EP2069539A2 - Microarray plastidial - Google Patents

Microarray plastidial

Info

Publication number
EP2069539A2
EP2069539A2 EP07823397A EP07823397A EP2069539A2 EP 2069539 A2 EP2069539 A2 EP 2069539A2 EP 07823397 A EP07823397 A EP 07823397A EP 07823397 A EP07823397 A EP 07823397A EP 2069539 A2 EP2069539 A2 EP 2069539A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microarray
probe
arabidopsis thaliana
gene
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07823397A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Régis MACHE
Silva Mache
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Joseph Fourier Grenoble 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2069539A2 publication Critical patent/EP2069539A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates generally to the field of microarrays and their use in the measurement of plant gene expression. More particularly, the present invention relates to a plastid microarray on which are immobilized specific probes transcripts of chloroplastid genes of Arabidopsis thaliana.
  • Microarray technology which allows the multiple detection of DNA in a sample concomitantly with a carrier comprising a plurality of immobilized nucleic acid probes, is ideally suited for measuring gene expression.
  • the principle of the microarray is based on the hybridization technique.
  • Single stranded oligonucleotides specific for different genes or I 1 cDNAs derived from RT-PCR constituting the probes are immobilized on a solid support, also called matrix.
  • the role of the probes is to detect complementary nucleic acid targets present in the complex mixture to be analyzed (mRNAs extracted from cells, tissues or whole organisms and converted into cDNA). These probes can be immobilized on the support or synthesized in situ.
  • the hybridization signals are detected according to the type of marking chosen: radioactivity or fluorescence and possibly quantified.
  • Stolc V. et al. discloses the use of a microarray of the complete genome of Arabidopsis thaliana, comprising 5 million 36-mer oligonucleotides. The analysis of 5 million probes present on the microarray requires the use of complex tools.
  • An object of the present invention is to provide a microarray that does not involve the use of advanced detection systems. This is possible because the total number of immobilized probes on the medium is less than 250, which allows direct reading without the use of advanced reading devices. This is to oppose microarrays with a very large number of elementary probes, greater than 1000, see 10000 or more.
  • microarrays Many scientific fields have found interest in the use of microarrays. This is particularly the case of plant biology where the microarray has many applications. For example, the sub-domain of transgenic plants may be mentioned. As an indication, in the US document
  • microarray is used to measure mRNA levels in transformed plant cells and it allows the simultaneous control of transcript levels of thousands of genes. Again, the size of the genome of the plants implies the complexity of the microarray.
  • An object of the present invention is to provide a microarray useful in the field of plants, less complex than those heretofore described in the prior art.
  • Plant cells contain three types of DNA: nuclear DNA, mitochondrial DNA and I 1 plastid DNA. Microarrays carrying nuclear gene sequences were the first to appear on the market.
  • Arabidopsis thaliana is a model plant in genetics. Sequencing of its genome indicates a genome size of 125 Mb and predicts 29,000 genes encoding proteins. Its plastid genome is composed of about one hundred copies of a circular plastid chromosome of about 150 kb. Each plastid genome contains about 120 genes, nearly 80 of which encode proteins. Arabidopsis thaliana has many advantages related to its ease of culture in the laboratory, its speed of development and prolificacy.
  • An object of the present invention is to provide a simple system for evaluating the expression of all the plastid genes, which is applicable to several higher plants.
  • An object of the present invention is to provide a microarray allowing a very specific hybridization of transcripts and the distinction between the expression of the gene and the expression of the antisense strand.
  • the present invention provides a microarray for all these objects.
  • SEQ ID No. 1 Oligonucleic probe of the L23 gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 2 Oligonucleic probe of the ndhB gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 3 Oligonucleic probe of the rps7 gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 4 Oligonucleic probe of the ccsA (ycf ⁇ ) gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 5 Oligonucleic probe of the ArthCpO72 rpl32 gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 6 Oligonucleic probe of the L2 gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 7 Oligonucleic probe of the Arabidopsis thaliana petD gene
  • SEQ ID No. 8 Oligonucleic probe of the petB gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 9 Oligonucleic probe of the psbH gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 17 Oligonucleic probe of the cemA (ycfiO) gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 18 Oligonucleic probe of the ycf4 gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 19 Oligonucleic probe of the Psal gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 20 Oligonucleic probe of the rbcL gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 21 Oligonucleic probe of the psbZ (ycf9) gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 22 Oligonucleic probe of the psbC gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 23 Oligonucleic probe of the Arabidopsis thaliana psbD gene
  • SEQ ID No. 24 Oligonucleic probe of the ycf ⁇ (petN) gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 25 Oligonucleic probe of the Arabidopsis thaliana psbl gene
  • SEQ ID No. 26 Oligonucleic probe of the psbK gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 27 Oligonucleic probe of the rps18 gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 28 Oligonucleic probe of the accD gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 29 Oligonucleic probe of the rps12 gene (transsplicing) of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 30 Oligonucleic probe of the ycf2 gene of Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID No. 31 Oligonucleic probe of the Arabidopsis thaliana orf77 gene
  • SEQ ID No. 32 Oligonucleic probe of the Arabidopsis thaliana ycfl gene
  • SEQ ID No. 33 Oligonucleic probe of the rps15 gene of Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 34: Oligonucleic probe of the ndhH gene of Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 35: Oligonucleic probe of the ndhA gene of Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 36: Oligonucleic probe of the ndH gene of Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 37 Oligonucleic probe of the ndhG gene of Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 38: Oligonucleic probe of the ndhE gene of Arabidopsis thaliana SEQ ID No.
  • the present invention relates to a plastid microarray comprising a solid support or matrix which comprises a multiplicity of elementary sites, each elementary site comprising several copies of the same nucleic acid probe, the said probe being single-stranded, comprising between 50 and 70 nucleotides. and corresponding to a sense oligonucleotide in an Arabidopsis thaliana chloroplastid gene or an antisense oligonucleotide in an Arabidopsis thaliana chloroplastid gene, the entire chloroplastid coding genome of Arabidopsis thaliana being represented on the microarray.
  • the present invention also relates to a process for preparing the microarray as defined above, in which: a) a solid support is available, and b) the probes are fixed on the surface of the support.
  • the present invention also relates to a method for detecting the microarray as defined above, comprising: a) bringing the target nucleic acid sample into contact with the microarray, so as to allow hybridization; b) detection of the microarray; hybridization
  • the present invention also relates to the use of the microarray as defined above, to establish an expression profile of plastid genes in plants.
  • the present invention also relates to a set of probes for measuring the expression of plant plastid genes, comprising at least two probes chosen from:
  • the present invention relates to a kit comprising a microarray as defined above.
  • microarray for the determination (existence or not, and / or measurement) of the expression of plant plastid genes.
  • microarray is meant a solid support, or matrix, comprising nucleic material immobilized at elementary sites, where appropriate identified according to any appropriate reference system. According to the present invention, each elemental site comprises several copies of the same nucleic acid probe.
  • the elementary sites are for example arranged in rows and columns.
  • antisense oligonucleotide any single-stranded oligonucleotide complementary to the oligonucleotide fragment of the coding strand (or sense strand).
  • the 5 'GCACG 3' nucleotide sequence has the 5 'CGTGC 3' antisense sequence.
  • the support on which the nucleic material is fixed is in the form of a flat, porous surface or pierced with wells. It comprises a useful face or operating surface comprising the immobilized nucleic material (i.e. the probes) intended to be in contact with the sample.
  • the material constituting such a support is, for example, silicon, a glass, or a plastics material, for example a thermoset or thermoplastic synthetic resin, for example a polypropylene or a resin polyacrylamide.
  • the support may comprise several materials, for example a hard material, such as glass, on which is deposited a nylon membrane or a nitrocellulose membrane.
  • the material constituting the support is non-conductive of electricity.
  • the microarray of the present invention is square or rectangular in shape and has a size less than 100 cm 2 , for example less than 10 cm 2 .
  • microarray of the invention is single use or not. It is implemented for the purpose of a molecular biological determination. This microarray can be used with a separate and complementary device or instrument.
  • the microarray of the invention is brought into contact with a sample of interest, liquid or fluid, immobile or in motion, comprising at least one target species, in suspension or in solution, optionally labeled, and delivering at least one signal in relation with the presence, and / or the nature, and / or the structure and / or the amount of said target species.
  • This sample of interest is called the "target nucleic sample” according to the present invention.
  • each elementary site of the support comprises several copies of the same nucleic acid probe.
  • probe is meant any DNA sequence corresponding to a part of a given gene and specifically recognizing it.
  • the immobilized probes at each elemental site of the support are single-stranded, i.e. single-stranded. They comprise between 50 and 70 nucleotides, preferably between 55 and 65 nucleotides, advantageously 60 ⁇ 1 nucleotides.
  • the length of the probes is chosen so as to be optimal, between a minimum which would be the limit of specificity for the hybridization and a maximum which would make the synthesis without error difficult and expensive.
  • the probes of the present invention can be prepared by conventional techniques of organic chemistry synthesis in automated apparatus. We bet synthetic oligosondes. In general, the chemical pathway of phosphoramidites is used for the synthesis of oligonucleotides. Once synthesized by the microprocessor-controlled automata, the oligonucleotide must be purified to remove the aborted reaction products. This purification can be carried out by preparative electrophoresis in acrylamide gel, by reverse phase column HPLC or in ion exchange. Each probe corresponds to a fragment of a chloroplastid coding gene of Arabidopsis thaliana.
  • the nucleotide sequences of the probes are chosen so as to allow the hybridization of complementary target nucleotide sequences, isolated from various higher plants of agronomic interest. In other words, each probe must be generic.
  • Arabidopsis thaliana is a model plant in genetics. There are similarities between the plastid genomes of different plant species. For each gene considered, the inventors thus sought and demonstrated similarities between the sequences of different plant species, and find probes capable of hybridizing genetic material from different species. The chosen sequences are common to several plants with a defined percentage of identity or similarity.
