EP2029119A2 - Functionalized solid polymer nanoparticles for diagnostic and therapeutic applications - Google Patents

Functionalized solid polymer nanoparticles for diagnostic and therapeutic applications

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EP2029119A2
EP2029119A2 EP07726022A EP07726022A EP2029119A2 EP 2029119 A2 EP2029119 A2 EP 2029119A2 EP 07726022 A EP07726022 A EP 07726022A EP 07726022 A EP07726022 A EP 07726022A EP 2029119 A2 EP2029119 A2 EP 2029119A2
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EP
European Patent Office
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polymer
polymer nanoparticles
nanoparticles according
particles
nanoparticles
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07726022A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Katrin Claudia Fischer
Sascha General
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Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer Schering Pharma AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Schering Pharma AG filed Critical Bayer Schering Pharma AG
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention describes cationic surface potential polymer nanoparticles in which both hydrophobic and hydrophilic pharmaceutically active substances can be included.
  • the hydrophilic and thus water-soluble substances are entrapped by ionic complexation with a charged polymer in the core of the particle by co-precipitation.
  • both therapeutics and diagnostics can be used as pharmaceutically active substances.
  • the cationic particle surface provides stable, electrostatic surface modification with partially oppositely charged compounds that may contain target-specific ligands to enhance passive and active targeting.
  • nanoparticulate drug delivery systems are mainly due to their small size, thereby overcoming different physiological barriers is possible [Fahmy T.M., Fong P.M. et al., Mater. Today, 2005; 8 (8): 18-26].
  • the associated altered distribution in the organism can, for. B. for the diagnosis as well as for the therapy of various tumor diseases can be used advantageously.
  • the associated therapeutic monitoring will enable faster detection of treatment resistance in the future and by timely use of alternative Therapies significantly improve the patient's cure [Emerich DF, Thanos CG, Curr. Nanosci., 2005; 1: 177-188].
  • a substance class used very successfully in tumor therapy is the group of cytostatic drugs. All rapidly dividing cells of the body, including tumor cells, are damaged by these substances. However, this not only leads to a death of the tumor cells, but often other vital organs and tissues such as the bone marrow, mucous membranes or heart vessels are affected.
  • EPR effect for short
  • This EPR effect was already described by Matsumura and Maeda in 1986 as a strategy for targeted drug accumulation in solid tumors [Matsumura Y, Maeda H., Cancer Res., 1986; 46: 6387-6392] [Maeda H., Adv. Enzyme Regul., 2001; 41: 189-207].
  • This is a passive enrichment mechanism that exploits the structural peculiarities of tumorous or inflamed tissue [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56 (7): 1023-1050].
  • tumor tissue is characterized by its fast growth and various messenger substances usually by a fenestr Understand "holey" tissue structure as well as a lack of lymphatic drainage
  • holey tissue structure As well as a lack of lymphatic drainage
  • this area is also referred to as nanosize window [Hobbs SK, Monsky WL et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998; 95: 4607-4612] [Brigger I., Dubernet C. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 2002; 54 (5): 631-651].
  • the nanoparticles must circulate in the blood stream for a sufficient period of time.
  • This requires particle sizes between approx. 10 nm and 380 nm as well as suitable particle surfaces.
  • pegylated particle surfaces can prevent endogenous proteins from identifying the particles as foreign and rapid elimination via the organs of the reticulo-endothelial system (short RES) [Otsuka H. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 2003; 55 (3): 403-419].
  • active ligands on the particle surface e.g., antibodies
  • tissue-specific enrichment can be further optimized [Nobs L. et al. Pharm. Sci., 2004; 93: 1980-1992] [Yokoyama M., J. Artif. Organs, 2005; 8: 77-84].
  • the cell membrane For a recording of the active ingredients in the cell, another physiological barrier, the cell membrane, must be overcome.
  • the active substance is introduced into the cell via endocytosis with the aid of nanoparticles, it is possible to circumvent ejecting transporters and to prevent multi-drug resistance (MDR) [Bharadwaj V., J. Biomed. Nanotechnol., 2005; 1: 235-258] [Huwyler J. et al., J. Drug Target., 2002; 10 (1): 73-79].
  • MDR multi-drug resistance
  • the release properties of the active substance from the nanoparticle can additionally be controlled by targeted selection of the polymer.
  • a nanoparticulate formulation can thus minimize the frequency of application and lead to a reduction of the therapeutically necessary dose. Furthermore, unwanted plasma peak levels can be avoided by encapsulation in nanoparticles and a delayed release can be achieved.
  • a nanoparticulate system which already fulfills all the described advantages, has not yet been developed according to the current state of knowledge.
  • the variety of nanoparticulate carrier systems described in the literature also makes it clear that there is currently no optimal nano-formulation for all problems.
  • the overall structure of the particles, matrix-forming substances, and especially their surface are of crucial importance for in vivo behavior [Choi SW, Kim WS, Kim JH, Journal of Dispersion Science and Technology, 2003; 24 (3 & 4): 475-487].
  • the physicochemical properties of various drugs differ greatly. Accordingly, there remains a need in the development of colloidal drug carrier systems with improved properties.
  • optical imaging techniques such as sonography, X-ray diagnostics, cross-sectional imaging (CT, MRI) and nuclear medicine (PET, SPECT) are available for in vivo detection.
  • CT cross-sectional imaging
  • PET nuclear medicine
  • SPECT nuclear medicine
  • Another and relatively new method is optical imaging, whose detection principle is based on the use of near-infrared fluorescence. It is a non-invasive procedure that works without ionizing radiation and is very inexpensive and inexpensive compared to methods such as MRI.
  • N I R dyes such as indocyanine green developed for such an application are very soluble in water, and therefore it is difficult to efficiently encapsulate them in a hydrophobic polymer matrix.
  • the reason for this is the rapid change of the hydrophilic substance into the aqueous phase, for example during production by means of nanoprecipitation.
  • hydrophilic substances in nanoparticles only a few technologies are available that have different disadvantages.
  • the amphiphilic nature of liposomes or polymerosomes allows the inclusion of hydrophilic substances in the aqueous interior of the particles, whereas hydrophobic compounds can be incorporated in the membrane. Due to the localization in the core or in the shell of the particles, the loading is very limited and thus usually insufficient.
  • a further disadvantage is that, above all, hydrophilic substances in an aqueous environment are rapidly washed out of such systems.
  • both water-soluble dyes for diagnosis and therapeutic substances which are usually poorly water-soluble due to their hydrophobic properties, should be able to be encapsulated effectively and with sufficient stability to wash out.
  • a technological challenge remains, on the one hand, through the use of suitable surfaces on the one hand a sufficient Particle stability and on the other hand to ensure a specific accumulation in the target tissue.
  • the whereabouts at the site of the enrichment depends, among other things, on how well the particles are absorbed into the tissue and the cell.
  • nanoparticulate systems with cationic surface properties should be prepared without the potential toxicologically harmful properties hindering an in vivo application.
  • the particle surface must be inconspicuous to the body's own defense mechanisms (Opsonine, RES), allowing only a sufficiently long circulation time, which is a prerequisite for a corresponding accumulation of particles from the blood stream in the target tissue.
  • the nanoparticulate systems should continue to support uptake into the target cell and endolysosomal release.
  • Another difficulty in the production of nanoparticulate systems is to apply suitable substances or target structures to the particle surface.
  • the surface of the particles is modified by means of covalent coupling reactions.
  • Prerequisite for this are functional groups on the polymer backbone or on the particle surface, which can be irreversibly linked by appropriate chemical coupling reactions with the target molecule [Nobs L. et al., J. Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992]. Since the stability of colloidal dispersions is often greatly reduced by the reagents or under the reaction conditions, the chemical implementation is usually complicated and problematic [Koo OM et al., Nanomedicine, 2005; 1 (3): 193-212] [Choi SW et al., J. Dispersion Sei. Technol., 2003; 24 (3 & 4): 475-487].
  • the covalent attachment of molecules and particle surfaces must be particularly suitable for any new molecule to be applied to the surface in order to avoid possible unwanted chemical reactions. Avoiding organic solvents, often used for covalent linkages, is also desirable because of the reduced burden on the environment and the simplification of the implementation of the reaction. Ideally, therefore, a non-covalent, easy-to-perform, and thus flexible, yet stable surface modification should be possible.
  • the known from the literature colloidal systems are usually only suitable for encapsulation of hydrophobic substances or hydrophilic substances. In the case of the frequently used covalent surface modification of the particles, there is little flexibility with regard to the use of a wide variety of surface structures on one and the same core particle.
  • the ligands for specific enrichment often adversely affect the uptake in the actual tumor tissue and in particular on the cell uptake. Insofar as the particles ensure adequate circulation and passively or actively accumulate well in the target tissue, internalization and endolysosomal release are usually not optimal [van Osdol W., Cancer Res., 1991; 51: 4776-4784] [Weinstein JN et al., Cancer Res., 1992; 52 (9): 2747-2751].
  • An object of the invention was therefore to provide an improved pharmaceutical formulation in which on the one hand hydrophilic as well as hydrophobic drugs can be encapsulated.
  • a flexible and sufficiently stable surface modification should allow optimal accumulation in the diseased tissue.
  • such a colloidal system must also be efficiently incorporated into the target tissue as well as into the individual cells where endolysosomal release can occur.
  • they should be practicable manufacturing methods to enable production in a timely and cost-effective manner.
  • the invention relates to polymer nanoparticles having a cationic surface potential containing a cationic polymer and a polymer which is sparingly soluble in water, characterized in that said polymer nanoparticles contain diagnostic and / or therapeutic agents.
  • substances can be encapsulated in the polymer particles which are suitable for the diagnosis and / or the therapy of various diseases.
  • the cationically functionalized particle surface can be electrostatically stably and flexibly surface-modified with a partially oppositely charged compound.
  • the described invention is therefore suitable for detecting diseases (diagnosis), for the treatment of diseases (therapy) as well as for monitoring a therapy.
  • the invention includes a suitable drug form using pharmaceutically acceptable excipients, which are necessary for the respective dosage form.
  • the drug form developed in the context of the invention can be applied to humans or animals via various routes of administration. Necessary application systems are also part of the invention described herein.
  • the composition of the nanoparticles includes a poorly water-soluble polymer, which is preferably a biodegradable polymer or else a mixture of various biodegradable polymers.
  • a biodegradable polymer can be described via individual monomer units which form said polymer by means of polymerization or other processes.
  • the polymer can be defined by its name.
  • the poorly water-soluble polymer is derived from the group of natural and / or synthetic polymers or from homo- and co-polymers of corresponding monomers.
  • the polymer is derived from the group of alkyl cyanoacrylates such as, for example, butyl cyanoacrylates and isobutyl cyanoacrylates, acrylates such as methacrylates, lactides, for example L-lactides or DL-lactides, glycolides, caprolactones such as ⁇ -caprolactones and others ,
  • said polymer or part of the polymer is selected from the group of polycyanoacrylates and polyalkylcyanoacrylates (PACA) such as polybutylcyanoacrylate (PBCA), polyesters such as poly (DL-lactides), poly (L-lactides), polyglycolides, polydioxanones, polyoxazolines , Poly (glycolide-co-trimethylene-carbonate), polylactide-co-glycolide (PLGA) such as poly (L-lactide-co-glycolide) or poly (DL-lactide-co-glycolide), poly (L-lactide) co-DL-lactides), poly (glycolide-co-trimethylene), poly (carbonates-co-dioxanones), alginic acid, hyaluronic acid, polysialic acid, acidic cellulose derivatives, acidic starch derivatives, polysaccharides such as dextrans, alginates, cycl
  • the poorly water-soluble polymer is selected from the group of polyalkyl cyanoacrylates (PACA).
  • PPA polyalkyl cyanoacrylates
  • polyalkylcyanoacrylates shows the structure indicated (formula 1), wherein the radical R given is preferably linear and branched alkyl groups having 1 to 16 carbon atoms, a cyclohexyl, benzyl or a phenyl group.
  • the poorly water-soluble polymer is a polybutyl cyanoacrylate (PBCA) (Formula 2).
  • PBCA polybutyl cyanoacrylate
  • the poorly water-soluble polymer forms the larger proportion of the polymer matrix of the particles.
  • the cationic polymer is derived from the group of natural and / or synthetic polymers or from homo- and co-polymers.
  • Suitable cationic polymers in the context of this invention are polymers having free primary, secondary or tertiary amino groups which can form salts with any low molecular weight acid, the salts being soluble in aqueous-organic solvents. Also suitable are polymers or their
  • Solvents are soluble.
  • the following groups of cationic polymers, polycations and polyamine compounds or polymers of homopolymers and copolymers of corresponding monomers are particularly suitable: modified natural cationic polymers, cationic proteins, synthetic cationic polymers, aminoalkanes of different chain lengths, modified cationic dextrans, cationic polysaccharides , cationic starch or cellulose derivatives, chitosans, guar derivatives, cationic cyanoacrylates, methacrylates and methacrylamides and those monomers and comonomers which can be used to form suitable compounds and the corresponding salts which can form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids.
  • These include in particular: diethylaminoethyl-modified dextrans, hydroxymethylcellulosetrimethylamine, polylysine, protamine sulfate,
  • the amino group-bearing compound in particular a cationic polymer
  • an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), or in a mixture of these solvents with water ,
  • the polymethylene particles contain, as the amino-containing compound, a cationically modified polyacrylate (poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, P (DMAEMA)) (formula 3).
  • a cationically modified polyacrylate poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, P (DMAEMA)
  • the biodegradable, cationically modified polyacrylate P (DMAEMA) is encapsulated in the polymer matrix, in particular the PBCA polymer matrix, by nanoprecipitation.
  • the surface of the resulting nanoparticles has a positive (cationic) surface potential (zeta potential) due to the amino groups of the cationic polymer.
  • the cationic particle surface ensures good cell uptake and enables flexible electrostatic surface modification with partially anionically charged compounds.
  • the polymer nanoparticles contain as cationic polymer a modified polyacrylate
  • the polymer nanoparticles contain as cationic polymer polyethyleneimine (PEI) of various molecular weights, in particular 1, 8 kDa, 10 kDa, 70 kDa and 750 kDa, (formula 4).
  • PEI polyethyleneimine
  • PEI is a polycation commonly used in the field of non-viral gene therapy for DNA polyplexes (PEK) and accordingly much studied [Remy J.-S. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 1998; 30 (1-3): 85-95].
  • the particle shell Due to the encapsulation of the cationic polyelectrolyte PEI in the PBCA polymer matrix, the particle shell consists of PEI polymer chains, which produce a cationic surface potential.
  • diagnostic as well as therapeutic substances can be included in the polymer matrix by means of nanoprecipitation.
  • the following substance classes for different molecular imaging methods can be used as diagnostic substances for encapsulation, in particular contrast agents or tracers for the following method for molecular imaging (Molecular Imaging) are to be mentioned: optical imaging, such as DOT (diffuse optical ultrasound imaging, OPT (optical projection tomography), near-infrared fluorescence imaging, fluorescence protein imaging and bioluminescence imaging (BLI) and magnetic resonance imaging (MRI, MRI) and X-ray imaging (X-ray imaging) ). But there are also other methods conceivable.
  • optical imaging such as DOT (diffuse optical ultrasound imaging, OPT (optical projection tomography), near-infrared fluorescence imaging, fluorescence protein imaging and bioluminescence imaging (BLI) and magnetic resonance imaging (MRI, MRI) and X-ray imaging (X-ray imaging)
  • DOT diffuse optical ultrasound imaging
  • OPT optical projection tomography
  • near-infrared fluorescence imaging fluorescence protein imaging and bioluminescence imaging (BLI)
  • the diagnostic agent is a dye, in particular selected from the following group: fluorescein,
  • Difluorofluorescein such as Oregon GreenTM 488, Oregon GreenTM 500 or
  • Polymethine dyes coumarin dyes, e.g. Coumarin 6,7-amino-4-methyl coumarin, metal complexes of DTPA or tetraazamacrocycles (Cyclen,
  • the diagnostic substance is a fluorescence-active dye.
  • the diagnostic agent is a fluorescent near-infrared (NIR) dye.
  • NIR dyes preferably used for optical imaging, absorb and emit light in the NIR range between 650 nm and 1000 nm.
  • the preferred dyes belong to the class of polymethine dyes and are selected from the following groups: carbocyanines such as diethyloxacarbocyanine (DOC), diethyloxadicarbocyanine (DODC ) Diethyloxatricarbocyanine (DOTC), indodi or indotricarbocyanines, tricarbocyanines, merocyanines, oxonol dyes (WO 96/17628), rhodamine dyes, phenoxazine or phenothiazine dyes,
  • carbocyanines such as diethyloxacarbocyanine (DOC), diethyloxadicarbocyanine (DODC ) Diethyloxatricarbocyanine (DOTC), in
  • Tetrapyrrole dyes especially benzoporphyrins, chorine and phthalocyanines.
  • Suitable inorganic cations or counterions for these dyes are, for example, the lithium ion, the potassium ion, the hydrogen ion and in particular the sodium ion.
  • Suitable cations of organic bases are, among others, those of primary, secondary or tertiary amines, such as ethanolamine, diethanolamine, morpholine, glucamine, N 1 N- dimethylglucamine and especially N-methylglucamine, and polyethyleneimine.
  • Suitable cations of amino acids are, for example, those of lysine, arginine and ornithine and the amides of otherwise acidic or neutral amino acids.
  • the preferred dyes may be used as bases or as salts thereof.
  • the diagnostic substance is a carbocyanine dye.
  • the general structure of the carbocyanines is described as follows (Formula 8).
  • R 20 to R 29 , R 32 and R 33 independently of one another represent a hydrogen atom, a hydroxy group, a carboxy, a sulfonic acid radical or a carboxyalkyl, alkoxycarbonyl or alkoxyoxoalkyl radical having up to 10 C atoms or a sulfoalkyl radical up to 4 carbon atoms, or for a non-specific binding macromolecule, or for a radical of general formula VI
  • R 20 to R 29 corresponds to a non-specific binding macromolecule or the general formula VI, where o and s are 0 or independently of one another for an integer from 1 to 6, q and v are independently 0 or 1,
  • R 34 represents a hydrogen atom or a methyl radical
  • R 35 is an alkyl radical having 3 to 6 C atoms, which has 2 to n-1 hydroxyl groups, where n is the number of C atoms, or a substituted with 1 to 3 carboxy groups alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, aryl radical 6 to 9 carbon atoms or arylalkyl radical having 7 to 15 carbon atoms, or a radical of the general formula IMd or MIe
  • anionic, readily water-soluble substances such as certain carbocyanines can be stably entrapped in the hydrophobic polymer matrix of the described nanoparticles.
  • an anionic water-soluble substance is encapsulated by ion complexation and co-precipitation with a cationic polymer in a sparingly water-soluble polymer matrix by nanoprecipitation, resulting in particles of defined size.
  • the carbocyanine dye is the readily water-soluble anionic tetrasulfocyanine (TSC) (Formula 9).
  • the carbocyanine dye is IDCC (indodicarbocyanine) (Formula 10).
  • the carbocyanine dye is ICG (indocyanine green) (Formula 11).
  • the encapsulated pharmaceutically active substance is a therapeutic agent.
  • the therapeutic agent is a substance for the treatment of tumor diseases, in particular vascularized tumors and metastases, or diseases with inflammatory reactions.
  • the latter can be, for example, diseases of the rheumatic type, such as, for example, Rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, collagenosis, vasculitis, and infectious diseases.
  • Other diseases with inflammatory processes and possible tissue changes include chronic inflammatory bowel disease (Crohn's disease, ulcerative colitis), multiple sclerosis, atopic dermatitis as well as certain erythema disorders.
  • the following groups can be used as therapeutic substances: immunogenic peptides or proteins, chemotherapeutic agents, toxins, radiotherapeutic agents, radiosensitizers, angiogenesis inhibitors and antiinflammatory substances such as NSAIDs or a combination of these.
  • the therapeutic agents for the treatment of tumor diseases can be selected from the group of alkylating agents, in particular bendamustine, busulfan, carmustine, chlorambucil, cyclophosphamide, ifosfamide, lomustine, Melphalan, nimustine, thiotepa, treosulfan and trofosfamide, the group of antimetabolites, in particular cytarabine, fludarabine, fluorouracil, gemcitabine, mercaptopurine, methotrexate and tioguanine, the group of alkaloids and diterpenes, in particular vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine, etoposide, and docetaxel , Paclitaxel, the group of taxanes, the group of antibiotics, especially aclubicin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mito
  • the therapeutic agent is a substance which is suitable for the treatment of inflammation.
  • They are in particular selected from the group of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), in particular salicylates (inter alia acetylsalicylic acid), arylacetic acid derivatives (inter alia acemetacin, diclofenac), propionic acid derivatives (inter alia ibuprofen, ketoprofen, naproxen, tiaprofen), indole derivatives (inter alia Indomethacin, acemetacin, lonazolac, proglumetacin), oxicams (including piroxicam, tenoxicam), alkalons (including nabumetone), pyrazolones (including azapropazone, pyrazinobutazone, phenylbutazone, oxyphenbutazone), anthranilic acid derivatives (including mefenamic acid, niflumic acid), COX 2 inhibitors (including melaminophen
  • the polymer nanoparticles are precipitation aggregates which are produced by nanoprecipitation.
  • the following production methods are available for this purpose:
  • Direct precipitation in a test tube by introducing the dissolved polymer-substance mixture into a surfactant-containing aqueous solution which is mixed by means of a magnetic stirrer.
  • Substance mixture in the surfactant-containing aqueous solution In the production of nanoparticles by nanoprecipitation, the organic solvent is abruptly withdrawn from the matrix polymer and the substances dissolved with it, when the polymer-containing organic solution is added to a significantly larger volume of an aqueous solution.
  • compounds dissolved in the polymer phase with amino groups water-soluble as well as water-insoluble
  • the condition for this is the unlimited miscibility of the organic solvent (eg acetone, ethanol) with water as well as the insolubility of the matrix polymer in the aqueous phase.
  • the surface of the polymer nanoparticles is electrostatically modified.
  • the electrostatic modification of the cationic nanoparticle surface is an outstanding advantage of the present invention.
  • the particle surface can be modified with a suitable substance without a chemical coupling reaction.
  • the prerequisite for this is that the modifying agent has partial charges which are opposite to the particle surface charge.
  • this method electrostatic surface modification by charge titration
  • the enrichment (active and passive targeting) of nanoparticles from the bloodstream into the target tissue requires that the particles circulate in the blood stream for a sufficient period of time.
  • the circulation time in the body can be adapted individually, in particular by using polyethylene oxides or polyethylene glycols (see Example 5).
  • Another outstanding advantage is that the electrostatic surface modification described here can be carried out quickly and without problems directly before use. This is done by simply mixing appropriate amounts of the nanoparticle dispersion with the modifying agent.
  • the separation of core particles and modifying agent further allows a surface modification according to the individual requirements of the patient.
  • the surface modification on a modular principle offers maximum flexibility for diagnosis, therapy and monitoring, whereby the uncomplicated implementation of the modification is carried out directly by the user.
  • the partially anionically charged moiety fulfills the function of an anchor on the positively charged particle surface through electrostatic interactions.
  • the neutral, aligned to the surrounding aqueous medium moiety consists of polyethylene glycol and / or polyethylene oxide units (PEG units) of different lengths. Preference is given here to PEG chains having a molecular weight of from 100 to 30,000 daltons and more preferably from 3,000 to 5,000 daltons. This moiety may alternatively be made of other suitable structures, such as. As hydroxyethyl starch (HES) and all possible polymeric compounds exist.
  • the radical R is preferably hydrogen or a methyl unit.
  • the surface of the polymer nanoparticle is modified with Glu (10) -b-PEG (110) (Formula 6).
  • the negative moiety (anchor) is the carboxylate groups of the glutamic acid subunits of the block copolymer.
  • Formula 6 Structural Formula of GIu (10) -b-PEG (110);
  • a target structure is present.
  • This target structure has at least one negatively charged moiety which is applied to the cationic particle surface by electrostatic interactions.
  • the partially anionically charged moiety fulfills the function of an anchor on the positively charged particle surface through electrostatic interactions.
  • the middle, neutral part of the molecule consists of polyethylene glycol units and / or polyethylene oxide units (PEG units) of different lengths. Preference is given here to PEG chains having a molecular weight of from 100 to 30,000 daltons and more preferably from 3,000 to 5,000 daltons. This moiety may alternatively be made of other suitable structures, such as. As hydroxyethyl starch (HES) and all possible polymeric compounds exist.
  • HES hydroxyethyl starch
  • the ligand X of the surface-modifying agent also referred to as target structure, serves to improve passive and active accumulation mechanisms of the polymer nanoparticles.
  • Suitable ligands as target structures may be antibodies, peptides, receptor ligands of ligand mimetics or an aptamer. Structures include amino acids, peptides, CDR (compementary determining regions), antigens, haptens, enzyme substances, enzyme cofactors, biotin, carotenoids, hormones, vitamins, growth factors, lymphokines, carbohydrates, oligosaccharides, lecithins, dextrans, lipids, nucleosides such as DNA or an RNA molecule containing native, modified or artificial nucleosides, nucleic acids, oligocucleotides, polysaccharides, B, A, Z-HeNx or hairpin structure (hairpin), a chemical entity, modified polysaccharides as well as receptor binding substances or fragments thereof consideration. Target structures may also be transferrin or folic acid or parts thereof, or all possible combinations of the foregoing.
  • ligands are bound to the nanoparticles via electrostatic interactions, but it is also possible to bind the ligands via covalent bonds to the particle surface. Furthermore, it is possible to incorporate a linker between ligand and nanoparticles.
  • the electrostatic attachment of the target structures takes place via charge interactions with at least one negatively charged moiety on the cationic particle surface.
  • compounds such as acetate, carbonate, citrate, succinate, nitrate, carboxylate, phosphate, sulfonate or sulfate groups, as well as salts and free acids of these groups, are suitable as the negatively charged moiety (anchor).
  • the size of the nanoparticles is between 1 nm and 800 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 5 nm and 800 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 1 nm and 500 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 1 nm and 300 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 5 nm and 500 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 5 nm and 300 nm.
  • the size of the nanoparticles is between 10 nm and 300 nm.
  • the size of the resulting polymer nanoparticles is determined by photon correlation spectroscopy (PCS).
  • PCS photon correlation spectroscopy
  • the polymer nanoparticles are characterized by carrying out the following process steps:
  • the water-insoluble polymer is dissolved in a suitable organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), or in a mixture of these solvents with water.
  • a suitable organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), or in a mixture of these solvents with water.
  • the cationic polymer is dissolved in a suitable solvent which is immiscible with water indefinitely, preferably acetone,
  • the active ingredient (diagnostic or therapeutic) is dissolved in an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide
  • a completely homogeneous solution of cationic polymer, water-insoluble polymer and active ingredient is produced. • By introducing the dissolved polymer-substance mixture in a surfactant-containing solution, as a surfactant in particular Pluronic F68, Triton X-100 and Synperonic T707, the spontaneous formation of a colloidal precipitation unit is brought about.
  • the organic solvent is then removed either under atmospheric pressure or negative pressure, via lyophilization or heat completely or other suitable methods.
  • the aqueous, stable nanoparticle dispersion is mixed in a suitable ratio with the modifying agent dissolved in water.
  • the determination of the appropriate quantitative ratio is carried out by stepwise titration of
  • Particle dispersion with the modifying agent The degree of electrostatic surface modification (charge titration) is controlled by determining the zeta potential.
  • the described nanoparticles can be further processed using suitable pharmaceutical additives to various dosage forms which are suitable for application to humans or animals. These include in particular aqueous dispersions, lyophilisates, solid oral dosage forms such as fast-dissolving tablets, capsules and others.
  • suitable pharmaceutical additives may be: sugar alcohols for lyophilization (eg sorbitol, mannitol), tableting excipients, polyethylene glycols, etc.
  • aqueous nanoparticle dispersion or of a further developed pharmaceutical form can be applied orally, parenterally (intravenously), subcutaneously, intramuscularly, intraocularly, intrapulmonary, nasally, intraperitoneally, dermally as well as on all other possible human or animal routes of administration.
  • the invention relates to a process for the preparation of a polymer nanoparticle, characterized in that the following process steps are carried out:
  • active ingredient includes therapeutically and diagnostically effective compounds. Also included are compounds that are effective in animals other than humans and plants.
