EP2073783A2 - Co-colloïdes supramoléculaires obtenus à l' aide de systèmes macrocycliques polyanioniques - Google Patents

Co-colloïdes supramoléculaires obtenus à l' aide de systèmes macrocycliques polyanioniques

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Publication number
EP2073783A2
EP2073783A2 EP07823415A EP07823415A EP2073783A2 EP 2073783 A2 EP2073783 A2 EP 2073783A2 EP 07823415 A EP07823415 A EP 07823415A EP 07823415 A EP07823415 A EP 07823415A EP 2073783 A2 EP2073783 A2 EP 2073783A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
colloidal dispersion
molecule
hydrophobic
water
amphiphilic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07823415A
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German (de)
English (en)
Inventor
Anthony William Coleman
Adina Nicoleta Lazar
Jean-Yves Pierre Paul Renault
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Delta Proteomics
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Delta Proteomics
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Delta Proteomics, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Delta Proteomics
Publication of EP2073783A2 publication Critical patent/EP2073783A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/04—Dispersions; Emulsions
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    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
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    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/41—Particular ingredients further characterized by their size
    • A61K2800/413—Nanosized, i.e. having sizes below 100 nm

Definitions

  • the present invention describes a method for dispersing hydrophobic substances in aqueous phase. Such a method is useful for many applications, especially for the formulation of pharmaceutical or cosmetic active substances.
  • hydrophobic active substances In the aqueous phase, the hydrophobic active substances have a tendency to precipitate, thus considerably limiting their bioavailable concentrations and their biological activities. It is possible to increase the bioavailable concentration of hydrophobic active substances in the aqueous phase in several ways, for example, by inclusion in suitable host molecules, such as cyclodextrins, or by encapsulation in a suitable colloidal dispersion, such as micelles. , liposomes or lipid nanoparticles. Encapsulation methods can also provide protection of the molecules against degradation by light or by enzymatic reactions.
  • amphiphilic molecules are used.
  • An amphiphilic molecule is a molecule that covalently combines an apolar hydrophobic group and a polar hydrophilic group.
  • Amphiphilic molecules have a double affinity, for apolar phases (air, oil, organic solvents) on the one hand, and for water, on the other hand.
  • Lipids are examples of amphiphilic molecules.
  • amphiphilic molecules are generally able to self-assemble forming structures of colloidal nature, characterized by the presence of particles in suspension.
  • the type of colloidal structure obtained depends on the chemical structure of the amphiphilic molecules, and in particular on the ratio of the size of the polar head and the size of the apolar tail of the molecule.
  • Colloidal dispersions can be used to increase the bioavailable concentration of the hydrophobic active substances.
  • the principle is that the hydrophobic active substance must be associated with the hydrophobic groups of the amphiphilic molecules.
  • a disadvantage of the methods using amphiphilic molecules lies in the fact that the maximum percentage (also called load factor which is calculated in unit weight) of active substances that can be dispersed in the colloidal structure is too low, of the order from 5 to 10%.
  • Another disadvantage of these colloidal assemblies is their poor stability over time, especially at room temperature.
  • solid lipid nanoparticles also known by the abbreviation SLN for "solid lipid nanoparticles” in English
  • Such structures are of a matrix nature.
  • the load factors are generally higher, of the order of 30%, and the stability over time is improved.
  • methods using products from the family of calix arenas have been described. For example, US Patent No. 2005/0240051 A1 to N. Yasuda and M.
  • Furukawa discloses a method using calix arenes for solubilizing carbon-based materials, such as fullerenes, graphite, diamond and dyes, in a non-aqueous organic solvent such as toluene, an oil or a resin.
  • the calix arenes used in this patent are not soluble in water and this patent does not relate to a method of dispersing pharmaceutical or cosmetic substances.
  • the authors describe a water dispersion system using calix arenes of amphiphilic and non-hydrophilic nature. These amphiphilic calix arenas can self-assemble spontaneously and form colloidal dispersions. The addition of a hydrophobic molecule to this colloidal suspension of calix arenes is possible but is not necessary.
  • W. Yang and MM. V Amsterdam have shown that it is possible to solubilize nifedipine, furosemide and niclosamide (active substances of pharmaceutical interest very insoluble in water) using para sulfonato-calix arenes in an acidic aqueous solution.
  • nifedipine, furosemide and niclosamide active substances of pharmaceutical interest very insoluble in water
  • W. Yang and MM. V Amsterdam describe only a method of solubilization and not a colloidal dispersion method, characterized in particular by the presence of particles.
  • co-crystal systems based on non-covalent supra-molecular assembly systems, have been used to modify the pharmacokinetic and physical properties of pharmaceuticals.
  • the known non-covalent interactions are used for a crystallizing agent to be bound to a pharmaceutical substance thus conferring on it different physical properties, stability and dissolution rate.
  • the object of the invention is in particular to implement a new method consisting in dispersing hydrophobic active substances, such as substances of pharmaceutical or cosmetic interest, in aqueous solution.
  • the invention also aims to propose new dispersions that do not have all the aforementioned drawbacks in the prior art and in particular that are stable over time.
  • the object of the invention is also to propose new dispersions which can be used as vehicles for hydrophobic active substances of pharmaceutical or cosmetic interest.
  • an aqueous dispersion method of a hydrophobic molecule such as hydrophobic active substances of pharmaceutical or cosmetic interest, which comprises a step of forming a supramolecular complex between said hydrophobic molecule and said hydrophilic molecule.
  • the dispersion method according to the invention makes it possible to generate co-colloidal dispersions of hydrophobic active molecules in aqueous solution.
  • a co-colloidal dispersion is proposed in an aqueous medium of at least one amphiphilic supramolecular complex in which said amphiphilic complex comprises a hydrophilic molecule and a hydrophobic molecule associated by non-covalent bonds.
  • the present invention utilizes the formation of an inter-molecular and non-covalent association between a molecule of hydrophobic active substance, the so-called guest molecule, and a suitable host hydrophilic molecule. This association results in the formation of amphiphilic supramolecular complexes comprising a polar head and an apolar tail. In the aqueous phase, these amphiphilic supramolecular complexes are capable of self-assembly and form suspensions of particles, characteristic of colloidal dispersions. The size of the particles obtained varies between 10 nm and 1 ⁇ m, and preferably between 100 and 450 nm.
  • This method therefore makes it possible to disperse a hydrophobic molecule in an aqueous phase in the form of a dispersion of a colloidal nature.
  • An aqueous phase contains at least 50% water and may consist for example of pure water, an isotonic solution, a physiological medium or an injectable or topical pharmaceutical solute.
  • the co-colloidal dispersions described in the present invention differ from all known colloidal dispersions, for example those using lipids, in that there are no covalent bonds in the assembly of the amphiphilic entity. They therefore also differ from all known colloidal dispersions in that the hydrophobic molecule which is to be dispersed is necessary for the formation of the colloidal structure formed in an aqueous medium.
  • the co-colloidal dispersions according to the present invention consist of the assembly of two molecules, one hydrophilic and the other hydrophobic forming a complex supramolecular amphiphilic; thus, neither molecule can form a colloidal dispersion when used alone. It is therefore a question of different states of matter.
  • hydrophilic host molecules that are used in the invention use, in particular, derivatives of the family of calix arenes, and preferably anionic water-soluble calixarenes, for example the para-sulfonato calix [4] arene and para-sulphonato calix [ 6] arena.
  • hydrophilic means a compound which is soluble in water and which is capable of creating hydrogen bonds with the water molecules.
  • the calix arenes used in the present invention are hydrophilic compounds since they carry polar and ionizable functions.
  • the calix arenes used in the present invention have the general formula (I):
  • R 1 represents a hydrogen atom or a polar group, such as a hydroxyl, a carboxylate, a sulfonate, a phosphonate, a sulfonamide or an amide, or a linear, branched or cyclic alkyl, alkene or alkyne group, possibly substituted, in particular by a polar group, and preferably a hydrogen atom or a sulfonate group.
  • a polar group such as a hydroxyl, a carboxylate, a sulfonate, a phosphonate, a sulfonamide or an amide, or a linear, branched or cyclic alkyl, alkene or alkyne group, possibly substituted, in particular by a polar group, and preferably a hydrogen atom or a sulfonate group.
  • R 2 represents a polar group, such as a hydroxyl, a carboxylate, a sulfonate, a phosphonate, a sulfonamide, an amide, an ester or an alkyl, branched or substituted by a polar group and preferably a hydroxyl if R 1 is a sulfonate or a phophonate group if R 1 is a hydrogen atom.
  • R 3 R 4 , R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl, alkene or alkyne group, optionally substituted, in particular with a polar group, in particular substituted or unsubstituted hydroxyl functional groups, and preferably a hydrogen atom.
