EP1991573A2 - Peptides a proprietes d'antagoniste allosterique selectif du recepteur adrenergique alpha1a et leurs applications - Google Patents

Peptides a proprietes d'antagoniste allosterique selectif du recepteur adrenergique alpha1a et leurs applications

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Publication number
EP1991573A2
EP1991573A2 EP07731030A EP07731030A EP1991573A2 EP 1991573 A2 EP1991573 A2 EP 1991573A2 EP 07731030 A EP07731030 A EP 07731030A EP 07731030 A EP07731030 A EP 07731030A EP 1991573 A2 EP1991573 A2 EP 1991573A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
adrenergic receptor
alphala
receptor
cysteine
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07731030A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas Gilles
André Menez
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Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1991573A2 publication Critical patent/EP1991573A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
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    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors

Definitions

  • PEPTIDES WITH ALPHAIA ADRENERGIC RECEPTOR SELECTIVE AJLOSTERIC ANTAGONIST PROPERTIES AND THEIR APPLICATIONS.
  • the present invention relates to peptides having alphala adrenergic receptor selective allosteric antagonist activity and their therapeutic and pharmacological applications.
  • the alphal receptors are mainly expressed in the postsynaptic position of the sympathetic nervous system and their activation leads to a contraction of the smooth muscles under their control. These receptors play a major role in the cardiovascular and genitourinary system, in the normal or pathological state (For a review see: Piascik et al, Pharmacol Ther, 1996, 72, 215-241, Michelotti et al, Pharmacology & Therapeutics, 2000, 88, 281-309).
  • blockade of alphala receptors results in smooth muscle relaxation of the urogenital tract that can be used in the treatment of urinary dysfunction and erectile dysfunction (Moreland et al, The Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics, 2004, 308, 797-804, Guiliano et al, Progress in Urology, 1997, 7, 24-33).
  • the main pathologies that can be treated are: - Functional obstructions of the urinary system in women or in men.
  • Prostate adenoma, or benign prostatic hyperplasia (BPH) is the normal progression of prostate size that increases from 40 years old. This hypertrophy of the prostate whose frequency increases with age (80% of men over 70) may be accompanied by a more or less significant obstruction of the urethra, causing urinary disorders.
  • Incontinence may be due to a pressure of the bladder greater than the retention force of the urethra. Blocking alpha-adrenoceptors would reduce bladder pressure.
  • Erectile disorders Some erectile problems can be treated by inhibiting the activity of alphala adrenoceptors, in order to promote the irrigation of cavernous bodies.
  • alpha-adrenoceptor blockade would have a preventive and curative effect on prostate tumors (European Patents EP 0 799 618 and EP 0 799 619, Thebault et al, The J. Clin Invest, 2003, 111, 1691-1701).
  • KMD3213 silodosin
  • KMD3213 is the first competitive antagonist with selectivity for the alphala subtype (Shibata et al., Mol., Pharmacol., 1995, 48-250). 258). This molecule is in clinical phase for the treatment of prostatic hypertrophy (Drugs, RD, 2004, 5, 50-51).
  • the p-TIA peptide is a natural peptide of 19 residues crosslinked by two disulfide bridges (FNWRCCLIPACRRNHKKFC, SEQ ID NO: 1), extracted from Conus tulipa marine cone venom. This peptide has an affinity of the order of 100 nM for ⁇ 1 adrenoceptors, and a low selectivity (affinity of 10 nM) for the ⁇ 1b subtype which controls the tonicity of the vessels.
  • European Patent EP 1,117,681 envisages the use of the p-TIA peptide for the prevention and treatment of cardiovascular (hypertension), urinary (prostatic hypertrophy), pain and inflammation pathologies.
  • the toxins of the family "three-toed toxins” or family of “cholinergic toxins” are peptides from 63 to 66 amino acids having four disulfide bridges (between cysteines 1 and 3, 2 and 4, 5 and 6 and 7 and 8: bridges 1-3, 2-4, 5-6 and 7-8) and a characteristic three-finger structure in which the loops I, II and III form the three central fingers of the hand and the disulfide bridges, the palm from the hand.
  • These toxins are divided into several groups depending on their activity: muscarinic toxins (MTs) that bind to muscarinic acetylcholine receptors, alpha neurotoxins ( ⁇ -neurotoxins) that bind to acetylcholine receptors.
  • MTs muscarinic toxins
  • ⁇ -neurotoxins alpha neurotoxins
  • MTX1 MT1
  • MTX2 MT2
  • MTX3 MT3 or m4-tox
  • MTX4 MT4
  • MTX5 MT5
  • MTX7 MT7, ML-tox
  • MT ⁇ Dendroaspis polylepis
  • these peptides have been used as a tool to determine the physiological role of certain muscular receptor subtypes.
  • AdTxI selectively binds the adrenergic receptor alpha 1a and allosterically decreases the affinity of orthosteric ligands.
  • AdTxI has a sequence of 65 amino acids (SEQ ID NO: 2):
  • AdTx1 comprises 4 disulfide bridges, between cysteines at positions 3 and 24 (cysteines 1 and 3: bridge 1-3), 17 and 42 (cysteines 2 and 4: bridge 2-4), 46 and 57 (cysteines 5 and 6: bridge 5-6), 58 and 63 (cysteines 7 and 8: bridge 7-8), characteristics of the family of three-finger toxins acting on the cholinergic system.
  • the ATx1 sequence has a very strong homology with certain sequences of the group of muscarinic toxins in the family of three-finger toxins: Table I: Homology Between AdTxI and Certain Muscarinic Three-Finger Toxins
  • This new toxin defines a subgroup of three-fingered muscarinic toxin group peptides, characterized by their allosteric alpha-adrenergic receptor antagonist property.
  • this allosteric antagonist property of the alphala adrenergic receptor is novel and does not clearly follow from the properties of the three-finger muscarinic toxins which are described in the state of the art.
  • the present invention relates to peptides for use as a drug, said peptides being characterized by: a) a sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 2, and derived variants having at least 70% d identity or 80% similarity to the entire SEQiD sequence NO: 2, b) a three-finger structure including eight cysteine residues
  • cystes 1 to 8 connected by four disulfide bridges, respectively between cysteines 1 and 3, 2 and 4, 5 and 6, 7 and 8 (bridges 1-3, 2-4, 5-6 and 7-8), and c) an allosteric antagonist activity which is selective for the alphala adrenergic receptor ( ⁇ la ).
  • the peptides as defined in the present invention are capable of specifically blocking the adrenergic alphala receptors, because of their selectivity for the alphala adrenergic subtype. .
  • inhibitors competitive antagonists
  • they act as modulators of agonist affinity; such modulators have the advantage of not blocking the functioning of the receptor but only of modulating their responses when they are activated by their agonist natural. This modulation seems easier to control than with competitive antagonists.
  • three-finger structure is understood to mean the characteristic structure of the family of three-finger toxins as defined above, which structure comprises three loops (loops I, II, II ) maintained by four disulfide bridges (bridges 1-3, 2-4, 5-6, 7-8),
  • sequence with respect to the sequence of SEQ ID NO: 2 as a reference sequence is evaluated according to the percentage of amino acid residues which are identical, when the two sequences are aligned, so as to get the maximum of correspondence between them.
  • the percentage of identity can be calculated by those skilled in the art using a computer program for comparing sequences such as, for example, that of the BLAST suite (Altschul et al, NAR, 1997, 25, 3389-3402).
  • the BLAST programs are implemented on the comparison window constituted by the whole of SEQ ID NO: 2, indicated as a reference sequence.
  • a peptide having an amino acid sequence having at least X% identity with a reference sequence is defined in the present invention as a peptide whose sequence may include up to 100-X alterations per 100 amino acids of the sequence reference, while retaining the functional properties of said reference peptide, in this case its selective antagonist activity of the alphala adrenergic subtype.
  • alteration includes deletions, substitutions or consecutive or dispersed insertions of amino acids in the reference sequence. This definition applies by analogy to nucleotide sequences.
  • a peptide having an amino acid sequence having at least X% similarity to a reference sequence is defined in this
  • non-conservative alterations includes deletions, non-conservative substitutions or consecutive or dispersed insertions of amino acids in the reference sequence.
  • the term "selective allosteric antagonist of the adrenergic receptor alphala” is intended to mean a peptide which selectively binds the adrenergic receptor alphala and is capable of allosterically decreasing the affinity of the orthosteric ligands of said receptor.
  • the orthosteric site is the site of binding of the endogenous receptor agonist (adrenaline in the case of the adrenergic receptor alphala).
  • ⁇ This site is also of some ⁇ antagonistic binding site (prazosin, in the case of alphalA adrenergic receptor).
  • Allosteric modulation implies that the receptor is capable of binding two ligands concomitantly through two topographically distinct binding sites; the orthosteric ligand binds to the orthosteric site while the modulator binds to a distinct site (allosteric site).