  • matrix polymer as used herein describes the polymer which quantitatively constitutes the major proportion of the particle mass, wherein further encapsulated substances (both arbitrary additives and pharmaceutically active substances) may be uniformly and / or non-uniformly embedded.
  • (nano) precipitation describes the formation of a colloidal precipitate by precipitating a sparingly water-soluble polymer when placed in an aqueous phase, with mixing of the solvents taking place Community precipitation of several substances which may be both water-soluble and poorly water-soluble in the context of the invention.
  • this precipitating aggregate consists of a matrix polymer in which further polymeric substances as well as pharmaceutically active substances can be partially or completely embedded in. A uniform or uneven distribution of the coagulum may be present. encapsulated substances in the matrix polymer.
  • an “anchor”, as used herein, describes an ionic moiety of the modifying agent that allows immobilization and thus localization of the modifying agent on the charged particle surface by ionic interactions between oppositely charged compounds.
  • Charge titration describes the process of electrostatic coupling of the armature on the particle surface that can be traced by zeta potential measurement. The charged anchor changes the zeta potential of the particle towards the charge of the anchor.
  • Surfactants according to the invention are, on the one hand, surface-active substances which lower the interfacial tension between two immiscible phases, which makes it possible to stabilize colloidal dispersions. Furthermore, according to the invention, surfactants can be any type of substances which are capable of sterically and / or electrostatically stabilizing colloidal dispersions.
  • active targeting is used when tissue- or cell-specific ligands are used for targeted enrichment, and active ligands can be coupled both directly to drugs (ligand-drug conjugates) and to the surface of colloidal carrier systems.
  • passive targeting is used when the distribution of the active ingredient is due to (nonspecific) physical, biochemical or immunological processes, primarily due to the enhanced permeation and retention effect (EPR effect) this is a passive enrichment mechanism that exploits the structural peculiarities of tumorous or inflamed tissue [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56 (7): 1023-1050].
  • surface potential also referred to as surface charge
  • zeta potential is synonymous with the term “zeta potential.”
  • This zeta potential is determined by the method of laser Doppler anemometry (LDA).
  • LDA laser Doppler anemometry
  • the surface potential also referred to as zeta potential, indicates the potential of a migrating particle at the shear plane, ie when most of the diffuse layer has been sheared off by movement of the particle.
  • the surface potential was determined by the method of laser Doppler anemometry using a "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments).
  • the migration speed of the particles in the electric field is determined. Particles with a charged surface migrate in an electric field to the oppositely charged electrode, wherein the
  • Migration rate of the particles depends on the amount of surface charges and the applied field strength.
  • particles traveling in the electric field are irradiated with a laser and the scattered laser light is detected.
  • a frequency shift in the reflected light is measured in comparison to the incident light.
  • the amount of this frequency shift is dependent on the rate of migration and is referred to as the so-called Doppler frequency (Doppler effect).
  • Doppler frequency Doppler effect
  • the electrophoretic mobility results from the quotient of the migration speed and the electric field strength.
  • the product of electrophoretic mobility and factor 13 corresponds to the zeta potential, the unit of which is [mV].
  • the software used was PCS V1.41 / PCS V1.51 Rev.
  • the control measurements of the zeta potential were made with standard latex particles of Company Malvern Instruments Ltd. (-50 mV ⁇ 5 mV). The measurements were made under the standard settings of Malvern Instruments Ltd. carried out.
  • the size of the nanoparticles was determined by Dynamic Light Scattering (DLS) using a "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments). In addition, images were taken in the scanning electron microscope (SEM), as shown by way of example in FIG. Figure 12 ( Figure 12) also confirms the spherical shape of the nanoparticles.
  • the determination of the particle size by DLS is based on the principle of Photon Correlation Spectroscopy (PCS).
  • PCS Photon Correlation Spectroscopy
  • the mean particle diameter is calculated from the slope of the correlation function.
  • the particles should have a spherical shape, which can be checked by SEM images (see above), do not sediment or float.
  • the measurements were carried out with samples in appropriate dilution, at a constant temperature of 25 ° C and a defined viscosity of the solution.
  • the measuring device was calibrated with standard latex particles of different sizes from Malvern Instruments Ltd.
  • the scanning electron micrographs (SEM images) for determining the particle size were prepared using a field emission scanning electron microscope of the type XL-30-SFEG from FEI (Kassel, Germany). In advance, the samples were sputtered in a high vacuum sputter 208 HR from Cressington (Watford, England) with a 5 nm gold-palladium layer.
  • solubility of a substance indicates whether and to what extent a pure substance can be dissolved in a solvent. It thus designates the property of a substance under homogeneous distribution (as atoms, molecules or
  • the solubility of a compound is determined to be the concentration of a saturated solution that is in equilibrium with the undissolved sediment as a function of temperature (space temperature).
  • a poorly soluble compound has a
  • Sicomet 6000 is used for PBCA production by anionic polymerization of butyl cyanoacrylate (BCA).
  • BCA butyl cyanoacrylate
  • the polymerization process is carried out by slow, permanent dropping of a total of 2.5% [m / v] BCA into a 1% [m / v] Triton X-100 solution at pH 2.2.
  • the pH is previously adjusted by means of a 0.1 N HCl solution.
  • the resulting dispersion is stirred while cooling in an ice bath (about 4 ° C) for 4 hours constantly at 450 U / min. Subsequently, larger agglomerates are separated by filtration through a paper-pleated filter.
  • the BCA polymerized to PBCA is precipitated and the filter residue obtained is washed several times with purified water (MiIIiQ system). After drying of the filter residue PBCA in a drying oven at 40 0 C for 24 h has an average molecular weight is determined (Mn ⁇ 2000 Da) by GPC. Polystyrene standards are used.
  • the mixed dye-polymer mixture is taken up with a 2.5 ml Eppendorf pipette and pipetted into 10 ml of an intensely stirred 1% [m / v] Synperonic T707 solution.
  • the nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent.
  • the workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps.
  • PLGA-P (DMAEMA) nanoparticles 500 ⁇ l of a 2% acetone PLGA solution [m / v] with 100 ⁇ l of P (DMAEMA) in acetone (2% [m / v]) are used.
  • 100 ⁇ l of the dye solutions a-d mentioned under i) are used.
  • the mixed dye-polymer mixture is taken up in a 2.5 ml Eppendorf pipette and pipetted into 10 ml of an intensively stirred 1% Synperonic T707 solution.
  • the nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent.
  • the workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps.
  • Example 3 Influence of Nanoprecipitation by Changing the Polymer Content in the Surfactant Phase
  • FIG. 1 shows that the particle size of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles can be controlled during production by varying the polymer concentration.
  • the cationically functionalized particles are prepared according to Example 2.
  • FIG. 2 shows the particle diameter as well as the zeta potential of PBCA [PEI-I DCC] nanoparticles, which are stabilized by either the Triton X-100 or Pluronic F 68 surfactant. Due to the encapsulation of the polycation polyethylenimine in the PBCA matrix, the particles have a positive zeta potential between 30 mV and 40 mV. Both the particle size and the zeta potential are constant before and after processing of the particles (washing process), evidence of a good stability of the particles.
  • PBCA [PEI-IDCC] nanoparticles used here are prepared according to Example 2.
  • the aqueous, stable nanoparticle dispersion is mixed in a suitable quantitative ratio with the modifying agent dissolved in water.
  • the determination of the appropriate quantitative ratio is carried out by stepwise titration of the particle dispersion with the modifying agent.
  • the degree of electrostatic surface modification (charge titration) is controlled by determining the zeta potential.
  • the change in the zeta-potential from +25 mV to about -30 mV is illustrated in FIG. 3 by stepwise addition of the modifying agent (Glu (10) -b-PEG (HO)) for particle dispersion (charge titration).
  • Example 6 R E M images of PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles loaded with different fluorescent dyes
  • FIG. 4 shows an SEM image of DODC-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
  • FIG. 5 shows an SEM micrograph of coumarin-6-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
  • FCS fetal calf medium
  • Additives penicillin / streptamycin
  • the cells are passaged regularly and sowed for experimental purposes 24 hours before the start of the investigations.
  • the cells are in 96-well plates of the company
  • FCS-containing medium is aspirated and replaced with 50 .mu.l of serum-free medium.
  • CMXRos dye previously diluted in medium, from Molecular Probes Europe BV, Leiden (NL) (0.25 ⁇ l / ml) is used. Incubation with 50 ⁇ l of the dye solution takes place in the incubator for 15 min (37 ° C., 5% CO 2). The dye solution is then filtered off with suction and the cells are washed 2-3 times with PBS.
  • the fixation of the cells is carried out with 100 ul of 1, 37% formaldehyde for 10 min at room temperature. After aspirating the fixing solution, the cells are washed 2-3 times with PBS. Nuclear staining takes place on the already fixed cells with a maximum of 33342. For this purpose, 100 ⁇ l of the dye solution diluted in PBS (2 ⁇ g / ml) are incubated for 10 min at room temperature. After removal of the dye solution, the cells are washed with 100 ⁇ l PBS 2-3 times. The fixed plates are stored in the refrigerator until the fluorescence microscopic examination with 200 .mu.l PBS / Well protected from light in the refrigerator at 8 ° C.
  • Example 8 Influence of functionalized particle surfaces on cell uptake
  • the nanoparticles used in Example 8 are prepared according to Example 2. Unmodified or after electrostatic surface modification with folic acid or Glu (10) -b-PEG (110), the particles have the properties listed in Table 1. In the 96-well plate used for the experiment all wells have the same cell density (sowing 24 h before experiment: 1x10 4 cells). A constant particle concentration of the particles listed in the table (Table 1) is incubated in the incubator over a period of 60 minutes. Subsequently, the cells are washed, fixed and measured on the following day. The uptake of the fluorescent cells is carried out with an automatic fluorescence microscope at 20 ⁇ magnification and constant exposure time (see FIG. 6).
  • Example 9 Cell uptake behavior of GIu (10) -b-PEG (110) modified PBCA P (DMAEMA) nanoparticles
  • the brightly fluorescent dots, which are endosomes or endolysosomes, are evidence of efficient uptake of the nanoparticles into the cell by endocytosis ( Figure 7).
  • the scale of the magnification proves that in this photograph individual particles can not be visible due to their size of less than 200 nm. A large number of particles within these vesicles (endosomes / endolysosomes) cause strong, punctate fluorescence contrast in the cytoplasm.
  • FIG. 11 shows in relation to Fig. 10 an increased particle uptake with incubation of a higher particle concentration.
  • Example 12 Characterization of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles
  • FIG. 12 Based on the SEM image (FIG. 12), it can additionally be shown that they are spherical nanoparticles with a size of about 200 nm.
  • Charge titration is used to modify the cationic surface of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles with the block copolymer Glu (10) -b-PEG (110) (see FIG. 14).
  • the surface charge measured as zeta potential is correspondingly titrated from approx. +3 ohms above the neutral point until reaching the dissociation equilibrium at approx. -3 oMV.
  • the surface-modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] particles show no change in the zeta potential over the investigated period of 7 days after titration. In connection with the unchanged particle size and the constant low PI, a good particle stability can be proven.
  • FIG. 15 shows the UV-Vis absorption spectra of an aqueous ICG solution as well as the ICG nanoparticle dispersion (washed and unwashed).
  • Indocyanine green is a near-infrared fluorescent dye whose absorption and emission spectrum is in the wavelength range between 650-900 nm.
  • DMAEMA cationic polyacrylate P
  • the animals used are supplied by Taconic M & B. These are female albino nude mice of the type NMRI nude. The adult animals have a weight of 22-24 g after about 8 weeks.
  • Five female nude mice are inoculated with 2x10 6 cells of a F9 teratoma in the right posterior flank. The cells are obtained from the company ATCC / LGC Promochem GmbH. It is mouse-derived embryonic cells of a testinal teratocarcinoma, which is used as a tumor model for cancer research purposes in mice. After 18 days, four of the five mice had tumors with an average size of about 0.5-1 cm in diameter.
  • the animals are permanently anesthetized with a rompun-ketavet injection in a dose of 100 ⁇ l / 10 g of animal for the first hour of the experiment.
  • the solution for injection consists of a 1: 1 mixture of 1:10 Dilution Rompun or 1: 5 dilution Ketavet with physiological saline.
  • 200 ⁇ l of the nanoparticle dispersion are injected iv into the tail vein.
  • the following anesthetics are carried out with Rompunketavet via the lungs as an inhalation anesthetic in order to minimize the circulation of the animals.
  • the animals are examined by fluorescence optics.
  • GIu (10) -b-PEG (110) -modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles after intravenous administration are capable of passive enrichment mechanisms (EPR effect) in tumor tissue.
  • Examination of the tumors ex vivo shows a clear enhancement of the fluorescence contrast in treated compared to untreated tumor tissue (compare Fig. 18 b with a and c with a).
  • Multiple, time-shifted detection of fluorescence in one and the same animal is possible after 24 h and 48 h (FIG. 17). Consequently, the particles can circulate in vivo for a sufficiently long time and accumulate accordingly in the tumor.
  • the electrostatically pegylated surface is thus stably connected to the particle surface.
  • the device used for the animal experiment was set up by the company LMTB (Berlin, Germany). As individual components were used:
  • Fig. 1 control of the particle diameter by changing the
  • FIG. 1 shows that the particle size of the PBCA
  • P (DMAEMA) nanoparticles can be controlled during production by varying the polymer concentration.
  • Fig. 3 Zeta potential Glu (10) -b-PEG (1 10) modified PBCA [PEI-IDCC] -
  • Fig. 4 SEM (Scanning Electron Microscope) image DODC-loaded
  • the figure shows an SEM image of DODC-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
  • FIG. 6 Influence of functionalized particle surfaces on the
  • Cell uptake a) Comparison of cell uptake behavior after surface modification; Row 1: unmodified particles; Row 2:
  • NP with folic acid Row 3: NP with Glu (10) -b-PEG (110); b) Section: Row 3 / Well 1 / Site 15; Arrows indicate marked fluorescence enhancement in the nucleus.
  • Fig. 7 Nanoparticle uptake in HeLa cells; Fluorescence of
  • the figure shows the cell uptake behavior of GIu (10) -b-PEG (HO) -modified PBCA P (DMAEMA) nanoparticles in HeLa cells.
  • P (DMAEMA) nanoparticles surface-modified with Glu (10) -b-PEG (HO); Abbreviations used PEG-NP: pegylated coumarin-containing
  • PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles
  • NP coumarin-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles
  • CP clathrin-coated pits
  • ES endosomes
  • LS lysosomes
  • ELS endolysosomes
  • ZK cell nucleus
  • H + H + ATPase
  • PEG-Glu free Glu (10) -b-PEG (110) block copolymer; Size relations do not correspond to reality.
  • Particle concentration of 0.21 mg / ml was incubated.
  • GIu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles were used.
  • Fig. 11 Increased particle uptake with incubation of higher particle concentration: 0.85 mg / ml; Fluorescence of the NP as grayscale image;
  • the figure shows more strongly fluorescent HeLa cells after a higher particle concentration of 0.85 mg / ml was incubated.
  • GIu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles were used for this purpose.
  • Fig. 12 SEM image of PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles
  • FIG. 13 particle diameter d hyd of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles, surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110); Shown is the particle size of the surface-modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles used for the animal experiment over a period of 7 days after preparation for the animal experiment.
  • Figure 14 Zeta potential of the untitrated (washed / unwashed) and titrated PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles;
  • the abbreviation shows the zeta potential measured surface charge of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles modified with the block copolymer Glu (10) -b-PEG (110). This was accordingly about + 3OmV beyond the neutral point titrated until reaching the dissociation equilibrium at about -3OmV.
  • Fig. 15 UV-Vis absorption spectra: a) aqueous ICG solution, b) PBCA [P (DMAEMA) -ICG] -NP unwashed; c) PBCA- [P (DMAEMA) -ICG]
  • This figure shows the UV-Vis absorption spectra of an aqueous ICG solution as well as the ICG nanoparticle dispersion (washed and unwashed).
  • Fig. 16 Emission spectrum of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles and an aqueous ICG solution;
  • the figure represents the corresponding emission spectra of the aqueous ICG solution compared to the nanoparticle dispersion.
  • Fig. 17 Detection of NIR fluorescence in vivo
  • the images show the NIR fluorescence in a time frame of 24 and 48 h after substance injection (a) ventrally 24 h, b) 24 h laterally, c) 48 h laterally, d) ventrally empty).
  • Fig. 18 NIR fluorescence contrast of the tumor tissue ex vivo 48 h after
  • the figure shows NIR fluorescence contrasts a) an untreated tumor without NIR fluorescence contrast, b) a large, treated tumor and c) a median, treated tumor ex vivo 48 h after treatment.

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Abstract

The present invention describes polymer nanoparticles having a cationic surface potential, into which both hydrophobic and hydrophilic pharmaceutically active substances can be enclosed. The hydrophilic and thus water-soluble substances are enclosed through ionic complexation with a charged polymer in the core of the particle by means of coprecipitation. It is possible to use as pharmaceutically active substances for encapsulation both therapeutic and diagnostic agents. The cationic particle surface makes stable electrostatic surface modification possible with partially oppositely charged compounds which may, to improve the passive and active targeting, comprise target-specific ligands.

Description

Funktionalisierte, feste Polymernanopartikel für diagnostische und therapeutische Anwendungen Functionalized solid polymer nanoparticles for diagnostic and therapeutic applications
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Die vorliegende Erfindung beschreibt Polymernanopartikel mit kationischem Oberflächenpotential, in welche sowohl hydrophobe als auch hydrophile pharmazeutisch aktive Substanzen eingeschlossen werden können. Die hydrophilen und somit wasserlöslichen Substanzen werden durch ionische Komplexierung mit einem geladenen Polymer in den Kern des Partikels mittels Co-Präzipitation eingeschlossen. Zur Verkapselung sind als pharmazeutisch aktive Substanzen sowohl Therapeutika als auch Diagnostika verwendbar. Die kationische Partikeloberfläche ermöglicht eine stabile, elektrostatische Oberflächenmodifikation mit partiell entgegengesetzt geladenen Verbindungen, die zur Verbesserung des passiven und aktiven Targetings zielspezifische Liganden enthalten können.The present invention describes cationic surface potential polymer nanoparticles in which both hydrophobic and hydrophilic pharmaceutically active substances can be included. The hydrophilic and thus water-soluble substances are entrapped by ionic complexation with a charged polymer in the core of the particle by co-precipitation. For encapsulation, both therapeutics and diagnostics can be used as pharmaceutically active substances. The cationic particle surface provides stable, electrostatic surface modification with partially oppositely charged compounds that may contain target-specific ligands to enhance passive and active targeting.
Hintergrund der ErfindungBackground of the invention
Die besonderen Eigenschaften nanopartikulärer Drug Delivery Systeme beruhen vor allem auf ihrer geringen Größe, wodurch eine Überwindung unterschiedlicher physiologischer Barrieren möglich ist [Fahmy T.M., Fong P.M. et al., Mater. Today, 2005; 8(8): 18-26]. Die damit verbundene veränderte Verteilung im Organismus kann z. B. für die Diagnose als auch zur Therapie verschiedener Tumorerkrankungen vorteilhaft genutzt werden.The particular properties of nanoparticulate drug delivery systems are mainly due to their small size, thereby overcoming different physiological barriers is possible [Fahmy T.M., Fong P.M. et al., Mater. Today, 2005; 8 (8): 18-26]. The associated altered distribution in the organism can, for. B. for the diagnosis as well as for the therapy of various tumor diseases can be used advantageously.
Nanopartikuläre Systeme, welche sowohl zur Erkennung als auch zur Behandlung von Erkrankungen eingesetzt werden können, werden als sogenannte Theranostika (= "Therapeutika + D\agngstika) bezeichnet. Das damit verundene therapeutische Monitoring wird zukünftig ein schnelleres Erkennen von Therapieresistenzen ermöglichen und durch rechtzeitigen Einsatz alternativer Therapien den Heilungserfolg des Patienten deutlich verbessern [Emerich D.F., Thanos CG., Curr. Nanosci., 2005; 1 : 177-188]. Eine in der Tumortherapie sehr erfolgreich eingesetzte Substanzklasse ist die Gruppe der Zytostatika. Alle sich schnell teilenden Zellen des Körpers, so auch Tumorzellen, werden durch diese Substanzen geschädigt. Dies führt allerdings nicht nur zu einem Absterben der Tumorzellen, sondern häufig sind auch andere vitale Organe und Gewebe wie das Knochenmark, Schleimhäute oder Herzgefäße davon betroffen. Die damit verbundene unerwünschte Toxizität ist häufig der Dosis limitierende Faktor der Therapie [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, development and optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299]. Es konnte gezeigt werden, dass durch das Verkapseln solcher Substanzen in nanopartikuläre Systeme gesunde Gewebe weniger stark geschädigt werden und eine lokal höhere Wirkstoffkonzentration im Tumorgewebe erzielt wird [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, development and optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271 -1299]. Die erfolgreiche Einführung des Marktproduktes Doxil® belegt den klinischen Vorteil einer solchen Nanoformulierung.Nanoparticular systems, which can be used both for the detection and treatment of diseases, are referred to as so-called theranostics (= " Therapeutics + D \ agngstika)." The associated therapeutic monitoring will enable faster detection of treatment resistance in the future and by timely use of alternative Therapies significantly improve the patient's cure [Emerich DF, Thanos CG, Curr. Nanosci., 2005; 1: 177-188]. A substance class used very successfully in tumor therapy is the group of cytostatic drugs. All rapidly dividing cells of the body, including tumor cells, are damaged by these substances. However, this not only leads to a death of the tumor cells, but often other vital organs and tissues such as the bone marrow, mucous membranes or heart vessels are affected. The associated undesirable toxicity is often the dose limiting factor of therapy [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299]. It has been shown that the encapsulation of such substances in nanoparticulate systems causes less damage to healthy tissue and a locally higher concentration of active substance in the tumor tissue [Silacci D., Neri M., Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, Volume 3, Part V, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; 1271-1299]. The successful launch of the market product Doxil ® proves the clinical advantage of such a nano-formulation.
In erster Linie wird der Enhanced Permeation and Retention-Effekt (kurz EPR- Effekt) dafür verantwortlich gemacht. Dieser EPR-Effekt wurde bereits 1986 von Matsumura und Maeda als eine Strategie zur gezielten Arzneistoffkumulation in soliden Tumoren beschrieben [Matsumura Y., Maeda H., Cancer Res., 1986; 46: 6387-6392][Maeda H., Adv. Enzyme Regul., 2001 ; 41 : 189-207]. Es handelt sich hierbei um einen passiven Anreicherungsmechanismus, welcher die strukturellen Besonderheiten von tumorösem oder auch entzündetem Gewebe ausnutzt [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56(7): 1023-1050]. Insbesondere Tumorgewebe ist aufgrund seines schnellen Wachstums und verschiedener Botenstoffe meist durch eine fenestrierte „löchrige" Gewebsstruktur sowie eine fehlende lymphatische Drainage gekennzeichnet. Je nach Tumorart wird die Größe der Fenestrierungen zwischen 380 nm und 780 nm angegeben, weshalb dieser Bereich auch als nanosize window bezeichnet wird [Hobbs S. K., Monsky W. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998; 95: 4607- 4612][Brigger I., Dubernet C. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 2002; 54(5): 631 -651]. Im Gegensatz dazu besitzen normale Gewebe wie Herz, Gehirn oder Lunge so genannte tight junctions, welche mit weniger als 10 nm (meist 2 nm bis 4 nm) Durchmesser undurchlässig für kolloidale Arzneistoffträger sind [Hughes G.A., Nanomedicine, 2005; 1 (1 ): 22-30]. Im Blutstrom zirkulierende Nanopartikel sind somit in der Lage, sich passiv durch Diffusion aus dem Blutstrom im Tumorgewebe anzureichern. Eine fehlende lymphatische Drainage begünstigt die dauerhafte Anreicherung im Tumor bzw. verhindert einen schnelles Auswaschen der Nanopartikel (EPR- Effekt).First and foremost, the enhanced permeation and retention effect (EPR effect for short) is held responsible. This EPR effect was already described by Matsumura and Maeda in 1986 as a strategy for targeted drug accumulation in solid tumors [Matsumura Y, Maeda H., Cancer Res., 1986; 46: 6387-6392] [Maeda H., Adv. Enzyme Regul., 2001; 41: 189-207]. This is a passive enrichment mechanism that exploits the structural peculiarities of tumorous or inflamed tissue [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56 (7): 1023-1050]. In particular tumor tissue is characterized by its fast growth and various messenger substances usually by a fenestrierte "holey" tissue structure as well as a lack of lymphatic drainage Depending on the type of tumor, the size of the fenestrations between 380 nm and 780 nm indicated, which is why this area is also referred to as nanosize window [Hobbs SK, Monsky WL et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998; 95: 4607-4612] [Brigger I., Dubernet C. et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 2002; 54 (5): 631-651]. In contrast, normal tissues such as heart, Brain or lung tight junctions which are less than 10 nm (usually 2 nm to 4 nm) in diameter impermeable to colloidal drug carriers [Hughes GA, Nanomedicine, 2005; 1 (1): 22-30]. Thus, circulating nanoparticles in the bloodstream are able to passively accumulate by diffusion from the bloodstream in the tumor tissue. A lack of lymphatic drainage promotes permanent accumulation in the tumor or prevents rapid washing out of the nanoparticles (EPR effect).
Damit dieser Anreicherungsmechanismus möglich ist, müssen die Nanopartikel ausreichend lange im Blutstrom zirkulieren. Voraussetzung dafür sind Partikelgrößen zwischen ca. 10 nm und 380 nm sowie geeignete Partikeloberflächen. Beispielsweise können pegylierte Partikeloberflächen verhindern, dass körpereigene Proteine die Partikel als fremd identifizieren und eine schnelle Eliminierung über die Organe des retikulo-endothelialen Systems (kurz RES) erfolgt [Otsuka H. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 2003; 55(3): 403- 419]. Durch die Nutzung aktiver Liganden auf der Partikeloberfläche (z.B. Antikörper) kann die gewebsspezifische Anreicherung nochmals optimiert werden [Nobs L. et al., . Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992] [Yokoyama M., J. Artif. Organs, 2005; 8: 77-84].For this enrichment mechanism to be possible, the nanoparticles must circulate in the blood stream for a sufficient period of time. This requires particle sizes between approx. 10 nm and 380 nm as well as suitable particle surfaces. For example, pegylated particle surfaces can prevent endogenous proteins from identifying the particles as foreign and rapid elimination via the organs of the reticulo-endothelial system (short RES) [Otsuka H. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 2003; 55 (3): 403-419]. By utilizing active ligands on the particle surface (e.g., antibodies), tissue-specific enrichment can be further optimized [Nobs L. et al. Pharm. Sci., 2004; 93: 1980-1992] [Yokoyama M., J. Artif. Organs, 2005; 8: 77-84].
Für eine Aufnahme der Wirkstoffe in die Zelle muss eine weitere physiologische Barriere, die Zellmembran, überwunden werden. Die Schwierigkeit besteht für viele Arzneistoffe u. a. darin, dass die Zelle sehr effektive Transportmechanismen (z. B. P-Glycoprotein) zum Ausschleusen fremder oder toxischer Substanzen besitzt. Wird jedoch der Wirkstoff mit Hilfe von Nanopartikeln in die Zelle über Endozytose eingeschleust, so können ausschleusende Transporter umgangen und die so genannte Multi Drug Resistance (MDR) verhindert werden [Bharadwaj V., J. Biomed. Nanotechnol., 2005; 1 : 235-258] [Huwyler J. et al., J. Drug Target., 2002; 10(1 ): 73-79].For a recording of the active ingredients in the cell, another physiological barrier, the cell membrane, must be overcome. The difficulty exists for many drugs u. a. in that the cell has very effective transport mechanisms (eg P-glycoprotein) for the removal of foreign or toxic substances. If, however, the active substance is introduced into the cell via endocytosis with the aid of nanoparticles, it is possible to circumvent ejecting transporters and to prevent multi-drug resistance (MDR) [Bharadwaj V., J. Biomed. Nanotechnol., 2005; 1: 235-258] [Huwyler J. et al., J. Drug Target., 2002; 10 (1): 73-79].