  • - n is a number between 4 and 8.
  • hydrophobic active substances that may be dispersed in the aqueous phase according to the invention are very numerous.
  • the examples described below show that the invention makes it possible to disperse in the form of co-colloidal dispersions molecules with very different chemical structures.
  • the experiments conducted show that the molecules to be dispersed must have a hydrophobic part and chemical groups that allow non-covalent interactions with the hydrophilic host molecules.
  • the non-covalent interactions involved may include hydrogen bonds, ion-ion interactions, ion-dipole interactions, cation- ⁇ interactions, ⁇ - ⁇ interactions, Van Der Walls forces, or hydrophobic interactions. .
  • the size of the hydrophobic active substance is not a limiting condition.
  • the subject of the present invention is also a process for dispersing an aqueous hydrophobic molecule of pharmaceutical interest comprising a step of forming a supramolecular amphiphilic complex between said hydrophobic molecule and a hydrophilic molecule.
  • a method of dispersing in aqueous medium a hydrophobic cosmetic agent comprising a step of forming a supramolecular amphiphilic complex between said hydrophobic agent and a hydrophilic molecule.
  • the present invention also relates to a process for obtaining co-colloidal dispersions which consists in adding a composition comprising, in an organic solvent, at least one anionic water-soluble calixarene to a composition comprising, in an organic solvent, a hydrophobic molecule, adding an aqueous solvent and then removing said organic solvent.
  • the method for obtaining co-colloidal dispersions is as follows.
  • the host molecule and the guest molecule are first solubilized separately in a strong organic solvent, preferably tetrahydrofuran (THF).
  • a strong organic solvent preferably tetrahydrofuran (THF).
  • Product quantities and solvent volumes are determined according to the desired concentrations and final volume. For example, at the laboratory scale, to obtain a co-colloidal dispersion of active substance at a final concentration of 50 mg / L, 2.5 mg of host molecule is solubilized, preferentially the para-sulfonato calix [4] arene. in 5 ml of THF and 2.5 mg of active substance are solubilized separately in 5 ml of THF. 2.) Formation of the co-colloid.
  • the two solutions are then mixed equally (5 ml for laboratory scale preparation) and kept under constant agitation, for example with a magnetic stirrer set at 350 rpm or a Vortex type apparatus. Then, the final solvent, for example pure water (50 ml), is gradually added with a fixed flow rate of 200 ml / s and maintaining constant stirring for half an hour.
  • the final solvent for example pure water (50 ml)
  • the initial organic solvent is then removed, preferably by evaporation, for example by placing the dispersion for 15 minutes, under reduced pressure and at a temperature of 40 ° C.
  • the co-colloidal dispersion finally obtained appears homogeneous, slightly opaque to visual examination, thus showing that the hydrophobic active substance has been dispersed homogeneously.
  • the active substances which can be dispersed according to the invention include, for example, substances which are active on the peripheral and central nervous system, on the renal, cardiovascular, gastrointestinal, blood, immune, hormonal, genital or reproductive functions, anti-inflammatory drugs. , antiparasitics, antibiotics, anticancer drugs, antidotes, vitamins, parenteral nutrition products or products for dermatological, topical or ophthalmic use.
  • Hydrophobic active substances of pharmaceutical interest which can be dispersed in the form of co-colloids include, for example, penclomedine, tamoxifen, tetracaine, chlorhexidine, mifepristone, etoposide, clarithromycin, benzafibrate, azithromycin, itraconazole, propofol, palmitoyl rhizoxin, clofibrate, clofibric acid, gemfibrozil, acediasulfone, acetophenetidine, 1-acetyl-2-phenylhydrazine, alexidine, ambenomium chlorate, amidinomycin, p-chlorobenzhydrazide, 2,3-diaminophenazine, dichlorphenamide, divicin, etc.
  • the term "hydrophobic" means an active substance whose solubility in water is insufficient to prepare formulations at sufficiently high concentrations to obtain the desired activity.
  • the hydrophobic active substances of pharmaceutical interest which can be dispersed in the form of co-colloids include tamoxifen, tetracaine, chlorhexidine, mifepristone, thalidomide and taxane family molecules.
  • Taxanes are a group of pharmaceuticals, including docetaxel and paclitaxel, which are used in the treatment of cancer. Taxanes have the property of preventing the growth of cancer cells by interfering with cellular structures called microtubules that play a vital role in cell division.
  • Microtubules are formed when cells begin to divide and are destroyed after cell division. Taxanes prevent the destruction of microtubules and thus prevent cells from dividing.
  • Docetaxel and paclitaxel are thus administered to patients intravenously for the treatment of cancerous diseases, in particular for cancers of the lung, prostate, ovary or breast.
  • Docetaxel and paclitaxel are poorly soluble molecules in water.
  • the preparation of a pharmaceutical formulation based on docetaxel generally requires the prior solubilization of docetaxel in a mixture based on ethanol and polysorbate, and then diluting the solution thus obtained in an aqueous solution. This transparent solution is then injected as an intravenous infusion.
  • the process according to the invention has the advantage of dispersing docetaxel in an aqueous medium without using polysorbate. A less toxic pharmaceutical formulation is thus obtained which can be administered intravenously.
  • this medicament when the drug in the form of a co-colloidal dispersion in an aqueous medium of at least one amphiphilic complex comprising at least one water-soluble anionic calixarene and docetaxel is administered, this medicament has the additional advantage of leading to an effect. anti-cancerous satisfying.
  • the present invention thus relates to an anticancer drug in the form of a co-colloidal dispersion in an aqueous medium of at least one amphiphilic complex comprising at least one water-soluble anionic calix arene and a molecule of the taxane family.
  • the present invention relates to a medicament in the form of a co-colloidal dispersion in an aqueous medium of at least one amphiphilic complex comprising at least one water-soluble anionic calix arone and docetaxel.
  • the invention relates to a medicament in the form of a co-colloidal dispersion in an aqueous medium of at least one amphiphilic complex comprising at least one water-soluble anionic calix arone and docetaxel for its intravenous use for the treatment of cancerous diseases.
  • this drug is used for the treatment of breast and lung cancer.
  • Docetaxel may be present in the co-colloidal dispersion in a concentration of from 0.01% to 1% by weight, based on the total weight of the dispersion.
  • thalidomide is a molecule known for its anti-angiogenic properties. These properties make it a drug used for the treatment of a form of cancer called multiple myeloma.
  • Thalidomide is a drug that is usually given orally. Furthermore, there is no pharmaceutical formulation of thalidomide allowing parenteral administration.
  • the process according to the invention has the advantage of dispersing thalidomide in an aqueous medium.
  • a pharmaceutical formulation is thus obtained which can be administered parenterally, for example intravenously, intramuscularly, subcutaneously or intravitreally.
  • the present invention therefore also relates to a medicament in the form of a co-colloidal dispersion in aqueous medium of at least one amphiphilic complex comprising at least one water-soluble anionic calixarene and thalidomide.
  • this drug can be administered to cancer patients and for whom oral administration is difficult or impossible.
  • the thalidomide prepared can be administered by a parenteral route, and especially by the intravenous route.
  • thalidomide can also be administered to patients intravitreally for the treatment of age-related macular degeneration (AMD).
  • AMD age-related macular degeneration
  • AMD is a disease of the retina caused by progressive degeneration of the macula, the central part of the retina, which appears most often from the age of 50, and more frequently from the age of 65, causing a weakening important visual abilities, without destroying them.
  • AMD is characterized by the appearance of choroidal neovessels.
  • the latter are either subepithelial, that is to say that they develop under the pigment epithelium and therefore called “occult” or supe- epithelial and so called “visible”. Because of its antiangiogenic properties, thalidomide can prevent the development of its new vessels and thus help stabilize the progression of the disease.
  • the present invention thus relates more particularly to a medicament in the form of a co-colloidal dispersion in an aqueous medium of at least one amphiphilic complex comprising at least one water-soluble anionic calixarene and thalidomide for its intravitreal use for the treatment of age-related macular degeneration.
  • Thalidomide may be present in the co-colloidal dispersion in a concentration of from 0.01% to 1% by weight, based on the total weight of the dispersion.
  • the co-colloidal dispersions may also contain various additives such as osmotic pressure regulators, for example sucrose or glycerine, oxidants such as alpha-tocopherol or ascorbic acid or preservatives such as methyl ethyl and butyl paraben.
  • osmotic pressure regulators for example sucrose or glycerine
  • oxidants such as alpha-tocopherol or ascorbic acid
  • preservatives such as methyl ethyl and butyl paraben.
  • compositions for cosmetic use of the invention include preparations for the skin or hair, such as shampoos, skin preparations or sunscreen lotions.
  • FIGS. 1 to 4 show the co-colloidal dispersions in accordance with the present invention which have been characterized by means of different analysis techniques.