  • the two binding sites are conformationally linked, so that the binding of a ligand at site 1 disrupts the structure of site 2, thus changing its affinity for its own ligand.
  • the binding of the peptide to the adrenergic receptor alphala decreases the affinity of receptor-specific antagonists, such as prazosin and vice versa.
  • the invention encompasses the use of natural, synthetic or recombinant peptides having allosteric antagonist activity selective for the adrenergic alpha-alphal receptor.
  • the invention notably encompasses the use of variants obtained by mutation (insertion, deletion, substitution) of one or more amino acids in the sequence SEQ ID NO: 2, since said variant retains a selective allosteric antagonist activity of the alphala adrenergic receptor.
  • the invention also encompasses the use of modified peptides derived from the foregoing by introduction of any modification at the level of amino acid residue (s), peptide bond or peptide ends, as long as said modified peptide retains activity.
  • selective allosteric antagonist alphala adrenergic receptor alphala adrenergic receptor.
  • modifications which are introduced into the peptides by conventional methods known to those skilled in the art, include in a nonlimiting manner: the substitution of a natural amino acid by a nonproteinogenic amino acid (amino acid D or the like of amino acid) ; the addition of a chemical group (lipid, oligo or polysaccharide) at a reactive function, in particular the side chain R; modification of the peptide bond (-CO-NH-), in particular by a retro-type or retro-inverso bond (-NH-CO-) or a bond different from the peptide bond; cyclization; the fusion of the sequence of said peptide with that of a peptide or a protein of interest (epitope of interest for immunodetection; labels (biotin, peptides, flag, in particular) useful for the purification of the peptide, in particular under a protease cleavable form, a fluorescent protein, the coupling to a suitable molecule, in particular a marker, for example a fluor
  • the peptide is advantageously modified by means well known to the skilled person, to change its physiological properties, and in particular to improve his time of 1 A life in the body (glycosylation: HAUBNER R. et al., J. Nucl Med., 2001, 42, 326-36, conjugation with PEG: KIM TH et al., Biomaterials, 2002, 23, 2311-7), its solubility (hybridization with albumin: KOEHLER MF et al., Bioorg Med Med Chem Lett, 2002, 12, 2883-6), its resistance to proteases (non-natural amino acids (L conformation, for example), and / or its intestinal absorption (Lien et al. , TIB, 2003, 21, 556-).
  • natural or synthetic amino acid is meant the naturally occurring ⁇ -amino acids commonly found in the proteins (A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F). P, S, T, W, Y and V), some amino acids rarely encountered in proteins (hydroxyproline, hydroxylysine, methyllysine, dimethyllysine ..), amino acids that do not exist in proteins such as ⁇ -alanine , ⁇ -aminobutyric acid, homocysteine, ornithine, citrulline, canavanine, norleucine, cyclohexylalanine ..., as well as the enantiomers and diastereoisomers of the preceding amino acids.
  • said peptide is the MT-beta toxin (SWISSPROT P80495, SEQ ID NO: 3), a natural peptide extracted from the venom of the snake Dendroaspis polylepis (black mamba); the MT-beta and AdTxI toxin sequences differ only at the residues at positions 38 and 43 which are respectively I 38 and V 43 (MT-beta), and S 38 and A 43 (AdTxI).
  • cysteine 1 is the first or the second amino acid residue and / or cysteine 8 is the penultimate or the last amino acid residue of the sequence of said peptide.
  • This peptide represents a truncated peptide derived from the preceding peptides by deletion of at least one of the N residues and / or or C terminal located upstream of cysteine 1 or downstream of cysteine 8.
  • the subject of the present invention is also an expression vector for use as a medicament, said vector comprising a polynucleotide coding for a peptide as defined above, under the control of appropriate regulatory sequences, the transcription and optionally the translation.
  • the sequence of said polynucleotide is that of the cDNA coding for said peptide; it is in particular the sequence SEQ ID NO: 4 coding for AdTxI. Said sequence may advantageously be modified in such a way that codon usage is optimal in the host in which it is expressed.
  • said polynucleotide may be linked to at least one heterologous sequence.
  • Heterologous sequence refers to a nucleic acid sequence encoding a peptide as defined in the present invention, any nucleic acid sequence other than those which, in nature, are immediately adjacent to said nucleic acid sequence encoding said peptide.
  • said recombinant vector comprises an expression cassette including at least one polynucleotide as defined above, under the control of transcriptional regulatory sequences and optionally the appropriate translation (promoter, activator, intron, initiation codon (ATG), stop codon, polyadenylation signal),
  • viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses, AAVs and baculoviruses, in which the sequence of interest has been inserted beforehand; said sequence (isolated or inserted in a plasmid vector) may also be associated with a substance enabling it to cross the membrane of the host cells, such as a transporter such as a nanotransporter or a preparation of liposomes, or of cationic polymers, or the to introduce into said host cell using physical methods such as electroporation or microinjection.
  • these methods can be advantageously combined, for example by using electroporation associated with liposomes.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises at least one peptide, a polynucleotide encoding said peptide, or a vector as defined above, and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • composition according to the invention is in a dosage form suitable for parenteral (subcutaneous, intramuscular, intravenous), enteral (oral, sublingual), or local (nasal, rectal, vaginal) administration.
  • the pharmaceutically acceptable vehicles are those conventionally used.
  • the present invention also relates to the use of at least one peptide and / or a vector as defined above for the preparation of a medicament having an allosteric antagonist activity selective for the adrenergic receptor alphala ( ⁇ la ), for the treatment of a urogenital or cardiovascular pathology, or cancer.
  • the peptides as defined in the present invention may be labeled directly or indirectly by a radioactive or non-radioactive compound, by covalent or non-covalent coupling, in order to obtain a delectable and / or quantifiable signal.
  • the marking is in particular a radioactive, magnetic, fluorescent marking, carried out according to the methods well known to those skilled in the art.
  • the markers detectable directly are in particular radioactive isotopes such as as tritium (H) and iodine (125 I) or luminescent compounds such as radioluminescent agents, chémoluminescents, bioluminescent, fluorescent or phosphorescent.
  • Indirectly detectable markers include, in particular, biotin and B epitopes.
  • Such labeled peptides are especially used to localize alphala adrenergic receptors, in vitro and in vivo, so as to determine their tissue expression profile under physiological, pathological conditions or in response to an endogenous or exogenous stimulus.
  • the present invention also relates to a process for detecting adrenergic receptor (s) alphala, in vitro and in vivo, comprising at least the following steps:
  • the detection of receptors, in vivo, in the body of a mammal comprises a prior step of administering said peptide to said mammal (parenteral injection, oral administration).
  • the labeling of the cells is in particular fluorescent labeling or magnetic labeling, detectable by any technique known to those skilled in the art (fluorescence microscopy, flow cytometry, magnetic resonance imaging).
  • the labeled peptides are used to screen libraries of molecules for the purpose of identifying other allosteric alphala adrenergic receptor ligands.
  • the present invention also relates to a method for screening allosteric alpha-alphal adrenergic receptor ligands, comprising at least the following steps:
  • the complexes between the peptide as defined in the present invention and the alphala adrenergic receptor can be advantageously used to obtain crystals; such crystals make it possible to determine the three-dimensional structure of the alphala adrenergic receptor, by ray diffraction
  • the subject of the present invention is also a method for preparing alphal adrenergic receptor crystals, comprising at least the following steps: a) contacting the alpha 1 adrenergic receptor with a peptide as defined above, so as to form receptor / ligand complexes, and b) incubation of the complexes obtained in a) under conditions and for a time sufficient to obtain the formation of crystals.
  • the present invention also relates to a receptor / ligand complex in which the receptor is the alphala adrenergic receptor and the peptide is a peptide as defined above, optionally coupled to a suitable marker.
  • the subject of the present invention is also the peptide of sequence SEQ ID NO: 2 and the variant peptides of SEQ ID NO: 2 comprising the substitution of lysine at position 34 of the sequence SEQ ID NO: 2 by another amino acid, especially arginine or homoarginine. According to an advantageous embodiment of said peptide, it is coupled to a suitable marker.
  • the present invention further relates to a polynucleotide, an expression cassette, a recombinant vector, and a modified prokaryotic or eukaryotic host cell derived from the foregoing peptide.
  • said polynucleotide has the sequence SEQ ID NO: 4 coding for AdTxI.
  • the invention encompasses in particular: a) expression cassettes comprising at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional regulatory and optionally translational sequences (promoter, activator, intron, initiation codon (ATG), stop codon, polyadenylation signal), and b) recombinant vectors comprising a polynucleotide according to the invention.
  • these vectors are expression vectors comprising at least one expression cassette as defined above.
  • Polynucleotides, recombinant vectors and transformed cells such as ⁇ defined above are useful in particular for the production of peptides as defined in the present invention.