Die Internalisierung in die Zelle erfolgt bei Nanopartikeln meist mittels Endocytose. Aus diesem Grund liegen die Partikel nach dem Aufnahmeprozess in Endosomen bzw. Endolysosomen vor [Koo O.M. et al., Nanomedicine, 2005; 1 (3):193-212]. Sofern keine Freisetzung der Partikel aus den Endolysosomen stattfindet, kommt es innerhalb der Vesikel zu einem enzymatischen Abbau von Wirkstoff und kolloidalem Trägersystem. Eine endolysosomale Freisetzung der Partikel und damit des Wirkstoffes ist deshalb für den intrazellulären therapeutischen Effekt essentiell.The internalization into the cell takes place with nanoparticles mostly by means of endocytosis. For this reason, the particles are after the recording process in endosomes or endolysosomes [Koo OM et al., Nanomedicine, 2005; 1 (3): 193-212]. If there is no release of the particles from the endolysosomes, an enzymatic degradation of active ingredient and colloidal carrier system occurs within the vesicles. An endolysosomal release of the particles and therefore of the active substance is therefore essential for the intracellular therapeutic effect.
Die Freisetzungseigenschaften des Wirkstoffes aus dem Nanopartikel können zusätzlich durch gezielte Auswahl des Polymers gesteuert werden. Eine nanopartikuläre Formulierung kann somit die Applikationshäufigkeit minimieren sowie zu einer Reduktion der therapeutisch notwendigen Dosis führen. Weiterhin können unerwünschte Plasmaspiegelspitzen durch Verkapselung in Nanopartikel vermieden und eine verzögerte Freisetzung erzielt werden.The release properties of the active substance from the nanoparticle can additionally be controlled by targeted selection of the polymer. A nanoparticulate formulation can thus minimize the frequency of application and lead to a reduction of the therapeutically necessary dose. Furthermore, unwanted plasma peak levels can be avoided by encapsulation in nanoparticles and a delayed release can be achieved.
Zusammengefasst sind folgende Vorteile sind für die Entwicklung von Polymernanopartikeln ausschlaggebend: (i) gezielte Anreicherung der Wirkstoffe (a) passiv mittels EPR-Effekt, (b) aktiv mittels gewebs- oder zellspezifischer Liganden, z. B. Antikörper, (ii) steuerbare Wirkstoff-Freisetzung durch gezielte Polymerauswahl, (iii) Vermeidung starker Schwankungen der Plasmaspiegel, (iv) Senkung der Dosis bzw. Steigerung der Effektivität bei gleicher Dosis, (v) geringere Nebenwirkungen bei erhöhtem Sicherheitsprofil, (vi) verringerte Applikationshäufigkeit mit verbesserter Compliance und (vii) Umgehung von Resistenzmechanismen (P-Gycoprotein) [Rosen H., Abribat T., Nature Reviews Drug Discovery, 2005 May; 4(5): 381 -5][McLennan D.N., Porter C. J. H. et al., Drug Discovery Today: Technologies, 2005 Spring; 2(1): 89-96]. Ein nanopartikuläres System, welches die Gesamtheit der beschriebenen Vorteile bereits erfüllt, ist nach dem aktuellen Wissensstand noch nicht entwickelt worden. Auch die Vielfalt der in der Literatur beschriebenen nanopartikulären Trägersysteme macht deutlich, dass es zum jetzigen Zeitpunkt nicht eine optimale Nanoformulierung für alle Problemstellungen gibt. Neben der Größe sind der gesamte Aufbau der Partikel, die matrixbildenden Substanzen und vor allem ihre Oberfläche für das Verhalten in vivo von entscheidender Bedeutung [Choi S.W., Kim W. S., Kim J. H., Journal of Dispersion Science and Technology, 2003; 24(3&4): 475-487]. Hinzu kommt, dass die physikochemischen Eigenschaften verschiedener Wirkstoffe sich stark unterscheiden. Es besteht demzufolge nach wie vor ein Bedarf in der Entwicklung kolloidaler Arzneistoffträgersysteme mit verbesserten Eigenschaften.In summary, the following advantages are decisive for the development of polymer nanoparticles: (i) targeted accumulation of the active ingredients (a) passively by means of EPR effect, (b) active by means of tissue- or cell-specific ligands, eg. (Iv) Controlled drug release by targeted polymer selection, (iii) avoidance of large fluctuations in plasma levels, (iv) dose reduction or increase in effectiveness at the same dose, (v) lower side effects with increased safety profile, (vi ) reduced frequency of application with improved compliance and (vii) avoidance of resistance mechanisms (P-mycoprotein) [Rosen H., Abribat T., Nature Reviews Drug Discovery, 2005 May; 4 (5): 381-5] [McLennan DN, Porter CJH et al., Drug Discovery Today: Technologies, 2005 Spring; 2 (1): 89-96]. A nanoparticulate system, which already fulfills all the described advantages, has not yet been developed according to the current state of knowledge. The variety of nanoparticulate carrier systems described in the literature also makes it clear that there is currently no optimal nano-formulation for all problems. In addition to size, the overall structure of the particles, matrix-forming substances, and especially their surface, are of crucial importance for in vivo behavior [Choi SW, Kim WS, Kim JH, Journal of Dispersion Science and Technology, 2003; 24 (3 & 4): 475-487]. In addition, the physicochemical properties of various drugs differ greatly. Accordingly, there remains a need in the development of colloidal drug carrier systems with improved properties.
Für zukünftige therapeutische Ansätze wird es beispielsweise notwendig sein, durch einen diagnostischen Nachweis der Verteilung der Partikel im Organismus zu belegen, dass eine Anreicherung vor allem im erkrankten Gewebe (z. B. im Tumor) stattfindet. Für eine Detektion in vivo stehen unter anderem optische Bildgebungsverfahren wie die Sonographie, die Röntgendiagnostik, Schnittbildverfahren (CT, MRT) und die Nuklearmedizin (PET, SPECT) zur Verfügung. Eine weitere und relativ neue Methode ist Optical Imaging, dessen Detektionsprinzip auf der Nutzung von Nahinfrarot-Fluoreszenz beruht. Es handelt sich um ein nicht-invasives Verfahren, welches ohne ionisierende Strahlung arbeitet und im Vergleich zu Verfahren wie dem MRT sehr kostengünstig und wenig aufwendig ist. Die für eine solche Anwendung entwickelten N I R- Farbstoffe wie Indocyaningrün sind sehr gut wasserlöslich, weshalb es schwierig ist, diese effizient in eine hydrophobe Polymermatrix zu verkapseln. Grund ist der schnelle Wechsel der hydrophilen Substanz in die wässrige Phase beispielsweise bei der Herstellung mittels Nanopräzipitation.For future therapeutic approaches, for example, it will be necessary to demonstrate by means of diagnostic proof of the distribution of the particles in the organism that accumulation takes place above all in the diseased tissue (eg in the tumor). Optical imaging techniques such as sonography, X-ray diagnostics, cross-sectional imaging (CT, MRI) and nuclear medicine (PET, SPECT) are available for in vivo detection. Another and relatively new method is optical imaging, whose detection principle is based on the use of near-infrared fluorescence. It is a non-invasive procedure that works without ionizing radiation and is very inexpensive and inexpensive compared to methods such as MRI. The N I R dyes such as indocyanine green developed for such an application are very soluble in water, and therefore it is difficult to efficiently encapsulate them in a hydrophobic polymer matrix. The reason for this is the rapid change of the hydrophilic substance into the aqueous phase, for example during production by means of nanoprecipitation.
Für die Verkapselung hydrophiler Substanzen in Nanopartikel stehen nur wenige Technologien zur Verfügung, die unterschiedliche Nachteile aufweisen. Der amphiphile Charakter von Liposomen oder Polymerosomen ermöglicht beispielsweise den Einschluss hydrophiler Substanzen in den wässrigen Innenraum der Partikel, wohingegen hydrophobe Verbindungen in der Membran eingelagert werden können. Aufgrund der Lokalisierung im Kern oder in der Hülle der Partikel ist die Beladung sehr limitiert und damit meist unzureichend. Nachteilig ist weiterhin, dass vor allem hydrophile Substanzen in wässriger Umgebung schnell aus solchen Systemen ausgewaschen werden.For the encapsulation of hydrophilic substances in nanoparticles, only a few technologies are available that have different disadvantages. The amphiphilic nature of liposomes or polymerosomes, for example, allows the inclusion of hydrophilic substances in the aqueous interior of the particles, whereas hydrophobic compounds can be incorporated in the membrane. Due to the localization in the core or in the shell of the particles, the loading is very limited and thus usually insufficient. A further disadvantage is that, above all, hydrophilic substances in an aqueous environment are rapidly washed out of such systems.
Eine alternative Verkapselung wasserlöslicher Substanzen in Polyelektrolytkomplexe ist nur begrenzt möglich, da Farbstoffe wie beispielsweise Indocyaningrün (ICG) kleine Moleküle mit nur wenigen geladenen Gruppen sind, womit nur unzureichend Ladungen für eine elektrostatische Komplexierung zur Verfügung stehen. Hinzu kommt, dass Polyelektrolytkomplexe in wässriger Lösung sehr dynamische Systeme sind, wodurch diese meist eine unzureichende kolloidale Stabilität in Plasma aufweisen [Thünemann A.F. et al., Adv. Polym. Sei., 2004; 166: 113-171].An alternative encapsulation of water-soluble substances in Polyelektrolytkomplexe is limited, since dyes such as indocyanine green (ICG) small molecules with only a few are charged groups, so that insufficient charges are available for electrostatic complexation. In addition, polyelectrolyte complexes in aqueous solution are very dynamic systems, as a result of which they usually have inadequate colloidal stability in plasma [Thünemann AF et al., Adv. Polym. Sei., 2004; 166: 113-171].
Wie zuvor beschrieben wird es zukünftig erforderlich sein, mittels einem diagnostischen Nanopartikel zu belegen, dass die Anreicherung der Partikel vor allem am Zielort, beispielsweise dem Tumor, stattfindet. Wird dieser Nachweis erbracht, so kann eine therapeutisch aktive Substanz in ein-und dasselbe System verkapselt werden und einen maximalen therapeutischen Effekt am Wirkort erzielen, da ja die erwünschte Verteilung der Nanopartikel bereits mittels des diagnostischen Systems nachgewiesen wurde. Um die Verteilungseigenschaften der Partikel nicht zu verändern ist es deshalb wichtig, für den diagnostischen Nachweis und die anschließende Behandlung ein und dasselbe nanopartikuläre System nutzen zu können. Wie zuvor beschrieben, gibt es eine Reihe unterschiedlicher nanopartikulärer Systeme, welche allerdings entweder für die Verkapselung hydrophiler oder hydrophober Substanzen geeignet sind. Aus der Literatur ist bekannt, dass nur geringe Veränderungen der Nanopartikeleigenschaften wie Partikelgröße, Oberflächenmaterial, Art des Matrixpolymers oder auch die Verwendung eines anderen Tensids einen enormen Einfluss auf die Verteilung der Partikel im Organismus haben. Deshalb ist es wichtig, sowohl Diagnose, Therapie als auch ein mögliches Monitoring der Behandlung mit ein-und demselben System durchführen zu können.As described above, it will be necessary in the future to prove by means of a diagnostic nanoparticle that the accumulation of the particles takes place above all at the target site, for example the tumor. If this proof is provided, then a therapeutically active substance can be encapsulated in one and the same system and achieve a maximum therapeutic effect at the site of action, since the desired distribution of the nanoparticles has already been detected by means of the diagnostic system. In order not to alter the distribution properties of the particles, it is therefore important to be able to use the same nanoparticulate system for the diagnostic detection and the subsequent treatment. As described above, there are a number of different nanoparticulate systems which, however, are either suitable for the encapsulation of hydrophilic or hydrophobic substances. It is known from the literature that only small changes in the nanoparticle properties such as particle size, surface material, type of matrix polymer or the use of another surfactant have a tremendous influence on the distribution of the particles in the organism. Therefore, it is important to be able to perform both diagnosis, therapy and possible monitoring of treatment with one and the same system.
Idealerweise sollten deshalb in ein- und demselben nanopartikulären System sowohl wasserlösliche Farbstoffe zur Diagnose als auch therapeutische Substanzen, welche meist aufgund ihrer hydrophoben Eigenschaften schwer wasserlöslich sind, effektiv und mit einer ausreichenden Stabilität gegen Auswaschen verkapselt werden können.Ideally, therefore, in the same nanoparticulate system, both water-soluble dyes for diagnosis and therapeutic substances, which are usually poorly water-soluble due to their hydrophobic properties, should be able to be encapsulated effectively and with sufficient stability to wash out.
Eine technologische Herausforderung besteht weiterhin darin, durch die Verwendung geeigneter Oberflächen einerseits eine ausreichende Partikelstabilität und andererseits eine spezifische Anreicherung im Zielgewebe zu gewährleisten. Der Verbleib am Ort der Anreicherung (Zielgewebe) wiederum ist u. a. davon abhängig, wie gut die Partikel in das Gewebe und die Zelle aufgenommen werden.A technological challenge remains, on the one hand, through the use of suitable surfaces on the one hand a sufficient Particle stability and on the other hand to ensure a specific accumulation in the target tissue. The whereabouts at the site of the enrichment (target tissue), in turn, depends, among other things, on how well the particles are absorbed into the tissue and the cell.
Aus der Literatur ist bekannt, dass kationische Partikeloberflächen eine Aufnahme in die Zelle begünstigen [Mounkes L.C. et al., J. Biol. Chem., 1998; 273(40): 26164-26170] [Mislick K.A., Baldeschwieler J. D., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996; 93: 12349-12354]. Grund sind elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der negativ geladenen Zellmembran (sulfatierte Proteoglykane) und der kationischen Partikeloberfläche (meist protonierte Aminfunktionen). Hinzu kommt, dass Aminogruppen tragende Polymere oder Substanzen dafür bekannt sind, endoosmoyltische Aktivität zu besitzen, d.h. sie fördern eine intrazelluläre Freisetzung der Partikel aus den Endolysosomen durch Schädigung der Endolysosomenmembran [DeDuve C. et al., Biochem. Pharmacol., 1974; 23:2495-2531 ]. Verbleiben die Partikel innerhalb der Zelle in den Endolysosomen, findet ein Abbau der Partikelmatrix sowie der darin eingeschlossenen Substanzen über zelleigene Enzyme statt. Die endolysosomale Freisetzung der verkapselten Wirkstoffe ist deshalb essentiell für den therapeutischen Effekt.It is known from the literature that cationic particle surfaces favor uptake into the cell [Mounkes L.C. et al., J. Biol. Chem., 1998; 273 (40): 26164-26170] [Mislick K.A., Baldeschwieler J.D., Proc. Natl. Acad. Be. USA, 1996; 93: 12349-12354]. The reason is electrostatic interactions between the negatively charged cell membrane (sulfated proteoglycans) and the cationic particle surface (usually protonated amine functions). In addition, amino-bearing polymers or substances are known to possess endo-osmotic activity, i. they promote intracellular release of the particles from the endolysosomes by damaging the endolysosome membrane [DeDuve C. et al., Biochem. Pharmacol., 1974; 23: 2495-2531]. If the particles remain within the cell in the endolysosomes, a degradation of the particle matrix and the substances contained therein takes place via cell-specific enzymes. The endolysosomal release of the encapsulated drugs is therefore essential for the therapeutic effect.
Problematisch ist jedoch, dass teilweise schwerwiegende toxikologische Effekte bei in vivo Untersuchungen von Polyplexen und Lipiden mit stark kationischen geladenen Oberflächen beschrieben worden sind [Kircheis S. et al., J. Gene Med., 1999; 1 : 1 1 1-120][Ogris M. et al., Gene Ther., 1999;6: 595-605]. Die Ursache liegt darin, dass kationische Partikel mit negativ geladenen Erythrozyten aggregieren und es dadurch zu einer Blockade der Blutgefäße kommt. Zusätzlich führt dies meist zu einer starken Akkumulation in der Lunge, welche die Partikel als erstes Kapillarbett nach i.v. Applikation passieren [Kircheis R. et al., Drug Deliv. Rev., 2001 ; 53(3): 341 -58]. Hier besteht die Gefahr einer Lungenembolie, begünstigt durch Agglomerate aus Partikeln und Erythrozyten oder anderen Blutkomponenten [Kircheis S. et al., J. Gene Med., 1999; 1 : 1 1 1-120][Ogris M. et al., Gene Ther., 1999;6: 595-605]. Idealerweise sollten deshalb nanopartikuläre Systeme mit kationischen Oberflächeneigenschaften hergestellt werden, ohne dass mögliche toxikologisch bedenkliche Eigenschaften eine in-vivo Anwendung behindern. Zusätzlich muss die Partikeloberfläche gegenüber körpereigenen Abwehrmechanismen (Opsonine, RES) unauffällig sein, wodurch erst eine ausreichend lange Zirkulationszeit ermöglicht wird, welche Voraussetzung für eine entsprechende Anreicherung der Partikel aus dem Blutstrom im Zielgewebe ist. Dabei sollten die nanopartikulären Systeme weiterhin die Aufnahme in die Zielzelle und die endolysosomale Freisetzung unterstützen.The problem, however, is that partially serious toxicological effects have been described in in vivo studies of polyplexes and lipids with highly cationic charged surfaces [Kircheis S. et al., J. Gene Med., 1999; 1: 1 1 1-120] [Ogris M. et al., Gene Ther., 1999; 6: 595-605]. The reason is that cationic particles aggregate with negatively charged erythrocytes resulting in blockage of the blood vessels. In addition, this usually leads to a strong accumulation in the lungs, which pass the particles as the first capillary bed after iv administration [Kircheis R. et al., Drug Deliv. Rev., 2001; 53 (3): 341-58]. Here there is a risk of pulmonary embolism, favored by agglomerates of particles and erythrocytes or other blood components [Kircheis S. et al., J. Gene Med., 1999; 1: 1 1 1-120] [Ogris M. et al., Gene Ther., 1999; 6: 595-605]. Ideally, therefore, nanoparticulate systems with cationic surface properties should be prepared without the potential toxicologically harmful properties hindering an in vivo application. In addition, the particle surface must be inconspicuous to the body's own defense mechanisms (Opsonine, RES), allowing only a sufficiently long circulation time, which is a prerequisite for a corresponding accumulation of particles from the blood stream in the target tissue. The nanoparticulate systems should continue to support uptake into the target cell and endolysosomal release.
Eine weitere Schwierigkeit bei der Herstellung nanopartikulärer Systeme besteht darin, geeignete Substanzen oder Zielstrukturen auf der Partikeloberfläche aufzubringen.Another difficulty in the production of nanoparticulate systems is to apply suitable substances or target structures to the particle surface.
Häufig wird die Oberfläche der Partikel mit Hilfe von kovalenten Kopplungsreaktionen modifiziert. Voraussetzung dafür sind funktionelle Gruppen am Polymerrückgrat bzw. an der Partikeloberfläche, welche durch entsprechende chemische Kopplungsreaktionen mit dem Zielmolekül irreversibel verknüpft werden können [Nobs L. et al., J. Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992]. Da die Stabilität kolloidaler Dispersionen durch die Reagenzien bzw. unter den Reaktionsbedingungen häufig stark verringert wird, ist die chemische Durchführung meist aufwendig und problematisch [Koo O.M. et al., Nanomedicine, 2005; 1 (3):193-212][Choi S.W. et al., J. Dispersion Sei. Technol., 2003; 24(3&4): 475-487]. Die kovalente Verknüpfung von Molekülen und Partikeloberflächen muss zusätzlich für jedes neue, auf die Oberfläche aufzubringende, Molekül speziell geeignet sein, um mögliche nicht gewollte chemische Reaktionen zu vermeiden. Auch eine Vermeidung von organischen Lösemitteln, häufig genutzt für kovalente Verknüpfungen, ist wegen der verringerten Belastung der Umwelt und der Vereinfachung der Durchführung der Reaktion anzustreben. Idealerweise sollte deshalb eine nicht-kovalente, einfach durchzuführende und somit flexible und dennoch stabile Oberflächenmodifikation möglich sein. Die aus der Literatur bekannten kolloidalen Systeme eignen sich meist nur zur Verkapselung hydrophober Substanzen oder aber hydrophiler Substanzen. Im Falle der häufig angewendeten kovalenten Oberflächenmodifikation der Partikel besteht wenig Flexibilität bezüglich der Nutzung unterschiedlichster Oberflächenstrukturen auf ein-und demselben Kernpartikel. Hinzu kommt, dass sich die Liganden zur spezifischen Anreicherung oft nachteilig auf die Aufnahme im eigentlichen Tumorgewebe und insbesondere auf die Zellaufnahme auswirken. Sofern die Partikel eine ausreichende Zirkulation gewährleisten und sich passiv oder aktiv gut im Zielgewebe anreichern, so ist meist die Internalisierung und die endolysosomale Freisetzung nicht optimal [van Osdol W., Cancer Res., 1991 ; 51 : 4776-4784] [Weinstein J. N. et al., Cancer Res., 1992; 52(9): 2747-2751 ].Frequently, the surface of the particles is modified by means of covalent coupling reactions. Prerequisite for this are functional groups on the polymer backbone or on the particle surface, which can be irreversibly linked by appropriate chemical coupling reactions with the target molecule [Nobs L. et al., J. Pharm. Sei., 2004; 93: 1980-1992]. Since the stability of colloidal dispersions is often greatly reduced by the reagents or under the reaction conditions, the chemical implementation is usually complicated and problematic [Koo OM et al., Nanomedicine, 2005; 1 (3): 193-212] [Choi SW et al., J. Dispersion Sei. Technol., 2003; 24 (3 & 4): 475-487]. In addition, the covalent attachment of molecules and particle surfaces must be particularly suitable for any new molecule to be applied to the surface in order to avoid possible unwanted chemical reactions. Avoiding organic solvents, often used for covalent linkages, is also desirable because of the reduced burden on the environment and the simplification of the implementation of the reaction. Ideally, therefore, a non-covalent, easy-to-perform, and thus flexible, yet stable surface modification should be possible. The known from the literature colloidal systems are usually only suitable for encapsulation of hydrophobic substances or hydrophilic substances. In the case of the frequently used covalent surface modification of the particles, there is little flexibility with regard to the use of a wide variety of surface structures on one and the same core particle. In addition, the ligands for specific enrichment often adversely affect the uptake in the actual tumor tissue and in particular on the cell uptake. Insofar as the particles ensure adequate circulation and passively or actively accumulate well in the target tissue, internalization and endolysosomal release are usually not optimal [van Osdol W., Cancer Res., 1991; 51: 4776-4784] [Weinstein JN et al., Cancer Res., 1992; 52 (9): 2747-2751].
Folglich besteht auch weiterhin ein Bedarf an pharmazeutischen, nanopartikulären Formulierungen, welche: (i) sowohl wasserlösliche als auch schwer wasserlösliche pharmazeutisch aktive Substanzen, effektiv und mit einer ausreichenden Stabilität gegen Auswaschen verkapseln (ii) eine nicht- kovalente, einfach durchzuführende (flexible) und dennoch stabile Oberflächenmodifikation ermöglichen, (iii) eine ausreichende Zirkulationszeit ermöglichen (iv), effektiv in das Zielgewebe aufgenommen werden sowie (v) dort intrazellulär aus den Endolysosomen freigesetzt werden.Thus, there continues to be a need for pharmaceutical, nanoparticulate formulations which: (i) encapsulate both water-soluble and sparingly water-soluble pharmaceutically active substances, effectively and with sufficient stability to wash out (ii) a non-covalent, easily performed (flexible) and (iii) allow sufficient circulating time (iv), be effectively absorbed into the target tissue, and (v) be released intracellularly from the endolysosomes.
Eine Aufgabe der Erfindung war es deshalb, eine verbesserte pharmazeutische Formulierung zur Verfügung zu stellen, in welche zum einen hydrophile als auch hydrophobe Wirkstoffe verkapselt werden können. Andererseits sollte eine flexible und ausreichend stabile Oberflächenmodifikation eine optimale Anreicherung im erkrankten Gewebe ermöglichen. Um einen maximalen diagnostischen oder therapeutischen Effekt erzielen zu können, muss ein solches kolloidales System auch effizient in das Zielgewebe sowie in die einzelnen Zellen aufgenommen werden, wo eine endolysosomale Freisetzung erfolgen kann. Ebenso sollte es sich um praktikable Herstellungsmethoden handeln, um die Herstellung in einem zeit- und kostengerechten Rahmen zu ermöglichen. Beschreibung der ErfindungAn object of the invention was therefore to provide an improved pharmaceutical formulation in which on the one hand hydrophilic as well as hydrophobic drugs can be encapsulated. On the other hand, a flexible and sufficiently stable surface modification should allow optimal accumulation in the diseased tissue. To achieve maximum diagnostic or therapeutic effect, such a colloidal system must also be efficiently incorporated into the target tissue as well as into the individual cells where endolysosomal release can occur. Likewise, they should be practicable manufacturing methods to enable production in a timely and cost-effective manner. Description of the invention
Die Erfindung betrifft Polymernanopartikel mit einem kationischen Oberflächenpotential, enthaltend ein kationisches Polymer und ein in Wasser schwer lösliches Polymer, dadurch gekennzeichnet, dass diese Polymernanopartikel diagnostische und/oder therapeutische Agenzien enthalten.The invention relates to polymer nanoparticles having a cationic surface potential containing a cationic polymer and a polymer which is sparingly soluble in water, characterized in that said polymer nanoparticles contain diagnostic and / or therapeutic agents.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass durch Co-Präzipitation eines wasserlöslichen kationischen Polymers mit einem schwer wasserlöslichen Polymer stabile Polymernanopartikel hergestellt werden können, welche eine kationisch funktionalisierte Oberfläche aufweisen. Weiterhin war im Sinne der Erfindung überraschend, dass sowohl hydrophile, gut wasserlösliche als auch hydrophobe, schwer wasserlösliche Substanzen in die Polymermatrix der zuvor beschriebenen Nanopartikel verkapselt werden konnten. Unerwarteterweise führte die ionische Komplexierung von wasserlöslichen Substanzen geringen Molekulargewichtes mit dem geladenen kationischen Polymer zu einer erfolgreichen Verkapselung in die Polymermatrix der Partikel mittels Nanopräzipitation. Im Sinne der Erfindung können Substanzen in die Polymerpartikel verkapselt werden, welche sich zur Diagnose und/ oder zur Therapie von verschiedenen Erkrankungen eignen. Weiterhin wurde gefunden, dass die kationisch funktionalisierte Partikeloberfläche elektrostatisch mit einer partiell entgegengesetzt geladenen Verbindung stabil und flexibel oberfächenmodifiziert werden kann. Die beschriebene Erfindung eignet sich damit zum Erkennen von Krankheiten (Diagnose), zur Behandlung von Krankheiten (Therapie) wie auch zum Monitoring einer Therapie. Weiterhin beinhaltet die Erfindung eine geeignete Arzneiform unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffen, die für die jeweilige Arzneiform notwendig sind. Die im Sinne der Erfindung entwickelte Arzneiform kann an Mensch oder Tier über verschiedene Applikationswege angewendet werden. Dazu notwendige Apllikationssysteme sind ebenso Teil der hier beschriebenen Erfindung. Die Zusammensetzung der Nanopartikel beinhaltet ein schwer wasserlösliches Polymer, wobei es sich bevorzugt um ein bioabbaubares Polymer oder auch eine Mischung verschiedener bioabbaubarer Polymere handelt. Das bioabbaubare Polymer kann über einzelne Monomereinheiten beschrieben werden, welche mittels einer Polymerisation oder anderer Prozesse besagtes Polymer formen. Weiterhin kann das Polymer über seinen Namen definiert sein.Surprisingly, it has been found that by co-precipitation of a water-soluble cationic polymer with a sparingly water-soluble polymer stable polymer nanoparticles can be prepared, which have a cationically functionalized surface. Furthermore, it was surprising in the context of the invention that both hydrophilic, readily water-soluble and hydrophobic, poorly water-soluble substances could be encapsulated in the polymer matrix of the nanoparticles described above. Unexpectedly, ionic complexation of low molecular weight water-soluble substances with the charged cationic polymer resulted in successful encapsulation in the polymer matrix of the particles by nanoprecipitation. For the purposes of the invention, substances can be encapsulated in the polymer particles which are suitable for the diagnosis and / or the therapy of various diseases. Furthermore, it has been found that the cationically functionalized particle surface can be electrostatically stably and flexibly surface-modified with a partially oppositely charged compound. The described invention is therefore suitable for detecting diseases (diagnosis), for the treatment of diseases (therapy) as well as for monitoring a therapy. Furthermore, the invention includes a suitable drug form using pharmaceutically acceptable excipients, which are necessary for the respective dosage form. The drug form developed in the context of the invention can be applied to humans or animals via various routes of administration. Necessary application systems are also part of the invention described herein. The composition of the nanoparticles includes a poorly water-soluble polymer, which is preferably a biodegradable polymer or else a mixture of various biodegradable polymers. The biodegradable polymer can be described via individual monomer units which form said polymer by means of polymerization or other processes. Furthermore, the polymer can be defined by its name.