  • a co-colloidal dispersion is prepared according to the process described above.
  • 2.5 mg of para-sulfonato calix [4] arene (designated C4S in the tables below) is solubilized in 5 mL of THF and solubilized separately in a second solution, 2.5 mg of tamoxifen (anticancer) in 5 mL of THF.
  • Tamoxifen is a hydrophobic active substance.
  • the two solutions are then mixed in equal parts and kept under constant agitation with a magnetic stirrer set at 350 rpm or a Vortex type apparatus. 50 mL of pure water is then gradually added at a fixed rate of 200 mL / sec while maintaining constant agitation for half an hour.
  • the THF is then evaporated off by placing the mixture for 15 minutes under reduced pressure at a temperature of 40 ° C.
  • This process was also carried out four times using para-sulphonato calix [4] arene and tetracaine at different concentrations to obtain co-colloidal dispersions with different final concentrations of para-sulphonato calix [4] arene and tetracaine. (local anesthetic).
  • Tamoxifen, tetracaine, chlorhexidine and mifepristone used in these preparations are pharmacologically active substances known for their low solubility in water.
  • the following table indicates the co-colloidal dispersions that have been obtained as well as the final concentrations of calix arenes (host molecules) and of hydrophobic active substances (guest molecules) present in such dispersions.
  • the intensity variations of the scattered light are related to the diffusion rates of the molecules in the studied region, because these are animated by a Brownian motion.
  • the data is directly analyzed to give the diffusion coefficients. When several molecular species are present, a distribution of diffusion coefficients can be observed. These data are then processed to obtain the particle diameter. Indeed, the relation between the diffusion coefficient and the size is based on the theoretical relations of the Brownian motion of the spherical particles (Stockes-Einstein law). Thus, for a medium of known viscosity, the measurement of the translation diffusion coefficient is sufficient to calculate the hydrodynamic radius of the particles.
  • the determination of the size of the particles in solution is carried out at room temperature. The analyzes are made using a MALVERN 4700C spectrometer. The light source used is a SIEMENS 40MW laser. Each measurement is repeated ten times, the sizes and the polydispersity indices retained corresponding to the average of the ten measurements.
  • Exploration in Atomic Force Microscopy consists of the analysis of a surface, thanks to a fine tip a few micrometers long and a hundred Angstroms in diameter, mounted at the end of a movable silicon arm, called microlevier, having a known force constant.
  • the various devices marketed have various geometries.
  • the AFM used is based on the technique of Explorer (Topometrix Inc.).
  • Explorer Topicometrix Inc.
  • the piezoelectric ceramic used to generate the scanning movement carries the microlevier.
  • the ceramic carries the sample, the rest of the AFM head being static. The balance of forces exerted between the surface of the sample and the tip causes variations in the position of the micro-lever.
  • the signal is collected on a four-dial photodetector via the reflection of a laser on the microlever whose deflection is measured, proportional to the forces acting on the probe. These data are then transformed into spatial coordinates, thus generating an image of the surface.
  • AFM measures the forces between the tip and the sample. These forces depend on the nature of the sample and the distance between the tip and the sample. When the tip approaches the surface, it first experiences attractive long-range forces (van der Waals forces). Then, when approaching the surface, the electron orbitals of the tip and sample create repulsive forces that neutralize the attractive forces before becoming the dominant forces. Measurements are made using a "Explorer ThermoMicroscope" microscope equipped with a 100 ⁇ m scanner, in non-contact mode. The scanning speed is 1-2 Hz. For each sample, the scans were made at 50 ⁇ m, 20 ⁇ m, 10 ⁇ m and 5 ⁇ m. The microleviers are in silicon, the resonance frequency f 0 is
  • FIG. 1 represents the image obtained by atomic force microscopy of a co-colloidal dispersion based on tamoxifen and para sulfonate calix [6] arene C6S according to example No. 2.
  • a topographic analysis of the size of these particles reveals a height of 75 nm and a diameter of approximately 300 nm. This diameter is slightly larger than that determined by light scattering (see results below) and can be explained by the slight flattening of the particles following drying of the sample.
  • FIG. 2 represents images of a co-colloidal dispersion according to Example No. 2 in scanning electron microscopy with three different magnifications; the scales (50 ⁇ m, 10 ⁇ m and 1 ⁇ m) are indicated on the images.
  • FIG. 3 represents images of a co-colloidal dispersion according to example n ° 2 obtained by transmission electron microscopy after negative staining with three different magnifications: the scales (2 ⁇ m, 100 nm and 200 nm) are indicated on the images. With respect to images that indicate a 200 nm scale, these were made at two different locations of the co-colloidal dispersion.
  • FIG. 4 represents images of a co-colloidal dispersion according to Example No. 2 obtained by transmission electron microscopy after negative cold fracture with two different magnifications; the scales (2 ⁇ m and 200 nm) are indicated on the images. With regard to the images which indicate a scale of 200 nm, the latter were made at three different places of the colloidal dispersion.
  • the measurements were repeated ten times and show the existence of a co-colloidal dispersion consisting of monodisperse particles having an average diameter of about 230 nm.
  • the polydispersity index is 0.03 demonstrating that the particles have a constant diameter.
  • the stability of the co-colloidal dispersions according to Examples 1 to 12 was studied for temperatures of 4, 20, 40 and 80 ° C.
  • the dispersions are placed in temperature-controlled enclosures and samples are taken periodically to analyze particle size and polydispersity or atomic force microscopy morphology. The results are grouped in the following table.
  • Tamoxifen 50 mg / 1 average particle size decreases from 190 to 175 nm over a period of 15 days
  • Tamoxifen 50 mg / 1
  • Tetracaine (50 mg / l) stable for 28 days.
  • the average particle size decreases from 205 to 165 nm and over a period of 15 days and is then kept stable for 28 days.
  • Tetracaine (50 mg / 1) days.
  • the light scattering analyzes show that the particle size in the presence of BSA exceeds 1 ⁇ m but these are still monodispersed. This phenomenon is explained by the presence of a protective protein matrix that envelops the colloidal particles.
  • the images obtained by atomic force microscopy on the contrary reveal the existence of particles much smaller than the normal size of the colloidal particles (15 nm instead of 200 nm or 1000 nm). This is explained by the fact that BSA forms a fairly dense protein gel which covers the co-colloidal particles and leaves only a part of the particles on the surface of the field examined by the atomic force microscope. Therefore, it appears that interactions with the main blood protein do not denature co-colloidal systems, but that albumin can form a matrix around the particles, which could protect them during transport in the blood.
  • Docetaxel, azacytidine and thalidomide are pharmacologically active substances known for their low solubility in water and known for their therapeutic activity against certain types of cancer.
  • Co-colloidal dispersions were prepared according to the method described above and stored for one week at room temperature. The average particle size was measured by DLS according to the method described above.
  • Calu-6 cells are human lung tumor cells.
  • the animals are randomly distributed in treatment groups.
  • the animals receive a series of intravenous injections of placebo or docetaxel formulated as a co-colloidal dispersion at concentrations ranging between 0.01 and 1%.
  • the animals are subjected to a daily clinical examination during which the volume of the tumor is measured. There is a satisfactory anticancer effect of treatment with docetaxel formulated as co-colloids.
  • Rabbits of the Fauve de Bourgogne strain are used to induce choroidal neovacularization. Burns of an area of about 75 ⁇ m are induced in the right eye of the animals using a 532 nm argon laser applied for 0.1 seconds at an intensity of 150 mW and using a Viridis photocoagulator. (Quantel Medical) around the optic disc and between the main vascular branches.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode permettant de préparer des dispersions co-colloïdales de substances actives hydrophobes, telles que des produits pharmaceutiques, des produits ayant une activité cosmétiques ou tout autre produit chimique. Les dispersions co-colloïdales ainsi obtenues sont caractérisées en ce qu' elles sont formées par des complexes amphiphiles résultant d' associations par des liaisons non-covalentes entre une substance active hydrophobe et une molécule hydrophile appropriée.

Description

Co-colloïdes supramoléculaires obtenus à l'aide de systèmes macrocycliques polyanioniques
La présente invention décrit une méthode de dispersion de substances hydrophobes en phase aqueuse. Une telle méthode est utile pour de nombreuses applications, notamment pour la formulation de substances actives pharmaceutiques ou cosmétiques.