  • the genome of Arabidopsis thaliana is fully sequenced to date.
  • the sequences of the plastid genome of Arabidopsis thaliana are accessible on the site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ using the code NC_000932.
  • the plastid genome of Arabidopsis thaliana is reproduced in its entirety in SEQ ID No. 81.
  • the inventors have compared the coding sequences of the chloroplastid genes of this plant with those of chloroplastid genes of other model plants, in particular tomato and rice. corn, tobacco, alfalfa, wheat and spinach, that is, other plants of agronomic interest.
  • Vector NTi Vector NTi 9.1.0 AlignX alignment program (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) can be used. Preferably, the default settings are used.
  • the sequence of each probe is chosen to be more than 50% identical with a nucleic sequence of at least one plant selected from tomato, alfalfa, tobacco, rice, spinach , wheat and corn.
  • Identity or “probes having a certain percentage of identity” means oligonucleotides that are invariant or unchanged to the percentage closely defined between two sequences. These oligonucleotides may have a deletion, an addition or a substitution of at least one nucleotide relative to the reference oligonucleotide.
  • the sequence of each probe is chosen to be identical to more than 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% and preferably 98%, with a nucleic sequence. at least one plant selected from tomato, alfalfa, tobacco, rice, spinach, wheat and corn.
  • the sequence of each probe is chosen to be more than 50% identical with a nucleic sequence of at least two plants chosen from tomato, alfalfa, tobacco, rice, spinach, wheat and corn.
  • the sequence of each probe is chosen to be identical to more than 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% and preferably 98%, with a nucleic sequence.
  • the plastid genome of these plants can be accessed at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ using the following codes:
  • the probes are also selected so as to have no internal secondary structures which prevent hybridization, nor internal repeats beyond a threshold of 6 nucleotides.
  • the hybridization conditions are specified below.
  • the probes are selected so as to "homogenize” the distance from the first nucleotide of the 5 'probe to the initiator codon of the corresponding Arabidopsis thaliana gene.
  • “homogeneous” it is understood that the probes are selected so that the distance between 1 nucleotide of the probe and the ATG initiator of the chloroplast gene of Arabidopsis thaliana is preferably less than 200 nucleotides to a maximum of probes microarray.
  • the interests of a homogenization of distances are numerous. These include the possibility of direct analysis of transcripts produced in vitro. Indeed, such transcripts labeled in vitro can hybridize even if the elongation of the transcription is incomplete.
  • the homogenization of the distances also allows a semi-quantitative analysis of the expression of genes between them. Indeed, when the labeled sequences are at the same distance from the initiator ATG, it is easy to compare the relative amounts of transcripts from one gene to another, for example by means of labeling the target nucleic acids by the so-called "run on” method.
  • at least 50% of the sequences corresponding to a sense oligonucleotide in a chloroplastid gene of Arabidopsis thaliana are chosen to be located within 200 nucleotides of the initiator codon.
  • At least 70%, 80% or 90% of the sequences corresponding to a sense oligonucleotide in a chloroplastid gene of Arabidopsis thaliana are selected to be within 200 nucleotides of the initiator codon.
  • the entire plastid coding genome of Arabidopsis thaliana is represented on the microarray.
  • the plastid genome of this plant can be described as small because it contains 111 genes, including 80 genes encoding proteins, rRNA genes and tRNA genes.
  • at least all of the 80 genes encoding proteins of the plastid genome of Arabidopsis thaliana are represented on the microarray.
  • all of the 80 genes encoding proteins of the Arabidopsis thaliana plastid genome and at least one rRNA or tRNA gene are represented on the microarray.
  • the entire plastid genome of Arabidopsis thaliana is represented on the microarray, that is to say the 111 genes.
  • oligosondes of these genes and oligonucleotides of the antisense strand of these genes are immobilized on the microarray support in order to measure the expression of plant plastid genes and the antisense expression of these genes. .
  • the prior art as a whole (Nagashima, Akitomo et al (Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2004, 68 (3), 694-704), Nakamura, Takahiro et al (Plant and CeII Physiology 2003, 44 (8) , 861-867); Legen Julia et al. (Plant Journal 2002, 31, 2, 171-188)) discloses microarrays on which are made deposits of PCR products. Such microarrays do not distinguish the sense and antisense expression of genes.
  • the number of probes is dependent on the number of genes represented on the microarray. When the entire Arabidopsis thaliana plastid genome of the 80 genes encoding proteins is present on the microarray, the number of probes is 160 (80 sense oligosondes and 80 antisense oligonucleotides) if each elemental site contains several copies of one and the same probe. If each elemental site of the microarray support has multiple copies of a first nucleic acid probe and several copies of a second antisense nucleic acid probe of the first probe, then the microarray has 80 elemental sites.
  • the number of probes is 222 (111 sense oligosondes and 111 antisense oligonucleotides) if each elemental site comprises several copies of one and the same probe.
  • each elementary site of the support comprises several copies of the same single probe, the support comprises between 160 and 222 elementary sites. If each elemental site of the microarray support has multiple copies of a first nucleic acid probe and several copies of a second antisense nucleic acid probe of the first probe, then the support has between 80 and 111 elemental sites.
  • the microarray of the present invention is represented on more than one support if it is not possible to deposit all the probes on one and the same support. According to one embodiment of the present invention, it is possible to proceed to the labeling of the probes, rather than to the marking of the target nucleic sample. In general, the labeling of the nucleic material allows the detection of hybridization.
  • each elemental site of the microarray support comprises several copies of a first nucleic acid probe and several copies of a second nucleic acid probe, antisense of the first probe, the two probes being marked differently.
  • each of the probes is chosen from the group of the following sequences: (a) an oligonucleotide according to any one of SEQ ID NO: 1 to 80,
  • the invention relates to a microarray on the surface of which is at each elemental site of the support an oligonucleotide comprising between 50 and 70 nucleotides, preferably between 55 and 65 nucleotides, advantageously 60 ⁇ 1 nucleotides.
  • This oligonucleotide is chosen from the group consisting of SEQ ID No. 1 to 80, an antisense oligonucleotide of one of SEQ ID No. 1 to 80 and an oligonucleotide having at least 70% identity with one of SEQ ID No.1 to 80.
  • the oligonucleotide may advantageously be chosen from oligonucleotides having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% and preferably at least 99% identity with one of the sequences SEQ ID No. 1 to 80.
  • oligonucleotides having a certain percentage of identity is meant oligonucleotides that are invariant or unchanged at the percentage defined between two sequences. These oligonucleotides may, for example, have a deletion, an addition or a substitution of at least one nucleotide relative to the reference oligonucleotide.
  • the present invention also relates to a method for preparing the microarray, the method according to which: a) a support is provided as defined above, b) the probes are fixed on the surface of the support.
  • a micropipette for example manual or robotic.
  • a substance making the attachment of the probes to the surface of the support is optionally added.
  • polylysine there may be mentioned polylysine.
  • the present invention also relates to a microarray detection method as defined above, said method comprising: a) contacting the target nucleic sample with the microarray, so as to allow hybridization, and b) the detection of hybridization.
  • target nucleic sample is meant a nucleic sample capable of hybridizing selectively to immobilized oligonucleotides on the surface of the support, called probes, and an integral part of the microarray according to the invention (G-C and T-A pairings).
  • the target nucleic sample needs to be prepared.
  • the cDNA is obtained with an RNA reverse transcriptase from a primer complementary to the transcript in a region positioned in the gene as close as possible to the probe oligonucleotide or from a random hexanucleotide.
  • the target sequences hybridize with the probe sequences at a level above the background noise significantly.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of hybridizing selectively and the probe sequence is generally 10 times, preferably 100 times, more intense than that of the interaction of the other DNA sequences generating the signal. background noise.
  • Stringent hybridization conditions allowing selective hybridization are well known to those skilled in the art.
  • the hybridization and washing temperature is at least 5 ° C lower than the Tm of the reference sequence at a given pH and for a given ionic strength.
  • the hybridization temperature is at least 30 ° C. for an oligonucleotide of 15 to 50 nucleotides and at least 60 ° C.
  • the hybridization is carried out in the following buffer: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 ⁇ g / ml sperm denatured salmon DNA.
  • the washes are, for example, carried out successively at low stringency in a 2 ⁇ SSC buffer, 0.1% SDS, medium stringency in a 0.5 ⁇ SSC buffer, 01% SDS, and high stringency in a 0.1 ⁇ SSC buffer. , 1% SDS.
  • Hybridization can of course be carried out according to other usual methods well known to those skilled in the art (see in particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Step a) of the process is also called probe-target hybridization phase.
  • the probe oligonucleotide or the target nucleic material can be labeled.
  • labeling or “labeling” is meant the characteristic according to which a marker, that is to say a substituent or residue allowing, with or without the aid of a label, is fixed on an entity in a covalent or other manner.
  • external means such as illumination, with or without a posterior step, such as in contact with a substrate, to produce a detectable signal.
  • radioactive isotope labeling and non-radioactive labeling.
  • radioactive labeling in practice 32 P, 35 S and 3 H are the three radioelements used in molecular biology.
  • Nucleotides labeled with 32 P should be used within days as 32 P has a short half-life (15 days). It takes on average 10 8 cpm / ⁇ g of nucleic acids. The life of the 35 S is four times longer but the analyzes are less sensitive.
  • non-radioactive labeling or cold marking there are a large number of systems. Some use a pair of ligands, for example avidin or streptavidin and biotin. In this case, biotin is incorporated into the target nucleic material. Mention may also be made, by way of indication, of the system based on cytosine sulfonation and the system based on bioluminescence.
  • the nucleic material can also be labeled with a fluorochrome.