In einer Ausführung leitet sich das schwer wasserlösliche Polymer aus der Gruppe der natürlichen und/oder synthetischen Polymere bzw. aus Homo- und Co-Polymeren entsprechender Monomere ab. Insbesondere leitet sich das Polymer aus der Gruppe Alkylcyanoacrylate wie beispielsweise der Butylcyanoacrylate und der Isobutylcyanoacrylate, der Acrylate, wie der Methacrylate, der Lactide, beispielsweise der L-Lactide oder DL-Lactide, der Glycolide, der Caprolactone wie der ε-Caprolactone und anderer ab.In one embodiment, the poorly water-soluble polymer is derived from the group of natural and / or synthetic polymers or from homo- and co-polymers of corresponding monomers. In particular, the polymer is derived from the group of alkyl cyanoacrylates such as, for example, butyl cyanoacrylates and isobutyl cyanoacrylates, acrylates such as methacrylates, lactides, for example L-lactides or DL-lactides, glycolides, caprolactones such as ε-caprolactones and others ,
In einer weiteren Ausführung ist besagtes Polymer oder Teil des Polymers ausgewählt aus der Gruppe Polycyanoacrylate und Polyalkylcyanoacrylate (PACA) wie beispielsweise Polybutylcyanoacrylat (PBCA), Polyester wie beispielsweise Poly(DL-Lactide), Poly(L-Lactide), Polyglycolide, Polydioxanone, Polyoxazoline, Poly(Glycolide-co-Trimethylene-Carbonate), Polylactid-co- Glycolide (PLGA) wie beispielsweise Poly(L-Lactide-co-Glycolide) or PoIy(DL- Lactide-co-Glycolide), Poly(L-lactide-co-DL-Lactide), Poly(Glycolide-co- Trimethylen), Poly(Carbonate-co-Dioxanone), Alginsäure, Hyaluronsäure, Polysialinsäure, saure Cellulose-Derivate, saure Stärke- Derivate, Polysaccharide wie beispielsweise Dextrane, Alginate, Cyclodextrine, Hyaluronsäure, Chitosane, saure Polyaminosäuren, polymere Proteine wie beispielsweise Collagen, Gelatine oder Albumin, Polyamide wie beispielsweise Poly(Asparaginsäure), Poly(Glutaminsäure), Polylysine, Poly(lminocarbonate) (Poly(carbonate) abgeleitet von Tyrosin, Poly(ß-Hydroxybutyrat), Polyanhydride wie beispielsweise Polysebacidsäure (PoIy(SA)), Poly(adipinsäure), PoIy(CPP- SA), PoIy(CPH), PoIyCPM) aromatische Polyanhydride, Polyorthoester, Polycaprolactone wie beispielsweise Poly-ε- oder γ-Caprolactone, Polyphosphorsäure wie Polyphosphate, Polyphosphonate, Polyphosphazene, Poly(amide-enamines), Azopolymers, Polyurethane, Polyorthoester, Dendrimere, Pseudopolymaminosäuren wie auch sämtliche Mischungen und Co-Polymere derselben Verbindungen.In a further embodiment, said polymer or part of the polymer is selected from the group of polycyanoacrylates and polyalkylcyanoacrylates (PACA) such as polybutylcyanoacrylate (PBCA), polyesters such as poly (DL-lactides), poly (L-lactides), polyglycolides, polydioxanones, polyoxazolines , Poly (glycolide-co-trimethylene-carbonate), polylactide-co-glycolide (PLGA) such as poly (L-lactide-co-glycolide) or poly (DL-lactide-co-glycolide), poly (L-lactide) co-DL-lactides), poly (glycolide-co-trimethylene), poly (carbonates-co-dioxanones), alginic acid, hyaluronic acid, polysialic acid, acidic cellulose derivatives, acidic starch derivatives, polysaccharides such as dextrans, alginates, cyclodextrins, Hyaluronic acid, chitosans, acidic polyamino acids, polymeric proteins such as collagen, gelatin or albumin, polyamides such as poly (aspartic acid), poly (glutamic acid), polylysines, poly (lminocarbonates) (poly (carbonates) derived from tyrosine, P poly (β-hydroxybutyrate), polyanhydrides such as, for example, polysebacic acid (poly (SA)), poly (adipic acid), poly (CPP-SA), poly (CPH), poly (CPM) aromatic polyanhydrides, polyorthoesters, polycaprolactones such as poly-ε- or γ-caprolactones, polyphosphoric acid such as polyphosphates, polyphosphonates, polyphosphazenes, Poly (amide-enamines), azopolymers, polyurethanes, polyorthoesters, dendrimers, Pseudopolymaminosäuren as well as all mixtures and co-polymers of the same compounds.
In einer bevorzugten Ausführung ist das schwer wasserlösliche Polymer aus der Gruppe der Polyalkylcyanoacrylate (PACA).In a preferred embodiment, the poorly water-soluble polymer is selected from the group of polyalkyl cyanoacrylates (PACA).
Den Aufbau dieser Polyalkylcyanoacrylate zeigt die angegebene Struktur (Formel 1 ), wobei es sich bei dem angegebenen Rest R bevorzugt um lineare und verzweigte Alkylgruppen mir 1 bis 16 Kohlenstoffatomen, eine Cyclohexyl-, Benzyl- oder eine Phenylgruppe handelt.The structure of these polyalkylcyanoacrylates shows the structure indicated (formula 1), wherein the radical R given is preferably linear and branched alkyl groups having 1 to 16 carbon atoms, a cyclohexyl, benzyl or a phenyl group.
Formel 1 : Strukturformel PACA1 n= 5 - 20000, bevorzugt n=5-6000, bzw. n=5- 100Formula 1: Structural formula PACA 1 n = 5 - 20000, preferably n = 5-6000, or n = 5- 100
In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist das schwer wasserlösliche Polymer ein Polybutylcyanoacrylat (PBCA) (Formel 2).In a further preferred embodiment, the poorly water-soluble polymer is a polybutyl cyanoacrylate (PBCA) (Formula 2).
Formel 2: Strukturformel PBCA; n= 5 - 20000 bevorzugt n=5-6000, bzw. n=5- 100Formula 2: Structural Formula PBCA; n = 5-20000, preferably n = 5-6000, or n = 5-100
Das schwer wasserlösliche Polymer bildet im Sinne der Erfindung den größeren Anteil der Polymermatrix der Partikel.For the purposes of the invention, the poorly water-soluble polymer forms the larger proportion of the polymer matrix of the particles.
Überraschenderweise konnte gefunden werden, dass durch den Einbau von Verbindungen mit Aminogruppen, inbesondere einem kationischen Polymer, in eine schwer wasserlösliche, feste Polymermatrix Nanopartikel mit einem kationisch geladenen Oberflächenpotential (Zetapotential) erzeugt werden.Surprisingly, it was found that by the incorporation of compounds with amino groups, in particular a cationic polymer, in a poorly water-soluble, solid polymer matrix nanoparticles with a cationically charged surface potential (zeta potential) are generated.
In einer Ausführung leitet sich das kationische Polymer aus der Gruppe der natürlichen und/oder synthetischen Polymere bzw. aus Homo- und Co-In one embodiment, the cationic polymer is derived from the group of natural and / or synthetic polymers or from homo- and co-polymers.
Polymeren entsprechender Monomere ab.Polymers of corresponding monomers.
Als kationische Polymere eignen sich im Sinne dieser Erfindung Polymere mit freien primären, sekundären oder tertiären Aminogruppen, die mit beliebigen niedermolekularen Säuren Salze bilden können, wobei die Salze in wässrig- organischen Lösungsmitteln löslich sind. Auch eignen sich Polymere oder derenSuitable cationic polymers in the context of this invention are polymers having free primary, secondary or tertiary amino groups which can form salts with any low molecular weight acid, the salts being soluble in aqueous-organic solvents. Also suitable are polymers or their
Salze, die quartäre Ammoniumgruppen tragen und in organischenSalts carrying quaternary ammonium groups and in organic
Lösungsmitteln löslich sind.Solvents are soluble.
In einer bevorzugten Ausführung sind folgende Gruppen kationischer Polymere, Polykationen und Polyaminverbindungen bzw. Polymere aus Homo- und Co- Polymeren entsprechender Monomere besonders geeignet: Modifizierte natürliche kationische Polymere, kationische Proteine, synthetische kationische Polymere, Aminoalkane unterschiedlicher Kettenlänge, modifizierte kationische Dextrane, kationische Polysaccharide, kationische Stärke- oder Cellulosederivate, Chitosane, Guarderivate, kationische Cyanoacrylate, Methacrylate und Methacrylamide und solche Monomere und Comonomere die zur Bildung entsprechender geeigneter Verbindungen genutzt werden können und die entsprechenden Salze, welche sich mit geeigneten anorganischen oder niedermolekularen organischen Säuen bilden können. Dazu zählen insbesondere: Diethylaminoethylmodifizierte Dextrane, Hydroxymethylcellulosetrimethylamin, Polylysin, Protaminsulfat,In a preferred embodiment, the following groups of cationic polymers, polycations and polyamine compounds or polymers of homopolymers and copolymers of corresponding monomers are particularly suitable: modified natural cationic polymers, cationic proteins, synthetic cationic polymers, aminoalkanes of different chain lengths, modified cationic dextrans, cationic polysaccharides , cationic starch or cellulose derivatives, chitosans, guar derivatives, cationic cyanoacrylates, methacrylates and methacrylamides and those monomers and comonomers which can be used to form suitable compounds and the corresponding salts which can form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids. These include in particular: diethylaminoethyl-modified dextrans, hydroxymethylcellulosetrimethylamine, polylysine, protamine sulfate,
Hydroxyethylcellulosetrimethylamin, Polyallylaminen, Protaminchlorid, Polyallylaminhydrosalze, Polyamine, Polyvinylbenzyltrimethylammoniumsalze, Polydiallyldimethylammoniumsalze, Polyimidazolin, Polyvinylamin und Polyvinylpyridin, Polyethylenimin (PEI), Putrescin (Butan-1 ,4-diamin), Spermidin (N-(3-Aminopropyl)butan-1 ,4-diamin), Spermin (N,N'-bis(3-aminopropyl)butan- 1 ,4-diamin) Dimethylaminoethylacrylat, PoIy-N, N-dimethylaminoethylmethacrylat Dimethylaminopropylacrylamid, Dimethylaminopropylmethacrylamid, Dimethylaminostyrol, Vinylpyridin und Methyldiallylamin, PoIy-DADMAC, Guar, deacetyliertes Chitin und die entsprechenden Salze, welche sich mit geeigneten anorganischen oder niedermolekularen organischen Säuen bilden können. Geeignete Säuren zur Salzbildung sind z. B.: Salzsäure, Schwefelsäure, insbesondere aber auch Essigsäure, Glycolsäure oder Milchsäure.Hydroxyethylcellulose trimethylamine, polyallylamines, protamine chloride, polyallylamine hydrosalts, polyamines, polyvinylbenzyltrimethylammonium salts, polydiallyldimethylammonium salts, polyimidazoline, polyvinylamine and polyvinylpyridine, polyethyleneimine (PEI), putrescine (butane-1, 4-diamine), spermidine (N- (3-aminopropyl) butane-1, 4 -diamine), spermine (N, N'-bis (3-aminopropyl) butan-1, 4-diamine) dimethylaminoethyl acrylate, poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, dimethylaminopropylacrylamide, dimethylaminopropylmethacrylamide, Dimethylaminostyrene, vinylpyridine and methyldiallylamine, poly-DADMAC, guar, deacetylated chitin and the corresponding salts which may form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids. Suitable acids for salt formation are, for. B.: Hydrochloric acid, sulfuric acid, but especially acetic acid, glycolic acid or lactic acid.
In einer Ausführung kann die aminogruppentragende Verbindung, insbesondere ein kationisches Polymer, in einem organischen Lösungsmittel, welches unbegrenzt mit Wasser mischbar ist, vorzugsweise Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, Dimetylsulfoxid (DMSO), oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln mit Wasser gelöst werden.In one embodiment, the amino group-bearing compound, in particular a cationic polymer, can be dissolved in an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), or in a mixture of these solvents with water ,
In einer besonders bevorzugten Ausführung enthalten die Polymemanopartikel als Aminogruppen tragende Verbindung ein kationisch modifiziertes Polyacrylat (PoIy-N, N-dimethylaminoethylmethacrylat, P(DMAEMA)) (Formel 3).In a particularly preferred embodiment, the polymethylene particles contain, as the amino-containing compound, a cationically modified polyacrylate (poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, P (DMAEMA)) (formula 3).
Formel 3: Strukturformel P(DMAEMA), n= 5 - 20000, bevorzugt n=5-6000, bzw. n=5-100Formula 3: Structural formula P (DMAEMA), n = 5-20,000, preferably n = 5-6000, or n = 5-100
Das biologisch abbaubare, kationisch modifizierte Polyacrylat P(DMAEMA) wird in die Polymermatrix, insbesondere die PBCA-Polymermatrix, mittels Nanopräzipitation verkapselt. Die Oberfläche der resultierenden Nanopartikel weist aufgrund der Aminogruppen des kationischen Polymers ein positives (kationisches) Oberflächenpotential (Zetapotential) auf. Die kationische Partikeloberfläche gewährleistet eine gute Zellaufnahme und ermöglicht eine flexible elektrostatische Oberflächenmodifikation mit partiell anionisch geladenen Verbindungen. In einer anderen bevorzugten Ausführung enthalten die Polymernanopartikel als kationisches Polymer ein modifiziertes PolyacrylatThe biodegradable, cationically modified polyacrylate P (DMAEMA) is encapsulated in the polymer matrix, in particular the PBCA polymer matrix, by nanoprecipitation. The surface of the resulting nanoparticles has a positive (cationic) surface potential (zeta potential) due to the amino groups of the cationic polymer. The cationic particle surface ensures good cell uptake and enables flexible electrostatic surface modification with partially anionically charged compounds. In another preferred embodiment, the polymer nanoparticles contain as cationic polymer a modified polyacrylate
Poly(Dimethylaminopropylmethacrylamid).Poly (dimethylaminopropylmethacrylamide).
In einer weiteren bevorzugten Ausführung enthalten die Polymernanopartikel als kationisches Polymer Polyethylenimin (PEI) verschiedener Molekulargewichte, insbesondere 1 ,8 kDa, 10 kDa, 70 kDa sowie 750 kDa, (Formel 4).In a further preferred embodiment, the polymer nanoparticles contain as cationic polymer polyethyleneimine (PEI) of various molecular weights, in particular 1, 8 kDa, 10 kDa, 70 kDa and 750 kDa, (formula 4).
PEI ist ein im Bereich der nicht-viralen Gentherapie für DNA-Polyplexe (PEK) häufig verwendetes und dementsprechend viel untersuchtes Polykation [Remy J.-S. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 1998; 30(1 -3): 85-95].PEI is a polycation commonly used in the field of non-viral gene therapy for DNA polyplexes (PEK) and accordingly much studied [Remy J.-S. et al., Adv. Drug DeNv. Rev., 1998; 30 (1-3): 85-95].
Formel 4: Allgemeine Strukturformel für verzweigtes Polyethylenimin, wobei x, y und z = 10-50 %, bevorzugt x, y und z = 20-40% sind und in die Geamtheit der Anteile 100% ergibtFormula 4: General structural formula for branched polyethylenimine, where x, y and z = 10-50%, preferably x, y and z = 20-40%, giving 100% in the entirety of the proportions
Aufgrund der Verkapselung des kationischen Polyelektrolyten PEI in die PBCA- Polymermatrix besteht die Partikelhülle aus PEI-Polymerketten, welche ein kationisches Oberflächenpotential erzeugen.Due to the encapsulation of the cationic polyelectrolyte PEI in the PBCA polymer matrix, the particle shell consists of PEI polymer chains, which produce a cationic surface potential.
Zusätzlich können erfindungsgemäß neben den zuvor genannten kationischen Polymeren bzw. Verbindungen mit Aminogruppen diagnostische aber auch therapeutische Substanzen in die Polymermatrix mittels Nanopräzipitation eingeschlossen werden.In addition, according to the invention, in addition to the abovementioned cationic polymers or compounds containing amino groups, diagnostic as well as therapeutic substances can be included in the polymer matrix by means of nanoprecipitation.
Als diagnostische Substanzen zur Verkapselung können folgende Substanzklassen für unterschiedliche Molecular-Imaging-Methoden herangezogen werden, insbesondere sind hier Kontrastmittel oder Tracer für folgende Methode für molekulare Bildgebung (Molecular Imaging) zu nennen: die optische Bildgebung (Optical Imaging), wie z.B. DOT (diffuse optical imaging), US (ultrasound imaging), OPT (optical projection tomography), Nah- Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung, Fluorezenz-Protein-Bildgebung und BLI (bioluminescence imaging) und die Magnetresonanztomographie (MRT, MRI) bzw. Röngenbildgebung (X-ray). Es sind aber auch noch andere Methoden denkbar. Die Verkapselung einer geeigneten diagnostischen Substanz aus gennanten Substanzgruppen ermöglicht eine Detektion der Partikel in vitro und/ oder in vivo.The following substance classes for different molecular imaging methods can be used as diagnostic substances for encapsulation, in particular contrast agents or tracers for the following method for molecular imaging (Molecular Imaging) are to be mentioned: optical imaging, such as DOT (diffuse optical ultrasound imaging, OPT (optical projection tomography), near-infrared fluorescence imaging, fluorescence protein imaging and bioluminescence imaging (BLI) and magnetic resonance imaging (MRI, MRI) and X-ray imaging (X-ray imaging) ). But there are also other methods conceivable. The encapsulation of a suitable diagnostic substance from named substance groups makes it possible to detect the particles in vitro and / or in vivo.
In einer bevorzugten Ausführung handelt es sich bei dem diagnostischen Agens um Farbstoffe, insbesondere ausgewählt aus folgender Gruppe: Fluorescein,In a preferred embodiment, the diagnostic agent is a dye, in particular selected from the following group: fluorescein,
Fluorescein-isothiocyanat, Carboxyfluorescein oder Calcein,Fluorescein isothiocyanate, carboxyfluorescein or calcein,
Tetrabromfluoresceine oder Eosine, Tertaiodfluorescein oder Erythrosine,Tetrabromofluoresceins or eosines, tertaioffluorescein or erythrosines,
Difluorofluorescein, wie Oregon GreenTM 488, Oregon GreenTM 500 oderDifluorofluorescein, such as Oregon GreenTM 488, Oregon GreenTM 500 or
Oregon GreenTM 514, Carboxyrhodol (Rhodol GreenTM)- Farbstoffe (US 5,227,487; US 5,442,045), Carboxyrodamin-Farbstoffe (Rhodamine GreenTMOregon Green ™ 514, carboxy rhodol (Rhodol Green ™) dyes (US 5,227,487, US 5,442,045), carboxyrodamine dyes (Rhodamine Green ™
Dyes) (US 5,366,860), 4,4-Difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-indacene, wie z.B.Dyes) (U.S. 5,366,860), 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-indacenes, e.g.
Dodipy FL1 Bodipy 493/503 oder Bodipy 530/550 und Derivate davon (USDodipy FL 1 Bodipy 493/503 or Bodipy 530/550 and derivatives thereof (US
4,774,339; US 5,187,288; US 5,248,782; US 5,433,896; US 5,451 ,663),4,774,339; US 5,187,288; US 5,248,782; US 5,433,896; US 5,451,663),
Polymethin-Farbstoffe, Coumarinfarbstoffe wie z.B. Cumarin 6, 7-Amino-4- methylcoumarin, Metallkomplexe von DTPA oder Tetraazamacrozyclen (Cyclen,Polymethine dyes, coumarin dyes, e.g. Coumarin 6,7-amino-4-methyl coumarin, metal complexes of DTPA or tetraazamacrocycles (Cyclen,
Pyvlen) mit Terbium oder Europium oder Tetrapyrrolfarbstoffe, insbesonderePyvlen) with terbium or europium or Tetrapyrrolfarbstoffe, in particular
Porphyrine.Porphyrins.
In einer besonders bevorzugten Ausführung handelt es sich bei der diagnostischen Substanz um einen fluoreszenzaktiven Farbstoff.In a particularly preferred embodiment, the diagnostic substance is a fluorescence-active dye.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung handelt es sich bei dem diagnostischen Agens um einen fluoreszierenden Nah-lnfrarot(NIR)-Farbstoff. Diese bevorzugt für Optical Imaging verwendeten NIR-Farbstoffe absorbieren und emittieren Licht im NIR-Bereich zwischen 650 nm und 1000 nm. Die bevorzugten Farbstoffe gehören zur Klasse der Polymethinfarbstoffe und sind aus folgenden Gruppen ausgewählt: Carbocyanine wie beispielsweise Diethyloxacarbocyanin (DOC), Diethyloxadicarbocyanin (DODC), Diethyloxatricarbocyanin (DOTC), Indodi- oder Indotricarbocyanine, Tricarbocyanine, Merocyanine, Oxonolfarbstoffe (WO 96/17628), Rhodaminfarbstoffe, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffe,In a most preferred embodiment, the diagnostic agent is a fluorescent near-infrared (NIR) dye. These NIR dyes, preferably used for optical imaging, absorb and emit light in the NIR range between 650 nm and 1000 nm. The preferred dyes belong to the class of polymethine dyes and are selected from the following groups: carbocyanines such as diethyloxacarbocyanine (DOC), diethyloxadicarbocyanine (DODC ) Diethyloxatricarbocyanine (DOTC), indodi or indotricarbocyanines, tricarbocyanines, merocyanines, oxonol dyes (WO 96/17628), rhodamine dyes, phenoxazine or phenothiazine dyes,
Tetrapyrrolfarbstoffe, insbesondere Benzoporphyrine, Chorine und Phthalocyanine.Tetrapyrrole dyes, especially benzoporphyrins, chorine and phthalocyanines.
Die genannten und in dieser Erfindung bevorzugten Farbstoffe können entweder als Säuren oder als Salze eingesetzt werden. Geeignete anorganische Kationen bzw. Gegenionen für diese Farbstoffe sind beispielsweise das Lithiumion, das Kaliumion, das Wasserstoffion und insbesondere das Natriumion. Geeignete Kationen organischer Basen sind unter anderem solche von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie zum Beispiel Ethanolamin, Diethanolamin, Morpholin, Glucamin, N1N- Dimethylglucamin und insbesondere N-Methylglucamin und Polyethylenimin. Geeignete Kationen von Aminosäuren sind beispielsweise die des Lysins, des Arginins und des Ornithins sowie die Amide ansonsten saurer oder neutraler Aminosäuren.The dyes mentioned and preferred in this invention can be used either as acids or as salts. Suitable inorganic cations or counterions for these dyes are, for example, the lithium ion, the potassium ion, the hydrogen ion and in particular the sodium ion. Suitable cations of organic bases are, among others, those of primary, secondary or tertiary amines, such as ethanolamine, diethanolamine, morpholine, glucamine, N 1 N- dimethylglucamine and especially N-methylglucamine, and polyethyleneimine. Suitable cations of amino acids are, for example, those of lysine, arginine and ornithine and the amides of otherwise acidic or neutral amino acids.
Ebenso können die bevorzugten Farbstoffe können als Basen oder als Salze von diesen eingesetzt werden.Likewise, the preferred dyes may be used as bases or as salts thereof.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung handelt es sich bei der diagnostischen Substanz um einen Carbocyanin-Farbstoff. Die allgemeine Struktur der Carbocyanine wird wie folgt beschrieben (Formel 8).In a most preferred embodiment, the diagnostic substance is a carbocyanine dye. The general structure of the carbocyanines is described as follows (Formula 8).
wobei Q ein Fragment wobei R30 für ein Wasserstoff atom, eine Hydroxygruppe, eine Carboxygruppe, einen Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder ein Chloratom steht, R31 für ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht, X und Y unabhängig voneinander für ein Fragment -O-, -S-, -CH=CH- oder - C(CH2R32) (CH2R33)- stehen, where Q is a fragment where R 30 is a hydrogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy radical having 1 to 4 carbon atoms or a chlorine atom, R 31 is a hydrogen atom or an alkyl radical having 1 to 4 carbon atoms, X and Y are each independently a fragment, O-, -S-, -CH = CH- or - C (CH 2 R 32 ) (CH 2 R 33 ) - stand,
R20 bis R29, R32 und R33 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, einen Carboxy-, einen Sulfonsäure-Rest oder einen Carboxyalkyl -, Alkoxycarbonyl- oder Alkoxyoxoalkyl- Rest mit bis zu 10 C- Atomen oder ein Sulfoalkylrest mit bis zu 4 C-Atomen, oder für ein nicht spezifisch bindendes Makromolekül, oder für einen Rest der allgemeinen Formel VIR 20 to R 29 , R 32 and R 33 independently of one another represent a hydrogen atom, a hydroxy group, a carboxy, a sulfonic acid radical or a carboxyalkyl, alkoxycarbonyl or alkoxyoxoalkyl radical having up to 10 C atoms or a sulfoalkyl radical up to 4 carbon atoms, or for a non-specific binding macromolecule, or for a radical of general formula VI
-(O)v-(CH2)o-CO-NR34-(CH2)s-(NH-CO)q-R35 (VI) steht, mit der Massgabe, dass bei der Bedeutung von X und Y gleich O, S, -CH=CH- oder -C(CH3)2- mindestens einer der Reste R20 bis R29 einem nicht spezifisch bindenden Makromolekül oder der allgemeinen Formel VI entspricht, wobei o und s gleich 0 sind oder unabhängig voneinander für eine ganze Zahl von 1 bis 6 stehen, q und v unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,- (O) v - (CH 2 ) o -CO-NR 34 - (CH 2 ) s - (NH-CO) q R 35 (VI), with the proviso that when X and Y are both O, S , -CH = CH- or -C (CH 3 ) 2 - at least one of R 20 to R 29 corresponds to a non-specific binding macromolecule or the general formula VI, where o and s are 0 or independently of one another for an integer from 1 to 6, q and v are independently 0 or 1,
R34 ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest darstellt,R 34 represents a hydrogen atom or a methyl radical,
R35 ein Alkylrest mit 3 bis 6 C-Atomen, welcher 2 bis n-1 Hydroxygruppen aufweist, wobei n die Anzahl der C-Atome ist, oder ein mit 1 bis 3 Carboxygruppen substituierter Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen, Arylrest mit 6 bis 9 C-Atomen oder Arylalkylrest mit 7 bis 15 C-Atomen, oder ein Rest der allgemeinen Formel IMd oder MIe R 35 is an alkyl radical having 3 to 6 C atoms, which has 2 to n-1 hydroxyl groups, where n is the number of C atoms, or a substituted with 1 to 3 carboxy groups alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, aryl radical 6 to 9 carbon atoms or arylalkyl radical having 7 to 15 carbon atoms, or a radical of the general formula IMd or MIe
( N I d ) ( H I e ) ist, unter der Massgabe, dass q für 1 steht, oder ein nicht spezifisch bindendes Makromolekül bedeutet, R20 und R21, R21 und R22, R22 und R23, R24 und R25, R25 und R26, R26 und R27 zusammen mit den zwischen ihnen liegenden Kohlenstoffatomen einen 5- oder 6- gliedrigen aromatischen oder gesättigten annelierten Ring bilden, sowie deren physiologisch verträgliche Salze. Formel 8: Allgemeine Struktur der Carbocyanine(NI d) (HI e) is, provided that q is 1, or a non-specifically binding macromolecule, R 20 and R 21 , R 21 and R 22 , R 22 and R 23 , R 24 and R 25 , R 25 and R 26 , R 26 and R 27 together with the carbon atoms between them form a 5- or 6-membered aromatic or saturated fused ring, and their physiologically acceptable salts. Formula 8: General structure of carbocyanines
Im Falle der Carbocyanine wird Bezug auf die Anmeldungen DE 4445065 und DE 6991 1034 genommen, deren Inhalt hiermit Gegenstand dieser Anmeldung sein soll.In the case of carbocyanines, reference is made to the applications DE 4445065 and DE 6991 1034, the content of which is hereby the subject of this application.