  • polynucleotides according to the invention are obtained by conventional methods, known per se, following the standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and his Inc, Library of Congress , USA) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Spring Harbor CoId, New York: CoId Spring Harbor Laboratory Press). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR, by screening genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe, or by total or partial chemical synthesis. Recombinant vectors are constructed and introduced into host cells by conventional methods of recombinant DNA and genetic engineering, which are known per se.
  • peptides and their derivatives are prepared by standard techniques known to the human being. in particular by solid or liquid phase synthesis or by expression of a recombinant DNA in a suitable cellular system (eukaryotic or prokaryotic). More precisely,
  • the peptides and their derivatives can be synthesized in solid phase, according to the Fmoc technique, originally described by Merrifield et al. (J. Am.
  • FIG. 1 illustrates the displacement of the binding of the radiolabeled AdTxI peptide ( 125 I-AdTxI) to the adrenergic receptor alphala, in the presence of prazosin (•) or of AdTx1 (O).
  • the IC 50 values are 2.2 ⁇ 10 -10 M and 5.10 -10 M, respectively for prasozine and AdTxI peptide.
  • FIG. 2 illustrates the displacement of the binding of the 3 H-prazosin, 3 H-rauwolscine and 3 H-CPG1 2177 binding to the various adrenergic receptor subtypes by prazosin or the AdTxI peptide.
  • IC 50 displacement by AdTxI of 3 H-prazosin binding to the receptor alphala
  • AdTxI of the 3 H-prazosin binding to the alp.99 receptor
  • FIG. 3 represents the hot saturation of 125 I-AdTxI on yeast membranes expressing the alphala adrenergic receptor. Different concentrations of 125 I-AdTxI are incubated for 20 hours in the presence of 20 ⁇ g of yeast membranes. Nonspecific binding is measured in the presence of 1 ⁇ M AdTxI. ( ⁇ ) Non-specific binding. (•) Specific binding. (O) Total binding. Specific binding is saturable and high affinity, equal to 0.8 ⁇ 0.2 nM.
  • AdTxI peptide is synthesized in the solid phase by the Fmoc (Fluorenyl methyloxycarbonyl) technique, using dicyclohexylcarbodiimide / 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT) as coupling agent and N-methylpyrrolidone as solvent (Mourier et al. al, Molecular Pharmacology, 2003, 63, 26-35). Briefly, the synthesis is carried out from the C-terminus to the N-terminus of the peptide using 0.05 mmol of resin.
  • Fmoc Fluorenyl methyloxycarbonyl
  • the resin / peptide is treated with a mixture of 9 ml of trifluoroacetic acid, 0.5 ml of triisopropylsilane and 0.5 ml of distilled water.
  • the peptide is then cleaved from the resin after two hours of incubation.
  • the mixture is filtered through cold ethyl ether and centrifuged twice.
  • the precipitate thus obtained is dissolved in a solution of 10% acetic acid and freeze-dried.
  • the reduced synthetic toxin is purified by reverse phase chromatography (HPLC) on a Discovery® Bio Wide Pore C5 semi-prepative column, 25 cm x 10 mm, 10 ⁇ m (SUPELCO) with a gradient of 40% to 70% solvent B in 150 minutes (A: 0.1% TFA, B: 50% acetonitrile and 0.1% TFA), with a flow rate of 4.5 ml / min.
  • HPLC reverse phase chromatography
  • A 0.1% TFA
  • B 50% acetonitrile and 0.1% TFA
  • the detection is monitored at 220 nm.
  • the synthetic toxin is then refolded in 100 mM Tris buffer, pH 8.0, in the presence of reduced glutathione (GSSG) and oxidized (GSH) with a GSSG / GSH molar ratio of 1/1 and a concentration of 1 mM.
  • GSSG reduced glutathione
  • GSH oxidized
  • the folded synthetic toxin is purified by reverse phase chromatography (HPLC) under the same conditions as previously described.
  • the concentration of synthetic toxin is 5 ⁇ M.
  • the cloning of the nucleotide sequence coding for AdTxI is carried out by homologous recombination according to the technology (Gateway®), Invitrogen).
  • a polynucleotide fragment comprising successively from 5 'to 3': an attB1 recombination sequence, the TEV cleavage site (ENLYFQG), the sequence coding for AdTxI (SEQ ID NO: 3), a pseudo stop, the coding sequence for the Stag peptide, a stop codon, and the attB2 recombination sequence, was amplified by PCR.
  • the PCR product was cloned by homologous recombination into the donor plasmid pDONR221 (Invitrogen). The clone thus obtained is used to generate recombinant expression vectors, suitable for the expression of AdTxI in a suitable cellular system.
  • Example 2 Assay of AdTx1 binding to alpha 1 adrenergic receptors 1
  • Materials and methods a) Iodization of AdTxI toxin The iodination of AdTxI is by a lactoperoxidase catalyzed halogenation reaction. The reaction mixture containing 50 ⁇ l of 0.1 " M phosphate buffer pH 7.3, 10 ⁇ l of 100 ⁇ M toxin, 10 ⁇ l of H 2 O 2 1/50 000 and 1 mCi [I] and 0.7 Lactoperoxidase unit (Sigma) is incubated for 1 minute at 25 ° C.
  • Each subtype receptor, ⁇ the at ,, ⁇ ⁇ , ⁇ 2a, P 1 is expressed in the yeast Pichia pastoris transformed with an expression plasmid comprising cDNA corresponding to said receiver.
  • Each clone is grown in the same way. Clones of Pichia pastoris are inoculated into 10 ml of medium (1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM Potassium Phosphate pH 6, 1.3% yeast nitrogen base, 1% Glycerol), overnight at 30 ° C. °, then the cultures are diluted in 100 ml of fresh medium and incubated again for 4 h at 30 ° C.
  • the cultures are then centrifuged (3000 g, 5 min), resuspended in 500 ml of induction medium (1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM Potassium Phosphate pH 6, 1.3% yeast nitrogen base, 0.5% methanol), supplemented with 2.5% DMSO and incubated for 18 h at 20 ° C., with stirring (200 rpm).
  • the cultures are harvested (3000 g, 15 min, 4 ° C) and resuspended in 3 ml of buffer (50 mM Potassium Phosphate pH 7.4, 100 mM NaCl, 5% Glycerol, 2 mM EDTA and 1 mM PMSF), cooled in ice.
  • the pellet of each preparation is resuspended in a buffer (50 mM Tris pH 8, 120 mM NaCl, 10% Glycerol, 1 mM PMSF) using a homogenizer, aliquoted and stored at -80 ° C until use. , c) Linkage tests.
  • the ⁇ Nonspecific binding was measured in the presence of 1 .mu.M of prazosin (Sigma) for binding with 3H-Prazosin, 1 .mu.M yohimbine (Sigma) for binding with 3 H-rauwolscine, or l ⁇ M propranolol (Sigma) for the bond with 3H-CPG12177.
  • the reaction is stopped by filtration preceded by a dilution of the reaction medium in 2 ml of washing buffer (Tris-HCl pH 7.2, 10 mM), at 4 ° C.
  • the filtration is carried out on glass filters (GFC, Whatman) pretreated in 0.3% PEI buffer (Polyethyleneimine, Sigma). Two successive and rapid washes are carried out.
  • the filters are dried for one hour at 80 ° C and added with 10 ml of Lipoluma Plus (Lumac LMC).
  • the emissions are detected by a Rockbeta 1211 counter (LKB Wallac) giving the value of each test in cpm (counts per minute).
  • the results are analyzed using Kaleidagraph software (Tools for discovery, Synergy Software, PA, USA).
  • Kaleidagraph software Tools for discovery, Synergy Software, PA, USA.
  • the analysis of the displacement of the adrenergic receptor binding alphala by the iodinated AdTxI peptide (0.1 nM) is carried out according to the same protocol than the one used for tritiated ligands, and the radioactivity is measured by a Multigamma 1261 counter (LKB Wallac).
  • AdTxI The analysis of the saturation of the alphala adrenergic receptor by AdTxI is carried out by incubating increasing concentrations of the iodinated peptide in the presence of 20 ⁇ g of membranes containing the adrenergic alphala receptor, for 20 h, and then measuring the radioactivity as above. Non-specific binding is measured in the presence of 1 ⁇ M AdTxI.
  • the AdTxI peptide is an alphahala adrenergic receptor ligand (FIG. 1).
  • the competitive binding assays with orthosteric ligands specific for the different adrenergic receptor subtypes indicate that the AdTxI peptide selectively binds the alphala adrenergic subtype.
  • Its affinities for the subtypes alphala, Ib, Id, 2a and betal, evaluated by the value of ICso, are respectively l, 8.10 ⁇ 9 M, 2.3.10 "6 M, 9.9.10 " 6 M,> 5.10 5M 5 and> 5.10 "5 M.
  • the displacement curve of the prazosin binding to the alphala adrenergic receptor, in the presence of the AdTxI peptide indicates that the displacement is incomplete, which signifies an allosteric modulation.