  • the target nucleic acid sample may also be 5 'labeled with a T4 polynucleotide kinase or 3' labeled with a T4 RNA ligase. It can also be labeled in vitro by RNA synthesis in the presence of a labeled nucleotide, by transcription of a template or by the so-called "run on” technique, according to which the cells are incubated in the presence of radioactive ribonucleoside triphosphates. After washing and autoradiography, the intensity of the spots is proportional to the amount of neo-synthesized RNA and therefore to the transcription rate. This technique is mainly comparative. It makes it possible to appreciate variations in the transcription rate, provided that these variations are sufficiently large.
  • the nucleic acid probes are labeled, so as to allow the detection of hybridization.
  • Step b) of the method comprises detecting hybridization. It is a question of determining the probes that have actually been hybridized, that is to say to identify at which addresses the probes are complementary to the targets of the nucleic sample.
  • the hybridization signals are detected according to the type of labeling, radioactivity or fluorescence, by radiographic or fluorescence measurement, and quantified.
  • an optical reading makes it possible to reveal the probes that have become fluorescent, hybridized with the labeled target nucleic material.
  • the collected data can be analyzed by software-image processing.
  • the contacting step is performed by incubating the microarray in the presence of a hybridization buffer comprising the labeled target nucleic sample.
  • a hybridization buffer comprising the labeled target nucleic sample.
  • the latter is marked by fluorescence, that is to say using a fluorochrome becoming fluorescent when excited by a light beam).
  • the hybridization buffer is then removed, and the microarray is exposed to a second, volatile, washing buffer which does not denature the specific hybridization at the surface of the microarray. The washing is intended to rid the microarray of unhybridized nucleic targets.
  • the second buffer is removed and this second buffer is allowed to evaporate for a sufficient time.
  • the filter is placed on a photosensitive screen deposited in a cassette, and after a variable time of exposure to darkness, the screen is scanned with a fluorescence or radioactivity scanner (typically a phosphorimager).
  • the invention also relates to sets of probes for establishing an expression profile of the plastid genes of plants.
  • Each probe is specific for a transcript of a chloroplastid gene of Arabidopsis thaliana.
  • the probes are capable of hybridizing under stringent conditions or under microarray hybridization conditions, with RNA transcripts of genes from other plants, or complements of these transcripts.
  • the set of probes described comprises one or more probes which are each directed to one of the following sequences:
  • the present invention also relates to the use of the microarray as defined above, for establishing an expression profile of the plastid genes in plants. -5
  • the present invention also relates to a kit comprising a microarray as defined above.
  • the kit also comprises the support, the solutions allowing the hybridization and the labeling, for example the fluorescence labeling of the target RNAs, and / or the RNA isolation protocols adapted to the different plants.
  • Figure 1 microarray after hybridization of the target nucleic sample isolated from wild Arabidopsis thaliana seedlings
  • Figure 2 microarray after hybridization of the target nucleic sample isolated from Arabidopsis thaliana seedlings of a particular mutant.
  • the 60 nucleotide sequences chosen from Arabidopsis thaliana are similar to those of the corresponding genes of 7 plants, with a rate greater than 80%. This allows hybridization on a plastid membrane of Arabidopsis with the RNA or cDNA of 7 other plants. Correction factors are possible.
  • probes 80 have a distance between 1 nucleotide of the probe and I 1 initiator ATG of chloroplast gene of Arabidopsis thaliana corresponding less than 200 nucleotides, or 90% of the probes.
  • the probes are synthesized in the following manner: the reactions are carried out in a small column containing microbeads of plastics or glass to which the first nucleotide 3 'of the oligonucleotide to be synthesized is attached. The reactive functions of this nucleotide are blocked. A reaction cycle will allow to add a new nucleotide. Each cycle consists of the following steps: release of phosphorus 5 ', activation, fixation of the next nucleotide in blocked form. One cycle has a duration of about 6 minutes, one nucleotide being incorporated in each cycle. Practically, it is sufficient to charge the reservoirs of the synthesis apparatus with the appropriate reagents, to type the desired sequence on the keyboard and to recover the synthesized oligonucleotide.
  • the synthesized probes are, in this case, labeled after synthesis.
  • the labeling is carried out on the 5 'end by the T4 polynucleotide kinase.
  • the probe is incubated at 37 ° C. for 45 minutes in the presence of ( ⁇ 32 P) ATP and the enzyme. Unreacted nucleotides are separated from the labeled probe.
  • RNAs isolated from Arabidopsis seedlings are prepared according to a standard method as described in Privat et al. (Plant Mol Biol., 55, 385-399.) And are stored at -80 ° C. 2 ⁇ g of RNA are removed and treated twice with 2 ⁇ / ⁇ g DNase I, at 37 ° C. for 30 minutes. min, the RNAs being purified in a phenol / chloroform mixture (1: 1, by volume).
  • RNAs 2 ⁇ g of the RNAs are added, 1 ⁇ l of the mixture of 20-mer oligonucleotides (0.1 pmol / ⁇ l), synthesized according to the tables below (Tables 1 and 2), 1.5 ⁇ l of nucleotides dA, dG, dT (10 mM), ml of ⁇ - [P32] -dCTP (10 ⁇ Ci / ⁇ l, Amersham), supplementing with 18 ⁇ l of water. The RNA are then denatured for 5 min at 65 ° C and then they are kept in ice.
  • RNA guard RNA guard, Amersham
  • the mixture is added to the solution containing the RNA and then is put at 42 ° C for 3 min. 1.5 ⁇ l of SSII are then added.
  • the RT reaction lasts 50 minutes at 42 ° C. and is stopped by heating at 70 ° C. for 15 minutes.
  • the cDNAs obtained are treated by adding 1 ⁇ l of RNase H for 20 min at 37 ° C.
  • the unincorporated nucleotides are removed by passing the cDNAs through a microcolumn of Sephadex G50 beads, as follows: to the 30 ⁇ l of cDNA are added 170 ⁇ l of Tris-EDTA (TE) buffer at pH 8, then 200 ml the same TE buffer. The whole is deposited on the microcolumn and the passage is stored in an eppendorf tube. After having re-deposited 300 .mu.l of TE pH 8 buffer on the column, the radioactive eluate is recovered in another eppendorf tube.
  • TE Tris-EDTA
  • the hybridization buffer contains, 100 ml of phosphate buffer (1 M NaHPO 4 , pH 5.2), 0.4 ml of 0.5 mM Na 2 EDTA, 70 ml of 20% SDS, 2 g of BSA. , and a complement of H 2 O for a final volume of 200 ml.
  • the wash buffer (500 ml) contains 40 mM NaHPO 4 , pH 7.2, 1 mM Na 2 EDTA and 7% SDS.
  • the dehybridization buffer (500 ml) contains 0.5% SDS and 0.01% SSC. After prehybridization for 1 h at 65 ° C., the hybridization is carried out for 72 h at 65 ° C. and is followed by washing for 10 min at room temperature and for 5 min at 65 ° C.
  • the analysis is done by software R or any other suitable software.
  • FIG. 1 represents a microarray after hybridization of the target nucleic sample isolated from wild Arabidopsis thaliana seedlings
  • Figure 2 shows a microarray after hybridization of the target nucleic acid sample isolated from Arabidopsis thaliana mutant plantlets.
  • the following table shows a comparison of tomato plastid gene expression with a chip constructed from arabidopsis sequences (probes and primers).
  • RNA was isolated from Arabidopsis thaliana or tomato (Solanume Lycopersicum, Ailsa craig var) cultured for 7 days at room temperature and was treated twice with DNase I (2 units / ⁇ g RNA) to remove traces of DNA, 6 ⁇ g (arabidopsis thaliana) or 8 ⁇ g (tomato) of RNA were considered hybridization microarray.
  • the RNA has undergone a reverse transcriptase using specific primers corresponding to the 79 coded protein genes that it is desired to analyze with the microarray.
  • the primers are located as close as possible to the 3rd end of 60-mer that have been identified on the filters.
  • Hybridization was conducted for 3 days at 65 ° C in phosphate buffer (NAHPO 4 , 0.5 M, Ph 7.2), 1 mM EDTA, 20% SDS, and 1% BSA.
  • the filters were washed in wash buffer containing 40mM NaHPO 4 , pH 7.2, 1mM EDTA and 7% SDS at room temperature for 10 minutes, followed by washing for 5 minutes at 65 ° C.
  • the second element involved in hybridization is the degree of identity between the sequences of Arabidopsis primers (used for cDNA labeling, by reverse transcription) and the corresponding sequences of tomato mRNAs.
  • Arabidopsis short olives (20 to 22 bases) must be able to hybridize with tomato mRNAs, to produce cDNAs.
  • the psbA gene (Table) gives a strong signal that the 17 identities with the Arabidopsis primer are largely sufficient. It should be noted that a signal is also obtained for the psbB gene whose 20 nucleotides of the Arabidopsis primer recognize only 15 identities of the corresponding tomato mRNA.

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Abstract

La présente invention concerne un microarray plastidial comprenant un support solide qui comprend une multiplicité de sites élémentaires, chaque site élémentaire comprenant plusieurs copies d'une même sonde d'acide nucléique, la dite sonde étant simple brin, comprenant entre 50 et 70 nucléotides et correspondant à un oligonucléotide sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana ou à un oligonucléotide anti-sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana, la totalité du génome codant chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana étant représenté sur le microarray.

Description

Microarray plastîdial
La présente invention concerne de manière générale le domaine des microarrays et leur utilisation dans la mesure de l'expression des gènes végétaux. Plus particulièrement, la présente invention, concerne un microarray plastidial sur lequel sont immobilisées des sondes spécifiques des produits de transcription des gènes chloroplastidiaux d'Arabidopsis thaliana.
De nombreuses fonctions biologiques dépendent de la régulation des taux d'expression des gènes, soit par des variations dans les taux de transcription, par exemple en contrôlant quand et à quelle fréquence un gène donné est transcrit, soit par des variations dans la synthèse protéique, par exemple en sélectionnant quels ARNm sont traduits par les ribosomes ou en activant ou inactivant sélectivement des protéines après qu'elles aient été synthétisées. La technologie microarray, qui permet la détection multiple d'ADN dans un échantillon de manière concomitante grâce à un support comprenant une pluralité de sondes d'acides nucléiques immobilisées, se prête parfaitement à la mesure de l'expression des gènes.