Unerwarteterweise können anionische, gut wasserlösliche Substanzen wie bestimmte Carbocyanine in die hydrophobe Polymermatrix der beschriebenen Nanopartikel stabil eingeschlossen werden.Unexpectedly, anionic, readily water-soluble substances such as certain carbocyanines can be stably entrapped in the hydrophobic polymer matrix of the described nanoparticles.
Im Sinne der Erfindung wird eine anionische wasserlösliche Substanz mittels lonenkomplexbildung und Co-Präzipitation mit einem kationischem Polymer in einer schwer wasserlöslichen Polymermatrix durch Nanopräzipitation verkapselt, wobei Partikel definierter Größe entstehen.For the purposes of the invention, an anionic water-soluble substance is encapsulated by ion complexation and co-precipitation with a cationic polymer in a sparingly water-soluble polymer matrix by nanoprecipitation, resulting in particles of defined size.
Durch den Einbau eines NIR-aktiven Fluoreszenzfarbstoffes in die Polymermatrix der Partikel sind diese mittels Optical Imaging nicht-invasiv im Gewebe über Fluoreszenz detektierbar. Es besteht damit in vivo die Möglichkeit, die Verteilung bzw. Anreicherung fluoreszensmarkierter Nanopartikel zu detektieren. In einer besonders bevorzugten Ausführung handelt es sich bei dem Carbocyanin-Farbstoff um das gut wasserlösliche anionischeTetrasulfocyanin (TSC) (Formel 9).By incorporating an NIR-active fluorescent dye into the polymer matrix of the particles, they are non-invasively detectable by fluorescence in the tissue by means of optical imaging. There is thus the possibility in vivo of detecting the distribution or accumulation of fluorescently labeled nanoparticles. In a particularly preferred embodiment, the carbocyanine dye is the readily water-soluble anionic tetrasulfocyanine (TSC) (Formula 9).
Formel 9: Tetrasulfocyanin / TSCFormula 9: Tetrasulfocyanine / TSC
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführung handelt es sich bei dem Carbocyanin-Farbstoff um IDCC (Indodicarbocyanin) (Formel 10).In another particularly preferred embodiment, the carbocyanine dye is IDCC (indodicarbocyanine) (Formula 10).
Formel 10: Indodicarbocyanin / IDCCFormula 10: Indodicarbocyanine / IDCC
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführung handelt es sich bei dem Carbocyanin-Farbstoff um ICG (Indocyaningrün) (Formel 11). In another particularly preferred embodiment, the carbocyanine dye is ICG (indocyanine green) (Formula 11).
Formel 1 1 : Indocyaningrün (ICG)Formula 1 1: Indocyanine Green (ICG)
In einer Ausführung handelt es sich bei der verkapselten pharmazeutisch aktiven Substanz um ein therapeutisches Agens .In one embodiment, the encapsulated pharmaceutically active substance is a therapeutic agent.
In einer bevorzugten Ausführung handelt es sich bei dem therapeutischen Agens um eine Substanz zur Therapie von Tumorerkrankungen, insbesondere vaskularisierten Tumoren und Metastasen, oder Erkrankungen mit Entzündungsreaktionen Bei letzterem kann es sich beispielsweise um Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, wie z. B. Rheumatoide Arthitis, Psoriasis Arthritis, Kollagenosen, Vaskulitiden und Infektarthritiden handeln. Weitere Erkrankungen mit entzündlichen Prozessen und möglichen Gewebsveränderungen sind chronisch etnzündliche Darmerkrankungen (Morbus Chrohn, Colitis Ulcerosa), Multiple Sclerose, Atopische Dermatitis wie auch bestimmte Erythema-Erkrankungen. Als therapeutische Substanzen können insbesondere folgende Gruppen herangezogen werden: immunogene Peptide oder Proteine, chemotherapeutische Agenzien, Toxine, radiotherapeutische Agenzien, Radiosensibilisatoren, Angiogenese-Inhibitoren und antientzündlich wirksame Substanzen wie NSAIDs oder eine Kombination aus diesen.In a preferred embodiment, the therapeutic agent is a substance for the treatment of tumor diseases, in particular vascularized tumors and metastases, or diseases with inflammatory reactions. The latter can be, for example, diseases of the rheumatic type, such as, for example, Rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, collagenosis, vasculitis, and infectious diseases. Other diseases with inflammatory processes and possible tissue changes include chronic inflammatory bowel disease (Crohn's disease, ulcerative colitis), multiple sclerosis, atopic dermatitis as well as certain erythema disorders. In particular, the following groups can be used as therapeutic substances: immunogenic peptides or proteins, chemotherapeutic agents, toxins, radiotherapeutic agents, radiosensitizers, angiogenesis inhibitors and antiinflammatory substances such as NSAIDs or a combination of these.
Die therapeutischen Agenzien zur Behandlung von Tumorerkrankungen können ausgewählt sein aus der Gruppe der Alkylanzien, insbesondere Bendamustin, Busulfan, Carmustin, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Lomustin, Melphalan, Nimustin, Thiotepa, Treosulfan und Trofosfamid, der Gruppe der Antimetaboliten, insbesondere Cytarabin, Fludarabin, Fluorouracil, Gemcitabin, Mercaptopurin, Methotrexat und Tioguanin, der Gruppe der Alkaloide und Diterpene, insbesondere Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinorelbin, Etoposid, und Docetaxel, Paclitaxel, die Gruppe der Taxane, der Gruppe der Antibiotika, insbesondere Aclarubicin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Mitomycin, Mitoxantron, der Gruppe der Platin Verbindungen, insbesondere Carboplatin und Cisplatin, der Gruppe der Hormone und Hormonagonisten, insbesondere Testolacton, Fosfestrol, Tamoxifen, Cyproteron Flutamid, Buserelin, Gonadorelin, Goserelin, Leuprorelin, Nafarelin, Triptorelin und Octreotid und der Gruppe der VEGF-Inhibitoren.The therapeutic agents for the treatment of tumor diseases can be selected from the group of alkylating agents, in particular bendamustine, busulfan, carmustine, chlorambucil, cyclophosphamide, ifosfamide, lomustine, Melphalan, nimustine, thiotepa, treosulfan and trofosfamide, the group of antimetabolites, in particular cytarabine, fludarabine, fluorouracil, gemcitabine, mercaptopurine, methotrexate and tioguanine, the group of alkaloids and diterpenes, in particular vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine, etoposide, and docetaxel , Paclitaxel, the group of taxanes, the group of antibiotics, especially aclubicin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitomycin, mitoxantrone, the group of platinum compounds, especially carboplatin and cisplatin, the group of hormones and hormone agonists, especially testolactone , Fosfestrol, Tamoxifen, Cyproterone Flutamide, Buserelin, Gonadorelin, Goserelin, Leuprorelin, Nafarelin, Triptorelin and Octreotide and the group of VEGF inhibitors.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung handelt es sich bei dem therapeutischen Agens um Substanzen, welche zur Therapie von Entzündungen geeignet sind. Sie sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR), insbesondere Salizylate (unter anderem Acetylsalicylsäure), Arylessigsäurederivate (unter anderem Acemetacin, Diclofenac), Propionsäurederivate (unter anderem Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Tiaprofen), Indol-Derivate (unter anderem Indometacin, Acemetacin, Lonazolac, Proglumetacin), Oxicame (unter anderem Piroxicam, Tenoxicam), Alkalone (unter anderem Nabumeton), Pyrazolone (unter anderem Azapropazon, Pyrazinobutazon, Phenylbutazon, Oxyphenbutazon), Anthranilsäurederivate (unter anderem Mefenaminsäure, Nifluminsäure), COX 2 Hemmer (unter anderem Meloxicam, Celecoxib, Rofecoxib) und eine Kombination von NSAR und anderen Medikamenten (unter anderem die Kombination aus Diclofenac und Misoprostol), der Gruppe der Glukokortikoide, insbesondere Betamethason, Budesonid, Cloprednol, Cortison, Deflazacort, Dexamethason, Fluocortolon, Hydrocortison, Methylprednisolon, Prednisolon, Prednison, Prednyliden, Triamcinolon, Beclometason, Flunisolid, Fluticason, Alclometason, Amcinonid, Clobetasol, Clobetason, Clocortolon, Desonid, Desoximetason, Diflorason, Diflucortolon, Fludroxycortid, Flumetason, Fluocinolon, Fluocinonid, Fluocortin, Flupredniden, Halcinonid, Halometason, Mometason, Prednicarbat, Fluorometholon, Medryson, Cortisol (Hydrocortison), Amcinonid, Rimexolon, der Gruppe der langwirksame Antirheumatika, insbesondere Chloroquin, Hydroxychloroquin, Sulfasalazin (Salazosulfapyridin), Adalimumab, Anakinra, Etanercept, Infliximab, D-Penicillamin, die Gruppe der Immunsuppressiva, insbesondere Azathioprin, Methotrexat, Mycophenolat mofetil, Cyclosporin A1 Cyclophosphami, Chlorambucil und Leflunomid, und die Gruppe der Antibiotika, insbesondere die Penicilline (unter anderem Ampicillin, Piperacillin, Amoxicillin Clavulansäure, Tazobaktam, Apalzillin, Penicillin G1 Oxacillin, Flucloxacillin, Mezlocillin, Phenoxymethylpenezillin), die Cephalosporine (unter anderem Cefotaxim, Cefoxitin, Cefotiam, Cefepim, Ceftazidim, Cefotriaxon, Cefuroxim, Cefamandol, Cefazolin), die Carbapeneme (unter anderem Imipenem, Carbapeneme, Cilastin, Meropenem), die Chinolone (unter anderem Moxifloxacin, Levofloxacin, Ciprofloxacin), die Aminoglykoside (unter anderem Gentamycin, Amikacin, Netilmycinsulfat, Tobramycin, Gentamycin), die Makrolide (unter anderem Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin, Roxithromycin), die Monobactame (unter anderem Aztreonam), die Glykopeptide (unter anderem Vancomycin, Teicoplanin) und andere Antibiotika (unter anderem Doxycyclin, Clindamycin, Ofloxacin, Chloramphenicol, Amphotericin B, Flucytosin, Metronidazol, Fusidinsäure, Fosfomycin.In a further preferred embodiment, the therapeutic agent is a substance which is suitable for the treatment of inflammation. They are in particular selected from the group of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), in particular salicylates (inter alia acetylsalicylic acid), arylacetic acid derivatives (inter alia acemetacin, diclofenac), propionic acid derivatives (inter alia ibuprofen, ketoprofen, naproxen, tiaprofen), indole derivatives (inter alia Indomethacin, acemetacin, lonazolac, proglumetacin), oxicams (including piroxicam, tenoxicam), alkalons (including nabumetone), pyrazolones (including azapropazone, pyrazinobutazone, phenylbutazone, oxyphenbutazone), anthranilic acid derivatives (including mefenamic acid, niflumic acid), COX 2 inhibitors (including meloxicam, celecoxib, rofecoxib) and a combination of NSAIDs and other medicines (including the combination of diclofenac and misoprostol), the group of glucocorticoids, in particular betamethasone, budesonide, cloprednol, cortisone, deflazacort, dexamethasone, fluocortolone, hydrocortisone, Methylprednisolone, prednisolone, prednisone, pred nylidene, triamcinolone, beclomethasone, flunisolide, fluticasone, alclometasone, amcinonide, clobetasol, clobetasone, clocortolone, desonide, desoximetasone, diflorasone, diflucortolone, fludroxycortide, flumetasone, fluocinolone, fluocinonide, fluocortin, flupredniden, halcinonide, halometasone, mometasone, prednicarbate, fluorometholone, Medrysone, cortisol (hydrocortisone), Amcinonide, rimexolone, the group of long-acting antirheumatics, in particular chloroquine, hydroxychloroquine, sulfasalazine (salazosulfapyridine), adalimumab, anakinra, etanercept, infliximab, D-penicillamine, the group of immunosuppressants, in particular azathioprine, methotrexate, mycophenolate mofetil, cyclosporin A 1 cyclophosphami, Chlorambucil and leflunomide, and the group of antibiotics, in particular penicillins (including ampicillin, piperacillin, amoxicillin clavulanic acid, tazobaktam, apalzillin, penicillin G 1 oxacillin, flucloxacillin, mezlocillin, phenoxymethylpenezillin), cephalosporins (inter alia cefotaxime, cefoxitin, cefotiam, Cefepim, ceftazidime, cefotriazone, cefuroxime, cefamandole, cefazolin), the carbapenems (including imipenem, carbapenems, cilastin, meropenem), the quinolones (including moxifloxacin, levofloxacin, ciprofloxacin), the aminoglycosides (including gentamycin, amikacin, netilmycin sulfate, Tobramycin, gentamycin), the macrolides (under other azithromycin, clarithromycin, erythromycin, roxithromycin), the monobactams (including aztreonam), the glycopeptides (including vancomycin, teicoplanin) and other antibiotics (including doxycycline, clindamycin, ofloxacin, chloramphenicol, amphotericin B, flucytosine, metronidazole, fusidic acid, fosfomycin.
In einer bevorzugten Ausführung handelt es sich bei den Polymernanopartikeln um Fällungsaggregate, welche durch Nanopräzipitation hergestellt werden. Hierfür stehen insbesondere folgende Herstellungsmethoden zur Verfügung:In a preferred embodiment, the polymer nanoparticles are precipitation aggregates which are produced by nanoprecipitation. In particular, the following production methods are available for this purpose:
• Direkte Fällung (Präzipitation) in einem Reagenzglas durch Einbringen des gelösten Polymer-Substanz-Gemisches in eine tensidhaltige wässrige Lösung, welche mittels Magnetrührer durchmischt wird.Direct precipitation (precipitation) in a test tube by introducing the dissolved polymer-substance mixture into a surfactant-containing aqueous solution which is mixed by means of a magnetic stirrer.
• Fällung des Polymer-Substanz-Gemisches in der tensidhaltigen wässrigen Lösung durch Zusammenführung der beiden Lösungen mittels eines Micro-Mischer-Systems. • Verwendung von Ultraschall zur gleichmäßigen Verteilung des Polymer-• Precipitation of the polymer-substance mixture in the surfactant-containing aqueous solution by combining the two solutions by means of a micro-mixer system. • use of ultrasound for uniform distribution of the polymer
Substanz-Gemisches in der tensidhaltigen wässrigen Lösung. Bei der Herstellung von Nanopartikeln mittels Nanopräzipitation wird das organische Lösungsmittel schlagartig dem Matrixpolymer und den mit ihm gelösten Substanzen entzogen, wenn die polymerhaltige organische Lösung in ein deutlich größeres Volumen einer wässrigen Lösung gegeben wird. Überraschenderweise werden in der Polymerphase gelöste Verbindungen mit Aminogruppen (wasserlösliche als auch wasserunlösliche) in dem schwer löslichen Polymer während der Fällung coverkapselt. Bedingung dafür ist die unbegrenzte Mischbarkeit des organischen Lösungsmittels (z. B. Aceton, Ethanol) mit Wasser sowie die Unlöslichkeit des Matrixpolymers in der wässrigen Phase.Substance mixture in the surfactant-containing aqueous solution. In the production of nanoparticles by nanoprecipitation, the organic solvent is abruptly withdrawn from the matrix polymer and the substances dissolved with it, when the polymer-containing organic solution is added to a significantly larger volume of an aqueous solution. Surprisingly, compounds dissolved in the polymer phase with amino groups (water-soluble as well as water-insoluble) are encapsulated in the sparingly soluble polymer during the precipitation. The condition for this is the unlimited miscibility of the organic solvent (eg acetone, ethanol) with water as well as the insolubility of the matrix polymer in the aqueous phase.
In einer bevorzugten Ausführung für alle vorhergehenden Polymernanopartikel ist die Oberfläche der Polymernanopartikel elektrostatisch modifiziert.In a preferred embodiment for all preceding polymer nanoparticles, the surface of the polymer nanoparticles is electrostatically modified.
Die elektrostatische Modifikation der kationischen Nanopartikeloberfläche ist ein herausragender Vorteil der vorliegenden Erfindung. Auf der Basis ionischer Wechselwirkungen kann ohne eine chemische Kopplungsreaktion die Partikeloberfläche mit einer geeigneten Substanz modifiziert werden. Voraussetzung dafür ist, dass das modifizierende Agens partiell über Ladungen verfügt, welche entgegengesetzt der Partikeloberflächenladung sind. Damit erlaubt diese Methode (elektrostatische Oberflächenmodifikation mittels Ladungstitration) eine einfache, flexible und vielseitige Modifikation der Partikeloberfläche. Zusätzlich ist es möglich, instabile Wirkstoffe auf der Partikeloberfläche zu adsorbieren, welche dadurch vor dem Abbau durch Enzyme geschützt sind und dementsprechend einen höheren therapeutischen Effekt erzielen können.The electrostatic modification of the cationic nanoparticle surface is an outstanding advantage of the present invention. On the basis of ionic interactions, the particle surface can be modified with a suitable substance without a chemical coupling reaction. The prerequisite for this is that the modifying agent has partial charges which are opposite to the particle surface charge. Thus, this method (electrostatic surface modification by charge titration) allows a simple, flexible and versatile modification of the particle surface. In addition, it is possible to adsorb unstable drugs on the particle surface, which are thereby protected from degradation by enzymes and accordingly can achieve a higher therapeutic effect.
Die Anreicherung (aktives und passives Targeting) von Nanopartikeln aus dem Blutstrom in das Zielgewebe setzt voraus, dass die Partikel ausreichend lange im Blutstrom zirkulieren. Erfindungsgemäß kann mittels der zuvor beschrieben Oberflächenmodifikation die Zirkulationszeit im Körper individuell angepasst werden, insbesondere durch Verwendung von Polyethylenoxiden oder Polythylenglycolen (siehe Beispiel 5). Ein weiterer herausragender Vorteil besteht darin, dass die hier beschriebene elektrostatische Oberflächenmodifikation direkt vor der Anwendung schnell und unproblematisch durchgeführt werden kann. Dies geschieht durch ein einfaches Mischen geeigneter Mengen der Nanopartikeldispersion mit dem modifizierendem Agens.The enrichment (active and passive targeting) of nanoparticles from the bloodstream into the target tissue requires that the particles circulate in the blood stream for a sufficient period of time. According to the invention, by means of the above-described surface modification, the circulation time in the body can be adapted individually, in particular by using polyethylene oxides or polyethylene glycols (see Example 5). Another outstanding advantage is that the electrostatic surface modification described here can be carried out quickly and without problems directly before use. This is done by simply mixing appropriate amounts of the nanoparticle dispersion with the modifying agent.
Damit besteht zusätzlich die Möglichkeit, den Kernpartikel separat vom oberflächenmodifizierendem Agens herzustellen und zu lagern. Dies ist zum einen besonders vorteilhaft für die kolloidale Langzeitstabilität. Zum anderen können extrem labile oberflächenmodifizierende Substanzen wie Peptide oder Antikörper unter geeigneten Bedingungen bis zur Verwendung aufbewahrt werden.Thus, it is additionally possible to prepare and store the core particles separately from the surface-modifying agent. This is for a particularly advantageous for the colloidal long-term stability. On the other hand, extremely labile surface-modifying substances such as peptides or antibodies can be stored under suitable conditions until use.
Die Trennung von Kernpartikel und modifizierendem Agens ermöglicht weiterhin eine Oberflächenmodifikation entsprechend den individuellen Anforderungen beim Patienten. Die Oberflächenmodifikation nach einem Baukastenprinzip bietet dabei maximale Flexibilität für Diagnose, Therapie und Monitoring, wobei die unkomplizierte Durchführung der Modifikation direkt durch den Anwender erfolgt.The separation of core particles and modifying agent further allows a surface modification according to the individual requirements of the patient. The surface modification on a modular principle offers maximum flexibility for diagnosis, therapy and monitoring, whereby the uncomplicated implementation of the modification is carried out directly by the user.
Ein bevorzugter Aufbau des oberflächenmodifizierenden Agens für kationisch funktionalisierte Polymernanopartikel, insbesondere die beschriebenen PBCA- Nanopartikel, ist in Formel 5 dargestellt. Der partiell anionisch geladene Molekülteil erfüllt die Funktion eines Ankers auf der positiv geladenen Partikeloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkungen. Der neutrale, zum umgebenden wässrigen Medium ausgerichetete Molekülteil besteht aus Polyethylenglycol und/oder Polyethylenoxid-Einheiten (PEG-Einheiten) unterschiedlicher Länge. Bevorzugt sind hier PEG-Ketten mit einem Molekulargewicht von 100 bis 30000 Dalton und besonders bevorzugt mit 3000 bis 5000 Dalton. Dieser Molekülteil kann alternativ auch aus anderen geeigneten Strukturen, wie z. B. Hydroxyethylstärke (HES) und allen daraus möglichen polymeren Verbindungen, bestehen. Bei dem Rest R handelt es sich bevorzugt um Wasserstoff oder eine Methyl-Einheit. Formel 5: Allgemeine Strukturformel eines oberflächenmodifizierenden Agens (R = H1 CH3), n=5-700, bevorzugt n=5-A preferred construction of the surface-modifying agent for cationically functionalized polymer nanoparticles, in particular the described PBCA nanoparticles, is shown in formula 5. The partially anionically charged moiety fulfills the function of an anchor on the positively charged particle surface through electrostatic interactions. The neutral, aligned to the surrounding aqueous medium moiety consists of polyethylene glycol and / or polyethylene oxide units (PEG units) of different lengths. Preference is given here to PEG chains having a molecular weight of from 100 to 30,000 daltons and more preferably from 3,000 to 5,000 daltons. This moiety may alternatively be made of other suitable structures, such as. As hydroxyethyl starch (HES) and all possible polymeric compounds exist. The radical R is preferably hydrogen or a methyl unit. Formula 5: General structural formula of a surface-modifying agent (R = H 1 CH 3 ), n = 5-700, preferably n = 5-
In einer besonders bevorzugten Ausführung ist die Oberfläche des Polymernanopartikels mit GIu(10)-b-PEG(110) modifiziert (Formel 6). Als negativer Molekülteil (Anker) dienen die Carboxylat-Gruppen der Glutaminsäure-Untereinheiten des Blockcopolymers.In a particularly preferred embodiment, the surface of the polymer nanoparticle is modified with Glu (10) -b-PEG (110) (Formula 6). The negative moiety (anchor) is the carboxylate groups of the glutamic acid subunits of the block copolymer.
Formel 6: Strukturformel von GIu(10)-b-PEG(110);Formula 6: Structural Formula of GIu (10) -b-PEG (110);
In einer besonders bevorzugten Ausführung ist eine Zielstruktur vorhanden.In a particularly preferred embodiment, a target structure is present.
Diese Zielstruktur besitzt mindestens einen negativ geladenen Molekülteil, welcher durch elektrostatische Wechselwirkungen auf die kationische Partikeloberfläche aufgebracht wird.This target structure has at least one negatively charged moiety which is applied to the cationic particle surface by electrostatic interactions.
Ein weiterer besonders bevorzugter Aufbau des oberflächenmodifizierenden Agens für kationisch funktionalisierte Polymernanopartikel, insbesondere die beschriebenen PBCA-Nanopartikel, ist in Formel 7 dargestellt.Another particularly preferred structure of the surface-modifying agent for cationically functionalized polymer nanoparticles, in particular the described PBCA nanoparticles, is shown in formula 7.
-°^^o^ anionischer Anker Formel 7: Allgemeine Strukturformel eines oberflächenmodifizierenden Agens, n=5-700, bevorzugt n=5-200- ^ ^ ^ ^ anionic anchor Formula 7: General structural formula of a surface-modifying agent, n = 5-700, preferably n = 5-200
Der partiell anionisch geladene Molekülteil erfüllt die Funktion eines Ankers auf der positiv geladenen Partikeloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkungen. Der mittlere, neutrale Molekülteil besteht aus Polyethylenglycol-Einheiten und/oder Polyethylenoxid-Einheiten (PEG- Einheiten) unterschiedlicher Länge. Bevorzugt sind hier PEG-Ketten mit einem Molekulargewicht von 100 bis 30000 Dalton und besonders bevorzugt mit 3000 bis 5000 Dalton. Dieser Molekülteil kann alternativ auch aus anderen geeigneten Strukturen, wie z. B. Hydroxyethylstärke (HES) und allen daraus möglichen polymeren Verbindungen, bestehen.The partially anionically charged moiety fulfills the function of an anchor on the positively charged particle surface through electrostatic interactions. The middle, neutral part of the molecule consists of polyethylene glycol units and / or polyethylene oxide units (PEG units) of different lengths. Preference is given here to PEG chains having a molecular weight of from 100 to 30,000 daltons and more preferably from 3,000 to 5,000 daltons. This moiety may alternatively be made of other suitable structures, such as. As hydroxyethyl starch (HES) and all possible polymeric compounds exist.
Der Ligand X des oberflächenmodifizierenden Agens, im weiteren auch Zielstruktur genannt, dient zur Verbesserung von passiven und aktiven Anreicherungsmechanismen der Polymernanopartikel.The ligand X of the surface-modifying agent, also referred to as target structure, serves to improve passive and active accumulation mechanisms of the polymer nanoparticles.
Geeignete Liganden als Zielstrukturen können sowohl Antikörper, Peptide, Rezeptor-Liganden von Liganden-Mimetika oder ein Aptamer sein. Als Strukturen kommen Aminosäuren, Peptide, CDR (compementary determining regions), Antigene, Haptene, Enzymsubstanzen, Enzym-Cofaktoren, Biotin, Carotinoide, Hormone, Vitamine, Wachstumsfaktoren, Lymphokine, Carbohydrate, Oligosaccharide, Lecitine, Dextrane, Lipide, Nucleoside wie beispielsweise ein DNA- oder ein RNA-Molekül enthaltend native, modifizierte oder artifizielle Nucleoside, Nucleinsäuren, Oligocucleotide, Polysaccharide, B-, A-, Z-HeNx oder Haarnadelstruktur (Hairpin), eine chemische Einheit, modifizierte Polysaccharide als auch rezeptorbindende Substanzen oder Fragmente davon in Betracht. Zielstrukturen können auch Transferrin oder Folsäure oder Teile davon sein oder alle möglichen Kombinationen aus den vorgenannten.Suitable ligands as target structures may be antibodies, peptides, receptor ligands of ligand mimetics or an aptamer. Structures include amino acids, peptides, CDR (compementary determining regions), antigens, haptens, enzyme substances, enzyme cofactors, biotin, carotenoids, hormones, vitamins, growth factors, lymphokines, carbohydrates, oligosaccharides, lecithins, dextrans, lipids, nucleosides such as DNA or an RNA molecule containing native, modified or artificial nucleosides, nucleic acids, oligocucleotides, polysaccharides, B, A, Z-HeNx or hairpin structure (hairpin), a chemical entity, modified polysaccharides as well as receptor binding substances or fragments thereof consideration. Target structures may also be transferrin or folic acid or parts thereof, or all possible combinations of the foregoing.
Diese Liganden werden erfindungsgemäß über elektrostatische Wechselwirkungen an die Nanopartikel gebunden, es ist aber auch möglich, die Liganden über kovalente Bindungen an die Partikeloberfläche zu binden. Weiterhin ist es möglich, einen Linker zwischen Ligand und Nanopartikel einzubauen.These ligands are bound to the nanoparticles via electrostatic interactions, but it is also possible to bind the ligands via covalent bonds to the particle surface. Furthermore, it is possible to incorporate a linker between ligand and nanoparticles.
Die elektrostatische Anlagerung der Zielstrukturen erfolgt über Ladungswechselwirkungen mit mindestens einem negativ geladenen Molekülteil an die kationische Partikeloberfläche. Als negativ geladener Molekülteil (Anker) eignen sich insbesondere Verbindungen insbesondere Gruppen wie Acetat-, Carbonat-, Citrat, Succinat-, Nitrat-, Carboxylat-, Phosphat-, Sulfonat- oder Sulfat-Gruppen, sowie Salze und freie Säuren dieser Gruppen.The electrostatic attachment of the target structures takes place via charge interactions with at least one negatively charged moiety on the cationic particle surface. In particular, compounds such as acetate, carbonate, citrate, succinate, nitrate, carboxylate, phosphate, sulfonate or sulfate groups, as well as salts and free acids of these groups, are suitable as the negatively charged moiety (anchor).