  • AdTxI variant K34R was synthesized as described in Example 1 for AdTxI. The AdTxI variant K34R was then coupled to the Cy3B- fluorophore. mono-NHS-ester (AMERSHAM) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • AMERSHAM mono-NHS-ester
  • COS cells transfected either with an alphala human adrenergic receptor expression vector or with an alpched human adrenergic receptor expression vector transiently expressing this alphala or alpschreib receptor were incubated in the presence of 2 ⁇ M of AdTxI -Cy 3b for 16 h, then the fluorescence emitted after laser excitation at 543 nm was analyzed using a fluorescence microscope (Leica TCS SP2, LEICA MICROSYSTEMS) at a magnification of 40. 2) Results Figure 4 illustrates the specific labeling of alphala adrenergic receptors by the fluorescent derivative of AdTxI.
  • FIG. 4A shows intense labeling of h-alphala adrenergic receptors by the fluorescent derivative of AdTx1.
  • FIG. 4B shows the absence of labeling of h-alphak adrenergic receptors (FIG. 4B) by the fluorescent derivative of AdTx1.

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Abstract

Peptides caractérisés par : a) une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO : 2, et les variants dérivés possédant au moins 70 % d'identité ou 80 % de similarité avec la totalité de la séquence SEQ ID NO : 2, b) une structure à trois doigts incluant huit résidus de cystéine reliés par quatre ponts disulfure, respectivement entre la première et la troisième cystéine, la deuxième et la quatrième cystéine, la cinquième et la sixième cystéine, et la septième et la huitième cystéine, et c) une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alpha1a, et leurs applications thérapeutiques et pharmacologiques.

Description

PEPTIDES À PROPRIETES D'ANTAGONISTE AJLLOSTERIQUE SELECTIF DU RECEPTEUR ADRENERGIQUE ALPHAIa ET LEURS APPLICATIONS.
La présente Invention est relative à des peptides ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala et à leurs appli- cations thérapeutiques et pharmacologiques.
Les récepteurs adrénergiques (adrénorécepteurs ou RA) classiques regroupent neufs sous-types de récepteurs caractérisés pharmacologiquement : trois adrénorécepteurs alphal (αθ : alphala (αia), alphalb (au,), alphald (au)) ; trois adrénorécepteurs alpha2 (α2) : alpha2a (α2a), alpha2b (α2b), alpha2c Ca20)) et trois adrénorécepteurs béta (β): bétal (β,), béta2 (β2), béta3 (β3) . Ces neuf récepteurs qui sont tous activés par les catécholamines, adrénaline et noradrénaline, produisent des effets physiologiques variés, par transduction du signal par couplage à une protéine G.
Les récepteurs alphal sont surtout exprimés en position post- synaptique du système nerveux sympathique et leur activation conduit à une contrac- tion des muscles lisses qui sont sous leur contrôle. Ces récepteurs jouent un rôle majeur dans le système cardiovasculaire et génito-urinaire, à l'état normal ou pathologique (Pour une revue voir : Piascik et al, Pharmacol. Ther., 1996, 72, 215-241 ; Michelotti et al, Pharmacology & Therapeutics, 2000, 88, 281-309). En outre, il a été démontré que la tonicité musculaire de l'ensemble des organes uro-génitaux chez l'homme et chez la femme, est principalement contrôlée par l'activation du sous-type alphala, alors que celle des veines et artères est surtout contrôlée par l'activation des sous-types alphalb et alphald (Barrow J.C. et al, J. Med. Chem., 2000, 43, 2703- 2718).
Par conséquent, le blocage des récepteurs alphala permet d'obtenir un relâchement des muscles lisses de l'appareil uro-génital qui peut être utilisé dans le traitement des dysfonctionnements urinaires et des troubles de l'érection (Moreland et al, The Journal of Pharmacology & Expérimental Therapeutics, 2004, 308, 797-804 ; Guiliano et al, Progrès en Urologie, 1997, 7, 24-33). Les principales pathologies qui peuvent être traitées sont : - les obstructions fonctionnelles de l'appareil urinaire chez la femme ou chez l'homme. L'adénome prostatique, ou hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) correspond à l'évolution normale de la taille de la prostate qui augmente à partir de 40 ans. Cette hypertrophie de la prostate dont la fréquence augmente avec l'âge (80% des hommes de plus de 70 ans) peut s'accompagner d'une obstruction plus ou moins importante de l'urètre, à l'origine de troubles urinaires.
Différentes approches ont été envisagées pour traiter cette affection ; il s'agit à chaque fois de bloquer le fonctionnement d'une enzyme (5-α-réductase), d'un transporteur (NET), ou d'un récepteur sensible à la sérotonine, au cannabinoïde, au glutamate, au calcium ou à l'adrénaline. Toutefois, c'est en bloquant les récepteurs adrénergiques alphal que les meilleurs résultats ont été obtenus. En effet, le blocage de ces récepteurs permet un relâchement des muscles lisses et un écoulement urinaire normal.
- l'incontinence : l'incontinence peut être due à une pression de la vessie supérieure à la force de rétention de l'urètre. Le blocage des adrénorécepteurs alphal a permettrait de diminuer la pression de la vessie.
- les troubles érectiles : certains problèmes érectiles peuvent être traités en inhibant l'activité des adrénorécepteurs alphala, afin de favoriser l'irrigation des corps caverneux.
En outre, il a été suggéré que le blocage des adrénorécepteurs alphala aurait un effet préventif et curatif sur les tumeurs de la prostate (Brevets européens EP 0 799 618, et EP 0 799 619, Thebault et al, The J. Clin. Invest, 2003, 111, 1691-1701).
Deux classes de molécules sont actuellement disponibles pour diminuer l'activité des adrénorécepteurs alphala au niveau des organes uro-génitaux :
- des antagonistes du récepteur adrénergique alphal
De nombreux antagonistes compétitifs de l' adrénaline qui se lient spécifiquement au niveau du site orthostérique des récepteurs adrénergiques alphal ont été identifiés : quinazolines (prazosine, térazosine, alfusozine, doxazosine), piperazines (RWJ-38063, RWJ-68141, RWJ-68157, RWJ-69736), phénylalkamines
(tamsulosine, indoramine), silodosine. Toutefois, toutes ces molécules, à l'exception du KMD3213 (silodosine), provoquent des effets secondaires indésirables (hypo- tension), du fait qu'ils ne possèdent pas de sélectivité pour le sous-type adrénergique alphala. Le KMD3213 (silodosine) est le premier antagoniste compétitif ayant une sélectivité pour le sous-type alphala (Shibata et al, Mol. Pharmacol., 1995, 48-250- 258). Cette molécule est en phase clinique pour le traitement de l'hypertrophie de la prostate (Drugs, R. D., 2004, 5, 50-51).
- des modulateurs allostériques du récepteur adrénergique alphal
Les seuls modulateurs allostériques connus actuellement pour ces adrénorécepteurs sont les amilorides (Leppik et al, Mol. Pharmacol., 2000, 57, 436-
445) et les rho-conotoxines (p-conotoxines), représentées par le peptide p-TIA
(Sharpe et al, Nature Neuroscience, 2001, 4, 902-907 ; Brevet européen EP 1 117
681). Les amilorides sont peu spécifiques et actifs à de très fortes concentrations. Le peptide p-TIA est un peptide naturel de 19 résidus réticulé par deux ponts disulfttre (FNWRCCLIPACRRNHKKFC ; SEQ ID NO : 1), extrait du venin de cône marin Conus tulipa. Ce peptide présente une affinité de l'ordre de 100 nM pour les adrénorécepteurs αl, et une faible sélectivité (affinité de 10 nM) pour le sous-type αlb qui contrôle la tonicité des vaisseaux. Le Brevet européen EP 1 117 681 envisage l'utilisation du peptide p-TIA pour la prévention et le traitement de pathologies cardiovasculaires (hypertension), urinaires (hypertrophie de la prostate), de la douleur et de l'inflammation.
Ces deux modulateurs allostériques des récepteurs adrénergiques alphal sont susceptibles de produire des effets secondaires indésirables, notamment au niveau des vaisseaux (hypotension), du fait de leur absence de sélectivité pour le sous- type alphal a
De nombreuses neurotoxines ont été isolées à partir du venin des mambas africains Dendroaspis angusticeps (mamba vert) et Dendroaspis polylepis (mamba noir) (Pour une revue voir Bradley, N; Pharmacology & Therapeutics, 2000, 85, 87-109 ; Jolkkonen M. et al, Eur. J. Biochem., 1995, 234, 2, 579-85). Les toxines de la famille des « toxines à trois doigts » ou famille des « toxines cholinergiques » sont des peptides de 63 à 66 acides aminés possédant quatre ponts disulfure (entre les cystéines 1 et 3, 2 et 4, 5 et 6 et 7 et 8 : ponts 1-3, 2-4, 5-6 et 7-8) et une structure caractéristique à trois doigts dans laquelle les boucles I, II et III forment les trois doigts centraux de la main et les ponts disulfure, la paume de la main. Ces toxines sont divisées en plusieurs groupes en fonction de leur activité : les toxines muscariniques (MT) qui se lient aux récepteurs de l'acétylcholine de type muscarinique, les neurotoxines alpha (α- neurotoxines) qui se lient aux récepteurs de l'acétylcholine post- synaptiques de type nicotinique et les fasciculines qui sont des inhibiteurs non- compétitifs des acétylcholinestérases. En outre, l'étude phylogénétique des séquences de ces toxines (Fry et al., J. Mol., Evol., 2003, 57, 110-129) montre que ces différents groupes fonctionnels et notamment les toxines muscariniques et les neurotoxines alpha (Demande Internationale PCT WO 99/24055) correspondent à des séquences peptidiques distinctes.