Le principe du microarray est basé sur la technique d'hybridation. Des oligonucléotides simples brins spécifiques de différents gènes ou de I1ADNc issus d'une RT-PCR constituant les sondes sont immobilisés sur un support solide, également appelé matrice. Les sondes ont pour rôle de détecter des cibles nucléiques complémentaires, présentes dans le mélange complexe à analyser (ARNm extraits de cellules, tissus ou organismes entiers et convertis en ADNc). Ces sondes peuvent être immobilisées sur le support ou synthétisées in situ. Les signaux d'hybridation sont détectés selon le type de marquage choisi : radioactivité ou fluorescence et éventuellement quantifiés.
De nombreux progrès ont été accomplis dans la technologie microarray. Un tel essor a conduit à l'utilisation des instruments issus des hautes technologies et de programmes informatiques. En 1991, est décrite une méthode de fabrication de puce à oligonucléotides par synthèse chimique in situ, base par base, utilisant la photolitographie qui permet d'atteindre une densité de 1 million de sondes par cm2. Dans le même temps, un tel développement a conduit à la complexification des matrices. En 1997, le génome complet de la levure Saccharomyces cerevisiae est représenté sur un microarray. Aujourd'hui, plusieurs sociétés proposent des microarrays couvrant l'intégralité du génome humain. De tels microarrays requièrent des systèmes de détection perfectionnés (i.e. des scanners de microarrays), ce qui prive un bon nombre de laboratoires de recherche ou petites structures de cette technologie.
Stolc V. et al. (PNAS 2005, 102, 4453-4458) décrit l'utilisation d'un microarray du génome complet d'Arabidopsis thaliana, comprenant 5 millions de 36-mers oligonucléotides. L'analyse de 5 millions de sondes présentes sur le microarray requiert l'utilisation d'outils complexes.
On notera, en outre, que les puces qui comportent un très grand nombre de sondes élémentaires présentent l'inconvénient d'être coûteuses, ce qui limite de surplus leur utilisation.
Un objet de la présente invention est de proposer un microarray n'impliquant pas l'usage de systèmes de détection perfectionnés. Ceci est possible du fait que le nombre total de sondes immobilisées sur le support est inférieur à 250, ce qui permet une lecture directe sans utiliser d'appareils de lecture perfectionnés. Ceci est à opposer aux microarrays comportant un très grand nombre de sondes élémentaires, supérieur à 1000, voir à 10000 ou plus.
De nombreux domaines scientifiques ont trouvé un intérêt dans l'utilisation des microarrays. C'est notamment le cas de la biologie végétale où le microarray a de nombreuses applications. On peut citer par exemple le sous domaine des plantes transgéniques. A titre indicatif, dans le document US
2006/015970 qui décrit des séquences nucléotidiques utiles pour l'obtention de plantes transgéniques, le microarray est utilisé pour mesurer les taux d'ARNm dans les cellules de plantes transformées et il permet le contrôle simultané de taux de transcrits de milliers de gènes. A nouveau, la taille du génome des plantes implique la complexification du microarray.
Un objet de la présente invention est de proposer un microarray utile dans le domaine des végétaux, moins complexe que ceux jusqu'à ce jour décrits dans l'art antérieur.
Les cellules végétales comportent trois types d'ADN : l'ADN nucléaire, l'ADN mitochondrial et I1ADN plastidial. Les microarrays portant des séquences de gènes nucléaires ont été les premiers à paraître sur le marché.
A ce jour, la mesure de l'expression des gènes plastidiaux est d'un grand intérêt. En effet, de plus en plus d'industries utilisent les plastes, notamment les chloroplastes, pour la production de protéines et un système de contrôle doit donc être mis en place. En outre, si on considère que les herbicides affectent les fonctions chloroplastiques, le microarray trouve également application dans le domaine des herbicides où il peut, par exemple, permettre de corréler l'usage des herbicides sur l'expression d'un gène du chloroplaste. Arabidopsis thaliana est une plante modèle en génétique. Le séquençage de son génome indique une taille de génome de 125 Mb et on prédit 29000 gènes codant pour des protéines. Son génome plastidial est composé d'une centaine de copies d'un chromosome plastidial circulaire d'environ 150kb. Chaque génome plastidial comporte environ 120 gènes dont près de 80 codent des protéines. Arabidopsis thaliana présente de nombreux avantages liés à sa facilité de culture en laboratoire, sa rapidité de développement et sa prolificité.
Un objet de la présente invention est de proposer un système simple permettant l'évaluation de l'expression de l'ensemble des gènes plastidiaux, qui soit applicable à plusieurs plantes supérieures.
Jean-Jacques Favory et al. (Nucleic Acids Research, 2005 ; 33(18) : 5991-9) ont étudié l'expression du gène SIG4 dans un mutant sig4 d'Arabidopsis thaliana et utilisé un microarray plastidial préparé à partir d'Arabidopsis thaliana, le microarray étant préparé à partir de produits PCR. Immobiliser du matériel nucléique double brin à la surface du support présente l'inconvénient de ne pas permettre la distinction entre l'expression du gène et l'expression du brin anti-sens, ce qui est aujourd'hui fondamental afin de mettre en évidence de nouveaux modes de régulation de l'expression des gènes plastidiaux. Un objet de la présente invention est de proposer un microarray permettant une hybridation très spécifique des transcrits et la distinction entre l'expression du gène et l'expression du brin anti-sens.
La présente invention propose un microarray répondant à tous ces objets.
Description des séquences :
SEQ ID No. 1 : Sonde oligonucléique du gène L23 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 2 : Sonde oligonucléique du gène ndhB d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 3 : Sonde oligonucléique du gène rps7 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 4 : Sonde oligonucléique du gène ccsA(ycfδ) d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 5 : Sonde oligonucléique du gène ArthCpO72 rpl32 d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 6 : Sonde oligonucléique du gène L2 d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 7 : Sonde oligonucléique du gène petD d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 8 : Sonde oligonucléique du gène petB d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 9 : Sonde oligonucléique du gène psbH d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 10 Sonde oligonucléique du gène psbT d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 11 Sonde oligonucléique du gène psbB d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 12 Sonde oligonucléique du gène rpl33 d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 13 Sonde oligonucléique du gène psaJ d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 14 Sonde oligonucléique du gène petG d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 15 Sonde oligonucléique du gène petL d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 16 Sonde oligonucléique du gène petA d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 17 : Sonde oligonucléique du gène cemA(ycfiO) d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 18 : Sonde oligonucléique du gène ycf4 d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 19 : Sonde oligonucléique du gène psal d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 20 : Sonde oligonucléique du gène rbcL d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 21 : Sonde oligonucléique du gène psbZ(ycf9) d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 22 : Sonde oligonucléique du gène psbC d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 23 : Sonde oligonucléique du gène psbD d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 24 : Sonde oligonucléique du gène ycfδ(petN) d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 25 : Sonde oligonucléique du gène psbl d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 26 : Sonde oligonucléique du gène psbK d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 27 : Sonde oligonucléique du gène rps18 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 28 : Sonde oligonucléique du gène accD d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 29 : Sonde oligonucléique du gène rps12(transsplicing) d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 30 : Sonde oligonucléique du gène ycf2 d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 31 : Sonde oligonucléique du gène orf77 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 32 : Sonde oligonucléique du gène ycfl d'Arabidopsis thaliana
SEQ ID No. 33 : Sonde oligonucléique du gène rps15 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 34 : Sonde oligonucléique du gène ndhH d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 35 : Sonde oligonucléique du gène ndhA d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 36 : Sonde oligonucléique du gène ndhl d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 37 : Sonde oligonucléique du gène ndhG d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 38 : Sonde oligonucléique du gène ndhE d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 39 : Sonde oligonucléique du gène psaC d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 40 : Sonde oligonucléique du gène ndhD d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 41 : Sonde oligonucléique du gène ndhF d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 42 : Sonde oligonucléique du gène ycfl d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 43 : Sonde oligonucléique du gène rps19 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 44 : Sonde oligonucléique du gène rpl22 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 45 : Sonde oligonucléique du gène rps3 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 46 : Sonde oligonucléique du gène rpl16 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 47 : Sonde oligonucléique du gène rpl14 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 48 : Sonde oligonucléique du gène rpsδ d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 49 : Sonde oligonucléique du gène rpl36 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 50 : Sonde oligonucléique du gène rps11 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 51 : Sonde oligonucléique du gène rpoA d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 52 : Sonde oligonucléique du gène psbN d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 53 : Sonde oligonucléique du gène clpP d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 54 : Sonde oligonucléique du gène rpl20 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 55 : Sonde oligonucléique du gène psbE d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 56 : Sonde oligonucléique du gène psbF d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 57 : Sonde oligonucléique du gène psbL d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 58 : Sonde oligonucléique du gène psbJ d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 59 : Sonde oligonucléique du gène atpB d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 60 : Sonde oligonucléique du gène atpE d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 61 : Sonde oligonucléique du gène ndhC d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 62 : Sonde oligonucléique du gène ndhK d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 63 : Sonde oligonucléique du gène ndhJ d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 64 : Sonde oligonucléique du gène rps4 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 65 : Sonde oligonucléique du gène ycf3(psa assembly) d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 66 : Sonde oligonucléique du gène psaA d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 67 : Sonde oligonucléique du gène psaB d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 68 : Sonde oligonucléique du gène rps14 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 69 Sonde oligonucléique du gène psbM d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 70 Sonde oligonucléique du gène rpoB d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 71 Sonde oligonucléique du gène rpoC1 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 72 Sonde oligonucléique du gène rpoC2 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 73 Sonde oligonucléique du gène rps2 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 74 Sonde oligonucléique du gène atpl d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 75 Sonde oligonucléique du gène atpH d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 76 Sonde oligonucléique du gène atpF d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 77 Sonde oligonucléique du gène atpA d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 78 Sonde oligonucléique du gène rps16 d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 79 Sonde oligonucléique du gène matK d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 80 Sonde oligonucléique du gène psbA d'Arabidopsis thaliana SEQ ID No. 81 Génome plastidial d'Arabidopsis thaliana
Description de l'invention :
La présente invention concerne un microarray plastidial comprenant un support solide ou matrice qui comprend une multiplicité de sites élémentaires, chaque site élémentaire comprenant plusieurs copies d'une même sonde d'acide nucléique, la dite sonde étant simple brin, comprenant entre 50 et 70 nucléotides et correspondant à un oligonucléotide sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana ou à un oligonucléotide anti-sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana, la totalité du génome codant chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana étant représentée sur le microarray.