In einer Ausführung beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 1 nm - 800 nm.In one embodiment, the size of the nanoparticles is between 1 nm and 800 nm.
In einer bevorzugten Ausführung beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 5 nm - 800 nm.In a preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 5 nm and 800 nm.
In einer bevorzugten Ausführung beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 1 nm - 500 nm.In a preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 1 nm and 500 nm.
In einer bevorzugten Ausführung beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 1 nm - 300 nm.In a preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 1 nm and 300 nm.
In einer besonders bevorzugten Ausführung beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 5 nm - 500 nm.In a particularly preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 5 nm and 500 nm.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführung beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 5 nm - 300 nm.In a further particularly preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 5 nm and 300 nm.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführung beträgt die Größe der Nanopartikel zwischen 10 nm - 300 nm.In a further particularly preferred embodiment, the size of the nanoparticles is between 10 nm and 300 nm.
Die Größe der entstandenen Polymernanopartikel wird mittels der Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) ermittelt. iner besonders bevorzugten Ausführung sind die Polymernanopartikel durch Durchführung folgender Verfahrensschritte gekennzeichnet:The size of the resulting polymer nanoparticles is determined by photon correlation spectroscopy (PCS). In a particularly preferred embodiment, the polymer nanoparticles are characterized by carrying out the following process steps:
• Das wasserunlösliche Polymer wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, welches unbegrenzt mit Wasser mischbar ist, vorzugsweise Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, Dimetylsulfoxid (DMSO), oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln mit Wasser gelöst.The water-insoluble polymer is dissolved in a suitable organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide (DMSO), or in a mixture of these solvents with water.
• Das kationische Polymer wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, welches unbegrenzt mit Wasser mischbar ist, vorzugsweise Aceton,The cationic polymer is dissolved in a suitable solvent which is immiscible with water indefinitely, preferably acetone,
Methanol, Ethanol, Propanol, Dimetylsulfoxid (DMSO), oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln mit Wasser gelöst.Methanol, ethanol, propanol, Dimetylsulfoxid (DMSO), or dissolved in a mixture of these solvents with water.
• Der Wirkstoff (Diagnostikum oder Therapeutikum) wird in einem organischen Lösungsmittel, welches unbegrenzt mit Wasser mischbar ist, vorzugsweise Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol, DimetylsulfoxidThe active ingredient (diagnostic or therapeutic) is dissolved in an organic solvent which is infinitely miscible with water, preferably acetone, methanol, ethanol, propanol, dimethylsulfoxide
(DMSO), oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln mit Wasser gelöst.(DMSO), or dissolved in a mixture of these solvents with water.
• Es wird eine vollständig homogene Lösung aus kationischem Polymer, wasserunlöslichem Polymer und Wirkstoff hergestellt. • Durch ein Einbringen des gelösten Polymer-Substanz-Gemisches in eine tensidhaltige Lösung, als Tensid insbesondere Pluronic F68, Triton X-100 und Synperonic T707, wird die spontane Bildung eines kolloidalen Fällungsaggregats herbeigeführt.• A completely homogeneous solution of cationic polymer, water-insoluble polymer and active ingredient is produced. • By introducing the dissolved polymer-substance mixture in a surfactant-containing solution, as a surfactant in particular Pluronic F68, Triton X-100 and Synperonic T707, the spontaneous formation of a colloidal precipitation unit is brought about.
• Das organische Lösungsmittel wird anschließend entweder unter Atmosphärendruck oder Unterdruck, über Lyophilisation oder Hitze vollständig oder andere geeignete Methoden entfernt.The organic solvent is then removed either under atmospheric pressure or negative pressure, via lyophilization or heat completely or other suitable methods.
• Zur Modifikation der Partikeloberfläche wird die wässrige, stabile Nanopartikeldispersion in einem geeigneten Mengenverhältnis mit dem in Wasser gelösten modifizierenden Agens vermischt. Die Bestimmung des geeigneten Mengenverhältnisses erfolgt durch schrittweise Titration der• To modify the particle surface, the aqueous, stable nanoparticle dispersion is mixed in a suitable ratio with the modifying agent dissolved in water. The determination of the appropriate quantitative ratio is carried out by stepwise titration of
Partikeldispersion mit dem modifizierenden Agens. Das Ausmaß der elektrostatischen Oberflächenmodifikation (Ladungstitration) wird durch Bestimmung des Zetapotentials kontrolliert. Die beschriebenen Nanopartikel können unter Verwendung geeigneter pharmazeutischer Zusatzstoffe zu verschiedenen Arzneiformen weiterverarbeitet werden, welche sich zur Applikation an Mensch oder Tier eignen. Dazu zählen insbesondere wässrige Dispersionen, Lyophilisate, feste orale Arzneiformen wie schnell auflösende Tabletten, Kapseln und andere. Geeignete pharmazeutische Zusatzstoffe können sein: Zuckeralkohole zur Lyophilisation (z. B. Sorbitol, Mannitol), Hilfstoffe zur Tablettierung, Polyethylenglycole etc.Particle dispersion with the modifying agent. The degree of electrostatic surface modification (charge titration) is controlled by determining the zeta potential. The described nanoparticles can be further processed using suitable pharmaceutical additives to various dosage forms which are suitable for application to humans or animals. These include in particular aqueous dispersions, lyophilisates, solid oral dosage forms such as fast-dissolving tablets, capsules and others. Suitable pharmaceutical additives may be: sugar alcohols for lyophilization (eg sorbitol, mannitol), tableting excipients, polyethylene glycols, etc.
Die Applikation der wässrigen Nanopartikeldispersion oder einer weiter entwickelten Arzneiform kann oral, parenteral (intra venös), subkutan, intramuskulär, intraokular, intrapulmonal, nasal, intraperitoneal, dermal sowie auf allen anderen für Mensch oder Tier möglichen Apllikationswegen angewendet werden.The application of the aqueous nanoparticle dispersion or of a further developed pharmaceutical form can be applied orally, parenterally (intravenously), subcutaneously, intramuscularly, intraocularly, intrapulmonary, nasally, intraperitoneally, dermally as well as on all other possible human or animal routes of administration.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polymernanopartikels, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:The invention relates to a process for the preparation of a polymer nanoparticle, characterized in that the following process steps are carried out:
• Lösen des kationischen Polymers in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch mit WasserDissolving the cationic polymer in an organic solvent or a solvent mixture with water
• Lösen des wasserunlöslichen Polymers in einem organischen LösungsmittelDissolving the water-insoluble polymer in an organic solvent
• Lösen des Wirkstoffes (Diagnostikum oder Therapeutikum) in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch mit Wasser,Dissolving the active ingredient (diagnostic or therapeutic agent) in an organic solvent or a solvent mixture with water,
• Herstellen eines vollständig gelösten Gemisches aus kationischem Polymer, wasserunlöslichem Polymer und Wirkstoff• Make a completely dissolved mixture of cationic polymer, water-insoluble polymer and active ingredient
• Einbringen des Gemisches in eine tensidhaltige Lösung, wobei es zur spontanen Bildung von Fällungsaggregaten kommt, • Entfernen des Lösungsmittels.• introduction of the mixture into a surfactant-containing solution, which leads to the spontaneous formation of precipitating aggregates, • removal of the solvent.
• Elektrostatische Oberflächenmodifikation der Partikel durch Zusammenfügen von Nanopartikeldispersion und modifizierendem Agens in geeigneten Mengen (Fakultativ). Definitionen• Electrostatic surface modification of the particles by combining nanoparticle dispersion and modifying agent in appropriate amounts (optional). definitions
Der Begriff "Wirkstoff", wie hier verwendet, umfasst therapeutisch und diagnostisch wirksame Verbindungen. Ebenso umfasst sind Verbindungen, die bei anderen Tieren als dem Menschen und bei Pflanzen wirksam sind.The term "active ingredient" as used herein includes therapeutically and diagnostically effective compounds. Also included are compounds that are effective in animals other than humans and plants.
Der Begriff "Matrixpolymer", wie hier verwendet, beschreibt das Polymer, welches mengenmäßig den größeren Anteil der Partikelmasse bildet, wobei weitere verkapselte Substanzen (sowohl beliebige Zusatzstoffe als auch pharmazeutisch aktive Substanzen) gleichmäßig und/oder ungleichmäßig eingebettet sein können.The term "matrix polymer" as used herein describes the polymer which quantitatively constitutes the major proportion of the particle mass, wherein further encapsulated substances (both arbitrary additives and pharmaceutically active substances) may be uniformly and / or non-uniformly embedded.
Der Begriff „(Nano)-Präzipitation", wie hier verwendet, beschreibt die Bildung eines kolloidalen Niederschlags durch Ausfällen eines schwer wasserlöslichen Polymers beim Einbringen in eine wässrige Phase, wobei eine Durchmischung der Lösungsmittel stattfindet. Im Falle einer Co-Präzipitation kommt es zu einer gemeinschaftlichen Ausfällung mehrerer Substanzen, welche im Sinne der Erfindung sowohl wasserlöslich als auch schwer wasserlöslich sein können.As used herein, the term "(nano) precipitation" describes the formation of a colloidal precipitate by precipitating a sparingly water-soluble polymer when placed in an aqueous phase, with mixing of the solvents taking place Community precipitation of several substances which may be both water-soluble and poorly water-soluble in the context of the invention.
Ein „Fällungsaggregat", wie hier verwendet, entsteht im Zuge der Nanopräzipitation. Dieses Fällungsaggregat besteht erfindungsgemäß aus einem Matrixpolymer, worin weitere polymere Substanzen wie auch pharmazeutisch aktive Substanzen teilweise oder vollständig eingebettet sein können. Es kann hierbei eine gleichmäßige oder ungleichmäßige Verteilung der co-verkapselten Substanzen im Matrixpolymer vorliegen.According to the invention, this precipitating aggregate consists of a matrix polymer in which further polymeric substances as well as pharmaceutically active substances can be partially or completely embedded in. A uniform or uneven distribution of the coagulum may be present. encapsulated substances in the matrix polymer.
Ein "Anker", wie hier verwendet, beschreibt eine ionische Teilstruktur des modifizierenden Agens, welche die Immobilisierung und somit Lokalisation des modifizierenden Agens auf der geladenen Partikeloberfläche durch ionische Wechselwirkungen zwischen entgegengesetzt geladenen Verbindungen ermöglicht. Ladungstitration beschreibt den über Zetapotentialmessung nachvollziehbaren Prozess der elektrostatischen Kopplung des Ankers auf der Partikeloberfläche. Der geladene Anker verändert dabei das Zetapotentials des Partikels hin zur Ladung des Ankers.An "anchor", as used herein, describes an ionic moiety of the modifying agent that allows immobilization and thus localization of the modifying agent on the charged particle surface by ionic interactions between oppositely charged compounds. Charge titration describes the process of electrostatic coupling of the armature on the particle surface that can be traced by zeta potential measurement. The charged anchor changes the zeta potential of the particle towards the charge of the anchor.
Tenside im Sinne der Erfindung sind zum einen oberflächenaktive Substanzen, welche die Grenzflächenspannung zwischen zwei nicht mischbaren Phasen erniedrigen, wodurch eine Stabilisierung kolloidaler Dispersionen möglich ist. Weiterhin kann es sich bei Tensiden erfindungsgemäß um jede Art von Substanzen handeln, welche in der Lage sind, kolloidale Dispersionen sterisch und / oder elektrostatisch zu stabilisieren.Surfactants according to the invention are, on the one hand, surface-active substances which lower the interfacial tension between two immiscible phases, which makes it possible to stabilize colloidal dispersions. Furthermore, according to the invention, surfactants can be any type of substances which are capable of sterically and / or electrostatically stabilizing colloidal dispersions.
Der Begriff „aktives Targeting" wird verwendet, wenn gewebs- oder zellspezifische Liganden für eine gezielte Anreicherung zum Einsatz kommen. Aktive Liganden können sowohl an Wirkstoffen direkt (Ligand-Wirkstoff- Konjugate) als auch auf die Oberfläche kolloidaler Trägersysteme gekoppelt werden.The term "active targeting" is used when tissue- or cell-specific ligands are used for targeted enrichment, and active ligands can be coupled both directly to drugs (ligand-drug conjugates) and to the surface of colloidal carrier systems.
Der Begriff „passives Targeting" wird verwendet, wenn sich die Verteilung des Wirkstoffs aufgrund (unspezifischer) physikalischer, biochemischer oder immunologischer Vorgänge ergibt. In erster Linie wird der Enhanced Permeation and Retention-Effekt (kurz EPR- Effekt) dafür verantwortlich gemacht. Es handelt sich hierbei um einen passiven Anreicherungsmechanismus, welcher die strukturellen Besonderheiten von tumorösem oder auch entzündetem Gewebe ausnutzt [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56(7): 1023- 1050].The term "passive targeting" is used when the distribution of the active ingredient is due to (nonspecific) physical, biochemical or immunological processes, primarily due to the enhanced permeation and retention effect (EPR effect) this is a passive enrichment mechanism that exploits the structural peculiarities of tumorous or inflamed tissue [Ulbrich K., Subr V., Adv. Drug Deliv. Rev., 2004; 56 (7): 1023-1050].
Der Begriff Oberflächenpotential", auch als Oberflächenladung bezeichnet, ist gleichbedeutend mit dem Begriff "Zetapotential". Dieses Zetapotential wird mittels der Methode der Laser-Doppler-Anemometrie (LDA) bestimmt. Das Oberflächenpotential, auch als Zetapotential bezeichnet, gibt das Potential eines wandernden Teilchens an der Scherebene an, d. h. wenn durch Bewegung des Teilchens der größte Teil der diffusen Schicht abgeschert worden ist. Das Oberflächenpotential wurde mit dem Verfahren der Laser- Doppler-Anemometrie unter Verwendung eines "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments) bestimmt.The term "surface potential", also referred to as surface charge, is synonymous with the term "zeta potential." This zeta potential is determined by the method of laser Doppler anemometry (LDA). The surface potential, also referred to as zeta potential, indicates the potential of a migrating particle at the shear plane, ie when most of the diffuse layer has been sheared off by movement of the particle. The surface potential was determined by the method of laser Doppler anemometry using a "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments).
Mittels der Methode der Laser-Doppler-Anemometrie wird die Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel im elektrischen Feld bestimmt. Teilchen mit einer geladenen Oberfläche wandern in einem elektrischen Feld zur entgegengesetzt geladenen Elektrode, wobei dieBy means of the method of laser Doppler anemometry, the migration speed of the particles in the electric field is determined. Particles with a charged surface migrate in an electric field to the oppositely charged electrode, wherein the
Wanderungsgeschwindigkeit der Partikel von der Menge der Oberflächenladungen und der angelegten Feldstärke abhängig ist. Zur Bestimmung der Wanderungsgeschwindigkeit werden im elektrischen Feld wandernde Teilchen mit einem Laser bestrahlt und das gestreute Laserlicht detektiert. Durch die Bewegung der Teilchen wird eine Frequenzverschiebung beim reflektierten Licht im Vergleich zum eingestrahlten Licht gemessen. Der Betrag dieser Frequenzverschiebung ist abhängig von der Wanderungsgeschwindigkeit und wird als so genannte Doppler-Frequenz bezeichnet (Doppler-Effekt). Aus der Doppler-Frequenz, dem Streuwinkel und der Wellenlänge kann die Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens abgeleitet werden. Die elektrophoretische Mobilität ergibt sich aus dem Quotienten der Wanderungsgeschwindigkeit und der elektrischen Feldstärke. Das Produkt aus elektrophoretischer Mobilität und dem Faktor 13 entspricht dem Zetapotential, dessen Einheit [mV] ist.Migration rate of the particles depends on the amount of surface charges and the applied field strength. To determine the migration speed, particles traveling in the electric field are irradiated with a laser and the scattered laser light is detected. As a result of the movement of the particles, a frequency shift in the reflected light is measured in comparison to the incident light. The amount of this frequency shift is dependent on the rate of migration and is referred to as the so-called Doppler frequency (Doppler effect). From the Doppler frequency, the scattering angle and the wavelength, the migration speed of a particle can be derived. The electrophoretic mobility results from the quotient of the migration speed and the electric field strength. The product of electrophoretic mobility and factor 13 corresponds to the zeta potential, the unit of which is [mV].
Die Messungen (n=5) wurden mit einem Zetasizer Advanced 3000 und einem Zetamaster der Firma Malvern Instruments Ltd. (Worcestershire, England) nach Verdünnen in elektrolytarmen Dispersionsmedium (MiIIiQ Wasser: Widerstandswert 18,2 MΩ.cm, 25 0C und TOC-Gehalt (gesamter organischer Kohlenstoff) <10 ppb) und unter definiertem pH Wert (pH 6,8-7,0) durchgeführt. Als Software wurden PCS V1.41/ PCS V1.51 Rev. verwendet. Die Kontrollmessungen des Zetapotentials erfolgten mit Latex-Standardpartikeln der Firma Malvern Instruments Ltd. (-50 mV ± 5 mV). Die Messungen wurden unter den Standardeinstellungen der Firma Malvern Instruments Ltd. durchgeführt.The measurements (n = 5) were carried out with a Zetasizer Advanced 3000 and a Zetamaster from Malvern Instruments Ltd. (Worcestershire, England) after dilution in low-electrolyte dispersion medium (MiIIiQ water: resistance 18.2 MΩ.cm, 25 0 C and TOC content (total organic carbon) <10 ppb) and at a defined pH (pH 6.8-7 , 0). The software used was PCS V1.41 / PCS V1.51 Rev. The control measurements of the zeta potential were made with standard latex particles of Company Malvern Instruments Ltd. (-50 mV ± 5 mV). The measurements were made under the standard settings of Malvern Instruments Ltd. carried out.
Die Größe der Nanopartikel wurde mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (Dynamic Light Scattering, DLS) unter Verwendung eines "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments) bestimmt. Zusätzlich wurden Aufnahmen im Raster- Elektronen-Mikroskop (REM) gemacht, wie in Fig. 12 beispielhaft gezeigt wird. Die Figur 12 (Fig. 12) bestätigt auch die kugelförmige Gestalt der Nano-partikel.The size of the nanoparticles was determined by Dynamic Light Scattering (DLS) using a "Zetasizer 3000" (Malvern Instruments). In addition, images were taken in the scanning electron microscope (SEM), as shown by way of example in FIG. Figure 12 (Figure 12) also confirms the spherical shape of the nanoparticles.
Die Bestimmung der Partikelgröße durch DLS beruht auf dem Prinzip der Photonenkorrelationsspektroskopie (Photon Correlation Spectroscopy, PCS). Dieses Verfahren eignet sich zur Vermessung von Partikeln mit einer Größe im Bereich von 3 nm bis 3 μm. Die Partikel unterliegen in Lösung einer ungerichteten Bewegung, ausgelöst durch die Kollision mit Flüssigkeitsmolekülen des Dispersionsmittels, deren treibende Kraft die Brown'sche Molekularbewegung ist. Die resultierende Bewegung der Partikel ist umso schneller, je kleiner ihr Partikeldurchmesser ist. Wird eine Probe in einer Küvette mit Laserlicht bestrahlt, so kommt es an den sich ungerichtet bewegenden Partikeln zur Streuung des Lichts. Durch diese Bewegung der Partikel ist die Streuung nicht konstant, sondern schwankt über die Zeit. Die im 90°-Winkel detektierten Schwankungen der Intensität des gestreuten Laserlichts sind umso stär-ker, je schneller sich die Partikel bewegen, d.h. je kleiner sie sind. Auf der Grundlage dieser Intensitätsschwankungen kann man mit Hilfe einer Autokorrelationsfunktion auf die Partikelgröße schließen. Der mittlere Teilchendurchmesser wird aus dem Abfall der Korrelationsfunktion berechnet. Zur korrekten Berechnung des mittleren Teilchendurchmessers sollten die Partikel eine kugelförmige Gestalt haben, was sich durch REM-Aufnahmen überprüfen lässt (siehe oben), nicht sedimentieren oder flotieren. Die Messungen wurden durchgeführt mit Proben in geeigneter Verdünnung, unter einer konstanten Temperatur von 25°C sowie einer definierten Viskosität der Lösung. Es erfolgte eine Kalibrierung des Messgerätes mit Standardlatexpartikeln unterschiedlicher Größe der Firma Malvern Instruments Ltd. Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen (REM-Aufnahmen) zur Bestimmung der Teilchengröße wurde mit einem Feldemissions- Rasterelektronenmikroskop vom Typ XL-30-SFEG der Firma FEI (Kassel, Deutschland) angefertigt. Vorab wurden die Proben in einem Hochvakuum- Sputter 208 HR der Firma Cressington (Watford, England) mit einer 5 nm Gold- Palladium Schicht gesputtert.The determination of the particle size by DLS is based on the principle of Photon Correlation Spectroscopy (PCS). This method is suitable for measuring particles with a size in the range of 3 nm to 3 μm. The particles, in solution, undergo an undirected motion caused by the collision with liquid molecules of the dispersant whose driving force is Brownian motion. The resulting particle motion is faster, the smaller their particle diameter. If a sample in a cuvette is irradiated with laser light, the particles scattered by the non-directionally moving particles will scatter the light. Due to this movement of the particles, the scattering is not constant, but fluctuates over time. The fluctuations of the intensity of the scattered laser light detected at 90 ° are the stronger the faster the particles move, ie the smaller they are. Based on these intensity variations, one can conclude the particle size using an autocorrelation function. The mean particle diameter is calculated from the slope of the correlation function. For the correct calculation of the average particle diameter, the particles should have a spherical shape, which can be checked by SEM images (see above), do not sediment or float. The measurements were carried out with samples in appropriate dilution, at a constant temperature of 25 ° C and a defined viscosity of the solution. The measuring device was calibrated with standard latex particles of different sizes from Malvern Instruments Ltd. The scanning electron micrographs (SEM images) for determining the particle size were prepared using a field emission scanning electron microscope of the type XL-30-SFEG from FEI (Kassel, Germany). In advance, the samples were sputtered in a high vacuum sputter 208 HR from Cressington (Watford, England) with a 5 nm gold-palladium layer.
Die Löslichkeit eines Stoffes gibt an, ob und in welchem Umfang ein Reinstoff in einem Lösungsmittel gelöst werden kann. Sie bezeichnet also die Eigenschaft eines Stoffes, sich unter homogener Verteilung (als Atome, Moleküle oderThe solubility of a substance indicates whether and to what extent a pure substance can be dissolved in a solvent. It thus designates the property of a substance under homogeneous distribution (as atoms, molecules or
Ionen) mit dem Lösungsmittel zu vermischen. Die Löslichkeit einer Verbindung wird als die Konzentration einer gesättigten Lösung bestimmt, die sich mit dem ungelösten Bodensatz im Gleichgewicht befindet in Abhängigkeit der Temperatur (Raum Temperature). Eine schwer lösliche Verbindung weist eineIons) with the solvent. The solubility of a compound is determined to be the concentration of a saturated solution that is in equilibrium with the undissolved sediment as a function of temperature (space temperature). A poorly soluble compound has a
Löslichkeit < 0,1 mol/l auf, eine mäßig lösliche zwischen 0,1 -1 mol/l und eine leicht lösliche Verbindung > 1 mol/l. Solubility <0.1 mol / l, a moderately soluble between 0.1 -1 mol / l and a slightly soluble compound> 1 mol / l.
Die Erfindung soll nun im Folgenden in den Beispielen weiter beschrieben werden, ohne darauf beschränkt zu sein.The invention will now be further described below in the examples, without being limited thereto.
BeispieleExamples
Beispiel 1 : Herstellung von PBCA mittels anionischer PolymerisationExample 1: Preparation of PBCA by means of anionic polymerization
Für die PBCA-Herstellung mittels anionischer Polymerisation von Butylcyanoacrylat (BCA) wird Sicomet 6000 verwendet. Der Polymerisationsprozess erfolgt durch langsames, permanentes Zutropfen von insgesamt 2,5% [m/v] BCA in eine 1 %-ige [m/v] Triton X-100 Lösung bei pH 2,2. Der pH-Wert wird mit Hilfe einer 0,1 N-HCI-Lösung zuvor eingestellt. Die entstehende Dispersion wird unter Kühlung im Eisbad (ca. 4°C) über 4 Stunden konstant bei 450 U/min gerührt. Anschließend werden größere Agglomerate durch Filtration über einen Papier-Faltenfilter abgetrennt. Durch Zusatz von Ethanol wird das zu PBCA polymerisierte BCA ausgefällt und der davon gewonnene Filterrückstand mehrere Male mit gereinigtem Wasser (MiIIiQ- System) gewaschen. Nach der Trocknung des PBCA-Filterrückstandes im Trockenschrank bei 400C über 24 h wird mittels GPC ein durchschnittliches Molekulargewicht bestimmt (Mn ~ 2000 Da). Es werden Polysterolstandards verwendet.Sicomet 6000 is used for PBCA production by anionic polymerization of butyl cyanoacrylate (BCA). The polymerization process is carried out by slow, permanent dropping of a total of 2.5% [m / v] BCA into a 1% [m / v] Triton X-100 solution at pH 2.2. The pH is previously adjusted by means of a 0.1 N HCl solution. The resulting dispersion is stirred while cooling in an ice bath (about 4 ° C) for 4 hours constantly at 450 U / min. Subsequently, larger agglomerates are separated by filtration through a paper-pleated filter. By adding ethanol, the BCA polymerized to PBCA is precipitated and the filter residue obtained is washed several times with purified water (MiIIiQ system). After drying of the filter residue PBCA in a drying oven at 40 0 C for 24 h has an average molecular weight is determined (Mn ~ 2000 Da) by GPC. Polystyrene standards are used.
Beispiel 2: Herstellung von funktionalisierten PBCA-Nanopartikeln durch NanopräzipitationExample 2: Preparation of Functionalized PBCA Nanoparticles by Nanoprecipitation
i) PBCA-P(DMAEMA) Nanopartikeli) PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles
Es werden 500 μl einer 2%-igen acetonischen PBCA-Lösung [m/v] mit 100 μl einer 2%-igen acetonischen P(DMAEMA)-Lösung [m/v] unter Verschluss (um ein Abdampfen des Acetons zu verhindern) mittels eines Standard- Laborschüttlers gut durchmischt. Das dafür verwendete PBCA wird gemäß Beispiel 1 hergestellt. Zu diesem Polymergemisch werden je 100 μl der im folgenden beschriebenen Farbstofflösungen zugesetzt. Farbstofflösunq a: 3 mg des Indocyaningrün werden in 300 μl gereinigtem Wasser im Ultraschallbad vorgelöst und dann mit 700 μl Aceton versetzt. Farbstofflösunq b. c. d: Die Farbstoffe DODC, IDCC und Cumarin 6 werden in einer 0,02%-igen acetonischen Lösung [m/v] eingesetzt.500 μl of a 2% acetone PBCA solution [m / v] are added with 100 μl of a 2% acetone P (DMAEMA) solution [m / v] under occlusion (to prevent evaporation of the acetone) of a standard laboratory shaker. The PBCA used for this is prepared according to Example 1. 100 μl each of the dye solutions described below are added to this polymer mixture. Dye solubility a: 3 mg of indocyanine green are pre-dissolved in 300 μl of purified water in an ultrasonic bath and then treated with 700 μl of acetone. Dye solubility bc d: The dyes DODC, IDCC and coumarin 6 are used in a 0.02% acetone solution [m / v].