Six toxines muscariniques ont été isolées chez Dendroaspis angusticeps [MTXl (MTl), MTX2 (MT2), MTX3 (MT3 ou m4-tox), MTX4 (MT4), MTX5 (MT5), MTX7 (MT7, ml-tox)], et deux chez Dendroaspis polylepis [MT- alpha (MTa) et MT-béta (MTβ)]. En dépit d'une forte homologie de séquence, ces peptides possèdent une spécificité dans leurs interactions avec les différents sous- types de récepteurs muscariniques et des effets pharmacologiques distincts.
Du fait de cette spécificité, ces peptides ont été utilisés comme outil pour déterminer le rôle physiologique de certains sous-types de récepteurs musca- riniques.
Les inventeurs ont isolé une nouvelle toxine à partir du venin de Dendroaspis angusticeps. Cette toxine dénommée AdTxI, lie sélectivement le récepteur adrénergique alpha la et diminue allostériquement l'affinité des ligands ortho- stériques. AdTxI présente une séquence de 65 acides aminés (SEQ ID NO : 2) :
LTC1VTSKS I FGITTEDC2PDGQNLC3 FKRRHYWPKI YDS TRGC4AATC5P I PENYDS IHC6C7KTDKC8NE
La structure d'AdTxl comprend 4 ponts disulfure, entre les cystéines en positions 3 et 24 (cystéines 1 et 3 : pont 1-3), 17 et 42 (cystéines 2 et 4 : pont 2-4), 46 et 57 (cystéines 5 et 6 : pont 5-6), 58 et 63 (cystéines 7 et 8 : pont 7-8), caractéristiques de la famille des toxines à trois doigts agissant sur le système cholinergique. La séquence d'ATxl présente une très forte homologie avec certaines séquences du groupe des toxines muscariniques dans la famille des toxines à trois doigts : Tableau I : Homologie entre AdTxI et certaines toxines muscariniques à trois doigts
Cette nouvelle toxine définit un sous-groupe de peptides du groupe des toxines muscariniques à trois doigts, caractérisés par leur propriété d'antagoniste allostérique du récepteur adrénergique alpha la. En outre, cette propriété d'antagoniste allostérique du récepteur adrénergique alphala est nouvelle et ne découle pas de manière évidente des propriétés des toxines muscariniques à trois doigts qui sont décrites dans l'état de la technique. En conséquence, la présente invention est relative à des peptides pour utilisation comme médicament, lesdits peptides étant caractérisés par : a) une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO : 2, et les variants dérivés possédant au moins 70 % d'identité ou 80 % de similarité avec la totalité de la séquence SEQiD NO : 2, b) une structure à trois doigts incluant huit résidus de cystéine
(cystéines 1 à 8) reliés par quatre ponts disulfure, respectivement entre les cystéines 1 et 3, 2 et 4, 5 et 6, 7 et 8 (ponts 1-3, 2-4, 5-6 et 7-8), et c) une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala (αla), Les peptides tels que définis dans la présente invention sont capables de bloquer spécifiquement les récepteurs adrénergiques alphala, du fait de leur sélectivité pour le sous-type adrénergique alphala. En outre, contrairement aux inhibiteurs (antagonistes compétitifs), ils agissent comme modulateurs de l'affinité des agonistes ; de tels modulateurs ont l'avantage de ne pas bloquer le fonctionnement du récepteur mais seulement de moduler leurs réponses lorsqu'ils sont activés par leur agoniste naturel. Cette modulation semble plus facile à contrôler qu'avec des antagonistes compétitifs. De plus, il n'existe pas d'effet plateau lors d'une utilisation massive d'antagonistes allostériques, ce qui diminue d'autant les effets toxiques potentiels.
* Définitions : - Au sens de la présente invention on entend par « structure à trois doigts », la structure caractéristique de la famille des toxines à trois doigts telle que définie ci-dessus, laquelle structure comprend trois boucles (boucles I, II, II) maintenues par quatre ponts disulfure (ponts 1-3, 2-4, 5-6, 7-8),
- L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de SEQ ID NO :2 comme séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Le pourcentage d'identité peut être calculé par l'Homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al, NAR, 1997, 25, 3389-3402).
Les programmes BLAST sont mis en œuvre sur la fenêtre de comparaison constituée par la totalité- de la SEQ ID NO :2, indiquée comme séquence de- référence.
Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est défini, dans la présente Invention comme un peptide dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles dudit peptide de référence, en l'occurrence son activité d'antagoniste sélectif du sous-type adrénergique alphala. Au sens de la présente Invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique par analogie aux séquences nucléotidiques.
La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente Invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles du peptide.
Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec une séquence de référence est défini, dans la présente
Invention comme un peptide dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente Invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence.
- Au sens de la présente invention on entend par « antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala », un peptide qui lie sélectivement le récepteur adrénergique alphala et est capable de diminuer allostériquement l'affinité des ligands orthostériques dudit récepteur. Selon la nomenclature conventionnelle, le site orthostérique est le site de liaison de l'agoniste endogène du récepteur (adrénaline dans le cas du récepteur adrénergique alphala). Ce site~est également le site de liaison de certains antagonistes^ (prazosine, dans le cas du récepteur adrénergique alphala). La modulation allostérique implique que le récepteur est capable de lier deux ligands, de façon concomitante, par l'intermédiaire de deux sites de liaison topographiquement distincts ; le ligand orthostérique se lie au site orthostérique alors que le modulateur se lie à un site distinct (site allostérique). Les deux sites de liaison sont liés de façon conformation- nelle, si bien que la liaison d'un ligand sur le site 1 perturbe la structure du site 2, modifiant ainsi son affinité pour son propre ligand. Dans le cas des peptides modulateurs selon l'invention, la liaison du peptide au récepteur adrénergique alphala diminue l'affinité d'antagonistes spécifiques du récepteur, tels que la prazosine et vice-versa.
L'activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala peut être mise en évidence par toute technique classique connue de l'Homme du métier :
- par mesure de la liaison d'un ligand orthostérique (prazosine) en présence du ligand allostérique (peptide), par un test de liaison ligand/récepteur classique ; le déplacement de la liaison du ligand orthostérique au récepteur adrénergique alpha la, par des concentrations croissantes de peptide démontre que le peptide est un inhibiteur du récepteur adrénergique alphala ; l'absence de déplacement complet signe une modulation allostérique. La sélectivité pour le récepteur adré- nergique alphala est démontrée par des tests de liaison, en présence des autres sous- types (alphalb, alphald) et types (alpha2, béta) de récepteurs adrénergiques.
- par mesure de la cinétique de dissociation des complexes ligand orthostérique marqué-récepteur, en présence du ligand allostérique, selon le principe décrit dans Ellis J. et Seidenberg M, Mol. Pharmacol., 2000, 58 : 1451-1460. - par mesure de l'inhibition de l'activation des récepteurs alphala exprimés dans des cellules eucaryotes, afin de montrer son caractère antagoniste. Des cellules eucaryotes de type COS ou HEK, par exemple, exprimant un récepteur adrénergique, par exemple alphala, ont la capacité de libérer du calcium dans le cyto- sole lors de l'activation du récepteur, par l'adrénaline par exemple. Ainsi, lors de la liaison de l'adrénaline sur son site orthostérique, le récepteur est activé. Il change de conformation afin de pouvoir lier une protéine G cytoplasmique. Cette liaison induit une cascade d'événements permettant entre autre la synthèse de diacylglycérol et-de inositol triphosphate (IP3). Ce dernier, en se fixant sur le récepteur à IP3, permet le relargage de calcium dans le cytosole. C'est cette variation de concentration en calcium qui est suivie par fluorescence. Cette technique permet de montrer le caractère agoniste ou antagoniste d'un produit.
L'invention englobe l'utilisation de peptides naturels, synthétiques ou recombinants ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala. L'invention englobe notamment l'utilisation de variants obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence SEQ ID NO : 2, dès lors que ledit variant conserve une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala.