La présente invention concerne également aussi un procédé de préparation du microarray tel que ci-dessus défini, selon lequel : a) on dispose d'un support solide, et b) on procède à la fixation des sondes à la surface du support.
La présente invention concerne également un procédé de détection du microarray tel que ci-dessus défini, comprenant : a) la mise en contact de l'échantillon nucléique cible avec le microarray, de manière à permettre l'hybridation b) la détection de l'hybridation La présente invention concerne aussi l'utilisation du microarray tel que ci-dessus défini, pour établir un profil d'expression des gènes de plastes chez les plantes.
La présente invention concerne aussi un jeu de sondes pour la mesure de l'expression des gènes de plastes de végétaux, comprenant au moins deux sondes choisies parmi :
(a) un oligonucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80,
(b) un oligonucléotide anti-sens de l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80,
(c) un oligonucléotide présentant au moins 70 % d'identité avec Poligonucléotide selon (a) ou (b).
Enfin la présente invention concerne un kit comprenant un microarray tel que ci-dessus défini.
Microarray
La présente invention concerne donc un microarray destiné à la détermination (existence ou non, et/ou mesure) de l'expression des gènes plastidiaux des végétaux. Par "microarray", on entend un support solide, ou matrice, comprenant du matériel nucléique immobilisé en des sites élémentaires, le cas échéant repérés selon tout référentiel approprié. Selon la présente invention, chaque site élémentaire comprend plusieurs copies d'une même sonde d'acide nucléique. Les sites élémentaires sont par exemple disposés en lignes et colonnes.
Par "oligonucléotide anti-sens", on entend tout oligonucléotide monocaténaire complémentaire de l'oligonucléotide fragment du brin codant (ou brin sens). Par exemple, la séquence nucléotidique 5' GCACG 3' a pour séquence anti-sens 5' CGTGC 3'. Le support sur lequel est fixé le matériel nucléique se présente sous la forme d'une surface plane, poreuse, ou percée de puits. Il comporte une face utile ou surface opératoire comprenant le matériel nucléique immobilisé (i.e. les sondes) destiné à être au contact de l'échantillon.
Le matériau constitutif d'un tel support est par exemple du silicium, un verre, ou une matière plastique, par exemple une résine de synthèse thermodurcie ou thermoplastique, par exemple un polypropylène ou une résine polyacrylamide. Le support peut comporter plusieurs matériaux, par exemple un matériau dur, tel que du verre, sur lequel est déposé une membrane de nylon ou une membrane de nitrocellulose. Selon la présente invention, le matériau constitutif du support est non conducteur d'électricité. Le microarray de la présente invention est de forme carrée ou rectangulaire et présente une taille inférieure à 100 cm2, par exemple inférieure à 10 cm2.
Le microarray de l'invention est à usage unique ou non. Il est mis en œuvre aux fins d'une détermination biologique moléculaire. Ce microarray peut être utilisé avec un appareil ou instrument distinct et complémentaire.
Le microarray de l'invention est mis en contact avec un échantillon d'intérêt, liquide ou fluide, immobile ou en mouvement, comprenant au moins une espèce cible, en suspension ou en solution, éventuellement marquée, et délivrant au moins un signal en relation avec la présence, et/ou la nature, et/ou la structure et/ou la quantité de ladite espèce cible. Cet échantillon d'intérêt est appelé "échantillon nucléique cible" selon la présente invention.
Selon la présente invention, chaque site élémentaire du support comporte plusieurs copies d'une même sonde d'acide nucléique. Par "sonde", on entend toute séquence d'ADN correspondant à une partie d'un gène donné et le reconnaissant spécifiquement. Les sondes immobilisées en chaque site élémentaire du support sont simple brin, i.e. monocaténaires. Elles comportent entre 50 et 70 nucléotides, de préférence entre 55 et 65 nucléotides, avantageusement 60±1 nucléotides. La longueur des sondes est choisie de manière à être optimale, entre un minimum qui serait la limite de spécificité pour l'hybridation et un maximum qui rendrait la synthèse sans erreur difficile et coûteuse.
Les sondes de la présente invention peuvent être préparées par les techniques classiques de synthèse de chimie organique dans des appareils automatisés. On parie d'oligosondes de synthèse. En général, la voie chimique des phosphoramidites est utilisée pour la synthèse d'oligonucléotides. Une fois synthétisé par les automates pilotés par des microprocesseurs, l'oligonucléotide doit être purifié pour éliminer les produits de réactions ayant avorté. Cette purification peut être réalisée par électrophorèse préparative en gel d'acrylamide, par HPLC sur colonne phase inverse ou en échange d'ions. Chaque sonde correspond à un fragment d'un gène codant chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana. Les séquences nucléotidiques des sondes sont choisies de manière à permettre l'hybridation de séquences nucléotidiques cibles complémentaires, isolées à partir de diverses plantes supérieures d'intérêt agronomiques. En d'autres termes, chaque sonde doit être générique. Arabidopsis thaliana est une plante modèle en génétique. Il existe des similitudes entre les génomes plastidiaux des différentes espèces de plantes. Pour chaque gène considéré, les inventeurs ont donc recherché et mis en évidence des similitudes entre les séquences de différentes espèces de plantes, et trouver des sondes susceptibles d'hybrider du matériel génétique issu de différentes espèces. Les séquences choisies sont communes à plusieurs plantes avec un pourcentage défini d'identité ou de similarité.
Le génome d'Arabidopsis thaliana, y compris son génome plastidial, est à ce jour entièrement séquence. Les séquences du génome plastidial d'Arabidopsis thaliana sont accessibles sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ en utilisant le code NC_000932. Le génome plastidial d'Arabidopsis thaliana est repris dans son intégralité à la SEQ ID No. 81. Les inventeurs ont comparé les séquences codantes des gènes chloroplastidiaux de cette plante avec celles de gènes chloroplastidiaux d'autres plantes modèles, notamment la tomate, le riz, le maïs, le tabac, la luzerne, le blé et l'épinard, c'est-à-dire d'autres plantes d'intérêt agronomique. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple Vector NTi Vector NTi 9.1.0, programme d'alignement AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De préférence, on utilise les paramètres par défaut.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence de chaque sonde est choisie pour être identique à plus de 50% avec une séquence nucléique d'au moins une plante choisie parmi la tomate, la luzerne, le tabac, le riz, Pépinard, le blé et le maïs.
Par "identité" ou "sondes présentant un certain pourcentage d'identité", on entend des oligonucléotides invariants ou inchangés au pourcentage près défini entre deux séquences. Ces oligonucléotides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au oligonucléotide de référence. De manière avantageuse, la séquence de chaque sonde est choisie pour être identique à plus de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et de préférence 98%, avec une séquence nucléique d'au moins une plante choisie parmi la tomate, la luzerne, le tabac, le riz, l'épinard, le blé et le maïs.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la séquence de chaque sonde est choisie pour être identique à plus de 50% avec une séquence nucléique d'au moins deux plantes choisie parmi la tomate, la luzerne, le tabac, le riz, l'épinard, le blé et le maïs.
De manière avantageuse, la séquence de chaque sonde est choisie pour être identique à plus de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et de préférence 98%, avec une séquence nucléique d'au moins deux plantes choisie parmi la tomate, la luzerne, le tabac, le riz, l'épinard, le blé et le maïs.
Le génome plastidial de ces plantes est accessible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ en utilisant les codes suivants :
Selon la présente invention, les sondes sont également choisies afin de ne présenter ni structures secondaires internes qui empêchent l'hybridation, ni répétitions internes au-delà d'un seuil de 6 nucléotides.
Les conditions d'hybridation sont précisées ci-après.
En outre, selon un mode de réalisation de la présente invention, les sondes sont choisies de façon à "homogénéiser" la distance du premier nucléotide de la sonde en 5' au codon initiateur du gène d'Arabidopsis thaliana correspondant. Par "homogénéiser", il faut comprendre que l'on choisit les sondes de manière à ce que la distance entre le 1er nucléotide de la sonde et l'ATG initiateur du gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana soit de préférence inférieure à 200 nucléotides pour un maximum de sondes du microarray. Les intérêts d'une homogénéisation des distances sont nombreux. Parmi ceux-ci figure notamment Ia possibilité d'analyse directe des transcrits produits in vitro. En effet, de tels transcrits marqués in vitro peuvent s'hybrider même si l'allongement de la transcription est incomplet. L'homogénéisation des distances permet en outre une analyse semi quantitative de l'expression des gènes entre eux. En effet, lorsque les séquences marquées se situent à une même distance de l'ATG initiateur, on peut aisément comparer les quantités relatives des transcrits d'un gène à l'autre, par exemple par le biais de marquage des acides nucléiques cibles par la méthode dite de "run on". Ainsi, avantageusement pour ce qui est des sondes du microarray plastidial, au moins 50% des séquences correspondant à un oligonucléotide sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana sont choisies pour être situées à moins de 200 nucléotides du codon initiateur. Encore plus avantageusement, au moins 70%, 80% ou 90% des séquences correspondant à un oligonucléotide sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana sont choisies pour être situées à moins de 200 nucléotides du codon initiateur.