L'un des problèmes majeurs rencontré lors du développement et de l'utilisation de nombreuses substances biologiquement actives réside dans leur nature hydrophobe. En phase aqueuse, les substances actives hydrophobes ont tendance à précipiter, limitant ainsi considérablement leurs concentrations biodisponibles et leurs activités biologiques. Il est possible d'augmenter la concentration biodisponible de substances actives hydrophobes en phase aqueuse de plusieurs façons, par exemple, par inclusion dans des molécule hôtes appropriées, telles que des cyclodextrines, ou bien par encapsulation dans une dispersion colloïdale appropriée, telle que des micelles, des liposomes ou des nanoparticules lipidiques. Les méthodes d' encapsulation peuvent également apporter une protection des molécules contre la dégradation par la lumière ou par des réactions enzymatiques. Les autres méthodes qui permettent de modifier la concentration des substances actives sont l'utilisation de co- solvants ou de co-solutés ou les modifications de pH. Par ailleurs, l'utilisation de co-cristaux permet la modification de cinétique de dissolution et permet ainsi de modifier la signature phaπnacocinétique d'une substance active.
Pour préparer des dispersions colloïdales, on utilise une ou plusieurs molécules amphiphiles. Une molécule amphiphile est une molécule qui combine de façon covalente un groupe hydrophobe apolaire et un groupe hydrophile polaire. Les molécules amphiphiles ont une double affinité, pour les phases apolaires (air, huile, solvants organiques) d'une part, et pour l'eau, d'autre part. Les lipides sont des exemples de molécules amphiphiles.
Au dessus d'une concentration critique dans un environnement aqueux, les molécules amphiphiles sont généralement capables de s' auto-assembler en formant des structures de nature colloïdale, caractérisées par la présence de particules en suspension. Le type de structure colloïdale obtenu dépend de la structure chimique des molécules amphiphiles, et notamment du rapport de la taille de la tête polaire et de la taille de la queue apolaire de la molécule.
Les dispersions colloïdales peuvent être utilisées pour augmenter la concentration biodisponible des substances actives hydrophobes. Le principe est que la substance active hydrophobe doit être associée avec les groupements hydrophobes des molécules amphiphiles. Toutefois, un inconvénient des méthodes utilisant des molécules amphiphiles réside dans le fait que le pourcentage maximum (appelé aussi facteur de charge qui est calculé en unité de poids) de substances actives pouvant être dispersées dans la structure colloïdale est trop faible, de l'ordre de 5 à 10 %. Un autre inconvénient de ces assemblages colloïdaux est leur faible stabilité dans le temps, notamment à température ambiante.
Ces problèmes ont été surmontés par l'utilisation de nanoparticules lipidiques solides (également connues sous l'abbréviation SLN pour « solid lipid nanoparticles » en anglais) qui regroupe les nanocapsules et les nanosphères polymériques. De telles structures sont de nature matricielle. Dans ce cas, les facteurs de charge sont généralement plus élevés, de l'ordre de 30%, et la stabilité dans le temps est améliorée. Par ailleurs, des méthodes utilisant des produits de la famille des calix arènes ont été décrites. Ainsi, le brevet US 2005/0240051 Al de N. Yasuda et M. Furukawa décrit notamment une méthode utilisant des calix arènes pour solubiliser des matériaux à base de carbone, tels que des fullérènes, du graphite, du diamant et des colorants, dans un solvant organique non aqueux tel que le toluène, une huile ou une résine. Cependant, les calix arènes utilisés dans ce brevet ne sont pas solubles dans l'eau et ce brevet ne concerne pas une méthode de dispersion des substances pharmaceutiques ou cosmétiques. Dans la demande de brevet WO 03/024583, les auteurs décrivent un système de dispersion dans l'eau utilisant des calix arènes de nature amphiphile et non hydrophile. Ces calix arènes amphiphiles peuvent s'auto-assembler spontanément et former des dispersions colloïdales. L'addition d'une molécule hydrophobe à cette suspension colloïdale de calix arènes est possible mais n'est pas nécessaire.
Dans deux articles (Eur. J. Pharm. Biopharm., 2004, 58(3), 629- 636 et J. Pharm. Pharmacol., 2004, 56(6), 703-708), W. Yang et MM. De villiers ont montré qu'il était possible de solubiliser la nifédipine, le furosémide et la niclosamide (des substances actives d'intérêt pharmaceutiques très peu solubles dans l'eau) en utilisant des para sulfonato-calix arènes dans une solution aqueuse acide. Cependant, les objectifs de ces travaux et les procédés utilisés sont différents de la présente invention. En effet, W. Yang et MM. De villiers ne décrivent qu'une méthode de solubilisation et non une méthode de dispersion colloïdale, notamment caractérisée par la présence de particules.
Plus récemment, les systèmes de co-cristaux, fondés sur des systèmes d'assemblages supra-moléculaires non-covalents ont été utilisés pour modifier les propriétés pharmacocinétiques et physiques des produits pharmaceutiques. Dans ce cas, on utilise les interactions non-covalentes connues pour qu'un agent cristallisant soit lié à une substance pharmaceutique lui conférant ainsi des propriétés physiques, une stabilité et un taux de dissolution différents.
Au vu de ce qui précède, l'invention a notamment pour but de mettre en œuvre une nouvelle méthode consistant à disperser des substances actives hydrophobes, telles que des substances d'intérêt pharmaceutiques ou cosmétiques, en solution aqueuse.
L'invention a également pour objet de proposer de nouvelles dispersions qui ne présentent pas l'ensemble des inconvénients précités dans l'art antérieur et en particulier qui sont stables dans le temps. Enfin, l'invention a également pour objet de proposer de nouvelles dispersions qui peuvent être utilisées comme véhicules pour des substances actives hydrophobes d'intérêt pharmaceutique ou cosmétique.
De manière surprenante et avantageuse, le demandeur vient maintenant de découvrir que ces buts pouvaient être atteints en mettant en œuvre un procédé de dispersion en milieu aqueux d'une molécule hydrophobe, telle que des substances actives hydrophobes d'intérêt pharmaceutiques ou cosmétiques, qui comprend une étape consistant à former un complexe supramoléculaire entre ladite molécule hydrophobe et ladite molécule hydrophile.
Dans la suite du texte, les dispersions ainsi obtenues dans le cadre de la présente invention, sont désignées par les termes « dispersions co-colloïdales ».
Ainsi, le procédé de dispersion selon l'invention, permet de générer des dispersions co-colloïdales de molécules actives hydrophobes en solution aqueuse.
De plus, ces dispersions co-colloïdales sont stables dans le temps.
Ainsi, selon une première variante de l'invention, il est proposé une dispersion co-colloïdale dans un milieu aqueux d'au moins un complexe supramoléculaire amphiphile dans laquelle ledit complexe amphiphile comprend une molécule hydrophile et une molécule hydrophobe associées par des liaisons non covalentes.
La présente invention utilise la formation d'une association inter-moléculaire et non-covalente entre une molécule de substance active hydrophobe, dite molécule invitée et une molécule hydrophile hôte appropriée. Cette association résulte dans la formation de complexes supramoléculaires amphiphiles comprenant une tête polaire et une queue apolaire. En phase aqueuse, ces complexes supramoléculaires amphiphiles sont capables de s'auto-assembler et former des suspensions de particules, caractéristiques des dispersions colloïdales. La taille des particules obtenues varie entre 10 nm et 1 μm, et préférentiellement entre 100 et 450 nm.
Cette méthode permet donc de disperser une molécule hydrophobe dans une phase aqueuse sous forme d'une dispersion de nature colloïdale. Une phase aqueuse contient au moins 50% d'eau et peut être constituée par exemple d'eau pure, d'une solution isotonique, d'un milieu physiologique ou d'un soluté pharmaceutique injectable ou à usage topique. Les dispersions co-colloïdales décrites dans la présente invention diffèrent de toutes les dispersions colloïdales connues, par exemple celles qui utilisent des lipides, en ce qu'il n'existe pas de liaisons covalentes dans l'assemblage de l'entité amphiphile. Elles diffèrent donc également de toutes les dispersions colloïdales connues en ce que la molécule hydrophobe que l'on veut disperser est nécessaire à la formation de la structure colloïdale formée en milieu aqueux.
Ainsi, à l'inverse des dispersions colloïdales décrites dans la demande de brevet WO 03/024583, les dispersions co-colloïdales selon la présente invention sont constituées par l'assemblage de deux molécules, l'une hydrophile et l'autre hydrophobe formant un complexe supramoléculaire amphiphile; ainsi, aucune des deux molécules ne peut former une dispersion colloïdale quand elle est utilisée seule. Il s'agit donc bien d'états de matière différents.
Les molécules hôtes hydrophiles qui sont utilisées dans l' invention utilisent notamment des dérivés de la famille des calix arènes, et préférentiellement des calix arènes hydrosolubles anioniques, par exemple les molécules de para-sulfonato calix[4]arène et de para- sulfonato calix[6] arène.
Par hydrophile, on entend au sens de la présente invention, un composé soluble dans l'eau qui est capable de créer des liaisons hydrogènes avec les molécules d'eau.