L'invention englobe également l'utilisation de peptides modifiés dérivés des précédents par introduction de toute modification au niveau de résidu(s) d'acide aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités des peptides, dès lors que ledit peptide modifié conserve une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala. Ces modifications qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l'Homme du métier, incluent de façon non-limitative : la substitution d'un acide aminé naturel par un acide aminé non- protéinogénique (acide aminé D ou analogue d'acide aminé) ; l'addition de groupe- ment chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d'une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (-CO- NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d'un peptide ou d'une protéine d'intérêt (épitope d'intérêt pour l'immunodétection ; étiquettes (biotine, peptides, flag, notamment) utiles pour la purification du peptide, notamment sous forme clivable par une protéase, protéine fluorescente ; le couplage à une molécule appropriée, notamment un marqueur, par exemple un fluorochrome. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité et plus particulièrement la résistance à la protéolyse, ainsi que la solubilité, ou à faciliter la purification ou la détection, soit du peptide selon l'invention, soit de récepteurs adrénergiques alphal .
Pour les~applications médicales, le peptide est avantageusement modifié par des moyens bien connus de l'Homme du métier, afin de changer ses propriétés physiologiques, et notamment pour améliorer son temps de 1A vie dans l'organisme (glycosylation : HAUBNER R. et al, J. Nucl. Med., 2001, 42, 326-36 ; conjugaison avec du PEG : KIM TH. et al, Biomaterials, 2002, 23, 2311-7), sa solubilité (hybridation avec de l'albumine : KOEHLER MF. et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 2002, 12, 2883-6), sa résistance aux protéases (acides aminés non naturels (conformation L, par exemple), et/ou son absorption intestinale (Lien et al, TIB, 2003, 21, 556-).
On entend par acide aminé naturel ou synthétique, les 20 α-acides aminés naturels communément trouvés dans les protéines (A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V), certains acides aminés rarement rencontrés dans les protéines (hydroxyproline, hydroxylysine, méthyllysine, diméthyllysine..), les acides aminés qui n'existent pas dans les protéines tels que la β-alanine, l'acide γ-amino- butyrique, l'homocystéine, l'ornithine, la citrulline, la canavanine, la norleucine, la cyclohexylalanine..., ainsi que les énantiomères et les diastéréoisomères des acides aminés précédents.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il s'agit de la toxine MT-béta (SWISSPROT P80495, SEQ ID NO : 3), un peptide naturel extrait du venin du serpent Dendroaspis polylepis (mamba noir) ; les séquences des toxines MT- béta et AdTxI différent uniquement au niveau des résidus en positions 38 et 43 qui sont respectivement I38 et V43 (MT-béta), et S38 et A43(AdTxI).
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide, la cystéine 1 est le premier ou le second résidu d'acide aminé et/ou la cystéine 8 est l'avant dernier ou le dernier résidu d'acide aminé de la séquence dudit peptide. Ce peptide représente un peptide tronqué, dérivé des peptides précédents par délétion d'au moins un des résidus N et/ou ou C terminal, situé en amont de la cystéine 1 ou en aval de la cystéine 8.
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression pour utilisation comme médicament, ledit vecteur comprenant un poly- nucléotide codant pour un peptide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, de la transcription et éventuellement de la traduction.
Conformément à l'invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l'ADNc codant pour ledit peptide ; il s'agit notamment de la séquence SEQ ID NO : 4 codant pour AdTxI . Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée. En outre, ledit polynucléotide peut être lié à au moins une séquence hétérologue. On entend par séquence hétérologue relativement à une séquence d'acide nucléique codant pour un peptide tel que défini dans la présente invention, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant ledit peptide.
Conformément à l'invention ledit vecteur recombinant comprend une cassette d'expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation),
De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les AAV et les baculovirus, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l'introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que Pélectroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant Pélectroporation associée à des liposomes.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide, un poly- nucléotide codant ledit peptide, ou un vecteur tels que définis ci-dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse), entérale (orale, sublinguale), ou locale (nasale, rectale, vaginale).
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables sont ceux classiquement utilisés.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un peptide et/ou un vecteur tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala (αla), destiné au traitement d'une pathologie uro-génitale ou cardiovasculaire, ou bien d'un cancer.
Les pathologies uro-génitales comprennent les dysfonctionnements urinaires : incontinence, obstruction fonctionnelle de l'appareil urinaire chez la femme ou chez l'homme, et les troubles de l'érection.
De préférence, ladite pathologie uro-génitale est l'hyperplasie bénigne de la prostate ; l'augmentation de volume de la prostate entraîne une obstruction de l'urètre, à l'origine de dysfonctionnements urinaires. Le blocage des adréno- récepteurs alphala permet un relâchement des muscles lisses et un écoulement urinaire normal.
Les pathologies cardiaques comprennent principalement l'hypertension artérielle, dans la mesure où le blocage des récepteurs alphala entraîne une hypotension. Certaines formes d'hypertension sont dues à une phéochromo- cytome ; l'utilisation d'un alpha bloquant est recommandée avant l'opération chirurgi- cale.
Les pathologies cancéreuses comprennent principalement le cancer de la prostate, dans la-mesure où les récepteurs adrénergiques alphala sont majoritairement exprimés dans cet organe. L'inhibition des adrénorécepteurs ralentirait la prolifération des cellules épithéliales du cancer de la prostate. La présente invention a également pour objet l'utilisation du peptide de séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un variant dérivé ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala (αla) tels que définis ci-dessus, comme outil pour l'étude du récepteur adrénergique alphala.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide est couplé à un marqueur approprié.
Les peptides tels que définis dans la présente Invention peuvent être marqués directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif, par couplage covalent ou non-covalent, afin d'obtenir un signal délectable et/ou quantifïable. Le marquage est notamment un marquage radioactif, magnétique, fluorescent, effectué selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. Les marqueurs détectables de manière directe sont notamment des isotopes radioactifs tels que le tritium ( H) et l'iode (125I) ou des composés luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les marqueurs détectables de manière indirecte incluent notamment la biotine et les épitopes B. Le marquage est notamment réalisé :
- par greffage d'un fluorophore sur une aminé réactionnelle, c'est-à- dire portée par une lysine. On peut par exemple obtenir l'AdTxI mutée en 34, la lysine étant remplacée par une arginine ou une homoarginine et dans laquelle le réactif Cy3B™ (Amersharn) a été greffé sur une ou plusieurs des autres lysines de l' AdTxI, - par incorporation directe d'un fluorophore par synthèse chimique
(en N ou C-terminal),
- par incorporation d'un groupement réactionnel (cystéine libre, biotine) par synthèse ou production recombinante, puis utilisation de ce groupement pour greffer un fluorophore. De tels peptides marqués sont notamment utilisés pour localiser les récepteurs adrénergiques alphala, in vitro et in vivo, de façon à déterminer leur profil d'expression tissulâire, dans des conditions physiologiques, pathologiques ou en réponse à un stimulus endogène ou exogène.
La présente invention a également pour objet un procédé de détec- tion de récepteur(s) adrénergique(s) alphala, in vitro et in vivo, comprenant au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact de cellules à analyser avec un peptide marqué tel que défini ci-dessus, et
- la détection des cellules marquées par tout moyen approprié. La détection des récepteurs, in vivo, dans l'organisme d'un mammifère (imagerie cellulaire), notamment en temps réel, comprend une étape préalable d'administration dudit peptide audit mammifère (injection parentérale, administration orale).
Le marquage des cellules est notamment un marquage fluorescent ou un marquage magnétique, détectable par toute technique connue de l'Homme du métier (microscopie de fluorescence, cytométrie de flux, imagerie de résonance magnétique). Alternativement les peptides marqués sont utilisés pour cribler des banques de molécules, dans le but d'identifier d'autres ligands allostériques du récepteur adrénergique alphala.
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de ligands allostériques du récepteur adrénergique alphala, comprenant au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact d'un récepteur adrénergique alphala, en présence d'une banque de molécules à tester et d'un peptide marqué tel que défini ci- dessus, et - l'identification des molécules capables de déplacer la liaison dudit peptide audit récepteur, par tout moyen approprié.
En outre, les complexes entre le peptide tel que défini dans la présente invention et le récepteur adrénergique alphala peuvent être avantageusement utilisés pour obtenir des cristaux ; de tels cristaux permettent de déterminer la struc- ture tridimensionnelle du récepteur adrénergique alphala, par diffraction aux rayons
X.
La_présente invention a également pour objet un procédé de préparation de cristaux du récepteur adrénergique alphal, comprenant au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact du récepteur adrénergique alpha 1 avec un peptide tel que défini ci-dessus, de manière à former des complexes récepteur/ligand, et b) l'incubation des complexes obtenus en a) dans des conditions et pendant une durée suffisante pour obtenir la formation de cristaux. La présente invention a également pour objet un complexe récepteur/ligand dans lequel le récepteur est le récepteur adrénergique alphala et le peptide est un peptide tel que défini ci-dessus, éventuellement couplé à un marqueur approprié.