Selon la présente invention, la totalité du génome codant plastidial d'Arabidopsis thaliana est représentée sur le microarray. Le génome plastidial de cette plante peut être qualifié de petit car il comporte 111 gènes, parmi lesquels figurent 80 gènes codant des protéines, les gènes des ARNr et les gènes des ARNt. Ainsi selon la présente invention, au moins la totalité des 80 gènes codant des protéines du génome plastidial d'Arabidopsis thaliana est représentée sur le microarray. Avantageusement, la totalité des 80 gènes codant des protéines du génome plastidial d'Arabidopsis thaliana et au moins un gène des ARNr ou ARNt est représentée sur le microarray. De manière encore plus avantageuse, la totalité du génome plastidial d'Arabidopsis thaliana est représentée sur le microarray, c'est-à-dire les 111 gènes.
Selon l'invention, des oligosondes de ces gènes et des oligosondes du brin anti-sens de ces gènes sont immobilisées sur le support du microarray en vue de mesurer l'expression des gènes plastidiaux des végétaux et l'expression anti-sens de ces gènes. Ceci est possible car les sondes sont monocaténaires. L'art antérieur dans sa globalité (Nagashima, Akitomo et al. (Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2004, 68(3), 694-704); Nakamura, Takahiro et al. (Plant and CeII Physiology 2003, 44(8), 861-867); Legen Julia et al. (Plant Journal 2002, 31 , 2, 171-188)) décrit des microarrays sur lesquels sont réalisés des dépôts de produits de PCR. De tels microarrays ne permettent pas de distinguer l'expression sens et anti-sens des gènes.
Le nombre de sondes est dépendant du nombre de gènes représentés sur le microarray. Lorsque la totalité du génome plastidial d'Arabidopsis thaliana des 80 gènes codant pour des protéines est présente sur le microarray, le nombre de sondes est de 160 (80 oligosondes sens et 80 oligosondes anti-sens) si chaque site élémentaire comporte plusieurs copies d'une seule et même sonde. Si chaque site élémentaire du support du microarray comporte plusieurs copies d'une première sonde d'acide nucléique et plusieurs copies d'une seconde sonde d'acide nucléique, antisens de la première sonde, alors le microarray comporte 80 sites élémentaires. Lorsque la totalité du génome plastidial d'Arabidopsis thaliana est représenté sur le microarray, le nombre de sondes est de 222 (111 oligosondes sens et 111 oligosondes anti-sens) si chaque site élémentaire comporte plusieurs copies d'une seule et même sonde. En outre, à la condition que chaque site élémentaire du support comprenne plusieurs copies d'une même et unique sonde, le support comprend entre 160 et 222 sites élémentaires. Si chaque site élémentaire du support du microarray comporte plusieurs copies d'une première sonde d'acide nucléique et plusieurs copies d'une seconde sonde d'acide nucléique, antisens de la première sonde, alors le support comporte entre 80 et 111 sites élémentaires.
Bien entendu, il se peut que le microarray de la présente invention soit représenté sur plus d'un support s'il n'est pas possible de déposer la totalité des sondes sur un seul et même support. Selon un mode de réalisation de la présente invention, il est possible de procéder au marquage des sondes, plutôt qu'au marquage de l'échantillon nucléique cible. De manière générale, le marquage du matériel nucléique permet la détection de l'hybridation.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, chaque site élémentaire du support du microarray comporte plusieurs copies d'une première sonde d'acide nucléique et plusieurs copies d'une seconde sonde d'acide nucléique, antisens de la première sonde, les deux sondes étant marquées de manière différente.
Dans un mode de réalisation préféré, chacune des sondes est choisie dans le groupe des séquences suivantes : (a) un oligonucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80,
(b) un oligonucléotide anti-sens de l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80, (c) un oligonucléotide présentant au moins 70 % d'identité avec l'oligonucléotide selon (a) ou (b).
L'invention se rapporte à un microarray à la surface duquel se trouve en chaque site élémentaire du support un oligonucléotide comportant entre 50 et 70 nucléotides, de préférence entre 55 et 65 nucléotides, avantageusement 60±1 nucléotides. Cet oligonucléotide est choisi dans le groupe constitué par SEQ ID No. 1 à 80, un oligonucléotide antisens de l'une de SEQ ID No. 1 à 80 et un oligonucléotide présentant au moins 70% d'identité avec l'une de SEQ ID No.1 à 80. L'oligonucléotide peut avantageusement être choisi parmi des oligonucléotides présentant au moins 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% et de préférence au moins 99% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID No. 1 à 80.
Par "identité" ou "oligonucléotides présentant un certain pourcentage d'identité", on entend des oligonucléotides invariants ou inchangés au pourcentage défini entre deux séquences. Ces oligonucléotides peuvent par exemple présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport au oligonucléotide de référence.
A toutes fins utiles, un bon nombre de techniques de biologie moléculaire sont décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989).
Procédé de préparation du microarrav
La présente invention concerne également un procédé de préparation du microarray, procédé selon lequel : a) on dispose d'un support tel que ci-dessus défini, b) on procède à la fixation des sondes à la surface du support.
Pour ce qui est de la fixation à proprement parler, on peut utiliser une micropipette, par exemple manuelle ou robotisée. Selon un mode de réalisation de la présente invention, on ajoute éventuellement une substance réalisant la fixation des sondes à la surface du support. A titre indicatif, on peut citer la polylysine. Procédé de détection
La présente invention concerne également un procédé de détection du microarray tel que ci-dessus défini, ledit procédé comprenant : a) la mise en contact de l'échantillon nucléique cible avec le microarray, de manière à permettre l'hybridation, et b) la détection de l'hybridation.
Les conditions d'hybridation sont précisées ci-après. Par "échantillon nucléique cible", on entend un échantillon nucléique capable de s'hybrider de manière sélective aux oligonucléotides immobilisés à la surface du support, appelés sondes, et partie intégrante du microarray selon l'invention (appariements G-C et T-A).
L'échantillon nucléique cible nécessite d'être préparé. L'ADNc est obtenu avec une reverse transcriptase ARN à partir d'une amorce complémentaire au transcrit dans une région positionnée dans le gène aussi prêt que possible de l'oligonucléotide servant de sonde ou à partir d'un hexanucléotide aléatoire.
Les séquences cibles s'hybrident avec les séquences sondes à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et la séquence sonde est généralement 10 fois, de préférence 100 fois, plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier. En général, la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement, la température d'hybridation est d'au moins 3O0C pour un oligonucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 600C pour un oligonucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant : 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 μg/ml sperme de saumon dénaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1% SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01% SDS, et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles bien connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989). L'étape a) du procédé est également appelée phase d'hybridation sonde-cible.
Selon la présente invention, peut être marqué l'oligonucléotide sonde ou le matériel nucléique cible. Par "marquage" ou "marqué", on entend la caractéristique selon laquelle on fixe sur une entité, de manière covalente ou autre, un marqueur, c'est-à-dire un substituant ou reste permettant, avec ou sans l'aide d'un moyen extérieur, tel que l'illumination, avec ou sans étape postérieure, telle que mise en contact avec un substrat, de produire un signal détectable. On distingue le marquage par les isotopes radioactifs et le marquage non radioactif. Pour ce qui du marquage radioactif, en pratique le 32P, le 35S et le 3H sont les trois radioéléments utilisés en biologie moléculaire. Les nucléotides marqués au 32P doivent être utilisés dans les jours qui suivent car le 32P présente une demi-vie brève (15 jours). Il faut en moyenne 108 cpm/μg d'acides nucléiques. La durée de vie du 35S est quatre fois plus longue mais les analyses sont moins sensibles. Concernant le marquage non radioactif ou marquage froid, il existe un grand nombre de systèmes. Certains font appel à un couple de ligands, par exemple l'avidine ou la streptavidine et la biotine. Dans ce cas, on incorpore la biotine dans le matériel nucléique cible. On peut également citer, à titre indicatif, le système basé sur la sulfonation des cytosines et le système basé sur la bioluminescence. Le matériel nucléique peut également être marqué à l'aide d'un fluorochrome.
L'échantillon nucléique cible peut également être marqué en 5' par une T4 polynucléotide kinase ou en 3' par une T4 RNA ligase. II peut également être marqué in vitro par synthèse d'ARN en présence d'un nucléotide marqué, par transcription d'une matrice ou par la technique dite de "run on", selon laquelle les cellules sont incubées en présence de ribonucléosides triphosphates radioactifs. Après lavage et autoradiographie, l'intensité des taches est proportionnelle à la quantité de RNA néosynthétisés donc au taux de transcription. Cette technique est principalement comparative. Elle permet d'apprécier des variations du taux de transcription, sous réserve que ces variations soient suffisamment importantes.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, les sondes d'acide nucléique sont marquées, de manière à permettre la détection de l'hybridation. L'étape b) du procédé consiste à détecter l'hybridation. Il s'agit de déterminer les sondes qui ont été effectivement hybridées, c'est-à-dire de repérer à quelles adresses les sondes sont complémentaires des cibles de l'échantillon nucléique. Les signaux d'hybridation sont détectés selon le type de marquage, radioactivité ou fluorescence, par mesure radiographique ou par fluorescence, et quantifiés.
Par exemple, une lecture optique permet de révéler les sondes devenues fluorescentes, hybridées avec le matériel nucléique cible marqué. Les données récoltées peuvent être analysées par un logiciel-traitement d'images.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, l'étape de mise en contact est réalisée par incubation du microarray en présence d'un tampon d'hybridation comprenant l'échantillon nucléique cible marqué. A titre indicatif, ce dernier est marqué par fluorescence, c'est-à-dire à l'aide d'un fluorochrome devenant fluorescent lorsqu'il est excité par un faisceau lumineux). Le tampon d'hybridation est ensuite retiré, puis on expose le microarray à un second tampon de lavage, volatile, qui ne dénature pas l'hybridation spécifique à la surface du microarray. Le lavage est destiné à débarrasser le microarray des cibles nucléiques non hybridées. On retire le second tampon et on laisse ce second tampon s'évaporer pendant un temps suffisant. Enfin, on pose le filtre sur un écran photosensible déposé dans une cassette, puis après un temps variable d'exposition à l'obscurité, on scanne l'écran avec un scanneur de fluorescence ou de radioactivité (typiquement un phosphσrimager).
