Olignukleotiden, RNAi Molekülen, Morpholinos, Ribozymen erfolgt oder durch Gen-Knockout, durch die7. A method for propagation or accumulation of primary cells according to any one of the preceding claims, characterized in that the cellular factors in b.) From the group p53, plβ, pRB, plO7, pl30 or their respective upstream or downstream factors or proteins binding thereto is selected in the pathway and the inactivation of such cellular factors by expression of dominant negative mutants or by inhibition of gene expression of these factors using antisense oligonucleotides, RNAi molecules, morpholinos, ribozymes or by gene knockout, by the
Wirkung spezifischer Antikörpern, chemischen Inhibitoren erfolgt. 23Effect of specific antibodies, chemical inhibitors occurs. 23
8. Verfahren zur Vermehrung oder Anreicherung von primären Zellen nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die virale Proliferationsgene, E6 und E7 von HPV oder BPV sind, insbesondere HPV16 und HPV18 und HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 und 82 und / oder HPV6 und HPVIl sowie HPV 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, und 81.8. A method for propagation or accumulation of primary cells according to any one of the preceding claims, characterized in that the viral proliferation genes, E6 and E7 of HPV or BPV, in particular HPV16 and HPV18 and HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51st , 52, 56, 58, 59, 68, 73 and 82 and / or HPV6 and HPVIl and HPV 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, and 81.
9. Verfahren zum Herstellen eines Assays, umfassend die folgenden Schritte: a.) Bereitstellen eines Trägermaterials, b. ) Immobilisieren oder Fixieren von mindestens einer geernteten Zelle gemäß Anspruch 1 auf diesem Trägermaterial und In Kontakt bringen dieser Zelle aus b.) mit einem Analyten.9. A method of making an assay comprising the following steps: a.) Providing a support material, b. ) Immobilizing or fixing at least one harvested cell according to claim 1 on said support material and contacting said cell from b.) With an analyte.
10. Verfahren zum Herstellen eines Assays nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe chemische Substanzen, Medikamente, Wirkstoffe, Kosmetika, Zellen.10. A method for producing an assay according to claim 9, characterized in that the analyte is selected from the group of chemical substances, drugs, active ingredients, cosmetics, cells.
11. Zellbank enthaltend geerntete Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 auf einem festen Träger oder in Suspension.Cell bank containing harvested cells according to any one of claims 1 to 8 on a solid support or in suspension.
12. 3D-Zellmodell oder in-vitro Gewebe enthaltend geerntete12. 3D cell model or in vitro tissue containing harvested
Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ggfs. auf einem festen Träger. 24Cells according to any one of claims 1 to 8, optionally on a solid support. 24
13. Starterkultur, Kokultivierungszellen oder Kultur enthaltend geerntete Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und weitere übliche Zusatz- und Hilfsstoffe.13. Starter culture, co-cultivation cells or culture containing harvested cells according to any one of claims 1 to 8 and other conventional additives and excipients.
14. Arzneimittel enthaltend geerntete Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, insbesondere zur Behandlung von14. Medicaments containing harvested cells according to one of claims 1 to 8, in particular for the treatment of
Krankheiten, insbesondere degenerative Erkrankungen wie Herzmuskelschwäche, Leberzirrhose, Parkinson-Krankheit und Insulin-abhängiger Diabetes und weitere übliche Zusatz- und Hilfsstoffe.Diseases, in particular degenerative diseases such as heart failure, cirrhosis, Parkinson's disease and insulin-dependent diabetes and other common additives and excipients.
15. Verwendung der geernteten Zellen nach einem Verfahren nach Anspruch 1 bis 8 zur Herstellung einer Zellbank, SD- Zellmodell oder in-vitro Gewebe, Starterkultur, Kultur, Kokultivierungszellen, Arzneimittel . 15. Use of the harvested cells according to a method according to claim 1 to 8 for the preparation of a cell bank, SD cell model or in vitro tissue, starter culture, culture, cocultivation cells, drugs.
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