Das durchmischte Farbstoff-Polymergemisch wird mit einer 2,5 ml Eppendorfpipette aufgenommen und in 10 ml einer intensiv gerührten 1%-igen [m/v] Synperonic T707 Lösung einpipettiert. Die Nanopartikeldispersion wird für 2 h bei 600 U/min (Standard Magnetrührer) und für weitere 16 h bei 100 U/min zum vollständigen Abdampfen des Lösungsmittels gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Zentrifugation in Eppendorf-Caps. Jeweils 1 ml der Partikeldispersion und 0,5 ml einer 1%-igen [m/v] CETAC-Lösung (Cetyltrimethylammoniumchlorid-Lösung) werden nach Durchmischung für 10 min bei 14000 UpM (auf einer Sigma 2 K 15 Laborzentrifuge) zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, die Partikel in der 1%-igen CETAC-Lösung redispergiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschprozess wird drei mal wiederholt, wobei zum Schluss die Partikel in einer 1%-igen Lösung Synperonic T707 aufgenommen werden.The mixed dye-polymer mixture is taken up with a 2.5 ml Eppendorf pipette and pipetted into 10 ml of an intensely stirred 1% [m / v] Synperonic T707 solution. The nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent. The workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps. In each case 1 ml of the particle dispersion and 0.5 ml of a 1% [m / v] CETAC solution (cetyltrimethylammonium chloride solution) are centrifuged after mixing for 10 min at 14000 rpm (on a Sigma 2 K 15 laboratory centrifuge). The supernatant is removed, the particles are redispersed in the 1% CETAC solution and recentrifuged. This washing process is repeated three times, and finally the particles are taken up in a 1% solution of Synperonic T707.
H) PBCA-tPEI-IDCCJ-NanopartikelH) PBCA-tPEI-IDCCJ nanoparticles
Es werden 500 μl einer 2%-igen acetonischen PBCA-Lösung [m/v] mit PEI 1 ,8 kDa in Isopropanol (2% [m/v]) verwendet. Es werden je 100 μ\ der unter i) genannten Farbstofflösungen a-d verwendet. Das durchmischte Farbstoff-Polymergemisch wird mit einer 2,5 ml Eppendorfpipette aufgenommen und in 10 ml einer intensiv gerührten 1%-igen Triton X-100 Lösung einpipettiert. Die Nanopartikeldispersion wird für 2 h bei 600 U/min (Standard Magnetrührer) und für weitere 16 h bei 100 U/min zum vollständigen Abdampfen des Lösungsmittels gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Zentrifugation in Eppendorf-Caps. Jeweils 1 ml der Partikeldispersion und 0,5 ml einer 1%-igen [m/v] CETAC-Lösung (Cetyltrimethylammoniumchlorid- Lösung) werden nach Durchmischung für 10 min bei 14000 UpM (auf einer Sigma 2 K 15 Laborzentrifuge) zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, die Partikel in der 1%-igen CETAC-Lösung redispergiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschprozess wird drei mal wiederholt, wobei zum Schluss die Partikel in einer 1 %-igen Lösung Triton X-100 aufgenommen werden.500 μl of a 2% acetone PBCA solution [m / v] with PEI 1.8 kDa in isopropanol (2% [m / v]) are used. There are used per 100 μ \ of the dye solutions ad mentioned under i). The mixed dye-polymer mixture is taken up with a 2.5 ml Eppendorf pipette and pipetted into 10 ml of an intensely stirred 1% Triton X-100 solution. The nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent. The workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps. In each case 1 ml of the particle dispersion and 0.5 ml of a 1% [m / v] CETAC solution (cetyltrimethylammonium chloride solution) are centrifuged after mixing for 10 min at 14000 rpm (on a Sigma 2 K 15 laboratory centrifuge). The supernatant is removed, the particles are redispersed in the 1% CETAC solution and recentrifuged. This washing process is repeated three times, and finally the particles are taken up in a 1% Triton X-100 solution.
iii) PLGA- P(DMAEMA)-Nanopartikel Es werden 500 μl einer 2%-igen acetonischen PLGA-Lösung [m/v] mit 100 μl P(DMAEMA) in Aceton (2% [m/v]) verwendet. Es werden je 100 μl der unter i) genannten Farbstofflösungen a-d verwendet.iii) PLGA-P (DMAEMA) nanoparticles 500 μl of a 2% acetone PLGA solution [m / v] with 100 μl of P (DMAEMA) in acetone (2% [m / v]) are used. In each case, 100 μl of the dye solutions a-d mentioned under i) are used.
Das durchmischte Farbstoff-Polymergemisch wird mit einer 2,5 ml Eppendorfpipette aufgenommen und in 10 ml einer intensiv gerührten 1 %-igen Synperonic T707 Lösung einpipettiert. Die Nanopartikeldispersion wird für 2 h bei 600 U/min (Standard Magnetrührer) und für weitere 16 h bei 100 U/min zum vollständigen Abdampfen des Lösungsmittels gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Zentrifugation in Eppendorf-Caps. Jeweils 1 ml der Partikeldispersion und 0,5 ml einer 1 %-igen [m/v] CETAC-Lösung (Cetyltrimethylammoniumchlorid- Lösung) werden nach Durchmischung für 10 min bei 14000 UpM (auf einer Sigma 2 K 15 Laborzentrifuge) zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, die Partikel in der 1%-igen CETAC-Lösung redispergiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschprozess wird drei mal wiederholt, wobei zum Schluss die Partikel in einer 1 %-igen Lösung Synperonic T707 aufgenommen werden.The mixed dye-polymer mixture is taken up in a 2.5 ml Eppendorf pipette and pipetted into 10 ml of an intensively stirred 1% Synperonic T707 solution. The nanoparticle dispersion is stirred for 2 h at 600 rpm (standard magnetic stirrer) and for a further 16 h at 100 rpm for complete evaporation of the solvent. The workup is carried out by centrifugation in Eppendorf Caps. In each case 1 ml of the particle dispersion and 0.5 ml of a 1% [m / v] CETAC solution (cetyltrimethylammonium chloride solution) are centrifuged after mixing for 10 min at 14000 rpm (on a Sigma 2 K 15 laboratory centrifuge). The supernatant is removed, the particles are redispersed in the 1% CETAC solution and recentrifuged. This washing process is repeated three times, and finally the particles are taken up in a 1% solution of Synperonic T707.
Beispiel 3: Beeinflussung der Nanopräzipitation durch Veränderung des Polymergehaltes in der TensidphaseExample 3: Influence of Nanoprecipitation by Changing the Polymer Content in the Surfactant Phase
In Fig. 1 ist dargestellt, dass die Partikelgröße der PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikel während der Herstellung durch Variation der Polymerkonzentration gesteuert werden kann. Die Stabilisierung der PBCA-P(DMAEMA) Nanopartikel, welche gemäß Beispiel 2 hergestellt werden, erfolgt mit dem Tensid Synperonic T707. Während der Partikelherstellung (Nanopräzipitation) wird das in die Tensidphase injizierte Volumen der organischen Polymerlösung konstant gehalten und nur die Polymerkonzentration entsprechend verändert. Alle weiteren Herstellungsbedingungen (Tensidkonzentration, Polymerverhältnis PBCA: P(DMAEMA)=I 0:1 , Farbstoff konzentration, Temperatur,FIG. 1 shows that the particle size of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles can be controlled during production by varying the polymer concentration. The stabilization of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles, which are prepared according to Example 2, is carried out with the surfactant Synperonic T707. During particle production (nanoprecipitation), the volume of the organic polymer solution injected into the surfactant phase is kept constant and only the polymer concentration is changed accordingly. All other production conditions (surfactant concentration, polymer ratio PBCA: P (DMAEMA) = I 0: 1, dye concentration, temperature,
Rührgeschwindigkeit / Rührfisch, Gefäß, Art der Injektion) bleiben konstant. Die Verwendung einer geringeren Polymerkonzentration in der Tensidphase während der Fällung führt zu kleineren Partikeldurchmessern. Über den untersuchten Zeitraum wurde keine Veränderung der Partikelgröße bei gleichem Polymergehalt festgestellt.Stirring speed / stirrer, vessel, type of injection) remain constant. The use of a lower polymer concentration in the surfactant phase during the precipitation results in smaller particle diameters. Over the period studied, no change in particle size was observed for the same polymer content.
Beispiel 4: Kationisch funktionalisierte PartikelExample 4: Cationically Functionalized Particles
Die kationisch funktionalisierten Partikel werden gemäß Beispiel 2 hergestellt. In Fig. 2 sind die Partikeldurchmesser als auch das Zetapotential von PBCA- [PEI-I DCC]-Nanopartikeln dargestellt, welche entweder durch das Tensid Triton X-100 oder Pluronic F 68 stabilisiert werden. Aufgrund der Verkapselung des Polykations Polyethylenimin in die PBCA-Matrix weisen die Partikel ein positives Zetapotential zwischen 30 mV und 40 mV auf. Sowohl die Partikelgröße als auch das Zetapotential sind vor und nach Aufarbeitung der Partikel (Waschprozeß) konstant, Beleg für eine gute Stabilität der Partikel.The cationically functionalized particles are prepared according to Example 2. FIG. 2 shows the particle diameter as well as the zeta potential of PBCA [PEI-I DCC] nanoparticles, which are stabilized by either the Triton X-100 or Pluronic F 68 surfactant. Due to the encapsulation of the polycation polyethylenimine in the PBCA matrix, the particles have a positive zeta potential between 30 mV and 40 mV. Both the particle size and the zeta potential are constant before and after processing of the particles (washing process), evidence of a good stability of the particles.
Beilspiel 5: Elektrostatische Oberflächenmodifikation von PBCA-[PEI- IDCC]-Nanopartikel mit GIu(10)-b-PEG(110)Supplement 5: Electrostatic surface modification of PBCA [PEI-IDCC] nanoparticles with Glu (10) -b-PEG (110)
Die hier verwendeten PBCA-[PEI-IDCC] Nanopartikel werden gemäß Beispiel 2 hergestellt.The PBCA [PEI-IDCC] nanoparticles used here are prepared according to Example 2.
Zur Modifikation der Partikeloberfläche wird die wässrige, stabile Nanopartikeldispersion in einem geeigneten Mengenverhältnis mit dem in Wasser gelösten modifizierenden Agens vermischt. Die Bestimmung des geeigneten Mengenverhältnisses erfolgt durch schrittweise Titration der Partikeldispersion mit dem modifizierenden Agens. Das Ausmaß der elektrostatischen Oberflächenmodifikation (Ladungstitration) wird durch Bestimmung des Zetapotentials kontrolliert. Dargestellt ist in Fig. 3 die Veränderung des Zetaptentials von +25 mV auf ca. -30 mV durch schrittweise Zugabe des modifizierenden Agens (GIu(10)-b- PEG(H O)) zur Partikeldispersion (Ladungstitration).In order to modify the particle surface, the aqueous, stable nanoparticle dispersion is mixed in a suitable quantitative ratio with the modifying agent dissolved in water. The determination of the appropriate quantitative ratio is carried out by stepwise titration of the particle dispersion with the modifying agent. The degree of electrostatic surface modification (charge titration) is controlled by determining the zeta potential. The change in the zeta-potential from +25 mV to about -30 mV is illustrated in FIG. 3 by stepwise addition of the modifying agent (Glu (10) -b-PEG (HO)) for particle dispersion (charge titration).
Beispiel 6: R E M -Aufnahmen von PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikeln beladen mit verschiedenen FluoreszenzfarbstoffenExample 6: R E M images of PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles loaded with different fluorescent dyes
Die mit den Farbstoffen Diethyloxadicarbocyanin (DODC) sowie Cumarin 6 beladenen P BCA-P(DMAEMA) werden gemäß Beispiel 2 hergestellt.The loaded with the dyes diethyloxadicarbocyanine (DODC) and coumarin 6 P BCA-P (DMAEMA) are prepared according to Example 2.
In Fig. 4 ist eine REM-Aufnahme von DODC-beladenen PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikeln dargestellt.FIG. 4 shows an SEM image of DODC-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
In Fig. 5 ist eine REM-Aufnahme von Cumarin 6 beladenen PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikeln dargestellt.FIG. 5 shows an SEM micrograph of coumarin-6-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
Beispiel 7: ZellkulturversucheExample 7: Cell culture experiments
Die Kultivierung der HeLa-Zelllinie erfolgt in 225 cm2 Kulturflaschen bei 37 0C und 5% CO2 in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) unter Zusatz vonCultivation of the HeLa cell line is carried out in 225 cm 2 culture flasks at 37 ° C. and 5% CO 2 in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) with the addition of
10% fötalem Kälbermedium (FCS) und 2 mM L-Glutamin. Auf antibiotische10% fetal calf medium (FCS) and 2 mM L-glutamine. On antibiotic
Zusätze (Penicillin / Streptamycin) wird verzichtet, um die Zellprozesse möglichst wenig zu beeinflussen. Die Zellen werden regelmäßig passagiert und eine Aussaat zu Versuchszwecken erfolgt 24 h vor Beginn der Untersuchungen. Für die Untersuchungen werden die Zellen in 96-Wellplatten der FirmaAdditives (penicillin / streptamycin) are dispensed with in order to influence the cell processes as little as possible. The cells are passaged regularly and sowed for experimental purposes 24 hours before the start of the investigations. For the investigations, the cells are in 96-well plates of the company
Falcon/Becton Dickinson ausgesät.Seeded Falcon / Becton Dickinson.
Vor Versuchsbeginn erfolgt eine optische Kontrolle bezüglich der Vitalität bzw. typischen Morphologie der Zellen. Anschließend wird das FCS-haltige Medium abgesaugt und durch 50 μl serumfreies Medium ersetzt.Before the start of the test, a visual check is carried out regarding the vitality or typical morphology of the cells. Subsequently, the FCS-containing medium is aspirated and replaced with 50 .mu.l of serum-free medium.
Nach einer maximal 60-minütigen Inkubationszeit einer Nanopartikeldispersion, welche gemäß Beispiel 2 hergestellt wird, wird die überstehende Partikeldispersion abgesaugt und die Zellen mit PBS 2-3 mal gewaschen. Zum Anfärben der Mitochondrien wird der zuvor in Medium verdünnte Farbstoff MitoTracker Red CMXRos der Firma Molecular Probes Europe BV, Leiden (NL) (0,25μl/ml) verwendet. Die Inkubation mit 50 μl der Farbstofflösung erfolgt für 15 min im Brutschrank (37°C, 5% CO2). Anschließend wird die Farbstofflösung abgesaugt und die Zellen 2-3 mal mit PBS gewaschen. Die Fixierung der Zellen erfolgt mit 100 μl 1 ,37% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur. Nach Absaugen der Fixierlösung werden die Zellen 2-3 mal mit PBS gewaschen. Die Zellkernfärbung erfolgt bei den bereits fixierten Zellen mit Höchst 33342. Dafür werden 100 μl der in PBS verdünnten Farbstofflösung (2 μg/ml) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Farbstofflösung werden die Zellen mit 100 μl PBS 2-3mal gewaschen. Die fixierten Platten werden bis zur fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung mit 200 μl PBS/Well lichtgeschützt im Kühlschrank bei 8°C aufbewahrt.After a maximum of 60 minutes incubation time of a nanoparticle dispersion, which is prepared according to Example 2, the supernatant Particle dispersion aspirated and the cells washed with PBS 2-3 times. For staining the mitochondria, the MitoTracker Red CMXRos dye, previously diluted in medium, from Molecular Probes Europe BV, Leiden (NL) (0.25 μl / ml) is used. Incubation with 50 μl of the dye solution takes place in the incubator for 15 min (37 ° C., 5% CO 2). The dye solution is then filtered off with suction and the cells are washed 2-3 times with PBS. The fixation of the cells is carried out with 100 ul of 1, 37% formaldehyde for 10 min at room temperature. After aspirating the fixing solution, the cells are washed 2-3 times with PBS. Nuclear staining takes place on the already fixed cells with a maximum of 33342. For this purpose, 100 μl of the dye solution diluted in PBS (2 μg / ml) are incubated for 10 min at room temperature. After removal of the dye solution, the cells are washed with 100 μl PBS 2-3 times. The fixed plates are stored in the refrigerator until the fluorescence microscopic examination with 200 .mu.l PBS / Well protected from light in the refrigerator at 8 ° C.
Beispiel 8: Einfluss funktionalisierter Partikeloberflächen auf die ZellaufnahmeExample 8: Influence of functionalized particle surfaces on cell uptake
Tab. 1 : Partikeldurchmesser dhyd, Polydispersitätsindex und ZetapotentialTab. 1: particle diameter d hy d, polydispersity index and zeta potential
(nicht)-funktionalisierter Cumarin 6 beladener PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikel (NP)(non) functionalized coumarin 6-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles (NP)
Die in Beispiel 8 verwendeten Nanopartikel werden gemäß Beispiel 2 hergestellt. Unmodifiziert bzw. nach elektrostatischer Oberflächenmodifikation mit Folsäure oder GIu(10)-b-PEG(1 10) weisen die Partikel die in der Tabelle 1 gelisteteten Eigenschaften auf. In der für den Versuch verwendeten 96-Wellplatte haben alle Wells die gleiche Zelldichte (Aussaat 24 h vor Versuch: 1x104 Zellen). Inkubiert wird eine konstante Partikelkonzentration der in der Tabelle (Tab. 1) aufgeführten Partikel über einen Zeitraum von 60 Minuten im Brutschrank. Anschließend werden die Zellen gewaschen, fixiert und am Folgetag vermessen. Die Aufnahme der fluoreszierenden Zellen erfolgt mit einem automatischen Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung und konstanter Belichtungszeit (siehe Fig. 6). Anhand von Fig. 6 wird gezeigt, wie durch unterschiedliche Oberflächeneigenschaften von ein-und derselben Nanopartikelcharge das Zellaufnahmeverhalten beeinflusst wird. Unmodifizierte Partikel in Reihe 1.) mit einem kationischem Oberflächenpotential zeigen eine höhere Affinität zur Zelloberfläche, erkennbar am stärkeren Fluoreszenzkontrast auf bzw. in den Zellen. Die ebenso effektive Internalisierung von Partikeln mit negativem Oberflächenpotential nach Titration mit GIu(10)-b-PEG(110) kann anhand des vergrößerten Ausschnittes der Zellen aus Reihe 3.) gezeigt werden.The nanoparticles used in Example 8 are prepared according to Example 2. Unmodified or after electrostatic surface modification with folic acid or Glu (10) -b-PEG (110), the particles have the properties listed in Table 1. In the 96-well plate used for the experiment all wells have the same cell density (sowing 24 h before experiment: 1x10 4 cells). A constant particle concentration of the particles listed in the table (Table 1) is incubated in the incubator over a period of 60 minutes. Subsequently, the cells are washed, fixed and measured on the following day. The uptake of the fluorescent cells is carried out with an automatic fluorescence microscope at 20 × magnification and constant exposure time (see FIG. 6). 6 shows how the cell uptake behavior is influenced by different surface properties of one and the same batch of nanoparticles. Unmodified particles in series 1.) with a cationic surface potential show a higher affinity for the cell surface, recognizable by the stronger fluorescence contrast on or in the cells. The equally effective internalization of particles with negative surface potential after titration with Glu (10) -b-PEG (110) can be shown by the enlarged section of the cells from row 3.).
Beispiel 9: Zellaufnahmeverhalten GIu(10)-b-PEG(110) modifizierter PBCA P(DMAEMA)-NanopartikelExample 9: Cell uptake behavior of GIu (10) -b-PEG (110) modified PBCA P (DMAEMA) nanoparticles
Die in Beispiel 9 verwendeten Nanopartikel werden gemäß Beispiel 2 hergestellt. Nach elektrostatischer Oberflächenmodifikation mit GIu(10)-b- PEG(HO) wird das Zellaufnahmeverhalten der Partikel (dhycι = 171 nm; ZP = -33 mV) untersucht. Die hell fluoreszierenden Punkte, bei welchen es sich um Endosomen oder Endolysosomen handelt, sind Beleg für eine effiziente Aufnahme der Nanopartikel in die Zelle mittels Endozytose (Fig. 7). Der Maßstab der Vergrößerung belegt, dass in dieser Aufnahme einzelne Partikel aufgrund ihrer Größe von weniger als 200 nm nicht sichtbar sein können. Eine Vielzahl von Partikeln innerhalb dieser Vesikel (Endosomen/Endolysosomen) verursachen den starken, punktförmigen Fluoreszenzkontrast im Cytoplasma. Die Zellaufnahme von PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikeln oberflächenmodifiziert mit GIu(10)-b-PEG(110) wird in Fig. 8 schematisch dargestellt. Beispiel 10: Anreicherung der GIu(10)-b-PEG(110) modifizierten PBCA P(DMAEMA)-Nanopartikel im ZellkernThe nanoparticles used in Example 9 are prepared according to Example 2. After electrostatic surface modification with Glu (10) -b-PEG (HO), the cell uptake behavior of the particles (d hyc ι = 171 nm, ZP = -33 mV) is investigated. The brightly fluorescent dots, which are endosomes or endolysosomes, are evidence of efficient uptake of the nanoparticles into the cell by endocytosis (Figure 7). The scale of the magnification proves that in this photograph individual particles can not be visible due to their size of less than 200 nm. A large number of particles within these vesicles (endosomes / endolysosomes) cause strong, punctate fluorescence contrast in the cytoplasm. Cell uptake of PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110) is shown schematically in FIG. Example 10: Enrichment of the GIu (10) -b-PEG (110) Modified PBCA P (DMAEMA) Nanoparticles in the Nucleus
Anhand der Aufnahme der mittleren Zellebene mit Hilfe des konfokalen Laser- Raster-Mikroskops (Fig. 9) kann gezeigt werden, dass eine partielle Anreicherung der Partikel im Zellkern stattfindet.On the basis of the recording of the central cell plane with the aid of the confocal laser scanning microscope (FIG. 9), it can be shown that partial accumulation of the particles takes place in the cell nucleus.
Beispiel 11 : Gesteigerte Partikelaufnahme bei Inkubation höherer PatikelkonzentrationExample 11: Increased particle uptake with incubation of higher particle concentration
Cumarin 6 beladene, GIu(10)-b-PEG(110) oberflächenmodifizierte PBCA- P(DMAEMA)-Partikel werden gemäß Beispiel 2 hergestellt. Es wird eine niedrige Partikelkonzentration 0,21 mg/ml (Fig. 10) und eine höhereCoumarin 6 loaded, Glu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles are prepared according to Example 2. There will be a low particle concentration of 0.21 mg / ml (Figure 10) and a higher
Partikelkonzentration von 0,85 mg/ml (Fig. 11) für den gleichen Zeitraum inkubiert auf den Zellen gemäß Beispiel 7 inkubiert. Fig. 11 zeigt im Verhältnis zu Fig. 10 eine gesteigerte Partikelaufnahme bei Inkubation einer höheren Patikelkonzentration.Incubated particle concentration of 0.85 mg / ml (Figure 11) incubated for the same period on the cells according to Example 7. Fig. 11 shows in relation to Fig. 10 an increased particle uptake with incubation of a higher particle concentration.
Beispiel 12: Charakterisierung der PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-NanopartikelExample 12: Characterization of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles
Dargestellt ist die Partikelgröße (Fig. 13) der für den Tierversuch verwendeten oberflächenmodifizierten PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-Nanopartikel über einen Zeitraum von 7 Tagen nach Herstellung für den Tierversuch. Die konstante Partikelgröße sowie der gleich bleibend niedrige Polydispersitätsindex (PkO, 1) als Merkmal für eine sehr enge Partikelgrößenverteilung sind Beweis für eine gute Stabilität der oberflächenmodifizierten Partikel.Shown is the particle size (Figure 13) of the surface-modified PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles used for the animal experiment over a period of 7 days after preparation for the animal experiment. The constant particle size and the consistently low polydispersity index (PkO, 1) as a feature of a very narrow particle size distribution are evidence of good stability of the surface-modified particles.
Anhand der REM-Auf nähme (Fig. 12) kann zusätzlich belegt werden, dass es sich um sphärische Nanopartikel mit einer Größe um 200 nm handelt. Mittels Ladungstitration wird die kationische Oberfläche der PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikel mit dem Blockcopolymer GIu(10)-b-PEG(1 10) modifiziert (siehe Fig. 14). Die als Zetapotential gemessene Oberflächenladung wird entsprechend von ca. +3OmV über den Neutralpunkt hinaus bis zum Erreichen des Dissoziations-Gleichgewichtes bei etwa -3OmV titriert. Die oberflächenmodifizierten PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-Partikel zeigen über den untersuchten Zeitraum von 7 Tagen nach Titration keine Veränderung des Zetapotentials. Im Zusammenhang mit der unveränderten Partikelgröße sowie dem konstant niedrigen PI kann somit eine gute Partikelstabilität belegt werden.Based on the SEM image (FIG. 12), it can additionally be shown that they are spherical nanoparticles with a size of about 200 nm. Charge titration is used to modify the cationic surface of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles with the block copolymer Glu (10) -b-PEG (110) (see FIG. 14). The surface charge measured as zeta potential is correspondingly titrated from approx. +3 ohms above the neutral point until reaching the dissociation equilibrium at approx. -3 oMV. The surface-modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] particles show no change in the zeta potential over the investigated period of 7 days after titration. In connection with the unchanged particle size and the constant low PI, a good particle stability can be proven.
In Fig. 15 sind die UV-Vis-Absorptionsspektren einer wässrigen ICG-Lösung als auch der ICG-Nanopartikeldispersion (gewaschen und ungewaschen) dargestellt. Indocyaningrün ist ein Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff, dessen Absorptions- und Emissionsspektrum im Wellenlängenbereich zwischen 650- 900 nm liegt. Die Komplexierung und Einkapselung von ICG mit Hilfe des kationischen Polyacrylates P(DMAEMA) führt zu einer minimalen bathochromen Verschiebung der beiden Wellenlängenmaxima.FIG. 15 shows the UV-Vis absorption spectra of an aqueous ICG solution as well as the ICG nanoparticle dispersion (washed and unwashed). Indocyanine green is a near-infrared fluorescent dye whose absorption and emission spectrum is in the wavelength range between 650-900 nm. The complexation and encapsulation of ICG using the cationic polyacrylate P (DMAEMA) leads to a minimal bathochromic shift of the two wavelength maxima.
Beispiel 13: TierversuchExample 13: Animal experiment
Die eingesetzten Tiere werden von der Firma Taconic M&B geliefert. Es handelt sich um weibliche Albino-Nacktmäuse vom Typ NMRI nude. Die ausgewachsenen Tiere besitzen nach ca. 8 Wochen ein Gewicht von 22-24 g. Fünf weiblichen Nacktmäusen werden 2x106 Zellen eines F9-Teratoms in die rechte hintere Flanke inokuliert. Die Zellen werden von der Firma ATCC / LGC Promochem GmbH bezogen. Es handelt sich um von der Maus stammende embryonale Zellen eines testinalen Teratokarzinoms, welches als Tumormodell für Krebsforschungszwecke in Mäusen verwendet wird. Nach 18 Tagen sind bei vier der fünf Mäuse Tumore mit einer durchschnittlichen Größe von ca. 0,5-1 cm Durchmesser gewachsen. Die Tiere werden für die erste Stunde des Versuches dauerhaft mit einer Rompun-Ketavet-Injektion in einer Dosis 100 μl / 10 g Tier anästhesiert. Die Injektionslösung besteht aus einem 1 :1 Gemisch einer 1 :10 Verdünnung Rompun bzw. 1 :5 Verdünnung Ketavet mit physiologischer Kochsalzlösung. Anschließend werden 200 μl der Nanopartikeldispersion in die Schwanzvene i.v. injiziert. Die nachfolgenden Narkosen erfolgen mit Rompun- Ketavet über die Lunge als Inhalationsnarkotikum, um den Kreislauf der Tiere nur minimal zu belasten. In einem Zeitraster von 24 und 48 h nach Substanzinjektion werden die Tiere fluoreszenzoptisch untersucht.The animals used are supplied by Taconic M & B. These are female albino nude mice of the type NMRI nude. The adult animals have a weight of 22-24 g after about 8 weeks. Five female nude mice are inoculated with 2x10 6 cells of a F9 teratoma in the right posterior flank. The cells are obtained from the company ATCC / LGC Promochem GmbH. It is mouse-derived embryonic cells of a testinal teratocarcinoma, which is used as a tumor model for cancer research purposes in mice. After 18 days, four of the five mice had tumors with an average size of about 0.5-1 cm in diameter. The animals are permanently anesthetized with a rompun-ketavet injection in a dose of 100 μl / 10 g of animal for the first hour of the experiment. The solution for injection consists of a 1: 1 mixture of 1:10 Dilution Rompun or 1: 5 dilution Ketavet with physiological saline. Subsequently, 200 μl of the nanoparticle dispersion are injected iv into the tail vein. The following anesthetics are carried out with Rompunketavet via the lungs as an inhalation anesthetic in order to minimize the circulation of the animals. In a time frame of 24 and 48 h after substance injection, the animals are examined by fluorescence optics.