La présente invention a également pour objet le peptide de séquence SEQ ID NO : 2 et les peptides variants de la SEQ ID NO :2 comprenant la substitution de la lysine en position 34 de la séquence SEQ ID NO :2 par un autre acide aminé, notamment une arginine ou une homoarginine. Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il est couplé à un marqueur approprié.
La présente invention a en outre pour objet un polynucléotide, une cassette d'expression, un vecteur recombinant et une cellule hôte procary ote ou euca- ryote modifiée, dérivés du peptide précédent.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide, il présente la séquence SEQ ID NO : 4 codant pour AdTxI. L'invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant au moins un polynucléo- tide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et b) des vecteurs recombinants comprenant un polynucléotide conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs sont des vecteurs d'expression comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
Les polynucléotides, les vecteurs recombinants et les cellules transformées tels que~définis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des peptides tels que définis dans la présente invention.
Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA) et Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, CoId Spring Harbor, New York: CoId Spring Harbor Laboratory Press). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.
Les peptides et leurs dérivés (variants, peptides modifiés) tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d'un ADN recombinant dans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procaryote). De manière plus précise,
- les peptides et leurs dérivés peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am.
Chem. Soc, 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse,
- les peptides et leurs dérivés tels que les variants peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier ; l'ADNc est clone dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels : ~
- la figure 1 illustre le déplacement de la liaison du peptide AdTxI radiomarqué (125I-AdTxI) au récepteur adrénergique alphala, en présence de prazo- sine (•) ou d'AdTxl (O). Les valeurs d'IC50 sont de 2,2.10'10M et de 5.10"10 M, respectivement pour la prasozine et le peptide AdTxI .
- la figure 2 illustre le déplacement de la liaison de la liaison de 3H- prazosine, 3H-rauwolscine et 3H-CPGl 2177 aux différents sous-types de récepteurs adrénergiques, par la prazosine ou le peptide AdTxI. (D) déplacement par la prazo- sine, de la liaison de 3H-prazosine au récepteur alphala (IC50 = 0,99.10"9 M). (Φ) déplacement par AdTxI, de la liaison de 3H-prazosine au récepteur alphala (IC5O = 1,8.10'9 M), (β) déplacement par AdTxI, de la liaison de 3H-prazosine au récepteur alphalb (IC50 = 2,3.10"6 M). (•) déplacement par AdTxI, de la liaison de 3H- prazosine au récepteur alphald (IC5O = 9,9.10"6 M). (O) déplacement par AdTxI, de la liaison de 3H-rauwolsine au récepteur alpha2a (IC50 > 5.10'5 M). (O) déplacement par AdTxI, de la liaison de 3H-CGP12177 au récepteur bétal (IC50 > 5.10'5 M). - la figure 3 représente la saturation chaude de 125I-AdTxI sur des membranes de levure exprimant le récepteur adrénergique alphala. Différentes concentrations de 125I-AdTxI sont incubées 20 h en présence de 20 μg de membranes de levure. La liaison non-spécifique est mesurée en présence de 1 μM de AdTxI. (Δ) Liaison non-spécifique. (•) Liaison spécifique. (O) Liaison totale. La liaison spécifique est saturable et de haute affinité, égale à 0,8 ± 0,2 nM.
- la figure 4 illustre le marquage par le dérivé fluorescent AdTxI- Cy3B™, des récepteurs adrénergiques h-alphala (A) et h-alphalb (B) exprimés transitoirement dans des cellules COS. Exemple 1 : Préparation du polypeptide AdTxI 1) Synthèse chimique
Le peptide AdTxI est synthétisé en phase solide par la technique Fmoc (Fluorényl méthyloxy carbonyle), en utilisant le dicyclohexylcarbodiimide/1- hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT) comme agent de couplage et le N-méthyl pyrro- lidone comme solvant (Mourier et al, Molecular Pharmacology, 2003, 63, 26-35). Brièvement, la synthèse est effectuée de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N- terminale du pëptide en utilisant 0,05 mmole de résine. A la fin de la synthèse, la résine/peptide est traitée avec un mélange de 9 ml d'acide trifluoroacétique, 0,5 ml de triisopropylsilane et 0,5 ml d'eau distillée. Le peptide est alors clivé de la résine après deux heures d'incubation. Le mélange est filtré sur de l'éther éthylique froid et centrifugé deux fois. Le précipité ainsi obtenu est dissous dans une solution d'acide acétique à 10 % et lyophilisé. La toxine synthétique réduite est purifiée par chromatographie en phase inverse (HPLC) sur une colonne semi-preparative Discovery® Bio Wide Pore C5, 25 cm x 10 mm, 10 μm (SUPELCO) avec un gradient de 40 % à 70 % de solvant B en 150 minutes (A : 0,1 % TFA, B : 50 % acétonitrile et 0,1 % TFA), avec un débit de 4,5 ml/min. La détection est suivie à 220 nm.
La toxine synthétique est ensuite repliée en tampon Tris 100 mM, pH 8,0, en présence de glutathion réduit (GSSG) et oxydé (GSH) avec un rapport molaire GSSG/GSH de 1/1 et une concentration de 1 mM. Après trois jours à 4°C, dans le noir et sous argon, la toxine synthétique repliée est purifiée par chromatographie en phase inverse (HPLC) dans les mêmes conditions que décrites précédemment. La concentration en toxine synthétique est de 5 μM. 2) Production de polypeptide recombinant
Le clonage de la séquence nucléotidique codant pour AdTxI est réalisé par recombinaison homologue selon la technologie (Gateway®), Invitrogen).
Un fragment polynucléotidique (SEQ ID NO : 4) comprenant successivement de 5' en 3' : une séquence de recombinaison attBl, le site de clivage de la TEV (ENLYFQG), la séquence codant pour AdTxI (SEQ ID NO : 3), un pseudo stop, la séquence codant pour le peptide Stag, un codon stop, et la séquence de recombinaison attB2, a été amplifié par PCR. Le produit PCR a été clone par recombinaison homologue dans le plasmide donneur pDONR221 (Invitrogen). Le clone ainsi obtenu est utilisé pour générer des vecteurs d'expression recombinants, adaptés à l'expression d' AdTxI dans un système cellulaire approprié.
Exemple 2 : Analyse de Ia liaison d'AdTxl aux récepteurs adrénergiques alpha 1 1) Matériels et méthodes a) Iodation de la toxine AdTxI La iodation de AdTxI s'effectue par une réaction d'halogénation, catalysée par la lactoperoxidase. Le mélange réactionnel contenant 50 μl de tampon phosphate 0,1" M à pH 7,3, 10 μl de toxine 100 μM, 10 μl H2O2 1/50 000 et 1 mCi [ I] et 0,7 Unité de Lactoperoxidase (Sigma) est incubé pendant 1 minute à 25°C. La toxine iodée est ensuite purifiée par HPLC en phase inverse comme précédemment décrit (Krimm I, et al. , J. Mol. Biol. , 1999, 285, 1749-63). b) Préparation de membranes contenant le récepteur adrénergique
Chaque sous-type de récepteur, αla, au,, α^, α2a, P1 est exprimé chez la levure Pichia pastoris, transformée par un plasmide d'expression comprenant PADNc correspondant audit récepteur. Chaque clone est cultivé de la même façon. Les clones de Pichia pastoris sont inoculés dans 10 ml de milieu (1 % extrait de levure, 2 % peptone, 100 mM Phosphate de Potassium pH 6, 1,3 % base azotée de levure, 1 % Glycérol), pendant une nuit à 30°, puis les cultures sont diluées dans 100 ml de milieu frais et incubées à nouveau pendant 4 h à 300C. Les cultures sont ensuite centrifugées (3000 g, 5 min), resuspendues dans 500 ml de milieu d'induction (1 % extrait de levure, 2 % peptone, 100 mM Phosphate de Potassium pH 6, 1,3 % base azotée de levure, 0,5 % Méthanol), supplémenté par 2,5 % DMSO et incubées 18 h à 20°C, sous agitation (200 rpm). Les cultures sont récoltées (3000 g, 15 min, 4°C) et resuspendues dans 3 ml de tampon (50 mM Phosphate de Potassium pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 % Glycérol, 2 mM EDTA et 1 mM PMSF), refroidi dans la glace. Des billes de verre froides (2 ml ; 400-600 μm acid washed glass beads, Sigma) sont ajoutées aux suspensions, puis le mélange est soumis à huit cycles de 30 secondes d'agitation par vortex, suivi d'un repos dans la glace. Les billes de verre et les cellules non lysées sont ensuite séparées du lysat par une centrifugation (5 min à 3000 g, 4°C), et un lavage du culot est effectué dans les mêmes conditions. Le surnageant est récupéré et centrifugé pendant 1 h à 20,000 g. Le culot de chaque préparation est resuspendu dans un tampon (50 mM Tris pH 8, 120 mM NaCl, 10 % Glycérol, 1 mM PMSF) à l'aide d'un homogénéisateur, aliquoté et conservé à -80°C jusqu' à utilisation, c) Tests de liaison.