En particulier, les calix arènes utilisés dans la présente invention sont des composés hydrophiles étant donné qu'ils portent des fonctions polaires et ionisables.
Les calix arènes utilisées dans la présente invention présentent la formule générale (I) :
dans laquelle,
- R1 représente un atome d'hydrogène ou un groupement polaire, tel qu'un hydroxyl, un carboxylate, un sulfonate, un phosphonate, un sulfonamide ou un amide, ou un groupement alkyle, alcène ou alcyne, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitués, notamment par un groupement polaire, et préférentiellement un atome d'hydrogène ou un groupe sulfonate.
- R2 représente un groupe polaire, tel qu'un hydroxyle, un carboxylate, un sulfonate, un phosphonate, un sulfonamide, un amide, un ester ou un alkyl, ramifié ou substitué par un groupement polaire et préférentiellement un hydroxyle si R1 est un sulfonate ou un groupe phophonate si R1 est un atome d'hydrogène.
- R3 R4, R5, R6 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alcène ou alcyne, éventuellement substitué, notamment par un groupement polaire, en particulier des fonctions hydroxyles, substituées ou pas, et préférentiellement un atome d'hydrogène.
- X représente un atome de carbone, (lorsque x=l et y=l) de soufre ou d'oxygène (lorsque x=0 et y=0) ou d'azote (lorsque x=l et y=0) ;
- n est un nombre compris entre 4 et 8.
Les substances actives hydrophobes invitées susceptibles d' être dispersées en phase aqueuse selon l'invention sont très nombreuses. Les exemples décrits ci-dessous montrent que l'invention permet de disperser sous forme de dispersions co-colloïdales des molécules ayant des structures chimiques très différentes. Les expériences conduites montrent que les molécules à disperser doivent présenter une partie hydrophobe et des groupes chimiques qui permettent les interactions de nature non covalente avec les molécules hôtes hydrophiles. Les interactions de nature non-covalentes mises en jeu peuvent inclure des liaisons hydrogènes, des interactions ion-ion, des interactions ion- dipôle, des interactions cation-π, des interactions π-π, des forces de Van Der Walls ou des interactions hydrophobes. La taille de la substance active hydrophobe ne constitue pas une condition restrictive. Ainsi la présente invention a également pour objet un procédé de dispersion en milieu aqueux d'une molécule hydrophobe d'intérêt pharmaceutique comprenant une étape consistant à former un complexe amphiphile supramoléculaire entre ladite molécule hydrophobe et une molécule hydrophile.
En variante, il est également proposé un procédé de dispersion en milieu aqueux d'un agent cosmétique hydrophobe comprenant une étape consistant à former un complexe amphiphile supramoléculaire entre ledit agent hydrophobe et une molécule hydrophile.
La présente invention concerne également un procédé permettant d'obtenir des dispersions co-colloïdales qui consiste à ajouter une composition comprenant, dans un solvant organique, au moins un calix arène hydrosoluble anionique à une composition comprenant, dans un solvant organique, une molécule hydrophobe, à ajouter un solvant aqueux puis à éliminer ledit solvant organique.
En particulier, le procédé permettant d'obtenir des dispersions co-colloïdales est le suivant.
1.) Solubilisation des molécules en solvant organique.
La molécule hôte et la molécule invitée sont préalablement solubilisées séparément dans un solvant organique puissant, préférentiellement le tétrahydrofurane (THF). Les quantités de produits et les volumes de solvant sont déterminés en fonction des concentrations et du volume final souhaités. Par exemple, à l'échelle du laboratoire, pour obtenir une dispersion co-colloïdale de substance active à une concentration finale de 50 mg/L, on solubilise 2,5 mg de molécule hôte, préférentiellement le para-sulfonato calix[4]arène, dans 5 mL de THF et on solubilise séparément 2,5 mg de substance active dans 5 ml de THF. 2.) Formation du co-colloïde.
Les deux solutions sont ensuite mélangées à part égale (5 mL pour une préparation à l'échelle du laboratoire) et maintenues sous agitation constante, par exemple avec un agitateur magnétique réglé à 350 tours par minutes ou un appareil de type Vortex. Puis, le solvant final, par exemple de l'eau pure (50 mL), est progressivement ajouté avec un débit fixe de 200 mL/s et en maintenant une agitation constante pendant une demi-heure.
3.) Formation du co-colloïde.
Le solvant organique initial est ensuite éliminé, préférentiellement par évaporation, par exemple en plaçant la dispersion pendant 15 minutes, sous pression réduite et à une température de 40°C.
La dispersion co-colloïdale finalement obtenue apparaît homogène, légèrement opaque à l'examen visuel, montrant ainsi que la substance active hydrophobe a été dispersée de façon homogène.
Les conditions techniques (volumes de solvant, quantités de produits, durée de chaque phase, etc.) indiquées ci-dessus sont données à titre d'exemple et peuvent, bien entendu, être adaptées en fonction de la nature de la substance active hydrophobe, ainsi que des volumes et des concentrations finales souhaitées.
Les substances actives qui peuvent être dispersés selon l' invention incluent par exemple des substances actives sur le système nerveux périphérique et central, sur les fonctions rénales, cardiovasculaires, gastro-intestinales, sanguines, immunes, hormonales, génitales ou reproductives, des anti-inflammatoires, des antiparasitaires, des antibiotiques, des anticancéreux, des antidotes, des vitamines, des produits pour la nutrition parentérale ou des produits à usage dermatologique, topique ou ophtalmologique. Les substances actives hydrophobes d'intérêt pharmaceutique qui peuvent être dispersées sous forme de co-colloïdes incluent par exemple la penclomédine, le tamoxifène, la tétracaïne, la chlorhexidine, la mifepristone, l'étoposide, la clarithromycine, le benzafibrate, l' azithromycine, l'itraconazole, le propofol, le palmitoyl de rhizoxin, le clofibrate, l' acide clofibrique, le gemfibrozil, l'acediasulfone, l'acétophenetidine, le l-acétyl-2-phénylhydrazine, l'alexidine, le chlorate d'ambenomium, l'amidinomycine, le p-chlorobenzhydrazide, la 2,3-diaminophénazine, le dichlorphénamide, la divicine, etc. Par hydrophobe, on entend au sens de la présente invention, une substance active dont la solubilité dans l'eau est insuffisante pour préparer des formulations à des concentrations suffisamment élevées pour obtenir l'activité recherchée.
De préférence, les substances actives hydrophobes d'intérêt pharmaceutique pouvant être dispersées sous forme de co-colloïdes incluent le tamoxifène, la tétracaïne, la chlorhexidine, la mifepristone, la thalidomide et les molécules de la famille des taxanes.
Les taxanes constituent un groupe de produits pharmaceutiques, incluant notamment le docétaxel et le paclitaxel, qui sont utilisés dans le traitement du cancer. Les taxanes ont la propriété de prévenir la croissance des cellules cancéreuses en interférant avec des structures cellulaires appelées microtubules qui jouent un rôle essentiel pour la division cellulaire.
Les microtubules se forment quand les cellules commencent à se diviser et sont détruits après la division cellulaire. Les taxanes empêchent la destruction des microtubules et empêchent ainsi les cellules de se diviser. Le docétaxel et la paclitaxel sont ainsi administrés aux patients par voie intraveineuse pour le traitement de maladies cancéreuses, notamment pour les cancers du poumon, de la prostate, de l'ovaire ou du sein. Le docétaxel et le paclitaxel sont des molécules peu solubles dans l'eau. Ainsi la préparation d'une formulation pharmaceutique à base de docétaxel nécessite généralement de solubiliser préalablement le docétaxel dans un mélange à base d'éthanol et de polysorbate, puis de diluer la solution ainsi obtenue dans une solution aqueuse. Cette solution transparente est ensuite injectée sous forme de perfusion intraveineuse.
Toutefois, la présence résiduelle de polysorbate dans une telle solution peut entraîner des effets toxiques significatifs lors de l'administration de ladite solution par voie intraveineuse. Ces effets toxiques peuvent nécessiter de pré-traiter les patients avec un médicament anti-inflammatoire.
Ainsi, le procédé selon l'invention présente l' avantage de disperser le docétaxel en milieu aqueux sans utiliser de polysorbate. On obtient donc une formulation pharmaceutique moins toxique qui peut être administrée par voie intraveineuse.
Par ailleurs, lorsque le médicament sous forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et du docétaxel est administré, ce médicament présente l'avantage supplémentaire de conduire à un effet anti-cancéreux satisfaisant.
La présente invention concerne donc un médicament anticancéreux sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calix arène anionique hydrosoluble et d'une molécule de la famille des taxanes. En particulier, la présente invention a pour objet un médicament sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calix arène anionique hydrosoluble et du docétaxel. Plus particulièrement, l'invention concerne un médicament sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d' au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calix arène anionique hydrosoluble et du docétaxel pour son utilisation par voie intraveineuse pour le traitement des maladies cancéreuses. En particulier, ce médicament est utilisé pour le traitement du cancer du sein et des poumons.