Jeu de sondes
L'invention concerne également des jeux de sondes permettant d'établir un profil d'expression des gènes plastidiaux de plantes. Chaque sonde est spécifique d'un produit de transcription d'un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana. Les sondes sont capables de s'hybrider dans des conditions stringentes ou dans des conditions d'hybridation sur microarray, avec des transcrits ARN des gènes d'autres plantes, ou des compléments de ces transcrits. Dans une forme de réalisation particulière, le jeu de sondes décrit comprend une ou plusieurs sondes qui sont chacune dirigées sur une des séquences suivantes :
(a) un oligonucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID 5 No:1 à 80,
(b) un oligonucléotide anti-sens de l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80,
(c) un oligonucléotide présentant au moins 70 % d'identité avec l'oligonucléotide selon (a) ou (b). 0
Utilisation
La présente invention concerne également l'utilisation du microarray tel que ci-dessus défini, pour établir un profil d'expression des gènes de plastes chez les plantes. -5
Kit
La présente invention concerne également un kit comprenant un microarray tel que ci-dessus défini.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le kit0 comprend en outre le support, les solutions permettant l'hybridation et le marquage, par exemple le marquage par fluorescence des ARN cibles, et/ou les protocoles d'isolement des ARN adaptés aux différentes plantes.
Description des figures 5
Figure 1 : microarray après hybridation de l'échantillon nucléique cible isolé à partir de plantules d'Arabidopsis thaliana sauvage
Figure 2 : microarray après hybridation de l'échantillon nucléique cible isolé à partir de plantules d'Arabidopsis thaliana d'un mutant particulier. 0 Exemples
A. Fabrication du microarray
1. Choix des sondes
A partir du génome plastidial d'Arabidopsis thaliana (voir référence NC_000932 sur http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pour ce qui est du génome chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana ou SEQ ID no. 81), les sondes dont les séquences sont définies ci-après sont retenues comme ayant un caractère universel, en particulier vis-à-vis des gènes choloroplastidiaux d'autres plantes notamment la tomate, le riz, le maïs et l'épinard.
Par exemple, choix de la sonde SEQ ID No. 29 - gène rps12
Tableau récapitulatif pour 8 sondes
Pour les 8 gènes testés, les séquences de 60 nucléotides choisis chez Arabidopsis thaliana sont similaires à celles des gènes correspondants de 7 plantes, avec un taux supérieur à 80%. Ceci autorise l'hybridation sur une membrane plastidiale d'Arabidopsis avec les ARN ou ADNc de 7 autres plantes. Des facteurs de correction sont possibles.
Tableau de distance entre le 1er nucléotide de la sonde et I1ATG initiateur du gène chloroplastidial $ Arabidopsis thaliana.
* distance entre le 1er nucléotide de la sonde et l'ATG initiateur du gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana > à 200 nucléotides
72 sondes sur les 80 présentent une distance entre le 1er nucléotide de la sonde et I1ATG initiateur du gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana correspondant inférieure à 200 nucléotides, soit 90% des sondes.
2. Synthèse et marquages des sondes
Les sondes sont synthétisées de la manière suivante : les réactions s'effectuent au sein d'une petite colonne contenant des microbilles de plastiques ou de verre sur lesquelles est fixé le premier nucléotide en 3' de l'oligonucléotide à synthétiser. Les fonctions réactives de ce nucléotide sont bloquées. Un cycle de réactions va permettre d'ajouter un nouveau nucléotide. Chaque cycle est composé des étapes suivantes : déblocage du phosphore en 5', activation, fixation du nucléotide suivant sous forme bloquée. Un cycle a une durée de 6 minutes environ, un nucléotide étant incorporé à chaque cycle. Pratiquement il suffit de charger les réservoirs de l'appareil de synthèse avec les réactifs appropriés, de taper la séquence désirée au clavier et de récupérer l'oligonucléotide synthétisé.
Les sondes synthétisées sont, en l'espèce, marquées après synthèse. Le marquage s'effectue sur l'extrémité 5' par la T4 polynucléotide kinase. La sonde est incubée à 37°C pendant 45 minutes en présence de (γ32P)ATP etde l'enzyme. Les nucléotides qui n'ont pas réagi sont séparés de la sonde marquée.
P 5' 3' OH oligonucléotide synthétique
e
P* 5' 3' OH oligonucléotide marqué
3. Fixation des sondes
10 pmol de sonde, correspondant à 190 ng, sont déposés en chaque site élémentaire du support, en l'espèce une membrane de nitrocellulose de dimension 12 cm x 8 cm. Les dépôts sont réalisés en double et espacés de 1 mm.
B. Préparation de la cible
1 - Préparation des ARN
Les ARN isolés de plantules d'Arabidopsis sont préparés selon une méthode standard comme indiqué dans Privât et al. (Plant Mol. Biol., 55, 385-399.) et sont conservés à -800C. 2 μg d'ARN sont prélevés et traités deux fois avec à 2 u/μg de DNase I, à 37°C pendant 30 min, les ARN étant purifiés dans un mélange phénol/chloroforme (1 :1 , en volume). On ajoute aux 2 μg des ARN, 1 μl de la mixture des oligonucléotides 20-mers (0,1 pmol/μl), synthétisées selon les tableaux ci-dessous (tableaux 1 et 2), 1 ,5 μl des nucléotides dA, dG, dT (10 mM), 5 ml de α-[P32]-dCTP (10 μCi/μl, Amersham) en complétant à 18 μl d'eau. Les ARN sont ensuite dénaturés pendant 5 min à 65°C puis ils sont maintenus dans la glace.
Exemple : amorces - Gène rps 12
position séquence
Gène 1 ATGCCAACCA TTAAACAACT TATTAGAAAT ACAAGACAGC CAATCCGAAA CGTCACGAAA rps 12
61 TCCCCAGCGC TTCGGGGATG CCCTCAGCGA CGAGGAACAT GTACTCGGGT GTATACTATC
121 ACCCCCAAAA AACCAAACTC TGCTTTACGT AAAGTTGCCA GAGTACGATT AACCTCGGGA
181 TTTGAAATCA CTGCTTATAT ACCTGGTATT GGCCATAATT TACAAGAACA TTCTGTAGTC
241 TTAGTAAGAG GGGGAAGGGT TAAGGATTTA CCCGGTGTGA GATATCACAT TGTTCGAGGA
301 ACCCTAGATG CTGTCGGAGT AAAGGATCGT CAACAAGGGC GTTCTAGTGC GTTGTAGATT
361 CTTATCCAAG ACTTGTATCA TTTGATGATG CCATGTGAAT CGCTAGAAAC ATGTGAAGTG
421 TATGGCTAAC CCAATAACGA AAGTTTCGTA AGGGGACTGG AGCAGGCTAC CACGAGACAA
481 AAGATCTTCT TTCAAAAGAG ATTCGATTCG GAACTCTTAT ATGTCCAAGG TTCAATATTG
541 AAATAATTTC AGAGGTTTTC CCTGACTTTG TCCGTGTCAA CAAACAATTC GAAATGCCTC
601 GACTTTTTTA GAACAGGTCC GGGTCAAATA GCAATGATTC GAAGCACTTA TTTTTACACT
661 ATTTCGGAAA CCCAAGGACT CAATCGTATG GATATGTAAA ATACAGGATT TCCAATCCTA
721 GCAGGAAAAG GAGGGAAACG GATACTCAAT TTAAAAGTGA GTAAACAGAA TTCCATACTC
781 GATTTCAGAG ATACATATAT AATTCTGTGG AAAGCCGTAT TCGATGAAAG TCGTATGTAC
841 GGTTTGGAGG GAGATCTTTC ATATCTTTCG AGATCCACCC TACAATATGG GGTCAAAAAG
901 CCAAAATAA
Amorce
111 GCCCTTGTTGACGATCCTTTAC reverse
Amorce
48 TCAGCGACGAGGAACATG forward Tableau 1 - amorces RT reverse
Tableau 2 - amorces RT forward
2 - Préparation des ADN monobrins par transcription reverse (RT). Le milieu réactionnel contient 6 μl de tampon 5x livré avec la reverse transcriptase Superscript AII (SSII) d'Invitrogen, 3 μl de dithiothréitol (DTT) 0,1 M, et 1 μl d'inhibiteur de RNAse (RNA guard, Amersham). Le mélange est ajouté à la solution contenant les ARN puis est mis à 42°C pendant 3 min. On ajoute ensuite 1 ,5 μl de SSII. La réaction de RT dure 50 min à 420C et est arrêtée par chauffage à 700C pendant 15 min. Les ADNc obtenus sont traités par ajout d'1 μl de RNase H pendant 20 min à 37°C.
3 - Purification des ADNc
Les nucléotides non incorporés sont éliminés en passant les ADNc au travers d'une microcolonne de billes de Sephadex G50, comme suit : aux 30 μl d'ADNc sont ajoutés 170 μl de tampon Tris-EDTA (TE) à pH 8, puis 200 ml du même tampon TE. L'ensemble est déposé sur la microcolonne et le passage est stocké dans un tube eppendorf. Après avoir déposé à nouveau 300 μl de tampon TE pH 8 sur la colonne, l'éluat radioactif est récupéré dans un autre tube eppendorf.
4. Vérification de l'efficacité de la réaction RT
Aux fins de vérification et pour comparer l'efficacité de la RT entre les différents échantillons 1 μl des ADNc marqués sont analysés par électrophorèses sur un gel d'acrylamide à 6%. Les quantités utilisées pour les hybridations sont ajustées pour avoir des incorporations de 32P sensiblement égales.