5 μg de membranes sont mélangés avec 1 nM final de 3H-Prazosine ([7-Methoxy-3H], PerkinElmer Life Sciences), ou de 3H-rauwolscine, [Methyl-3H] (PerkinElmer Life Sciences), ou de 3H-CPG12177 (PerkinElmer Life Sciences) dans du tampon Tris-HCl pH 7,2, additionné de 10 mM de MgCl2, dans un volume final de 200 μl, puis le mélange est incubé pendant 5 heures à température ambiante, en présence de~doses croissantes d'AdTxl (0,01 nM à 100 μM). La~liaison non spécifique est mesurée en présence de 1 μM de prazosine (Sigma) pour la liaison avec 3H- Prazosine, de 1 μM de yohimbine (Sigma) pour la liaison avec 3H-rauwolscine, ou de lμM de propranolol (Sigma) pour la liaison avec 3H-CPG12177. La réaction est stoppée par filtration précédée d'une dilution du milieu réactionnel dans 2 ml de tampon de lavage (Tris-HCl pH 7,2, 10 mM), à 4°C. La filtration est réalisée sur des filtres de verre (GFC, Whatman) préalablement traités dans du tampon 0,3 % PEI (Polyéthylèneimine, Sigma). Deux lavages successifs et rapides sont effectués. Les filtres sont séchés pendant une heure à 80°C et additionnés de 10 ml de Lipoluma Plus (Lumac LMC). Les émissions sont détectées par un compteur Rockbeta 1211 (LKB Wallac) donnant la valeur de chaque test en cpm (coups par minute). L'analyse des résultats est réalisée, à l'aide du logiciel Kaleidagraph (Tools for discovery, Synergy Software, PA, USA). L'analyse du déplacement de la liaison au récepteur adrénergique alphala par le peptide AdTxI iodé (0.1 nM) est réalisée suivant le même protocole que celui utilisé pour les ligands tritiés, et la radioactivité est mesurée par un compteur Multigamma 1261 (LKB Wallac).
L'analyse de la saturation du récepteur adrénergique alphala par AdTxI est réalisée par incubation de concentrations croissantes du peptide iodé en présence de 20 μg de membranes contenant le récepteur adrénergique alphala, pendant 20 h, puis mesure de la radioactivité comme ci-dessus. La liaison non-spécifique est mesurée en présence de l μM de AdTxI. 2) Résultats
L'analyse de la liaison du peptide AdTxI aux différents sous-types de récepteurs adrénergiques sous-types alphala, Ib, Id, 2a et bétal est présentée aux figures 1, 2 et 3.
Le peptide AdTxI est un ligand du récepteur adrénergique alphala (figure 1). Les tests de liaison en compétition avec des ligands orthostériques spécifiques des différents sous-types de récepteurs adrénergiques (figure 2) indiquent que le peptide AdTxI lie sélectivement le sous-type adrénergique alphala. Ses affinités pour les sous-types alphala, Ib, Id, 2a et bétal, évaluées par la valeur d'ICso, sont respectivement de l,8.10~9 M, 2,3.10"6 M, 9,9.10"6 M, > 5.10-5 M5 et > 5.10"5 M.
La courbe de déplacement de la liaison de la prazosine au récepteur adrénergique alphala, en présence du peptide AdTxI (figures 1 et 2) indique que le déplacement est incomplet, ce qui signe une modulation allostérique.
Les résultats présentés aux figures 1 et 2 indiquent que le peptide AdTxI lie spécifiquement le récepteur adrénergique alphala et qu'il diminue allosté- riquement l'affinité des ligands orthostériques, du fait de cette liaison. C'est donc un antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala. La courbe de saturation du récepteur adrénergique alphala (figure 3) montre que la liaison spécifique d1 AdTxI est saturable et de haute affinité, égale à 0,8 ± 0,2 nM.
Exemple 3: Marquage des récepteurs adrénergiques alphala par Ie dérivé fluorescent AdTxI Cy3B™ 1) Matériels et méthodes
Le variant AdTxI K34R a été synthétisé comme décrit à l'exemple 1 pour AdTxI. Le variant AdTxI K34R a ensuite été couplé au fluorophore Cy3B- mono-NHS-ester (AMERSHAM) selon le protocole recommandé par le fabricant. Des cellules COS (ATCC) transfectées, soit par un vecteur d'expression du récepteur adrénergique humain alphala, soit par un vecteur d'expression du récepteur adrénergique humain alphalb et exprimant transitoirement ce récepteur alphala ou alphalb, ont été incubées en présence de 2 μM de AdTxI -Cy 3b pendant 16 h, puis la fluorescence émise après excitation laser à 543 nm a été analysée à l'aide d'un microscope à fluorescence (Leica TCS SP2, LEICA MICROSYSTEMS), au grossissement de 40. 2) Résultats La figure 4 illustre le marquage spécifique des récepteurs adrénergiques alphala par le dérivé fluorescent d' AdTxI. La figure 4A montre un marquage intense des récepteurs adrénergiques h-alphala par le dérivé fluorescent d'AdTxl. Par comparaison, la figure 4B montre l'absence de marquage des récepteurs adrénergiques h-alphalb (figure 4B) par le dérivé fluorescent d'AdTxl.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Peptide pour utilisation comme médicament, ledit peptide étant caractérisé par : a) une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO : 2, et les variants dérivés possédant au moins 70 % d'identité ou 80 % de similarité avec la totalité de la séquence SEQ ID NO : 2, b) une structure à trois doigts incluant huit résidus de cystéine reliés par quatre ponts disulfure, respectivement entre la première et la troisième cystéine, la deuxième et la quatrième cystéine, la cinquième et la sixième cystéine, et la septième et la huitième cystéine, et c) une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala (αia),
2°) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 3. 3°) Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la première cystéine est en position 1 ou 2 et/ou la huitième cystéine est en dernière ou avant dernière position de ladite séquence définie en a).
4°) Vecteur d'expression pour utilisation comme médicament, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, de la transcription et éventuellement de la traduction,
5°) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou un vecteur tel que défini à la revendication 4, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
6°) Utilisation d'au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou un vecteur tel que défini à la revendication 4, pour la préparation d'un médicament ayant une activité d'antagoniste allostérique sélectif du récepteur adrénergique alphala, destiné au traitement d'une pathologie uro- génitale ou cardiovasculaire, ou bien d'un cancer.
7°) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite pathologie est sélectionnée dans le groupe constitué par l'hyperplasie bénigne de la prostate, l'incontinence urinaire, les troubles de l'érection, l'hypertension artérielle et le cancer de la prostate.
8°) Utilisation du peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 comme outil pour l'étude du récepteur adrénergique alphala. 9°) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le dit peptide est un variant de la séquence SEQ ID NO: 2 comprenant la substitution de la lysine en position 34 de la séquence SEQ ID NO: 2 par un autre acide aminé.
10°) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que la lysine en position 34 est substituée par une arginine ou une homoarginine. 11°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que le dit peptide est couplé à un marqueur approprié.
12°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que ladite étude comprend la détermination du profil d'expression tissulaire du récepteur adrénergique alphala. 13°) Utilisation du peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications I à 3 et 9 à ll, pour cribler des ligands allostériques du récepteur adrénergique alphala. ~
14°) Procédé de criblage de ligands allostériques du récepteur adrénergique alphala, comprenant au moins les étapes suivantes : - la mise en contact d'un récepteur adrénergique alphala avec une banque de molécules à tester et un peptide marqué tel que défini à la revendication 11, et
- l'identification des molécules capables de déplacer la liaison dudit peptide audit récepteur, par tout moyen approprié. 15°) Procédé de détection d'un récepteur adrénergique alphala, in vitro et in vivo, comprenant au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact de cellules à analyser avec un peptide marqué tel que défini à la revendication 11, et
- la détection des cellules marquées par tout moyen approprié. 16°) Procédé de préparation de cristaux du récepteur adrénergique alphal, comprenant au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact du récepteur adrénergique alpha 1 avec un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 9 à 11, de manière à former des complexes récepteur/ligand, et b) l'incubation des complexes obtenus en a) dans des conditions et pendant une durée suffisante pour obtenir la formation de cristaux.
17°) Peptide isolé, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 2.
18°) Peptide isolé, tel que défini à la revendication 9 ou la revendication 10. 19°) Peptide selon la revendication 17 ou la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est couplé à un marqueur approprié.
20°) Complexe récepteur/ligand isolé, caractérisé en ce que ledit récepteur est le récepteur adrénergique alphala et ledit peptide est un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications I à 3 et 9 à ll. 21°) Polynucléotide, caractérisé en ce qu'il code pour le peptide selon la revendication 17 ou la revendication 18.
— 22°) Polynucléotide selon la revendication^ 1, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO : 4.
23°) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide selon la revendication 21 ou la revendication 22.
24°) Cellule modifiée par le polynucléotide selon la revendication 21 ou la revendication 22, ou bien le vecteur selon la revendication 23.
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