Mit Hilfe von Fig. 17 wird gezeigt, dass GIu(10)-b-PEG(110)-modifizierte PBCA- [P(DMAEMA)-ICG]-Nanopartikel nach intravenöser Applikation (Schwanzvene) in der Lage sind, sich über passive Anreicherungsmechanismen (EPR-Effekt) im Tumorgewebe anzureichern. Die Untersuchung der Tumoren ex vivo belegt eine deutliche Verstärkung des Fluoreszenzkontrastes bei behandelten im Vergleich zu unbehandeltem Tumorgewebe (Vergleich Fig. 18 b mit a bzw. c mit a). Eine mehrfache, zeitversetzte Detektion der Fluoreszenz bei ein und demselben Tier ist nach 24 h und 48 h möglich (Fig. 17). Die Partikel können demzufolge in vivo ausreichend lange zirkulieren und sich entsprechend im Tumor anreichern. Die elektrostatisch pegylierte Oberfläche ist somit stabil mit der Partikeloberfläche verbunden. Es findet eine schnelle biliäre Eliminierung nicht-tumorassoziierter Partikel aus der Leber statt. Indiz dafür ist ein fehlender NIR-Fluoreszenzkontrast in der Leber nach 24 bzw. 48 h. Eine schnelle Eliminierung nicht im Tumor angereicherter Partikel aus dem Organismus (z.B. Leber) ermöglicht einen guten Tumorkontrast bei minimaler Belastung anderer Organe, Voraussetzung für ein nebenwirkungsarmes Kontrastmittelsystem.With reference to Figure 17, it is shown that GIu (10) -b-PEG (110) -modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles after intravenous administration (tail vein) are capable of passive enrichment mechanisms (EPR effect) in tumor tissue. Examination of the tumors ex vivo shows a clear enhancement of the fluorescence contrast in treated compared to untreated tumor tissue (compare Fig. 18 b with a and c with a). Multiple, time-shifted detection of fluorescence in one and the same animal is possible after 24 h and 48 h (FIG. 17). Consequently, the particles can circulate in vivo for a sufficiently long time and accumulate accordingly in the tumor. The electrostatically pegylated surface is thus stably connected to the particle surface. There is a rapid biliary elimination of non-tumor associated particles from the liver. Indication for this is a lack of NIR fluorescence contrast in the liver after 24 or 48 h. Rapid elimination of non-tumor-enriched particles from the organism (e.g., liver) allows good tumor contrast with minimal stress on other organs, a prerequisite for a low-contrast contrast agent system.
Das für den Tierversuch verwendete Gerät wurde von der Firma LMTB (Berlin, Deutschland) aufgebaut. Als Einzelkomponenten wurden verwendet:The device used for the animal experiment was set up by the company LMTB (Berlin, Germany). As individual components were used:
Laser: Diodenlaser (742 nm), Modell Ceralas PDT 742/1 ,5W; Fa.Laser: diode laser (742 nm), model Ceralas PDT 742/1, 5W; Fa.
CeramOptec (Bonn, Deutschland) Anregungsfilter: 1xLCLS-750 nm-F; 1x740 nm Interferenzfilter (Bandpass) Emissionsfilter: 1 x bk-802,5-22-Ci ; 1 xbk-801 -15-C1 Kamera: Peltier gegen Luft gekühlte CCD Kamera, Modell C4742-95CeramOptec (Bonn, Germany) Excitation Filter: 1xLCLS-750 nm-F; 1x740 nm interference filter (bandpass) Emission filter: 1 x bk-802.5-22-Ci; 1 xbk-801 -15-C1 camera: Peltier air-cooled CCD camera, model C4742-95
12ER, Fa. Hamamatsu (Herrsching, Deutschland) Software: Simple PCI 5.0, Fa. Compix / Hamamatsu 12ER, Fa. Hamamatsu (Herrsching, Germany) Software: Simple PCI 5.0, Compix / Hamamatsu
Figurencharacters
Fig. 1 : Steuerung des Partikeldurchmessers durch Änderung derFig. 1: control of the particle diameter by changing the
Polymerkonzentration; In Fig. 1 ist dargestellt, dass die Partikelgröße der PBCA-Polymer concentration; FIG. 1 shows that the particle size of the PBCA
P(DMAEMA)-Nanopartikel während der Herstellung durch Variation der Polymerkonzentration gesteuert werden kann.P (DMAEMA) nanoparticles can be controlled during production by varying the polymer concentration.
Fig. 2: Partikeldurchmesser dhyd und Zetapotential von PBCA-[PEI- IDCC]-NP in gewaschener und ungewaschener Partikel in zwei verschiedenen Tensiden (TX-100 = Triton X-100, F 68 = PluronicFigure 2: Particle diameter d hyd and zeta potential of PBCA [PEI-IDCC] NP in washed and unwashed particles in two different surfactants (TX-100 = Triton X-100, F 68 = Pluronic
F-68);F-68);
In dieser Darstellung sind die Partikeldurchmesser als auch dasIn this illustration, the particle diameter as well as the
Zetapotential von PBCA-[PEI-I DCC]-Nanopartikeln dargestellt, welche entweder durch das Tensid Triton X-100 oder Pluronic F 68 stabilisiert wurden.Zeta potential of PBCA [PEI-I DCC] nanoparticles stabilized by either the Triton X-100 or Pluronic F 68 surfactant.
Fig. 3: Zetapotential GIu(10)-b-PEG(1 10) modifizierter PBCA-[PEI-IDCC]-Fig. 3: Zeta potential Glu (10) -b-PEG (1 10) modified PBCA [PEI-IDCC] -
Nanopartikel; Dargestellt ist in dieser Abbildung die Veränderung desnanoparticles; Shown in this figure is the change in the
Zetaptentials von +25 mV auf ca. -30 mV durch schrittweise Zugabe des modifizierenden Agens (GIu(10)-b-PEG(1 10)) zur Partikeldispersion (Ladungstitration).Zetapentials of +25 mV to about -30 mV by stepwise addition of the modifying agent (Glu (10) -b-PEG (1 10)) for particle dispersion (charge titration).
Fig. 4: REM (Rasterelektronenmikroskop)-Aufnahme DODC-beladenerFig. 4: SEM (Scanning Electron Microscope) image DODC-loaded
PBCA-P(DMAEMA)- Nanopartikel;PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles;
In der Abbildung ist eine REM-Aufnahme von DODC-beladenen PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikeln dargestellt.The figure shows an SEM image of DODC-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles.
Fig. 5: REM-Aufnahme Cumarin 6-beladener PBCA-P(DMAEMA)-5: SEM image of coumarin 6-loaded PBCA-P (DMAEMA) -
Nanopartikel;nanoparticles;
In der Abbildung ist dargestellt eine REM-Aufnahme von Cumarin 6-beladenen PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikeln. Fig. 6: Einfluss funktionalisierter Partikeloberflächen auf dieThe figure shows an SEM image of coumarin 6-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles. Fig. 6: Influence of functionalized particle surfaces on the
Zellaufnahme: a) Vergleich des Zellaufnahmeverhaltens nach Oberflächenmodifikation; Reihe 1 : unmodifizierte Partikel; Reihe 2:Cell uptake: a) Comparison of cell uptake behavior after surface modification; Row 1: unmodified particles; Row 2:
NP mit Folsäure; Reihe 3: NP mit GIu(10)-b-PEG(110); b) Ausschnitt: Reihe 3/ Well 1/ Site 15; Pfeile markieren deutliche Fluoreszenzverstärkung im Zellkern.NP with folic acid; Row 3: NP with Glu (10) -b-PEG (110); b) Section: Row 3 / Well 1 / Site 15; Arrows indicate marked fluorescence enhancement in the nucleus.
Fig. 7: Nanopartikelaufnahme in HeLa-Zellen; Fluoreszenz derFig. 7: Nanoparticle uptake in HeLa cells; Fluorescence of
Nanopartikel als Graustufenabbildung;Nanoparticles as grayscale imaging;
Die Abbildung zeigt das Zellaufnahmeverhalten GIu(10)-b- PEG(HO) modifizierter PBCA P(DMAEMA)-Nanopartikel in HeLa- Zellen.The figure shows the cell uptake behavior of GIu (10) -b-PEG (HO) -modified PBCA P (DMAEMA) nanoparticles in HeLa cells.
Fig. 8: Schematische Darstellung der Zellaufnahme von PBCA-8: Schematic representation of the cell uptake of PBCA
P(DMAEMA)-Nanopartikeln oberflächenmodifiziert mit GIu(10)-b- PEG(HO); Verwendete Abkürzungen = PEG-NP: pegylierte cumarinhaltigeP (DMAEMA) nanoparticles surface-modified with Glu (10) -b-PEG (HO); Abbreviations used = PEG-NP: pegylated coumarin-containing
PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikel; NP: cumarinbeladene PBCA- P(DMAEMA)-Nanopartikel; CP: Clathrin-coated pits; ES: Endosomen; LS: Lysosomen; ELS: Endolysosomen; ZK: Zellkern; H+: H+ATPase; PEG-GIu: freies GIu(10)-b-PEG(110) Blockcopolymer; Größenrelationen entsprechen nicht der Realität.PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles; NP: coumarin-loaded PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles; CP: clathrin-coated pits; ES: endosomes; LS: lysosomes; ELS: endolysosomes; ZK: cell nucleus; H +: H + ATPase; PEG-Glu: free Glu (10) -b-PEG (110) block copolymer; Size relations do not correspond to reality.
Fig. 9: a) Darstellung der Fluoreszenz in der mittleren Zellebene (CLSM, konfokales Laser-Raster-Mikroskop), b) computerbasierte SD- Darstellung der Fluoreszenz; Die Darstellung zeigt die Anreicherung der GIu(10)-b-PEG(110) modifizierten PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikel im Zellkern. Dies ist möglich durch die Beladung mit dem fluoreszenzaktiven Farbstoff Cumarin 6. Fig. 10: Geringere Partikelaufnahme bei Inkubation niedrigerer Patikelkonzentration: 0,21 mg/ml; Fluoreszenz der NP als Graustufenabbildung; Die Abbildung zeigt fluoreszierende HeLa-Zellen nachdem eine9: a) representation of the fluorescence in the middle cell level (CLSM, confocal laser scanning microscope), b) computer-based SD representation of the fluorescence; The plot shows the accumulation of the GIu (10) -b-PEG (110) modified PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles in the nucleus. This is possible by loading with the fluorescence-active dye coumarin 6. Fig. 10: Lower particle uptake with incubation of lower particle concentration: 0.21 mg / ml; Fluorescence of the NP as grayscale image; The picture shows fluorescent HeLa cells after a
Partikelkonzentration von 0,21 mg/ml inkubiert wurde. Es wurden dafür GIu(10)-b-PEG(1 10) oberflächenmodifizierte PBCA- P(DMAEMA)-Partikel verwendet.Particle concentration of 0.21 mg / ml was incubated. For this, GIu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles were used.
Fig. 11 : Gesteigerte Partikelaufnahme bei Inkubation höherer Patikelkonzentration: 0,85 mg/ml; Fluoreszenz der NP als Graustufenabbildung;Fig. 11: Increased particle uptake with incubation of higher particle concentration: 0.85 mg / ml; Fluorescence of the NP as grayscale image;
Die Abbildung zeigt deulich stärker fluoreszierende HeLa-Zellen nachdem eine höhere Partikelkonzentration von 0,85 mg/ml inkubiert wurde. Es wurden dafür GIu(10)-b-PEG(110) oberflächenmodifizierte PBCA-P(DMAEMA)-Partikel verwendet.The figure shows more strongly fluorescent HeLa cells after a higher particle concentration of 0.85 mg / ml was incubated. GIu (10) -b-PEG (110) surface-modified PBCA-P (DMAEMA) particles were used for this purpose.
Fig. 12: REM-Aufnahme von PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-NanopartikelnFig. 12: SEM image of PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles
Fig. 13: Partikeldurchmesser dhyd der PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]- Nanopartikel, oberflächenmodifiziert mit GIu(10)-b-PEG(1 10); Dargestellt ist die Partikelgröße der für den Tierversuch verwendeten oberflächenmodifizierten PBCA-[P(DMAEMA)- ICG]-Nanopartikel über einen Zeitraum von 7 Tagen nach Herstellung für den Tierversuch.FIG. 13: particle diameter d hyd of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles, surface-modified with Glu (10) -b-PEG (110); Shown is the particle size of the surface-modified PBCA [P (DMAEMA) -ICG] nanoparticles used for the animal experiment over a period of 7 days after preparation for the animal experiment.
Fig. 14: Zetapotential der untitrierten (gewaschenen / ungewaschenen) und der titrierten PBCA [P(DMAEMA) ICG] Nanopartikel; Die Abbbldung zeigt die als Zetapotential gemessene Oberflächenladung der PBCA-P(DMAEMA)-Nanopartikel modifiziert mit dem Blockcopolymer GIu(10)-b-PEG(1 10). Dieses wurde entsprechend von ca. +3OmV über den Neutralpunkt hinaus bis zum Erreichen des Dissoziations-Gleichgewichtes bei etwa -3OmV titriert.Figure 14: Zeta potential of the untitrated (washed / unwashed) and titrated PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles; The abbreviation shows the zeta potential measured surface charge of the PBCA-P (DMAEMA) nanoparticles modified with the block copolymer Glu (10) -b-PEG (110). This was accordingly about + 3OmV beyond the neutral point titrated until reaching the dissociation equilibrium at about -3OmV.
Fig. 15: UV-Vis-Absorptionsspektren: a) wässrige ICG-Lösung, b) PBCA- [P(DMAEMA)-ICG]-NP ungewaschen; c) PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]Fig. 15: UV-Vis absorption spectra: a) aqueous ICG solution, b) PBCA [P (DMAEMA) -ICG] -NP unwashed; c) PBCA- [P (DMAEMA) -ICG]
Nanopartikel gewaschen;Washed nanoparticles;
In dieser Abbildung sind die UV-Vis-Absorptionsspektren einer wässrigen ICG-Lösung als auch der ICG-Nanopartikeldispersion (gewaschen und ungewaschen) dargestellt.This figure shows the UV-Vis absorption spectra of an aqueous ICG solution as well as the ICG nanoparticle dispersion (washed and unwashed).
Fig. 16: Emissionsspektrum der PBCA-[P(DMAEMA)-ICG]-Nanopartikel und einer wässrigen ICG-Lösung;Fig. 16: Emission spectrum of the PBCA [P (DMAEMA) ICG] nanoparticles and an aqueous ICG solution;
Die Abbildung stellt die entsprechenden Emissionsspektren der wässrigen ICG-Lösung im Vergleich zur Nanopartikeldispersion dar.The figure represents the corresponding emission spectra of the aqueous ICG solution compared to the nanoparticle dispersion.
Fig. 17: Detektion der NIR-Fluoreszenz in vivo;Fig. 17: Detection of NIR fluorescence in vivo;
Die Darstellungen zeigen die NIR-Fluoreszenz in einem Zeitraster von 24 und 48 h nach Substanzinjektion (a) 24 h ventral, b) 24 h lateral, c) 48 h lateral, d) Leerwert ventral).The images show the NIR fluorescence in a time frame of 24 and 48 h after substance injection (a) ventrally 24 h, b) 24 h laterally, c) 48 h laterally, d) ventrally empty).
Fig. 18: NIR-Fluoreszenzkontrast des Tumorgewebes ex vivo 48 h nachFig. 18: NIR fluorescence contrast of the tumor tissue ex vivo 48 h after
Behandlung; Die Abbildung zeigt NIR-Fluoreszenzkontraste a) eines unbehandelten Tumors ohne NIR-Fluoreszenzkontrast, b) eines großen, behandelten Tumors und c) eines mittleren, behandelten Tumors ex vivo 48 h nach Behandlung. Treatment; The figure shows NIR fluorescence contrasts a) an untreated tumor without NIR fluorescence contrast, b) a large, treated tumor and c) a median, treated tumor ex vivo 48 h after treatment.

Claims

Patentansprücheclaims
1 ) Polymernanopartikel mit einem kationischen Oberflächenpotential, enthaltend ein kationisches Polymer und ein in Wasser schwer lösliches Polymer, dadurch gekennzeichnet, dass diese Polymernanopartikel diagnostische und/oder therapeutische Agenzien enthalten.1) Polymer nanoparticles having a cationic surface potential containing a cationic polymer and a sparingly water-soluble polymer, characterized in that said polymer nanoparticles contain diagnostic and / or therapeutic agents.
2) Polymernanopartikel gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Fällungsaggregat handelt.2) Polymer nanoparticles according to claim 1, characterized in that it is a precipitation aggregate.
3) Polymernanopartikel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das in Wasser schwer lösliche Polymer ein3) Polymer nanoparticles according to claim 1 or 2, characterized in that the sparingly water-soluble polymer
Polycyanoacrylate, Polyalkylcyanoacrylate (PACA), Polyester Alginsäure, Hyaluronsäure, Polysialinsäure, saure Cellulose-Derivate, saure Stärke- Derivate, Polysaccharide, polymere Proteine, Polyamide, Polyanhydride, Polyorthoester, Polycaprolactone, Polyphosphorsäure, Poly(amide- enamines), Azopolymers, Polyurethane, Polyorthoester, Dendrimere,Polycyanoacrylates, polyalkylcyanoacrylates (PACA), polyesters alginic acid, hyaluronic acid, polysialic acid, acidic cellulose derivatives, acidic starch derivatives, polysaccharides, polymeric proteins, polyamides, polyanhydrides, polyorthoesters, polycaprolactones, polyphosphoric acid, poly (amide-enamines), azopolymers, polyurethanes, Polyorthoester, dendrimer,
Pseudopolymaminosäuren oder sämtliche Mischungen und Co-Polymere derselben Verbindungen ist.Pseudopolymaminosäuren or all mixtures and co-polymers of the same compounds.
4) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -3, dadurch gekennzeichnet, dass das in Wasser schwer lösliche Polymer ein Polybutylcyanoacrylat (PBCA) ist.4) polymer nanoparticles according to any one of claims 1 -3, characterized in that the sparingly water-soluble polymer is a polybutyl cyanoacrylate (PBCA).
5) Polymernanopartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, enthaltend ein kationisch modifiziertes Polyacrylat P(DMAEMA)1 Diethylaminoethylmodifizierte Dextrane, Hydroxymethylcellulosetrimethylamin, Polylysin, Protaminsulfat, Hydroxyethylcellulosetrimethylarnin, Polyallylaminen, Protaminchlorid,5) Polymer nanoparticles, according to one of claims 1 or 2, comprising a cationically modified polyacrylate P (DMAEMA) 1 diethylaminoethyl-modified dextranes, hydroxymethylcellulosetrimethylamine, polylysine, protamine sulfate, hydroxyethylcellulosetrimethylamine, polyallylamines, protamine chloride,
Polyallylaminhydrosalze, Polyamine,Polyallylamine hydrosalts, polyamines,
Polyvinylbenzyltrimethylammoniumsalze,Polyvinylbenzyltrimethylammoniumsalze,
Polydiallyldimethylammoniumsalze, Polyimidazolin, Polyvinylamin und Polyvinylpyridin, Polyethylenimin (PEI), Putrescin (Butan-1 ,4-diamin), Spermidin (N-(3-Aminopropyl)butan-1 ,4-diamin), Spermin (N,N'-bis(3- aminopropyl)butan-1 ,4-diamin) Dimethylaminoethylacrylat, PoIy-N, N- dimethylaminoethylmethacrylat Dimethylaminopropylacrylamid,Polydiallyldimethylammonium salts, polyimidazoline, polyvinylamine and polyvinylpyridine, polyethyleneimine (PEI), putrescine (butane-1, 4-diamine), spermidine (N- (3-aminopropyl) butane-1, 4-diamine), spermine (N, N'-bis (3-aminopropyl) butane-1, 4-diamine) dimethylaminoethyl acrylate, poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, dimethylaminopropylacrylamide,
Dimethylaminopropylmethacrylamid, Dimethylaminostyrol, Vinylpyridin und Methyldiallylamin, PoIy-DADMAC, Guar, oder deacetyliertes Chitin und die entsprechenden Salze, welche sich mit geeigneten anorganischen oder niedermolekularen organischen Säuen bilden können. 6) Polymernanopartikel, gemäß Anspruch 5, enthaltend ein kationisch modifiziertes Polyacrylat P(DMAEMA),Dimethylaminopropylmethacrylamide, dimethylaminostyrene, vinylpyridine and methyldiallylamine, poly-DADMAC, guar, or deacetylated chitin and the corresponding salts which may form with suitable inorganic or low molecular weight organic acids. 6) polymer nanoparticles, according to claim 5, containing a cationically modified polyacrylate P (DMAEMA),
7) Polymernanopartikel, gemäß Anspruch 5, enthaltend ein Polyethylenimin.7) Polymer nanoparticles according to claim 5, containing a polyethyleneimine.
8) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -7, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche elektrostatisch modifiziert ist. 9) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -7, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche mit GIu(10)-b-PEG(1 10) modifiziert ist.8) polymer nanoparticles according to any one of claims 1-7, characterized in that the surface is electrostatically modified. 9) polymer nanoparticles according to any one of claims 1-7, characterized in that the surface with GIu (10) -b-PEG (1 10) is modified.
10) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -9 dadurch gekennzeichnet, dass das diagnostische und/oder therapeutische Agens negativ geladen ist und als lonenpaar mit dem kationischen Polymer in den Partikel eingeschlossen wird.10) polymer nanoparticles according to any one of claims 1-9, characterized in that the diagnostic and / or therapeutic agent is negatively charged and is included as an ion pair with the cationic polymer in the particle.
1 1 ) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem diagnostischen Agens um einen fluoreszierenden Farbstoff handelt. 12) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem diagnostischen Agens um einen fluoreszierenden NIR-Farbstoff handelt.1 1) polymer nanoparticles according to any one of claims 1-10, characterized in that it is the diagnostic agent is a fluorescent dye. 12) Polymer nanoparticles according to one of claims 1 to 10, characterized in that the diagnostic agent is a fluorescent NIR dye.
13) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem diagnostischen Agens um einen Carbocyanin-Farbstoff handelt.13) Polymer nanoparticles according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the diagnostic agent is a carbocyanine dye.
14) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem diagnostischen Agens um TSC (Tetrasulfocyanin) handelt.14) Polymer nanoparticles according to any one of claims 1-13, characterized in that the diagnostic agent is TSC (tetrasulfocyanine).
15) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem diagnostischen Agens um IDCC15) Polymer nanoparticles according to one of claims 1 to 13, characterized in that the diagnostic agent is IDCC
(Indodicarbocyanin) handelt. 16) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -13 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem diagnostischen Agens um ICG (Indocyaningrün) handelt.(Indodicarbocyanin) acts. 16) Polymer nanoparticles according to one of claims 1 to 13, characterized in that the diagnostic agent is ICG (indocyanine green).
17) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem therapeutischen Agens um eine17) polymer nanoparticles according to any one of claims 1-10, characterized in that the therapeutic agent is a
Substanz zur Therapie von Tumorerkrankungen oder Erkrankungen mit Entzündungsreaktionen handelt.Substance for the treatment of tumor diseases or diseases with inflammatory reactions.
18) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -10 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Zielstruktur gibt. 19) Polymernanopartikel gemäß Anspruch 18, wobei die Zielstruktur ein negativ geladenes Molekülteil besitzt und durch elektrostatische Wechselwirkungen auf die kationische Partikeloberfläche aufgebracht wird.18) Polymer nanoparticles according to any one of claims 1-10 and 17, characterized in that there is a target structure. 19) Polymer nanoparticles according to claim 18, wherein the target structure has a negatively charged moiety and is applied to the cationic particle surface by electrostatic interactions.
20) Polymernanopartikel gemäß Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielstruktur einen Antikörper, ein Protein, ein20) Polymer nanoparticles according to claim 18 or 19, characterized in that the target structure is an antibody, a protein
Polypeptid, ein Polysaccharid, ein DNA Molekül, ein RNA Molekül, eine chemische Einheit, eine Nukleinsäure, ein Lipid, ein Carbohydrat oder Kombinationen aus den vorgenannten beinhalten kann.Polypeptide, a polysaccharide, a DNA molecule, an RNA molecule, a chemical moiety, a nucleic acid, a lipid, a carbohydrate, or combinations of the foregoing.
21) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Teilchen zwischen 1 -800 nm beträgt.21) Polymer nanoparticles according to one of claims 1-10, characterized in that the size of the particles is between 1 and 800 nm.
22) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -10, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Teilchen zwischen 5-800 nm beträgt. 23) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -10, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Teilchen zwischen 1 -500 nm beträgt.22) Polymer nanoparticles according to any one of claims 1-10, characterized in that the size of the particles is between 5-800 nm. 23) Polymer nanoparticles according to one of claims 1 to 10, characterized in that the size of the particles is between 1 and 500 nm.
24) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 -10, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Teilchen zwischen 5-500 nm beträgt.24) polymer nanoparticles according to any one of claims 1-10, characterized in that the size of the particles is between 5-500 nm.
25) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Teilchen zwischen 1 -300 nm beträgt. 26) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Teilchen zwischen 5-300 nm beträgt.25) Polymer nanoparticles according to any one of claims 1-10, characterized in that the size of the particles is between 1 -300 nm. 26) polymer nanoparticles according to any one of claims 1-10, characterized in that the size of the particles is between 5-300 nm.
27) Polymernanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Teilchen zwischen 10-300 nm beträgt.27) polymer nanoparticles according to any one of claims 1-10, characterized in that the size of the particles is between 10-300 nm.
28) Die Verwendung eines Polymemanopartikels gemäß einem der Ansprüche 1-26 für die Diagnose oder Therapie von Krankheiten, Tumorerkrankungen oder Erkrankungen mit Entzündungsreaktionen. 29) Verfahren zur Herstellung eines Polymemanopartikels gemäß einem der Ansprüche 1-27, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:28) The use of a Polymemanopartikels according to any one of claims 1-26 for the diagnosis or therapy of diseases, tumors or diseases with inflammatory reactions. 29) Process for the preparation of a Polymemanopartikels according to any one of claims 1-27, characterized in that the following process steps are carried out:
• Lösen des kationischen Polymers in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch mit Wasser • Lösen des wasserunlöslichen Polymers in einem organischenDissolving the cationic polymer in an organic solvent or a solvent mixture with water; dissolving the water-insoluble polymer in an organic solvent
Lösungsmittelsolvent
• Lösen des Wirkstoffes (Diagnostikum oder Therapeutikum) in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch mit Wasser, • Herstellen eines vollständig gelösten Gemisches aus kationischem• dissolving the active substance (diagnostic or therapeutic) in an organic solvent or a solvent mixture with water, • preparing a completely dissolved mixture of cationic
Polymer, wasserunlöslichem Polymer und WirkstoffPolymer, water-insoluble polymer and active ingredient
• Einbringen des Gemisches in eine tensidhaltige Lösung, wobei es zur spontanen Bildung von Fällungsaggregaten kommt.• introducing the mixture into a surfactant-containing solution, which leads to the spontaneous formation of precipitation aggregates.
• Entfernen des Lösungsmittels. • Elektrostatische Oberflächenmodifikation der Partikel durch• Remove the solvent. • Electrostatic surface modification of the particles by
Zusammenfügen von Nanopartikeldispersion und modifizierendem Agens in geeigneten Mengen (Fakultativ)..Assembly of Nanoparticle Dispersion and Modifying Agent in Appropriate Quantities (Optional).
30) Verwendung eines Nanopartikels gemäß einem der Ansprüche 1 -27 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung /Arzneiform unter Verwendung pharmazeutisch akzeptabler Hilfsstoffe.30) Use of a nanoparticle according to any one of claims 1 -27 for the preparation of a pharmaceutical preparation / dosage form using pharmaceutically acceptable excipients.
31 ) Verwendung eines Nanopartikels gemäß einem der Ansprüche 1 -27, wobei die pharmazeutische Zubereitung über ein geeignetes Applikationssystem an Mensch oder Tier über einen geeigneten Applikationsweg verabreicht wird. 31) Use of a nanoparticle according to any one of claims 1 -27, wherein the pharmaceutical preparation via a suitable Application system is administered to humans or animals via a suitable administration route.
EP07726022A 2006-06-08 2007-06-07 Functionalized solid polymer nanoparticles for diagnostic and therapeutic applications Withdrawn EP2029119A2 (en)

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