C. Hybridation des ADNc marqués sur les microarrays
Le tampon d'hybridation contient, 100 ml de tampon phosphate (NaHPO4, 1 M, pH 5,2), 0,4 ml de Na2 EDTA à 0,5 mM, 70 ml de SDS 20%, 2 g de BSA, et un complément d'H2O pour un volume final de 200 ml. Le tampon de lavage (500 ml) contient 40 mM de NaHPO4, pH 7,2, 1 mM de Na2 EDTA et 7% SDS. Le tampon de déhybridation (500 ml) contient 0,5% de SDS et 0,01% de SSC. Après une préhybridation pendant 1h à 65 0C, l'hybridation est réalisée pendant 72 h à 650C et est suivie d'un lavage pendant 10 min à température ambiante et pendant 5 min à 65 0C.
D. Détection : mesure de la radioactivité hybridée
Après une exposition des microarrays pendant 15 jours, la radioactivité est révélée avec un phosphorimager et les quantités relatives sont mesurées en utilisant un logiciel approprié. E. Analyse
L'analyse est faite par un logiciel R ou tout autre logiciel adapté.
Voir figures 1 et 2
La figure 1 représente un microarray après hybridation de l'échantillon nucléique cible isolé à partir de plantules d'Arabidopsis thaliana sauvage
La figure 2 représente un microarray après hybridation de l'échantillon nucléique cible isolé à partir de plantules d'Arabidopsis thaliana mutant.
On distingue des variations d'expression sur deux couples de sites élémentaire par comparaison entre les microarrays.
Le tableau ci-après montre une comparaison de l'expression des gènes plastidiaux de tomate avec une puce construite d'après les séquences d'arabidopsis (sondes et amorces).
S = significatif ; S ? résultat incertain
*P : nombre d'identités dans la tomate relativement à l'Arabidopsis 60-mer **p : nombre d'identités dans la tomate relativement à l'Arabidopsis 20-22 mer + , le nombre de + indique l'importance du signal d'hybridation Le ARN total a été isolé du Arabidopsis thaliana ou de tomate (Solanume Lycopersicum, var. Ailsa craig) cultivée pendant 7 jours à température ambiante et a été traité deux fois avec de la DNase I (2 unités/μg ARN) afin d'enlever les traces d'ADN, 6 μg (arabidopsis thaliana) ou 8 μg (tomate) deARN ont été considérés comme hybridation microarray.
Le ARN a subi une reverse transcriptase en utilisant des amorces spécifiques correspondant aux 79 gènes protéiniques codés que l'on souhaite analyser avec le microarray. Les amorces sont situées aussi près que possible de la 3eme extrémité de 60-mer qui ont été repérées sur les filtres.
La réaction a été conduite comme décrit précédemment (Favory et al. 2005, Nucl. Acids Res. 33, 5991-5999) en présence de 100μ Ci de α32P d'ATP (Amersham Bioscience) utilisant la reverse transcriptase Superscript II (Invitrogen). Des échantillons ont été traités avec RNase H à 37°C pendant 15 minutes et des desoxyribonucléotides ont été enlevés par passage à travers du Sephadex G50. Un échantillon de chacun des ADNc synthétisés a été analysé sur un gel de polyacrylamide à 6%, afin de vérifier la qualité d'ADNc synthétisé.
L'hybridation a été conduite pendant 3 jours à 65°C dans un tampon phosphate (NAHPO4, 0,5 M, Ph 7,2), 1 mM EDTA, 20% SDS ET 1% BSA.
Après hybridation, les filtres ont été lavés dans un tampon de lavage contenant 4OmM de NaHPO4, pH 7,2, 1mM EDTA et 7% SDS à la température ambiante pendant 10 minutes, suivi par un lavage pendant 5 minutes à 65°C.
Après une exposition de 3 semaines sur des plaques Fujifilm Imagin Plates, les plaques sont analysées en utilisant un phosphorimarger (fujifilm FLA 8000) et un logiciel approprié.
Les essais décrits ci-dessus ont eu pour but de valider le caractère « universel » du microarray construit à partir des séquences du génome plastidial d'Arabidopsis thaliana, en analysant les ARNm plastidiaux d'une plante particulière, ici la tomate. En premier lieu, il faut noter que deux éléments entrent en ligne de compte dans les essais concernant le microarray « arabidopsis » : d'un côté les sondes (60-mer) et de l'autre les amorces (20-22 mer) servant pour le marquage des ARNm. La question posée est de savoir si le système « arabidopsis » est applicable à la Tomate (il s'agit de la plante Solanum Lycopersicum, anciennement Lycopersicum esculentum, et non du simple fruit).
(1) En ce qui concerne les sondes, l'analyse bioinformatique montre que, pour un seuil de 49 identités sur 60, 87% des ARNm plastidiaux de tomate peuvent s'hybrider. Ces conclusions sont tirées de données partiellement reportées dans le Tableau. Ainsi, le ARNm du gène psbl de tomate donne un signal fort d'hybridation avec la sonde d'Arabidopsis portée sur la membrane laquelle ne possède que 49 identités avec la partie correspondante du ARNm . Ainsi, on peut conclure qu'une identité de 49/60 est largement suffisante. Avec un seuil de 44/60, 93% des sondes devraient pouvoir s'hybrider avec les ARNm de tomate.
(2) Le deuxième élément intervenant dans l'hybridation est le degré d'identités entre les séquences des amorces d'Arabidopsis (utilisées pour le marquage des ADNc, par transcription inverse) et les séquences correspondantes des ARNm de tomate. Les oligo courts d'Arabidopsis (de 20 à 22 bases) doivent pouvoir s'hybrider avec les ARNm de tomate, pour produire des ADNc. Le gène psbA (Tableau) donne un signal fort montrant que les 17 identités avec l'amorce d'Arabidopsis sont largement suffisantes. Il est à noter qu'un signal est également obtenu pour le gène psbB dont les 20 nucléotides de l'amorce d'Arabidopsis reconnaissent seulement 15 identités du ARNm correspondant de tomate. Ainsi, pour un seuil de 15 identités dans les amorces (tomate/Arabidopsis), 61/77 des amorces d'Arabidopsis, soit 80%, sont utilisables pour l'analyse de l'expression plastidiale de la tomate. La conséquence de ces observation est que pour étudier l'expression des gènes plastidiaux de tomates il faudrait synthétiser une vingtaine d'amorces spécifiques de la tomate.
En conclusion, en utilisant les seuils de 44 et 15 identités pour les sondes et les amorces, respectivement, on peut raisonnablement valider les résultats des hybridations des ADNc de tomate avec le microarray « Arabidopsis » (construit à partir des séquences d'Arabidopsis).
En résumé, il peut être conclu que : Le microarray « arabidopsis » est applicable à l'évaluation de l'expression des gènes plastidiaux de tomate, directement, c'est-à-dire, avec les amorces d'Arabidopsis, pour 93 % des gènes, et, en ajoutant les amorces appropriées, pour la quasi totalité des gènes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Microarray plastidial comprenant un support solide qui comprend une multiplicité de sites élémentaires, chaque site élémentaire comprenant plusieurs copies d'une même sonde d'acide nucléique, la dite sonde étant simple brin, comprenant entre 50 et 70 nucléotides et correspondant à un oligonucléotide sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana ou à un oligonucléotide anti-sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana, la totalité du génome codant chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana étant représentée sur le microarray.
2. Microarray selon la revendication 1 , dans lequel la séquence correspondant à un oligonucléotide sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana est choisie pour être identique à plus de 50% avec une séquence nucléique d'au moins une plante choisie parmi la tomate, la luzerne, le tabac, le riz, l'épinard, le blé et le maïs.
3. Microarray selon la revendication 1 ou 2, dans lequel au moins la moitié des séquences correspondant à un oligonucléotide sens dans un gène chloroplastidial d'Arabidopsis thaliana est choisie pour être située à moins de 200 nucléotides du codon initiateur.
4. Microarray selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les sondes d'acide nucléique sont marquées, de manière à permettre la détection de l'hybridation.
5. Microarray selon la revendication 4, dans lequel chaque site élémentaire du support comporte plusieurs copies d'une première sonde d'acide nucléique et plusieurs copies d'une seconde sonde d'acide nucléique, antisens de la première sonde, les deux sondes étant marquées de manière différente.
6. Microarray selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel chaque site élémentaire comprend plusieurs copies d'une même sonde choisie parmi les séquences suivantes : (a) un oligonucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80,
(b) un oligonucléotide anti-sens de l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80, (c) un oligonucléotide présentant au moins 70 % d'identité avec
Poligonucléotide selon (a) ou (b).
7. Procédé de préparation du microarray selon l'un quelconque des revendications 1 à 6, selon lequel : a) on dispose d'un support solide, et b) on procède à la fixation des sondes à la surface du support.
8. Procédé de détection du microarray selon l'un quelconque des revendications 1 à 6, comprenant : a) la mise en contact de l'échantillon nucléique cible avec le microarray, de manière à permettre l'hybridation, et b) la détection de l'hybridation.
9. Utilisation du microarray selon les revendications 1 à 6, pour établir un profil d'expression des gènes de plastes chez les plantes.
10. Jeu de sondes pour la mesure de l'expression des gènes de plastes de végétaux, comprenant au moins deux sondes choisies parmi :
(a) un oligonucléotide selon l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80,
(b) un oligonucléotide anti-sens de l'une quelconque des séquences SEQ ID No:1 à 80,
(c) un oligonucléotide présentant au moins 70 % d'identité avec l'oligonucléotide selon (a) ou (b).
11. Kit comprenant un microarray selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
12. Kit selon la revendication 11, comprenant en outre le support, les solutions permettant l'hybridation et le marquage et/ou les protocoles d'isolement des ARN adaptés aux différentes plantes.
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