Le docétaxel peut être présent dans la dispersion co-colloïdale dans une concentration allant de 0,01% à 1% en poids, par rapport au poids total de la dispersion. Par ailleurs, la thalidomide est une molécule connue pour ses propriétés anti-angiogène. Ces propriétés en font un médicament utilisé pour le traitement d'une forme de cancer appelé myélome multiple.
La thalidomide est un médicament généralement administré par voie orale. Par ailleurs, il n'existe pas de formulation pharmaceutique de la thalidomide permettant une administration par voie parentérale.
Ainsi, le procédé selon l'invention présente l' avantage de disperser la thalidomide en milieu aqueux. On obtient donc une formulation pharmaceutique qui peut être administrée par voie parentérale, par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire, souscutanée ou intravitréale.
La présente invention a donc également pour objet un médicament sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et de la thalidomide. En particulier, ce médicament peut être administré aux patients atteints de cancer et pour lesquels l'administration par voie orale est difficile voire impossible.
En effet, certains patients présentent des lésions de la région buccopharyngée ou de l'œsophage qui rendent l'administration de médicaments par voie orale très difficile. Dans ce cas, la thalidomide préparée peut être administrée par une voie parentérale, et notamment par la voie intraveineuse.
En particulier, la thalidomide peut également être administrée aux patients par voie intravitréale pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA).
La DMLA est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la macula, partie centrale de la rétine, qui apparaît le plus souvent à partir de l'âge de 50 ans, et plus fréquemment à partir de 65 ans, provoquant un affaiblissement important des capacités visuelles, sans toutefois les anéantir.
La DMLA est caractérisée par l'apparition de néovaisseaux choroïdiens. Ces derniers sont soit sous-épithéliaux, c'est-à-dire qu'ils se développent sous l'épithélium pigmentaire et donc dits, "occultes", soit sus-épithéliaux et donc dits "visibles". A cause des ses propriété antiangiogène, la thalidomide peut prévenir le développement de ses nouveaux vaisseaux et donc contribuer à stabiliser la progression de la maladie.
La présente invention concerne ainsi plus particulièrement un médicament sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et de la thalidomide pour son utilisation par voie intravitréale pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge. La thalidomide peut être présente dans la dispersion co- colloïdale dans une concentration allant de 0,01 % à 1 % en poids, par rapport au poids total de la dispersion.
Les dispersions co-colloïdales peuvent également contenir des additifs divers tels que des régulateurs de pression osmotique, par exemple le sucrose ou la glycérine, des oxydants tels que l'alpha- tocophérol ou l' acide ascorbique ou des conservateurs tels que le méthyl, l'éthyl- et le butyl-parabène.
Les compositions à usage cosmétique de l'invention incluent des préparations pour la peau ou les cheveux, tels que des shampoings, des préparations à usage cutané ou des lotions de protection solaires.
Les exemples qui suivent sont destinés à mieux comprendre l' invention sans présenter un caractère limitatif. Ces exemples sont illustrés par les figures 1 à 4 annexées représentant les dispersions co- colloïdales conformes à la présente invention qui ont été caractérisées au moyen de différentes techniques d'analyse.
EXEMPLES
Préparation des dispersions co-colloïdales
Les exemples décrits ci-dessous ont permis de caractériser la méthode de préparation des dispersions co-colloïdales ainsi que de caractériser la qualité desdites dispersions.
On prépare une dispersion co-colloïdale selon le procédé décrit ci-dessus. Ainsi, dans une première solution, on solubilise 2,5 mg de para-sulfonato calix[4]arène (désigné C4S dans les tableaux ci-dessous) dans 5 mL de THF et on solubilise séparément, dans une deuxième solution, 2,5 mg de tamoxifène (anticancéreux) dans 5 mL de THF. Le tamoxifène est une substance active hydrophobe.
Les deux solutions sont ensuite mélangées à part égale et maintenues sous agitation constante avec un agitateur magnétique réglé à 350 tours par minutes ou un appareil de type Vortex. 50 mL d' eau pure est ensuite progressivement ajoutée avec un débit fixe de 200 mL/s tout en maintenant une agitation constante pendant une demi-heure.
On évapore ensuite le THF en plaçant le mélange pendant 15 minutes, sous pression réduite à une température de 400C.
A la suite de ce procédé, on obtient une dispersion co-colloïdale ayant une concentration finale en tamoxifène et en para-sulfonato calix[4]arène de 50mg/L. La dispersion co-colloïdale apparaît homogène et légèrement opaque à l'examen visuel, ce qui indique que le tamoxifène a été dispersée de façon homogène.
Ce procédé a été réalisé à trois reprises en utilisant le para sulfonato calix[6]arène (désigné par le terme C6S dans les tableaux ci- dessous) et le tamoxifène à différentes concentrations afin d'obtenir des dispersions co-colloïdales ayant des concentrations finales en para sulfonato calix[6]arène et en tamoxifène différentes.
Ce procédé a également été réalisé à quatre reprises en utilisant le para sulfonato calix[4] arène et la tétracaïne à différentes concentrations afin d'obtenir des dispersions co-colloïdales ayant des concentrations finales différentes en para sulfonato calix[4]arène et en tétracaïne (anesthésique local).
Ce procédé a été réalisé à deux reprises en utilisant le para sulfonato calix[6] arène et le para sulfonato calix[4] arène avec la chlorhexidine (antibiotique) à des concentrations égales.
Ce procédé a été réalisé à deux reprises en utilisant le para sulfonato calix[6] arène et le para sulfonato calix[4] arène avec la mifepristone (abortif) à des concentrations égales.
Le tamoxifène, la tétracaïne, la chlorhexidine et le mifepristone utilisées dans ces préparations sont des substances pharmacologiquement actives connues pour leur faible solubilité dans l' eau.
Le tableau suivant indique les dispersions co-colloïdales qui ont été obtenues ainsi que les concentrations finales en calix arènes (molécules hôtes) et en substances actives hydrophobes (molécules invitées) présentes dans de telles dispersions.
Exemple Molécule hôte (concentration finale) Molécule invitée (concentration finale)
No
1 C4S (50 mg/1) Tamoxifène (50 mg/1)
2 C6S (50 mg/1) Tamoxifène (50 mg/1)
3 C6S (55 mg/1) Tamoxifène (25 mg/1)
4 C6S (87,4 mg/1) Tamoxifène (12,4 mg/1)
5 C4S (50 mg/1) Tétracaïne (50 mg/1)
6 C4S (70 mg/1) Tétracaïne (30 mg/1)
7 C4S (83 mg/1) Tétracaïne (17 mg/1)
8 C4S (50 mg/l) Tétracaïne (50 mg/1)
9 C4S (50 mg/1) Chlorhexidine (50 mg/1)
10 C6S (50 mg/1) Chlorhexidine (50 mg/1)
11 C4S (50 mg/1) Mifepristone (50 mg/1)
12 C6S (50 mg/1) Mifepristone (50 mg/1)
Dans tous les cas, on obtient une dispersion co-colloïdale homogène légèrement blanchâtre. Ainsi, les molécules actives hydrophobes ont été dispersées dans une phase aqueuse alors qu'elles sont peu ou faiblement solubles dans l'eau. De cette façon, ces dispersions co-colloïdales peuvent être utilisées comme véhicules pour des substances actives hydrophobes d'intérêt pharmaceutique.
Différentes techniques ont été ensuite employées afin de caractériser une dispersion co-colloïdale ayant une concentration finale en tamoxifène et en para-sulfonato calix[6]arène égales à 50 mg/L (correspondant à l'exemple n°2 dans le tableau décrit ci-dessus). En particulier, on a utilisé la diffusion dynamique de la lumière, la microscopie à force atomique, la microscopie électronique à balayage et la microscopie électronique à transmission. Ces techniques permettent une analyse des particules colloïdales en suspension en phase aqueuse ou après séchage. La technique de diffusion dynamique de la lumière (ou DLS pour Dynamic Light Scaterring en langue anglaise) permet d'obtenir des informations concernant la taille des particules. Lorsqu'un faisceau lumineux monochromatique et polarisé rencontre une particule, la lumière est diffusée dans toutes les directions de l'espace. Les variations d'intensité de la lumière diffusée sont liées aux taux de diffusion des molécules dans la région étudiée, car celles-ci sont animées d'un mouvement brownien. Les données sont directement analysées pour donner les coefficients de diffusion. Lorsque plusieurs espèces moléculaires sont présentes, une distribution des coefficients de diffusion peut être observée. Ces données sont ensuite traitées pour obtenir le diamètre des particules. En effet, la relation entre le coefficient de diffusion et la taille est fondée sur les relations théoriques du mouvement brownien des particules sphériques (loi de Stockes-Einstein). Ainsi, pour un milieu de viscosité connue, la mesure du coefficient de diffusion de translation est suffisante pour calculer le rayon hydrodynamique des particules. La détermination de la taille des particules en solution est réalisée à température ambiante. Les analyses sont faites à l'aide d'un spectromètre 4700C MALVERN. La source lumineuse utilisée est un laser SIEMENS 40MW. Chaque mesure est répétée dix fois, les tailles et les indices de polydispersité retenus correspondant à la moyenne des dix mesures.
L'exploration en Microscopie à Force Atomique (ou AFM pour Atomic Force Microscopy, en anglais) consiste en l'analyse d'une surface, grâce à une fine pointe de quelques micromètres de long et d'une centaine d'Angstroms de diamètre, montée à l'extrémité d'un bras mobile de silicium, appelé microlevier, ayant une constante de force connue. Les différents appareils commercialisés présentent diverses géométries. L'AFM utilisé est basé sur la technique de l'Explorer (Topometrix Inc.). Dans ce montage, la céramique piézo-électrique servant à générer le mouvement de balayage porte le microlevier. Dans les autres techniques, plus courantes, la céramique porte l'échantillon, le reste de la tête AFM étant statique. L'équilibre des forces s'exerçant entre la surface de l'échantillon et la pointe provoque des variations de position du microlevier. Le signal est collecté sur un photo-détecteur à quatre cadrans via la réflexion d'un laser sur le microlevier dont on mesure la déflexion, proportionnelle aux forces agissant sur la sonde. Ces données sont alors transformées en coordonnées spatiales, générant ainsi une image de la surface. L'AFM mesure les forces entre la pointe et l'échantillon. Ces forces dépendent de la nature de l'échantillon et de la distance entre la pointe et l'échantillon. Lorsque la pointe s'approche de la surface, elle subit d'abord des forces attractives à longue distance (forces de van der Waals). Puis, à l'approche de la surface, les orbitales électroniques de la pointe et de l'échantillon créent des forces répulsives qui neutralisent les forces attractives avant de devenir les forces dominantes. Les mesures sont réalisées en utilisant un microscope "Explorer ThermoMicroscope" équipé d'un scanner de 100 μm, en mode non-contact. La vitesse de balayage est de 1-2 Hz. Pour chaque échantillon les balayages ont été réalisés à 50 μm, 20 μm, 10 μm et 5 μm. Les microleviers sont en silicium, la fréquence de résonance f0 est
260 kHz et la constante de raideur est de 45 N.
Pour les études faites avec la microscopie électronique à balayage, on dépose un volume de 50 μl de dispersion co-colloïdale sur une lamelle de verre, puis on laisse sécher à température ambiante pendant 18 heures. Les échantillons sont ensuite recouverts d'une couche d'or-palladium et observés à l'aide d'un microscope électronique Hitachi S800 à 15kV.
Des études utilisant la microscopie électronique à transmission après fracture à froid et après coloration négative sont aussi réalisées. Pour ces dernières, on dépose un volume de 5 μl de dispersion co- colloïdale à 0.2mM sur une grille de cuivre (300-mesh) recouverte d'un film de Formvar® (PoIy vinyl formai). Après 5 minutes d'adsorption, les échantillons sont colorés négativement, soit avec une solution aqueuse de silicotungstène de sodium à 1 %, soit avec une solution aqueuse d'acétate d'uranyle à 4%. Ils sont ensuite immédiatement observés à l' aide d'un microscope électronique Philips CM120 à 80 kV.
La dispersion co-colloïdale selon l' exemple n°2 a été étudiée selon les façons suivantes :
Observations en microscopie à force atomique (AFM)
La figure 1 représente l'image obtenue en microscopie à force atomique d'une dispersion co-colloïdale à base de tamoxifène et de para sulfonato calix[6]arène C6S selon l'exemple n° 2.
Ainsi, les études AFM sur la dispersion co-colloïdale mettent en évidence l'existence de nanoparticules, même après séchage de l' échantillon.
Une analyse topographique de la taille de ces particules révèle une hauteur de 75 nm et un diamètre approximatif de 300 nm. Ce diamètre est légèrement plus grand que celui déterminé par diffusion de la lumière (voir résultats ci-dessous) et s'explique par le léger aplatissement des particules consécutif au séchage de l' échantillon.
Observations en microscopie électronique à transmission
La figure 2 représente des images d'une dispersion co-colloïdale selon l'exemple n°2 en microscopie électronique à balayage avec trois grossissements différents ; les échelles (50 μm, 10 μm et 1 μm) sont indiquées sur les images.
La figure 3 représente des images d'une dispersion co-colloïdale selon l'exemple n°2 obtenues par microscopie électronique à transmission après coloration négative avec trois grossissements différents : les échelles (2 μm, 100 nm et 200 nm) sont indiquées sur les images. En ce qui concerne, les images qui indiquent une échelle de 200 nm, ces dernières ont été réalisées à deux endroits différents de la dispersion co-colloïdale. La figure 4 représente des images d'une dispersion co-colloïdale selon l'exemple n°2 obtenues par microscopie électronique à transmission après fracture à froid négative avec deux grossissements différents ; les échelles (2 μm et 200 nm) sont indiquées sur les images. En ce qui concerne, les images qui indiquent une échelle de 200 nm, ces dernières ont été réalisées à trois endroits différents de la dispersion co- colloïdale.
Ces images permettent d'identifier les particules de la dispersion co-colloïdale. Elles montrent notamment une structure sphérique externe, mais également une structure interne organisée en petites vésicules. Une telle structure est différente de la structure multilamellaire des liposomes.
Par ailleurs, on obtient des images similaires avec des dispersions co-colloïdales à base de para-sulfonato calix[6]arène et de griséofulvine ou de chlorhexidine. Mesure de la taille et de la polydispersité des particules
La dispersion co-colloïdale de tamoxifène et de parasulphonatocalix[6] arène selon l'exemple n°2 a été analysée par diffusion dynamique de la lumière immédiatement après sa formation.
Les mesures ont été répétées dix fois et montrent l'existence d'une dispersion co-colloïdale constituées de particules monodispersées ayant un diamètre moyen égal environ à 230 nm. L'indice de polydispersité est de 0,03 démontrant que les particules ont un diamètre constant.
Ces mesures ont été également répétées dix fois sur les dispersions co-colloïdales des exemples 1 et 3 à 12. Les résultats sont regroupés dans le tableau suivant.
Exemple Molécule hôte (concentration finale) / Mesure moyenne des particules
„ . , . . ., , , . .. „ . , mesurées par DLS no. Molécule invitée (concentration finale)
1 C4S (50 mg/1) / Tamoxifène (50 mg/1) 190 nm
2 C6S (50 mg/ml) / Tamoxifène (50 mg/1) 230 nm
3 C6S (55 mg/ml) / Tamoxifène (25 mg/1) 225 nm
4 C6S (87,4 mg/ml) / Tamoxifène (12,4 mg/1) 215 nm
5 C4S (50 mg/1) / Tétracaïne (50 mg/1) 205 nm
6 C4S (70 mg/1) / Tétracaïne (30 mg/1) 440 nm
7 C4S (83 mg/1) / Tétracaïne (17 mg/1) 269 nm
8 C4S (50 mg/1) / Tétracaïne (50 mg/1) 220 nm
9 C4S (50 mg/1) / Chlorhexidine (50 mg/1) 275 nm
10 C6S (50 mg/1) / Chlorhexidine (50 mg/1) 460 nm
11 C4S (50 mg/1) / Mifepristone (50 mg/1) 238 nm
12 C6S (50 mg/1) / Mifepristone (50 mg/1) 191 nm
Ces résultats montrent que la méthode de préparation de dispersions co-colloïdales permet d'obtenir des populations relativement homogènes de particules dont la taille varie approximativement entre 150 nm et plus de 450 nm selon la nature des molécules hôtes et des molécules invitées et le ratio de concentrations entre les deux molécules.
Etudes de la stabilité des dispersions co-colloïdales
La stabilité des dispersions co-colloïdales selon les exemples 1 à 12 a été étudiée pour des températures égales à 4, 20, 40 et à 80°C. Les dispersions sont placées dans des enceintes à température contrôlée et des échantillons sont prélevés périodiquement pour analyser la taille et la polydispersité des particules ou la morphologie en microscopie à force atomique. Les résultats sont regroupés dans le tableau suivant.
Dispersion Molécule hôte Stabilité des particules mesurées par diffusion no. dynamique de la lumière à différentes températures
Molécule invitée
1 C4S (50 mg/1) A 200C, la taille moyenne des particules décroît légèrement de 190 à 130 nm sur une période de 15 jours. A 800C, la
Tamoxifène (50 mg/1) taille moyenne des particules décroît de 190 à 175 nm sur une période de 15 jours
2 C6S (50 mg/ml) A 4°C, 20, 40 et 800C la taille moyenne des particules est maintenue proche de 200 nm sur une période de 43 jours.
Tamoxifène (50 mg/1)
5 C4S (50 mg/1) A 4°C, la taille moyenne des particules augmente de 205 à 230 nm et sur une période de 15 jours puis est maintenue
Tétracaïne (50 mg/1) stable pendant 28 jours. A 20, 40 et 800C, la taille moyenne des particules décroît de 205 à 165 nm et sur une période de 15 jours puis est maintenue stable pendant 28 jours.
8 C4S (50 mg/1) A 4 et 200C, la taille moyenne des particules décroît de 220 à 170 et 150 nm, respectivement, sur une période de 15
Tétracaïne (50 mg/1) jours.
11 C4S (50 mg/1) A 20 et 800C, la taille moyenne des particules décroît de 238 à 220 sur une période de 15 jours.
Mifepristone (50 mg/1)
12 C6S (50 mg/1) A 20 0C, la taille moyenne des particules décroît de 190 à 174 sur une période de 15 jours. A 800C, la taille moyenne
Mifepristone (50 mg/1) des particules est maintenue à 190 nm pendant 15 jours. Ces résultats montrent que la taille des particules varie faiblement, même lorsque les préparations sont maintenues pendant plusieurs semaines à des températures basses (4°C) ou élevées (80°C), montrant ainsi la remarquable stabilité des dispersions co-colloïdales. Ainsi les résultats montrent que la taille des particules n'est pratiquement pas influencée par la température de stockage. On observe des résultats similaires pour d'autres dispersions co-colloïdales qui n'ont pas été exemplifiées.
Etudes des interactions des suspensions colloïdales avec l'albumine
Afin d'envisager une administration intraveineuse des dispersions co-colloïdales, il est nécessaire de s'assurer que de telles dispersions ne s'agrègent pas au contact de l'albumine qui est la protéine la plus abondante dans le système sanguin. Les interactions des dispersions co-colloïdales avec l' albumine ont donc également été étudiées. Une solution à 1 mg/ml d'albumine bovine (BSA) a été ajoutée à une dispersion co-colloïdale de tamoxifène et le mélange a été analysé par diffusion dynamique de la lumière et en microscopie à force atomique.
Les analyses par diffusion de lumière montrent que la taille des particules en présence de BSA dépasse l μm mais celles-ci restent toujours monodispersées. Ce phénomène s'explique par la présence d'une matrice protéique protectrice qui enveloppe les particules colloïdales. Les images obtenues par microscopie à force atomique révèlent au contraire l'existence de particules de taille bien plus réduite que la taille normale des particules colloïdales (15 nm au lieu de 200 nm ou de 1000 nm). On explique cet aspect par le fait que la BSA forme un gel protéique assez dense qui recouvre les particules co-colloïdales et ne laisse entrevoir qu'une partie des particules à la surface du champ examiné par le microscope à force atomique. Il apparaît donc que les interactions avec la principale protéine sanguine ne dénaturent pas les systèmes co-colloïdaux, mais que l'albumine peut former une matrice autour des particules, qui pourrait les protéger pendant le transport dans le sang.
Exemple de préparation d'une dispersion co-colloïdale comprenant des molécules anti-cancéreuses
Le docétaxel, l'azacytidine et la thalidomide sont des substances pharmacologiquement actives, connues pour leur faible solubilité dans l'eau et connues pour leur activité thérapeutique contre certains types de cancer. Des dispersions co-colloïdales ont été préparées selon le procédé décrit ci-dessus et conservées pendant une semaine à température ambiante. La taille moyenne des particules a été mesurée par DLS selon la méthode décrite ci-dessus.
Le tableau ci-dessous résume ces données.
Exemple Molécule hôte Molécule invitée Mesure moyenne des
M (concentration finale) (concentration finale) particules mesurées par
DLS après 1 semaine à température ambiante
13 C4S (5 mg/ml) Docétaxel (5 mg/ml) 221 nm
14 C4S (5 mg/ml) Thalidomide (5 mg/ml) 112 nm Propriétés anticancéreuses du docétaxel formulé sous forme de co-colloïdes
Des souris de souche Swiss nude sont irradiées et reçoivent une injection sous-cutanée de cellules Calu-6. Les cellules Calu-6 sont des cellules tumorales humaines de poumon.
Lorsque la tumeur atteint un volume de 100 à 200 nm3, les animaux sont répartis de façon aléatoire dans des groupes de traitement.
Selon leur groupe, les animaux reçoivent une série d'injections intraveineuses de placebo ou de docétaxel formulés sous forme d'une dispersion co-colloïdales à des concentrations variant entre 0,01 et 1%.
Les animaux font l'objet d'un examen clinique quotidien pendant lequel le volume de la tumeur est mesuré. On constate un effet anticancéreux satisfaisant du traitement avec le docétaxel formulé sous forme de co- colloïdes.
Applications au traitement de la DMLÂ du thalidomide formulé sous forme de co-colloïdes
Des lapins de souche Fauve de Bourgogne sont utilisés pour induire une néovacularisation choroïdienenne. Des brûlures d'une surface d'environ 75 μm sont induites dans l'œil droit des animaux à l'aide d'un laser argon à 532 nm appliqué pendant 0, 1 seconde avec une intensité de 150 mW et en utilisant un photocoagulateur Viridis (Quantel Médical) autour du disque optique et entre les principales branches vasculaires.
Ces brûlures entraînent la formation de néovaisceaux que l'on mesure par des examens ophthalmologiques périodiques. Les animaux sont répartis de façon aléatoire dans des groupes de traitement. Selon leur groupe, les animaux reçoivent une injection intravitréale de placebo ou de thalidomide formulée sous forme de co-colloïdes à des concentrations variant entre 0,01 et 1 %. On constate un effet inhibiteur satisfaisant du développement des néovaisceaux du traitement avec la thalidomide formulée sous forme de co-colloïdes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispersion co-colloïdale dans un milieu aqueux d'au moins un complexe supramoléculaire amphiphile dans laquelle ledit complexe amphiphile comprend une molécule hydrophile et une molécule hydrophobe associées par des liaisons non covalentes.
2. Dispersion co-colloïdale selon la revendication 1, caractérisée par le fait que la molécule hydrophile est un calix arène hydrosoluble.
3. Dispersion co-colloïdale selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que la molécule hydrophile est un calix arène hydrosoluble anionique.
4. Dispersion co-colloïdale selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que la molécule hydrophile est un para-sulfonato calix arène.
5. Dispersion co-colloïdale selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la molécule hydrophobe est une molécule d'intérêt pharmaceutique ou un agent cosmétique.
6. Dispersion co-colloïdale selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la molécule hydrophobe est choisie parmi des substances actives sur le système nerveux périphérique et central, sur les fonctions rénales, cardiovasculaires, gastro-intestinales, sanguines, immunes, hormonales, génitales ou reproductives, des antiinflammatoires, des anti-parasitaires, des antibiotiques, des anticancéreux, des antidotes, des vitamines, des produits pour la nutrition parentérale ou des produits à usage dermatologique, topique ou ophtalmologique.
7. Procédé de dispersion en milieu aqueux d'une molécule hydrophobe d'intérêt pharmaceutique comprenant une étape consistant à former un complexe amphiphile supramoléculaire entre ladite molécule hydrophobe et une molécule hydrophile.
8. Procédé de dispersion en milieu aqueux d'un agent cosmétique hydrophobe comprenant une étape consistant à former un complexe amphiphile supramoléculaire entre ledit agent hydrophobe et une molécule hydrophile.
9. Procédé de préparation d'une dispersion co-colloïdale telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 6 consistant à ajouter une composition comprenant, dans un solvant organique, au moins un calixarène hydrosoluble anionique à une composition comprenant, dans un solvant organique, une molécule hydrophobe, à ajouter un solvant aqueux puis à éliminer ledit solvant organique.
10. Médicament anticancéreux sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et d'au moins une molécule de la famille des taxanes.
11. Médicament anticancéreux sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et du docétaxel.
12. Médicament, sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et du docétaxel pour son utilisation par voie intraveineuse pour le traitement des maladies cancéreuses.
13. Médicament sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et de la thalidomide.
14. Médicament, sous la forme d'une dispersion co-colloïdale en milieu aqueux d'au moins un complexe amphiphile comprenant au moins un calixarène anionique hydrosoluble et du thalidomide pour son utilisation par voie intravitreale pour le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge.
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